KR960004264B1 - B형 간염 표면항원, 이의 생성 진핵 세포 및 백신의 제조방법, 검정방법 및 진단용 키트 - Google Patents

B형 간염 표면항원, 이의 생성 진핵 세포 및 백신의 제조방법, 검정방법 및 진단용 키트 Download PDF

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1996년03월30일
엘. 로바우 맠
에이. 토마스 한스
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엔도트로닉스, 인크.
윌리엄 디. 스터블필드
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Abstract

내용 없음.

Description

B형 간염 표면항원, 이의 생성 진핵 세포 및 백신의 제조방법, 검정방법 및 진단용 키트
제1도는 플라스미드 pBPV342-12의 부분적인 제한 효소 엔도 뉴클레아제지도를 나타내고 있고, 또한 플라스미드 pBPV342-12상에 플라스미드 pML2-유도된 DNA, 소 유두종 바이러스 DNA, MMT-프로모터 및 sv-PAS-t 전자종결영역의 위치를 보여준다. 또한, 제1도는 플라스미드 pBPV342-12를 제한효소 엔도뉴클레아제 Bam으로 처리하여 절단된 형태를 보여주고 있다.
제2도는 완전한 B형 간염 바이러스 게놈을 함유하고 있는 플라스미드 pA01의 부분적인 제한 효소 엔도 뉴클레아제지도를 나타내고 있다. 또한 제2도는 pA01를 제한효소 엔도뉴클레아제 EcoRI으로 처리하여 잘라진 형태, 콘카타머를 만들기 위해 EcoRI으로 잘라서 직선화된 HBV산물을 T4-DNA리가제로 접합시키고 형성된 콘카타머 (concatamer), 콘카타머 산물을 제한효소 엔도뉴클레아제 Bg1Ⅱ 로 절단시켜 형성된 것인, PreS1-PreS4-S 단백질 암호화 영역의 완전한 DNA 서열을 함유한 특정 DNA 단편을 보여준다.
제3도는 플라스미드 pDml의 부분적인 제한 효소 엔도뉴클레아제지도를 나타내고 있고, 플라스미드 pMMT-neo을 포함하고 있는 BamHI DNA 단편과 PreS1-PreS4-S 단백질을 암호화한 B형 간염 바이러스의 Bg1Ⅱ 게놈 단편을 접합시켜 플라스미드 pDml의 생성된 것을 보여준다.
제4A도와 4B도는 플라스미드 pDM2의 부분적인 제한효소 엔도뉴클레아지도를 나타내고 있고, 플라스미드 pDml으로부터의 BamHI 제한효소 엔도뉴클레아제 단편과 플라스미드 pDml로부터의 BamHI-Bg1Ⅱ로 제한효소 엔도뉴클레아제 단편을 연결시켜 플라스미드 pDM2가 생성된 것을 보여준다.
제 5도는 플라스미드 pDM3의 부분적인 제한효소 엔도뉴클레아제지도를 나타내고 pDml과 pMMT-neo로부터 플라스미드 pDM3의 작제를 보여주고 있다.
제6도는 BioRad(A5m) 컬럼으로부터의 본 발명 입자들이 용출패턴을 보여준 그래프이다.
제 7도는 BioRad(A5m) 칼럼에서 얻은 첫번째 피크 (Peak)로 부터 약 30개의 분획에서 얻은 본 발명의 입자들을 전형적인 등밀도 세슘클로라이드 (isopycnic CsC1) 원심 분리한 결과의 그래프이다.
제8A,8B 및 8C도는 다른 비율로 희석된 본 발명의 정제된 입자들에 의해 마우스에서 유도된 혈청양성전환율을 보여주는 그래프이다.
제 9A도와 9B도는 플라스미드 pENDO-1의 부분적인 제한 효소 엔도뉴클레아제지도를 나타내고 있다. 이 플라스미드의 여러단계에 걸친 작제방법을 보여주고 있다.
제10도는 플라스미드 pENDO-2의 부분적인 제한효소 엔도뉴클레아제지도를 나타내고 있고, 플라스미드 pENDO-1과 플라스미드 pDM2을 제한효소 엔도뉴클레아제로 처리하여 언든 DNA단편을 접합시켜 플라스미드 pENDO-2를 작제하는 것을 보여주고 있다.
제11도는 플라스미드 pENDO-0의 부분적인 제한효소 엔도뉴클레아제지도와 이 플라스미드의 작제 방법을 보여주고 있다.
본 발명은 PreS1-PreS4-S 단백질 암호영역을 가지나 B형 간염 코어 항원의 암호서열이 결실된 세균의 플라스미드로 진핵 세포주를 형질 감염시켜, PreS1-PreS4-S 단백질 암호영역으로부터의 발현된 폴리펩타이드를 함유한 입자를 제조하는 방법을 관한 것이다.
최근 유전공학의 발전은 많은 펩타이드를 및 단백질을 세균, 효모뿐 아니라 동물 세포내에서 발현시킴으로서 수율 증진을 가능케하였다. 많은 단백질과 펩타이드들이 세균으로부터 상당량 발현되기는 하지만 세균 세포 그 자체나 세균내에서의 발현으로부터 생산된 어떤 오염산물과 관련된 장애를 피하기 위하여 사람 치료에 사용할 수 있는 다량의 단백질이나 폴리페타이드들을 포유동물 세포내에서 발현시키는 것이 특히 적합하다.
특히 흥미로운 것 중에는 B형 간염 표면항원 (surface antigen)단백질을 포유동물 세포내에서 대량 발현 시키는 것이다. 포유동물 세포내에서의 이들 폴리펩타이드의 발현율을 경제적으로 생산할 만큼 높지는 못하다.
B형 간염 바이러스는 사람들 사이에 전염되며 심한 간손상, 초기 악성종양 및 죽음을 일으키는 만성병이고 쇠약증의 원인이 된다. 대개의 경우 B형 간염은 완전히 회복이 가능하다. 그러나 많은 아프리카나 아시아 국가들에서는 B형 간염 바이러스 감염은 풍토병이다. 이들 국가들의 국민중 상당수가 B형 간염 바이러스의 만성적인 보균자이며, 그로인해 질병을 더욱 전염시키는 위험성을 가지고 있다.
백신화는 B형 간염 바이러스에 대한 유일한 예방책이다. 최근 몇몇 회사들(예를 들면, 미국의 Merk, Sharp and Dohme, 및 프랑스의 Pasterur Institute)은 B형 간염 바이러스에 대한 혈장 유래 백신을 소개하였다. 백신은 항원으로서 대개 바이러스 입자의 외피상에 존재하는 B형 간염 바이러스 단백질을 함유한다. 이와 같은 항원은 대개 B형 간염 바이러스 표면항원 (HBsAg)으로서 언급되며 이 항원은 대개 B형 간염 바이러스 표면항원(HBsAg)으로서 언급되며 이 항원을 암호화한 바이러스 유전자는 HBsAg 유전자라 한다. 위에서 언급한 백신은 B형 간염 바이러스 환자의 형청으로부터 분리한 표면항원을 함유한다. 비록 표면 항원 자체는 병된성이 아니지만 인체내의 B형 간염 바이러스 입자에 대한 항체의 생성을 자극한다.
B형 간염 표면항원의 상업적으로 이용 가능한 유일한 근원은 B형 간염 바이러스 환자의 혈액뿐이다. 사람 혈청으로부터의 표면 항된의 분리 정제는 번거롭게 많은 시간이 소모되는 과정이기 때문에 비교적 비용이 많이 든다. 또한 사람의 혈청이 표면항원을 상업적으로 이용할 수 있는 유일한 근원인 한, 백신으로 이용 가능한 표면 항원의 양은 제한될 것이다.
특히 B형 간염 바이러스가 풍토병인 지역에서 대량의 백신화를 위해서는 B형 간염 바이러스의 표면 항원에 대한 값싸고 무한정인 공급원을 갖는 가장 중요한 일이다. 표면 항원을 사람 혈청으로부터 얻을 경우 병원성 인자의 오염 위험 가능성 때문에 표면 항원의 근원으로서 사람 혈청의 이용을 피하는 것이 바람직하지만 B형 간염 바이러스가 생육 및 증식 가능한 생물학적 체계는 사람이나 침팬치 뿐인 것으로 알려져 있다.
최근 분자 생물학의 발전을 B형 간염 바이러스의 완전한 게놈의 서열을 클로닝할 수 있도록 해 주었다.(Siddiqui, A. et. al, Proc. Natl. Aca. Sci, U.S.A Vol. 76, p4664, 1979; Sninsky, J.J. et al, Nature. Vol. 279, p346, 1979; 및 Charnay, P. et al, Nucl. Acids Res., Vol 7, p335, 1979). 또한 B형 간염 바이러스의 다른 바이러스 단백질의 암호영역이 동정되었다.(European Patent Application Publication Nos. 13828, 20251 and 38765; Galibert et al. Nature, Vol 281, p646-650, 1979; Pasek et al., Nature Vol. 282, p575-579, 1979; 및 Valenzuela et al., Nature, Vol. 280, p815-819, 1979). 이와같은 발전에 이어, B형 간염 바이러스의 표면 항원을 암호화한 바이러스 게놈중의 그 부분이 몇몇 숙주 체계에서 발현되는지에 대한 연구가 이루어져왔다. 많은 경우에서 세균은 특정 진핵세포 산물을 위한 값싼 생산 체계를 제공할 수 있는 것으로 밝혀졌다. 그러나, 진핵세포 산물의 세균내 합성시에는 많은 어려움이 있다. 예를 들면,
1) 세균에서의 코돈 이용과 진핵세포에서의 코돈 이용과는 차이가 있기 때문에 진핵세포의 구조유전자가 세균내에서 효율적으로 전사될 수 없고;
2) 진핵세포 유전자 산물은 숙주세균 세포에 독성을 띨 수 있으며;
3) 진핵세포 유전자 산물의 구조와 기능은 당화나 디설파이드 결합의 특별한 연결 등과 같은 해독후 과정에 의존하지만, 어느것도 세균 숙주에포에서 일어날 수 없으며;
4) 유전자 산물이 세균 숙주 세포로부터 분리되는 경우는 매우 드물고;
5) 진핵 세포의 프로모터는 대개 세균내에서 작용하지 못하여 세균의 프로모터에 의하여 대치됨으로써 결과적으로 진핵세포 유전자 산물에 변형을 야기할 수 있고, 즉, 생산물의 N-말단부위는 세균으로부터 유래되며 초기 아미노산으로서 진핵 세포에는 존재하지 않고 포유동물 면역체계에 대한 새로운 면역원성 결정소를 제공할 수 있는 N-포르밀 메티오닌을 포함하고;
6) 정제과정중 세균 세포벽 성분들이 유전자 산물과 동시에 정제되어 심각한 알레르기 반응의 원인이 되거나 유전자 산물을 수용하는 포유동물에 아나필락시 쇼크를 일으킨다.
세균에서 만들어진 B형 간염 표면항원에는 문제점들이 있다. 무엇보다도 세균에서의 생성속도가 매우 낮으며 또한, 산물이 세균 세포로부터 분비되지 않기 때문에 정제는 세균이 세포 용해물로부터 시작되어야 한다. 또다른 문제점은 특정한 해독후 과정(예를 들면, 면역 반응의 수준과 특이성에 영향을 주는 표면 항원의 당화)이 세균내에 존재하지 않는다는 점에서 발생한다. 이런 이유들 때문에 생산 숙주로 세균을 피하는 것이 좋다.
B형 간염 표면항원의 암호서열을 포함하는 적당한 재조합 DNA에 의해 형질 전환된 효모 세포는 그 표면 항원을 효모 배양물내에 상당량 합성, 축적한다. 그러나, 이 숙주 체계 역시 몇몇 심각한 결점이 있다. 즉,
1) 표면항원은 효모 세포에서 분비되지 않아서, 그 세포의 용해물로부터 분리되어야 하며,
2) 효모 세포에서 생성된 표면항원 단량체는, 포유동물 세포에서 분리된 표면 항원과는 달리, 공유결합을 통한 이량체를 형성하지 않는다.
표면하원을 생산하는 포유동물 세포주를 개발하려는 몇몇 시도가 있었다. 이들 세포주들은 클로낭된 B형 간염 바이러스 DNA에 의해 형질감염된 세포로부터 뿐만 아니라 사람의 간암 세포로부터 (Alexander, J.J. et al. Afr. Med. J., Vol. 50. P2124, 1976) 유도되었다. 또한, B형 간염 바이러스 게놈의 40%를 갖는 시미안 바이러스 40(SV40)- 기본 DNA재조합 벡터를 원숭이 신장세포에 도입시켰다(Laub, O.et al, J. of Virol, Vol. 48, p271, 1983). 또한, 동시형질감염 방법을 사용하여 표면 항원을 발현하는 세포주를 선별하였다(Standring, D.N. et al, J. of Viroll, Vol. 50, p563, 1984). 디하이드로플로트 리덕타제(Dihydrofolote reductase, DHFR) 유전자의 증폭은 항원을 많이 생산하는 포유동물 세포주 선별에 이용하였다(Michel et al, Proc. Natl. Aca. Sci. Vol. 81, p7708, 1984). 또한, 선별용 마커로써 형질 전환된 표현 형질을 이용하는 진핵 세포의 바리러스 벡터가(Hsiung, N. et al, Molec, and Applied Genetics, Vol. 2, p497, 1984) 포유동물 세포내로 표면 항원유전자를 옮기기 위하여 선택하였다. 이들 경우에 있어서, 종양원성 DNA 서열을 DNA 작제물 도는 종양원성 바이러스로부터 DNA 서열은 표면항원을 생산하는 세포주를 선별하는데 이용되었다. 종양유전자 서열을 선별마커로 이용하는 것은 이들 세포에 의해 만들어진 표면 항원을 백신화에 이용할 경우 새로운 안정성 문제를 낳는다.
B형 간염 바이러스 암호서열에 의해 합성된 폴리 펩타이드의 발현에 관한 많은 문헌이 있다.
1980년 8월 8일 공개된 유럽 특허원 공개번호 013,828-A1(EPA 013,828)에서는 HBA 게놈내에서 S 단백질 암호영역 바로 앞에 존재하는 163개의 아미노산의 암호화 뉴클레오타이드서열(PreS 암호영역)이 B형 간염 바이러스 표면 항원의 항원성을 나타내는 폴리펩타이드를 생성하는데 유용한 재조합 DNA 분자의 제조에 사용된 단편내에 함유될 수 있다고 설명하고 있다. 그리고 HBsAg의 전구 서열과 구조유전자를 둘다 포함하는 유전자 단편은 클로닝벡터를 작제하기 전이나 그 과정중에 하나 또는 그 이상의 다양한 제한 효소 엔도뉴클레아제를 사용하여 절단할 수 있다고 기술되어 있다. 게다가, HBsAg를 암호화한 구조 유전자에 선행하는 163개 코돈 전구체는 형질전환을 위한 벡터를 이용하기전에 S단백질의 암호서열을 포함하는 크로닝 비히클로부터 절단되어야 하는 것으로 기술하고 있다.
1983년 2월 16일 공개된 유럽 특허된 공개번호 072,318-82(EPA 072,318)에서는 효모 레플리콘, 효모 프로모터 및 S 단백질의 암호화 DNA 단편을 포함하고 HBsAg의 암호화 구조유전자에 선행되는 163개 코돈 전구체를 특정적으로 제거한 벡터로 형질 전환된 효모세포를 성장시켜 HBsAg를 생산하는 방법이 기술되어 있다. HBsAg항원을 함유하는 백신 및 HBsAg에 면역성을 가지는 동물의 혈청으로부터 항체를 정제하여 HBsAg 항체를 얻는 방법에 대해서도 논하고 있다. 그리고 HBsAg항체와 면역 복합체를 형성할 수 있는 14-18nm의 항원입자에 대해서도 논하고 있다.
Feitelson 등의 문헌[Virology, Vol. 130, p75-90, 1983]에서는 24,000, 28,000, 32,000, 43,000 및 50,000달톤 분자량을 갖는 많은 표면항원-결합된 폴리펩티드들의 PreS의 암호서열내에 부분적으로 코딩될 수 있음을 찾아볼 수 있다. Laub 등의 문헌(J.Virol, Vol. 48, NO.1, p271-280, 1983)에서는 구조 유전자 바로앞에 존재하는 163개 코돈 전구체 서열을 포함한 HBsAg의 암호화 구조 유전자를 가지는 시미안 바이러스 40초기 치환 벡터의 제조와 그러한 벡터에 의해 형질 전환된 SV-40 형질전환된 CV-1 세포 (COS 세포)에 의한 그러한 암호서열의 발현에 관하여 논하고 있다. 또한 Laub 등은 HBsAg의 암호화 구조유전자 바로앞에 위치한 163개 코돈 전구 서열을 가지는 벡터에 의해 형질전환된 COS 세포와 비교할 때 S 단백질의 암호서열만을 지닌 벡터에 의해 형질 전환된 COS 세포에 의하여 더많은 HBsAg가 발현됨을 보고 한다.
Takeda Chemical Inc.의 1983년 11월 12일 공개된 일본 특허된 J5-8194-897-A(Takeda I)에서는 완전한 Pres-S 단백질의 폴리펩타이드를 암호화하는 HBV DNA(adw 아형) 뿐만 아니라 이 DNA를 함유한 벡터 및 이로 형질전환된 숙주가 기술되어 있다. Takeda Chemical Inc.의 1984년 5월 10일 공개된 일본 특허된 J5-9080-615-A(Takeda Ⅲ)에서는 완전한 Pres-S 단백질 폴리펩타이드의 암호화 HBV DNA(adw 아형)이 DNA에 의해 생성된 폴리펩타이드 및 백신을 위한 그의 용도가 기술되어 있다. Takeda Chemical Inc.의 1984년 4월 27일 공개된 일본 특허된 J5-9074-985-A(Takeda Ⅲ)는 완전한 awd형 Pres-S 단백질을 풀암호서열, S 단백질 암호서열 또는 B형 간염 바이러스 코어 항원 (HBcAg) 암호서열중 하나 이상을 함유하는 DNA 단편, 이러한 DNA 가지는 벡터 및 그 DNA에 의해 형질 전환된 숙주 세포에 대해 논하고 있다. Takeda Ⅲ에서는 Pre-S 단백질 암호서열에 암호화된 43,000 달톤의 폴 Pre-S 단백질 암호서열을 이.콜라이내에 클로닝하고 그 서열에 의해 생산된 폴리펩타이드를 동정하는 것에 대해서 Takeda Ⅲ에서 밝히고 있다.
Gerlich는 1983년 10월 18일에 Bologna 소재의 European Association of Clinical Microbiology에 제출한 논문에서 다음의 사실들을 발표하였다. 클로닝된 HBV-DNA의 DNA 서열로부터 HBV의 4가지의 가능한 유전자를 추론하였고, HBV의 표면 단백질에 대한 유전자 (S-유전자)는 적어도 세개의 폴리펩타이드로 해독되는 하나의 비절단된 DNA 서열로 이루어져 있고, 주 단백질(P24)의 서열 및 이의 당화형태(GP27) S-유전자의 3번째 보존된 해독 개시 시그날로 시작되며, 부 표면 단백질인 GP33 또는 GP36은 2번째 개시시그날로서 시작되고 단지 HBV의 P41 폴리펩타이드만이 S-유전자의 전체 암호서열을 이용하고, P41은 HBV의 주 항원 결정소를 가지고 있으며, 그리고 이것은 완전한 바이러스 입자에만 존재하나, 현대 통용되는 B형 간염 백신을 유도하는 과잉의 표면항원 20nm 입자에는 존재하지 않는다. Gerlich의 보고서에는 특별하게 P41의 PreS1영역을 다루지 않았으며 PreS1영역이 HBV 백신에서 유용하게 쓰일 항원 결정소를 지니고 있다고 언급하지 않았다.
Stibbe 등(Develop. Biol. Standard, Vol. 54, p33-43, 1983)은 1982년 그리이스 아테네에서 개최된 제 2회 WHO/IABS 심포지움의 바이러스에 의한 간염:감염 바이러스에 의한 감염의 면역프로필락시스에서의 표준화라는 표제하에서 HBV로 감염된 사람의 혈청에서 분리된 HBsAg의 20nm 입자를 SDS- 겔 전기영동했을때 적어도 세가지의 부 단백질(GP33, GP36, P41)이 확인되었다고 보고하였다. 그리고 Stibbe등은 GP33고 GP36은 HBV 백신의 필수 구성 성분이 아닐 것이라고 결론지었다. 그러나 그들 역시 P41의 PreS1영역을 다룬 영역이나 그 영역이 HBV 백신에 있어 유용하게 쓰일 항원 결정소를 지닌다는 보고는 없었다.
Stibbe 등(J. Virol. Vol. 46, No.2, p626-628, 1983)은 HBsAg 암호영역으로부터 해독된 부 당단백질들(GP33, GP36)은 PreS2-S 단백질의 암호서열에 암호화되어 있다고 밝혔다. PreS2영역은 B형 간염 바이러스 게놈내에 PreS2암호영역의 일부분이며 S 단백질 바로 앞에 위치한 일차 55개 아미노산을 암호화 한다.
Neurath 등(Science. 224, p392-394, 1984)은 PreS2영역의 아미노 말단 26개 아미노산과 동일한 서열을 가진 폴리펩타이드는 톺은 효율의 면역원으로 작용한다고 면역원에 의해 유도된 항체들은 진단 시험에 이용될 수 있을 것이라 제안했다.
Heerman 등(J. Virol. Vol. 52, No.2, p396-402, 1984)은 S단백질 암호서열 및 PreS암호서열을 모두 포함하는 전체 389개 아미노산의 암호서열을 기술하고, 이 서열은 자연적으로 유도된 HBV 입자들과 바이러스 표면 항체 필라멘트에서 발견된 폴리펩타이드 P39를 암호화하고 있을 뿐만 아니라 당화 형태인 GP42, 다른 HBV 표면항원과 결합된 폴리펩타이드인 P24, GP27, GP33 및 GP36은 암호화한다고 기술하였다. Heerman 등은 또한 P39/P42 단백질의 독특한 부위 즉, 그의 PreS1영역은 HBV 입자로 면역화시킴으로서 유도된 모노클로날 항체와 결합했다고 밝히고 그런 PreS1영역은 아마도 고도의 면역원성일 것이라 제안하였다. PreS1영역은 PreS2영역바로 앞에 선행되는 PreS암호영역의 일부분 PreS2암호서열 바로 앞에 위치한 일련의 아미노산인 아미노산 1-108(또는 바이러스형에 따라 1-122)의 암호화 서열을 포함한다. 그리고, Heerman 등은 HBV에 대한 또다른 백신으로서 면역원성 및 예방성인 폴리 또는 올리고펩타이드에 대한 연구에 있어서 PreS영역의 서열은 흥미가 있을 것이라고 말하고 있다. Michel 등(Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. Vol. 81, p7708-7712, 1984)은 PreS2-S 단백질 암호서열을 가진 플라스미드에 의해 형질감염된 챠이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포내에서 사람 혈청 폴리-알부민 수용체를 지니고 있는 HBsAg의 합성에 대해 논하였다.
Cattaneo 등(Nature. Vol. 305, p335-338, 1985)은 HBV 게놈의 S 유전자는 PreS영역의 초기부(즉, S 유전자의 489개 뉴클레오타이드 또는 163개 코돈 상향서열)에서 단백질 합성이 시작되며 mRNA는 코어 유전자 내부위에서 프로쎄싱(processing) 및 폴리아데닐화(polyadenylation)된다.
Persing 등(Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. Vol. 82, p3440-3444, 1985)은 PreS2-S단백질의 암호서열로 형질 전환된 쥐의 L세포는 분자량 24,000, 27,000 및 35,000 달톤의 3가지 HBsAg와 관련된 폴리펩타이드를 생산하여 이들 모두는 중합화된 사람 혈청 알부민(HSA)에 결합하는 지금 22nm의 면역 반응성 HBsAg 복합입자로 조직화되는 반면, PreS2영역의 3' 말단 근처에 프레임-이동 돌연변이가 일어난 Pre-S 단백질 암호서열로 형질 전환된 쥐의 L 세포는 HSA와 결합하지 못하는 지금 22nm의 면역반응성 HBsAg 입자로 조직화된 24,000 및 27,000달톤의 폴리펩타이드만을 합성한다고 밝혔다.
Persing 등은 Pre-S 단백질 암호서열은 35,000 달톤의 폴리펩타이드를 암호화하고 있으며, PreS2암호화 부위는 HBsAg의 HSA-결합 활성을 가지고 있으나 HBsAg 입자의 응집이나 분비에는 필요치 않고, 또한 HBsAg의 주된 폴리펩타이드(24,000 달톤의 폴리펩타이드)가 주로 PreS2-S 단백질 암호서열에 의해 암호화된 좀더 큰 전구체(즉, 분자량 27,000 및 35,000 달톤의 폴리펩타이드)가 분해되어 유도되는 것은 아니라는 결론을 지었다.
Milich 등(Science, Vol. 228, p1195-1199, 1985)은 다음의 사실등을 밝히고 있다. Pre-S 단백질 암호서열을 함유하는 플라스미드로 형질감염시킨 챠이니스 햄스터 난소(CHO) 세포에 의해 분비되는 입자로서 PreS2및 HBsAg의 아미노산들로 이루어진 HBsAg 입자를 가지는 백신은 HBsAg를 함유하는 백신에 대한 비반응성을 피할 수 있다. 왜냐하면 HBsAg에 대한 면역원성 반응은 PreS2에 대한 면역원성 반응과는 독립적이기 때문이다. 그리고, PreS2-S 단백질의 암호서열로부터 합성된 33,000 달톤 폴리펩타이드의 아마노 말단의 24개 아미노 잔기는 PreS2영역상에서 지배적인 항체 결합부위를 나타낸다.
Neurath 등(Nature, Vol. 315, p154-156,1985)은 PreS2영역은 간세포를 독특하게 인식하는 도메인을 갖는 HBV 외피 단백질을 암호화한다고 밝혔다. 즉, Pre-S2단백질의 암호서열은 HBV 입자에 존재하는 단백질을 암호화하고 있으며, PreS2의 암호 유전자에 해당하는 합성 펩타이드는 높은 면역원성을 가진다고 밝혔다. 그래서 HBV 백신은 PreS2를 함유해야만 한다고 결론지었다.
Velenzuela는 Boston에서 1985년 5월 15일 열린 Bio-Expo-5회의에서 효모에서 완전한 PreS2단백질의 암호서열의 발현에 대한 발표를 하였으며 그러한 효모 세포는 전자 현미경과 침강 특성에 있어서 HBsAg만을 함유한 입자와 아주 유사한 HBsAg와 PreS2펩타이드 둘다를 함우한 입자를 합성하며, PreS2영역은 22nm HBsAg 입자를 형성하는 능력을 방해하지 않는다고 밝혔다. Valenzuela는 또한 HBV는 폴리알부민을 이의 수용체와 결합시키고 이것은 차례로 간세포내의 폴리알부민 수용체와 결합하여 이로인해 바이러스는 간세포 내부로 유입할 수 있다로 가정하였다. HBV의 폴리아부민 수용체는 PreS2영역에 암호화되어 있다. Valenzuela는 PreS2를 함유하는 백신은 정상체계를 통하여 HBV를 불활성시키는 것 외에 바이러스가 간세포로 들어가는 것을 방해할 수 있는 항체를 유도할 것으로 결론지었다(Valenzuela 등 Biotechnology, Vol. 3, p317-320, 1985).
Valenzuela등(Biotechnology, Vol. 3, p323-327, 1985)은 다가 백신을 제조하는 수단으로써 PreS2암호서열에 암호화된 HBsAg 폴리알부민 수용체의 이용을 밝혔다. Valenzuela는 완전한 HSV1gD-PreS2-S 단백질 암호서열을 효모에서 발현시킴으로써 하이 브리드 HBsAg-헤르페스심플렉스 1 바이러스 당단백질(HSV1gD) 입자를 제조하였다.
Neurath 등(1985년 9월 18일 공개된 유럽 특허원 공개번호 0,154,902-A2)은 B형 간염 바이러스 외피의 PreS 유전자 영역내 적어도 6개의 연속적인 아미노산 사슬이 있는 펩타이드가 함유된 B형 간염 백신을 밝혔다. 이 백신은 B형 간염 바이러스의 천연 외피 단백질에 해당하는 아미노산 서열과 생리적으로 허용되는 희석제가 없다. 펩타이드는 단독으로 사용되거나 담체에 연결될 수 있다. Neurath의 유럽 특허원은 1984년 3월 7일 출원된 마합중국 특허출된 587,090과 1985년 5월 2일 출원된 미합중국 특허출원 698,499를 우선권으로 주장하고 있다.
Kent등(Pept. Chem., Vol. 22, p167-170,1984)은 PreS2영역의 N-말단의 26개 아미노산을 가지는 화학합성 펩타이드는 아주 양호한 항원이며 아마 좋은 합성 백신이 될 것이라고 하였다.
Lo등 (Biochem. Biophys. Res. Comn., Vol 129, No. 3, p 797-803, 1985)은 전체 PreS 영역의 제한효소 엔도뉴클레아제지도의 특징을 포함하여 HBV의 상이한 아형(adw, adrm, ayw와 adyw)에 대한 전체 HBV DNA 길이의 제한효소 엔도뉴클레아제지도의 특징을 밝혔다. 또한, Lo 등은 pUC8 발현 벡터를 이용하여 이.콜라이에서 완전한 전체 HBV DNA를 클로닝하고 발현한 것에 대해 논하였고, 본인들은 진단시약 및 백신의 원료로써 원핵세포나 진핵세포에서 발현된 그러한 HBV 유전자 산물을 이용하려 한다고 언급하고 있다.
Wong 등(J. Virology, Vol. 55, No. 1, p 223-231, 1985)은 HBsAg와 PreS 영역 모두의 결정소를 포함하여 전체 PreS 개방 판독 프레임에 의해 암호화된 2개의 HBV 폴리펩타이드들 즉, 42와 466kd의 당화폴리펩타이드를 동정하였다. 또한 그들은 베타-갈락토시다아제와 크로람페니콜 아세틸트란스퍼라제 서열뿐만 아니라 PreS 영역(adw2아형)의 174개 아미노산중 N-말단의 27-133의 아미노산들에 해당하는 108개의 아미노산을 함유하는 3중 융합 단백질의 발현에 대해서도 언급하였다. 이 펩타이드는 PreS2영역의 15개 아미노산과 PreS1영역의 93개 아미노산을 포함한다. 그리고 Wong 등은(a) 3중 융합단백질에서 형성된 폴리클로날 항혈청은 부분적으로 정제된 바이러스 입자 제제중에서 42와 46kd 폴리펩타이드를 검출할 수 있으며, (b) 당화된 42와 46kd 폴리펩타이드는 앞에서 인용된 Heerman등의 39와 42kd의 비당화 폴리펩타이드에 해당한다고 밝혔다.
Offensperger등(Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. Vol. 82, p 7540-7544, 1985)은, 이.콜라이에서 PreS2펩타이드-베타-갈락토시다아제 융합단백질을 암호화한 클로닝된 DNA 서열이 발현하였음을 밝혔다.
많은 참고문헌들은 마우스 메탈로티오네인 유전자의 프로모터를 가진 플라스미드에 대해 언급하고 있다.
Hamer등(1982년 12월 23일 출된된 미국특허된 452,783)과 Pavlakis등(Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., Vol. 80.p397.1983)은 인체성장호르몬(hGH) 유전자 및 메탈로티오네인 유전자(MMT)의 프로모터를 가진 재조합된 소의 유두종 바이러스 플라스미드에 대해 언급하였다.
Hofschneider등(1984년 4월 11일 공개된 유럽 특허원 EP 0,105,141A2)은 S 단백질 암호서열과 소의 유두종 바이러스 I형 DNA나 Maloney 마우스 육종 바이러스 DNA를 가지는 재조합 플라스미드에 대해 논하고 있다. Hofschneider 등에 의해 언급된 플라스미드들은 바람직하게는 S 단백질 암호서열과 연관된 서열과 연결된 천연프로모터를 이용하지만, Hosfschneider의 문헌에서는(예시되지 않았지만) "[a] 천연 진핵세균 발현 시그날의 또다른 예는 마우스 세포로부터의 메탈로티오네인 시그날이다"라고 언급하고 있다.
Fogel등(유럽특허원 공개번호 EP 0,096,491A2)은 포유동물 숙주세포에서 메탈로티오네인 유전자의 하향 부위를 강력하게 발현시키기 위한 수단으로서, 프로모터 부위를 포함한 완전한 메탈로티오네인 유전자 서열을 가진 플라스미드의 사용을 밝히고 있다.
University Patent, Inc.(1983년 5월 26일 공개된 PCT 특허된 공개 번호 WO83/01783)이나 Palmiter등(Cell, Vol. 29, p701, 1982)은 구조유전자(바람직하게는, 헤르페스 심플렉스 바이러스의 티미딘 키나제 유전자의) 융합시킨 마우스 MT-1 유전자의 프로모터를 포함한 플라스미드와 이 플라스미드를 마우스의 배에 미세주사(microinjection)한 것에 대해 언급하며, 배로부터 성숙한 쥐의 분화세포에서 생성된 융합된 폴리펩타이드 산물에 대한 유전자 발현은 중금속 이온의 투여로 조절 가능하다고 진술하고 있다. 또한 Palmiter등은 랫트 성장 호르몬과 융합시킨 마우스의 MT-1 프로모터를 포함한 플라스미드, 마우스 배내로의 그 플라스미드의 미세 주사 그리고 금속 투여에 의한 융합 폴리펩타이드를 생성하는 유전자 발현의 조절에 대해 논하고 있다.
본 발명은 전체 PreS1-PreS2-S 단백질 암호영역에 의해 암호화된 적어도 하나의 단백질을 포함하는, 재조합 DNA 기술에 의해 제조된 입자에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 PreS1-PreS2-S 단백질 암호영역과 마우스 메탈로티오네인(MMT) 프로모터를 함유한 재조합 DNA 벡터에 관한 것이다. 이러한 벡터는 바람직하게는 전신종결 부위와 선별 마커를 추가로 함유한다.
본 발명은 PreS1-PreS2-S 단백질 암호영역과 MMT-프로모터를 함유한 재조합 DNA 벡터로 형질감염된 숙주 진핵세포에 관한 것이다. 그러한 벡터는 부가적으로 전사종결 부위 및 선별 마커를 함유함이 바람직하다. 숙주는 포유동물 세포가 바람직하다. 부가적으로, 본 발명은 본 발명의 재조합 DNA 벡터로 진핵세포를 형질감염시켜 형질감염된 숙주 세포를 제조하는 방법에 관한 것이다.
본 발명은 또한 완전한 PreS1-PreS2-S 단백질 암호영역으로부터 발현된 한 개 이상의 단백질을 함유한 입자를 제조하는 방법에 관한 것이다. 그 방법은 다음의 단계를 포함한다 :
a) 본 발명에 따른 형질감염된 숙주 진핵 세포를 이 숙주 세포가 상기 단백질을 발현할 수 있도록 하는 배양 배지조건하에서 배양시키고 ;
b) 상기 입자를 분리한다.
바람직하게는, 형질감염 숙주는 상기의 입자로 응집된 단백질을 배지내로 분비할 수 있다. 이같은 방법은 부가적으로 상기 단백질의 발현을 촉진하기 위해 상기 배양배지에 중금속 이온이나 스테로이드 호르몬을 첨가시킴이 바람직하다. 이 발명은 또한, 그러한 방법에 의해 제조된 입자에 관한 것이다.
본 발명은 또한 면역 방어적 양의 본 발명에 따른 입자를 포함하는 백신에 관한 것이기도 하다.
본 발명은 포유동물의 혈청 시료중에서 PreS1-PreS2-S 단백질 암호영역으로부터 발현된 단백질에 대한 항체의 존재를 검출하기 위한 방법에 관한 것이다. 그 방법은 다음과 같은 단계를 포함한다. :
a) 본 발명의 비-표지된 입자로 코팅된 고체 기질과 시료를 접촉시키고 ;
b) 접촉된 시료를 항온 배양하고 세척하며 ;
c) 접촉된 시료를 본 발명의 표지된 입자와 접촉시켜서 표지된 접촉시료를 생성하고 ;
d) 표지된 접촉시료를 항온 배양 및 세척하고 ;
e) 표지된 접촉시료중의 표지된 입자의 양을 측정한다.
본 발명은 또한 포유동물의 혈청시료중에서 PreS1-PreS2-S 단백질 암호영역으로 발현된 단백질의 존재를 검출하는 방법에 관한 것이다. 이 방법은 다음의 단계를 포함한다 :
a) 이 발명의 입자에 의해 이루어진 면역원에 의해 생성된 항체를 함유한 조성물을 제조하고 ;
b) 조성물의 제1분취량과 표지된 면역원을 시료와 접촉시키고, 제1분취량을 배양 및 세척하고 ;
c) 조성물의 제2분취량과 표지된 면역원을 항원-유리된 대조군과 접촉시키고, 제2분취량을 배양 및 세척하고 ;
d) 단계 b와 c의 조성물에 동량의 단백질 A-함유 스타필로코커스(staphylococci)를 첨가하고, 두 조성물을 배양한 뒤 고체로부터 액체를 분리하고 ;
e) 단계 b의 결과로 생성된 각각의 조성물중에서 표시된 면역원의 양을 측정한다.
본 발명은 또한, 포유동물의 혈청시료 중에서 PreS1-PreS2-S 단백질 암호영역으로부터 발현된 단백질에 대한 항체의 존재를 검출하는 진단 키트에 관한 것이다. 이 진단 키트는 다음의 것을 함유한다 :
a) 고체 지지체에 부착된 본 발명의 입자를 함유한 비표지된 단백질 및
b) 예를 들어, 사람 IgG 혹은 IgM에 표지된 항체.
본 발명은 또한 포유동물의 혈청 시료에서 PreS1-PreS2-S 단백질 암호영역으로부터 발현된 단백질의 존재를 검출하는 진단 키트에 관한 것이다 :
이 키트는 다음의 것을 함유한다 :
a) 고체 지지체에 부착된 본 발명의 입자에 의해 생성된 항체 및
b) 본 발명의 입자에 의해 생성된 표지된 항체.
본 발명은 또한 발명의 재조합 DNA 벡터 및 PreS2-S 단백질 암호영역, 혹은 단지S 단백질만의 암호영역과 MMT-프로모터(promoter)를 함유한 제2의 재조합 DNA 벡터로 동시형질감염된 진핵숙주세포에 관한 것이다. 바람직하게는, 제2의 재조합 벡터는 부수적으로 전사 종결 부위 및 임의로 선별마커를 함유하고 있다. 임의로, 동시형질 감염된 숙주는 본 발명의 재조합 DNA 벡터, 제2의 재조합 DNA 벡터 및 MMT-프로모터와 선별 마커를 함유하는 제3의 재조합 DNA 벡터로 동시형질감염시킨다.
바람직하게는, 제3의 재조합 벡터는 부가적으로 전사종결 부위를 포함하고 있다. 부가적으로 본 발명은 진행세포를 본 발명의 재조합 DNA 벡터, 상기한 제2의 재조합 DNA 벡터 및 상기한 제3의 재조합 DNA 벡터로 동시형질감염시켜, 동시형질감염된 숙주세포를 제조하는 방법에 관한 것이다.
본 발명은 또한 다음 단계를 포함하여 완전한 PreS1-PreS2-S 단백질 암호영역으로부터 발현된 적어도 한개의 단백질을 함유하고 있는 입자를 제조하는 방법에 관한 것이다 ;
a) 본 발명의 동시형질 감염된 숙주 진핵세포를 이 숙주가 상기의 단백질을 발현할 수 있도록 하는 배양 배지 조건하에 배양하고 ;
b) 그 입자를 분리한다.
N 바람직하게는, 이같은 동시형질감염된 숙주는 입자로 응집되는 단백질을 배지체 분비할 수 있다. 바람직하게는 이같은 방법으로 부가적으로 상기 단백질의 발현을 촉진하기 위해 상기 배양배지에 중금속이온이나 스테로이드 호르몬을 첨가시킨다. 이 발명을 또한 그러한 방법에 의해 제조된 입자에 관한 것이다.
본 발명은, 또한, a)PreS1-PreS3-S 단백질 암호영역을 포함하는 벡터 및 PreS1-PreS2-S 단백질 암호영역, PreS3-S 단백질 암호영역 또는 S 단백질 암호영역중의 하나를 포함하는 벡터 한개 이상; 및 b)MMT 프로모터를 포함하는 재조함 DNA 콘카타머에 관한 것이다. 바람직하게는, 이 콘카타머는 부가적으로 선별마커와 전사종결부위를 갖는다. 이와 같은 콘카타머는 본 분야에 공지된 기술에 의해 제조할 수 있다. 본 발명은 또한 본 발명의 콘카타머로 형질감염된 숙주진핵 세포에 관한 것이다.
바람직하게는, 숙주는 포유동물의 세포이다. 또한, 본 발은 본 발명의 콘카타머로 진핵세포를 형질감염시켜 본 발명의 콘카타머를 이용하여 형질감염된 숙주 세포를 제조하는 방법에 관한 것이다.
본 발명은 또한 다음의 단백질을 포함하여 전체의 PreS1-PreS2-S 단백질 암호영역으로부터 적어도 한개의 단백질을 함유한 입자를 제조하는 방법에 관한 것이다 ;
a) 본 발명의 콘카터머를 포함하고 있는 형질감염된 숙주를 숙주가 상기의 단백질을 발현할 수 있도록 하는 배양 배지 조건하에서 배양하고 ;
b) 입자를 분리한다.
바람직하게는, 이러한 형질감염된 숙주는 입자들로 응집된 단백질들을 배지에 분비할 수 있다. 바람직하게는, 이같은 방법은 부가적으로 상기 단백질의 발현을 촉진하기 위해 상기 배지에 중금속 이온이나 스테로이드 호르몬을 첨가시킨다. 본 발명은 또한 상기 방법에 의해 제조된 입자에 관한 것이다.
"PreS1-PreS2-S 단백질 암호영역"이란 PreS1-PreS2-S 폴리펩타이드로 알려진 완전한 폴리펩타이드를 암호한 HBV DNA 게놈(genome)의 영역을 뜻한다. 이 영역은 개시 메티오닌에 대한 코돈에서부터 아미노산의 삽입이 없음을 지정하면서 해독종결을 지시하는 최종 종결코돈(TAA), 또는 이와 같은 암호영역의 작용성 유도체를 포함한다. 이 영역에 의해 암호화되어 있는 단백질은 PreS1-PreS2-S- 폴리펩타이드(예를 들어 HBV 하형 adw에서의 389개 아미노산 잔기), PreS2-S 폴리펩타이드(예를 들어, HBV 아형 adw에서의 281개의 아미노산 산기) 및 S 폴리펩타이드(예를 들어 HBV 아형 adw에서의 226개 아미노산 잔기)를 포함한다. 바람직한 PreS1-PreS2-S 단백질 암호영역은 아형 adr, ayw, aduw 및 adw로 부터 유도된다. "작용성 유도체"란 용어는 입자로 응집됐을때, 천연 PreS1-PreS2-S 단백질 암호영역으로부터 발현된 폴리펩타이디의 응집에 의해 형성된 입자와 면역원성 관점에서 실질적으로 동일한 방식으로 작용하는, 폴리펩타이드를 암호화하는 PreS1-PreS2-S 단백질 암호화영역의 모든 유도체를 의미한다. 이 유도체는 상기 암호영역의 변형에 의해 생성되는 유도체 뿐만 아니라 PreS1-PreS2-S 단백질 암호영역의 부분적인 염기 서열 뿐만 아니라 그러한 암호영역의 변형에 의해 생성된 유도체를 포함한다.
이러한 암호영역을 변형시키는 기술은 본 분야에 알려져 있는데 예를 들면 화학적 또는 생화학적 돌연변이 유도체, 방사선요법, 혹은 효소나 다른 재조합 기술 및 분자생물학적 기술을 사용하여 핵산을 첨가, 삭제, 치환 등과 같은 직접적인 유전자 공학을 포함한다.
"PreS2-S 단백질 암호영역"은 캐시 메티오닌에 대한 코돈에서 부터 아미노산의 삽입이 없음을 지정하는 최종 종결코돈(TAA)을 포함하여, PreS2-S 폴리펩타이드로 알려진 완전한 폴리펩타이드를 암호화하는 HBV DNA 게놈의 영역 또는 이러한 암호영역의 작용성 유도체를 의미한다. 이와 같은 영역에 의해 암호화된 단백질은 PreS2-S 폴리펩타이드 (HBV 아형 adw에서 281개 아미노잔기)와 S 폴리펩타이드 (HBV 아형 adw에서의 226에서의 281개 아미노 잔기)를 포함한다. 바람직한 PreS2-S 단백질 암호영역은 HBV 아형 adr, ayw, adyw, adw로부터 유도된다.
"작용성 유도체"란 용어는 입자로 응집됐을 때, 천연 PreS2-S 단백질 암호영역에 암호화되어 있는 폴리펩타이드의 응집에 의해 형성된 압자와 면역원성 관점에서 실질적으로 동일한 방식으로 작용하는, 폴리펩타이드를 암호화하는 PreS2-S 단백질 암호영역의 모든 유도체를 의미한다. 이 유도체는 상기 암호영역의 변형에 의해 생성되는 유도체 뿐만 아니라 PreS1-S 단백질 암호영역의 부분적인 염기서열을 포함한다. 이와같은 암호영역을 변형시키는데 사용하는 기술은 본 분야에 알려져 있고 위에서 대략 기술하였다.
"S 단백질 암호영역"은 개시 메티오닌에 대한 코돈에서부터 아미노산의 삽입이 없음을 지정하는 최종 종결코돈(TAA)을 포함하여, S 폴리펩타이드로 알려진 완전한 폴리펩타이드를 암호화하는 HBV DNA 게놈의 영역, 또는 이러한 암호영역의 작용성 유도체를 의미한다. 이와 같은 영역에 의해 암호화된 단백질은 S 폴리펩타이드(예를들면, HBV 아형 adw에서의 226개 아미노잔기)를 포함한다.
바람직한 S 단백질 암호영역 HBV 아형 adr, ayw, adyw, adw로 부터 유도된다. "작용성 유도체"란 용어는 입자로 응집됐을 때, 천연 S 단백질 암호영역에 암호화되어 있는 폴리펩타이드의 응집에 의해 형성된 입자와 면역원성 관점에서 실질적으로 동일한 방식으로 작용하는 폴리펩타이드를 암호화하는 S 단백질 암호영역의 모든 유도체를 의미한다. 이 유도체는 산기 암호영역의 변형에 의해 생성되는 유도체 뿐만 아니라 S 단백질 암호영역의 부분적인 염기서열을 포함한다. 이러한 암호영역을 변형시키는데 사용하는 기술은 본 분야에 알려져 있고 위에서 대략 기술하였다.
"프로모터(promoter)"란 용어는 한유전자의 특정한 부위에서 DNA분자에 적당한 숙주세포 RAN 폴리머라제 복합체가 부착되도록하고 DNA 상의 특정위치에서 유전자의 전사가 시작되도록 적절하게 위치시켜 DNA 가닥중 하나의 RNA 복사물을 합성시켜 주는 DNA 분자 상향부위내의 DNA 서열을 의미한다.
"전사"란 용어는 주형으로서 2개의 상보적 DNA 가닥 중에서 1개를 사용하여 5'에서 3'의 방향(DNA 주형 가닥의 관점에서는 3'에서 5'으로)으로 차례로 리보뉴클레오타이드를 중합화하여, DNA 가닥중 하나의 완전한 복사물(데옥시리보뉴클레오타이드 대신에 리보뉴클레오타이드를 함유함)을 생성하는, RNA 폴러머라제 복합체를 포함한 숙주 세포의 생합성 기구에 의해 수행되는 과정이다.
"전사 종결 서열"이란 용어는 전사 과정에 참여한 RNA 폴리머라제 복합체에 신호를 보내어 전사 과정을 종결시켜, 숙주 세포질내에서 mRNA 분자로서 사용될 RNA 분자의 폴리아데닐화 및 수송을 포함하여, 적절하게 프로쎄싱될 수 있는 RNA 분자를 생성해주는 DNA 분자내의 영역(t)을 뜻한다.
"폴리아데닐화"란 용어는 숙주세포의 생합성적 기구가 RNA 분자내의 폴리아데닐화 시그날에 대한 특정서열, 보통 PAS라고 표시되는 5'AATAAA-3'을 인식하고, 비-주형 결정된 폴리리보아데닐레이느 잔기의 15-20개 뉴클레오타이드 하향 서열(3' 말단의 방향으로)을 상기분자의 3'말단에 첨가 해주는 과정을 의미한다.
"선별 마커"란 용어는 세포내에서 발견됐을 때, 유전자 결정인자를 갖는 세포가 유전자 결정 인자를 갖고있지 않거나 발현하지 않는 세포로부터 구분시켜 주거나 분리될 수 있도록 하는 특정의 특징을 부여해주는유전자 결정 인자를 의미한다. 바람직한 선별 마커로서는 드러그 내성 마커가 포함된다. "드러그 내성 마커"란 세포가 그러한 마커롤 발현했을 때 그러한 드러그 내성 마커를 갖고 있지 않거나 발현하지 않는 세포를 사멸시키거나 성장을 저해하는 드러그 또는 항생 물질의 치사 효과에 대해 내성을 부여하는 특정 부류의 선별 마커를 의미한다. 바람직한 드러그 내성 마커로서는 네오 마이신-내성 유전자(neo, Eco-gpt 유전자)(Mulligan, R.C. and Berg. p., Science. Vo1. 209, P. 1422, l980), 디하이드로폴레이트 환된 유전자(Ringold, G. et al, J. of Molec, and Appld, Genet., Vol. 1, p. 165, l981)에 대한 암호 서열이 포함된다.
"완전한 PreS1-PreS2-S 단백질 암호 영역으로부터 발현된 적어도 한 개의 단백질을 함유한 입자"란 완전한 PreS1, PneS2및 S 영역으로 형질 감염된 진핵 세포의 배양 용해물 내에서 또는 이로부터 응집되어 형성되어 어떠한 핵산도 존재하지 않으며, 주로 S 폴리 펩타이드(이량체)로 구성될 뿐만 아니라 좀더 소량의 완전한 PreS1-PreS2-S, 임의로 PreS2-S 폴리펩타이드로 구성된 아단위를 함유한 B형 간염 입자를 의미한다.
본 발명은 PreS1-PreS2-S 단백질 암호 영역과 MMT-프로모터를 함유한 재조합 DNA 벡터에 관한 것이다. MMT-프로모터는 그 DNA 서열에 대한 천연 프로모터(B형 간염 프로모터)와 함께 또는 B형 간염 프로모터 대신에 DNA 벡터 내로 삽입될 수 있다. 바람직하게는, MMT-프로모터는 DNA 벡터에서 PreS1-PreS2-S 단백질 암호영역의 근접 상향 부위에 위치시킨다. 바람직하게는, 이러한 벡터는 전사 종결 서열과 선별 마커를 포함한다. 선별 마커는 네오마이신 유전자 같은 드러그-내성 마커가 바람직하다. 바람직하게는, 상기의 전사 종결 서열은 SV40 종결 부위(sv-PAS-t)이고, 혹은 더욱 바람직하게는 마우스 글로빈(globin) 유전자의 DEF 영역(mg-PAS-t)이다. SV 40종결 서열은 본 분야에 잘 알려져 있고 문헌[Mulligan과 Berg, Science, Vo1, 209, p 1422, 1980]과 같은 다양한 참고 문헌에 기술되어 있다. 마우스 글로빈 유전자의 DEF 영역은 문헌[Falck-Pederson등, Cell, Vo1. 40, p 897, 1985]에 기술되어 있다. 상기 벡터는 일반적인 재조합 DNA 기술 및 다른 분자 생물학적 기술에 의해 제조될 수 있다.
mg-PAS-t영역을 사용하는 가장 바람직한 경우는 벡터가 어떠한 바이러스 DNA 단편도 포함하지 않고 발암 유전자가 아니어야 한다. 즉, 벡터가 숙주 내로 삽입되었을 때 어떠한 숙주 세포도 형질 전환시켜 암을 일으키지 않는다. 상기 벡터는 숙주 내로 형질 감염됐을 때, 이 벡터로 형질 감염된 숙주 재에서 작용할 수 있는 자가 복제 서열(레플리콘)을 가지고 있지 않다면 이 벡터는 숙주 엄색체내로 삽입되어서 숙주 게놈과 함께 피동적으로 복제된다.
바람직하게는, 본 발명의 재조합 DNA 벡터는 다음과 같은 특성을 포함해야 한다 :
1) PreS1-PreS2-S 단백질 암호 영역 ;
2) PreS1-PreS2-S 단백질 암호 영역의 근접 상향 부위에 위치한 MMT-프로모터를 함유하고 ;
3) 다량의 재조합 벡터를 증식, 증폭, 제조하기 위해 세균이나 혹은 다른 원핵 숙주 내에서 복제될 수 있어야 하고(그렇기 때문에 상기 벡터는 세균 혹은 다른 원핵 생물의 레플리콘 즉, 세균 숙주 세포와 같은 원핵 숙주 세포에서 염색체 외적으로 벡터를 자가 복제하고 유지하는데 필요한 모든 기능을 소유한 DNA 단편을 포함하고 있어야 한다. 이와 같은 레플리콘은 본 분야에 잘 알려져 있다) ;
4) 벡터, 레플리콘은 유전적, 분자 생물학적 조작이 쉽도록 작아야 하고(즉, 6-8킬로 염기 쌍보다 작아야 한다) ;
5) 벡터는 형질 전환된 세균 숙주 세포 내에서 사용하기 위한 선별마커, 바람직하게는 같은 드러그-내성마커를 함유하여야 하고,
6) 벡터는 되도록이면 형질 전환된 진핵 숙주 세포 내에서 사용하기 위한 제2의 선별 마커, 바람직하게는 네오마이신 같은 드러그 내성 마커를 함유해야 하고,
7) 벡터는 클로닝을 위해 펀리한 앤도뉴클리아제 제한 부위를 포함하고 있어야 하고,
8) 벡터는 전사 종결 서열과 폴리아데닐화 서열을 포함하고 있어야만 한다.
가장 바람직하게는, 본 발명의 벡터는 이 벡터로 형질 감염된 진핵 숙주 세포 내에서 작용할 수 있는 자가 복제 서열(레플리콘)을 포함하지 않는 것이다. 진행 숙주 세포에서 비-복제 벡터 체계를 사용하는 주된 이유는 이 벡터로 형질 감염된 포유동물 숙주 진핵 세포내에서 자가 및 염색체의 복제를 할 수 있는 모든 벡터 체계는 발암성 바이러스로부터 유도된 레플리콘을 함유하고 있기 때문이다.
PreS1-PreSz-S 단백질 암호 영역으로부터 발현된 단백질과 같이 제약적으로인 중요성을 가진 폴리펩타이드를 암호화한 DNA 서열을 발현시키기 위해 발암성 바이러스에서 유래되지 않은 DNA를 함유하는 벡터를 사용하는 것이 바람직하다.
본 발명의 벡터는 MMT-프로모터를 포함하고 있다. MMT-프로모터는 비바이러스성의 강력한 전사용 프로모터이다. MMT-프로모터의 암호 서열은 문헌[Pavlakis와 Hamer, Proc. Natl. Acad, Sci., Vol. 1l, p 397]에 기술되어 있다. MMT-프로모터는 아연과 카드뮴 같은 중금속 이온과 덱사메타슨(dexamethasone)과 같은 호르몬에 의해 제어된다. 이 같은 제어는 잘 알려져 있다. (Yagle and Palmiter, Molecular and Cellular Biol, Vo1. 5, p. 291, 1985).
본 발명은 또한 본 발명의 재조함 DNA 벡터로 형질 전환된 숙주 진핵 세포에 관한 것이다. 바람직하게는, 숙주는 포유 동물의 세포이면 좋고, 가장 바람직한 숙주는 챠이니즈햄스터 난소(CHO)세포주, 베로세포주, L-세포주, 마우스 또는 랫트의 섬유 아세포주이다.
상기 숙주는 Graham과 van der Eb. Virology, Vol. 52, p.456, 1973이나 Wig1er, M., Cell, Vol. 14, p.725, 1978의 방법과 같은 통상적인 기술에 의해 본 발명의 재조합 DNA 벡터로 진핵 세포를 형질 감염시킴으로써 제조될 수 있다.
또한 본 발명은 다음과 같은 단계를 포함하여, PreS1-PreS2-S 단백질 암호영역으로부터 발현된 단백질(이들 단백질중 한개 이상은 완전한 PreS1-PreS2-S 단백질 암호영역으로부터 발현된 폴리펩타이드에 상응한다)들을 포함하고 있는 입자를 제조하는 방법에 관한 것이다 :
a) 본 발명의 형질 감염된 숙주를 이 숙주가 상기의 단백질을 발현할 수 있도록 해주는 배지 조건하에서 배양하고 ;
b) 상기 입자를 분리한다.
바람직하게는, 그러한 공동 형질 감염된 숙주 세포는 입자로 응집된 상기 단백질을 배지내로 분비할 수 있다. MMT-프로모터를 유도시켜 상기 암호 영역의 발현을 촉진시키기 위해 상기 배양 배지에 중급속 이온이나 덱사메타손과 같은 스테로이드 호르몬을 첨가한다. 카드뮴이나 아연과 같은 중금속 이온이 가장 좋다. 배지에 들어가는 중금속 이온이나 스테로이드 호르몬의 최적농도는 통상적인 기술로 결정할 수 있다.
본 발명은 또한 상기 방법에 의해 제조된 입자에 관한 것이다. 만약 본 발명의 형질 감염된 숙주 세포가 배지 내로 상기의 입자를 직접 분비한다면, 상기 입자는 통상적인 단백질 분리 방법으로 배지에서 분리할 수 있다. 만약 본 발명의 형질 감염된 숙주 세포가 상기의 입자를 분비하지 않으면, 통상적인 배양물 용해 기술에 의해 숙주의 용해물로부터 얻을 수 있다. 이와 같은 입자는 당화된 형태로 얻어지고 PreS1-PreS2-S 단백질 암호 영역으로부터 발현된 단백질로 구성되어 있다. 이 단백질은 완전한 PreS1-PreS2-S 단백질 암호영역으로부터 발현된 적어도 1개의 단백질을 포함하고 있다.
또한 본 발명은 본 발명 입자의 면역 보호 량을 함유한 백신에 관한 것이다. "면역보호량"이란 의미는 감염균을 중화시키고 감염 균에 의한 증식과 그 결과로 인한 질병을 방지하기에 충분한 항체의 수준을 유도하고 유지하는데 필요한 본 발명의 입자(1-20ug이 좋다)을 말한다.
본 발명의 입자는 어떠한 바이러스 DNA 성분도 함유하고 있지 않으므로 자연에서 유도된 백신에서 일반적으로 발견되는 바이러스로 인한 우연한 감염, 알레르기 반응, 고열 등과 같은, 바람직하지 못한 부작용을 일으키지 않는다. 본 발명의 면역 보호 량의 입자를 함유하는 백신은 HBV 면역 반응을 증가시키고 완전한 PreS1-PreS2-S 암호영역에 의해 암호화된 단백질을 함유하고 있지 않은 B형 간염 바이러스에 대해 비반응성을 해소시키는데 사용될 수 있다.
본 발명의 백신은 인산 염으로 완충된 염수와 같은 적당한 완충 액에서 본 발명의 변역 보호 량을 혼합시킴으로써 제조할 수 있다. 이 백신은 부수적으로 수산화 알루미늄 등과 같은 보조제를 포함할 수도 있다.
다른 방도로서, 본 발명의 입자로 구성되는 폴리펩타이드는 상기의 입자에서 분리시키고 지질 소포(lipid vesicle)에 재결합시킬 수 있다. B형 간염 바이러스에 대한 백신은 본 발명의 폴리펩타이드를 함유하고 있는 지질 소포를 이용하여 제조할 수 있다. 적당한 농도에서 지방 소포는 수산화 알루미늄과 같은 보조제와 함께 혹은 보조제 없이 백신으로 사용될 수 있다.
본 발명의 백신 입자는 인산 염으로 완충된 염수와 같은 생리학적으로 허용되는 희석제와 함께 사용될 수 있다.
본 발명의 면역 보호 량의 입자를 함유하는 본 발명의 백신은 미국 특허 제4,118,479에 나타나 있는 방법과 동일한 일반적인 방법으로 제조하여 사용할 수 있다. 상기 특허의 모든 내용은 본원에 참고 사항으로 인용된다.
본 발명은 또한 다음과 같은 단계를 포함하여 포유 동물의 혈청 시료 중에서 PreS1-PreS2-S 단백질 암호영역으로부터 발현된 단백질에 대한 항체의 존재를 검출하기 위한 방법에 관한 것이다:
a) 본 발명의 표지되지 않은 입자로 코팅된 고체기질과 시료를 접촉시키고;
b) 접촉된 시료를 항온배양 및 세척하고;
c) 접촉된 시료를 본 발명의 표지된 입자와 접촉시켜서 표지된 접촉시료를 형성하고;
d) 표지된 접촉시료를 항온배양 및 세척하고;
e) 표지된 접촉시료중에서 표지된 입자의 양을 측정한다.
본 발명은 또한 다음과 같은 단계를 포함하여, 포유동물의 혈청시료 중에서 PreS1-PreS2-S 단백질 암호영역으로부터 발현된 단백질의 존재를 검출하는 방법에 관한 것이다:
a) 이 발명의 입자에 의해 이루어진 면역원에 의해 생성된 항체를 함유한 조성물을 제조하고;
b) 시료를 조성물의 일차분취량 및 표지된 면역원과 접촉시키고, 항온배양한 다음 일차분취량을 세척하고;
c) 항원을 보유하지 않은 대조시료를 조성물의 이차분취량 및 표지된 면역원과 접촉시켜서 항온 배양시키고 이차분취량을 세척하고;
d) 단계 b와 c의 조성물에 동량의 단백질 A-함유 스타필로코커스(staphylococci)를 처가하고 두 조성물을 항온배양한뒤 고체로 부터 액체를 분리하고;
e) 과정 d의 결과로 생성된 각각의 조성물 중에서 표지된 면역원의 양을 측정한다.
본 발명은 또한 포유동물의 혈청 시료중에서 PreS1-PreS2-S 단백질 암호영역에 의해 암호화된 단백질에 대한 항체의 존재를 검출하는 진단키트에 관한 것이다. 이 키트는 다음과 같은 성분을 포함하고 있다:
a) 고체 지지체에 부착된, 본 발명의 입자를 함유하고 있는 표지되지 않은 단백질 및
b) 예를들어, 인간의 IgG 혹은 IgM에 표지된 항체.
본 발명은 또한 포유동물의 혈청시료 중에서 PreS1-PreS2-S 단백질 암호영역으로부터 발현된 단백질의 존재를 검출하는 진단키트에 관한 겻이다. 이 키트는 다음과 같은 성분을 포함하고 있다:
a) 고체 지지체에 부착된, 본 발명의 입자에 의해 생성된 항체; 및
b) 본 발명의 입자에 의해 생성된 표지된 항체.
본 발명은 B형 간염 표면항원과 그 항원에 대해 생긴 항체의 검출을 의한 진단시험도 포함하고 있다. 방사성 면역분석법(RIA)이나 효소-연결된 면역흡착분석법(ELISA)는 HBV에 감염된 동물이나 인체의 혈청중에 있는 PreS1-PreSz-S 암호영역으로부터 발현된 단백질을 함유한 HBV 항원을 검출하기 위해 사용된다. 한가지 진단 시험으로서 다음과 같은 단계를 포함한다.
1. 폴리스티렌 구슬(bead)과 같이 도면에 결합부위가 있는 고체기질에 PreS1-PreS2-S를 포함하는 폴리펩타이드의 해덩 아미노산 서열을 가지는 입자들에 대한 항체로 코팅시킨다.
2. 코팅된 구슬들은 과량의 항체를 제거하기 위해, 예를 들어 트리스로 완충시킨 영수로 세척한다.
3. 그리고나서 구슬들을 소의 혈청 알부민(BSA)이나 젤라틴과 같은 단백질을 함유한 용액과 접촉시켜서 구슬표면의 단백질을 결합부위를 포화시킨다. (비특이적 결합을 감소시키기 위해). 이런 단백질을 함유한 용액의 농도는 1mg/ml에서 50mg/ml까지 편리하케 사용할 수 있다.
4. 그후 과량의 BSA나 젤라딘을 제거하기 위해 구슬을 세척한다.
5. 구술을 HBV나 HBV 표면 항원이 들어 있을 것으로 예상되는 헐청시료와 항온배양한다(정상혈청은대조군으로 사용한다).
6. 그리고나서 구슬을 트리스로 완충시킨 염수 용액과 같은 용액으로 세척하고 HBV 표면항원에 대하여 생긴12=I로 표지한 항체와 같은 방사성 물질로 표지한 항체와 혼합한다.
7. 구슬을 항온 배양하고난후,
8. 구슬을 세척하고 감마계수기로 계수한다.
PreS1-PreS2-S 단백질 암호영역에 의해 발현된 븐 발명의 입자들은 주어진 시료에서 HBV 표면 항원단백질의 PreS1-PreS2-S 영역에 대한 항체를 검출하는 진만도구로 사용할 수 있다. PreS1-PreS2-S를 포함하는 입자들은 예를들어 폴리스티렌구슬과 같이 표면에 결합부위가 있는 고체기질에 흡착시킨다. 그후 기질을 젤라틴, BSA 또는 분말우유와 같은 물질에 접촉시켜 표면에 존재하는 비특이적 결합부위를 포화시킨다. 그후 기질을 완총용액으로 세척한 후, 완충용액을 제거한다. 동물 혈청으로 희석시킨 인체혈청과 같은 시료를 기질에 첨가한다. 그 결과로 생성된 덩어리를 항온 배양시키고 세척한다. 그후 IgG나 IgM에 요오드(12=I)와 같은 방사성 물질로 표지한 사람의 항체를 그 덩어리에 첨가한다. 그결과로 생성된 덩어리를 배양하고 난후 세척하고 감마계수기등으로 계수한다. 계수량이 정상 혈청시료에서 얻은 계수량보다 높으면그 시료는 HBV의 PreS1-PreS2-S 암호영역에 대한 항체를 포함하고 있다. HBV의 PreS1-PreS2-S 단백질 암호영역으로부터 발현된 단백질에 대한 항체의 검출 절차는 B형 간염 바이러스 감염을 검출하는 진단도구로 이용필 수 있는 것으로 확신된다. 시험 시료에서 HBV 게놈의 PreS1-PreS2-S 암호영역으로부터 발현된 항원을 검출하기 위한 진단시험 키트는 다음과 같은 것을 포함한다:
1. 본 발명의 HBV 표면항원 입자의 PreS1-PreS2-S 영역에 상응하는 아이노산 서열을 가지는 입자에 대한 항체로 코팅원 고체기질.
2. 고체기질 표면의 단백질 결합부위를 포화시키기 위한 단백질을 합유한 용액 : 및
3. HBV 표면 항원 폴리펩타이드에 대한 항체와 같은 주어진 양의 방사능 물질로 표시된 항체.
시험 시료에서 B형 간영 바이러스 게놈의 PreS1-PreS2-S 암호영역으로부터 발현된 단백질에 대한 항체를 검츨하기 위한 또 다른 진단시험 키트는 다음과 같은 것을 포함한다 :
1. 본 발명의 HBV 표면 항원 단벡질의 PreS1-PreS2-S 암호영역에 상웅하는 아미노산 서1필을 가진 입자들을 표면에 흡착시킨 고체기질(이 기질은 단백질을 함유하는 용액에 노출되어 고체기질표면의 비특이적 단백질 결합부위가 포함된다):
2. 인간의 IgG 또는 IgM에 방사성 물질로 표시된 주어진 양의 항체.
위에 기술된 진단 키트에 사용원 방사성 물질로 표지된 항체는 재구성에 적당한 용액형태로 또는 동결 건조상태로 포장할 수 있다. 부가적으로 효소와 연결되거나 형광성 물질로 표시된 항체가 위에서 기술한 방사성 물질로 표지한 항체와 대치될 수 있다.
B형 간염 바이러스 PreS1-PreS2-S 암호영역의 폴리펩타이드에 대한 항체를 검출하기 의한 상기 시험 키트 및 방법은 환자로 부터 혈청을 취하여 상기 시험을 응용하거나 이용함으로써, 환자의 HBV 감염을 검출하고, 감염된 환자로부터 혈청을 취하여 위에서 기술한 항체 검출절차를 응용함으로써 HBV 감염으로부터의 회복을 예측하는 것과 같은 응용면에 이용할 수 있다.
항체검출을 위한 시험 절차와 진단키트는 예방접촉을 한 환자로부터 혈청을 취하여 서로 다른 HBV 백신사이의 정성적 비교를 하는데 이용될 수 있다. 일반적으로 이 항원을 시약으로 사용한 알려진 모든 면역분석법은 본 발명의 PreS1, PreS2또는 S를 함유하는 입자들을 사용함으로써 실행할 수 있다. 일반적으로 항체를 함유하는 혈청이나 시약을 사용한 알려진 모든 면역분석법은 본 발명의 DNA 재조합 기술에 의해 생산한 펩타이드의 사용을 통해 생성된 항체 혈청을 사용함으로써 실행할 수 있다. 이러한 면역분석법은 Method of Enzymology, Academic Press, Vols. 70,73 alc 74에서 Langone과 Van Vunakis가 발표한 모든 면역분석법을 포함하고 있는 이러한 분석법들은 다음의 미국특허 및 문헌에 기술되어 있다 : 4,459,359; 4,343,896; 4,331,76l; 4,292,403; 4,228,240; 4,157,280; 4,152,411; 4,169,0l2; 4,016,043; 3,839,153; 3,654,090 및 Re. 31,006과 Method of Enzymology Vols. 70, 73, 74.
본 발명은 또한 본 발명의 재조합 벡터와 PreS2-S 단백질 암호영역 또는 S 단백질만의 암호영역과 MMT-프로모터를 함유하고 있는 제2재조합 DNA 벡터로 동시형질감염된 진핵숙주세포에 관한 것이다. 바람직하게는 제2의 재조합 벡터는 부수적으로 전사종결부위와 임의적으로 선별마커를 포함한다. 임의적으로 동시형질 감염된 숙주는 본 발명의 재조합 DNA 벡터, 제2의 재조합 DNA벡터 및 MMT-프로모터와 선별마커를 함유한 제3의 재조합 DNA 벡터로 형질감염된다. 바람직하게는, 제3의 재조합 DAB 벡터는부가적인 전사종결 부위를 가지고 있다. 바람직하게는, 제2와 임의적인 제3의 재조합 DNA 벡터는 또한 세균숙세포와 같은 원핵숙주 세포가 상술한 제2의 또는 임의적인 제3의 재조합 DNA 벡터로 형질 전환될때 그 숙주세포에서 성장하고 증폭하는데 필요한 레플리콘을 가지고 있다.
부가적으로 본 발명은 위에서 기술한 동시형질감염된 숙주세포를 제조하는 방법에 관한 것인데, 그 방법은 본 발명의 재조합 DNA 벡터와 위에 기술한 제2의 재조합 DNA 벡터, 그리고 임의적으로, 위에서 기술한 제3의 재조합 DNA 벡더를 이용하여 진핵세포를 동시형질감염시키는 것을 포함하고 있다. 임의적인 제3벡터가 사용되지 않는다면 제2의 재조합 DNA 벡터는 드러그 내성마커와 같은 선별마커를 부가적으로 함유하는 것이 바람직하다. 바람직하게는, 제2 및/또는 임의의 제3재조합 DNA 벡터가 mg-PAS-t 종결부위이다. 전사종결 부위를 함유한다면, 이 부위는 바람직하게는 위에 기술한 제2의 재조합 DNA 벡터에서 MMT-프로모터는 벡터에서 PreS2-S 단백질 암호영역의 근접 상향부위에 위치한다. 바람직하게는,위에 기술한 임의적인 제3의 재조합 DNA 벡터에서 MMT-프로모터는 선별마커의 근접 상향부위에 위치한다. 바람직하게는, 제2재조합 벡터나 임의적인 3재조합 벡터는 어떠한 비-HBV 바이러스성 DNA 단편도 가지고 있지 않으며 비-발암성이다. 그러므로, 숙주 세포내로 형질감염될때 그같이 바람직한 벡터들은 숙주 염색체내로 통합되며 숙주 게놈과 함께 수동적으로 복제된다.
본 발명의 벡터, 위에 기술한 제2의 재조합 DNA 벡터 및 임의적으로 위에 기술한 제3의 재조합 DNA 벡터는 일반적 방법을 사용하여 쌍조합으로 또는 세 벡터 모두 함께 진핵세포 숙주내로 동시 형질감염 된다. 다른 방도로서, 이 발명의 벡터, 제2의 재조합 DNA 벡터, 그리고 임의적인 제3의 재조합 DNA 벡터는 연속적인 단계로 진핵 숙주내로 형질 감염시킨다. 일차로, 이 발명의 벡터를 본 발명의 방법에 따라 진핵 숙주내로 형질감염시켜 본 발명의 형질감염된 숙주를 생성한다.
그뒤 그 같이 형질감염된 숙주는 통상의 방법에 따라 위에 기술한 제2의 재조합 DNA 벡터와, 위에 기술한 임의적인 제3의 재조합 DNA 벡터로 형질감염시켜 본 발명 공동 형질 감염된 숙주을 생성한다.
바람직하게는, 이 발명의 벡터, 제2의 재조합 DNA 벡터 그리고 임의로 제3의 재조합 DNA 벡터는 본 발명의 최종적인 형질감염된 숙주를 만들어내는 계속되는 각각의 형질감염 단계에서 새롭게 형질감염된 숙주를 분별해주는 선별마커를 함유한다. 그 같은 제2의 형질감염 단계는 복식으로 형질감염된 숙주세포에 의해 이루어진 PreS1-PreS2-S 단백질 암호 영역의 유전자 복제수를 증가시키기 의하여 실행한다. 바람직하게는, 제2의 재조합 벡터나 임의적인 제3의 재조합 벡터는 진핵세포에서 기능을 나타낼 수 있는 레플리콘을 함유하지 않는다. 、
본 발명은 또한 하기 단계를 포함하여, 완전한 PreS1-PreS2-S 단백질 암호영역으로 부터 발현된 적어도 한개의 단백질을 함유하고 있는 입자를 제조하는 방법에 관한 것이다.
a) 상기의 숙주가 상기의 단백질을 발현할 수 있도록 하는 배지 조건하에서 본 발명의 공동 형질감염된 진핵세포를 배양하고 :
b) 상기의 입자를 분리한다.
바람직하게는 이같은 공동 형질감염된 숙주는 배지에서 상기의 입자로 응집된 단백질을 분비할 수 있다. 바람직하게는, 그 방법은, 부가적으로, 공동 형질전환된 벡터들이 지니고 있는 PreS1-PreS2-S 단백질 암호영역의 발현을 강화하기 위해서 중금속 이온이나 스테로이드 호르몬을 배지에 첨가하는 것을 함유하고 있다. 중금속이온, 특히 아연이나 카드뮴이 가장 좋다. 배지에 들어가는 중금속이온이나 스테로이드 호르몬의적정농도는 통상의 기술로 결정할 수 있다. 본 발명은 또한 상기 방법에 의해 제조한 입자에 관한 것이다. 만약 본 발명의 입자는 통상의 단백질 분리방법으로 배지에서 분리할 수 있다.
만약 본 발명의 공동 형질감염된 숙주세포가 상기의 입자를 분비하지 않으면, 통상의 융해 기술에 의해 공동 형질 전환된 숙주의 배양 용해물로부터 수득할 수 있다.
상기 입자는 당화된 형태로 분리되며 PreS1-PreS2-S 단백질 암호영역, PreS2-S 단백질 암호영역 그리고 S 단백질 암호영역으로 부터 발현된 단백질들로 구성된다.
본 발명은 또한 본 발명의 공동형질감염된 숙주에 의해 생성된 입자의 면역보호량(바람직하게는 1-20ug)을 함유한 백신에 관한 것이다.
본 발명의 공동형질감염원 숙주에 의해 생성된 입자는 바이러스 DNA 성분을 전혀 함유하지 않으며, 따라서 바이러스에 의한 우발적 감염, 알레르기 반응, 열병등과 같은, 천연적으로 유도된 백신에서 혼히 볼수있는 바람직하지 못한 부작용을 일으키지 않는다. 본 발명의 공동형질감염된 숙주에 의해 생성된 입자의 면역 보호량을 함유한 본 발명의 백신은 HBV 면역반응을 개선하는데 사용될 수 있으며, 완전한 PreS1-PreS2-S 단백질 암호서열로부터 발현된 적어도 하나의 단백질질도 포함하지 않는 B형 간염 바이러스 백신에 대한 무반응성을 해소시키는데 사용될 수 있다.
본 발명의 백신은 인산염으로 완충된 염수와 같은 적당한 완충액에 본 발명의 공동형질감염된 숙주에 의해 생성된 면역보호량의 입자를 혼입시킴으로써 제조할 수 있다. 이 백신은 부수적으로 수산화알루미늄등과같은 보조제를 포함할 수 있다.
다르게는, 본 발명의 공동형질감염된 숙주에 의해 생성된 입자를 구성하는 폴리펩타이드를 입자에서 분리시키고 지질소포에 재결합시킬 수 있다. B형 간염 백신은 본 발명 입자의 폴리텝타이드를 함유하고 있는 지질소포를 이용하여 제조할 수 있다. 지질소포를 함유한 본 발명의 백신은 추가로 수산화 알루미늄과 같은 보조제를 추가로 함유할 수 있다.
본 발명의 백신 입자는 인산염으로 완충된 염수와 같은 생리학적으로 적당한 희석제와 함께 사용될 수 있다. 본 발명의 면역보호량의 입자를 함유하는 본 발명의 백신은 미국 특허 제4,118,479호에 나타나 있는 방법과 동일한 일반적 방법으로 제조하여 사용할 수 있다.
본 발명의 백신은 피하, 피내, 또는 근육내 주사에 의해 투여될 수 있다. 바람직한 경로는 특정 백신에 의해 좌우되지만, 일반적으로 근육내 주사가 좀더 적합하다. 투여횟수는 백신에 따라 다양하게 정할 수 있다.
본 발명은 또한 포유동물의 혈청시료에 존재하는 PreS1-PreS2-S 단백질 암호영역으로부터 발현된 단백질에 대한 항체의 생성을 검출하기 위한 방법에 관한 것이다. 그 방법은 다음과 같은 단계를 포함하고 있다.
a) 본 발명의 동시형질감염된 숙주에의해 생성된 표지되지 않은 입자로 코팅된 고체 기질과 시료를 접촉시킨다;
b) 접촉시킨 시료를 항온배양하고 세척한다;
c) 접촉시킨 시료를 본 발명의 표지된 입자와 접촉시켜서 표지된 접촉시료를 생성한다;
d) 표지된 접촉시료를 항온배양하고 세척한다;
e) 표지된 접촉시료중에서 표지된 입자의 양을 측정한다.
본 발명은 또한 포유동물의 혈청시료에 존재하는 PreS1-PreS2-S 단백질 암호영역으로부터 발현된 단백질의 존재를 검출하는 방법에 관한 것이다. 그 방법은 다음과 같은 단계를 포함하고 있다:
a) 본 발명의 입자로 이루어진 면역원에 의해 생성된 항체를 함유한 조성물을 생성한다;
b) 조성물의 제1분취량 및 표지된 면역원을 시료와 접촉시키고, 항온 배양한후 제1분취량을 세척한다;
c) 항원이 없는 대조군과 조성물의 제2분취량 및 표지된 면역원을 접촉시키고, 항온배양한후 제2분취량을 세척한다;
d) 과정 b와 c의 조성물에 동량의 단백질 A-함유 스타필로코커스(staphylococci)를 첨가하고 이 두 조성물을 항온배양한뒤 고체로부터 액체를 분리한다;
e) 과정 d의 결과로 생성되는 각각의 조성물중 표지된 면역원의 양을 측정한다.
본 발명은 또한 다음과 같은 성분을 포함하여, 포유동물의 혈청시료중에서 PreS1-PreS2-S 단백질 암호영역으로부터 발현된 단백질에 대한 항체의 존재를 검출하는 진단 키트에 관한 것이다:
a) 고체 지지체에 부착시킨 본 발명의 입자를 포함한 표지되지 않은 단백질; 및
b) 예를들어 인간의 IgG 혹은 IgM에 표지된 항체.
본 발명은 또한 다음과 같은 성분을 포함하여, 포유동물의 혈청시료중에서 PreS1-PreS2-S 단백질 암호영역으로부터 발현된 단백질의 존재를 검출하는 진단 키트에 관한 것이다.:
a) 고체지지체에 부착시킨, 본 발명의 입자에 의해 생성된 항체; 및
b) 본 발명의 입자에 의해 생성된 표지된 항체
본 발명은 또한 a) PreS1-PreS2-S 단백질 암호영역을 포함한 플라스미드 벡터 및 PreS1-PreS2-S 단백질 암호영역, PreS2-S 단백질 암호영역 및 S 단백질 암호영역중 하나를 포함한 하나이상의 추가 플라스미드; 와 b) MMT-프로머터를 갖는 재조합 DNA 콘카타머에 관한 것이다. 이와같은 콘카타머는 추가로 선별마커와 전사종결부위를 함유하는 것이 바람직하다.
본 발명은 또한 본 발명의 콘카타머로 형질감염된 숙주 진핵세포에 관한 것이다. 숙주는 포유동물 세포가바람직하다. 부가적으로, 본 발명 본 발명의 콘카타머로 진핵세포를 형질감염시켜, 콘카타머로 형질감염된 숙주세포를 제조하는 방법에 관한 것이다.
본 발명은 또한 하기의 단계를 포함하여, 완전한 PreS1-PreS2-S 단백질 암호영역으로부터 발현된 적어도 한개의 단백질을 포함하는, 본 발명의 형질감염된 숙주에의해 생성된 입자를 제조하는 방법에 관한 것이다.
a) 본 발명의 콘카타머를 포함하고 있는 본 발명의 형질감염된 진핵숙주 세포를 이 숙주가 상기의 단백질을 발현할 수 있도록 하는 배지조건하에서 배양하고;
b) 상기의 입자를 분리한다.
바람직하게도, 이러한 동시형질감염된 숙주는 입자로 응집된 단백질들을 배지내로 분비할 수 있다. 바람직하게는 본 방법은 부가적으로 형질감염된 벡터에 포함된 PreS1-PreS2-S 단백질 암호영역의 발현을 증대시키기 위해 상기 배지에 중금속이온이나 스테로이드 호르몬을 첨가시킨다. 카드뮴이나 아연과 같은 중금속 이온이 가장 좋다. 배지에 들어가는 중금속이온이나 스테로이드 호르몬의 최적농도는 통상의 기술로 결정할 수 있다. 본 발명은 또한 상기 방법에 의해 제조된 입자에 관한 것이다. 만약 본 발명의 콘카타머로 형질감염된 숙주가 배지내로 상기의 입자를 분비한다면, 이 입자는 통상적인 단백질 분리기술로 배지에서 분리할 수 있다. 만약 본 발명의 형질감염된 숙주세포가 상기 입자를 배양배지내로 분비하지 않으면 이 입자는 통상적인 배양물 용해 기술에의해 상기 형질감염된 숙주의 배양용해물로부터 얻을 수 있다. 상기 입자는 당화된 형태로 분리되며 PreS1-PreS2-S 단백질 암호영역, PreS2-S 단백질 암호영역, 및 S 단백질암호영역으로부터 발현된 단백질로 구성된다.
본 발명은 또한 본 발명의 콘카타머로 형질감염된 숙주에 의해 생성된 입자의 면역보호량(바람직하게는 1-20ug)을 함유한 백신에 관한 것이다.
본 발명의 콘카타머로 형질감염된 숙주에 의해 생성된 입자는 바이러스 DNA 성분을 함유하지 않으며 따라서 바이러스에 의한 우연한 감염, 알레르기반응, 열병 그리고 그와 유사한 것과 같은, 천연적으로 유도된백신에서 흔히 볼 수 있는 바람직하지 못한 부작용이 없다. 본 발명의 콘카타머로 형질감염된 숙주에 의해 생성된 입자의 면역보호량을 함유한 본 발명의 백신은 HBV 면역반응을 개선하는데 사용될 수 있으며 완전한 PreS1-PreS2-S 단백질 암호서열로부터 발현된 적어도 하나의 단백질도 포함하지 않는 B형 간염 바이러스 백신에 대한 무반응성을 해소시키는데 사용될 수 있다.
본 발명의 백신은 인산염으로 완충된 염수와 같은 적당한 완축액에 본 발명의 콘카타머로 형질감염된 숙주에 의해 생성된 면역보호량의 입자를 배합함으로써 제조할 수 있다. 백신은 부수적으로 수산화알루미늄과 같은 보조제를 함유할 수 있다.
다르게는, 본 발명의 콘카타머로 형질감염된 숙주에 의해 생성된 입자를 형성하는 폴리펩타이드는 그 입자로 부터 분리하고 지질소포에 재결합시킬 수 있다. B형 간염 백신은 위에서 말한 본 발명의 입자의 폴리펩타이드를 함유하는 위의 지질소포를 사용하여 제조할 수 있다. 지질소포를 함유하는 백신은 부수적으로 수산화알루미늄과 같은 보조제를 함유할 수 있다.
본 발명의 백신에 함유되는, 본 발명의 콘카타머로 형질감염된 숙주에 의해 생성된 입자는 인산염으로 완충시킨 염수와 같은 생리적으로 허용되는 희석제와 함께 사용될 수 있다.
본 발명의 면역보호량의 입자를 함유하는 본 발명의 백신은 미국 특허 제4,118,479호에 기술된 것과 같은 통상의 방법으로 제조하고 사용할 수 있다.
본 백신은 피하주사, 피내주사, 근육내주사로 투여할 수 있다.
가장 좋은 방법은 벡신에 달려있지만 근육내주사가 일반적으로 가장 적당하다. 투약횟수는 백신에 따라 다양하다.
본 발명은 또한 다음의 단계를 포함하여, 포유동물의 혈청시료에 존재하는, PreS1-PreS2-S 단백질 암호영역으로부터 발현된 단백질에 대한 항체를 검출하기 위한 방법에 관한 것이다;
a) 본 발명의 콘카타머로 형질감염된 숙주에 의해 생성된 표지되지 않은 입자로 코팅된 고체기질과 시료를 접촉시키고;
b) 접촉시킨 시료를 항온배양하고 세척하며;
c) 접촉시킨 시료를 본 발명의 표지된 입자와 접촉시켜서 표지된 접촉시료를 생성하고;
d) 표지된 접촉시료를 항온배양하고 세척하며;
e) 표지된 접촉시료중에서 표지된 입자의 양을 측정한다.
본 발명은 또한 다음과 같은 단계를 포함하여, 포유동물의 혈청시료에 존재하는 PreS1-PreS2-S 단백질 암호영역으로부터 발현된 단백질을 검출하는 방법에 관한 것이다.
a) 이 발명의 입자로 구성된 면역원에 의해 생성된 항체를 함유한 조성물을 생성하고;
b) 조성물의 제1분취량 및 표지된 면역원을 시료와 접촉시키고, 항온 배양한후 제1분위량을 세척한다;
c) 항원이 없는 대조군과 조성물의 제2분취량 및 표지된 면역원을 접촉시키고, 항온배양한후 제2분취량을 세척한다;
d) 과정 b와 c의 조성물에 동량의 단백질 A-함유 스타필로코커스(staphylococci)를 첨가하고 이 두 조성물을 항온배양한뒤 고체로부터 액체를 분리한다;
e) 과정 d의 결과로 생성되는 각각의 조성물중 표지된 면역원의 양을 측청한다.
본 발명은 또한 다음과 같은 성분을 포함하여, 포유동물의 혈청시료에 존재하는 PreS1-PreS2-S 단백질암호영역으로부터 발현된 단백질에 대한 항체의 존재를 검출하는 진단키트에 관한 것이다.
a) 고체지지체에 부착된, 본 발명의 입자를 함유한 표지되지 않은 단백질; 및
b) 예를들어 인간의 IgG 혹은 IgM에 표지된 항체.
본 발명은 또한 다음과 같은 성분을 포함하여, 포유동물의 혈청시료에 존재하는 PreS1-PreS2-S 단백질 암호영역으로부터 발현된 단백질을 검출하는 진단키트에 관한 것이다;
a) 본 발명의 입자에 의해 생성된, 고체지지체에 부착시킨 항체; 및
b) 본 발명의 입자에 의해 생성된 표지된 항체.
첫번째 바람직한 양태로서, 본 발명의 한가지 벡터는 재조합 플라스미드 pBPV 342-12(Law 등, Molecular and Cellular Biol,, Vol.3, p.2110, 1983)와 pAOI(Cummings, I. W. Proc. Natl. Aca. Sci., U.S.A. Vol 77, p1842, 1980)로부터의 유전자서열을 함유한 벡터 작제물을 포함한다. 이들 플라스미드로부터의 유전요소중 일부를 조합하여 플라스미드 pDml(제3도)로 표시된 본 발명의 벡터를 제조하였다. 플라스미드 pDml은 PreS1-PreS2-S 단백질 암호영역을, 이 영역에 대한 천연 프로모터 체계의 조절하에, 갖는 유전자 단편, 네오마이신 내성유전자, MMT-프로모터 및 SV40 PAS-t 기능을 지닌다. 그런후, 플라스미드 pDml으로 포유동물 세포와 같은 많은 진핵세포들중의 하나를 형질가염시켜, 본 발명 입자의 높은 수준의 발현 및 바람직하게는 분비를 유도하였다.
플라스미드 pBPV 342-12(제1도)는 MMT-프로모터를 포함하는 유전자 서열, 네오마이신 내성유전자, SV40 PAS-t 기능과 소의 유두종 바이러스(BPV) 게놈을 지닌다. 플라스미드 pDml의 작제시, 플라스미드 pBPV342-12를 BamH I으로 처리하여 두개의 DNA 단편으로 절단한다. 그 단편들을 분리한 후 완전한 BPV 게놈을 가지는 7.95킬로베이스(kb) 단편을 버린다. BPV DNA를 제거하면 백신제제에 사용할 본 발명의 입자에 어떠한 BPV DNA 또는 단백질의 혼입도 배제되므로 매우 유리하다. 그런후, pBPV342-12의 나머지 MMT-프로모터에 대한 유전자서열, 네오마이신 내성유전자와 SV40 PAS-t 영역을 지니는 BamH I 단편(6.65kb)를 완전한 PreS1-PreS2-S 단백질 암호영역을 지니는 플라스미드 pAOI로부터 유도된 DNA 서열과 통상의 기술로 결합시킨다(제2도).
완전한 B형 간염 바이러스 게놈을 지니는 플라스미드 pAOI(제2도)를 EcoR I으로 분해시켜 3.2kb 단편을 생성한다. 3.2kb 단편을 그 자체에 연결시켜 B형 간염 바이러스의 코어와 표면 항원 모두를 암호화한 유전자 서열을 가지는 긴 콘카타머 DNA 구조를 갖는 순차 반복체(tandem repeats)를 형성한다. 플라스미드 pAOI에서 분자 클로닝에 의해 일어난 과잉돌연변이를 극복하고 PreS1-PreS2-S 단백질 암호영역의 기능적 쳬계를 복구하는데 필요한 B형 간염 바이러스 유전자 서열의 조작방법은 Proc. Natl. Sci., U. S. A., Vo1. 77, p1842, 1980)에 기술된 Cumnuings 등의 방법이다. 그런후, Bgl II절단을 통해 HBV 코어 항원 유전자 단편을 제거하고 B형 간염 바이러스 게놈의 PreS1-PreS2-S 단백질 암호영역을 이 영역의 천연 프로모터체계(PHB)와 함께 지니는 DNA 단편(2.78kb)을 수득한다.
이어서, 선형 pBPV342-12 BamH I 단편(제1도)과 pAOI-유도된 Bg1Ⅱ단편(제2도)를 연결하여 PreS1-PreS2-S 단백질 암호영역에 대한 천연프로모터(PHB)를 보유하는 재조합 플라스미드 pDMl(제3도)을 생성한다.
두번째 바람직한 양태로서, pDMl내의 천연 프로모터를 Bg1II와 BamH I으로 절단하여 MMT 프로머터가 PreS2-S 단백질 암호영역의 바로 앞에 위치시켜 이 암호영역의 전사가 MMT프로머더에의해 조절되도록 한다. BamH I + Bgl II으로 분해했을때 3가지 명확한 DNA 절편이 얻어진다(제4A 및 4B도):
1) 폴리아데닐화 부위와 MMT-프로모터를 포함하는 5.1kb 단편;
2) 네오마이신 내성 유전자와 천연 프로머터를 포함하는 3.0kb 단편; 및
3) PreS2-S 단백질 암호영역을 포함하는 1.4kb 단편.
정제한 후 5.1과 1.4kb 단편을 통상의 기술로 결합시켜서 MMT-프로모터의 조절하에 PreS2-S 단백질암호영역을 지니는 재조합 플라스미드(6.46kb)를 생성한다. 두개의 결합된 단편의 상대적인 배향은 무작위적이고 2개의 다른 플라스미드 형태가 생성되기 때문에, 이들둘중에서 MMT-프로모터로부터 표면 항원 유전자 서열로의 정확한 전사 판독 배향을 나타내는 기능상 정상적인 플라스미드 pDM2만을 분리하기 위해서는 상기 정재된 플라스미드를 EcoR I+Xba I으로 분해시킨다. 이렇게 분해시켰을 때 정확한 배향을 갖춘 플라스미드는 2.1과 4.4kb 단편을 형성시킨다.
플라스미드 pDM2를 지니고 있는 균주 HB101이 1985년 4월 4일에 독일연방공화국 궤팅엔 소재의 Deutsche Sammlung fur Mikroorganismen에 기탁번호 DSM3285로 기탁되어 있다. 플라스미드 pMMT-neo을 지니고 있는 균주 HB101은 미국 메릴랜드 로크빌소재의 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션(American Type Culture Collection)에 1986년 4월 11일자로 기탁번호 제67074호로 기탁되었다. 이들 균주는 각각1986년 7월 14일에 기탁번호 제 KFCC-10230 및 KFCC-10229호 재기탁되었다.
세번째 바람직한 양태로서, PreS1-PreS2-S 단백질 암호영역을 MMT 프로모터의 직접적인 조절하에 있도록 하기 위하여, 천연프로모터를 제거하고, MMT 프로모터를 PreS1-PreS2-S 단백질 안호영역을 포함하는 HBV 유전자 단편에 접합시킨다(재9도).
네번째 바람직한 양태로서, 플라스미드 pBR322 βG2에서 얻은 마우스 글로빈 유전자 mg-PAS-t 단편을 폴리아데닐화 종결(PAS-t)시그날로서 SV40 PAS-t 영역대신 사용한다. mg-PAS-t를 사용함으로써 어떠한 비-HBV 바이러스 게놈부분도 없는 DNA 전달벡터를 얻을 수 있다(제9, 10 및 11도).
다섯번째 바람직한 양태는 세포주에 형질감염을 시키기 위해서, 플라스미드 DNA 혼합된 콘카타머를 제조하는 방법, 즉 약물-내성마커를 갖는 플라스미드에 PneS1-PreS2-S, PreS2-S 또는 2단백질의 암호영역을 갖는 플라스미드를 높은 비율로 연결시켜서 유전자 복제수를 증폭시키는 방법이다.
플라스미드 pBR322 βG2, POLINK 23456 및 pBIg12.8은 각각 1986년 4월 11일 기탁번호 제67073, 67072 및 67075호로 미국 매릴랜드 로크빌 소재의 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션에 기탁되었고 또한 각각 1986년 7월 4일에 기탁번호 제 KFCC-10231, KFCC-10233 및 KFCC-10232호로 한국종균협회에 재기탁되었다.
다음 실시예들에서, 본 발명의 재조합 DNA 벡터, 숙주 및 입자들의 제조는 물론, 포유동물 세포주내로의 혼힙이 더욱 상세하게 설명된다. 다음의 실시예들은 단지 예를들어 설명하기 위한 목적일뿐 본 발명을 제한하려는 것은 아니다.
실시예
재료 및 절차
A. 포유동물 세포주의 근원 및 설명
1. L-세포
NCTC클론 929는 1940년 더블유. 알. 일레(J.Nat.Cancer Inst, Vol. 4, p165, 1943)에 의해 1940년에 설정된 모균주 L로부터 케이. 케이. 샌포드, 더블유. 알. 일레 및 지. 디. 라이클리(J.Nat.Cancer Inst., Vo1.9, p.229, 1948)에 의해서 1948년 3월에 유도되었다. 모균주 L은 생후 100일된 숫컷 C3H/An 마우스의 정상적인 피하 소성 및 지방 조직으로부터 유도되었고, 클론 929는 모균주의 제95번째 아배양물 세대로부터(단일 세포의 분리를 위한 모세관 기술에 의해서) 설정되었다.
마우스 L세포의 아세포주인 LM(TK-)는 디. 알. 두브스 및 에스.키트(S.Kit et al, Exp. Cell Res., Vo1.31, p.297-312, 1963; 및 D.R.Dubbs & S Kit, Exp Cell Res., Vol. 33, p.19, 1964)에 의해서 분리되었고 티미딘 키나제가 결핍되어 있다. 이 세포주는 HAT를 함유하는 배지에서 성장할 수 없다. 이 세포주에서는 HAF 내성의 자발적인 환원이 전혀 관찰되지 않았으며, 십중팔구를 이 유전자와 연관된 결실이 발생된 것으로 보인다.
조직원에서 유도된 일련의 아배양물의 수 : 648; 클론 553
동결배지 : 배양배지 90% ; DMSO 10% ; 항생물질 없음.
생존율 : 81-96%(염료 배제).
배양배지 : DMEM +10% FBS(Dulbecco's and Vogt's Modified Eagle's Medium+10% FBS).
해빙된 세포의 성장특성 : T-25 플라스크당 상기 배양 배지 5ml에 6-8×105세포들의 접종물은, 배양배지를 매주 두번 갈아주고 공기중 5% 또는 10% 이산화탄소의 습윤혼합물을 유지하면서 pH를 7.3로 조절한다면, 37℃에서 7일 이내에 500배로 증가되었다. 아배양물은 스크레이핑 또는 진탕에 의해 준비한다. 세포는 또한 10%-30% 말혈청으로 보충된 다른 배지(웨이마우스, 이글, NCTC135 배지등)에서 잘 성장한다.
플레이팅 효율 : 70%
형태 : 섬유 아세포유형
세포핵질 : 염색체 빈도 분포 100개 세포 : 2n=40
Figure kpo00002
Figure kpo00003
이차성 협착이 있는 긴 경심의 염색체가 77/100 세포에서 주목된다.
무균성 : 마이코플라스마, 세균 및 진균에 대한 시험은 음성이 있다.
종 : 응집 반응과 혈구응집반응의 복합 시험에서 마우스로 확인됨.
바이러스 감염율 : 광견병공포증 바이러스와 소수포성 구내염(인디안 스트레인) 바이러스에 감염되기 쉬움. 본 세포를 상기 배지에서 배양했을때, 단순포진 B 바이러스 및 백시니아는 일차 계대접종만으로 세포병리학적 효과를 나타냈다. 어떤 비루스에 대한 감염성은 이용한 배지에의해 여러가지로 변화될 수 있다. 폴리오바러스 타입 1, 콕사키 바이러스 타입 B-5 및 폴리오마 바이러스에는 감염되지 않음.
종양발생도 : 마우스 한 마리당 1×106개 세포의 접종물을 마우스에 피하로 주사했다. X-선으로 조사받지 않은 마우스에서, 0/25종양이 생성됐다. X-선이 조사된 마우스(425r,전선)에서는 11/18 종양(육종)이 주사부위에서 생성되었다.
역전사효소 : 양성
입수처 : 본 균주는 미합중국 메릴렌드 로크빌소재의 아메리칸 타입컬쳐 콜렉션으로부터 일반세포주 제ATCC CCL 1로 어떠한 제한없이 이용가능하다.
2. 베로 세포(Vero Cell)
베로 세포주는 정상적이고 성숙한 아프리카 녹색 원숭이의 신장으로부터 1982년 3월 27일에 와이. 야수무아 및 와이, 가와기타에 의해서 일본 시바소재의 시바대학((Nippon Rinsho, Vol. 21, p.1209, 1963)에서 처음으로 분리되었다.
조직원으로부터의 일련의 아배양물의 수 : 121
동결배지 : 비-필수 아미노산과 Earle의 BSS를 가진 최소 필수
배지(이글) 85% : 소의태 혈청 5% ; 디메틸 설폭사이드(DMSO) 10% ; 항생물질 없음.
생존율 : 약97%(염료 배제)
배양배지:DMEM+5% FBS
해빙 세포의 성장특성 : 배양배지를 일주당 3희 갈아주고 공기중의 5% 또는 10% 이산화탄소의 습윤 혼합물을 유지하면서 pH를 7.4로 조절했을때 T-25 플라스크당 상기 배양배지 3ml에 3×105개의 생균 배양물은 37℃에서 7일 이내에 30-배 증가된다. 아배양물은 트립신화에 의해 제조된다.
플레이팅 효율 : 상기 배양배지에서 약 24%
형태 : 상피 섬유아세포와 유사함
세포헥질 : 염색체 빈도분포 50개 세포 : 2n = 60
세 포: 2 1 2 2 3 4 5 7 2 1 17 2 2
염색체 : 47-49 59 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60
무균성 : 마이코플라스마, 세균 및 진균류에 대한 시험은 음성이었다.
종 : 면역형광 시험에 의해 원숭이로서 확인됨.
바이러스 감염율 : 폴리오바이러스 타입 3, 게타(Getah), 엔엔두무(NNdumu), 픽슈나(pixuna), 로스리버(Ross River), 셈리키(Semliki), 파라마리보(Paramaribo), 코코베라(Kokobera), 모독(Modoc), 무루투쿠(Munducu), 게르미스톤(Germiston), 구아로아(Guaroa), 폰골라(Pongola) 및 타카리베 아르보바이러스(Tacaribe Arbovirus)에 민감함. 스트라트포트(Stratford), 아페우(Apeu), 카라파루(Carapam), 마드리드(Madrid), 네퓨요(Nepuyo) 및 오사 아르브바이러스(Ossa Arbovirs)에감염되지 않음.
역전사 효소 : 검출 안됨.
입수처 : 본 세포주는 미합중국 메릴랜드 로크빌소재의 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션으로 부터 일반세포주제 ATCC CCL 81호로 아무런 제한없이 이용가능하다.
3. CHO - KI세포
CHO-KI 세포는 1957년 티. 티. 푸크에 의해서 성숙한 차이니스 햄스터의 난소의 생검으로부터 처음으로 분리된 모 CHO 세포주로부터의 아클론으로서 유도되었다(J. Exp. Med., Vol. 108, p. 945, 1958). CHO-KI 세포는 프롤린요구하며, 형식상의 염색체 20번을 가지고 있다.(Proc. Nat. Acad. Sci, Vol. 60,). 이 세포는 프롤린 합성에 필요한 활성 유전자가 명백히 없으며, 생합성체인의 차단은 글루탐산을 글루탐산 감마-세미알데하이드로 전환하는 단계에서 달성된다.
프롤린 독립에 대한 반전 빈도는 약 10-6이다(Genetics Vol. 55, p. 513, 1967).
조직원으로 부터의 일련의 아배양물의 수 : 약 400 ; ATCC에서 7
동결배지 : 배양배지 92% ; 글리세롤 8% ; 항생물질 없음
생장율 : 약 90%(염료 배제)
배양배지 : F-12 배지(햄) 90% : 소의태 혈청 10% , 항생물질 없음
해빙세포의 성장특성 : 37℃ 하에 상기 배양배지에서 105개 생세포/ml의 접종물은 7일 이내에 15-20재로 증가한다.
플레이팅 효율 : 상기 배양배지에서 약 90%
형태 : 상피와 유사
세포핵질 : 염색체 빈도 분포 50개 페소 : 2n-22
Figure kpo00004
무균성 : 피코플라스마, 세균 및 진균에 대한 시험은 음성이었다.
종 : 세포 독성-항체 염료-배제 시험 및 이소엔자임 분석에 의해 차이니스 햄스터로서 확인됨.
비루스 감염성 : 소수포성 구내염(인디아나 스트레인)과 게타 아르보바이러스에 감염되기 쉬움. 폴리오바이러스 타입2, 모독과 부톤 월리암아르보바이러스에는 감염되지 않음.
역전사효소 : 검출되지 않음.
특별한 특징 : 성장시 프롤린을 필요로 한다.
입수처 : 본 세포주는 미합중국 메릴랜드 로크빌소재의 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션으로부터 일반세포주 제ATCC CCL 61호로 아무런 제한없이 이용가능하다.
4. NIH/3T3 세포
고도의 접촉-억제된 세포의 연속 세포주인, NIH/3T3는 최초의 임의 품종 개량 3T3(ATCC CCL92) 및 등계교배 BALB/3T3(ATCC CCL163)와 같은 방법으로 NIH 스위스 마우스 태아 배양물로 부터 설정됐다. 이 NIH/3T3 세포주는 형질전환 분석에 가장 적합한 형태학적 특징을 갖는 아클론을 개발하기 위해서 연속 5주기 이상 아콜로닝되었다. 이 아클론의 최초 이용 가능한 계대수는 일차 태아 배양물로부터 약 120번째이다. NIH/3T3은 육종 바이러스 명소 형성 및 백혈병 바이러스 증식에 고도로 민감하고 DNA 형질감염 연구에 매우 유용한 것으로 입증되있다(J. Virol., Vol. 4, pp. 549-553, 1969 ; Cell, Vol. 16, pp. 63-75 및 347-356, 1979).
본 세포주는 미합중국 메릴랜드 로크빌소재의 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션으로부터 일반세포주 제ATCC CRL 1658호로 아무런 제한 없이 이용가능하다.
B. 배지, 완충액 및 용액.
1. 포유동물 세포 배양의 경우
a. 돌베고의 변성된 이글 배지, 고도의 글루코스(DMEM).
GIBCO 분말배지를 준비하고 여기에 26mM NaHCO3, 2mM L-클루타민(GIBCC), 1mM Na-피루베이트(GIBCC), 60㎍/ml 겐타마이신 또는 100단위/페니실린 ml+100㎍/스트렙토마이신 ㎍으로 보충하였다.
b. 햄의 F12.
GIBCO 분말배지를 준비하여 14mM NaHCO360㎍/겐타마이신 ml로 보충하였다.
c. 세포 동결 배지.
90%(v/v) FBS-DMEM에 10%(v/v) 디메틸설폭사이드로 보충하였다.
동결 배지는 사용 직전에 제조했다. 모든 배지들은 0.45 내지 0.2 미크론 필터(Gilman)를 통하여 여과살균되었다. 배지의 무균성은 1주간 37℃에서 항생 물질이 없는 배지의 분취량을 배양시켜서 평가하였다. 정지 배양에서 사용한 배지에 10% FBS를 보충하였다. 소의 태 혈청(FBS)은 30분간 56℃에서 가열하여 불활성시켰다. 무균배지는 사용하기전 40℃로 저장했다.
d. 트립신 용액
0.5g/1 트립신+한크의 평형염용액 중의 0.2g/1 EDTA(테트라나트륨). EDTA는 배로 세포에 독성이 있는 것으로 밝혀져있기 때문에, 이들 베로세포에는 EDTA-유리된 트립신용액이 사용된다.
e. PBS(인산염 완충염수, GIBCO) 183mM NcCl
8.6mM Na2HPO4
2.2mM KH2PO4
f. TNE 160mM NaCL
10mM 트리스 pH7.5
1mM EDTA
2. 분자생물학의 경우
a. SDS-PAGE용 용액
아크릴 아미드(용액) 30%(w/w) 아크릴아미드(BioRad)
0.8%(w/w) N'N-메틸렌-
비스아크릴아미드(BioRad)
단리겔용 4 x 완충액 1.5M 트리스-Cl pH8.8
0.4%(w/v) 나트륨도데실설페이트
(SDS)
(Serva)
스페이서 겔용
4 x 완충액 0.5M 트리스-Cl pH6.8
0.4%(w/v) SDS
3 x 시료완충액 22.3%(v/v) 글리세롤
0.03%(w/v) 브롬페놀블루
6.7%(w/v) SDS
10 x 전극완충액 0.25% M 트리스 pH8.2
1.90 M 글리신
1%(w/v) SDS
b. 은 염색용 용액
용액 Ⅰ 50%(v/v) 메탄올
10%(v/v) 아세트산
용액 Ⅱ 10%(v/v) 메탄올
5%(v/v) 아세트산
용액 Ⅲ 10% 글루타르알데하이드
용액 Ⅳ H2O중 20% AgNO3(원료)
용액 Ⅴ 3%(w/v) NaCO3
0.1%(v/v) 포름알데히드
c. 니크 해독용 용액
10 x 반응완충액 500mM 트리스-Cl pH 7.2
100mM MgSO4
1mM DTT
뉴클레오타이드혼합물 100mM 트리스 pH 7.5중의
100mM dGTP
100mM dATP
100mM dTTP
d. 하이브리드화용 용액
20 x SSC 3M NaCl
0.3M Na3-시트레이트
50 x 덴하르트 용액 1%(w/w) 피콜 400(PL-Pharmacia)
1%(w/w) 폴리비닐피롤리돈(Sigma)
1%(w/w) BSA
여과멸균시켜-20℃에 저장됨
예비하이브리드화 혼합물 50%(v/v) 포름아미드
5 x 덴하르트 용액
5 x SSC
50mM Na-인산염 pH7.0
250㎍/ml 변성된 연어 정자 DNA
하이브리드화 혼합물 50% 포름아미드
5 x SSC
20mM Na-인산염 pH 7.0
1×덴하르트 용액
100㎍/ml 변성된 연어 정자 DNA
e. 제한효소용 완충액.
제조업자들의 명세서 또는 :
Figure kpo00005
제한 완충액 :
Figure kpo00006
f. 배지
1. L-육즙 : 10g 박토트립톤
5g 효소추출물
10g NaCl
1리터 H2O
2. L-육즙 한천 플레이트 : 15g/ℓ 디포한천을 함유하는 L-육즙
3. L-육즙-amp 한철 플레이트 : 20-50㎍/ml 앰피실린을 함유하는 L-육즙한천
C. 효소
다음 효소들이 사용되었다 :
1. 데옥시리보뉴클레아제 Ⅰ (Worthington)
2. DNA-폴리머라제 Ⅰ("클레노우-단편") (Boehringer Mannheim)
3. T4-DNA리가제(Boehringer Mannheim)
4. 제한 효소 : EcoR Ⅰ, Xba Ⅰ, BamH Ⅰ, BglⅡ, BstEⅡ, SpeⅠ, SalⅠ, HpaⅠ, SmaⅠ, PvuⅠ, PstⅠ(Boehringer Mannheim, BRL, New England BioLabs)
5. 리소자임(SIGMA)
6. 프로나제
D. 분석 및 정량 절차
1. 염료 결합 검정
본 발명의 정제된 입자제조물에서 총단백질의 농도는 바이오-라드 단백질 검정 키트를 사용하여 측정한다. 이 방법은 브라드포드 검정법, 즉 단백질에 결합하는 쿠마시 블루를 측정하는 분광도계측 수단을 이용한다. 오발부민을 표준물로서 사용한다.
2. 방사능면역 검정(RIA)
NML RIA-125-1 "샌드 위치" 방사능면역 검정에서, B형 간염 표면 항원(항-HBs)에 대한 마우스 항체로 피복된 구슬을 혈청 또는 혈장 및 적절한 대조물과 함께 배양한다. PreS1-PreS2-S 단백질 암호 영역으로부터 발현된 폴리펩타이드를 함유한 입자들은 고체상 항체와 결합한다. 결합되지 않은 물질을 흡입하고 구슬을 세척한후, 인간123I-항-HBs를 구슬상의 항체-항원 복합물과 반응시킨다. 그런 다음, 구슬들을 세척하여 결합되지 않은125I-항-HBs를 제거한다.
구슬상에 잔류하는 방사능을 감마 신틸레이션 계수기에서 계측한다. 분당계수(cpm)가 음의 대조 평균 계수율(NCx)을 어떤 인수로 곱하여 결정한 차단(cut-off) 값보다 크거나 동일한 것으로 나타난 시료들은 활성이 있는 것으로 판단된다.
3. 면역침전법
세포를 T75 플라스크에서 100% 군집으로 성장시킨다. 그 다음 그 배양배지를 400uCi의 L-[35S]메티오닌과 400uCi의 L-[35S]시스테인(NEN)을 함유하는 5ml의 메티오닌-유리 배지로 대치한여 하룻밤 배양시킨다. 그 배지를 폴리에틸렌 글리콜로 분별 침전시켜서 10배로 줄여서 농축시킨다. 농축시킨 당백질(약 106Cpm)을, 50μl의 TEN(10mM 트리스 pH 7.4, 1mM EDTA, 130mM NaCl)-0.5% 트윈 20에 10μl의 예비-면역 기니아피그 혈청을 넣은 것이나 1 및 10μl의 항-HBsAg 기니아피그 혈청을 탄 것으로 37℃에서 1시간 동안 배양시킨다. 그 면역 글로부린을 20μl의 단백질 A-세파로스 Cl-4B(Pharmacia)에 1시간 동안 37℃에서 결합시키고 TEN-트윈 20과 500mM LiCl로 한번 씻고 다시 TEN-트윈 20으로 세척한다. 시료를 아래에서 설명한 SDS-PAGE에서 전기 영동시킨다. 겔을 10% 삼염화-초산, 10% 빙초산 및 30% 메탄올의 용액에 60분간 고정시키고 30분간 빛을 비추어서(NEN)배양시킨다. 겔을 건조하고 코닥 XAR-5 필름으로 자동 방사능 사진을 찍는다.
4. SDS-폴리아크릴 아미드 겔 전기영동(PAGE)
시료와 겔 제조
PAGE에 의한 분석을 위해서, 본 발명의 정제된 입자의 분취물을 10㎍/ml로 조절하였다. 각각의 시료로부터 10μl를 취하여 10% SDS중의 10μl 1M DTT 및 10μl 시료 완충액과 혼합한다. 이 혼합물을 20nm 입자들을 파괴하여 단량체 분자들을 생성하기 위하여 중량하기 바로 전에 5, 10 또는 15분간 끓인다. 10μl의 중량 완충액을 첨가한 후, 그 혼합물을 0.75mm의 두꺼운 슬랩겔(12×18×0.1cm)의 12.5% 폴리아크릴아미드-0.4% 비스아프릴아미드에서 라엠리(1970) 완충액계를 사용하여 15mA 및 100V에서 6시간 동안 전기 영동시킨다. 단백질 띠들은 은염색에 의해서 눈으로 보이게 된다(아래의 은염색 부분 참조).
5. 은염색
PAGE 겔은 메르릴(Merril)등 (1981)에 의한 은으로 염색한다. 단백질을 50% 메타놀 및 10% 초산 용액으로 30분간 겔에서 고정시킨다. 겔을 10% 메타놀 및 5% 초산 용액으로 30분간 세척한다. 10% 글루타르알데히드에서 30분간 배양시킨 후, 겔을 탈이온화된 H2O로 하룻밤 동안 세척한다. 0.1% AgNO3로 30분동안 배양하고 그 겔을 H2O로 잠시 동안 세척을 실시한다. 염색된 겔을 100ml의 3% Na2CO3및 30μl의 포름알데히드에서 현상시켜서 1% 초산에서 고정시켰다. 겔을 플라스틱 백에 밀봉하여 사진을 찍는다.
E. 유전공학적 절차
1. 재조합 DNA 절차
a. 정제된 DNA의 제한효소 엔도뉴클레아제 분해
특정한 엔도뉴클레아제의 제조업자들의 명세서에 의하여
b. 플라스미드 DNA 분리
대규모 CsCl 플라스미드 제조 :
1. L-육즙의 0.5 OD600에 11의 플라스미드-함유 세포를 성장시키고 : 200㎍/ml 클로람페니콜로 12-20시간 더 증식시킨다.
2. 20분 동안, 8000rpm으로 소르발(Sorval RC56)에서 원심 분리한다.
3. pH 8.0인 18ml의 찬 25% 수크로오즈, 50mM 트리스에서 재현탁시킨다.
4. 250ml 엘렌마이어 플라스크에 옮겨서 얼음에 보관한다.
5. pH 8.0인 250mM 트리스에서 6ml의 5mg/ml 리소자임을 첨가하여 10-15분간 정지해둔다.
6. pH 8.0인 6ml의 250mM EDTA을 첨가하여 부드럽게 혼합하여, 얼음에서 15분 동안 배양한다.
7. 0.01% 트리톤 X-100 60mM EDTA, pH 8.0 50mM 트리스, pH 8.0을 혼합한 30ml 세척제를 첨가한다.
8. 30분 동안 얼음에서 배양한다.
9. 4℃로 SW28 축자에서 90분 동안 25,000rpm으로 원심 분리한다.
10. 상등물 유체에 프로나제를 250㎍/ml까지 첨가하고 30분 동안 배양한다.
11. TE(pH 8.0인 10mM 트리스, 1mM EDTA)로 평형된 1/2 용적 페놀로 한번 페놀 추출한다.
12. 수성 층을 제거하고 ; 초산 나트륨을 300mM까지 첨가하고 ; 2용적의 찬 100% 에탄올을 첨가하여 ; 전체적으로 혼합한다. -20℃에서 하룻밤 동안 유지시킨다.
13. 원심 분리하고 ; 6ml TE-100(pH 8.0인 10mM 트리스, 10mM EDTA)에 재현탁시킨다.
14. 9.4g CsCl, 0.65ml의 6mg/ml 에티듐 브로마이드를 가하고 ; 멸균한 이중-증류된 물로 10ml 용적까지 만든다.
15. 베크만 가열-밀봉 가능한 구배관에 채우고 ; 40시간 동안 Ti 70.1 베크만 축차에서 48,000rpm으로 원심 분리한다.
16. UV를 사용하여 플라스미드 띠를 육안으로 확인하고 시린지 및 18게이지 침으로 그 관의 측면을 뚫어서 플라스미드 DNA를 제거한다.
17. 동일 용적의 이소부탄올로 3회 연속 추출하여 플라스미드 단편으로부터 에티듐 브로마이드를 제거한다.
18. pH 7.4인 10mM 트리스, pH 7.5인 1mM EDTA, 10mM NaCl의 하나의 2-리터 양에서 2시간 이상동안 4℃에서 투석시킨다.
19. 상기와 같이 TE로 평형된 1/3 용적 페놀로 한번 페놀 추출한다.
20. NaAc를 300mM까지 가하고, 2용적의 100% 에탄올을 가하여 ; -20℃에서 하룻밤 동안, 또는 -70℃에서 30분 동안 침전시킨다.
c. 니크 해독
니크 해독은 리그비등에 의하여 실시한다(J. Mol. Biol., Vol. 113, pp. 237-251, 1977), DNA의32p-라벨링을 위한 반응 혼합물은 일반적으로, 예를 들면, pH 7.8인 50mM 트리스, 5mM MgCl2, 10mM 메르캅토에탄올, 0.1mM dTTP, 0.1mM dGTP, 0.1mM dTTP, 50uCi32p-dCTO, 10단위 DNA 폴리머라제 I, 3μl의 2×10-5배로 희석한 1mg/ml DNase I으로 이루어진 총용적 30μl중에 0.5㎍의 pDM2의 EcoR I-Xba I 단편을 함유하고 15℃에서 90분간 배양시켜 3×106내지 12×106총 cpm, 즉 1×107내지 5×107cpm/μl의 DNA을 얻는다.
d. 컴피턴트 세균 세포의 형질전환
하룻밤 배양한 농후한 배양물에서, 1ml의 세균 세포 현탁액을 100ml 배양 배지(L-육즙)의 배양용으로 취한다. 세포를 500ml의 엘렌마이어 플라스크에서 격렬하게 진탕시켜서 2시간 이내에 도달되는 OD550=0.7의 농도로 37℃에서 성장시킨다. 10분 동안 얼음에서 그 배지를 냉각시킴으로써 성장을 중단시킨다. 이 배양물로부터, 5분 동안 3000rpm에서 지수 세균 세포를 얻기 위해서 3ml를 취한다. 그 세포들을 pH 8.0인 10mM 트리스중의 50mM CaCl2용액 1.5ml에 재현탁시켜서 다시 15분 동안 얼음에서 배양시킨다. 그 세포들을 5분 동안 3000rpm으로 원심분리하여 다시 한번 수거하고 pH 8.0인 10mM 트리스중의 50mM CaCl2용액 200μl에서 재현탁시켜서, 4℃에서 하룻밤 동안 유지한다.
그후, 연결 혼합물을 pH 7.5인 10mM 트리스, 1mM EDTA로 총 용적 70μl까지 채우고 DNA 침지를 위하여 200μl 세균 세포 현탁액에 첨가한다.
그 혼합물을 30분 동안 얼음에서 배양시킨 다음, 1ml L-육즙을 첨가하고 그 혼합물을 42℃로 2분 동안 및 37℃로 40분 동안 배양한다. 배양 후, 세포들을 플레이트당 세포 현탁액 50μl 이상 내지 300μl 이하의 용적에 앰피실린 50㎍/한천 ml를 함유한 한천 플레이트에 스트리킹하였다. 한천 플레이트를 37℃에서 하룻밤 동안 배양시켰다. 이 배양 기간후, 단일 분리된 세균의 콜로니가 형성되었다.
e. 써던 블롯팅 검정법
본 발명의 벡터(Vector)의 숙주 세포 게놈내에 구조를 특정짓기 위하여, 본 발명의 입자들을 생성하는 세포 주들로부터 염색체 DNA를 분리시켜서 적당한 제한 효소(들)로 분해시키고32p-표지된 DNA 탐침을 사용하는 써던 블롯팅 방법(J. Mol. Biol., Vol. 98, pp. 503-517, 1975)에 의하여 분석한다. 제한 효소 EcoR I 및 Xba I으로 염색체 DNA(20㎍)를 분해시키고, 그 결과 생긴 단편들을 0.7% 아가로오즈 겔 전기용동으로 분리시킨다. 그후, DNA를 10분 동안 366nm UV 광선에 노출시키고 0.5N NaOH 및 1M NacL의 용액에서 45분 동안 배양시킴으로써 변성시킨다. 그 겔들을 pH 7.5인 0.5M 트리스, 1.5M NaCl에서 60분 동안 배양시킴으로써 중화한다. 건성 페이퍼 타월의 원료로 니트로셀룰로즈 여과판의 상부를 덮어서 그 겔을 통하여 20시간 동안 3M NaCl, 0.3M 구연산 나트륨(20×SSC)에 함침시킴으로써 니트로셀룰로즈 여과판에 DNA을 옮겼다. 그 니트로셀룰로즈 여과판을 2시간 동안 진공 오븐에서 80℃로 유지한다.
pDml 플라스미드(4.3kb)의 EcoR I-Xba I 단편으로부터의 방사성 DNA 탐침을 니크-해독에 의해 제조하였다.
DNA 탐침과 하이브리드화시키기 위하여, 니트로셀룰로즈 여과판을 10ml의 예비 하이브리드화 혼합물 : 50% 포롬아미드, pH 7.0인 5×SSC 50mM 인산나트륨, 5 × 덴하르트의 용액, 250㎍/ml 변성된 연어 정자 DNA를 함유한 플라스틱 백에 밀봉하였다. 예비-하이브리드화 혼합물을 하이브리드화 혼합물 : 50% 포름아미드, 5×SSC, pH 7.0인 20mml×덴하르트의 용액, 100㎍/ml 변성된 연어 정자 DNA, 5×105cpm/ml32p-탐침으로 대체한 후, 여과판을 이 혼합물에서 4시간 동안 45℃에서 배양시켰다. 45℃에서 18시간 동안 하이브리드화 혼합물에서 배양시킨 후, 여과판을 10분 동안 60℃에서 건조시키고 두개의 증감지 사이의 X-선 필름(XAR-5, 코닥)에 노출시켜서 -80℃로 유지한다. 첫번째 X-선 필름은 3일간의 노출후에 현상시키고, 두번째 필름은 7일간의 노출후에 현상시킨다. 본 발명의 입자들을 생성하는 형질 감염체로부터의 세포 DNA 제한 단편중 하나에 표지된 DNA 탐침의 하이브리드화는 세포 DNA가 실제로 본 발명의 통합된 벡터를 함유하고 있음을 입증하는 것이다. 세포 DNA 제한 형태는 써던 블롯팅 절차에서 설명한 바와같이, 본래의 플라스미드 구조의 형태와 동일하기 때문에, 플라스미드 DNA의 주요한 재배열은 숙주 세포 DNA로의 통합으로 일어나지 않았다.
2. 포유동물 세포주들의 형질감염과 본 발명의 입자들을 생성하는 클론의 동정
세포를 위글러(Wigler)등의 인산칼슘 침전방법(Cell, Vol. 14, p. 725, 1978)을 사용하여 형질감염시킨다. 그후 세포를 새로운 배양 접시들에 1 : 6으로 분할하고, 약물-내성 마커(neo)를 지닌 세포를 G418-함유 배지에서 성장시킴으로써 선별한다. 선별 배지에서 성장시킨후 10일 경과하여, 약물-내성 콜로니들은 미세역가 플레이트내로 클론닝된다. 본 발명 입자의 발현수준을 그 세포가 배양기 전체에 덮인후 RIA 기술에 의해서 평가한다.
조직 배양 배지(100mm 직경)를 5×105세포로 접종시키고 37℃에서 하룻밤 동안 배양시킨다. 형질 감염시키기 4시간 전에, 배양 배지를 새로운 배지로 대체하였다. 형질 감염시키려는 DNA를 250mM CaCl2, 140mM NaCl, pH 7.1인 25mM Hepes 및 0.75mM NaHPO4를 함유하는 1ml의 용액에 현탁시킨다. 이 인산 칼슘-DNA 침전물을 배양물중의 세포에 첨가한다. 하룻밤 동안 배양시킨 후, 새로운 배지를 그 세포 배양물에 첨가하고 그 세포를 추가의 2일 동안 배양한다.
F. 포유동물 세포의 정지 세포 배양을 위한 절차
액체 질소에서 196℃로 유지한 세포의 앰플은 5분 동안 37℃ 수조에 그 앰플을 놓음으로써 곧 해빙된다. 1ml의 신선하게-해빙된 세포 현탁액을 10ml의 적당한 배양 배지를 서서히 첨가함으로써 희식시킨다. 그후, 세포를 원심 분리하여 수거하고, 10ml의 배양 배지에 재현탁시킨다. 그후, 그 세포들을 원심 분리하여 수거하고, 10ml의 배양 배지에서 재현탁시켜 T25 배양 플라스크에 옮기고, 37℃ 및 5% CO2에 배양기에서 성장시킨다. 이들 조건을 사용하면, 배가 시간은 L-세포 및 CHO 세포가 15 내지 20시간, 베로(Vero) 세포가 30 내지 40시간 범위이다. L-세포 및 CHO 세포는 100% 집락으로 생존 및 증식될 수 있고, 반면에 베로 세포는 100% 집락에서 계대접종된다.
G. ACUSYSTP-P에서 포유동물의 세포 증식과 본 발명의 입자들의 수거를 위한 절차
1. 접종물의 증식 및 제조
세포를 DMEM-10% FBS를 함유하는 T75 플라스크 또는 T150 플라스크에 유지시킨다. 로울러 병(850㎠)을 T-플라스크에서 수거된 10 내지 15×106세포로 접종시킨다. 3 내지 5일 증식시킨 후, 약 109의 총 세포를 6개의 로울러 병으로부터 수거하여 미합중국 미네소타주 미네아폴리스의 엔도트로닉스 인코퍼레이션에서 만든 ACUSYST-P중의 6개 유공 섬유 카트리지(HFC)를 접종하는데 사용한다.
2. ACUSYST-P 배양 및 본 발명의 입자의 수거
접종후, HFC를 ACYSYST-P 배양 시스템에 넣고, 카트리지를 통하여 배지의 유속비율을 50ml/hr로 조절하여 유지시킨다. 배지의 pH PO2, 글루코스 및 락테이트를 매일 분석한다. 2 내지 3주 증식 후, 600ml 유체 용적을 각각의 ACUSYST-P 유공 섬유 카트리지의 모세관의 공간으로부터 매주 2회 수거한다. 본 발명의 입자의 생성물을 방사 면역분석(RIA)에 의하여 분석한다. 냉동은 RIA의 분석가능 활성을 파괴하기 때문에, 정제하기 전에 4℃에서 수확물을 보관한다. 어떤 프로테아제 활성도 아조콜 기질 단백질 분해(SIGMA)에 의해 분석된 이들 조건하에서는 검출할 수가 없다.
3. 정질 검사
a. 세균 및 진균의 존재에 대한 시험
세포 배양 배지에 현탁시킨 ml당 약 5×105세포를 함유하는 세포의 풀(pool)을 세균 및 진균의 존재를 시험한다. 1ml의 세포를 트립티케이스 콩 한천(BBL) 플레이트상에 획선접종(steak)시키고, 또 다른 1ml의 세포를 티오글리콜레이트 배지(DIFCO)에 접종시켜 호기성뿐만 아니라 혐기성 세균의 존재를 시험한다. 균류 혼입을 사보우라우드(Sabouraud)(DIFCO)한천 플레이트상에 1ml의 세포를 획선접종시켜서 분석한다. 이들 시험은 증식 배지의 무균성 및 세포 배양물에 세균 및 진균의 혼입이 없음을 보증하기 위하여 규정 기준으로 수행된다.
b. 마이코플라스마의 존재에 대한 시험 : 형광에 의한 염색
세포의 세포질에 마이코플라스마 DNA의 존재를 형광색소, 훽스트 33258를 사용한 염색 방법에 의해서 측정한다. 이 DNA-염색 염료는 자외선 광선하에 형광을 발하고, 마이코플라스마에 대해 매우 빠르고 민감한 시험을 위한 기준을 제공한다. 이 절차는 50 내지 70%가 집락할 때에 사용되는 시험할 세포들의 커버슬립 배양물과 관련된다. 고정 및 염색후, 카버슬립을 형광 현미경으로 검사한다. 세포질의 형광성은 마이코플라스마의 존재를 나타낸다.
훽스트 33258 비스벤즈아미드 형광색소 용액의 공급물은 자기 교반기를 사용하여 100ml PBS에 5mg을 용해시켜서 만든다. 공급물을 4℃에서 암소에 보관된 0.22um 막을 통해서 여과시킴으로써 멸균하고 사용전에 PBS를 사용하여 1000배로 희석한다. 50 내지 70% 집락이 형성되어 있는 카버슬립 배양물로부터의 배지를 세포로부터 흡입하고 에타놀 : 초산(3 : 1)의 두가지 변화로 4℃에서 고정시킨다. 탈이온수로 한번 세척하고, 이어서 37℃에서 30분 동안 희석된 비스벤즈아미드 형광색소(훽스트-33258)와 함께 배양시켜서 카버슬립들을 탈이온수로 헹구어낸다. 카버슬립을 글리세롤 판(22.2ml의 2.1% 구연산 ; 1ml의 H2O ; 27.8ml의 2.8% Na2HPA4; 50ml의 글리세롤 pH 5.5)을 사용한 슬라이드상에 세포-측면 아래로 올려놓는다.
c. 비루스의 존재에 대한 시험
1) 세포 배양물의 시험
시험 세포는 시험할 세포주의 현탁액으로 접종시킨후 14일 이상의 배양 기간 동안 표준 형태를 검사한다. 또한, 3 내지 5일째에, 및 12일후에 다시, 접종된 시험 배양물의 4% 이상을 세척하고 양 또는 인간의 적혈구를 사용하여 적혈구 협착비루스에 대해 시험한다. 시험은 배양물을 3 내지 4℃에서 30분 동안 배양시키고 다시 34 내지 37℃에서 30분 동안 배양시킨후에 기록한다. 적혈구를 흡수한 비루스-감염된 세포에 대한 시험의 결과는 어떤 비루스 혼입도 없음을 나타낸다.
2) 동물에서의 시험
시험할 세포들을 pH 7.2의 140mM의 NaCl, 2.7mM의 KCl, 8.1mM의 Na2HPO4에 ml당 106의 농도로 현탁시켜 동물들의 상이한 그룹에 접종시킨다. 한 그룹에서, 2배 이상의 새끼 마우스로부터 10마리 이상의 동물들을 접종시킨다. 각 동물에게 0.1ml 세포를 복강내로 0.01ml를 뇌내로 접종시킨다. 그 마우스를 적어도 14일 동안 매일 관찰한다. 시험한지 최초 24시간 후에 죽은 쥐, 또는 질병으로 인하여 희생된 각각의 쥐들은 비루스 감염의 증거를 위해 부검하여 검사한다. 이와 같은 시험은 추가의 5마리 이상의 새끼 마우스의 그룹에게 적합한 조직 현탁액을 뇌내 및 복강내로 접종시키고, 이어서 14일 동안 매일 관찰하는 추가시험을 포함한다. 또한, 무분별 계대 접종은 본래의 24-일 시험후에 생존한 모든 마우스의 유탁된 조직(음성 피부 및 내장)의 단일 풀로부터 만들어진다.
또다른 그룹에서, 또한 10마리의 성숙한 마우스를 접종시킨다. 각각의 동물에게 복강내로 0.5ml의 세포를, 뇌내로 0.03ml의 세포를 접종시킨다. 그 동물들을 4주 동안 관찰하고, 병이 나거나 비정상을 나타내는 모든 쥐를 검사하여 병의 원인을 확정한다. 혼입한 비루스의 존재에 대한 동물에서의 시험 결과는 어떤 비루스 혼입도 없음을 나타낸다.
d. 종양 형성에 대한 시험
누드 마우스(nu/nu)를 사용한 종양 형성에 대한 적절한 시험은 0.1ml의 유효한 혈청으로 태어난지 24시간 이내의 20마리 동물을 접종하는 것을 포함한다. 근육내 또는 피하경로로 주사하고 살아있는 2일, 7일 및 14일에 반복한다. 일백만개의 관련 종양 세포들은 관례상 점진적으로 성장하는 종양 및 전이를 생성한다. 대표적인 세포 주중 백만개의 생존 가능 세포들을 발육 종양들이 떨릴 수 있는(손발이 적합함) 어떤 부위에 피하 경로로 접종시킨다. 주사한 부위에서 소결절 형성을 입증하기 위해 21일 동안 그 동물들을 관찰하고, 점진적으로 성장하는지를 결정하기 위해 주기적으로 측정한다. 21일간의 관찰 기간 중 마지막에, 모든 동물들을 희생시키고 주사한 부위 및 임파절, 폐, 신장 및 간과 같은 다른 기관에서 전체적인 종양 형성을 입증하기 위해서 검사한다. 또한, 몇가지 세포주들은 국소 종양성장의 증거 없이 전이를 형성할 수 있기 때문에 모든 동물의 폐 및 국부 임파절을 조직 병리학적으로 검사한다.
이런 시험을 목적으로, 점진적으로 성장하는 종양은 21일간의 관찰 기간에 크기를 증가시키고, 조직 병리학적으로 검사할 경우 생존 가능한 및 유핵분열적으로 활성 접종된 세포들을 나타내는 명백한 소결절로서 정의된다. 고정 또는 퇴행 소결절과 관련된 현미경적으로 생존 가능한 세포들의 존재는 점진적으로 성장하는 종양이라고 생각되지 않는다.
H. 본 발명 입자의 정제
1. 폴리에틸렌 글리콜(PEG)로의 침전
모세관의 공간으로부터의 배지를 ACUSYST-P 배양시스템에서 수거하여 3000ml의 용적에 저장한다. 각 용적에, 180g의 PEG 8000(SIGMA)을 첨가하고, 실온에서 20분 동안 교반하면서 용해시키고 다시 3시간 동안 4℃에서 교반한다. 그 침전물을 GS 3 축자로 500ml의 병에서 4500rpm(3000×g)으로 30분 동안 10℃에서 원심분리하여 수거한다. 그 상등물을 수거하고, 180g의 PEG 8000을 다시 첨가하고 실온에서 상기 설명한 바와같이 용해한다. 그 용액을 추가로 3시간 동안 4℃에서 교반한다. 이 용액에서의 침전물을 60분 동안 9000rpm(15,000×g)으로 원심분리가 수행되는 것외에는 상기된 바와같이 수거한다. 펠릿을 인산염 완충된 염수(PBS) 20ml에 재현탁시킨다.
2. 겔 여과 크로마토그라피
PEG 침전후에 얻고 PBS에 재용해시킨 물질을 4℃에서 비오라드 A-5m 수지를 사용하는 겔 여과 크로마토그라피를 실시했다. 칼럼 크기는 25×1000mm이고, 베드 체적은 480ml이다. 통상의 단편화 작업(run)에 있어서, 10 내지 15ml의 용적에 본 발명의 PEG-침전된 입자 1000㎍을 넣고 3ml 단편에 6방울/분(18ml/시간)의 속도로 PBS 또는 TNE으로 용출시킨다. 제6도는 A-5m 칼럼으로부터 용출된 RIA-분석 가능한 물질의 종단면을 나타낸다. 실선은 각 단편의 280nm 흡광도를 가리키고, 점선은 RIA 결과에서 계산된 물질의 양을 가리킨다.
3. CsCl에서 등밀도 원심 분리
겔 여과 칼럼 크로마토그라피로부터 생긴 첫번째 피크를 덮고 있고 본 발명의 부분적으로 정제된 입자를 함유한 약 30개의 단편을 모은다(약 100ml). 이 용액을 CsCl를 사용하여 1.30g/cc의 밀도로 조절하고 예속하여 SW 27/28 축차(베크만)에 조절한 니트로 셀룰로즈관으로 옮긴다. 구배는 1.35g/cc의 CsCl 용액 4ml를 아래에 놓고 1.25g/cc의 밀도의 4ml 및 1.20g/cc 밀도의 4ml를 위에 놓음으로써 세트한다. 구배를 10℃에서 50시간 동안 28,000rpm으로 작동하고 분류하여, 구배에 상부에 있는 1.20g/cc 밀도 층의 정제된 입자(제7도)를 수거한다. 정제된 입자는 구배의 중앙에 있는 소량의 혼입된 단백질 디로부터 잘 분리된다. 그 용액을 처음에는 물에 대해서, 이어서 염수의 3변화에 대하여 24시간 이상 투석하여 탈염시킨다.
추가의 양 조절 측정으로서, 이 구배-정제된 물질의 일부분을 선형 CsCl-구배 원심분리시킨다. 정제된 입자의 단일 피크는 1.2g/cc에서 예상된 바와 같이 나타난다.
Ⅰ. 본 발명의 정제된 입자들의 보조제의 제조 및 안정성 시험
본 발명의 백신 보조제를 제조하기 위해서, 1/10,000 용적의 티메르졸, 및 1/10 용적의 여과-멸균된 0.2M Al K(SO4)2: 12 H2O를 멸균 염수중의 목적하는 농도의 항원에 첨가한다. pH는 멸균 1N NaOH를 사용하여 5.0으로 조절하고, 그 현탁액을 실온에서 3시간 동안 교반한다. 알룸-침전된 항원을 10분 동안 2000rpm으로 원심 분리하여 회수하고, 1 :10,000 티메르졸을 함유하는 멸균의 표준 염수에 재현탁시키고, 멸균 상태에서 분취한다.
알룸에 흡수된 본 발명의 입자들의 안정성을 측정하기 위해서, 항원은 3% 구연산 나트륨에 알륨을 재용해시키고 이어서 3% 구연산 나트륨 및 PBS에 대해 연속 투석함으로써 회수된다. 그후 본 발명 입자의 양을 PBS-50% 갓난 송아지 혈청중의 정제된 HBsAg 표준물의 희석에 대한 평행성 방사 면역 검정에 의해서 측정한다.
[표 1]
Figure kpo00007
실시예 1
PreS1-PreS2-S 단백질 암호 영역의 폴리펩타이를 포함하는 입자의 발현
A. A. 재조합 플라스미드 pMMT-neo의 제조
플라스미드 pBPV324-12를 제한효소-엔도뉴클레아제 BamHⅠ(제1도 및 재료와 절차 참조)로 분해시켰다. 두개의 DNA 분자가 생성되었고, 한개의 분자(7.95kb)는 소의 유두증 비루스(BPV)의 전체 게놈을 포함하고 ; 다른 하나의 분자(6.65kb)는 세균 플라스미드 pML2("독성 서열"이 결실된 pBR322)의 일부, 마우스의 메탈로티오네인 프로모터(pMMT), 네오마이신 내성 유전자(neo) 및 SV40 PAS-t(제1도 참조)를 포함한다. 그 자체로 연결될때(원형화됨), 플라스미드 pMMT-neo(또한 제5도 참조)가 형성된다.
이 반응은 최종 농도 0.2㎍/μl pBPV342-12 DNA 및 80단위의 BamHⅠ로 37℃에서 4시간 동안, 총용적 400μl 의 반응 완충액(재료 및 절차 참조)에서 실시했다. 분해의 종료는 0.7% 아가로즈 겔(재료 및 절차 참조)에서 아가로즈 겔 전기영동에 의해 체크되었다. 이 반응을 40μl 의 8M LiCl을 첨가함으로써 정지시키고 DNA를 -80℃에서 30분 동안 1ml의 에탄올로 침전시켰다. 침전된 DNA를 100μl 의 pH 7.8인 10mM 트리스에 재현탁시킨다.
B. 천연 프로모터와 함께 전체 PreS1-PreS2-S
단백질 암호 영역을 함유한 단편의 분리
HBV 게놈, 아형 adw의 제조 및 클로닝은 문헌[Cummings, I.W. et al in Proc. Natl. Aca. Sci., U.S.A., Vol. 77, p. 1842, 1980]에 기재되어 있다. 원형 HVB 게놈을 박테리오파아지 람다 gtWES에 클로닝하고 세균 플라스미드에 아클로닝시키는데 독특한 EcoRⅠ부위에서 선형화시켜 플라스미드 pAO1(제2도 참조)을 생성하였다. EcoRⅠ 제한 부위가 PreS1-PreS2-S 단백질 암호 영역내에 있기 때문에, EcoRⅠ 선형의 경우에는 그 단백질 암호 영역이 절단된다. 완전한 PreS1-PreS2-S 단백질 암호 영역을 재생하기 위하여, pAO1중의 3.2kb EcoRⅠ 삽입물을, 200단위의 EcoRⅠ를 함유하는 400μl 의 총용적 반응 완충액(재료 및 절차 참조)에서 37℃로 4시간 동안 100㎍의 pAO1을 분해시켜서, 단리 및 분리시켰다. 3.2kb 삽입 DNA를 예비 0.7% 아가로즈겔 전기영동법(재료 및 절차 참조)에 의해서 플라스미드 DNA로부터 분리했다. 그 DNA를, DNA가 높은 염 용액에서 제거되는 DE 81 왓트만 이온 교환 여과기상의 아가로즈겔로부터, 전기 용출시켰다. 그 DNA를 1회의 페놀/클로로포름 추출과 2회의 에탄올 침전에 의하여 정제하였다. 완전한 HBV 게놈을 암호화한 정제된 선형의 3.2kb EcoRⅠ 단편을 콘카타머 형성을 촉진하기 위하여 고도의 DNA 농도로 자체-연결시켰다 : 30㎍의 EcoRⅠ 단편 DNA를 1.8 단위 T4 DNA 리가제 및 2mM ATP를 함유하는 총용적 50μl 의 반응 완충액에서 15℃로 1시간 동안 및 4℃로 하룻밤동안 연결시키고 ; 그후, 그 DNA를 2회의 페놀/클로로포름 추출, 1회의 클로로포름 추출에 의해서 정제하고, 이어서 2회의 에탄올 침전에 의해서 정제하였다. 펠릿화된 DNA를 pH7.8인 20μl 의 10mM 트리스에 재현탁시키고, 50 단위의 BglⅡ를 함유하는 총용적 50μl 의 반응 완충액(재료 및 절차 참조)중에서 제한효소 BglⅡ로 37℃에서 4시간 동안 분해시켰다.
이 반응으로 생성된 DNA 단편들을 1.5% 아가로즈 겔 전기영동에 의해서 분리시켰다. 표면 항원 폴리펩타이드의 발현에 필요한 천연 프로모터 시스템과 함께, 완전한 PreS1-PreS2-S 단백질 암호 영역을 함유하는 2.78kb 크기의 BglⅡ 단편을 아가로즈 겔에서 분리시켜서 상기한 바와같이 정제하였다(제2도 참조).
C. pMMT-neo 플라스미드에 PreS1-PreS2-S 단백질 암호 영역을 함유하는 단편의 삽입 : pDml의 작제
상기 A단게에서 설명한 바와같이 제조한 DNA 용액에서 1μl 를 취하여, 상기 B단계에서 설명한 5μl 의 2.78kb BglⅡ 단편(0.25㎍/μl )과 혼합하였다.
그 혼합물을 1시간 동안 15℃ 및 하룻밤동안 4℃에서 0.9 단위의 T4 DNA 리가제를 함유하는 총용적 10μl 의 반응 완충액에서 연결 반응시켰다.
세균 세포들, 바람직하게는 HB101을 재료 및 절차에서 설명한 방법에 따른 형질전환 반응에서 DNA을 흡수하기에 적격하게 되도록 만들었다. 그 연결 혼합물을 총 용적 70μl 의 pH 7.5인 10mM 트리스, 1mM EDTA로 만들고, DNA 흡수를 위해 적격한 200μl 의 세균 세포 현탁액에 첨가하였다.
그 혼합물을 30분동안 얼음에서 배양시킨 다음, 1ml L-육즙을 첨가하고 그 혼합물을 42℃에서 2분동안 및 37℃에서 40분동안 배양시켰다. 배양후, 세포들을 플레이트당 50μl 이상 내지 300μl 의 세포 현탁액 용적으로 앰피실린 50㎍/ml를 함유하는 LB 한천 플레이트상에 스트리킹하였다. 그 한천 플레이트를 하룻밤동안 37℃에서 배양하였다. 이 배양 기간후, 단일 분리된 세균 콜로니를 목적하는 2.78kb BglⅡ DNA 단편 삽입체를 함유하는 pMMT-neo 세균 플라스미드의 존재에 대해 스크리닝했다.(제3도 참조)
스크리닝은 선택적으로 콜로니 하이브리드화 절차에 의해 수행되었다. 이 절차를 위해서 단일 콜로니를 이쑤시개로 찝어내어 클론이 동정되도록 격자모양의 LB-엠피실린 함유 한천 플레이트로 옮겼다. 그 플레이트를 37℃에서 하룻밤동안 배양시켰다.
그 콜로니, 니트로셀룰로즈 여과지가 습윤될때까지 한천 표면에 여과판을 올려놓음으로써 니트로셀루로즈 여과지에 옮겼다. 그 여과지를 재빨리 벗겨내고, 계속하여 왓트만 3M 종이의 3개층에 옮겼다. 각 층은 0.5M NaOH, 또는 pH 7.0인 1M 트리스 ; pH 7.4인 1.5M NaCl/0.5M 트리스, 또는 2×SSC에 침윤시켰다. 그 여과지를 세포가 용해되고 이어서 중화 및 고정 단계중에 콜로니 측면 위의 침윤된 종이상에 놓았다.
그 여과지를 대기중에서 건조한 후, 전공에서 80℃로 구웠다. 그후, 니트로셀룰로즈 여과지를 니크-해독(재료 및 절차 참조)에 의하여, 상기 B단계에서 설명한 바와 같이 제조된 PreS1-PreS2-S 단백질 암호영역을 함유하는 2.78kb Bg1Ⅱ 단편으로부터 만들어진 방사능 표지된 DNA 탐침과 DNA 하이브리드화시켰다.
그 니트로셀룰로즈 여과지를 50% 포름아미드 pH 6.6인 20mM 인산나트륨 완충액 ; 1×덴하르트 용액 ; 100㎍/ml 변성된 연어 정자 DNA 및 10분동안 68℃에서 0.2N NaOH에서 용융시킨 1×107cpm32P-표지된 DNA를 함유하는 예비-하이브리드화 혼합물에서 배양시켰다.
그 여과지를 45℃에서 16시간 동안 이 혼합물에서 배양시켰다. 그후, 그 여과지를 2×SSC, 0.1% SDS에서, 각 주기마다 실온에서 5분간동안 2회 세척하고 50℃에서 각 주기마다 15분동안 0.1×SSC, 0.1% SDS에서 2회 세척하였다. 그 여과지를 두 스크린 사이에 X-선필름(바람직하게는 3M)에 -80℃에서 2일동안 노출시켰다.
클론된 2.78kb BglⅡ 단편을 갖는 재조합 플라스미드를 함유하는 콜로니는 점은 반점으로 나타났다. 50개 콜로니중의 4개가 확인되었고 이들 콜로니의 플라스미드 DNA를 문헌[Birnboim and Doly, Nucl, Acids Res., Vol. 7, p. 1513, 1979]에 따라 소형 표본들로 분리시키고, BglⅡ 및 XbaⅠ의 이중분해에 의해서 분석하였다. 이 분석으로 상기 설명된 의도된 작제물을 확인하였다(제3도 참조).
D. PreS1-PreS2-S 단백질 암호 영역의 천연 프로모터를 메탈로티오네인 프로모터로 치환 : pDM2의 작제
상기된 플라스미드 pDml을 20㎍의 플라스미드 DNA를 함유하는 총용적 100μl 에서 제한 효소 BglⅡ 및 BamHⅠ으로 완전히 분해시켰다 : 처음에는 pH 7.8인 6.7mM 트리스 ; 6.7mM MgCl2: 6.7mM β-메르캅토에탄올을 함유하는 반응 완충액에서 50단위의 BglⅡ로 37℃에서 4시간 동안 분해한 다음, 이어서 염농도를 150mM NaCl까지 올리고, 37℃에서 하룻밤 동안 40단위의 BamHⅠ를 첨가하여 분해를 완료하였다. 3개의 단편이 생성되었고, 큰 단편은 5.1kb이고, 중간의 단편은 2.97kb이며, 작은 단편은 1.4kb이었다. 이들 단편을 예비 0.7% 아가로즈겔 전기 영동에 의해서 분리하였다. 이로부터 그(5.1kb 및 1.4kb) 단편들이 DE 81 왓트만 이온 교환 여과지를 사용한 전기 영동에 의해서 분리되었다.
DNA를 4℃에서 4시간 동안 높은 염에서 배양시켜 여과지로부터 제거하고, 페놀/클로로포름 추출과 2회의 에탄올 침전에 의해 정제하였다. DNA를 pH 7.8인 20μl 의 10mM 트리스에 재현탁시켰다. 1μl 을 사용하여 아가로즈젤 전기영동에 의한 정량 평가 및 순도를 측정하였다.
BglⅡ 말단에 메탈로티오네인 프로머트를 함유하는 큰(5.1kb) 단편을 그 유전자의 천연 프로머터 또는 PreS1부분이 아닌 PreS2-S 단백질 암호 영역을 함유하는 작은(1.4kb) 단편과 결합시켰다. 큰 단편은 또한 B형 감염 PreS2-S 단백질 암호 영역(또한 제4도 참조)의 발현을 위해 필요한 천연 종결-폴리아데닐화 시그날(hb-PAS-t)을 함유하였다.
또한 큰 단편이 세균 플라스미드를 함유하기 때문에, 이 단편의 자가-결합은 작은 크기의 BamHⅠ 단편을 결합하지 않고 그 자체로 일어날 수 있다. 따라서, 큰 단편의 총 20μl 조제물중 10μl 를 28단위의 알카리성 포스포타제로 처리하고, 37℃에서 20분동안 배양시켰다. 1μl 의 50mM EGTA를 첨가하고 68℃에서 10분동안 배양시켜서 반응을 중단시켰다. DNA를 0.8M LiCl에서 2회 에탄올 침전시켜 정제하였다.
펠릿화된 DNA를 pH 7.8D인 10μl 의 10mM 트리스에 재현탁시키고, 이중 5μl 을 대조물로 취하여 자가-결합에 대해 조사하고 또다른 5μl 를 5μl 의 전기용출된 작은(1.4kb) BamHⅠ 단편과 혼합시켰다. 각 시료의 결합은 상기 설명한 바와 같이 20μl 의 총용적에서 수행되었다. HB101 세균 세포에 대한 형질전환을 상기와 같이 수행하였다.
12개의 단일 콜로니를 취하여 2ml 배양물로 증식시키고 플라스미드 DNA를 상기의 비른보임 및 돌리의 방법에 따라 분리시켰다. 플라스미드 DNA를 제한효소 EcoRⅠ+XbaⅠ로 이중 분해시켜 작은 크기의 BamHⅠ 단편의 삽입 및 방향에 대하여 조사하였다.
12개의 플라스미드 DNA중 두개가 메탈로티오네인 프로머터와 같은 방향에서 삽입된 작은(1.4kb) BamHⅠ 단편을 함유하였다.
이들 플라스미드 DNA들은 진핵 세포에 공동-형질감염시킬 목적으로 대규모 배양물로 증식 제조하였다.
다른 방도로, pDml중의 PreS2-S 단백질 암호영역의 앞에 짧은(32.b.p) EcoRⅠ-BamHⅠ단편을 메탈로티오네인 프로모터를 갖는 플라스미드 pMMT-neo로부터의 EcoRⅠ/BglⅡ(1.9kb) 단편으로 대체하여 플라스미드 pDM3를 제조하였다(제5도).
E. 포유동물 세포들에, 상기 C 및 D단계에서 수득된 재조합 DNA 벡터의 도입과 본 발명의 입자들을 생성하는 세포주의 설정
재조합 플라스미드 pDml 및 pDM2를 표준 형질감염 절차[Graham and van der Eb, Virology, Vol. 52. 52, p. 456, 1973](재료 및 절차 참조)에 의해 마우스 L 세포, 베로(아프리카 녹색 원숭이)세포, CHO 세포 및 3T3 마우스 섬유아세포에 공동-형질 감염시켰다. 플라스미드 DNA을 함유하고 유지한 세포는 약제 G428에 내성이 있고 이 약제를 함유하는 선택배지에서 생존한다. DNA를 함유하지 않는 세포는 선택배지에서 생존하지 못한다. 이들 세포는 배양 플레이트의 표면상에 단일 클론으로 검출된다. 세포를 클로닝 시린더로 피킹하고, 일반적인 영양 배지, 예컨대 10% 송아지 혈청 및 500㎍ G418/ml로 보충시킨 둘베코의 변형된 이글 배지에서 통상의 방법으로 대규모 배양물로 증식시켰다(재료 및 절차 참조). 이들 클론중 5개를 세포주로 설정하고, EMDO-Ⅰ, -Ⅱ, -Ⅲ, -Ⅳ 및 -Ⅴ로 지정하여, 냉동 스톡을 제조하였다(재료 및 절차 참조). 정지 배양물에서 이들 세포주들의 생성 속도를 방사능 면역분석법에 의해서 측정하고 (RIA : 재료 및 절차 참조), 공지된 세포주의 생성 속도와 비교하였다. 평균적으로, 본 발명에 따른 세포주는 1일에 배양 배지의 ml당 본 발명의 입자 500ng 내지 1,000ng을 생성했다.
F. 본 발명의 입자들은 생성하는 세포주들의 Acusyst-P 배양
6개의 로울러 병(재료 및 절차 참조)중의 DMEM+10% FBS에서 증식된 약 109개의 총 세포를 Acusyst-P 배양 시스템(재료 및 절차 참조)에 있는 6개의 유공 섬유 카트리지를 접종하는데 사용하였다. 약 600ml 용적의 유체를 각각의 Acusyst-P 유공 섬유 카트리지의 모세관 공간으로부터 1주일에 2회 수거하고 정제하기 전에 4℃에서 저장하였다. 본 발명 입자들의 농도를 RIA(재료 및 절차 참조)로 분석하였다.
G. Acusyst-P 배양 배지로부터 본 발명 입자의 정제
신규 세포주에 의해 생성된 PreS1-PreS2-S 단백질 암호 영역으로부터 발현된 단백질들을 함유하는 입자들을 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 침전, 겔 여과 및 CsCl 구배중에서 등밀도 초원심 분리에 의해서 정제하였다(아래 참조).
1. 폴리에틸렌 글리콜(PEG)를 사용한 침전
모세관의 공간으로부터의 배지를 Acusyst-P 배양 시스템에서 회수하여 3000ml 용적으로 모았다. 각각의 용적에 180g의 PEG 8000(시그마사)를 첨가하고, 20분동안 실온에서 교반시키면서 용해하고, 추가로 4℃에서 3시간 동안 교반하였다. 침전물을 GS 3 축자에서 4500rpm으로(3000×g) 30분동안 10℃에서 500ml 병에서 원심 분리하여 수거하였다. 상등물을 수거하고 180g의 PEG 8000을 다시 첨가하여 상기 설명한 바와 같이 실온에서 용해시켰다. 용액을 추가로 3시간 동안 4℃에서 교반하였다. 이 용액으로부터의 침전물은 원심 분리가 60분동안 9000rpm(15,000×g)에서 수행된 것을 제외하고는 상기 설명한 바와 같이 수거되었다. 펠릿을 20ml의 인산염 완충된 염수(PBS)에 재현탁시켰다.
2. 겔 여과 크로마토그래피
PEG 침전 후 수득하여 PBS에 재용해시킨 재료를 바이오라드(BioRad) A-5m 수지를 사용하여 4℃에서 겔 여과 크로마토그래피시켰다. 칼럼 크기는 25×1000mm이었고, 베드 체적은 480ml이었다. 전형적인 분별 작업에 있어서, 10 내지 15ml의 용적에 1000㎍의 PEG-침전된 본 발명의 입자를 넣고, 3ml의 분획중에 6방울/분(18ml/시간)의 속도로 PBS 또는 TNE로 용출시켰다. 제6도 A-5m 칼럼으로부터 용출된 본 발명 입자의 프로파일을 나타낸다. 실선은 각 단편의 280mm 흡광도를 가리키며, 점은 RIA에 의해 계산된 각 분획중에 본 발명 입자의 양을 가리킨다.
3. CsCl에서의 등밀도 원심분리
겔 여과 칼럼 크로마토그래피로부터 생긴 첫번째 피크에 해당하고 본 발명의 부분적으로 정제된 입자들을 포함하는 약 30개의 분획(제6도 참조)을 모았다(약 100ml). 이 용액을 CsCl로 1.30g/cc로 조절하고 이어서 SW 27 또는 SW 28축차(백크만)에 고정시킨 니트로셀룰로즈 관으로 옮겼다. 1.35g/cc의 CsCl 용액 4ml를 아래에 놓고 1.20g/cc 4ml 및 1.25g/cc 4ml를 위에 놓아 구배를 셋팅하였다. 구배를 28,000rpm으로 50시간 동안 10℃에서 작동하고 분류시켜서, 구배의 상부에서 1.20g/cc 밀도 층중의 정제된 항원을 수거하였다. 본 발명의 입자는 구배의 중앙에 소량의 혼입 단백질 띠로 잘 분리되었다(제7도 참조). 그 용액을 24시간에 걸쳐 염수를 3회 변화시켜서 투석함으로써 탈염시켰다.
정질 측정으로서, 이 구배-정제된 재료의 일부를 선형 CsCl-구배 원심 분리시켰다. 본 발명 입자의 단일 피크는 1.2g/cc에서 예상한 바와 같이 나타났다.
H. 세포주들에 의해 생성된 본 발명 입자들의 특성화
본 발명 입자들의 폴리펩타이드의 순도 및 물리적 동질성은 방사능 면역분석, 면역 침전 및 SDS-PAGE(재료 및 절차 참조)와 같은 통상의 실험 기술에 의해 입증되었다.
1. 순도 측정
a. 혈장 단백질 오염물의 수준 측정
본 발명의 정제된 입자 제제에서 여러가지 혈청 단백질의 수준은 소의 혈청 알부민, IgA, IgG, IgM 등에 대하여 특수한 항체를 사용한 표준 RIA 기술에 의하여 평가되었다. 표2에서 도시된 결과는 어떤 검출가능한 면역글로블린 오염물이 없음을 나타내며 소량의 알부민 오염물만을 나타낸다.
[표 2]
Figure kpo00008
b. 도트-블롯팅(dot-blot) 방법에 의한 본 발명 입자의 정제된 제제내의 숙주 세포오염물 또는 PreS1-PreS2-S 헥산 서열오염물의 수준 측정
PreS1-PreS2-S DNA 서열오염물 또는 숙주 염색체 DNA 서열오염물을 조사하기 위하여 본 발명의 정제된 입자상에 도트-블롯팅 하이브리드화를 수행한다. 각 반점에 대하여, 40μl 의 0.25N NaOH중의 본 발명의 정제된 입자 100ng 양을 10분동안 68℃에서 가열시켰다. 정량 대조로서, 40μl 의 0.25N NaOH중의 본 발명의 재조합 플라스미드 pDml DNA 20Pg를 동일한 방법으로 처리하였다. NaOH에서 변성후 즉시, 그 용액을 니트로셀룰로즈 여과지상에 짐적하였다. 여과지의 추가 처리 및 하이브리드화 절차들은32 :P-표지된 탐침이 PreS1-PreS2-S 단백질 암호영역을 함유하는 본 발명의 염색체의 DNA 및 플라스미드 DNA의 50 : 50의 혼합물이라는 것을 제외하고는 써던 블로팅 절차에서 설명한 것과 동일하다. 예상된 바와 같이, 교잡 탐침은 본 발명의 재조합 플라스미드 DNA과 강력한 시그널을 나타내지만, 정제된 입자 제조물과는 약한 후 시그날을 나타낸다. 이 교잡 형태는 시료중에 어떤 PreS1-PreS2-S DNA 또는 염색체 DNA도 없음을 나타낸다.
2. 면역 침전 및 SDS-폴리아크릴아미드 겔 분석
본 발명의 형질감염체에 의하여 생성된 PreS1-PreS2-S 폴리펩타이드의 형태를 측정하기 위하여, 그 형질감염체에 의해 생성된 단백질을 생합성적으로 표지하고, 면역 침전시켜서 SDS-PAGE 겔(재료 및 절차 참조)에 의해서 분석하였다. 천연적으로 유도된 HBV에 대한 항체로 면역 침전시켜서 배양 배지에서 분리시킨 단백질의 전기 영동 모형은 은 염색 절차로 눈에 보이게 하였다. 두개의 주된 단백질은 S 단백질 암호영역으로부터 발현된 비당화된 및 당화된 폴리펩타이드에 상응한다(각각, 24kd 및 27kd).
소량의 두개의 33kd 및 36kd 단백질은 PreS1-S 단백질 암호 영역으로부터 발현된 두개의 폴리펩타이드에 상응한다. 이 방법은 PreS1-PreS2-S 폴리펩타이드를 함유하는 소량의 폴리펩타이드를 검출하기에 충분히 민감하지 않으나, 전체 PreS1-PreS2-S 단백질 암호 영역으로부터 발현된 단백질의 존재는 웨스턴 면역블로팅 방법(하기 참조)에 의해 검출된다. 겔의 상부에 있는 약한 띠는 응집된 단백질에서 생겨난 것이며, 또한 천연적으로-유도된 HBV 입자들로 육안 확인이 가능하다. 따라서, PreS1-PreS2-S 단백질 암호영역으로 형질 감염된 세포들은 천연 생성물에 대한 항체와 반응할 뿐만 아니라, 또한 크기에 있어서도 동일한 단백질들을 분비한다. B형 간염 비루스로부터의 천연 당화된 PreS1-PreS2-S, PreS2-S 및 S 폴리펩타이드와 크기가 동일한 단백질의 존재는 글리코실화 경로가 이들 세포들에서 정상적으로 작용함을 시사하는 것이다.
3. 면역 블로팅 방법(웨스턴)
은 염색된 SDS-PAGE 겔 시스템에 나타나는 폴리펩타이드 종류들의 각각이 특이적 항-HBV 항체와 반응한다는 것을 입증하기 위해서, 웨스턴 면역블로팅 방법을 사용했다. SDS-PAGE에서 분리된 단백질을 4℃에서 100V로 3시간 동안 전기블로팅(바이오라드)시켜서 니트로셀룰로즈 여과지(Schleicher & Schull)로 옮겼다. 옮긴 후, 여과지를 페록시다제-표지된 항체의 비특이적 결합을 피하기 위하여 단백질로 포화시킨다. 이것을 수행하기 위하여, 여과지를 PBS중의 20% 갓난 송아지 혈청에서 실온으로 1시간 동안 배양시키고, 본 발명입자의 폴리펩타이드를 페록시다제와 결합된 HBV-특이성 항체에 의하여 육안 확인 가능토록 하였다. 여과지를 파라필름에 놓고 3시간 동안 실온으로 젖은 습윤 챔버에서 결합된 항체의 용액으로 덮었다. 여과기를 10mM 트리스 및 5mM CaCl중의 0.5% 트윈으로 6회 세척하고, 계속하여 색소원, 구연산염-인산염 완충액중의 과산화수소(0.3g/l)에 POD(O-페닐렌디아민디하이드로클로라이드)를 사용하여 덮었다. 정지 용액은 0.5N 황산이다. 모두 6개의 비루스 폴리펩타이드에 상응하는 단백질 띠, 즉, PreS1-PreS2-S 단백질 암호영역으로부터 발현된 모든 단백질이 나타나다.
4. 본 발명의 입자를 포함하는 PreS1-PreS2-S 단백질 암호 영역으로부터 발현된 정제된 단백질의 아미노산 조성
산 가수분해한 후, PreS1-PreS2-S 단백질 암호 영역으로부터 발현된 정제된 단백질의 아미노산 조성을 결정하고 S 단백질 암호영역, PreS2-S 단백질 암호영역 또는 PreS1-PreS2-S 단백질 암호영역의 뉴클레오티드 서열로부터 계산된 폴리펩타이드 조성과 비교하였다. 표3에 제시된 결과는 DNA 서열로부터 예상된 값뿐만 아니라 공지된 결과(Shiraishi et al, J. Gen. Virol., Vol. 48, p. 31, 1980]와의 상호 관계를 나타낸다. 특히, 세린, 프롤린 및 루이신의 비교적 높은 퍼센트는 이들 폴리펩타이드의 특징이다.
[표 3]
Figure kpo00009
Figure kpo00010
* 트립토판은 산가수분해 과정에서 상실된다.
I. 본 발명의 정제된 B형 간염 입자들의 전자현미경에 의한 검정
전자현미경으로, 본 발명의 정제된 입자들은 B형 간염 S 단백질 폴리펩타이드의 응집에 의하여 전형적으로 형성된 것들과 유사한 구형의 22nm 입자들로서 가시화되었다.
J. 본 발명의 정제된 입자들의 보조제의 제조 및 안정성 시험
본 발명의 백신의 보조제를 제조하기 위해서는, 1/10,000 용적의 티메로솔, 및 1/10 용적의 여과-멸균된 0.2M A1 K(SO4)2:12H2O)를 멸균 염수중의 목적하는 농도의 항원에 첨가한다. 멸균된 1N NaOH를 사용하여 pH 5.0으로 조절하고, 현탁액을 3시간 동안 실온에서 교반한다. 알룸-침전된 항원을 10분 동안 2000rpm으로 원심분리하여 회수하고 1:10,000 티메로솔을 함유하는 멸균의 표준 염수에 재현탁시키고, 멸균 조건하에 분취한다.
알룸에 흡수된 본 발명 입자의 안정성을 측청하기 위하여, 항원을 3% 구연산 나트륨에 알룸을 다시 용해시키고, 이어서 3% 구연산 나트륨 및 PBS에 대해 계속 투석하여 회수한다. 그 후, 본 발명 입자들의 양을 PBS-50% 갓난 송아지 혈청에서 정제된 표준 희석액에 대하여 일련으로 방사능 면역분석으로 측정하였다. 안정성 시험 결과(표 4)는 정제된 입자(벌크입자 또는 알룸-흡수된 입자)가 7개월 이상동안 2°∼8℃에서 안정적임을 보여준다.
[표 4]
Figure kpo00011
Figure kpo00012
K. 본 발명 입자들의 혈청 전환 및 ED50
혈청 전환 시험은 5개 그룹의 열마리 성숙한 흰마우스로 수행한다(제8a도, 제8b도 및 제8c도). Gm 암컷 ICR 스트레인 스위스 마우스에 1/1(5.0㎍), 1/4(1.3㎍), 1/16(0.31㎍), 1/64(0.16㎍) 및 1/256(0.078㎍)의 희석비율로 본 발명의 입자들을 함유하는 1㎖의 알룸 보조제 백신을 피하 주사하였다. 28일 후 마우스의 혈액을 채취하고, HBIG 표준과 비교하여 AUSAB 시험에 의하여 항체 역가를 징량하였다. 각각의 동물로부터의 혈청 시료를 연속적으로 4배로 희석시키고, 3중으로 시험하였다.
양성 혈청형을 나타내는 마우스의 백분율은 본 발명의 입자들의 증가되는 희석비율에 비례하여 감소하였다. 혈청양성 반응결과를 나타내는 용량(ED55)은 본 발명의 입자들을 함유하는 약 0.05-0.25㎍의 백신이다. 일반적으로, 본 발명의 백신으로 수득된 혈청전환 결과는 천연적으로 유도된 백신으로 수득된 결과와 차이가 없다.
실시에 2
PreS1-PreS2-S 단백질 암호영역으로부터의 발현된 폴리펩타이드를 함유하는 입자의 발현
A. 제조합 플라스미드 pENDO-1의 제조
pBg1II2.8, pBR322.βG2(문헌[Tilghman, S. M. et al, Proceeding Natl. Acad. Sci., Vol. 75, p. 725. 1978]에 기재된 플라스미드 pMBq.βG2로부터 유도된 7kb EcoRIβG2 단편을 PBR322의 EcoRI 부위에 아클로닝시켜서 제조된 플라스미스), DM2, POLINK 23456(아래참조) 및 pMMT-neo 플라스미드로부터의 유전자 서열을 사용하여 비-HPV 비루스 게놈이 존재하지 않는 재조합 발현 벡터를 생성한다.
제9a도 및 제9b도에서, pBg1II 2.8 플라스미드는 PreS1-PreS2-S 단백질 암호영역을 함유하는 유전자단편(1.34kb BstE II-HHpa I 단편)을 포함하고, PreS2-S 단백질 암호영역의 전사를 위한 강력한 천연프로모터를 지니고 있지만, PreS1-PreS2-S 단백질 암호영역의 전사를 위한 약한 천연프로모터는 물론, 전사 종결 기능 및 폴리아데닐화 시그날은 없다. 플라스미드 pBg1 II 2.8을 BstE II 및 Hpa I로 분해시켜 두개의 DNA 단편을 생성한다. 단편을 3.5% 폴리아크릴아미드 겔 전기영동법을 분리한후, PreS1-PreS2-S 단백질 암호영역을 함유하는 단편중의 하나(1.34kb)를 정제하였다. Hpa I 말단은 비접착성이다. BstE II 말단을 통상의 기술에 의해 DNA 폴리머라제 I(클레노우 단편) 및 4개의 dNTP를 사용하여 채움으로써(이중가닥으로 만듬) 두개의 비접착성 말단을 가진 DNA 단편을 생성하였다.
아래의 폴리링커 영역내에 함유된 다수의 제한 부위들을 갖는 폴리링커 플라스미드, 즉 POLINK 23456이 사용되었다.
Figure kpo00013
폴리링커의 어댑터는 pBR328의 EcoR I-Sal I 골격단편(3.1Kb)내애 함유되어 있다.
POLINK23456을 Hpa I로 분해시켜 선형으로 만들었다. 이와같이 선형화된 플라스미드는 두개의 비접착성말단을 지니고 있다. 그런다음, 선형 플라스미드이 비접착성말단에 pBgl II 2.8 플라스미드로부터 수득된 PreS1-PreS2-S 단백질 암호영역을 함유하는 1.34kb DNA 단편을 연결시킨다. 1.34Kb 단편은 폴리링커플라스미드에 어느 방향으로든 결합될 수 있기 때문에, 정확한 방향(천연적인 전사 방향에 대해 시계방향)은 EcoR I으로 분해하고, 이어서 1% 아가로즈 겔에서 크기 분석함으로써 확인한다. 정확한 방향으로 PreS1-PreS2-S 단백질 암호영역을 지닌 플라스미드를 EcoR I으로 분해시켰을때 두개의 단편 0.4kb와 4.1kb가 생성된다. 그러나 부정확한 방향의 경우에는 1.0kb와 3.5kb의 두개 단편이 생성된다. 이어서, PreS1-PreS2-S 단백질 암호영역을 함유하는 새로운 플라스미드를 Hpa I로 분해시키고 BamH I으로 부분적으로 분해시킨다. HpaI 과 BamH I 제한 부위사이의 짧은(24개 염기) 서열을 Hpa I-BamH I "부분"골격(5.0kb)으로부터 분리하고, 완전히 분해됐을때 생성된 반응 혼합물중의 단편과 함께 버렸다.
pBR322.βG2 플라스미드를 Bgl I(비접착 말단) 및 Bgl II(접착 말단)으로 분해시켜서 마우수의 글로빈유전자로부터 mg-PAS-t 폴리아데닐화-종결 서열을 함유하는 유전자 서열(1.6kb)을 얻는다. 그 다음, mg-PAS-t 단편을 앞서 수득한 개방된 Hpa I-BamH I 선형 플라스미드, Bgl I-Hpa I 및 BglII-BamH I에 연결시켜서(BglII과 BamH I "접착성"말단은 동일하고 따라서 서로 양졉할 수 있으며 서로 연결되기에 적합하다) PreS1-PreS2-S 단백질 암호영역과 mg-PAS-t 서열이 정확한 방향 및 순서로 함유된 새로운 중간체 재조합 플라스미드(6.0kb)를 형성한다. 이어서, PreS1-PreS2-S 단백질 암호영역과 mg-PAS-t가 함유된 플라스미드를 Bgl II 및 Sal I으로 분해하고 1% 아가로즈 겔 전기영동하면 두개의 DNA 단편(2.9kb 및 3.05kb)이 형성된 것으로 확인된다. PVu I로 3.05kb 단편을 분해시켜 두개의 작은 단편(1.08kb 및 1.98kb)를 생성하고, 이어서 융합된 PreS1-PreS2-S 단백질 암호영역/mg-PAS-t 단편이 함유된 2.95kb Bgl II-Sal I DNA 단편(Pvu I 부위 함유하지 않음)을 정제한다.
실시예 1 A단계(제9도 참조)에서 얻은 6.65kb 단편의 플라스미드 pMMT-neo를 Bgl II 및 Sal I으로 분해시켜 두개의 DNA 단편(4.23kb 및 2.42kb)을 생성한다. 네오마이신 선별마커 및 SV40 PAS-t를 함유하는 2.42kb 단편을 버린다. 남아있는 4.23kb 단편을 0.8%의 아가로즈 갤전기영동하여 정제한 후 앞서 수득된 Bgl II-Sal I 2.95kb PreS1-PreS2-S 단백질 암호영역/mg-PAS-t DNA 단편과 연결시켜 MMT-프로모터, PreS1-PreS2-S 단백질 암호영역 및 mg-PAS-t 폴리아데닐화 및 종결 서열을 차례로 함유하는 7.15kb 제조합 플라스미를 형성한다. 이 플라스미드를 pENDO-1로 명명하였다. pENDO-1플라스미드는 비-HBV 비루스 게놈을 전혀 포함하지 않는다(제9도 참조).
B. 재조합 플라스미드 pENDO-2의 제조
제10도에서, MMT-프로머터, PreS1-PreS2-S 단백질 암호영역 및 단백질 X 암호영역을 포함하는 pDM2를 제한효소 Spe I 및 Sal로 분해시켰다. Spe I 제한부위는 PreS2-S 단백질 암호영역의 S 단백질 영역내에 존재하고 Sal I 하향부위와 함께 pDM2에서 유일하다. 이들 두 효소로 플라스미드 pDM2를 분해시켜 두개의 DNA 단편(1.58kb 및 4.88kb)을 생성한 다음, PreS2-S 단백질 암호영역의 카르복시 말단 및 단백질 X 암호영역이 함유된 1.58kb 단편은 버리고 4.88kb 단편은 정제한다.
pENDO-1 플라스미드를 또한 Spe I 및 Sal II로 분해시켜 두개의 DNA 단편 1.9kb와 5.25kb를 얻는다. PreS2-S 단백질 암호영역의 S 단백질 영역의 카르복시 말단과 mg/PAS-t 영역이 함유된 1,9kb 단편을 정제한다.
그후 두개의 DNA 단편 1.9kb와 4.88kb을 연결시켜 pENDO-2로 명명된 새로운 재조합 플라스미드(6.8kb)을 생성하였다. 이 플라스미드 MMT-프로모터, PreS2-S 단백질 암호영역 및 mg-PAS-t 서열을 함유한다. 플라스미드 pENDO-2는 비-HBV 비루스성 게놈을 함유하지 않는다(제10도 참조).
C. 재조합 플라스미드 pENDO-0의 제조
네오마이신 선별 마커를 함유하는 pENDO-0으로 명명된 제3의 새로운 플라스미드는 다음과 같이 제조한다(제11도). 실시예 1단계 A에서 수득된 6.65kb의 플라스미드인 pMMT-neo를 제한효소 Sma I(비접착말단) 및 BamH I로 분해시켜 두개의 DNA 단편 5.5kb와 1.15kb을 형성한다. 5.5kb 단편은 pMMT-neo 플라스미드 골격으로부터 유래된 네오마이신 선별마커 및 MMT-프로모터를 함유한다. pENDO-1의 제조에서 기술된 바와 같이 Bal I-Bgl II mg-PAS-t 서열을 함유하는 DNA(1.6kb) 단편을 상기 5.5kb단편과 결합시킨다. 그 결과 생긴 7.2kb 재조합 플라스미드 pENDO-0는 MMT-프로모터, 네오마이신 선별마커 및 mg-PAS-t 서열을 함유하고 비루스 DNA 서열은 함유하지 않는다(제l1도 참조).
D. 플라스미드 백터 pENDO-0, pENDO-1 및 pENDO-2를 공동형질감염에 의하여 포유동물 세포내에 도입
재조합 플라스미드 벡더 pENDO-0, pENDO-1 및 pENDO-2를 마우스 L-세포, 베로(아프리카 녹색원숭이)세포, CHO 셰포 및 3T3 마우스 섬유아세포들과 같은 포유동물 세포내로, 표준 공동형질 감염방법을 이용하여, 공동형질감염시킨다. G418-내성 형질감염체를 분리하고 RIA방법을 사용하여 본 발명의 입자를 생성하는 형질감염체를 스크리닝한다.
E. 세포주의 형질감염을 위한 pENDO-0, pENDO-1, pENDO-2 플라스미드 DNA의 혼합된 콘카타머의 제조
플라스미드 pENDO-1, pENDO-2, 및 pENDO-0 각각은 EcoR I 제한부위에 시계반대방향으로 Amp유전자내에 존재하는 유일한 제한부위의 PVu I을 함유하고 있다(제9, 10 및 11도 참조). 이들 각각의 플라스미드를 PVu I로 개별적으로 분해시켜 선형으로 만든다. 그 다음, 이들 플라스미드를 중합화하여 상이한 플라스미드의 여러가지 비율로 혼합된 콘카타머(concataer)를 형성한다. 예를들어, T4DNA 리가제와 같은 리가제를 사용하여 선형화된 pENDO-1 및 pENDO-0 플라스미드를 중합시켰을때 선형화 플라스미드의 비율이 10:1(pENDO-1:pENDO-0)이라면 10:1 pENDO-1:pENDO-0의 비율로 혼합된 콘카타머를 형성할 수 있다. pENDO-1/pENDO-0 혼합된 콘카타머 생성물을 포유동물 세포와 같은 진핵세포내로 형질감염시키고 G418로 선별한다. 평균적으로 G418-내성(형질 감염된) 세포마다 neo 유전자의 한개 복제물당 PreS1-PreS2-S 단백질 암호영역의 약 10개 복제물을 함유한다.
이와 유사하게, pENDO-0 단편을, T4DNA 리가제와 같은 리가제에 의해서, pENDO-2 단편과 10:1pENDO-2:pENDO-0의 비율로 연결시켜 pENDO-2/pENDO-0 혼합된 콘카타머를 형성한다. 그런다음, 콘카타머를 포유동물 세포와 같은 진핵 세포에 형질 감염시키고 G418로 선별한다. 평균적으로 각각의 G418-내성(형질감염된) 세포는 pENDO-1 10개 복제물과 pENDO-0 한개복제물을 함유한다.
이와 유사하게, pENDO-1, pENDO-2 및 pENDO-0를 T4DNA 리가재와 같은 리가제에 의하여 예를들어 10:10:1의(pENDO-1:pENDO-2:pENDO-0)의 비율로 중합하여 콘카타머를 형성한다. 혼합된 콘카타머 생성물을 포유동물 세포와 같은 진핵세포에 형질감염시키고 G418로 선별한다. 평균적으로, 내성(형질감염된) 세포는 pENDO-1 10개 복제물, pENDO-2 10개 복제물, pENDO-0 1개 복제물을 함유한다.
생성된 내성세포들의 각각은 PreS1-PreS2-S 단백질 암호영역으로부터 발현된 단백질을 함유한 입자들을 높은 수율로 생성한다.
형질감염된 진핵 숙주세포내에서 기타 단백질을 발현시키기 위하여 마우스 메탈로티오네인 프로모터를 포함하는 비-복제벡터의 사용
본 발명은 또한 메탈로티오닌 프로모터를 가진 작용성 DNA 서열과 형질감염된 진핵 숙주 세포에서 사람이나 랫트의 성장 호르몬을 생성시키기 위한 작용성 DNA 서열을 사용한 재조합 DNA 벡터를 포함한다.
용어 "작용성 DNA 서열"은 완전한 유전자 발현모듈, 구조 유전자, 프로모터 또는 조절영역으로서 본 발명의 벡터로 형질감염된 진핵숙주세포에서 기능을 발휘하는 모든 공급원으로부터 직접 또는 간접적으로 유도된 상이한 DNA 영역을 의미한다.
용어 "원전한 유전자 발현단위"는 전사와 해독을 의해 필요한 구조유전자, 프로모터 및 기타의 조절 영역을 의미한다.
용어 "프로모터"는 RNA 폴리머라제를 결합시키고 전사를 개시하도록 하는 구조 유전자의 상부영역을 의미한다.
용어 "조절영역"은 구조유전자의 전사율 또는 정도를 통제하는 영역을 의미한다.
용어 "구조 유전자"메신저 RNA의 합성을 위한 주형으로 작용하는 암호서열을 의미한다.
바람직한 구조 유전자에는 비루스성 항원, 인슐린, 인더페론 또는 기타의 림포킨, 랫트, 사람 또는 기타의 성장 호르몬, 조직 플라스미노겐 활성화제, 알파-1-안티프립신등과 같은 제약상 중요한 폴리펩타이드들을 암호화한 유전자가 포함된다. 가장 바람직하게는 랫트 또는 사람의 성장 호르몬이다.
본 발명은 작용 DNA 서열 및 MMT-프로모터을 포함하는 재조합 DNA 벡터에 관한 것이다. MMT-프로모터는 목적하는 DNA 서열에 대한 천연 프로모터와 함께 DNA 벡터에 도입되거나 천연 프로모터 대신에 도입될 수 있다. 바람직하게는 MMT-프로모터는 DNA 서열 단백질 암호영역의 상부에 근접하여 DNA 백터에 위치시킨다. 벡터는 또한 전사종결 서열 및 선별 마커를 함유하는 것이 바람직하다. 바람직하게는, 선별마커는 약물-내성 마커인데, 예컨데, 네오마이신 유전자이다. 바람직한 전사종결서열은 SV 종결부위(sv-PAS-t)이고 더욱 바람직한 것은 마우스 글로빈 유전자의 DEF 영역(mg-PAS-t)이다. 이러한 본 발명 백터는 통상적인 재조합 DNA 기술 및 기타의 분자 생물학적 기술로 제조할 수 있다. 가장 바람직한 경우로서, mg-PAS-t 영역을 사용했을때 벡터는 어떤 비루스성 DNA 단편도 포함하지 않고 암을 유발하지 않는다. 즉 본 발명 벡터는 숙주 세포내로 도입됐을때 숙주의 형질을 전환 시키지 않는다(숙주는 암형질로 변하지 않는다). 숙주내로 감염됐을때 본 발명 벡더는 형질감염숙주에서 기능을 발휘할 수 있는자가복제서열(레플리콘)을 포함하지 않는다면, 숙주 염색체내로 통합되며 피동적으로 숙주 게놈과 함께 복제된다.
바람직하게는, 본 발명의 재조합 DNA 벡터는 다음과 같은 특징을 지닌다;
1) 목적하는 DNA 서열과 이 DNA 서열의 상부에 근접 위치된 MMT-프로모터를 함유한다;
2) 재조합 벡터를 대량 증식, 증폭 및 제조하기 위하여 세균, 또는 다른 원핵숙주에서 복제될 수 있어야 한다. 따라서, 세균 또는 기타의 원핵레플리콘, 즉, 세균 숙주 세포와 같은 원핵 숙주 세포내에서 염색 체외적으로 벡터의 자가복제 및 유지를 위해 필요한 모든 기능을 갖고 있는 DNA 단편을 함유한다. 그런 레플리콘은 본 본야에 잘 알려져 있다;
3) 벡터 레플리콘은 유전학적 및 분자 생물학적 조작을 쉽게 할 수 있도록 작다((즉, 6.8kb 이하);
4) 세균 숙주세포에 사용하기 위해 선별마커, 바람직하게는 앰피실린과 같은 약물-내성 마커를 함유한다;
5) 진핵 숙주세포에서 사용하기 위해서 제2의 선별마커, 바람직하게는 네오마이신과 같은 약물- 내성 마커를 갖는다;
6) 클로닝을 위해 편리한 제한효소 부위를 갖는다;
7) 전사종결과 폴리아데닐화 서열을 포함한다;
8) 유전자 발현단위에 어떠한 비루스 단편도 포함하지 않으며 비발암성이다.
가장 바람직하게는, 본 발명의 벡터는 이에 의해서 형질감염된 진핵숙주세포에서 기능를 발휘할 수 있는 자가복제 서열(레플리콘)을 함유하지 않는 것이다. 진핵숙주세포에서 비-복제 벡터 시스템을 사용하려는 주된 이유는 그것에 의해 형질 감염된 포유동물 진핵 숙주 세포에서 자가복제 및 염색체외 복제할 수 있는 모든 공지된 벡터 시스템이 발암성 비루스로부터 유래된 레플리콘을 포함하고 있기 때문이다. 제약상 중요한 폴리펩타이드를 암호화한 DNA 서열을 발현하기 위하여 발암성 비루스로부터 유래되지 않는 DNA를 포함한 벡터를 이용하는 것이 바람직하다.
본 발명은 또한 본 발명의 적용성 DNA 서열을 함유한 제조합 DNA 벡터로 형질감염된 진핵 숙주세포에 관한 것이다. 바람직한 숙주는 포유동물 세포이며, 가장 바람직하게는, 챠이니즈 햄스터 난소(CHO) 세포주, 베로 세포주, L-세포주, 또는 마우스 또는 랫트의 섬유아세포주이다. 본 발명의 숙주세포는 통상의 기술에 의해 본 발명의 재조합 DNA 벡터로 진핵세포를 형질감염시켜 제조할 수 있다.
본 발명은 또한 a) 본 발명의 형질감염된 숙주를, 이 숙주가 단백질을 발현할 수 있도록 하는 배양배지 조건하에, 배양하고 (b) 본 발명에 따른 입자를 분리하여 제조하는 방법에 관한 것이다. 바람직하게는, 본 발명의 형질감염된 숙주는 배지에 단백질 입자를 분비할 수 있다. 바람직하게는, 중금속 이온이나 스테로이드호르몬(예, 텍사메타손)을 배양재지에 첨가하여 MMT-프로모터를 유도하고 그럼을써 암호영역의 발현을 증대시킨다. 카드뮴이나 아연과 같은 중금속 이온이 가장 바람직하다. 배지중에 함유된 중금속 이온이나 스테로이드호르몬의 최적 농도는 통상의 기술로 결정할 수 있다.
본 발명은 또한 상기 방법에 의해서 제조된 입자에 관한 것이다. 본 발명의 형질 감염된 숙주 세포가 배양배지에 직접 입자를 분비한다면, 이때 입자는 통상적인 단백질 분리기술에 의해 본 발명의 형질감염된 숙주의 배양배지로부터 분리할 수 있다. 본 발명의 형질 감염된 숙주 세포가 입자를 분지하지 않는 경우라도, 통상적인 배양물 용해 기술에 의해서 숙주의 배양 용해물로부터 입자를 수득할 수 있다.
실시예 3
사람 성장호르몬의 발현
사람 성장호르몬 암호화 유전자와 메탈로티오네인 프로모터를 재조합 DNA 벡터의 제조
A. 전사를 위한 천연 프로모터가 없는 사람 성장 흐르몬을 함유하는 DNA 단편의 분리
사람 성장흐르몬 유전자를 가진 2kb EcoR I 단편 삽입체를 시계반대방향으로 함유하는 재조합 플라스미드 pBR322를 BamH I (고염도) 완충액에, 100㎍의 플라스미드 DNA, 240단위의 BamH I를 함유하는 총용적 500μl로 하여 제한 효소로 분해시킨다. 두개의 단편 생성되는데, 하나는 약 5.6kb이고 또다른 단편은 0.8kb이다. 단편들을 0.8% 예비 아가로즈 겔에서 전기영동법으로 분리한다. 천연 프로모터가 없는 사람 성장호르몬 구조유전자를 함유하는 큰 단편은 그 겔에서 전기용출시키고 2의 페놀/클로로포름 추출과, 2회의 클로로포름 추출 및 2회의 에탄올 침전에 의해서 정제한다. 펠릿화시킨 DNA를 2μl의 pH 8.0인 10mM 트리스에 재현탁시킨다.
B. 메탈로티오네인 프로모터와 pML2 벡터골격을 함유하는 DNA 단편의 분리
플라스미드 pMMT-neo(제5도 참조)를, 제한효소 BglII 및 BamII로 분해시켜 MMT-프로모터와 pML2 벡터골격을 함유하고 있는 4.5kb 단편 및 sv-PAS-t 단편과 결합된 neo 유전자를 함유하고 있는 2.15kb 단편을 수득한다. 자체 결합을 막기 위하여, 선형 DNA를 25㎍의 DNA 단편과 28U의 알칼리성 포스포타제을 함유한 총용적 100μl으로 하여 알카리성 포스포타제로 처리한다. 그 혼합물을 37℃로 20분간 배양시키고, 그 반응은 10μl 50mM EDTA를 첨가하고 10분간 68℃로 가열시키셔 중단시킨다. 단편을 0.8% 아가로즈 겔에서 전기영동법에 의해서 분리하였다. 4.5kb 단편을 설명된 바와같이 갤로부터 전기-용출시켜서 2회 주기의 페놀/클로로포름추출, 2회 주기의 클로로포름 및 2회 주기의 에탄올 침전에 의해서 정재하였다. DNA 펠릿을 20μl의 pH 8.0인 10mM 트리스에 재현탁시켰다.
C. 상기 A와 B단계에서 분리된 DNA 단편들의 결합
상기 A단계로부터의 5.6kb 단편 1.5μg량을 취하여 0.9단위의 T4DNA-리가제 및 1×결합 완충액에 100mM ATP를 함유하는 총용적 10μl로 하여 상기 B단계에서의 단편 0.3㎍과 혼합한다. 그 혼합물을 1시간 동안 15℃에서 및 40℃에서 하룻밤동안 배양시킨다. 그 다음 그 결합 혼합물을 세균 균주 HB101에 재료 및 절차에서 설명한 절차를 이용하여 삽입시켰다. 그 형질전환 혼합물로부터의 세포들을 LB-엠피실린 한천 플레이트에 플레이팅하고 분리된 클론들을 제한효소 BamH I 선형화될 수 있는 10/0k 플라스미드를 함유한 것을 스크리닝한다. 방항은 EcoR I 분해에 의해서 결정한다. 정확한 방향으로 그 삽입체를 포함하는 플라스미드는 두 개의 EcoRI 단편, 즉 하나는 3.5kb이고, 다른 하나는 6.6kb인 단편을 생성한다. PMM-hGH로 명명된 그 플라스미드는 설명한 것과 같이 대규모 증식 및 정제를 행한다.
D. 포유돌물 세포내로 상기 C단계에서 얻은 재조합 벡터의 도입 및 사람 성장호르몬을 생성하는 세포주들의 동정
그 다음, 벡타 pMMT-hGH를 공통-형질감염 표준기술로 진핵성 숙주 세포(포유 동물)에 형질 감염시켜서, 사람 성장호르몬 폴리펩타이드를 합성하는 형질감염체를 생성한다. 그 형질감염체를 사람 성장 호르몬에 대한 항체를 사용하는 RIA 기술로 동정한다. 사람 성장 호르몬 분비를 나타내는 형질 감염체를 통상의 기술을 이용하여 세포주로서 설정한다.
실시예 4
랫트 성장 호르몬의 발현
랫트 성장흐르몬 유전자 및 메탈로티오네인 프로모터를 함유하는 재조합 DNA 벡터의 제조
A. pMMT-neo 내의 Bgl II 제한효소 부위를 Xho I로 전환
200㎍량의 pMMT-neo를, 총 반응용적 1,000μl로 하여 배지염 완충액중에서 500U의 제한효소 Bgl II로 분해시켰다. 6.65kb 선형 플라스미드 DNA의 말단을 먼저, 앞서 설명한 것처럼 DNA 폴리머라제 I(클레노우 단편) 및 4개의 dNTP를 사용하여 Bgl II 말단에 채운 다음, Xho I 제한효소 인식부위 및 절단부위를 함유하는 다음의 합성 DNA 링커단편(미국 위스콘신 53205 밀워키 소재의 PL Biochemicals로부터 입수)을 부착시켜 비접착화시킨다.
5' -CCTCGAGG - 3'
3' - GGAGCTCC -5'
채움반응은 2.5㎍의 6.65kb 단편, 200mM의 4개 dNTP, 3μl NT-완충액 및 1μl 클레노우 단편을 포함한총용량 30μl에서 실시한다. 그 혼합물을 실온에서 30분간 배양한다. 그 반응은 2μl 0.25MEDTA를 첨가하여 중지시키고 DNA를 같은 용량의 페놀/클로로포름으로 한번 씻은 다음 동일용량의 클로로포름 단독으로 세척한다. 수상에 있는 DNA를 두번의 에탄올 침전으로 좀더 정제한다. 침전된 DNA를 50ng/μl의농도로 10μl의 pH 0.8인 10mM 트리스에 재현탁시킨다. 링커단편을 1피코몰/μl의 농도로, 50μl의 pH 8.1인 10mM 트리스에 용해시킨다. 비접착-말단된 6.65kb 단편을 2피코몰의 링커단편, 0.5㎍의 6.54kb 단편, 9단위의 T4DNA-리가제(베링거 만하임), 30μl×2×비접착 말단의 결합 완충액 및 100mM ATP를 포함한 총 2μl의 용량으로 링커단편에 결합시킨다. 그 결합은 15℃로 1시간, 4℃로 하룻밤 실시한다.
이 결합 혼합물을 "재료 및 절차"에서 설명한 것처럼 알맞게 만들어진 세균 균주, HB101를 형질전환시키는데 사용한다. 형질전환 혼합물에서 나온 세포들을 LB-앰피실린 한천 플레이트에 스트리킹한다. 앰피실린 플레이트에서 성장할 수 있는 세균 콜로니들을 집어내서 2μl 배양 배지에서 성장시키고 위에서 설명한 것처럼 플라스미드가 제조되도록 한다.
B. 메탈로티오네인 프로모터 및 pML2 벡터골격을 함유하는 DNA 단편의 분리
OK 3 및 OK 11 각각 100㎍량을 두개의 단편, 즉 Xho I에 근접위치한 MMT-프로모터와 pML2의 BamH I 부분을 함유한 5.8kb 단편과 sv-PAS-t 서열을 함유한 0.85kb 단편을 생성하는 제한효소 BamH I 및 Xho I 로 분해시켰다. 그 단편들은 0.8% 아가로즈에서 전기영동법에 의해 분리하였다. 5.8kb 단편을 전기 용출시킨 다음, 2회 주기의 페놀/클로로포름 추출, 2회 주기의 클로로포름추출 및 2회 주기의 에탄올침전에 의해서 정제하였다. 펠릭화한 DNA를 50μl의 pH 8.0인 10mM 트리스에 재현탁시켰다.
C. 랫트성장흐르몬 유전자를 함유한 DNA 단편의 분리
랫트 성장호르몬 유전자를 암호화하는 게놈 BamH I 삽입체를 시계반대방향으로 함유한 플라스미드 pBR322.rGH를 BamH I와 Xho I로 분해시켰다. 구조 유전자를 포함한 게놈성 BamH I-Xho I 단편을 상기와 같이 0.8% 예비 아가로즈 겔에서 분리한다.
D. 상기 B 및 C 단계에서 처럼 분리된 단편들의 결합
단편들을 MMT-프로모터가 Xho I의 점착말단을 경유하여 구조 유전자에 정확한 배향으로 직접 연결되도록 서로 결합시킨다.
그 결합 혼합물을 세균 균주, HB101를 상기한 것처럼, 형질 전환시키는데 사용한다. LB-엠피실린 한천 플레이트상에 콜로니를 형성하는 형질전환체를 집어내어 2ml의 배양물에서 소규모 플라스미드 제조를 위해서 배양시킨다. 그런다음, BamH I와 Xho I로 분해시켜서 두개의 예상했던 단편들을 생성하는 플라스미드 pMMT-rGh를 포유동물 세포에 형질감염시키기 위해서 대규모로 증식시킨다.
E. 포유동물 세포들에 상기 D 단계에서 얻은 재조합 DNA 벡터의 도입 및 랫트의 성장호르몬을 생성하는 세포주들의 동정
벡터 pMMT-rGH를, 표준공동-형질감염 기술에 의해서, 진핵성 숙주세포들(포유동물)에 형질감염시켜서 랫트의 성장호르몬 폴리펩타이드를 생성하는 형질감염체를 얻는다. 그 형질감염체를 랫트의 성장 호르몬에 대한 항체를 사용한 RIA 기술로 동정한다. 랫트의 성장 호르몬을 분비하는 형질감염체를 통상적인 기술에 의해 세포주로서 설정한다.
본 발명은 바람직한 양태를 예시하여 설명되어 있지만, 본 분야의 전문가들은 본 발명의 취지와 범위를 벗어나지 않고 여러면에서 변형시킬 수 있음을 인식할 것이다.

Claims (15)

  1. PreS1-PreS2-S 단백질 암호영역과 메탈로티오네인 유전자 프로모터를 함유한 재조합 DNA 벡터로 진핵세포를 형질감염시킴을 특징으로 하여, PreS1-PreS2-S 단백질을 함유한 입자를 생성하는 진핵세포를 제조하는 방법.
  2. PreS1-PreS2-S 단백질 암호영역과 메탈로티오네인 유전자 프로모터를 함유한 제1의 재조합 DNA벡터 및 PreS2-S 단백질 암호영역 또는 S 단백질 암호영역과 메탈로티오네인 유전자 프로모터를 함유한 제2의 재조합 DNA 벡터로 진핵세포를 공동형질감염시킴을 특징으로 하여, PreS1-PreS2-S 단백질을 함유한 입자를 생성하는 진핵세포를 제조하는 방법.
  3. PreS1-PreS2-S 단백질 암호영역 및 메탈로티오네인 유전자 프로모터를 함유한 제1의 재조합 DNA 벡터, PreS2-S 단백질 암호영역을 함유한 제2의 재조합 DNA 백터, 및 메탈로티오네인 유전자의 프로모터와 선별마커를 함유한 제3의 재조합 DNA 벡터로 진핵세포를 공동형질감염시킴을 특징으로 하여, PreS1-PreS2-S 단백질을 함유한 입자를 생성하는 진핵세포를 제조하는 방법.
  4. 제3항에 있어서, 세개의 재조합 DNA 벡터를 두개씩 쌍으로, 세개를 한번에, 또는 한개씩 차례로 공동형질감염시키는 방법.
  5. 제1항 내지 제4항중 어느 한 항의 방법에 따라 제조된 숙주세포를 이 숙주세포가 B형 간염 표면항원의 PreS1-PreS2-S 단백질 암호영역으로부터 발현된 단백질을 함유한 입자를 발현하도록 하는 배양배지조건하에서 배양하고, 발현된 입자를 분리함을 특징으로 하여, 상기 입자를 제조하는 방법.
  6. 제5항에 있어서, 배양배지에 카드뮴 또는 아연과 같은 중금속 또는 댁사메타손과 같은 스테로이드호르몬이 함유하는 방법.
  7. 완전한 PreS1-PreS2-S 단백질 암호영역으로부터 발현된 단백질을 함유한 입자를 사용하여 인간으로부더 채취한 혈청시료를 정량적 면역검정을 실시하여 혈청시료중에 존재하는 항체의 양을 측정하고 그 측정치를 공지된 표준치와 비교함을 특징으로 하여, B형 간염 바이러스의 존재를 검정하는 방법.
  8. 완전한 PreS1-PreS2-S 단백질 암호영역으로부터 발현된 단백질을 함유한 면역보호량의 입자를 통상의 담체물질과 배합시킴을 특징으로 하여 B형 간염 바이러스에 감염되지 않도록 인간을 보호하는 백신을 제조하는 방법.
  9. 완전한 PreS1-PreS2-S 단백질 암호영역으로부터 발현된 단백질을 함유한 입자로부터 폴리펩타이드를 분리시키고, 이 폴리팝타이드를 지질소포에 재결합시킴을 특징으로 하여, B형 감임에 감염되지 않도록 인간을 보호하는 백신을 제조하는 방법.
  10. (a) B형 간염 표면 항원의 완전한 PreS1-PreS2-S 단백질 암호영역으로부터 발현된 단백질을 함유한 비표지된 입자로 피복된 고체기질과 포유동물 혈청시료를 접촉시키고 ; (b) 접촉시료를 항온배양하여 세척하고 ; (c) 접촉시료를 완전한 PreS1-PreS2-S 단백질 암호영역으로부터 발현된 단백질을 함유한 입자와 접촉시켜 표지된 접촉시료를 생성시키고 ; (d) 표지된 접촉시료를 항온배양하여 세척하고 ; (e) 표지된 접촉시료중에서 표지된 입자의 양을 측정함을 특징으로 하여, 포유동물 형청시료중에서 B형 간염 표면 항원의 PreS1-PreS2-S 단백질 암효영역으로부터 발현된 단백질에 대한 항체의 존재를 검정하는 방법.
  11. (a) B형 간염 표면 항원의 완전한 PreS1-PreS2-S 단백질 암호영역으로부터 발현된 단백질의 입자를 함유한 면역원에 의해 생성된 항체를 함유하는 조성물을 생성하고; (b) 이 조정물의 제1분취량 및 표지된 면역원을 포유동물의 혈청시료와 접촉시키고, 항온배양하여, 제1분취 조성물을 세척하고; (c) 항원이 없는 대조군을 표지된 면역원 및 조성물의 제2분취량과 접촉시키고, 항온 배양하여, 제2분취 조성물을 세척하고; (d) 상기 (b) 및 (c) 단계의 조성물 각각에 단백질 A-함유 스타필로코시를 동일량 첨가하고,양쪽의 조성물을 항온배양하여, 고체로부터 액체를 분리시키고; (e) 상기 (d) 단계에서 생성된 각 조성물 중에서 표지된 면역원의 양을 측정함을 특징으로 하여, 포유동물 형철의 시료중에서 PreS1-PreS2-S 단백질 암호영역으로부터 발현된 단백질의 존재를 검정하는 방법.
  12. (a) B형 간염 표면 항원의 완전한 PreS1-PreS2-S 단백질 암호영역으로부터 발현된 단백질의 입자가 부착되어 있는 고체지지체 및 (b) 인간 IgG 또는 IgM에 표지된 항체를 함유함을 특징으로 하는, 동물의 혈청시료중에서 PreS1-PreS2-S 암호영역으로부터 발현된 단백질에 대한 항체의 존재를 검정하기 위한 진단용 키트.
  13. (a) B형 간염 표면 항원의 완전한 PreS1-PreS2-S 단백질 암호영역으로부터 발현된 단백질의 입자에 의해 생성된 항체가 부착되어 있는 고체지지체 및 (b) 완전한 PreS1-PreS2-S 암호영역으로부터 발현된 단백질의 입자에 의해 생성된 표지된 항체를 함유함을 특징으로 하는, 포유동물 혈청시료중에서 PreS1-PreS2-S 암호영역으로부터 발현된 단백질의 존재를 검정하기 위한 진단용 키트.
  14. (a) 결합부위를 가진 고체기질에 B형 간염 표면 항원의 완전한 PreS1-PreS2-S 단백질 암호영역으로부터 발현된 단백질에 대한 항체를 처리하고; (b) 피복된 구슬을 세척하여 과량의 항체를 제거하고; (c) 구슬을 단백질-함유 용액과 접촉시켜서 비-특이성 결합을 감소시키고; (d) 구슬을 세척하여 과량의 단백질-함유용액을 제거하고 ; (e) 구슬을 HBV 또는 HBV 표면 항원을 함유할 것으로 예상되는 혈청시료와 함께 항온배양시키고; (f) 구슬을 표지된 항체와 혼합된 용액으로 세척하고; (g) 표지된 항체의 양을 측정함을 특징으로 하여, HBV에 감염된 동물의 혈청중에서 PreS1-PreS2-S 암호영역으로부터 발현된 단백질을 함유한 HBV 항원을 검정하는 방법.
  15. (a) 결합부위를 가진 고체기질상에 B형 간염 표면 항원의 완전한 PreS1-PreS2-S 단백질 암호영역으로부터 발현된 단백질의 입자를 흡착시키고; (b) 고체기질을 이 고체기질상의 비특이적 결부위를 포화시키는 물질과 접촉시키고; (c) 고고체기질을 완충액으로 세척하고 완충액을 제거하며; (d) 고체기질에 시료를 가하고; (e) 시료를 함유한 고체기질을 항온배양시켜 세척하고; (f) 고체기질에 인간 IgG 또는 IgM에 표시된 항체를 가하고; (g) 고체기질을 항온배양하여 세척하고; (h) 표지된 항체의 양을 측정함을 특징으로 하여, 시료중에서 HBV 표면항원 단백질의 PreS1-PreS2-S 영역에 대한 항체를 검정하는 방법.
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