PT85137B - Processo de preparacao de um polipeptido de composito imunogenico, de melhoramento da imunogenicidade de um imunogenio e de atenuacao da falta de capacidade de resposta a uma vacina do virus da hepatite b - Google Patents
Processo de preparacao de um polipeptido de composito imunogenico, de melhoramento da imunogenicidade de um imunogenio e de atenuacao da falta de capacidade de resposta a uma vacina do virus da hepatite b Download PDFInfo
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Description
MEMORIA descritiva
Campo Técnico do Invento presente invento refere-se à produção de antigénios sintéticos novos relacionados com a proteína do antigénio de superfície do vírus da hepatite B (AgHBs) e à utilização des. ses antigénios na produção de vacinas, reagentes diagnósticos, e semelhantes. Mais especificamente, este invento refe re-se a polipéptidos antigénicos sintéticas que correspondem imunologicamente a uma porção determinante de célula T e célula B do AgHBs.
Antecedentes do Invento
A hepatite virai continua a ser considerada como uma das doenças não conquistadas mais importantes da humanidade.
termo geral, hepatite virai, refere-se principalmejn te à hepatite A (hepatite infecciosa), à hepatite B (hepatite do soro) e à hepatite não-A, não-B, embora outros vírus conhecidos tais como o vírus da febre amarela, o vírus da Epstein-Barr e o citomegalovirus, possam causar hepatite no homem. A hepatite é paticularmente conhecida pela sua lesão focal no fígado (Greek, hepar) mas a doença tem influência também sobre outros órgãos.
Em 1965, Blumberg descobriu um antigénio circulando no sangue de certos seres humanos; (1965) 3. Am. Med. Assoe., 191:541 e (1967) Ann< Int.Med., 66,:924. Esta substância foi subsequentemente descoberta por Prince como sendo o antigénio de superfície do vírus da hepatite B (AgHBs) que é produzido abundantemente por indivíduos que estão infectados de f,orma crónica com o agente virai; (1968) Proc. Natl. Acad. Sei. (USA), 60:814.
antigénio de superfície da hepatite B que ocorre naturalmente (AgHBs) é composto de um polipéptido maior, referido como p25, e a sua forma glicosilada, gp28. Contudo, ’ t ) 66 397
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-3têm sido identificados polipéptidos adicionais de peso molecu. lar mais elevado (p39/gp42 e gp33/gp36); Heermann e col., (1984) J, Virol. 52:396; Stibbe, e col. (1982) Virol 123:436; Machida, e col. (1984) Gastroenterol. 86:910.
A grande estrutura de leitura aberta (ORF) para o AgHBs termina num só cõdao de interrupção mas pode iniciar em cÓdões de iniciação de tradução possíveis, que definem as regiões pre-Sl, pre-S2 e S, dando polipéptidos referidos como p39, p33 e p25, respectivamente. Todos os três polipéptidos partilham os 226 resíduos aminoácidos da região S (p25). 0 p33 consiste da sequência p25 mais 55 resíduos terminais ami no (pre-S2); e p39 consiste da sequência p33 mais 119 resíduos terminal amino (pre-Sl) no sub tipo adtu ou 108 resíduos no subtipo ayui devido a uma rejeição Nh^-terminal de 11 resí. duos; Tiollais e col., (1981) Science 213:406.
AgHBs tem sido matéria de caracterização imunoquími ca extensa. Os estudos serológicos mostram que diversas estirpes do virus da hepatite B (VHB) têm um ou mais determinaji tes em comum, que é designado por .a. Cada estirpe tem também duas outras determinantes: quer d ou y e quer uj ou r> A es. pecificidade do AgHBs está associada com um só polipéptido (Gold e col., (1976) 0. Immunol. 117:1404 e Shih e col., (1978) 0. Immunol, 120:520) cuja sequência total de 226 aminoácidos está estabelecida a partir da sequência nucleótida do gene S (Tiollais e col., (1981) Science, 213:406) do VHB; Valenzuela e col., (1979) Nature (Londres), 280:815; Galibert e col., (1979) Nature (Londres), 281:646 e Pasek e col., (1979) Nature (londres), 282:575.
Existe uma necessidade urgente de uma vacina para ahepatite B para grupos em alto risco de adquirir esta infecção. Estes grupos incluem pessoal dos serviços de saúde e de Laboratório, e indivíduos necessitando (1) hemodiálise de manutenção; (2) transfusões de sangue repetidas ou a administração de produtos do sangue; (3) tratamento com drogas imunossupressoras ou citotóxicas; e (4) tratamento de doenças malignas e alterações relacionadas com depressão da res-
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-4posta imunológica. Em adição, uma vacina é necessária para indivíduos vivendo em certas áreas tropicais em que a infecção da hepatite B é prevalente.
Os virus da hepatite A e B, contudo, não se multiplicam significativamente em cultura celular, e não há qualquer fonte corrente de vírus propagados laboratorialmente para a preparação da vacina. De facto, tem havido uma falha repeti, da para transmitir o vírus da hepatite B (VHB) em série em culturas de tecidos ou de órgãos o que tem impedido o progre£ so em direcção ao desenvolvimento de uma vacina convencional; Zuckerman, (1975) Amer. 3. Med. Sei., 270:205.
Classicamente, é manufacturada uma vacina introduzindo um organismo morto ou atenuado no hospedeiro juntamente com transportadores e/ou adjuvantes adequados para iniciar a res. posta imunológica normal para o organismo enquanto, de forma desejável, evitando os efeitos patogénicos do organismo no hospedeiro. Essa abordagem sofre de diversas limitaçóes bem conhecidas. Tais vacinas são complexas e incluem não só o determinante antigénico (imunogénico) de interesse mas muitos materiais nocivos relacionados e não relacionados, qualquer quantidade dos quais pode, nalguns ou em todos os indivíduos, induzir uma reacção indesejável no hospedeiro.
Por exemplo, vacinas produzidas da forma clássica podem incluir imunogénios competitivos que são negativos para a resposta imunológica desejada, imunogénios que induzem res. postas imunológicas não relacionadas, ácidos nucleicos do ojç ganismo ou da cultura, endotóxinas e constituintes de fonte e composição desconhecida. Estas vacinas, produzidas a partir de materiais complexos, tÊm inerentemente uma probabilidade relativamente elevada de induzir respostas competitivas mesmo a partir do antigénio (imunogénio) com interesse.
As vacinas correntes para □ VHB consistem de componejn tes sub virais da capa da superfície do vírus (AgHBs) purifi cado a partir do plasma de dadores cronicamente infectados com VHB e inactivadosj McAuliffe e col., (1980) Rev. Infect. Pis. , 2.:470. 0 processo de purificação produz partículas
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-5contendo AgHBs/p25 mas não AgHBs/p33 ou AgHBs/p39. Os ensai. os clínicos têm demonstrado a segurança e eficácia de vacinas AgHBs correntes mas uma percentagem significativa de pessoas não são protegidas pela inoculação com tais vacinas devido a uma incapacidade genética para responder ao AgHBs/p25 (não respondedores à região S). Além disso, tais vacinas estão limitadas no fornecimento e são relativamente dispendiosas, particularmente para aqueles países com a incidência mais elevada de doença do l/HB, Os polipéptidos quimicamente sintetizados oferecem, portanto, vantagens consideráveis em ter, mos de custo e segurança dos programas de vacinação VHB.
No passado, os imunogénios (antigénios) têm sido obti dos através de diversos métodos incluindo derivação a partir de materiais naturais, ligação de um hapteno a um transportai dor e através de tecnologia de ADN recombinante. Sela e col., (1971) Proc. Nat. Acad. Sei, (USA), 68.:1450} (1969)
Science, 166:1365 e (1966) Adv. Immun,, 5.:129 têm também des. crito certos antigénios sintéticos.
Certos imunogénios “sintéticos (antigénios) têm sido preparados ligando pequenas moléculas (por exemplo, dinitrofenol) a transportadores(tais como keyhole limpet hemocyanin ou albumina de soro bovino), produzindo assim imunogénios (antigénios) que provocam a produção de anticorpo para a pequena molécula ligada. A molécula transportadora é geralmeri te necessária porque a pequena molécula por si só é tipicamente não reconhecida pelo sistema imunológico do animal para o qual é introduzida. Esta técnica tem também sido uti. lizada em casos isolados para preparar imunogénios (antigéni ' os) ligando fragmentos de polipéptido de proteínas conhecidas a transportadores.
Enquanto esta técnica hapteno-transportador tem servi do bem a comunidade investigadora nas suas investigaçães sobre a natureza da resposta imunológica, não tem tido ainda uso significativo na produção de imunogénios que têm um papel em modalidades diagnósticas ou terapêuticas.
Estudos anteriores por Arnon e col., (1971) Proc. Nat.
-6Açad. Sçj. (USfl), 68, 1450, Atassi, (1975) Immunochemistry, 12:423 e Vyas e col., (1972) Science♦ 178:1300 foram interpretados por aqueles autores como indicando que sequências aminoácidas lineares curtas provocam pouco provavelmente, de uma maneira geral, formação de anticorpos reactivos com a estrutura da proteína original. Pensou-se que para a maior parte das regiões da maior parte das moléculas, os determinantes antigénicos resultavam de resíduos aminoácidos bem se, parados na sequência linear mas bastante juntos na proteína dobrada. Pensou-se que a configuração tridimensional exacta dos polipéptidos usados para provocar a formação de anticorpos era crítica na maior parte dos casos, mesmo para aqueles imunogénios e antigénios envolvendo resíduos aminoácidos jun tos numa sequência.
Contudo, Sutcliffe e col., (1980) Nature, 287: 801 de£ cobriu que anticorpos para polipéptidos lineares reagem com moléculas originais. Investigações recentes têm mostrado que polipéptidos quimicamente sintetizados relativamente cur tos podem dar origem à formação de anticorpos reactivos com quase qualquer região de uma superfície exposta de uma proteína; Green e col., (1982) Cell, 2.8:477. Além disso, como as sequências de resíduos aminoácidos podem agora ser rapidat mente determinadas com tecnologia de sequenciação de ácido nucleico, os polipéptidos sintéticos podem ser sintetizados para fabricar vacinas com uma precisão previamente impossível. Assim, os polipéptidos sintéticos proporcionam uma alternati va à biossíntese elaborada.
A Patente U.S. |\|3 4 415 491 de Vyas revela uma série de péptidos que correspondem ao determinante £ do antigénio de superfície do Vírus da hepatite B. Embora não se apresen tem quaisquer dados em relação à protecção do hospedeiro, os péptidos são descritos como sendo úteis numa preparação de vacina da hepatite.
Sabe-se que anti-soros para polipéptidos sintéticos previstos a partir da sequência nucleótida de diversas regiões do gene S do VHB, reagem com AgHBs original por radioimu
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-7noprecipitação /~Lerner e cal., (1981) Proc* Natl. Acad, Sei. (USA), 78:3403 7 e par radioimunoensaios comerciais de fase sólida para anti-AgHBs; Gerin e col., (1982) em Virai Hepatites, Szmuness e col. (eds.), 49-55.
Foi também determinado que uma proteína patogenicamen, te relacionada pode ser imunologicamente mimetizada pela pr£ dução de um polipéptido sintético cuja sequência corresponde à de um domínio determinante da proteína patogenicamente relacionada. Tais observações estão descritas por Sutcliffe e col., (1980) Nature, 287;801) e Lerner e col., (1981) Proc. Natl. Acad. Sei. (USA), 78:3403.
Além disso, Gerin e col., (1983) Proc. Natl. Acad. Sei, (USA), 80:2365 têm mostrado a protecção limitada do vírus da hepatite B aquando da imunização com polipéptidos siri táticos ligados a um transportador possuindo sequências de resíduos aminoácidos que correspondem à sequência de uma por, ção determinante do AgHBs; em particular, os resíduos 110-137 da região S (superfície).
Recentemente, foram relatados dois pêptidos sintéticos derivados da sequência da região pré-S2 como provocando a formação de anticorpos de reacção cruzada com a região pre-S2 original; Milich e col.; (1985) Science, 228:1195 ; Neurath e col. (1985) Nature (Londres), 315:154. Indicando os terminais-amino da região pré-S2 de todos os subtipos como resíduo 120 (i.e. representando pl-119 ou pl2-119 a região pré-Sl), um péptido sintético correspondendo aos resíduos 120 a 145 do subtipo a d um (0120-145/adui^) mostrou ligar anti corpos humanos formados por infecção de VHB, e anticorpos de rato anti-pl20-145 foram capazes de reconhecer p33 em partículas AgHBs originais; Neurath, e col. (1984) Science 224:392. Noutro estudo, mostrou-se que o anticorpo anti-nativo estimu lado por imunização com partículas AgHBs/33 e anticorpo anti. -pl20-145 competem para o mesmo, ou próximos, determinantes em partículas AgHBs/p33; Milich e col., (1985) Science 228:1195.
De forma semelhante, outro péptido sintético designa-
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-8do P133-151/aytu (correspondendo aos resíduos 133 a 151 a par. tir do terminal amino da região pre-S do subtipo ayuj) foi utilizado para produzir anticorpos monoclonais que reconhecem a região pre-S2 em partículas AgHBs/33 originais? Okamo to e col., (1985) 3. Immunol. 134:1. Estas duas sequências pre-S2-específicas partilham os resíduos 133 a 145 com uma só substituição de resíduo aminoácido dependente do subtipo na posição 141. 0 elevado grau de reactividade cruzada entre antisoros nativo- e péptido-induzido específicos para a região pre-S2 do AgHBs, e a resistência do antigénio nativo pre-S2 para a redução e desnaturação são consistentes com a presença de determinantes contínuos ou sequenciais, em opos.i ção a determinantes dependentes de conformação, na região pre-S2; Neurath, e col. (1984) Science 224:392, Milich, e col. (1985) Science 228:1195. Isto contrasta com o grupo ma jor e com os determinantes específicos de subtipo da região S, os quais são altamente dependentes de pontes de dissulfureto intactasj Vyas e col., (1972) Sei. 178:1300; Dreesman e col., (1973) J. Gen. Virol. 19:129.
A construção de uma vacina AgHBs sintética pode, contudo, requerer em adição a polipéptidos sintéticos correspon dendo a epitopos de célula B (indutores de anticorpo), polipéptidos sintéticos correspondendo a determinantes de célula T não sobreponíveis (epitopos de célula T).
Por via de outros antecedentes, três componentes celu lares do sistema ímunológíco são células B (linfocitos derivados da medula óssea ou da bursa), células T (linfócitos d_e rivados do timo) e macrófagos. As células B circulam no san gue e no fluído linfático e estão envolvidas na produção de anticorpos. As células T amplificam ou suprimem a resposta das células B.
Os macrófagos por outro lado, estão envolvidos em apresentar e concentrar antigénios para as células B e T. Além disso, os macrófagos segregam diversos mediadores biolo gicamente activos que regulam o tipo e magnitude de ambas as respostas das células T e B quer aumentando ou suprimindo a divisão celular ou diferenciação celular. Os macrófagos são
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-9não específicos e reagem contra qualquer antigénio estranho. As células T e B são, contudo, antigénio-específicas e reagem atraués de receptores da membrana celular que são especí ficos para o antigénio particular.
Nos ratos, a produção de anticorpo para o AgHBs in vivo é regulada por pelo menos dois genes de resposta imunológica (ir), um na subregião I-A (lr-HBs-1) e um na subregião I-C (lr-HBs-2) do complexo H-2 murino. Observou-se que a imunização com um péptido quimicamente sintetizado correspori dendo ao determinante .d não distinguiu entre estirpes murinas muito respondedoras e não respondedoras; Milich e col., (1983) 3. Immunol., 130:1401. Isto sugere que a restrição-Ir pode ocorrer ao longo do reconhecimento de células T de regi, ães adicionais, talvez não sobreponíveis, da molécula.
A ligação entre o complexo de histocompatibilidade ma jor e a regulação de capacidade de resposta imunológica para o AgHBs em ratos, tem sido estendida à resposta imunológica humana pelo relatório de uma associação entre o fenotipo HLA-DR e a ausência de resposta para um teste de vacina para AgHBs recente. Assim, a construção de uma vacina UHB inclui idealmente, em adição a epitopos imunogénicos de célula B, uma diversidade suficiente de determinantes epitopicos de cé lula T para acomodar a variação genética no reconhecimento do epítopo de uma população humana com a mesma ascendência.
Além disso, enquanto se conhecem diversos polipéptidos sintéticos e preparações proteicas de AgHBs purificadas, a especificidade precisa da imunogenicidade da região pré-S não está ainda compreendida. Em adição, a relação entre a imunogenicidade da região pré-Sl e da região pré-S2 e das re giães S não é ainda conhecida.
f
Seria particularmente útil elucidar a relação entre a região pré-Sl e o restante do AgHBs. Seria também útil deter; minar a localização específica dos epitopos das células T e B na região pré-S do AgHBs de forma que só sequências conten, do os resíduos aminoácidos daqueles epitopos necessitem sejam incluídos em vacinas sintéticas. Além disso, a compreejr
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-10são da relação entre o tamanho de um polipéptido sintético e o efeito de usar um transportador não-AgHBs como um estimula dor de célula T, e a especificidade dos anticorpos produzidos, aumentaria a capacidade de preparar um imunogene para a finalidade desejada.
Sumário do Invento presente invento refere-se a polipéptidos possuindo sequências de resíduo aminoácido que correspondem a porções da região pré-S da proteína do antigénio de superfície do yí rus da hepatite B (AgHBs) contendo um epítopo de célula T e/ /ou um epítopo de célula B.
Numa concretização, o presente invento contempla um polipéptido de cerca de 6 a cerca de 50 resíduos aminoácidos. Aquele polipéptido consiste essencialmente de uma sequência de resíduo aminoácido que corresponde a uma porção da região pré-S da proteína AgHBs localizada entre uma posição terminal amino e uma posição terminal carboxilo, respectivamente, seleccionada a partir do grupo consistindo de 12-21, 16-27, 94-105, 106-117, 120-126, 120-132, 120-140, 128-138, 133-139, 133-140, 133-143, 133-145, 134-139, 135-143, 135-145, 137-143, 137-145 e 140-151 a partir do terminal amino da região pré-S. 0 polipéptido está isento de resíduos aminoácidos nas posições terminal amino e terminal carboxilo enumeradas que correspondem a resíduos aminoácidos contíguos na sequência line ar de AgHBs.
Numa outra concretização, o invento contempla um compósito de imunogene de pelo menos 14 resíduos aminoácidos com preendendo um primeiro polipéptido (a) possuindo um resíduo terminal que está operativamente ligado a um resíduo termi<* nal de um segundo polipéptido, polipéptido (b). 0 polipépti do (a) consiste essencialmente de uma sequência de resíduo aminoácido de epítopo de célula T que corresponde a uma porção da região pré-S da proteína AgHBs situada entre uma posí ção terminal amino e posição terminal carboxilo, respectivamente, seleccionado a partir do grupo consistindo de 12-21,
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-1194-105, 106-117, 120-126, 120-132, 120-140 e 140-151 a partir do terminal amino da região pré-S. 0 polipéptido (b) consiste essencialmente de uma sequência de resíduo aminoáci do que corresponde a uma sequência de resíduo aminoácido do AgHBs que contém um epítopo de célula B nativo. 0 resíduo terminal do polipéptido (a) que está operativamente ligado ao resíduo terminal do polipéptido (b) corresponde a posições separadas na sequência linear do AgHBs em pelo menos 10 resíduos aminoácidos.
invento contempla também um imunogénio composto com preendendo um polipéptido operativamente ligado a um epítopo de célula B não-AgHBs. 0 polipéptido consiste essencialmente de uma sequência de resíduo aminoácido de epítopo de céljj la T que corresponde a uma porção da região pré-S do AgHBs situado entre uma posição terminal amino e uma posição termi nal carboxilo, respectivamente, seleccionado a partir do gru po consistindo de 12-21, 94-105, 106-117, 120-126, 120-132, 120-140 e 133-145 a partir do terminal amino da região pré-S.
Está também contemplado um processo de aumentar a imu nogenicidade de um imunogénio. 0 processo consiste em ligar operativamente o imunogénio a um polipéptido consistindo essencialmente de uma sequência de resíduos aminoácida que cojç ) responde a uma porção da região pré-S do AgHBs contende um epítopo de célula T. A porção está situada entre uma posição terminal amino e uma posição terminal carboxilo, respectivamente, seleccionada a partir do grupo consistindo de 12-21, 94-105, 106-117, 120-126, 120-132, 120-140 e 133-151 a partir do terminal amino da região pré-S.
Um processo de atenuar a incapacidade de resposta para uma vacina do VHB é ainda contemplada. Esse método compreende ligar operativamente uma sequência de resíduo aminoácido correspondendo a um epítopo de célula nativa na região pré-S do AgHBs para o imunogénio da vacina.
presente invento proporciona diversos benefícios e vantagens. Um benefício do presente invento é que a falta
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-12de capacidade de resposta para uma vacina do UHB pode ser atenuada. Outro benefício é que os epítopos particulares de célula T e B têm sido localizados dentro das sequências da região pré-S permitindo assim o uso de epítopos específicos que proporcionara aspectos particulares, desejados, para um inóculo. Assim, uma sequência de só aqueles resíduos tem de ser sintetizada para um imunogenio. Uma vantagem do presente invento é que os epítopos de célula T podem estar operati vamente ligados a epítopos de célula B não-AgHBs para propoj? cionar imunogénios de peso molecular relatiuamente baixo que podem induzir a secrecção de anticorpos para uma gama estrej. ta de epítopos. Ainda outros benefícios e vantagens do invento tornar-se-ão evidentes para os entendidos na arte a partir da discussão que se segue.
Breve descrição dos Desenhos
A Figura 1 ilustra a sequência de resíduo aminoácido da esquerda para a direita, na direcção do terminal amino pa ra o terminal carboxilo e usando um código de resíduo aminoácido de letra única, da região pré-S do AgHBs de seis subti pos do VHB. A linha de resíduos adicional debaixo das seis sequências dá a lista dos resíduos que são homólogos em todos os seis subtipos. Os números acima das sequências ilustram a sequência de posiçães a partir do terminal amino, estando cada décima posição numérica representada verticalmente em vez da forma horizontal usual. As sequências para os subtipos são as seguintes: ayuj - Galibert e col., (1979) Nature, 281: 646 ; a dut/ adr - Ono e col., (1983) Nucl. Acids Res., 11:1747; a d um - Valenzuela e col., (1980) em ICN-UCLA Symposia on Animal Virus Genetics, Fields e col., eds. pp 57-70, Academic Press; adyw - Pasek e col., (1979) Nature, 282:575 ; e adr^ - Fujiyama e col., (1983) Nucl. Acids Res., 11:4601.
A Figura 2 é uma série de três gráficos que ilustram antigenicidades relativas das composiçães contendo região S, pré-S2 e pré-Sl das partículas AgHBs utilizadas nos estudos
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-13que formam a base do presente invento. As partículas AgHBs/ /p39, AgHBs/p33, e AgHBs/p25 nas concentrações indicadas foram ensaiadas para antigenicidade da região S, pré-S2 e pré—SI por fase sólida, métodos de sanduíche ELISA usando reagentes monoclonais específicos pares anti-S-, anti-pré-S2e anti-pré-Sl. Os resultados estão expressos como unidades de absorvância a 490 nanomeros (nm) (A^g unidades) corrigidos em relação ao fundo. 0 eixo X representa a concentração de partículas AgHBs em microgramas por mililitro ( y^g/ml). 0 eixo Y representa A^g unidades. Os quadrados a cheio repre sentam pre-Sl; os circulos vazios, pre-S2; e os circulos a cheio, S.
A Figura 3 é um gráfico ilustrando a resposta prolife rativa de célula T (H-2^) de ratos Balb/c após imunização com AgHBs/p39. Um grupo de quatro ratos foi estimulado com 4 de AgHBs/p39 por rato. As células T do gánglio linfático popliteu (PLI\l) foram recolhidas, seleccionadas e cultivadas in vitro com doses variáveis (concentrações) de AgHBs/ /p39, AgHBs/p33, AgHBs/p25 ou só meio. As respostas prolife rativas de célula T foram determinadas. Os resultados estão expressos como a quantidade de incorporação de /^HjZ-timidj. na corrigido para a proliferação do fundo, só em meio, em contagen por minuto (/\CPM). A proliferação de fundo variou de 1000 a 4000 cpm. 0 eixo X representa a concentração de AgHBs em y^g/ml. 0 eixo Y representa a incorporação de /~^H_7-timidina em CPM (/\CPM x 10“^). Os quadrados a cheio representam AgHBs/p39; os circulos vazios Ag HBs/p 33; e os círculos a cheio, AgHBs/p25.
A Figura 4 é um gráfico representando a resposta proliferativa de célula T de rato S3L/J (H-2S) após a imunização com AgHBs/p39. A resposta de célula T foi analisada como descrito na Figura 3. Os eixos X e Y e os símbolos repre sentando as proteínas AgHBs estão descritos na Figura 3.
A Figura 5 é um gráfico ilustrando a resposta prolife p rativa de células T do rato B10.M (H-2 ) após imunização com AgHBs/p39. A resposta da célula T foi analisada como descri
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-14ta na Figura 3. Os eixos X e Y e os símbolos representando as proteínas AgHBs são como descritos na Figura 3.
A Figura 6 é um gráfico mostrando que a resposta proliferativa de célula T da estirpe B10.M para o AgHBs/p39 foi específica para a região pre-Sl. As células T estimuladas para AgHBs/p39 foram cultivadas in vitro com cinco preparações AgHBs/p39 separadas possuindo antigenicidades da região S equivalentes, e percentagens variáveis das porções possuin do pre-Sl. 0 imunogénio representado por quadrados a cheio continha 5,1% de moléculas possuindo a região pre-Sl, enquajj to as outras quantidades de pre-Sl foram as seguintes: quadrados não preenchidos 2,5%; círculos a cheio, 2,2%, círculos não preenchidos, 2,0%, e triângulos não preenchidos 1,6%. As respostas proliferativas da célula T foram analisadas como descrito na Figura 3. Os eixos X e Y são como descritos na Figura 3.
A Figura 7 é um gráfico demonstrando que a estirpe mu rina S3L/J, as células T estimuladas por AgHBs/p39 foram activadas por polipéptidos sintéticos específicos para pre-Sl in vitro. Ratos SJL/J foram imunizados com quatro j^g de AgHBs/p39 e as células PLN escorridas foram cultivadas com concentrações variáveis dos péptidos sintéticos específicos para pre-Sl. As respostas da célula T proliferativa foram determinadas por incorporação de /~^H_7-timidina, como atrás discutido. 0 eixo Y é como descrito na Figura 3. 0 eixo X representa a concentração do polipéptido (Péptido) em y^g/ml. Os polipéptidos usados têm nomes atribuídos pelas suas posições na sequência de resíduos aminoácidos amino terminal e carboxilo terminal precedidas pela letra p para indicar que são polipéptidos, e foram: pl2-32 - círculos a cheio, pl-21 - círculos não preenchidos, p94-117 - triângulos não preenchidos, p53-74 - quadrados não preenchidos, e p32-53 - quadrados a cheio.
A Figura 8 é um gráfico demonstrando que as células T estimuladas por pl2-32, da estirpe SOL/j foram activadas in vitro por pl2-32 e por AgHBs/p39. Os ratos S3L/3 foram imu-
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-15nizados com 100 yug de pl2-32 e as células PLN escorridas foram cultivadas com as concentrações indicadas de pl2-32 (círculos fechados), cada uma de duas preparações AgHBs/p39 (círculos abertos e quadrados abertos) ou AgHBs/p33 (quadrados fechados) como antigénio. As respostas proliferativas de célula T foram determinadas como descrito na Figura 3. 0 eixo Y é como descrito na Figura 3. concentração de antigénio (AgHBs ou eixo X representa péptido) em
A Figura 9 é um gráfico ilustrando a resposta proliferativa de célula T de ratos S3L (não respondedores da região S) imunizados com 100 de pl2-32 por rato. Recolheram-se células T do gânglio linfático popliteu (PLN), foram seleccionadas e cultivadas in vitro com concentrações variáveis de pl2-32 (círculos preenchidos), pl2-21 (círculos não preenchidos), duas preparações de AgHBs/p39 (quadrados preenchidos e não preenchidos), AgHBs/p33 (triângulos não preenchidos) ou AgHBs/p25 (triângulos preenchidos) como antigénio. Os resultados estão expressos como a quantidade de incorporação de /~^H_7-ti midina (/~^H_7TdR) corrigida em rela ção à proliferação de fundo só em meio, em contagens por minuto (/\cpm). 0 eixo X representa a concentração de antigénio, quer péptido quer partícula, em microrganismos por mi li. litro ( y^g/ml). 0 eixo Y representa a quantidade de incorpçj ração de Ζ~^Η_/ΤdR em cpm. 0 gráfico de barras inserido ilus. tra a reactividade do anticorpo induzido por pl2-32 com pl2-32 ou pl-21 como determinado por ELISA.
A Figura 10 representa as sequências de resíduo amino ácido das posições de resíduo 120 a 145 a partir do terminal amino da região pre-S2 dos subtipos ayui, adu^ e adiu do VHB, são como apresentadas na Figura 1. As sequências estão apresentadas no sistema de código de uma só letra o qual está incluído daqui em diante no Quadro 1. Uma linha tracejada representa um resíduo não alterado a partir da sequência ayw. Estão também descritas as sequências de polipéptidos sintéticos usados nos estudos que formam a base do presente invento, e nas quais a sequência utilizada foi a do subtipo
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-16aym com a excepção de resíduos substituídos que estão indica dos pelas letras nas linhas. Os resíduos da sequência ayuj nas posições 126 e 141 nas sequências descritas na linha são para ilustrar as posições de alterações noutros polipéptidos sintéticos.
A Figura 11 consiste de duas séries de gráficos de barras que ilustram restrição H-2 distinta das respostas imu nológicas para a região pre-S2 nativa em partículas AgHBs/ /p33/ay e a região pre-S2 do pêptido sintético p!20-145/ay. Ratos de uma série de estirpes congénitas H-2 foram imunizadas quer com AqHBs/p33/ay (painel superior), quer com pl20-145/ay (painel inferior). A produção de anticorpo específico pre-S2, determinado por radioimunoensaio (RIA) usando P120-145/ay como o ligante, unido à fase sólida, foi analis£ da após imunização primária com AgHBs e imunização secundária com pl20-145. Os resultados estão expressos como uma percentagem da resposta mais elevada de estirpe respondedoraj i.e., B10 imunizado com AgHBs/p33, 1:40:96; B10 BR imunizado com pl20-145 1:80.000. Mostra-se o halotipo H-2 de cada estirpe.
A Figura 12 ilustra a resposta proliferatiua de células T de rato C^H.Q após imunização com p!20-145/ay. Um gru po de ratos C^H.Q foram imunizados com 100 y^g de pl20-145/ /ayuj por rato. A proliferação de célula T específica para os polipéptidos indicados (Péptidos) foi determinada por incorporação de [_ 3H_7 timidina (/~^H_7TdR) e expressa -como contagens por minuto (cpm) ajustada para o fundo (/\cpm). 0 eixo Y é como descrito na Figura 3. 0 eixo X representa a concentração de polipéptido em micromoles ( yx,M). Os polipéptidos estão representados da seguinte forma; p!20-145/ay
- círculos preenchidos, pl20-132/ay - círculos não preenchidos, pl20-145/ad - triângulos não preenchidos, p!33-145/ay -
- quadrados preenchidos, e pl28-138 - quadrados não preenchi dos.
A Figura 13 contém uma série de gráficos de barras que ilustram a produção de anticorpo in vivo após imunização
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Ref: SCRF 95.1 - EPG:11 com p!20-145/ay em ratos C^H.O. Um grupo de cinco ratos C-jH.Q foram imunizados com 100 ^g de p!20-145/ayiu por rato. Os soros foram recolhidos 24 dias após a primeira imunização (12) e 2 semanas após a segunda imunização (23) com meia dose de imunogénio. Os soros foram seleccionados e analisados por RIA para detectar ligação aos ligantes ligados à fase só, lida indicada. Os resultados estão expressos como a máxima diluição de soros para dar três vezes as contagens dos soros de pré-imunização (Titulo).
A Figura 14 é uma série de dois gráficos que ilustram a resposta proliferativa de célula T de C^H.Q após a imuniza ção usando pl20-132 como imunogénio. Grupos de três ratos
C.jH.Q foram imunizados com 100 de quer p!20-132/ayiu (paj. nel a) quer 0120-132/ad um (painel b) por rato. A proliferação de célula T específica para os péptidos indicados foi de, terminada como descrito na Figura 12. Os eixos X e Y são co mo descritos na Figura 12. Os antigénios são P120-132/ay -
- círculos preenchidos, p!20-145/ay - círculos não preenchidos, 0120-132/ad - quadrados preenchidos, e pl20-140/ad -
- quadrados não preenchidos.
A Figura 15 é um gráfico ilustrando a influência do subtipo na resposta proliferativa de célula T de C^H.Q após imunização com 0120-131/adiu. Um grupo de três ratos C^H.Q foram imunizadas com 100 de 0120-131/adiu. A proliferação de célula T induzida pelo péptido homólogo (pl20-131/ /adiu - círculos preenchidos, 0120-132/aduM - círculos não preenchidos e Ρ120-132/ayiu - quadrados não preenchidos) foi determinada como descrito na Figura 12. Os eixos X e Y são como descritos na Figura 12.
A Figura 16 ilustra a variabilidade em relação às estirpes da resposta da célula T específica para pl20-132 após imunização usando pl20-145 como imunogénio. Grupos de três ratos de cada uma das estirpes indicadas foram imunizados com 100 yug de P120-145/ayiu por rato. A proliferação de célula T induzida por P120-132/ayiu foi determinada da forma descrita na Figura 12. 0s eixos X e Y são como descritos na
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-18Figura 12. Os quadradas preenchidos representam a estirpe
C-jH.Q, os quadrados não preenchidos - SOL/J, os círculos não preenchidos - B1O.S, os triângulos não preenchidos
- B1D.BR, os triângulos preenchidos C^H, e os círculos pre enchidos - B10.
A Figura 17 ilustra a sequência de resíduo aminoácido
mo também estão apresentados nas Figuras 10, 18 e 19. Uma linha tracejada representa um resíduo comum a ambas as sequêri cias. Estão também descritos polipéptidos sintéticos usados nos estudos que formam a base deste invento. Nas sequências descritas na linha em que se mostram duas sequências de subtipos, usa-se uma só linha para representar dois polipéptidos, mostrando a diferença de resíduos em ambos os lados da linha na mesma posição, p.e., F e L na posição 141.
A Figura 18 ilustra a reactividade de anticorpos mono clonais específicos para pre-S2 (Mab 5521, 5161 e 4408) com partículas AgHBs/p33 dB 22 nanómetros (nm) e polipéptidos sintéticos. Os anticorpos monoclonais foram analisados em relação à ligação a partículas de fase sólida AgHBs/p33
por RIA. As posições das substituições de resíduo aminoácido dependente do subtipo, estão indicadas por uma linha tracejada. As sequências dos subtipos ayw e aduM foram analisa.
das. A reactividade está expressa como a concentração mínima (em ng/ml) de anticorpo monoclonal necessário para ligar cijn co vezes as contagens de fundo: quatro sinais mais (++++), indicam uma concentração mínima de 0,03-0,06 ng/ml; (+++), 0,12-0,25; dois sinais mais (++), 0,5-1,0; um sinal mais (+), 2,0-4,0; +_, um sinal mais ou menos 8,0-32; zero 0, inferior a 500 ng/ml.
A Figura 19 mostra a sequência aminoácida de dois locais de ligação de anticorpo distintos e sobreponíveis (epítopos) dentro da região pre-S2. 0 epítopo 1 (pl33-139) foi definido através do monoclonal 4408 e está mantido nos subti pos aym, adr, adui^ e adiu. 0 epítopo 2 (p!37-143) foi defini.
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-19do pelosmonoclonais 5520, 5521, 5535 e 5161. Hauia uma subs tituição de resíduo aminoácido, dependente do subtipo, no re síduo 141 /~fenilalanina (ayui, adr) ; leucina (adiUo, adiu) 7« A sobreposição dos três resíduos aminoácidos entre os epítopos 1 e 2 é definida pelos resíduos (RGL) dentro do rectângu. lo.
A Figura 20 é um gráfico ilustrando a análise da inibição quantitativa do anticorpo monoclonal 4408 ligado a par tículas AqHBs/p33/ay. Os anticorpos monoclonais específicos para pre-S2 indicados foram pré-incubados com partículas
I AqHBs/p33/ay de fase sólida até ao equilíbrio, e misturou-se subsequentemente uma concentração pré-determinada de monoclo nal 4408 marcado com enzima. Determinou-se a percentagem de inibição pelos anticorpos competitivos não marcados. As coji centraçães dos anticorpos competitivos variaram de 0,6 a 625 nanogramas por mililitro (ng/ml). 0 eixo X representa a cori centração de anticorpo competitivo em ng/ml. 0 eixo Y repre senta a percentagem de inibição. 0s quadrados preenchidos representam Mab 5535, os triângulos preenchidos - 4408, os círculos preenchidos - 5520, os quadrados não preenchidos - 5161 e os círculos não preenchidos - 5521.
A Figura 21 é um gráfico ilustrando a análise da iniI bição quantitativa do anticorpo monoclonal 5521 ligado a-par tículas AqHBs/p33/ay. 0s anticorpos monoclonais específicos para pre-S2 indicados foram analisados para a sua capacidade para inibir o monoclonal 5521 marcado com enzima como descri, to na Figura 20. Os eixos X e Y e os símbolos representando os anticorpos monoclonais são como descritos na Figura 20,
A Figura 22 contém uma série de gráficos de barras ilustrando a especificidade da resposta humoral específica para pre-S2 apés a imunização com partículas AqHBs/p33/ay nativas. Os ratos C^H.Q foram imunizados com 1,0 ^g de AqHBs/p33/ay em adjuvante de Freund completo (CFA). Os soros foram recolhidos 24 dias após a primeira imunização (19), e duas semanas apés uma segunda imunização (29) dada com 0,5 ug de AqHBs/p33/ay em adjuvante de Freund incomple-
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-20to (IFA). Os soros foram analisados através de RIA de fase sólida para detectar a reactividade com os antigénios indica dos. Os resultados estão expressos como a diluição de soro mais elevada para dar três vezes as contagens dos soros de pré-imunização (Título de Anticorpo).
A Figura 23 é uma série de dois gráficos que ilustram a inibição quantitativa de anticorpos monoclonais específicos para pre-S2 através de antisoros policlonais anti-péptido e policlonais anti-AgHBs/p33. Ratos C^H.Q foram imunizados quer com 100 ug de pl20-145 (painel a) quer com 1 ug de AqHBs/p33/ayuj (painel b). Seis semanas após a 1^ imuniza ção, os ratos receberam uma segunda imunização (23) com meia dose do mesmo antigénio. Catorze dias depois os soros foram recolhidos e examinados para detectar a capacidade para inibir a ligação dos anticorpps monoclonais, marcados com enzima, específicos para pre-S2, indicados, a partículas AgHBs/ /p33 ligadas à fase sólida. Os resultados são expressos como a percentagem de inibição por uma dada diluição do soro. 0 eixo X representa a diluição sérica recíproca, enquanto o ei. xo Y representa a percentagem de inibição. 0 anticorpo mono clonal 4408 está representado por círculos preenchidos, 5521 - quadrados preenchidos, e 5161 - círculos não preenchidos.
A Figura 24 é um gráfico ilustrando a inibição quanti tativa de anticorpos monoclonais específicos para pre-S2 por anti-soros anti-péptido policlonais específicos para um determinante pre-S2 não sobreponível. Ratos Balb/c foram imunizados com 100
dária, o soro foi examinado para detectar a capacidade para inibir a ligação de anticorpos monoclonais 5151 e 4408 a partículas AgHBs/p33 dos substipos adiUp (painel esquerdo; AgHBs/ /p33/ad) e aym (painel direito; AgHBs/p!33/ay). Os resulta, dos são expressos como a percentagem de inibição por uma dada diluição do soro. 0s eixos X e Y são como descritos na Figura 23. 0s círculos preenchidos representam Mab 4408, os círculos não preenchidos - Mab 5161.
-21Descrição Detalhada do Invento
I. Introdução
Verificou-se que a inoculação de algumas estirpes de animais que não respondem às regiões pre-S2 e S do AgHBs com imunogénios contendo a região pre-Sl de epítopos de célula T estimulavam a produção de anticorpo para ambas as regiões pre-S2 e S em adição ao anticorpo específico pre-Sl, ultrapas. sando assim a falta de resposta.
Além disso, verificou-se que alguns dos polipéptidos conhecidos previamente relacionados com porções da região pre-S do AgHBs, contêm um epítopo de célula T, um epítopo de célula B, ambos os epítopos de célula T e B e/ou resíduos ami noácidos adicionais que são desnecessários para o carácter imunogénico dos polipéptidos. Em particular, os epítopos de célula T e B dentro das sequências 12-32, 94-117, 120-145 e 133-151 da região pre-S do AgHBs foram agora esclarecidos. Aqueles epítopos de célula T correspondem a porções da região pre-S localizada entre as posições terminal amino e termi nal carboxilo 12-21, 94-105, 106-117, 120-126, 120-132, 120-140 e 140-151 a partir do terminal amino da região pre-S. Os epítopos de célula B abrangidos por essas sequências estão localizados em porções da região pre-S entre as posições te.r minai amino e terminal carboxilo, 16-27, 94-105, 106-117, 120-140, 133-139, 133-140, 133-143, 133-145, 134-139, 137-143 e 137-145 a partir do terminal amino da região pre-S.
Verificou-se ainda que adicionando resíduos adicionais a um polipéptido alterou a imunogenicidade do péptido. Por exemplo, a adição de escassos 13 resíduos incluídos na sequência polipéptida alterou as propriedades de ligação do anti génio de anticorpos induzidos, como descrito detalhadamente na Secção VI 3 e ilustrado no Quadro 14. Adicionalmente, ligando um péptido a um transportador tal como ovalbumina, induziu anticorpo específico do subtipo como descrito em detalhe na secção VI 3 e ilustrado no Quadro 14.
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-22A sequência de resíduo aminoácido da região pre-S de cinco subtipos do UHB aqui utilizados estão ilustrados na Fi gura 1. 0 código de aminoácido de letra única usado na Figjj ra e noutros locais está ilustrado abaixo no Quadro 1.
Os nomes completos para resíduos aminoácidos individjj ais são por vezes aqui utilizados bem como as abreviaturas de três letras bem conhecidas. As abreviaturas de letra úni ca (código) são as mais frequentemente utilizadas. 0 Quadro 1, abaixo, proporciona o nome completo bem como as abreviatu ras de uma letra e de três letras para cada resíduo aminoáci do aqui nomeado (ver, por exemplo, L. Stryer, Biochemistry, 2^ ed., W. H. Freeman and Company, São Francisco (1981), página 16). Os resíduos aminoácidos aqui utilizados estão na forma natural L excepto quando indicado em contrário:
QUADRO 1
| A minoácido | Abreviação de três letras | Símbolo de uma letra |
| Alanina | Ala | A |
| A rginina | Arg | R |
| Asparagina | Asn | N |
| Acido aspártico | Asp | D |
| Asparagina ou ácido aspártico | Asx | B |
| Cisteína | Cys | C |
| Glutamina | Gin | Q |
| Acido Glutâmico | Glu | E |
| Glutamina ou ácido glutâmico | Glx | Z |
| Glicina | Gly | G |
| Histidina | His | H |
| Isoleucina | Ile | I |
| Leucina | Leu | L |
| Lisina | Lys | K |
| Metionina | Met | M |
| Fenilalanina | Phe | F |
| Prolina | Pro | P |
| Serina | Ser | S |
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-2 3-
| 1UADR0 I | (continuação) | |
| Aminoácido | Abreviação de três letras | Símbolo de Uma letra |
| T reonina | Thr | T |
| T riptofano | T rp | w |
| T irosina | Tyr | Y |
| Valina | Vai | V |
| II. Abreviaturas e Definições |
A. Abreviaturas
As seguintes abreviaturas são usadas ao longo da descrição e reivindicações:
VHB - vírus da hepatite B
AgHBs - proteína de antigénio de superfície do vírus da hepatite B. Na literatura mais antiga o AgHBs referia-se somente à região S da proteína. Agora, contudo, esse termo é usado para referir todos os três tamanhos do AgHBs; isto é, a região S (o polipéptido maior designado p25), as regiões S e pre-S2 (p33) e as regiões S e pre-Sl e S2 (p39). As pos.i ções dos resíduos aminoácidos da região pre-S do AgHBs estão numeradas para o terminal carboxilo e de tal forma que a posj.
ção 120 é a primeira posição na região pre-S2 do polipéptido de todos os subtipos do VHB. A numeração das posições começa novamente a partir do terminal amino para o terminal carboxilo na região S do polipéptido, sendo a posição 1 designa, da como o resíduo terminal amino.
AgHBs/p25, AgHBs/p33, AgHBs/p39 - uma partícula contendo polipéptidos AgHBs cuja sequência mais longa é região S (AgHBs/p25), regiões S mais pre-S2 (AgHBs/p33) e regiões S mais pre-Sl e 52 (AgHBs/p39), respectivamente.
/ad, /ay, /adw, /ayw, /adu^ * e /adr - usados como AgHBs ou com polipéptidos com ele relacionados indicam o sub tipo do VHB para o qual corresponde a sequência aminoácida.
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-24p__-__ - um polipéptido correspondendo a uma porção da região pre-S do AgHBs. Os espaços em branco contêm os nú meros da posição terminal amino e carboxilo da região pre-S para as quais os resíduos aminoácidos no polipéptido correspondem, p.e. pl2-21 designa um polipéptido correspondendo na sequência de resíduos aminoácidos aos resíduos 12 a 21 a pa_r tir do terminal amino da região pre-S.
B. Definição
A frase operativamente ligado como aqui utilizada significa que a ligação não interfere com a capacidade de qualquer dos grupos ligados de funcionar como descrito; p. e., para funcionar como epítopo de célula T ou B.
A frase epitopo de célula B nativa como aqui usada significa um epítopo numa proteína na sua forma nativa, em comparação com a desnaturada, que induz a secrecção de anticorpo. Em particular, um epítopo de célula B nativa do AgHBs é um epítopo da proteína que induz a formação de anticorpos num animal hospedeiro infectado/imunizado com UHB.
A frase corresponde como aqui usada significa uma sequência de resíduo aminoácido tem a mesma disposição line ar dos mesmos resíduos aminoácidos como a sequência à qual corresponde. Contudo, é bem conhecido na arte que as subs tituições para resíduos aminoácidos podem ser efectuadas e que são antigenicamente e imunogenicamente equivalentes. Em particular, as substituições conservadoras tal como um resíduo hidrofóbico ou polar por outro numa das muitas posições num pêptido frequentemente não altera as características imu nogénicas/antigénicas de um polipéptido. Além disso, exemplos específicos de substituições estão discutidos na descri ção. Assim, o presente invento contempla aquelas sequências idênticas à sequência de um subtipo do AgHBs e aquelas sequêri cias específicamente ligadas por anticorpos, induzido por s.e quências AgHBs (sequências antigenicamente equivalentes) ou que induzem anticorpo que se liga especificamente a sequênci as AgHBs (sequências imunogenicamente equivalentes).
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-25As palavras polipéptido e péptido são usadas ds forma permutável ao longo da descrição. Embora o termo pr£ teína seja usualmente aqui usado para referir um polipéptido grande, é também usado para referir polipéptidos menores, particularmente os polipéptidos da região S e pre-S.
A palavra antigénio tem sido usada historicamente p.a ra designar uma entidade que é ligada por um anticorpo e tam bém para designar a entidade que induz a produção do anticojr po. A utilização mais corrente limita o significado de anti génio àquela entidade ligada por um anticorpo, enquanto a pa lavra imunogénio é usada para a entidade que induz a prodju ção de anticorpo. Quando uma entidade aqui discutida for am bos imunogénica e antigénica, será geralmente denominada antigénio.
As palavras segrega·' e produz são frequentemente usadas iritei^ei^iutavelmente na arte para células a partir das quais se obtêm as moléculas de anticorpo. As células que produzem anticorpos podem, contudo, não segregar aquelas moléculas p.a ra o meio. Aqui, as moléculas de anticorpo são segregadas e são obtidas a partir da corrente sanguínea (anticorpo humoral). Contudo, os anticorpos são geralmente referidos como sendo produzidos mantendo a frase usada na arte.
A frase polipéptido (ou proteína) da região S (ou pre-Sl, pre-S2 ou pre-S) é aqui usada, como na arte, para referir a toda a região designada de um subtipo da proteína AgHBs ou um polipéptido possuindo uma sequência de resíduo aminoácido correspondente. Se se faz referência a uma porção de qualquer uma dessas regiões, essa referência é explíci ta, quer mencionando, por exemplo que uma porção da região-S é referida ou designando explicitamente a porção particular da sequência, como indicando as posições dos resíduos aminoácidos incluídos.
A designação os polipéptidos de 25 kilodaltons (kd) do AgHBs ou polipéptido 25 kd AgHBs significa aqui para indicar o polipéptido da região S na forma glicosilada ou não-glicosilada, por vezes também referida como p25 e gp28.
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-26De forma semelhante, o polipéptido de 33 kd do AgHBs e polipéptido de 39 kd do AgHBs são usados para designar as formas glicosiladas ou não-glicosiladas daqueles polipéptidos, e são também referidas como p33 e p39.
III. Polipéptidos presente invento contempla um polipéptido de cerca de 6 a cerca de 50 resíduos aminoácidos que consiste essenci almente de uma sequência de resíduo aminoácido que correspojn de a uma porção da região pre-Ξ da proteína AgHBs, Aquela porção está localizada entre uma posição terminal amino e terminal carboxilo, seleccionada respectivamente a partir do grupo consistindo de 12-21, 16-27, 94-105, 106-117, 120-126, 120-132, 120-140, 128-138, 133-139, 133-140, 133-143, 133-145, 134-139, 135-143, 135-145, 137-143, 137-145 e 140-151 a partir do terminal amino da região pre-S. 0 polipéptido está isento de resíduos aminoácidos nas posições terminal amino e terminal carboxilo enumeradas que correspondem a resíduos aminoácidos contíguos na sequência linear do AgHBs.
0s resíduos aminoácidos que compreendem as sequências acima estão na lista da Figura 1. Examinando essa Figura, ve rificar-se-á que há sequências ilustradas para seis subtipos de AgHBs, e que todos os resíduos aminoácidos não são os mes. mos numa dada posição.
As sequências da região pre-S de AgHBs atrás enumeradas são destinadas a incluir as sequências em linha para todos os subtipos do VHB excepto quando indicado em contrário. Assim, um polipéptido de epítopo de célula T correspondendo às posiçães 12-21 inclui as sequências, da esquerda para a direita e na direcção do terminal amino para o terminal carboxilo, representadas pelas fórmulas:
MGQNLSTSNP; e MGTNLSVPNP;
nas quais a primeira sequência da lista é apresentada pelos subtipos do VHB aytu e adytu, e a segunda sequência da lista é
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-27apresentada pelos subtipos aduM, adtu e adr.
Outra forma de escrever as duas sequências acima apre sentadas é a seguinte:
MGQ(T)NLST(V)S(P)NP, na qual cada resíduo aminoácido entre parêntesis é uma altejç nativa ao resíduo imediatamente precedente. Membros adicionais do grupo útil atrás descrito de polipéptidos pode ser escrito usando parêntesis para resíduos alternativos, embora os resíduos alternativos não sejam sempre necessários, como é a situação com o polipéptido 94-105 no qual há uma identidade de resíduos de entre os subtipos.
Os polipéptidos atrás descritos correspondem a epítopos de célula T e B apresentados pelo VHB. Como consequência, um polipéptido que se liga a um epítopo de célula B pode ser usado para induzir a secrecção de anticorpos quando ligado a um polipéptido ou proteína contendo epítopo de célu la T. Um polipéptido contendo epítopo de célula T útil pode ser ligado a um polipéptido de epítopo de célula B do VHB ou outro imunogénio (epítopo de célula B) e usado para induzir a secrecção dos anticorpos. Estas e outras utilizações são discutidas mais detalhadamente adiante.
IV. Imunoqénios f
A. Uteis para a Indução de Anticorpos para o AgHBs
Num outro aspecto, o presente invento contempla imuno gênios compostos de pelo menos 14 resíduos aminoácidos, e po. de conter várias centenas de resíduos como ilustrado daqui em diante. De preferência, o imunogénio composto contém um total de cerca de 20 a cerca de 50 resíduos aminoácidos'. Tais imunogénios são úteis para a indução de anticorpos para o AgHBs. Um imunogénio composto do presente invento compreende um primeiro polipéptido (a) possuindo um resíduo terminal que está operativamente ligado a um resíduo terminal de um segundo polipéptido (b).
polipéptido (a) consiste essencialmente de um epítopo
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-28de célula T possuindo uma sequência de resíduo aminoácido que corresponde a uma porção da região pre-S do AgHBs situado entre uma posição terminal amino e terminal carboxilo, respectivamente, seleccionado a partir do grupo consistindo de 12-21, 94-105, 106-117, 120-126, 120-132, 120-140, e 140-151 a partir do terminal amino da região pre-S. 0 polipéptido (b) consiste essencialmente de uma sequência de resj[ duo aminoácido de AgHBs que contém um epítopo de célula B na tivo do AgHBs.
resíduo terminal operativamente ligado do polipépti do (a) e o resíduo terminal operativamente ligado do polipépti do (b) correspondem a posições separadas na sequência linear AgHBs em pelo menos 10 resíduos aminoácidos. De preferência, quer o resíduo terminal carboxilo quer o resíduo terminal amino do polipéptido (a) está operativamente ligado directamente ao resíduo terminal amino ou carboxilo, respectivamente, do polipéptido (b) através de uma ligação péptida, e □ polipéptido inteiro é sintetizado como uma sequência, como pela síntese de fase sólida abaixo descrita.
Numerosos métodos adicionais de ligar operativamente o polipéptido (a) ao polipéptido (b) são conhecidos na arte. Por exemplo, um dialdeído tal como glutaraldeído e um redutor tal como borohidreto de sódio podem ser usados para ligar resíduos terminais-amino dos dois polipéptidos. Um resí. duo cisteína pode ser adicionado a um resíduo terminal do polipéptido (a). Usando éster de N-maleimidobenzoil-N-hidro xi succinimida (MBS) seguindo o processo de Liu e col., (1979) Biochemistry, 18:690, o resíduo cisteína pode ser ligado covalentemente ao resíduo terminal amino do polipéptido (b) reagido com MBS. Uma carbodiimida solúvel em água tal como l-etil-3-(3-dimetil-aminopropil)carbodiimida pode também ser utilizada para ligar operativamente os dois polipépti dos.
□s polipéptidos (a) e (b) também podem ser separados através de um grupo espaçador. Tais grupos espaçadores são de preferência polímeros curtos de um a cerca de dez resíduos
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-29aminoácidos. Aqueles resíduos não são resíduos contíguos na sequência linear de AgHBs, mas podem ser seleccionados a pa_r tir de outra parte da molécula AgHBs. Além disso, sequências sem sentido tais como poli-glicina podem ser usadas.
Numa concretização o polipéptido (b) é um polipéptido AgHBs de 33 kilodaltons ou um polipéptido AgHBs de 25 kilodaltons. Noutra concretização, o polipéptido (b) corresponde a uma porção da região pre-S do AgHBs situado entre a posição terminal amino e terminal carboxilo, respectivamente, seleccionado a partir do grupo consistindo de 1-21, 16-27, 32-53, 53-74, 94-105, 94-117, 106-117, 120-140, 120-145, 128-138, 133-139, 133-140, 133-143, 133-145, 135-143, 135-145, 133-151, 137-143 e 153-171. Ainda noutra concretização o polipéptido (b) corresponde a uma porção da região S do AgHBs localizado entre uma posição terminal amino e termi nal carboxilo, respectivamente, seleccionado a partir do gru po consistindo de 110-137, 117-137, 122-137, e 135-155. 0
Quadro 2, abaixo, ilustra os imunogénios preferidos deste in vento.
| Polipéptida | -30- | ||||||
| QUADRO | 2 Polipéptido (a) | ||||||
| 12- | 94- | 106- | 120- | 120- | 120- | 140 | |
| 21a | 105a | 117a | 126a | 132a | 140a | 151 | |
| 1 1 | |||||||
| AgHBsb | |||||||
| AgHBS/p33 | N,C° | N,C | N,C | l\l,C | l\l,C | N,C | N,C |
| AgHBs/p25 | l\l,C | N,C | N,C | N,C | l\l,C | N,C | N,C |
| Pre-Sd | |||||||
| 1-21 | N,C | N,C | l\l,C | N,C | N,C | l\l,C | N,C |
| 16-27 | N | N,C | l\l,C | N,C | N,C | N,C | N,C |
| 32-53 | l\l,C | l\l,C | l\l,C | N,C | N,C | N,C | N,C |
| 53-74 | N,C | N,C | N,C | l\l,C | N,C | l\l,C | l\l,C |
| 94-105 | l\l,C | N,C | C | N,C | N,C | N,C | N,C |
| 94-117 | l\l,C | N,C | l\l,C | N,C | C | N,C | N,C |
| 106-117 | l\l,C | N,C | N,C | C | C | N,C | N,C |
| 120-145 | N,C | N,C | N,C | N | N,C | C | N,C |
| 128-138 | l\l,C | N,C | l\l,C | N | N | N,C | C |
| 133-139 | N,C | N,C | N,C | N | N | N,C | C |
| 133-140 | N,C | l\l,C | l\l,C | N | N | C | C |
| 133-143 | N,C | N,C | N,C | N | N | C | N |
| 133-145 | N,C | N,C | N,C | N | N | c | N |
| 135-143 | N,C | N,C | N,C | N | l\l | c | N |
| 135-145 | N,C | l\l,C | N,C | N | N | c | N |
| 137-143 | l\l,C | N,C | N,C | N,C | N | c | N,C |
| 133-151 | l\l,C | l\l,C | N,C | N,C | N | c | N,C |
| 153-171 | N,C | N,C | N,C | N,C | N,C | N,C | N |
| SB | |||||||
| » | |||||||
| 110-137 | N,C | N,C | N,C | N,C | l\l,C | N,C | N,C |
| 117-137 | N,C | N,C | N,C | N,C | N,C | N,C | N,C |
| 122-137 | N,C | l\l,C | l\l,C | N,C | N,C | N,C | N,C |
| 135-155 | N,C | N,C | N,C | l\l,C | l\l,C | N,C | l\l,C |
I (0
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-31a Números da posição das sequências do polipéptido (a) da região pre-S do AgHBs.
b Polipéptidos AgHBs.
c N = o polipéptido (b) indicado está ligado ao terminal amino (NH2) do polipéptido (a). C = o polipéptido (b) in dicado está ligado ao terminal carboxilo do polipéptido (a) ·
Números da posição das sequências polipéptidos correspondendo à região pre-S do AgHBs.
B
Números da posição das sequências polipéptidos correspondendo à região S do AgHBs.
Em adição aos polipéptidos compostos ligados operativamente descritos atrás os genomas para as regiões S, pre-Sl e pre-S2 do AgHBs são conhecidos, e podem ser adequadamente ligados e expressos a partir de microrganismos tais como ba£ térias como £. coli ou levedura como S.. cerevisiae, bem como através de células de mamíferos tais como células do ovário do hamster Chinês (CHO) para proporcionar um imunogénio composto recombinante, Por exemplo, Tiollas e colaboradores /Michel e col., Proc. Natl. Açad. Sçj. USA, (1984) 81:7708_7 relataram a expressão a partir de células CHO de uma partícu la recombinante contendo as regiões pre-S2 e S do AgHBs juntas na ordem em que aquelas sequências são encontradas na na tureza.
Um imunogénio AgHBs composto recombinante pode ser preparado de forma semelhante (expresso), contendo uma sequêjn cia polipéptida de epítopo de célula T pre-Sl e uma sequência polipéptida de epítopo de célula B como atrás descritas. 0 imunogénio assim descrito pode estar isento de sequências de resíduo aminoácido que não proporcionam a estimulação da célula T ou de célula B desejada tal como aquelas sequências que não induzem anticorpos protectores em que o imunogénio é usado numa vacina.
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-32Adicionalmente, o imunogénio composto recombinante p£ de ser trabalhado de forma a conter mais de uma sequência epi tópica desejada tal como pl2-21 da pre-Sl simplesmente colocando duas sequências genómicas para a sequência epitópica desejada no genoma recombinante usado para exprimir o imunogénio composto.
Adicionalmente, ainda, um imunogénio composto recombi nante pode ser feito de modo a exprimir múltiplos epítopos de subtipo, incluindo dois genomas para as mesmas sequências que codificam para variantes de subtipo tais como aquelas pa ra as posições 120-140 dos subtipos ad e ay.
Um imunogénio composto de AgHBs recombinante contém pelo menos um polipéptido (a) que consiste essencialmente de pl2-21 da região pre-Sl, um polipéptido (b) que é o polipépti do da região p25 S, os quais são operativamente ligados atra vés de uma ligação péptida ou de um resíduo aminoácido. Na prática preferida, aquelas duas sequências são ligadas dire£ tamente através de um resíduo terminal de cada sequência atra vés da ligação péptida. Mais preferivelmente, a sequência pre-Sl pl2-21 está ligada através do seu resíduo terminal carboxilo ao resíduo terminal amino do p25.
Sequências epitópicas de célula T e célula B adicionais como aqui discutidas podem também estar presentes num imunogénio composto de AgHBs recombinante, e podem estar situadas entre os polipéptidos pl2-21 e p25 na sequência expres. sa ou em qualquer um dos seus lados. Imunogénios de polipépti. do composto exemplares estão indicados abaixo, e estão ilustrados da esquerda para a direita e da direcção do terminal amino para o terminal carboxilo, usando a rotação da posição da sequência polipéptida previamente descrita, na qual as se, quências individuais estão separadas por uma barra (/) para facilidade de compreensão, e o polipéptido da região S, p25, é referido como S,
1. pl2-21/S;
2. S/pl2-21;
3. pl2-21/p94-117/S;
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4. pl2-21/S/p94-117;
5. pl2-21/p94-117/pl20-151/S;
6. pl2-32/pl20-126/s/pl2-21;
7. p32-53/pl2-21/s/pl2-27;
8. pl2-21/pl33-145/S;
9. pl2-21/pl2-21/p94-117/pl20-151/S,· e
10. S/pl20-151/p94-117/pl2-21.
Um imunogénio composto recombinante acima descrito é preparado usando técnicas bem conhecidas de engenharia genética. Como previamente referido, as sequências de resíduo aminoácido para as regiães pre-S e S do AgHBs são conhecidas, bem como os genomas que codificam para aquelas sequências.
Assim, usando tecnologia de síntese de genes comerci almente disponíveis, pode-se sintetizar o genoma conhecido de, sejado a partir dos reagentes disponíveis. Os vectores esp.e cificamente designados para clonar um genoma para proporcionar quantidades úteis para a expressão subsequente do imunogénio composto desejado estão também comercialmente disponíveis, bem como os vectores especificamente designado para a expressão. Bactérias, leveduras e células de mamíferos adequadas para transfecção através do vector de expressão e subsequente do imunogénio, estão também comercialmente dispçi níveis.
Em adição a Michel e col., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, (1984) 81:7708, revela de uma forma exemplar que a descrição de técnicas para submeter a engenharia genética um imunogénio composto atrás descrito pode ser encontrado nas Patentes U.S. N9 4 428 941 da Galibert e col., I\I9 4 237 224 de Cohen e col., Ne 4 273 875 de Manis; Ne 4 431 739 de Riggs; Ne.
363 877 de Goodman e col., Rodriguez & Tait, Recombinant DNA Techniques: An Introduction, The Benjamin/Cummings Publishing Co., Inc. Menlo Park, CA (1983), cujas divulgaçães estão aqui incorporadas por referência.
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-34B. Uteis para Induzir Anticorpo para Epítopos de Células B Não AgHBs presente invento contempla também imunogénios compostos que são úteis para induzir anticorpos para epítopos de célula B não-AgHBs. Em tais imunogénios, um polipéptido correspondendo a uma porção da região pre-S do AgHBs contendo um epítopo de célula T, está operativamente ligado a um epítopo de célula B não AgHBs. Tais imunogénios compostos são particularmente úteis quando se desejam níveis de anticorpo humoral elevados. Especificamente, anticorpos para uso em diagnósticos e noutros ensaios podem ser induzidos sem a necessidade de ligar um epítopo de célula B em relação ao qual se desejam anticorpos para transportadores usualmente usados tais como KLH, toxoide do tétano, albumina do soro bovino ou ovalbumina.
Os anticorpos policlonais assim induzidos não contêm anticorpos para o transportador, mas pode estar presente anti corpo mínimo para epítopo de célula T. Portanto, aquelas preparações de anticorpo são mais homogénias/que quando se usa uma proteína transportadora. Enquanto é preferível incluir epítopos de célula T nativos a partir da proteína para a qual os anticorpos são induzidos num imunogénio usado numa vacina, os epítopos de célula T da região pre-S do AgHBs são adequados para estimular a secreção de anticorpo quando um elevado nível de anticorpo circulante é o resultado desejado em comparação com protecções contra teste de imunidade subsequente.
Em particular, o invento contempla um imunogénio composto compreendendo um polipéptido operativamente ligado a' um epítopo de célula B não AgHBs. 0 polipéptido consiste essencialmente de uma sequência de resíduo aminoácido que corresponde a uma porção da região pre-S do AgHBs contendo um epítopo de célula T situado entre uma posição terminal amino e terminal carboxilo, respectivamente, seleccionado a partir do grupo constituído por 12-21, 94-105, 106-117, 120-126, 120-132, 120-140 e 140-151 a partir do terminal
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Ref? SCRF 95.1 - EPGíll amino da região pre-S.
Tais imunogénios são capazes de induzir anticorpos para o epítopo de célula B incluído no imunogénio. Embora muitos ensaios utilizem proteína desnaturada, é preferível, nalguns casos, induzir o anticorpo que se liga à proteína na tiva. Nesses casos, o epítopo de célula B seleccionado é um epítopo de célula B nativo de uma proteína, de preferência uma proteína de superfície de um patogene.
epítopo não-AgHBs é de preferência um polipéptido contendo uma sequência de cerca de 7 a cerca de 40 resíduos. Exemplo de tais epítopos de célula B são os polipéptidos dos vírus do pé e da mão como revelado na Patente U.S. N9
544 500, e os do vírus influenza revelados no requerimento de Patente U.S. N9 de Série 527 401 depositado em 29 de Agos. to de 1983, estando ambas as divulgaçOes aqui incorporadas por referência.
polipéptido contendo o epítopo de célula T pode ser operativamente ligado à porção contendo epítopo de célula B AgHBs ou não AgHBs do imunogénio de uma forma previamente discutida.
C. Métodos
Os polipéptidos contendo célula T deste invento aqui descrito são úteis para aumentar a imunogenicidade de um imunogénio. Além disso, os epítopos de célula T da região pre-Sl podem ser usados num processo para diminuir a falta de resposta para uma vacina contra o VHB.
Em particular, o presente invento contempla um proces. so para aumentar a imunogenicidade de um imunogénio. 0 processo compreende ligar operativamente o imunogénio a um poli, péptido que consiste essencialmente de um epítopo de célula T possuindo uma sequência de resíduo aminoácido que corresponde a uma porção da região pre-S do AgHBs situado entre a posição terminal amino e terminal carboxilo, respectivamente, seleccionado a partir do grupo constituído por 12-21, 94-105,
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-36106-117, 120-126, 120-132, 120-140 e 140-151 a partir do ter minai amino da região pre-S.
Noutra concretização, o presente invento contempla um processo que diminui a falta de resposta a uma vacina contra o VHB. Aquele processo compreende ligar operativamente uma sequência de resíduo aminoácido correspondendo a um epítopo de célula T nativo na região pre-Sl do AgHBs para o imunogénio da vacina. De preferência, o epítopo de célula T nativa está situado nas posições 12-21, 94-105 ou 106-117 do terminal amino para a região pre-S. Noutra concretização preferi, da, do processo, o polipéptido AgHBs de 39 kd está incluído no imunogénio da vacina.
A ligação operativa do polipéptido do epítopo de célu. la T a um imunogénio acima descrito pode ser conseguida como previamente discutido.
V. Incapacidade de resposta contornada pela resposta de célula T específica de Pre-Sl, para as regiões Pre-S2 e S do AgHBs
A. Discussão
Os estudos aqui descritos representam um exame das respostas imunolégicas das células T e B à região pre-Sl do AgHBs. Os resultadas obtidos indicaram: (1) a região pre—SI era imunogénica aos níveis das células T e B; (2) a pro dução de anticorpo específico anti-pre-Sl (secrecção) foi re guiada por genes ligados a H-2 e pode ser independente da produção de anticorpo anti-S e anti-pre-S2; (3) imunização com partículas AgHBs/p39 contendo a falta de resposta desviada da região pre-Sl para as regiões S e pre-S2 em termos de produção de anticorpo; (4) uma resposta imunológica humoral específica para pre-Sl pode ocorrer durante o curso de uma infecção aguda por VHB no homem? (5) dois péptidos sintéticos p32-53 e p94-117 definiram locais de ligação de anti corpo murino e humano na região pre-Sl, e pl-21 e pl2-32 definem locais de ligação de anticorpo humano,adicionais;
(6) células T específicas para pre-Sl foram provocadas na re
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-37gião S e pre-S2 sem resposta do rato, e proporcionaram auxílio funcional para a produção de anticorpo específico para S, pre-S2 e pre-Sl; e (7) identificou-se um local de reconhecimeri to de célula T na região pre-Sl, pl2-32.
Duas doses de microgramas ( ^g) cada de AgHBs/p39 foram necessárias para provocar uma resposta de anticorpo espe. cífico pre-Sl. Contudo, a preparação do AgHBs/p39 usado cori tinha somente 0,052 ^ug da proteína da região pre-Sl (polipéptido) por 4 ylig de proteína da região S (diferença de 77 vezes). Portanto, uma comparação directa entre os títulos de anticorpo anti-S e anti-pre-Sl não foi informativa. Contudo, uma dose total de 0,052 JUg de proteína da região S foi não-imunogénica na região S de estirpes não respondedoras e de baixa resposta, e minimamente imunogénica em altamente respondedoras, enquanto que a imunização com AgHBs contendo 0,052 jj-q da proteína (polipéptido) da região pre—SI provocou a produção de ambos anticorpos anti-pre-Sl s anti-S na região S de estirpes não respondedorase respondedo ras.
Na estirpe BIO.M, que não tem o reconhecimento de célula T das regiães S e pre-S2, são necessárias células T específicas para a região pre-Sl para a produção de anticorpos para anti-região S. Contudo, nas partículas AgHBs usadas pa, ra imunização só 2,5/ó dos polipéptidos continham sequências na região pre-Sl, contudo, ratos B10.M produziram uma respos^ ta imunológica anti-região S significativa (1:10, 240). Isto sugere função de auxílio de célula T específica para pre-Sl eficaz. De forma semelhante, células T específicas para pre—SI foram estimuladas com 0,1 y*g de proteína da região pre-Sl, enquanto que, um mínimo de 2-4 yxg de AgHBs/p25 foi necessário para estimular células T específicas da região* S; Milich e col., (1985) 3. Immunol,, 134:4194. Cumulativamente, estes factos indicaram que a região pre-Sl era um imunogénio eficaz no rato ao nível das células T e B. Além disso, a identificação de anticorpo específico para pre-Sl no soro de doentes humanos infectados com VHB indicou que a imunogeni
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Ref: SCRF 95.1 - EPGzll
-38cidade da região pre-Sl não era única para o modelo murino.
A comparação das respostas humorais de um painel de estirpes murina Η-2-congénicas apôs imunização com três formas de partículas AgHBs contendo ou p25 só, p25 e p33, ou p25, p33 e p39 mostrou que as produções de anticorpos anti-S, anti-pre-S2, e anti-pre-Sl eram reguladas independentemente por genes ligados por H-2. Isto foi claramente demonstrado pela identificação de uma estirpe não respondedora da região S (B1O.S) que foi capaz de responder, apesar disso, à região pre-S2, e uma estirpe não respondedora da região S e pré-S (BIO.m) que foi capaz de responder, apesar disso, à região pre-Sl. Outro facto com interesse foi que a resposta imunológica para essa região poderia influenciar as respostas para as outras regiões. Esta observação foi também possível devido à existência de variáveis estirpes não-respondedoras. A imunização da estirpe BIO.M não respondedora da região S θ pre-S2 com AgHBs/p39 que contém a região pre-Sl provocou res_ postas de anticorpo específicas para S e pre-S2 bem como respostas de célula T com anticorpo específico para pre-Sl.
Uma situação semelhante relativa à região pre-S2 na região S não respondedora da estirpe B1O.S foi previamente observada? Milich e col., (1985) Science, 228:1195.
facto da produção de anticorpo para as três regiões do AgHBs estar independenetemente restringido por H-2 e exibir ainda assim mecanismos reguladores sobreponíveis, sugeriu a influência de reconhecimento de célula T específico de região do AgHBs, que poderia funcionar para auxiliar clones de células B com capacidade de resposta para todas as regiões. Isto foi directamente demonstrado pelo facto de célurlas T da estirpe B1O.M imunologicamente estimuladas com AgHBs/ /p39 reconhecerem soa região pre-Sl, enquanto que esta estirpe produz anticorpos específicos anti-S, anti-pre-S2, e anti-pre-Sl após imunização AgHBs/p39. Portanto, torna-se agora claro que células T específicas para pre-Sl podem proporcionar auxílio funcional para clones de célula B que reconhecem determinantes da região S, pre-S2, e pre-Sl presumivelmente
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-39no polipéptido p39 do AgHBs.
Parece, contudo, que podem existir diferenças qualitativas ou pelo menos quantitativas entre auxílio de célula T em relação a células B reconhecendo determinantes dentro da mesma região reconhecida por células T, versus auxílio pa ra células B reconhecendo determinantes numa região não reco, nhecida por células T. Por exemplo, a estirpe B1O.FI foi de resposta elevada em termos de produção de anticorpo anti-pre-Sl, mas de resposta baixa em termos de produção de anticorpo anti-S e anti-pre-S2 apés imunização com AgHBs/p39. De forma semelhante, após imunização com AgHBs/p33, ratos B1O.S re conheceram somente a região pre-S2 a nível da célula T, e produziram mais anticorpo específico pre-S2 que anticorpo es. pecífico S. Além disso, o anticorpo anti-S produzido pela estirpe B10.S foi em primeiro lugar específico de subtipo em oposição aos anticorpos anti-S específicos de grupo e de subtipo produzidos por estirpes que reconhecem a região S em ambos os níveis de célula B e de célula T; Milich e col.; (1985) Proc. Matl. Acad. Sei. U.S.A., 82:8168.
Diversas sequências candidatas foram identificadas pa, ra traçar os locais de reconhecimento de células T e B na re gião pre-Sl do AgHBs. A imunização com partículas AgHBs/p39 nativas provocou uma resposta de IgG específica para a sequêri cia p94-117 da pre-Sl em todas as estirpes ΒΙΟ, H-2 congénicas estudadas, e uma resposta p32-53 específica nas estirpes B10, B1O.D2 e B10.M. A resposta variável de anticorpo para a sequência p32-53 sugere ainda a influência de especificida de de célula T ligada a H-2 sobre a especificidade do anticorpo visto que todas estas estirpes partilham os mesmos antecedentes genéticas de B10 e presumivelmente os mesmos reportórios de célula B.
A única diferença significativa entre soros positivos anti-pre-Sl murino e humano foram as respostas dirigidas ao terminal amino (pl-21, pl2-32) observadas no soro humano. Es. ta especificidade foi já observada em soro humano de doentes com VHB por outros investigadores; Neurath e col., (1985) Nature (London), 315:154. A falta desta especificidade nos
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-40soros murinos pode ser única para a estirpe B10 e tem de ser examinada em ratos com outros antecedentes genéticos.
Ao nível da célula T, a sequência pl2-32 específica para pre-Sl pareceu representar um local de reconhecimento de célula T pelo menos na estirpe SOL/O. Os ratos estimulados com AgHBs/p39 demonstraram activação de célula T específica para ambos AgHBs/p39 e pl2-32 in vitro. De forma semelhante, ratos SOL/J estimulados com pl2-32 demonstraram respostas de célula T específicos para ambos AgHBs/p39 e pl2-32 in vitro. As células T estimuladas com péptido sintético pl2-32 responderam melhor ao AgHBs/p39 que as pl2-32 numa ba se molar. Assumindo que a eficácia de processamento do anti génio (imunogénio) de uma partícula em comparação com um poli, péptido não é responsável, estes dados sugerem que uma eleva, da percentagem de células T SOL/O estimuladas com pl2-32 reconhecem esta sequência no AgHBs/p39. Outros estudos serão necessários para determinar a frequência destas células T dentro da população específica pre-Sl, e a distribuição desta especificidade de célula T noutros genotipos H-2.
Os resultados acumulados dos estudos correntes sobre a resposta imunológica para as regiões pre-S do AgHBs têm im plicações importantes em termos de desenvolvimento de vacina AgHBs futuro. Trabalhos anteriores sugeriram um número ines. peradamente baixo de locais de reconhecimento de células T no AgHBs/p25 considerando a sua natureza particular e o tarna. nho do polipéptido subunitário (226 aminoácidos); Milich e col. , (1985) 3.Immunol., 134:4203. Isto foi reflectido na capacidade para identificar pelo menos dois halotipos H-2 mu rinos (H-2^’s) que eram totalmente não-respondedores, e um (Η-2^) qUe era S(5 respondedor a determinantes de subtipo após imunização com AgHBs/p25; Milich e col., (1984) 3. Exp. Med., 159:41. Em oposição, um halotipo não respondedor após imunização com AgHBs/p39 não foi ainda identificado de entre os seguintes halotipos H-2 estudados até à data: q, d, s, k, b, p, f, t4.
Como acima discutido, a falta de incapacidade de res-
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-41posta para o AgHBs/p39 pode ser atribuída a um aumento de com plexidade para o reconhecimento de célula T. Ao nível da cé lula T, as regiões pre-S2 e pre-Sl proporcionam heterogeneidade antigénica adicional para AgHBs/p25, que compreende a vacina Americana derivada do plasma corrente (Heptavax-B, Fie rek Sharp and Dohme, Philadelphia, PA). Portanto, a inclusão de sequências pre-S em vacinas AgHBs pode diminuir a incidência de incapacidade de resposta genética, e proporcionar uma partícula AgHBs mais imunogénica baseada na imunogeni cidade aumentada da região pre-S2; Milich e col., (1985) Science, 228:1195.
z
E importante verificar que as partículas AgHBs/p39 d.e rivadas do soro aqui estudadas continham quantidades menores das proteínas da região pre-Sl e pre-S2 numa proporção especi fica para a proteína da região S maior. As estratégias para produzir partículas AgHBs recombinante para o desenvolvimento da vacina deveriam ter em conta a possibilidade de que al. terações drásticas na proporção da proteína de região pre-S para S pode afectar a antigenicidade e/ou imunogenicidade.
As implicações destes resultados em relação à depuração virai não são tão evidentes como para □ desenvolvimento da vacina. Embora os polipéptidos contendo pre-S representem um componente menor (1-10/) de proteína em partículas, derivadas do soro, esféricas AgHBs de 22 nanómetros (nm), e_s tes polipéptidos de peso molecular mais elevado (AgHBs/p33 e AgHBs/p39 podem corresponder a até 40/ da proteína total no virião intacto; Heerman e col., (1984) 3. Virol., 52:396. Portanto, a resposta imunológica para as partículas AgHBs/ /p39 aproxima-se muito a uma resposta imunológica específica do VHB.
z *
E evidente a partir do presente trabalho e dos estudos anteriores (Neurath e col., (1984) Science, 224:392, Neju rath e col., (1985) Nature (London), 315:154) que os antico£ pos específicos para pre-Sl e pre-S2, bem como específicos para S, são produzidos durante a infecção no homem por VHB. Contudo, a produção de anticorpos específicos para as regiI 66 397
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-42ões pre-Sl, pre-S2 e S do AgHBs não são preditores de respos. tas específicas de célula T visto que o auxílio de célula T pode derivar de uma população de células T limitadas ao reco nhecimsnto de uma só região. Isto é importante no contexto da hipótese de que a depuração do VHB é mediado ao nível da célula T. Por exemplo, uma resposta de célula T citotóxica ou de célula T de auxílio específica para pre-S2 pode ser ne cessária para uma depuração virai, mas não é necessária para a produção de anticorpo anti-pre-S2, como foi observado na estirpe B1O.M.
Tem sido descrito que um certo número de não responde, dores à vacina AgHBs/p25 que foram subsequentemente infectados com VHB, não só limparam a infecção (i.e. não se tornaram portadores crónicos) mas produziram também uma resposta de anticorpo da região anti-S; Walker e col., (1931) Transfusion, 21.:601 (Resumo). Uma explicação possível deste fenó. meno é que aquando da infecção com VHB, as células T específicas pre-S proporcionaram auxílio para as células B específicas da região S resultando em produção anti-S por não respondedores à vacina, análogos aos modelos murinos B10.S e B10.M. Como estes doentes limparam a infecção, o papel das células de auxílio T específicas da região S na depuração vi. ral mantém-se problemática. Contudo, a necessidade pela jun ção de célula T específica de pre-S necessita ser examinada.
A produção recente de ratos transgénicos, que exprimem ambos os determinantes antigénicos S e pre-S (Chisari e col., (1985) Science, 230:1157), deve proporcionar um modelo para estudar as respostas de célula T citolíticas específicas para S e pre-S. Pensa-se que o espectro de manifestaçães clínicas da infecção por VHB correlaciona-se com a capacidade genética do hospedeiro para acumular uma resposta de célu la T adequada para um só ou um grupo de determinantes virais. Torna-se claro a partir deste estudo que os polipéptidos do invólucro do VHB apresentam uma depuração de determinantes de célula T que o hospedeiro consegue reconhecer, e a especi ficidade deste processo de reconhecimento pode ser influen66 397
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-43ciada por genes ligados a complexos de histocompatibilidade major (MHC).
B. Composição polipéptida das Partículas AgHBs Usadas neste estudo
Como as partículas AgHBs podem ser variavelmente compostas de p25, p33 e p39, era importante caracterizar as pa_r tículas AgHBs utilizadas em relação à proporção destes poli péptidos. Preparações purificadas de AgHBs foram ensaiadas para a antigenicidade S, pre-S2 e pre-Sl através de ELISA de fase sólida em sanduíche descrita em detalhe na Secção VII C2. As antigenicidades relativas das três preparações do AgHBs, (1) partículas AgHBs/p39 que continham polipéptidos da região pre-Sl, pre-S2 e S; (2) partículas AgHBs/p33 que con' tinham polipéptidos da região pre-S2 e Ξ; e (3) partículas AgHBs/p25 que continham somente polipéptido da região S, estão ilustradas na Figura 2.
Em comparação com uma preparação de AgHBs padrão de composição polipéptida conhecida, a percentagem aproximada de moléculas possuindo uma dada região, podia ser calculada. Por exemplo, as preparações AgHBs apresentadas na Figura 2 ti nham as seguintes composições: para AgHBs/p39, pre-Sl 5,1/, pre-S2 6,5/, S 100/; em relação ao AgHBs/p33, pre-Sl 0/, pre-S2 38,5/, S 100/, e para AgHBs/p25, pre-Sl 0/, pre-S2 0/, S 100,3. Dito de forma diferente, usando □ AgHBs/p39 como exemplo, todas as moléculas das partículas continham antigénio polipéptido S, enquanto que 6,5/ continham polipéptido pre-S2, e somente 5,1/ continham também antigénio polipéptido pre-Sl.
C. Produção de Anticorpo in vivo Apés Imunização com AgHBs/
Ze22
Grupos de cinco ratos cada a partir de um painel de estirpes congénicas H-2 foram imunizados a reforçados com uma preparação de AgHBs/p39 representando uma dose de 2,0 e polipéptido da região S, 0,04 o polipéptido da
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-44pre-S2 e 0,026 do polipéptido da região pre-Sl como descrito na Secção VII B. Duas semanas após o reforço, os soros foram separados e testados para a reactividade contra um painel de antigénios como ilustrado no Quadro 3.
QUADRO 3
A resposta humoral após imunização com AgHEs/p39
Estirpe H-2 Título de Anticorpo (1/diluição)
Antigênio ligado à fase sólida
| AgHBs/p39 | AgHBs/p33 | A gHBs/p25 | Péptido Pre-S2 | Péptido Pre-Sl | ||
| 810.D2 | d | 81.920 | 40.960 | 81.920 | 5.120 | 640 |
| B10 | b | 20.480 | 40.960 | 20.480 | 40.960 | 10.240 |
| B10.BR | k | 5.120 | 5.120 | 5.120 | 1.280 | 2.560 |
| B10.S | s | 10.240 | 10.240 | 5.120 | 10.240 | 1.280 |
| B10.M | f | 10.240 | 2.560 | 10.240 | 1.280 | 10.240 |
Péptido pre-S2, pl20-145 a partir da sequência ayw da região pre-S do AgHBs.
Péptido pre-Sl, p94-117 a partir da sequência aduM da região pre-S do AgHBs.
De uma forma significativa, todas as estirpes produziram anticorpos específicos para os determinantes S, pre-Sl e pre-S2, embora o polipéptido pre-S estivesse presente somente em quantidades vestigiais em comparação com a quantida de do polipéptido da região S. Isto também é digno de menção, visto que as estirpes B10.S e B10.M eram não respondedo, ras para a região S após imunização com AgHBs/p25; Milich e col., (1984) J. Exp. Med., 159:41. A estirpe B10.M não respondia também para a região pre-S2 após imunização em AgHBs/ /p33; Milich e col., (1985) Sçj ence, 228:1195. Isto sugeriu
397
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-45que a resposta imunológica para a região pre-Sl pode influejr ciar as respostas do anticorpo para outras regiões. Que a região pre-S2 pode influenciar positivamente as respostas p.a ra os determinantes da região S, foi já previamente demonstra, do; Milich e col., (1985) Proc. Natl. Açad. Sei. U.S.A,, .82:8168, Milich e col., (1985) Science, 228:1195.
A hierarquia de status de resposta para a região S aquando da imunização com AgHBs/p25 é: B10.D2 é superior a B10 superior a B1O.BR as estirpes B1O.S e B1D.M são não τεεί pondedoras; Milich e col., (1984) 3. Exp. Me d. , 159:41. Co_n tudo, após imunização com AgHBs/p39 esta hierarquia, que era baseada,e pelo menos,numa diferençado 4 vezes, xxixjxxrexxxx (significativo) entre estirpes, mudou para 810.D2 superior a B10, superior a B10.M, B10.BR, e B10.S como analisado em AgHBs/p25. Quando as respostas do anticorpo para a região pre-S2 após imunização com AgHBs/p39 foram analisadas utilizando um polipéptido sintético específico para pre-S2, pl20-145, como a substância de ligação ligada à fase sólida, evi. denciou-se outro padrão: B10 superior a B10.S e B10.D2 supjs rior a B10.BR e B10.M. Finalmente quando as respostas de ari ticorpos específicos para a região pre-Sl após imunização a AgHBs/p39 foram classificadas, apareceu um terceiro padrão: ) B10.M e B10 superior a B10.BR e B1D.S superior a B10.D2 como ilustrado no quadro 3 anterior. Como estas estirpes são H-2 - congénicas. Os dados indicaram que as três respostas de anticorpo para polipéptidos da região S, pre-S2 e pre-Sl podem ser reguladas independentemente por genes ligados a H-2. Isto prevê que as células de auxílio T (Th) podem reconhecer determinantes únicos em cada região, e essas células Th são restringidas H-2, independentemente.
A existência de regulação distinta das respostas imunológicas para os determinantes da região S, pre-S2 e pre-Sl, torna-se mais clara quando as respostas secundárias após imu. nização com AgHBs/p39 são directamente comparadas para as respostas secundárias após imunizações com AgHBs/p25 e AgHBs/p33 num painel de ratos congénicos H-2 como se mostra no Quadro 4, abaixo.
397
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-46QUADRO 4
Influência do Genotipo H-2 sobre a resposta humoral a partículas AgHBs de composição variada
| Imunogénio | Estirpe | H-2 | Título de Anticorpo Específico para: (1/diluição) | ||
| S | pre-S2 | pre-Sl | |||
| AgHBs/p25 | B10.D2 | d | 81.920 | 0 | 0 |
| B10 | b | 20.480 | 0 | 0 | |
| B10. B R | k | 5.120 | 0 | 0 | |
| 310.S | s | 0 | 0 | 0 | |
| B10.M | f | 0 | 0 | 0 | |
| AgHBs/p33 | B10.D2 | d | 40.960 | 10,240 | 0 |
| B10 | b | 10.240 | 40.960 | 0 | |
| B1O.BR | k | 1.280 | 2.560 | 0 | |
| B10.S | s | 640a | 10.240 | 0 | |
| BlO.Fi | f | 0 | 0 | 0 | |
| AgHBs/p39 | B10.D2 | d | 81.920 | 5.120 | 640 |
| B10 | b | 20.480 | 40.960 | 10.240 | |
| B1O.BR | k | 5.120 | 1.280 | 2.560 | |
| B1O.S | s | 5.120 | 10.240 | 1.280 | |
| B10.H | f | 10.240 | 1.280 | 10.240 |
Os números sublinhados representam uma resposta de antico^ po para uma região específica do AgHBs que não foi observado quando a estirpe foi imunizada com esse mesmo antigénio; i.e., B1O.S foi não respondedor para a região S quando imunizado com AgHBs/p25.
Os dados acima ilustram que a imunização com AgHBs/p25 provocava respostas na região anti-S em todas as estirpes ex cepto B1O.S e B1O.M. A imunização com AgHBs/p33 provocou
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-47respostas anti-pre-S2 em todas as estirpes excepto a estirpe B10.H.É de notar que provocou também uma resposta anti-S na região S não respondedora, estirpe B1O.S, indicada pelo número sublinhado no Quadro 4.
A resposta anti-S da estirpe B1O.S resultou a partir do auxílio de célula T específica para a pre-S2 a clones de célula B específicos S; r.ilich e col., (1935) Proc. Natl. Açad. Sei. U.S.fl., 182:8168, fsilich e col., (1985) Science, 223:1195. Portanto, a imunização com AgHBs/p33 proporcionou um local (locais) de reconhecimento de célula T adicional pa. ra ratos B1O.S.
A disponibilidade de uma estirpe não respondedora para ambos os determinantes de região S e pre-S2 (BIO.F.) permitiu determinar se a região pre-Sl proporcionava centros de reconhecimento de célula T alternativos que a B1O.M era capaz de reconhecer e, sendo assim, se o reconhecimento de pre-Sl ao nível da célula T influenciou a resposta de anticorpo para B1O.M para as regiães pre-S2 e S. A imunização com AgHBs/p39 provocou respostas específicas anti-pre-Sl em todas as estirpes, e, além disso, provocou respostas anti-S e anti-pre-S2 em todas as estirpes incluindo uma resposta específica-S na estirpe B1O.S não respondedora e respostas específicas Ξ e pre-S2 na estirpe B1O.M não respondedora, como indicado pelos números sublinhados no Quadro 4. Este resultado sugere que a estirpe B1O.M possuía células T específicas de pre-Sl que eram capazes de auxiliar clones de células B específicos para os determinantes da região S e pre-S2 bem como clones de célula B específicos para pre-Sl.
D. Especificidade precisa da Resposta Humoral Específica Pre-Sl Murina péptido sintético utilizado acima na Secção C e de£ crito no Quadro 3 (p94-117) como um ligante específico pre-Sl foi escolhido baseado na observação de que sé o péptido sintético p94-117 ligado ao anticorpo de todas as estirpes imunizava com AgHBs/p39 como ilustrado no Quadro 5, abaixo.
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-40QUADRO 5
Especificidade precisa da resposta do Anticorpo para a região pre-Sl do AgHBs/p39
Estirpe Título de Anticorpo (1/diluição)
Sequência polipéptida sintética de pre-Sl (adiu)
| pl-21 pl2-32 | p32-53 | p53-74 | p94-117 | ||
| A gHBs/p39 | como | imunogénio | |||
| B10.D2 | 0 0 | 2.560 | □ | 640 | |
| B10 | 0 0 | 160 | 0 | 10.240 | |
| B10.BR | 0 0 | 0 | 0 | 2.560 | |
| B10.S | 0 0 | 0 | 0 | 1.280 | |
| B10.M | 0 0 | 640 | 0 | 10.240 | |
| A gHBs/p25 | como | imunogénio | |||
| B10.D2 | 0 0 | 0 | 0 | 0 | |
| AgHBs/p33 | como | imunogénio | |||
| B10.D2 | 0 0 | 0 | 0 | 0 | |
| Os | dados | do Quadro 5 mos | tram também | que as | estirpes |
B10.D2, B10, e B1O.M produziram um anticorpo que reagiu com p32-53 de uma região pre-Sl. Ratos imunizados com partículas AgHBs não possuindo um polipéptido de região pre-Sl não produziu qualquer anticorpo reactivo com o painel dos péptidos específicos pre-Sl como exemplificado pelas respostas B10.D2 à imunização com AgHBs/p25 e AgHBs/p33.
Ratos SOL foram imunizados com 100 de pl2-32 por rato noutro estudo. A resposta proliferativa de célula T in vitro a pl2-32, pl-21, duas preparações de AgHBs/p39, bem como AgHBs/p33 e AgHBs/p25 foram determinadas. Como ilustra
397
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-49do na Figura 9, pl2-32, pl-21 e ambas as preparações de AgHBs/ /p39 simularam proliferação de célula T, enquanto AgHBs/p33 e AgHBs/p25 não simularam respostas proliferativas. Como pl2-32 e pl-21 simularam ambos a resposta de célula T, o ep_í topo de célula T estava localizado em pl2-21, os resíduos contidos em ambos os péptidos.
anticorpo humoral induzido por p!2-32 foi analisado por ELISA para a reactividade com pl2-32 e pl-21. Como ilus trado no gráfico de barras inserido na Figura 9, estava presente um elevado título de anti-pl2-32 e nenhum anticorpo p.a ra pl-21. Portanto, pl2-21 não contém um epítopo de célula T completo reconhecido por aquela estirpe murina, 0 polipéptido pl2-32 continha um epítopo de célula S. Esse epítopo é pl6-27.
Quadro 6, abaixo, ilustra que polipéptidos sintéticos pre-Sl estimularam a produção de anticorpo in vivo para as regiões pre-Sl, pre-S2 e S do AgHBs.
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-50QUADRO 6
Polipéptidos sintético pre-Sl estimularam a produção in vivo para as regiões Pre-Sl, Pre-S2 e S do AgHBs
Título de anticorpo para: (1/diluição)
| Imunogênio | Tem po^ | Ξ | Epítopos pre-Sl | |||
| AgHBs/ /p25 | Pre-S2 P120-145 | pl2-32 | p32-53 | p94-117 | ||
| 0 | 1 | 0 | 0 | 0 | 40 | 0 |
| A gHBs/p39 | 3 | 1280 | 640 | 0 | 40 | 0 |
| pl2-32 | 1 | 0 | 0 | 640 | 0 | 0 |
| 0 | 3 | 0 | 0 | 640 | 0 | 0 |
| P12-32 | 1 | 80c | 2560 | 2560 | 40 | 0 |
| AgHBs/p39 | 3 | 10.240 | 2560 | 5120 | 40 | 40 |
| P94-117 | 1 | 0 | 0 | 0 | 0 | 640 |
| 0 | 3 | 0 | 0 | 0 | 0 | 640 |
| p94-117 | 1 | 12 | 640 | 0 | 2560 | 20.480 |
| AgHBs/p39 | 3 | 1280 | 5120 | 0 | 1280 | 10.240 |
| 3 Grupos de | 4 ratos foram | estimulados com | 100 yU/g | dos pépti | ||
| dos indicados | ou com nenhum imunogénio | (0) em CFA, e re- |
forçados4 semanas depois com 1 yig de AgHBs/p39 ou nenhum imunogénio (C) em adjuvante de Freund incompleto como mos. trado.
& Semanas após o reforço.
c
Os números sublinhados representam uma diferença de pelo menos 4 vezes a partir do grupo de controlo não estimula do.
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-51Os dados do Quadro acima demonstram que os ratos est mulados com pl2-32 produziram anticorpo para as regiões pol péptidas pre-Sl, pre-S2 e S. Contudo, enquanto os ratos estimulados com p-94-117 produziram anticorpos significativamente aumentados para polipéptidos da região pre-S2 e pre-Sl, às três semanas após imunização secundária (reforço) com AgHBs/p39, os ratos produziram anticorpo do mesmo título para a região S que os controlos não estimulados. Portanto, p94-117 não estimulados para a produção de anticorpo da região S em ratos da estirpe SOL.
Em adição, o uso de pl-21, pl2-21 e pl2-32 em estudos de proliferação de célula T mostraram resultados comparáveis independentemente de qual dos três polipéptidos foi usado. Aqueles resultados dos estudos de proliferação bem como os resultados acima discutidos, demonstram a presença de um epX topo de célula T nas posições 12 a 21 a partir da terminação amino da região pre-Sl AgHBs em ambos os níveis de função de auxílio e proliferativo.
E. Especificidade precisa da Resposta Humoral Específica de pre-Sl Humana Durante Infecção Aguda por VHB
Soros de sete doentes com VHB aguda recolhidos durante ou pouco após a doença clínica e soros de quatro humanos normais (NHS) (dadores que não tinham sido infectados com VHB) foram examinados para detectar a presença de anticorpo IgG específico para pre-Sl. Os polipéptidos sintéticos pre—S1 usados pars analisar a especificidade da resposta murina foram utilizados como antigénios ligados à fase sólida. Estes dados estão ilustrados no Quadro 7 abaixo.
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-52QUADRO 7
Especificidade precisa da resposta humoral específica para pre-Sl humana durante infecção aguda por VHB
| Doente Ne. | Sequência péptida sintética pre-Sl (adiu) do anticorpo (unidades OD^g)3 | ||||
| pl-21 | P12-32 | p32-53 | p53-74 | p94-117 | |
| 2673 | 0,03 | 0,06 | 0,09 | 0,02 | 0,40b |
| 2674 | 0,06 | 0,16 | 0,26 | 0,08 | 0,95 |
| 2681 | 0,04 | 1,50 | 0,52 | 0,07 | 0,50 |
| 2686 | 1,50 | 1,20 | 0,02 | 0,70 | |
| 2689 | 0,40 | 0,34 | 0,22 | âxlâ | 0,10 |
| 2690 | 0,08 | 0,30 | 0,18 | 0,03 | 0,03 |
| 2693 | 0,29 | 0,06 | 0,08 | 0,05 | 0,07 |
| NHS | 0,07 | 0,03 | 0,03 | 0,01 | 0,03 |
| NHS | 0,07 | 0,02 | 0,04 | 0,04 | 0,03 |
| NHS | 0,03 | 0,03 | 0,04 | 0,02 | 0,04 |
| NHS | 0,03 | 0,03 | 0,02 | 0,02 | 0,03 |
Diluições 1:50 de soro humano de doentes com infecção aqu da de hepatite B (números) ou pessoas normais (NHS) que não foram expostas a VHB‘ foram incubados (misturados e mantidos) com os polipéptidos ligados à fase sólida indicados como antigénios, e sondados com IgG anti-humana monoclonal marcada com enzima. Os valores de controlo varã, aram de 0,01 a 0,08.
As leituras sublinhadas são pelo menos 4 vezes (significa tivo) ou mais/que a leitura feita em depósitos de controlo não revestidos com polipéptido.
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-53Como ilustrado no Quadro 7, todos os soros de VHB agjj da ensaiados continham anticorpos específicos para pelo menos um dos polipéptidos pre-Sl, enquanto que, todos os quatro soros normais (ΝΗΞ) eram negativos. Semelhante a antiso. ros murinos imunizados com AgHBs/p39, um polipéptido sintéti co contendo resíduos pre-Sl 94-117 (p94-117) e p32-53, repre sentou locais de ligação de anticorpo humano nativo, enquanto que, p53-74 foi sé reconhecido pelo soro de um doente. De forma diferente da resposta murina (usando 310 como base), quatro de sete soros de VHB aguda humanos ligaram a sequência terminal amino pl-21 e quatro ligaram pl2-32. A produção de anticorpos específicos pl2-32 em soro de fase aguda foi já previamente descrita: Neurath e col., (1985) Nature (London), 315:154.
Torna-se evidente a partir destes dados que a resposta anti-pre-Sl humana pode incluir especificidades múltiplas. Estes resultados confirmam a ocorrência de uma resposta humo ram específica pre-Sl durante o curso de uma infecção aguda por VHB no homem.
F. A Especificidade das Respostas Proliferativas de Célula
T para AgHBs/p39 Estava Dependente do Genotipo da Estirpe Respondedora
Para examinar directamente a resposta de célula T para AgHBs/p39, e para confirmar a hipótese que após a imuniza, ção com AgHBs/p39 as células Th específicas para pre-Sl podiam contornar a falta de resposta para as regiões S e pre-S2 ratos Balb/c (H-2d), S3L/3 (H-2S) e B1D.M (H-2f) foram imunizados com AgHBs/p39. As respostas proliferativas de cé lula T específicas para AgHBs/p25, AgHBs/p33 e AgHBs/p39, fo ram determinadas. Como se desejava provocar uma resposta de célula T específica para pre-Sl, utilizaram-se partículas AgHBs/p39 contendo uma quantidade superior de pre-Sl que as partículas usadas nos estudos de anticorpo discutidas na Se£ ção V C, acima (i.e. 5,1/í vs. 2,5;ó pre-Sl). A resposta de anticorpo à imunização por AgHBs/p39 na estirpe Balb/c foi
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-54equivalente à estirpe B10:D2 de idêntico H-2. A resposta do anticorpo da estirpe S3L./3 foi semelhante à resposta B1O.S de idêntico H-2.
Estes halotipos H-2 foram escolhidos porque representavam três padrões distintos de produção de antibiótico em termos de especificidade. A estirpe Balb/c respondeu às regiões polipéptidas S, pre-S2 e pre-Sl após imunização com a partícula AgHBs apropriada. A estirpe SJL/J não respondeu à região S quando imunizada com AgHBs/p25, mas respondeu às re giões pre-S2 e pre-Sl. A estirpe 310.M não respondeu às regiões S e pre-S2 após imunização com AgHBs/p25 e AgHBs/p33 e só respondeu à imunização com AgHBs/p89 como demonstrado no Juadro 4 acima.
A resposta proliferativa de célula T Balb/c após imunização com AgHBs/p39 está apresentada na Figura 3. Células T estimuladas com AgHBs/p39 foram activadas por partículas AgH3s/p25, AgHBs/p33 e AgHBs/p39 in vitro. As curvas de res_ posta de dose indicaram que as células T específicas para a região S e para a região pre-S2 estão presentes na estirpe Balb/c. Contudo, a estimulação quase equivalente induzida com AgHBs/p33 e AgHBs/p39 torna difícil interpretar a contri buição de células T específicas para pre-Sl na resposta proliferativa desta estirpe.
Em contraste, a estirpe SJL/J demonstrou claramente uma resposta específica para pre-S2 visto que AgH3s/p25 não foi estimulante, enquanto que AgHBs/p33 induziu uma resposta proliferativa. Aqueles resultados estão ilustrados na Figura 4. 0 efeito aditivo observado quando AgHBs/p39 foi o antigénio provocador, mostrou claramente que uma população de células T específica para pre-Sl estava também presente.
g
Portanto, as estirpes oossuindo H-2 não responderam à região Ξ ao nível de célula T quer o imunogénio fosse AgHBs/p25, AgHBs/p33 (Fiilich e col., (1985) Proc. Natl. Açad. Sei. U.5.A., 82:8168), quer AgHBs/p39 (Figura 4). Mesmo assim, essa estirpe produziu anticorpos anti-S após imunização
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-55com AgHBs/p33 ou AgHBs/p39, como se mostra no Quadro 4, acima. Apôs imunização com AgHBs/p39 na estirpe ΒΙΟ.M,soo AgHBs/ /p39 induziu uma resposta de célula T proligerativa in vitro, como ilustrado na Figura 5, indicando uma resposta específica para pre-Sl exclusiva.
f
Portanto, as estirpes possuindo H-2 não responderam aos polipéptidos da região S e pre-S2 ao nível da célula T quer o antigénio estimulante fosse AgHBs/p25 (Fiilich e col., (1985) J, Immunol., 134:4194), AgHBs/p33 (Hilich e col., (1985) Proc. Natl. Açad. Sçj. U.S.A., 82.:8168) quer AgHBs/p39, como se mostra na Figura 5. Mesmo assim essa estirpe produziu anticorpo anti-S e anti-pre-S2 apôs imunização com AgHBs/ /p39, como se mostra no Quadro 4. Isto indica que na estirpe B1O.M todas as especificidades dos anticorpos produzidos apôs imunização com AgHBs/p39 resultaram da função de auxílio de célula T específica para pre-Sl.
Para demonstrar que a resposta proliferativa de célula T específica para pre-Sl da estirpe B1O.M não foi única para o imunogénio, células T estimuladas com AgHBs/p39 foram esti muladas in vitro com cinco preparaçães de partículas AgHBs/ /p39 separadas (três do subtipo ad; e duas do subtipo ay), possuindo quantidades variáveis de p39, como ilustrado na Fi gura 6. Todas as preparaçães AgHBs/p39, independentemente do subtipo, induziram uma resposta proliferativa que estava relacionada com a quantidade de p39 presente na preparação AgHBs. Isto indicou a presença de uma resposta de célula T específica de grupo na estirpe B10.M, mas não impediu a exis tência de uma população de célula T específica de subtipo.
G, Definição de um Local de Reconhecimento de Célula T na Região Pre-Sl do AgHBs/p39
Para examinar a especificidade precisa de célula T pa. ra os determinantes polipéptidos da região pre-Sl, células T SJL/3 estimuladas com AgHBs/p39 foram estimuladas com péptidos sintéticos da região pre-Sl como se mostra na Figura 7. Todos os polipéptidos sintéticos induziram respostas prolife
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-56rativas a concentrações relativamente elevadas /~50-200 microgramas por mililitro ( yvg/ml)_7. Os polipéptidos sintéticos específicos da região pre-S2 e S não provocaram uma resposta. Só pl2-32 induziu uma resposta proliferativa significativa, embora baixa, ao longo de toda a curva de resposta de dose.
Por esta razão, ratos SJL/O foram imunizados com 100 yuug de pl2-32 em adjuvante de Freund completo (CFA). As res. postas de célula T proliferativas in vitro provocadas com pl2-32, duas preparações de AgHBs/p39 e AgHBs/p33, foram determinadas .
Como se mostra na Figura 8, células T estimuladas com pl2-32 proliferaram em resposta ao polipéptido homólogo e a ambas as preparações AgHBs/p39, mas não ao AgHBs/p33 que não tem a região pre-Sl. Numa base de peso, o péptido sintético provocou uma resposta proliferativa de célula T ligeiramente superior. Contudo, numa base molar, o AgHBs/p39 foi superior; i.e. para provocar 20.000 CPK, foram necessários 0,03 micromoles ( yJM) de AgHBs/p39 e 18 de pl2-32. Portanto, pare ce que em ratos SJL/O o polipéptido sintético pl2-32 estimulou células T capazes de reconhecer a sequência homóloga específica para pre-Sl no polipéptido p39 provavelmente transformado.
VI. Um polipéptido sintético correspondendo a uma porção de uma região pre-S2de AgHBs continha determinantes de célula T e B não sobreponíveis e determinantes de célula B sobreponíveis distintos
A. Determinantes de Célula Te B não sobreponíveis
Examinou-se um reconhecimento de célula T de um AgHBs, o polipéptido sintético da região pre-S2 (pl20-145) que mostrou previamente ser imunogénico (Neurath e col., (1984) Science, 224:392)« e representar um local de ligação de anti corpo dominante na região pre-S2 nativa /Milich e col., (1985) Science, 228:392 7. Os resultados deste estudo indicaram o seguinte: (1) a resposta anti-p!20-145 foi regulada por ge-
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-57nes ligados por H-2, mas eram diferentes do padrão da restri ção H-2 observada para a resposta anti-pre-S2 nativa; (2) lo cais de reconhecimento de célula T e B dominantes, não sobre poníveis, foram identificados no pêptido sintético pl20-145;
(3) a especificidade precisa do reconhecimento da célula T do pl20-145 foi definida por umasé substituição aminoâcida;
(4) 0 pêptido sintético contendo ambos os determinantes de célula T e B foi altamente imunogénico em estirpes respondedoras, enquanto que, determinantes péptidos de célula T ou de célula B separados foram minimamente imunogénicos; e (5) o local de reconhecimento de célula T sintético estimulou auxí. lio de célula T para produção de anticorpo para 0 local de célula B sintético, 0 qual foi reactivo de forma cruzada com a região pre-S2 nativa.
Trabalho anterior demonstrou a influência de genes l_i gados por H-2 na produção de anticorpo e na resposta prolife rativa de célula T para a região pre-S2 nativa do AgHBs; Mi lich e col., (1985) Science, 228:392, Milich e col., (1985) Proc. Natl. Acad. Sçj. U.S.A., 82.:8168. A ordem escalonada de capacidade de resposta ao nível do anticorpo estava relacionada com as respostas proliferativas de célula T e foi a seguinte: B10 superior a B10.D2 superior a B1O.S superior a B1O.BR superior a B1O.M (não respondedora). Como 0 anticorpo específico para a região pre-S2 nativa e para 0 polipépti do sintético foram altamente reactivos de forma cruzada como descrito em Milich e col., (1985) Science, 228:392. e daqui em diante foi possível comparar a influência de genes ligados por H-2 sobre a produção de anticorpo in vitro para a re gião pre-S2 nativa versus o polipéptido sintético pl20-145.
Embora a região pre-S2 exista num polipéptido maior (p33), que inclui determinantes antigénicos do polipéptido da região S, e no contexto de partículas AgHBs, as respostas de anticorpo específico para pre-S2 e de célula T têm mostra do ser de magnitude superior, precedidas no tempo, ocorridas a uma dose de AgHBs inferior e foram independentemente reguladas em oposição às respostas específicas para a região S
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-58/~Milich e col., (1985) Science, 228:392, Milich e col., (1985) Proc. Natl Açad» Sei. U.S.A., 82:81687« Portanto, as influências genéticas e outras da resposta imunolégica pa, ra a região S sobre a resposta imunolégica para a região pre-S2, pode ser discriminada e/ou negada.
A ordem escalonada de capacidade de resposta para pl20-145 após imunização com o polipéptido sintético homólogo, não conjugado pl20-145 foi: B1O.BR superior a B10 e B1O.S superior a B10.D2 e B10.M (não respondedoras) foi claramente diferente da observada após imunização com partículas contendo região pre-S2 (AgHBs/p33). Por exemplo, a estirpe B10.D2 produziu anticorpos anti-pl20-145 após imunização com AgHBs/p33, mas foi totalmente não respondedora quando imunizada com p!20-145. Como as estirpes B10.D2 e Balb/c (ambas H-2^) respondiam bem ao nível da célula T para a regi ão pre-S2 nativa (Milich e col., (1985) Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A., 82.:8168) mas não para o pl20-145 é evidente que pl20-145 não representa o determinante de célula T na região pre-S2 reconhecida por estirpes possuindo H—2**. De forma ijn versa, a estirpe B1O.BR respondeu pouco quando imunizada com a região pre-S2 intacta, e altamente respondedora após imuni zação com pl20-145. Este facto sugere que determinantes activadoras de supressores podem existir noutro local da proteí^ na nativa que regulam por baixo as respostas específicas P120-145.
Têm sido implicados mecanismos supressores na faixa de resposta baixa da estirpe B1O.BR após imunização com AgHBs/ /p25; Milich e col., (1985) 3» Immunol., 134:4194, Milich e col., (1984) 3. Exp. Med., 159:41. Estes resultados indicam que a imunogenicidade de um polipéptido constituinte, embora esse polipéptido represente um local de ligação de anticorpo dominante na proteína nativa, não foi necessariamente preditores da imunogenicidade da molécula intacta e vice-versa. Além disso, a imunogenicidade de um transportador isento de polipéptido foi criticamente dependente da função de auxílio de célula T, a qual é regulada por genes ligados por H-2.
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-59Como o padrão de restrição H-2 era. diferente após imu nização com pêptido ou AgHBs/p33, torna-se claro que o reconhecimento de locais de célula T em pl20-145 não necessita ser idêntico aos reconhecidos quando a região pre-S2 nativa era o imunogénio. Isto foi mais directamente demonstrado pei la observação de que células T estimuladas por p!20-145 a partir da maior parte das estirpes não reconheceu a região pre-S2 nativa aquando da indução in vitro, e não estimulam uma resposta de anticorpo anti-pre-S2 in vivo após um reforço com AgHBs/p33. Isto foi verdade mesmo na estirpe C^H.Q, que responde muito bem em termos de produção de anticorpo a_n ti-pl20-145 quer imunizado com pl20-145 ou AgHBs/p33. Portanto, um pêptido constituinte pode representar um local de ligação de anticorpo sobre a proteína nativa, mas não tem o local de reconhecimento de célula T relevante para a proteína nativa.
Embora a sequência 120-145 da região pre-S2 não pareça possuir um local de reconhecimento de célula T relevante para a proteína nativa na maior parte das estirpes de ratos, um determinante de célula T dominante, relevante para a imuni zação com pl20-145, foi identificado no terminal amino do pl20-145 (pl20-132). Este determinante de célula T não se sobrepôs com o local de ligação do anticorpo dominante (célu la B) no terminal carboxilo (pl33-145) do pl20-145. Na estirpe CjH.Q, a sequência pl20-132 representou o local de reconhecimento de célula T dominante no pl20-145 como é mostra do pela sua capacidade para activar células T estimuladas por pl20-145 aproximadamente tão bem como o imunogénio, e pela capacidade de pl20-132 de estimular auxílio de célula T para a produção de anticorpo para a sequência pl33-145.
A especificidade precisa do reconhecimento de célula T de pl20-132 foi ainda refinada examinando a influência do subtipo. Os subtipos ayu> e adm2 diferem numa só substituição aminoácida no resíduo 126 na sequência 120-132. Contudo, as células T específicas para p!20-132/aym foram virtualmente sem reacção cruzada sobre p!20-132/adu)2. Reciprocamente, células T específicas para pl30-132/adtu2 foram minimamente
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-60de reacção cruzada com P120-132/aym.
modelo de complexo trimolecular de reconhecimento de célula T proposto por Heber-Katz e col., (1983) 3. Mol. Cell. Immunol, 1:3 sugere que moléculas codificadas Ia de classe II e antigénio interagem fisicamente num sublocal no antigénio (agretopo) e outro sublocal no antigénio contacta o receptor de célula T (epítopo). Em relação ao antigénio pêptido pl20-132, uma só substituição de resíduo aminoácido no resíduo 126 reduziu drasticamente a activação de célula
T. Além disso, a imunização com o polipéptido substituído provocou uma resposta de célula T comparável específica para a substituição.
No contexto do modelo trimolecular, estes resultados eram consistentes com o resíduo 126 representando um local de contacto com o receptor de célula T (epítopo); Schtuartz e col., (1985) 3. Immunol., 135:2598. 0 facto de ambos os polipéptidos serem equivalentemente imunogénicos na estir
vadora treonina para alanina, sugere que o agretopo residiria numa sequência repartida fora do resíduo 126. Se isto fosse verdade, podia-se prever que os dois péptidos competiri am para o mesmo local de ligação Ia (Werdelin, (1982) 3. Immunol., 129:1883, Rock e col., (1983) 3. Exp. Med., 157:1618) e pl20-132/adujp inibiria a activação de células T estimuladas por pl20-132/ayui provpcadp por p!20-132/aym. Contudp, não ocorreu tal inibição, sugerindo que o resíduo 126 pode estar envolvido na interacção com Ia; i.e., um agretopo.
Neste caso, teria de se assumir que ambas as substituições no 126 são permissíveis no contexto de Ia^ (i.e. imu nogénico), e que as interacções trionina vs. alanina-Ia^ influenciam variavelmente o complexo trimolecular ao ponto de que pelo menos dois clones de célula T de reacção não cruzada seriam produzidas numa só sequência primária (epítopo).
Como os estudos de inibição do agretopo não têm tido sucesso universalmente (Schwartz, (1985) Ann. Rev. Immunol., .3:237), a interpretação de que o resíduo 126 representava
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-61um local de contacto com o receptor de célula T ê favorecido pelos presentes inventores e pelos seus colaboradores. Contudo, estudos posteriores com pêptidos sintéticos truncados e substituídos numa série de estirpes congénicas H-2, serão necessários para resolver esta questão.
A observação da resposta proliferativa de célula T p_a ra uma terceira sequência de subtipo, pl20-131 adu/, que dife re da sequência ayw nos resíduos 126, 127, 130, 132 e da sequência adujo nos resíduos 127, 130 e 132, reiterou a importância do resíduo 126 e revelou que os resíduos 127, 130 e 132 não eram críticos para o reconhecimento da célula T. Po.r tanto, um determinante de célula T dominante no pl20-145 foi localizado por tentativas nos resíduos 120-126.
Tendo identificado um local dominante no pl20-145 reconhecido por células T da estirpe C^H.Q e de outras estirpes, era interessante observar a especificidade dos anticorpos produzidos após imunização com pl20-145 em ratos C^H.Q. Em contraste com o reconhecimento de célula T, a maior parte dos anticorpos específicos para pl20-145 Ugaram-se à sequência pl33-145 terminal carboxilo, e demonstraram um elevado grau de reactividade cruzada para a sequência aduu» Além disso, uma grande proporção de anticorpos anti-pl20-145 tiveram reacção cruzada com AgHBs/p33 nativo, ao contrário das células T estimuladas com pl20-145. Adicionalmente, os anticorpos produzidos para a sequência pl20-132 pareceram reconhecer regiões distintas do polipéptido em comparação com o reconhecimento de célula T. Estes resultados indicam que os locais de reconhecimento de célula T e B podem ser distintos, mesmo num péptido sintético pequeno de 13 resíduos.
Como as regiões pre-S2 e S existem no mesmo polipépti do, a utilização de uma só composição imunogénia contendo epítopos de ambas células T e B é exemplificada, e uma tal estratégia tem a vantagem de que uma resposta de célula T pja ra a região pre-S2 evita falta de resposta para a região S na região S não respondedora dos ratos; Milích e col., (1985) Proc. Natl. Açad. Sei. U.S,A., 82:8168. Como o deter
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-62minante sintético de célula T pl20-132 fci capaz de estimular auxílio de célula T para a produção de anticorpo para o determinante de célula B sintético pl33-145, e este anticorpo reagiu com a região pre-S2 nativa, este sistema proporcio nou provas de que os locais de reconhecimento de células T e B sintéticos podem ser combinados para dar um imunogénio cojn posto, funcional, útil numa vacina ou noutro inóculo.
Devido às restrições dependentes de MHC impostas no reconhecimento de célula T do antigénio, diversos locais de reconhecimento de célula T ou uma combinação de polipéptidos livres e conjugados, são para assegurar a capacidade de resposta numa elevada percentagem de recipientes de vacina. A este respeito, a sequência pl20-132 serviu como um local de reconhecimento de célula T em ratos possuindo os halotipos H—2C7,s,k mas não o halotipo H-28.
Um imunogénio sintético ideal é composto por locais de reconhecimento de célula T e B idênticos àqueles reconhecidos na molécula nativa. Um tal imunogénio induz anticorpos protectores e provoca a memória das células T e B relevante para o patogene na eventualidade de uma infecção subs_e quente após um nível de anticorpo protector declinar. Um d_e terminante de célula T sintético também obvia a necessidade de conjugar locais de célula B sintéticos para um transporta dor de proteína heterologo tal como Keyhote limpet hemocyanin ou albumina de soro bovino, embora se possam ainda usar tais transportadores para ambos/e^ítopos de célula B e T. E_n quanto pl20-145 pode não representar o imunogénio da região pre-S2 sintética ideal em ratos, ele representa um imunogénio completamente sintético e funcional, semelhante a um co_n jugado péptido-transportador, que não necessitado transporta dor de proteína heterólogo para provocar a função de auxílio de célula T.
Estes resultados e a identificação dos locais de reco nhecimento de célula T abrangidos pelas regiões S /~Milich e col., (1985) 3. Immunol., 134:4203 7 e pre-Sl do AgHBs nativo (como atrás descrito) aumentou a practicabilidade de uma
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-63vacina do VHB completamente sintética.
1. Sumário reconhecimento da célula T de um polipéptido sintéti co da região pre-S2 do AgHBs, p!20-145, em termos de especificidade precisa, influências genéticas ligada a H-2, comparação com ligação do anticorpo e relevância para □ reconheci mento da célula T da proteína nativa, foi observado. Demons trou-se que a resposta imunológica para o péptido sintético foi regulada por genes ligados por H-2, mas o padrão da restrição H-2 era diferente do observado para a resposta anti-pre-S2 nativa. Os locais de reconhecimento de célula T e de célula B dominantes e não sobreponíveis foram identificados no polipéptido sintético pl20-145. 0 reconhecimento da célula T foi focado na sequência terminal amino (120-132) e o reconhecimento do anticorpo (célula B) foi focado na sequêri cia terminal carboxilo (133-145). A especificidade precisa de reconhecimento da célula T do pl20-145 foi definida por uma sá substituição aminoácida, dependente do subtipo. A es. pecificidade precisa do reconhecimento da célula B está descrita adiante.
Em relação à imunogenicidade do pl20-145, o péptido sintético contendo ambos os determinantes de célula T e B, fci altamente imunogénico em estirpes respondedoras, enquanto que, os determinantes péptidos de célula T ou de célula B separados foram minimamente imunogénicos. Além disso, o local de reconhecimento de célula T sintético estimulou auxílio de célula T para a produção de anticorpo para o local da célula B sintético, o qual tinha reacção cruzada com a região pre-S2 nativa em partículas AgHBs/p33. Este sistema demonstrou que locais de reconhecimento de célula T e de célula B totalmente sintéticos podem ser combinados para dar um imuno génio eficaz.
B. Determinantes de célula B sobreponíveis
A especificidade precisa da resposta humoral para a
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-64região pre-S2 do AgHBs foi observada. Os resultados indicaram: (1) a resposta do anticorpo murino para a região pre-S2 foi dirigida principalmente para os resíduos 133 a 143;
(2) foram identificados dois epitopos distintos,mas sobrepostos,de entre estes 11 resíduos contínuos; (3) um epíto po era específico de grupo, e um epítopo foi influenciado por uma só substituição de resíduo dependente do subtipo, e 0 grau de influência variou com 0 tamanho do antigénio;
(4) 0 tamanho mínimo de ambos os locais de ligação do anticorpo foi de sete resíduos aminoácidos; (5) a forma física e química do imunogénio influenciou a especificidade precisa do anticorpo; (ó) anti-soros humanos reconheceram as sequências da região pre-S2 em comum com anti-soros murinos; e (7) anticorpos com especificidades precisas com ausência de sobreposição bem como com sobreposição para a região pre-S2 foram indistinguíveis pela análise de competição de anticorpo.
Utilizando anticorpos monoclonais específicos de pre-S2 e polipéptidos sintéticos específicos de subtipo e truncados, traçaram-se dois locais de ligação de anticorpo dominante dentro de 11 resíduos contínuos da região pre-S2 do AgHBs. Um epítopo específico de grupo (epítopo 1) representado pelo pêptido sintético p!33-139 e um epítopo dependente do subtipo (epítopo 2) representado pelo pl38-143, partilharam três resíduos sobrepostos. I\la sequência pl37-143 uma só substituição aminoácida no resíduo 141 de leucina (aduM) Pa~ ra fenilalanina (ayw) distinguiu ossubtipos. Contudo, a influência do resíduo 141 foi coberta pelo facto de que só foi detectado em antigénios sintéticos (imunogénios polipépti. dos) de 19 aminoácidos de comprimento ou menos e não num polipéptido sintético de 26 resíduos ou partículas nativas.
Isto sugere que enquanto 0 resíduo 141 foi envolvido no local de ligação do anticorpo, outros resíduos fora do lo cal de ligação (i.e., pl20-132) podem influenciar 0 local de ligação até ao ponto em que a leucina ou a fenilalanina no 141 não era crítico. Se isto representou uma influência não
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-65específica do tamanho do péptido ou se foi específico para a sequência pre-S2, será investigado. Contudo, o tamanho esta, va implicado visto que a influência do subtipo se tornou pro gressivamente mais aparente à medida que o tamanho do polipéptido diminuiu de 26-mero para 19-mero ou para 13-mero e era absoluta num 11-mero ou menor.
Em termos de estratégia de vacinação, esta influência coberta do subtipo foi de pequeno significado prático após imunização com partículas AgHBs/p33 nativas visto que a resposta predominante foi dirigida para o epítopo específico de grupo 133-140. De forma semelhante, embora a imunização com polipéptido sintéticos pl20-145 ou pl33-151 do subtipo ayuj provocou uma resposta específica de epítopo 2 significativa, anticorpos anti-pl37-143 ligaram-se a partículas nativas de ambos os subtipos de forma equivalente.
/
E também digno de nota que embora todos os anti-soros murinos e diversos anti-soros específicos anti-pre-S2 humanos demonstrassem uma resposta predominante para a sequência pl33-143, identificaram-se também anti soros humanos que reja giram preferencialmente para a sequência pl20-132. As respostas do anticorpo específico pl20-132 humano e murino não foram significativamente influenciadas pela substituição do resíduo aminoácido dependente do subtipo no resíduo de posição 126 como atrás descrito.
tamanho mínimo dos epítopos 1 e 2 foi de sete amino ácidos. Contudo, polipéptidos de 8-11 resíduos de comprimejn to demonstraram ligação ao anticorpo significativamente maior. Os anticorpos monoclonais específicos para os epítopos 1 e 2 foram capazes de inibição quantitativa mútua para 100$, o que pode ser esperado com base na sobreposição de três resíduos aminoácidos destes epítopos. Contudo, anticorpos para um determinante não sobreposto separado por pelo menos 13 resíduos (o terminal amino do local de ligação em pl53-171 não foi ainda definido) na sequência principal inibiu quanbi tativamente para pelo menos 80$ a ligação do epítopo 1 e 2 monoclonais específicos para partículas AgHBs/p33 nativas.
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-66Embora os dados cumulativos sugiram a conformação-independência de determinantes da região pré-S2, a estrutura secundária pode influenciar a relação espacial entre pl33-140 e pl53-171 na molécula intacta. Alternativamente, os anticorpos que ligam determinantes separados por 13 resíduos podem ser submetidos a obstáculo estérico. Qualquer que seja o mecanismo de inibição, torna-se claro que a análise de inibição anticorpo-anticorpo não foi suficientemente sensível para permitir a interpretação das especificidades precisas do anticorpo para a região pre-S2 do AgHBs.
A capacidade de traçar os locais de ligação do anticor. po dentro da região pre-S2 do AgHBs sugeriu que este seria um modelo útil para abordar a possível influência da função de auxílio da célula T sobre a especificidade precisa do anticorpo. Por exemplo, demonstrou-se que a imunização com partículas AgHBs/p33 provocava uma resposta dominante anti-e pítopo 1, enquanto que, a imunização com pêptido livre (pl20— -145) provocou respostas específicas em ambos epítopos-1 e-2, e a imunização com conjugado transportador-péptido (pl20-145) pareceu favorecer uma resposta específica do epítopo -2.
Como atrás demonstrado, as células T estimuladas altej? nativamente com AgHBs/p33 ou pl20-145 não produziam reacção cruzada, e também seria de esperar que células T específicas transportadoras não produzissem reacção cruzada. Portanto, estes três imunogénios exprimindo os mesmos determinantes de célula B exprimiram determinantes de célula T únicos em termos de especificidade e mecanismos reguladores; i.e., gene de restrição Ir. Pensa-se que células T transportadoras estimuladas podem auxiliar mais eficientemente clones de célula B específicas de epítopo -2 versus específicas de epítopo -1, de que células T estimuladas com polipéptido livre; i.e. específicas de 120-132 na estirpe C^H.Q, são eficazes em pro porcionar auxílio para ambas especificidades da célula B. Ou tras especificidades da célula T ainda não definidas são ope. rativas após imunização com AgHBs/p33. Podia-se argumentar também que outras influências, incluindo transformação do a.n
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-67tigénio possam afectar a especificidade precisa da célula B.
Contudo, uma observação intrigante aqui descrita foi que na estirpe BID, a imunização com P133-151/ad provocou res. postas específicas anti-epitopo -1 e -2, enquanto que, a imu nização com 0133-151/ay resultou numa resposta exclusiva anti-epitopo 2. Embora o reconhecimento da célula T de pl33-151 não tenha sido determinado, dados preliminares sugerem que o terminal carboxilo e o resíduo 141 estavam envolvidos visto que as células T estimulada com pl33-151 não foram activadas por pl20-145, e células T estimuladas com pl33-151/ /adwp e aytu não efectuaram reacção cruzada. Portanto, parece que as células T com especificidades precisas distintas definidas por um só aminoácido; i.e·, resíduo 141, proporcionam auxílio diferencial para os mesmos clones de célula B. As células T estimuladas com P133-151/ay proporcionaram aux_í lio funcional para o clone de célula B específico para pl37-143 mas não para o clone de célula B específico para pl33-140, enquanto que, células T estimuladas com p!33-151/ad proporcionaram auxílio para ambas as especificidades de célula B.
Torna-se claro a'partir de estudos prévios que células T específicas para uma região do AgHBs (pre-S2) podem proporcionar auxílio de célula T funcional para múltiplas es pecificidades de clones de célula B que reconhecem determinantes da região pre-S2 e S; Milich e col., (1985) Science, 228;1195. Contudo, outros estudos no sistema AgHBs sugerem a presença de células T específicas de subtipo, que podem cooperar selectivamente com clones de célula B específicos do subtipo; Milich e col., (1982) 3. Immunol., 129:320. Por exemplo, ratos hiperimunizados B10.S (9R) com o AgHBs/ /p25 multideterminante produzem só anticorpos específicos de subtipo e nenhuns anticorpos específicos de grupo mensuráveis .
A existência de auxílio de célula T específico de determinante e auxíluo de célula T abrangendo todos os clones AgHBs-específicos de célula B não foram mutualmente exclusi66 397
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-68vos. O mecanismo molecular através do qual as células T podem proporcionar auxílio diferencial para clones de célula B com especificidades diferentes no mesmo polipéptido é difí cil de explicar no contexto de modelos de interacção de célu las T-B, mas tem sido observado também noutros sistemas anti génicos; Checka e col., (1976) Eur. J. Immunol. 6.:639, Campos-Netro e col., (1982) Cell. Immunol., 69.:128, Berzofsky e col., (1979) Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A., 76.:4046. Tem si. do proposto um circuito de reciprocidade de célula T-B no qual as interaeções de célula B-Ia-antigénio limitam a especificidade da célula T, que por sua vez limita a especificidade da célula B; Berzofsky, (1983) Surv. Immunol. Res. , .2:223. Análises posteriores do reconhecimento das células T e B da região pre-S2 do AgHBs será necessária para abordar esta questão interessante.
Tem sido proposto que os determinantes da região pre-S2 sejam incluídos nas vacinas VHB de segunda geração; Neu. rath e col., (1984) Science, 224:392, Milich e col., (1985) Science, 228:1195, Michel e col., (1984) Proc. Matl. Acad. 5ci. U.S.A., 81.:7708. Os resultados deste estudo e do previa mente descrito têm implicações em relação a uma vacina AgHBs sintética e/ou reagentes de diagnóstico sintéticos. Por exemplo, os pequenos polipéptidos podem ser usados para dete_r minar a especificidade precisa de resposta do anticorpo para ver se o anticorpo para só um de dois epitopos é protector. A comparação das duas sequências polipéptidas sintéticas publicadas da região pre-S2, nomeadamente pl20-145 (Neurath e col., (1984) Science, 224:392) e pl33-151 (Okamoto e col., (1985) J. I mmunol., 134:1); revelou: (1) ambos os polipéptidos possuiam locais de ligação de anticorpo murino e hu mano dominantes dentro da sequência pl33-143; (2) o péptido pl20-145 exprimiu também a região pl20-132 que é reconheci da por alguns anti-soros humanos; (3) o péptido pl20-145 livre era mais imunogénico que o péptido pl33-151 em estirpes murinas em virtude de um local de reconhecimento de céljj la T eficiente (p!20-132); e (4) embora menos imunogéniI 66 397
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-69co, uma porção maior de anticorpo induzido por pl33-151 fez reacção cruzada com partículas AgHBs/p33 nativas/que a induzida com pl2B-145 como acima descrito. 0 conhecimento da efi cácia protectora e relevância da produção de anticorpo específica para pre-S2 e o reconhecimento da célula T na doença, serão um prez-requesito para determinar a aplicação clínica destes e de outros reagentes específicos para pre-S2.
1. Sumário
A especificidade precisa da resposta imunológica humo ral para a região pre-S2 do AgHBs foi estudada. Demonstrou-se que a resposta de anticorpo murino para a região pre-S2 foi focada nos resíduos 133-143, e dois epitopos distintos mas sobrepostos foram identificados dentro de 11 resíduos contínuos. Um epítopo era específico de grupo, e um epítopo foi influenciado por uma substituição aminoácida, dependente do subtipo, no resíduo 141.
Contudo, a influência do resíduo 141 foi coberta pelo facto de que só foi detectada em antigénios sintéticos de 19 resíduos de comprimento ou menores, e não quando se usaram polipéptidos sintéticos de 26 resíduos ou partículas nativas, como o ligante de fase sólida. 0 tamanho mínimo de ambos os epitopos (pl33-139 e pl37-143) era de sete resíduos aminoáci dos. A forma física e química do imunogénio (i.e. proteína vs. polipéptido relativamente mais curto; transportador-co_n jugado v.s. polipéptido livre) influenciaram a especificidade precisa do anticorpo. Em estudos de inibição quantitativa de anticorpo, demonstrou-se que anticorpos com ausência de sobreposição bem como com sobreposição de especificidades precisas foram capazes de inibição mútua. Finalmente, soros de doentes infectados com VHB humano mostraram possuir anticorpos da região anti-pre-S2 que reconheceram sequências em comum com os anti-soros murinos. Estes resultados têm impli. caçães relevantes em relação ao projecto de vacinas VHB sintéticas e recombinantes de segunda geração e para reagentes de diagnóstico.
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-70C. A resposta anti-polipéptido (p!20-145) Pre-S foi restringida por H-2, mas de uma forma distinta da restrição H-2 da resposta ã região Pre-S(2) nativa
Como foi previamente demonstrado que a resposta imuno lógica para a região pre-S2 nativa é regulada por genes liga dos por H-2 e foi mediada ao nível da célula T (Kilich e col., (1985) Proc. Natl. Açad. Sei. U.S.A., 82:8168), tinha interesse determinar se a resposta para o péptido pre-S2 sintéti co era regulada de forma semelhante. Um painel de estirpes congénicas H-2, B10, foi imunizado intraperitonealmente (i. p.) quer com partículas AgHBs/p33 quer com o polipéptido sin tético específico de pre-S2 livre pl20-145, ambos do subtipo ayw, como ilustrado na Figura 11. As respostas da região a_n ti-pre-S2 foram analisadas por radioimunoensaio (RIA) usando pl20-145 como o agente de ligação ligado à fase sólida. Os soros anti-AgHBs/p33 foram ensaiados 24 dias após a imunização primária. (A resposta pre-S2 predominava sobre a respos. ta S nesta altura; Milich e col., (1985) Science, 228:392). Os soros anti-polipéptido foram ensaiados após imunização sje cundária.
Como ilustrado na Figura 11, a imunização com AgHBs/ /p33 levaram à formação de anticorpo específico pre-S2 em to das as estirpes excepto B10.M. A hierarquia de capacidade de resposta foi a seguinte: B10 superior a B10.D2 superior a B10.S superior a B10.BR, indicando que a resposta anti-pre -S2 foi influenciada por genes ligados por H-2.
Os resultados da imunização com pl20-145 indicaram também a influência de genes ligados por H-2 na resposta do anticorpo. Contudo, a ordem de capacidade de resposta, B10.BR superior a B10 e B10.S superior a B10.D2 e B10.M (não respondedores), foi significativamente diferente em comparação com imunização por AgHBs/p33. Por exemplo, a estirpe B10.D2 produziu anticorpo específico anti-pl20-145 após imunização por AgHBs/p33 e mesmo assim foi um não respondedor total para o péptido pl20-145 aquando da imunização com poli.
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-71péptido sintético; i.e., 1:80.000 de título. A estirpe C,H.Q (H-2^) demonstrou a resposta mais elevada para imuni> 6 zação com pl20-145 com um título secundário de 1:1,2x10 . Portanto, a estirpe C^H.Q foi utilizada em muitas das análises descritas adiante.
Como a restrição H-2 foi determinada ao nível da célu la T, estes resultados argumentam muito fortemente que os lo, cais de reconhecimento de célula T na região pre-S2 nativa (i.e. resíduos 120-174) não necessitam ser idênticos aos reconhecidos quando o péptido sintético pl20-145 era o imunog^ nio. A estirpe murina B10.D2 demonstrou uma resposta proliferativa de célula T específica para pre-S2 apés imunização com AgHBs/p33 /^ilich e col., (1985) Proc. Natl, Acad. Sçj.
U.S.A, , 82:8168 7 e possuia clones de célula B específicos para pl20-145. Nessa estirpe, é claro que a resposta do anticorpo para a região pre-S2 não foi mediada através do reco, nhecimento de célula T da sequência pl20-145, visto que esta estirpe era não respondedora à imunização com pl20-145. Por outras palavras, pl20-145 não contém um determinante de célju la T reconhecível no contexto do haplotipo H-2d.
Balb/c (H-2d) são também não respondedores a este péptido__7· Consistente com isto é a descoberta de que as estirpes B10.D2 e Balb/c estimuladas com pl20-145 não demonstrou uma resposta proliferativa de célula T específica para pl20-145.
D. Reconhecimento de célula T de p!2D-145 focado no terminal amino, enquanto o reconhecimento de célula B (Anticorpo) é focado na sequência carboxilo terminal
Para examinar a especificidade precisa do reconhecimento de célula T e de célula B (anticorpo) da região pre-S2 do péptido sintético pl20-145, ratos C^H.Q foram imunizados com P120-145/ayu/. A especificidade de resposta de célula T proliferativa in vitro e a resposta do anticorpo in vivo, fo ram determinadas. Com esta finalidade um péptido terminal amino (pl20-132), um péptido terminal carboxilo (pl33-145), e um péptido sobreposto (pl28-138) foram sintetizados como
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-72se mostra na Figura 10.
Para determinar possíveis influências específicas de subtipo, pl20-145/aduj2 foi também sintetizado. De notar que o subtipo aduM difere do subtipo ayiu nas posições de resíduo aminoácido 126 e 141.
Após estimular 120-145/ay, p!20-145/ay e p!20-132/ay foram capazes de provocar respostas de célula T proliferativas significantes, enquanto que, pl33-145/ay foi minimamente reactivo e ρ12θ-138 foi totalmente não estimulador como se mostra na Figura 12. 0 facto de que havia uma diferença inferior a duas vezes (não significativa) entre a resposta pro liferativa de células T estimuladas com p!2 0-145/ay induzidas por pl20-145 e pl20-132 através da maior parte das curvas de resposta de dose, localizaram um local de reconhecimento de célula T predominante para os resíduos terminais amino 120-132, Além disso, o grau mínimo de reactividade cruzada entre pl20-145 do aym versus o subtipo adu^ indicou que o resíduo 126 foi crítico para a activação da célula T.
Células T estimuladas com polipéptido pl20-145 foram também submetidas a teste de imunidade in vitro com partículas AgHBs/p33 nativas, as quais não provocaram uma resposta proliferativa. 0 estudo recíproco de estimulação com AgHBs/ /p33 e teste de imunidade com pl2D-145 foi também negativo. Esta observação reitera que pl20-145 não necessita representar o local de reconhecimento de célula T na região pre-S2 nativa, como sugerido pelos dados de restrição H-2.
A especificidade da resposta do anticorpo após imunização com 0120-145/ay é mostrada na Figura 13. Os soros foram ensaiados 2 semanas após as imunizações primária (lo) e secundária(25).
A resposta do anticorpo para pl20-145 diferiu da resposta de célula T em diversas formas significativas. Em pri meiro lugar, anti-pl20-145 ligou AgHBs/p33 nativo quase até ao mesmo ponto que o polipéptido homólogo. /~AgHBs/p33 anti -nativo também liga pl20-145 muito eficientemente; Milich e
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-73col., (1985) Science, 228:392 7. Fm segundo lugar a maior parte dos anticorpos ligaram-se à sequência pl33-145 terminal carboxilo (1:409.600) em oposição a pl20-132 (1:4096), que provocou a maior resposta proliferativa de célula T. Em terceiro lugar, uma pequena percentagem de anticorpos ligou-se a pl28-138, enquanto que este polipéptido não activou cé lulas T estimuladas com pl20-145. Finalmente anticorpos anti-0120-145/ayw demonstraram um elevado grau de reactividade cruzada para o polipéptido do subtipo 0120-145/aduM em contraste com a resposta de célula T. Estes dados indicam que ' pl33-145 representava 0 local de ligação de anticorpo dominante no pl20-145, bem como, um local de ligação principal no AgHBs/p33 nativo, e que pl20-132 representava 0 local de reconhecimento de célula T dominante no polipéptido sintético pl20-145, mas não em relação à proteína nativa, pelo menos na estirpe C^H.Q.
Como epitopos de célula T e B independentes, dominantes, foram identificados em pl20-145, tinha interesse comparar as imunogenicidades relativas do epitopo de célula T (pl20-132) e 0 epitopo de célula B (pl33-145) com 0 imunogénio intacto (pl20-145). Embora o pl20-132 induzisse uma res. posta de anticorpo primária (quatro semanas) reactiva com a | sua própria sequência, ele não induziu uma resposta de reactividade cruzada em AgHBs/p33 nativo, como ilustrado no Quadro 8.
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-74QUADRO 8
Imunogenicidade comparativa de péptidos sintéticos da região pre-S2 não ligados em ratos C^H.Q
| Imunogénio3 | T ítulo | e Especificidade do anticorpo8 | ||
| P120-145 | Ρ120-132 | P133-145 | AgHBs/p33 | |
| P120-145 | 1:512.000 | 1:5120 | 1:256.000 | 1:160.000 |
| P120-132 | 1:160 | 1:640 | 0 | 0 |
| P133-151 | 1:10.240 | 0 | 1:10.240 | 1:10.240 |
Grupos de 5 ratos foram imunizados intraperitonealmente com 100 ^Lug de cada péptido do subtipo ayw em CFA.
8 Os soros foram recolhidos e seleccionados quatro semanas após a imunização primária.
polipéptido 133-151 foi usado para representar o epi. topo de célula B neste estudo, e provocou uma resposta de ari ticorpo primária que reagiu equivalentemente com AgHBs/p33 nativo e com a sequência pl33-145; i.e., 1:10.240. Contudo, como se mostra no Quadro 8, estas respostas foram bastante baixas em comparação com a resposta provocada por p!20-145, que possuía ambos os determinantes de célula T e B.
Em adição, os dados preliminares indicam a presença de um epitopo de célula T cerca de pl40-151. Aqui, ratos estimu lados com pl33-151 jd e submetidos a teste de imunidade com pl33-151d mostraram uma resposta de célula T proliferativa, enquanto submetido a teste de imunidade com pl33-151y ou pl20-145.d não mostrou qualquer proliferação. Estes dados iri dicam também a importância do resíduo 141 no reconhecimento de célula T.
Ainda adicionalmente, dados preliminares usando babuí nos como animais hospedeiros indicam a presença de um epitopo
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-75de célula T dentro de pl20-145 e pl33-151 visto que ambos os polipéptidos usados como imunogénios sem um transportador fo ram capazes de induzir anticorpos. Assim, os dados do siste ma murino foram confirmados num sistema primata.
E. Uma só substituição de aminoócido definiu o reconhecimento de célula T do polipéptido sintético 120-132
Porque Ρ120-132/ay induziu eficientemente a prolifera ção de células T estimulada com P120-145/ay, e o subtipo parecia importante, ratos C^H.Q foram estimulados com a sequêri cia do subtipo ayw ou adu^ de pl20-132. As células T foram submetidas a teste de imunidade in vitro com pl20-132/ay, pl20-145/ay, 120-132/ad ou 120-145/ad. As sequências ayw e a d ui π de pl20-132 diferem somente no resíduo 126 (trionina, alanina, respectivamente).
As células T estimuladas com a sequência ayw de 120-132 proliferaram em resposta a pl20-132/ay e p!2 0-145/ay só marginalmente para as sequências aduu (diferença de 66,6 vezes), como ilustrado na Figura 14a. No estudo recíproco, as células T estimuladas com a sequência adw^ de pl20-132 proliferaram aquando da confrontação com pl20-132/ad e pl20-145/ad, e foram só minimamente reactivos para as sequências ayuj (diferença de 32 vezes) como se mostra na Figura 14b.
Estes dados indicam a importância do resíduo 126 no reconhecimento de célula T de pl20-132, e demonstrou que um só aminoácido afectou dramaticamente a especificidade precisa do reconhecimento da célula T visto que as sequências ayw e aduio aram relativamente de não-reactividade cruzada. Para definir melhor o local de reconhecimento de célula T, ratos C-jH.Q foram estimulados com pl20-131 da sequência adiu que di. fere de ambas as sequências ayw e adw^ nos resíduos 127 e 130 e não tem o resíduo 132. Ver Figura 10.
Como ilustrado na Figura 15, as sequências adiu e adw^ foram de bastante reactividade cruzada, e a sequência ayw foi não estimuladora para as células T estimuladas por pl2066 397
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-76-131/adiu. Este facto reitera a importância do resíduo 126 e indica que os resíduos 127, 130 e 132 não eram críticos para o reconhecimento da célula T da sequência pl20-132, o que im plica que os resíduos de pl20-126 representaram o local de reconhecimento de célula T dominante no pl20-145.
Para examinar se o reconhecimento de célula T do P120-132 era único para a estirpe C^H.Q, diversas outras estirpes murinas foram imunizadas com p!20-145/ayw, e as respostas proliferativas de célula T específicas para pl20-132/ /ayw foram determinadas, como se mostra na Figura 16. Todas as estirpes excepto a estirpe B10 demonstraram uma resposta proliferativa de célula T dependente do subtipo para o imuno génio p!20-145/ayw. Embora a estirpe C^H.Q respondesse melhor para pl20-132, todas as estirpes testadas excepto a estirpe B10 (S3L/3, B10.S, B10.BR e C^H) demonstraram uma resposta significativa para pl20-132 apôs estimulação com pl20-145.
Portanto, parece que pl20-132 pode ser reconhecido no □ s k contexto dos haplotipos H-2 , H-2 , H-2 , mas não do haploti b po H-2 . Curiosamente, células T da estirpe B10 imunizadas com pl20-145/ayw proliferaram de forma equivalente às sequê_n cias de subtipo aduip e ayw do pl2Q-145, e B10 foi a única es. tirpe que demonstrou pelo menos uma resposta marginal para teste de imunidade com AgHBs/p33 nativo. A ausência de uma resposta específica de subtipo indica que o resíduo 126 não era crítico para o reconhecimento da célula T de pl20-145 na estirpe B10,
Foi também interessante examinar a especificidade pre cisa da produção de anticorpo in vivo para pl20-132. Portaji to, os ratos C^H.Q foram imunizados com p!20-132/ayw. Os s.o ros primário e secundário foram analisados para a sua reacti. vidade em p!20-l32/ayw, 120-132/adw^ e 120-131/adw ligados à fase sólida, como ilustrado no Quadro 9 abaixo.
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-77QUADRO 9
Reactividade de Anti-ol20-132/ay com sequências de subtipo
| Imunogénio | T a Tempo | Titulo e | especificidade | do anticorpi |
| P120-132/ / ayw | P120-132/ / adujp | P120-131/ /a dm | ||
| pl20-132/ay | 12 | 1:1280 | 1:640 | 1:80 |
| 2° | 1:5120 | 1:2560 | 1:40 | |
| pl20-145/ay | 12 | 1:10.240 | 1:5120 | 1:640 |
g
Os soros foram recolhidos 4 semanas apôs a primeira imunização (12) e 2 semanas apôs a segunda imunização (22).
Em contraste com o reconhecimento de célula T, anticorpos para 120-132/ayw tiveram reacção cruzada muito boa com a sequência adw^ (diferença de 2 vezes), indicando que a substituição de alanina para trionina no resíduo 126 não afeç. tou gravemente o local de ligação de anticorpo no pl20-132. Inversamente, anticorpos anti-p!20-132/ay não se ligaram bem a p!20-131/aduj indicando que o terminal carboxilo do pl20-132 estava envolvido no reconhecimento do anticorpo.
Para comparação, soro anti-pl2 0-145/aytu primário foi também examinado em relação à especificidade precisa e demons trou resultados semelhantes, com excepção de que o mais imunogénico pl20-145 provocou uma resposta maior para todos os antigénios como demonstrado no Quadro 9. De notar que ao ni vel da célula T as sequências aduM e adui eram de grande reaç. tividade cruzada. Estes dados indicam que mesmo em relação a um péptido sintético tão pequeno como de 13 aminoácidos, os locais de reconhecimento de célula T e B foram distintos.
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F. 0 polipéptido terminal amino 120-132 estimulou auxílio de célula T para o polipéptido terminal carboxilo 133-145
Porque parecia que existiam epitopos de célula T e de célula B distintos no pl20-145, examinou-se a capacidade do local de célula T isolado (pl20-132) de estimular a função da célula de auxílio T para o local de ligação de anticorpo dominante no pl20-145 (pl33-145). Ratos C^H.Q foram ou esti mulados com 100 de 0120-132/ay em CFA ou injectados só com CFA, e quatro semanas depois reforçados ou com 100 y^g de P120-145/ay ou com 1,0 yug de AgHBs/p33/ay em adjuvante de Freund incompleto (IFA). 0s soros foram analisados para uma resposta de IgG específica para diversos determinantes uma semana após a imunização de reforço. Como ilustrado no Quadro 10, pl20-132 estimularam a resposta anti-pl33-145 após o reforço com pl20-145.
QUADRO 10
Capacidade de pl20-132 para estimular Produção de Anti corpo In Vivo
| Q Imunogénio | Título | e Especificidade do Anticorpo | ||
| P120-145 | P120-132 | P133-145 | AgHBs/p33 | |
| Ρ120-132 0 | 1:160 | 1:640 | 0 | 0 |
| 0 P120-145 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| P120-132 P120-145 | 1:2560 | 1:5120 | 1:640 | 1:1280 |
| 0 AgHBs/p33 | 1:320 | 1:40 | 1:160 | 1:160 |
| P12 0-132 | 1:640 | 1:640 | 1:40 | 1:320 |
AgHBs/p33
) 66 397
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-79p*
Grupos de quatro ratos foram estimulados com 100 ycg cada de pl20-132 em CFA administrado i.p. ou só CFA (0), e 4 semanas depois reforçados ou com 100 de pl20-145 ou com 1 j»q de AgHBs/p33 em adjuvante incompleto (IFA), Os ratos foram sangrados uma semana após o reforço (2- imuni zação), e os soros foram ensaiados para detectar IgG espe. cífica para os antigénios indicados. Todos os antigénios eram do subtipo ayw.
Ratos não estimulados não produziram anticorpos anti-pre-S2 de qualquer especificidade. Contudo, ratos estimula dos com pl20-132 produziram um título de IgG de 1:640 especí fico para o pêptido pl33~145. Os outros antigénios ligados à fase sólida possuíam todos a sequência 120-132, de forma que é difícil discriminar anticorpos anti-pl33-145 de anticorpos anti-pl20-132 nestes ligantes. Embora pl20-132 estimulassem a resposta anti-pl33-145 após um reforço de pl20-145, pl20-132 não estimularam qualquer resposta específica para pre-S2 após reforço com AgHBs/p33. Ver Quadro 10. Este facto confirmou que células T estimuladas com pl20-132, C^H.Q não reconheceram esta sequência na proteína nativa o que é consistente com a falta de resposta proliferativa induzida por AgHBs/p33, e com os dados de restrição H-2.
G. Anticorpos monoclonais definem dois determinantes distintos mas sobrepostos na região pre-S2
Para determinar a especificidade precisa de cinco anticorpos monoclonais murinos específicos para pre-S2, diluições representando de 0,007 nanogramas por mililitro (ng/ /ml) a 500 ng/ml de cada anticorpo monoclonal foram ensaiadas para a reactividade de ligação a partículas AgHBs/p33 e a polipéptidos sintéticos específicos para pre-S2 das sequêjn cias dos subtipos ayuj e adiu^. Todos os monoclonais foram produzidos para antigénios polipéptidos (imunogénios) exprimindo o subtipo aym. Cada anticorpo monoclonal ligou partículas AgHBs/p33 muito eficientemente a uma concentração mini
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-80ma de 0,03 ng/ml e não distinguiu entre os subtipos. Os resultados estão apresentados no Quadro 12, e expressos como as concentrações de anticorpo mínimas em ng/ml necessárias para detectar ligação superior a cinco vezes o valor de liga ção basal.
QUADRO 12
Reactividade de um Painel dos Anticorpos monoclonais com Partículas AgHBs/p33 e com polipéptidos sintéticos específicos da região Pre-S2 correspondendo aos resíduos 120 a 151
| Antigénio de Fase sélida | Anticorpo Monoclonal Específico | para Pre-S2' 4408 | |||
| 5520 | 5521 | 5535 | 5161 | ||
| AqHBs/q33/ay | 0,03 | 0,03 | 0,03 | 0,03 | 0,03 |
| AgHBs/p3$ad | 0,03 | 0,03 | 0,03 | 0,03 | 0,03 |
| pl20-145/ax | 0,06 | 0,03 | 0,06 | 0,03 | 0,03 |
| pl20-145/ad | 0,06 | 0,06 | 0,03 | 0,12b | 0,03 |
| pl20-132/ax | 0C | 0 | 0 | 0 | 0 |
| pl20-132/ad | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| pl33-151/ax | 0,12 | 0,06 | 0,06 | 0,03 | 0,06 |
| pl33-151/ad | 0,06 | 0,25 | 0,12 | 4,0 | 0,06 |
| pl33-145/ay | 0,12 | 0,25 | 0,06 | 0,12 | 0,25 |
| pl33-145/ad | 4,0 | 8,0 | 1,0 | 32,0 | 0,25 |
Concentração de anticorpo monoclonal mínima necessária para ligação, ng/ml.
b
Os números sublinhados representam uma diferença de quatro vezes ou mais entre a ligação à sequência de subtipo ay versus ad.
c Nenhuma ligação detectável a uma concentração de 500 ng/ml.
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-810 polipéptido sintético maior ensaiado, pl20-145 era também um substrato antigénico excelente. Contudo, o anticorpo monoclonal 5161 demonstrou uma preferência para o subtipo ay (subtipo do imunogénio) neste ligante. A sequência terminal amino de pl20-145, nomeadamente 120-132, não foi reactiva com nenhum dos monoclonais ensaiados. Isto era esperado em relação ao Mabs 5520, 5521 e 5535 visto que eles foram produzidos contra a sequência pl33-151 intacta. Mas Mabs 4408 e 5161 que foram produzidos contra o polipéptido pl33 intacto, também não ligou pl20-132. Note-se que a sequência pl20-132 representou um local de reconhecimento de célula T dominante em diversas estirpes murinas, como atrás referido.
Embora o polipéptido pl33-151, um 19-mero, fosse o imunogénio para Mabs 5520, 5521 e 5535, ele foi, apesar disso, inesperadamente, equivalentemente antigénico ou ligeira mente menos antigénico que o pêptido maior de 26 resíduos aminoácidos, pl20-145. Isto minimizou a possível influência dos resíduos 146-151.
Além disso, o monoclonal 5521 bem como o 5161 demonstraram preferência de subtipo no p!33-151. Quando a sequência p!33-145 (13-mero) foi ensaiada, todos os monoclonais com excepção do 4408 exprimiram uma forte preferência para a sequência do subtipo ayw, como se mostra no Quadro 12. Como a presença da sequência 146-151 foi demonstrada como não afectando a ligação no pl33-151 e foi conservada entre os subtipos ayw e a d um , parece que o tamanho mais do que a presença da sequência terminal carboxilo 146-151 foi responsável pela especificidade do subtipo evidenciada no 13-mero em comparação com o 26 mero ou com o 19 mero.
Para definir melhor a especificidade destes reagentes de anticorpo monoclonal, outra Série de polipéptidos truncados foi sintetizada e usada como ligantes ligados à fase sólida como ilustrado no Quadro 13.
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Ref: SCRF 95.1 - EPGzll
-82QUADRO 13
Reactividade de um painel de anticorpos monoclonais com pêptidos sintéticos Específicos de Pre-S2 Representando os Resíduos 133 a 145.
| Péptido de fase sólida | Ligação de anticorpo monoclonal específico | ||||
| de pre-S2a | 4408 | ||||
| 5520 | 5521 | 5535 | 5161 | ||
| p!33-143/ay | 0,12 | 0,12 | 0,06 | 0,12 | 0,5 |
| pl33-143/ad | 16^ | 4,0 | 4,0 | 16,0 | 0,5 |
| P133-140 | 250 | 0c | 64,0 | 64,0 | 0,25 |
| P133-139 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0,5 |
| P128-138 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| 0135-145/ay | 0,12 | 0,12 | 0,12 | 1,0 | 0 |
| pl35/145/ad | 250 | 0 | 64,0 | 0 | 0 |
| pl35-143/ax | 0,12 | 0,12 | 0,25 | 0,5 | 0 |
| 0135-143/ad | 0 | 0 | 64χ0 | 0 | 0 |
| pl37-145/a2 | 4,0 | 0,5 | 4,0 | 8,0 | 0 |
| pl37-145/ad | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
a Concentração mínima requerida para ligação, ng/ml.
Os números sublinhados representam uma diferença de quatro vezes ou mais entre ligação às sequências do subtipo ay versus ad.
c Nenhuma ligação detectável a uma concentração de 500 ng/ml.
A rejeição de dois resíduos terminais carboxilo, 144 e 145 da sequência pl22-145 não afectou significativamente a ligação por qualquer um dos monoclonais; i.e. , pl33-145 cojn parado com pl33-143. Contudo, a rejeição de cinco resíduos terminais carboxilo, deixando o péptido específico de grupo pl33-140, eliminou virtualmente a ligação dos monoclonais 5520 e 5521, e reduziu drasticamente (533 a 1066 vezes em
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-8 3comparação com 0133-143/ay) a ligação dos monoclonais 5535 e 5161. Por outro lado, o monoclonal 4408 ligou pl33-140 de forma equivalente ao P133-145/ay.
Estes resultados indicaram que os resíduos 141, 142 e 143 eram críticos para o local de ligação reconhecido pelos monoclonais 5520, 5521, 5535 e 5161, mas irrelevante para o monoclonal 4408. Como o 4408 também ligou pl33-139 eficientemente, o resíduo 140 também não foi crítico para o local de ligação deste anticorpo.
monoclonal 4408 foi não reactivo no pl28-138, o que definiu o terminal carboxilo do local de ligação do 4408 como o resíduo 139. 0 terminal amino do local de ligação do 4408 foi definido como 133-134, visto que Mab 4408 foi não reacti vo no pl35-145 de qualquer dos subtipos. Portanto, o local de reconhecimento do monoclonal 4408 pode ser definido como o sete-mero pl33-139, possivelmente pl34-139. Esta sequência foi conservada em todos os subtipos AgHBs, e previsivelmente, 4408 não demonstrou especificidade de subtipo em qualquer ljÍ gante.
0s monoclonais 5520, 5521, 5535 e 5161 foram minimamente reactivos em pl33-140 e não reactivos em pl33-139 como se mostra no Quadro 13 acima. Todos os quatro monoclonais ligaram pl35-145 e pl35-143 eficientemente, contudo, de uma forma específica de subtipo (mínima a nenhuma ligação nas se quências aduu). Estes resultados indicam que o terminal caj? boxilo do local de ligação reconhecido pelos monoclonais 5520, 5521, 5535 e 5161 era pelo menos o resíduo 143. Embora a ligação a Ρ137-145/ay estivesse significativamente redjj zida em comparação com P135-145/ay em relação a todos os qua tro monoclonais, a reactividade positiva definiu o terminal amino do local de ligação reconhecido por estes quatro monoclonais até pelo menos ao resíduo 137. Portanto, o local de reconhecimento dos monoclonais 5520, 5521, 5535 e 5161 pode ser minimamente definido como o sete-mero pl37-143. Ligação significativamente aumentada (imunorreacção) ocorreu no P135-143.
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-84Note-se que enquanto os monoclonais 5520, 5521, 5535 e 5161 demonstraram todos especificidade de subtipo, esta preferência de subtipo foi somente observada em polipéptidos sintéticos de 19 aminoácidos ou menores, e não no 26-mero (excepto 5161) ou nas partículas AgHBs/p33 intactas, como se mostra nos Quadros 12 e 13. Esta especificidade de subtipo tem de ser focada no resíduo 141 visto que a substituição fenilalanina/leucina nesta posição foi a única diferença de subtipo na sequência pl33-151.
I As especificidades precisas dos monoclonais representativos: 5521, 5161 e 4408 nos péptidos sintéticos pertineri tes estão resumidas na Figura 18. Cumulativamente, estes da. dos indicaram a existência de dois locais distintos de ligação de anticorpo sobreposto cada um de sete resíduos aminoácidos em comprimento dentro dos resíduos 133 a 143 da região pre-S2. 0 epítopo 1 foi minimamente definido através do monoclonal 4408 como pl33-139, e o epitopo 2 foi minimamente definido pelos outros quatro monoclonais como pl37-143. Os polipéptidos sintéticos pl33-140 e pl35-145, ligaram anticoj? po mais eficientemente com o mesmo grau de especificidade, e foram portanto usados como antigénios ligados à fase sólida para representar os epitopos 1 e 2, respectivamente, noutros
I estudos.
epitopo 1 é específico de grupo visto que estava conservado em todos os subtipos, enquanto que, o epitopo 2 apresentava especificidade de subtipo dependendo do tamanho do ligante examinado. A sequência sobreposta repartida por ambos os epitopos, os resíduos 137, 138, 139, estava conservada em todos os subtipos do AgHBs como se mostra na Figura 19.
H. Anticorpos monoclonais específicos de pre-S2 com especificidades precisas distintas mas sobrepostas inibiram mutuamente a ligação a partículas AgHBs/p33
Como o monoclonal 4408 foi específico para um epítopo distinto na região pre-S2 em comparação com os monoclonais
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Ref: SCRF 95.1 - EPG:11
-855520, 5521, 5535 e 5161, houve interesse em determinar se o monoclonal 4408 ligando-se à região pre-S2 em partículas AgHBs/p33 nativas seria inibido pelos outros monoclonais e vice versa. Como ilustrado na Figura 20, todos os anticorpos monoclonais específicos de pre-S2 sem contar com a especificidade precisa inibiu quantitativamente a ligação de 4408 em A qHBs/p33/ay em 100/. Isto fci verdade para ambos os subtipos de AgHBs/p33.
Comparando as concentrações necessárias para inibir 50/ da ligação, houve somente uma diferença de 4,5 vezes entre □ melhor (Mab 5535) e o pior (Mab 5521) inibidor. Numa análise recíproca, cada monoclonal inibiu quantitativamente a ligação de 5521 no AgHBs/p33 em 100/ com uma diferença de cinco vezes entre o mais e o menos eficiente inibidor, como ilustrado na Figura 21, Todas as combinações de monoclonais competitivos e marcados deram resultados semelhantes.
Estes dados indicaram que embora a especificidade pre. cisa do monoclonal 4408 fosse distinta dos outros monoclonais, a proximidade dos epítopos (sobreposição de 3 resíduos) foi suficiente de forma que inibiram mutuamente a ligação do outro.
Foram também efectuados estudos de competição de anti. corpo monoclonal usando polipéptidos sintéticos como ligante ligado à fase sólida. Contudo, como a eficiência de ligar os polipéptidos sintéticos variou de certa forma entre monoclonais e a competição foi comensurada com ligação directa, estas análises foram menos informativas.
I. Especificidade da Resposta Policlonal Murina a Partículas AgHBs/p33 Nativas
Para determinar a especificidade da resposta humoral específica de pre-S2 murina após imunização com partícula AgHBs/p33, ratos C^H.Q foram imunizados com AqHBs/p33/ay. A_n tisoros primário e secundário foram seleccionados num painel de péptidos sintéticos envolvendo virtualmente toda a s.e quência pre-S2 como ilustrado na Figura 22.
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-86E digno de menção que o título de anticorpo primário e secundário detectado no péptido sintético pl20-145 era equivalente ao título detectado nas partículas intactas, e observou-se muito pouco anticorpo específico para o terminal carboxilo pl53-171. Isto indicou que a maior parte do anticorpo específico para pre-S2 provocado pela imunização com partículas AgHBs/p33 nativas foi dirigido para os resíduos 120 a 145. Além disso, a maior parte do anticorpo específico para AgHBs/p33 foi dirigido para a sequência terminal cai; boxilo pl33-145 (1:40.960) em oposição ao terminal amino □120-132 (1:5120) como foi previamente observado após imunização com polipéptido sintético pl20-145, como atrás descrito.
Em relação à especificidade precisa da resposta pre-S2 anti-nativa, pl33-140 (epítopo 1) representou o local de ligação de anticorpo dominante. Anti-soros policlonais C-jH.Q anti-pl20-145 /Figura 23 (a)_7 e anti-AgHBs/p33 /Figura 23 (b)_7 inibiram a ligação de anticorpos monoclonais 5521, 5161 e 4408 para AgHBs/p33, confirmando assim que a se quência pl33-143 representava um local de ligação de anticoí; po predominante para estes anti-soros policlonais. Numerosas estirpes consaguíneas de ratos foram imunizadas com partículas AgHBs/p33, e as respostas específicas de pre-S2 foram bastante semelhantes à da estirpe C^H.Q.
J. A forma física do imunogénio influenciou a especificidade precisa da resposta humoral específica de Pre-S2
Formas alternadas antigénicas da região pre-S2 podem ser consideradas para fins de vacina ou de outro inéculo. Portanto, foi interessante comparar os efeitos da imunização com determinantes pre-S2 expressos em partículas intactas, com polipéptido livre, com conjugado polipéptido-proteína, e com uma preparação de polipéptido p33, sobre a especificidade precisa da resposta. Os antisoros foram analisados para a reactividade com péptidos de fase sólida: pl33-145 (repre sentando epitopos 1 e 2); pl33-140 (representando epítopo 1);
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-87e pl35-145 (representando epítopo 2) de ambos subtipos (excepto para o pl33-140 específico de grupo).
Como ilustrado no Quadro 14, abaixo, as estirpes CjH.Q e B10 imunizadas com partículas AgHBs/p33 produziram predominantemente anticorpo específico para pl33-140. A influência do subtipo foi mínima, como demonstrado pelas respostas marginais à sequência pl35-145. A imunização de ratos CjH.Q com o pêptido livre, relativamente grande (120-145) provocou uma resposta de anticorpo heterogénea consistindo de uma resposta específica de subtipo detectada no pl35-145 do subtipo apropriado e uma resposta específica de grupo detecta da no pl35-140.
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-88QUADRO 14
Influência da forma física do imunogénio sobre a esp_e cificidade precisa Anti-pre-S2
Título Anti-Pre-S2 (1/diluição) Epitopo
1+2 1 2 (pl33-145) (pl33-140) (pl35-145)
| A ntisoros | d | X | cl | X | |
| Partícula | |||||
| B10 a-HBs/p33/aya | 10.240 | 20.480 | 10.240 | 0 | 80 |
| B10 a-HBs/p33/ad | 5.120 | 5,120 | 10.240 | 0 | 0 |
| C-jH.Q a-HBs/p33/ay | 10.240 | 40.960 | 20.480 | 0 | 160 |
Polipéptido livre
| C3H.Q a-pl20-145/aya | 25.600 | 409.600 | 51.200 | 200 | 102.900 |
| C^H.Q a-pl20-145/ad | 51.200 | 6.400 | 12.800 | 12.800 | 400 |
| B10 a-pl33-151/ayb | 0 | 32 0 | 0 | 0 | 160 |
| B10 a-pl33-151/ad | 2.560 | 2.560 | 2.560 | 640 | 40 |
| OVAL - | polipéptido | ligado0 | |||
| Balb/c a-p!33-151/ay8 | 128.000 | 4xl06 | 0 | 0 | 4x106 |
(Mab 5521)
Polipéptido p33
| Balb/c a-p33/ay8 | 2xl06 | 2xl06 | 4x106 | 0 0 |
| (Mab 4408) Balb/c a-p33/ay | 32.000 | 8xl06 | 4.000 | 0 lxlO6 |
(Mab 5161)
Antisoros policlonais recplhidos após imunização secundária.
Antisoros policlonais recolhidos após imunização primária.
C p peptido ligado a OVAL = polipéptido ligado à ovalbumina como
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-89um conjugado.
Anticorpos monoclonais, concentração do caldo 1 mg/ml.
Note-se que os anticorpos detectados no pl33-140 desti nados para o anticorpo anti-pl33-145 que se ligou à sequência de subtipo heteróloga, enquanto que os anticorpos reactivos com a sequência pl35-145, eram virtualmente específicos de grupo. A imunização da estirpe B10 com o 19-mero (pl33-151) da sequência ayuj induziu uma resposta de baixo título, exclui sivamente específica de subtipo. Em contraste, a imunização com o subtipo aduM do pl33-151 provocou ambas respostas espe. cífica de grupo (epitopo 1) e específica de subtipo (epitopo 2) de título mais elevada em comparação com a imunização P133-151/ay. Esta observação interessante indicou que a úni ca substituição aminoácida entre os subtipos no resíduo 141 influenciou ambas a imunogenicidade e a especificidade do ajn ticorpo da resposta imunológica para pl33-151 na estirpe B10.
monoclonal 5521, bem como 5520 e 5531 foram produzi, dos após imunização com p!33-151/ayuj ligado à ovalbumina, e todos estes monoclonais são altamente específicos de subtipo. Como o monoclonal 5521 é não reactivo no pl33-140 como se mostra no Quadro 14, a reactividade no subtipo heterólogo Ρ133-145 representa reactividade cruzada em vez de uma especificidade dupla como se vê nos soros policlonais. Como estes são anticorpos monoclonais, o facto de todos eles serem específicos de subtipo não implica que só polipéptidos ligados provoquem a formação do anticorpo específico de epitopo -2, mas indica que tal imunização induziu clones de célula B específicos de epitopo 2.
Contudo, ratos imunizados com p!20-145 livre produziram predominantemente anticorpo específico de grupo, enquanto que, ratos imunizados com pl20-145 ligado aKeyhole limpet hemocyanin(KLH) produziram predominantemente anticorpo específico de subtipo. Portanto, é possível que essa imunização com polipéptido ligado versus livre influencie a especificidade precisa do anticorpo. A especificidade dos dois mo
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-90noclonais produzidos por imunização com preparações de polipéptido p33 (Mab 4408 e Mab 5161) indicou que tal imunização levava à formação de anticorpo quer específico de grupo (4408) quer específico de subtipo (5161) como se mostra no Quadro 14.
K. Um anticorpo não sobreposto específico de pre-S2 inibiu a ligação anti-pl33-143 ao AgHBs/p33
Ao contrário da metade terminal amino da região pre-S2, a metade terminal carboxilo é altamente substituída em relação às sequências adWp e ayw como se mostra na Figura 17. Um antisoro policlonal murino para p!53-171/adwn fci preparado, o qual era bastante específico de subtipo. Como se mostra na Figura 24, esta preparação de anticorpo inibiu eficientemente ambos/°monoclonal 4408 específico de pl33-139, e monoclonal 5161 específico de pl37-143 ligando-se ao subtipo ApHBs/p33/adw^ mas não ao subtipo ayw. Portanto, dois locais de ligação de anticorpo distintos e não sobrepostos, i. e., pl33-139 e pl53-171, separados por pelo menos 13 resíduos aminoácidos na sequência primária, não podem ser ocupados sj. multaneamente pelos seus anticorpos respectivos.
L. Especificidade precisa da resposta humoral do anti-pre-S2 humano após infecção por VHB
Um certo número de soros humanos de doentes com infeç. ção por VHB aguda e crónica foram seleccionados para anticor, po específico para a região pre-S2 do AgHBs usando o polipéjq tido sintético pl20-145 como o antigénio ligado à fase sólida. Os soros positivos foram seleccionados e a especif icida. de precisa para polipéptidos truncados foi determinada. Observaram-se numerosos padrões de especificidade fina. Os resultados para soros representativos estão ilustrados no Quadro 15.
397
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-91QUADRO 15
Especificidade precisa da resposta anti-pre-S2 humana após infecção por VHB
| Soro do VHB Número | Título de anticorpo para : | |||||
| Péptido | sintético (1/dili | da região jição) | pre-S2 | |||
| P120-145 | P120-132 | P133-145 | P133-140 | P135-145 | P153-171 | |
| 1 | 800 | 100 | 160 | 50 | 50 | 50 |
| 2 | 3200 | 50 | 800 | 20 | 10 | 10 |
| 3 | 6400 | 200 | 3200 | 3200 | 200 | 50 |
| 4 | 1600 | 100 | 1600 | 50 | 1600 | 100 |
| 5 | 6400 | 3200 | 100 | 50 | 50 | 100 |
| 6 | 6400 | 3200 | 800 | 200 | 50 | 50 |
| NHSb | 50 | 50 | 50 | 50 | 100 | 50 |
| NHS | 50 | 100 | 50 | 100 | 100 | 50 |
| NHS | 10 | 20 | 50 | 20 | 10 | 50 |
| NHS | 20 | 10 | 10 | 10 | 20 | 10 |
Diluições de soros humanos foram incubadas (misturadas e mantidas) com pêptidos ligados à fase sólida ou com depósitos não revestidos e determinou-se o anticorpo ligado sondando com um reagente de IgG anti-humana marcada com enzima. A titulação foi definida como a diluição serica mais elevada que dava uma leitura de OD^^g de 0,10. Ligari do a uma diluição de soro superior ou igual a quatro vezes a observada em depósitos não revestidos, foi considerada específica de péptido, e está sublinhada. As diluições séricas para depósitos não revestidos (ligação de fundo não específica) variaram de 10 a 100.
b NHS, soro humano normal.
) 66 397
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-92Nenhum dos soros mostrou ligação aos resíduos 153-171 do terminal carboxilo da região pre-S2. As especificidades precisas de alguns dos soros não foram testadas visto que o anticorpo foi sé detectado no pêptido grande (pl20-145), como exemplificado pelo soro do doente n9. 1. 0 soro n9. 2 ilustra o padrão de ligação mais frequentemente observado, no qual os anticorpos específicos para pl20-145 e para pl33-145 foram detectados, mas a ligação do anticorpo aos péotidos truncados menores não foi observada. Contudo, diversos soros demonstraram ligação ao pl33-140 e 135-145, como exemplificado pelos soros n^s. 3 e 4 respectivamente. Interessari temente, □ soro 4 ligou-se às sequências ayw de pl20-145 e pl35-145 preferencialmente em comparação com as sequências aduJo» implicando o resíduo 141. Os soros representando outros padrães de especificidade não demonstraram especif icida. de de subtipo significativa. Enquanto todos os soros murinos e a maior parte dos soros humanos reconheceram preferencialmente a sequência pl33-145, diversos soros humanos reconheceram a sequência terminal amino pl20-132 quer exclusivamente (soro n2. 5) quer em adição à sequência pl33-145 (soro n9. 6).
Cumulativamente, estes resultados confirmaram um trabalho anterior em que uma resposta humoral específica para pre-S2 ocorreu durante infecção por VHB (Neurath e col., (1984) Sei ence, 224:392), e indicou que esta resposta estava dirigida para a região pl2D-145 e principalmente para a sequência pl33-145 como foi observado para a resposta murina após imunização. Contudo, deve-se notar que diversos anti-soros humanos também reconheceram eficientemente a sequência pl20-132, ao contrário da resposta murina.
M, p!2-21 ligado a um determinante de célula B actua como um determinante de auxílio de célula T
Um grupo de 5 ratos SOL/J foram imunizados quer com pl33-151 quer com o pêptido composto p(12-21)-133-151, no qual a sequência péptida 12-21 serviu como um polipéptido (a) e a sequência 133-151 serviu como um polipéptido (b).
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-93Como se mostra no Quadro 16, a imunização sô com pl33-151 não levou à produção de anticorpo após quatro semanas, contu do, a imunização com p(12-21)-133-151 resultou na produção de anticorpo para pl33-151 no mesmo período de tempo. Os an ticorpos assim induzidos reagiram de forma cruzada com parti cuias AgHBs/p33 nativas. Só após uma imunização secundária com pl33-151 foram detectados anticorpos anti-pl33-151, e os seus títulos eram aproximadamente 10 vezes inferiores aos me didos contra pl33-151 e 32 vezes inferior ao medido contra AgHBs/gp33 em comparação com soros de ratos imunizados com p(12-21)-133-151.
QUADRO 16
Capacidade da sequência pl2-21 para funcionar como trans portadora para um determinante de célula B da região pre -5(2) sintético (pl33-151)
| Imunogénio | Tempo·*· | T ítulo | de anticorpo antigénios | contra | |
| P12-21 | P133-151 | p(12-21)- 133-151 | AgHBs/p33 | ||
| P133-151 | 2 u/k | 0 | 0 | 0 | 0 |
| 4 u/k | 0 | 0 | 0 | 0 | |
| 28 | 0 | 1.280 | 160 | 160 | |
| p(12-21)- | |||||
| 133-151 | 2 uik | 0 | 0 | 0 | 0 |
| 4 uik | 0 | 1,280 | 1.280 | 160 | |
| 28 | 0 | 10.240 | 5.120 | 5.120 |
Tempo em semanas (u/k). 28 = imunização secundária.
Os resultados apresentados no Quadro 16 ilustram que pl2-21 pode funcionar como um determinante de auxílio de célula T /polipéptido (a)_7 para um determinante de célula B
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rí
-94sintético /~p°lipéptido (b)_/ numa estirpe que responde a P12-21 ao nível da célula T. Note-se que a sequência pl33-151 não estâ adjacente à sequência pl2-21 na molécula nativa, e de facto, aquelas sequências estão separadas por 111 re síduos aminoácidos na sequência linear.
N. Vacinas de subtipo composto
As vacinas AgHBs da região S comerciais desenvolvidas até à data (derivadas do plasma e recombinante) têm consisti, do de partículas subvirais de um só subtipo (i.e., ad ou ay). 0 raciocínio tem sido que anticorpos para os determinante(s) específico de grupo (a) é protector, e os anticorpos específicos de subtipo não são necessários para a protecção. Esta prática não tem levado em conta a vontade de estimular a memória de célula T específica de subtipo. Assim, quando um indivíduo foi imunizado com um subtipo, a memória específica de subtipo das células T devia ser incapaz de evocar uma res. posta anamnéstica no caso de uma infecção virai subsequente com o subtipo heterólogo.
Foi previamente demonstrado que um certo número de es. tirpes murinas imunizadas com AgHBs/p25 (ad) reconheceram lo cais da célula T esclusivamente específicos de subtipo, e ne nhuns locais específicos de grupo dentro da região S, mas apesar disso produziu anticorpos anti-a. bem como anticorpos anti-jd. Portanto, as células T específicas de subtipo são capazes de auxiliar produção de anticorpo de célula B especí. fico de grupo. Milich e col., 3. Immunol., 134:4194 (1985).
Verificou-se agora que quando as estirpes murinas B1O.S e B10.M foram examinadas para a influência do subtipo na resposta imunológica pertencente a pre-S (2), verificou-se também que o reconhecimento de célula T da região pre-S(2) era específico de subtipo. Isto é, as células T es. timuladas por pre-S(2)/ad reconheceram partículas AgHBs contendo pre-S(2)ad, mas não partículas AgHBs contendo pre-S(2)/ /ay. Além disso, como se pode ver a partir do Quadro 17, abaixo, ratos B10.M, que não respondem às regiões pre-S(2) e
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| Ξ quando imunizados com partículas pre-S(2) | ou S-AqHBs/ay, | |
| respondem a partículas pre-S(2)-AgHBs | /ad, e | produzem anti- |
| corpos ambos anti-S e anti-pre-S(2). | ||
| QUADRO 17 | ||
| ESPECIFICIDADE DE SUBTIPO DE RE | SPOSTAS | DE ANTICORPO |
| TITULO | DE A MT 1002PO | |
| IMUNOGENIO estirpe1 tempo2 | ANTI-S | ANTI-PRE-S(2) |
| AgHBs/p33(ay) B1O.S 10o. | 0 | 0 |
| 24d. | 0 | 1:640 |
| 9 0 | 1:640 | 1:10.240 |
| B10.M lOd. | 0 | 0 |
| 24d. | 0 | 0 |
| 2° | 0 | 0 |
| AgHBs/p33(ad) BlO.S lOd. | 0 | 1:640 |
| 24d. | 1:640 | 1:640 |
| B10.M lOd. | 0 | 1:160 |
| 24d. | 1:2560 | 1:5120 |
1 Ratos B10.S são não respondedores para a região S do AgHBs de ambos os subtipos quando imunizados com AgHBs/ /p25. Ratos B10.M são não respondedores para a região S do AgHBs de ambos os subtipos (i.e. AgHBs/p25), e para a região pre-S(2) do subtipo ay /~i.e. AgHBs/gP33 (ay)_7, mas respondem para o subtipo ad /”i.e. AgHBs/gP33 (ad) 7»
Tempo em dias (d.) após imunizações primárias. 2s = resposta após imunização secundária.
Estes resultados indicam que as vacinas AgHBs contendo S— e pre-S(2) beneficiam da inclusão de ambos os subtipos ad e ay de pre-S(2) e S por pelo menos duas razões: (1) a es. timulação da memória de célula T relevante para a infecção por subtipo com qualquer dos subtipos do vírus; e (2) não res. pondedores para um subtipo podem ser respondedores para os ou.
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-96tros subtipos em termos de produção de anticorpo e portanto, o número de não respondedores genéticos pode ser reduzido.
Assim, o presente invento contempla ainda uma vacina contra infecção pelo VHB compreendendo, em mistura com um d_i luente fisiologicamente tolerável, um primeiro polipéptido imunogénico apresentando o subtipo de célula T ad da pre-S (2) e S do UHB, e um segundo polipéptido imunogénico apresejn tando 0 subtipo de célula T ay da pre-S(2) e S do VHB, estar) do cada um do primeiro e segundo polipéptidos presentes numa quantidade suficiente para induzir uma resposta de célula T específica de subtipo. 0 polipéptido da vacina pode estar sob a forma de partículas de polipéptido como nas partículas AgHBs/gP33 aqui discutidas ou como imunogénios compostos, são também aqui descritos. Ambos os polipéptidos de subtipo podem também estar presentes numa sé sequência polipéptida co mo nos imunogénios compostos aqui discutidos, excepto que um tal imunogénio contém um polipéptido (a) para cada subtipo.
VII. Materiais e Métodos
A. Materiais
As estirpes murinas consanguíneas C57BL/10 (B10), B1O.D2, B10.BR, B1O.S, B1O.M, S3L/3, C^H.Q, C3H e Balb/c foram obtidas a partir das colónias em reprodução no Research Institute ofScripps Clinic, La 3olla, CA. Ratos fêmea entra seis e oito semanas de idade no início dos estudos foram us.a dos em todos os estudos.
Partículas de AqHBs/q33/ay recombinante foram forneci, das por Dr. P. Tiollais (Instituto Pasteur, Paris). Aquelas partículas foram preparadas a partir de células do ovário do hamster chinês (CHO) transfectadas com um plasmídeo contendo o gene S e 0 gene da região pre-S do subtipo ayw do VHB. As partículas derivadas de CHO são compostas do p25 codificado por S e 0 p33 codificado por pre-S2 e S numa proporção de aproximadamente 3 para 1, como descrito em Michel e col., Proc. Natl. Acad. Sçj. U.S.A., (1984) 81:7708. □ qual está
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-97aqui incorporado por referência.
Partículas purificadas, de AqHBs/p33/ad derivadas do soro foram proporcionadas por Dr. D. Peterson (Medicai College of Virgínia, Richmond, VA). Aquelas partículas foram derivadas de subtipo adUM 6 contêm p33 representado como apro ximadamente 8,2 por cento dos polipéptidos substituintes. Uma preparação de AgHBs/p39 derivado do plasma foi também proporcionada por Dr. Peterson.
As preparações purificadas de AgHBs/p25/ad foram fornecidas por Dr. R. Louis (Cutter Laboratories, Berkeley, CA). Aquela preparação foi purificada por Cutter Laboratories a partir de plasma humano através de uma combinação de processos padrão incluindo ultracentrifugação, precipitação em sujL fato de amónia, digestão com pepsina e cromatografia em gel. A preparação resultante foi composta exclusivamente pelo polipéptido (p25) de 25 kilodalton (kd) e pela sua forma glico silada (gp28).
Preparações de AgHBs purificado, derivado do plasma, representando ambos os subtipos ad e ay, e consistindo de d_i versas proporções de p25, p33 e p39 foram fornecidas por Dr. Gerin (Georgetou/n University, Rockville, MD). A preparação contendo a proporção mais elevada de pre-Sl (p39) foi usada predominantemente ao longo deste estudo, e foi designada AgHBs/p39.
Houve uma variação na quantidade de antigenicidade es. pecífica da região Ξ por unidade de peso de partículas nas preparações de AgHBs aqui utilizadas. Portanto, todas as preparações foram equilibradas em primeiro lugar em relação à antigenicidade específica da região S em termos de ligação de anticorpo usando um ensaio imunosorvente de ligação enzimática em sanduíche, de fase sólida, (ELISA) descrito adiante. Depois, as proporções de p25, p33 e p39 presentes nas diversas preparações de partículas AgHBs, foram determinadas de forma semelhante. Num ensaio ELISA em sanduíche, que é bem conhecido na arte, o antigénio (AgHBs) a ser medido foi
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-98colocado em sanduíche entre um anticorpo monoclonal ligado à fase sólida específico quer para S, pre-Sl ou pre-S2 e um se. gundo monoclonal anti-S marcado com percxidase (sem reactivi. dade cruzada com o monoclonal anti-S de fase sólida) usado aqui como uma sonda.
Dois anticorpos monoclonais (Mabs) específicos para a região S do AgHBs foram proporcionados pelo Dr. P. Kaplan (Ortho Diagnostics, Inc., Raritan, N3). Mab específico para a região pre-Sl do AgHBs (A18/7) foram fornecidos pelo Dr.
W. Gerlich (University of Gottingen, Gottingen, Alemanha). Aqueles Mabs estão descritos em Heerman e col., (1984) 3, Virol., 52:396. Mab 5520, 5521 e 5535 específicas para pre-S2 foram produzidos após imunização de rato Balb/c estando o pêptido sintético pl33-151 (subtipo ayui) ligado à ovalbumina e foram fornecidos pelo Dr. T. Nakamura (Institute of Immuno logy, Tokyo, 3apão), como descrito em Okamoto e col., 3. Immunol., (1985) 134:1212. Mab 4408 e Mab 5161 específicos pa ra a pre-S2, produziram após imunização de ratos Balb/c com um derivado polipéptido pl33 intacto das partículas AgHBs/ /ayw como descrito por Machida e col., (1984) Gastroenterol., .86:910, foram também fornecidos pelo Dr. T. Nakamura.
B. Imunização
Para estudar a produção de anticorpo in vivo, grupos de ratos foram imunizados usando inóculos contendo quer 1-2 microgramas de AgHBs nativo nas suas diversas formas, p25, p33 ou p39, quer 100 microgramas dos diversos polipéptidos sintéticos como imunogénio disperso em adjuvante de Freund completo (CFA) através de injecção intraperitoneal (IP) como a primeira imunização (15). Uma segunda imunização (25) usari do um inóculo contendo 2 microgramas ( yxg) de AgHBs nas suas diversas formas em CFA ou contendo 0,5 y*.g de AgHBs/p35 ou 50 yug de um polipéptido sintético como imunogénio em adjuvante de Fpeund incompleto (IFA) foi administrada IP cerca de quatro semanas após a primeira imunização (1θ). Soros de ratos foram obtidos a partir de plexo retro-orbital 24 dias após a primeira imunização e novamente duas semanas após a
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-99imunização secundária, excepto quando indicado em contrário.
A estimulação in vivo para o ensaio proliferativo de célula T foi conseguido através de injecçães na pata traseira de ou 4 yUg de AgHBs ou 100 yUg de polipéptido sintético em CFA.
C. Medição de Anti-HBs e de Anti-pre-S
Os anticorpos anti-S e anti-pre-S induzidos por imuni zação com um polipéptido sintético ou com AgHBs nativo, e ari ticorpos anti-polipéptido induzidos por imunizaçães de polipéptido, foram medidos através dos seguintes métodos.
1. Radioimunoensaio
Soros murinos foram avaliados para a reactividade poli, péptida anti-S, anti-pre-Sl ou anti-pre-S2 e anti-sintética num radioimunoensaio (RIA), indirecto, específico de classe de imunoglobina, utilizando como o ligante ligado à fase sólida, ou um polipéptido sintético (1-2 por depósito), ou partículas AgHBs purificadas (0,1 microgramas por depósito). IgQs anti-rato de cabra, foram utilizados para colocar em sajn duíche os anticorpos murinos ligados ao ligante de ligação à fase sólida. Após lavar qualquer anticorpo anti rato de ca125 bra não ligado, IgG anti-cabra suína marcada com I foram misturadas e mantidas com os anticorpos anti-rato de cabra ligados à fase sólida como descrito em Milich e col., (1982) 3. Immunol., 129:320. AgHBs/c25/ad fgi usada coma um ligante de ligaçãn à fase sólida para ensaiar anticnrpe específicg da região anti-S. 0 polipéptido sintético pl20-145 foi usado como um ligante de ligação à fase sólida para ensaiar o anticorpo específico de pre-S2. De forma semelhante, ο p_o lipéptido sintético p94-117 foi usado para ensaiar anticorpo específico de pre-Sl. Numerosas outras preparaçães de AgHBs e polipéptidos sintéticos foram também usados como ligante de ligação à fase sólida nestes estudos como indicado nos quadros relevantes.
Os dados são expressos como um título de anticorpo re
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-100presentando a diluição mais elevada para dar três vezes as contagens dos valores dos soros de pre-imunização. Os anticorpos monoclonais específicos para estes mesmos antigénios, foram ensaiados pelo mesmo RIA de fase sólida indirecto, excepto que os dados estão expressos como título de anticorpo representando a concentração mínima necessária para dete_ç tar ligação superior a cinco vezes as contagens do valor de base,
2. ELISA
Soros humanos foram ensaiados para a reactividade de anticorpo usando péptidos sintéticos pre-Sl ou pre-S2 especí ficos como ligantes de ligação à fase sólida (1,0 micrograma por depósito) num ensaio imunosorvente de ligação enzimática (ELISA). Os soros ensaiados foram primeiro misturados e mar) tidos (incubados) com os ligantes ligados à fase sólida.
Após remover quaisquer constituintes não ligados do soro, as fases sólidas resultantes foram sondadas com um anticorpo mo noclonal IgG anti-humana marcada com peroxidase. Valores da amostra de densidade óptica a 490 nanómetros (O.D. 490) quatro vezes superior às do soro normal foram considerados posi. tivos usando diluições 1:50 de soro humano que foram mistura das e mantidas (incubadas) com ligante. Nalguns casos, diluições de soros, p.e. Quadro 15, foram incubadas com ligante. Aqui, o título foi definido com a diluição mais elevada para dar uma leitura de O.D. 490 de 0,10.
Ensaios de competição anticorpo-anticorpo foram efectuados pre-misturando e mantendo (pre-incubando) concentrações variáveis /~0,6 - 625 nanogramas por mililitro (ng/ml)__/ do anticorpo de competição marcado com uma concentração pre-determinada limitante de ligante ligado à fase sólida (AgHBs/p33 0,1 yUg por depósito) por um período de tempo de cerca de 18 horas (durante a noite) a 43 centígrados, seguido pela mistura e manutenção (incubação) de uma quantidade pré-determinada de segundo anticorpo marcado com enzima (pero xidase de rábano), cuja inibição estava a ser medida. Os resultados estão expressos como percentagem de inibição da in-
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-101teracção anticorpo marcado ligante de ligação à fase sólida. Os anticorpos monoclonais 4408, 5521 e 5161 foram marcados com enzima e usados da forma descrita. Os anticorpos de com petição usados nestes estudos foram quer anticorpos monoclonais quer policlonais produzidos para polipéptidos sintéticos ou preparações de partícula AgHBs.
D. Ensaio de Proliferação de célula T específica para AgHBs
Grupos de quatro ratos foram imunizados nas plantas das patas traseiras com uma emulsão de CFA e ou 4 de AgHBs ou 100 ^ug de polipéptido sintético. Oito a dez dias depois, foram recolhidas células do ganglio linfático popli5 teu, e cultivadas in vitro para uma concentração de 5x10 c.é lulas/ml com diversos antigénios de competição (ligantes). Os antigénios in vitro incluíam AgHBs nativo /~p25, p33 e p39 os quais continham diversas proporções, conhecidas, de S, pre-Sl e pre-S2_/, e os polipéptidos sintéticos da região pre-S, pl-21, pl2-32, p32-53, p53-74, p94-117, P120-131/adiu, O120-132/adiu, pl2 0-132/ayiu, pl20-140/ad, pl20-145/ad, pl20-145/ax, pl28-138 e pl33-145.
As células de ganglio linfático popliteu em drenagem foram recolhidas assépticamente de cada rato e espalhadas pa ra dar uma suspensão de uma sé célula. As células foram lavadas duas vezes com uma solução salina equilibrada (BSS) contendo fosfato tamponado salino (pH 7,2). As células foram ressuspensas em meio de Click contendo BSS, glutamina L, piruvato de sódio, antibióticos, 2-mercaptoetanol, aminoácidos essenciais e não-essenciais e vitaminas. Click e col., (1972) Cell. Immunol., _3:264_7. 0 meio de Click foi modificado através da adição de HEPES 10 milimolar (mM) (ácj. do Ν-2-hidroxietil piperazina-N'-2-etanossulfónico) e gentamicina (10 yug/ml) e pela substituição de 0,5 por cento de soro de rato normal sinergico por soro fetal de vitelo.
0s antigénios foram ensaiados em cultura sobre uma qa ma de doses de 0,003 a 1 ^ug/ml para preparações AgHBs, e 0,07 a 200 yxg/ml para polipéptidos sintéticos.
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-102Células viáveis do ganglio linfático (5x10^) em 0,1 ml de meio, foram colocadas em depósitos de microtitulação de fundo direito (Falcon 3072, Falcon Plastics, Inc.) com: (a) 0,1 mililitro de meio contendo diversas concentrações de uma preparação de AgHBs ou de um péptido sintético, (b) meio de cultura e ovalbumina £~20D microgramas por mili.
litro (^g/ml)_7 como um controlo negativo, do de proteína purificada (PPD) 100 mg/mlj ou (c) deriva(Parke-Davis, De troit, Ml) como um controlo positivo.
As culturas foram mantidas durante cinco dias a 37 graus C numa atmosfera humidificada contendo 5 por cento de dióxido de carbono no ar.
No quarto dia, cada cultura foi misturada e mantida (incubada) com um microcurie (^Ci) de ^H-timidina (^HTdR) (6,7 Ci/milimole, New England Nuclear, Boston, MA) durante 16 horas antes de ser recolhida. As células foram recolhidas sobre tiras de filtro e a proliferação foi determinada pela incorporação de ^HTdR para dentro do ADN. Os dados estão expressos como contagens por minuto (cpm) corrigidos para a proliferação de base na ausência de antigénio. Demonstrou-se previamente que a resposta de proliferação específica para AgHBs de células PLN em drenagem recolhidas até 13 dias após imunização foi devida a células T proliferativas; Milich e col. (1983) J, Immunol., 130:1401. Portanto, células PLN não fraccionadas foram usadas em análises aqui descritas.
E. Síntese de Polipéptidos
0s polipéptidos correspondendo à região pre-S2 aqui utilizados foram sintetizados quimicamente através de métodos de fase sólida como descrito por Merrifield e col», (1963) J. Am. Chem» Soc., .85:2149. 0 método de fase sólida de síntese de polipêptido foi praticado usando um sintetizador de Péptido Vega 250 e um Sintetizador de Péptido Applied Biosciences 430A, comercialmente disponíveis de Vega Biotechnologies, Inc., Tucson, AZ e Applied Biosystems, Foster
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-103City, CA, respectivamente. A composição de cada péptido foi confirmada por análise aminoácida.
Em resumo, na preparação de um polipéptido sintético através do método de fase sólida acima, os resíduos aminoáci dos são ligados a uma resina (suporte sólido) através de uma ligação éster a partir do resíduo terminal carboxilo. Quando o polipéptido é para ser ligado a um transportador ou a outro polipéptido através de um resíduo Cis ou reagido através de resíduos Cis terminais, é conveniente utilizar aquele resíduo Cis, como o resíduo terminal carboxilo, que está ligado por éster à resina.
grupo alfa-amino de cada aminoácido adicionado está tipicamente protegido por um grupo terciário butoxicarbonilo (t-BOC) antes do aminoácido ser adicionado para a cadeia poli, pêptida em crescimento. 0 grupo t-BOC é então removido antes da adição do próximo aminoácido à cadeia polipéptida em cre.s cimento.
As cadeias laterais aminoácidas reactivas foram também protegidas durante a síntese dos polipéptidos. Grupos protectores de cadeia lateral usuais foram usados para os restantes resíduos aminoácidos da seguinte forma: 0-(£-bromobenziloxicarbonil) para tirosina; 0-benzilo para treonina, serina, ácido aspártico e ácido glutâmico; 4-metilbenzilo e Ξ-metoxibenzilo para cisteína; dinitrofenil para histidina; 2-clorobenzoxicarbonil para lisina e tosil para arginina.
Os péptidos sintetizados no Sintetizador de Péptido Applied Biosystems Model 430A foram feitos usando o método de anidrido simétrico de Hagenmaier, H., e Frank, A. (1972), Hoppe-Seyler^ Z. Physiol. Chem.» 353:1973. 0 método DCC in situ, como descrito por Merrifield e col. (1963) 3, Amer. Chem. Soc. 85:2149 foi usado para sintetizar os péptidos do Sintetizador de Péptido Vega 250, A ligação repetida dos aminoácidos protegidos admitidos foi por vezes necessária para efectuar eficientemente a ligação completa. Todas as reacçães de ligação foram mais de 99%> completas através do teste quantitativo da ninidrina de Sarin (1981), Analytical
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-104Chemistry, 117:147.
Após preparação de um polipéptido desejado, uma porção do polipéptido protegido resultante (cerca de 1 grama) foi tratada com dois mililitros de anisol, e ácido fluorídrico anidro, cerca de 20 mililitros, fci condensada para o frasco de reacção à temperatura de gelo seco para formar uma mistura. A mistura resultante foi agitada durante cerca de uma hora a cerca de 4 graus C para clivar os grupos de protecção e para remover o polipéptido da resina. Apôs evaporar o áci do fluorídrico a uma temperatura de 4 graus C com uma correri te de Np, o resíduo foi extraído com éter dietílico anidro três vezes para remover o anisol, e o resíduo foi seco.
material seco foi extraído com 5 por cento de ácido acético aquoso (3 vezes 50 mililitros) para separar o polipéptido livre da resina. A solução contendo o extracto foi liofilizada para proporcionar o polipéptido.
Os polipéptidos derivados da região pre-Sl foram quimicamente sintetizados.
Os polipéptidos sintéticos resultantes foram usados como reagentes num ensaio imunosorvente de ligação enzimática (ELISA) para detectar anticorpos anti-AgHBs. Os polipépti dos sintéticos foram também usados em inôculos, geralmente em CFA ou em IFA, como atrás discutido.
presente invento tem sido descrito em relação às concretizações preferidas. Tornar-se-á claro para os entendidos na arte que modificações e/ou variações das composições e métodos reveladas podem ser feitas sem se afastar do alcance do invento aqui apresentado.
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Claims (16)
1 - Processo de preparação de um polipéptido de cerca de 6 a cerca de 50 resíduos aminoácidos consistindo essencialmente de uma sequência de resíduos aminoácidos que corresponde a uma porção da região pré-S da proteína AgHBs localizada entre uma posição amino-terminal e uma posição carboxi-terminal, respectivamente, seleccionado do grupo consistindo em 12-21, 16-27, 94-105, 106-117, 120-126, 120-132, 120-
I -140, 128-138, 133-139, 133-140, 133-143, 133-145, 134-139,
135-143, 135-145, 137-143, 137-145 e 140-151 a partir do ter. minai amino da referida região pré-S, estando o referido polipéptido isento de resíduos aminoácidos nas posições amino-terminal e carboxi-terminal enumeradas que correspondem a resíduos aminoácidos contíguos na sequência linear do AgHBs.
2 - Processo de preparação de um compósito imunogénico com pelo menos 14 resíduos aminoácidos compreendendo um primeiro polipéptido (a) tendo um resíduo terminal que está operativamente ligado a um resíduo terminal de um segundo po, lipéptido (b), no qual:
k o polipéptido (a) consiste essencialmente num epitopo de célula T tendo uma sequência de resíduos aminoácidos que corresponde a uma porção da região pré-S da proteína AgHBs Lo calizada entre uma posição amino-terminal e uma posição carboxi-terminal, respectivamente, seleccionada do grupo consis. tindo em 12-21, 94-105, 106-117, 120-126, 120-132, 120-140 e 140-151 desde o terminal amino da referida região pré-S; e o polipéptido (b) consiste essencialmente numa sequêjn cia de resíduos aminoácidos que corresponde a uma sequência de resíduos aminoácidos de AgHBs que contém um epitopo de cé lula B nativa;
o referido resíduo terminal do polipéptido (a) que es_ tá operativamente ligado ao referido resíduo terminal do polipéptido (b), correspondendo a posições separadas na sequê_n
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Ref: SCRF 95.1 - EPGíll
-106cia de AgHBs linear em pelo menos quinze resíduos aminoácidos.
3 - Processo, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado por o polipêptido (b) ser seleccionado do grupo co_n sistindo no polipêptido AgHBs de 33 kilodalton e no polipépti do AgHBs de 25 kilodalton.
4 - Processo, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado por o polipêptido (b) corresponder a uma porção da região pré-S do AgHBs localizado entre uma posição amino-te.r minai e uma posição carboxi-terminal seleccionada do grupo consistindo em 1-21, 16-27, 32-53, 53-74, 94-105, 94-117, 106-117, 120-140, 120-145, 128-138, 133-139, 133-140, 133-143, 133-145, 133-151, 135-143, 135-145, 137-143 e 153-171.
5 - Processo, de acordo com a reivindicação 2, caracte rizado pelo facto do polipêptido (b) corresponder a uma porção da região Ξ do AgHBs localizada entre uma posição amino-terminal e uma posição carboxi-terminal, respectivamente, s_e leccionada do grupo consistindo em 110-137, 117-137, 122-137 e 135-155.
6 - Processo, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo facto do resíduo terminal do polipêptido (a), operativamente ligado ao referido resíduo terminal do polipêptido (b) ser um resíduo carboxi-terminal do polipêptido (a).
7 - Processo, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo facto do resíduo terminal do polipêptido (a) operatiuamante ligado ao referido resíduo terminal do polipêptido (a) ser um resíduo amino-terminal do polipêptido (a).
8 - Processo de preparação de um compósito imunogénico compreendendo um polipêptido que consiste essencialmente numa sequência de resíduos aminoácidos que correspondem a uma porção da região pré-S da proteína AgHBs localizada entre uma posição amino-terminal e uma posição carboxi-terminal,
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Ref: SCRF 95.1 - EPGíll
-107respectivamente, seleccionada do grupo consistindo em 12-21, 120-126 e 120-132 desde α terminal amino da referida região pré-S operativamente ligada ao epitopo de célula B não AgHBs.
9 - Processo, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo facto do epitopo da célula B ser um polipéptido.
10 - Processo, de acordo com a reivindicação 8, caraç. terizado pelo facto do epitopo de célula B conter uma sequên cia de resíduos aminoácidos que correspondem ao epitopo de célula B nativo de uma proteína.
11 - Processo, de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo facto da referida proteína ser uma proteína de superfície de um patogene.
12 - Processo de melhoramente da imunogenicidade de um imunogene compreendendo ligar operativamente o referido imunogene a um polipéptido consistindo essencialmente numa sequência de resíduos aminoácidos que corresponde a uma porção da região pré-S da proteína AgHBs localizada entre uma posição amino-terminal e uma posição carboxi-terminal, respectivamente, seleccionada do grupo consistindo em 12-21, 94-105, 106-117, 120-126, 120-132, 120-140, 133-145 e 140-151 a partir do terminal amino da referida região pré-S.
13 - Processo, de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo facto do referido imunogene ser um imunoge. ne de uma vacina contra o vírus da hepatite B.
14 - Processo, de atenuação da falta de capacidade de resposta a uma vacina do VHB (Vírus da Hepatite B) compreendendo ligar operativamente uma sequência de resíduos aminoácidos correspondendo a um epitopo de célula T nativo na região pré-Sl do AgHBs em relação ao imunogene da referida vacina.
15 - Processo, de acorda com a reivindicação 14, caracterizado pelo facto do dito epitopo de célula T nativo es.
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-108tar localizado em posições seleccionadas do grupo consistindo em 12-21, 94-105 e 106-117 a partir do terminal amino da região pré-S.
16 - Processo, de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo facto de se incluir um polipéptido AgHBs de 39 kilodalton no imunogene da vacina.
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