KR940005588B1 - 효모에서 b형 간염 바이러스 단백질을 제조하는 방법 - Google Patents

효모에서 b형 간염 바이러스 단백질을 제조하는 방법 Download PDF

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KR940005588B1 KR1019870000733A KR870000733A KR940005588B1 KR 940005588 B1 KR940005588 B1 KR 940005588B1 KR 1019870000733 A KR1019870000733 A KR 1019870000733A KR 870000733 A KR870000733 A KR 870000733A KR 940005588 B1 KR940005588 B1 KR 940005588B1
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Description

효모에서 B형 간염 바이러스 단백질을 제조하는 방법
제a도, 제1b도 및 제1c도는 플라스미드 pYGAP/PSS△, pYGAP/PSSC, pYGAL/PSS△, pYGAL/PSSC, pYADH2/PSS△, pYADH2/PSSC 및 pUC13/PSSC의 작제 방법을 도해한 다이아그람이다.
제2도 및 제3도는 알파 교배 인자 백터 pJC197의 작제 방법을 도해한 다이아그람이다.
제4a도 및 제4b도는 플라스미드 pYαMF/PS△의 작제 방법을 도해한 다이아그람이다.
본 발명은 효모에서 B형 간염 바이러스 단백질을 제조하는 방법에 관한 것이다.
B형 간염 바이러스(HBV)는 다양한 인간의 간 질환의 원인이 되는 감염균이다. HBV로 감염된 많은 사람들이 발병 단계인 급성 질환 상태에 있다. 그러나, 많은 다수의 사람들은 그러한 감염으로부터 회복되지 못하고 그 감염균의 만성 보균자가 되어 버린다. HBV 감염은 세계 여러 곳곳에서 유행하고 있으며 만성적으로 감염된 모체로부터 분만시 그들의 신생아에게 고빈도로 전염되고 있다. 세계적으로 만성 보균자의 수는 3억 이상으로 추정되고 있다. 이러한 보균자 군중에서, 해마다 수십만명이 만성 B형 간염의 말기증상(경변증 또는 간세포암)으로 죽어가고 있다.
HB 비리온(virion)은 두 그룹의 구조 단백질, 코어 단백질(core protein) 및 외피 또는 표면("S") 단백질로 이루어져 있다. 비리온 즉, 데인(Dain) 입자의 주표면 단백질 외에도, "S" 단백질은 오스트랄리아 항원(Australia antigen) 또는 22nm 입자의 유일한 구성 성분이다. "S" 단백질은 혈청형에 따라, 389 내지 400개의 아미노산을 코드화하는 거대 개방 판독 프레임(open reading frame : ORF)의 해독 생성물이다.
이 ORF는 3개의 영역으로 구분되는데, 이들 각각은 생체내에서 해독 개시 부위로서 작용할 수 있는 ATG 코돈으로 시작된다. 이들 영역은 유전자의 5'-3'방향으로 preS-1(108 내지 119개의 아미노산), preS-2(55개의 아미노산) 및 S(226 개의 아미노산)로 나타낸다. 이 ORF로부터 유도된 6개의 단백질 생성물은 하기 조성물을 갖는다 :
1) gp42(42,000달톤의 당 단백질)=preS-1/preS-2/(preS-1이 preS-2에 인접하고, preS-2가 S에 인접함을 의미한다)
2) p39(p=단백질)=preS-1/preS-2/S
3) gp36=preS-2/S(2개의 글리코실화 부위)
4) gp33=preS-2/S(1개의 글리코실화 부위)
5) gp27=S(1개의 글리코실화 부위)
6) P24=S
6개의 단백질 모두는 HBV 데인 입자에서 대략 등몰량 정도로 존재한다. 22nm 입자에서는, 더 작은 4개의 단백질이 대략 등몰량 정도로 존재하면서, gp42 및 p49가 입자당 기껏해서 1개 또는 소수의 분자로 존재한다.
22nm 입자 또는 HB 표면 항원(HBsAg) 입자는 만성 보균자의 혈장으로부터 정재해 왔다. 혈장이 입자-양성으로 나타나는 만성 보균자를 HBs+라 칭한다. 이들 보균자가 충분한 면역반응을 갖춘 경우, 이들은 감염을 깨끗이 제거할 수 있으며 HBs-가 된다. HBs에 대한 항체가 형성된 보균자가 항-HBs+로 나타낸다. 이러한 방식으로, 항 -HBs+는 질병으로부터 회복과 상관관계가 있다. 그러므로, HB 백신(vaccine)에 의한 항-HBs+의 자극 또는 형성은 HBV 감염에 대한 보호를 부여하는 것으로 기대되어 왔다.
이 가설은 실험적으로 시험 가능하다. 사람 외에는, 침팬지가, HBs+및 혈청중의 상승된 간 효소 농도 등과 같은 정량 가능한 마커에서 인식되는 바와 같이, HBV 감염에 대해 완전히 감수성이 있는 유일한 종이다. 침팬지를 3회 용량의 HBsAg 입자로 접종한 다음 대량의 감염성 HBV로 공격시킨다. 모의 접종된 동물은 급성 HBV 감염 증상을 나타내는 반면, HBsAg-접종된 동물은 어떠한 감염 증상으로부터도 완전히 보호되었다. 그러므로, 이러한 실험 시스템에서, gp27 및 p24(오직 S영역)로 이루어진 HBsAg 입자가 보호성 면역을 유도하는데 충분하였다. 이러한 관찰에 고무된 몇몇 제조업자들이 HBsAg 입자로 구성된 HB 백신을 생산하였다.
최근의 데이타는 preS-1 및 preS-2 영역이 HBV 감염에 대한 면역에 중요한 역할을 할 수 있음을 제시하고 있다. preS-1에 대한 항체(preS-1의 아미노산 잔기 10번 내지 32번으로 이루어진 펩타이드로 면역화시킴으로써 유도된 것)뿐만 아니라 preS-2에 대한 항체(preS-2의 아미노산 잔기 1번 내지 26번으로 이루어진 팹타이드로 면역화시킴으로써 유도된 것) 둘 다는 시험관내에서 인간의 간암 세포에 HBV가 결합되는 것을 차단할 수 있지만; 항-HBs(preS-1 또는 preS-2가 결여된 HBsAg로 접종된 환자로부터의 혈청)는 그러한 차단을 중재할 수 없다. 시험관내에서의 이러한 결과를 생체내 감염에 모사하는 경우, 그때 pre-S(즉, 하나로 함께 연결된 preS-1 및 preS-2) 영역은 각 세포 수용체에 대한 HBV 결합부위로서 나타날 수 있으며, 항-pre-S는 HBV 부착 및 감염의 개시를 차단할 수 있다. 또한, 항-pre-S는 HBV 급성 감염으로부터의 회복 기간 동안에 역가가 상승하는 것으로 밝혀졌는데, 이것은 회복 기간 동안에 이들 항체의 역할을 나타낸다. 최종적으로 108개의 아미노산으로 이루어진 pre-S 폴리펩타이드(preS-2의 잔기 1번 내지 16번 및 인접한 preS-1의 잔기 27번 내지 119번)로 침팬지를 접종시키면 HBV 공격에 대한 보호를 어느 정도 중재할 수 있다고 밝혀졌다. 예컨대 이들 실험적 관찰은 pre-S 영역이 HB 백신을 제공하는데 유용한 부가물임을 제시한다.
HB 백신의 이용 가능한 공급을 확대시키기 위해, 제조업자들은 DNA 재조합 기술을 이용하여 "S" 단백질의 발현을 모색하기 시작했다. 미생물계 중에서, 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli) 및 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomvces cerevisiae)가 많은 재조합-유도된 단백질의 발현에 가장 통상적으로 사용되어 왔다. 이 콜라이에서 면역학적 활성 HBsAg 입자를 발현시키려는 수많은 시도는 성공하지 못했다. 그러나 사카로마이세스 세레비지애는 면역학적 활성 HBsAg 입자를 발현시키는 능력을 매우 다양하게 보여주어 왔다. 이들 입자는, 백신으로 재형화될 때, 생(live) HBV에 의한 공격에 대해 침팬지를 완전히 보호시킬 수 있다고 입증되었다. 더우기, 효모-유도된 HBsAg는 혈장-유도된 HBsAg와 마찬가지로 인간에 대한 임상적 시험에서 면역학적으로 유효하였다. 그러므로, 제조합 HBsAg의 합성을 유도하기 위한 숙주종으로서 사카로마이세스 세레비지애의 유용성은 확실히 확립된다. 이러한 관점에서, 면역원 입자에서 S영역에 연결된 전체 pre-S 영역을 발현시키는 것이 바람직할 것이다.
여러 가지 재조합 미생물 발현계에서, 많은 상이한 폴리펩타이드의 합성은 숙주 세포에 해로운 것으로 밝혀져 왔다. 결국 대규모의 재조합 배양물에 축적되는 세포는 외래 폴리펩타이드의 발현을 중지하거나 배양물이 목적하는 폴리펩타이드의 비경제적인 공급원이 되도록 하는 외래 폴리펩타이드를 거의 발현하지 않는 세포가 되도록 목적하는 폴리펩타이드의 발현에 대한 선별의 부담이 있다. 일부의 경우, 유해한 영향은, 발현이 강력한 구성 프로모터에 의해 유도될 때, 새로이 형질전환된 세포가 선택성 평판상에서 증식하고 콜로니를 형성하지 못할 정도로 강하다. 이들 유해한 영향은 이러한 폴리펩타이드의 합성을 지시하는 유도 가능한 프로모터를 사용함으로써 극복할 수 있다. 다수의 유도 가능한 유전자가 사카모라이세스 세레비지애에 존재한다. 3개의 잘-특성화된 유도 가능한 시스템은 갈락토오즈(GAL)이용 유전자, 알콜 데하이드로게나제 2(ADH2) 유전자 및 알파 교배 인자(mating factor) 유전자이다.
사카로마이세스 세레비지애는 성장을 위한 탄소원으로서 갈락토오즈를 이용하는 것에 관련된 효소를 코드화하는 3개의 유전자를 갖는다. GAL1, GAL7 및 GAL10 유전자는 각각 갈락토키나제, α-D-갈락토오즈-1-포스페이트 우리딜트랜스퍼라제 및 우리딘디포스포갈락토오즈- 4 - 에피머라제를 코드화한다. 갈락토오즈의 부재하에서는, 이들 효소의 극소량의 발현만이 검출된다. 세포를 글루코오즈 상에서 성장시킨 다음 갈락토오즈를 배양물에 가하면, 이들 3개의 효소는 RNA 전사 수준에서 적어도 1000-배까지 동등하게 유도된다. GAL1 및 GAL10 유전자는 분자적으로 클로닝되고 서열 분석되어있다. 각각의 코드화 부위의 5'쪽에 대한 조절 및 프로모터 서열은lacZ 유전자의 코드화 영역에 인접하여 설정되었다. 이들 실험은 갈락토오즈 유도에 필요하고 충분한 프로모터 및 조절 서열에 한정해준다.
사카로마이세스 세레비지애는 또한 각각의 ADH의 이소자임(isozyme)을 코드화하는 3개의 유전자도 갖는다. 이들 효소중 하나인 ADHII는 산화적 성장 과정중에 탄소원으로서 에탄올을 이용하는 사카로마이세스 세레비지애의 능력에 관여한다. ADHII 이소자임을 코드화하는 ADH2 유전자의 발현은 글루코오즈에 의해 이화대사산물적으로-억제되므로, 글루코오즈 0.1%(w/v) 존재하에서의 발효 성장 과정중에 ADH2 유전자의 전사는 실질적으로 없다. 비-억제성 탄소원의 존재하에서 글루코오즈가 고갈됨에 따라, ADH2유전자의 전사는 100- 내지 1000 -배로 유도된다. 이 유전자는 분자적으로 클로닝되고 서열 분석되어 있으며, 전사의 억제 해제에 필요하고 충분한 조절 및 프로모터 서열을 한정해준다.
알파 교배 인자는 MATα 세포와MATa 세포 사이의 교배에 필요한 사카로마이세스 세레비지애의 성페로몬(sex pheromone)이다. 이 트리데카 펩타이드는 프리프로페로몬(prepro pheromon)으로서 발현되는 데 이는 불규칙한 소포체(endoplasmic reticulum)내로 향하여, 글리코실화된 다음 최종의 완전한 형태로 단백질 분해적으로 프로쎄싱되어 세포로부터 분비된다. 이러한 생화학적 경로는 외래 폴리펩타이드에 대한 발현 방법으로서 이용되어 왔다. 알파 교배 인자 유전자는 분자적으로 클로닝되고 프리-프로-리이더(pre-pro-leader) 서열이 포함된 그의 프로모터를 이용하여 여러 가지의 폴리펩타이드를 발현시키고 분비시켰다. 불규칙한 소포체 및 골기체(Golgi apparatus)를 통과하는 것으로 기대되는 바와 같이, 외래 단백질은 N- 및 O-연결된 글리코실화를 둘다 겪을 수 있다. 알파 교배 인자 프로모터는 표현형적으로 α인 세포에서만 활성적이다. 사카로마이세스 세레비지애는 SIR로서 알려진 4개의 유전자좌(genetic locus)가 존재하는데, 이들은 a 및 α 정보의 다른 정상적으로 휴지 상태인(silent) 복사체의 억제에 필요한 단백질을 합성한다. 이러한 억제를 방해하는 온도-감수성(ts) 영역이 이들 유전자좌중 적어도 하나의 유전자 생성물에 존재한다. 이러한 돌연변이체를 35℃에서 성장시키면 억제가 파기되어, 알파 교배 인자 프로모터가 불확실성 상태인 세포(표현형적으로 a/α)가 생성된다. 온도를 23℃로 전환시킴에 따라, 세포는 표현형적으로 α상태로 되돌아간다. ts SIR영역이 포함된 균주를 사용하여 여러 가지 외래 폴리펩타이드의 조절된 발현을 입증하여 왔다.
본 발명의 목적은 효모에서 면역원성 입자로서 S 영역에 작동적으로 연결된 preS-1 및 preS-2 영역을 발현시키는 방법 및 발현 백터를 제공하는 것이다. 또다른 목적은 효모에서 preS-1 및 preS- 2영역을 발현시키는 방법 및 벡터를 제공하는 것이다. 본 발명의 또다른 목적은, preS- 함유 폴리펩타이드의 최대 수율이 이러한 폴리펩타이드의 정제시 대규모 용량 및 농도로 얻어질 수 있도록, 벡터에 의해 형질전환된 재조합 숙주 세포의 대규모 성장을 위한 조건을 구체화 하는 것이다. 본 발명의 이러한 목적 및 다른 목적은 하기 설명으로부터 명백해진다.
하나의 인접한 판독 프레임에서 B형 간염 바이러스 표면 항원 유전자에 연결된 전체 B형 간염 바이러스 pre-S 항원 유전자를 사카로마이세스 세레비지애에서 발현시킨다. 발현된 단백질은 미립자 형태로 응결하여 양 영역에 의해 코드화된 주항원부위를 나타내며, 그러므로써 pre-S 영역의 발현을 위한 숙주로서 효모의 이용성을 가장 효과적으로 해준다. 이 단백질은 시험관내 진단 시스템에 유용할 뿐 아니라 B형 간염 바이러스-유도된 질병 및/또는 감염의 치료 및 예방을 위한 백신으로서 유용하다.
본 발명은 인접한 폴펩타이드로서 S영역에 연결된 pre-S 영역(또는 이의 부분) 또는 pre-S 영역 자체(또는 이의 부분)를 효모종내에서 발현시키는 방법에 관한 것이다. 더욱 특히, 본 발명은 pre-S 영역의 발현이 강력한 구성 프로모터에 의해 지시될 때 숙주에 대한 pre-S 영역의 독성 영향을 극복하기 위해, 사카로마이세스 속의 종에서 그들 영역의 발현을 지시하는 것으로서 갈락토오즈-유도성 프로모터, 글루코오즈-억제성 프로모터 및 온도-유도성 프로모터를 사용하는 것에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 pre-S-함유 폴리펩타이드를 미립자 형태로 발현하는 재조합 세포를 대규모 용량으로 제조하기 위한 조건에 관한 것이다. 활성이 생리적으로 조절될 수 있는(즉, 유도 가능한 ) 다른 프로모터도, pre-S 영역의 상기-언급한 독성 작용을 극복하기 위해, 효모종에서 pre-S-함유 폴리펩타이드의 발현을 지시하는데 이용될 수 있다는 것이 본 분야의 숙련가에게는 명백할 것이다.
데인 입자를 preS-1/preS-2/S ORF의 분리를 위한 HBV 핵산의 공급원으로서 이용한다. HB 비리온에 천연적으로 내재해 있는 니크되고 캐핑된 형태로부터 HBV 제놈의 공유적으로 폐쇄된 한상 이본쇄 DNA를 제조하기 위해 내인성 폴리머라제 반응을 이용한다. 복구된 DNA를 분리하고 EcoR1로 완전히 분해시킨다. 이 콜라이 클로닝 백터 pBR322도 EcoR I로 분해시키고, HBV DNA에 연결시킨 다음 이를 사용하여 이 콜라이를 형질전환시킨다. 제조합 플라스미드를 분리한다. 이들 플라스미드는 EcoR I 부위에 의해 완전한 preS-1/preS-2/S 코드화 영역이 0.4킬로 염기쌍(kbp)의 5' 영역과 0.8kbp의 3' 영역으로 나누어지는 환상 형태 내에 HBV 제놈을 함유한다. 이들 2개의 영역을 전체 유전자가 궁극적으로 재집합되도록 서브클로닝시킨다. 3' 영역의 경우, pUC19를 EcoR I 및 BamH I로 분해시킨 다음, 코드화 영역의 최종의 5개 뉴클레오타이드, 정지 코돈, HindIII 부위 및 BamH I 말단으로 이뤄진 합성 올리고뉴클레오타이드에 연결시킨다. 이 백터내로 0.8kbp EcoR I - Acc I 단편으로 이뤄진 preS-1/preS-2/S 유전자의 3' 영역을 클로닝시킨다. 0.3kbp BamH I-EcoR I 단편으로 이뤄진 5' 영역은, (1) 완전한 ORF를 발현시킬 것인가 또는 (2) 추정의 소수성 시그널 서열(아미노산 2 내지 15)을 제거할 것인지에 따라, 하기 두가지 방식중 한 방식으로 pUC18내로 서브 클로닝시킨다. 첫번째 방식으로, pUC18을 HindIII 및 EcoR I로 분해시킨 다음, BamH I 부위의 상부로부터, 말단 ATG 및 10bp의 비해독 리이더 서열을 경유하여, HindIII 상용(compatible) 말단까지의 완전한 ORF를 재구성하는 72bp 합성 올리고뉴클레오타이드에 연결시킨다. 두번째 방법으로는, 동일한 기능을 수행하지만 아미노산 2 내지 15번에 대한 코드화 부위가 제거된 30bp 올리고뉴클레오타이드를 연결시킨다. 이어서 이들 올리고뉴클레오타이드-연결된 클로닝 벡터중 하나에 5' 영역의 0.3kbp BamHI - EcoR I 단편을 연결시킨다. 5' pUC18 및 3' pUC19 클론을 이 콜라이에서 성장시켜 증폭시키고, 분리된 플라스미드로부터 코드화 부위를 HindIII-EcoR I 단편으로서 분해시킨다. 5' 및 3' 단편을 연결시키고, HindIII 분해시키고, HindIII 말단을 갖는 완전한 ORF를, HindIII로 미리 분해시킨 pUC13내로 클로닝시킨다. HindIII 단편으로서 완전한 ORF를 GAPDH, ADH2 또는 GAL10 프로모터 발현계내로 클로닝시키기 위해 예비 아가로오즈 겔 전기영동에 의해 정제한다.
GAPDH 발현 카세트를 함유하는 pBR322 플라스미드는 GAPDH 프로모터와 ADH1 전사 터미네이터 사이에 독특한 HindIII 부위를 가지며 이것내로 상기 기술한 pUC13로부터의 완전한 ORF가 적절한 배향으로 삽입된다. 그후 이 3.0kbp 발현 카세트를SphI 분해시켜 제거한 다음 셔틀 백터(shuttle vector) pCl/1에 연결하여SphI 소단편을 대체한다. 이러한 방식으로 작제된 백터를 사용하여 사카로마이세스 세레비지애 균주 2150-2-3(참조 : Valenzuela et al., Biotechnology 3 : 317-320, 1985년 4월 ; 워싱턴 대학으로부터 입수용이함)을 형질전환시킨다. 그러나, 형질전환 혼합물을 선별 평판상에 플레이팅하면 안정한 콜로니가 생성되지 않는다. 발현된 생성물의 예상되는 독성은 preS-1/preS-2/S 코드화 영역의 대부분을 제거하고 BamH I 분해로 프레임 이동 돌연변이를 일으킨 다음 플라스미드를 재연결시킴에 의해 확인되며; 이러한 방식으로 제조된 DNA는 효모 세포를 효율적으로 형질전환시킨다.
YEp 52 이. 콜라이/사카로마이세스 세레비지애 셔틀 백터를 갈락토오즈-유도성 GAL10 프로모터로부터 HindIII 부위에서 삽입된 외래 유전자의 발현을 유도한다. 이 백터의 HindIII 부위에 상기 기술한 preS-1/preS-2/S ORF(HindIII말단 함유)를 연결시킨다. 이 재조합 플라스미드를 사카로마이세스 세레비지애 균주 BY-19(참조: Broachet al., Cell21: 501-508, 1980 ; DC04로도 알려져 있는 것으로 프린스톤 대학 분자 생물학과로부터 입수용이함)에 도입시키고, 형질전환된 클론을 선별한다. 세포를 글리세롤-락토산을 함유하는 합성 선택 배지에서 성장시킨다. 이어서, 갈락토오즈를 배양물에 가하여 발현을 유도한다. 옹해물(lysate)을 제조하여, 나트륨 도데실 설페이트- 폴리아크릴아미드 겔 전기영동(SDS PAGE)으로 분석하고 니트로셀룰로오즈로 웨스턴 블로팅(Western blot)한다. p39 생성물은 유도된 형질전환체에서만 존재한다는 것 및 회복기 인간의 HB 혈청과의 반응성으로 인해 preS-1/preS-2/S에 대해 특이적임이 밝혀졌다. 더우기, 야생형 사카로마이세스 세레비지애가 아닌 형질전환체의 용해물은, 방사성 면역 검정으로서 HBsAg에 대해 양성이며 pre-S 영역에 대해 특이적인 것으로 밝혀진 중합화된 인간의 알부민에 대한 결합으로 인해 pre-S에 대해 양성이다. HBsAg의 미립자 형태를 인지하는 염소의 항체와 결합하는 면역-친화성 칼럼은 형질전환된 사카로마이세스 세레비지애로부터preS-1/preS-2/S를 정제하는데 사용해 왔다. 용출된 생성물은 방사성 면역 검정에서 HBsAg에 대해 양성이고, 중합화된 인간의 알부민에 결합함으로써 pre-S에 대해 양성이며, 전자 현미경에서는 미립자 형태이다. 이런 데이타는 모든 preS-1/preS-2/S 단백질이 사카로마이세스 세레비지애에서 미립자 형태로 존재하는 p39 단백질로서 발현된다는 것을 입증해준다. HBs 및 pre -S 항원 둘다를 함유하는 이러한 미립자 형태는 HB 백신 및 진단 시약으로서 유효하다.
사카로마이세스 세레비지애에서, pADH2△67(-1) 이.콜라이 클로닝 벡터는, ADH2(글루코오즈-억제성) 프로모터로부터 독특한 HindIII 부위에 삽입된 외래 유전자의 발현을 유도할 수 있는 서열을 함유한다. pAHD2△67(-1)을BamH I 및EcoR I로 분해시키고, DNA 폴리머라제 I의 클레노우 단편으로 평활 말단화한 다음,ADH2 프로모터 및 터미네이터를 함유하는 4.9kbp 단편을 예비 아가로오즈 겔 전기영동으로 정제한다. pUC7을 Pst I으로 분해시키고, T4 DNA 폴리머라제로 평활 말단화한 다음, 4.9kbp 단편에 연결시킨다. 생성된 플라스미드를 Sal I으로 분해시키고, 4.9kbp 단편을 예비 아가로오즈 겔 전기영동으로 정제한다. pUC18을 HindIII로 분해시키고, DNA 폴리머라제 I의 클레노우 단편으로 평활 말단화한 다음, 자체-연결시킨다. 생성된 플라스미드를 SalI로 분해시키고, 4.9kbpSalI 단편에 연결시킨다. 상기 기술한 1.2kbp preS-1/pre-2/S ORF(HindIII 말단 함유)를 이 벡터의 HindIII 부위에 연결시킨다. 생성된 플라스미드를 Sal I으로 분해시키고, 6.1kbp 단편을 셔틀 백터 pCl/1의SalI부위에 연결시킨다. 플라스미드 pCl/1은 pJDB219에서 세균 플라스미드 pMB9에 상응하는 영역이 pBR322로 대체된 pJDB219의 유도체이다. 이 재조합 플라스미드를 사카로마이세스 세레비지애에 도입하고, 형질전환된 클론을 선별한다. 세포를 0.3%(w/v) 글루코오즈를 함유하는 선택성 합성 배지에서 성장시킨다. 48시간 후에, 글루코오즈가 고갈되면, 용해물을 제조하여 SDS -PAGE로 분석하고 니트로셀룰로오즈상에 웨스턴 블로팅한다. p39 생성물은 형질전환체에만 존재한다는 것과 회복기 인간의 HB 혈청과의 반응성으로 인해 pre S-1/preS-2/S에 특이적인 것으로 밝혀졌다. 더우기, 야생형 사카로마이세스 세레비지애가 아닌 형질전환체의 용해물은 방사성 면역 검정으로는 HBsAg에 대해 양성이며 중합화된 인간의 알부민에 결합한다는 점으로 pre-S에 대해 양성이다. HBsAg의 미립자 형태를 인지하는 염소의 항체와 결합한 면역-친화성 칼럼을 이용하여 형질전환된 사카로마이세스 세레비지애로부터 preS-1/preS-2/S를 정제한다. 용출된 생성물은 방사성 면역 검증으로는 HBsAg에 대해 양성이고, 중합화된 인간의 알부민에 결합한다는 점으로는 pre-S에 대해 양성이며, 전자 분광분석에서는 미립자 형태이다.
알파 교배 인자 유전자 MFα1을 사카로마이세스 세레비지애 제놈 DNA로부터의 플라스미드 벡터상으로 클로닝 시킨다. 생성된 플라스미드 pKH2를 EcoR I로 분해시키고 알파 교배 인자 유전자를 함유하는 1.7kbp 단편을 예비 아가로오즈 겔 전기영동으로 정제한다. 플라스미드 pRJ148(HindIII 부위가 결손된 변형된 pBR322)을 EcoR I로 분해시키고 , 1.7kbp 단편에 연결하여 플라스미드 pRJ159를 수득한다. 이 DNA를 HindIII로 분해시키고 자체-연결시켜 플라스미드 pRJ167을 형성시키면 이 플라스미드는 독특한 HindIII 부위를 갖게 된다. 플라스미드 pRJ167을 HindIII로 분해시키고 합성 올리고뉴클레오타이드 어댑터(adaptor)를 삽입하여 변형시켜, 3개의 판독 프레임 모두에서 프로모터 및 프리-프로-리이더의 3' 측면까지 및 해독 종결 시그널의 5' 측면까지인 독특한 HindIII 부위를 함유하는 신규 플라스미드(pRJ178)를 수득한다. HindIII 부위를 HIndIII로 분해시켜 BamH I 부위로 전환시키고, DNA 폴리머라제 I의 클레노우 단편으로 평활 말단화하고, BamHI 링거한 다음 자체-연결시켜 플라스미드 pJC193을 형성시킨다. 이 플라스미드를 EcoR I로 분해시키고, DNA 폴리머라제 I의 클레노우 단편으로 평활 말단화하고, Bcl I링커를 가하여 변형시키고, Bcl I로 분해시킨 다음, 알파 교배 인자 유전자를 함유하는 1.5kbp 단편을 예비겔 전기영동으로 분리한다. 이 생성된 Bcl I 단편을 송아지 장 알칼리성 포스파타제로 처리한 다음 pC1/1의 독특한 BamH I 부위에 삽입하는데, 원래는 BamH I 부위는 과정 동안에 파괴된다. (플라스미드 pJC194). 이 DNA를 BamH I로 분해시키고 자체- 연결시켜 과량의 BamH I 링커를 제거하면, 신규의 알파 교배 인자 발현 플라스미드 pJC197이 된다.
상기 기술한 pUC13중의 1/preS-1/preS-2/S ORF를 Hinf I 및 Ava I으로 분해시키고, 0.5kbp ORF를 예비 아가로오즈 겔 전기영동으로 정제한다. pUC18을 Bcl I 및 BamH I로 분해시켜 2개의 합성 올리고뉴클레오타이드와 연결시킨다. 5' 올리고뉴클레오타이드는 Sal I 말단, HindIII 부위, KEX2 절단 부위를 코드화하는 뉴클레오타이드, preS-1의 아미노산 2 및 3을 코드화하는 뉴클레오타이드 및 Hinf I 부위로 이뤄진다. 3' 올리고뉴클레오타이드는 Ava I 부위, preS-2의 최종 8개의 아미노산을 코드화하는 뉴클레오타이드, 정지 코돈, HindIII 부위 및 BamH I 말단을 함유한다. 0.5kbp ORF를 이 올리고뉴클레오타이드-연결된 pUC18 벡터로 클로닝시킨다. 생성된 백터를 HindIII로 분해시키고 DNA 폴리머라제 I의 클레노우 단편으로 평활말단화한다. 생성된 변형된 0.5kbp preS-1/pre-2 ORF를 예비 아가로오즈 겔 전기 영동으로 정제하고 BamH I 로 분해시킨 바 있는 pJC197로 DNA 클로닝시키며 폴리머라제 I의 클레노우 단편으로 평활 말단화하면 알파 교배 인자의 프리-프로-리이더 서열에 작동적으로 연결된 preS ORF가 생성된다.
알파 교배 인자 프로모터는 표현형상 α인 세포에서만 활성이 있다. 사카로마이세스 세레비지애에서는 SIR로서 알려진 4개의 유전자좌가 존재하는데, 이들은 a 및 α 정보의 다른 정상적으로 휴지 상태인 복사체의 억제에 필요한 단백질을 합성한다. 균주 JRY188 세포(MATα, sir 3-8, leu 2-3, leu 2-112, trp1, ura 3-52, his 4)(참조: Brake et al., P.N.A.S. USA 81: 4642-4644(1984); 캘리포니아 대학 생화학과로부터 입수용이함)는 SIR 3 유전자 생성물 중에 ts 병소를 함유한다. 결국, 35℃에서 성장시킨 JRY 188 세포는 표현형상 a/α이며 알파 교배 인자 프로모터는 활성이 없는 반면, 23℃에서 성장시킨 세포는 표현형상 α이므로 알파 교배 인자 프로모터에 의해 지시되는 발현을 유도할 수 있다. 제조합 preS-1/ preS-2-함유 알파 교배 인자 플라스미드를 사용하여 사카로마이세스 세레비지애 균주 JRY188(참조: Brake et) al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81 : 4642-4646. 1984)을 형질 전환시키고 형질 전환된 클론을 선별한다. 세포를 합성 선택(leu-) 배지중, 35℃에서 성장시키고 동일 배지의 23℃에서 A600=0.5까지 세포를 성장시킨다. 용해물을 제조하여 SDS-PAGE로 분석한 후 니트로셀룰로오즈상에 웨스턴 블로팅시킨다. P21생성물은 그의 형질전환체에서만 존재하고 회복기 인간의 HB 혈청과 반응한다는 점으로 인해 preS-1/preS-2에 특이적인 것으로 밝혀졌다.
작제 GAPDH 프로모터로부터 preS-1/preS-2/S 발현을 지시하여 사카로마이세스 세레비지애를 안정하게 형질전환시킬 수 없는 벡터의 무능한(inability)은 사카로마이세스 세레비지애에 대한 구성 및 고-수준 pre-S 발현의 음성적 생리학적 효과를 강력하게 해주고 ; 이 동일 프로모터로부터 S 폴리팹타이드 발현을 지시하는 플라스미드 pHSBS56-GAP347/33은 사카로마이세스 세레비지애를 효과적으로 형질전환시키며, 이렇게 형질전환된 사카로마이세스 세레비지애는 생산 규모로 효과적으로 성장한다. 이것은 사카로마이세스 세레비지애에서, 유도성 탈억제성 preS- 함유 폴리펩티드의 발현 지시를 위한 또는 덜 활성인 구성적 프로모터를 활용하는 셔틀 백터의 유용성을 강조해준다. 특히, 이것은 사카로마이세스 세레비지애에서 preS-1/preS-2/S의 발현을 지시하는데 GAL10 프로모터를 사용하는 발현 백터의 유용성을 강조하고 있다. 조절 가능한 GAL10 프로모터, 또는 구별할 수 없는 방식으로 작용하는 GAL1, GAL2, GAL7 또는 MEL1 프로모터가, 재조합 사카로마이세스 세레비지애 배양물을 재조합 단백질의 합성이 개시되기 전, 생산 규모용적으로 확장시켜 성장시킬 수 있으므로, 숙주 세포에 대한 음성적 효과가 최소화된다는 것은 본 분야의 숙련가에게는 명백할 것이다.
더우기, 이로써 제한되지는 않으나, ADH2 및 알파 교배 인자 외에 다른 방식으로 생리학적으로 유도성이거나 탈억제성인 다른 조절 가능한 프로모터를 함유하는 발현 벡터를 사용하여 pre-S-함유 폴립펩타이드의 발현을 지시할 수 있다는 것도 본 분야의 숙련가에는 명백할 것이다. 또한, CYC1을 포함하나 이로써 제한되지는 않는, GAPDH보다 효능이 작은 구성적 프로모터가 pre-S-함유 폴리펩타이드의 발현을 세포 단백질의 더 낮은 퍼센테지로 유도하므로, 과잉 발현의 음성적 생리학적 효과가 제거된다는 것은 본 분야의 숙련가에는 명백할 것이다. 당해 분야의 숙련가라면 이러한 시스템에서 pre-S-함유 폴리펩타이드의 발현을 검정하여 최대 수율을 수득하기 위해 적당한 검정계, 예를 들면 웨스턴 블롯(Western blot) 또는 방사성 면역 검정계가 사용되어야 하고 이로써 배양물의 수거 시간을 최적화할 수 있음을 알 것이다.
사카로마이세스 속은 다양한 종으로 이루어져 있다. 다양한 외래 폴리펩타이드의 재조합 DNA 매개 발현용 숙주로서 가장 통상적으로 사용되는 것은 사카로마이세스 세레비지애 또는 제빵용 효모이다. 그러나, 사카로마이세스 속은 다른 종들 사이의 구별은 항상 잘 규정되어 있는 것은 아니다. 이들 종 중의 대다수는 사카로마이세스 세레비지애와 동종한 번식이 가능하며, 사카로마이세스 세레비지애의 프로모터와 유사하거나 동일하며 GAL10, ADH2 및/또는 알파 교배 인자 프로모터를 포함하나 이로써 제한되지는 않는 조절 가능한 프로모터를 함유할 수 있다. 그러므로 pre-S-함유 폴리펩타이드의 발현에 대해, 숙주 균주의 선택은 칼스베르겐시스(carlsbergensis), 우바름(uvarum), 로욱시(rouxi), 몬타너스(montanus), 클루이베리(kluyveri), 엘론기스포러스(elongisporus), 노르벤시스(norbensis), 오비포르미스(oviformis) 및 디아스타티커스(diastaticus)를 포함하나 이로써 제한되지는 않는 사카로마이세스 속의 다른 종들에까지 확대된다는 것이 본 분야의 숙련가에는 명백할 것이다.
여러 가지 효모속, 예를 들면 한세눌라(Hansenula), 캔디다(Candida, 토룰롭시스(Torulopsis) 및 피키아(Pichia)는 성장에 대한 유일한 탄소원으로서 메탄올을 이용하는 유사한 물질 대사 경로를 갖는 것이 밝혀졌다. 이 물질 대사 경로에 관계하는 효소인 알콜 산화 효소에 대한 유전자를 피키아 파스토리스(Pichia pastoris)로부터 분리한 바 있다. 피키아 파스토리스 알콜 산화효소 프로모터가 분리된 바 있고 발현의 메탄올 유도에 감수성인 것으로 나타났다. 이러한 유도성 프로모터는 효모에서 음성적으로 선별되는 폴리펩타이드의 발현에 유용하다. 특히, 이 프로모터는 피키아 파스토리스에서 미립자 형태의 S 영역의 유도성 발현에 대해 플라스미드상에서 활성인 것으로 밝혀졌다. 이는 면역학적으로 활성 형태인 S 폴리펩타이드의 제조합 DNA -매개 발현에 대한 숙주로서 작용하는 다른 효모속의 능력을 강조해준다. 그러므로, 당해 분야의 전문가라면 pre-S-함유 폴리펩타이드의 발현을 위해, 사카로마이세타시애(Saccharomycetaceae) 및 크립토코카시애(Cryptococcaceae)과(科)로부터의 효모의 다른 속(屬)로부터의 종(種)까지 숙주 균주의 선택이 확정되고 피키아(Pichia), 캔디다(Candida), 한세눌라(Hansenula), 토룰롭시스(Torulopsis), 클루이베로마이세스(Kluyveromyces) 및 사카로마이콥시스(Saccharomycopsis)를 포함하나 이로써 제한되지는 않음을 알수 있다.
최근에는, 효모보다 고등인 진핵 생물의 세포에서, 특히 바클로바이러스(baculovirus) 발현 백터로 형질 감염시킨 포유동물 세포주에서 및 곤충 세포에서 재조합 단백질 발현의 주목할 만한 성공이 보고되었다. S영역 자체뿐만 아니라 S 영역에 연결된 preS-2 영역 둘다의 면역원 입자로서 성공적인 발현이 성취된 바있다. 그러므로. 효모에서 면역원 입자로서 완전한 preS-1/preS-2/S 영역의 발현 개념은 Vero, GH3, Ltk-및 CHO와 같은 포유동물 세포주를 포함하나 이로써 제한되지는 않는 더 고등의 진행 생물의 세포에서 이들 연결된 영역의 발현까지 확대된다는 것이 본 분야의 숙련가에는 명백할 것이다.
하기 실시예는 본 발명을 설명하기 위한 것이며, 이로써 본 발명이 제한되지는 않는다. 하기 실시예에서 언급한 각 참조 문헌은 본 명세서에서 참조 문헌으로 인용한다.
[실시예 1]
preS-1/preS-2/S 유전자의 클로닝
감염된 개체의 혈장으로부터 데인 입자(아형 ayw)를 확립된 기술[참조: Landers et al., J. Virology 23 : 368(1977)]로 정제한다. HBV 제놈 DNA는 비리온에서 니크되고 갭된 형태로 존재한다[참조 : Hruska et al., J. Virology 21 : 666(1977)]. 분자 클로닝용 DNA를 제조하기 위해, 내인성 폴리머라제 반응을 사용하여 공유적으로 결합된 폐쇄된 환상 이본쇄 DNA를 제조한다[참조 : Landers et al., J. Virology 23 : 368(1977)]. DNA를 나트륨 도데실 설페이트 및 단백질 분해 효소 K를 함유하는 완충액에서 배양하고 페놀 : 클로로포름: 이소아밀 알콜(25:24:1)로 추출하고 에탄올 침전으로 농축하여 단잭질 제거한다. 이 정제된 DNA를 EcoR I로 완전히 분해시킨다. 이.콜라이 클로닝 벡터 pBR322도 EcoR I로 분해시키고, 분해된 HBV DNA에 연결시킨 다음 이를 사용하여 이 콜라이를 형질전환시킨다. 재조합 플라스미드를, 완전한 preS-1/preS-2/S 코드화 영역을 04.kbp의 5' 영역과 0.8kbp의 3' 영역으로 나누는 [참조: Galibert et al., Nature 281: 646(1979)] 독특한 EcoR I 부위 pHBV/AYW-1, 제1a도)에 대해 환상 순서 배향으로 HBV 제놈을 함유하도록 분리한다. 이들 두 영역은 전체 유전자의 궁극적 재조합을 위해 서브클로닝한다. pUC19를 EcoR I 및 BamH I로 분해시킨 다음, 코드화 영역의 최종 5개의 뉴클레오타이드, 정지 코돈, HindIII 부위 및 BamH I 말단으로 구성된 합성 올리고뉴클레오타이드에 연결시킨다. 이 올리고뉴클레오타이드의 구조는 다음과 같다 :
Figure kpo00002
0.8kbp EcoR1-Acc I 단편을 구성하는 preS-1/preS-2/S 유전자의 3' 영역을 이 벡터로 클로닝한다(pUC19/DSD, 제1a도 및 제1b도).
완전한 ORF를 발현시킬 것인가 또는 가상의 소수성 시그널 서열(아미노산 2 내지 15)을 제거할 것인가에 따라, 두가지 방식중 한 방식으로 5' 영역을 pUC18로 서브클로닝시킨다. 첫번째 방법으로 pUC18을 HindIII 및 EcoR I로 분해시키고, 말단 ATG에 대해 상향인 BamH I 부위로부터 10bp 비해독 리이더 서열을 통해, HindIII 상용 말단까지의 완전한 ORF를 재구성하는 72bp 합성 올리고뉴클레오타이드에 연결시킨다. 이 올리고뉴클레오타dlem의 구조는 다음과 같다 :
Figure kpo00003
(*천연 서열은 T 대신에 C를 함유하는데, 상기 변화로 코드화된 아미노산을 변화시키지 않고서 Hindf I 부위를 파괴한다). 두번째 방법으로는, 72bp 올리고뉴클레오타이드와 동일한 작용을 수행하지만 아미노산 2 내지 15에 대한 코드화 부위가 제거된 30bp 올리고뉴클레오타이드에 연결시킨다. 이 올리고뉴클레오타이드의 구조는 다음과 같다 :
Figure kpo00004
이어서 5' 영역의 0.4kbp BamH I - EcoR I 단편을 이들 올리고뉴클레오타이드-연결된 클로닝 백터(pUC18/USD△, pUC18/USDC, 제1a 도및 제1b도 참조)중 하나에 연결시킨다. 5' pUC18 및 3' pUC19 클론을 이.콜라이에서 성장시켜 증폭시키고, 코드화 영역을 분리된 플라스미드로부터 HindIII-EcoR I 단편으로서 분해시킨다. 이들 단편을 결합시키고, HindIII로 분해하며, HindIII 말단을 갖는 완전한 ORF를 HindIII로 분해시킨 pUC13내로 클로닝한다(pUC13/PSS△, pUC13/PSSC:제1b도 및 제1c도 참조). 이 백터로부터의 완전한 ORF를, GAPDH 또는 GAL10 프로모터(YEp52) 또는 ADH-2 프로모터 발현계내로 클로닝시키기 위해 실시예 2, 3 및 4에서 기술한 바와 같이 예비 아가로오즈 겔 전기영동으로 정제한다.
[실시예 2]
사카로마이세스 세레비지애에서 preS-1/preS-2/S의 발현을 지시하기 위한 GAPDH 프로모터의 용도
GAPDH 발현 카세트를 함유하는 pBR322 플라스미드[참조 : Holland and Holland, J, Biol. Chem. 255: 2596(1980)]는 HindIII 말단을 갖는 1.1kbp preS-1/pre-2/S ORF(실시예 1에서 기술)가 클로닝된 유일한 HindIII 클로닝 부위를 갖는다(pEGAP/PSS△, pEGAP/PSSC, 제1c조 참조). 발현 카세트(HBV 유전자를 함유)는 Sph I 분해 및 예비 아가로오즈 겔 전기영동으로 pBR322 플라스미드로부터 제거한다. 이어서 발현 카세트를 이미 Sph I으로 분해시킨 셔틀 백터 pCl/1[참조 : Beggs, Nature 275: 104(1979) ; Rosenberg et al., Nature 312 : 77(1984)]로 클로닝시킨다(pYGAP/PSS△, pYGAP/PSSC. 제1C도 참조). 발현 카세트를 함유하는 pC1/1 플라스미드를 사용하여 사카로마이세스 세레비지애 균주 2150-2-3을 형질전환시킨다. 그러나, 형질전환체 혼합물을 도말한 선택성 평판 배지로부터는 안정한 재조합 호모 클론이 거의 회수되지 않는다. 사카로마이세스 세레비지애에 대한 생성물을 함유하는 pre-S의 예상되는 독성은 preS-1/preS-2/S 코드화 영역을 제거하고 BamH I 분해 로 프레임 이동 돌연변이를 일으킨 후 플라스미드를 재연결시켜 확인하며; 이러한 방식으로 제조된 DNA는 효율적으로 효모를 형질전환시킨다.
[실시예 3]
사카로마이세스 세레비지애에서 preS-1/ preS-2/S 발현 지시를 위한 GAL10 프로모터의 용도
YEp52 이.콜라이/ 사카로마이세스 세레비지애 셔틀 벡터는 갈락토오즈-유도성 GAL10 프로모터로부터 독특한 HindIII 부위에서 삽입된 외래 유전자의 발현을 유도한다[참조 : Broach et al., In Expreimental Manipu1ation of Gene Expression, p83, Academic Press(1983)]. 또한, 이 벡터는 사카로마이세스 세레비지애에서의 증식을 위한 부분적 2￡ 환상 서열(ori) 및 하나의 역위 반복). 사카로마이세스 세레비지애에서의 선별을 위한 LEU2 및 각각 이.콜라이에서의 증폭 및 선별을 위한 ori 및 bal 서열을 함유한다. Hind III 말단을 갖는 1.1kbp preS-1/preS-2/S ORF (실시예 1에서 기술)를 유일한 HindIII 부위(pYGAL/PSS, pYGAL/PSSC, 제1C도)에 클로닝시키고, 생성된 플라스미드를 사용하여 프린스톤 유니버셔티(Princeton UniverSity)에 재직중인 닥터 제이.알. 브로치(J.R. Broach)의 실험실에서 수득한 사카로마이세스 세레비지애 균주 BY -19를 형질전환시킨다.
재조합 클론을 분리하고 preS-1/preS-2/S 폴리펩타이드 발현을 확인한다. 클론을 선택성(leu-)합성 글리세롤-락트산 배지[아미노산이 없는 0.67%(w/v) 효모 질소 염기, 0.004% 아데닌, 0.004% 우라실, 1% 숙시네이트, 0.005% 티로신, 0.002% 아르기닌, 0.006% 이소로이신, 0.004% 리신, 0.001% 메티오닌, 0.006% 페닐알라닌, 0.006% 트레오닌, 0.004% 트립토판, 0.001% 히스티딘, 0.6% 수산화나트륨, 2%(v/v)락트산, 3%(v/v) 글리세롤]에서 성장시킨다. 효모를 A600=0.3까지 성장시킨 후 갈락토오즈를 2%(w/v)까지 가하여 유전자 생성물 생산을 유도한다. 목적하는 항원의 발현은 오스리아
Figure kpo00005
(Ausria
Figure kpo00006
; Abbott 제조) 반응성, 중합화된 인간의 알부민 결합 활성[참조: Machida' et al., Gastroenterology 86 : 910(1984)] 및 웨스턴 블롯에서, 회복기 인간의 혈청 및 방사선 표지한 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus) 단백질 A를 사용하여 제조한 p39의 존재로 HBsAg를 검출함으로써 입증한다. 이들 재조합 클론은 실시예 6에서 기술하는 대규모 발효 및 분리에 대한 시드(see) 배양물로서 제공한다.
[실시예 4]
사카로마이세스 세레비지애에서 preS-1/pre-S-2/S 발현 지시를 위한 ADH2 프로모터의 용도
pADH2
Figure kpo00007
67(-1) 이.콜라이 클로닝 벡터는 사카로마이세스 세레비지애에서 ADH2 억제해소성 프로모터로부터 독특한 HindIII 부위로 삽입된 외래 유전자의 발현을 유도할 수 있는 서열을 함유한다[참조: Russell et al., J. Biol. Chem. 258 : 2674(1983); E. T. Young, 공개용으로 제출]. 이 독특한 HindIII 부위는 5' 비해독 플랭킹 서열의 뉴클레오타이드-1과 ADH2 유전자의 전사 터미네이터 사이에 위치한다. pADH2 67(-1)을 BamH I 및 EcoR I로 분해시키고, DNA 폴리머라제 T의 클레노우 단편으로 평활 말단화한 다음, ADH2 프로모터 및 터미네이터를 함유하는 4.9kbp 단편을 예비 아가로오즈 겔 전기영동으로 정제한다. pUC7을 Pst I으로 분해시키고, T4 DNA 폴리머라제로 평활 말단화한 다음, 4.9kbp ADH2 단편에 연결시킨다. 생성된 플라스미드를 Sal I 으로 분해시키고, 4.9kbp Sal I 단편에 예비 아가로오즈 겔 전기영동으로 정제한다. pUC18을 HindIII로 분해시키고, DNA 폴리머라제 I의 클레노우 단편으로 평활 말단화한 다음, 자체-연결시킨다. 생성된 플라스미드를 Sal I으로 분해시키고, 4.9kbp Sal I 단편에 연결시켜 벡터 pUC18 HindIII- ADH2를 작제한다(제1도). HindIII 말단을 갖는 2개의 상이한 1.1kbp preS-1/preS-2/S ORF(실시예 1에서 기술)를 이 벡터의 HindIII 부위에 연결시킨다. 생성된 플라스미드(pEADH2/PSS△, pEADH2/PSSC, 제1c도)를 Sal I으로 분해시키고, 6.1kbp 단편을 pCl/1의 Sal I 부위에 연결시켜 플라스미드 pYADH2/PSS△, pYADH2/PSSC를 작제한다(제1C도 참조). 이들 재조합 플라스미드를 사용하여 워싱톤 유니버서티(Washington University)에 재직중인 닥터 엘. 하트웰(L. Hartwell)의 실험실로부터 수득한 사카로마이세스 세레비지애 균주 2150-2-3을 형질전환 시킨다. 재조합 클론을 분리하고 preS-1/preS-2/S 폴립펩타이드 발현에 대해 검사한다. 클론을 0.3%(w/v) 글루코오즈를 함유하는 선택성(leu-) 합성 배지에서 성장시킨다. 세포를 30%에서 48시간동안 A600=1.5까지 성장시키는데, 이 기간 동안에 글루코오즈의 고갈로 ADH2 프로모터가 탈억제된다. 이와는 별도로, 클론을 탄소 공급원으로서 2% 글루코오즈를 함유하는 선택성(leu-) 합성 배지에서 성장시킨다. 세포를 30℃에서 24시간 동안 A600이 0.1 또는 1.0이 될 때까지 성장시키고, 이 기간 동안에 탄소공급원으로서 1.6% 글루코로즈를 갖는 복합배지를 함유하는 대형 플라스크 또는 발효기에 접종한다(접종 크기=10% v/v). 세포를 상기와 같이 45시간 더 A600=12.0내지 14.0까지 성장시키는데, 이 기간 동안에 글루코오즈가 고갈되어 ADH2가 프로모터가 탈억제된다. 목적하는 항원의 발현은 오스리아(AUSRIA
Figure kpo00008
; Abott)반응성, 중화화된 인간의 알부민 결합활성 및 웨스턴 블롯에서, 회복기의 인간 형청 및 방사선 표지한 스타필로코커스 아우레우스 단백질 A를 사용하여 제조한 p39의 존재로 HBsAg를 검출함으로써 입증한다. 성장된 재조합 클론을 실시예 7에서 기술하는 규모 확장 발효 및 분리에 대한 시드(see) 배양물로서 제공된다.
[실시예 5]
사카로마이세스 세레비지애에서 preS-1/preS-2 발현 지시를 위한 알파 교배 인자 프로모터 및 프리-프로-리이더의 용도
알파 교배 인자 유전자 MFα1을 사카로마이세스 세레비지애 제놈 DNA로부터의 플라스미드 백터상에 클로닝한다[참조 : Kurjan et al., Cell 30 : 933(1982); Singh et al., Nucleic Acids Res. 11: 4049(1983)]. 생성된 플라스미드 pKH2를 EcoR I로 분해시키고 알파 교배 인자 유전자를 함유하는 1.7kbp 단편을 예비 아가로오즈 겔 전기영동으로 정제한다. 플라스미드 pRJ148(HindIII 부위가 결핍된 변형된 pBR322)을 EcoR I로 분해시키고, 1.7kbp 단편에 연결시켜 플라스미드 pRJ159를 수득한다. 이 DNA를 HindIII로 분해시키고 자체-연결시켜 플라스미드 pRJ167를 형성시키며, 이 플라스미드는 독특한 HindIII부위를 갖는다. 플라스미드 pRJ167을 HindIII로 분해시키고 합성 올리고뉴클레오타이드 어댑터를 가하여 변형시켜, 3개의 모든 판독 프레임에서 프로모터 및 프리-프로 리이더에 대해 3' 측면이고 해독 종결 시그널에 대해 5' 측면인 독특한 HindIII 부위를 함유하는 신규의 플라스미드(pRJ178)을 수득한다(제2도). HindIII 부위를 HindIII로 분해시켜 BamH I 부위로 전환시키고, DNA 폴리머라제 I의 클레노우 단편으로 평활 말단화한 후, BamH I 링커를 가하고 자체-연결시켜 플라스미드 pJC193을 형성시킨다.
이 플라스미드를 EcoR I로 분해시키고, DNA 폴리머라제 I의 클레노우 단편으로 평활말단화한 후, Bcl I 링커를 가하여 변형시키고, Bcl I으로 분해시킨 다음, 알파 교배 인자 유전자를 함유하는 1.5kbp 단편을 예비 겔 전기영동으로 분리한다. 이로써 생성된 Bcl I 단편을 송아지 장 알칼린 포스파타제로 처리하고 pCl/1의 독특한 BamH I로 부위에 삽입하여 이 과정 동안에 원래의 BamH I 부위를 파괴한다(플라스미드 pJC(194). 이 DNA를 BamH I로 분해시키고 자체-연결시켜 과량의 BamH I 링커를 제거하여, 신규의 알파 교배 인자 발현 플라스미드 pJC197을 생성시킨다(제3도). △13/PSSC 플라스미드(실시예 1에서 기술)를 Hinf I 및 Ava I으로 분래시키고, 0.45kbp ORF를 예비 아가로오즈 겔 전기영동으로 정제한다(제4a도). pUC18을 Sal I 및 BamH I로 분해시켜 2개의 합성 올리고뉴클레오타이드에 연결시킨다. 5' 올리고뉴클레오타이드는 Sal I 말단, HindIII 부위, KEX2 절단 부위를 코드화하는 뉴클레오타이드, preS-1의 아미노산 2 및 3을 코드화하는 뉴클레오타이드 및 Hinf I 말단으로 이뤄진다. 이 올리고뉴클레오타이드의 구조는 다음과 같다 :
Figure kpo00009
3' 올리고뉴클레오타이드는 Ava I 부위, pre S-2의 최종 8개의 아미노산을 코드화하는 뉴클레오타이드, 정지 코돈, HindIII 부위 및 BamH I 말단을 함유한다. 이 올리고뉴클레오타이드의 구조는 다음과 같다 :
Figure kpo00010
0.4kbp ORF를 이 올리고뉴클레오타이드-연결된 pUC18 벡터를 클로닝한다(제4a도 및 제4b도). 생성된 백터(pUC18/PSS)를 HindIII로 분해시키고 DNA 폴리머라제 I의 클레노우 단편으로 평활 말단화 하여, 알파 교배 인자 프리-프로-리이더에 작동적으로 연결된 preS-1/pre-2 ORF를 함유하는 발현 카세트를 생성시킨다. 이 카세트를 예비 아가로오즈 겔 전기영동으로 정제한 다음, BamH I로 분해시키고 DNA 폴리머라제 I의 클레노우 단편으로 평활 말단화한 pJC197에 클로닝하여(pYαMF/PS△S, 제4b도), 알파 교배 인자 프리-프로-리이더에 작동적으로 연결된 preS-1/preS-2 ORF를 생성시킨다.
알파 교배 인자 프로모터는 표현형이 α인 세포에서만 활성이 있다[참조: Brake et al., Mol. Cell Biol. 3 : 1440(1983)]. 사카로마이세스 세레비지애에서는 SIR로서 알려진 4개의 유전자좌가 존재하는데, 이들은 a 및 α 정보의 다른 정상적으로 휴지 상태인 복사체의 억제에 필요한 단백질을 합성한다[참조: Rine et al., Genetics 93 : 877)1979)] 균주 JRY188 세포(MATα, sir 3-8, leu 2-3, leu 2-112, trp1, ura 3-52, his 4)는 SIR 유전자 생성물에서 온도-감수성 병소를 함유한다. 결국, 35℃에서 성장시킨 JRY 188 세포는 표현형이 a/α로서 알파 교배 인자 프로모터는 활성이 없으며; 이와 반대로, 23℃에서 성장시킨 세포는 표현형적으로 α이므로 알파 교배 인자 프로모터에 의해 지시된 발현을 유도할 수 있다[참조; Brake et al., Proc. Natl. Acad Sci. USA 81 : 4642(1984)]. 재조합 preS-1/preS-2 함유 알파 교배 인자 플라스미드를 사용하여 버클리(Berkeley) 소재의 캘리포니아 유니버서티(California Uinversity)에 재직중인 닥터 자스퍼 린(Jasper Rine)의 실험실로부터 수득한 사카로마이세스 세레비지애 균주 JRY 188을 형질전환시킨 다음 형질전환된 클론을 선별한다. 세포를 선택성(leu-) 합성 배지중 37℃에서 성장시키고 ; 후속 단계로, A600=0.5에서의 세포를 동일 배지중 23℃에서 성장시킨다. 용해물을 제조하여, SDS-PAGE로 분석하고, 니트로셀룰로오즈에 웨스턴 블로팅한다. p21 생성물은 형질전환체에서만 존재하고 및 회복기 인간의 HB 혈청과의 반응성으로 인해 preS-1/preS-2에 특이적이라고 밝혀졌다.
[실시예 6]
면역 친화성 크로마토그라피에 의한 미립자 형태의 preS-1/preS-2/S 정제
실시예 3에서 기술한 바와 같이 작제된 재조합 사카로마이세스 세레비지애(아미노산 2 내지 15 를 포함하는 완전한 preS 서열)를 실시예 3에서 기술한 바와 같이 구성된 선택성 합성 글리세롤-락트산 배지 9.0ι를 채운 16ι들이 뉴우 브룬스위크 사이언티픽 발효기(New Brunswick Scientific fermenter)에서 성장시킨다. 발효 조건은 30℃, 250rpm 교반, 2.5ι 공기/분이다. A600=0.25까지 성장시킨 후, 갈락토오즈(2%(w/v)]를 가하여 생성물의 합성을 유도한 다음 발효를 추가로 33시간 동안 최종의 A600=2.40이 될때까지 계속 수행한다. 효모 세포를 아미콘(Amicon) DC-10 단위에서 미세 여과로 수거하여, 30ml 완충액 A[0.1M Na2HPO4, pH 7.2, 0.5M NaCl]에서 현탁시키고, 스탠스티드 압착기(Stansted pressure)에서 평방 인치당 75 내지 85파운드로 7회 통과시켜 세포를 파괴한다. 파괴된 세포 현탁액(31gm 습식 중량 세포)을 120ml 완충액 A로 희석하고, 트리톤(Triton) X-100
Figure kpo00011
을 최종 농도를 0.5%(w/v)까지 가하고, 현탁액을 4℃에서 10,000×g으로 20분동안 원심 분리하여 깨끗이 한다. 처리된 브로쓰를 버리고 HBsAg에 대한 항체로 커플링된 세파로오즈(Sepharose) 4B[참조 : McAleer et al., Nature 307 : 178(1984))와 함께 4℃에서 19시간 동안 배양하여 항원을 수지상에 흡착시킨다. 배양 기간 후에, 슬러리를 모든 후속의 단계들에 대해 실온까지 가온하고 진공하에서 15분 동안 탈기시킨다. 탈기시킨 슬러리를 2.5×40cm 컬럼에 붓는다. 컬럼이 완전히 채워지면, 결합되지 않은 단백질은 완충액 A로 세척시켜 제거한다. 항원을 완충액 A중의 3MKSCN으로 용출시킨다. 항원을 함유하는 분획을 4℃에서 0.007M Na2HPO4, 7.2, 0.15M NaCl에 대해 투석하고 함께 모아 단백질 1.08mg을 함유하는 투석된 친화성 푸울(Dialyzed Affinity Pool) 20ml를 형성시킨다. 투석된 친화성 푸울 16ml를 5.6ml 0.006M Na2HPO4, pH 7.2, 0.15M NaCl로 40mcg/ml까지 희석한다. 생성물을 밀렉스(Millex)-GV 0.22￡m막을 통해 여과하여 멸균시킨다. 투석된 친화성 푸울에서 생성물의 동정은 오스리아
Figure kpo00012
(Ausria
Figure kpo00013
)반응성 및 중화화된 인간의 알부민 결합 활성으로 HBsAg를 검출하여 입증한다.
[실시예 7]
면역 친화성 크로마토그라피에 의한 미립자 형태의 preS-1/preS-2/S의 정제
실시예 4에서 기술한 바대로 작제된 재조합 사카로마이세스 세레비지애(아미노산 2 내지 15를 포함하는 완전한 preS서열)를 히소이(Hysosy:호박색)을 팹톤 대신에 사용하는 것을 제외하고는, 문헌(YPD; 참조: Methods in Yeast Genetics, p.61, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor NY)에서 기술한 바와 같이 제조한 복합 배지 9.0ι를 채운 16ι들이 뉴우 브룬스위크 사이언티픽 발효기(New Brunswick Scientific fermenter)에서 성장시킨다. 발효 조건은 A600=0.65 내지 A600=9.50이 될 때까지 30℃에서 44시간 동안 500rpm으로 교반, 5.0ι 공기/분이다. 효모 세포를 수거하여 용해시키고, preS-1/preS-2/S 생성물을 실시예 6에서 기술한 바와 같이 정제한다. 생성물의 실체는 오스리아
Figure kpo00014
(Ausria
Figure kpo00015
)반응성, 중합화된 인간의 알부민 결합 활성 및 웨스턴 블롯에서 회복기 인간 혈청 및 방사선 표지한 스타필로 코커스 아우레우스 단백질 A를 사용하여 제조한 p39의 조내로 HBsAg를 검출함으로써 입증한다.

Claims (15)

  1. 완전한 B형 간염 바이러스(HBV) preS-2 유전자, HBV preS-1 유전자의 적어도 일부를 암호화하는 DNA의 절편 및 효모 전사 종결 서열을 사카로마이세타세애(Saccharomycetaceae) 또는 크립토코카세애(Cryptococcaceae)과로부터 유도된 효모의 종에서 목적하는 플라스미드의 선별 및 증폭을 위한 효모-유도된 서열 및 효모 프로모터가 함유된 셔틀 벡터내 정확한 판독 프레임으로 삽입시킴을 특징으로 하여, 효모내에서 HBV preS-1 및 preS-2 영역의 발현을 유도할 수 있는 재조합 플라스미드를 제조하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 언급된 절편이 HBV 게놈에서 preS-2 유전자에 인접한 preS-1 유전자의 뉴클레오타이드에 상응하는 방법.
  3. 제2항에 있어서, 언급된 절편이 preS-1 팹타이드 모두를 코드화하는 방법.
  4. 제2항에 있어서, 추가로 HBV S 유전자 모두를 포함하는 방법.
  5. 제3항에 있어서, 추가로 HBV S 유전자 모두를 포함하는 방법.
  6. 제4항에 있어서, 언급된 절편이 preS-1 펩타이드의 N-말단에서의 15개의 아미노산을 제외한 preS-1 펩타이드 모두를 코드화하는 방법.
  7. 제1항에 있어서, 효모 프로모터가GAL10,ADH2, α-교배 인자,GAL1,GAL7 또는MEL1이거나 플라스미드가 도입되는 숙주에 대해 독성이 없는 수준에서 발현 생성물의 합성을 지시하는 프로모터인 방법.
  8. 제7항에 있어서, 효모 프로모터가GAL10,ADH2 또는 α-교배 인자인 방법.
  9. 제1항에 따라 제조된 재조합 플라스미드로 사카로마이세타세애 또는 크립토코카세애 과로부터 유도된 효모의 종을 형질전환시킴을 특징으로 하여, HBV preS-1 및 preS-2 영역을 발현할 수 있는 형질 전환 효모를 제조하는 방법.
  10. 제9항에 있어서, 종이 사카로마이세스 속(屬)로부터 유도되는 방법.
  11. 제10항에 있어서, 종이 사카로마이세스 세레비지애인 방법.
  12. 사카로마이세타세애 또는 크립토코카세애 과로부터 선택된 균주로부터의 세포를 제1항의 재조합 플라스미드로 형질전환시키고, 형질전환된 세포를 배양한 다음, 생성된 배양 세포 또는 성장 배지로부터 팹타이드를 회수함을 특징으로 하여, preS-1 펩타이드의 적어도 일부 및 preS-2 펩타이드를 함유하고 다른 HBV 펩타이드는 함유하지 않는 HBV 폴리펩타이드를 제조하는 방법.
  13. 제12항에 있어서, 생성된 폴리펩타이드가 preS-1 펩타이드 모두를 함유하는 방법.
  14. 제12항에 있어서, 생성된 폴리펩타이드가 추가로 S 펩타이드의 적어도 일부를 함유하며, 다른 HBV 펩타이드는 함유하지 않는 방법.
  15. 제13항에 있어서, 생성된 폴리펩타이드가 S 펩타이드 모두를 함유하고 다른 HBV 펩타이드는 함유하지 않는 방법.
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