JPS62502340A - マラリアに対するワクチンに使用するための免疫性抗体一担体蛋白質の複合体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 マラリアに対するワクチンに使用するための免疫性抗体−担体蛋白質の複合体 技術分野 米国政府は、政府の国際開発機構からの許可番号ＤＰＥ−０４５３−Ｃ−００− ２００２−００及び保険人類サービス省の許可番号５Ｒ０１−ＡＩ−１７４２９ −０３の効力に基づき本発明における権利を有するものである。

本出願は、 （ａ）１９８４年８月２１日に発行されたマラリアワクチンと題するＮｕｓｓｅ ｎｚｗｅｉｇ、　Ｒ，らの米国特許第４．４６６．９１７号： （ｂ）１９８４年１月２７日に出願された“保護ペプチド抗体”と題するＨｌｉ ｓ、Ｊ、らの発明であって、譲受人の同時係属米国特許出願用５７４．５５３号 ； （ｃ）１９８４年７月２３日に出願された“熱帯熱マラリア原虫Ｃ８（Ｐｌａｓ ｍｏｄｉｕｍ　ｆａｌｃｉｐａｒｍ　Ｃｉｒｃｕｍｓｐｏｒｏｚｏｉｔｅ　）に 応答する保護ペプチド抗体”と題するＥｌｌｉｓ、Ｊ、らの発明であって、譲受 人の同時係属米国特許出願用６３３，１４７号：（ｄ）１９８４年１０月２６日 に出願された“Ｃ８蛋白質の交差反応性及び保護エピトープと題するＶｅｒｇａ ｒａ、　Ｌｌ、らの発明であって、譲受人の同時係属米国特許出願用６４９．９ ０３号：及び （ｅ）１９８５年１月２８日に出願された“Ｃ８表面蛋白質の免疫支配エピトー プと題するｈｕｓｓｅｎｚｗｅｒｇ、　ｖ、らの発明であって、譲受人の同時係 属米国特許出願用６９５．２５７号 の全開示を引用することによって包含させたものである。

本発明は、マラリアに対する保護免疫性を付与するために有用な抗体と担体蛋白 質との複合体に関するものであり、更に詳しくは、マラリアのスポロゾイト段階 に対して保護免疫性を付与するために有用なペプチドと担体蛋白質との複合体に 関するものである。

背　景　技　術 比較的少囚のＸ線を照射したスポロゾイトを習歯類、霊長類及びヒトに接種する と保護免疫を生ずることが知られている。

免疫は、期待異的（ｓｔａｇｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ）　（即ち、それはマラリア のスポロゾイト段階に対しては保護するが、血液段階に対しては保護しない。〕 であり、多くの例にあっては、種特異的（ｓｐｅｃｉｅｓ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ） 　（即ち、単一の種のスポロゾイトに接種すると、通常その種に対してのみ免疫 を付与する。〕であるが、系統特異的（ｓｔｒａｉｎ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ　）　 （ある特定の風土病地域において発生するある種のスポロゾイトを接種すると他 の風土病地域において発生するそれと同一種のスポロゾイトに対して免疫を付与 する。〕ではない。

Ｘ線を照射した同一種のスポロゾイトで免疫化された宿主（ｈｏｓｔ）であれば いかなる宿主であっても、それに由来する抗血清を有するスポロゾイト種は全て 、インキュベーションにより尾状の沈殿をスポロゾイト表面に形成する結果とな ることもよく知られている（この反応は、゛サーカムスボロゾイト沈殿反応”又 は“”ｃｓｐ反応”として知られている。）。そして、かかる反応によりスポロ ゾイト感染性を完全に中和（ＩＯ３Ｓ）させる結果ともなる。

これら抗−スポロゾイト抗血清の標的抗原は、モノクロナール抗体によって同定 されており、通常、スポロゾイト膜の全表面を被覆するが、抗体と反応（交差結 合）するポリペプチド類（サーカムスボロゾイト表面−又はＣ８−蛋白質）に属 する。

公知の°Ｃ８蛋白質は全て、強い免疫支配性反復エピトープを包含する。これら エピトープに対するモノクロナール抗体は、生体内（ｉｎ　ｖｉｖｏ　）におい ても生体外（ｉｎ　ｖｉｔｒｏ）においてもスポロゾイト感染性を中和する。

熱帯熱’？７！Ｊ７原虫（Ｐ、　ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）のＣ８蛋白質、ヒトマ ラリア種に対応する遺伝子は、既に、クローン化されている。

この免疫支配性エピトープは、Ｈ−（Ａｓｎ−Ａｌａ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ　）３− ０ｆ（−・・連鎖からなり、（ＮＡＮＰ）　３としても表わされる。このエピト ープは、世界のあらゆる風土病地域にお（プる熱帯熱マラリア原虫種において見 出され、Ｃ８分子として表わされることも多い（Ｅｎｅａら、１９８４．　５ｃ ｉｅｎｃｅ　＋　２２５　、　６２８　ＨＤａｍｅら、１９８４゜５ｃｉｅｎｃ ｅ　：　２２５　、５９３　；　Ｚａｖａｌａ、Ｆ、ら、Ｆｅｄ、Ｐｒｏｃ、　 ４３　：　１８０８゜１９８４及びＪ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、印刷中）。

これら研究の究極的目標は、マラリアに対する予防ワクチンを開発することであ る。

かかるワクチンは、前記（又は後記）免疫性において有効なばかりでなく、免役 性を付与すべき人が多いことからも、容易にかつ人聞生産で廉価に製造する必要 がある。

発　明　の　開　示 熱帯熱マラリア原虫Ｃ８蛋白質と担体との免疫支配性エピトープからなるペプチ ド複合体が抗体のｉｎ　ｖｉｖｏにおける高力価を生じさせるのに有効であるこ とが発見されている。これら抗体はスポロゾイトを認識し、過激なＣ２Ｆ反応に よってｉｎ　ｖｉｔｒＯにおけるスポロゾイト感染性を中和する。かかるペプチ ドは、好ましくは、Ｈ−（Ａｓｎ−Ａｌａ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ　）３−ＯＨであり 、（ＮＡＮＰ　）　３と表わすこともできる。即ち、アミノ酸遠鎖ＮＡＮＰが並 列して三度繰り返されてなるドデカペプチドである。担体は、好ましくは、チタ ヌストキソイドである。

世界の風土病地域に由来するヒト血清中の抗体の大部分又は全ての抗体が合成ペ プチド（ＮＡＮＰ）　３を認識することもまた発見されている。かかる事実は、 更に、（ＮＡＮＰ）　３が実際に熱帯熱マラリア原虫Ｃ８蛋白質の反覆エピトー プを正確に表わしているという考えを支持するものである。したがって、本発明 の複合体は、マラリアに対する保護ワクチンの開発において有用である。

以下、本発明を更に詳細に説明する。

図面の簡単な説明 第１図〜第３図は、本発明に従う複合体で免疫化された兎に由来する相互血清希 釈液に対する免疫放射分析において観察される１分間当りの放射活性のカウント 数をプロットしたものである。

第４図は、流体層中の（ＮＡＮＰ）　３の存在濃度を増大させる場合の本発明の 複合体に対して生起される兎の抗ｔｈ清の免疫放射分析の結果をプロットしたも のである。

第５図は（ａ）熱帯熱マラリア原虫のスポロゾイト抽出物：（ｂ）完全なＦｒｅ ｕｎｄアジュバントを有する本発明の複合体：（Ｃ）正常な兎の血清；及び（ｄ ）不完全なＦｒｅｕｎｄアジュバントにおける本発明の複合体に対して生起する 兎の抗血清によって生ずる熱帯熱マラリア原虫のウェスターンブロッティング（ Ｗｅｓｔｅｒｎ　８１０ｔｔｉｎｇ）の結果を表わす。

第６図は、熱帯熱マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ　ｆａｃｉｐａｒｕｍ） 及びＰＩａｓｎ＋ｏｄｉｕＩＩｌｂｅｒｇｈｅｉスポロゾイト抽出物の存在濃度 を増大させた場合に本発明に従う複合体に対して生起する兎抗血清の免疫放射分 析の結果をプロットしたものである。

第７図は、ヒト被検体の年齢に従う風土病地域出身のヒトにおける（ＮＡＮＰ） 　３とポジティブな血清反応との割合を表わすものである。

第８図は、第７図を作成するために用いられた同一のヒト血清の免疫放射分析の 結果のヒストグラムであり、かかる分析は流体層中で拮抗する（ＮＡＮＰ）　３ 又は他のペプチドの存在下又は不存在下において行なった。

発明を実施するための最良の形態 本発明の複合体は、兎、マウス及びアオタスモンキーの免疫処置、即ち、これら の複合体をＦｒｅｕｎｄのアジュバントに完全に乳濁させるか又は不完全に乳濁 させるかによって、抗−熱帯熱マラリア原虫のスポロゾイト抗体の高力価を生成 することが発見されている。かかる複合体は、アジュバントが存在しなくとも兎 に抗−スポロゾイト抗体を生起させた。

本発明の複合体に対して生起した抗体の多くは、熱帯熱マラリア原虫のＣ８蛋白 質を認識し、低濃度（約０．２μ９７ｍ１ｌ以下）でｉｎ　ｖｉｔｒｏにおいて スポロゾイト感染性を中和する。

抗体の力価は、注射される抗原の量とともに増大する。

風土病地域に由来するヒト血清中のスポロゾイトに対する抗体の多くは、（ＮＡ ＮＰ）　３と反応し、熱帯熱マラリア原虫のＣ８蛋白質エピトープが系統特異的 でないことが確認される。したがって、かかるエピトープは、系統特異的な抗体 に対して生起することはないものであろう。

それ故に、本発明の複合体は、マラリアワクチン、特に種々の地域においてヒト を免疫化するために用いることのできるマラリアワクチンを開発するための佼れ た候補である。

本発明の複合体は、（ＮＡＮＰ）　３とチタヌストキソイドとの接合（ｃｏｎｊ ｕｇａｔｉｏｎ　）によって調製される。チタヌストキソイドは、担体蛋白質で あることに加えて、本来、免疫剤である。しかしながら、用いることのできるか かる担体はその他数多い。

例えば、ジフテリアトキソイド（数多くの市販源：ニューヨーク州バールリバー 所在のレーデルラボラトリーズ；オハイオ州シンシナチ所在のメレル・ダウ・） ７−マソイテイカルズ；インシアナ州インジアナポリス所在のエリ　リリイー　 アンドカンパニーズ社等から入手可能である。）、その他の蛋白質及びかかる目 的に対しよく知られているポリサツカロイド並びにリジンとアルギニン群からな る合成ペプチド及びポリマー。これらの他の担体を使用すると、有効な複合体が 生起する可能性が十分にあることが期待される。

以下に記載するある例においては、複合体は、カップリング剤としてグルタルア ルデヒドを用いてＷｌｔＪされる。しかしながら、他のカップリング操作も容易 に利用することができ、例えば水溶性のカルボジイミド（Ｊ、Ｂｏｉｌ、Ｃｈｅ Ｉｌｌ、　２４２　、２４４７〜２４５３　、１９６７）　、ごスージアゾベン チジン〔続いて、（ＮＡＮＰ）　、のＮ−末端に特別のチロシン残基を付加する （米国科学アカデミ−誌、７７　：　５１９７−５２００．１９８０）　）又は マリイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシ−スクシンイミドエステル〔続いて、（ ＮＡＮＰ）３のＮ−末端に特別のシスティン残基又は他のスルフヒドリルを付加 する（米国科学アカデミ−誌、７８　：　３４０３〜３４０７．１９８１参照） 。〕を用いることもそのひとつである。本発明の特に好ましい実施態様にあって は、ペプチドのＮ−末端にシステイン残基を付加し、カンプリング剤としてマリ イミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシ　スクシンイミドエステルを用いる。

本発明においては、Ｆｒｅｕｎｄの完全（及び不完全）アジュバントをアジュバ ントとして用いた。アジュバントの機能は、免疫性の応答を増幅することである 。ワクチン調製に用いるのに好適なアジュバントは、いかなるアジュバントであ っても、用いることができる。

本発明における結果は、ワクチン調製におけるアジュバントの存在が必須でない ことを示しているけれども、アジュバントは、複合体の免疫抗原性を増大させる のに有利であり、したがって、アジュバントを包含することが好ましい。その他 の好適なアジュバントとしては、リン酸アルミニウム、水酸化アルミニウム、ム ラミルジペプチド又はその誘導体等がある。

本発明にあっては、更に、以下に、特に好ましい実施態様について記載する。し かしながら、当業者であれば、本明細書。

添付の請求の範囲及び補足的な図面において開示したような本発明の範囲又は精 神から離れることなく、種々の変形、付加及び変換が可能であることが容易に認 識されるであろう。

以下の実施例の目的とするところは、本発明を説明することであって、その請求 の範囲を何ら限定するものではない。

Ｆ：ＮＡＮＰ　のＡ　び精シ ドデカペプチド（ＮＡＮＰ）　３を）Ｉｅｒｒｉｆｉｅｌｄ、Ｒ，Ｂ、の固相法 〔（１９６２）Ｆｅｄ、Ｐｒｏｃ、Ｆｅｄ、Ａｎ＋、Ｓｏｃ、Ｅｘ、　Ｂｉｏｌ 、、　２１　：　４１２及びＪ、　Ｃｈｅｍ、　Ｓｏｃ、、８５　：　２１４９ 参照。）によって合成した。

Ｃ−末端のアミノ酸残基Ｂｏｃ−Ｐｒｏをヒドロキシメチル−Ｐａｌ−〔コポリ （スチレン−１％ジビニルベンゼン）〕樹脂支持体（Ｈｉｃｈｅｌｌ、Ａ、Ｒら によって１９７６　Ｊ、Ａｍ、Ｃｈｅｍ、Ｓｏｃ、　９８　：　７３５７に開示 されているように、カリフォルニア州すッチモンド所在のバイオ−ラッド社から 入手される非誘導ポリスチレンから合成される。〕に結合させて、合成の際のペ プチド鎖のロスを防止する。

このようにして調製されたＢｏｃ−Ｐｒｏ−ＯＣＨ２−Ｐａｍ−樹脂（樹脂１ｇ 当たり０．４ミリモル置換）２ｇを変形Ｂｅｃｋｍａｎ　９９０シンセサイザー （カリフォルニア州パロアルト所在のベツクマンインスツルメンツ社製）の反応 容器に入れた。合成は、カップリング工程を最適化するコンピュータを用いて行 った。

保護したドデカペプチド−樹脂を０℃で６０分間ＨＦ−アニソール（９：１体積 ／体積、１０ｄ）によりバッチ式で脱保護した。

開裂収率は、６ＮのＨＣＲによる樹脂の逆加水分解を基準として９１％であった 。粗製のペプチドの純度は、下記のような水性ＣＦ３　Ｃｏ２Ｈ及びＣＨ３Ｃｔ ｌ成分系を用いて、逆相Ｃ−１８カラム（カリフォルニア州へスベリア所在のヴ イタック社製４．６×２５０、ａｍ）上、高圧液体りＯマドグラフィ（ＨＰＬＣ ）により８５％より高いことが測定された。１００ｄの８２０と０．０５ｔｄノ ＣＩｈ　ＣＯ２Ｎ　トラ含有Ｔル１１ｉ［液Ａ、１Ｆ６０ｄ）Ｈ２０、！：４０ ｔｉｒｌｆ）ＣＨ３ＣＮと０．０５ａｌ！のＣｈ　ＣＯ２Ｈとを含有する溶離液 Ｂ０この系を、ウォーターズアソシエイッ社（マサチューセッツ州ミルフォード 所在）製のＨＰＬＣシステムにおいて、３０分間、１０％Ｂ〜８５％Ｂ線型“勾 装置Ｉ！ｆ！／１ｌｌｉｎで溶離させた。検出は２１５ｎｍで行い、主対称ピー クは１１．４分に検出された。このピークは、粗ペプチド含徂の８５％を集積し 、（ＮＡＮＰ）３に対する正確なアミノ酸比を含有していた。

調製的な精製（６０１ｆｔｇ）を、２．５Ｘ３０ｃｍのマイケルミラーカラム上 で低圧液体クロマトグラフィーにおいて行った。

溶離系は、溶離液Ａ　（７１２，５ｉｄのＬｏ、３７．５＆！のＣ１’３ＣＮ及 ヒ０．３７５ｄ（７）ＣＦ３ＣＯ２Ｈ）　７５０１ｄｌと溶離液Ｂ（４８０ｄの Ｈ２０、３７、５ｍ（７）Ｃｈ　ＣＮ及（Ｆｏ　、　４ｍ）ＣＦ３ＣＯ２Ｈ）　 ８００ａ！からなっていた。この系を１．５ｄ／ｍｉｎでＦ８ｔｌｉさせた。Ｌ ＤＣポンプにより、溶離液Ｂの線型勾配Ｏ〜１００％において、５ｍ！／ｎ＋ｉ ｎで両分を集めた。検出は２１５ｒｌｌＯで行い、主要な対称ピークは両分４３ 〜５７間で検出された。

この両分を集め、ＣＦ３ＣＯ２Ｈを澗ＮＨ４０ＪＣより中和し、ＣＨ３ＣＮを減 圧で除去した。水性部分を凍結乾燥した。

精製したペプチドは、逆相高圧液体クロマトグラフィー（ＨＰｔＣ）において、 単一の対称ピークを与えた。アミノ酸分析において、ペプチドはＡｓｐ　：　Ａ ｌａ　：　Ｐｒｏ比２．０２　：　１　：０．９９（理論比２：１　：１）を与 えた。調製的なスケール（ｐｒｅｐａｒａｔｉｖｅ　５ｃａｌｅ　）の結果は、 シンセサイザーにおけるカップリング工程を最適化し、これによりコンピュータ のプログラムを作成するために用いた。

ａ　：　Ａｃ−Ｃｓ−ｔｌＡｔ４Ｐ　−ＯＨＵＣ５（ＮＡＮＰ　−０ＨＢｏｃ− Ｐｒｏ−ヒドロキシメチルー：　１の４８ｏｃ−Ｐｒｏ−ＯＨ（２０，６６１９ ６ミリモル）とＤＣＣ（９゜８９１４８ミリモル）をＤＭＦ中で１時間反応させ 、濾過し、生じた予備形成対称酸無水物を、４−ジメチルアミノピリジン（０， ５８６ｇ：４．８ミリモル）の存在下、ヒドロキシメチルー樹脂（２０ｇ：　０ ．８ｍｅｇ　／９　；　１６ミリモル）に添加する。このスラリーを室温で２４ 時間振盪する。アリクラオート（約５０Ｒ９）を封管中プロピオン酸／ＨＣｆ　 １：１　１ｍを用。

いて１５０℃で加水分解する。アミノ酸分析の結果、置換レベルは０．３６ミリ モル／ｇである。この樹脂を、ＣＨ２Ｃ１ｚ　：ピリジン（４００ｔｄ：　１２ ．９４ｄ）中で撹拌し、塩化ベンゾイル（１８，７５４１６０ミリモル）を添加 し、０℃で３０分間撹拌を続け、更に室温で１時間撹拌する。反応混合物を濾過 し、ＣＨ２（Ｊ２　（３Ｘ３５０ｍｅ）、ＤＭＦ　（２ｘ３５０ｄ）、Ｃ１２Ｃ １ｚ　（２ｘ３５０ｄ）、Ｈｅ０Ｈ（２Ｘ３５０Ｉｄ）で洗浄し、減圧乾燥する と旦　２１．６９を得る。

Ｐｒｏ−ヒ゛ロ　シ　ルー１ Ｂｏｃ−Ｐｒｏ−ヒドロキシメチル−樹脂１　（２１ｇ：０．３６ｍｏｌ　／ｇ ：　７．５６ミリモル）をＣＨ２Ｃ１２６００ｔｔｄｌで洗浄し、５０％のＴＥ Ａ−ＣＨ２（Ｊ２３００ｔｄで１時間脱保護し、ＣＨ２Ｃｆ２３００ｄで洗浄し 、再度、５０％ＴＦＡ　−Ｃｔ１２Ｃ１２３００ｔｎｌで２０分間脱保護する。

反応混合物をＣＨ２Ｃ１２３００ｍＡで４度洗浄し、８％ＤＩＥＡ　−ＣＨ２Ｃ １２３００ｒｉｄｌで２度（各５分間）　、ＣＨ２Ｃｌ２３００ｄで２度、２− プロパツール３００ｄで２度、ＣＨ２Ｃ１２３００ｕｄｌで６度洗浄することに より中和する。

Ｂｏｃ−へ５ｎ−Ｐｒｏ−ヒドロキシメチル−６３Ｂｏｃ　−Ａｓｎ−ＯＨ（７ ，０２ｙ、３０．２４ミリモル、４．０ｅｑｕｉｖ、）を、ＣＨ２Ｃ１ｘ　３０ ０−中でＰｒｏ−ヒドロキシメチル−樹脂（２，７，５６ミリモル）に添加し、 ５分間激しく撹拌する。ジシクロヘキシルカルボジイミド ４ミリモル、　４．　Ｏｅｑｕｉｖ．）を添加し、撹拌を６０分間続ける。

ジイソプロピルエチルアミン（３Ｉｌｌｉりを添加（体積で１％）し、撹拌を、 更に、１５分間続ける。反応混合物を濾過し、ＣＨ２　（Ｊ２　３００ａｆ！で ３度洗浄する。樹脂のアリクウォット（約１．５１ｔｇ）を取出し、下記のよう なニンヒドリン反応でモニターする。

ペプチド−樹脂を小さな試験管にいれ、溶液Ａ．Ｂ及びＣ〔溶液Ａ　：　ＥｔＯ ８１　０ｄ中ニンヒドリン５００■；溶液Ｂ　：　ＥｔＯＨ２　０Ｏａｆ中フ工 ノール８０ｇ：溶液Ｃ：ピリジン１００ｄ中０．００１８ＫＣＮ２ｍ）の各３滴 で処理する。試験管を９５〜１００°に５分間加熱し、ビーズ及び溶液を目視に より検査する。ニンヒドリン反応がポジティブであり、青色溶液又は青色ピース が得られれば、ペプチドカップリング反応が不完全であることが検出される。ニ ンヒドリン反応がポジティブであれば、全カップリング反応サイクルを繰り返す 。

＾ｃ−Ｃ　ｓ　Ｄｍｂ　−Ａｓｎ−Ａｌａ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ−Ａｓｎ−Ａｌａ− Ａｓｎ−Ｐｒｏ−Ａｓｎ−Ａｌａ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ−ヒ゛ロ　シメ　ルー′″　 ４ Ｂｏｃ　−ＡＳＪＩ−Ｐｒｏ−ヒドロキシメチル−樹脂３　（７．５６ミリモル ）をクラフトシェーカー（にｒａｆｔ　Ｓｈａｋｅｒ）に付いた１０００ｍの反 応容器に入れ、洗浄し、脱保護し、工程２において具体的に説明した中和操作を 行う。次いで、カップリング反応と洗浄とを、工程３において具体的に説明した ＤＤＣ操作によりＢｏｃ−アミノ酸（又はＨＯＢＴ−エステルを経由して）３０ ．２４ミリモル（　４　ｅｑｕｉｖ．　）で下記に示す順序で行う。

１　１１　Ａｌａ　１１．５ｇ　ＤＣＣｌｏ　２　１０　Ａｓｎ　３５．Ｏｇ　 ＨＯＢｔ−Ｅｓｔｅｒ３　９　Ｐｒｏ　２２．０ｇ　ＤＣＣ ４　８　Ａｓｎ　２１．Ｏｇ　ＨＯＢｔ−Ｅｓｔｅｒ５　７　Ａｌａ　１１．５ ｇ　ＤＣＣ ６　６　Ａｓｎ　２８．Ｏｏ　ＨＯＢｔ−Ｅｓｔｅｒ１５　７　５　Ｐｒｏ　１ ９．５ｇ　ＤＣＣ８　４　Ａｓｎ　３５．Ｏｇ　ＨＯＢｔ−Ｅｓｔｅｒ９　３　 Ａｌａ　１７．２ｇ　ＤＣＣ ｌｏ　２　Ａｓｎ　３５．Ｏｇ　ＨＯＢｔ−Ｅｓｔｅｒｌｌ　１　Ｃｙｓ（Ｄｍ ｂ）　３１．０（ｌ　ＤＣＣ修飾したプロトコールを、１−ヒドロキシベンゾト リアゾール（）ＩＯＢｔ）−ジシクＯへキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）カップ リング操作に対して用いる。これらの場合、別のフラスコ中のＤＨＦ３００ａｅ にＢｏｃ−アミノ＠　（　４　ｅｑｕｉｖ．　）を溶解させ、１−ヒドロキシベ ンゾトリアゾール（５．０９ｇ，３３．２６ミリモル，　４．４ｅｑｕｉｖ．） と４５分間反応させる。反応混合物を（ジシクロへキシルウレアを除去するため に）濾過し、ペプチド樹脂に加え（これに先立って、ＤＨＦ３００ｍで洗浄し、 これに続いて、ＨＯＢｔ−エステルを添加する。）、１時間撹拌する。

洗浄サイクルは、ＤＤＣ−カップリング操作のためのプロトコールに対しても、 その他の場合と同様である。１１のカップリング反応及び最終的な５０％ＴＦＡ 　ＣＨ２　Ｃｌｚによる脱保護が完了した後、ＣｙｓのＮ　アミノ酸を無水酢＆ ｉ（１５０Ｉｄ）：ピリジン（１５０ｍ）の溶液で１時間アセチル化する。

ペプチド−樹脂４は、ＣＨ２　Ｃｊｚ　３　０　０ｒｎｌｌで最終的に４度洗浄 し、減圧乾燥すると４　２０．５９を生成する。

ＡＣ−ＣＳ−ＡＳｎ−＾Ｉ　ａ−Ａ　ｓｎ−Ｐ　ｒｏ−Ａｓ　ｎ−Ａ　Ｉ　ａ− Ａｓｎ−Ｐ　ｒｏ−Ａｓｎ−Ａ　Ｉ　ａ−Ａｓ　ｎ−Ｐ　ｒ潤|Ｏ Ｈ　Ａｃ−Ｃ　ｓ　ＮＡＮＰ　−ＯＨ　５ペプチド−樹脂４の一部（１０．５９ ）をＨＦ反応容器に入れ、ジチオエタン１０．５ｄを添加する。液体ＨＦ（９４ ．５＃１１りを反応容器内に凝縮させ、撹拌を０℃で１時間続ける。減圧下での 蒸発乾燥に続いて、残漬をＥｔｏＡｃ　５　０　０　ｄ．で処理し濾過する。

沈殿をＴＥＡ各８０ｒｄで４度抽出し蒸発させる。オイル状の残漬を無水エーテ ル３００ｍｇ４度すりつぶし、減圧乾燥すると粗製の旦　１．９８９を得る。

粗製の旦　１．９８ｇをＨＦ０（０．１％ＴＦＡ含有）３０Ｉｌｌ！！に溶解し 、０．８μのＴｙｐｅ　ＡＡミリポアフィルタ−で濾過し、０、４５μのＴｙｐ ｅ　ＨＡミリポアフィルタ−で再濾過する。濾液（総体積４５ｄ）をヌクレオジ ル（Ｎｕｃｌｅｏｓｉｌ　）　（：、ＴＢ逆相カラム（　２　、　５　４　Ｘ　 ２　５　ｃｍ　）　（予め５％のアセトニトリル（０．１％ＴＦＡ含有）−ＨＦ ０　（０．１％ＴＦＡ含何ンで平衡にさせたもの）に載せる。このカラム°を、 グラディエンドマスター（　Ｇｒａｄｉｅｎｔ　Ｍａｓｔｅｒ　）とスペクトロ モニター■ディテクター（ＳｐｅＣｔｒｏｍｏｎｉｔｏｒ　’ｆＪＪ　Ｄｅｔｅ ｃｔｏｒ　）とを具備したＬＤＣ　：ＩンスタメリックＩ［　Ｇ　（ＬＤＣ　Ｃ ｏｎｓｔａｍｅｒｉｃ　Ｉｆ　Ｇ）及びＬＫＢフラクション　コレクター（１に Ｂ　Ｆｒａｃｔｉｏｎ　Ｃｏｌｌｅｃｔｏｒ）を用いて５％アセトニトリル〜２ ５％アセトニトリルの線型勾配のアセトニトリル（０。

１％ＴＦＡ含有）−水（０．１％ＴＥＡ含有）からなる溶媒系で流速５Ｉｎｉ／ ｍｉｎで溶離する〔セッティング二波長：２１５ｎｍ：レコーダスピード：　１ 　ｍ／ｍｉｎ　；感度：　２．　ＯＡＵＦＳ：フラクション：１ｍｉｎ　（５ｄ ）／フラクション）。

アリクウォットを、グラディエントマスタースベクトロモニター１［　（Ｇｒａ ｄｉｅｎｔ　Ｍａｓｔｅｒ　Ｓｐｅｃｔｒｏｍｏｎｉｔｏｒ　ｌ［　Ｄｅｔｅｃ ｔｏｒ　）とミクロメリティックス　７２５　オートインジェクター（Ｈｉｃｒ ｏｍｅｒｉｔｉｃｓ　７２５　Ａｕｔｏｉｎｊｅｃｔｏｒ）とを具備したＬＤＣ 　：ｌンスタメトリック　ｌ［　Ｇ　（　ＬＤＣ　Ｃｏｎｓｔａｍｅｔｒｉｃ　 ■Ｇ）を用いてＨＰＬＣで分析する〔セッティング二波長：２０６ｎｍＨ力ラム ：ジクロゾルブ（　Ｌｉｃｈｒｏｓｏｒｂ）　ＲＰ　−　８　（　５μ）；溶離 液ニアセトニトリル−〇．　１）４　ＨＣｊＯａ　（ｐＨ２．　５）　；勾配二 線型，８％〜２０％アセトニトリルで２０分；感度：Ｑ，　２ＡＩＩＦＳ）。生 成物は５５〜６５両分中に現われ、これを合わせて蒸発させ、凍結乾燥すると純 生成物５７７〜が得られる。サイドバンド（画分５０〜５４及び６６　〜７０． ４２１ｍｇ）も得られる。収量：　９　１　４ｍｇ（１９．６％）。

アミノ酸分析（６ＨＨＣｊ：１５０°、Ｉｈ　）：Ａｓｐ、５．８５：ｐｒｏ、 ３．０２．Ａｌａ、３．１１　：Ｃｙｓ、１．１３〔α）　−１６３，９°　（ Ω　０．　８６．　０．　２Ｎ　Ａｃ０ＩＩ）（＋）ＦＡＢマススペクトロスコ ピー（６にｖ）：計算値　Ｃｓ３Ｈ８１Ｎ１９０２ｏ、　Ｓ　１３５２．５６測 定値　１３５２ Ｈ−ＮＨＲスペクトロスコピー（ＤＨ３Ｏ−ｄ　ｓ　）　：　１．１８　（３Ｈ 。

ｄ、Ｊ＝７Ｈｚ、ＡＩａのＣＨ３＞、　１．２２　（６Ｎ　、　ｄ　、　Ｊ　＝ ７Ｆｌｚ。

ＡＩａの２ＸＣＨ３）　、　１．８９　（３Ｈ、ｓ　、　ＮＡＣ）ＨＰＬＣ分析 二カラム、　Ｌｉｃｈｒｏｓｏｒｂ　ＲＢ　−８（５μ）：溶離液、　（Ａ）　 ０．１８　ＨＣＲＯ４（１）８２．５）　（Ｂ）アセトニトリル５％（Ｂ）〜１ ５％（Ｂ）の３０分線型勾配検出、２０６μｍ。

測定純度　９５％以上（保持時間＝２３分）Ｈ−Ｃ５−ＡＳｎ−＾１ａ−八５ｎ −Ｐｒｏ−Ａｓｎ−Ａ　Ｉａ−ＡＳｎ−Ｐｒｏ−ＡＳｎ−Ａ　Ｉａ−八５ｎ−Ｐ ｒｏ−ＯＨＣ５（ＮＡＮＰ　−０ｆｆ　６ ５０％ＴＦＡ−ＣＬ　Ｃｆ　２で脱保護したがＮ　−アセチル化していないペプ チド−樹脂（ユから）の１ｇ部分をＨＦ開裂させ、互におけると同様にワークア ップした。収量：１９２１１１＃粗生成物を旦におけると同様にしてＨＰＬＣで 精製した。混合物をＮｕｃｌｅｏｓｉｌ　Ｃｙ３逆相カラム（２、５４Ｘ　２５ 　ｃｍ　）に載せ、このカラムをアセトニトリル（０，１％ＴＥＡ含有）・−水 （０，１％ＴＦＡ含有）からなる溶媒系で７％アセトニリル〜２２％アセと全く 同様にしてモニターした。生成物は画分８６〜９３に現われ、これを集め、蒸発 させ、凍結乾燥するとＣｙｓ（ＮＡＮＰ）　３−ＯＨ６１，２１１？９（０，０ ４７ミリモル、１２．７％）が得られた。

サイドバンド（画分８４〜８５及び９４〜９７．１９．２■）も得られた。全収 率：１５．５％ 生成物は、前述したＨＰＬＣシステムで均一　（保持時間：１８分）であること が示され、予想されるアミノ酸絹成（６８ＨＣｆ−丁ＧＡ：１１０°　：２４ｈ ）が得られた。

Ａｓｐ　、　５．９６＋Ｐｒｏ　、　３−１３　：ＡＩａ　、　３−０７・　２ ：、−、ｉ フランス国パリ所在のバスツールインスティチュート（Ｐａ５ｔｅｕｒ　Ｉｎ５ ｔｉｔｕｔｅ　）によって得られた流体のチタヌストキソイド（ＴＴ）を蒸留水 に対して４８時間透析し、凍結乾燥した。ヒトのワクチンとして使用するのに好 適な、部分的に精製したチタヌストキソイドもノースカロライナ州トライアング ルパーク所在のバロットウェルカムリサーチ（Ｂｕｒｒｏｕｇｈｔｓ　Ｗｅｌｌ ｃｏｍｅ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ）又はペンシルバニア州フィラデルフィア所在のア ムホームブロダクツコーポレーション（Ａｍ、Ｈｏｍｅ　Ｐｒｏｄｕｃｔｓ　Ｃ ｏｒｐ、　）　（７）ワイスラボラトリーズディ７　（Ｗｙｅｔｈ　ｒａｂｏｒ ａｔｏｒｉｅｓ　Ｄｉｒ）から市販されている。

ＴＴ　（１ｍ９／ｒａｉｌ　）と（ＮＡＮＰ）　３　（１！ｒｔｇ／ｄ）　ト（ Ｄ等体積ヲａ合した。０．３７％のグルタルアルデヒド水溶液を添加して最終濃 度を０．０２％とした。室温で６時間インキュベートした後、混合物を蒸留水に 対して４８時時間分透析し、凍結乾燥した。

重合したトキソイド及びペプチドは６８〜８０暑簗％回収した。

調製物は、ＨＰＬＣ分析により、遊離のペプチド含有率が１％以下であった。

得られた物質をリン酸緩衝生理食塩水（１）１１７．４）２ｄに再懸濁し、冷蔵 庫中に保存した。

ふたつの抗原ロフトはこのようにして調製され、Ｆｒｅｕｎｄのアジュバント（ 完全又は不完全）の存在又不在において１．０又はＯ，ＩＩｎｇの蛋白質を有す る兎群を免疫処置するために使用した。

ｙ６３：処 兎（２〜２．５７（ｙ＞の後足パッド及び大腿裏側の筋肉内に、実施例２のワク ヂン調製物総量２ｄを、一方はＦｒｅｕｎｄアジュバント（完全及び不完全）に 乳濁させ、他方はＰＢＳに稀釈して注射した。注射した蛋白質の総量は兎−四当 たり１Ｈｇ又は０．１■であった。アジュバントを使用しない場合には、同ｍの ワクチンブースターを、最初の注射から２週間後皮下投与した。アジュバント混 合物は実施例２において記載した等体積のワクチンを（２■／ｄの濃度で）アジ ュバントに乳濁させることにより調製した。

兎は免疫処置の後４週間で出血した。

−４：　）析（ＩＲＨＡ フレキシブルなポリ塩化ビニル製のマイクロタイタープレート（ＩｎｉＣｒＯｔ ｉｔｅｒ　ｐｌａｔｅ）で５０μｇ／ｍｇの牛血清アルブミン〔放射−免疫分析 規格、ミズリー州セントルイス所在のシグマケミカルカンパニーインク（Ｓｉｇ ｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ、１ｎｃ、）社製〕１５０μノを３７℃で４時間 インキュベートした。リン酸緩衝生理食塩水（＋）８７．４）で装置洗浄した後 、１００μｇ／ｄ（ＮＡＮＰ）　３と０．２５体積％のグルタルアルデヒドとを 含有する溶液２０μノをウェル毎に入れ、室温で２時間インキュベートした。こ のウェルをＰＢＳで３度洗浄し、１％の牛血清アルブミン（ＢＳＡ）と０．５８ のエタノールアミンとを含有するＰＢＳｌ　５０ｕＪ　トトモに：ｌ］Ｈ７，５ （ＰＢＳ−ＢＳＡ−Ｅｔｈ緩衝液）チー晩インキュベートした。

兎の血清試料（注射後４週間で得られた。）を、０．５％のＴｗｅｅｎ　−２０ を含有する緩＠　ＰＢＳ−ＢＳＡ−Ｅｔｈで稀釈し、この３０μノを各ウェルに 入れる。室温で１時間インキュベートした後、各ウェルを、０．５％Ｔｗｅｅｎ 　−２０（プラウエア、ウィルミントン所在のアイシーアイアメリカインク（Ｉ ＣＩ　Ａｍｅｒｉｃａ　Ｉｎｃ、）製〕を含有するＰＢＳ−ＢＳＡ−Ｅｔｈで３ 度洗浄し、非結合物質を除去した。

１２５〔工〕で標識した親和性精製山羊抗−兎免疫グロブリン（インシアナ州エ ルクハート所在のマイルスーイエダ製）３０μ、ｆ（７Ｘ１０’カウント／分） を各ウェルに入れ、結合した抗血清を標識した。各ウェルを洗浄し、カットして カウントした。

免疫放射分析の結果を第１図〜第３図に示した。

第１図において、抗体力価（ＩＲＨＡにおいて１１０３ｃｐを与える血清稀釈液 として定義される。＞ｉ、ｏｏｏ〜１０．０００が不完全なＦｒｅｕｎｄアジュ バントにおいて抗原（（ＮＡＮＰ）　３−ＴＴ）１Ｒｇで免疫処置された兎６匹 に見い出された。複合体ワクチンロットはともに同様に有効であることがわかる 。ロット１の兎の抗血清は、第１の兎に対する白丸、第２の兎に対する黒マル及 び第３の兎に対する白い正方形で表わされる。ロット２の兎の抗血清は、熱い三 角形、白い直立した三角形及び白い逆三角形でそれぞれ表わされる。

完全なＦｒｃｕｎｄアジュバントにおける（ＮＡＮＰ）　３−ＴＴで免疫処置す ることによって得られた抗血清を用いて行われた免疫放射分析の結果は同様であ った（図示せず）。

予備免疫性兎血清を用いるコントロール免疫放射分析はネガティブな結果（バッ クグラウンド上３０ＣＩ）ｍ）を与えた。

第２図は、抗体（（ＮＡＮＰ）　３−ＴＴ）　０．１１ｎｇをＦｒｅｕｎｄのア ジュバントとともに３匹の兎に注射した場合に得られる抗体力価を示す。血清力 価は３２０〜８０であった。予備免疫性兎血清はネガティブであった。

第３図は、抗体０．１１ｆｆをＦｒｅｕｎｄアジュバントを存在させることなく 注射した場合に得られる抗体力価を示す。力価は８０〜ｉＱｃｐｍの範囲であっ た。更に、予備免疫性兎血清もネガティブであった。プレートをペプチドのみで 被覆した場合には、反応性は観察されなかった。残留した血清の力価は、免疫処 置接受なくとも１０週間は実際上変化しなかった。

上記結果によれば、チタヌストキソイドと接合した（　ＮＡＮＰ　）３を、好ま しくは、アジュバントに乳濁させて用いると効果的な免疫処置を起こすことが可 能であることがわかる。生成される抗体の俤は、注射した抗原の岸とともに増大 する。ドデカペプチド（ＮＡＮＰ）　３を認識する抗スポロゾイト抗体は、アジ ュバントが存在しなくとも生起する。

宇　１５：　接・な 実施例４の免疫放射分析において用いたのと同じ兎の血清を、熱帯熱マラリア原 虫のグルタルアルデヒド−固定スポロゾイトの表面膜との反応性に対しても分析 した。

免疫蛍光分析は、Ｎａｒｄｉｎ、Ｅ、旧らの（１９７９）　５ｃｉｅｎｃｅ　２ ０６：５９７において開示されている。固定した寄生体調製物は、０．１％のグ ルタルアルデヒドを用いて室温で１０分間インキュベートすることによって得ら れた。このスポロゾイトを洗浄し、３〜５Ｘ１０”／ｄの濃度に再懸濁した。ス ポロゾイトを多重ウェルスライドに分散し、風乾し、−７０℃で貯蔵した。　こ の結果を要約して第１図〜第３図に挿入する。抗体力価（免疫蛍光法によって得 られた）とｒＲＨＡにおいて得られた抗体力価との相関関係はＳｐｅａｒｍａｎ のランク相関係数により極めて顕著（＋）＜０．００１）であった。

６：　に　ぼす　ＮＡＮＰ　の （ＮＡＮＰ）　３の濃度を増加させてインキュベーション混合物の抗血清に添加 した以外は実施例４の分析を繰り返した。

本発明の複合体に対する兎の抗血清の一定（１／１，０００＞の稀釈液を、（Ｎ ＡＮＰ）　３の血清による稀釈液を用いてインキュベートした。（ＮＡＮＰ）　 ３は兎の抗−複合体抗血清とウェルに結合した（ＮＡＮＰ）３との間の免疫化学 反応を効果的に抑制する。

結果は、第４図に示したように、ペプチド−抗血清反応の特異性を示す。

更に、活性なＣ８蛋白質と反応した抗−複合体抗体の割合を測定するために免疫 放射分析を行った。

この分析においては、熱帯熱マラリア原虫スポロゾイト抽出物の濃度を増大させ て存在させ、複合体に対する兎の抗体の一定の稀釈液（１／１００）を用いた。

第６図において示したように、抗体の結合した（ＮＡＮＰ）　３との反応性は、 約３０％のコントロール（スポロゾイト抽出物のない）濃度に減少した。このこ とは、抗−複合体抗体の反応性の７０％が熱帯熱マラリア原虫のＣ８蛋白質によ って吸収されたことを意味する。この抑制効果は、プラスモチイウム　ベルガイ （Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ　ｂｅｒｇｈｅｉ　）のスポロゾイト抽出物では観察さ れないので、特異的であった。

−：ニスターン　ブロツテイン　（Ｗｅｓｔｅｒｎ　Ｂｌｏｔｔｉｎ抗−複合体 抗血清のＯ８蛋白質及びその前駆体との反応性を測定するために−ｅｓｔｅｒｎ 　Ｂｌｏｔｔｉｎｇを用いた。

Ｗｅｓｔｅｒｎ　Ｂｌｏｔｔｉｎ（＋は、以下のようにして行った。

スポロゾイト抽出物を１０％の硫酸ドデシルナトリウムアクリルアミドゲル中で 電気泳動させた。分離された蛋白質を電気泳動的にニトロセルロースに移動させ た（　Ｔｏｗｂｉｎ、　Ｈ，らによりＥｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｔｉｃ　Ｔｒａ ｎｓｆｅｒ　ｏｆ　Ｐｒｏｔｅｉｎｓ　ｆｒｏｍ　Ｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄ ｅＧｅｔｓ　ｔｏ　Ｎ１ｔｒｏｃｅｌｌｕｌｏｓｅ　５ｈｅｅｔｓ　（米国Ｈ学 アカデミー誌か：４３５０〜４３５４　（１９７９）　）に開示されている如く 。）。このニトロセルロース紙を５％のＢＳＡと１０％の正常山羊血清とを含有 するＰＢＳを用いて３７℃で２時間飽和させた。種々のレーンを切り取り、各レ ーンを以下のようにインキュベートした＝（１）全熱帯熱マラリア原虫抽出物に 対する兎の抗血清とともに；（２）抗−（（ＮＡＮＰ）　３−ＴＴ）　（完全な Ｆｒｅｕｎｄアジュバントを用いた免疫処置による）とともに；（３）正常な予 備免疫兎血清とともに；及び（４）不完全なＦｒｅｕｎｄアジュバントで免疫処 置された抗−（（ＮＡＮＰ）　３−ＴＴ）とともに。全熱帯熱マラリア原虫スポ ロゾイトに対する抗血清はコントロールとして用いた。

１％ＢＳＡを含有するＰＢＳで十分に洗浄した後、このストリツ温で２時間イン キュベートした。ストリップを洗浄し、乾燥し、オートラジオグラフィにさらし た。結果を第５図に示す。ふたつのトップハンドはＣ８蛋白質の細胞膜内前駆体 （６７，０００Ｈｒ）と膜（５，８０００８ｒ）形態に相当する。更にいくつか の低Ｈｒ（恐らくは蚊由来１＊の）の未同定の抗原が全熱帯熱マラリア原虫スポ ロゾイトに対する抗血清によって出現する（レーン１）〔尚１＊は熱帯熱マラリ ア原虫スポロゾイトに感染した蚊の唾液腺に由来する粗製の夾雑物によって兎が 免疫処置されたことによる。〕。予想された如く、抗−熱帯熱マラリア原虫活性 はレーン３には存在しなかった。

８：　−Ａ　９によるスポロ−イト　和使用した操作は、Ｈｏｌｌｉｎｇｄａｌ ｅ、Ｈ，Ｒ，らによってＪ、　Ｉｍｎ＋ｕｎｏ１．　。

１３２：９０９に開示されている。

−匹の兎の血清に由来する免疫グロブリンをジエチル−アミノ−エチルセルロー ス（ＤＥＡＥ−Ｃａｔ　１ｕｌｏｓｅ）上のりＯＶヒトラフイーにより精製し、 Ｈｏｌｌｉｎｇｄａｌｅの操作（Ｊ、Ｉｕｕｎｏｌ、　１３２　：９０９　（１ ９８４））に従って、スポロゾイトのｉｎ　ｖｉｔｒｏニおける中和実験に用い た。パライサイトは、熱帯熱マラリア原虫の血液工程の培養物を供給する膜によ って感染した実験室養育蚊の唾液腺から得られた。唾液腺を熱不活性化したヒト 血清中に集め、すりつぶして破壊し、カウントした。実験は全て、ヒトのへバト ーム〔メリーランド州ロックビル所在のアメリカンタイプカルチャーコレクショ ン（Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｏ１ｔｅｃｔｉｏｎ）か ら入手されるＨｅｔｔ　Ｇ２−ＡＩＧ）細胞で行い、１％のヒト血清を加えたＥ ａＱｌｅの最小必須媒体にューヨーク州グランドアイランド所在のＧＩＢＣＯ社 製）中で培養した。

結果を下記第１表に要約した。

第　■　表 この表から明らかなように、免疫性兎１ｇＧは投与量依存性のパラサイトの成長 を抑制した。全ＩＱＧが２μ９／ｒｄ以下のような低濃度（このうち１０％以下 が（ＮＡＮＰ）　３特異蚊抗体である。

〕であっても極めて強い中和（４０〜８０％）が生じた。抗−複合体抗体を、吸 着剤として（ＮＡＮＰ）　ｚを用いる免疫親和性クロマトグラフィーによりその ＩｇＧから除去する場合には、パラサイト成長における抑制は観察されなかった （実験＃４）。ＩｇＧ画分からの抗ペプチド抗体の除去は、実施例４の方法に従 い、免疫放射分析によって確認された。

：ヒトー　による、　熱マラリア、　に・　る　ＮＡＮＰＬ夏塁１ ヒト抗体も熱帯熱マラリア原虫Ｃ８蛋白質の反復エピトープを認識するかどうか を測定するために、かかる抗体の（ＮＡＮＰ）３との反応性を試験した。

西アフリカ、（風土病地域）のガンピア人５８検体の血清とニューヨーク市の健 康な血液供与者２９検体（非風土病地域）からの血清とを、（ＮＡＮＰ）　２を 認識する抗体の存在についてＩＲＨＡにより分析した。第２の抗体を１２５（Ｉ ）で標識し、アフィニティー精製した兎　抗−ヒトＩｇＧ　（特異活性的５ｘ１ ０７ｃｐｍ／μｇ）を用いた以外は実施例４の分析を使用した。

免疫グロブリンクラスを測定するために第２の抗体を用いた＝１２５〔■〕で標 識し、アフィニティー精製した山羊　抗−ヒトＩｇａ　（ガンマ）又は抗−ヒト Ｉ（１Ｎ　（ミュー）は、いずれもメリーランド州ガイチルスパーク所在のカー クガードアンドベリーラボラトリーズ（Ｋｉｒｋｅｇａａｄ　＆　Ｐｅｒｒｙ　 Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）社製。

抗体のウェルに対する非特異的結合を、ウェルから（ＮＡＮＰ）３を除去するこ とによって得られる各個々の血清試料について測定した。コントロールウェルに おけるｃｐｍの数は、３００〜８００　（１／１０の血清稀釈液について）であ った。非特異的ｃｐｍを実験結果から差引いた。その差（特巽的結合）がＣｐｌ である。

正常な血清の１０倍稀釈した平均ｃｐｍは、２５９±１５５であった。この値、 プラス又はマイナス−３標準偏差（７２４ＣＤＩ）を正常な領域と定義した。

分析結果を第７図にプロットする。

風土病地域におけるポジティブな血清（ｃｐｍ＞７２４）のパーセンテージは年 齢とともに増大し、子供（１〜１４才）では２５％であって、３４才以上の大人 では８４％である。最もポジティブな血清は１／２００以上の力価を有した。抗 体のタイプはＩＱＧであった。

抗血清−（ＮＡＮＰ）　３の反応の特異性は、実施例４の抑制分析、即ち、抗血 清の（ＮＡＮＰ）３を用いる予備免疫（５０μｇ／ｄ）によって試験した。結果 を第８図に示す。

抗体ペプチド結合は、流体層における（ＮＡＮＰ）　３の存在により完全に抑制 された。これとは対照的に、無関係な合成ドデカペプチドが存在すると（Ｐ、　 Ｋｎｏｗｌｅｓｉの反復エピトープに相当する。）、抗血清−（ＮＡＮＰ）　３ 結合をうまく抑制できなかった。

１０　：　か　＝　ＩＦＡ 熱帯熱マラリア原虫の表面膜に対するヒト抗体のＩＦＡによる検出は、実施例５ の方法に従って行った。この目的は、（ＮＡＮＰ）３を認識しないヒト抗体の割 合を知ることである。

２０才以上のマラリア風土病地域に生存する個々の抗体からランダムに選択した ＩＲＨＡ−ネガティブ及びＴＲＨＡ−ポジティブ血清について、拮抗（ＮＡＮＰ ）　３の存在（５０μｙ／ｄ）又は不在において抗体のスポロゾイトに対する特 異性を試験した。結果を下記第■表に要約する。

第　■　表 Ｇ、２．　９２０１　４０９６　３２０１ＤＡ　４８５１　１２８０　＜２０ ８０１７　３５３９　６４０　＜２０ ７９３０　３５０１　６４０　＜２０ ７９７９　３３１１　６４０　＜２０ ７９７３　２７３５　３２０　＜２０ Ｐ−２２４７３３２０＜２０ Ｐ−５２０２４３２０＜２０ ８０１２　１７６５　６４０　＜２０ 正常　１６３　〈１０　Ｎ、　０゜ ７９８１　１６８　（１０Ｎ、０゜ ８０７４　１３３　２０　Ｎ、Ｄ。

７８７８　９６　く１０　Ｎ、Ｄ、 Ｐ−１２７５＜１０　Ｎ、０゜ ８３１２　７２　＜ｉｏ　Ｎ、Ｄ。

Ｐ−１１−１３＜１０　Ｎ、０゜ ８２８６　−９１　２０　Ｎ、０゜ ７９０７　−１０３　＜１０　Ｎ、Ｄ。

免疫放射分析の結果は、ＩＦＡ　（ｐ＜０．００１　）の結果と極めて相関関係 にあった（　ｓｐｅａｒｍａｎのランク相関試験）。（ＮＡＮＰ）３が存在する とＴＲＨＡポジティブな血清の力価を実質上減少させた。

実施例９及び１０の結果は、免疫放射分析（及びそれ故に、熱帯熱マラリア原虫 の表面抗原のみを認識する。）によって検出されるヒト抗体の大部分が、事実上 、熱帯熱マラリア原虫のＣ８蛋白質の免疫支配性エピトープに対するものであり 、（ＨＡＮＰ）　、をａ　Ｈした。これらの結果もまた、ヒトにおけるＣ８蛋白 質の反復エピトープの強力な免疫支配を強調するものであった。

これらの８−細胞゛は、１次免疫を与えるか、風土病地域に生存する各人の天然 免疫を増進するための合成ペプチドワクチンに対する応答を可能とすることが期 待される。

Ｆ１ａ　１ ｍ嘴手状度の蓮数 Ｆ１ａ　２ ５，１２０　１．２８０　３２０　８０　２０血浦諭ｇ度の逆数 Ｆ１ａ　３ ｍ潰諦穀度の逆（文 Ｆｌに、４ 流体１中ｆ＞　（ＮＡＮＰ）３　Ｌ１ｇ／ｍｌＦ／に、６ ＃３お掬中のλボロソイト較 Δｃｐｍ（幻ｏ−３） Ｆ／６．８ 国際調査報告

Claims (26)

【特許請求の範囲】
1. １．熱帯熱マラリア原虫のサーカムスポロゾイト蛋白質の免疫支配性エピトープ に対応するアミノ酸連鎖と、ワクチン調製に用いられる担体蛋白質群から選ばれ た担体蛋白質とを有してなる免疫性ペプチド複合体。
2. ２．前記エピトープが、本質的に、アミノ酸連鎖【配列があります】の並列反復 からなる請求の範囲第１項記載の免疫性ペプチド複合体。
3. ３．前記ペプチドが化学的に合成された請求の範囲第２項記載の免疫性ペプチド 複合体。
4. ４．前記ペプチドが、アミノ酸連鎖【配列があります】を有する請求の範囲第３ 項記載の免 疫性ペプチド複合体。
5. ５．前記担体蛋白質が、ジフテリアトキソイド，チタヌストキソイド及びリジン ，アルギニン又はこれらの組合わせを含有するアミノ酸の合成ランダムコポリマ ーからなる群から選ばれる請求の範囲第１項記載の免疫性ペプチド複合体。
6. ６．前記ペプチドがチタヌストキソイドである請求の範囲第４項記載の免疫性ペ プチド複合体。
7. ７．本質的に請求の範囲第１項記載の免疫性ペプチド複合体からなる熱帯魚マラ リア原虫パラサイトに対するワクチン成分。
8. ８．本質的に請求の範囲第２項記載の免疫性ペプチド複合体からなる熱帯熱マラ リア原虫パラサイトに対するワクチン成分。
9. ９．本質的に請求の範囲第４項記載の免疫性ペプチド複合体からなる熱帯熱マラ リア原虫パラサイトに対するワクチン成分。
10. １０．本質的に請求の範囲第６項記載の免疫性ペプチド複合体からなるマラリア に対するワクチン成分。
11. １１．前記エビトープが、本質的に、Ｃ末端からＮ末端に向けて、アミノ酸連鎖 【配列があります】の並列反復からなる請求の範囲第４項記載の免疫性ペプチド 複合体。
12. １２．前記ペプチドが化学的に合成された請求の範囲第１１項記載の免疫性ペプ チド複合体。
13. １３．前記ペプチドが、Ｎ末端からＣ末端に向けて、アミノ酸連鎖【配列があり ます】を有 する請求の範囲第４項記載の免疫性ペプチド複合体。
14. １４．前記蛋白質がチタヌストキソイドである請求の範囲第１３項記載の免疫性 ペプチド複合体。
15. １５．本質的に請求の範囲第１１項記載の免疫性ペプチド複合体からなる熱帯熱 マラリア原虫パラサイトに対するワクチン成分。
16. １６．本質的に請求の範囲第１３項記載の免疫性ペプチド複合体からなる熱帯熱 マラリア原虫パラサイトに対するワクチン成分。
17. １７．本質的に請求の範囲第１４項記載の免疫性ペプチド複合体からなるマラリ アに対するワクチン成分。
18. １８．前記ペプチドが、Ｎ末端からＣ末端に向けて、連鎖【配列があります】を 有する 請求の範囲第１１項記載の免疫性ペプチド複合体。
19. １９．前記ペプチドが化学的に合成された請求の範囲第１８項記載の免疫性ペプ チド複合体。
20. ２０．前記ペプチドが、Ｃ−末端からＮ−末端に向けて、アミノ酸連鎖【配列が あります】 を有する請求の範囲第１１項記載の免疫性ペプチド複合体。
21. ２１．前記ペプチドが化学的に合成される請求の範囲第２０項記載の免疫性ペプ チド複合体。
22. ２２．前記ペプチドがチタヌストキソイドである請求の範囲第１８項記載の免疫 性ペプチド複合体。
23. ２３．前記ペプチドがチタヌストキソイドである請求の範囲第２０項記載の免疫 性ペプチド複合体。
24. ２４．本質的に請求の範囲第１８項記載の免疫性ペプチド複合体からなる熱帯熱 マラリア原虫パラサイトに対するワクチン成分。
25. ２５．本質的に請求の範囲第２０項記載の免疫性ペプチド複合体からなる熱帯魚 マラリア原虫パラサイトに対するワクチン成分。
26. ２６．連鎖【配列があります】 を有するペプチドと担体蛋白質とワクチンアジュバンドとの複合体からなり、哺 乳類を免疫処置するために好適である１熱帯熱マラリア原虫マラリアパラサイト のスポロゾイト段階に対するワクチン。