JP3228737B2 - キメラヘパドナウイルスコア抗原蛋白 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、キメラヘパドナウイルスコア抗原蛋白の構
築に関する。

Ｂ型肝炎ウイルスは、3200ヌクレオチドからなる部分
的に２重鎖のゲノムをもったヘパドナウイルスである。
本ウイルスのDNAは、同様に、ウイルスによってコード
された表面抗原（Robinson,Ann.Rev.Microbiol.31,357
−377,1977）によって包まれているウイルスによってコ
ードされたコア抗原（HBcAg）によって囲まれている。
表面抗原を温和な洗剤で除去すると、HBcAgとウイルスD
NAからなる直径27nmのコア粒子が残る。HBcAgは、微生
物の細胞において、天然のままのポリペプチドとして、
及びβ−ガラクトシダーゼの末端の８ケの残基（参照、
Murrayら、EMBOJ.３,645−650,1984）に融合した誘導体
として発現された。

大腸菌において合成されるとき、コア蛋白自体は、27
nmの粒子となって集合するが、これは、電子顕微鏡下で
みることができ（CohenとRichmond,Nature,296,677−67
8,1982）、実験動物において免疫原性である（Stahl
ら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 79,1606−1670,1982）。
コア抗原のアミノ酸配列には、カルボキシル末端の近く
にあるプロタミン（DNA結合蛋白）中に見出される配列
と相同であるところの１領域が存在している。推測によ
り、分子のこの部分が、コア粒子の集合の間にDNAと相
互作用するものと示唆されている（Pasekら、Nature,28
2,575−579,1979）。Ｂ型肝炎コア抗原と非相同蛋白配
列を含む組換え体粒子の強力な免疫原部分としての使用
については、十分報告されている。我々は、蛋白のアミ
ノ末端に対して非相同配列を付加した結果、その表面に
非相同エピトープが高密度で差出され、実験動物に接種
されたとき、高度に免疫原性である粒子構造となって、
自動的に集合することを以前に示した（Clarkeら、Natu
re 330,381−384,1987）。同じ様な結果が、我々の系
を使用して他のグループによって報告されている（例え
ば、Changら、正の鎖のRNAウイルスに関する第２回国際
シンポジウム、Vienna,Austria,1989,要旨010）。

他のグループのその後の実験によって、該蛋白のカル
ボキシル末端からの、約40のアミノ酸を、非相同配列で
置換え、依然として粒子の形態を保つことが可能である
ことが示された（StahlとMurray,Proc.Natl.Acad.Sci.U
SA,86 6283−6287,1989）。その上、これらの粒子は、
明らかにアミノ末端融合よりは弱いけれども、やはり抗
原性である。

これらの融合粒子が加えられたエピトープに対するす
ぐれた免疫応答を誘導するという事実にもかかわらず、
いくつかの観点から、依然として改善の余地が残されて
いる。加えられたエピトープに対する免疫応答は、すば
らしいとはいえ、HBcAg配列に対して発生された相当す
る応答には及ばない。第２に、アミノ末端とカルボキシ
ル末端の融合においては、ともに、付加したエピトープ
はそれが一方の端だけで共有結合しているため、本質的
な可撓性を有している。これは、立体配座に融通性がな
いエピトープにとっては不利となると思われる。第３
に、Ｂ型肝炎コア抗原のモデル構造から、天然では、蛋
白のアミノ基とカルボキシル基末端は、粒子の内部に位
置していることが予知された（ArgosとFuller,EMBOJ.1,
819−824,1988）。それらを表面にさし向けるのは、大
抵の非相同エピトープの内在性の親水性のエピトープだ
けである。

我々は、今や、HBcAg粒子の表面領域における高度に
免疫原性の領域の位置をつきとめた。HBcAgをコードし
ていて、この高免疫原性の領域に制限酵素部位をもって
いるベクターが構築された。外来配列を、制限酵素部位
において挿入し、キメラHBcAg蛋白が発現できるように
した。キメラ蛋白は、外来エピトープがそれらの表面に
露出している粒子となって自己集合した。

したがって、本発明は、コア抗原がHBcAgである場合
には、アミノ酸残基68から90の配列、または別のヘパド
ナウイルスコア抗原の場合に相当するアミノ酸残基配列
のすべて、または一部の中に、エピトープを含む外来ア
ミノ酸配列が挿入されるか、すべてまたは一部を置換し
ているところのキメラヘパドナウイルスコア蛋白からな
る粒子を提供する。HBcAg残基は、Onoら、Nucl.Acid.Re
s.11,1747−1757,1983によって番号がつけられている。
別のヘパドナウイルスのコア蛋白の相当する残基は、HB
cAgと他のコア蛋白の配列を並べあわせることによって
決定できる。

キメラ蛋白粒子は、キメラ蛋白が担っているエピトー
プに対して特異的な抗体を作るために用いることができ
る。それゆえ、抗体は哺乳類に外来配列が望ましい特異
性の抗体を誘導することができるエピトープを含むキメ
ラ蛋白から構成されている粒子の効果的量を投与するこ
とによって作ることができる。キメラ蛋白粒子は、医薬
として、または動物薬として受入れることができる担体
を含む医薬または動物薬の１成分として、この目的のた
めに提供することができる。

本発明は、また、ヘパドナウイルスコア蛋白をコード
し、そして、（ａ）HBcAgアミノ酸残基68から90、また
は、別のヘパドナウイルスの相当する配列内に１つの制
限酵素部位をもつか、（ｂ）HBcAgのアミノ酸残基68か
ら90までをコードする配列、HBcAgのアミノ酸残基68か
ら90までをコードする配列の１部、または、別のヘパド
ナウイルスのコア蛋白の相当する配列の側面にある２つ
の制限部位をもっているDNA配列を提供する。HBcAgコド
ン68から90まで、または、別のヘパドナウイルスのコア
蛋白についてのそれらの相当するコドンが、完全にまた
は部分的欠失している場合は、制限部位は、残っている
配列において適当に位置される。２つの制限酵素部位が
用意される場合には、典型的にはそれらは同じ酵素によ
って切断される部位である。

このようなDNA配列を組込むあるベクターを構築する
ことができる。本ベクターは、宿主内に提供される。本
ベクターは、本発明のキメラ蛋白を発現することができ
るベクターの調整のために、１つの出発点を提供する。
この目的のためには、キメラ蛋白をコードするDNA配列
が構築される必要がある。さらに具体的には、このよう
なDNA配列を組込み、適切な宿主に提供される場合に、
該キメラ蛋白を発現することができるベクターが必要で
ある。

キメラ蛋白を発現することができるベクターは、外来
配列をコードするDNA配列を、ヘパドナウイルスコア蛋
白をコードし、そして、上述の制限酵素部位、（単数）
（ａ）または、（複数）（ｂ）、をもつベクターの中に
挿入することによって調製される。好ましくは、制限酵
素部位（ａ）は、HBcAgコドン80と81にあるか、もしく
は、別のヘパドナウイルスのコア蛋白についての相当す
るコドンにある。さもなければ、２つの制限部位（ｂ）
は、１つの隣接部がHBcAgコドンの68と69において、他
の隣接部が、80と81において、または再び別のヘパドナ
ウイルスのコア蛋白質については、その相当するコドン
において用意されることができる。その結果生じたキメ
ラ蛋白をコードするベクターは、典型的には、適合性の
宿主中に提供される。

キメラ蛋白を得るためには、宿主体は、キメラ蛋白が
発現されるような条件下で培養される。宿主は、キメラ
蛋白をコードする発現ベクターを提供される。キメラ蛋
白は、発現したときは、自動的に集合して粒子となり、
そして、単離することができる。これらの粒子は、Ｂ型
肝炎ウイルスを変性させることによって得ることができ
るHBcAgと、ウイルスDNAから構成されている27nmコア粒
子に極めて似ている。外来エピトープは、粒子の外表に
露出している。

キメラ蛋白は、エピトープを含む外来アミノ酸配列を
含む。“外来”とは、その配列がヘパドナウイルスコア
蛋白の配列の部分ではないことを意味する。HBcAgアミ
ノ酸残基の68から90までのすべて、または１部内に挿入
されたか、すべて、または１部を置換している外来配列
は、それゆえ、トリ肝炎ウイルス、特にアヒル（Feitel
sonとMiller,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,85,6162−6166,1
988）からのウイルスのHBe1エピトープの予知された位
置の近くの39の挿入部分の１部またはすべてではない。
キメラ蛋白のヘパドナウイルスコア蛋白は、典型的に
は、哺乳類のヘパドナウイルスコア抗原、特にヒトのHB
cAg、またはウッドチャックのWHcAgである。Ｂ型肝炎ウ
イルスadw血清型HBcAgが使用されることがある。

どんな外来エピトープ、すなわち、ヘパドナウイルス
コア蛋白のエピトープでないエピトープは、キメラ蛋白
の１部として提供することができる。エピトープは、抗
体を産生することができるアミノ酸残基の配列である。
該エピトープは、例えば、感染体またはウイルスやバク
テリアのような病原体のエピトープのように、中和抗体
を産生することができるエピトープであってよい。それ
は、生長ホルモンのような非感染作用体のエピトープで
あってもよい。外来配列は、例えば１つのエピトープの
８こまでの、または４こ迄のコピーのように、１つのエ
ピトープの繰返しを含んでいてよい。それゆえ、外来配
列中には、エピトープの２つのコピーが存在することが
ある。外来配列は、例えば、３または４この２つ以上の
異なるエピトープを含んでいてよい。

そのエピトープが、そこに与えられてよいウイルスの
例として、Ａ型肝炎ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、イン
フルエンザウイルス、口蹄疫ウイルス、ポリオウイルス
（pV）、単純ヘルペスウイルス、狂犬病ウイルス、ネコ
白血病ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス１型（HIV−
１）、HIV−２、サル免疫不全ウイルス（SIV）、ヒトラ
イノウイルス（HRV）、デング熱ウイルス及び黄熱病ウ
イルスがあげられる。それゆえ、キメラ蛋白によって与
えられるエピトープは、HBsAgのエピトープ、HBsAgのpr
es領域のエピトープまたはHRV2のエピトープであってよ
い。

キメラ蛋白中の外来配列は、例えば、50こまでのよう
に、100こまでのアミノ酸残基の長さがあってよい。そ
れゆえ、外来配列は、長さが40こまで、30こまで、20こ
までまたは10こまでのアミノ酸残基であってよい。外来
配列は、それに対し、抗体を誘導することが望まれるエ
ピトープを含んでいる。外来配列はまた、エピトープの
いずれか一方、または両末端に、さらにアミノ酸残基を
含むことがある。

さらに、アミノ酸残基が存在している場合には、これ
らは、ヘパドナウイルスコア抗原をコードするベクター
に望ましいエピトープをコードしているDNAを挿入する
のに必要な操作によって決定することができる。それら
は、天然にエピトープに並列しているアミノ酸であって
よい。例えば、４こまでのように10こまでのアミノ酸
を、さらに外来エピトープの末端に提供してよい。

外来の配列は、例えば、HBcAg残基配列69から90、71
から90、または75から85のように68から90の、または別
のヘパドナウイルスコア蛋白の相当する残基の中に挿入
してよい。最も好ましいのは、外来配列を、HBcAgのア
ミノ酸残基80と81の間、または別のヘパドナウイルスの
コア蛋白の相当する残基間に挿入することである。代替
策としては、コア蛋白残基の配列によって、または１部
は、外来配列によって置換することができる。それゆ
え、HBcAgのアミノ酸残基75から85、80と81、または、
より好ましくは、70から79、または別のヘパドナウイル
スのコア蛋白の相当する残基は、それゆえ、外来の配列
によって置換することができる。外来配列が天然のまま
のコア蛋白配列のすべて、または１部を置換する場合に
は、挿入された外来配列は、それが置換するHBcAg配列
よりも一般的に短かくない。

２番目の外来アミノ酸の配列は、コア蛋白のアミノ酸
のＮ末端またはＣ末端に融合することができる。この２
番目の外来配列も、エピトープを含むことができる。こ
のエピトープは、HBcAgアミノ酸残基68から90、または
別のヘパドナウイルスのコア蛋白の相当する残基のすべ
て、または１部内に挿入されたか、すべて、または１部
を置換するエピトープ（第１のエピトープ）と同一であ
っても、異っていてもよい。第１のエピトープに関連し
て、上述したように、どのようなエピトープも、２番目
のエピトープとして存在してよい。２番目のエピトープ
を含む外来配列の長さと構造も、第１のエピトープに関
連して、上に記述された通りであってよい。

キメラ蛋白を調製するためには、発現ベクターがまず
構築される。このようにして、望ましいキメラ蛋白をコ
ードするDNA配列が提供される。該DNA配列を組込み、相
当な宿主中に提供されたとき、キメラ蛋白を発現するこ
とができる発現ベクターが調製される。DNA配列に対す
るプロモーター、転写末端部位、翻訳開始部位及び停止
コドンをはじめとする適切な転写ならびに翻訳調節要素
が用意される。DNA配列は、ベクターと適合性のもつ宿
主において、ポリペプチドの発現がおこることが可能に
なるような正しいフレームの中で用意される。

キメラ蛋白を発現することができる適切なベクター
は、上記のように、制限酵素部位（ａ）、または、２つ
の制限酵素部位（ｂ）をもつHBcAg発現ベクターから構
築することができる。制限酵素部位（ａ）は、例えば、
HBcAgアミノ酸残基71から90、もしくは別のヘパドナウ
イルスのコア蛋白の相当する残基内に提供することがで
きる。

外来のアミノ酸配列をコードするDNA配列を制限酵素
部位（ａ）において、HBcAgの発現ベクターに挿入する
か、制限酵素部位（ｂ）の横に接したDNA配列の代りに
挿入する。HBcAg発現ベクターは、適切な制限エンドヌ
クレアーゼで消化され、脱燐酸化される。外来配列をコ
ードするDNA配列を切断した発現ベクターにつなぐ。挿
入されたDNA配列は、典型的にはオリゴヌクレオチド合
成の標準技術によって調製される。

HBcAg発現ベクターにおける各制限酵素部位は、より
好ましくは、HBcAgアミノ酸配列が変化しないように、H
BcAgをコードする配列において提供される。制限酵素部
位（ａ）は、HBcAgコドン80及び81または別のヘパドナ
ウイルスコア蛋白のための相当するコドンに存在するこ
とができる。より好ましくは、HBcAgをコードする配列
中のコドン80と81において、Nhe I部位が提供される。
このようなNhe I部位が備えられているHBcAg発現ベクタ
ーであるプラスミドpPV−Nheを宿しているE.coli XL−
１ Blueを1989年９月12日にNational Collection of I
ndustrial and Marine Bacteria,Aberdeen,GBに、受入
れ番号NCIMB40210の下で寄託した。

これに替る、または付加的な好ましい制限酵素部位
は、HBcAgコドン68と69、または他のヘパドナウイルス
のコア蛋白についての相当するコドンにまたがってい
る。適切には、NheF I部位（下線が引かれている）は、
以下の如く提供される。

67 68 69 ACＧ CTA GCＴ T L A １つのNhe I部位が、コドン80と81において、コドン6
8と69に上述の如く用意されているHBcAgの発現ベクター
であるプラスミドpN₂ E.coli XL−1 Bloeを、1990年８
月20日にNational Collection of Industrial and Mari
ne Bacteria Aberdeen,GBにおいて受入れ番号NCIMB4031
2の下に寄託した。

新しい制限酵素部位は、２つの方法のうちのいずれか
において達成することができる。第１に、それは、この
領域をコードしている制限酵素部位断片を、この領域を
コードする一連の合成オリゴヌクレオチドによって置換
え、新規の制限部位を導入することによって達成するこ
とができる（例１を参照）。

第２に、それは、同じコード領域（例５を参照）の制
限部位の突然変異誘発によって達成することができる。
これは、典型的には１本鎖DNAを生産することができるM
13mp18のようなベクターの中に、この領域を代表する制
限断片を、最初にサブクローニングすることによって実
行することができる。次に、特定部位の突然変異誘発
は、特異的不適性合成オリゴヌクレオチドを使用して、
標準的方法によって達成することができる。次に、この
ような突然変異誘発を受けた制限酵素断片は、適切な発
現ベクターにおける親遺伝子中に置換導入することがで
きる。

アミノ酸68から90の、例えば71から90までのHBcAgの
コーディング配列のすべて、または１部が、制限酵素部
位によって置換されたHBcAgの発現ベクターの場合に
は、外来アミノ酸配列をコードするDNA配列が、上に述
べられたように挿入されることができる。このDNA配列
は、リジン残基の外に天然のHBcAgアミノ酸配列の部分
が、68と90残基の間で提供されるように、１つ以上の天
然HBcAg残基をコードすることができる。例えば、HBcAg
残基68,69及び70は、この方法で提供されることができ
る。

キメラ蛋白をコードする発現ベクターは、適切な宿主
において提供されている。そのとき、キメラ蛋白が発現
される。ベクターを宿している細胞は、発現がおこるこ
とが可能なように生育させるが、培養する。発現される
キメラ蛋白は、自動的に集合して粒子となる。そのと
き、キメラ粒子を単離することができる。

いかなる適切な宿主−ベクター系も用いることができ
る。ベクターはプラスミドであってよい。その場合にお
いて、E.coliやS.cerevisiaeのような細菌または酵母の
宿主を用いることができる。代替策としては、ベクター
は、ウイルスのベクターであってよい。これは、ポリペ
プチドの発現を起すために、チャイニーズハムスター卵
巣（CHO）細胞のような哺乳類細胞系の細胞を、トラン
スフェクトするのに使用することができる。

キメラ蛋白は、ヒトまたは動物のためのワクチンとし
て使用することができる。それは、どのような適切な方
法においても投与されることができる。経口投与が、皮
下、静脈または筋肉内投与のような、非経口経路かのい
ずれを選ぶか、そして、投与量の選択は、予防接種の目
的と予防接種されるのがヒトであるか哺乳動物であるか
に依存している。同様な基準によって、ワクチン製剤に
おいて使用される生理学的に受入れることがきる担体ま
たは希釈剤が左右される。従来の製剤、担体または希釈
剤を使用することができる。しかし、典型的には、融合
蛋白は、経口、または非経口経路によって、用量あたり
１−1000μｇ、より好ましくは、用量あたり10−100μ
ｇの量で投与される。

以下の例は、本発明を具体的に説明する。随伴してい
る図面において： 第１図に、プラスミドpBc404が示されている。B,E,及
びＰは、それぞれBamH1,EcoR I及びPst Iについての制
限酵素部位を示す。tacはtacプロモーターを意味し;ori
は複製の起点を意味する;blaは、β−ラクタマーゼ、そ
し、SDはシャインダルガノ配列を意味する。

第２図は、プラスミドpPV−Nheの構築を示す。

参考例:N末端にPV1Mahoney VP1の95−104残基を含む短
い延長部を有するHBcAgの調製物 発現プラスミドpPV404は、第１図に示されている親プ
ラスミドpBc404から調製された。pBc404を宿しているE.
coli JM101を、1989年２月９日にNational Collection
of Industrial and Marine Bacteria,Aberdeen GBの受
入れ番号40111の下に寄託した。PV1MahoneyからのPV1の
アミノ酸95から104を表す合成オリゴヌクレオチドを標
準的手順によって、T₄リガーゼを使用して、pBc404に連
結した。この結果、pPV404を生じた。合成オリゴヌクレ
オチド、それらが、どのようにともにアニールするか、
Ｎ−末端の延長のコーディング配列は、以下の通りであ
る。

例1:プラスミドpPV−Nheの調製 20このアミノ酸の長さの一連ペプチドを化学合成し
た。これらのペプチドは、互に10このアミノ酸が重複し
ていて、全部でＢ型肺炎ウイルスと血清型からのコア蛋
白の全アミノ酸配列を表している。これらのペプチドの
各々が、炭酸塩コーティングバッファー中で、ミクロタ
イタープレートをコートするのに用いられ、モルモット
からの血清でのエンザイム−リンクトイムノソルベント
アッセイ（ELISA）分析において使用された。モルモッ
トに細菌を宿主として発現した肝炎Ｂコア粒子を接種し
ておいた。

アミノ酸71から90に相当するペプチドの１つが、極め
て強力な反応を与えた。これは、コア粒子が直線ペプチ
ドと反応した抗体を、in vivoで引出したことを示して
いる。該配列は、大ざっぱに、肝炎Ｂのコア粒子（Will
iamsとLe Bouvier,Bibilotheca Haematologica 42,71−
75,1976）の報告されているHBelエピトープに相当し
た。我々の結果から、外来のエピトープによるHBcAgの
この免疫優勢域（immuno dominant region）の挿入また
はそれによる置換の結果、外来エピトープに関する免疫
性の増強を示すキメラ蛋白を生ずることを示唆した。そ
れゆえ、我々は、外来配列をadwコア配列に挿入するこ
とを試みた。

我々が従った戦略は、第２図に示されている。最初、
プラスミドは、プラスミドpPV404であった。このプラス
ミドは、動物において極めて免疫性の強いキメラ粒子
を、バクテリア中で大量に発現する。その戦略は、コア
遺伝子中のアミノ酸の位置80−81における独特なNhe I
制限部位の導入を含んでいる。これはコア蛋白中におい
て、アミノ酸の変化を生じない、突然変異の性質は、以
下の通りである 最初にpPV404を制限酵素XbalとAcc IIIで消化し、その
結果、3.96kbrと340bpの２つの断片を生じた。これらの
断片を、電気泳動で分離し、切出し、比較的小さい断片
をさらに、Xho IIで消化し、その結果、第２図において
示されるように３つの断片を生じた。

第２図に示した如くの配列をもった、２つのオリゴヌ
クレオチドを同時に合成した。これらのオリゴンクレオ
チドを、それらがXho II適合性の付着端及び内部のNhe
I部位をもったリンカーとなるように標準的方法によっ
てアニールさせ、リン酸化した。次に、これらのオリゴ
ヌクレオチドは、340bpの断片に連結され、19bpの天然
のXho II断片と置き換えた。この連結物質は、次に、大
きな3.96kbp断片に連結し戻し、標準法によって、E.col
iの株XL−1Blveに導入して形質転換した。

この戦略のデザインは、天然の19bpXho II断片がベク
ター中に再挿入される可能性を除外していない。新しい
Nhe I部位を含むプラスミドを宿しているバクテリアを
選択するために、形質転換によって発生した組換え体の
クローンすべてから培養物を調製した。次に、この培養
物を使用して、コロニーの全“ライブラリー”を代表し
ているプラスミドDNAを抽出した。塩化セシウムで精製
した後、このDNAをNhe Iで消化した。

新しいリンカーを担っているこれらの組換え体のプラ
スミドのみ、この方法によって消化され、その結果、こ
の集団の線形化に至った。したがって、線形のDNAは、
残りの抹消化分子から、アガロースゲル電気泳動により
精製し、再連結の後、E.coliに導入して形質転換し戻
し、Nhe I陽性の形質転換体の集団を得た。個々のクロ
ーンを制限酵素部位地図作成によって分析した。挿入Nh
e I部位をもつことが確認されたNhe I部位は、DNA配列
決定によって、さらに特徴づけを行った。得られたクロ
ーンpPV−Nheの正しい配列をもっていた１つの制限酵素
部位の地図を第２図に示してある。

前に述べた通り、実験のデザインによって正しいHBcA
gのアミノ酸配列の維持が確保された。したがって、イ
ソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（IPTG）
で誘導した後の発現分析により高収量のPV−HBcAg粒子
の存在が確認されたことは、驚くにあたらない。

例2:キメラHBcAg蛋白から構成されている粒子の調製 pPV−Nheが非相同性配列を発現する能力は、始めは、
ヒトライノウイルス２型（HRV2）とＢ型肝炎表面抗原
（HBsAg）からのエピトープの挿入によって評価され
た。これは、Nhe I付着端が横に接している各配列をコ
ードする合成オリゴヌクレオチドをNhe Iで消化し、脱
リン酸したpPV−Nheに導入することによって達成され
た。pPV−NheのNhe I部位に挿入された配列が、以下に
示されている。

合成オリゴヌクレオイドを連結したプラスミドを、E.
coli株XL−1BLueに導入して形質転換した。各新構造体
は、分析のための内部の制限酵素部位が存在して、得ら
れたクローンの迅速なスクリーニングができるようにデ
ザインが行われた。内部制限酵素部位はHRV2について
は、M1u1であり、HBsAgについては、Sph Iであった。正
しい制限部位を有する得られたクローンを、普通ブイヨ
ン中で高密度迄培養し、IPTGを培地に添加することによ
ってキメラ蛋白の発現が誘導された。37℃で６から８時
間培養した後、バクテリアの細胞を遠心分離によって収
穫し、標準的手順によって溶解し、発現蛋白をPAGE,ウ
エスターンブロット及びエリザで分析した。粒子構造の
存在は、蔗糖密度勾配遠心分離によって決定した。

HRV2エピトープからHBsAgのいずれかを含むキメラ蛋
白の発現が観察された。キメラ蛋白は、自動的に集合し
て粒子となった。HRV2エピトープ構造物に関する詳細な
分析により、バクテリアにおいては、発現の水準は極め
て高く、粒子の形成が維持され、キメラ蛋白がウエスタ
ーンブロットによって、抗−HRV2血清と反応することが
示された。エリサ分析によってもHRV2エピトープが粒子
の表面に露出していることが示された。

例3:さらなる粒子状キメラHBcAg蛋白の調製 さらにエピトープをpPV−Nheに挿入した。合成オリゴ
ヌクレオチド（複数）を一緒に連結して、エピトープを
コードし、Nhe I付着末端をもっているDNA断片を調製し
た。該DNA断片をNhe Iで消化し、脱リン酸したpPV−Nhe
に挿入した。該DNAを連結したプラスミドをE.coli株XL
−１ Blueに導入して形質転換した。

クローンを普通ブイヨン中で高密度まで培養し、キメ
ラ蛋白の発現を、IPTGを培地に添加することによって誘
導した。37℃で６−８時間インキュベートした後、細胞
を収穫し、標準法で溶解し、発現した蛋白をPAGD、ウエ
スターンブロット及び／またはエリザによって分析し
た。粒子構造の存在は、蔗糖密度勾配遠心分離によって
決定した。

以下のエピトープをもっているキメラ蛋白が、この方
法で得られた。各場合において、エピトープはクローニ
ングの手順のため、Ａ−Ｓ残基が横に接して並んでい
る。

1.B型肝炎ウイルス（HBV）のPre−S1領域からのQE1−ア
ミノ酸残基15から47。この領域は、ウイルスと細胞の相
互作用に関っている。本配列はadw血清型から由来し
た。

（ａ）合成オリゴヌクレオチド （ｂ）コーディング配列 2.HBVのPre−S2領域からのQM2−133−144。この領域
は、HBVにおける一連のエピトープであり、チンパンジ
ーを感染から守ることができる。本配列は、adw血清型
から由来している。

（ａ）合成オリゴヌクレオチド （ｂ）コーディング配列 3.HBVのPre−S2領域からのQM2−120−153。これは２の
大型判である。配列は、adw血清型から由来していた。

（ａ）合成オリゴヌクレオチド （ｂ）コーディング配列 4.pPD1−110−148、HBsAgからの複合エピトープ （ａ）合成オリゴヌクレオチド （ｂ）コーディング配列 5.pPA1−VP1 101−110HAV（Ａ型肝炎ウイルス） （ａ）合成オリゴヌクレオチド （ｂ）コーディング配列 6.pPA2−VP1 13−24HAV （ａ）合成オリゴヌクレオチド （ｂ）コーセィング配列 7.pPA3−VP3 61−83HAV （ａ）合成オリゴヌクレオチド （ｂ）コーディング配列 8.pPA4−VP1 160−182HAV （ａ）合成オリゴヌクレオチド （ｂ）コーディング配列 9.pPA5−VP2 40−60HAV （ａ）合成オリゴヌクレオチド （ｂ）コーディング配列 10.HIV−Ｉのgp41からのアミノ酸735−752。これは、HI
Vに対する潜在的中和エピトープである。

（ａ）合成オリゴヌクレオチド （ｂ）コーディング配列 11.中和抗体の誘導に関与するネコ白血病ウイルスgp70
（197−219）からのエピトープ （ａ）合成オリゴヌクレオチド （ｂ）コーディング配列 例4:両方のアミノ末端においてHRV2エピトープをもち、
HBcAg残基80と81の間に挿入されたキメラ蛋白の調製 例２において示されているHRV2 VR2をコードするオ
リゴヌクレオチドを、その例において詳述したように、
pPV−Nheベクター中に挿入した。その組換え体ベクター
をE.coR IとBamH Iで消化した。約4.4kbのバンドは低融
点アガロースゲル電気泳動によって精製した。HRV2から
のVP2のアミノ酸156から170を表す合成オリゴヌクレオ
チドを、標準手順によってT48リガーゼを用いて組換え
体ベクターに連結した。合成オリゴヌクレオチド、それ
らがどのようにともにアニールするか、及びＮ−末端延
長部のコーディング配列は以下の通りであった。

その結果得られたプラスミドは、E.coli株XL−１ Bl
ueに導入して形質転換された。クローンを普通ブイヨン
中で高密度に培養した。キメラ蛋白の発現は、例２にお
いて記述された如く行われた。発現蛋白は、PAGE、ウエ
スターンブロット及びエリザで分析した。粒子構造の存
在は蔗糖濃度勾配遠心分離によって決定された。

例5:HBcAgアミノ酸配列の１部を置換することを可能に
するプラスミドpPN2の調製 全HBcAg遺伝子を１本鎖DNAを産生することができるベ
クター中にサブクローンニングを行った。これは、特に
付着足突然変異（sticky foot mutagenesis）として知
られている技術を使用して実行された。最初に、pPV−N
he I（例１）からのコア遺伝子、以下に示すように、２
つのオリゴヌクレオチドを使用して増幅させた。

したがって、その結果得られた断片（600塩基対）は
各末端にlac Ｚ相補性配列を有する。平行的に、１本
鎖のウラシルに富んだDNAを完全なlac Ｚ遺伝子を含む
市販ベクターpBS−SK（＋）（Stratagene）から調製し
た。この１本鎖DNAをPCK断片と混合した。その過程を通
じて、新たに導入したlac Ｚを横にもつ領域が、１本
鎖ベクターとアニールした。このアニールした重複体
は、次にDNAポリメラーゼを使用して２重鎖化し、E.col
i株XL1−Blueにトランスフェクトした。コロニーは正し
い組換え体プラスミドの存在について制限酵素地図作成
によって検定した。

それゆえ、このプラスミド（Q9）、lacプロモーター
の転写調節の下にあるPV−Nhe I HBcAgの全コピーを担
っている。それはまたpBSに由来しているので１本鎖DNA
を生産することができる。それゆえ、このような１本鎖
DNA（ウラシルに富んだ）を調節し、HBcAg蛋白のアミノ
酸68と69の部位において、さらにNhe I制限酵素部位を
造るために使用された。これは、合成オリゴヌクレオチ
ドを、Q9からの１本鎖DNAでアニールし、重合させ、前
と同様に、親のテンプレートを除くことによって行われ
た。突然変異誘発のために使用されたオリゴヌクレオチ
ドは、以下の通りであった。： 組換え体DNAは、E.coliXL−1Blue内にトランスフェク
トし、コロニーは、結果として生じたDNAのプライマー
エクステンション法による直接配列決定によって分析し
た。pPN2による突然変異を起こさせた領域の配列は下線
を引いた２つのNhe I部位について示されている如くで
ある。２つの制限酵素部位の間の領域は、必要とされる
エピトープをコードする合成オリゴヌクレオチドで置換
することができる。

例6:動物試験 免疫処置のプロトコル 重さ約400gの雌のDunkin Hartleyモルモットに、それ
ぞれ不完全Freundのアジュバンド（IFA）中に製剤され
た0.5ml用量のキメラHBcAg蛋白の調製物を、それぞれに
筋肉内接種した。４匹ずつの動物の群に特定用量の精製
コア粒子を接種し、最初と同じ用量で、56日目から70日
目に１回強化接種を行った。実験期間を通じて14日間隔
毎に血液検体を採取した。

ELISA 血清中の抗ペプチド、抗ウイルス及び抗−粒子活性を
間接的または２重抗体サンドウィッチELISA法の改変法
によって測定した。サンドウィッチELISAにおいては、
ポリクローナル抗ペプチド血清（1:200）を、PBSと２％
乾燥粉ミルク中の粒子の連続希釈を捕捉するために使用
した。間接的エリザにおいては、２μg/mlのペプチド、
粒子またはウイルスで、ミクロタイタープレート上に、
直接的にコートした。それぞれの場合において、プレー
トを洗い、試験血清試料とともにインキュベートした。
37℃で１−２時間インキュベーションした後、プレート
を再び洗い、抗IgG−ペルオキシダーゼ結合体を加え
た。37℃で、さらに１時間洗った後に、プレートを洗
い、酵素基質（0.04％ｏ−フェニレンジアミンと0.1Mホ
スフェート、0.05Mクエン酸塩バッファー中の0.04％の
過酸化水素）を加えた。その結果得られた色素の発現
を、硫酸で停止させ、A492をTitertek Multiskan（Flow
Labs）において測定した。

接種後の検体の希釈から得られたA492測定値を、血液
希釈度の逆数のlog10に対してプロットした。そして、
抗体価を陰性対照（接種前の血清の1:10の希釈）を参照
して計算した。

結果 1. モルモットに、PreS1−HBcAgキメラ蛋白で構成され
た例３・１において得られた20μｇまたは２μｇの粒子
を筋肉内接種した。規則的間隔で、血液を採取した。そ
れぞれの場合において、キメラHBcAg蛋白（392）中のPr
e−S1挿入部からなるペプチド、挿入部（対照）なしのH
BcAg、及びPreS1−HBcAg粒子をエンザイムリンクドイム
ノソルベントアッセイ（ELISA）のディッシュをコート
し、次に集められた抗血清の希釈に対して、検定を行っ
た。結果は、表１に示されている。極めて高水準の抗ペ
プチド抗体価、抗HBcAg及び抗PreS1−HBcAg粒子抗体が
達成された。

2.手順は以下、すなわち − モルモットにPreS2エピトープ−HBcAg小キメラ蛋白
から構成される例３・２において得られる粒子を接種し
たこと − PreS2挿入部（393）、HBcAg、PreS2−HBcAg粒子及
びPreS2エピトープが組込まれた酵母由来のHBsAg粒子か
らなるペプチドが、エリザディッシュ上にコートされた
こと を除いて、１におけるのと同じであった。

結果は、表２において示されている。再び極めて高水
準の抗体が、モルモット中に誘導された。

3. HRV2VP2のエピトープが本発明（“インサート”、
例２）にしたがって挿入されているキメラHBcAg蛋白か
ら成立つ粒子によって、モルモットとウサギに誘導され
た免疫応答と同じHRV2VP2のエピトープが、HBcAgのアミ
ノ末端（“ターミナル”）に融合されているキメラ状蛋
白から構成されている粒子によって誘導された免疫応答
を比較した。該“ターミナル”キメラHBcAg蛋白は、JP
−Ａ−196299/88において記載されている手順にしたが
って調製された。結果は、表３と表４においてエリザの
終点抗体価（log10）として示してある。エリザのプレ
ートは、HRV2 VP2エピトープまたはHRVのいずれかから
構成されているペプチドでコートされた。“インサー
ト”キメラHBcAg蛋白は、よりすぐれた結果をあたえ
た。すなわち、より高い抗HRVペプチド抗体価と、より
高い抗−HRV抗体価 4. 中和抗体応答を、上記３のモルモットとウサギにつ
いて検べた。特に、“インサート”粒子の２つの接種に
対する動物の応答を検定した。その結果は、表５に示さ
れている。

5. ウサギとモルモットは、例２のキメラHBsAg139−14
7エピトープHBcAg蛋白で構成されている粒子を接種し
た。抗−ペプチド139−147（αpep448）と抗−HBsAg
（αHBsAg）応答は、粒子の３つの投与を用いて決定し
た。その結果は、表６において示されている。示されて
いるデータは、42日目の最初の強化接種以前、及び最終
採血日98日目における抗体価（log₁₀）である。抗−HBs
Ag活性によれば、ウサギ、そして特にモルモットの最終
血液中に良好な抗体水準が観察された。

表 ５ （ａ）モルモット 中和抗体価 ペプチド用量（μｇ） 90％プラークの減少 1.5 90,30,50,25 0.15 20,5 0.015 ＜5,＜５ （ｂ）ウサギ 中和抗体価 ペプチド用量（μｇ） 90％プラークの減少 1.5 300,5 0.15 10,15 0.015 ＜5,＜５

【図面の簡単な説明】

第１図は、プラスミドpBc404を示す。 第２図は、プラスミドpPV−Nheの構築を示す。

フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｐ 21/00 Ｃ Ｃ１２Ｐ 21/00 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ (72)発明者 バーウィン エワート クラーク イギリス国ケント，ベッケンハム，ラン グリィ コート，（番地なし）ザ ウエ ルカム ファウンデーション リミテッ ド 気付 (72)発明者 デビッド ジョン ロウランズ イギリス国ケント，ベッケンハム，ラン グリィ コート，（番地なし）ザ ウエ ルカム ファウンデーション リミテッ ド 気付 (56)参考文献 Ｎａｔｕｒｅ，ｖｏｌ．330（1987) ｐ．381−384 ＴＨＥ ＥＭＢＯ ＪＯＵＲＮＡＬ, ｖｏｌ．７（1988）ｐ．819−824 (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) C12N 7/00 C12N 15/09 ZNA ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)

Claims (22)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】エピトープを有する外来アミノ酸配列を含
   むキメラヘパドナウイルスコア抗原蛋白から構成される
   粒子であって、 該エピトープは、該コア抗原がＢ型肝炎コア抗原の場合
   には、75から85までのアミノ酸配列の全部または１部の
   中に挿入されるかまたはそれらと置換しており、別のヘ
   パドナウイルスのコア抗原の場合には、相当するアミノ
   酸配列の全部または１部の中に挿入されるかまたはそれ
   らと置換している、 ことを特徴とする上記粒子。
2. 【請求項２】外来アミノ酸配列が、その長さが40までの
   アミノ酸残基である請求項１の粒子。
3. 【請求項３】外来アミノ酸配列が、その長さが20までの
   アミノ酸残基である請求項２の粒子。
4. 【請求項４】外来アミノ酸配列が、Ｂ型肝炎コア抗原の
   アミノ酸残基80と81の間に、あるいは別のヘパドナウイ
   ルスのコア抗原の相当する間に、挿入されている請求項
   １〜３のいずれかの粒子。
5. 【請求項５】エピトープが、病原体のエピトープである
   請求項１〜４のいずれかの粒子。
6. 【請求項６】エピトープが、Ａ型肝炎ウイルス、Ｂ型肝
   炎ウイルス、インフルエンザウイルス、口蹄疫ウイル
   ス、ポリオウイルス、単純ヘルペスウイルス、狂犬病ウ
   イルス、ネコ白血病ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス１
   型または２型、サル免疫不全ウイルス、ヒトライノウイ
   ルス、デング熱ウイルスまたは黄熱病ウイルスのエピト
   ープである請求項５の粒子。
7. 【請求項７】エピトープが、Ｂ型肝炎表面抗原（HBsA
   g）のpre−Ｓ領域からのものである請求項６の粒子。
8. 【請求項８】第２の該外来アミノ酸配列が、コア蛋白の
   アミノ酸配列のＮ−末端に結合している請求項１〜６の
   いずれかの粒子。
9. 【請求項９】エピトープを有する外来アミノ酸配列を含
   むキメラヘパドナウイルスコア抗原蛋白をコードするDN
   A配列を含むベクターであって、適当な宿主中に用意さ
   れた時に、該キメラ蛋白を発現するベクターであり、 該エピトープは、該コア抗原がＢ型肝炎コア抗原の場合
   には、75から85までのアミノ酸配列の全部または１部の
   中に挿入されるかまたはそれらと置換しており、別のヘ
   パドナウイルスのコア抗原の場合には相当するアミノ酸
   配列の全部または１部の中に挿入されるかまたはそれら
   と置換している、 ことを特徴とする上記ベクター。
10. 【請求項１０】エピトープを有する外来アミノ酸配列を
    含むキメラヘパドナウイルスコア抗原蛋白をコードする
    DNA配列を含むベクターで形質転換された宿主であっ
    て、該宿主中で該キメラ蛋白が発現される宿主であり、 該エピトープは、該コア抗原がＢ型肝炎コア抗原の場合
    には、75から85までのアミノ酸配列の全部または１部の
    中に挿入されるかまたはそれらと置換しており、別のヘ
    パドナウイルスのコア抗原の場合には相当するアミノ酸
    配列の全部または１部の中に挿入されるかまたはそれら
    と置換している、 ことを特徴とする上記宿主。
11. 【請求項１１】外来アミノ酸配列を含むキメラヘパドナ
    ウイルスコア抗原蛋白から構成される粒子の調製法であ
    って、 （ｉ）該キメラ蛋白をコードするDNA配列を含むベクタ
    ーで形質転換された宿主であって、該宿主中で該キメラ
    蛋白が発現される宿主を、該キメラ蛋白が発現されるよ
    うな条件下で培養し、次いで （ii）かくして形成される該キメラ蛋白から構成される
    粒子を回収する、ことを含む上記調製法であって、 該エピトープは、該コア抗原がＢ型肝炎コア抗原の場合
    には、75から85までのアミノ酸配列の全部または１部の
    中に挿入されるかまたはそれらと置換しており、別のヘ
    パドナウイルスのコア抗原の場合には相当するアミノ酸
    配列の全部または１部の中に挿入されるかまたはそれら
    と置換している、 ことを特徴とする上記調製法。
12. 【請求項１２】薬学的にあるいは獣医学的に許容し得る
    担体または希釈剤と、活性成分としての、エピトープを
    有する外来アミノ酸配列を含むキメラヘパドナウイルス
    コア抗原蛋白から構成される粒子を含有する薬学的ある
    いは獣医学的製剤であって、 該エピトープは、該コア抗原がＢ型肝炎コア抗原の場合
    には、75から85までのアミノ酸配列の全部または１部の
    中に挿入されるかまたはそれらと置換しており、別のヘ
    パドナウイルスのコア抗原の場合には相当するアミノ酸
    配列の全部または１部の中に挿入されるかまたはそれら
    と置換している、 ことを特徴とする上記製剤。
13. 【請求項１３】外来アミノ酸配列が、その長さが40まで
    のアミノ酸残基である請求項12の製剤。
14. 【請求項１４】外来アミノ酸配列が、その長さが20まで
    のアミノ酸残基である請求項13の製剤。
15. 【請求項１５】外来アミノ酸配列が、Ｂ型肝炎コア抗原
    のアミノ酸残基80と81の間に、あるいは別のヘパドナウ
    イルスのコア抗原の相当する間に、挿入されている請求
    項12〜14のいずれかの製剤。
16. 【請求項１６】エピトープが、病原体のエピトープであ
    る請求項12〜15のいずれかの製剤。
17. 【請求項１７】エピトープが、Ａ型肝炎ウイルス、Ｂ型
    肝炎ウイルス、インフルエンザウイルス、口蹄疫ウイル
    ス、ポリオウイルス、単純ヘルペスウイルス、狂犬病ウ
    イルス、ネコ白血病ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス１
    型または２型、サル免疫不全ウイルス、ヒトライノウイ
    ルス、デング熱ウイルスまたは黄熱病ウイルスのエピト
    ープである請求項16の製剤。
18. 【請求項１８】エピトープが、Ｂ型肝炎表面抗原（HBsA
    g）のpre−Ｓ領域からのものである請求項17の製剤。
19. 【請求項１９】第２の該外来アミノ酸配列が、コア蛋白
    のアミノ酸配列のＮ−末端に結合している請求項12〜17
    のいずれかの製剤。
20. 【請求項２０】ヘパドナウイルスコア抗原をコードする
    DNA配列を含む発現ベクターであって、 該ベクターは、 （ａ）Ｂ型肝炎コア抗原のアミノ酸基75から85をコード
    する配列、あるいは別のヘパドナウイルスのコア蛋白の
    相当する配列内の制限酵素部位、または （ｂ）該配列または該配列の１部に接している２つの制
    限酵素部位、 を有することを特徴とする上記発現ベクター。
21. 【請求項２１】制限酵素部位（ａ）は、Ｂ型肝炎抗原コ
    ドン80と81に、あるいは別のヘパドナウイルスの相当す
    るコア蛋白コドンに生じる請求項20の発現ベクター。
22. 【請求項２２】pPV−Nhe（NCIMB 40210）またはpPN2
    （NCIMB 40312）である請求項20の発現ベクター。