KR970007153B1 - B형 간염 표면 항원 백신 - Google Patents

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Abstract

내용없음

Description

B형 간염 표면 항원 백신
숙주 세포에서의 발현
백신 생산 기술의 발달로 인하여 세균, 효모 및 포유 동물 세포내에서 HBs 항원에 대응하는 폴리펩티드의 합성이 가능하게 되었다. 그러나, 세균 및 효모 중에서 진핵 유전자의 전사는 펩티드의 글리코실화 및 분비에 관한 여러가지 결점 및 유전자 내에서 형성된 입자의 조성물로 인하여 항원으로서 상기 폴리펩티드의 효능에 불리한 영항을 끼친다.
예를 들면, B형 간염 바이러스의 경우에 있어서, 생체내에서 생성된 폴리펩티드 항원은 심하게 글리코실화되어 있다[게르리히(Gerlich), 1984 ; J. Virol : 52(2), 396 참조]. 원핵 생물에 있어서 글리코실화는 필수적인 과정이 아니므로 유전공학적으로 조작된 세균에 의해 생성된 폴리펩티드는 글리코실화가 되어 있지 않거나 불완전하게 글리코실화되어 있다. 어느 경우에 있어서도, HBsAg에 대응하는 폴리펩티드는 세균내에서 발현될 경우, HBsAg를 효과적인 백신으로 여길만한 항체를 생산하지 못한다. 진핵 숙주로서 효모가 보다 완전한 글리코실화를 행할 수 있으나, 효모에서 발현되는 HBsAg에 대응하는 폴리펩티드는 세균에서 발현되는 것과 동일한 결함을 갖게 된다[머레이(Murray)등, 1979년 : Nature, 282, 575 : 발렌쥬엘라(Valenzuela)등, 1982년 : Nature, 298, 347 ; 미야노하라(Miyanohara)등, 1983년 : PNAS, 80, 1 참조].
다른 예로서는, 세균내에서 HBsAg의 진핵성 구조 유전자는 대다수의 경우에 충분하게 전사되지 않는다. 게다가 진핵 HBsAg 유전자 생산물의 구조 및 기능은 세균 숙주에 의해서 수행될 수 없는 이황화 결합의 부가적인 후-전사 결합 과정에 의존될 수 있다.
또다른 예로서, 발현된 폴리펩티드는 세균 숙주 세포에서 거의 분비되지 않는다. 이들은 발현된 폴리펩티드를 수확하기 위해 분해되는 것으로 보인다. 정제 과정 중에 세균의 벽 성분은 폴리펩티드를 오염시킬 수도 있으며 환자에게 심한 알레르기 반응을 일으키거나 아나필락시성 쇼크를 초래한다.
마지막으로, 진핵성 프로모터는 일반적으로 세균내에서는 작용하지 않으며 발현된 폴리펩티드의 변형을 초래할 수 있는 세균성 프로모터로 대체되어야 한다[오펜스페르거(Offesperger)등, 1985년 : PNAS, 82권, 제7540면 ; 발렌쥬엘라(Valenzuela)등, 1980년 : ICN-UCLA Symp, Mol. Cell. Biol., 18 57 참조].
입자들의 형성 및 분비
B형 간염 바이러스(HBV) 및 HBV 단백질의 천연 형태는 세가지 뚜렷한 형태를 가진다 : 즉, 감염성물질로 여겨지는 HBV-비리온[데인(Dane)입자], 필라멘트(filament) 및 단백질 인벨로프(envelope)로만 구성된 20 또는 22㎚ 입자(이후로는 20㎚ 입자).
효과적인 백신으로서 가장 주목을 받는 형태는 20㎚ 입자인데, 그 이유는 1) 코딩 서열이 완전히 알려져 있고 2) 완전히 비감염성이며 3) 인체 내에서 어느 정도 유효한 면역원성을 일으키기 때문이다.
HBV 입자를 구성하는 세가지 알려진 성분들은 이들의 단백질 조성물의 상대적인 양에 있어서 다르다. 226개의 아미노산으로 이루어진 주단백질, 281개의 아미노산으로 이루어진 중간 단백질 및 아형(亞型) ayw 및 adw에 따라 결정되는 389 내지 400개의 아미노산으로 이루어진 큰 단백질이라고 하는 세개의 단량체가 있다. 큰 단백질은 pre-S1-, -S2- 및 S-영역의 완전한 서열에 의해 코딩되는 반면에, 중간 단백질은 단지 pre-S2- 및 pre-S1-영역에서만 유도되며, 마지막으로 주 단백질은 S-영역의 서열에서만 유도된 것이다[티올라이스(Tiollais)등, 1985년 : Nature, 317, 489 ; 듀보이스(Dubois)등, 1980년 : PNAS, 77, 4549 ; 맥칼져(McAlzer)등, 1984년 : Nature, 307, 178 참조].
HBV(데인 입자)의 감염성 비리온은 20㎚ 입자에 비해 40 내지 80배 이상의 고분자 단량체(pre-S1및 pre-S2펩티드)를 함유한다. 현재 이러한 pre-S-폴리펩티드들은 몇가지 생물학적 및 임상학적인 함의를 갖는 것으로 알려져 있다. pre-S 폴리펩티드상의 폴리알부민 수용체는 HBV에 감염되기 쉬운 인간 및 침팬지로부터 유래된 중합된 알부민과 결합할 수 있다[텅(Thung)등, 1983년 : Liver, 3, 290 ; 마치다(Machida)등, 1984년 : Gastroenterology, 86, 910 참조]. 이러한 좁은 숙주 범위 및 인체 간세포상의 인체 혈청 알부민을 위한 공지된 수용체는 HBV의 간친화성(hepatotropism)을 설명해준다. 즉, 데인 입자들은 순환시 간세포에 의해 흡수된 폴리(poly) 인체 혈청 알부민을 통하여 간세포와 접촉할 수 있다. 이러한 증거를 근거로 할때, pre-S 펩티드는 틀림없이 HBV에 대한 효과적인 백신으로 유용하다. 그 이유는 이것의 항체가 간세포에 들어가는데 필요한 데인 입자상의 중요한 자리를 차단하는 것으로 예견될 수 있기 때문이다[티올라이스 등, 1985년 : Nature, 317, 489 ; 밀리히(Millich) 등, 1985년 : science, 228, 1195 참조].
문헌 데이타는 또한 pre-S1에피토프가 인벨로프 입자에서 보다 훨씬 높은 비율로 존재할 경우 감염성 데인 입자에 대한 보다 양호한 보호를 암시한다.
한정된 면역원성의 방지를 유발하는 천연 원천(즉, 공혈자)에서 유래된 백신은 어떠한 pre-S 단백질도 거의 함유하지 않는다. 이것은 두가지 다른 이유가 있다. 첫째로는, 정제 과정이 비감염성의 20㎚ 입자에 촛점을 맞추었으며, 이것들은 데인 입자의 15 내지 20%에 비하여 기껏해야 1%의 pre-S1입자를 함유한다는 것이다[게르리히, 1984년 : J. Vir., 52(2), 396 ; 티올라이스 등, 1985년 : Nature, 317, 489 ; 게르리히, 1982년 : Virology, 123권, 4369 참조]. 둘째로는 20㎚ 입자들은 항-HBE 양성 운반체(Hevac B, Heopavac B)의 혈청으로부터 분리되거나 정제 과정 동안 프로테아제에 의해 절단된다는 것이다. 이 단백질 가수분해의 절단은 S 단량체만을 남겨둔 채 pre-S-폴리펩티드를 절단하는 것으로 나타났다. 이 결과, 이러한 백신은 pre-S 펩티드를 거의 또는 전혀 함유하지 않는다.
따라서, 입자의 조성물로 인하여 고도의 면역원성을 갖고 세포내에서 글리코실화되어 입자를 생성하는 세포에서 연속적으로 분비되는 HBs 항원 입자의 형태로 된 백신에 대한 요구가 있어 왔다.
참고 문헌 및 특허
유럽 특허 출원 제72 318호에는 효모, 리플리콘(replicon), 효모 프로모터 및 S 펩티드를 코딩하는 DNA 서열로 이루어진 벡터로 형질 전환시킨 효모 세포내에서 HBsAg의 발현을 기재하고 있다. 라웁(Laub)등은 J. Virol.,(48권 제1호, 271-280페이지, 1980년)에 163코돈의 전구 서열을 함유한 HBsAg가 병합되어 있는 시미안 바이러스 40(SV40)으로부터 출발한 벡터의 제조에 관하여 기재하였다. 라웁 등은 벡터가 부가적으로 163코돈의 전구 서열로 이루어지는 벡터에 비하여 S 단백질을 코딩하는 서열만을 함유할 때 상기 벡터로 형질 전환시킨 CV-1 세포가 더 양호하게 발현함을 보고하고 있다.
또한, 타케다 케미컬 인더스트리사는 일본국 특허 출원 제J5-819A-897-A에서 전체의 pre-S 및 S 펩티드의 발현에 관하여 기재하고 있다. 이 참고 문헌 역시 adw 아형의 발현을 행하였다.
페이틸슨(Feitilson) 등은 Virology(130권, 75-90페이지, 1983년)에 24,000, 28,000, 43,000 및 50,000달톤을 가진 종들을 함유한 pre-S 코딩 서열내의 폴리펩티드의 부분적인 발현에 관하여 기재하고 있다.
또한, 독일연방공화국의 DE-OS 34 39 400호에는 B형 간염 바이러스의 면역원성 폴리펩티드의 발현에 관하여 기재하고 있다.
상기 서열은 108 또는 109 코돈으로 이루어진 pre-S1폴리펩티드의 부분적인 서열을 나타내며, HBsAg의 제1개시 코돈에서 시작하여 정지 코돈의 앞에 있는 281 코돈에서 종결한다.
유럽 특허 출원 제154 902호는 B형 간염의 인벨로프 부위의 pre-S 사슬 코딩 영역내의 적어도 6개의 연속적인 아미노산의 아미노산 사슬을 가지는 펩티드를 함유하는 B형 간염 백신을 기재하고 있다.
또한, 켄트(Kent)등은 Pept. Chem.(22권 16770페이지, 1984년)에서 pre-S2영역의 N-말단의 26개 아미노산으로 이루어지는 화학적으로 합성된 펩티드가 항원으로 작용할 수 있으며 따라서 합성 백신으로서 적합할 수 있다는 사실을 기재하고 있다.
발명의 목적
상기한 어떠한 참고 문헌도 20㎚ 입자를 구성하는 단량체의 조성을 변화시켜 데인 입자의 천연 조성에 이르게 함으로써, 입자들의 항원성이 증진될 수 있다는 가능성에 대해서는 고려하지 않고 있다.
상기에서 논의한 바와 같이, 바이러스 인벨로프 단백질의 펩티드 단량체의 면역원성은 집합된 단백질 입자에 비하여 매우 적다. 본 발명의 목적은 감염성 데인 입자의 표면 항원의 천연 조성에 비유할만한 일정량의 pre-S1폴리펩티드 에피토프를 함유하는 단백질 입자의 개발에 있다.
또한, 본 발명의 목적은 이미 시판되었거나 현재 개발중에 있는 다른 모든 제품에 비하여 보다 양호한 면역 반응, 지속된 방어 및 보다 낮은 비-반응(non-responder)율을 증진시키는데 있어서 중요한 방어성 에피토프를 함유하는 pre-S1펩티드를 이용하는데 있다.
본 발명의 또다른 목적은 포유 동물 세포 내에서 HBsAg를 발현시키는 것이다. 이것은 포유 동물 세포내에서 목적하는 펩티드를 발현시킴에 있어서,
세개의 번역(전사) 산물에 대한 다른 조절 기작
프로모터-프로모터 저해
다른 길이의 개시 코돈
모든 펩티드가 발현되지는 않은 결과를 초래할 수도 있는 알려진 난점들을 극복하는 것을 필요로 한다.
발명의 요약
본 명세서에서 사용한 HBV S 펩티드는 HBV 게놈의 전체 S 영역에 의해 코딩된 펩티드를 의미한다. HBV pre-S2펩티드는 HBV 게놈의 전체 pre-S2및 S 영역에 의해 코딩되는 펩티드를 의미하며, HBV pre-S1펩티드는 HBV 게놈의 전체 pre-S1, pre-S2및 S 영역에 의해 코딩되는 폴리펩티드를 의미한다. 에피토프는 주어진 게놈 부위에 의해 코딩되는 적어도 6개의 연속적인 아미노산의 서열을 의미하고, 따라서 HBV pre-S2에피토프는 HBV 게놈의 pre-S2영역에 의해 코딩된 적어도 6개의 아미노산 서열을 의미한다. 항원성은 면역 반응을 일으키는 능력(즉, 백신 또는 항원으로서 작용하는 능력), 항체생성을 유발하는 능력 및(또는) 면역 반응 또는 항체 생성을 증대시키기 위해 세포 표면 수용체와 상호 작용할 수 있는 능력(즉, 면역 반응을 증대시키기 위하여 T-세포 표면 수용체와 반응할 수 있는 능력)을 의미한다.
HBV는 논문에 기재한[피이. 발렌쥬엘라, Nature 280권, 815페이지(1979년), 게르리히, 유럽 특허 출원-85 111 361, 뉴우라스(Neurath), 유럽 특허 출원-85 102 250] 바이러스의 모든 아형, 특히, adw, ayw, adr 및 ayr를 의미한다. 본 발명의 에피토프가 유도된 펩티드 서열의 예는 도 XⅥ 내지 도 XX에 나타냈다.
본 발명에 의하면, a) 제1DNA 서열이, pre-S1ATG 개시 코돈의 측면에 위치(flanking)하는 뉴클레오티드 서열이 천연 서열로부터 변경된, HBV pre-S1영역의 적어도 일부의 뉴클레오티드 서열로 이루어지고, 상기 제1DNA 서열은 일부 또는 전체가 HBV pre-S1에피토프의 항원성을 나타내는 아미노산 서열을 코딩하고, b) 제2DNA 서열이, 아미노산 서열이 분비시 pre-S1에피토프에 대한 면역 반응을 일으키는 입자의 직접적인 형성을 유도하는, HBV S 항원 또는 HBV 중심 항원의 전체 또는 일부에 대응하는 아미노산 서열을 코딩하는 것을 특징으로 하는 프레임 내에 연결된 제1 및 제2DNA 서열을 작동가능하게 연결된 발현 조절 서열로 이루어지고, 상기 DNA 서열 각각은 재조합 DNA 분자에 의해 발현된 단일 펩티드의 별개의 도메인을 코딩하는 재조합 DNA 분자가 제공된다.
분비시 형성되는 입자는 HBV 백신의 기초로서 사용할 수 있다. 입자는 직경이 10㎚ 이상인 것이 바람직하다. HBV S 펩티드의 실질적인 부위 또는 전체는 제2DNA 서열에 의해 코딩되는 펩티드로서 바람직하다.
본 발명의 특히 발람직한 실시 태앙은 상기 제1DNA 서열이 pre-S1영역 ATG 개시 코돈을 함유하는 5' 말단 영역이 S 영역 ATG 개시 코돈을 함유하는 HBV S 영역의 5' 말단 영역으로 대체된 것인 HBV pre-S1영역의 적어도 일부의 뉴클레오티드 서열로 이루어지고, 상기 제2DNA 서열이 ATG 개시 코돈이 없는 HBV S 영역의 뉴클레오티드 서열로 이루어진 것인 DNA 분자에 있다. 이 DNA 분자에 있어서, pre-S1영역은 사실상 S 서열내로 이동되었다.
본 발명의 재조합 DNA 분자로 형질감염된 포유류 숙주 세포 역시 기재하였다. 본 명세서에서 사용한 형질감염된 또는 형질감염은 형질감염, 형질전환 또는 다른 수단의 어느 것에 의하든지 외래성 DNA를 숙주 세포에 첨가하는 것을 의미한다. 본 발명의 숙주 세포는 또한 HBV S 펩티드의 아미노산 서열의 실질적인 부위 또는 전체에 대응하는 아미노산의 발현을 코딩하는 DNA 서열로 이루어지는 제2재조합 DNA 분자로 동시에 형질감염되어도 좋다.
제1별개의 영역 및 제2별개의 영역으로 이루어지는 펩티드가 또한 개시되어 있다. 제1영역은 HBV pre-S1에피토프의 에피토프 항원성을 나타낸다. 제2영역은 HBV S 항원, HBV 중심 항원의 전부 또는 일부에 대응한다. HBV S 펩티드의 실질적인 영역 및 전체가 특히 적합하다. 바람직하게는, 제1영역을 제2영역보다 펩티드의 N-말단에 근접하게 위치시키는 것이 좋다.
또한, 다수의 제1펩티드 단량체로 이루어지는 면역원성 입자들이 개시되어 있다. 상기 제1펩티드 단량체 각각은 상기한 펩티드의 제1 및 제2별개의 펩티드와 동일한 제1별개의 영역 및 제2별개의 영역으로 이루어진다. 또한, 추가로 다수의 제2펩티드 단량체로 이루어지고, 제1 및 제2펩티드 단량체가 단량체 사이의 상호 작용하는 힘에 의해 함께 결합되어 있는 면역원성 입자들이 개시되어 있다. 상기 제2펩티드 단량체 각각은 HBV S 펩티드의 아미노산 서열의 실질적인 영역 또는 전체에 대응하는 아미노산으로 이루어진다.
면역원성 입자들은 또한, 실질적으로 1% 이상, 바람직하게는 5% 이상의 pre-S1에피토프를 함유한다. 본 명세서에 기재한 바와 같이 주어진 에피토프를 가진 펩티드 단량체가 입자 중에서 모든 단백질의 1%를 함유할 경우, 입자는 주어진 에피토프의 1%를 함유한다. 면역원성 입자는 또한 실질적으로 10% 이상, 바람직하게는 15% 이상의 pre-S2단백질을 함유할 수도 있다.
제제의 투여시 면역 반응을 일으키기에 충분한 농도의 상기 면역원성 입자들 및 적합한 담체로 이루어진 약제 또한 개시되어 있다. 적합한 담체는 당업계에서 숙련된 자들에게 공지되어 있으며 간단한 완충 용액을 함유시켜도 좋다.
형질감염된 포유류 숙주 세포를 생성하는 방법을 기재하였으며, 이 방법은 DNA의 수용을 위한 적격 세포로 된 포유류 숙주 세포를 제공하고, 상기 숙주 세포를 본 발명에 따른 재조합 DNA 분자로 이루어진 제1DNA 제조물에 노출시키고, 적합한 조건하에서 상기 숙주 세포를 상기 제1DNA 제조물로부터의 DNA를 수용하도록 하고, 상기 재조합 DAN 분자를 수용한 숙주 세포를 선별하는 것으로 이루어진다.
이 방법은 추가로 상기 숙주 세포를 HBV S 펩티드의 전부 또는 실질적인 부분의 아미노산 서열을 함유하는 펩티드를 코딩하는 DNA 분자로 이루어진 제2DNA 제조물에 노출시키고, 적합한 조건하에서 상기 숙주 세포를 상기 제2DNA 제조물로부터의 DNA를 수용하도록 하는 단계를 포함한다. 제2DNA 제조물의 노출 및 흡수는 제1DNA 제조물의 노출 및 흡수 전 또는 후에 행할 수도 있다. 별법으로, 제1DNA 제조물 역시 HBV S 펩티드의 아미노산 서열을 함유하는 펩티드를 코딩하는 DNA 분자를 함유할 수 있다.
펩티드를 생성하는 방법 역시 개시되어 있으며, 이 방법은 상기 숙주 세포에 의한 단백질의 발현 및 분비를 허용하는 조건하에서 본 발명의 따른 재조합 DNA 분자로 형질감염된 포유류 숙주 세포를 배양하고, 재조합 DNA 분자로부터의 발현의 결과 생성된 펩티드를 회수하는 단계로 이루어진다. 이러한 방법에 의해 생성된 펩티드는 재조합 DNA 분자의 코딩 영역에 의해 코딩된 전체 아미노산 서열보다 적게 함유할 수 있다. 이러한 결과는 재조합체 분자의 코딩 영역의 일부분만이 전사 및(또는) 번역되거나 또는 번역 후 펩티드 내에 결실로서 일어날 수 있다.
면역원성 입자를 생성하는 방법이 개시되어 있으며, 이는 숙주 세포에 의해 펩티드 단량체의 발현 및 분비를 허용하는 조건하에서 본 발명에 따른 재조합 DNA 분자로 형질감염된 포유류 숙주 세포를 배양하고, 적합한 조건하에서 펩티드 단량체의 응집을 허용하는 것으로 이루어진다.
또한, HBV S 펩티드의 아미노산 서열의 전부 또는 실질적인 부분을 함유하는 펩티드를 코딩하는 DNA 분자로 숙주 세포를 형질감염(동시 형질감염)시키는 것을 추가로 포함하는 면역원성 입자들을 생성하는 방법이 개시되어 있다. 동시 형질감염은 상기한 재조합 DNA 분자의 형질감염 전후에 또는 동시에 일어날 수 있다. 동시에 형질감염된 DNA 분자에 의해 코딩된 펩티드의 존재는 숙주 세포에서 분비되는 소량의 입자보다 다량으로 얻는데 필요하다.
바람직한 실시예에 대한 설명
본 발명의 적합한 DNA 구조물은 dhfr(디히드로폴레이트 리덕타제), MT-네오(메탈로티오네인 프로모터에 결합된 네오마이신 내성 서열) 및 MT-ecogpt(메탈로티오네인 프로모터에 결합된 내성 서열)으로 이루어진 군 중에서 선택된 선별 마커의 존재에 의해 특성화되었다. 발현율은 증폭 유전자로서 dhfr 유전자를 DNA 구조물에 첨가함으로써 더욱 증진시킬 수 있다.
본 발명의 구조물에 사용된 HBV 뉴클레오티드 서열은 제한 단편 및 합성 올리고뉴클레오티드의 분리 및 결합을 포함한 어떠한 방법에 의해서도 형성하거나 분리할 수 있다. 특히, 본 명세서에 기재한 구조물들은 전체 pre-S1-pre-S2-S 영역을 함유한 BglⅡ-BglⅡ 단편(이후로는 BglⅡ-BglⅡ 단편)에서 유도한 도 Ⅸ에 나타낸 HBV 게놈의 S 영역으로부터의 5'Xba I -BglⅡ3'(이후로는 Xba I -BglⅡ 단편)에 합성 올리고뉴클레오티드를 결합하여 형성하였다. HBV 게놈의 pre-S1-pre-S2-S 영역은 도 Ⅸ에 나타냈다. 상기의 구조물을 제조하는데 사용한 올리고뉴클레오티드는 표 1에 요약하였다.
벡터 작제를 위한 올리고뉴클레오티드 복합체
[표 1]
Figure kpo00002
Figure kpo00003
표 1의 올리고뉴클레오티드들은 바람직한 특성을 가진 구조물을 생성하기 위해 Xba I -BglⅡ 단편으로 결합시켰다. 어떤 구조물에 있어서는, 올리고뉴클레오티드 및 다른 구조물 성분에 적절히 결합되는 점성 말단을 발생시키기 위해 아답터(adaptor) 올리고뉴클레오티드 서열(표 2)을 사용하였다.
올리고뉴클레오티드 복합체(아답터 서열)
[표 2]
Figure kpo00004
Figure kpo00005
기타 아답터 서열들은 표 1의 바람직한 올리고뉴클레오티드와 Xba I -BglⅡ 단편, 다른 제한 단편, 올리고뉴클레오티드 및 다른 구조물 성분을 결합시켜 사용해도 좋다. 상기한 기타 아답터 서열의 필요한 서열은 제한 부위의 표[즉, 이것들은 본 명세서에 참고 문헌으로 인용한[Methods in Enzymology 125권, 121-128페이지의 Guide to Molecular cloning Techniques, 베르거(Berger) 및 킴멜(Kimmel)저, Academic press사, 1987년] 및 결합시킬 여러가지의 뉴클레오티드 서열을 고려함으로써 당업계에 숙련된 자들에게는 명백할 것이다. 아답터 서열은 또한 부가적인 제한 부위를 본 발명의 구조물에 도입시켜 사용할 수 있다. 아답터 서열은 적절한 번역 프레임이 HBV 서열을 통해 유지되도록 선택하거나 고안해야 하는 것에 유의해야 한다.
숙주 세포들을 형질감염시키는데 사용한 바람직한 유전자 구조물은 본 발명에 의한 재조합 DNA 기술에 의해 제조하였다. 증진된 발현율을 가진 구조물의 바람직한 실시예는 도 I-Ⅷ에 나타냈으며 하기한 바와 같이 개략적으로 표시하였다.
pU2-구조 유전자
pU2-구조 유전자-dhfr
pU2-구조 유전자-dhfr-MT-네오
pU2-구조 유전자-dhfr-MT-egpt
pMT-구조 유전자-dhfr
pMT-구조 유전자-dhfr-MT-네오
pMT-구조 유전자-dhfr-MT-egpt
pH2K-구조 유전자-dhfr
pH2K-구조 유전자-MT-네오
pH2K-구조 유전자-MT-egpt
pH2K-구조 유전자-dhft-MT-네오
pH2K-구조 유전자-dhft-MT-egpt
도 I-Ⅷ에 나타낸 구조물 각각은 HBV 서열 이외에 MT 프로모터를 가진 네오마이신 선별 마커, dhfr 선별/증폭 유전자 및 HBV 서열에 대한 프로모터를 함유한다. HBV 서열의 프로모터는 U2프로모터, MT 프로모터 또는 H2K 프로모터가 바람직하다. 여러가지 선별 마커 및 증폭 유전자를 함유하는 단편의 분리는 하기하였다. 도 I-Ⅷ의 구조물의 HBV 서열은 Xba I -BglⅡ 단편과 결합시킨 표 1 및 2의 올리고뉴클레오티드 및(또는) 아답터 서열을 나타내는 각각의 도면에 있어서 직각 바(Bar)로 개략적으로 나타냈다. 바내의 그늘진 구역은 일반적으로 특수한 구조물에서 발견되지 않는 전체의 pre-S1-pre-S2-S 영역을 나타낸다. 각 형태의 HBV 서열을 조립하는데 사용할 수 있는 표 1의 올리고뉴클레오티드는 도면에 나타냈다. 도 X는 MT 프로모터의 조절하에 pre-S2영역으로부터의 서열을 함유한 펩티드의 발현용인 두 개의 부가적인 구조물을 나타낸 것이다.
구조물들은 또한 U2프로모터의 조절하에 HBV의 게놈의 BglⅡ-BglⅡ 단편을 함유하도록 만들었다. 이러한 구조물들은 웨스턴 브랏(Western blot) 분석에 의해 나타낸 바와 같이 S 영역에서 결실 영역을 갖는 펩티드를 생성했다.
상기한 프로모터들은 특히, 발현을 증가시키기 위해 dhfr 유전자 및 메토트렉세이트를 사용한 변형시킨 방법과 결합해서 이들은 사용할 때 적합하다. 이것은 선별 마커 외에 dhfr 소형 유전자(minigene)를 또한 플라스미드에 도입시킬 때 얻어진다. dhfr 유전자를 발현될 구조 유전자와 함께 동일한 플라스미드 내에 위치시키는 것은 필수적이다. 따라서, 구조 유전자의 발현율에 있어서 증가는 마이크로몰(μM)의 농도 범위내에서 메토트렉세이트를 첨가시킴으로써 이루어질 수 있다. 따라서, 거듭 증가된 발현율을 얻을 수 있다.
적합한 세포들은 VERO 세포(원숭이 신장 세포주), 3T3-세포(쥐의 섬유 아세포 주), C127-세포(쥐의 섬유아세포 주), L-세포 및 CHO-세포(차이니즈 햄스터 세포, 이들은 디하이드로폴레이트 리덕타제에 있어서 양성이거나 또는 음성이다)이다.
정지 신호로서 진핵 세포의 정지 신호를 사용하는 것이 바람직하다. 바람직하게는 카세인 DNA 서열을 사용하는 것이 좋다. 하기의 실시예에 걸쳐서 사용한 바와 같이 HBV 단백질은 일반적으로 HBsAg 서열에 대응하는 본 발명에 의해 생성된 모든 단백질을 의미한다.
본 발명은 재조합 DNA 공정에 의해 제조된 폴리펩티드로 이루어진 B형 간염 표면 항원 입자들(HBs 항원 또는 HBsAG), B형 간염 표면 항원 폴리펩티드를 코딩하는 DNA 서열 및 상기 DNA 서열을 발현하는 세포주에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 증가된 면역원성(immunogenicity)을 갖는 신규한 입자들에 관한 것이다.
도 I, Ⅲ, Ⅳ, Ⅵ 및 Ⅷ은 본 발명에 따른 유전자 구조물을 나타낸다.
도 Ⅱ, V, Ⅶ 및 X는 본 발명의 범위 밖의 것이며, pre-S2-함유 펩티드를 코딩하는 유전자 구조물을 나타낸다.
도 I 내지 Ⅷ 및 X에서 진한 부분은 구조물에 존재하지 않는 영역을 나타낸다.
도 Ⅸ는 pre-S1, pre-S2 및 S를 코딩하는 BglⅡ-BglⅡ 단편의 서열을 나타낸다.
도 ⅩI 및 도 XⅡ는 실시예 10에 따른 면역원성 입자들을 염화세슘 침전시킴으로써 얻은 결과를 나타낸다.
도 XⅢ는 표 XI에 나타낸 선행 기술의 구조물을 나타낸다.
도 XⅣ는 본 발명의 추가의 실시태양에 따른 구조물로부터 유도되는 입자의 특성화를 나타낸다.
도 XV는 도 X-2의 올리고 서열을 나타낸다.
도 XⅥ 내지 도 XX는 본 발명의 에피토프를 유도할 수 있는 펩티드 서열의 예를 나타낸다.
입자 정제 공정
1. 폴리에틸렌 글리콜(PEG)를 사용한 분별 침전
단량체를 생성하는 배양물의 상징액을 수집하여, 2,400ml씩 분할하였다. 각각에 PEG 6000 144g을 첨가하고, 실온에서 20분간 교반시켜 용해시킨 후, 다시 4℃에서 6시간 동안 교반시켰다. 침전물을 500ml들이 병에 넣어 10℃에서 GS3 회전기 중에, 9,000rpm으로, 30분간 원심분리하였다. 상징액을 수집하고, 여기에 PEG 6000 144g을 첨가하여 상기한 방법으로 용해시켰다. 용액을 4℃에서 3시간 동안 교반시켰다. 이 용액의 침전물을 원심분리를 60분간 행한 것을 제외하고는 상기한 바와 같은 방법으로 수확하였다. 펠릿을 PBS 20ml중에 재현탁시키고, 겔 크로마토그래피시켰다.
2. 겔 크로마토그래피
PEG 석출 후 얻은 물질을 PBS 중에 재용해시키고, A-5m[바이오래드(Bio Rad)사 제품]상에서 겔 크로마토그래피시켰다. 컬럼 크기는 25×1000㎜ 및 480층 용적이었다. 전형적인 분별법으로, 10 내지 15ml중의 PEG로 석출시킨 단량체들을 걸어주고, PBS를 사용하여 6방울/분(18ml/h)의 속도로 용출시켰다. 3ml의 분획물을 수집하여 CsCl 구배시켰다.
3. CsCl 구배에서의 침전
미리 정제한 단량체를 함유하는 A-5m상의 컬럼 크로마토그래피 중 약 30분획물에 걸친 피크를 수집하여 거의 100ml가 되었다. 이 용액을 CsCl을 사용하여 1.30g/cc의 밀도로 조절하고, 이어서 SW 27/28회전기[벡크먼(Beckman)사 제품]에 장착한 니트로셀룰로오스 관으로 옮겼다. 구배는 1.35g/cc 밀도의 CsCl 용액 4ml를 하부에 넣고, 1.25g/cc 밀도 4ml와 1.20g/cc 밀도 4ml를 상부에 놓아 설정하였다. 구배를 10℃에서 50시간 동안 28,000rpm으로 시행하였다. 이어서, 구배를 분별시키고, 1.20g/cc 밀도층 중에 부유하는 정제된 단량체를 수집하였다. 이 용액을 백 중에서 물에 대해 3회 투석하여 탈염시켰다.
실시예 2
HBV 단백질의 정량 분석
1. 방사상 면역 분석법에 의한 분석
오스트리아 Ⅱ-25 샌드위치 방사성 면역 분석법[아보트(ABBOTT)부터 입수 가능함)으로, B형 간염표면 항원(항-HBs)에 대한 기니아픽 항체로 피복한 비이드를 혈청, 혈장 또는 정제한 단백질 및 적당한 대조물과 함께 인큐베이션시켰다. 이때 존재하는 HBsAg 고상 항체에 결합되었다. 비결합 물질을 흡출시키고, 비이드를 세척한 후, 인체125I-항 HBs를 비이드 상의 항체-항원 복합체와 반응시켰다. 이어서 비이드를 세척하여 비결합125I-항-HBs는 제거하였다.
)-항-HBs HBsAg
)-항-HBs·HBsAg125I-항-HBs
)-항-HBs·HBsAg·125I-항-HBs
비이드 상에 남아 있는 방사능을 감마 신틸레이션 카운터로 측정하였다.
2. ELISA(효소 면역 분석법)를 이용한 분석
엔자이노스트(Enzygnost) HBsAg 마이크로 샌드위치 분석법[베링(Behring)사로부터 입수 가능]으로, 웰을 항-HBs 항체로 피복시켰다. 혈청, 혈장 또는 정제한 단백질 및 적절한 대조물을 웰에 첨가하고, 인큐베이션시켰다. 이를 세척 후, 피록시다제-공액 항-HBs를 잔여 에피토프와 반응시켰다. 비결합 효소-결합항체는 세척하여 제거하고, 고체 상 효소 활성을 측정하였다. 과산화수소 및 크로모겐의 효소적 촉매 반응을 묽은 황산을 첨가하여 정지시켰다. 색 강도는 시료의 HBsAg 농도에 비례하는데, 알려지지 않은 시료의 색강도를 첨가된 음성 및 양성 대조 혈청의 색 강도와 광도계 상으로 비교를 함으로써 측정하였다.
실시예 3
메탈로티오네인 프로모터를 함유한 본 발명의 구조물의 제조
1) MI 프로모터의 분리
플라스미드 pBPV-342-12(ATCC로부터 입수 가능함)를 제한 효소 BglⅡ 및 BamH I 로 절단하였다. 3개의 DNA 분자가 발생되었으며, 목적하는 단편은 4.5kb의 메탈로티오네인 프로모터 및 pBR 322서열을 함유하며 다른 단편(2.0kb 및 7.6kb)으로부터 쉽게 탐지할 수 있다.
반응은 각각의 제한 효소 당 100단위를 함유하는 0.5㎍/ml DNA의 최종 농도 중의 200μl의 반응 완충액의 전체 용적내에서 행하였다. 절단의 완성은 37℃에서 3시간 동안 배양한 후 0.8% 아가로스 겔에서 전기영동법으로 점검하였다. 반응은 4μl의 0.5M EDTA를 첨가하여 정지시켰다.
4.5kb 단편을, 준비한 1.2% 아가로스 겔 전기 영동법으로 다른 단편과 분리하였다. DNA를 고농도의 염 완충액 중에서 제거시킨 DE-81 와트만(whatman) 여과 종이상의 아가로스 겔로부터 DNA를 용출시켰다. DNA를 페놀/클로로포름 및 2회의 에탄올 침전시켜 정제하였다.
2) 2.3kb HBV BglⅡ-BglⅡ 단편의 연결
HBV pre-S1, pre-S2및 S 코딩 영역을 함유한 2.3kb BglⅡ-BglⅡ 단편을 HBV를 함유하는 DNA로부터 분리하였다. 2.3kb 단편을 메탈로티오네인 프로모터를 함유한 4.5kb 단편(Cl에 기재한 바와 같이 얻은)과 함께 연결시켰다.
2.3K 단편 2μl을 4.5kb 단편 3μl과 혼합하여 T4-DNA 리가제 2단위 및 2mM ATP를 함유하는 전체 용적 10μl의 연결 완충액 중에서 14℃, 하룻밤 동안 연결시켰다.
DNA를 흡수하기에 적합한 세균 세포 현탁액에 결합 혼합물을 첨가하였다. DNA 흡수 후, 세균 세포를 플레이트 당 50 내지 300μl의 세포 현탁액 용적에 50㎍/ml 앰피실린을 함유한 LB 아가 플레이트 상에 분산시켰다. 아가 플레이트를 37℃에서 하룻밤 배양하였고, 하나의 단일 콜로니가 목적하는 단편을 가진 플라스미드인 것으로 선별되었다.
3) 목적하는 플라스미드를 함유하는 세균 콜로니의 선별
단일 콜로니를 이쑤시개로 뽑아 5ml의 LB-앰피실린 배지를 함유하는 튜브에 전이시켰다. 튜브를 37℃에서 하룻밤 동안 진탕 배양시켰다. 각각의 성장한 세균 현탁액의 소형-플라스미드를 제조하였다. 다른 생성된 DNA들은 제한 효소 EcoR I으로 절단하여 확인하였다. 2분자가 생성되었으며, 2.2kb 단편 및 4.6kb 단편이다. 절단 여부는 아가로스 전기 영동법으로 분석하였고 플라스미드 DNA는 세균 세포로부터 분리하였다.
4) HBV-유전자 서열 일부의 전환
상기 (3)과정으로부터 생성된 플라스미드를 제한 효소 BglⅡ 및 Xba I으로 절단하였다. 2분자를 기대하였으며, 아가로스 겔 전기 영동 후 분리된 각각의 550bp 단편 및 6.250kb 단편이다.
6.250kb 단편을 표 1의 55번 단편과 함께 결합시켰다. DNA를 수용하기에 적합한 150μl의 세균 세포 현탁액에 연결 혼합물을 첨가하였다. 하나의 단일 세균 콜로니가 목적하는 플라스미드를 가진 것으로 선별되었다. 새로운 플라스미드는 제한 효소 EcoR I 및 BglⅡ로 절단하여 확인하였다.
5) 네오마이신 선별 유전자의 도입
상기 (4)의 과정으로부터 생성된 플라스미드를 제한 효소 EocR I으로 절단하여 선형화시켰다. 반응은 전체 용적 50μl 및 1㎍/μl 플라스미드의 최종 농도로 행하였다. 50단위의 EcoR I을 첨가하고, 37℃에서 3시간 동안 배양한 후 절단 여부를 아가로스 겔 전기 영동법으로 확인하였다. 반응은 0.5M EDTA 1μl를 첨가하여 정지시키고, 최종 농도 0.3M의 소듐 아세테이트 및 3-4배의 에탄올로-80℃에서 30분 동안 DNA를침전시켰다. 침전된 DNA를 50
Figure kpo00006
의 증류수에 용해시켰다. 선형화시킨 플라스미드 2μl를 메탈로티오네인 프로모터 및 네오마이신 선별 유전자[제한 효소 EcoR I으로 절단하여 플라스미드 pMT-네오-E(ATCC로부터 입수 가능)로부터 4kb 단편으로 분리했음]를 함유하는 3μl의 DNA 단편과 혼합하고 연결시켰다. 단일세균 콜로니가 목적하는 플라스미드를 가진 것으로 선별되었다.
6) dhfr 증폭 유전자의 첨가
플라스미드 pdhfr 3.2(ATCC로부터 입수 가능함)을 제한 효소 Hind Ⅲ로 절단하였다. 2분자가 발생하였으며, 각각 dhft 서열을 가진 3,000bp 및 3,400bp이었다. 3,000bp 단편을 분리하여 Hind Ⅲ로 절단하여 미리개환(open)시킨 상기(5)의 과정으로부터 생성된 플라스미드에 연결시켰다. 생성된 플라스미드는 제I-2도에 나타냈다.
실시예 4
1) U2프로모터 서열을 함유한 단편의 분리
플라스미드 pUC-8-42(Exogene사로부터 구입 가능)를 제한 효소 EcoR I 및 Apa I으로 절단하였다. 2개의 DNA 분자가 발생되었으며, 목적하는 단편은 340bp로 이루어진 U2프로모터이며 다른 단편(3160bp)과 쉽게 구별된다. 절단은 각각의 제한 효소 100단위를 함유하는 0.5㎍/μl 최종 농도의 DNA에 200μl 전체용적의 반응 완충액 중에서 행하였다. 절단의 완성은 37℃에서 3시간 동안 배양후 0.7% 아가로스 겔 중에서 아가로스 전기 영동법으로 확인하였다. 반응은 0.5M EDTA 4μl를 첨가하여 정지시켰다. 340bp 단편을 준비한 1.2% 아가로스 겔 전기 영동법으로 다른 단편과 분리하였다. DNA를 고농도의 염 완충액 중에서 제거시킨 DE-81 와트만(whatman) 여과 종이 상의 아가로스 겔로부터 DNA를 용출시켰다. DNA를 페놀/클로로포름 및 2회의 에탄올 침전시켜 정제하였다.
2) 프로모터 서열을 함유한 단편을 폴리링커(polylinker) 플라스미드로의 삽입
폴리링커 서열(EcoR I, Sac I, Sma I, Ava I, BamH I, BglⅡ, Sal I, Pst I, HindⅢ의 제한 부위를 가지는)을 함유한 플라스미드 pSP 165[바이오텍(Biotec)사로부터 상업적으로 구입 가능]를 제한 효소 EcoR I으로 선형화시켰다. 반응은 전체 용적 50μl 및 1㎍/μl 최종 농도의 DNA 중에서 행하였다. 50단위의 EcoR I을 첨가하였고, 37℃에서 3시간 배양시킨 후, 절단은 아가로스 전기 영동법으로 확인하였다. 반응은 0.5M EDTA 1μl을 첨가하여 정지시키고, 최종 농도 0.3M의 소듐 아세테이트 및 3-4배의 에탄올로 -80℃에서 30분간 DNA를 침전시켰다. 침전된 DNA를 50μl의 증류수에 용해시켰다. 2μl1의 플라스미드 DNA를 U2프로모터 서열을 함유하는 DNA 단편 10μl와 혼합하고, T4-DNA 리가제 2단위 및 2mM AMP를 함유한 25μl 전체 용적의 연결 완충액에서 14℃에서 하룻밤 동안 연결시켰다. 이어서, DNA를 페놀/클로로포름 추출하여 정제하고, 다음에 2회의 에탄올 침전을 시킨 후, 10μl의 증류수 중에 용해시켰다. 결과적으로 생성된 EcoR I 및 Apa I의 점성 말단은 평활 말단으로 전환시켜 연결시켜야 한다. 평활 말단은 하기한 바와 같이 멍 빈(Mung bean) 뉴클레아제로 제거시키는 절단을 행하여 전환시킨다 : 즉, 25μl DNA(1㎍/μl 농도) 반응 완충액에, 20 단위의 효소 및 전체 35μl 용적에 대한 최종 농도 1% 글리세롤을 첨가하였다. 30℃에서 30분간 배양한 후, DNA를 페놀/클로로포름 추출에 이어서 에탄올 침전시켜 정제하였다. DNA를 5μl의 증류수에 용해시켰다. 생성된 평활 말단은 상기 사용한 10X 이상의 T4리가제 및 2mM AMP를 함유한 15μl중의 반응 용적에서 연결시켰다. DNA를 흡수하기에 적합한 세균 세포 현탁액에 연결 혼합물을 첨가하였다. DNA 흡수 후, 세균 세포를 플레이트 당 50 내지 300μl 세포 현탁액에 50㎍/μl 앰피실린을 함유한 LB 아가 플레이트 상에 분산시키고 아가 플레이트를 37℃에서 하룻밤 배양하였다. 하나의 단일 콜로니가 목적하는 U2-프로모터 단편을 함유하는 플타스미드인 것으로 선별하였다.
3) 목적하는 플라스미드를 함유하는 세균 콜로니의 선별
단일 콜로니를 이쑤시개로 뽑아 5ml의 LB-앰피실린 배지를 함유하는 튜브에 전이시켰다. 튜브를 37℃에서 하룻밤 동안 진탕 배양시켰다. 각각의 성장한 세균 현탁액의 소형-플라스미드를 제조하였다. 다른 생성된 DNA들은 제한 효소 EcoR I 및 HingdⅢ로 절단하여 확인하였다. 2분자가 발견되었으며, U2프로모터를 함유한 400bp 단편 및 2,700bp 단편이다. 절단 여부는 아가로스 전기 영동법으로 분석하였고, 플라스미드 DNA는 세균 세포로부터 분리하였다.
4) 네오마이신 선별 마커의 삽입
플라스미드 pBPV-342-12(ATCC로부터 입수 가능함)을 제한 효소 EcoR I 및 BamH I으로 절단하였다. 2분자가 분리되었으며, 4,000bp로 된 네모마이신 선별 유전자를 가진 MT 프로모터 단편 및 10,000bp의 플라스미드이다.
상기 (3) 과정에서 생성한 플라스미드를 EcoR I으로 절단하여 네오마이신 선별 유전자를 가진 MT-프로모터를 함유하는 4,000bp 단편과 함께 연결시켰다. 생성된 점성 말단 역시 평활 말단으로 전환시켜 상기한 대로 연결시켰다. 세균 형질 전환, 콜로니 선별 및 소형 플라스미드 제조 후, 생성된 플라스미드를 제한효소 EcoR I 및 HindⅢ로 절단하여 분석하였다. 두 DNA 분자가 분리되었으며, 400bp 단편 및 6,700bp 단편이었다.
5) BglⅡ-BglⅡ 단편의 연결
상기 (4)의 과정으로부터 생성시킨 플라스미드를 BglⅡ로 선형화시켰다. 2.3kb의 BglⅡ-BglⅡ 단편을 선형화시킨 플라스미드와 함께 연결시켰다. 이 플라스미드를 EcoR I로 절단시키고, 2개의 생성된 단편을 얻었으며, 프로모터 및 HBV-서열을 함유한 700bp 단편 및 잔여 HBV-서열, MT-네오 및 플라스미드를 함유한 8,700bp 단편이었다.
6) HBV-서열내에서 변경
상기 (5)의 과정으로부터 생성한 플라스미드를 제한 효소 BglⅡ 및 MstⅡ로 절단하였다. 두 분자가 발생되었으며 이는 상기한 대로 용출한 pre-S 서열의 일부를 함유한 300bp 단편 및 다른 9,100bp의 단편이었다. 이 9,100bp 단편을 변경된 pre-S1유전자 서열을 코딩하는 다른 BglⅡ/MstⅡ 216bp 단편(서열은
Figure kpo00007
임)에 연결시켰다.
목적하는 플라스미드를 절단하여 2개의 생성된 단편을 분리하였는데 각각 616bp 단편 및 8,700bp 단편이다.
실시예 5
H2K 프로모터의 분리
H2K 프로모터를 psp65H2[엑소진(Exogene)사로부터 구입 가능함]로부터 EcoR I/BglⅡ 단편으로 분리하였다.
egpt 마커의 분리
메탈로티오닌 프로모터 및 egpt-선별 유전자를 함유한 단편은 제한 효소 EcoR I을 사용하여 플라스미드 pMSG[파마시아(Pharmacia)사로부터 구입 가능]를 절단함으로서 3.6kb 단편으로 분리하였다.
모든 기타의 플라스미드는 필요한 구성 성분을 함유한 단편을 혼합시키고, 목적하는 올리고뉴클레오티드 및 아답터 서열(필요할 경우)을 사용하여 유사한 방법으로 제조하였다.
실시예 6
본 발명의 구조물을 사용한 포유 동물 세포의 형질 감염
본 발명의 구조물에 의해 코딩된 실질적인 양의 HBV 펩티드를 분비시키기 위해서 포유 동물 세포들은 본 발명의 구조물 및 전체 S 단백질을 발현하는 구조물로 형질감염시켜야 한다. 동시 형질감염은 각 구조물을 분리하여 형질감염시키기는 2단계 또는 두 구조물은 1회의 형질감염에 사용하는 단일 단계로 행하였다.
동시 형질감염은 두 구조물상에 다른 선별 마커를 사용하거나 면역 분석법으로 두 구조물의 발현 산물이 분비되는 것을 탐지함으로서 확인할 수 있다. 별법으로는, 본 발명의 HBV 펩티드 서열을 코딩하는 서열 및 전체 S 단백질을 코딩하는 분리 서열을 한 구조물에 결합시킬 수 있다.
실시예 7
일반적인 방법
본 발명을 실시하는데 있어서 유용한 일반적인 방법은 (1) Method of Enzymology, 제152권, 분자 클로닝 기술에 대한 지침(Guide to Molecular Cloning Techniques) 베르거(Berger) 및 킴멜(Kimmel) 편집(Academic Press 1987), 및 (2) 매니아티스(Maniatis) 등의 Molecular Cloning ; A Laborator Manual(Cold Spring Harbor Laboratory, 1982년)에 기재되어 있는데, 이를 본 명세서에 참고 문헌으로 인용한다. 사용한 구체적인 기술을 하기한다.
1) 제한 효소 절단 및 단편의 분리
사용한 제한 효소는 BalⅡ, BamH I, HindⅢ, EcoR I, Xba I, MstⅡ, Xho I 및 PflM I로 이들은 각각의 제한 효소 완충액(10X)과 함께 현재 기브코/비알엘(Gibco/BRL)사에서 시판하고 있다.
달리 기재하지 않은 한, 다음과 같은 방법으로 제한 효소 절단을 행하고, 단편을 분리하였다. 반응에는 통상적으로 DNA 1-5㎍을 함유시켰다.
-증류수를 에펜도르프(eppendorf) 튜브 중의 DNA에 첨가하여 최종 부피가 8μl가 되게 하였다.
-여기에 적절한 10X 절단 완충액 1μl를 첨가하고, 조심스럽게 혼합하였다.
-반응 튜브를 37℃에서 1시간 동안 배양하였다.
-여기에 0.5M EDTA(pH 8.0)을 최종 농도가 10mM이 되도록 첨가하여 절단을 정지시켰다.
-DNA를 겔 상에서 직접 분석하는 경우에는 겔-부하 염료 Ⅲ(마니아티스) 1μl를 첨가하고, 혼합해서 시료를 0.8% 아가로스 겔의 홈 중에 부하시켰다.
아가로오스 겔은 통상적으로 0.8% 아가로오스, 1X 이동 완충액(TEB, 마니아티스)을 함유한다. 약 100-1000bp의 단편을 아가로스 겔로부터 분리한 경우에, 아가로스 농도를 1.2에서 1.4%로 증가시켰다.
2) 적합한 박테리아 세포
밀생한 철야 배양물로부터, 1ml 박테리아 세포 현탁액을 100ml의 신성한 생장 배지(L-브로쓰)에 첨가하였다. 세포를 37℃에서, 500ml용 엘렌메이어 플라스크 중에서 격렬하게 교반시키면서 2시간 동안 생장시켜서 OD600=0.7의 밀도로 만들었다. 배양물을 얼음 상에서 10분간 냉각시켜서 생장을 정지시켰다. 이 배양물로부터, 3ml을 취하여 3,000rpm으로 5분 동안 원심분리하여 지수적인 세균 세포를 수확하였다. 세포를 10mM Tris, pH 8.0 중의 50mM CsCl21.5ml 중에 재현탁시키고, 얼음 상에서 15분간 인큐베이션시켰다. 세포를 3,000rpm에서 5분 동안 1회 더 원심분리하여 수확한 후, 10mM Tris, pH 8.0 중의 50mM CaCl2200㎕ 중에 재현탁시키고, 직접 사용하였다.
3) 적합한 박테리아 세포의 형질 전환
형질 전환하고자 하는 DNA를 10mM Tris, pH 7.5, 1mM EDTA 70μl 중에 현탁시키고, DNA를 용해시키기 위해 박테리아 세포 현탁액 200μl에 첨가하였다. 이 혼합물을 얼음액 상에서 30분 동안 인큐베이션한 후, 이어서 여기에 L-브로쓰 1ml를 첨가하였다. 혼합물을 42℃에서 2분간, 37℃에서 40분간 인큐베이션시켰다.
배양 후, 세포를 앰피실린 50㎍/ml(한천 함유하는) 한천 플레이트 상에 플레이트당 50-300μl 세포 현탁액의 용적으로 분산시켰다. 한천 플레이트를 37℃에서 철야 인큐베이션시켰다. 이 인큐베이션 후, 단일의 분리된 세균 콜로니가 형성되었다.
4) 플라스미드 DNA 분리
플라스미드 함유 세포 1리터를 L-브로쓰 중에서 OD600=0.5까지 생장시키고, 200㎍/ml 클로람페니콜로 20시간 동안 증폭시켰다. 이어서, 배양물을 4℃, JA-10로타 내에서 30분간 4,000rpm으로 원심분리시켰다. 펠릿을 18ml의 차가운 25% 수크로오스, 50mM Tris, pH 8.0, 용액 중에 재현탁시키고, 250ml용 엘렌메이어 플라스크로 옮겨서 얼음상에서 방치하였다. 여기에, 250mM Tris, pH 8.0중의 5㎎/ml 라이소자임 6ml를 첨가한 후, 혼합물을 10-15분간 방치하였다. 여기에 250mM EDTA, pH 8.06ml를 첨가하고, 가볍게 혼합시킨 후, 얼음상에서 15분간 인큐베이션시켰다. 여기에 세정제(0.1% Triton X-100 ; 60mM EDTA pH 8.0 ; 50mM Tris, pH 8.0) 30ml를 첨가하고, 혼합물을 얼음상에서 30분간 인큐베이션시켰다. 인큐베이션 후, 혼합물을 4℃, SW28 회전기 중에서 90분간 25,000rpm으로 원심분리시켰다.
프로나제를 상징액에 250㎍/ml까지 첨가하고, 37℃에서 30분간 인큐베이션시켰다. 용액을 10mM Tris, pH 8.0, 1mM EDTA를 사용하여 평형을 맞춘 1/2용적의 페놀을 사용하여 1회 추출시켰다. 수용액층을 제거하고, 이어서 아세트산 나트륨을 최종 농도 30mM이 되도록 첨가한 후, 3용적의 차가운 100% 에탄올을 첨가하여 완전히 혼합하였다. 혼합물을 -20℃에서 철야 저장하였다.
혼합물을 해동시켜서 원심분리하였다. 펠릿을 10mM Tris, 10mM EDTA, pH 8.0, 6ml 중에 재현탁시키고, 여기에 CsCl 9.4g 및 6㎎/ml 에타듐 브로마이드 0.65ml을 첨가하여 멸균시킨 2차 증류수를 첨가하였다. 용적을 10ml로 만들었다. 10ml 부분표본을 베크만(Beckman) 가열-밀봉성 가배 튜브에 넣고, Ti 70.1 베크만 회전기 중에서 50,000rpm으로 48시간 동안 원심분리시켰다.
플라스미드 밴드를 UV로 가시화하여, 주사기 및 18게이지 바늘로 튜브의 측면을 뚫어 제거하였다. 동일한 용적의 이소부탄올로 3회 연속 추출함으로써 플라스미드 분획물로부터 에티듐 브로마이드를 제거하였다. 이어서 분획물을 (1) 10mM Tris, pH 7.4, 1mM EDTA, pH 7.5, 5mM NaCl로 이루어진 한개의 2리터에 대하여 4℃에서 2시간 이상 투석시키고, (2) 상기한 방법으로 평형시킨 1/3 용적의 페놀을 사용하여 1회 추출시켰다. 이어서, 여기에 아세트산나트륨을 최종 농도 300mM까지 첨가하고, 100% 에탄올 2용적을 첨가하였다. 이를 -20℃에서 철야 방치하거나 또는 -70℃에서 30분간 방치하여 침전물이 생성되었다.
3) 미니-플라스미드 제조
철야 세균 배양물 1ml를 에펜도르프 튜브에 넣고, 20분간 원심분리시켰다. 상징액을 제거하고, 50mM 글루코스, 25mM Tris(pH 8.0), 10mM EDTA(pH 8.0) 100μl를 첨가한 후, 와동시켜 혼합하고, 실온에서 5분간 인큐베이션시켰다. 여기에 0.2N NaOH, 1% SDS 200μl를 첨가하고, 와동시켜 혼합시킨 후, 얼음상에서 5분간 인큐베이션시켰다. 여기에 3M 아세트산나트륨(pH 4.8) 50μl를 첨가하고, 와동시켜 혼합한 후, 얼음상에서 5분간 인큐베이션시켰다. 이를 13,000rpm으로 5분동안 원심분리시킨 후, 상징액을 새로운 에펜도르프튜브로 경사 제거하였다. 여기에 100% 에탄올 3용적을 보충하고, 충분히 혼합한 후, -80℃에서 30분간 인큐베이션시키고, 13,000rpm으로 30분간 원심분리시켰다. 이어서, 에탄올을 제거하고, 펠릿을 70% 에탄올로 세척한 후, 동결 건조시키고, 20μl 증류수 중에 용해시켰다. 이 플라스미드 DNA 용액 5μl을 제한 분석에 직접 사용하였다.
6) 닉 트렌스레이션(Nick Translation)
닉 트랜스레이션은 본 명세서에 참고 문헌으로 기재한 릭비(Rigby)등(J. Mol. Biol., Vol. 113, pp. 237-251, 1977)의 방법에 따라 행하였다. DNA를 32p-표지시키는데 사용한 반응 혼합물은 50mM Tris, pH 7.8, 5mM MgCl2, 10mM 메르캅토에탄올, 0.1mM dATP, 0.1mM dGTP, 0.1mM dTTP, 50uCi32P-dCTP, 10단위의 DNA 폴리머라제 I 3μl의 2×10-5배 희석한 1㎎/ml DNase로 된 30μl의 전체 용적 중에 0.5㎍의 HBV 단편을 함유하였고, 이 혼합물을 15℃에서 90분 동안 배양하여 3×106내지 12×106전체 cpm, 즉 1×107내지 5×107cpm/㎍ DNA를 생성시켰다.
7) 서던 브랏 분석
숙주 세포내 본 발명의 벡터의 구조를 특성화하기 위해, 본 발명의 입자들을 생성하는 세포주로부터 염색체 DNA를 분리하고, 적절한 제한 효소로 절단해서,32P-표지시킨 DNA 프로브를 사용하여 본 명세서에 참고로 인용한 서던의 방법(J. Mol. Biol., 98권, 503-517페이지, 1975년)에 의해 분석하였다. 염색체 DNA(20㎍)를 제한 효소 BglⅡ로 절단시킨 후, 이 결과 생성된 단편들을 0.7% 아가로스 겔 전기영동하여 분리하였다. 이어서, DNA를 366㎚의 자외선에 10분 동안 노출시키고 0.5M NaOH 및 1M NaCl로 된 용액 중에서 45분 동안 배양시킴으로서 변성시켰다. 겔을 0.5M Tris, 1.5M NaCl, pH7.5로 된 용액 중에서 60분 동안 배양함으로서 중성화시켰다. DNA는 3M NaCl, 0.3M 시트르산나트륨(20X SSC)의 용액 중에서 20시간동안 니트로셀룰로오스 필터의 상부를 마른 종이 수건의 스테이크리로 덮은 겔을 통하여 빨아들임으로서 니트로셀룰로오스 필터로 옮겼다. 니트로셀룰로오스 필터를 80℃의 진공 오븐에서 보관시켰다. pHBV의 BglⅡ 단편(2.3kb)의 방사성 DNA 프로브를 닉 트랜스레이션에 의하여 제조하였다.
DNA 프로브로 혼성화시키기 위하여, 니트로셀룰로오스 필터를 10ml의 전혼성화 화합물(50% 포름아미드, 5X SSC, 50mM 인산나트륨, pH7.0, 5X 덴하르디트의 용액, 250㎍/ml의 변성시킨 연어 정자 DNA)을 함유한 플라스틱 백 중에 밀봉시켰다. 필터를 이 혼합물 중에서 45℃, 4시간 동안 배양시킨 후, 전혼성화 혼합물을 혼성화 화합물(50% 포름아미드, 5X SSC, 20mM 인산나트륨, pH7.0, 1X 덴하르디트의 용적, 100㎍/ml의 변성된 연어 정자 DNA, 5×104cpm/ml32P-프로브)로 대체시켰다. 필터를, 혼성화 혼합물 중에 45℃, 18시간 동안 배양시킨 후, 50℃의 0.1% SSC, 0.1% SDS 용액 중에서 각각 5분 동안 3회 세척시켰다. 필터를 60℃에서 10분간 건조시키고 두 증간 스트린 사이의 X-선 필름(XAR-5, KODAK사 제품)에 노출시키고 -80℃에 유지시켰다. 첫번째 X-선 필름을 3일간의 노출후 현상하고, 두번째 X-선 필름은 7일의 노출 후 현상하였다.
8) 형질감염시키기 위한 포유동물 세포 및 DNA 침전물의 제조
수용체 세포[C1 27, L- 또는 CHO- 세포(ATCC로부터 구입할 수 있음)]로 페트리 디쉬(디쉬 당 1-2×106세포, Ø 10㎝) 내의 정상 성장 배지(DMEM+5% 송아지 태아혈청, 글루코스 및 글루타민)에서 하루 종균 배양(Seed culture)시켰다. 다음날 DNA 침전물을 세포위에 첨가하기 4시간 전에 배지를 제거하고 세포들을 1X PBS로 2회 세척하였다. 이어서 FCS가 없는 8ml의 DMEM(HEPES로 보충하여 최종 농도 10mM 되게 함)을 첨가하였다. 4시간 후 하기한 대로 제조한 DNA 침전물을 세포에 첨가하고, 다시 4시간 후에 배지를 제거하고, 3ml의 글리세롤 혼합물(50mM의 2X HBS 완충액, 30ml 글리세롤, 120ml 증류수)을 첨가하였다. 글리세롤 혼합물을 37℃에서 3분간 배양시킨 후 즉시 제거하고 세포들을 1X PBS로 세척하였다. 세포들은 10% FCS를 함유한 8ml의 DMED으로 철야 배양시켰다.
다음날 세포들은 트립신-EDTA 용액(0.025% 트립신+1mM EDTA)을 처리하여 디쉬로부터 회수한 후, 트립신-EDTA 용액을 제거하기 위해, 세포를 1X PBS로 세척하고, 10% FCS를 함유한 DMEM 중에 현탁시켜 24(costar)-웰-플레이트(한 디쉬의 세포를 24-웰-플레이트)에 분포시켰다. 세포가 잘 자랐을 때, 선별 배지(예컨대, 0.5-1㎎/ml 농도의 네오마이신을 함유하는 배지)를 첨가한다. 배지는 매주마다 교체하였다. 처음으로 성장하는 세포 콜로니는 2주후에 나타났다.
10㎍의 플라스미드 DNA 및 20㎍의 운반 DNA(연어 정자 DNA, 소흉선 DNA)에, TE 완충액(10mM Tris-HCl, 1mM EDTA, pH7.05)을 최종 부피가 440μl 되도록 첨가하고 60μl의 2M CaCl2와 함께 혼합하였다. 이어서 동량의 2X TBS(HEPES 50mM, NaCl 280mM Na2HPO41.5mM, pH7.05)를 첨가하여 잘 혼합하였다. 침전 용액을 37℃에서 30분간 배양하여 곧바로 형질감염시킬 세포에 첨가하였다.
실시예 8
단백질을 분비하는 형질감염된 세포의 배양
선별한 세포는 상기 9번에 기재한 대로 정상 배지 중에 더욱 배양시켰다.
실시예 9
정제된 입자들의 보조제
멸균 염수중에 현탁시킨 목적하는 농도의 항원 입자에 1 : 10,000용적의 티메로졸, 1/10용적의 필터로 멸균시킨 0.2M AlK(SO4)2: 12H2O를 첨가하였다. pH를 멸균 1N NaOH를 첨가하여 5.0으로 조절하고, 현탁액을 실온에서 3시간 동안 교반시켰다. 명반으로 석출시킨 항원을 2,000rpm으로 10분간 원심분리하여 회수한 후, 1 : 10,000 티메로졸을 함유하는 멸균 정상 염수중에 재현탁시키고 멸균 조건하에서 부분 표본을 분할하였다.
실시예 10
표 3-10-X은 하기한 대로 본 발명의 면역원성 입자들은 ELISA(효소 면역 분석법) 분석한 결과를 나타낸 것이다.
표 3은 pre-S2의 전체 서열이 결실되고 pre-S2ATG의 상부 서열이 결실된 pre-S1영역 및 S ATG와 Xba I 영역에 걸친 S ATG의 하부가 결실된 S영역을 함유하는 본 발명의 HBV 서열을 가진 구조물(즉, 도 I-I의 구조물)에서 생산된 정제한 HBS 항원 입자를 항-pre-S1단일 클론 항체 MA 18/7로 효소 면역 분석한 통계를 나타낸다. 분획 9-15(도 ⅩI)은 CsCl 침전 후에 모았다.
표 4는 pre-S2의 전체 서열이 결실되고 pre-S2ATG의 상부 서열이 결실된 pre-S1영역 및 S ATG와 Xba I 영역을 통한 S ATG의 하부가 결실된 S 영역을 함유하는 본 발명의 HBV 서열을 가진 구조물(즉, 도 I-1의 구조물)에서 생산된 정제한 HBS 항원 입자를 항-pre-S1단일 클론 항체 MQ 19/10으로 효소 면역 분석한 통계를 나타낸다. 분획 9-15(도 ⅩI)은 CsCl 침전 후에 모았다.
표 5는 pre-S1의 전체 서열이 없고, S ATG의 상부 서열 및 Xba I 영역을 통한 S ATG의 하부 서열이 결실된 pre-S2영역 및 S ATG가 결실된 S 영역을 함유하는 HBV 서열을 가진 구조물(즉, 도 Ⅱ-1의 구조물)에서 생산된 정제한 HBS항원 입자를 항-pre-S1단일 클론 항체 MA 18/7으로 효소 면역 분석한 통계를 나타낸다. 분획 9-15(도 ⅩI)은 CsCl 침전 후에 모았다.
표 6은 pre-S1의 전체 서열이 없고, S ATG의 상부 서열 및 Xba I 영역을 통한 S ATG의 하부 서열이 결실된 pre-S2부위 및 S ATG가 결실된 S 영역을 함유하는 HBV 서열을 가진 구조물(즉, 도 Ⅱ-1의 구조물)에서 생산된 정제한 HBS 항원 입자를 항-prs-S1단일 클론 항체 MQ 19/10으로 효소 면역 분석한 통계를 나타낸다. 분획 9-15(도 XI)은 CsCl 침전 후에 모았다.
[표 3]
Figure kpo00008
[표 4]
Figure kpo00009
[표 5]
Figure kpo00010
[표 6]
Figure kpo00011
표 7은 pre-S2의 전체 서열이 결실되고, pre-S2ATG의 상부 서열이 결실된 pre-S1영역 및 S ATG가 결실된 S 영역을 함유하는 본 발명의 HBV 서열을 가진 구조물(즉, 도 VI-2의 구조물)에서 생성된 정제한 HBS 항원 입자를 항-pre-S1단일 클론 항체 MA 18/7로 효소 면역 분석한 통계를 나타낸다. 분획 9-15(도 XI)은 CsCl 침전 후에 모았다.
표 8은 pre-S2ATG의 상부 서열 및 S ATG가 결실된 pre-S1영역을 함유하는 본 발명의 HBV 서열을 가진 구조물에서 생산된 정제한 HBS 항원 입자를 항-pre-S2단일 클론 항체 MQ 19/10로 효소 면역 분석한 통계를 나타낸다. 분획 9-15(도 XI)은 CsCl 침전 후에 모았다.
표 9는 pre-S2의 전체 서열이 없고 S ATG의 상부 서열이 결실된 pre-S2영역 및 S ATG가 결실된 S 영역을 함유하는 HBV 서열을 가진 구조물(즉, 도 Ⅶ-2의 구조물)에서 생산된 정제한 HBS 항원 입자를 항-pre-S1단일 클론 항체 MA 18/7로 효소 면역 분석한 통계를 나타낸다. 분획 9-15(도 XⅡ)은 CsCl 침전 후에 모았다.
표 10은 S ATG의 상부 서열이 결실되고, S ATG가 결실된 pre-S2영역을 함유하는 HBV 서열을 가진 구조물(즉, 도 Ⅶ-4의 구조물)에서 생산된 정제한 HBS 항원 입자를 항-pre-S2단일 클론 항체 MQ 19/10로 효소 면역 분석한 통계를 나타낸다. 분획 9-15(도 XⅡ)은 CsCl 침전 후에 모았다.
[표 7]
Figure kpo00012
[표 8]
Figure kpo00013
[표 9]
Figure kpo00014
[표 10]
Figure kpo00015
표 11은 전체의 pre-S2-pre-S2-S 영역을 함유한 구조물에서 생성된 정제한 HBs 항원을 자극제(즉, PMA)로 자극시키고, S(도 XⅢ)로 부가적으로 동시에 형질전환시킨 후 라우스 육종 바이러스 LTR 부위의 조절하에서 효소 면역 분석한 통계를 나타낸다.
[표 11]
Figure kpo00016
표 12는 CsCl 구배에서 정제시킨 후, C1 27에 동시 형질감염시킨 표 3(도 I -1) 및 표 5(도 Ⅱ-1)에 의한 유전자 구조물로부터 유도한 입자들의 특성화를 나타낸다.
표 12는 데텐코퍼(Dettenkofer) 연구소에서 행한 S 서열을 갖는 도 I-1에 의한 혈청형의 입자들을 나타낸다.
[표 12]
Figure kpo00017
이상으로부터, 당업계의 숙련된 자들에게는 상기한 조성물 및 방법에 있어서 여러가지의 변형이 본 발명의 의도 및 영역을 벗어남이 없이 실시 가능하다는 것은 명백한 것이다. 따라서, 본 발명은 본 발명의 의도 또는 본질적인 특성을 벗어남이 없이 다른 특수한 형태로 실시해도 좋다. 본 발명의 실시태양은, 그러므로, 모든 관점에 있어서 제한적이기보다는 설명하려는 것이며, 첨부한 특허 청구 범위로 기재한 발명의 영역을 상기한 명세서의 기재의 것이며, 따라서 청구 범위와 같은 의미 및 범주내에 있는 모든 변형 청구 범위에 포함되어야 한다.

Claims (33)

  1. a) 제1 DNA서열이, pre-S1ATG 개시 코돈의 측면에 위치(flanking)하는 뉴클레오티드 서열이 천연 서열로부터 변경된, HBV pre-S1영역의 적어도 일부의 뉴클레오티드 서열로 이루어지고, 상기 제1 DNA 서열은 일부 또는 전체가 HBV pre-S1에피토프의 항원성을 나타내는 아미노산 서열을 코딩하고, b) 제2 DNA 서열이, 아미노산 서열이 분비시 pre-S1에피토프에 대한 면역 반응을 일으키는 입자의 직접적인 형성을 유도하는 HBV S 항원 또는 HBV 중심 항원의 전체 또는 일부에 대응하는 아미노산 서열을 코딩하는 것을 특징으로 하는 프레임 내에 연결된 제1 및 제2 DNA서열에 작동가능하게 연결된 발현 조절 서열로 이루어지고, 상기 DNA 서열 각각은 재조합 DNA 분자에 의해 발현된 단일 펩티드의 별개의 도메인을 코딩하는 재조합 DNA 분자.
  2. 제1항에 있어서, 상기 제2 DNA서열이 HBV S 항원의 전체 또는 일부에 대응하는 아미노산 서열을 코딩하는 것인 DNA 분자.
  3. 제1항에 있어서, 상기 제2 DNA서열이 HBV S영역의 전부 또는 일부에 대응하는 아미노산 서열을 코딩하고, 상기 제1 DNA서열이, pre-S1영역의 N-말단에서 아미노산이 S-영역의 N-말단으로부터의 아미노산으로 대체되도록, N-말단이 결핍된 pre-S1여역을 코딩하는 것인 DNA 분자.
  4. 제1항에 있어서, 상기 DNA 분자가 도 I-1, 도 I-2, 도 Ⅳ-1, 도 Ⅳ-2, 도 Ⅳ-3, 도 Ⅵ-1, 도 Ⅵ-2 또는 도 Ⅵ-3에 나타낸 바와 같이 배열된 HBV 서열을 갖는 것인 DNA 분자.
  5. a) 제1 DNA서열이, pre-S1ATG 개시 코돈의 측면에 위치(flanking)하는 뉴클레오티드 서열이 천연서열로부터 변경된, HBV pre-S1영역의 적어도 일부의 뉴클레오티드 서열로 이루어지고, 상기 제1 DNA 서열은 일부 또는 전체가 HBV pre-S1에피토프의 항원성을 나타내는 아미노산 서열을 코딩하고, b) 제2 DNA 서열이, 아미노산 서열이 분비시 pre-S1에피토프에 대한 면역 반응을 일으키는 입자의 직접적인 형성을 유도하는, HBV S 항원 또는 HBV 중심 항원의 전체 또는 일부에 대응하는 아미노산 서열을 코딩하는 것을 특징으로 하는 프레임 내에 연결된 제1 및 제2 DNA 서열에 작동가능하게 연결된 발현 조절 서열로 이루어지고, 상기 DNA 서열 각각은 재조합 DNA 분자에 의해 발현된 단일 펩티드의 별개의 도메인을 코딩하는 재조합 DNA 분자로 형질감염된 숙주 세포.
  6. 제5항에 있어서, HBV S 항원의 아미노산 서열 전체 또는 일부를 코딩하는 제2재조합 DNA 분자로 동시에 형질감염된 숙주 세포.
  7. 제6항에 있어서, 상기 제2 재조합 DNA 분자가 HBV S 항원의 전체 아미노산 서열을 코딩하는 것인 숙주 세포.
  8. 제5항 내지 제7항 중 한 항에 있어서, VERO 세포, 3T3 세포, C127 세포, L 세포, 디하이드로폴레이트 리덕타제에 대해 양성인 CHO 세포 및 디하이드로폴레이트 리덕타제에 대해 음성인 CHO 세포로 이루어지는 군 중에서 선택된 것인 숙주 세포.
  9. 제2항에 있어서, 상기 제1 DNA서열이 상기 제2 DNA서열보다 상기 발현 조절 서열에 더 근접하게 위치한 것인 DNA 분자.
  10. 제9항에 있어서, 상기 제1 DNA서열이 pre-S1영역 ATG 개시 코돈을 함유하는 5' 말단 영역이 S영역 ATG 개시 코돈을 함유하는 HBV S 영역의 5' 말단 영역으로 대체된 것인 HBV pre-S1영역의 적어도 일부의 뉴클레오티드 서열로 이루어지고, 상기 제2 DNA서열이 ATG 개시 코돈이 없는 HBV S 영역의 뉴클레오티드 서열로 이루어진 것인 DNA 분자.
  11. 제10항에 있어서, HBV S 영역의 상기 5' 말단 영역의 뉴클레오티드 서열이 ATGGAGAAC인 DNA분자.
  12. 제10항에 있어서, HBV S 영역의 상기 5' 말단 영역의 뉴클레오티드 서열이 AACATGGAGAAC인 DNA 분자.
  13. 제1항, 2항 및 9항 내지 12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 DNA서열이 pre-S1영역의 3' 말단부가 결실된 HBV pre-Sl영역의 뉴클레오티드 서열로 이루어진 것인 DNA 분자.
  14. 제1항, 2항 및 9항 내지 12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 DNA서열이 5'-말단부 및 3'-말단부 영역이 결실된 HBV pre-S1영역의 뉴클레오티드 서열로 이루어지고, 상기 제2 DNA서열이 S 개시 코돈 ATG가 없는 HBV S 영역의 뉴클레오티드 서열로 이루어진 것인 DNA 전자.
  15. 제1항, 2항 및 9항 내지 12항중 어느 한 항에 있어서, ayw 혈청형의 HBV pre-S1에피토프를 코딩하는 것인 DNA 분자.
  16. 제1항, 2항 및 9항 내지 12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 DNA서열이 표 1 로부터의 뉴클레오티드 서열을 하나 이상 포함하는 것인 DNA 분자.
  17. 제16항에 있어서, 상기 제1 DNA서열이 표 1의 올리고뉴클레오티드 번호 55의 서열로 이루어진 것인 DNA 분자.
  18. 제16항에 있어서, 상기 제1 DNA 서열이 표 1의 올리고뉴클레오티드 번호 23의 서열로 이루어진 것인 DNA 분자.
  19. 제1항, 제2항 및 9항 내지 12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제2 DNA서열이 도 Ⅸ에 나타낸 HBV S 유전자의 Xba I -BglII 단편의 S-코딩 서열로 이루어진 것인 DNA 분자.
  20. N-말단 서열이 천연 서열로부터 변경된 것인 제1항, 2항 및 9항 내지 12항 중 어느 한 항에 청구된 바의 재조합 DNA 분자에 의해 코딩되는 펩티드.
  21. 펩티드 단량체가 입자 내에서 실질적으로 전체 단백질의 1% 이상을 구성하는 것인, 제20항에서 청구된 바의 pre-S1에피토프로 이루어진 다수의 펩티드 단량체로 이루어진 면역원성 입자.
  22. 제21항에 있어서, 상기 펩티드 단량체가 입자 내에서 전체 단백질의 5% 이상을 구성하는 것인 면역원성 입자.
  23. 제21항에 있어서, 직경이 10nm 이상인 면역원성 입자.
  24. 제21항에 있어서, HBV S 항원의 아미노산 서열의 전체 또는 실질적인 부분으로 이루어지는 제2 펩티드의 다수의 단량체로 더 이루어지고, 상기 제2 펩티드 단량체가 pre-S1에피토프로 이루어진 펩티드 단량체에 결합된 것인 면역원성 입자.
  25. 제21항에 있어서, pre-S2에 에피토프를 함유하는 다수의 펩티드의 단량체를 더 포함하는 면역원성 입자.
  26. 적합한 담체 중의 제21항에 따른 면역원성 입자로 이루어지며, 상기 입자가 개체에 투여시 면역 반응을 일으키기에 충분한 농도로 존재하는 약제.
  27. 제21항에 있어서, HBV에 대한 백신접종의 방법에 사용하기 위한 입자.
  28. DNA의 수용을 위한 적격 세포로 된 포유류 숙주 세포를 제공하고, 상기 숙주 세포를 제1항, 2항 및 9항 내지 12항 중 어느 한 항에 따른 재조합 DNA 분자로 이루어진 제1 DNA제조물에 노출시키고, 적합한 조건하에서 상기 숙주 세포를 상기 제1 DNA제조물로부터의 DNA를 수용하도록 하고, 상기 재조합 DNA분자를 수용한 숙주 세포를 선별하는 것으로 이루어진 형질감염된 숙주 세포의 제조 방법.
  29. 제28항에 있어서, 추가로 상기 숙주 세포를 HBV S 펩티드의 전부 또는 실질적인 부분의 아미노산 서열을 함유하는 펩티드를 코딩하는 DNA 분자로 이루어진 제2 DNA제조물에 노출시키고, 적합한 조건하에서 상기 숙주 세포를 상기 제2 DNA제조물로부터의 DNA를 수용하도록 하는 단계를 포함하는 방법.
  30. 숙주 세포에 의한 단백질의 발현 및 분지를 허용하는 조건하에서 제1항, 2항 및 9항 내지 12항 중 어느 한 항에 따른 재조합 DNA분자로 형질감염된 포유류 숙주 세포를 배양하고, 상기 재조합 DNA분자로부터의 발현의 결과 생성된 펩티드를 회수하는 것으로 이루어진 펩티드의 제조 방법.
  31. 제30항에 있어서, 상기 재조합 DNA분자로부터 제조된 펩티드가 상기 재조합 DNA분자의 전체 코딩영역 미만에 대응하는 아미노산 서열을 함유하는 것인 방법.
  32. 숙주 세포에 의한 펩티드 단량체의 발현 및 분비를 허용하는 조건하에서 제1항, 2항 및 9항 내지 12항 중 어느 한 항에 따른 재조합 DNA분자로 형질감염된 포유류 숙주 세포를 배양하고, 적합한 조건하에서 펩티드 단량체의 응집을 허용하는 것으로 이루어진 면역원 입자의 제조 방법.
  33. 제32항에 있어서, 상기 숙주 세포가 또한 HBV S 항원의 전체 또는 실질적인 부분의 아미노산을 포함하는 펩티드를 코딩하는 DNA분자도 형질감염된 것인 방법.
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