KR930003609B1 - B형간염 비루스표면 항원 및 중합된 인체혈청 알부민의 수용체를 함유하는 폴리펩티드의 제조방법 - Google Patents

B형간염 비루스표면 항원 및 중합된 인체혈청 알부민의 수용체를 함유하는 폴리펩티드의 제조방법 Download PDF

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Description

B형간염 비루스표면 항원 및 중합된 인체혈청 알부민의 수용체를 함유하는 폴리펩티드의 제조방법
본 발명은 B형간염 비루스 표면 항원 및 중합된 인체 혈청 알부민의 수용체를 함유하는 폴리펩티드의 제조방법에 관한 것이다.
본 발명은 특히 거의 구형인 폴리펩티드입자들을 함유하거나 또는 그 입자로 구성되며, 이 입자들 대부분은 비루스성 B형 간염 비루스의 표면항원이 갖고 있는 면역원적 특성과 면역학적 특성을 갖는 것을 특징으로 하는, 백신의 제조에 유용한 조성물에 관한 것이다.
상기 표면항원은 대개 약자로 HBsAg로 표시되거나, 더욱 간단히 HBs로 지칭한다. 본 발명은 또한 높은 생산수율로써 상기와 같은 폴리펩티드 입자를 그들의 배양배지내로 배출할 수 있는 진핵셀라인(cell line), 바람직하게는 동물셀라인에 관한 것이며, 또한 이와같은 셀라인을 제공할 수 있는 수단, 특히 변형된 벡터에 관한 것이다.
B형간염 비루스(HBV)의 만성 보균자의 혈청은 22nm 지름을 갖는 입자형태 또는 필라멘트 형태의 빈비루스 외피(envelope)를 함유하며, 때로는 42nm의 구형입자인 완전한 감염성 비루스 입자(virion)를 함유하고 있다. 상기 비루스 외피는 표면항원(HBsAg)를 가지며, 상기 감염성 비루스 입자가 존재하면 일반적으로 용해성 항원으로 명명되어 있는 항원(HBeAg)이 함께 존재한다.
상기 비루스 외피의 폴리펩티드 조성에 대해서는 많은 연구가 실시되어 왔다(Robinson W. S.(1977) Ann. Rev. Microbiol. 31. 357-377). 이것은 글리코실화형태(GP29)와 비글리코실화 형태(P25)로 존재하는 주성분 폴리펩티드와 GP33, GP36 과 P41로 명명된 최소한 세개의 부성분 폴리펩티드를 함유하고 있다.
상기 폴리펩티드 GP33과 GP36은 동일한 아미노산 서열을 갖는다. GP36이 단지 하나의 보족 당 잔기(Supplementary sugar residue)를 가진다(Stibbe W. 와 Gerlich W. H.(1983). J. Virology 46, 626-628).
상기 주성분 폴리펩티드에 대한 상기 부성분 단백질의 상대적이 양은 혈장을 따라서 다양하다. 그 상대적인 양은 비루스 입자가 많은 HBeAg 양성혈청에서 매우 높다. 상기 폴리펩티드는 GP33과 GP36은 외피단백질중에 수 %로 존재하며, 비감염성 HBeAg 음성 혈청에서는 1% 이하로 존재한다(Stibbe W. and Gerlich W. H. (1982) Virology 123, 436-442).
외피의 주요 폴리펩티드는 226개의 아미노산으로 구성되며 유전자 S로 암호되어 있다. 상기 GP33과 GP36의 폴리펩티드 서열은 상기 S유전자와 pre-S 영역의 일부분에 의해 암호될 수 있다. 이 가정에서, 이 폴리펩티드 서열은 상기 주요 폴리펩티드와 동일한 C-말단을 가지며 N-말단위치에서 55개의 아미노산으로 구성된 보족 서열(supplementary sequence)을 갖고 있을 것이다(Stibbe W와 Gerlich W. H. (1983), J. Virology 46, 626-628).
최근에, HBeAg 양성혈청에서 분리된 비루스성 입자는 대한 중합된 인체알부민(pHSA)에 대한 수용체(receptor)를 함유하고 있음이 밝혀졌다(Machida A. 등의 (1983) Gastroenterology 85, 268-274). 이 수용체는 폴리펩티드 GP33과 GP36에 의해 보유될 수 있다. 이 수용체로 인해, 상기 pHSA는 비루스 입자와 간세포(hepatocyte)사이에 다리를 형성할 수 있으며, 이로써, 비루스가 부착될 수 있고, 또한 간세포내로 침투할 수도 있게 된다. 따라서 상기 비루스를 "정화(clearance)"하는 과정에서는, 항-수용체 항체가 필히 출현할 것이다. 사실은, 회복의 초기단계인 HBeAg/항-HBe 혈청전환 단계에서 상기 항체가 출현하지만 만성화로의 진행중에 이들항체는 존재하지 않는다(Pontisso P. 등의 (1983) J. of Virological Methods 6, 151-159).
또한, pHSA 수용체에 상응하는 항원이 소실되는 현상이 관찰되는데, 이것은 그 해당 유전자가 특이상황(특히, 비루스의 복제단계중에)을 제외하고는 일반적으로 형질발현되지 않는다는 것을 의미한다. 이러한 사실은, B형간염 비루스에 과거에 감염되었었던 공혈자(donor)로부터 제공된 혈액 혈청에서 얻어져 현재 시판되고 있는 백신 제제내에 함유되어 있는 B형간염 비루스의 비어 있는 천연외피를 분석한 결과 더욱 분명해졌다.
사실, 디티오트레이톨(DTT)의 존재하에 분간 100℃에서 처리해 상기 천연입자들을 분해한 후 얻어진 폴리펩티드들을 소듐 도데실설페이트(SDS)의 존재하에 폴리아크릴아미드상에 겔 전기영동시켜 분석한 결과 고분자량의 폴리펩티드, 특히 34,000 정도의 분자량을 갖는 폴리펩티드는 존재하지 않는 것으로 나타났다. 마찬가지로, 상기와 같은 고분자량 폴리펩티드는 유럽특허출원 제38765호에서 이미 제시된바 있는 벡터를 사용하여 유전자 공학기술에 의해 형질전환시킨 동물세포의 형질전환체에 의해 제공된, HBs 항원의 면역학적 특성 및 면역원적 특성을 가지는 입자로 구성된 조성물에서도 존재하지 않는 것으로 관찰되었다.
본 발명의 목적은 B형 간염 비루스에 대하여 강화된 방어특성을 지닌 백신 조성물을 제공하는 것이다. 또한 본 발명의 목적은 배양체로 유지될 수 있고, 상기 강화된 백신조성물의 활성성분을 그 배양배지내로 분비하며, 현재 시판되고 있는 유전적으로 형질전환된 배양체에 의한 것보다 훨씬 높은 생산 수율로 상기 활성성분을 제공하는, 유전자 공학기술로 형질전환된 세포주를 제공하는 것이다. 그리고 마지막으로, 본 발명의 목적은 배양체로 유지될 수 있는 종류의 진핵셀라인, 특히 포유동물로부터의 셀라인을 제공할 수 있도록 하는 수단(벡터 및 방법)을 제공하는 것이다.
본 발명은 이미 제시된 특이한 생물학적 조건과는 상당히 다른 조건하에서도 B형간염 비루스 게놈내에 있는 pHSA 수용체를 암호하는 유전자 서열을 형질발현시킬 수 있음을 관찰하게 됨에 따라 완성되었다. 마지막으로, HBs 항원으로 구성된 동일한 백신 조성물내에 상기 수용체에 해당하는 것으로 보이는 항원 결정인자를 보유한 폴리펩티드 단편을 함께 사용함으로써 백신 조성물의 효능이 강화된 백신 조성물이 얻어진다는 것을 발견했다.
본 발명에 의한 백신 제조에 유용한 조성물은 HBsAg 항원의 면역학적 특성 및 면역원적 특성을 가지며, 18 내지 25nm, 특히 20 내지 22nm 크기와 CsCl 기초 농도 구배에서 1.20-1.22g/ml의 밀도 영역내에서 분리될 수 있는 밀도를 갖으며, 데인입자와 HBc 항원을 비롯한 HBe 항원이 존재하지 않는 순도를 갖는 거의 구형의 폴리펩티드 입자들을 함유하거나 또는 이들 입자로 구성되며, 특히 상기 구형의 입자는 중합된 인체 알부민에 대한 수용체를 함유하는 것을 특징으로 한다.
더욱 특히, 본 발명의 폴리펩티드 입자들은 34,000 달톤정도의 분자량을 갖는 폴리펩티드를 상당량 함유하는 것으로 관찰되며, 이들 폴리펩티드는 전술한 입자를 구성하고 있는 폴리펩티드 전체량의 10% 이상, 바람직하게는 20% 이상의 비율로 존재하는 것이 바람직하다. 더욱 바람직하게, 본 발명의 조성물은 인체 혈액혈청에서 발견되는 바와같은 인체 기원의 어떠한 성분도 존재하지 않는다.
특히 본 발명은 적절한 암호서열을 함유한 벡터로 사전에 형질전환되어 배양체로 유진된 셀라인에 의해 그들의 배양배지내로 분리되며, HBsAg항원과 pHSA 수용체의 면역원적 특성을 갖는 입자들로 구성된 조성물에 관한 것이며, 상기 형질전환은 상기 HBs 항원과 pHSA 수용체뿐만 아니라 그 면역원적 부위를 함유한 펩티드 서열을 효과적으로 형질발현시킬 수 있는 조건하에서 수행된다.
본 발명은 또한 배양시 상기 면역원적 입자들을 생산할 수 있도록 진핵셀라인, 특히 인체나 동물세포의 셀라인을 형질전환시키는데 적합한 벡터에 관한 것이다.
상기 벡터는 비루스성 B형간염 비루스 게놈의 S와 pre-S 영역(regions)을 암호하는 DNA 서열을 포함하며, 이들 벡터내에서 상기 DNA 서열은 그들이 사용될 진핵 세포, 특히 인체 또는 동물세포내에서 유전자 전사를 직접적으로 유효하게 개시하는 능력을 지닌 공지된 외인성 프로모터의 직접 조절하에 위치되어 있는 것을 특징으로 한다. 예컨대, Galibert 등이 제시한 상기 DNA 서열에 관한 (1979) Nature, 281권 p646-650에 의한 논문을 참고하기 바란다.
이것은 특히 약 165개 트리플렛(triplets)을 가지는 pre-S 서열이 선행되어 있는 S 유전자를 함유하며, 하기에 도시한 상기 서열에 대한 일부 조성표시부에 그들의 첫번째 뉴클레오티드를 나타내었다 :
Figure kpo00001
사용되는 외인성 프로모터는 " 내인성" 프로모터 즉, 일반적으로 B형간염 비루스 게놈내에서 S 및 pre-S 유전자와 결합되어 있는 것과는 다른 것이다.
이들 세포들이 원숭이로부터 유래된 것일때는, 비루스 SV40으로부터 유래한 프로모터를 사용하는 것이 유리하며, 이 프로모터는 원숭이 세포에서 인접 유전자의 전사를 효과적으로 개시한다고 알려져 있다. 유리하게는, 상기 프로모터가 SV40 비루스이 "조생" 프로모터("precocious" promotor)에 해당하며, 일반적으로 작은 T 항원과 큰 T 항원의 형질발현을 똑같이 조절한다.
그러나 형질전환된 세포에 의해 HBs 항원과 pHSA 수용체의 특징적인 면역원적 결정인자를 보유한 폴리펩티드를 제조하는 방법과 관련하여 상기 특정 프로모터를 사용함으로써 이용된 배양배지내로 상기 폴리펩티드를 특히 바람직하게는 분리하는 등 양호한 결과를 제공한다 하더라도, 본 발명은 상기 특정한 프로모터를 사용하는 방법으로만 제한되지는 않는다. 예를들어, SV40, 후기프로모터(late promoter ; 단백질 VP1, VP2, VP3의 형질발현을 조절)를 사용할 수도 있다.
상기 프로모터 및 여기에 결합되어 있는 상이한 항원들을 암호하는 유전자들의 상대적인 위치를 이해하기 위해, SV40 비루스의 제한효소 지도를 참조할 수 있다. (J. Tooze, Ed. DNA Tumor Viruses, Cold Spring Harbor, N.Y., 1980, chaps 2-5).
물론 SV40 프로모터는 다른 유형의 프로모터로 대체될 수도 있는데, 이러한 프로모터들은 그의 조절하에 전술한 S와 pre-S 부위를 암호하는 상기 서열이 위치하면, 사용된 셀라인내에서 상기 서열의 전사를 촉진하는 능력을 지니고 있거나, 그러한 능력이 발견된 것들로서, 수용세포(receiving cell) 의 게놈내에 이 프로모터와 상기 서열이 결합함으로써, 또는 그렇게 형질전환된 수용세포에 부여된 능력으로 인해 HBsAg와 pHSA 수용체의 면역원적 특성을 가지는 폴리펩티드가 다량 합성되어 분비되며, 이렇게 획득된 능력은 이들 세포로부터 유래된 이후 세대에 계속 전달되어 진다.
상기 형질전환된 세포가, 본 발명에 의해 그 셀라인에 획득된, 상기 폴리펩티드를 합성하는 특성을 한 세포세대로부터 다른 세대로 약 10세대 이상 전달할 때 '안정'한 것으로 명명할 수 있다.
사용하기 적합한 다른 프로모터의 예로, 폴리옴(polyome)의 초기프로모터(early promoter) 또는 다른 레트로비루스의 LTR 프로모터 또는 아데노비루스의 EA 프로모터를 들 수 있다.
널리 공지된 바와같이, 그들이 유래된 비루스의 게놈에서 취한 프로모터들은 통상 그들앞에 (그들의 조절하에 통상 위치하는 유전자서열의 전사방향에 대해) "활성화 서열"(activating sequence)을 동반하는 것이 바람직하다. 이같은 활성화 서열의 예는 Science(1983), vol219, p626 내지 631과 Nature(1982), vol295, p568 내지 572 에 수록된 논문에 열거되어 있다.
유리하게, 상기 pre-S 와 S영역을 암호하는 전술한 DNA 서열은 pre-S 또는 S 서열의 전사를 가능하게 하는 상기 프로모터와 활성화 서열로 구성된 DNA 분체(fragments)로 바로뒤에 위치한다. 전술한 분체는 프로모터의 종류와 사용되는 활성서열에 따라서 300 내지 400 염기쌍을 함유한다.
더욱 바람직하게, 본 발명에 의한 벡터는 또한 효소와 같은 DNA 서열 또는 라벨을 함유하는데, 이 라벨은 상술한 제 1 프로모터 보다 약한 별도의 프로모터의 조절하에 존재한다. 이 라벨은 바람직하게는 디하이드로폴레이트리덕타제(dhfr)를 암호하는 유전자 또는 DNA 서열로 구성되어 있다. 이 라벨은 상기 벡터들이 특정조건하에서 형질전환시킬 수 있는 세포내에서 상기 벡터의 복사체 수를 증폭(확대)시키는 잇점을 제공한다.
대부분의 경우에, 상기 제 2 프로모터는 외인성 프로모터이다. 그러나 이것은 또한 B형 간염 비루스의 게놈내에 함유된 천연 프로모터중의 하나로 이루어질 수 있다. 특히 바람직한 프로모터는 마우스 유방 암 비루스(MMTV)의 LTR(Nature(1981), 294, 228-232 에 기재된 : "Long Terminal Repeat(장말단반복부)"로 지칭되는 서열)로부터 유래된 것이다.
본 발명은 또한 상기에서 정의된 바와같은 벡터로써 형질전환되고 그의 배양배지내로 상기 면역원적 입자를 분비할 수 있는 셀라인에 관한 것이다.
특히, 본 발명은 106세포에서 24시간당 1μg당, 바람직하게는 10μg 이상의 HBsAg 생산능을 가지는 셀라인에 관한 것이다. 본 발명은 특히, S와 pre-S 영역의 전사가 발생할 때, 특히 pre-S 영역에서 전사가 개시될때 검출될 수 있는 2.1kb이상, 특히 2.2 내지 2.8kb의 정도, 바람직하게는 2.6kb 크기를 갖는 특이 HBV-RNA들로써 특징지워지는 셀라인에 관한 것이다.
바람직한 셀라인은 2.1kb 이상, 특히 2.2 내지 2.8kb, 그리고 보다 바람직하게는 2.4-2.6kb의 크기를 갖는 특이 HBV-RNA 들을 검출할 수 있는 셀라인이다. 일반적으로는, 상기에서 언급한 특정한 생물학적 조건하에서(특히 B형간염 비루스의 복제과정중에서) pre-S 와 S영역의 전사로부터 얻어지는 것, 특히 내인성 프로모터의 조절하에 pre-S 영역의 전사가 개시될때 얻어지는 2.1kb 정도의 크기를 갖는 특이 HBV-RNA 들과 그 크기이상의 특이 HBV-RNA 들이 동시에 검출된다. 바람직하게, 본 발명에 의한 셀라인은 포유동물세포, 특히 CHO(Chinese hamster ovary)세포로부터 얻어진다.
본 발명은 또한, 배양체로 유지될 수 있는 상기 셀라인의 제조방법에 관한 것으로, 이 방법은 상술한 벡터로 상기 셀라인을 형질전환시키고, B형간염 비루스 게놈의 S및 pre-S 영역을 암호하는 서열을 동시에 발현하는 배양체의 셀라인을 분리하는 것을 포함한다.
우선적으로, 상기 제 2 프로모터의 조절하에 상기 라벨을 포함하는 완전한 벡터를 사용할 수 있는데, 형질 전환된 셀라인의 배양은 마커의 억제제 존재하에 실시되며, 배양배지중에 이 억제제의 농도는 배양중의 임의의 콜로니에서 상기 라벨을 암호하는 유전자의 복사체의 수를 증폭시키기에 충분한 농도로 조절되며, 이와같은 증폭과정에 의해 내성 콜로니들을 선택할 수 있고 HBsAg와 pHSA 수용체의 특징적인 면역원적 활성을 나타내는 입자를 분비하는 세포클론을 얻을 수 있다.
유리하게, 상기 라벨은 dhfr을 암호하는 DNA(또는 유전자)의 서열로 구성되며, 상기 억제제는 메토트레세이트로 구성된다.
상기 제 1 프로모터보다 약한 제 2 프로모터를 사용함으로써 HBsAg와 pHSA 수용체를 암호하는 DNA 서열의 복사체수를 증폭시키는데 바람직한 효과를 제공한다. 결과적으로 본 발명의 바람직한 셀라인은 상기 라벨을 암호하는 서열의 복제수가 가장 많이 포함되어 있으며, 결국 pre-S 및 S 영역을 암호하는 서열을 가장 많은 수로 포함하는 클론이며, 그 결과 이들은 억제제를 포함하는 배양배지중에서 생존한다.
유효한 클론들은 0.5 내지 40μg의 메토트레세이트, 특히 1 내지 25μg의 메토트레세이트를 함유하는 배양배지내에서 선택된다. 억제제가 보다 적은, 특히 5 내지 150nM의 메토트레세이트를 함유하는 배지내에서 사전-증폭을 실시하는 것이 바람직하며, 그후 이 일차단계에서 선택된 클론들을 상술한 바와같은 고농도의 메토트레세이트를 함유하는 배지내에서 배양시킨다.
본 발명은 이후 동물에서 유래된 셀라인을 형질전환시키기위해 사용되는 벡터들을 바람직하게 제작하는 방법 및 본 발명에 의한 입자들을 고수율로 분비하는 셀라인을 제조하는 방법에 관한 상세한 설명을 통해 확인할 수 있을 것이다. 이하 첨부된 도면을 참고로 설명한다 :
제 1 도와 제 2 도는 본 발명에 적합한, 특히 CHO 라인과 같은 동물세포를 효과적으로 형질전환시키는데 적합한 플라스미드의 제작방법을 구성하는 연속적인 단계를 나타낸 것이다.
제 3 도는 CHO 세포내에서 본 발명에 의한 폴리펩티드 면역원을 암호하는 DNA 서열을 증폭시키기 위한 조작을 도해적으로 나타낸 것이다. 제 4 도와 제 5 도는 본 발명에 의한 방법의 조건하에서 미리 형질전환시킨 세포들을 유전자 증폭시킨 결과를 나타낸 것이다. 제 6 도는 상기에서 얻어진 세퐁에서 관찰될 수 있는 특이 HBV-RNA 들의 함량의 함수로써, 상기 세포에서 얻어진 HBsAg 항원의 변화량을 나타낸 곡선이다. 제 7 도는 정지기에서 세포의 연속적인 수득결과를 도식적으로 나타낸 것이다.
I.-벡터의 제작
A-pSVS 플라스미드의 제작(제 1 도)
이 플라스미드는 SV40 비루스의 초기 프로모터의 조절하에 S영역(pre-S 영역 및 S 유전자)를 발현시킨다.
2.3kb의 Bg1 II분체(fragments)는 유럽특허출원 제81400634호에 이미 공지된 pCP10으로부터 절단했다. pCP10 플라스미드는 제 1 도에 도해되어 있다. 굵은선의 음영 부분은 HBV-DNA 에서 유래된 것이고, 얇은선 부분은 pBR322 플라스미드에서 유래된 것이다. 호 a로 나타낸 부분은 2.3kb의 전술한 분체에 해당한다. pCP10은 HBV 게놈이 헤드에서 꼬리로 직렬연결된 다이머를 포함하고 있다. 이 분체는 pre-S 영역의 ATG 앞쪽에 있는 10개 뉴클레오티드로 시작되며 S 유전자의 TAA 정지코돈뒤로 1.1kb 길이를 갖는 상태로 종결된다. 이것은 HBsAg 의 mRNA의 폴리아데닐화부위로 추정되는 부위와 S 유전자의 전사개시부위를 포함한다.
E.coli의 gpt 유전자가 SV40의 초기 영역인 348 염기쌍의 Puv II Hind III 분체에 융합되어 있는 플라스미드 pSV2 gpt (ATCC 37145)내에 함유된 SV40의 초기프로모터를 사용한다. 상기 분체는 SB40의 복제오리진(SV40 ori)이외에 초기 및 후기프로모터, 초기 메신저의 전사개시 부위와 일렬로 반복된 72 염기쌍을 포함하고 있다.
pSV2 gpt가 제 1 도에 도해되어 있다. 굵고 검은색 부분은 SV40 에서 유래된 것이고, 얇은선 부분은 pBR322로부터 유래된 것이다. 굵고 흰색인 pre-S 와 S 영역을 함유한다. 상기 음영부분은 HBV 의 비사용 서열에 해당한다.
pCP10에서 유래된 2.3kb Bg II 분체는 DNA 중합효소(Klenow)를 사용해, 개환시킨 상기 DNA의 상기 분체말단부를 플라스미드 pSV2 gpt 의 고유한 Hind III 부위내로 결찰시켜 삽입했다. 얻어진 재조합 플라스미드들을 연구한 후에, HBS 를 암호하는 영역이 SV40 프로모터에 대하여 그의 발현을 가능하도록 하는 형태로 배향되어 있는 클론을 선택하였다(pSVH4). 그 구조는 제한효소 지도로 확인하였고 두개의 분체 SV40과 HBV의 접합부에서의 뉴클레오티드 서열이 결정되었다.
플라스미드 pSVS는 세개의 플라스미드로부터 얻어진 하기의 세개 분체를 결찰시켜 제작했다.
1) pSVH4로부터 유래된 2.5kb의 분체인 Pvu I-Xho I(호 b).
2) pCP10으로부터 유래된 1.9kb의 분체인 Xho IBg1 II(호 c).
3) pBR322로부터 유래된 1.0kb의 분체인 BamH I Pve I(호 d).
그 결과 얻어진 플라스미드, pSVS(5.4kb)는 gpt영역이 없고, 이 gpt 서열 바로뒤의 SV40 DNA 서열이 다르고, pBR322의 EcoR I-BamHI 분체가 존재한다는 점에서 pSVH4와는 다르다.
B-프라스미드 pSVS dhfr의 제작(제 2 도)
하기 a)와 b)에서 정의된 분체들을 유전자 재조합시켜 실시했다.
a) dhfr을 함유하는 분체
G. Ringold와 coll. (1981) J. of Molecular and Applied Genetics 1: 165-1170(제 I-286호로 84년 3월 7일에 C.N.C.M.에 제출됨)에 상술된 플라스미드 pMTV dhfr을 효소 Pvu I로 선형화한 후에, 효소 Hind III를 사용해 부분적으로 분해시켜서,
-MMTV 의 LTR,
-dhfr의 cDNA,
-SV40의 tAg의 인트론,
-SV40의 초기유전자의 폴리아데닐화부위,
-pBR322의 EcoRI-PvuI 분체를 함유하는 4400 염기쌍의 분체(호 e)를 유리시켰다.
b) HBV DNA 분체
pSVS 플라스미드를 Puv I와 Hind III순서로 분해시켜,
-pBR322의 복제오리진을 함유하는 PvuI-PvuII ;
-SV40 비루스의 복제오리진과 초기 프로모터 ;
-pre-S와 S유전자의 폴리아데닐화 시그날뿐아니라 이 유전자를 암호하는 부분을 포함하는 HBV의 2.3kb Bg1 II분체 ;
-pBR322의 BamHI-HindIII 분체를 포함하는 4676 염기쌍의 분체(호 f)를 유리시켰다.
c) 상기 분체들의 결찰
이들 두개 분체를 정제한 후, 상동부위 Pvu I과 HindIII를 이용해 결합시킴으로써, pBR322의 암피실린에 대한 내성을 제공한다.
얻어진 재조합 벡터내에서, S 영역의 전사단위체와 dhfr 유전자의 전사단위체는 같은 방향으로 배향되어 있고, pBR322의 약 300 염기쌍에 의해 분리되어 있다.
dhfr을 암호하는 cDNA 는 또한 pSV2 dhfr(ATCC 337146), pSV3 dhfr(ATCC 37147) 또는 pSV5 dhfr(ATCC 31148)으로부터 얻을 수 있다. 약한 프로모터(MMTV의 LTR)의 조절하에 dhfr의 유전자가 위치하고 강한 프로모터(SV40의 초기 프로모터)의 조절하에 HBV 유전자가 위치함으로써 유전자 증폭 효율을 증가시킨다. pre-S 영역과 SV40의 초기 프로모터사이의 결합부의 뉴클레오티드 서열이 확정되었다(제 2 도).
II-동물세포의 형질감염(transfection)
1) CHO dhfr-에서 플라스미드 pSVS dhfr의 전달 및 발현 ;
CHO dhfr-세포(Urlaub G와 Chasin L.A. (1980) P.N.A.S. 77, 4216-4220)(제 I-287호로 1984년 3월 7일 C.N.C.M에 제출됨)를 Parker와 Stark(1979. J. Virology, 31, 360-369)에 의해 변형된 Graham 와 Van der Eb의 방법(1973, virology 52, 456-467)을 사용해 형질감염시켰다. CHO dhfr+에 의한 HBsAg의 생산여부는 세포배양물의 상청액중에서 방사면역분석법(RIA)으로 시험하였다. dhfr+클론의 60%가 HBsAg+였다. HBsAg 생산율은 24시간당 1 내지 20ng/106세포로 비교적 약했다.
2) HBV 서열의 증폭 :
이것은 엽산 유사물이며 dhfr 억제제인 메토트레세이트(MTX)의 존재하에서 CHO HBsAg+클론을 증식시킴으로써 실시되었다. 실제로, MTX 에 대한 내성은 주로 dhfr 유전자의 복사체수가 증폭되어 dhfr 효소의 양을 증가시키기 때문에 나타나는 것이다. HBV 서열과 dhfr 유전자가 같은 플라스미드에 의해 운반되어, 숙주세포의 DNA 내에 함께 통합되는 경우, HBV 서열은 MTX 내성클론에서 dhfr 서열과 함께 공동증폭된다. dhfr과 같이, HBV 서열의 복사체수도 증가되고, 그 결과 그 세포에 의한 HBsAg의 합성량도 함께 증가된다.
유전자 증폭은 제 3 도에 개요된 방법에 의해 두 단계로 실시했다. 제 4 도는 일차증폭 단계의 결과를 나타낸 것이고, 제 5 도는 이차증폭단계의 결과를 나타낸 것이다. 이것은 일차단계로부터 얻어진 대부분의 생산성 클론을 사용해 실시했다. 제 4 도와 제 5 도에서 점선의 막대는 증폭전의 HBsAg 합성율을 의미하며, 그리고 실선의 막대는 증폭후의 합성율을 나타낸 것이다. MTX의 농도는 이들 도면내에 기재되어 있다. 이 농도는 일차단계에서 50, 100 또는 140nM이며, 이차단계에서는 1.5, 10 또는 25μM이다. 전체적으로, 약 150개의 MTX 내성클론들이 HBsAg 의 생산을 위해 서별되었다.
제 4 도와 제 5 도에 나타낸 바와같이, HBsAg 생산의 증폭정도는 이차단계뿐 아니라 일차단계에서도 클론에 따라 상당히 가변적이었다. 다른 클론들중에 존재하는 HBV 서열의 세포당 복사체수는 32p로 라벨된 클론화된 HBV-DNA를 프로브(probe)로 사용하여 "도트블롯(dot blot)", 명명된 기법에 의해, 셀룰로즈 필터 또는 그의 유사물상에서 하이브리드화 방법으로 측정되었다. 동일한 용량의 MTX 를 사용한 경우, 이 복사체는 100 내지 500으로 클론에 따라 상당히 다양했다.
세포클론내의 HBV 서열의 구성은 Southern 방법으로 분석되었다. 상기 HBV 서열들은 통합형태(integrated from)로 존재하였다 ; 전기 영동 프로파일에 의해 각 클론들을 서로 비교하였다. 동일한 용량의 MTX 를 사용하였을때도 선택된 클론들 사이에서 차이가 관찰되기 때문에 HBsAg의 합성 농도 (결과를 나타내지 않았음)와 HBV-DNA의 복사체수 사이의 상층성에 관해 설명되지 않는다. dhfr 유전자에 대하여 비교 분석을 실시하였다. 동일한 용량의 MTX 를 사용하는 경우, 세포당 복사체의 수는 마찬가지로 클론에 따라서 상당히 다양했다(결과 보고 하지 않음). 소정의 클론에 대하여, HBV와 dhfr 서열이 함께 증폭되었다.
HBV의 특이 RNA의 양을 분자 하이브리드화 방법으로 분석하였다. DNA에 대하여 얻어진 결과와는 대조적으로, 특이 HBV RNA 의 양은 HBsAg 생산율과 비례하였다(제6도). 또한, 동일한 용량의 MTX(50nM)를 사용한 경우, dhfr 특이 RNA의 양은 분석된 다른 클론들내에서 일정하였다(제6도). 상기 특이 HBV RNA들을 Northern 방법에 의해 분석하였다. 두개의 RNA, 2.1kb의 RNA가 다량, 그리고 2.5kb 의 RNA 소량 존재한다는 것이 증명되었다. 이들 RNA들을 S1 뉴클레아제 지도로 분석 연구한 결과 2.1kb RNA 에 해당하는 3157 위치에서 pre-S 영역내에 주요개시부(major initiation)가 존재하며 2.5kb RNA에 해당하는 SV40 프로모터내에 부개시부(minor initiation)가 존재함이 확인되었다.
3) HBsAg 입자의 분석 :
이 분석은 37BA5에 의해 생산된 입자에 대하여 실시되었다. 정지상에서 얻어진 24시간 동안의 수득물에 해당하는 상청액을 함께 혼주한다. HBsAg 입자들을 CaCl 밀도구배에 2회 연속 초원심 분리시키고, 그후 자당구배에서 속도 초원심분리하여 정제한다. HBsAg 입자는 1.20의 밀도를 가진다. 전자현미경하에 관찰한 결과, 그들은 22nm의 평균 지름을 갖는 구형입자로 나타나며, 형태적으로는 인체유래의 입자와 유사했다. 관 형태(tubular form)의 것은 관찰되지 않았다.
DTT 존재하에서 5분간 100℃에서 입자를 해리시킨 후, 그 폴리펩티드를 SDS 의 존재하에서 폴리아크릴아미드상에서 겔 전기영동시켜 분석했다. 상기 겔을 실버염으로 착색시킴으로써 육안관찰할 수 있었다. 22, 300, 26, 100 및 34,000달톤의 폴리펩티드에 해당하는 세개가 밴드가 관찰되었다. 이들 세개 밴드의 상대적인 착색도면에서 볼때 상기 세단백질의 비율은 54%, 19%와, 27%였다.35S 메티오닌으로 생체내 라벨링한후에, 얻어진 정제입자를 항-HBs 혈청으로 면역침전시키고, 그후 이 단백질들을 전기 영동으로 분석했다. 상술된 세개 폴리펩티드는 오토래디오그램(autoradiogram)상에서의 비율로 검출되었다.
상기 입자의 표면에 pHSA에 대한 수용체가 존재하는지는 Pontisso등 (J. of Virological Methods 6, 151-159)에 의해 변형된 Hansson와 Purcell(1979), (Infect, Immun. 26, 125)의 방법에 따라 고체상에서의 방사능면역 분석법으로 시험했다.
이 수용체의 검출 시험결과, 정제된 입자상에서 뿐만아니라 상층액에서 모두 양성인 것으로 나타났다 (표 1) :
[표 1]
Figure kpo00002
Machida 등에 의해(1983) Gastroenterology 85, 268-274에 서술된 방법을 또한 사용할 수도 있다.
III-면역화분석법
알루미늄하이드록시드 Al(OH)3를 0.1% 농도로 가한 상기 입자의 제조물을 사용하여, Balb/c 쥐를 면역시켰다. 표 II에 나타낸 바와같이, 세포입자의 면역원 능력은 상표명 HEVAC B로 시판되는 B형간염백신(천연 HBsAg 를 일정농도로 함유한 혈청을 갖는 인체공혈자로부터 얻은 것임)의 면역원능력과 동일하다. 50%의 유효용량은 세포입자의 경우 0.04μg이며 HEVAC B(Institut Pasteur의 상표명)의 경우 0.03μg이다.
[표 II]
Figure kpo00003
μRIA=ABBOTT에 의해 시판되는 AUSAB 테스트로써 정의된 단위 선행된 과정으로부터 벡터 pSVS dhfr은 세포 DNA내로 통합된후 22nm의 입자형태인 HBV 비루스의 빈 외피를 합성 및 배출한다. HBV 게놈의 상당부분, 특히 캡시드(capsid)의 단백질을 암호하는 유전자를 제거하면 완전한 감염성 비루스 입자가 생산되지 않는다. 이 벡터는 또한 뮤린(murine) dhfr 유전자의 전사단위체를 갖고 있는데, 이것은 dhfr-내로 도입된 후 MTX 의 존재하에 그들을 유전자 증폭현상에 의해 증식시킬 수 있는 역할을 한다.
본원에서 사용된 MTX 에 대한 내성에 의한 증폭기법은 HBsAg 입자를 고농도로 생산하는 CHO 세포클론을 얻을 수 있도록 해준다. 이 증폭 방법은 클론에 따라서 변화될 수 있다. 어떤 경우에는, 그 합성농도가 1500배까지 증가되었다. 이같은 클론의 경우, 생산률은 24시간당 15μg/106세포이었다. 24시간당 106세포에서 1 내지 10μg의 HBsAg 를 생산하는 몇 개의 클론을 얻었다. 24시간 동안 ml당 발현되는 HBsAg 생산율은 배양조건에 좌우된다. 통상 10 내지 20μg/ml 24시간의 값이 얻어지며, 이 값은 만성보균자의 혈청내에 존재하는 HBsAg 농도에 필적하는 것이다. HBsAg 생산에 관한 동렷학 연구에 의하면 이합성과정은 수주일동안 정지상에서 일정하게 유지된다는 것이 증명되었다. 제 7 도는 제 3 주일 이상 배양배지를 주기적으로 교환(renewal)시킴으로써 정지상에서 세포로부터 연속적으로 얻어진 수율결과를 나타낸 것이다. 이 수거과정을 위해 무혈청 배지를 사용할 수 있다.
혈청이 없는 배지를 사용함으로써 비용면에서 절감효과외에도 세포상청액으로부터 입자를 용이하게 정제할 수 있고, 혈청에서 유래될 수 있는 오염물을 제거할 수 있는 장점이 있다. CHO 클론에서 HBsAg 를 합성하는 방법은 MTX 의 부재하에서도 대단히 안정함이 입증되었다. 이것은 6개월이상, 약 300세대동안 안정하다. 어떤 경우에는, 생산되는 HBsAg 가 약간 자발적으로 증가되는 현상도 관찰되었다.
유전자 증폭과정 동안 약 150개의 클론을 시험한 결과 HBsAg 생산이 감소되거나 소실되는 현상은 관찰되지 않았다. 이와같은 후자의 두 가지 관찰현상은 상기 벡터내에 있는 상기 HBV 서열과 상기 dhfr 유전자가 pBR322의 약 300 염기쌍에 의해 분리되어 있는벡터의 구조때문일 수도 있다.
본 발명은 결과적으로, 현저한 유전적 안정성을 갖는 면역원입자를 생산하는 클론을 제공할 수 있다.
HBV 서열의 복사체수와 HBsAg 합성률사이의 상관관계는 관찰되지 않았다. 상기에서 사용된 방법 ("도트블롯")으로 전체적인 정량화는 가능하지만, 작용성 서열(functional sequence)은 구별할 수 없다. 상기에서 얻어진 결과는 형질감염 및 증폭과정에 벡터내에 누락(deletion) 및 재배열이 발생하는 것으로 설명할 수 있다. 이 가정은 통합된 HBV 와 dhfr 서열을 전기영동시킨 결과 복잡한 프로파일이 나타나는 것으로부터 확인된다.
많은 이들 서열이 아마도 비-기능적일 것이다. 한편, HBsAg 합성수준과 특이 HBV-RNA의 양 사이에는 완전한 비례관계가 존재한다. 이로써 상기 관찰된 HBsAg 합성의 증가가 실제로는 HBV 서열의 전사가 증대되었기 때문이며 부분적으로는 아마도 기능성 복사체의 수 증대됨으로 인한 것임이 입증되었다. 이 결과는 또한, 증폭된 유전자의 복사체수를 측정함에 있어, 도트블롯에 의하거나 또는 전기영동 분석에 의한 것이거나 세포클론내의 유효한 복사체수를 측정하는 가장 우수한 시험방법은 아님을 나타내 주고 있다.
한편, 특이 RNA 를 정량하면 기능성 복사체수를 완벽하게 알 수 있다. 이 정량방법은 생산단백질이 쉽게 측정되지 않는 경우에서 특히 주목할만 하다. 그러므로 본 발명은 특히, 106cpm/μg의 특이활성도를 가지는 프로브(32 p로 라벨됨)에 대하여 상술된 바와같은 측정시스템에서 2×103cpm/106세포이상의 HBV-RNA 용량을 갖는 클론에 관한 것이다.
두개의 특이 HBV-RNA 가 존재함이 입증되었다. 2.1kb의 주요전사체 개시부는 3157 위치에서 pre-S 영역에 소재한다. 이것은 Catteneo 등이 (1983) Nature, 제305권, 336-338에 제시한 결과와 일치하는데, 그는 이 위치에 S 유전자의 전사개시부가 위치하고 있다고 하였다. 2.5kb의 소량의 RNA는 SV40 의 프로모터 내에서 개시된다. 이 RNA가 상기 입자내에 존재하는 34,000(GP34)의 폴리펩티드의 mRNA일 수도 있다. 따라서 아마도, GP34가 다량합성(상기 입자의 폴리펩티드중 27%)되는 이유는 반복되는 72염기쌍을 포함하며 pre-S 영역의 상부에 위치하는 SV40 의 초기프로모터를 이용하였기 때문일 것이다.
방사능면역 분석법을 사용한 결과, 상기 입자들이 pHSA 수용체를 함유하는 CHO 세포에 의해 합성되었다는 것이 입증되었다. Machida 등에 의해 (1983) Gastroenterology 85, 268-274에 개시된 바에 따르면, 이 수용체는 폴리펩티드 GP31과 GP35 에 의해 보유될 수 있다. 그러므로, 본 발명의 시스템에서는 상기 수용체가 GP34에 의해 보유된다고 추정할 수 있다. 세포유래의 입자내에서 pHSA 수용체의 보유체로써 두개가 아닌 단지 하나의 폴리펩티드가 존재한다고 하는 본 발명의 결과는 설명되지 않는다. 그러나 혈청입자와 반대로, CHO 세포에서의 글리코실화는 균일하다고 할 수 있다.
CHO 세포에 의해 합성된 22nm 의 HBsAg 입자는 혈청유래의 입자 제조물인 HEVAC B 와 동일한 면역 원성을 갖는다. 얻어진 HBsAg 생산율은 산업적으로 효용성을 갖을 수 있는 것이다. 이 입자들은 표면에 pHSA 수용체가 존재하므로 B형간염백신의 제조를 위해 본 발명시스템을 이용하면 추가 잇점을 얻을 수 있다.
이로써 본 발명은 본 발명에 의한 입자의 유효량, 특이 3 내지 6μg의 단백질/ml(단위용량)을 포함하며, 선택된 투여형태에 적합한, 특히 비경구 투여에 적합한 약학부형제를 함께 포함하는 비루스성 B형간염에 대한 백신조성물에 관한 것이다.

Claims (23)

  1. 비루스성 B형간염의 비루스 게놈중 S영역과 pre-S 영역을 암호하는 DNA 서열을 함유한 벡터를 사용하여 배양체로 유지시킬 수 있는, 인체 또는 동물에서 얻어진 셀라인을 형질전환시키는 단계 ; 와 상기 B형간염 비루스의 게놈중 S-영역과 pre-S 영역을 형질발현하는 배양체들을 분리하는 단계 ; 및 이렇게 얻어진 셀라인으로부터 배출된 폴리펩트드 입자를 회수하는 단계를 포함하며, 이때 이 폴리펩티드 입자는 B형간염 비루스 표면항원 및 중합된 인체혈청 알부민의 수용체를 함유하며 상기 DNA 서열은 상기 벡터의 내부에 위치하고, 상기 인체 또는 동물 세포내에서 상기 유전자의 전사를 유효하게 개시하는 능력을 갖고 있는 외인성 프로모터의 직접 조절하에 위치하고 있는 것을 특징으로 하는 폴리펩티드의 제조방법.
  2. 제 1 항에 있어서, 상기 벡터는 비루스 SV40에서 유래된 제 1 프로모터를 함유하며, 이 프로모터는 비루스 SV40의 초기 프로모터인 것을 특징으로 하는 방법.
  3. 제 2 항에 있어서, 상기 S영역과 pre-S 영역을 암호하는 상기 DNA 서열은 상기 프로모터 및 이 제 1 프로모터와 결합된 활성화 서열을 포함하는 DNA 분체 바로 뒤에 위치된 것을 특징으로 하는 방법.
  4. 제 3 항에 있어서, 상기 DNA 분체는 300 내지 400 염기쌍을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  5. 제 4 항에 있어서, 상기 DNA 분체는 별도의 프로모터 조절하에 위치한 라벨을 암호하는 DNA 서열을 포함하며, 이 제 2 프로모터는 상기 제 1 프로모터 보다 약한 것을 특징으로 하는 방법.
  6. 제 5 항에 있어서, 상기 라벨은 효소인 것을 특징으로 하는 방법.
  7. 제 6 항에 있어서, 상기 라벨은 디히드로폴레이트 리덕타제를 암호하는 유전자로 구성된 것을 특징으로 하는 방법.
  8. 제 7 항에 있어서, 상기 제 2 프로모터는 쥐의 유방암 비루스(MMTV)에서 유래된 것임을 특징으로 하는 방법.
  9. 제 1 항에 있어서, 상기 셀라인은 포유동물에서 유래된 것인 것을 특징으로 하는 방법.
  10. 제 9 항에 있어서, 상기 셀라인은 차이니즈 햄스터 오버리(CHO) 세포인 것을 특징으로 하는 방법.
  11. 제 9 항에 있어서, 상기 세포들은 상기 배양 배지내로 HBsAg 항원의 면역원적 특성 및 면역학적 특성을 갖으며, 18 내지 25mm 크기를 갖고, CsCl 기제의 밀도 구배에서 1.20-1.22g/ml의 밀도를 갖으며, 데인입자, HBe 와 HBc 항원은 함유하지 않고 중합된 인체 알부민에 대한 수용체를 함유하는 구형의 폴리펩티드 입자들을 배출하는 것을 특징으로 하는 방법.
  12. 제11항에 있어서, 상기 폴리펩티드들은 34,000탈톤의 분자량을 갖는 것을 특징으로 하는 방법.
  13. 제12항에 있어서, 상기 34,000달톤의 분자량을 갖는 폴리펩티드들은 상기 입자를 구성하는 폴리펩티드 총량의 10% 이상의 비율로 존재하는 것을 특징으로 하는 방법.
  14. 제19항에 있어서, 상기 34,000달톤의 분자량을 갖는 폴리펩티드들은 상기 입자를 구성하는 폴리펩티드 총량의 20% 이상의 비율로 존재하는 것을 특징으로 하는 방법.
  15. 제13항에 있어서, 인체에서 유래된 혈청성분은 제거하는 것을 특징으로 하는 방법.
  16. 제11항에 있어서, 상기 세포들은 상기 배양 배지내로 24시간 동안 106세포당 HBsAg 항원을 1μg이상의 비율로 배출하는 것을 특징으로 하는 방법.
  17. 제16항에 있어서, 상기 세포들은 상기 배양 배지내로 24시간동안 106세포당 HBsAg 항원을 10μg 이상의 비율로 배출하는 것을 특징으로 하는 방법.
  18. 제16항에 있어서, 2.1kb 이상의 크기를 갖는 검출가능한 특이 HBV-RNA들이 존재하는 것을 특징으로 하는 방법.
  19. 제16항에 있어서, 2.2내지 2.8kb의 크기를 갖는 검출가능한 HBV-RNA들이 존재하는 것을 특징으로 하는 방법.
  20. 제19항에 있어서, 말단-S 영역에서 개시되어 상기 S영역과 pre-S 영역이 전사됨으로써 얻어진 2.1kb 크기의 특이 HBV-RNA가 동시에 검출되는 것을 특징으로 하는 방법.
  21. 제11항에 있어서, 상기 세포가 HBsAg 항원의 면역원적 특성 및 면역학적 특성을 갖으며, 적어도 일부는 분자량이 34,000 정도인 단백질로 형성되며, HBsAg 및 pHSA 수용체 모두의 항원 부위를 함유하는 것을 특징으로 하는 입자를 배출하는 것을 특징으로 하는 방법.
  22. 제 15 항에 있어서, 상기 형질전환된 셀라인의 배양체는 상기 라벨의 억제제 존재하에 생성되며, 상기 배양 배지내에서 상기 억제제의 농도는 배양단계에서 상기 콜로니중 적어도 일부가 상기 라벨을 암호하는 유전자의 복사체수를 증폭시키기에 충분한 농도로 조절되며, 상기 라벨을 암호하는 유전자의 수를 증폭시킴으로써 내성콜로니를 선택할 수 있고, 이와동시에 상기 입자들을 증가된 량으로 분비하는 세포클론을 얻을 수 있는 것을 특징으로 하는 방법.
  23. 제22항에 있어서, 상기 라벨은 디하이드로 폴레이트-리덕타제를 암호하는 서열 또는 유전자로 구성되며, 상기 억제제는 메토트레세이트로 구성된 것을 특징으로 하는 방법.
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