JP2758184B2 - 肝炎ｂ表面抗原ワクチン - Google Patents

肝炎ｂ表面抗原ワクチン

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Description

【発明の詳細な説明】 発明の分野 本発明は、組換DNA法により製造されるポリペプチド
から構成される肝炎Ｂ表面抗原（「HBs抗原」又は「HBs
AG」）粒子、これらのポリペプチドをコードするDNA配
列、及びその発現のためのセルラインに関する。本発明
は特に、増加した免疫原性を有する新規な粒子に関す
る。
発明の背景 宿主細胞での発現 ワクチン製造技術の発展は、細菌、酵母及び哺乳類細
胞中でHBs抗原に対応する、ポリペプチドを合成するこ
とを可能にした。しかしながら、ポリペプチドのグリコ
シル化及び分泌並びに該ポリペプチドから形成される粒
子の組成に関する幾つかの欠点のため、細菌及び酵母で
の真核生物遺伝子の転写は抗原としてのこれらのポリペ
プチドの有効性に不都合な影響を与える。
例えば、肝炎Ｂウイルスの場合、インビボ生産される
ポリペプチド抗原は高度にグリコシル化されている〔Ge
rlich,1984:J.Virol.:52（２）,396〕。原核生物におい
てグリコシル化は本質的な過程ではなく、遺伝子操作さ
れた細菌により生産されるポリペプチドはグリコシル化
されていないか、又はグリコシル化が不完全である。い
ずれの場合にも、HBsAgに対応するポリペプチドは、細
菌中で発現される場合、HBsAgに見られるような効果的
なワクチンのために十分な抗体を生じさせない。真核宿
主としての酵母はより完全なグリコシル化を行うことが
できるが、酵母中で発現されたHbsAgに対応するポリペ
プチドは細菌での発現の場合と同じ欠陥を有する（Murr
ay等、1979:Nature,282 575;Valenzuela等、1982:Natur
e,298,347;Miyanohara等、1983:PNAS,80,1）。更なる例
として、細菌中では、HBsAgの真核性構造遺伝子はほと
んどの場合効果的に転写されない。さらに、真核性HBsA
g遺伝子産物の構造及び機能はジスルフィド結合の連結
の追加の翻訳後過程に依存し、これは細胞宿主において
は達成され得ない。
さらに、発現されたポリペプチドはほとんどの場合細
菌宿主細胞から分泌されない。発現されたポリペプチド
の収得のためにはこれらが溶解されなければならない。
精製の過程で、細菌壁成分がポリペプチドに汚染し、そ
して患者において深刻なアレルギー反応を惹起するか又
は過敏性ショックを導くかもしれない。
最後に、真核性プロモーターは通常細菌中では機能せ
ず、そして細菌性プロモーターにより置き換えられなけ
ればならず、この細菌性プロモーターは発現されたポリ
ペプチドの修飾をもたらすかもしれない（Offensperger
等、1985:PNAS,82,7540;Valenzuela等、1980:ICN-UCLA
Symp,Mol.Cell.Biol.,1857）。
粒子の形成及び分泌 肝炎Ｂウイルス（「HBV」）の天然形、及びHBV蛋白質
は３種類の区別される形態で存在する。
・感染性材料であると思われるHBV−ビリオン〔デーン
（Dane）粒子〕 ・フィラメント（filament） ・蛋白質エンベロープのみから成る20又は22nm粒子（以
後、「20nm粒子」と称する） 有効なワクチンのための最も興味ある形態は20nm粒子
である。なぜなら、１）コード配列が完全に知られてお
り、２）全く非感染性であり、そして３）ヒト生物体に
おいて幾らかの有用な免疫原性を発揮するからである。
HBV粒子の３種類の既知の成分は蛋白質組成のそれら
の相対量において異る。226個のアミノ酸を有する主要
蛋白質、281個のアミノ酸を有する中間蛋白質、及びそ
れぞれサブタイプayw及びadwに依存して389個又は400個
のアミノ酸を有する大形蛋白質と称される３種類のモノ
マーが存在する。大形蛋白質はプレ−S1−領域、プレ−
S2−領域及びＳ−領域の完全配列によりコードされ、他
方中間蛋白質はプレ−S2−領域及びＳ−領域のみに由来
し、そして最後に主要蛋白質はＳ−領域のみからである
（Tiollais等、1985:Nature,317,489;Dubois等、1980:P
NAS,77,4549;McAlzer等、1984:Nature,307,178）。
HBVの感染性ビリオン（デーン粒子）は、20nm粒子に
比べて40〜80倍多くの高分子量モノマーすなわち、プレ
−S1ペプチド及びプレ−S2ペプチドを含有する。これら
のプレ−Ｓポリペプチド類が幾つかの生物学的及び臨床
的事項と関連性を有することが今や知られている。プレ
−Ｓポリペプチド上のポリアルブミン受容体は、HBVに
感受性のヒト及びチンパンジーからの重合したアルブミ
ンに結合し得る（Thung等、1983:Liver,3,290;Machida
等、1984:Gastroenterology,86,910）。この狭い宿主域
及びヒト肝細胞上のポリヒト血清アルブミンに対する既
知のリセプターはHBVのヘパトトロピズム（hepatotropi
sm）を説明する：デーン（Dane）粒子は循環から肝細胞
により取り上げられたポリヒト血清アルブミンを介して
肝細胞に接触することができる。この証拠に基いて、プ
レ−ＳペプチドはHBVに対する効率的なワクチンとして
有用なはずである。なぜなら、その抗体は肝細胞に入る
ために必要なデーン粒子上の有意な部位をブロックする
ことが期待され得るからである（Tiollais等、1985:Nat
ure,317,489;Millich等、1985;Science,228,1195）。
文献のデーターもまた、エンベロープ粒子上における
よりも高い比率でプレS1エピトープが存在する感染性デ
ーン粒子に対するよりよい保護を示唆するであろう。
限定された免疫原性保護を生じさせる天然源（例えば
提供血）から得られるワクチンはプレ−Ｓ蛋白質を（ほ
とんど）含有せず、これは２つの異る理由による。第一
に、精製工程が非感染性20nm粒子に向けられる。これら
は、デーン粒子中の15〜20％に比べてせいぜい１％のプ
レ−S1ペプチドを含有する（Gerlich,1984:J.Vir.,52
（２）,396;Tiollais等、1985:Nature,317,489;Gerlic
h,1982:Virology,123,436）。第二に、20nm粒子は抗−H
BE陽性キャリヤー（Hevac B,Hepavac B）の血清から単
離され、又は精製工程中にプロテアーゼにより消化され
る。このプロテアーゼ消化は、Ｓモノマーのみを残して
プレ−Ｓ−ポリペプチドを切断することが示されてい
る。その結果、これらのワクチンはプレ−Ｓポリペプチ
ドを含有しないか、又はほとんど含有しない。
従って、粒子の組成のために高い免疫原性を有し、細
胞中でグリコシル化を受けそして粒子産生細胞から連続
的に分泌されるHBs抗原粒子の形のワクチンの要求が存
在する。
参照文献及び特許 EP-A-72318は、酵母レプリコン、酵母プロモーター及
びＳペプチドをコードするDNA配列を含んで成るベクタ
ーにより形質転換された酵母細胞中でのHBsAgの発現を
記載している。
Laub等、J.Virol.Vol.48,No.1,271-280頁、1983は、1
63コドンの前駆体配列を含む、HBsAgが導入されている
シミアンウイルス40から出発するベクターの作製を開示
している。Laub等の報告によれば、該ベクターにより形
質転換されたCV-1細胞は、さらに追加の163コドンの前
駆体配列を含有する上記ベクターに比べて、Ｓ蛋白質の
ためのコード配列のみをベクターが含有する場合、一層
良好な発現をもたらす。
さらに、武田薬品工業の日本特許出願No. J5-8194-89
7-Aは、全体プレ−Ｓペプチド及びＳペプチドの発現を
記載している。adwサブタイプの発現にも言及されてい
る。
Feitilson等、Virology,Vol.130,75-90頁、1983は、2
4000,28000,32000,43000及び50000ダルトンの種を含む
プレ−Ｓコード配列内のポリペプチドの部分的発現を記
載している。
さらに、DE-OS 34 39 400は、肝炎Ｂウイルスの免疫
原性ポリペプチド配列の発現を記載している。
上記の配列はプレ−S1ポリペプチドの部分配列を代表
し、108コドン又は119コドンを含み、そしてHBsAgの第
一出発コドンから始まりそして終止コドンの前の281コ
ドンで終わる。
EP-A-154 902は、肝炎Ｂウイルスのエンベロープのプ
レ−Ｓ鎖コード領域内の少なくとも６個の連続するアミ
ノ酸のアミノ酸鎖を有するペプチドを含有する肝炎Ｂワ
クチンを開示している。このワクチンは、肝炎Ｂウイル
スの天然エンベロープ蛋白質に対応するアミノ酸配列を
含有しない。
さらに、Kent等はPept.Chem.Vol.22,16770頁、1984
に、プレ−S2領域のＮ−末端の26アミノ酸を含有する化
学合成されたペプチドが抗原として機能することがで
き、そして従って合成ワクチンとして適当であることを
記載している。
発明の目的 前記参照文献はいずれも、20nm粒子を構成するモノマ
ーの組成を変え、そしてそれによってデーン粒子の天然
組成に接近することにより、粒子の抗原性が改良され得
る可能性を考慮していない。
上に検討したように、ウイルスエンベロープ蛋白質の
ペプチドモノマーの免疫原性は、集合した蛋白質粒子に
比べて非常に貧弱である。本発明の目的は、感染性デー
ン（Dane）粒子の表面構造の天然組成に匹敵するプレ−
Ｓポリペプチドエピトープの量を含有する蛋白質粒子を
開発することである。
更なる目的は、すでに市販されているか開発中の他の
すべての生成物に比べて良好な免疫応答、長期間の保
護、及び低い非−レスポンダー速度（nom-responder ra
te）の出現における重要な保護エピトープを含有する追
加のプレ−Ｓペプチドを用いることである。
他の目的は、哺乳類細胞中でHBsAgを発現せしめるこ
とである。これは、哺乳類細胞での目的ペプチドの発現
が ・３つの翻訳／（転写）生成物のための異る制御機構 ・プロモーター−プロモーター阻害 ・出発コドンの強さの相違 ・発現されるのがペプチドのすべてではないこと、 をもたらし得るという既知の困難を克服することを必
要とする。
発明の概要 この明細書で使用する場合、「HBV Sペプチド」なる
語はHBVゲノムの完全なＳ領域によりコードされるペプ
チドを意味する。この明細書で使用する場合、「HBVプ
レ−S2ペプチド」なる語は、HBVゲノムの完全なプレ−S
2領域及びＳ領域によりコードされるペプチドを意味す
る。この明細書において使用する場合、「HBVプレ−S1
ペプチド」なる語は、HBVゲノムの完全なプレ−S1領
域、プレ−S2領域及びＳ領域によりコードされるポリペ
プチドを意味する。この明細書において使用する場合
「エピトープ」なる語は、呼称されるゲノム領域により
コードされる少なくとも６個の連続するアミノ酸の配列
を意味する（例えば、「HBVプレ−S2エピトープ」はHBV
ゲノムのプレＳ−領域によりコードされる少なくとも６
個のアミノ酸の配列を意味する）。この明細書において
使用する場合、「抗原性」は免疫応答を惹起する（例え
ば、ワクチン又は抗原として作用する）能力、抗体の生
産を生じさせる（例えば、抗原として作用する）能力、
及び／又は免疫応答もしくは抗体の産生を増強するよう
に細胞表面受容体と相互作用する（例えば、Ｔ−細胞表
面受容体と反応して免疫応答を増強する）能力を意味す
る。
「HBV」なる語は、文献〔P.Valenzuela,Nature Vol.2
80,815頁（1979）;Gerlich,EP-A-85 111 361;Neurath,E
P-A-85 102 250〕に記載されているあらゆるサブタイプ
のウイルス、特にadw,ayw,adr及びayrを意味する。本発
明のエピトープがそれに由来することができるペプチド
配列の例は第V II I〜XX図に示されている。
本発明に従えば、第一DNA配列及び第二DNA配列を含ん
で成る組換DNA分子が開示される。該第一DNA配列はアミ
ノ酸配列の発現をコードしており、該アミノ酸配列の一
部分はHBVプレ−S1エピトープ及びHBVプレ−S2エピトー
プから成る群から選択されたエピトープの抗原性を示
す。該第二DNA配列は、分泌後に直径10nm以上の粒子を
形成するペプチドの発現をコードする。これらの粒子は
良好なワクチンを効果的に構成する最小の粒子であると
信じられる。好ましくは、分泌後に直径10nm以上の粒子
を形成するペプチドはHBV Sペプチド、HBVコアー抗原、
ポリオ表面抗原、肝炎Ａ表面抗原、肝炎Ａコアー抗原、
HIV表面抗原及びHIVコアー抗原のいずれかである。第二
DNA配列によりコードされるペプチドとして、HBV Sペプ
チドの実質的な部分又は全部が特に好ましい。第一DNA
配列及び第二DNA配列をコードする組換DNA分子におい
て、これらは同じリーディングフレーム内にあり、単一
ペプチドのそれぞれの別個の領域をコードし、そして発
現制御配列に作用可能に連結されるべきである。最後
に、これらの組換DNA分子は完全なHBVプレ−S1ペプチド
又はHBVプレ−S2ペプチドの発現をコードするDNA配列を
含有しない。
本発明の特定の組換DNA分子も開示され、ここで、第
一DNA配列は、（１）HBVプレ−S1領域及びプレS2−領域
であって、プレ−S2開始コドンATGが除去されたもの、
（２）HBVプレ−S1領域及びプレ−S2領域であり、ここ
でプレ−S1 ATGに対するフランキング配列が天然配列か
ら変化しているもの、（３）HBVプレ−S1領域及びHBVプ
レ−S2領域であって、ここでプレ−S2 ATGに対するフラ
ンキング領域が天然配列から変化しているもの、（４）
HBVプレ−S1領域及びプレ−S2領域であって、ここでプ
レ−Ｓ領域の５′−末端が除去されているもの、（５）
HBVプレ−S1領域及びプレ−S2領域であって、ここでプ
レ−S2領域の５′−末端が除去されているもの、（６）
HBVプレ−S1領域であって、プレ−S1領域の３′−末端
が除去されているもの、（７）HBVプレ−S2領域であっ
て、ここでプレ−S2領域の３′−末端が除去されている
もの、又は（８）HBVプレ−S1領域及びプレ−S2領域で
あって、これからプレ−S2 ATGが除去されているものに
対応するヌクレオチド配列を含んで成り；そして第二DN
A配列はHBV S領域であってS ATGが除去されているも
の、及び／又は（ａ）第Ｉ表に記載するオリゴヌクレオ
チドに対応する配列を含んで成る。
本発明の組換DNA分子によりトランスフェクトされた
宿主細胞も開示される。この明細書において使用する場
合、「トランスフェクトされた」又は「トランスフェク
ション」とはトランスフェクション、トランスホーメー
ション又は他の手段による宿主細胞への外来DNAの付加
を意味する。宿主細胞は、組換DNA分子を転写及び翻訳
することができる任意の単細胞生物を包含し、哺乳類細
胞、細菌及び酵母を制限なく包含する。本発明の宿主細
胞はまた、HBV Sペプチドのアミノ酸配列の実質的な部
分又はすべてに対応するアミノ酸配列の発現をコードす
るDNA配列を含んで成る第二組換DNA分子により同時トラ
ンスフェクトされ得る。
第一の個別の領域及び第二の個別の領域を含んで成る
ペプチドも開示される。該第一領域はHBVプレ−S1エピ
トープ又はHBVプレ−S2エピトープのいずれかのエピト
ープの抗原性を示す。該第二領域は、分泌の後に直径10
nm以上の粒子を形成するペプチドの実質的部分に対応す
る。好ましくは、分泌の後に直径10nm以上の粒子を形成
するペプチドはHBV Sペプチド、HBVコアー抗原、ポリオ
表面抗原、肝炎Ａ表面抗原、肝炎Ａコアー抗原、HIV表
面抗原及びHIVコアー抗原のいずれかである。HBV Sペプ
チドの実質的部分及び全部が好ましい。好ましくは、第
一領域は第二領域よりペプチドのＮ−末端近くに位置す
る。
複数の第一ペプチドモノマーを含んで成る免疫原性粒
子も開示される。該第一ペプチドモノマーのそれぞれ
は、第一の個別の領域及び第二の個別の領域を含んで成
り、これらは前記のペプチドの第一及び第二の個別の領
域と同一であることができる。さらに複数の第二ペプチ
ドモノマーを含んで成り、そして前記第一ペプチドモノ
マー及び該第二ペプチドモノマーがこれらのモノマー間
の相互作用力により結合している免疫原性粒子も開示さ
れる。該第二ペプチドモノマーのそれぞれはHBV Sペプ
チドのアミノ酸配列の実質的な部分又は全部に対応する
アミノ酸配列を含んで成る。
実質的に１％より多くの、好ましくは５％より多くの
プレ−S1エピトープを含有する免疫原性粒子も開示され
る。この明細書において使用する場合、示されるエピト
ープを有するペプチドモノマーが粒子中の全蛋白質の１
％を構成する場合に、粒子が示されるエピトープを「１
％含有する」と言う。10％より、好ましくは15％より実
質的に多くのプレ−S2エピトープを含有する免疫原性粒
子もまた開示される。
適当なキャリヤーと共に投与された後に免疫応答を惹
起するのに十分な濃度で上記の免疫原性粒子を含んで成
る、抗体の生産のために有用な製剤又は医薬製剤も開示
される。適当なキャリヤーは当業界においてよく知られ
ており、そして簡単な緩衝液を包含する。
適当なキャリヤーと共に投与した後に免疫応答を惹起
するのに十分な濃度で前記の免疫原性粒子を含んで成
る、抗体の生産のために有用な他の調製物も開示され
る。適当なキャリヤーは当業界において知られており、
そして簡単な緩衝液を包含する。
トランスフェクトされた宿主細胞の製造方法が開示さ
れ、この方法はDNAの取り込みのために許容性にされた
宿主細胞を用意し、前記の組換DNA分子の１つを含んで
成るDNAの第一調製物に前記宿主細胞を暴露し、適当な
条件下でDNAの前記第一調製物からのDNAの取り込みを前
記宿主細胞に許容し、そして外来DNAを取り込んだ宿主
細胞を選択することを含んで成る。この方法はさらに、
HBV Sペプチドのアミノ酸配列を含むペプチドをコード
するDNA分子を含んで成るDNAの第二調製物に前記宿主細
胞を暴露し、そして適当な条件下でDNAの第二調製物か
らのDNAを該宿主細胞に取り込ませることを、さらに含
むことができる。DNAの第二調製物への暴露及びその取
り込みは第一DNA調製への暴露及びその取り込みの前又
は後に行うことができる。あるいは、第一DNA調製物は
さらにHBV Sペプチドのアミノ酸配列を含むペプチドを
コードするDNA分子を含むことができる。
ペプチドの製造方法も開示され、この方法は前記組換
DNA分子を用意し、該組換DNA分子により宿主細胞をトラ
ンスフェクトし、該宿主細胞による蛋白質の発現及び分
泌を許容する条件下で該宿主細胞を培養し、そして該組
換DNA分子中のDNA配列の発現の結果として生産されたペ
プチドを集める、ことを含んで成る。この方法により製
造されたペプチドは組換DNA分子のコード領域によりコ
ードされる全アミノ酸配列より少ない部分を含有するこ
とができる。これは、組換DNA分子のコード領域の一部
分のみの転写及び／又は翻訳から、あるいは翻訳後にペ
プチド中になされる欠失により生ずるであろう。
免疫原性粒子の製造方法が開示され、この方法は、前
記組換DNA分子を用意し、宿主細胞による蛋白質の発現
及び分泌を許容する条件下で該宿主細胞を培養し、そし
て適当な条件下で該宿主細胞内での外来DNA配列の発現
の結果として生産されたペプチドモノマーの凝集を許容
することを含んで成る。HBV Sペプチドのアミノ酸配列
を含むペプチドをコードするDNA分子により前記宿主細
胞をトランスフェクト（同時トランスフェクト）するこ
とをさらに含んで成る免疫原性粒子の製造方法も開示さ
れる。このトランスフェクションは、前記組換DNA分子
のトランスフェクションの前、後又はそれと同時に行う
ことができる。同時トランスフェクトされたDNA分子に
よりコードされるペプチドの存在は、宿主から分泌され
た痕跡量よりも多くの粒子を得るために必要である。
抗体の生産のために有用な製剤又は医薬製剤が開示さ
れ、この方法は、前記の組換DNA分子を用意し、宿主細
胞を、該宿主細胞による蛋白質の発現及び分泌を許容す
る条件下で培養し、適当な条件下で、宿主細胞中のDNA
配列の発現の結果として生産されたペプチドの凝集によ
り免疫原性粒子を形成せしめ、そして該免疫原性粒子を
適当なキャリヤーと一緒にして、個体への製剤の投与の
後に抗体の生産を惹起するのに十分な濃度で該免疫原性
粒子を存在せしめることを含んで成る。これらの方法に
おいて使用される宿主細胞もまた前記のようにして同時
トランスフェクトすることができる。
図面の簡単な説明 第Ｉ図〜第Ｘ図は、本発明の遺伝子の構成を示す。
第XI図及び第XII図は、例10の免疫原性粒子の塩化セ
シウム沈澱により得られた結果を示す。
第XIII図は、第XI表に示す従来技術の構成物を示す。
第XIV図は、本発明の他の態様に従う構成物に由来す
る粒子の特徴付けを示す。
第XV図は、第Ｘ−２図のオリゴ配列を示す。
第XVI図〜第XX図は、本発明のエピトープがそれに由
来することができるペプチド配列の例を示す。
好ましい態様の記載 本発明の好ましいDNA構成物はdhfr（ジヒドロフォレ
ート・レダクターゼ）、MT-neo（メタロチオネインに連
結されたネオマイシン耐性配列）、及びMT-ecogpt（メ
タロチオネイン プロモーターに連結された耐性配列）
から成る群から選択された選択マーカーの存在により特
徴付けられる。この構成物に増幅遺伝子としてdhfr遺伝
子を付加することにより発現速度をさらに上昇せしめる
ことができる。
本発明の幾つかの構成物において使用されるHBVヌク
レオチド配列は、制限断片及び合成オリゴヌクレオチド
の単離及び連結を含む任意の手段により形成し又は単離
することができる。本明細書に具体的に記載された構成
物は、完全なプレ−S1−プレ−S2‐Ｓ領域を含むBgl II
-Bgl II HBV断片（「Bgl II-Bgl II断片」）に由来する
第IX図に示すHBVゲノムのＳ領域からの５′ Xba I-Bgl
II 3′断片（以下、「Xba I-Bgl II断片と言う）に合成
オリゴヌクレオチドを連結することにより形成された。
HBVゲノムのプレ−S1−プレ−S2‐Ｓ領域を第IX図に示
す。これらの構成物の作製に使用されるオリゴヌクレオ
チドを第Ｉ表に示す。
第Ｉ表中のオリゴヌクレオチドをXba I-Bgl II断片に
結合して所望の性質を有する構成物を製造した。幾つか
の構成物においてはアダプターオリゴヌクレオチド（第
II表）を用いてオリゴヌクレオチド及び他の構成成分上
に適切にマッチする付着末端を形成した。
第Ｉ表の所望のオリゴヌクレオチドをXha I-Bgl II断
片、他の制限断片、オリゴヌクレオチド及び他の構成物
成分と連結するために他のアダプター配列を使用するこ
とができる。このような他のアダプター配列の必要な配
列は、制限部位の表〔例えば、Mothods in Enzymology,
Vol.152,“Guide to Molecular Cloning Techniques",B
erger及びKimmel編集（Academic Press 1987）、これを
引用によりこの明細書に組み入れる〕、及び連結される
べき種々のヌクレオチドを考慮して、当業者に容易に明
らかであろう。アダプター配列はまた、本発明の構成物
に追加の制限部位を導入するためにも使用することがで
きる。なお、アダプター配列は、HBV配列にわたって適
切なリーディングフレームが維持されるように選択され
又は設計されなければならない。
宿主細胞をトランスフェクトするために使用される好
ましい遺伝子構成物は本発明に従って組換DNA技法によ
り調製された。増強された発現を伴う構成物の好ましい
具体例は第Ｉ図〜第VIII図に示され、そして次の様に模
式的に示される。
pU2−構造遺伝子 pU2−構造遺伝子−dhfr pU2−構造遺伝子−dhfr-MT-neo pU2−構造遺伝子−dhfr-MT-egpt pMT−構造遺伝子−dhfr pMT−構造遺伝子−dhfr-MT-neo pMT−構造遺伝子−dhfr-MT-egpt pH2K−構造遺伝子−dhfr pH2K−構造遺伝子−MT-neo pH2K−構造遺伝子−MT-egpt pH2K−構造遺伝子−dhfr-MT-neo pH2K−構造遺伝子−dhfr-MT-egpt 第Ｉ図〜第VIII図中に示される構成物のそれぞれは、
HBV配列に加えて、MTプロモーターを伴うネオマイシン
選択マーカー、dhfr選択／増幅遺伝子、及びHBV配列の
ためのプロモーターを含有する。HBV配列のためのプロ
モーターは好ましくはU2プロモーター、MTプロモーター
又はH2Kプロモーターである。種々のプロモーター、選
択マーカー及び増幅遺伝子を含む断片の単離を後記す
る。第Ｉ図〜第VIII図中の構成物中のHBV配列は各図中
の長方形の棒により模式的に示されており、これはXba
I-Bgl II断片と連結された第Ｉ表及び第II表からのオリ
ゴヌクレオチド及び／又はアダプター配列を示してい
る。棒中の影を付した部分は一般に、特定の構成物には
見出されない完全なプレ−S1−プレ−S2‐Ｓ領域を模式
的に示す。HBV配列の各タイプを構成するために使用さ
れ得る第Ｉ表からのオリゴヌクレオチドがこれらの図中
に示される。
第Ｘ図は、MTプロモーターの制御のもとでプレ−S2領
域からの配列を含むペプチドの発明のための２つの追加
の構成物を示す。
USプロモーターの制御のもとにHBVゲノムからの全Bgl
II-Bgl II断片を含む構成物も作られた。これらの構成
物は、ウエスタンブロット分析により示されるようにＳ
領域の欠失を含むペプチドを生産した。
上記のプロモーターは、それらの使用が発現を増強す
るためにdhfr遺伝子及びメトトレキセートを用いるモジ
ュレーション法、と組み合わされる場合、特に好まし
い。これは、選択マーカーに加えてdsfrミニ遺伝子（mi
ni gene）もプラスミド配列中に導入される場合に達成
される。dhfr遺伝子が、発現されるべき構造遺伝子と一
緒に同じプラスミド上に位置することが必須である。次
に、μＭの濃度範囲でメトトレキセートを添加すること
により構造遺伝子の発現速度の増強が得られる。こうし
て発現速度の多数倍の増強が達成される。
適当な細胞は例えばVERO細胞（モンキー腎セルライ
ン）、3T3−細胞（ネズミ繊維芽細胞系）、C127−細胞
（ネズミ繊維芽細胞系）、Ｌ−細胞、及びCHO−細胞
（チャイニーズ・ハムスター細胞、これはデヒドロフォ
レート リダクターゼ陽性又は陰性である）である。
終止シグナルとして、真核細胞からの終止シグナルを
用いるのが好ましい。後記の例にわたって使用される場
合、 「HBV蛋白質」は一般にHBsAg配列に対応する本発明に
従って生産される任意の蛋白質を意味する。
例 １ 粒子精製法 1. ポリエチレングリコール（PEG）により分画された
沈澱 HBV蛋白質生産培養物の上清を集め、そして2,400mlの
部分に分割した。各部分に144gのPEG 6000（Serva）を
加え、そして室温にて20分間撹拌することにより撹拌
し、そして４℃にてさらに６時間撹拌した。500mlのボ
トル中GS3ローター中で9,000rpm（15,000×ｇ）にて30
分間10℃で遠心することにより沈澱を分離した。上清を
集め、そして144gのPEG 6000を添加し、そして上記の様
にして溶解した。この溶液を４℃にて３時間撹拌した。
この溶液からの沈澱を上記の様にして収得したが、遠心
は60分間続けた。
2.ゲルクロマトグラフィー PEG後に得られた材料を20ml PBSに再溶解し、そしてA
-5m（Bio Rad）上でのゲルクロマトグラフィーにかけ
た。カラムの寸法は25×1000mmで、ヘッドボリウム480m
lであった。典型的な分画操作においては、10〜15ml中P
EG沈澱したHBV蛋白質1,000μｇを負荷し、そしてPBSに
より６滴／分（18ml/時）の速度で3mlずつの画分を集め
た。HBV蛋白質は最初のピークと共に溶出した。集めら
れた画分はCsClグラジエントにかけられた。
3. CsClグラジエントにおける沈降 A-5m上でのカラムクロマトグラフィーの最初のピーク
を包含し、そして予備精製されたHBV蛋白質を集めて約1
00mlとした。この溶液を1.30g/ccの密度にCsClにより調
整し、そして次にSW 27/28ローター（ベックマン）に装
着されたニトロセルロースチューブに移した。1.35g/cc
のCsCl溶液4mlの上層及び1.25gの4ml及びこれに続く1.2
0g/ccの4mlの下層によりグラジエントを設定した。この
グラジエントを28,000rpmにて50時間10℃にて運転し
た。次に、グラジエントを分画し、そして1.20g/cc密度
層に浮く精製されたHBV蛋白質を集めた。水に対してバ
ッグ中での３ライクルの透析により溶液を脱塩した。
例 ２ HBV蛋白質の定量 1. ラジオイムノアッセイによる AUSRRIA II-125「サンドイッチ」ラジオイムノアッセ
イ（アボットから市販されている）において、肝炎Ｂ表
面抗原に対するモルモット抗体（Anti-HBs）を血清もし
くは血漿又は精製された蛋白質及び適当な対照と共にイ
ンキュベートした。存在するすべてのHBsAgを固相抗体
に結合せしめた。未結合物質の吸引除去及びビーズの洗
浄の後、ヒト125T-Anti-HBsをビーズ上の抗体−抗原複
合体と反応せしめた。次に、ビーズを洗浄して未結合12
5I-Anti-HBsを除去した。
）−Anti-HBs HBsAg ）−Anti-HBs.HBsAg 125I-Anti-HBs ）−Anti-HBs.HBsAg.125-Anti-HBs ビーズ上に残る放射能をγ−シンチレーションカウン
ターで計数した。
2. ELISAによる Enzygnost HBsAgミクロ「サンドイッチ」アッセイ（B
ehringから市販されている）において、ウエルを抗−HB
sによりコートした。血清もしくは血漿又は精製された
蛋白質及び適当な対照をウエルに加え、そしてインキュ
ベートした。洗浄後、HBsAgに対するパーオキシダーゼ
ラベル化抗体を残留する抗原決定基と反応せしめた。未
結合の酵素リンク抗体を洗浄により除去し、そして固相
上の酵素活性を決定する。過酸化水素と発色剤との酵素
触媒反応を希硫酸の添加により停止せしめた。色の強さ
はサンプルのHBsAg濃度に比例し、そして未知サンプル
の色の強さを陰性及び陽性対照領域の色の強さと光度計
比較することにより決定された。
例 ３ メタロチオネインプロモーターを含有する本発明の構成
物の調製 1. MIプロモーターの単離 プラスミドpBPV-342-12（ATCCから商業的に入手可
能）をエンドヌクレアーゼBgl II及びBamH Iにより消化
した。３つのDNA分子が生じた。目的の断片はメタロチ
オネインプロモーター及び4.5kbから成るpBR322配列を
含有し、そして他の断片（2.0kb及び7.6kb）から容易に
検出できる。
反応は合計容量200μｌの反応緩衝液中、各制限酵素1
00ユニットを含む0.5μg/μlDNAの最終濃度において行
った。37℃にて３時間のインキュベーションの後、0.8
％アガロースゲルでのアガロースゲル電気泳動により反
応の完了をチェックした。４μｌの0.5M EDTAの添加に
より反応を停止した。
4.5kb断片を、分取用1.2％アガロースゲル電気泳動に
より他の断片から分離した。DNAをアガロースゲルからD
E-81ワットマン濾紙に溶出し、ここからDNAを高塩緩衝
液中に取り出した。DNAをフェノール／クロロホルム抽
出、及び２回のエタノール沈澱により精製した。
2. 2.3kb MBV Bgl II-Bgl II断片の連結 HBVプレ−S1，プレ−S2及びＳコード領域を含有する
2.3kb Bgl II-Bgl II断片を、HBV含有DNAから単離し
た。この2.3kb断片を、メタロチオネインプロモーター
を含有する4.5kb断片（1.に記載したようにして得たも
の）と連結した。
２μｌの2.3kb断片を３μｌの4.5kb断片と混合し、そ
して２ユニットのT4-DNAリガーゼ及び2mM ATPを含有す
る合計容量10μｌの連結緩衝液中で14℃にて一夜連結し
た。
DNAの取り込みのため、連結混合物を150μｌのコンピ
テント細菌細胞懸濁液に加えた。DNAの取り込みの後、
細菌細胞を50μg/mlアンピシリンを含有するLB寒天プレ
ート上に、プレート当り50〜300μｌの細胞懸濁液の容
量で拡げた。この寒天プレートを37℃にて一夜インキュ
ベートした。単一の単離された細菌コロニーを、目的の
断片を含有するプラスミドの存在についてスクリーニン
グした。
3. 目的プラスミドを含有する細菌コロニーのスクリー
ニング 単一コロニーをつまようじで拾い上げ、そしてLB−ア
ンピシリン培地を収容するチューブ（5ml）に移した。
このチューブを速く振とうしながら37℃にて一夜インキ
ュベートした。各増殖した細菌懸濁液のミニ−プラスミ
ド調製を行った。異る生ずるDNAを制限エンドヌクレア
ーゼEcoR Iによる消化によってプローブした。２つの分
子、すなわち2.2kb断片及び4.6kb断片が予想された。消
化物をアガロースゲル電気泳動により分析した。細菌細
胞からプラスミドを単離した。
4. HBV−遺伝子配列の一部分の変換 上記3.から得られたプラスミドをエンドヌクレアーゼ
Bgl II及びXba Iにより消化した。２つの分子、すなわ
ち１個の550bp断片及び１個の6.250kb断片が予想され、
これをアガロースゲル電気泳動により単離した。
この6.250kb断片を第Ｉ表のオリゴヌクレオチドNo.55
と連結した。DNAの取り込みのため、連結混合物を150μ
ｌのコンピテント細菌細胞懸濁液に加えた。単一の単離
された細菌コロニーを目的プラスミドの存在についてス
クリーニングした。新しいプラスミドをエンドヌクレア
ーゼEcoR I及びBgl IIによる消化によってプローブし
た。２つの分子、すなわち１個の1.9kb及び１個の4.450
kbが予想された。
5. ネオマイシン選択マーカーの単離 上記4.から得られたプラスミドを制限酵素EcoR Iによ
る消化によって線状化した。合計容量50μｌ及び最終濃
度１μg/μｌプラスミドDNAで反応を行った。50ユニッ
トのEcoR Iを添加し、そして37℃にて３時間のインキュ
ベーションの後アガロースゲル電気泳動により消化物を
プローブした。１μｌの0.5M EDTAの添加により反応を
停止せしめ、そして最終濃度0.3Mの酢酸ナトリウム及び
３〜４容量のエタノールにより−80℃にて30分間DNAを
沈澱せしめた。沈澱したDNAを50μｌの蒸留水中に溶解
した。
２μｌの線状化されたプラスミドを、メタロチオネイ
ンプロモーター及びネオマイシン選択遺伝子〔エンドヌ
クレアーゼEcoR Iによる消化によってプラスミドpMT-ne
o-E（ATCCから入手可能）から4kb断片として単離したも
の〕を含有するDNA断片３μｌと混合し、そして連結し
た。単一細菌コロニーを目的プラスミドの存在について
スクリーニングした。
6. dhfr増幅遺伝子dhfrの付加 プラスミドpdhfr3.2（ATCCから入手可能）を制限エン
ドヌクレアーゼHind IIIにより消化した。２つの分子、
１個のすなわちdhfr遺伝子配列を含有する3,000bp及び
１個の3,400bpが生じた。3,000bp断片を単離し、そして
上記5.から得られるプラスミドであってHind IIIにより
あらかじめ開環したものに連結した。生ずるプラスミド
を第Ｉ−２に示す。
例 ４ 1. U2プロモーター配列を含有する断片の単離 プラスミドpUC-8-42（Exogeneから入手可能）を制限
エンドヌクレアーゼEcoR I及びApa Iにより消化した。
２つのDNA分子が生じた。目的の断片は340bpを含んで成
るU2−プロモーターを含有し、そして他の断片（3160b
p）から容易に検出できる。全容量200μｌの反応緩衝液
中、100ユニットの各制限酵素を含む0.5μg/μlDNAの最
終濃度において消化を行った。37℃にて３時間のインキ
ュベーションの後、0.7％アガロースゲル中アガロース
ゲル電気泳動により消化の完了をチェットした。４μｌ
の0.5M EDTAを添加することにより反応を停止した。340
bpの断片をプラスミドDNAから、分取用1.2％アガロース
ゲル電気泳動により分離した。DNAをアガロースゲルか
らDE-81ワットマン濾紙に溶出し、ここからDNAを高塩緩
衝液中に取り出した。フェノール／クロロホルム抽出及
び２回のエタノール沈澱によりDNAを精製した。
2. ポリリンカープラスミドへのプロモーター配列含有
断片の挿入 ポリリンカー配列（制限部位:EcoR I,Sac I,Sma I,Av
a I,BamH I,Bgl II,Sal I,Pst I,Hind IIIを含有する）
を含有するプラスミドpSP165を制限酵素EcoR Iにより線
状化した。全容量50μｌ及び１μg/μｌプラスミドDNA
の最終濃度中で反応を行った。50ユニットのEcoR Iを添
加し、37℃にて３時間のインキュベーションの後アガロ
ースゲル電気泳動により消化をプローブした。１μｌの
0.5M EDTAを添加することにより反応を停止し、そして
最終濃度0.3Mの酢酸ナトリウム及び３〜４容量のエタノ
ールにより−80℃にて30分間DNAを沈澱せしめた。沈澱
したDNAを50μｌの蒸留水に溶解した。
２μｌのプラスミドDNAを、U2プロモーター配列を含
有するDNA断片10μｌと混合し、そして２ユニットのT4-
DNAリガーゼ及び2mM ATPを含有する合計容量25μｌの連
結緩衝液中で14℃にて一夜連結した。この後、DNAをフ
ェノール／クロロホルム抽出及びこれに続く２回のエタ
ノール沈澱により精製し、そして10μｌの蒸留水に溶解
した。EcoR I及びApa Iの生ずる付着末端をほ平滑化し
そして連結しなければならなかった。平滑末端はムング
ビーン（Mungビーン）ヌクレアーゼを用いる除去反応に
より次の様にして転換された。25μｌのDNA（濃度１μg
/μｌ）反応緩衝液に、20ユニットの酵素及び最終濃度
１％のグリセロールを35μｌの反応容積となるように添
加した。30℃にて30分間のインキュベーションの後、DN
Aをフェノール／クロロホルム抽出及びこれに続く２回
のエタノール沈澱によって精製した。DNAを５μｌの蒸
留水に再溶解した。生ずる平滑末端を、上に使用したの
より10倍多いT4リガーゼ及び2mM ATPを含有する反応容
量15μｌ中で、14℃にて一夜連結した。
DNA取り込みのため、連結混合物を150μｌのコンピテ
ント細菌細胞懸濁液に添加した。DNAの取り込みの後、
細菌細胞を、50μg/μｌアンピシリンを含有するLB寒天
プレート上に、プレート当り50〜300μｌ細胞懸濁液の
容量で拡げた。単一の単離された細菌コロニーを、目的
のU2−プロモーター断片を含有するプラスミドの存在に
ついてスクリーニングした。
3. 目的のプラスミドを含有する細胞クローンのスクリ
ーニング 単一コロニーをつまようじにより拾い上げ、そしてLB
−アンピシリンを収容するチューブ（5ml）に移した。
このチューブを速く振とうしながら37℃にてインキュベ
ートした。各増殖した細菌懸濁液のミニ−プラスミド調
製を行った。異る得られたプラスミドを制限エンドヌク
レアーゼEcoR I及びHind IIIの両者によって消化してプ
ローブした。２つの分子、すなわちU2プロモーター配列
を含有する400bp断片及び2,700bpのプラスミドが見出さ
れた。消化物をアガロースゲル電気泳動により分析し
た。生じたプラスミドを細菌細胞から単離した。
4. ネオマイシン選択マーカーの挿入 プラスミドpBPV-342-12（ATCCから商業的に入手でき
る）をエンドヌクレアーゼEcoR I及びBamH Iにより消化
した。２つの分子、すなわち4,000bpのネオマイシン選
択遺伝子と共にMTプロモーターを含有するもの及び10,0
00bpのプラスミドを単離した。
前記3.から得られたプラスミドをEcoR Iにより線状化
し、そしてネオマイシン選択遺伝子と共にMT−プロモー
ターを含有する4,000bp断片と連結した。生ずる付着末
端をやはり平滑化し、そして前記のようにして連結し
た。
細菌形質転換、コロニー選択及びミニプラスミド調製
の後、生ずるプラスミドを制限酵素EcoR I及びHind III
を用いる消化によって分析した。２つのDNA分子、すな
わち400bp断片及び6,700bp断片を単離した。
5. Bgl II-Bgl II断片の連結 上記4.からのプラスミドをBgl IIにより線状化した。
2.3kbのBgl II-Bgl II断片を該線状化されたプラスミド
と連結した。生ずるプラスミドを見出すため細菌コロニ
ーを分析した。プラスミドDNAをEcoR Iで消化し、そし
て生ずる２つの断片、すなわち700bp断片（プロモータ
ー及びHBV−配列の部分を含有する）及び8,700bp断片
（HBV配列の残りの部分、MT-neo及びプラスミド）を得
た。
6. HBV配列内の変更 上記5.からのプラスミドをエンドヌクレアーゼBgl II
及びMst IIにより消化した。２つの分子、すなわちプレ
−Ｓ配列の部分を含有する300bp及び前記のようにして
溶出された他方（9,000bp）が生じた。この9,100bp断片
を、変更されたプレ−S1遺伝子配列をコードする他方の
Bgl II/Mst II 216bp断片（配列： に連結した。
目的プラスミドをEcoR Iで消化し、そして２つの生ず
る断片、すなわち616bp断片及び8,700bp断片を単離し
た。
例 ５ H2Kプロモーターの単離 H2Kプロモーターをpsp65H2（Exogeneから入手可能）
からEcoR I/Bgl II断片（2kb）として得た。
egpt選択マーカーの単離 メタロチオネインプロモーター及びegpt−選択遺伝子
を含有する断片を、制限酵素EcoR IによるプラスミドpM
SG（Pharmaciaから入手可能）の消化により、3.6kb断片
として単離した。
他のすべてのプラスミド構成は、同様にして、必要な
成分を含有する断片を結合せしめ、そして目的のオリゴ
ヌクレオチド及びアダプター配列（必要な場合）を用い
ることにより行った。
例 ６ 本発明の構成物による哺乳類細胞のトランスフェクショ
ン 本発明の構成物によりコードされたHBVペプチドの実
質的量の分泌を達成するためには、哺乳類細胞が本発明
の構成物及び全Ｓ蛋白質を発現する構成物の両者により
トランスフェクトされなければならない。トランスフェ
クションは２つの段階（すなわち、各構成物のための別
々のトランスフェクション）、又は第一段階（すなわ
ち、１つのトランスフェクションが両構成物の調製物を
使用）で行われた。同時トランスフェクションは、２つ
の構成物上の異る選択マーカーにより、又はイムノアッ
セイによる両構成物の発現生成物の分泌の検出により確
認された。
あるいは、本発明のHBVペプチド配列をコードする配
列、及び全Ｓ蛋白質をコードする個別の配列を単一の構
成物中に結合せしめることができよう。
例 ７ 一般的方法 本発明を実施するのに、有用な一般的方法は、（１）
Methods of Enzymology,Vol,152,“Guide to Molecular
Cloning Technicques;Berger及びKimmel編（アカデミ
ックプレス）、及び（２）Maniatis等、“Molecular Cl
oning:A Laboratory Manual"（Cold Spring Harber Lab
oratory 1982）に見ることができ、このいずれも引用に
よりこの明細書に組み入れる。使用される特定の技法を
後に記載する。
1. エンドヌクレアーゼによる消化及び断片の単離 使用した制限エンドヌクレアーゼはBgl II,BamH I,Hi
nd III、EcoR I,Xba I,Mst II,Xho I,PflM Iであり、こ
れらはこれらそれぞれの制限緩衝液と共にGibco/BRLか
ら市販されている。
特にことわらない限り、次の様にして制限消化を行
い、そして断片を単離した。反応は典型的には１〜５μ
ｇのDNAを含有した。
・蒸留水をエッペンドルフチューブ中のDNAに最終体積
８μｌまで加えた。
・１μｌの適当な10X消化緩衝液を加えた。
・１μｌ（５〜10U含有）の制限酵素を受え、そして注
意深く混合した。
・反応チューブを37℃にて１時間インキュベートした。
・0.5M EDTA（pH8.0）を最終濃度10mMに添加することに
より消化を停止した。
・DNAがゲル上で直接分析される場合、１μｌのゲル負
荷色素III（Maniatis）を添加し、混合し、そしてサン
プルを0.5％アガロースゲルのスロットに負荷した。
アガロースゲルは通常、0.8％アガロース、1X泳動緩
衝液（TBE,Maniatis）を含有する。断片（約100〜1000b
p）がアガロースゲルから単離される場合、アガロース
は1.2〜1.4％に増加された。
2. コンピテント（受容性）細菌細胞 濃厚な一夜培養物からの1mlの細菌細胞懸濁液を100ml
の新鮮な増殖培地（Ｌ−ブロス）に添加した。細胞を37
℃にてOD600＝0.7の密度に増殖せしめた。この密度は50
0mlのエルレンマイヤーフラスコ中で激しく振とうして
２時間以内に達成された。培養物を氷上で10分間冷却す
ることにより増殖を停止せしめた。この培養物から3ml
を取り、3000rpmにて５分間、指数期の細菌細胞を収得
した。細胞を10mM Tris（pH8.0）中50mM CaCl2 1.5mlに
再懸濁し、そして氷上でさらに15分間インキュベートし
た。3000rpmで５分間の遠心分離により細胞を再度収得
し、そして10mM Tris（pH8.0）中50mM CaCl2 200ml中に
再懸濁し、そして直接使用した。
3. コンピテント細菌細胞の形質転換 形質転換されるべきDNAを70μｌの10mM Tris（pH7.
5）、1mM EDTに懸濁し、そしてDNAの取り込みのために2
00μｌの細菌細胞懸濁液に加えた。混合物を氷上で30分
間インキュベートし、そして1mlのＬ−ブロスを添加し
た。混合物を42℃にて２分間、そして37℃にて40分間イ
ンキュベートした。インキュベーションの後、細胞を、
50μg/mlアンピシリンを含有する寒天プレート上にプレ
ート当り50〜300μｌの細胞懸濁液で拡げた。寒天プレ
ートを37℃にて一夜インキュベートした。このインキュ
ベーション期間の後、単一の単離された細菌コロニーが
形成された。
4. プラスミドDNAの単離 １のプラスミド担持細胞をＬ−培地中で0.5OD600に
増殖せしめ、そして200μg/mlのクロラムフェニコール
と共に20時間増幅せしめた。次に、培養物を4,000rpmに
て20分間JA-10ローター中で４℃にて遠心した。ペレッ
トを18mlの冷25％シュークロース、50mM Tris（pH8.0）
に再懸濁し、250mlのエルレンマイヤーフラスコに入
れ、そして氷上に保持した。250mM Tris（pH8.0）中5mg
/mlリゾチーム6mlを加え、そしてこの混合物を10〜15分
間放置した。6mlの250mM EDTA（pH8.0）を添加し、ゆっ
くり混合し、そして氷上で15分間インキュベートした。
30mlの洗浄〔0.01％トリトンX-100;60mM EDTA（pH8.
0）;50mM Tris（pH8.0）〕を添加し、そして混合物を30
分間氷上でインキュベートした。インキュベーションの
後、この混合物を25,000rpmにてSW28ローター中で90分
間４℃にて遠心した。
プロナーゼを上清に250μg/mlに添加し、そして37℃
にて30分間インキュベートした。この溶液を、10mM Tri
s（pH8.0）,1mM EDTAで平衡化したフェノール1/2容量に
より１回フェノール抽出した。水層を取った。酢酸ナト
リウムを最終濃度300mMに添加し、次に３容量の冷100％
エタノールを添加し、そして十分に混合した。この混合
物を−20℃にて一夜貯蔵した。
この混合物を解凍し、そして遠心分離した。ペレット
を6mlの10mM Tris,10mM EDTA（pH8.0）に再懸濁した。
9.4gのCsCl及び0.65mlの6mg/ml臭化エチジウムを添加
し、そして無菌二重蒸留水により体積を10mlにした。10
mlのアリコートをベックマン溶封グラジエントチューブ
に入れ、そしてTi 70.1ベックマンローター中で50,000r
pmにて48時間遠心した。
プラスミドのバンドをUVにより可視化し、そしてシリ
ンジ及び18ゲージ針を用いてチューブの側部に突き刺す
ことにより取り出した。同容量のイソブタノールで３回
連続して抽出することによりプラスミド画分から臭化エ
チジウムを除去した。次に、画分を（１）2lの10mM Tri
s（pH7.4）、1mM EDTA（pH7.5）、5mM NaClに対して１
回４℃にて２時間以上にわたって透析し；そして（２）
上記のようにして平衡化された1/3量のフェノールによ
り１回フェノール抽出した。次に、酢酸ナトリウムを最
終濃度300mMに加え、次に２容量の100％エタノールを添
加した。−20℃にて一夜、又は−70℃にて30分間、沈澱
を形成せしめた。
5. ミニプラスミド調製 1mlの一夜細菌培養物をエッペンドルフチューブに入
れ、そして20分間遠心した。上清を除去した。100μｌ
の50mMグルコース、25mM Tris（pH8.0）、10mM EDTA（p
H8.0）をペレットに添加し、ボルテックスで混合し、そ
して室温にて５分間インキュベートした。200μｌの0.2
N NaOH,1％ SDSを添加し、そしてボルテックスで混合
し、そして氷上で５分間インキュベートした。150μｌ
の3M酢酸ナトリウム（pH4.8）を添加し、ボルテックス
で混合し、そして氷上で５分間インキュベートした。1
3,000rpmにて５分間の遠心の後、上清を新たなエッペン
ドルフチューブにデカントした。３容量の100％エタノ
ールを補充し、よく混合し、そして−80℃にて30分間イ
ンキュベートし、次に13,000rpmにて10分間遠心した。
エタノールを除去し、ペレットを70％エタノールで洗浄
し、凍結乾燥し、そして20μｌの蒸留水に溶解した。５
μｌのこのプラスミドDNA溶液を制限分析のために直接
使用した。
6. ニックトランスレーション ニックトランスレーションをRigby等、J.Mol.Biol.,V
ol.113,237-251頁、1977（引用によりこれをこの明細書
に組み入れる）に従って行った。DNAの32P−ラベル化の
ための反応混合物は0.5μｇのHBV断片を、全容量30μｌ
の50mM Tris（pH7.8）、5mM MgCl2,10mMメルカプトエタ
ノール、0.1mM dATP,0.1mM dGTP,0.1mM dTTP,50μCi 32
P‐dCTP,10ユニットのDNAポリメラーゼＩ、３μｌの２
×10-5稀釈の1mg/mlDNアーゼＩを含有しており、そして
15℃にて90分間インキュベートして３×106〜12×106の
全cpm、すなわち１×107〜５×107cpm/μgDNAを得る。
7. サザンブロット分析 本発明のベクターの宿主細胞ゲノム中での構成を特徴
付けるため、本発明の粒子を生産するセルラインから染
色体DNAを単離し、そして適切な制限酵素により消化
し、そしてSouthern（J.Mol.Biol.,Vol.98,503-517頁、
1975）（引用によりこの明細書に組み入れる）の方法に
より32P−ラベル化DNAプローブを用いて分析した。制限
酵素Bgl IIによる染色体DNA（20μｇ）の消化の後、生
ずる断片を0.7％アガロースゲル電気泳動により分離し
た。次に、DNAを366nmUV光への10分間の暴露により、及
び0.5M NaOH及び1M NaClの溶液中45分間のインキュベー
ションにより変性した。ゲルを0.5M Tris,1.5M NaCl（p
H7.5）中での60分間のインキュベーションにより中和し
た。3M NaCl,0.3Mクエン酸ナトリウム（20×SSC）中に2
0分間浸漬することにより、乾燥ペーパータオルのステ
ープルによりニトロセルロースフィルターの頂部を覆う
ことによりゲルを通してDNAをニトロセルロースフィル
ターに移行せしめた。ニトロセルロースフィルターを２
時間真空オーブル中で80℃にて保持した。pHBV（2.3k
b）のBgl II断片からの放射性DNAプローブをニックトラ
ンスレーションにより調製した。
DNAプローブとのハイブリダイゼーションのため、ニ
トロセルロースフィルターを、10mlの前ハイブリダイゼ
ーション混合物〔50％ホルムアミド、5X SSC,50mMリン
酸ナトリウム（pH7.0）、5Xデンハート溶液、250μg/ml
変性サケ精子DNA〕を収容するプラスチックバッグ中に
シールした。フィルターをこの混合物中で45℃にて４時
間インキュベートし、この後この前ハイブリダイゼーシ
ョン混合物をハイブリダイゼーション混合物（50％ホル
ムアミド、5X SSC,20mMリン酸ナトリウム（pH7.0）、1X
デンハート溶液、100μg/l変性サケ精子DNA、５×105cm
p/ml 32P−プローブ）で置換した。フィルターを、ハイ
ブリダイゼーション混合物中で45℃にて18時間インキュ
ベートした後、５分間ずつ0.1X SSC,0.1％SDS中で３回5
0℃にて洗浄した。フィルターを60℃にて10分間乾燥
し、そして２株の増強スクリーン間の２枚のＸ−線フィ
ルム（XAR-5,KODAK）に暴露し、そして−80℃にて保持
した。第１のＸ−線フィルムは３日間の暴露の後に現像
し、第２のフィルムは７日間の暴露の後に現像した。
8. トランスフェクションのための哺乳類細胞及びDNA
沈澱物の調製 １日目に、受容体細胞（ATCCから入手可能なC127又は
CHO−細胞）を正常増殖培地（DMEM＋10％ウシ胎児血
清、グルコース及びグルタミン）中でペトリ皿（１〜２
×106細胞／皿、φ10cm）に接種した。次の日、培地を
除去し（DNA沈澱物を細胞に添加する４時間前）、そし
て細胞を1X PBSで２回洗浄した。次に、FCSを含有しな
い8mlのDMEMを加えた。４時間後、DNA沈澱物を細胞に添
加した。さらに４時間後、培地を除去し、3mlのグリセ
ロール−Mix（50mlの2X TBS緩衝液、30mlグリセロー
ル、120ml蒸留水）を添加した。37℃にて３分間のイン
キュベーションの後、グリセロール−Mixをすぐに除去
し、そして細胞を1X PBSにより洗浄した。
細胞を、10％ FCSを含有する8mlのDMEMと共に一夜培
養した。
48時間後、トリプシン−EDTA溶液（0.025％トリプシ
ン＋1mM EDTA）で処理することにより細胞を皿から除去
した。次に、トリプシン−EDTAを除去するため、細胞を
1X PBSで洗浄し、10％ FCSを含有するDMEM中に懸濁し、
そして24コスター・ウエルプレートに分配した（１枚の
皿からの細胞を４枚の24ウエルプレートに）。細胞が十
分に増殖した時、選択培地を添加した〔濃度0.5〜1mg/m
lのネオマイシン、又はキサンチン:250μg/ml、ヒポキ
サンチン:15μg/ml（又はアデニン:25μg/ml）、チミジ
ン:10μg/ml、アミノプテリン２μg/ml、ミコフェノー
ル酸:25μg/ml、（例えばeco-gptのため）〕。培地を毎
週交換した。最初の増殖中の細胞コロニーが２週間後に
見られた。
10μｇのプラスミドDNA及び20μｇのキャリヤーDNA
（サケ精子DNA、ウシ胸腺DNA）に、TE緩衝液（10mM Tri
s-HCl,1mM EDTA,pH7.05）を最終容量440μｌに添加し、
そして60μｌの2M CaCl2と混合した。次に、同じ量の2X
TBS（50mM Hepes,280mM NaCl,1.5mM Na2HPO4,pH7.05）
を添加し、そしてよく混合した。沈澱溶液を37℃にて30
分間インキュベートし、そしてトランスフェクトされる
べき細胞に直接添加した。
例 ８ 蛋白質の分泌のためのトランスフェクトされた細胞の培
養 選択された細胞を、セクション８において記載したよ
うに正常増殖培地中でさらに培養するために処理する。
例 ９ F.精製された粒子のアジュバントの調製 無菌塩に懸濁された抗原粒子の所望の濃度に、1:10,0
00容量のチメロソール（Thimerosol）,1/10容量のフィ
ルター除菌0.2M AlK(SO4)2 12H2Oを加えた。pHを無菌1
N NaOHにより5.0に調整し、そして懸濁液を室温にて３
時間撹拌した。明ばん沈澱した抗原を2000rpmにて10分
間の遠心により回収し、1:10000チメロソールを含有す
る無菌中性塩溶液に再懸濁し、そして無菌条件下で小分
けした。
例 10 第III-X表は、下記のごとく、本発明の免疫原性粒子
のELISA分析の結果の幾つかを示す。
第III表は、抗−プレ−S1モノクローナル抗体MA18/7
を使用しての、本発明のHBV配列構成物から生産された
精製されたHBs抗原粒子のELISAデーターを示し、このも
のはプレ−S2の全部の除去及びプレ−S2 ATGの上流の除
去を伴うプレ−S1領域、並びにS ATGと該S ATGの下流XB
a I部位までとの除去を伴うＳ領域を含む（例えば、第
Ｉ−１図の構成物）。画分９〜15（第XI図）をCsCl沈降
後にプールした。
第IV表は、抗−プレ−S2モノクローナル抗体MQ19/10
を使用しての、本発明のHBV配列構成物により生産され
た精製されたHBS抗原粒子のELISAデーターを示し、この
ものはプレ−S2の全部の除去及びプレ−S2 ATGの上流の
除去を伴うプレ−S1領域、並びにS ATGと該S ATGの下流
XBa I部位までとの除去を伴うＳ領域を含む（例えば、
第Ｉ−１図の構成物）。画分9-15（第XI図）をCsCl沈降
後にプールした。
第Ｖ表は、抗−プレ−S1モノクローナル抗体MA18/7を
使用しての、本発明のHBV配列構成物から生産された精
製されたHBs抗原粒子のELISAデーターを示し、このもの
はプレ−S1領域を含まずS ATGの上流及びS ATGの下流XB
a I部位までの除去を伴うプレ−S2領域、並びにS ATGの
除去を伴うＳ領域を含む（例えば、第II-1図の構成
物）。画分9-15（第XII図）をCsCl沈降後にプールし
た。
第VI表は、抗−プレ−S2モノクローナル抗体MQ19/10
を用いての、本発明のHBV配列構成物から生産された精
製された抗原粒子のELISAデーターを示し、このものは
プレ−S1領域を含まずS ATGの上流及びS ATGの下流XBa
I部位までの除去を伴うプレ−S2領域、並びにS ATGの除
去を伴うＳ領域を含む（例えば、第II-1図の構成物）。
画分9-15（第XII図）をCsCl沈降後にプールした。
第VII表は、抗−プレ−S1モノクローナル抗体MA18/7
を使用しての、本発明のHBV配列構成物から生産された
精製されたHBs抗原粒子のELISAデーターを示し、このも
のはプレ−S2の全部の除去及びプレ−S2 ATGの上流の除
去を伴うプレS1領域、並びにS ATGの除去を伴うＳ領域
を含む（例えば、第VI-2図の構成物）。画分9-15（第XI
図）をCsCl沈降の後にプールした。
第VIII表は、抗−プレ−S2モノクローナル抗体MQ19/1
0を用いての、本発明のHBV配列構成物から生産された精
製された抗原粒子のELISAデーターを示し、このものは
プレ−S2 ATGの上流の除去を伴うプレ−S1領域を含み、
S ATGの除去を伴う（例えば、第VI-4図の構成物）。画
分9-15（第XI図）をCsCl沈降の後にプールした。
第IX表は、抗−プレ−S1モノクローナル抗体MA18/7を
用いての、本発明のHBV配列構成物から生産された精製
されたHBs抗原粒子のELISAデーターを示し、このものは
プレ−S1領域を含まずS ATGの上流の除去を伴うプレ−S
2領域、並びにS ATGの除去を伴うＳ領域を含む（例え
ば、第VII-2図の構成物）。画分9-15（第XII図）をCsCl
沈降の後にプールした。
第Ｘ表は、抗−プレ−S2モノクローナル抗体MQ19/10
を用いての、本発明のHBV配列構成物から生産された精
製されたHBs抗原粒子のELISAデーターを示し、このもの
はS ATGの上流の除去を伴うプレ−S2領域を含み、S ATG
の除去を伴う（例えば、第VII-4図の構成物）。画分9-1
5（第XII図）をCsCl沈澱の後にプールした。
第XI表は、刺激物質（例えば、PMA）による刺激の後
ウラス肉腫ウイルスのLTR領域の制御の下での完全なプ
レ−S1−プレ−S2‐Ｓ領域を含む構成物並びにＳによる
追加の同時トランスフェクション（第XIII図）により生
産された精製されたHBs抗原粒子のELISAデーターを示
す。
第XIV図は、C127に同時トランスフェクトされた第III
表（第Ｉ−１図）及び第Ｖ表（第II-1図）の遺伝子構成
物に由来する粒子の、CsClグランジエントでの精製後の
特徴付けを示す。集められた画分はより小さい体積を有
していた。
第XII表は、Pettenkofer Instituteにおいて行われ
た、Ｓ配列を有する第Ｉ−１図の粒子の血清型（セロタ
イプ）を示す。
第XII表 結果 adw/ayw:陽性 以上の記載から、本発明の本質及び範囲を逸脱するこ
となく、上記の組成物及び方法において種々の変更を行
うことができることが当業者には自明であろう。従っ
て、本発明を、その本質又は本質的特徴から逸脱するこ
となく、他の特定の形態において具体化することができ
る。従って、この具体例はすべての点において例示的な
ものであって制限的なものではなく、本発明の範囲は前
記の記載によってではなく添付された請求の範囲によっ
て特定されるべきであり、そして請求の範囲の均等の意
味及び範囲に入るすべての変更はそれ故にその中に含ま
れると考えられる。
フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｐ 21/02 (56)参考文献 特開 昭62−55088（ＪＰ，Ａ) 特開 昭61−129135（ＪＰ，Ａ) 特開 昭61−111695（ＪＰ，Ａ) Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍ ｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．138 Ｎｏ. 12 （1987） Ｐ．4457−4465

Claims (31)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】フレーム内に連結された第一DNA配列及び
    第二DNA配列に作用可能に連結された発現制御配列を含
    んで成る組換えDNA分子であって、該DNA配列はそれぞれ
    が該組換えDNA分子により発現される単一ペプチドの別
    々のドメインをコードしており、 ａ）前記第一DNA配列はHBVプレ−S1エピトープの抗原性
    を示すHBVプレ−S1領域のアミノ酸配列をコードしてお
    り、ここでプレS1 ATG開始コドンを含むプレS1領域の
    ５′−末端領域が除去されており且つＳ領域のATG開始
    コドンを含有するHBV S領域の５′−末端領域により置
    換されており、 ｂ）前記第二DNA配列は、HBV S抗原のアミノ酸配列をコ
    ードしておりここでS ATG開始コドンは存在せず、この
    アミノ酸配列は、分泌後に、プレ−S1エピトープに対す
    る免疫応答を生じさせる粒子の形成を指令する、 ことを特徴とする組換えDNA分子。
  2. 【請求項２】前記HBV S領域の５′−末端領域のヌクレ
    オチド配列がATGGAGAACである、請求項１に記載のDNA分
    子。
  3. 【請求項３】前記HBV S領域の５′−末端領域のヌクレ
    オチド配列がAACATGGAGAACである、請求項１に記載のDN
    A分子。
  4. 【請求項４】前記第一DNA配列が、HBVプレ−S1領域のア
    ミノ酸配列をコードしており、ここで該プレ−S1領域の
    ３′−末端が除去されている、請求項１〜３のいずれか
    １項に記載のDNA分子。
  5. 【請求項５】HBVプレ−S1エピトープがaywセロタイプの
    ものである、請求項１〜４のいずれか１項に記載のDNA
    分子。
  6. 【請求項６】前記第一DNA配列が、第Ｉ表からのオリゴN
    O.55の配列を含んで成る、請求項１〜５のいずれか１項
    に記載のDNA分子。
  7. 【請求項７】前記第一DNA配列が、第Ｉ表からのオリゴN
    O.23の配列を含んで成る、請求項１〜５のいずれか１項
    に記載のDNA分子。
  8. 【請求項８】前記第二DNA配列が、HBV S遺伝子のXba I-
    Bg1 II断片のＳコード配列を含んで成る、請求項６又は
    ７に記載のDNA分子。
  9. 【請求項９】前記DNA分子が、図Ｉ−1,I−2,I−3,IV-1,
    IV-2、IV-3,VI-1,VI-2,又はVI-3により記載されるよう
    に配置されたHBV配列を有する、請求項１に記載のDNA分
    子。
  10. 【請求項１０】請求項１〜９のいずれか１項に記載の組
    換えDNA分子によりトランスフェクトされた宿主細胞。
  11. 【請求項１１】請求項１〜９のいずれか１項に記載の組
    換えDNA分子である前記第一組換えDNA分子と、HBV Sペ
    プチドのアミノ酸配列の全部又は実質的部分をコードす
    る前記第二組換えDNA分子により同時形質転換された宿
    主細胞。
  12. 【請求項１２】前記第二組換えDNA分子がHBV Sペプチド
    のアミノ酸配列の全部をコードするDNA配列を含んで成
    る、請求項11に記載の宿主細胞。
  13. 【請求項１３】真核生物由来である、請求項10〜12のい
    ずれか１項に記載の宿主細胞。
  14. 【請求項１４】哺乳類由来の、請求項13に記載の宿主細
    胞。
  15. 【請求項１５】VERO,CHO,CHO-dhfr,3T3及びC127細胞か
    ら成る群から選択される、請求項14に記載の宿主細胞。
  16. 【請求項１６】請求項１〜９のいずれか１項に記載の組
    換えDNA分子の発現から製造されるペプチド。
  17. 【請求項１７】請求項16に記載のペプチドの複数のモノ
    マーを含んで成る免疫原性粒子であって、該ペプチドモ
    ノマーは該粒子の全蛋白質の１％より実質的に多くを占
    めている、ことを特徴とする免疫原性粒子。
  18. 【請求項１８】前記ペプチドモノマーが、粒子中の全蛋
    白質の実質上５％より多くを占めている、請求項17に記
    載の免疫原性粒子。
  19. 【請求項１９】10nm以上の直径を有する、請求項17又は
    18に記載の免疫原性粒子。
  20. 【請求項２０】請求項16に記載の第一ペプチドの複数の
    モノマー及びHBV Sペプチドのアミノ酸配列の全部又は
    部分を含んで成る第二ペプチドの複数のモノマーを含ん
    で成る、請求項17〜19のいずれか１項に記載の免疫原性
    粒子。
  21. 【請求項２１】プレ−S2エピトープを含有するペプチド
    の複数のモノマーをさらに含んで成る、請求項17〜20の
    いずれか１項に記載の免疫原性粒子。
  22. 【請求項２２】前記第二ペプチドがadwセロタイプのHBV
    Sペプチドを含んで成る、請求項20又は21に記載の免疫
    原性粒子。
  23. 【請求項２３】適当なキャリヤー中に請求項17〜22のい
    ずれか１項に記載の免疫原性粒子を含んで成るHBVに対
    するワクチン処理のための医薬製剤であって、該製剤を
    固体に投与した後に免疫応答を惹起するのに十分な濃度
    で該粒子が存在することを特徴とする医薬製剤。
  24. 【請求項２４】適当なキャリヤー中に請求項17〜22のい
    ずれか１項に記載の免疫原性粒子を含んで成る、抗体の
    産生のために有用な製剤であって、該製剤を個体に投与
    した後に抗体の産出を惹起するために十分な濃度で該粒
    子が存在することを特徴とする製剤。
  25. 【請求項２５】請求項16に記載のペプチド及び適当なキ
    ャリヤーを含んで成る、抗体の産生のための製剤であっ
    て、該製剤を個体に投与した後に抗体の生産を惹起する
    のに十分な濃度で該ペプチドが存在することを特徴とす
    る製剤。
  26. 【請求項２６】請求項１〜９のいずれか１項に記載の組
    換えDNA分子をコンピテント宿主細胞に導入し、該宿主
    細胞が該DNA分子を取り込むのに適当な条件に付し、そ
    してトランスフェクトされた宿主細胞を選択することを
    特徴とする、トランスフェクトされた宿主細胞の製造方
    法。
  27. 【請求項２７】HBV Sペプチドのアミノ酸配列の実質的
    な部分又はすべてをコードする第二のDNA分子に前記宿
    主細胞を暴露し、該第二のDNA分子を該宿主細胞が取り
    込むのに適当な条件に付し、そしてトランスフェクトさ
    れた細胞を選択することをさらに含んで成る、請求項26
    に記載の方法。
  28. 【請求項２８】請求項10〜15のいずれか１項に記載の宿
    主細胞を、該宿主細胞による蛋白質の発現及び分泌を許
    容する条件下で培養し、そして前記組換えDNA分子から
    の発現の結果として生産されたペプチドを集めることを
    含んで成る、ペプチドの製造方法。
  29. 【請求項２９】前記組換えDNA分子からの発現の結果と
    して生産された前記ペプチドが、該組換えDNA分子の全
    コード領域より少ない領域に対応するアミノ酸配列を含
    有する、請求項28に記載の方法。
  30. 【請求項３０】請求項10〜15のいずれか１項に記載の宿
    主細胞を、該組換えDNA分子の発現及びその発現により
    生産されたペプチドの該宿主細胞からの分泌を許容する
    条件下で培養し、そして適当な条件下で該ペプチドの凝
    集を許容することを含んで成る、免疫原性粒子の製造方
    法。
  31. 【請求項３１】前記宿主細胞を、HBV Sペプチドのアミ
    ノ酸配列の全部又は部分をコードするDNA分子によりト
    ランスフェクトすることをさらに含んで成る、請求項30
    に記載の製造方法。
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