DK166357B - Partikler med immunogene egenskaber svarende til hbs antigen samt vektorer og animalske celler til produktion af saadanne partikler - Google Patents
Partikler med immunogene egenskaber svarende til hbs antigen samt vektorer og animalske celler til produktion af saadanne partikler Download PDFInfo
- Publication number
- DK166357B DK166357B DK202586A DK202586A DK166357B DK 166357 B DK166357 B DK 166357B DK 202586 A DK202586 A DK 202586A DK 202586 A DK202586 A DK 202586A DK 166357 B DK166357 B DK 166357B
- Authority
- DK
- Denmark
- Prior art keywords
- particles
- polypeptide
- amino acids
- region
- foreign
- Prior art date
Links
- 239000002245 particle Substances 0.000 title claims abstract description 99
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 title claims abstract description 71
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 title claims abstract description 71
- 239000000427 antigen Substances 0.000 title claims abstract description 69
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 title claims abstract description 12
- 239000013598 vector Substances 0.000 title claims description 13
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 title claims description 6
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims abstract description 68
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims abstract description 59
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims abstract description 58
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims abstract description 43
- 101150010882 S gene Proteins 0.000 claims abstract description 15
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 claims abstract description 14
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims abstract description 9
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims abstract 6
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 44
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 40
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 18
- 241000700721 Hepatitis B virus Species 0.000 claims description 16
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 16
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims description 7
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 7
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 7
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 claims description 6
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 claims description 6
- 238000013518 transcription Methods 0.000 claims description 6
- 230000035897 transcription Effects 0.000 claims description 6
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 claims description 5
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 claims description 5
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 3
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 2
- 210000005253 yeast cell Anatomy 0.000 claims description 2
- 244000005700 microbiome Species 0.000 claims 1
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 34
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 30
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 26
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 26
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 23
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 23
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 16
- AIYUHDOJVYHVIT-UHFFFAOYSA-M caesium chloride Chemical compound [Cl-].[Cs+] AIYUHDOJVYHVIT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 16
- 241000991587 Enterovirus C Species 0.000 description 13
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 13
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 13
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 11
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 10
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 8
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 8
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 8
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 7
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 7
- 208000002672 hepatitis B Diseases 0.000 description 7
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 7
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 6
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 6
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 6
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 6
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 6
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 6
- 101710132601 Capsid protein Proteins 0.000 description 5
- 101710118046 RNA-directed RNA polymerase Proteins 0.000 description 5
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 5
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 5
- 238000001114 immunoprecipitation Methods 0.000 description 5
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 5
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 5
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 5
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 5
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 206010003445 Ascites Diseases 0.000 description 4
- 101710197658 Capsid protein VP1 Proteins 0.000 description 4
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 4
- 108010053187 Diphtheria Toxin Proteins 0.000 description 4
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 4
- 101710108545 Viral protein 1 Proteins 0.000 description 4
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 4
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 4
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 4
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 4
- 208000006454 hepatitis Diseases 0.000 description 4
- 231100000283 hepatitis Toxicity 0.000 description 4
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 4
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 4
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 4
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 4
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 3
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 3
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 3
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 3
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 3
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 3
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 3
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 3
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 3
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 3
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 3
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 3
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 3
- 108091005573 modified proteins Proteins 0.000 description 3
- 102000035118 modified proteins Human genes 0.000 description 3
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 3
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 3
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 3
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 3
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 3
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 3
- 230000000153 supplemental effect Effects 0.000 description 3
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 3
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 3
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 2
- 102000016607 Diphtheria Toxin Human genes 0.000 description 2
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 2
- SBANPBVRHYIMRR-GARJFASQSA-N Leu-Ser-Pro Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N1CCC[C@@H]1C(=O)O)N SBANPBVRHYIMRR-GARJFASQSA-N 0.000 description 2
- SBANPBVRHYIMRR-UHFFFAOYSA-N Leu-Ser-Pro Natural products CC(C)CC(N)C(=O)NC(CO)C(=O)N1CCCC1C(O)=O SBANPBVRHYIMRR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 2
- 108700003740 Poliovirus VP1 Proteins 0.000 description 2
- 241000220317 Rosa Species 0.000 description 2
- QOLYAJSZHIJCTO-VQVTYTSYSA-N Thr-Pro Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(=O)N1CCC[C@H]1C(O)=O QOLYAJSZHIJCTO-VQVTYTSYSA-N 0.000 description 2
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 2
- 238000000376 autoradiography Methods 0.000 description 2
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 2
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 2
- 108091092356 cellular DNA Proteins 0.000 description 2
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 2
- 239000000470 constituent Substances 0.000 description 2
- 229960003964 deoxycholic acid Drugs 0.000 description 2
- KXGVEGMKQFWNSR-LLQZFEROSA-N deoxycholic acid Chemical compound C([C@H]1CC2)[C@H](O)CC[C@]1(C)[C@@H]1[C@@H]2[C@@H]2CC[C@H]([C@@H](CCC(O)=O)C)[C@@]2(C)[C@@H](O)C1 KXGVEGMKQFWNSR-LLQZFEROSA-N 0.000 description 2
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 description 2
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 description 2
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 2
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 2
- 239000012133 immunoprecipitate Substances 0.000 description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 2
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 2
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 2
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 2
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 2
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 2
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 2
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 230000003472 neutralizing effect Effects 0.000 description 2
- YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N phenylmethanesulfonyl fluoride Chemical compound FS(=O)(=O)CC1=CC=CC=C1 YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 2
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 2
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 2
- 238000004062 sedimentation Methods 0.000 description 2
- 229910052709 silver Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000004332 silver Substances 0.000 description 2
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 2
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 2
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 2
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 2
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241001529453 unidentified herpesvirus Species 0.000 description 2
- 210000003501 vero cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 2
- XVZCXCTYGHPNEM-IHRRRGAJSA-N (2s)-1-[(2s)-2-[[(2s)-2-amino-4-methylpentanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]pyrrolidine-2-carboxylic acid Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N1CCC[C@H]1C(O)=O XVZCXCTYGHPNEM-IHRRRGAJSA-N 0.000 description 1
- GEYOCULIXLDCMW-UHFFFAOYSA-N 1,2-phenylenediamine Chemical compound NC1=CC=CC=C1N GEYOCULIXLDCMW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- -1 6-13 amino acids Chemical class 0.000 description 1
- 208000030507 AIDS Diseases 0.000 description 1
- HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N Acrylamide Chemical compound NC(=O)C=C HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OOIMKQRCPJBGPD-XUXIUFHCSA-N Arg-Ile-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O OOIMKQRCPJBGPD-XUXIUFHCSA-N 0.000 description 1
- AOHKLEBWKMKITA-IHRRRGAJSA-N Arg-Phe-Ser Chemical compound C1=CC=C(C=C1)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)N AOHKLEBWKMKITA-IHRRRGAJSA-N 0.000 description 1
- IBLAOXSULLECQZ-IUKAMOBKSA-N Asn-Ile-Thr Chemical compound C[C@@H](O)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)CC)NC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O IBLAOXSULLECQZ-IUKAMOBKSA-N 0.000 description 1
- SONUFGRSSMFHFN-IMJSIDKUSA-N Asn-Ser Chemical compound NC(=O)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O SONUFGRSSMFHFN-IMJSIDKUSA-N 0.000 description 1
- 102100022717 Atypical chemokine receptor 1 Human genes 0.000 description 1
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 1
- 208000000419 Chronic Hepatitis B Diseases 0.000 description 1
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K Citrate Chemical compound [O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- BYALSSDCQYHKMY-XGEHTFHBSA-N Cys-Arg-Thr Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)NC(=O)[C@H](CS)N)O BYALSSDCQYHKMY-XGEHTFHBSA-N 0.000 description 1
- ABLJDBFJPUWQQB-DCAQKATOSA-N Cys-Leu-Arg Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CS)N ABLJDBFJPUWQQB-DCAQKATOSA-N 0.000 description 1
- DQUWSUWXPWGTQT-DCAQKATOSA-N Cys-Pro-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H]1CCCN1C(=O)[C@@H](N)CS DQUWSUWXPWGTQT-DCAQKATOSA-N 0.000 description 1
- KSMSFCBQBQPFAD-GUBZILKMSA-N Cys-Pro-Pro Chemical compound SC[C@H](N)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N1[C@H](C(O)=O)CCC1 KSMSFCBQBQPFAD-GUBZILKMSA-N 0.000 description 1
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 1
- 108010005054 Deoxyribonuclease BamHI Proteins 0.000 description 1
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 1
- 102100031780 Endonuclease Human genes 0.000 description 1
- 108010042407 Endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- 101710142246 External core antigen Proteins 0.000 description 1
- 208000034454 F12-related hereditary angioedema with normal C1Inh Diseases 0.000 description 1
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 1
- NBWATNYAUVSAEQ-ZEILLAHLSA-N His-Thr-Thr Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC1=CN=CN1)N)O NBWATNYAUVSAEQ-ZEILLAHLSA-N 0.000 description 1
- 101000678879 Homo sapiens Atypical chemokine receptor 1 Proteins 0.000 description 1
- 241000709727 Human poliovirus 3 Species 0.000 description 1
- XQFRJNBWHJMXHO-RRKCRQDMSA-N IDUR Chemical compound C1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C(=O)NC(=O)C(I)=C1 XQFRJNBWHJMXHO-RRKCRQDMSA-N 0.000 description 1
- TYYLDKGBCJGJGW-UHFFFAOYSA-N L-tryptophan-L-tyrosine Natural products C=1NC2=CC=CC=C2C=1CC(N)C(=O)NC(C(O)=O)CC1=CC=C(O)C=C1 TYYLDKGBCJGJGW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- XVZCXCTYGHPNEM-UHFFFAOYSA-N Leu-Leu-Pro Natural products CC(C)CC(N)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)N1CCCC1C(O)=O XVZCXCTYGHPNEM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- IEWBEPKLKUXQBU-VOAKCMCISA-N Leu-Leu-Thr Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O IEWBEPKLKUXQBU-VOAKCMCISA-N 0.000 description 1
- JDBQSGMJBMPNFT-AVGNSLFASA-N Leu-Pro-Val Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O JDBQSGMJBMPNFT-AVGNSLFASA-N 0.000 description 1
- SVBJIZVVYJYGLA-DCAQKATOSA-N Leu-Ser-Val Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O SVBJIZVVYJYGLA-DCAQKATOSA-N 0.000 description 1
- BQVUABVGYYSDCJ-ZFWWWQNUSA-N Leu-Trp Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](NC(=O)[C@@H](N)CC(C)C)C(O)=O)=CNC2=C1 BQVUABVGYYSDCJ-ZFWWWQNUSA-N 0.000 description 1
- FDBTVENULFNTAL-XQQFMLRXSA-N Leu-Val-Pro Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N1CCC[C@@H]1C(=O)O)N FDBTVENULFNTAL-XQQFMLRXSA-N 0.000 description 1
- BDFHWFUAQLIMJO-KXNHARMFSA-N Lys-Thr-Pro Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)N1CCC[C@@H]1C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCCCN)N)O BDFHWFUAQLIMJO-KXNHARMFSA-N 0.000 description 1
- BQVUABVGYYSDCJ-UHFFFAOYSA-N Nalpha-L-Leucyl-L-tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(NC(=O)C(N)CC(C)C)C(O)=O)=CNC2=C1 BQVUABVGYYSDCJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229930193140 Neomycin Natural products 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 description 1
- 240000008881 Oenanthe javanica Species 0.000 description 1
- 108010038807 Oligopeptides Proteins 0.000 description 1
- 102000015636 Oligopeptides Human genes 0.000 description 1
- RFCVXVPWSPOMFJ-STQMWFEESA-N Phe-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 RFCVXVPWSPOMFJ-STQMWFEESA-N 0.000 description 1
- OSBADCBXAMSPQD-YESZJQIVSA-N Phe-Leu-Pro Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(=O)N1CCC[C@@H]1C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC2=CC=CC=C2)N OSBADCBXAMSPQD-YESZJQIVSA-N 0.000 description 1
- GKZIWHRNKRBEOH-HOTGVXAUSA-N Phe-Phe Chemical compound C([C@H]([NH3+])C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C([O-])=O)C1=CC=CC=C1 GKZIWHRNKRBEOH-HOTGVXAUSA-N 0.000 description 1
- VDTYRPWRWRCROL-UFYCRDLUSA-N Phe-Val-Phe Chemical compound C([C@H](N)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(O)=O)C1=CC=CC=C1 VDTYRPWRWRCROL-UFYCRDLUSA-N 0.000 description 1
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 description 1
- 208000000474 Poliomyelitis Diseases 0.000 description 1
- XYSXOCIWCPFOCG-IHRRRGAJSA-N Pro-Leu-Leu Chemical compound [H]N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O XYSXOCIWCPFOCG-IHRRRGAJSA-N 0.000 description 1
- LNICFEXCAHIJOR-DCAQKATOSA-N Pro-Ser-Leu Chemical compound [H]N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O LNICFEXCAHIJOR-DCAQKATOSA-N 0.000 description 1
- RMJZWERKFFNNNS-XGEHTFHBSA-N Pro-Thr-Ser Chemical compound [H]N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O RMJZWERKFFNNNS-XGEHTFHBSA-N 0.000 description 1
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 description 1
- NLOAIFSWUUFQFR-CIUDSAMLSA-N Ser-Leu-Asp Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O NLOAIFSWUUFQFR-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- FLONGDPORFIVQW-XGEHTFHBSA-N Ser-Pro-Thr Chemical compound C[C@@H](O)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H]1CCCN1C(=O)[C@@H](N)CO FLONGDPORFIVQW-XGEHTFHBSA-N 0.000 description 1
- PYTKULIABVRXSC-BWBBJGPYSA-N Ser-Ser-Thr Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O PYTKULIABVRXSC-BWBBJGPYSA-N 0.000 description 1
- DKGRNFUXVTYRAS-UBHSHLNASA-N Ser-Ser-Trp Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC1=CNC2=C1C=CC=C2)C(O)=O DKGRNFUXVTYRAS-UBHSHLNASA-N 0.000 description 1
- TYIHBQYLIPJSIV-NYVOZVTQSA-N Ser-Trp-Trp Chemical compound C1=CC=C2C(=C1)C(=CN2)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC3=CNC4=CC=CC=C43)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CO)N TYIHBQYLIPJSIV-NYVOZVTQSA-N 0.000 description 1
- 101710185500 Small t antigen Proteins 0.000 description 1
- 241000191967 Staphylococcus aureus Species 0.000 description 1
- VPZKQTYZIVOJDV-LMVFSUKVSA-N Thr-Ala Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O VPZKQTYZIVOJDV-LMVFSUKVSA-N 0.000 description 1
- KWQBJOUOSNJDRR-XAVMHZPKSA-N Thr-Cys-Pro Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N1CCC[C@@H]1C(=O)O)N)O KWQBJOUOSNJDRR-XAVMHZPKSA-N 0.000 description 1
- YJCVECXVYHZOBK-KNZXXDILSA-N Thr-Ile-Pro Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N1CCC[C@@H]1C(=O)O)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)N YJCVECXVYHZOBK-KNZXXDILSA-N 0.000 description 1
- GXDLGHLJTHMDII-WISUUJSJSA-N Thr-Ser Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O GXDLGHLJTHMDII-WISUUJSJSA-N 0.000 description 1
- AHERARIZBPOMNU-KATARQTJSA-N Thr-Ser-Leu Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O AHERARIZBPOMNU-KATARQTJSA-N 0.000 description 1
- RVMNUBQWPVOUKH-HEIBUPTGSA-N Thr-Ser-Thr Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O RVMNUBQWPVOUKH-HEIBUPTGSA-N 0.000 description 1
- DSGIVWSDDRDJIO-ZXXMMSQZSA-N Thr-Thr Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O DSGIVWSDDRDJIO-ZXXMMSQZSA-N 0.000 description 1
- NDZYTIMDOZMECO-SHGPDSBTSA-N Thr-Thr-Ala Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O NDZYTIMDOZMECO-SHGPDSBTSA-N 0.000 description 1
- LECUEEHKUFYOOV-ZJDVBMNYSA-N Thr-Thr-Val Chemical compound CC(C)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@@H](N)[C@@H](C)O LECUEEHKUFYOOV-ZJDVBMNYSA-N 0.000 description 1
- BTAJAOWZCWOHBU-HSHDSVGOSA-N Thr-Val-Trp Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](N)[C@@H](C)O)C(C)C)C(O)=O)=CNC2=C1 BTAJAOWZCWOHBU-HSHDSVGOSA-N 0.000 description 1
- 102000006601 Thymidine Kinase Human genes 0.000 description 1
- 108020004440 Thymidine kinase Proteins 0.000 description 1
- 108090000992 Transferases Proteins 0.000 description 1
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 description 1
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 1
- AVYVKJMBNLPWRX-WFBYXXMGSA-N Trp-Ala-Ser Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O)=CNC2=C1 AVYVKJMBNLPWRX-WFBYXXMGSA-N 0.000 description 1
- RWAYYYOZMHMEGD-XIRDDKMYSA-N Trp-Leu-Ser Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O)=CNC2=C1 RWAYYYOZMHMEGD-XIRDDKMYSA-N 0.000 description 1
- UQHPXCFAHVTWFU-BVSLBCMMSA-N Trp-Phe-Val Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CNC2=C1C=CC=C2)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O UQHPXCFAHVTWFU-BVSLBCMMSA-N 0.000 description 1
- TYYLDKGBCJGJGW-WMZOPIPTSA-N Trp-Tyr Chemical compound C([C@H](NC(=O)[C@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)N)C(O)=O)C1=CC=C(O)C=C1 TYYLDKGBCJGJGW-WMZOPIPTSA-N 0.000 description 1
- WGBFZZYIWFSYER-BVSLBCMMSA-N Trp-Val-Tyr Chemical compound CC(C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(C=C1)O)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC2=CNC3=CC=CC=C32)N WGBFZZYIWFSYER-BVSLBCMMSA-N 0.000 description 1
- 101710162629 Trypsin inhibitor Proteins 0.000 description 1
- 229940122618 Trypsin inhibitor Drugs 0.000 description 1
- YLHFIMLKNPJRGY-BVSLBCMMSA-N Tyr-Arg-Trp Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC1=CNC2=C1C=CC=C2)C(O)=O YLHFIMLKNPJRGY-BVSLBCMMSA-N 0.000 description 1
- YYLHVUCSTXXKBS-IHRRRGAJSA-N Tyr-Pro-Ser Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O YYLHVUCSTXXKBS-IHRRRGAJSA-N 0.000 description 1
- QPOUERMDWKKZEG-HJPIBITLSA-N Tyr-Ser-Ile Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 QPOUERMDWKKZEG-HJPIBITLSA-N 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 150000001412 amines Chemical class 0.000 description 1
- 229940126575 aminoglycoside Drugs 0.000 description 1
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 125000000613 asparagine group Chemical group N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)* 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 1
- 244000309466 calf Species 0.000 description 1
- 210000000234 capsid Anatomy 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 239000003638 chemical reducing agent Substances 0.000 description 1
- 210000004978 chinese hamster ovary cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000001684 chronic effect Effects 0.000 description 1
- 239000007979 citrate buffer Substances 0.000 description 1
- 239000004927 clay Substances 0.000 description 1
- 238000012761 co-transfection Methods 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 108010004073 cysteinylcysteine Proteins 0.000 description 1
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 description 1
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 1
- 230000007717 exclusion Effects 0.000 description 1
- 230000029142 excretion Effects 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 230000002349 favourable effect Effects 0.000 description 1
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 description 1
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 1
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 1
- 239000012737 fresh medium Substances 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 239000008187 granular material Substances 0.000 description 1
- 208000016861 hereditary angioedema type 3 Diseases 0.000 description 1
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 239000007928 intraperitoneal injection Substances 0.000 description 1
- NUHSROFQTUXZQQ-UHFFFAOYSA-N isopentenyl diphosphate Chemical compound CC(=C)CCO[P@](O)(=O)OP(O)(O)=O NUHSROFQTUXZQQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002386 leaching Methods 0.000 description 1
- 230000002934 lysing effect Effects 0.000 description 1
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 201000000050 myeloid neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 229960004927 neomycin Drugs 0.000 description 1
- 230000001254 nonsecretory effect Effects 0.000 description 1
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 1
- 102000013415 peroxidase activity proteins Human genes 0.000 description 1
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 1
- 108010073101 phenylalanylleucine Proteins 0.000 description 1
- 108010073025 phenylalanylphenylalanine Proteins 0.000 description 1
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 229910052698 phosphorus Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011574 phosphorus Substances 0.000 description 1
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 description 1
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 1
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 1
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 230000001177 retroviral effect Effects 0.000 description 1
- 239000013049 sediment Substances 0.000 description 1
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 239000012798 spherical particle Substances 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 230000001629 suppression Effects 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 1
- 238000010257 thawing Methods 0.000 description 1
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 1
- 239000002753 trypsin inhibitor Substances 0.000 description 1
- 108010044292 tryptophyltyrosine Proteins 0.000 description 1
- 231100000588 tumorigenic Toxicity 0.000 description 1
- 230000000381 tumorigenic effect Effects 0.000 description 1
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 description 1
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 1
- 210000002845 virion Anatomy 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- 238000004018 waxing Methods 0.000 description 1
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 1
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2730/00—Reverse transcribing DNA viruses
- C12N2730/00011—Details
- C12N2730/10011—Hepadnaviridae
- C12N2730/10111—Orthohepadnavirus, e.g. hepatitis B virus
- C12N2730/10122—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
- C12N2770/00011—Details
- C12N2770/32011—Picornaviridae
- C12N2770/32611—Poliovirus
- C12N2770/32622—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Virology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Oncology (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Description
DK 166357B
i
Den foreliggende opfindelse angår polypeptidpartikler, som fortrinsvis er i det væsentlige kugleformede, i det mindste for størstedelens vedkommende, hvilke partikler har immunogene og immunologiske egenskaber, som er karak-5 teristiske for overfladeantigenet (ofte betegnet ved forkortelsen HBs antigen) af hepatitis B virus. De omhandlede partikler er særegne ved, at de desuden bærer mindst én fremmed peptid-sekvens af et polypeptid, som normalt kodes af S-genet i hepatitis B-virus. Opfindelsen angår 10 endvidere rekombinant-DNA'er og eukaryote cellelinier, fortrinsvis af animalsk oprindelse, som i deres dyrkningsmedium er i stand til at udskille polypeptidpartikler af den ovennævnte art.
15 Det er velkendt, at serum fra kroniske bærere af hepatitis B virus (HBV) indeholder tomme virale kapper i form af partikler eller filamenter med en diameter på 22 nm og undertiden fuldstændige inficerende virion'er, som er sfæriske partikler med en diameter på 42 nm.
20 Når de tomme kapper først er oprenset på basis af serum fra kroniske virus-bærere, anvendes de til fremstilling af vacciner imod hepatitis B. Man ved, at det nu også er muligt at opnå partikler med en diameter på 22 nm i store 25 mængder ved andre fremgangsmåder. De genetiske manipulationer med genet, som koder for partiklernes hovedprotein (genet S), har gjort det muligt at fremstille partiklerne i kulturens cellelinier (M.F. Dubois et al., (1980),
Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77, 4549-4553), i gær (P. Va-30 lenzuela et al., (1982), Nature, 298, 347-350) eller under medvirken af rekombinant virus (G. L. Smith et al., (1983), Nature, 302, 490-495). En metode til fremstilling af partiklerne omfatter en transformation af eukaryote celler ved hjælp af en passende vektor, som indeholder 35 genet S under styring af en effektiv, promotor, en dyrkning af de transformerede celler og en udvinding af de producerede partikler, enten ud fra på forhånd lyserede 2
DK 166357 B
celler eller ud fra dyrkningsmediet, når partiklerne er blevet udskilt af de anvendte cellelinier (især i de tilfælde, hvor man anvender celler fra aber, f.eks. af typen VERO).
5
Hovedpolypeptidet, som indkodes af genet S, og som indgår i konstitutionen af de omhandlede partikler, er sammensat af 226 aminosyrer og har en molekylvægt på 25400 dalton.
Det er desuden eftervist, at visse naturlige partikler i 10 hovedpolypeptidet kan bestå af et polypeptid med en højere molekylvægt, nærmere bestemt af størrelsesordenen 34000 dalton, som indeholder polypeptidsekvensen af det ovennævnte hovedpolypeptid, idet det har den samme C-ter-minale ende som hovedpolypeptidet og desuden en supple-15 rende sekvens på 55 aminosyrer i den N-terminale ende (Stibbe X. og Gerlich W.H., (1983), J. Virology, 46, 626-628) indkodet af præ-S-regionen af genomet i hepatitis B.
Denne supplerende sekvens i den N-terminale position er tilsyneladende ikke særligt stabil i de naturlige partik-20 ler, og den synes derfor ikke at spille nogen væsentlig rolle for HBs partiklernes konstitution og kohæsion. HBs-partiklerne vides at være sammensat af organiserede aggregater, som kun i ringe grad er følsomme over for proteaser, og de omfatter omkring 100 sådanne hovedpoly-25 peptider og andre bestanddele, nærmere bestemt lipidiske bestanddele. En metode, som gør det muligt at opnå sammensætninger, der indeholder en betydelig del, nærmere bestemt op til i alt 35% af de dannede polypeptider, af mere stabile partikler indeholdende den nævnte suppleren-30 de sekvens, er tidligere beskrevet (Michel, M.L. et al., (1984), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81, 7708-7712). Denne kendte proces gør brug af eukaryote cellelinier, nærmere bestemt en kultur af humane eller animalske celler, som på forhånd er transformeret af vektorer, der indeholder 35 en DNA-sekvens, som koder for S- og præ-S regionerne i hepatitis B virus-genomet, hvilken sekvens er lokaliseret . i vektorens indre og er under direkte kontrol af en exo- 3
DK 166357 B
gen promotor. Denne promotor har en kendt evne til at sikre en effektiv start af den genetiske transkription under direkte kontrol i de eukaryote celler, i særdeleshed humane eller animalske celler, til hvilke de nævnte 5 vektorer er beregnet. Der kan eksempelvis henvises til artiklen af Galibert et al., (1979), Nature 281, p. 646-650), hvad angår den nævnte DNA-sekvens.
Når de anvendte cellelinier stammer fra aber, er det en 10 fordel at råde over en promotor hidrørende fra SV40 virus, om hvilket virus man kender evnen til at iværksætte en effektiv transkription af de nærliggende gener i abecellerne. Denne promotor kan med fordel svare til den "tidligere" SV40 virus-promotor, som normalt kontrollerer 15 udtrykkeisen af det "lille" T-antigen ("small T antigen") og ligeledes det "store" T-antigen ("large T antigen").
Den naturlige variabilitet af den N-terminale ende af polypeptiderne i kappen af hepatitis B virus har givet 20 anledning til den antagelse, at de protein-fragmenter, som er adskilt fra den nævnte supplerende sekvens, vil kunne substitueres og fusioneres med det nævnte hovedpo-lypeptid. Denne tanke er blevet realiseret af Valenzuela et al., som i transformerede gærtyper opnåede partikler 25 på basis af hybrid-proteiner, der i det væsentlige bestod af det ovennævnte hovedpolypeptid, som i den N-terminale ende var modificeret med et supplerende polypeptid omfattende omkring 100 aminosyrer, der hidrørte fra glycoprotein D fra herpes-virus. Valenzuela et al. har rapporte-30 ret, at de transformerede partikler er i stand til at inducere antistoffer imod både hepatitis B virus og herpesvirus på en gang (P. Valenzuela et al., (1982), Nature, 298, 347-350, og P. Valenzuela (1984), "Proceedings of the Twelwth International Conference on Yeast Genetics 35 and Molecular Biology", Edinburgh, (1984), 16).
4
DK 166357 B
Formålet med den foreliggende opfindelse er at tilvejebringe polypeptid-partikler, som har grundlæggende immunogene egenskaber svarende til egenskaberne af HBs antigen, og som indeholder mindst en anden peptid-sekvens, 5 som fortrinsvis også er immunogen, hvilket med andre ord vil sige polypeptidpartikler, som er i stand til at kunne udnyttes til opbygning af blandede vacciner, der har en optimal stabilitet, hvilken anden peptid-sekvens skal være til stede, hver gang hovedpolypeptidet, enten hoved-10 polypeptidet i sig selv eller fortrinsvis hoved-glycopro-teinet af HBs antigenet, skal syntetiseres, uden at der sker nogen væsentlig påvirkning af den særlige og karakteristiske opbygning af kappe-antigenerne i hepatitis B virus1 et.
15
Opfindelsen har også til formål at tilvejebringe partikler af denne type, som i givet fald også kan indeholde den supplerende sekvens, der normalt kodes af præ-S-regionen af genomet i hepatitis B-virus, i intakt til-20 stand. Dette skal dog forstås således, at den supplerende sekvens også kan modificeres, f.eks. ifølge de tilfælde, som er beskrevet af Valenzuela et al. Opretholdelsen af den intakte karakter af den nævnte supplerende sekvens kan imidlertid forklares ved den forstærkede immunogeni-25 citet, som kan opstå hos de modificerede polypeptider ifølge opfindelsen.
Partikler ifølge opfindelsen, som indeholder en så stor del af de karakteristiske aminosyresekvenser af hovedpep-30 tidet i hepatitis B virus-overfladeantigenet (HBs antigen), at denne del er tilstrækkelig til at bibringe partiklerne en struktur, der ligner strukturen af de naturlige partikler, der er karakteristiske for HBs antigen, er ejendommelige ved, at partiklerne på deres overflade 35 og indbygget i hovedpolypeptidet bærer mindst én fremmed aminosyresekvens, som fortrinsvis selv indeholder et im-munogent område, og som indsættes i en af hovedpolypepti- 5
DK 166357 B
dets hydrofile regioner, der normalt · er eksponeret på partiklens ydre overflade eller erstatter en eller flere af aminosyrerne i en af hovedpolypeptidets hydrofile regioner .
5
Den fremmede aminosyresekvens kan nærmere bestemt indføres i en af de regioner, som omfatter aminosyrerne 32-74 eller aminosyrerne 110-156 i hoved-polypeptidet, og hvis almene formler er gengivet i artiklen af P. Tiollais 10 et al., (1981) Science, 213, p. 406-411. Disse formler er vist nedenfor:
A
t Met Clu Asn Ile Thr Ser Cly Phe Leu Cly Pro Leu Leu Vet Lcu 6ln Atå Cly Phe Ph· 21 Leu Leu Thr Arg Ile Leu Thr Ile Pro Cln Ser Leu Asp Ser Trp Trp Thr Ser Leu Atn
Ser Pro Thr t LI Phe Leu Cly Cly Thr Thr Val Cys Leu Cly Cln Asn Ser Cln Ser Pre Thr SerlAsn His Thr Thr I le -- Ile 6t Seri Pro Thr Ser CyS Pro Pro Thr Cys Pro Cly Tyr Arg Trp Met Cys Leu Arg Arg Phe
Thr 20 8l Ile Ile Phe Leu Phe Ile Leu Leu Leu Cys Leu Ile Phe Leu Leu Val Leu Leu Asp Tyr
Thr Pro 101 Cln Cly Met Leu Pro Val Cys Pro Leu Ile Pro Cly Ser Ser Thr Thr Ser Thr Cly Pro
Ser *«r
Lys Thr Pro Asn Phe „ 121 Cys Arg Thr Cys Met Thr Thr Ala Cln Cly Thr Ser Mat Tyr Pro Ser Cys Cys Cly Thr 25 Arq Thr Pro I le Tyr
Al«
M| ir« fro Ser (up dr »* Cr« Thr C,* Ile Tre Ile Tro Ser Ser Trp Μ» The dr Lr* Ser - e,T
t6l ph£ Leu Trp Clu Trp Ala Ser Ala Arg Phe Ser Trp Leu Ser Leu Leu Val Pro Phe Val Phe Ala
Thr Ala 30 l8l Cln Trp Phe Val Cly Leu Ser Pro Thr Val Trp Leu Ser Val Ile Trp net Met Trp Tyr
Ile Val
Val Ile 201 Trp Cly Pro Ser Leu Tyr Ser Ile Leu Ser Pro Phe Leu Pro Leu Leu Pro IU Phe Phe
Lcu Leu
Val 221 Cyt Le« Trp Val Tyr Ile ΛΙλ 35 6
DK 166357 B
Det skal bemærkes, at formlen for hovedpolypeptidet kan undergå variationer. Dette gælder i særdeleshed, hvad angår de forskelle imellem de konstitutive aminosyrer, som er observeret af Valenzuela et al. (1980) "Animal Virus 5 Genetics", B. Fields, R. Jaenisch, C.F. Fox, Ed.: Academic Press, New York, p. 57, og som er vist over hovedlinierne i den nævnte formel, og de konstitutive aminosyrer, som er observeret af Pasek et al., Nature (London) 282, 575 (1979), og som er vist under de nævnte hovedli-10 nier.
Nærmere bestemt angår opfindelsen således nyttige sammensætninger til fremstilling af vacciner, som indeholder i det væsentlige sfæriske polypeptidpartikler (eller som 15 består af sådanne partikler), i det mindste hvad angår størstedelen af partiklerne, hvilke vacciner har immunogene og immunologiske egenskaber, som er karakteristiske for HBs antigenet. Partiklerne har en størrelse på 18-25 nm, især 20-22 nm, og densiteter, som gør det muligt at 20 isolere dem i en densitetszone på 1,20-1,22 g/ml i en densitetsgradient på basis af CsCl. Partiklerne har et sådant renhedsniveau, at der er fuldstændigt fravær af Dane-partikler og HBs antigen, herunder HBc, og partiklerne er nærmere bestemt karakteriseret ved tilstedevæ-25 reisen af de nævnte fremmede sekvenser i de ovenfor angivne tilstande.
Størrelsen af de fremmede sekvenser, som kan indføres i hovedpolypeptidets indre, således som det lige er blevet 30 defineret, kan modificeres inden for vide grænser. Det er muligt at indføre aminosyresekvenser, som eksempelvis kan omfatte op til 100 aminosyrer, undertiden flere. Det er imidlertid en fordel, at den fremmede peptid-sekvens har en størrelse, som ikke overstiger 16 aminosyrer, og den 35 er fortrinsvis på 5-16 aminosyrer, f.eks. 6-13 aminosyrer, i særdeleshed i de tilfælde, hvor den er indført i hovedpolypeptidet uden undertrykkelse af et i det væsent- 7
DK 166357 B
lige ækvivalent antal aminosyrer, som den tidligere har omfattet. Den foreliggende opfindelse tilvejebringer et bemærkelsesværdigt resultat, som består i muligheden af at frembringe cellulære systemer, der tillader udskillel-5 se af modificerede partikler, som omfattes af opfindelsen, fra de pågældende celler, når disse på forhånd er blevet transformeret af en passende vektor, der indeholder en DNA-sekvens, som koder for det modificerede poly-peptid ifølge opfindelsen.
10
Opfindelsen angår naturligvis også de rekombinant-DNA'er, som koder for de nævnte modificerede polypeptider, der indgår i sammensætningen af de ovennævnte partikler. I denne henseende er rekombinant-DNA'erne, og fortrinsvis 15 de vektorer, som indeholder disse DNA'er, og som indeholder en DNA-sekvens, der koder for S-regionen og eventuelt præ-S-regionen af genomet i hepatitis B virus, karakteristiske ved, at den nævnte DNA-sekvens er modificeret lokalt af mindst én nucleotidsekvens, som koder for den 20 ovennævnte fremmede sekvens, og mindst én af zonerne i S-regionen svarer til de hydrofile regioner i det ovennævnte hovedpolypeptid. S-regionen og eventuelt også præ-S-regionen findes i det indre af rekombinant-DNA'et, anbragt under direkte kontrol af en exogen promotor, som 25 har en kendt evne til at iværksætte en effektiv tran-skription af gener under direkte kontrol i de eukaryote celler, især humane eller animalske celler, men også i gærceller, hvortil de omhandlede vektorer er særligt egnede.
30
Den anvendte exogene promotor er adskilt eller fremmed i forhold til den "endogene" promotor, som normalt er knyttet til S-generne og præ-S-generne i genomet i hepatitis B virus. Når disse celler hidrører fra aber, er det en 35 fordel at råde over en af promotorerne hidrørende fra SV40 virus, sådan som det er omtalt ovenfor.
8
DK 166357 B
Opfindelsen er imidlertid ikke begrænset til anvendelsen af denne bestemte promotor, selv om· denne giver særligt favorable resultater med hensyn til den produktion af hy-brid-polypeptider ifølge opfindelsen, som skyldes de 5 transformerede celler, HBs antigenets og en pHSA-recep-tors karakteristika samt udskillelsen af de producerede substanser i det anvendte dyrkningsmedium. Man kan eksempelvis også anvende den senere SV40 promotor (som kontrollerer udtrykkeisen af proteinerne VPl, VP2 og VP3).
10 Der kan i denne forbindelse henvises til restriktionsdiagrammet for SV40 virus (J. Tooze, Ed., DNA Tumor Viruses,
Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y., 1980, kapitel 2-5), som angiver de relative positioner af disse promotorer og gener, der koder for de forskellige 15 tilknyttede antigener.
Det siger selv selv, at man kan erstatte SV40 promotorerne med enhver anden promotor-type, som vides at besidde (eller som kan bibringes) en evne til at fremme tran-20 skriptionen i de anvendte cellelinier, hvis sekvenser koder for de ovennævnte S-regioner og eventuelt præ-S-re-gioner, så snart de er placeret under den fornødne kontrol. Herved opnås, at disse sekvenser med den nævnte promotor inkorporeres i de modtagende cellers genomer, 25 og/eller at de således transformerede modtagende celler bibringes en evne til at syntetisere og udskille væsentlige mængder hybrid-polypeptider ifølge opfindelsen, idet den således opnåede kapacitet derefter kan overføres til efterfølgende generationer af cellerne.
30
De nævnte transformerede cellelinier benævnes "stabile", når den egenskab, som cellelinierne ifølge opfindelsen har opnået med hensyn til at syntetisere de ovennævnte polypeptider, kan overføres fra en generation af celler 35 til den næste over mindst 10 generationer.
9
DK 166357 B
Med hensyn til andre anvendelige promotorer kan man f.eks. nævne den tidlige polyom-promotor eller LTR promotorerne fra forskellige retrovirus-typer, ligesom man kan nævne EA adenovirus-promotoren såvel som de effektive 5 promotorer for gener af cellulær oprindelse.
Som det er velkendt, er promotorerne, som er udtaget fra de virus-genomer, hvorfra de hidrører, fortrinsvis ledsaget af aktiverende "sekvenser", som normalt går forud for 10 promotorerne (i forhold til transkriptionsretningen for de gen-sekvenser, der normalt er anbragt under deres kontrol ). Med hensyn til eksempler på sådanne aktiverende sekvenser kan henvises til artiklerne i Science, 1983, vol. 219, side 626-631, og Nature, 1982, vol. 295, side 15. 568-572.
Den ovennævnte DNA-sekvens, som koder for de nævnte præ- S- og S-regioner, er med fordel placeret umiddelbart efter et DNA-fragment, som udgøres af promotoren og den ak-20 tiverende .sekvens, der tillader en normal transkription af præ-S- eller S-sekvensen. Det nævnte fragment omfatter fortrinsvis 300-400 basepar i afhængighed af promotor-typen og de anvendte aktiverende sekvenser.
25 Opfindelsen angår således også cellelinier, som er transformeret af vektorer såsom de ovenfor definerede vekto rer, og som er i stand til at udskille de ovennævnte immunogene partikler i deres dyrkningsmedium.
30 De foretrukne cellelinier ifølge opfindelsen er sammensat af pattedyr-celler, i særdeleshed CHO-celler eller VERO-celler.
Sådanne cellelinier, som kan opretholdes i kulturen, k-an 35 produceres ved, at man transformerer' disse cellelinier med en vektor som defineret ovenfor, hvorefter man isolerer de celler fra kulturen, som udtrykker sekvenser, der
DK 166357B
10 koder for hybrid-proteinet ifølge opfindelsen.
Yderligere karakteristika ved den foreliggende opfindelse vil fremgå af den efterfølgende beskrivelse, som giver 5 eksempler på konstruktioner, der illustrerer opfindelsens grundprincip. I den efterfølgende beskrivelse henvises endvidere til tegningen, hvor fig. 1 viser den skematiske struktur af plasmid pLAS, som 10 anvendes i konstruktionerne ifølge opfindelsen og fig. 2 viser den skematiske struktur af plasmid pPAP, som er afledt af plasmid pLAS, og som udover dette omfatter et syntetisk DNA-fragment, der koder for en sekvens på 11 15 aminosyrer fra VPl-proteinet i poliovirus type I (stamme Mahoney).
Konstruktion af transfekterede plasmider 20 Plasmid pLAS
Dette plasmid omfatter (se fig. 1) den kodende del af S-genet (P. Charnay et al. 1979) med det naturlige sted for polyadenyleringen (fragment Stul (43) Bglll (1984)) hvor 25 BamHI-stedet (1400) er udeladt og erstattet af et klenow-enzym.
Dette gen uden promotor bringes under kontrol af den tidlige promotor for SV40 virus (et SV40 virus-fragment 30 imellem PvuII-stedet (250) og Hindlll-stedet (5154)).
Endvidere omfatter plasmidet det store BamHI (375)-Sall (650)-fragment af plasmid pML2 (lusky, M. og Botchan, M.
1981).
35 Fragmentet af S-genet ligeres i sin Bglll-ende til BamHI-enden af plasmid pML2 (Bglll- og BamHI-enderne er indbyr-des forligelige). Fragmentet af S-genet modificeres i sin 11
DK 166357 B
Stul-ende med en bindende nucleotid-sekvens ("linker"), som er opnået ved kemisk syntese, og som indeholder et Hindlll-sted, til frembringelse af en ligering med HindiII-enden af det SV4 virus-fragment, der indeholder 5 den nævnte promotor. Endelig udskiftes Sall-enden af fragmentet, som stammer fra plasmid pLM2, før ligeringen med PvuII-enden (den frie ende) af SV40 virus-fragmentet.
Plasmiderne pLASj. og pLAS^ 10
Disse to plasmider udledes af plasmid pLAS, som er beskrevet ovenfor, ved i det eneste BamHI-sted (488) at indføre et eller to BamHI-fragmenter af DNA bestående af 24 basepar afledt af pSKS104 (Shapiro et al. 1983). Dette 15 fragment på 24 nucleotider, som koder for otte amino syrer, og hvis indføring i S-genet ikke modificerer aflæsningsfasen, bærer et kløvningssted for restriktionsenzymerne PstI og to kløvningssteder for enzymerne Hindlll (Sall, Accl).
20 EKSEMPEL 1
Frembringelse af cellelinier fra mus, som producerer Hbs-protein efter transfektion, og udvælgelse af de produce-25 rende kloner LMTK~-celler (klon ID, museceller afledt af klon L929 med mangel på thymidin-kinase, dyrket i Eagle-medium modificeret med Dulbecco (medium DMEM) suppleret med 10% kalve-30 serum og 4 mM glutamin) blev underkastet co-transfektion (efter teknikken beskrevet af Grahåm og Van der Eb, 1973, modificeret af Wigler et al., 1979) med DNA fra en af tre vektorer (pLAS, pLAS^., pLAS^) og med DNA fra plasmid pW, som bærer aminoglycosid-3’-phosphortransferase-genet 35 APH3', der er resistent overfor neomycin (Colbére-Garapin et al., 1981). De transfekterede celler, som udtrykker enzym APH3', blev udvalgt i nærværelse af 400 ug/ml ami- 12
DK 166357 B
noglycosid G418 (Colbére-Garapin et al., 1981). Klonerne, som opnåedes ved denne udvælgelse, blev derefter testet 5 - for produktion af HBs-protein. Således blev 5 x 10 LMTK -celler co-transfekteret med 10 ug DNA fra det første 5 plasmid og med 2 ug DNA fra plasmid pW. Fire dage efter transfektionen blev det selektive G418-medium påført.
De fremkomne levedygtige kloner blev isoleret, dyrket og testet med hensyn til deres evne til at producere HBs an-10 tigen i mediet.
Tilstedeværelsen af HBs antigen blev påvist ved hjælp af den radioimmunologiske test AUSRIA. II (Abbott Laboratories). Blandt de celleulære kloner, som gav positiv re-15 spons, udvalgtes 3 kloner (LAS, LASI og LASII) svarende til plasmiderne pLAS, pLASI og pLASII, som derefter blev karakteriseret.
Karakterisering af de detekterede partikler i de cellulæ-20 re kloners medium
Klonerne bringes til at flyde sammen, og cellernes næringsmedium ændres og hensættes til akkumulering i 48 timer. Derefter klares supernatanten ved 2000 omdr./min.
25 og centrifugeres for at sedimentere partiklerne (Smith et al., 1983). Det sammenpressede bundfald genoptages i puffer, behandles med en CsCl-gradient, centrifugeres og opsamles, og fraktionerne testes ved RIA (Moriarty et al., 1981). HBs antigen-aktiviteten af de modificerede og 30 ikke-modificerede proteiner ses at være koncentreret omkring en enkelt top, der ligger mellem densiteterne 1,18 3 og 1,24 g/cm , som svarer til densiteterne af rensede serumpartikler (Pillot et al., 1984). Man afsætter derefter en prøve på en saccahrose-gradient (Moriarty et al., 35 1981). Efter opsamling af fraktionerne samler HBs anti gen-aktiviteten sig om en enkelt top med en sedimentationskoefficient, der tilsyneladende er den samme blandt 13
DK 166357 B
de tre typer af polypeptider.
Karakterisering af S-gen-sekvenserne, der er integreret i genomet af de cellulare kloner LAS, LASI og LASII 5
Det celleulære DNA fra klonerne LAS, LASI og LASII fremstilles ved metoden beskrevet af Gross-Bellard et al., (1973) og digereres med restriktionsenzymerne Hindlll og Pstl. Efter agarose-gelelektroforese overføres DNA'erne 10 til et lag af nitrocellulose (Soutern, 1975), som hybri-diseres med en radioaktiv sonde fremstillet ud fra et DNA-fragment, der indeholder S-genet, ved såkaldt "nick-translatering" (Rigby et al., 1977).
15 Efter autoradiografi af kopierne på nitrocellulose viser det sig, at et eller flere af generne er blevet integreret i de tre kloner. Desuden eksisterer der et enkelt Pstl-sted på niveau med det modificerede S-gen i de cellulære kloner LASI og LASII. Dette Pstl-sted eksisterer 20 ikke i den naturlige sekvens af det anvendte S-gen (P. Charney et al., 1979), hvorimod det eksisterer i de fremmede DNA-fragmenter, som er indført i de anvendte plasmi-der pLASI og pLASII.
25 Immunopraacipitering med et anti-HBs antigen-serum af proteiner udskilt af klonerne LAS, LASI og LASII
De sammenflydende cellulære kloner mærkes med methionin 35 [ S] i 48 timer, og supernatanterne immunopræcipiteres 30 med antistoffer til kanin-anti-HBs antigen (Behring) og derefter med protein A Sepharose (Pharmacia) i nærværelse af 0,5% NP40. Efter udvaksning anbringes immunopræcipita-terne på en 15% polyacrylamid-gel ifølge teknikken beskrevet af Laemmli (1970) i nærværelse af molekylvægts-35 markører (Pharmacia). De behandlede og tørrede geler underkastes derefter autoradiografi.
DK 166357B
14
For hver supernatant fremkommer 2 betydende bånd. Deres molekylvægte er henholdsvis 23000 og 27000 for LAS-klo-nen, 24750 og 28500 for LASI-klonen og 26000 og 29000 for LASII-klonen.
5 PLasmid pLAS har vist sig efefktivt til at fremme udtrykkeisen af HBs antigen i L-celler. Desuden bærer plasmid pLASI supplerende restriktionssteder i regionen, hvor S-genet kodes, hvilket kan lette indføring af nye sekven-10 ser.
Den kendsgerning, at man ved RIA kan detektere de strukturer, som .svarer til HBs antigen-partikler i de cellulære supernatanter, gør det muligt at forudsige, at de 15 strukturer, som induceres af plasmiderne pLASI og pLASII, i det mindste bevarer en antigenicitet, som delvis svarer til antigeniciteten af partiklerne i humant serum. Indføringen af de anvendte 8 eller 16 aminosyrer forhindrer udskillelse af de modificerede HBs antigen-proteiner i 20 cytoplasmaet, som vender ud imod L-cellernes ydre medium.
Valget af BamHI-stedet til gennemførelse af indføringerne, i S-genet forekommer berettiget. Det svarer faktisk til begyndelsen af den væsentligste hydrofile region i proteinet (P. Tiollais et al., 1981) og respekterer den kends-25 gerning, at de hydrofobe Sekvenser skal være i kontakt med partiklernes lipid-membran. Intermembran-området af HBs antigenet, som er ansvarligt for strukturen af partiklerne med en størrelse på 22 nm, undergår tilsyneladende kun minimale konformationsmæssige forandringer.
30
Analyserne af supernatanter fra cellulære kloner med cæ-siumchlorid- og saccharose-gradienter gør det ikke muligt, inden for de anvendte eksperimentelle grænser, at sandsynliggøre forskellene imellem de modificerede og 35 ikke-modificerede strukturer.
15
DK 166357 B
En analyse af de cellulære DNA'er viser, at de integrerede S-gener altid bærer de modifikationer, som er indeholdt i de anvendte plasmider.
5 De proteiner, som fremkommer efter immunopræcipitering, viser de forventede forskelle i molekylvægt. Imidlertid synes den målte molekylvægt af de modificerede proteiner at være højere end den reelle molekylvægt (molekylvægten af et fragment på 8 aminosyrer er faktisk 957). På den 10 anden side tillader modifikationerne altid en partiel glycosylering af HBs antigen-proteinet. De to bånd, som fremkommer på polyacrylamid-gelen, er karakteristiske ved et glycosyleret polypeptid og et ikke-glycosyleret poly-peptid. Den rest, som er mest udsat for at blive glycosy-15 leret, nemlig asparagin-resten 146 (Machida et al., 1983), indgår i den sekvens, som deltager i den væsentligste antigeniske bestemmelse (Pillot et al., 1984). Konformationen af denne del af proteinet må således være relativt identisk med konformationen i modificerede eller 20 naturlige proteiner.
EKSEMPEL 2
Fremstilling af partikler, som bærer overfladeantigener 25 til hepatitis B modificeret ved indføring af sekvenser af difteritis-toxin
Plasmid pTD134-DNA, som indeholder genet for difteritis-toxin (M. Kaczorek et al., 1983), skæres af enzymet 30 Haelll, behandles med NAL31-nuclease og ligeres i nærværelse af T4 DNA ligase med BamHI-adaptorer. Efter kløvning med enzymet BamHI ligeres fragmenterne med plasmid pSKS105-DNA (Shapiro et al., 1983) skåret med det samme enzym. Dette DNA anvendes derefter til at transformere en 35 stamme af E. coli. Kolonierne overføres til lag af nitrocellulose, hvor de lyseres. Nitrocelluloselagene hybridi-seres med en radioaktiv sonde, som er frembragt ved
DK 166357B
16 "nick-translatering" på basis af et renset fragment på en acrylamid-gel efter digestion af plasmid pTD134 med Haelll-endonuclease (fragment Haelll 597-HaeIII 746). Plasmiderne fra de kolonier, der danner hybrider med den-5 ne sonde, sekvenseres partielt ved anvendelse af metoden beskrevet af Maxam og Gilbert (Maxam et al., 1980). Man udvælger et af de plasmider, som indeholder et BamHI-fragment, der koder for aminosyrerne 201-231 i difteri-tis-toxin-genet (Kaczorek et al., 1983). Dette fragment 10 genindføres derefter på BamHI-stedet i plasmid pLAS.
Det nye plasmid pTAS renses og transfekteres i L-celler fra mus. Efter udvælgelse af de cellulære kloner, som er resistente overfor G418 (ifølge metoden beskrevet i før-15 ste afsnit af eksempel 1), tester man for tilstedeværelse af HBs antigen i supernatanterne. Af de 20 undersøgte kloner er ingen positive.
Cellerne fra 10 kloner behandles med trypsin, vaskes 2 20 gange med PBS og lyseres ved 3 gange frysning og optøning i 250 ul Tris (10 mM) pH 7,4, EDTA (1 mM). Lysatet klares ved 2000 rpm og testes. Alle lysaterne af klonerne indeholder HBs antigen.
25 En af klonerne lyseres under de samme betingelser. Derefter overføres prøver til behandling med cæsiumchloridel ler saccharose-gradienter sammen med HBs antigen-partikler, der er oprenset på basis af humant serum (IPP), og et lysat af kloner transfekteret af plasmid pLAS, der 30 producerer ikke-modificerede partikler. Det viser sig, at der ikke kan påvises nogen forskel imellem partiklerne af humant serum og HBs antigen-signalerne fra de undersøgte lysater. Dette synes at bevise, at de modificerede proteiner, selv om de ikke udtrykkes, efter lysering af cel-35 lerne er i en konformation, der er relativt identisk med konformationen af de "naturlige" partikler. En indføring på BamHI-stedet (aminosyrerne 112-113) af HBs antigen med
DK 166357B
17 32 aminosyrer, der koder for en del af difteritis-toxi-net, tillader ikke længere en udskillelse af proteinet, når dette er translateret i L-cellerne. Dette fremgår af de erfaringer, man har med plasmid pTAS. Den kendsger-5 ning, at man genfinder det modificerede protein i form af ikke-udskilte partikler, gør det imidlertid muligt at antage, at det vil være muligt at modificere HBs antigen og udtrykke dette i et ikke-udskillende system (f.eks. gær). Opretholdelsen af bestemte strukturer bibringer proteinet 10 en høj grad af stabilitet, hvilket letter dets oprensning.
EKSEMPEL 3 15 Fremstilling af partikler, der bærer overfladeantigenet af hepatitis B modificeret ved indføring af sekvenser af poliovirus
De 2 strenge af et DNA-fragment på 47 basepar, som koder 20 for 11 aminosyrer i proteinet VP1 fra poliovirus type I (aminosyrerne 93-103) og for 2 steder, der genkendes af enzymet BamHI, syntetiseres ad kemisk vej ved hjælp af et automatiseret synteseapparat (Applied Biosystem). De 2 strenge oprenses separat på en denaturerende polyacryl-25 amid-gel, hvorefter de hybridiseres. Fragmentet skæres af BamHI-endonuclease og indføres på BamHI-stedet i plasmid pLAS. Det nye plasmid pPAP (fig. 2) sekventeres partielt (Maxam og Gilbert, 1980), amplifikeres og indføres i L-cellerne ved den metode, som tidligere er beskrevet; se 30 første afsnit af eksempel 1. De kloner, som er resistente over for G418, isoleres, og deres supernatantér testes for tilstedeværelse af HBs antigen. 14 ud af 20 kloner blev fundet positive.
35 Til oprensning af partikler med en størrelse på 22 nm dyrkes de cellulære kloner i DMEM, og efter 8 dages forløb underkastes celle-supernatanterne en klaring, hvor 18
DK 166357 B
efter der tilsættes 45% af en ammoniumsulfatopløsning (pH 7,5).
Bundfaldet opsamles ved centrifugering, hvorefter de op-5 nåede granuler opløses i 10 mM Tris-HCl, pH 7,5, 150 mM NaCl og 1 mM EDTA (TNE) og dialyseres mod den samme puffer.
Der tilsættes 0,3 mg/ml CsCl, hvorefter der centrifugeres 10 i 72 timer ved 4 °C med en omdrejningshastighed på 40000 omdr./min. i en Beckman 60 Ti rotor.
Efter centrifugeringen opsamles fraktioner på 1 ml, som testes for HBs antigen ved RIA.
15
De fraktioner, der indeholder HBs antigen, bliver omgrupperet og centrifugeret påny i CsCl ved 4 °C i 48 timer med 47000 omdr./min. i en Beckman 50 Ti rotor.
20 Fra supernatanten høstes fraktioner på 0,33 ml, som endnu en gang testes for tilstedeværende HBs antigen.
De fraktioner, som svarer til en maksimal HBs antigenaktivitet, omgrupperes og dialyseres imod TNE, hvorefter 25 HBs antigenet udfældes ved centrifugering i 24 timer med 28000 omdr./min. i en SW41-rotor. Bundfaldet holdes i suspension i 0,5 ml TNE og anbringes i en lineær 10-30% (w/w) saccharose-gradient i TNE med 0,5 ml 66% saccharose.
30
Der centrifugeres i 4,5 timer ved 4 0C og en omdrejningshastighed på 35000 omdr./min. i en SW41-rotor, hvorefter der udtages fraktioner på 0,33 ml fra supernatanten.
35 De fraktioner, der svarer til en maksimal HBs antigen-aktivitet, omgrupperes og dialyseres imod TNE. De rensede kappe-partikler analyseres ved SDS-polyacrylamid-gelelek-
DK 166357B
19 troforese efterfulgt af en farvning med sølv.
Koncentrationen bestemmes ved BioRad-metoden.
5 Partiklerne, som er oprenset fra dyrkningsmediet indeholdende de cellulære kloner (PAP og LAS) og transfekteret af henholdsvis pPAP og pLAS, har omtrent den samme densitet i CsCl. De afviger ikke på signifikant måde fra humane HBs antigen-partikler, som eftervist ved sedimentati-10 onsforsøg i saccharose, men de synes at have mere variable diametre.
Polypeptiderne HBs antigen og HBspolioAg (HBs polio-antigen), som er immunopræcipiteret af et anti-serum-anti-HBs 15 antigen opnået ud fra henholdsvis LAS- og PAP-partikler, foreligger i glycosyleret og ikke-glycosyleret form.
Forskellen på 1,5 kDa (kilodalton) imellem de tilsyneladende molekylvægte af HBs antigen og HBspolioAg svarer 20 til molekylvægten af den indførte sekvens.
Disse resultater viser, at en sådan indføring hverken hindrer de specifikke vekselvirkninger imellem proteiner og lipider, som er nødvendige for at samle kappens par-25 tikler, eller hindrer glycosyleringen og udskillelsen af partikler i dyrkningsmedierne.
Med det formål at fastslå, hvorvidt sekvensen af det indførte poliovirus udtrykkes på overfladen af partiklerne, 30 og at undersøge, hvorvidt der er induceret ændringer i konformationen, har man foretaget undersøgelser af sensibiliteten over for protease hos HBs antigen og HBspolioAg partiklerne.
35 Cellulære kloner (LAS, PAP) blev dyrket under sammenflyd-ning, vasket 2 gange med DMEM uden methionin og inkuberet i 2 timer i det samme medium, hvortil endvidere sattes 4 20.
DK 166357 B
mM glutamin og 1% kalvefosterserum.
Inkubationen blev forlænget til 24 timer i et frisk me- 6 25 dium indeholdende 2 x 10 celler og 100 uCi/ml S-Met 5 (100 Ci/mmol; Amersham).
Efter 6 timers inkubation i nærværelse af 30ug/ml ikke-mærket Met blev kappepartiklerne delvis oprenset fra su-pernatanten af dyrkningsmediet, og der centrifugeredes i 10 24 timer med 28000 omdr./min. og ved 4 °C (SW41-rotor), hvorefter der centrifugeredes imod en CsCl-gradient (1,1- 3 1,6 g/cm ) i 24 timer ved 4 °C med 35000 omdr./mim.
Man opsamlede fraktioner på 0,5 ml, og top-fraktionerne 15 blev dialyseret imod PBS. Prøver på 100 ul blev blandet med 50 ul trypsin (300 ug/ml Worthington) i PBS med eller uden 3% Ø-mercaptoethanol, og der inkuberedes i 2 timer ved 37 °C. Derefter tilsattes 50 ul af en opløsning af 300 ug/ml af en sojatrypsin-inhibitor i PBS (Worthing- / 20 ton). Volumenet blev forøget til 400 ul med PBS, og der tilsattes 1% okseserumalbumin, 1% natriumdesoxycholat og 0,1% SDS. Immunopræcipiteringen opnåedes efter henstand natten over ved 4 °C i nærværelse af kanin-antiserum rettet imod humane HBs antigen-partikler (Behring) i en for-25 tynding på 1:100. Der tilsattes 50 ul Sepharose-protein A, som blev holdt i suspension i et volumen af 25 mM Tris-HCl (pH 7,2), 2,5 mM EDTA og 2 mM PMSF.
Efter 1 times forsigtig omrystning ved 4 °C blev Sepha-30 rose-fasen vasket 3 gange med 10 mM tris-HCl (pH 7,2),
NaCl, 1% triton X-100, 0,1% SDS og 1% natriumdesoxycholat og 2 gange med 25 mM Tris-HCl (pH 6,8).
Endelig blev proteinerne elueret, idet man lod sepharosen 35 koge i 40 ul af en pufferopløsning til gel-elektroforese.
21
DK 166357 B
Til gel-elektroforesen anvendtes en 15% polyacrylamid-gel, og man anvendte metoden beskrevet af Laemli.
Efter behandling ved fluorografi blev gelen tørret og 5 eksponeret på en film (Kodak XAR-5) ved -70 °C.
På denne måde kunne man konstatere, at HBs antigen-partiklerne er meget resistente overfor trypsin under ikke-reducerende betingelser, mens HBspolioAg bliver fuldstæn-10 digt spaltet på et enkelt sted (eller på flere nærliggende steder) under frembringelse af polypeptider med tilsyneladende molekylvægte på 17,4 og 14,3 kDa.
Størrelsen af fragmenterne stemmer overens med kløvningen 15 af den indsatte sekvens.
I nærværelse af et reducerende middel bliver HBs antigenet kun spaltet på niveauet Arg-122 (Peterson, D.L.), idet der dannes fragmenter på 16,6 og 13,2 kDa, mens 20 HBspolioAg spaltes i 2 fragmenter på 17,4 og 13,2 kDa.
Dette indikerer, at fragmentet på 14,3 kDa, som opnås under ikke-reducerende betingelser ud fra HBspolioAg, indeholder Argl22 og er 10-12 aminosyrer længere ved N-termi-25 nalen end det 13,2 kDa store fragment. Dette bekræfter også, at spaltningen af HBspolioAg-partikler under ikke-reducerende betingelser foregår omkring en eller flere Lys-rester i den indførte sekvens (fig. 2).
30 Disse resultater viser, at den indførte peptid-sekvens let bliver tilgængelig for proteaser, hvilket vil sige, at den bliver eksponeret på overfladen af kappens hybridpartikler. Hos poliovirus af type 1 (Mahoney) svarer peptid-sekvensen til en struktur, som er mindre eksponeret, 35 og som gør Lys-resten utilgængelig for trypsin under de reducerende betingelser (Fricks et al.).
22
DK 166357 B
De øvrige potentielle kløvningssteder i de hybride HBspolioAg-partikler er utilgængelige for trypsin, hvilket også indikerer, at disse dele af HBs antigen-molekylet forbliver i en meget struktureret ordning.
5
En række konformationsmæssige ændringer kan imidlertid finde sted i den antigeniske hovedregion af HBs. Dette viser sig ved en reduktion (omkring 20 gange) af bindingen af anti-HBs antigen-antistof til HBs antigen-partik-10 ler som bestemt ved radioimmunologi, idet man anvender HBs antigen-partikler som reference og bestemmer proteinerne ved farvning med sølv efter SDS-PAGE.
Erfaringerne med immunopræcipitering af HBs antigen og 15 HBspolioAg med forskellige serum-typer indikerer, at de 2 partikler reagerer med anti-HBs antigen-antistof, og at HBspolioAg-partiklerne bliver immunopræcipiteret specifikt af monoklonale C^-antistoffer, som neutraliserer poliovirus, og af 2 forskellige antiserum-typer imod de 20 syntetiske oligopeptider, som indeholder den indførte sekvens .
Med henblik på at bedømme de immunogene egenskaber af hybrid-partiklerne har man immuniseret mus med HBs antigen 25 eller HBspolioAg (tabel 1). Man frembragte ascites in-traperitonealt ved hjælp af tumorigene celler, som ikke producerer antistoffer, med henblik på at opnå en asci-tisk væske, som immunologisk svarer til museserum (Anacker et al.).
30
En vaccination med HBs antigen fører til en høj koncentration af antistoffer, som reagerer med humane HBs antigen-partikler (mus nr. 1) 35 De mus, som er immuniseret med HBspolioAg, reagerer imidlertid kun svagt på HBs antigenerne (mus nr. 2 og 4, tabel Ib).
23
DK 166357 B
Dette er i overensstemmelse med observationen af det faktum, at HBs antigenets determinanter er delvis forskudte i hybrid-partiklerne.
5 På den anden side er den indførte poliovirus VPl-sekvens immunologisk aktiv, og hos alle musene inducerer den antistoffer, som genkender de syntetiske peptider, der bærer denne sekvens (tabel Ic) såvel som hele VP1-proteinet i poliovirus af type 1 (Western blot). Desuden besidder 10 det opnåede antiserum en specifik effektivitet overfor det inficerende virus såvel som overfor de virustyper, der denatureres af varme, hvilket fremgår af de forsøg med immunopræcipitering, som er anført i tabel Id. Alle de afprøvede antiserum-typer besidder endvidere et signi-15 fikant indhold af antistoffer, som neutraliserer poliovirus (tabel le).
Foreløbige resultater har vist, at HBs antigen-partikler også bliver immunogene hos kaniner. Efter injektion af 2 20 doser HBspolioAg (10-40 ug pr. dosis) danner 3 ud af 4 dyr antistoffer, som kan immunopræcipitere med det inficerende poliovirus.
Den evne, som HBspolioAg-partiklerne har med hensyn til 25 at frembringe neutraliserende antistoffer, som genkender en fælles sjælden epitop på det inficerende poliovirus, og som denatureres af varme (Emini et al.), viser, at bindingsaktiviteten til antistoffet og immunogeniciteten af den tilsvarende aminosyresekvens i det.mindste delvis 30 udtrykkes på overfladen af HBV-kappe-partiklerne.
Denne korte sekvens danner en top på poliovirus'ets capsid (Hogle et al.) og kan som følge heraf have en autonom struktur.
35 I HBspolioAg-partiklerne kan de tilgrænsende HBsAg-se-kvenser desuden opetholde stabiliteten eller fleksibili- 24
DK 166357 B
teten af den indførte poliovirus-sekvens.
5 10 / 15 20 25 30 35 25
DK 166357 B
<D
Ό
C
0) u
(D
(0 P ^ H CM VD t> CT>
(0 <D CO CO CO
ij m [j ». ». «.
+-> i-) O — O <N CO O
3 ί* Φ Φ P H W Z K ^ co
3 P
0 0) P 0 > Φ O ^ ^ Ή # 3
H w p CO
0 (0 3 co in
o, tn d ø CO O' 00 00 CS
1 c <d -η Η Ή fl ^
PH
d <D Ό (OP —
P
P & <0 P Φ G Ό P fB C Φ 0 0)
P øi 0 H P O <D
> d o w
Η -H 3 P 3 σ' η O
m μ g p ø co oo o σ\ co
Λ * B d P
(0 < Η H >
EH
J*
0) CO CO P Η P
0) Q)
-G P d d Ό 0) >1 P
x co p
Ό Øi I + + + I
o p Φ o O (0 ft ^ d o w P CO P CQ H (0 K —
ø I P
p P d o o P
d P <D o - φ G to H o o o o
O (0 P
d p ~ O p d Λ tf <d (0 — d p Φ O) O) O) o to < < < μ P o o o
CO p P P P O
p d p p P © .μ (0 o o o ω C ft ft ft o (0 CO CO co to < m m m m m p S Ό ^ tCWKK© 3 O (0 2 6- to · 3 ø g; d η o n ^ id 26
DK 166357 B
Undersøgelserne af de immunogene egenskaber af HBs antigen og HBsPolioAg, som svarer til de i det foregående kommenterede resultater fra tabel I, er gennemført på følgende måde: 5 a) Mus af stammen Balb/C, 8 uger gamle, blev immuniseret med enten 2 ug HBs antigen (nr. 1) eller 30 ag HBsPolioAg (nr. 2-4), som var renset som tidligere beskrevet, ved intraperitoneal injektion i kombination med en emulsion 10 af 50% fuldstændig Freund's adjuvans, der blev suppleret 2 uger senere med ufuldstændig Freund's adjuvans.
Efter 3 ugers forløb injiceredes myeloma-celler fra mus af stammen sp2/0-Agl4 (Couillin et al.) efterfulgt af en 15 efterinjektion uden adjuvans.
Mus nr. 5 blev behandlet uden antigen. Ascitesvæsken blev opsamlet efter 2 uger og analyseret under anvendelse af de nedenfor beskrevne procedurer.
20 b) Koncentrationerne af anti-HBs antigen blev bestemt ved en radioimmunologisk test benævnt AU5AB (Abott) og udtrykt i internationale enheder (I.E.).
25 c) Bindingen til peptidet svarende til aminosyrerne 93-104 i poliovirus VP1 blev bestemt ved ELISA-metoden (Voller et al.).
Fordybningerne blev overstrøget med dette peptid (0,5 ug 30 i PBS), og efter henstand natten over blev de ubesatte steder blokeret med BSA (1% i PBS indeholdende 0,05% Tween-20).
Efter gentagne udvaskninger med Tween-20 (0,05% i PBS) 35 blev ascitesvæskerne tilsat i en fortynding på 1:80 til PBS indeholdende 1% BSA og 0,05% Tween-20, og der'inkuberedes i 2 timer ved 37 °C.
DK 166357 B
27
Brøndene blev vasket, og der tilsattes anti-muse-IgG-an-tistof fra geder (Cappell), som var mærket med peroxydase og fortyndet til 1:1000.
5 Efter udvaskning tilsattes o-phenylendiamin (Merck; 0,5 ag/ml) i 50 mM citrat/phosphat-puffer, pH 5, og efter 10 minutters henstand ved stuetemperatur blev reaktionen standset ved tilsætning af 2,5% ^SO^.
10 De positive serumprøver var sådanne, som udviste en absorptionsværdi (DO), som var mindst 3 gange så stor som kontrolværdien (mus nr. 5).
35 d) Poliovirus af type 1 (Mahoney) blev mærket med S-Met 15 og renset ved centrifugering i en CsCl-gradient.
Varmedenatureret virus fremstilledes ved inkubation af inficerende virus i 1 time ved 56 °C.
20 Prøver på 50 al indeholdende 15000 cpm partikler mærket 35 med S-Met (Emini et al.) i opløsning i 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 50 mM Tris (pH 7,4), 0,02% NaN^ og 0,05% Nonid og P40 blev inkuberet i nærværelse af 50 al ascitesvæske fra mus. Der inkuberedes i 1 time ved 37 °C og natten 25 over ved 4 °C.
Immunkomplekserne blev præcipiteret med Staphylococcus aureus (stamme Cowan I) (Kessler), og deres radioaktivitet blev testet. Tallene i tabel Id viser de procentvise 30 værdier af den immunopræcipiterede aktivitet.
e) Koncentrationen af neutraliserende antistoffer i hver serumprøve blev målt ved en standard-reduktionstest med VERO-celler, idet der tilsattes en mængde på 10 pletdan- 35 nende enheder poliovirus af type 1 (Mahoney).
DK 166357B
28
De inverse serumfortyndinger (log 2), som giver 5% pletreduktion, blev beregnet ud fra regressionskurver for de middelværdier, der opnåedes på basis af 3 forsøg.
5 Forsøgene med det modificerede gen af plasmid pPAP viser, at de fremmede sekvenser, som indføres i proteinet, kan udtrykkes på partiklernes overflade. Hvis den oprindelige konformation af de exogene sekvenser modificeres, er det rimeligt at antage, at en indføring af større strukturer 10 eller en udelukkelse af visse dele af HBs antigen-proteinet vil kunne løse dette problem. En forskning i andre indføringssteder er også mulig. En indføring af 8 aminosyrer ved resten 50 i HBs antigenet (på stedet Ball i S-genet) muliggør en produktion af partikler og en udskil-15 lelse af disse.
Opfindelsen muliggør således fremstilling af blandede vacciner.
20 Hvis man indfører den bestemmende sekvens af de fremmede antigener i HBs antigenet, bliver det muligt, hvis HBs antigen-partiklerne udtrykkes på overfladen, at fremstille blandede vacciner imod en anden undertype af HBV-virus, imod virus-determinanter (HBcAg, HBeAg) (A.M.
25 Prince et al., 1983, S. Iwarson et al., 1984), imod antigeniske determinanter af virus, som rammer de samme populationer som hepatitis B (AIDS, herpes) og imod antigeniske determinanter af andre virustyper (T.M. Shinnick et al., 1983). De 8 aminosyrer, som indgår i den 30 antigeniske hoveddeterminant i proteinet VP1 fra poliovirus type 3 (D.M.A. (Evans et al., 1983)), kan indføres i HBs antigen-proteinet via et intermediært DNA-fragment syntetiseret ad kemisk vej.
35 Denne type manipulation kan også muliggøre udtrykkelse af biologisk aktive sekvenser, som har farmaceutisk interesse.
29
DK 166357 B
De partikler, som produceres af animalsk Hepadna-virus (P.L. Marion et al., 1983) kan anvendes under samme betingelser.
5 Af denne grund omfatter opfindelsen enhver vaccinesammensætning imod viral hepatitis B, som indeholder en effektiv dosis af partikler ifølge opfindelsen, især 3-6 ag protein pr. ml, f.eks. 5 ug protein pr. ml (enhedsdosis), i kombination med en passende farmaceutisk bærer valgt 10 under hensyn til den valgte indgivelsesvej. Denne er fortrinsvis parenteral.
I den nedenstående liste er anført de litteraturreferencer, hvortil der er henvist i det foregående.
15 - Anacker, R.L. og Munoz, J.J. Immunol. 87, 426-432 (1961).
- Cattaneo, R., Will, H., Hernandez, N. og Schaller, H., (1983) Nature, 305, 336-338.
20 - Colb'ere-Garapin, F., Horodniceanu, F., Kourilsky, P.
og Garapin, A.C. (1981), J. Mol. Biol., 150, 1-14.
- Couillin, P., Crainic, R., Cabau, N., Horodniceanu, F.
& Boué, A., Ann Virol. (Inst. Pasteur) 133E, 315-323 (1982).
25 - Dubois, M.F., Pourcel, C., Rousset, S., Chany, C. og
Tiollais, P. (1980) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77, 4549-4553.
- Emini, E.A., Bradford, A.J. og Wimmer, E., Nature 304, 699-703 (1983).
30 - Evans, D.M.A., Minor, P.D., Schild, G.S. og Almond, J.W., (1983) Nature 304, 460-462.
- Fricks, C.E., Icenogle, J.P. og Hogle, J.M., J. Virol.
54, 856-859 (1985).
- Graham, F.L. og Van der Eb, A.J., (1973) Virology, 52, 35 456.
- Gross-Bellard, M., Oudet, P. og Chambon, P., (1973)
Europ. J. Biochem. 36, 32.
30
DK 166357 B
- Hogle, J.M., M. og Filman, D.J., Science 229, 1358-1365 (1985).
- Hollinger, F.B., Sanchez, Y., Troisi, C., Dressman, G.R. og Melnick, J.L., (1984) The 1984 International 5 Symposium on Viral Hepatitis, San Francisco, USA.
- Iwarson, S., Tabor, E., Thomas, H., Snoy, P. Gerety, R.J., (1984) The 1984 International Symposium on Hepatitis Virus, San Francisco, USA.
- Kaczorek, M., Delpeyroux, F., Chenciner, N., Streeck, 10 R.E., Murphy, J.R., Boquet, P. og Tiollais, P. (1983),
Science 221, 853-855.
- Kessler, S.W., J. Immunol. 115, 1617-1624 (1975).
- Laemmli, U.K., (1970) Nature, 227, 680-685.
- Lusky, M. og Botchan, M. (1981) Nature, 293, 79.
15 - Machida, A., Kishimoto, S., Ohnuma, H., Miyamoto, I..,
Baba, K., Oda, K., Nakamura, T., Funatsu, G., Mijakawa, Y. og Mayami, M., (1982) Mol. Immunol. 19, 1087-1093.
- Marion, P.L., Knight, S.S., Feitelson, M.A., Oskiro, L.S. og Robinson, W.S. (1983) Journal of Virology, 48, 20 534-541.
- Maxam, A. og Gilbert, W. (1980), Methods Enzymol. 65, 499.
- Michel, M.L., Pontisso, P., Sobczak, E., Malpi'ece, Y., Streeck, R.E. og Tiollais, P., (1984), Proc. Natl. Acad.
25 Sci. USA 81, 7708-7712.
- Moriarty, A.M., Hoyer, B.H., Wai-Kuo Shih, J., Gerin,
J.L. og Hamer, D.H., (1981) Proc. Natl. Acad. Sci. USA
78.
- Neurath, A.R., Kent, S.B.H. og Strick, N., (1984) The 30 · 1984 International Symposium on Hepatitis Virus, San
Francisco, USA.
- Newmark, P. (1984), Nature 311, 510-511.
- Pasek, M. et al., Nature (London) 282-575 (1979).
- Peterson, D.L., Paul, D.A., Gavilanes, F. og Achord, 35 D.T., i: Advances in Hepatitis research (ed. Chisari, F.V.) 30-39 (Mason Publishing U.S.A., Inc. 1984).
- Pillot, J. og Petit, M.A. (1984) Molecular Immunology, 31
DK 166357 B
21, 53-60.
- Prince, A.M., Vnek, J. og Stephan, W., (1983) Develop.
Biol. Standard. 54, 13-22 (S. Kargel, Basel).
- Rigby, P.W.J., Dieckmann, M., Rhodes, C. og Berg, P.
5 (1977) J. Mol. Biol. 113, 237.
- Shapiro, S. K., Chou, J., Richaud, F.V. og Casadaban, M.J., (1983) Gene, 25, 71-82.
- Smith, G.L., Mackett, M. og Moss, B. (1983) Nature, 302, 490-495.
10 - Southern, E.M. (1975), J. Mol. Biol. 98, 503-517.
- Stibbe, W. og Gerlich, W. (1983) Journal of Virology 46, 626-628.
- Tiollais, P., Charnay, P. og Vyas, G.N. (1981) Science 212, 406-411.
15 - Valenzuela, P., Medina, A. og Rutter, W.J. (1982)
Nature, 298, 347-350.
- Valenzuela, P., i Proceedings og the Twelwth International Conference on Yeast Genetics and Molecular Biology, Edinburgh 1984, 16.
20 " Van der Werf, S., Wychowski, C., Bruneau, P., Blondel, B., Crainic, R., Horodniceanu, F. og Girard, M. (1983),
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80, 5080-5084.
- Voller, A. , Bedwell, D.E. & Berlett, A. ϊ A Guide with Abstracts of Microplate Applications, p. 1 (Dynatech, 25 Guernsey 1979).
- Wigler, H., Pellicer, A., Silverstein, S., Axel, R.,
Urlaub G. og Chasin, L., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.
76, 1373-1376 (1979).
30 35
Claims (14)
1. Partikler, der indeholder en så stor del af de karak-5 teristiske aminosyresekvenser af hovedpolypeptidet i hepatitis B virus-overfladeantigenet (HBs antigen), at denne del er tilstrækkelig til at bibringe · partiklerne en struktur, der ligner strukturen af de naturlige partikler, der er karakteristiske for HBs antigen, kende- 10 tegnet ved, at partiklerne på deres overflade og indbygget i hovedpolypeptidet bærer mindst én fremmed aminosyresekvens, som fortrinsvis selv indeholder et im-munogent område, og som indsættes i en af hovedpolypepti-dets hydrofile regioner, der normalt er eksponeret på 15 partiklens ydre overflade eller erstatter en eller flere af aminosyrerne i en af hovedpolypeptidets hydrofile regioner .
2. Partikler ifølge krav 1, kendetegnet ved, 20 at den fremmede aminosyresekvens indsættes i den region, der omfatter aminosyrerne 32-74 i polypeptidet.
3. Partikler ifølge krav 1, kendetegnet ved, at den fremmede aminosyresekvens indsættes i den region, 25 der omfatter aminosyrerne 110-156 i polypeptidet.
4. Partikler ifølge ethvert af kravene 1-3, k e n d e -tegnet ved, at den fremmede polypeptidsekvens har en størrelse, der ikke overstiger 16 aminosyrer, for- 30 trinsvis en størrelse på 5-16 aminosyrer, især 6-13 aminosyrer.
5. Partikler ifølge ethvert af kravene 1-4, kende -tegnet ved, at de også indeholder den polypeptidse- 35 kvens, som indkodes i præ-S-regionen af hepatitis B-virus genomet. DK 166357 B
6. Rekombinant DNA indeholdende en DNA-sekvens, der koder for S-regionen og eventuelt tillige præ-S-regionen af ge-nomet i hovedpolypeptidet af hepatitis B virus, kendetegnet ved, at det omfatter mindst én nucleo- 5 tidsekvens, der koder for den nævnte fremmede aminosyre-sekvens, i mindst én af de zoner i S-regionen, der svarer til de hydrofile regioner af det nævnte hovedpolypeptid af hepatitis B virus, og at S-regionen og eventuelt også præ-S-regionen, som befinder sig i DNA'et, står under di- 10 rekte kontrol af en exogen promotor, som vides effektivt at kunne iværksætte transkriptionen af de gener, der er under direkte kontrol af promotoren i eukaryote celler, især humane eller animalske celler eller gærceller, hvortil vektorerne er beregnet. 15
7. Rekombinant DNA ifølge krav 6, kendetegnet ved, at den nucleotidsekvens, der koder for den nævnte fremmede sekvens, er lokaliseret i den region af S-genet, som koder for det polypeptid, der strækker sig mellem 20 aminosyrerne 32 og 74 i hovedpolypeptidet, der indgår i konstitutionen af HBs antigenet.
8. Rekombinant DNA ifølge krav 6, kendetegnet ved, at den nucleotidsekvens, der koder for den nævnte 25 fremmede sekvens, er lokaliseret i den region af S-genet, som koder for det polypeptid, der strækker sig imellem aminosyrerne 110 og 156 i hovedpolypeptidet, som indgår i konstitutionen af HBs antigenet.
9. Rekombinant DNA ifølge ethvert af kravene 6-8, ken detegnet ved, at den nævnte fremmede nucleotidsekvens koder for et polypeptid, som højest omfatter 16 aminosyrer, fortrinsvis 6-13 aminosyrer.
10. Rekombinant DNA ifølge ethvert af kravene 6-9, kendetegnet ved, at den ovennævnte exogene promotor er en af de promotorer, der findes i SV40-virus. DK 166357 B
11. Cellelinie hidrørende fra en værtsorganisme, især en human eller animalsk værtsorganisme eller gær, som er i stand til at genkende den exogene promotor af et rekom-binant DNA ifølge ethvert af kravene 6-10, k en de 5 tegnet ved, at den omfatter et rekombinant DNA ifølge ethvert af kravene 6-10 inkorporeret i genomet.
12. Cellelinie ifølge krav 11, kendetegnet ved, at den er sammensat af celler, som genkender promo- 10 toren af SV40 virus.
13. Fremgangsmåde til fremstilling af partikler ifølge ethvert af kravene 1-5, kendetegnet ved, at man transformerer en cellelinie, især en human eller ani- 15 malsk cellelinie, med et rekombinant DNA ifølge ethvert af kravene 6-10, idet DNA’ets promotor er valgt i overensstemmelse med naturen af den anvendte værtscelle, og at man dyrker den således transformerede mikroorganisme, hvorefter man udvinder de fremstillede partikler. 20
14. Fremgangsmåde ifølge krav 13, kendetegnet ved, at den fremmede sekvens, som er inkorporeret i ho-vedpolypeptidet, højest omfatter 16 aminosyrer, og at man udvinder de frembragte partikler fra værtsorganismens 25 dyrkningsmedium, hvori de udskilles. 30 35
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| FR8506708A FR2581394B1 (fr) | 1985-05-02 | 1985-05-02 | Particules ayant les proprietes immunogenes de l'antigene hbs et portant un site antigenique etranger aux epitopes portes par l'antigene hbs, vecteurs et cellules animales pour la production de telles particules et compositions contenant de telles particules pour la production de vaccins mixtes |
| FR8506708 | 1985-05-02 |
Publications (4)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| DK202586D0 DK202586D0 (da) | 1986-05-02 |
| DK202586A DK202586A (da) | 1986-11-03 |
| DK166357B true DK166357B (da) | 1993-04-13 |
| DK166357C DK166357C (da) | 1993-09-06 |
Family
ID=9318908
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| DK202586A DK166357C (da) | 1985-05-02 | 1986-05-02 | Partikler med immunogene egenskaber svarende til hbs antigen samt vektorer og animalske celler til produktion af saadanne partikler |
Country Status (10)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0201416B1 (da) |
| JP (2) | JPH088869B2 (da) |
| AT (1) | ATE62508T1 (da) |
| CA (1) | CA1282021C (da) |
| DE (1) | DE3678609D1 (da) |
| DK (1) | DK166357C (da) |
| ES (1) | ES8703520A1 (da) |
| FR (1) | FR2581394B1 (da) |
| GR (1) | GR861141B (da) |
| PT (1) | PT82500B (da) |
Families Citing this family (23)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0278940A3 (en) * | 1987-01-30 | 1988-12-07 | Smithkline Biologicals S.A. | Hepatitis b virus surface antigens and hybrid antigens containing them |
| EP0299242A3 (en) * | 1987-06-22 | 1989-01-25 | Medico Labs Ag | Heterologous viral peptide particle immunogens |
| FR2635532B1 (fr) * | 1988-07-29 | 1992-05-22 | Pasteur Institut | Particules hbsag recombinantes hybrides : caracteristiques morphologiques de l'antigene hbsag contenant 1 sequence immunogene induisant des anticorps neutralisants diriges contre hiv ou susceptible d'etre reconnue par de tels anticorps; sequences nucleotidiques codant pour de telles particules; vaccins les contenant |
| EP0491077A1 (en) * | 1990-12-19 | 1992-06-24 | Medeva Holdings B.V. | A composition used as a therapeutic agent against chronic viral hepatic diseases |
| US6740323B1 (en) | 1999-11-24 | 2004-05-25 | Chiron Corporation | HBV/HCV virus-like particle |
| JP4647870B2 (ja) * | 1999-11-24 | 2011-03-09 | ノバルティス バクシンズ アンド ダイアグノスティックス，インコーポレーテッド | Ｈｂｖ／ｈｃｖウイルス様粒子 |
| JP4085231B2 (ja) | 2000-02-28 | 2008-05-14 | 株式会社ビークル | タンパク質中空ナノ粒子とそれを用いた物質運搬体、ならびに細胞への物質導入方法 |
| US7128911B2 (en) | 2001-01-19 | 2006-10-31 | Cytos Biotechnology Ag | Antigen arrays for treatment of bone disease |
| US7094409B2 (en) | 2001-01-19 | 2006-08-22 | Cytos Biotechnology Ag | Antigen arrays for treatment of allergic eosinophilic diseases |
| JP4516748B2 (ja) | 2001-09-14 | 2010-08-04 | サイトス バイオテクノロジー アーゲー | ウィルス様粒子中への免疫賦活物質のパッケージ化：調製法および使用法 |
| US7115266B2 (en) | 2001-10-05 | 2006-10-03 | Cytos Biotechnology Ag | Angiotensin peptide-carrier conjugates and uses thereof |
| JP2003286199A (ja) * | 2002-03-29 | 2003-10-07 | Japan Science & Technology Corp | タンパク質中空ナノ粒子を用いる肝臓疾患治療用薬剤 |
| JP2003286198A (ja) * | 2002-03-29 | 2003-10-07 | Japan Science & Technology Corp | 増殖因子等を提示するタンパク質中空ナノ粒子を用いる治療薬剤 |
| JP2003286189A (ja) * | 2002-03-29 | 2003-10-07 | Japan Science & Technology Corp | 中空ナノ粒子を形成するタンパク質に疾患治療用の細胞導入物質を融合させた薬剤 |
| JP2004081210A (ja) * | 2002-06-28 | 2004-03-18 | Japan Science & Technology Corp | システイン残基を改変したタンパク質からなる中空ナノ粒子およびそれを用いた薬剤 |
| US8575110B2 (en) | 2003-02-17 | 2013-11-05 | Alpha-O Peptides G | Peptidic nanoparticles as drug delivery and antigen display systems |
| US7537767B2 (en) | 2003-03-26 | 2009-05-26 | Cytis Biotechnology Ag | Melan-A- carrier conjugates |
| CA2517675A1 (en) | 2003-03-26 | 2004-10-07 | Cytos Biotechnology Ag | Packaging of immunostimulatory oligonucleotides into virus-like particles: method of preparation and use |
| IN2014CN03364A (da) | 2011-10-12 | 2015-09-04 | Alpha O Peptides Ag | |
| KR20150099601A (ko) | 2012-12-25 | 2015-08-31 | 잇빤 자이단호진 가가쿠오요비겟세이료호겐쿠쇼 | HPV/HBs 키메라 단백질을 유효성분으로 하는 HPV 감염증 및/또는 B형 간염용 백신 |
| US10279019B2 (en) | 2014-02-11 | 2019-05-07 | Stc.Unm | PCSK9 peptide vaccine conjugated to a Qbeta carrier and methods of using the same |
| US20200061172A1 (en) | 2017-02-23 | 2020-02-27 | Alpha-O Peptides Ag | Self-assembling protein nanoparticles encapsulating immunostimulatory nucleid acids |
| WO2018172447A1 (en) | 2017-03-23 | 2018-09-27 | Alpha-O Peptides Ag | Self-assembling protein nanoparticles with built-in six-helix bundle proteins |
Family Cites Families (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4415491A (en) * | 1980-01-14 | 1983-11-15 | The Regents Of The University Of California | Synthetic vaccine peptide epitomes of hepatitis B surface antigen |
| FR2532850B1 (fr) * | 1982-09-15 | 1985-12-20 | Pasteur Institut | Conjugues immunogenes entre un haptene et une molecule porteuse derivee d'une toxine, les vaccins les composant et procede pour leur obtention |
| US4483793A (en) * | 1982-10-04 | 1984-11-20 | The Regents Of The University Of California | Dimeric oligopeptides as heptenic epitopic sites for hepatitis |
| FR2550203B1 (fr) * | 1983-08-01 | 1985-11-22 | Anvar | Peptides synthetiques immunogenes porteurs d'un epitope caracteristique de l'antigene de surface du virus de l'hepatite b et compositions les contenant |
| FR2569984B1 (fr) * | 1984-09-12 | 1987-08-14 | Anvar | Molecule synthetique contenant une pluralite d'epitopes distincts, procede pour son obtention et application a la production de polyvaccins |
-
1985
- 1985-05-02 FR FR8506708A patent/FR2581394B1/fr not_active Expired
-
1986
- 1986-04-29 AT AT86400944T patent/ATE62508T1/de not_active IP Right Cessation
- 1986-04-29 EP EP86400944A patent/EP0201416B1/fr not_active Expired - Lifetime
- 1986-04-29 GR GR861141A patent/GR861141B/el unknown
- 1986-04-29 DE DE8686400944T patent/DE3678609D1/de not_active Expired - Fee Related
- 1986-05-02 DK DK202586A patent/DK166357C/da not_active IP Right Cessation
- 1986-05-02 CA CA000508233A patent/CA1282021C/fr not_active Expired - Fee Related
- 1986-05-02 JP JP61102929A patent/JPH088869B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1986-05-02 ES ES555124A patent/ES8703520A1/es not_active Expired
- 1986-05-02 PT PT82500A patent/PT82500B/pt not_active IP Right Cessation
-
1995
- 1995-07-24 JP JP7187404A patent/JPH08198897A/ja active Pending
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| DE3678609D1 (de) | 1991-05-16 |
| JPH088869B2 (ja) | 1996-01-31 |
| GR861141B (en) | 1986-08-21 |
| PT82500B (pt) | 1989-05-12 |
| EP0201416A1 (fr) | 1986-11-12 |
| JPS61258000A (ja) | 1986-11-15 |
| CA1282021C (fr) | 1991-03-26 |
| FR2581394A1 (fr) | 1986-11-07 |
| ATE62508T1 (de) | 1991-04-15 |
| ES8703520A1 (es) | 1987-03-01 |
| DK202586A (da) | 1986-11-03 |
| DK202586D0 (da) | 1986-05-02 |
| DK166357C (da) | 1993-09-06 |
| EP0201416B1 (fr) | 1991-04-10 |
| FR2581394B1 (fr) | 1988-08-05 |
| PT82500A (fr) | 1986-06-01 |
| JPH08198897A (ja) | 1996-08-06 |
| ES555124A0 (es) | 1987-03-01 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| DK166357B (da) | Partikler med immunogene egenskaber svarende til hbs antigen samt vektorer og animalske celler til produktion af saadanne partikler | |
| Cheng et al. | Hepatitis B virus large surface protein is not secreted but is immunogenic when selectively expressed by recombinant vaccinia virus | |
| JP2610015B2 (ja) | アデノウイルスプロモーターの制御下で所定のポリペプチドをコードしているヌクレオチド配列を含む組換えｄｎａ | |
| KR0181940B1 (ko) | 변형된 HBsAg 라아지 단백질 | |
| US6306625B1 (en) | Method for obtaining expression of mixed polypeptide particles in yeast | |
| JP2634371B2 (ja) | 脊椎動物細胞内でｂ型肝炎表面抗原をコードするｄｎａを発現するベクター | |
| US6099840A (en) | Hepatitis B vaccine | |
| JP3228737B2 (ja) | キメラヘパドナウイルスコア抗原蛋白 | |
| EP0300213A1 (en) | Hepatitis a viral peptide particle immunogens | |
| HU196625B (en) | Process for producing hepatitis b virus vaccine | |
| KR930003609B1 (ko) | B형간염 비루스표면 항원 및 중합된 인체혈청 알부민의 수용체를 함유하는 폴리펩티드의 제조방법 | |
| US6426216B1 (en) | Defective recombinant adenovirus lacking E1A coding sequence and comprising a heterologous nucleotide sequence under control of the E1A promoter | |
| Seifer et al. | Expression pattern of the hepatitis B virus genome in transfected mouse fibroblasts | |
| US5854024A (en) | Hepatitus B vaccine | |
| US5077213A (en) | Recombinant vaccinia virus | |
| AU4315689A (en) | Defective hepadnaviruses and producer cell line for vaccines and treatment of liver diseases and disorders | |
| PL168787B1 (pl) | Sposób wytwarzania czastki kompozytowej PL | |
| Marquardt | Hepatitis B virus components produced by the human hepatoma cell line PLC/PRF/5: Do they indicate virus propagation? | |
| KR960004264B1 (ko) | B형 간염 표면항원, 이의 생성 진핵 세포 및 백신의 제조방법, 검정방법 및 진단용 키트 | |
| AU625348B2 (en) | Heterologous viral peptide particle immunogens | |
| AU642729C (en) | Hepatitis B vaccine | |
| US5989865A (en) | Hepatitis B vaccine | |
| KR900005534B1 (ko) | 복합 프로모터를 이용한 효모 발현 벡터에 의한 b형 간염 바이러스 표면항원들의 제조방법 | |
| WATANASEREE et al. | COS-7 CELLS BY USING A RECOMBINANT pcDNA I VECTOR KRUAVON BALACHANDRA", KASAMA SUPANARANOND", CHUENCHIT |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PBP | Patent lapsed |