JPH0759595B2 - 酵母内でｂ型肝炎ウイルス蛋白を生産する方法 - Google Patents
酵母内でｂ型肝炎ウイルス蛋白を生産する方法Info
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- JPH0759595B2 JPH0759595B2 JP62019679A JP1967987A JPH0759595B2 JP H0759595 B2 JPH0759595 B2 JP H0759595B2 JP 62019679 A JP62019679 A JP 62019679A JP 1967987 A JP1967987 A JP 1967987A JP H0759595 B2 JPH0759595 B2 JP H0759595B2
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Description
【発明の詳細な説明】 Ｂ型肝炎ウイルスは数種のヒト肝臓疾患の原因となる感
染因子である。HBVの感染した多くの個体は疾患の急性
期を経て快復する。しかしながら多数の個体でその感染
を除去することが出来ず、それにより該感染の慢性保持
者となる。HBV感染は世界の多くの部位において特有の
ものであり、慢性的に感染している母体からその新生児
に高頻度で周産期感染が生じる。世界中の慢性保持者は
３億人以上と算定されている。この保持者群から慢性Ｂ
型肝炎の長期間の結末（肝硬変または肝細胞癌）として
年間数十万が死亡している。
染因子である。HBVの感染した多くの個体は疾患の急性
期を経て快復する。しかしながら多数の個体でその感染
を除去することが出来ず、それにより該感染の慢性保持
者となる。HBV感染は世界の多くの部位において特有の
ものであり、慢性的に感染している母体からその新生児
に高頻度で周産期感染が生じる。世界中の慢性保持者は
３億人以上と算定されている。この保持者群から慢性Ｂ
型肝炎の長期間の結末（肝硬変または肝細胞癌）として
年間数十万が死亡している。
HBヴイリオンは２群の構造蛋白、コア蛋白および外殻ま
たは表層（“S"）蛋白からなつている。ヴイリオンすな
わちデーン粒子の主要表層蛋白であるのに加えて、該
“S"蛋白はオーストラリア（Australia）抗原、または2
2nm粒子の唯一の構成成分である。該“S"蛋白は血清型
により389-400アミノ酸をコードする大開放読み取り枠
（ORF）の翻訳産物である。このORFは３つのドメインに
画されておりその各々は生体内において翻訳開始部位と
して機能しうるATGコドンで始まつている。これらドメ
インは遺伝子中でのそれら相互の５′−３′順でプレＳ
−１（108-119アミノ酸）、プレＳ−２（55アミノ
酸）、およびＳ（226アミノ酸）と表示される。このORF
から由来する６種の産物は以下の組成を有する： １） gp 42（42,000ダルトン糖蛋白）＝プレＳ−1/プ
レＳ−2/S（プレＳ−１、プレＳ−２に隣接、Ｓに隣接
を意味する） ２） p39（ｐ＝蛋白）＝プレＳ−1/プレＳ−2/S ３） gp 36＝プレＳ−2/S（２つの糖付加部位） ４） gp 33＝プレＳ−2/S（１つの糖付加部位） ５） gp 27＝Ｓ（１つの糖付加部位） ６） p24＝Ｓ 全６種の蛋白はデーン粒子内で等分子量存在する。22nm
粒子内では４種のより低分子の蛋白がほぼ等分子量存在
するがgp42およびp39は粒子あたり多くて１あるいは数
分子存在する。
たは表層（“S"）蛋白からなつている。ヴイリオンすな
わちデーン粒子の主要表層蛋白であるのに加えて、該
“S"蛋白はオーストラリア（Australia）抗原、または2
2nm粒子の唯一の構成成分である。該“S"蛋白は血清型
により389-400アミノ酸をコードする大開放読み取り枠
（ORF）の翻訳産物である。このORFは３つのドメインに
画されておりその各々は生体内において翻訳開始部位と
して機能しうるATGコドンで始まつている。これらドメ
インは遺伝子中でのそれら相互の５′−３′順でプレＳ
−１（108-119アミノ酸）、プレＳ−２（55アミノ
酸）、およびＳ（226アミノ酸）と表示される。このORF
から由来する６種の産物は以下の組成を有する： １） gp 42（42,000ダルトン糖蛋白）＝プレＳ−1/プ
レＳ−2/S（プレＳ−１、プレＳ−２に隣接、Ｓに隣接
を意味する） ２） p39（ｐ＝蛋白）＝プレＳ−1/プレＳ−2/S ３） gp 36＝プレＳ−2/S（２つの糖付加部位） ４） gp 33＝プレＳ−2/S（１つの糖付加部位） ５） gp 27＝Ｓ（１つの糖付加部位） ６） p24＝Ｓ 全６種の蛋白はデーン粒子内で等分子量存在する。22nm
粒子内では４種のより低分子の蛋白がほぼ等分子量存在
するがgp42およびp39は粒子あたり多くて１あるいは数
分子存在する。
該22nm粒子あるいはHB表層抗原（HBsAg）は、慢性保持
者の血漿から精製されている。これらの血漿が粒子−陽
性であることにより、これら慢性抱持者はHBs+と表示さ
れる。これら保持者が充分な免疫反応を起こすと感染を
除くことができHBs-となる。彼らがHBsに対する抗体を
形成することによりこれら個体は抗−HBs+と表される。
このようにして抗−HBs+は疾病からの快復と関連してい
る。従つて、HBワクチンによる抗−HBs+の促進または形
成がHBV感染に対する保護をもたらすことが期待され
る。
者の血漿から精製されている。これらの血漿が粒子−陽
性であることにより、これら慢性抱持者はHBs+と表示さ
れる。これら保持者が充分な免疫反応を起こすと感染を
除くことができHBs-となる。彼らがHBsに対する抗体を
形成することによりこれら個体は抗−HBs+と表される。
このようにして抗−HBs+は疾病からの快復と関連してい
る。従つて、HBワクチンによる抗−HBs+の促進または形
成がHBV感染に対する保護をもたらすことが期待され
る。
この仮説は実験的に検討可能である。ヒト以外では、HB
s+、肝臓酵素の血清中量の上昇などのような定量可能な
指標に反映されるように、チンパンジーがHBV感染に完
全に感受性をもつ唯一の種である。チンパンジーが３投
与量の精製HBsAg粒子でワクチン処理されついで多量の
感染性HBVを投与された。為−ワクチン処理された動物
は急性HBV感染の兆候を示したが、HBsAg−ワクチン処理
動物は感染の如何なる兆候からも完全に保護された。従
つてこの実験系においてはgp27およびp24（Ｓドメイン
のみ）からなるHBsAg粒子は保護免疫を誘導するのに十
分であつた。これら観察に勇気ずけられて、いくつかの
製造業者がHBsAg粒子からなるHBワクチンを生産した。
s+、肝臓酵素の血清中量の上昇などのような定量可能な
指標に反映されるように、チンパンジーがHBV感染に完
全に感受性をもつ唯一の種である。チンパンジーが３投
与量の精製HBsAg粒子でワクチン処理されついで多量の
感染性HBVを投与された。為−ワクチン処理された動物
は急性HBV感染の兆候を示したが、HBsAg−ワクチン処理
動物は感染の如何なる兆候からも完全に保護された。従
つてこの実験系においてはgp27およびp24（Ｓドメイン
のみ）からなるHBsAg粒子は保護免疫を誘導するのに十
分であつた。これら観察に勇気ずけられて、いくつかの
製造業者がHBsAg粒子からなるHBワクチンを生産した。
最近のデータは、プレＳ−１およびプレＳ−２ドメイン
がHBV感染に対する免疫において重要な役割を演じてい
ることを示唆している。プレＳ−１に対する抗体（プレ
Ｓ−１のアミノ酸残基10-32からなるペプチドによる免
疫によつて引き出された）およびプレＳ−２に対する抗
体（プレＳ−２のアミノ酸残基１−26からなるペプチド
による免疫によつて引き出された）の両者は試験管内に
おいてHBVのヒト肝臓癌細胞への結合を阻止することが
出来る；抗−HBs（プレＳ−１またはプレＳ−２を欠くH
BsAgでワクチン処理された患者からの血清）はこの阻止
現象をもたらすことが出来ない。もしこの試験管内の現
象が生体内感染を映すものならプレ−Ｓ（すなわちプレ
Ｓ−１およびプレＳ−２が全体としてたがいに結合して
いる）ドメインがHBVの肝細胞受容体への結合部位を代
表しており、抗−プレ−ＳがHBV結合及び感染の開始を
阻止するであろう。さらに、抗−プレ−Ｓの力価が急性
HBV感染からの快復期に上昇することが見いだされてお
り、これら抗体の快復における役割を示している。最後
に、チンパンジーを108アミノ酸プレ−Ｓポリペプチド
（プレＳ−２の１−16と隣接するプレＳ−１の残期27-1
19）でワクチン処理すると、HBV投与に対しある程度の
保護をもたらすことができることが示されている。まと
めると、これら実験的観察はプレ−Ｓドメインが現在の
HBワクチンに対する有用な追加物であることを示唆して
いる。
がHBV感染に対する免疫において重要な役割を演じてい
ることを示唆している。プレＳ−１に対する抗体（プレ
Ｓ−１のアミノ酸残基10-32からなるペプチドによる免
疫によつて引き出された）およびプレＳ−２に対する抗
体（プレＳ−２のアミノ酸残基１−26からなるペプチド
による免疫によつて引き出された）の両者は試験管内に
おいてHBVのヒト肝臓癌細胞への結合を阻止することが
出来る；抗−HBs（プレＳ−１またはプレＳ−２を欠くH
BsAgでワクチン処理された患者からの血清）はこの阻止
現象をもたらすことが出来ない。もしこの試験管内の現
象が生体内感染を映すものならプレ−Ｓ（すなわちプレ
Ｓ−１およびプレＳ−２が全体としてたがいに結合して
いる）ドメインがHBVの肝細胞受容体への結合部位を代
表しており、抗−プレ−ＳがHBV結合及び感染の開始を
阻止するであろう。さらに、抗−プレ−Ｓの力価が急性
HBV感染からの快復期に上昇することが見いだされてお
り、これら抗体の快復における役割を示している。最後
に、チンパンジーを108アミノ酸プレ−Ｓポリペプチド
（プレＳ−２の１−16と隣接するプレＳ−１の残期27-1
19）でワクチン処理すると、HBV投与に対しある程度の
保護をもたらすことができることが示されている。まと
めると、これら実験的観察はプレ−Ｓドメインが現在の
HBワクチンに対する有用な追加物であることを示唆して
いる。
HBワクチンの入手可能な供給量を増大するために製造業
者は“S"蛋白の発現をもたらす組換えDNA技術を指向し
た。微生物系において、多くの組換え由来蛋白の発現の
ためにエシエリシア コリ（Escherichia coli）および
サツカロミセス セレビシエ（Saccharomyces cerevisi
ae）がもつとも一般に用いられてきた。E.コリにおいて
免疫学的に活発なHBsAg粒子を発現させる多くの試みは
不成功であつた。しかしながら、S.セレビシエは免疫学
的に活発なHBsAg粒子を発現する能力に大変優れている
ことが示された。これら粒子は、ワクチンに剤形される
と、生HBVによる挑戦に対しチンパンジーを完全に保護
することが出来ることを示した。更に、酵母−由来HBsA
gはヒト臨床試験において血漿−由来HBsAgと免疫学的に
同程度有効であつた。従つて、S.セレビシエの組換えHB
sAgの剛性を指示するための宿主としての有用性は確立
された。この背景のもとに、Ｓドメインと連結した全プ
レ−Ｓドメインを免疫粒子として発現することは望まし
いであろう。
者は“S"蛋白の発現をもたらす組換えDNA技術を指向し
た。微生物系において、多くの組換え由来蛋白の発現の
ためにエシエリシア コリ（Escherichia coli）および
サツカロミセス セレビシエ（Saccharomyces cerevisi
ae）がもつとも一般に用いられてきた。E.コリにおいて
免疫学的に活発なHBsAg粒子を発現させる多くの試みは
不成功であつた。しかしながら、S.セレビシエは免疫学
的に活発なHBsAg粒子を発現する能力に大変優れている
ことが示された。これら粒子は、ワクチンに剤形される
と、生HBVによる挑戦に対しチンパンジーを完全に保護
することが出来ることを示した。更に、酵母−由来HBsA
gはヒト臨床試験において血漿−由来HBsAgと免疫学的に
同程度有効であつた。従つて、S.セレビシエの組換えHB
sAgの剛性を指示するための宿主としての有用性は確立
された。この背景のもとに、Ｓドメインと連結した全プ
レ−Ｓドメインを免疫粒子として発現することは望まし
いであろう。
種々の組換え微生物発現系において、多くの異なるポリ
ペプチドの合成が宿主細胞に有害であることが示され
た。結果として、そのようなポリペプチドの発現に反対
する選択圧がかかり、そのような組換え体培養の大規模
化において異種ポリペプチドを発現しなくなつたか、該
ポリペプチドの供給源として経済的に成り立たないくら
いの少量しか発現しないような細胞のみが集積するよう
になる。ある場合には、有害効果が余りに強くて、発現
が強力な構成定なプロモーターにおり動かされたときに
は、新たに形質転換された細胞が選択培地において増殖
し集落を形成することができなくなる。これらの有害効
果はそのようなポリペプチドの合成を指示する誘導可能
なプロモーターを用いることにより乗り越えることが出
来る。S.セレビシエには多くの誘導可能な遺伝子があ
る。３種のよく特性付けされた誘導可能な系はガラクト
ース（GAL〕利用遺伝子、アルコール デヒドロゲナー
ゼ２（ADH2）遺伝子、およびアルフア接合因子遺伝子で
ある。
ペプチドの合成が宿主細胞に有害であることが示され
た。結果として、そのようなポリペプチドの発現に反対
する選択圧がかかり、そのような組換え体培養の大規模
化において異種ポリペプチドを発現しなくなつたか、該
ポリペプチドの供給源として経済的に成り立たないくら
いの少量しか発現しないような細胞のみが集積するよう
になる。ある場合には、有害効果が余りに強くて、発現
が強力な構成定なプロモーターにおり動かされたときに
は、新たに形質転換された細胞が選択培地において増殖
し集落を形成することができなくなる。これらの有害効
果はそのようなポリペプチドの合成を指示する誘導可能
なプロモーターを用いることにより乗り越えることが出
来る。S.セレビシエには多くの誘導可能な遺伝子があ
る。３種のよく特性付けされた誘導可能な系はガラクト
ース（GAL〕利用遺伝子、アルコール デヒドロゲナー
ゼ２（ADH2）遺伝子、およびアルフア接合因子遺伝子で
ある。
S.セレビシエは、生育のための炭素源としてガラクトー
スを利用するために必要な酵素をコードする３遺伝子を
有する。GAL1、GAL7およびGAL10遺伝子は各々ガラクト
キナーゼ、α−Ｄ−ガラクトース−１−燐酸 ウリジル
トランスフエラーゼおよびウリヂン ジフオスフオガラ
クトース−４−エピメラーゼをコードする。ガラクトー
スのないときにはこれら酵素の非常に僅かな発現が認め
られる。細胞がグルコース上で生育され、次いで培養に
ガラクトースが添加されるとこれら３種の酵素はRNA転
写の段階において同等に少なくとも1,000倍誘導され
る。該GAL1およびGAL10遺伝子は分子としてクローンさ
れ配列決定された。各々のコード領域の５′側にある制
御及びプロモーター配列は1acZ遺伝子のコート領域の近
傍におかれた。これら実験は、ガラクトース誘導に必要
十分なプロモーターおよび制御配列を明らかにした。
スを利用するために必要な酵素をコードする３遺伝子を
有する。GAL1、GAL7およびGAL10遺伝子は各々ガラクト
キナーゼ、α−Ｄ−ガラクトース−１−燐酸 ウリジル
トランスフエラーゼおよびウリヂン ジフオスフオガラ
クトース−４−エピメラーゼをコードする。ガラクトー
スのないときにはこれら酵素の非常に僅かな発現が認め
られる。細胞がグルコース上で生育され、次いで培養に
ガラクトースが添加されるとこれら３種の酵素はRNA転
写の段階において同等に少なくとも1,000倍誘導され
る。該GAL1およびGAL10遺伝子は分子としてクローンさ
れ配列決定された。各々のコード領域の５′側にある制
御及びプロモーター配列は1acZ遺伝子のコート領域の近
傍におかれた。これら実験は、ガラクトース誘導に必要
十分なプロモーターおよび制御配列を明らかにした。
S.セレビシエは、各々ADHのアイソザイムをコードする
３遺伝子も有する。これら酵素の一つADHIIはS.セレビ
シエが酸化的生育のあいだにエタノールを炭素源として
利用するのに働いている。ADHIIアイソザイムをコード
するADH2遺伝子の発現はグルコースによりカタボライト
抑制を受けその結果グルコース量が0.1％存在すると発
酵生育のあいだADH2遺伝子の転写は事実上ない。グルコ
ースを除去し、非抑制炭素源が存在するとADH2遺伝子の
転写は100から1000倍誘導される。この遺伝子は分子と
してクローンされ配列決定されており、転写の抑制解除
に必要十分な該制御およびプロモーター配列が明らかに
されている。
３遺伝子も有する。これら酵素の一つADHIIはS.セレビ
シエが酸化的生育のあいだにエタノールを炭素源として
利用するのに働いている。ADHIIアイソザイムをコード
するADH2遺伝子の発現はグルコースによりカタボライト
抑制を受けその結果グルコース量が0.1％存在すると発
酵生育のあいだADH2遺伝子の転写は事実上ない。グルコ
ースを除去し、非抑制炭素源が存在するとADH2遺伝子の
転写は100から1000倍誘導される。この遺伝子は分子と
してクローンされ配列決定されており、転写の抑制解除
に必要十分な該制御およびプロモーター配列が明らかに
されている。
アルフア接合因子はMATαおよびMATa細胞のあいだの接
合に要求されるS.セレビシエの性フエロモンである。こ
のトリデカペプチドは粗面小胞体中に移行し、糖付加さ
れ蛋白分解を受けて細胞から分泌される最終成熟型にプ
ロセスされるプレプロフエロモンとして発現される。こ
の生化学的な過程は異種蛋白の発現戦略として利用され
た。該アルフア接合因子遺伝子は分子的にクローンされ
そのプロモーターはプレプロリーダー配列と共に種々の
ポリペプチドの発現及び分泌に利用されてきた。その粗
面小胞体からゴルジ器官への横断から期待されるように
異種蛋白はＮ−およびＯ−結合糖付加反応を受ける。該
アルフアー接合因子プロモーターは表現形質がである細
胞内でのみ活性である。S.セレビシエにはSIRとして知
られる４遺伝子座位があり他の通常発現していないａお
よびα情報コピーの抑制に要求される蛋白を合成する。
この抑制現象を妨害する温度感受性（ts）欠損がこれら
座位の少なくとも一つの遺伝子産物内に存在する。この
変異株では35℃の生育で抑制を妨害しアルフア接合因子
プロモーターが不活性な表現系がa/αである細胞を生じ
る。23°に温度移行するとプロモーターが活性となり表
現型がαに復帰する。tsSIR欠損を有する株の利用は数
種の異種蛋白の制御された発現に示されてきた。
合に要求されるS.セレビシエの性フエロモンである。こ
のトリデカペプチドは粗面小胞体中に移行し、糖付加さ
れ蛋白分解を受けて細胞から分泌される最終成熟型にプ
ロセスされるプレプロフエロモンとして発現される。こ
の生化学的な過程は異種蛋白の発現戦略として利用され
た。該アルフア接合因子遺伝子は分子的にクローンされ
そのプロモーターはプレプロリーダー配列と共に種々の
ポリペプチドの発現及び分泌に利用されてきた。その粗
面小胞体からゴルジ器官への横断から期待されるように
異種蛋白はＮ−およびＯ−結合糖付加反応を受ける。該
アルフアー接合因子プロモーターは表現形質がである細
胞内でのみ活性である。S.セレビシエにはSIRとして知
られる４遺伝子座位があり他の通常発現していないａお
よびα情報コピーの抑制に要求される蛋白を合成する。
この抑制現象を妨害する温度感受性（ts）欠損がこれら
座位の少なくとも一つの遺伝子産物内に存在する。この
変異株では35℃の生育で抑制を妨害しアルフア接合因子
プロモーターが不活性な表現系がa/αである細胞を生じ
る。23°に温度移行するとプロモーターが活性となり表
現型がαに復帰する。tsSIR欠損を有する株の利用は数
種の異種蛋白の制御された発現に示されてきた。
本発明の目的は、処理できるようにＳドメインに連結し
たプレＳ−１およびプレＳ−２ドメインを酵母内で免疫
原性粒子として発現させるための発現ベクター及び方法
を与えることである。他の目的は、プレＳ−１およびプ
レＳ−２ドメインの酵母内での発現のためのベクター及
び方法を与えることである。さらに他の目的はそのよう
なベクターで形質転換された組換え体宿主細胞の生育の
大規模化のための条件を特定し、プレＳ含有ポリペプチ
ドの精製のためにそのペプチドの最大収率が大量および
高濃度で得られるようにすることである。本発明のこれ
ら及び他の目的が以下の記述により明らかになるだろ
う。
たプレＳ−１およびプレＳ−２ドメインを酵母内で免疫
原性粒子として発現させるための発現ベクター及び方法
を与えることである。他の目的は、プレＳ−１およびプ
レＳ−２ドメインの酵母内での発現のためのベクター及
び方法を与えることである。さらに他の目的はそのよう
なベクターで形質転換された組換え体宿主細胞の生育の
大規模化のための条件を特定し、プレＳ含有ポリペプチ
ドの精製のためにそのペプチドの最大収率が大量および
高濃度で得られるようにすることである。本発明のこれ
ら及び他の目的が以下の記述により明らかになるだろ
う。
Ｂ型肝炎ウイルス表層抗原遺伝子に一つの隣接する読み
取り枠で連結した全Ｂ型肝炎ウイルスプレ−Ｓ抗原遺伝
子がサツカロミセスセレビシエで発現された。該発現さ
れた蛋白は両ドメインによりコードされた主要抗原部位
を表す粒状に凝結し、それによりプレ−Ｓドメインの発
現のための宿主としての酵母の利用性を明らかにした。
この蛋白は、試験管内診断系およびＢ型肝炎ウイルスの
誘起する疾患、および／または感染の治療、または予防
のためのワクチンとして有用である。
取り枠で連結した全Ｂ型肝炎ウイルスプレ−Ｓ抗原遺伝
子がサツカロミセスセレビシエで発現された。該発現さ
れた蛋白は両ドメインによりコードされた主要抗原部位
を表す粒状に凝結し、それによりプレ−Ｓドメインの発
現のための宿主としての酵母の利用性を明らかにした。
この蛋白は、試験管内診断系およびＢ型肝炎ウイルスの
誘起する疾患、および／または感染の治療、または予防
のためのワクチンとして有用である。
本発明は、隣接するポリペプチドとしてＳドメインに連
結したプレ−Ｓドメイン（またはその部分）またはプレ
−Ｓドメインそれ自体（またはその部分）の酵母種にお
ける発現の方法に向けられたものである。より特定する
と、このドメインの発現が強力な構成的なプロモーター
により支配された際の宿主に対するプレ−Ｓドメインの
示す毒性効果を打ち消すために、サツカロミセス属の種
におけるこれらドメインの発現を指示するためのガラク
トース−誘導プロモーター、グルコース−抑制プロモー
ターおよび温度−誘導プロモーターの利用に向けられて
いる。さらに、プレ−Ｓ−含有ポリペプチドを粒子形で
発現する組換え体細胞を大量に調整するための条件に向
けられている。当業者には、活性が生理的に制御されて
いる（すなわち誘導可能な）他のプロモーターが、上に
指摘したプレ−Ｓドメインの毒性効果を打ち消すために
酵母種におけるプレ−Ｓ−含有ポリペプチドの発現を指
示するために利用し得ることは明白であろう。
結したプレ−Ｓドメイン（またはその部分）またはプレ
−Ｓドメインそれ自体（またはその部分）の酵母種にお
ける発現の方法に向けられたものである。より特定する
と、このドメインの発現が強力な構成的なプロモーター
により支配された際の宿主に対するプレ−Ｓドメインの
示す毒性効果を打ち消すために、サツカロミセス属の種
におけるこれらドメインの発現を指示するためのガラク
トース−誘導プロモーター、グルコース−抑制プロモー
ターおよび温度−誘導プロモーターの利用に向けられて
いる。さらに、プレ−Ｓ−含有ポリペプチドを粒子形で
発現する組換え体細胞を大量に調整するための条件に向
けられている。当業者には、活性が生理的に制御されて
いる（すなわち誘導可能な）他のプロモーターが、上に
指摘したプレ−Ｓドメインの毒性効果を打ち消すために
酵母種におけるプレ−Ｓ−含有ポリペプチドの発現を指
示するために利用し得ることは明白であろう。
プレＳ−1/プレＳ−2/S ORFの単離のためのHBV核酸の源
としてデーン粒子が用いられた。HBビリオン中に生来存
在するニツクまたはギヤツプの入つた形からHBVゲノム
の共有結合により閉環した二本鎖DNAを調製するため
に、内在性のポリメラーゼ反応が用いられた。修復され
たDNAが単離されそしてEcoRIで完全消化された。E.コリ
ーのクローニング ベクターであるpBR322もまたEcoRI
で消化されHBV DNAと連結され、そしてE.コリーを形質
転換するのに用いられた。組換え体プラスミドが選択さ
れる。これらは、HBVゲノムを環状に入れ替えた形で含
んでおり、そこではEcoRI切断部位が、完全なプレＳ−1
/プレＳ−2/Sコード領域を0.4キロ塩基対（kbp）の５′
ドメインと0.8kbpの３′ドメインに分ける。これら二つ
のドメインは偶発的な全ゲノムの再配列を目的としてサ
ブクローンされる。３′ドメインについてはpUC19がEco
RIおよびBamHIにより消化され、次いでコード領域の最
後の５ヌクレオチド、停止コドン、HindIII部位およびB
amHI末端からなる合成オリゴヌクレオチドに連結され
る。0.8kbpEcoRI-AccI断片からなるプレＳ−1/プレＳ−
2/S遺伝子の３′部分がこのベクター中にクローンされ
る。0.3kbp BamHI-EcoRI断片からなる５′部分は（１）
完全なORFが発現されるべきか、または（２）推定状の
疏水的シグナル配列（アミノ酸２−15）が除かれるべき
か、により二通りの方法のどちらかでpUC18中にサブク
ローンされる。最初の戦略では、pUC18はHindIIIおよび
EcoRIで消化され、72bpの合成オリゴヌクレオチドと連
結され、BamHI部位上流から末端ATGおよび10bp非翻訳リ
ーダー配列を過ぎてHindIII対応末端までの完全ORFを再
構成する。第二の戦略では同じ機能を持つがアミノ酸配
列２−15のコード領域をなくした30bpオリゴヌクレオチ
ドが連結される。５′ドメインの0.3kbp BamHI-EcoRI断
片が次いでこれらオリゴヌクレオチド連結クローニング
ベクターのどちらかの中に連結される。該５′pUC18
および３′pUC19クローンは、E.コリ中での生育により
増幅され、コード領域は、単離されたプラスミドからHi
ndIII-EcoRI断片として消化される。該５′および３′
断片は連結され、HindIIIで消化され、HindIII末端を持
つた完全ORFは、HindIIIで予め消化されたpUC13中にク
ローンされる。HindIII断片としての完全ORFは、GAPD
H、ADH2またはGAL10プロモーター発現系中にクローンす
るために、調製用ゲル電気泳動により精製される。GAPD
H発現カセツトを含む該pBR322プラスミドはGAPDHプロモ
ーターとADHI転写終結のあいだに唯一のHindIII部位を
有し、その中に上に述べたpUC13からの完全ORFが適当な
配向性で挿入される。この3.0kbpの発現カセツトは次い
でSphI消化により除かれ小SphI断片と置き換えるために
シヤトルベクターpC1/1中に連結される。この方法で構
築されたベクターはS.セレビシエ2150−２−３株〔（バ
レンツエラ（Valenzuela）等、バイオテクノロジー、
3、317-320、1985年４月に記載）本株は、既知の株であ
り、容易に入手可能である。〕を形質転換するのに用い
られる；しかしながら該形質転換混合物を平板に広げる
と安定な集落は出現しない。発現された産物の推定され
た毒性はプレS1−プレＳ−2/Sコード領域の大部分の除
去およびBamHIによるフレームシフト変異の創製とプラ
スミドの再連結により確認される；このように調製され
たDNAは酵母細胞を効率よく形質転換する。
としてデーン粒子が用いられた。HBビリオン中に生来存
在するニツクまたはギヤツプの入つた形からHBVゲノム
の共有結合により閉環した二本鎖DNAを調製するため
に、内在性のポリメラーゼ反応が用いられた。修復され
たDNAが単離されそしてEcoRIで完全消化された。E.コリ
ーのクローニング ベクターであるpBR322もまたEcoRI
で消化されHBV DNAと連結され、そしてE.コリーを形質
転換するのに用いられた。組換え体プラスミドが選択さ
れる。これらは、HBVゲノムを環状に入れ替えた形で含
んでおり、そこではEcoRI切断部位が、完全なプレＳ−1
/プレＳ−2/Sコード領域を0.4キロ塩基対（kbp）の５′
ドメインと0.8kbpの３′ドメインに分ける。これら二つ
のドメインは偶発的な全ゲノムの再配列を目的としてサ
ブクローンされる。３′ドメインについてはpUC19がEco
RIおよびBamHIにより消化され、次いでコード領域の最
後の５ヌクレオチド、停止コドン、HindIII部位およびB
amHI末端からなる合成オリゴヌクレオチドに連結され
る。0.8kbpEcoRI-AccI断片からなるプレＳ−1/プレＳ−
2/S遺伝子の３′部分がこのベクター中にクローンされ
る。0.3kbp BamHI-EcoRI断片からなる５′部分は（１）
完全なORFが発現されるべきか、または（２）推定状の
疏水的シグナル配列（アミノ酸２−15）が除かれるべき
か、により二通りの方法のどちらかでpUC18中にサブク
ローンされる。最初の戦略では、pUC18はHindIIIおよび
EcoRIで消化され、72bpの合成オリゴヌクレオチドと連
結され、BamHI部位上流から末端ATGおよび10bp非翻訳リ
ーダー配列を過ぎてHindIII対応末端までの完全ORFを再
構成する。第二の戦略では同じ機能を持つがアミノ酸配
列２−15のコード領域をなくした30bpオリゴヌクレオチ
ドが連結される。５′ドメインの0.3kbp BamHI-EcoRI断
片が次いでこれらオリゴヌクレオチド連結クローニング
ベクターのどちらかの中に連結される。該５′pUC18
および３′pUC19クローンは、E.コリ中での生育により
増幅され、コード領域は、単離されたプラスミドからHi
ndIII-EcoRI断片として消化される。該５′および３′
断片は連結され、HindIIIで消化され、HindIII末端を持
つた完全ORFは、HindIIIで予め消化されたpUC13中にク
ローンされる。HindIII断片としての完全ORFは、GAPD
H、ADH2またはGAL10プロモーター発現系中にクローンす
るために、調製用ゲル電気泳動により精製される。GAPD
H発現カセツトを含む該pBR322プラスミドはGAPDHプロモ
ーターとADHI転写終結のあいだに唯一のHindIII部位を
有し、その中に上に述べたpUC13からの完全ORFが適当な
配向性で挿入される。この3.0kbpの発現カセツトは次い
でSphI消化により除かれ小SphI断片と置き換えるために
シヤトルベクターpC1/1中に連結される。この方法で構
築されたベクターはS.セレビシエ2150−２−３株〔（バ
レンツエラ（Valenzuela）等、バイオテクノロジー、
3、317-320、1985年４月に記載）本株は、既知の株であ
り、容易に入手可能である。〕を形質転換するのに用い
られる；しかしながら該形質転換混合物を平板に広げる
と安定な集落は出現しない。発現された産物の推定され
た毒性はプレS1−プレＳ−2/Sコード領域の大部分の除
去およびBamHIによるフレームシフト変異の創製とプラ
スミドの再連結により確認される；このように調製され
たDNAは酵母細胞を効率よく形質転換する。
該YEp52 E.コリ/S.セレビシエシヤトル ベクターは、
唯一のHindIII部位に挿入された異種遺伝子のガラクト
ース誘導可能なGAL10プロモーターからの発現を行わせ
る。上に述べたプレＳ−1/プレＳ−2/S ORF（HindIII末
端を持つ）は、ベクターのHindIII部位に連結される。
この組換え体プラスミドはS.セレビシエBY-19株〔（ブ
ロウチ（Broarh）等、セル（Cell）、21、501-508 1980
年に記載）本株は、既知の株であり、容易に入手可能で
ある。又本株はDC04としても知られている。〕に導入さ
れ形質転換されたクローンが選択される。細胞は、グリ
セロール−乳酸を含む合成選択培地で生育される。その
後発現を誘導するために、培養にガラクトースが添加さ
れる。容菌液が調製され、ドデシル硫酸ナトリウム−ポ
リアクリルアミド ゲル電気泳動（SDS-PAGE）で分析さ
れ、ニトロセルロースにウエスタン（Western）ブロツ
トされる。誘導された形質転換体にのみ存在すること、
および回復期のヒトHB血清との反応性の点からp39産物
がプレＳ−1/プノＳ−2/Sに特異的であることが見いだ
されている。さらに、形質転換体の容菌液はラジオイム
ノアツセイによりHBsAg陽性であり、プレ−Ｓ領域に特
異的であることが示されている結合である、重合したヒ
ト アルブミンとの結合の点でプレＳ陽性であるが、野
性型S.セレビシエではそうでない。粒状のHBsAgを認識
する山羊抗体を結合した免疫アフイニチー カラムが、
形質転換されたS.セレビシエからのプレＳ−1/プレＳ−
2/Sを精製するのに利用された。溶出された産物は、ラ
ジオイムノアツセイでHBsAg陽性、重合したヒト アル
ブミン結合においてプレ−Ｓ陽性であり、電子顕微鏡で
粒子状である。これらのデータは全プレＳ−1/プレＳ−
2/S蛋白がS.セレビシエ内で粒子状に存在するp39として
発現されることを示す。HBsおよびプレ−Ｓ抗原の両方
を含むその様な粒子形はHBワクチンおよび診断試薬とし
て有効である。
唯一のHindIII部位に挿入された異種遺伝子のガラクト
ース誘導可能なGAL10プロモーターからの発現を行わせ
る。上に述べたプレＳ−1/プレＳ−2/S ORF（HindIII末
端を持つ）は、ベクターのHindIII部位に連結される。
この組換え体プラスミドはS.セレビシエBY-19株〔（ブ
ロウチ（Broarh）等、セル（Cell）、21、501-508 1980
年に記載）本株は、既知の株であり、容易に入手可能で
ある。又本株はDC04としても知られている。〕に導入さ
れ形質転換されたクローンが選択される。細胞は、グリ
セロール−乳酸を含む合成選択培地で生育される。その
後発現を誘導するために、培養にガラクトースが添加さ
れる。容菌液が調製され、ドデシル硫酸ナトリウム−ポ
リアクリルアミド ゲル電気泳動（SDS-PAGE）で分析さ
れ、ニトロセルロースにウエスタン（Western）ブロツ
トされる。誘導された形質転換体にのみ存在すること、
および回復期のヒトHB血清との反応性の点からp39産物
がプレＳ−1/プノＳ−2/Sに特異的であることが見いだ
されている。さらに、形質転換体の容菌液はラジオイム
ノアツセイによりHBsAg陽性であり、プレ−Ｓ領域に特
異的であることが示されている結合である、重合したヒ
ト アルブミンとの結合の点でプレＳ陽性であるが、野
性型S.セレビシエではそうでない。粒状のHBsAgを認識
する山羊抗体を結合した免疫アフイニチー カラムが、
形質転換されたS.セレビシエからのプレＳ−1/プレＳ−
2/Sを精製するのに利用された。溶出された産物は、ラ
ジオイムノアツセイでHBsAg陽性、重合したヒト アル
ブミン結合においてプレ−Ｓ陽性であり、電子顕微鏡で
粒子状である。これらのデータは全プレＳ−1/プレＳ−
2/S蛋白がS.セレビシエ内で粒子状に存在するp39として
発現されることを示す。HBsおよびプレ−Ｓ抗原の両方
を含むその様な粒子形はHBワクチンおよび診断試薬とし
て有効である。
pADH2Δ67（−１）E.コリ クローニングベクターは、
S.セレビシエにおいて唯一のHindIII部位に挿入された
異種遺伝子のADH2（グルコース−抑制のかかる）プロモ
ーターからの発現を指示することができる。pADH2Δ67
（−１）がBamHIおよびEcoRIで消化され、DNAポリメラ
ーゼＩのクレノー（Klenow）断片により平滑末端化され
ADH2プロモーターおよび終結配列を含む4.9kbpの断片が
調製用アガロースゲル電気泳動により精製される。pUC7
がPstIで消化され、T4 DNAポリメラーゼにより平滑末端
化され、該4.9lbp断片と連結される。出来たプラスミド
はSaIIで消化され、4.9kbp断片が調製用アガロースゲル
電気泳動により精製される。pUC18はHindIIIで消化さ
れ、DNAポリメラーゼＩのクレノー断片で平滑末端化さ
れ、自己連結される。出来たプラスミドはSalIで消化さ
れ4.9kbpSalI断片に連結される。上に述べた1.2kbp Pre
S−1/PreS−2/S ORF（HindIII末端を持つ）はこのベク
ターのHindIII部位に連結される。出来たプラスミドはS
alIで消化され、該6.1kbpの断片はシヤトルベクターのp
C1/1のSalI部位に連結される。プラスミドpC1/1はpJDB2
19内の細菌プラスミドpMB9に対応する領域がpBR322で置
換されたpJDB219の誘導体である。この組換えプラスミ
ンドはS.セレビシエ中に導入され、性質転換されたクロ
ーンが選択される。細胞は0.3％（w/v）グルコースを含
む合成選択培地に生育させられる。48時間後に、グルコ
ース除去に続いて、容菌液が調製され、SDS-PAGEで分析
されニトロセルロースにウエスタン（Western）ブロツ
トされる。p39産物が、形質転換体にのみ存在するこ
と、および回復期ヒトHB血清と反応することから、プレ
Ｓ−1/プレＳ−2/Sに特異的であることが見いだされ
る。さらに、形質転換体の容菌液は、ラジオイムノアツ
セイでHBsAg陽性であり、そして重合したヒトアルブミ
ンと結合することによりプレ−Ｓ陽性であるが、野生型
S.セレビシエのではそうでない。粒子状のHBsAgを認識
する山羊抗体を結合した免疫アフイニチーカラムが、形
質転換されたS.セレビシエからプレＳ−1/プレＳ−2/S
を精製するのに利用される。溶出した産物は、ラジオイ
ムノアツセイでHBsAg陽性、重合したヒトアルブミン結
合によりプレ−Ｓ陽性、そして電子顕微鏡で粒状であ
る。
S.セレビシエにおいて唯一のHindIII部位に挿入された
異種遺伝子のADH2（グルコース−抑制のかかる）プロモ
ーターからの発現を指示することができる。pADH2Δ67
（−１）がBamHIおよびEcoRIで消化され、DNAポリメラ
ーゼＩのクレノー（Klenow）断片により平滑末端化され
ADH2プロモーターおよび終結配列を含む4.9kbpの断片が
調製用アガロースゲル電気泳動により精製される。pUC7
がPstIで消化され、T4 DNAポリメラーゼにより平滑末端
化され、該4.9lbp断片と連結される。出来たプラスミド
はSaIIで消化され、4.9kbp断片が調製用アガロースゲル
電気泳動により精製される。pUC18はHindIIIで消化さ
れ、DNAポリメラーゼＩのクレノー断片で平滑末端化さ
れ、自己連結される。出来たプラスミドはSalIで消化さ
れ4.9kbpSalI断片に連結される。上に述べた1.2kbp Pre
S−1/PreS−2/S ORF（HindIII末端を持つ）はこのベク
ターのHindIII部位に連結される。出来たプラスミドはS
alIで消化され、該6.1kbpの断片はシヤトルベクターのp
C1/1のSalI部位に連結される。プラスミドpC1/1はpJDB2
19内の細菌プラスミドpMB9に対応する領域がpBR322で置
換されたpJDB219の誘導体である。この組換えプラスミ
ンドはS.セレビシエ中に導入され、性質転換されたクロ
ーンが選択される。細胞は0.3％（w/v）グルコースを含
む合成選択培地に生育させられる。48時間後に、グルコ
ース除去に続いて、容菌液が調製され、SDS-PAGEで分析
されニトロセルロースにウエスタン（Western）ブロツ
トされる。p39産物が、形質転換体にのみ存在するこ
と、および回復期ヒトHB血清と反応することから、プレ
Ｓ−1/プレＳ−2/Sに特異的であることが見いだされ
る。さらに、形質転換体の容菌液は、ラジオイムノアツ
セイでHBsAg陽性であり、そして重合したヒトアルブミ
ンと結合することによりプレ−Ｓ陽性であるが、野生型
S.セレビシエのではそうでない。粒子状のHBsAgを認識
する山羊抗体を結合した免疫アフイニチーカラムが、形
質転換されたS.セレビシエからプレＳ−1/プレＳ−2/S
を精製するのに利用される。溶出した産物は、ラジオイ
ムノアツセイでHBsAg陽性、重合したヒトアルブミン結
合によりプレ−Ｓ陽性、そして電子顕微鏡で粒状であ
る。
アルフア接合因子遺伝子MFα１はS.セレビシエ ゲノム
DNAからプラスミド ベクター上にクローンされた。得
られたプラスミドpKH2はEcoRIで消化され、アルフア接
合因子を保持している1.7kbp断片は調製用アガロースゲ
ル電気泳動により精製される。プラスミドpRJ148（Hind
III部位を欠く改変されたpBR322）がEcoRIで消化され、
その1.7kbp断片と連結されpRJ159を与える。このDNA
は、HindIIIにより消化され、自己連結されてプラスミ
ドpRJ167を形成する。このプラスミドは、唯一のHindII
I部位を有する。プラスミドpRJ167はHindIIIで消化さ
れ、合成オリゴヌクレオチドアダプターの挿入により改
変され、３種の読み取り枠総てにプロモーターおよびプ
レプロリーダーの３′側で翻訳終結シグナルの５′側に
存在する唯一のHindIII部位を含む新たなプラスミド（p
RJ178）を与える。該HindIII部位は、HinIIIによる消
化、DNAポリメラーゼＩのクレノー（Klenow）断片によ
る平滑末端化、BamHIリンカーの付加、自己連結によりB
amHI部位に変換され、プラスミドpJC193を形成する。こ
のプラスミドは、EcoRIで消化され、DNAポリメラーゼＩ
のクレノー断片により平滑末端化され、BclIリンカーの
付加により改変され、BclIで消化され、アルフア接合因
子遺伝子を保持する1.5kbp断片が、調製用ゲル電気泳動
により単離される。こうして得られたBclI断片は子牛腸
アルカリ性フオスフアターゼにより処理され、次いでpC
1/1の唯一のBamHI部位に挿入され、この過程で元来のBa
mHI部位を破壊する（プラスミドpJC194）。このDNAは、
過剰のBamHIリンカーを除くためにBamHIで消化され自己
連結されることにより新たなアルフア接合因子発現ベク
タープラスミドpJC197となる。上に述べたpUC13中のプ
レＳ−1/プレＳ−2/S ORFはHinfIおよびAvaIにより消化
され、0.5kbp ORFは調製用アガロースゲル電気泳動によ
り精製される。pUC18はSalIおよびBamHIで消化され、次
いで２合成オリゴヌクレオチドと連結される。該５′オ
リゴヌクレオチドはSalI末端、HindIII部位、KEX2開裂
部位をコードするヌクレオチド、プレＳ−１の２および
３アミノ酸をコードするヌクレオチド、およびHinfI末
端からなる。該３′オリゴヌクレオチドはAvaI部位、プ
レＳ−２の最後の８アミノ酸をコードするオリゴヌクレ
オチド、停止コドン、HindIII部位、およびBamHI末端を
含む。該0.5kbpORFはこのオリゴヌクレオチド連結pUC18
ベクター中にクローンされる。できたベクターはHindII
Iで消化されDNAポリメラーゼＩのクレノー断片で平滑末
端化される。できた0.5kbpプレＳ−1/プレＳ−2 ORFは
調整用アガロースゲル電気泳動により精製され、BamHI
で消化されDNAポリメラーゼＩのクレノー断片で平滑末
端化されたpJC197中にクローンされ、アルフア接合因子
のプレ−プロ−リーダー配列に機能するように連結され
たプレS ORFとなる。
DNAからプラスミド ベクター上にクローンされた。得
られたプラスミドpKH2はEcoRIで消化され、アルフア接
合因子を保持している1.7kbp断片は調製用アガロースゲ
ル電気泳動により精製される。プラスミドpRJ148（Hind
III部位を欠く改変されたpBR322）がEcoRIで消化され、
その1.7kbp断片と連結されpRJ159を与える。このDNA
は、HindIIIにより消化され、自己連結されてプラスミ
ドpRJ167を形成する。このプラスミドは、唯一のHindII
I部位を有する。プラスミドpRJ167はHindIIIで消化さ
れ、合成オリゴヌクレオチドアダプターの挿入により改
変され、３種の読み取り枠総てにプロモーターおよびプ
レプロリーダーの３′側で翻訳終結シグナルの５′側に
存在する唯一のHindIII部位を含む新たなプラスミド（p
RJ178）を与える。該HindIII部位は、HinIIIによる消
化、DNAポリメラーゼＩのクレノー（Klenow）断片によ
る平滑末端化、BamHIリンカーの付加、自己連結によりB
amHI部位に変換され、プラスミドpJC193を形成する。こ
のプラスミドは、EcoRIで消化され、DNAポリメラーゼＩ
のクレノー断片により平滑末端化され、BclIリンカーの
付加により改変され、BclIで消化され、アルフア接合因
子遺伝子を保持する1.5kbp断片が、調製用ゲル電気泳動
により単離される。こうして得られたBclI断片は子牛腸
アルカリ性フオスフアターゼにより処理され、次いでpC
1/1の唯一のBamHI部位に挿入され、この過程で元来のBa
mHI部位を破壊する（プラスミドpJC194）。このDNAは、
過剰のBamHIリンカーを除くためにBamHIで消化され自己
連結されることにより新たなアルフア接合因子発現ベク
タープラスミドpJC197となる。上に述べたpUC13中のプ
レＳ−1/プレＳ−2/S ORFはHinfIおよびAvaIにより消化
され、0.5kbp ORFは調製用アガロースゲル電気泳動によ
り精製される。pUC18はSalIおよびBamHIで消化され、次
いで２合成オリゴヌクレオチドと連結される。該５′オ
リゴヌクレオチドはSalI末端、HindIII部位、KEX2開裂
部位をコードするヌクレオチド、プレＳ−１の２および
３アミノ酸をコードするヌクレオチド、およびHinfI末
端からなる。該３′オリゴヌクレオチドはAvaI部位、プ
レＳ−２の最後の８アミノ酸をコードするオリゴヌクレ
オチド、停止コドン、HindIII部位、およびBamHI末端を
含む。該0.5kbpORFはこのオリゴヌクレオチド連結pUC18
ベクター中にクローンされる。できたベクターはHindII
Iで消化されDNAポリメラーゼＩのクレノー断片で平滑末
端化される。できた0.5kbpプレＳ−1/プレＳ−2 ORFは
調整用アガロースゲル電気泳動により精製され、BamHI
で消化されDNAポリメラーゼＩのクレノー断片で平滑末
端化されたpJC197中にクローンされ、アルフア接合因子
のプレ−プロ−リーダー配列に機能するように連結され
たプレS ORFとなる。
アルフア接合因子プロモーターは表現型αである細胞内
でのみ活性となる。S.セレビシエにはSIRとして知られ
る４座位が知られておりａおよびα情報の他の通常休止
しているコピーの抑制に必要な蛋白を合成している。JR
Y188株細胞〔（ブレーク（Brake）等、プロク、ナト
ル、アカド、サイ、（Proc.Natl.Acad.Sci.）、USA、8
1、4642-4646、1984年に記載）本株は、既知の株であ
り、容易に入手可能である。〕（MATα、sir3−８、leu
2−３、leu2−112、trpl、ura3−52、his4）はSIR3遺伝
子産物内にts欠損を含む。その結果、35℃で生育したJR
Y188細胞は表現型がa/αでありアルフア接合因子プロモ
ーターは活性でない；他方、23℃で生育した細胞は表現
型がαでありしたがつてアルフア接合因子プロモーター
により支配される発現を誘導することが出来る。組換え
体プレＳ−1/プレＳ−２含有アルフア接合因子プラスミ
ドがS.セレビシエJRY188株の形質転換に用いられ、形質
転換クローンが選択される。細胞は合成選択培地（le
u-）に35°で生育させられる；その後構胞はA600＝0.5
で同じ培地に23℃生育させられる。溶菌液が調製され、
SDS-PAGEで分析され、ニトロセルロースにウエスタンブ
ロツトされる。それが形質転換株にのみ存在すること、
および回復期のヒト血清と反応することからp21産物が
プレＳ−1/プレＳ−２に特異的であることが見いだされ
る。
でのみ活性となる。S.セレビシエにはSIRとして知られ
る４座位が知られておりａおよびα情報の他の通常休止
しているコピーの抑制に必要な蛋白を合成している。JR
Y188株細胞〔（ブレーク（Brake）等、プロク、ナト
ル、アカド、サイ、（Proc.Natl.Acad.Sci.）、USA、8
1、4642-4646、1984年に記載）本株は、既知の株であ
り、容易に入手可能である。〕（MATα、sir3−８、leu
2−３、leu2−112、trpl、ura3−52、his4）はSIR3遺伝
子産物内にts欠損を含む。その結果、35℃で生育したJR
Y188細胞は表現型がa/αでありアルフア接合因子プロモ
ーターは活性でない；他方、23℃で生育した細胞は表現
型がαでありしたがつてアルフア接合因子プロモーター
により支配される発現を誘導することが出来る。組換え
体プレＳ−1/プレＳ−２含有アルフア接合因子プラスミ
ドがS.セレビシエJRY188株の形質転換に用いられ、形質
転換クローンが選択される。細胞は合成選択培地（le
u-）に35°で生育させられる；その後構胞はA600＝0.5
で同じ培地に23℃生育させられる。溶菌液が調製され、
SDS-PAGEで分析され、ニトロセルロースにウエスタンブ
ロツトされる。それが形質転換株にのみ存在すること、
および回復期のヒト血清と反応することからp21産物が
プレＳ−1/プレＳ−２に特異的であることが見いだされ
る。
プレＳ−1/プレＳ−2/Sを構成的なGAPDHプロモーターか
ら発現させるベクターがS.セレビシエを安定に形質転換
できないことは、構成的また高レベルのプレ−Ｓ発現の
S.セレビシエにたいする悪い生理的な効果を明らかにす
る；この同じプロモーターからのＳポリペプチドの発現
をさせるプラスミドpHBS56-GAP347/33はS.セレビシエを
効果的に形質転換し、そのような形質転換したS.セレビ
シエは生産規模まで効率的に生育する。この観察結果
は、S.セレビシエ中でプレＳ−含有ポリペプチドの発現
をさせるのに、誘導可能、脱抑制の可能、あるいは活性
の弱い構成的なプロモーターを利用するシヤトルベクタ
ーの有用性を明らかにする。特にこのことは、S.セレビ
シエ中でプレＳ−1/プレＳ−2/Sの発現をさせるのにGAL
10プロモーターを利用する発現ベクターの有用性を明ら
かにする。該分野の熟練者にとつて、同じような様式で
機能する制御可能なGAL10プロモーターあるいはGAL1、G
AL2、GAL7またはMEL1プロモーターが、宿主細胞に対す
る負の効果を最小にするようにして、組換え体蛋白の合
成が始まる前に組換え体S.セレビシエ培養の生育を生産
規模体積にまで拡大させることができるということは明
白である。さらに該分野の熟練者にとつて、ADH2および
アルフア接合因子を含むがそれに限定されない、生理的
に誘導可能なまたは他の方法により脱抑制の可能なほか
の制御可能なプロモーターを含む発現ベクターがプレ−
Ｓ−含有ポリペプチドの発現をさせるのに利用され得る
ことは明白である。さらに該分野の熟練者にとつては、
CYC1を含むがそれに限定されない、GAPDHより強力でな
い構成的なプロモーターが、過剰発現による負の生理的
効果が回避されるように、プレ−Ｓ−含有ポリペプチド
の発現を細胞蛋白の低いパーセントにしてしまうという
ことは明白である。該分野の熟練者にとつて、例えばウ
エスタンブロツトまたはラジオイムアツセイのような適
当な検定系が、最大の収率を得るための培養収穫時が最
適になるように、この系におけるプレ−Ｓ−含有ポリペ
プチドの発現を検定するために利用されるべきであると
いうことは明白である。
ら発現させるベクターがS.セレビシエを安定に形質転換
できないことは、構成的また高レベルのプレ−Ｓ発現の
S.セレビシエにたいする悪い生理的な効果を明らかにす
る；この同じプロモーターからのＳポリペプチドの発現
をさせるプラスミドpHBS56-GAP347/33はS.セレビシエを
効果的に形質転換し、そのような形質転換したS.セレビ
シエは生産規模まで効率的に生育する。この観察結果
は、S.セレビシエ中でプレＳ−含有ポリペプチドの発現
をさせるのに、誘導可能、脱抑制の可能、あるいは活性
の弱い構成的なプロモーターを利用するシヤトルベクタ
ーの有用性を明らかにする。特にこのことは、S.セレビ
シエ中でプレＳ−1/プレＳ−2/Sの発現をさせるのにGAL
10プロモーターを利用する発現ベクターの有用性を明ら
かにする。該分野の熟練者にとつて、同じような様式で
機能する制御可能なGAL10プロモーターあるいはGAL1、G
AL2、GAL7またはMEL1プロモーターが、宿主細胞に対す
る負の効果を最小にするようにして、組換え体蛋白の合
成が始まる前に組換え体S.セレビシエ培養の生育を生産
規模体積にまで拡大させることができるということは明
白である。さらに該分野の熟練者にとつて、ADH2および
アルフア接合因子を含むがそれに限定されない、生理的
に誘導可能なまたは他の方法により脱抑制の可能なほか
の制御可能なプロモーターを含む発現ベクターがプレ−
Ｓ−含有ポリペプチドの発現をさせるのに利用され得る
ことは明白である。さらに該分野の熟練者にとつては、
CYC1を含むがそれに限定されない、GAPDHより強力でな
い構成的なプロモーターが、過剰発現による負の生理的
効果が回避されるように、プレ−Ｓ−含有ポリペプチド
の発現を細胞蛋白の低いパーセントにしてしまうという
ことは明白である。該分野の熟練者にとつて、例えばウ
エスタンブロツトまたはラジオイムアツセイのような適
当な検定系が、最大の収率を得るための培養収穫時が最
適になるように、この系におけるプレ−Ｓ−含有ポリペ
プチドの発現を検定するために利用されるべきであると
いうことは明白である。
サツカロミセス属は種々の種からなつている。種々の異
種ポリペプチドの組換えDNA−仲介発現のための宿主と
して最も普通に用いられるのは、サツカロミセス セレ
ビシエ、またはパン酵母、である。しかしながら、サツ
カロミセス属の他の種のあいだの分別は、常によく定め
られているとはいえない。これら種の多くはS.セレビシ
エと交雑可能であり、GAL10、ADH2、そして／またはア
ルフア接合因子プロモーターを含むがそれに限定されな
い、S.セレビシエ内のプロモーターと類似或は同一の制
御可能なプロモーターを有しているようである。従つ
て、該分野の熟練者にとつて、プレ−Ｓ−含有ポリペプ
チドの発現のための宿主株の選択はカルスベルゲンシス
（carlsbergensis）、ウバルム（uvarum）、ルクシ（ro
uxii）、モンタナス（montunus）、クルベリ（kluyver
i）、エロンギスポラス（elongisporus）、ノルベンシ
ス（norbensis）、オビフオルミス（oviformis）、およ
びジアスタチカス（diastaticus）を含むがそれに限定
されないサツカロミセス属の他の種にまで及ぶというこ
とは明白である。
種ポリペプチドの組換えDNA−仲介発現のための宿主と
して最も普通に用いられるのは、サツカロミセス セレ
ビシエ、またはパン酵母、である。しかしながら、サツ
カロミセス属の他の種のあいだの分別は、常によく定め
られているとはいえない。これら種の多くはS.セレビシ
エと交雑可能であり、GAL10、ADH2、そして／またはア
ルフア接合因子プロモーターを含むがそれに限定されな
い、S.セレビシエ内のプロモーターと類似或は同一の制
御可能なプロモーターを有しているようである。従つ
て、該分野の熟練者にとつて、プレ−Ｓ−含有ポリペプ
チドの発現のための宿主株の選択はカルスベルゲンシス
（carlsbergensis）、ウバルム（uvarum）、ルクシ（ro
uxii）、モンタナス（montunus）、クルベリ（kluyver
i）、エロンギスポラス（elongisporus）、ノルベンシ
ス（norbensis）、オビフオルミス（oviformis）、およ
びジアスタチカス（diastaticus）を含むがそれに限定
されないサツカロミセス属の他の種にまで及ぶというこ
とは明白である。
ハンセヌラ（Hansenula）、カンヂダ（Candida）、トル
ロプシス（Torulopsis）、およびピキア（Pichia）のよ
うないくつかの酵母属は、生育のための唯一炭素源とし
てメタノールを利用するための同様な代謝系を含むこと
が示されている。この代謝系に関与している酵素である
アルコール オキシダーゼの遺伝子はピキア パストリ
ス（Pichia pastoris）から単離されている。P.パスト
リス アルコール オキシダーゼ プロモーターが単離
され発現のメタノール誘導に感受性であることが示され
ている。そのような誘導可能なプロモーターは、酵母内
で負に選択されるポリペプチドの発現に有用である。特
に、このプロモーターはプラスミド上でP.パストリスに
おけるＳドメインの粒状での誘導発現に活性であること
が示されている。この観察は、他の酵母属が組換えDNA
−仲介の免疫学的に活発な形でのＳポリペプチドの発現
のための宿主として機能する能力があることを明らかに
した。従つて、該分野の熟練者にとつて、プレ−Ｓ−含
有ポリペプチドの発現のための、宿主株の選択がピキ
ア、カンヂダ、ハンセヌラ、トルロプシス、クルベロミ
セス（Kluyveromyces）、およびサツカロミセスを含む
がそれに限定されない、サツカロミセスおよびクリプト
コカス科からの酵母の他の属からの種にまで広がるとい
うことは明白である。
ロプシス（Torulopsis）、およびピキア（Pichia）のよ
うないくつかの酵母属は、生育のための唯一炭素源とし
てメタノールを利用するための同様な代謝系を含むこと
が示されている。この代謝系に関与している酵素である
アルコール オキシダーゼの遺伝子はピキア パストリ
ス（Pichia pastoris）から単離されている。P.パスト
リス アルコール オキシダーゼ プロモーターが単離
され発現のメタノール誘導に感受性であることが示され
ている。そのような誘導可能なプロモーターは、酵母内
で負に選択されるポリペプチドの発現に有用である。特
に、このプロモーターはプラスミド上でP.パストリスに
おけるＳドメインの粒状での誘導発現に活性であること
が示されている。この観察は、他の酵母属が組換えDNA
−仲介の免疫学的に活発な形でのＳポリペプチドの発現
のための宿主として機能する能力があることを明らかに
した。従つて、該分野の熟練者にとつて、プレ−Ｓ−含
有ポリペプチドの発現のための、宿主株の選択がピキ
ア、カンヂダ、ハンセヌラ、トルロプシス、クルベロミ
セス（Kluyveromyces）、およびサツカロミセスを含む
がそれに限定されない、サツカロミセスおよびクリプト
コカス科からの酵母の他の属からの種にまで広がるとい
うことは明白である。
近年、酵母より高等な真核細胞、特に棒状ウイルス（ba
culovirus）発現ベクターでトランスフエクトされた哺
乳動物細胞系および昆虫細胞における組換え蛋白の発現
の目ざましい成功が報告されている。Ｓドメインに連結
したプレＳ−２ドメインとともにＳドメインそれ自体の
両者の、免疫原性粒子としての成功裡の発現が達成され
ている。それ故に、該分野の熟練者にとつて、酵母にお
いて完全なプレＳ−1/プレＳ−2/Sドメインを免疫原性
粒子として発現させるという考えが、これら連結ドメイ
ンをベロ（vero）、GH3、Ltk-およびCHOのような哺乳動
物細胞を含むがそれに限定されない高等真核生物の細胞
内での発現にまで容易に広がるということは明白であ
る。
culovirus）発現ベクターでトランスフエクトされた哺
乳動物細胞系および昆虫細胞における組換え蛋白の発現
の目ざましい成功が報告されている。Ｓドメインに連結
したプレＳ−２ドメインとともにＳドメインそれ自体の
両者の、免疫原性粒子としての成功裡の発現が達成され
ている。それ故に、該分野の熟練者にとつて、酵母にお
いて完全なプレＳ−1/プレＳ−2/Sドメインを免疫原性
粒子として発現させるという考えが、これら連結ドメイ
ンをベロ（vero）、GH3、Ltk-およびCHOのような哺乳動
物細胞を含むがそれに限定されない高等真核生物の細胞
内での発現にまで容易に広がるということは明白であ
る。
以下の例示は本発明を説明するがどれだけに限定するも
のではない。以下の例示に指摘されている各参照例の開
示はここに参考として取り入れられている。
のではない。以下の例示に指摘されている各参照例の開
示はここに参考として取り入れられている。
実施例１ プレＳ−1/ピレＳ−2/S遺伝子のクローン化 デーン粒子（サブタイプayw）が、感染個体の血漿から
確立された方法（ランダース他、ジヤーナル オブ ヴ
イロロジー（Landers etal.,Virology）23巻、368頁197
7年）により精製された。該ゲノムDNAはニツクの入つた
ギヤツプを有有する形でヴイリオン中に存在する（ルス
カ（Hruska）他、ジヤーナル オブ ヴイロロジー21
巻、666頁1977年）。このDNAを分子クローニング用に調
製する目的で、共有結合閉環二本鎖DNAを生産するため
に内在性ポリメラーゼ反応が利用された（ランダース
他、ジヤーナル オブ ヴイロロジー23巻、368頁、197
7年）。該DNAは、ドデシル硫酸ナトリウムおよびプロテ
イナーゼＫを含む緩衝液中でインキユベートした後フエ
ノール：クロロフオルム：イソアミル アルコール（2
5:24:1）による抽出およびエタノール沈殿による濃縮に
より除蛋白された。この精製DNAはEcoRIにより完全消化
された。E.コリ クローニング用ベクターpBR322もまた
EcoRIで消化され、消化されたHBV DNAと連結されE.コリ
に形質転換するのに用いられた。HBVゲノムを、完全な
プレＳ−1/プレＳ−2/Sコード領域を0.4kbpの５′ドメ
インと0.8kbpの３′ドメインに分ける唯一のEcoRI部位
のところで環状に入れ替わつた配向性で含む組換えプラ
スミド（pHBV/AYW−１、第１図）が単離された（ガリバ
ート（Galibert）他、ネイチヤー281巻、646頁1979
年）。これら二つのドメインは、全遺伝子の偶発的な再
会合の目的でサブクローンされた。pUC19はEcoRIおよび
BamHIで消化され、次いでコード領域の最後の５ヌクレ
オチド、停止コドン、HindIII部位およびBamHI末端から
なる合成オリゴヌクレオチドに連結された。このオリゴ
ヌクレオチドは ATACATTTAAAGCTTG TGTAAATTTCGACCTAG である。0.8kbp EcoRI-AccI断片からなる、プレＳ−1/
プレＳ−2/S遺伝子の３′部分がこのベクターにクロー
ン化された（pUC19/DSD、第１図）。
確立された方法（ランダース他、ジヤーナル オブ ヴ
イロロジー（Landers etal.,Virology）23巻、368頁197
7年）により精製された。該ゲノムDNAはニツクの入つた
ギヤツプを有有する形でヴイリオン中に存在する（ルス
カ（Hruska）他、ジヤーナル オブ ヴイロロジー21
巻、666頁1977年）。このDNAを分子クローニング用に調
製する目的で、共有結合閉環二本鎖DNAを生産するため
に内在性ポリメラーゼ反応が利用された（ランダース
他、ジヤーナル オブ ヴイロロジー23巻、368頁、197
7年）。該DNAは、ドデシル硫酸ナトリウムおよびプロテ
イナーゼＫを含む緩衝液中でインキユベートした後フエ
ノール：クロロフオルム：イソアミル アルコール（2
5:24:1）による抽出およびエタノール沈殿による濃縮に
より除蛋白された。この精製DNAはEcoRIにより完全消化
された。E.コリ クローニング用ベクターpBR322もまた
EcoRIで消化され、消化されたHBV DNAと連結されE.コリ
に形質転換するのに用いられた。HBVゲノムを、完全な
プレＳ−1/プレＳ−2/Sコード領域を0.4kbpの５′ドメ
インと0.8kbpの３′ドメインに分ける唯一のEcoRI部位
のところで環状に入れ替わつた配向性で含む組換えプラ
スミド（pHBV/AYW−１、第１図）が単離された（ガリバ
ート（Galibert）他、ネイチヤー281巻、646頁1979
年）。これら二つのドメインは、全遺伝子の偶発的な再
会合の目的でサブクローンされた。pUC19はEcoRIおよび
BamHIで消化され、次いでコード領域の最後の５ヌクレ
オチド、停止コドン、HindIII部位およびBamHI末端から
なる合成オリゴヌクレオチドに連結された。このオリゴ
ヌクレオチドは ATACATTTAAAGCTTG TGTAAATTTCGACCTAG である。0.8kbp EcoRI-AccI断片からなる、プレＳ−1/
プレＳ−2/S遺伝子の３′部分がこのベクターにクロー
ン化された（pUC19/DSD、第１図）。
５′部分は、完全なORFが発現されるべきか、あるいは
推定上の疏水性シグナル領域（アミノ酸２−15）が除去
されるべきかにより、二つのどとらかの方法でpUC18中
にサブクローン化された。第一の戦略では、pUC18はHin
dIIIおよびEcoRIで消化され、末端ATG上流のBamHI部位
から10bpの非翻訳リーダー配列を経てHindIII対応末端
までの完全ORFを再構成する72bp合成オリゴヌクレオチ
ドに連結された。このオリゴヌクレオチドの構造は： （＊天然配列はＴではなくＣを含む；上の変更はコード
されるアミノ酸を変えることなくHinfI部位をなく
す。）第二の戦略では、72bpオリゴヌクレオチドと同一
の機能を持つがアミノ酸２−15のコード領域を失つた30
bpオリゴヌクレオチドが連結された。このオリゴヌクレ
オチドの構造は AGCTTACAAACAAATGGACCACCAGTTG ATGTTTGTTTACCTGGTGGTCAACCTAG である。
推定上の疏水性シグナル領域（アミノ酸２−15）が除去
されるべきかにより、二つのどとらかの方法でpUC18中
にサブクローン化された。第一の戦略では、pUC18はHin
dIIIおよびEcoRIで消化され、末端ATG上流のBamHI部位
から10bpの非翻訳リーダー配列を経てHindIII対応末端
までの完全ORFを再構成する72bp合成オリゴヌクレオチ
ドに連結された。このオリゴヌクレオチドの構造は： （＊天然配列はＴではなくＣを含む；上の変更はコード
されるアミノ酸を変えることなくHinfI部位をなく
す。）第二の戦略では、72bpオリゴヌクレオチドと同一
の機能を持つがアミノ酸２−15のコード領域を失つた30
bpオリゴヌクレオチドが連結された。このオリゴヌクレ
オチドの構造は AGCTTACAAACAAATGGACCACCAGTTG ATGTTTGTTTACCTGGTGGTCAACCTAG である。
５′ドメインの0.4kbp BamHI-EcoRI断片は次いで、これ
らオリゴヌクレオチド連結クローニング ベクター（pU
C18/USDΔ、pUC18/USDC、第１図）のどちらかに連結さ
れた。該５′pUC18および３′pUC19クローンは、E.コリ
ー中での増殖により増幅され、コード領域は単離された
プラスミドからHindIII-EcoRI断片として消化された。
これら断片は、連結され、HindIIIで消化され、HindIII
末端を有する完全ORFは、HindIIIで消化されたpUC13中
にクローン化された（pUC13/PSSΔ、pUC13/PSSC:第１
図）。このベクターからの完全ORFは、実施例２、３お
よび４に記載されているようなGAPDHまたはGAL10プロモ
ーター（YEp52）またはADH−２プロモーター発現系中に
クローン化するために、調製用アガロース ゲル電気泳
動により精製された。
らオリゴヌクレオチド連結クローニング ベクター（pU
C18/USDΔ、pUC18/USDC、第１図）のどちらかに連結さ
れた。該５′pUC18および３′pUC19クローンは、E.コリ
ー中での増殖により増幅され、コード領域は単離された
プラスミドからHindIII-EcoRI断片として消化された。
これら断片は、連結され、HindIIIで消化され、HindIII
末端を有する完全ORFは、HindIIIで消化されたpUC13中
にクローン化された（pUC13/PSSΔ、pUC13/PSSC:第１
図）。このベクターからの完全ORFは、実施例２、３お
よび４に記載されているようなGAPDHまたはGAL10プロモ
ーター（YEp52）またはADH−２プロモーター発現系中に
クローン化するために、調製用アガロース ゲル電気泳
動により精製された。
実施例２ S.セレビシエ中でプレＳ−1/プレＳ−2/Sの発現をさせ
るためのGAPDHプロモーターの利用 GAPDH発現カセツトを含むpBR322プラスミド（ホーラン
ドおよびホーランド、ジヤーナル オブ バイオロジカ
ル ケミストリー（Holland and Holland,J.Biol.Che
m.）255巻、2596頁1980年）は唯一のHindIIIクローニン
グ部位を有しており、そこにHindIII末端を持つ1.1kbp
プレＳ−1/プレＳ−2/S ORP（実施例１に記載）がクロ
ーン化された（pEGAP/PSSΔ、pEGAP/PSSC、第１図）。
該発現カセツト（HBV遺伝子含有）はプラスミドpBR322
よりSphI消化および調製用アガロースゲル電気泳動によ
り除かれた。該発現カセツトは次いで、前もつてSphIで
消化されていたシヤトルベクターpC1/1（ベクス（Begg
s）、ネイチヤー275巻、104頁1978年；ローゼンバーグ
他、ネイチヤー312巻、77頁1984年）中にクローン化さ
れたpYGAP/PSSΔ、pYGAP/PSSC、第１図）。発現カセツ
トを含む該pC1/1プラスミドが、S.セレビシエ2150−２
−３株を形質転換するのに用いられた；しかしながら、
形質転換混合物を平板に広げた後にほんの少数の安定な
組換え体酵母クローンが選択平板から回収された。プレ
−Ｓを含む物産のS.セレビシエに対する予想された毒性
は、プレ−S1/プレＳ−2/Sコード領域の除去およびBamH
I消化およびプラスミドの再連結によるフレームシフト
変異の創造により確認された；このようにして調製され
たDNAは効率よく酵母を形質転換した。
るためのGAPDHプロモーターの利用 GAPDH発現カセツトを含むpBR322プラスミド（ホーラン
ドおよびホーランド、ジヤーナル オブ バイオロジカ
ル ケミストリー（Holland and Holland,J.Biol.Che
m.）255巻、2596頁1980年）は唯一のHindIIIクローニン
グ部位を有しており、そこにHindIII末端を持つ1.1kbp
プレＳ−1/プレＳ−2/S ORP（実施例１に記載）がクロ
ーン化された（pEGAP/PSSΔ、pEGAP/PSSC、第１図）。
該発現カセツト（HBV遺伝子含有）はプラスミドpBR322
よりSphI消化および調製用アガロースゲル電気泳動によ
り除かれた。該発現カセツトは次いで、前もつてSphIで
消化されていたシヤトルベクターpC1/1（ベクス（Begg
s）、ネイチヤー275巻、104頁1978年；ローゼンバーグ
他、ネイチヤー312巻、77頁1984年）中にクローン化さ
れたpYGAP/PSSΔ、pYGAP/PSSC、第１図）。発現カセツ
トを含む該pC1/1プラスミドが、S.セレビシエ2150−２
−３株を形質転換するのに用いられた；しかしながら、
形質転換混合物を平板に広げた後にほんの少数の安定な
組換え体酵母クローンが選択平板から回収された。プレ
−Ｓを含む物産のS.セレビシエに対する予想された毒性
は、プレ−S1/プレＳ−2/Sコード領域の除去およびBamH
I消化およびプラスミドの再連結によるフレームシフト
変異の創造により確認された；このようにして調製され
たDNAは効率よく酵母を形質転換した。
実施例３ S.セレビシエ中でプレＳ−1/プレＳ−2/Sの発現をさせ
るためのGAL10プロモーターの利用 YEp52 E.コリ/S.セレビシエ シヤトルベクターは、唯
一のHindIII部位に挿入された異種遺伝子の発現を、ガ
ラクトースにより誘導可能なGAL10プロモーターから行
わせる（ブローチ（Broach）他、エクスペリメンタル
マニレーシヨン オブ ジーン エクスプレツシヨン中
（In Experimental Manipulation of Gene Expressio
n）、83頁、アカデミツク プレス1983年）。加えて、
このベクターは、S.セレビシエ中で増えるための部分的
な２μ環配列（oriおよび一つの逆繰り返し）、S.セレ
ビシエ中で選択するためのLEU2、およびE.コリ中でそれ
ぞれ増幅および選択するためのoriおよびbla配列を含
む。HindIII末端をもつ該1.1kbpプレＳ−1/プレＳ−2/S
ORF（実施例１記載）が唯一のHindIII部位にクローン
され（pYGAL/PSSΔ、pYGAL/PSSC、第１図）、できたプ
ラスミドはS.セレビシエBY-19株を形質転換するのに用
いられた。組換え体クローンが単離されpreS−1/プレＳ
−2/Sポリペプチドの発現に関して検討された。クロー
ンは合成選択（leu-）グリセロール−乳酸培地（0.67％
（w/v）酵母無アミノ酸窒素基、0.004％アデニン、0.00
4％ウラシル、１％琥珀酸、0.005％チロシン、0.002％
アルギニン、0.006％イソロイシン、0.004％リジン、0.
001％メチオニン、0.006％フエニルアラニン、0.006％
スレオニン、0.004％トリプトフアン、0.001％ヒスチジ
ン、0.6％水酸化ナトリウム、２％（v/v）乳酸、３％
（v/v）グリセロール）中で生育させられた。該遺伝子
産物の生産は、酵母がA600＝0.3にまで生育した後にガ
ラクトースを２％（w/v）まで添加することにより誘導
された。望みの抗原の発現はオーストリアR（アボツト
（AusriaR（Abbott））反応性の検出、重合ヒトアルブ
ミン結合活性（マチダ他、ガストロエンテロロジ−86巻
910頁1984年）および回復基ヒト血清と放射能標識した
スタフイロコカス アウレウス（Staphylococcus aureu
s）Ａ蛋白を用いて明らかにされたウエスタンブロツト
におけるp39の存在により確かめられた。これら組換え
体クローンは、実施例６に記載される大規模発酵および
単離のための種培養として使われた。
るためのGAL10プロモーターの利用 YEp52 E.コリ/S.セレビシエ シヤトルベクターは、唯
一のHindIII部位に挿入された異種遺伝子の発現を、ガ
ラクトースにより誘導可能なGAL10プロモーターから行
わせる（ブローチ（Broach）他、エクスペリメンタル
マニレーシヨン オブ ジーン エクスプレツシヨン中
（In Experimental Manipulation of Gene Expressio
n）、83頁、アカデミツク プレス1983年）。加えて、
このベクターは、S.セレビシエ中で増えるための部分的
な２μ環配列（oriおよび一つの逆繰り返し）、S.セレ
ビシエ中で選択するためのLEU2、およびE.コリ中でそれ
ぞれ増幅および選択するためのoriおよびbla配列を含
む。HindIII末端をもつ該1.1kbpプレＳ−1/プレＳ−2/S
ORF（実施例１記載）が唯一のHindIII部位にクローン
され（pYGAL/PSSΔ、pYGAL/PSSC、第１図）、できたプ
ラスミドはS.セレビシエBY-19株を形質転換するのに用
いられた。組換え体クローンが単離されpreS−1/プレＳ
−2/Sポリペプチドの発現に関して検討された。クロー
ンは合成選択（leu-）グリセロール−乳酸培地（0.67％
（w/v）酵母無アミノ酸窒素基、0.004％アデニン、0.00
4％ウラシル、１％琥珀酸、0.005％チロシン、0.002％
アルギニン、0.006％イソロイシン、0.004％リジン、0.
001％メチオニン、0.006％フエニルアラニン、0.006％
スレオニン、0.004％トリプトフアン、0.001％ヒスチジ
ン、0.6％水酸化ナトリウム、２％（v/v）乳酸、３％
（v/v）グリセロール）中で生育させられた。該遺伝子
産物の生産は、酵母がA600＝0.3にまで生育した後にガ
ラクトースを２％（w/v）まで添加することにより誘導
された。望みの抗原の発現はオーストリアR（アボツト
（AusriaR（Abbott））反応性の検出、重合ヒトアルブ
ミン結合活性（マチダ他、ガストロエンテロロジ−86巻
910頁1984年）および回復基ヒト血清と放射能標識した
スタフイロコカス アウレウス（Staphylococcus aureu
s）Ａ蛋白を用いて明らかにされたウエスタンブロツト
におけるp39の存在により確かめられた。これら組換え
体クローンは、実施例６に記載される大規模発酵および
単離のための種培養として使われた。
実施例４ S.セレビシエ中でのプレＳ−1/プレＳ−2/Sの発現をさ
せるためのADH2プロモーターの利用 pADH2Δ67（−１）E.コリ クローニングベクターは、
S.セレビシエ中で、唯一のHindIII部位に挿入された異
種遺伝子の発現をADH2脱抑制可能プロモーターからさせ
ることができる（ラツセル（Russell）他、ジヤーナル
オブ バイオロジカル ケミストリー258巻:2674頁19
83年；ヤングE.T.投稿中）。該唯一のHindIII部位は、
５′非翻訳隣接配列のヌクレオチド−１とADH2遺伝子の
転写終結部位との間に位置する。pADH2Δ67（−１）
は、BamHIおよびEcoRIで消化され、DNAポリメラーゼＩ
のクレノー断片で平滑末端化され、ADH2プロモーターと
終結部位を含む4.9kbp断片は調製用アガロースゲル電気
泳動により精製された。pUC7はPstIで消化され、T4 DNA
ポリメラーゼにより平滑末端化され、該4.9kbpADH2断片
に連結された。できたプラスミドはSalIで消化され、4.
9kbp断片は調製用アガロースゲル電気泳動により精製さ
れた。pUC18はHindIIIで消化され、DNAポリメラーゼＩ
のクレノー断片で平滑末端化され、自己連結された。で
きたプラスミドはSalIで消化され、4.9kbySalI断片に連
結されベクターpUC18ΔHindIII-ADH2（第１図）をつく
つた。HindIII末端をもつ二つの異なる1.1kbpプレＳ−1
/プレＳ−2/S ORF（実施例１で記載）は、このベクター
のHicdIII部位に連結された。できたプラスミド（pEADE
2/PSSΔ、pEADH2/PSSC、（第１図）はSalIで消化され、
6.1kbp断片はpC1/1のSalI部位中に連結されプラスミドp
YADH2/PSSΔ、pYADH2/PSSCをつくつた（第１図）。これ
ら組換え体プラスミドは、S.セレビシエ2150−２−３株
を形質転換するのに用いられた。組換え体クローンが単
離され、プレＳ−1/プレＳ−2/Sポリペプチドの発現に
ついて検討された。クローンは、0.3％（w/v）グルコー
スを含む合成選択（leu-）培地中に生育させられた。細
胞は30℃48時間でA600＝1.5まで生育させられ、その間
グルコース枯渇がADH2プロモーターを脱抑制した。そう
でない場合は、該クローンは炭素源として２％グルコー
スを含む合成選択（leu-）培地中に生育させられた。細
胞は30℃24時間でA600が0.1または1.0まで生育させら
れ、この時点で炭素源として1.6％グルコース（glycos
e）をふくむ複合培地の入つた大きなフラスコまたは発
酵槽に植菌された（植菌量＝10％vol/vol）。細胞はさ
らに45時間上述のようにA600＝12.0-14.0まで生育させ
られた。この間にグルコース枯渇がADH2プロモーターを
脱抑制していた。望みの抗原の発現はオーストリア
R（アボツト）反応性による検出、重合ヒトアルブミン
結合活性、および回復期ヒト血清と放射標識したスタフ
イロコカス アウレウスＡ蛋白を用いて明らかにされた
ウエスタンブロツトにおけるp39の存在により確かめら
れた。選択された組換え体クローンは、実施例７に記載
される大規模発酵および単離のための種培養として使わ
れた。
せるためのADH2プロモーターの利用 pADH2Δ67（−１）E.コリ クローニングベクターは、
S.セレビシエ中で、唯一のHindIII部位に挿入された異
種遺伝子の発現をADH2脱抑制可能プロモーターからさせ
ることができる（ラツセル（Russell）他、ジヤーナル
オブ バイオロジカル ケミストリー258巻:2674頁19
83年；ヤングE.T.投稿中）。該唯一のHindIII部位は、
５′非翻訳隣接配列のヌクレオチド−１とADH2遺伝子の
転写終結部位との間に位置する。pADH2Δ67（−１）
は、BamHIおよびEcoRIで消化され、DNAポリメラーゼＩ
のクレノー断片で平滑末端化され、ADH2プロモーターと
終結部位を含む4.9kbp断片は調製用アガロースゲル電気
泳動により精製された。pUC7はPstIで消化され、T4 DNA
ポリメラーゼにより平滑末端化され、該4.9kbpADH2断片
に連結された。できたプラスミドはSalIで消化され、4.
9kbp断片は調製用アガロースゲル電気泳動により精製さ
れた。pUC18はHindIIIで消化され、DNAポリメラーゼＩ
のクレノー断片で平滑末端化され、自己連結された。で
きたプラスミドはSalIで消化され、4.9kbySalI断片に連
結されベクターpUC18ΔHindIII-ADH2（第１図）をつく
つた。HindIII末端をもつ二つの異なる1.1kbpプレＳ−1
/プレＳ−2/S ORF（実施例１で記載）は、このベクター
のHicdIII部位に連結された。できたプラスミド（pEADE
2/PSSΔ、pEADH2/PSSC、（第１図）はSalIで消化され、
6.1kbp断片はpC1/1のSalI部位中に連結されプラスミドp
YADH2/PSSΔ、pYADH2/PSSCをつくつた（第１図）。これ
ら組換え体プラスミドは、S.セレビシエ2150−２−３株
を形質転換するのに用いられた。組換え体クローンが単
離され、プレＳ−1/プレＳ−2/Sポリペプチドの発現に
ついて検討された。クローンは、0.3％（w/v）グルコー
スを含む合成選択（leu-）培地中に生育させられた。細
胞は30℃48時間でA600＝1.5まで生育させられ、その間
グルコース枯渇がADH2プロモーターを脱抑制した。そう
でない場合は、該クローンは炭素源として２％グルコー
スを含む合成選択（leu-）培地中に生育させられた。細
胞は30℃24時間でA600が0.1または1.0まで生育させら
れ、この時点で炭素源として1.6％グルコース（glycos
e）をふくむ複合培地の入つた大きなフラスコまたは発
酵槽に植菌された（植菌量＝10％vol/vol）。細胞はさ
らに45時間上述のようにA600＝12.0-14.0まで生育させ
られた。この間にグルコース枯渇がADH2プロモーターを
脱抑制していた。望みの抗原の発現はオーストリア
R（アボツト）反応性による検出、重合ヒトアルブミン
結合活性、および回復期ヒト血清と放射標識したスタフ
イロコカス アウレウスＡ蛋白を用いて明らかにされた
ウエスタンブロツトにおけるp39の存在により確かめら
れた。選択された組換え体クローンは、実施例７に記載
される大規模発酵および単離のための種培養として使わ
れた。
実施例５ S.セレビシエ中でのプレＳ−1/プレＳ−２の発現をさせ
るアルフア接合因子プロモーターおよびプレ−プロ−リ
ーダーの利用 アルフア接合因子遺伝子MFα１がS.セレビシエ ゲノム
DNAからのプラスミドベクター上にクローンされていた
（カージヤン（Kurjan）他、セル30巻:933頁1982年；シ
ン他、ヌクレイツク アシツド リサーチ11巻:4049頁1
983年）。できたプラスミドpKH2はEcoRIで消化され、ア
ルフア接合因子遺伝子を保持する1.7kbp断片が調製用ア
ガロースゲル電気泳動により精製された。プラスミドpR
J148（HindIII部位を欠いた修飾pBR322）がEcoRIで消化
され、該1.7kbp断片と連結されプラスミドpRJ159を生成
した。このDHAは、HindIIIで消化され自己連結されプラ
スミドpRJ167を形成した。このプラスミドはこれで唯一
のHindIII部位を有する。プラスミドpRJ167はHindIIIで
消化され、３種の読み取り枠の全てにおいてプロモータ
ーおよびプレ−プロ−リーダーの３′側および翻訳終結
シグナルの５′側に唯一のHindIII部位を含む、新たな
プラスミド（pRJ178）を生成するように、合成オリゴヌ
クレオチドの挿入により修飾された（第２図）。該Hind
III部位は、HindIIIによる消化、DNAポリメラーゼＩの
クレノー断片による平滑末端化、BamHIリンカーの付加
および自己連結によりBamHI部位に変換されプラスミドp
JC193を形成した。このプラスミドはEcoRIで消化、DNA
ポリメラーゼＩのクレノー断片による平滑末端化、BclI
リンカーの付加による修飾、BelIでの消化をうけ、アル
フア接合因子遺伝子を保持する1.5kbp断片が調製用ゲル
電子泳動により単離された。この1.5kbp断片（BclI断
片）は子牛腸アルカリ性フオスフアターゼで処理されpC
1/1の唯一のBamHI部位に挿入された。この過程で本来あ
るBamHI部位が破壊された（プラスミドpJC194）。このD
NAは過剰のBamHIリンカーを除くためにBamHIで消化され
自己連結され、新たなアルフア接合因子発現プラスミド
pJC197となつた（第３図）。pUC13/PSSCプラスミド（実
施例１に記載）がHicfIおよびAvaIIで消化され、0.45kb
pのORFが調製用アガロースゲル電気泳動により精製され
た（第４図）。pUC18がSalIおよびBamHIで消化され、次
いで２合成オリゴヌクレオチドと連結された。該５′オ
リゴヌクレオチドは、SalI末端、HindIII部位、KEX2開
裂部位をコードするヌクレオチド、プレＳ−１のアミノ
酸２および３をコードするヌクレオチド、およびHinfI
末からなる。このオリゴヌクレオチドの構造は TCGACAAGCTTGGATAAGAGAGGGCAG GTTCGAACCTATTCTCTCCCGTCTTA である。該３′オリゴヌクレオチドは、AvaI部位、プレ
Ｓ−２の最後の８アミノ酸をコードするヌクレオチド、
停止コドン、HindIII部位、およびBamHI末を含む。この
オリゴヌクレオチドの構造は TCGAGGATTGGGGACCCTGCGCTGAACTAAAGCTTG CCTAACCCCTGGGACGCGACTTGATTTCGAACCTAG である。該0.5kbp ORFがこのオリゴヌクレオチド連結pU
C18ベクター中にクローン化された（第４図）。できた
ベクターはHindIIIで消化され、DNAポリメラーゼＩのKl
enow断片により平滑末端化された。結果的にプレS1/プ
レS2 ORFとなる該0.5kbpプレＳ−1/（pydMF/PSS第４
図）が機能するようにアルフア接合因子プレプロ−リー
ダーに連結した。プレＳ−2 ORFは、調製用アガロース
ゲル電気泳動により精製され、BamHIで消化されDNAポリ
メラーゼＩのクレノー断片により平滑末端化されたpJC1
97中にクローン化され（pYαMF/PSΔＳ、第４図）、機
能するようにアルフア因子プレ−プロ−リーダーに連結
したプレS1/プレS2 ORFとなつた。
るアルフア接合因子プロモーターおよびプレ−プロ−リ
ーダーの利用 アルフア接合因子遺伝子MFα１がS.セレビシエ ゲノム
DNAからのプラスミドベクター上にクローンされていた
（カージヤン（Kurjan）他、セル30巻:933頁1982年；シ
ン他、ヌクレイツク アシツド リサーチ11巻:4049頁1
983年）。できたプラスミドpKH2はEcoRIで消化され、ア
ルフア接合因子遺伝子を保持する1.7kbp断片が調製用ア
ガロースゲル電気泳動により精製された。プラスミドpR
J148（HindIII部位を欠いた修飾pBR322）がEcoRIで消化
され、該1.7kbp断片と連結されプラスミドpRJ159を生成
した。このDHAは、HindIIIで消化され自己連結されプラ
スミドpRJ167を形成した。このプラスミドはこれで唯一
のHindIII部位を有する。プラスミドpRJ167はHindIIIで
消化され、３種の読み取り枠の全てにおいてプロモータ
ーおよびプレ−プロ−リーダーの３′側および翻訳終結
シグナルの５′側に唯一のHindIII部位を含む、新たな
プラスミド（pRJ178）を生成するように、合成オリゴヌ
クレオチドの挿入により修飾された（第２図）。該Hind
III部位は、HindIIIによる消化、DNAポリメラーゼＩの
クレノー断片による平滑末端化、BamHIリンカーの付加
および自己連結によりBamHI部位に変換されプラスミドp
JC193を形成した。このプラスミドはEcoRIで消化、DNA
ポリメラーゼＩのクレノー断片による平滑末端化、BclI
リンカーの付加による修飾、BelIでの消化をうけ、アル
フア接合因子遺伝子を保持する1.5kbp断片が調製用ゲル
電子泳動により単離された。この1.5kbp断片（BclI断
片）は子牛腸アルカリ性フオスフアターゼで処理されpC
1/1の唯一のBamHI部位に挿入された。この過程で本来あ
るBamHI部位が破壊された（プラスミドpJC194）。このD
NAは過剰のBamHIリンカーを除くためにBamHIで消化され
自己連結され、新たなアルフア接合因子発現プラスミド
pJC197となつた（第３図）。pUC13/PSSCプラスミド（実
施例１に記載）がHicfIおよびAvaIIで消化され、0.45kb
pのORFが調製用アガロースゲル電気泳動により精製され
た（第４図）。pUC18がSalIおよびBamHIで消化され、次
いで２合成オリゴヌクレオチドと連結された。該５′オ
リゴヌクレオチドは、SalI末端、HindIII部位、KEX2開
裂部位をコードするヌクレオチド、プレＳ−１のアミノ
酸２および３をコードするヌクレオチド、およびHinfI
末からなる。このオリゴヌクレオチドの構造は TCGACAAGCTTGGATAAGAGAGGGCAG GTTCGAACCTATTCTCTCCCGTCTTA である。該３′オリゴヌクレオチドは、AvaI部位、プレ
Ｓ−２の最後の８アミノ酸をコードするヌクレオチド、
停止コドン、HindIII部位、およびBamHI末を含む。この
オリゴヌクレオチドの構造は TCGAGGATTGGGGACCCTGCGCTGAACTAAAGCTTG CCTAACCCCTGGGACGCGACTTGATTTCGAACCTAG である。該0.5kbp ORFがこのオリゴヌクレオチド連結pU
C18ベクター中にクローン化された（第４図）。できた
ベクターはHindIIIで消化され、DNAポリメラーゼＩのKl
enow断片により平滑末端化された。結果的にプレS1/プ
レS2 ORFとなる該0.5kbpプレＳ−1/（pydMF/PSS第４
図）が機能するようにアルフア接合因子プレプロ−リー
ダーに連結した。プレＳ−2 ORFは、調製用アガロース
ゲル電気泳動により精製され、BamHIで消化されDNAポリ
メラーゼＩのクレノー断片により平滑末端化されたpJC1
97中にクローン化され（pYαMF/PSΔＳ、第４図）、機
能するようにアルフア因子プレ−プロ−リーダーに連結
したプレS1/プレS2 ORFとなつた。
アルフア接合因子プロモーターは表現型がαである細胞
内でのみ活性である（ブレイク他、モレキユラー アン
ド セルラー バイオロジー（Brake etal.,Mol.Cell B
iol.）３巻:1440頁1983年）。S.セレビシエには、他の
通常発現していないａおよびα情報のコピーの抑制に必
要な蛋白を合成するSIRとして知られる４座位がある
（ライン他、ジエネチツクス（Rine etal.,Genetics）9
3巻:877頁1979年）。JRY188株細胞（MATα、sir3−８、
leu2−３、leu2-112、trp1、ura3-52、his4）は、SIR3
遺伝子産物中に温度感受性欠損を含む。結果として、35
℃で生育したJRY188細胞は表現型がa/αであり、アルフ
ア接合因子プロモーターは活性でない；他方、23℃で生
育した細胞は表現型がαであり従つてアルフア接合因子
プロモーターにより指示される発現を誘導することが出
来る（ブレイク他、プロシーヂングス オブ ザ ナシ
ヨナル アカデミー オブ サイエンス（Brake etal.,
Proc.Natl.Acad.Sci.）USA 81巻;4642頁1984年）。該組
換え体プレＳ−1/プレＳ−２−保持アルフア接合因子プ
ラスミドがS.セレビシエ株JRY188を形質転換するのに用
いられ、形質転換されたクローンが選択された。細胞は
合成選択（leu-）培地中で37℃で生育させられた；その
後、A600＝0.5の細胞は同じ培地で23℃で生育させられ
た。溶菌液が調製され、SDS-PAGFで解析され、ニトロセ
ルロースにウエスタンブロツトされた。p21産物が、形
質転換株にのみ存在することおよび回復期ヒトHB血清と
の反応性の点でプレＳ−1/プレＳ−２に選択的であるこ
とが見いだされた。
内でのみ活性である（ブレイク他、モレキユラー アン
ド セルラー バイオロジー（Brake etal.,Mol.Cell B
iol.）３巻:1440頁1983年）。S.セレビシエには、他の
通常発現していないａおよびα情報のコピーの抑制に必
要な蛋白を合成するSIRとして知られる４座位がある
（ライン他、ジエネチツクス（Rine etal.,Genetics）9
3巻:877頁1979年）。JRY188株細胞（MATα、sir3−８、
leu2−３、leu2-112、trp1、ura3-52、his4）は、SIR3
遺伝子産物中に温度感受性欠損を含む。結果として、35
℃で生育したJRY188細胞は表現型がa/αであり、アルフ
ア接合因子プロモーターは活性でない；他方、23℃で生
育した細胞は表現型がαであり従つてアルフア接合因子
プロモーターにより指示される発現を誘導することが出
来る（ブレイク他、プロシーヂングス オブ ザ ナシ
ヨナル アカデミー オブ サイエンス（Brake etal.,
Proc.Natl.Acad.Sci.）USA 81巻;4642頁1984年）。該組
換え体プレＳ−1/プレＳ−２−保持アルフア接合因子プ
ラスミドがS.セレビシエ株JRY188を形質転換するのに用
いられ、形質転換されたクローンが選択された。細胞は
合成選択（leu-）培地中で37℃で生育させられた；その
後、A600＝0.5の細胞は同じ培地で23℃で生育させられ
た。溶菌液が調製され、SDS-PAGFで解析され、ニトロセ
ルロースにウエスタンブロツトされた。p21産物が、形
質転換株にのみ存在することおよび回復期ヒトHB血清と
の反応性の点でプレＳ−1/プレＳ−２に選択的であるこ
とが見いだされた。
実施例６ 免疫アフイニチー クロマトグラフイー法によるプレＳ
−1/プレＳ−2/Sの粒状での精製 実施例３で記載されたように構築された組換え体S.セレ
ビシエ（アミノ酸２−15を含む完全プレＳ配列）が、実
施例３で記載されたように配合した9.0リツトルの合成
選択グリセロール−乳酸培地を充填した16リツトルのニ
ユー ブルンスウイツク サイエンチフイツク発酵槽中
で生育させられた。発酵条件は、250rpm攪拌、2.5リツ
トル エア／分30℃であつた。A660＝0.25にまで生育の
後、産物の合成がガラクトース（２％（w/v））の添加
により誘導され、発酵はさらに33時間最終A660＝2.40ま
で続けられた。該酵母細胞はアミコンDC-10ユニツト中
でミクロろ過により集菌され、30mlのバツフアーＡ（0.
1M Na2HPO4、pH7.2、0.5M NaCl）に懸濁され、スタンス
テツド圧力容器中で平方インチあたり75-85ポンドで７
回通過させることにより破壊された。該破壊細胞懸濁液
（31gm湿細胞重量）は、120mlのバツフアーＡで希釈さ
れ、トリトン（Triton）Ｘ−100 が終濃度0.5％（w/
v）になるように添加され、10,000xg20分間４℃の遠心
により清澄化された。該清澄化した培養液は注がれ、抗
原が樹脂上に吸着するように19時間４℃でHBaAgに対す
る抗体を結合させたセフアロース4B（マクアリア（Mc A
leer）他、ネイチヤー307巻:178頁1978年）とインキユ
ベートされた。インキユベーシヨン期間の後、スラリー
は以後の全段階のために室温まで暖められ真空下で15分
間脱気された。脱気されたスラリーは、2.5x40cmカラム
中へ注がれた。カラムが一杯まで充填されたら、結合し
ていない蛋白はバツフアーＡで洗い出された。該抗原は
バツフアーＡ中の3M KSCNで溶出された。抗原を含む分
画は、４℃で0.007M Na2HPO4、pH7.2、0.15M NaClに対
して透析され、20ml中に1.08mgの蛋白を含む透析アフイ
ニチー プール（Dialysed Affinity Pool）を形成する
ように貯められた,16mlの透析アフイニチー プール
は、5.6mlの0.006M Na2HPO4、pH7.2、0.15M NaClで40mc
g/mlに希釈された。該産物はMillex-GV0.22μｍ膜を通
すろ過により除菌された。透析アフイニチー プール中
の産物の正体は、オースリアR反応性によるHBsAgの検出
および重合ヒトアルブミン結合活性により確認された。
−1/プレＳ−2/Sの粒状での精製 実施例３で記載されたように構築された組換え体S.セレ
ビシエ（アミノ酸２−15を含む完全プレＳ配列）が、実
施例３で記載されたように配合した9.0リツトルの合成
選択グリセロール−乳酸培地を充填した16リツトルのニ
ユー ブルンスウイツク サイエンチフイツク発酵槽中
で生育させられた。発酵条件は、250rpm攪拌、2.5リツ
トル エア／分30℃であつた。A660＝0.25にまで生育の
後、産物の合成がガラクトース（２％（w/v））の添加
により誘導され、発酵はさらに33時間最終A660＝2.40ま
で続けられた。該酵母細胞はアミコンDC-10ユニツト中
でミクロろ過により集菌され、30mlのバツフアーＡ（0.
1M Na2HPO4、pH7.2、0.5M NaCl）に懸濁され、スタンス
テツド圧力容器中で平方インチあたり75-85ポンドで７
回通過させることにより破壊された。該破壊細胞懸濁液
（31gm湿細胞重量）は、120mlのバツフアーＡで希釈さ
れ、トリトン（Triton）Ｘ−100 が終濃度0.5％（w/
v）になるように添加され、10,000xg20分間４℃の遠心
により清澄化された。該清澄化した培養液は注がれ、抗
原が樹脂上に吸着するように19時間４℃でHBaAgに対す
る抗体を結合させたセフアロース4B（マクアリア（Mc A
leer）他、ネイチヤー307巻:178頁1978年）とインキユ
ベートされた。インキユベーシヨン期間の後、スラリー
は以後の全段階のために室温まで暖められ真空下で15分
間脱気された。脱気されたスラリーは、2.5x40cmカラム
中へ注がれた。カラムが一杯まで充填されたら、結合し
ていない蛋白はバツフアーＡで洗い出された。該抗原は
バツフアーＡ中の3M KSCNで溶出された。抗原を含む分
画は、４℃で0.007M Na2HPO4、pH7.2、0.15M NaClに対
して透析され、20ml中に1.08mgの蛋白を含む透析アフイ
ニチー プール（Dialysed Affinity Pool）を形成する
ように貯められた,16mlの透析アフイニチー プール
は、5.6mlの0.006M Na2HPO4、pH7.2、0.15M NaClで40mc
g/mlに希釈された。該産物はMillex-GV0.22μｍ膜を通
すろ過により除菌された。透析アフイニチー プール中
の産物の正体は、オースリアR反応性によるHBsAgの検出
および重合ヒトアルブミン結合活性により確認された。
実施例７ 免疫アフイニチー クロマトグラフイー法によるプレＳ
−1/プレＳ−2/Sの粒状での精製 実施例４で記載されたように構築された組換え体S.セレ
ビシエ（アミノ酸２−15を含む完全プレＳ）がハイソイ
（アンバー）（Hysoy（amber））をもつてペプトンに替
えたことを除き記載（メソツド イン イースト ジエ
ネチツクス（Methods in Yeast Genetics）61頁コール
ド スプリング ハーバー ラボラトリー、コールド
スプリング ハーバー、ニユーヨーク中のYPD）された
ように作られた9.0リツトルの複合培地の充填された16
リツトルのニユー ブルンスウイツク サイエンチフイ
ツク発酵槽内で生育させられた。発酵条件は、A600＝0.
65からA600＝9.50まで500rpm攪拌、5.0リツトル エア
ー／分30℃44時間であつた。該酵母細胞は集菌され溶菌
され、プレＳ−1/プレＳ−2/S産物は実施例６に記載さ
れたように精製された。産物の正体は、（オースリ
ア ）反応性によるHBsAgの検出、重合ヒトアルブミン
結合活性、そして回復期ヒト血清および放射能標識した
スタフイロコカス アウレウスＡ蛋白を用いて示された
ウエスタンブロツトでのp39の存在により確認された。
−1/プレＳ−2/Sの粒状での精製 実施例４で記載されたように構築された組換え体S.セレ
ビシエ（アミノ酸２−15を含む完全プレＳ）がハイソイ
（アンバー）（Hysoy（amber））をもつてペプトンに替
えたことを除き記載（メソツド イン イースト ジエ
ネチツクス（Methods in Yeast Genetics）61頁コール
ド スプリング ハーバー ラボラトリー、コールド
スプリング ハーバー、ニユーヨーク中のYPD）された
ように作られた9.0リツトルの複合培地の充填された16
リツトルのニユー ブルンスウイツク サイエンチフイ
ツク発酵槽内で生育させられた。発酵条件は、A600＝0.
65からA600＝9.50まで500rpm攪拌、5.0リツトル エア
ー／分30℃44時間であつた。該酵母細胞は集菌され溶菌
され、プレＳ−1/プレＳ−2/S産物は実施例６に記載さ
れたように精製された。産物の正体は、（オースリ
ア ）反応性によるHBsAgの検出、重合ヒトアルブミン
結合活性、そして回復期ヒト血清および放射能標識した
スタフイロコカス アウレウスＡ蛋白を用いて示された
ウエスタンブロツトでのp39の存在により確認された。
第１図Ａ、Ｂ及びＣはプラスミドpYGAP/PSSΔ、pYGAP/P
SSC、pYGAL/PSSΔ、pYGAL/PSSC、pYADH2/PSSΔ、pYADH2
/PSSC、およびpUC13/PSSCの構築を模式的に説明した図
である。 第２図及び第３図は、α−接合因子ベクターpJC197の構
築を模式的に説明した図である。 第４図Ａ及びＢはプラスミドpYαMF/PSΔＳの構築を模
式的に説明した図である。
SSC、pYGAL/PSSΔ、pYGAL/PSSC、pYADH2/PSSΔ、pYADH2
/PSSC、およびpUC13/PSSCの構築を模式的に説明した図
である。 第２図及び第３図は、α−接合因子ベクターpJC197の構
築を模式的に説明した図である。 第４図Ａ及びＢはプラスミドpYαMF/PSΔＳの構築を模
式的に説明した図である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:85） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:645） (72)発明者 ピーター ジエー．ニスカーン アメリカ合衆国，19446 ペンシルヴアニ ア，ランスデール，パターソン ドライヴ 841 (56)参考文献 特開 昭58−77823（ＪＰ，Ａ) 特開 昭59−74985（ＪＰ，Ａ)
Claims (6)
- 【請求項１】２−15位のアミノ酸を欠いたpreS1ドメイ
ンとpreS2ドメインおよびＳドメインとからなる、組換
えＢ型肝炎ウイルス（HBV）ポリペプチド。 - 【請求項２】他のHBVポリペプチドを含まない特許請求
の範囲第１項記載のポリペプチド。 - 【請求項３】（１） ２−15位のアミノ酸を欠いたpreS
1ドメインとpreS2ドメインおよびＳドメインとからな
る、Ｂ型肝炎ウイルス（HBV）ポリペプチドをコードす
るDNA部分、サッカロミセスまたはクリプトコッカス科
に属する酵母種内でのプラスミドの選択ならびに増幅に
必要な酵母由来の配列、酵母プロモーター、酵母転写終
結配列を含むプラスミド発現ベクターでサッカロミセス
またはクリプトコッカス科から選択された酵母株を形質
転換し、 （２） 形質転換細胞を培養し、 （３） 得られた培養細胞または生育培地からポリペプ
チドを回収する、 ことからなる２−15位のアミノ酸を欠いたpreS1ドメイ
ンとpreS2ドメインおよびＳドメインとからなる、組換
えHBVポリペプチドを得る方法。 - 【請求項４】ポリペプチドが他のHBVポリペプチドを含
まない特許請求の範囲第３項記載の方法。 - 【請求項５】酵母プロモーターがGAL10、ADH2またはα
接合因子である特許請求の範囲第３項記載の方法。 - 【請求項６】得られるポリペプチドが球状である特許請
求の範囲第３項記載の方法。
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