JPS62208288A - 酵母内でｂ型肝炎ウイルス蛋白を生産する方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 Ｂ型肝炎ウィルスは数種のヒト肝臓疾患の原因となる感
染因子である。ＨＢＶの感染した多くの個体は疾患の急
性期を経て快復する。

しかしながら多数の個体でその感染を除去することが出
来ず、それにより該感染の慢性保持者となる。ＨＢＶ感
染は世界の多くの部位において特有のものであシ、慢性
的に感染している母体からその新生児に高頻度で周産期
感染が生じる。世界中の慢性保持者は３億Å以上と算定
されている。この保持者群から慢性Ｂ型肝炎の長期間の
結末〔肝硬変または肝細胞癌〕として年間数十刃が死亡
している。

ＨＢヴイリオンは２群の溝造蛋白、コア蛋白および外殻
または表層（ｌｌｓ＃）蛋白がらなっている。ヴイリオ
ンすなわちゾーン粒子の主要表層蛋白であるのに加えて
、該１８′蛋白はオーストラリア（Ａｕ５ｔｒａｌｉ逸
）抗原、または２２　ｎｍ　粒子の唯一の構成成分であ
る。

該％　Ｓ　ｌ蛋白は血清型によシ３８９−４００アミノ
酸をコードする大開放読み取シ枠〔０ＲＦ）の翻訳産物
である。このＯＲＦは３つのドメインに画されておりそ
の各々は生体内において翻訳開始部位として機能しうる
ＡＴＧコドンで始まっている。これらドメインは遺伝子
中でのそれら相互のＳ　／　　−３７順でプレＳ−１（
１０８−１１９アミノ酸）、プレＳ−２（５５アミノ酸
）、および５（２２６アミノ酸）と表示される。このＯ
ＲＦから由来する６種の産物は以下の組成を有する＝１
）ｇｐ４２（４乳０００ダルトン糖蛋白）＝プレＳ−１
／プレＳ−２／Ｓ（プレＳ−１、プレＳ−２に隣接、Ｓ
に隣接を意味する）２）ｐ３９（ｐ−蛋白）＝プレＳ−
１／プレＳ−２／Ｓ ３）ｇｐ３６−プレＳ−２／Ｓ（２つの糖付加部位） ４）ｇｐ３３＝プレＳ−２／ｓ（ｔつの糖付加部位） ５）ｇｐ　　２７＝Ｓ（１つの糖付加部位〕６）ｐ２４
−８ 全６種の蛋白はゾーン粒子内で等分子量存在する。２２
　ｎｍ　粒子内では４種のより低分子の蛋白がほぼ等分
子量存在するがｇｐ４２およびｐ３９は粒子あたり多く
て１あるいは数分子存在する。

該２２　ｎｍ　粒子あるいはＨ８表層抗原（ＨＢｓＡｇ
）は、慢性保持者の血漿から精製されている。これらの
血漿が粒子−陽性であることによシ、これら慢性保持者
はＨＢｓ”と表示される。これら保持者が充分な免疫反
応を起こすと感染を除くことができＨＢｓ−となる。彼
らがＨＢｓに対する抗体を形成することによシこれら個
体は抗−ＨＢｓ＋と表される。このようにして抗−ＨＢ
　ｓ＋は疾病からの快復と関連している。従って、ＨＢ
ワクチンによる抗−ＨＢ８＋の促進または形成がＨＢＶ
感染に対する保護をもたらすことが期待される。

この仮説は実験的に検討可能である。ヒト以外では、Ｈ
Ｂｓ＋、肝臓酵素の血清中量の上昇などのような定量可
能な指標に反映されるように、チンパンジーがＨＢＶ感
染に完全に感受性をもつ唯一の種である。チンパンジー
が３投与量の精ＮＨＢｓＡｇ粒子でワクチン処理されつ
いで多量の感染性ＨＢｖを投与された。偽−ワクチン処
理された動物は急性ＨＢＶ感染の兆候を示したが、ＨＢ
ｓＡｇ−ワクチン処理動物は感染の如何なる兆候からも
完全に保護された。従ってこの実験系においてはｇｐ２
７およびｐ２４（Ｓドメインのみ）からなるＨ　Ｂ　ｓ
　Ａ　ｇ粒子は保護免疫を誘導するのπ十分であった。

これら観察に勇気ずけられて、いくつかの製造業者がＨ
ＢａＡｇ粒子からなるＨＢワクチンを生産した。

最近のデータは、プレＳ−１およびプレＳ−２ドメイン
がＨＢＶ感染に対する免疫において重要な役割を演じて
いることを示唆している。プレＳ−１に対する抗体（プ
レＳ−１のアミノ酸残基１０−３２からなるペプチドに
よる免疫によって引き出された）およびプレＳ−２に対
する抗体（プレＳ−２のアミノ酸残基１−２６からなる
ペプチドによる免疫によって引き出された）の両者は試
験管内においてＨＢＶのヒト肝臓癌細胞への結合を阻止
することが出来る；抗−ＨＢｓ（プレＳ−１またはプレ
Ｓ−Ｚを欠（ＨＢｓＡｇでワクチン処理された患者から
の血清）はこの阻止現象をもたらすことが出来ない。も
しこの試験管内の現象が生体内感染を映すものならプレ
ーＳ（すなわちプレＳ−１およびプレＳ−２が全体とし
てたがいに結合している）ドメインがＨＢＶの肝細胞受
容体への結合部位を代表しておシ、抗−プレーＳがＨＢ
Ｖ結合及び感染の開始を阻止するであろう。さらに、抗
−フレーＳの力価が急性ＨＢＶ感染かラノ快復期に上昇
することが見いだされており、これら抗体の快復におけ
る役割を示している。

最後に、チンパンジーを１０８アミノ酸プレーＳポリペ
プチド（プレＳ−２の１−１６と隣接するプレＳ−１の
残基２７−１１９）でワクチン処理すると、ＨＢＶ投与
に対しある程度の保護をもたらすことができることが示
されている。まとめると、これら実験的観察はプレーＳ
ドメインが現在のＨＢワクチンに対する有用な追加物で
あることを示唆している。

ＨＢワクチンの入手可能な供給量を増大するためて製造
業者は％　Ｓｌ蛋白の発現をもたらす組換えＤＮＡ技術
を指向した。微生物系において、多くの組換え由来蛋白
の発現のためにニジエリシア　コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉａ
ｈｉａｃｏｌｉ　）　　およびサツカロミセス　セレビ
シェ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉ
ａｅ　）　　がもっとも一般に用いられてきた。Ｅ、コ
リにおいて免疫学的に活発なＨＢｓＡｇ粒子を発現させ
る多くの試みは不成功であった。しかしながら、Ｓ、セ
レビシェは免疫学的に活発なＨＢｓＡｇ粒子を発現する
能力に大変優れていることが示された。これら粒子は、
ワクチンに剤形されると、生ＨＢＶによる挑戦に対しチ
ンパンジーを完全に保護することが出来ることを示した
。更に、酵母−由来ＨＢ　ｓ　Ａｇはヒト臨床試験にお
いて血漿−由来ＨＢｓＡｇと免疫学的に同程度有効であ
った。従って、Ｓ。

セレビシェの組換えＨＢ　ｓ　Ａｇの合成を指示するた
めの宿主としての有用性は確立された。

この背景のもとに、Ｓドメインと連結した全プレーＳド
メインを免疫粒子として発現することは望ましいであろ
う。

鍾々の組換え微生物発現系において、多くの異なるポリ
ペプチドの合成が宿主細胞に有害であることが示された
。結果として、そのようなポリペプチドの発現に反対す
る選択圧がかかシ、そのような組換え体培養の大規模化
において異種ポリペプチドを発現しなくなったか、該ポ
リペプチドの供給源として経済的に成シ立たないくらい
の少量しか発現しないような細胞のみが集積するように
なる。ある場合には、有害効果が余りに強くて、発現が
強力な構成定なプロモーターによシ動かされたときには
、新たに形質転換された細胞が、選択培地において増殖
し集落を形成することができなくなる。これらの有害効
果はそのようなポリペプチドの合成を指示する誘導可能
なプロモーターを用いることにより乗り越えることが出
来る。Ｓ、セレビシェには多くの誘導可能な遺伝子があ
る。３種のよく特性付けされた誘導可能な系はガラクト
ース（ＧＡＬ）利用遺伝子、アルコール　デヒドロゲナ
ーゼ２（ＡＤＨ２）遺伝子、およびアルファ接合因子遺
伝子である。

Ｓ、セレビシェは、生育のための炭素源としてガラクト
ースを利用するために必要な酵素をコードする３遺伝子
を有する。ＧＡＬ　１、ＧＡＬ７およびＧＡＬＩＯ遺伝
子は各々ガラクトキナーゼ、α−Ｄ−ガラクトースー１
−燐酸　ウリジルトランスフェラーゼおよびウリヂン　
ジフオスフオガラクトースー４−エピメラーゼをコード
する。ガラクトースのないときにはこれら酵素の非常に
僅かな発現が認められる。

細胞がグルコース上で生育され、次いで培養にガラクト
ースが添加されるとこれら３種の酵素はＲＮＡ転写の段
階において同等に少なくとも１．０００倍誘導される。

該ＧＡＬ１およびＧＡＬＩＯ遺伝子は分子としてクロー
ンされ配列決定された。

各々のコード領域の５′側にある制御及びプロモーター
配列が１ａｃＺ遺伝子のコート領如近傍におかれた。こ
れら実験は、ガラクトース誘導に必要十分なプロモータ
ーおよび制御配列を明らかにした。

Ｓ、セレビシェは、各々ＡＤＨのフイソザイムをコード
する３遺伝子も有する。これら酵素の一つＡＤＨＩＩは
Ｓ、セレビシェが酸化的生育のあいだにエタノールを炭
素源として利用するのに働いている。ＡＤＨＩＩアイン
ザイムをコードするＡＤＨ２遺伝子の発現はグルコース
によシカタボライト抑制を受けその結果グルコース量が
ｏ、　ｒ　％存在すると発酵生育のあいだＡＤＨ２遺伝
子の転写は事実上ない。グルコースを除去し、非抑制炭
素源が存在するとＡ　Ｄ　Ｈ２遺伝子の転写は１００か
ら１０００倍誘導される。この遺伝子は分子としてクロ
ーンされ配列決定されておシ、転写の抑制解除に必要十
分な該制御およびプロモーター配列が明らかにされてい
る。

アルファ接合因子はＭＡＴαおよびＭＡＴａＮＪＪ胞の
あいだの接合に要求されるＳ、セレビシェの性フェロモ
ンである。このトリデカペプチドは粗面小胞体中に移行
し、糖付加され蛋白分解を受けて細胞から分泌される最
終成熟型疋プロセスされるプレプロフェロモンとして発
現される。この生化学的な過程は異種蛋白の発現戦略と
して利用された。該アルファ接合因子遺伝子は分子的に
クローンされそのプロモーターはプレプロリーダー配列
と共に種々のポリペプチドの発現及び分泌に利用されて
きた。その粗面小胞体からゴルジ器官への横断から期待
されるように異ｓ１蛋白はＮ−および〇−結結合付付加
反応受ける。該アルファー接合因子プロモーターは表現
形質が　である細胞内でのみ活性である。Ｓ、セレビシ
ェにはＳＩＲとして知られる４遺伝子座位がアシ他の通
常発現していないａおよびα情報コピーの抑制に要求さ
れる蛋白を合成する。この抑制現象を妨害する温度感受
性（ｔｓ）欠損がこれら座位の少なくとも一つの遺伝子
産物内に存在する。この変異株では３５℃の生育で抑制
を妨害しアルファ接合因子プロモーターが不活性な表現
形がａ／αである細胞を生じる。２３℃に温度移行する
とプロモーターが活性となり表現型がαに復帰する。ｔ
ｓｓＩＲ欠損を有する株の利用は数種の異種蛋白の制御
された発現に示されてきた。

本発明の目的は、処理できるようにＳドメインに連結し
たプレＳ〜１およびプレＳ−２ドメインを酵母内で免疫
原性粒子として発現させるための発現ベクター及び方法
を与えることである。他の目的は、プレｓ−ｉおよびプ
レＳ−２ドメインの酵母内での発現のためのベクター及
び方法を与えることである。さらに他の目的はそのよう
なベクターで形質転換された組換え体宿主細胞の生育の
大規模化のための条件を特定し、プレＳ含有ポリペプチ
ドの精震のためにそのペプチドの最大収率が大量および
高濃度で得られるようにすることである。本発明のこれ
ら及び他の目的が以下の記述によシ明らかになるだろう
。

Ｂ型肝炎つィルス表層抗原遺伝子に一つの隣接する読み
取シ枠で連結した全Ｂ型肝炎ウィルスプレーＳ抗原遺伝
子がサツカロミセスセレビシェで発現された。該発現さ
れた蛋白は両ドメインによシコードされた主要抗原部位
を表す粒状に凝結し、それによりプレーＳドメインの発
現のだめの宿主としての酵母の利用性を明らかにした。

この蛋白は、試験管内診断系およびＢ型肝炎ウィルスの
誘起する疾患、および／′または感染の治療、または予
防のためのワクチンとして有用である。

本発明は、隣接するポリペプチドとしてＳドメインに連
結したプレーＳドメイン（またはその部分）またはプレ
ーＳドメインそれ自体（またはその部分）の酵母種にお
ける発現の方法に向けられたものである。よシ特定する
と、このドメインの発現が強力な構成的なプロモーター
により支配された際の宿主に対するプレーＳドメインの
示す毒性効果を打ち消すために、サツカロミセス属の種
におけるこれらドメインの発現を指示するためのガラク
トース−誘導プロモーター、グルコース−抑制プロモー
ターおよび温度−誘導プロモーターの利用に向けられて
いる。さらに、プレーＳ−含有ポリペプチドを粒子形で
発現する組換え体細胞を大量に調製するだめの条件に向
けられている。当業者には、活性が生理的に制御されて
いる（すなわち透導可能な）他のプロモーターが、上に
指摘したプレーＳドメインの毒性効果を打ち消すために
酵母種におけるプレーＳ−含有ポリペプチドの発現を指
示するために利用し得ることは明白であろう。

プレＳ−１／プレＳ−２／Ｓ　　ＯＲＦの単離のための
ＨＢＶ核酸の源としてゾーン粒子が用いられた。ＨＢピ
リオン中に生来存在するニックまたはギャップの入った
形からＨＢＶゲノムの共有結合によシ閉環した二本鎖Ｄ
ＮＡを調製するために、内在性のポリメラーゼ反応が用
いられた。修復されたＤＮＡが単離されセしてＥｃｏＲ
Ｉで完全消化された。

Ｅ、コリーのクローニング　ベクターであるｐＢＲ３２
２もまたＥｃ　ｏＲＩで消化されＨＢＶ　　ＤＮＡと連
結され、そしてＥ、コリーを形質転換するのに用いられ
た。組換え体プラスミドが選択される。これらは、ＨＢ
Ｖゲノムを環状に入れ替えた形で含んでおり、そこでは
Ｅｃ　ｏＲＩ切断部位が、完全なプレＳ−１／プレＳ−
２／Ｓコード領域を、０．４キロ塩基対（ｋｂｌ））の
５′　ドメインと０．８ｋｂｐの３′　ドメインに分け
る。これら二つのドメインは偶発的な全ゲノムの再配列
を目的としてサブクローンされる。３′　ドメインにつ
いてはｐＵｃ１９がｌｉ：ｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩに
よシ消化され、次いでコード領域の最後の５ヌクレオチ
ド、停止コドン、ＨｉｎｄＩＩＩ部位およびＢ　ａ　ｍ
　ＨＩ末端からなる合成オリゴヌクレオチドに連結され
る。

０．８ｋｂｐＥｃｏＲＩ−ＡｃｃＩ断片からなるプレＳ
−１／プレＳ　−２／　Ｓ遺伝子の３′部分がこのベク
ター中にクローンされる。

０．３ｋｂｐ　　ＢａｍＨＩ−ＥｃｏＲＩ断片からなる
５′部分は（１）完全なＯＲＦが発現されるべきか、ま
たは（２）推定状の疎水的シグナル配列（アミノ酸２−
１５）が除かれるべきか、によシニ通シの方法のどちら
かでｐＵｃ１８中にサブクローンされる。最初の戦略で
は、ｐＵｃ１８はＨｉ　ｎ　ｄ　Ｉ　Ｉ　ＩおよびＥｃ
ｏＲＩで消化され、７２ｂｐの合成オリゴヌクレオチド
と連結され、ＢａｍＨＩ部位上流から末端ＡＴＧおよび
１０ｂｐ非翻訳リ一ダー配列を過ぎてＨｉ　ｎ　ｄ　Ｉ
　Ｉ　Ｉ対応末端までの完全ＯＲＦを再構成する。第二
の戦略では同じ機能を持つがアミノ醪配列２−１５のコ
ード領域をなくした３０ｂｐオリゴヌクレオチドが連結
される。５′　ドメインの０．３　ｋｂｐＢａｍＨＩ−
ｇｃｏＲＩ断片が次いでこれらオリゴヌクレオチド連結
クローニング　ベクターのどちらかの中に連結される。

該５′ｐＵｃ１８および３’　ｐＵｃ１９クローンは、
Ｅ、コリ中での生育により増幅され、コード領域は、単
離されたプラスミドからＨｉｎｄＩ　Ｉ　Ｉ−Ｅｃ　ｏ
ＲＩ断片として消化される。

該５′および３′断片は連結され、ＨｉｎｄＩＩＩで消
化され、ＨｉｎｄｌｌＩ末端を持った完全ＯＲＦは、Ｈ
ｉｎｄＩＩＩで予め消化されたｐＵｃ１３中にクローン
される。

ＨｉｎｄＩＩＩ断片としての完全ＯＲＦは、モーター発
現系中にクローンするために、調製用ゲル電気泳動によ
り精製される。ＧＡＰＤＨ発現カセットを含む該ｐＢＲ
３２２プラスミドはＧＡＰＤＨプロモーターとＡＤＨＩ
転写終結部位のあいだに唯一のＨｉ　ｎｄ　Ｉ　１１部
位を有し、その中に上に述べたｐＵＣ１３からの完全Ｏ
ＲＦが適当な配向性で挿入される。この３．０ｋｂｐの
発現カセットは次いでＳｐｈ　Ｉ消化によシ除かれ小ｓ
ｐｈ　Ｉ断片と置き換えるためにシャトルベクターｐＣ
１／１中に連結される。この方法で構築されたベクター
はＳ、セレビシェ２１５０−２−３株を形質転換するの
に用いられる；しかしながら該形質転換混合物を平板に
広げると安定な集落は出現しない。発現された産物の推
定された毒性はプレ８１−プレＳ−２／Ｓコード領域の
大部分の除去およびＢａｍＨＩによるフレームシフト変
異の創製とプラスミドの再連結によシ確認される：この
ように調製する。

該ＹＥｐ５２　　Ｅ、コリ／Ｓ、セレビシェシャトル　
ベクターは、唯一のＨｉｎｄＩＩ工部位に挿入された異
種遺伝子のガラクトース誘導可能なＧＡＬＩＯプロモー
ターからの発現を行わせる。上に述べたプレ５−１７プ
レＳ−２／Ｓ　　０ＲＦ（ＨｉｎｄｌＩＩ末端を持つ）
は、ベクターのＨｉ　ｎ　ｄ　Ｉ　Ｉ　Ｉ部位に連結さ
れる。この組換え体プラスミドはＳ、セレビシよりＹ−
１９株に導入され形質転換されたクローンが選択される
。細胞は、グリセロール−乳酸を含む合成選択培地で生
育される。その後発現を誘導するために、培養にガラク
トースが添加される。溶菌液が調製され、ドデシル硫酸
ナトリウム−ポリアクリルアミド　ゲル電気泳動（ＳＤ
Ｓ−ＰＡＧＥ）で分析され、ニトロセルロースにヤ１ス
タン（Ｗｅ＋５ｔｅｒｎ）プロットされる。誘導された
形質転換体にのみ存在すること、および回復期のヒトＨ
Ｂ血清との反応性の点からｐ３９産物がプレＳ−１／プ
ノＳ　−Ｚ／Ｓに特異的であることが見いだされている
。さらに、形質転換体の溶菌液はラジオイムノアッセイ
によりＨＢｓＡｇ陽性であり、プレーＳ領域に特異的で
あることが示されている結合である、重合したヒト　ア
ルブミンとの結合の点でプレＳ陽性であるが、野生型Ｓ
、セレビシェではそうでない。粒状のＨＢ　ｓ　Ａ　ｇ
を認識する山羊抗体を結合した免疫アフイニチー　カラ
ムが、形質転換されたＳ、セレビシェからのプレ５−１
７プレＳ−２／Ｓを精製するのに利用された。溶出され
た産物は、ラジオイムノアッセイでＨＢｓＡｇ陽性、重
合したヒト　アルブミン結合においてプレーＳ陽性であ
り、電子顕微鏡で粒子状である。これらのデータは全プ
レ５−１７プレＳ−２／Ｓ蛋白がＳ、セレビシェ内で粒
子状に存在するｐ３９として発現されることを示す。Ｈ
ＢｓおよびプレーＳ抗原の両方を含むその様な粒子形は
ＨＢワクチンおよび診断試薬として有効である。

ｐＡＤＨ２Δ６７（−１）Ｅ、コリ　クローニングベク
ターは、Ｓ、セレビシェにおいて唯一のＨｉｎｄＩＩＩ
部位に挿入された異種遺伝子のＡＤＨ２（グルコース−
抑制のかかる）プロモーターからの発現を指示すること
ができる。ＰＡＤＨ２Δ６７（−１）が１３ａｍＨＩお
よびＥｃｏＲＩで消化され、ＤＮＡポリメラーゼＩのグ
、Ｉ−ノー（ｋｉすれσＷ）断片によシ平滑末端化され
ＡＤＨ２プロモーターおよび終結配列を含む４．９ｋｂ
ｐの断片が調製用アガロースゲル電気泳動忙よシ精製さ
れる。

ｐＵＣ７がＰｓｔＩで消化され、Ｔ４　　ＤＮＡポリメ
ラーゼにより平滑末端化され、該４、９　ｋ　ｂ　ｐ断
片と連結される。出来たプラスミドは５ａｌＩで消化さ
れ、４．９ｋｂｐ断片が調製用アガロースゲル電気泳動
により精製される。ｐＵｃ１８はＨｉｎｄＩＩ工で消化
され、ＤＮＡポリメラーゼ■の　クムノー断片で平滑末
端化され、自己連結される。出来たプラスミドは５ａｌ
Ｉで消化され４，９ｋｂｐｓａｌＩ断片に連結される。

上に述べた１、２ｋｂｐ　　ＰｒｅＳ−１／ＰｒｅＳ−
２／Ｓ　　０ＲＦ（ＨｉｎｄＩＩＩ末端を持つ）はこの
ベクターのＨｉｎｄＩＩＩ部位に連結される。出来たプ
ラスミドは５ａｌＩで消化され、該６．１　ｋ　ｂ　ｐ
の断片はシャトルベクターのｐ　Ｃ１／　１の５ａｌＩ
部位に連結される。

プラスミドｐ　Ｃ１／　１はｐＪＤＢ２１９内の細菌プ
ラスミドｐＭＢ９に対応する領域がｐＢＲ３２２で置換
されたｐＪＤＢ２１９の誘導体である。この組換えプラ
スミドはＳ、セレビシェ中に導入され、形質転換された
クローンが選択される。細胞は０．３％（ｗ　／　ｖ　
）グルコースを含む合成選択培地に生育させられる。４
８時間後に、グルコース除去に続いて、溶菌液が調製さ
れ、５ＤＳ−ＰＡＧＥで分析されニトロセルロースにウ
ェスタン（Ｗｅｓｔｅｒｎ）プロットされる。ｐ３９産
物が、形質転換体にのみ存在すること、および回復期ヒ
トＨＢ血清と反応することから、プレ５−１７プレＳ　
−２／Ｓに特異的であることが見いだされる。さらに、
形質転換体の溶菌液は、ラジオイムノアッセイでＨＢ　
ｓＡｇ陽性であシ、そして重合したヒトアルブミンと結
合することによりプレーＳ陽性であるが、野生型Ｓ、セ
レビシェのではそうでない。粒子状のＨＢｓＡｇを認識
する山羊抗体を結合した免疫アフイニチー力ラムが、形
質転換されたＳ、セレビシェからプレＳ　−１／フレ５
−２Ａを精製するのに利用される。溶出した産物は、ラ
ジオイムノアッセイでＨＢ　ｓ　Ａｇ陽性、重合したヒ
トアルブミン結合によりプレーＳ陽性、そして電子顕微
鏡で粒状である。

アルファ接合因子遺伝子ＭＦα１はＳ、セレビシェ　ゲ
ノムＤＮＡからプラスミド　ベクター上にクローンされ
た。得られたプラスミドｐＫＨ２はＥｃｏＲＩで消化さ
れ、アルファ接合因子を保持している１、７ｋｂｐ断片
は調製用アガロースゲル電気泳動にょシ精製される。プ
ラスミドｐＲＪ１４８（ＨｉｎｄＩＩＩ部位を欠く改変
されたｐＢＲ３２２）がＥｃ　ｏＲＩで消化され、その
１．７ｋｂｐ断片と連結されｐＲＪ　１５９を与える。

このＤＮＡは、ＨｉｎｄＩＩＩによシ消化され、自己連
結されてプラスミドｐＲＪ１６７を形成する。このプラ
スミドは、唯一のＨｉｎｄＩＩＩ部位を有する。プラス
ミドｐＲＪ１６７はＨｉｎｄＩＩＩで消化され、合成オ
リゴヌクレオチドアダプターの挿入により改変され、３
種の読み取シ枠総てにプロモーターおよびプレプロリー
ダーの３′側で翻訳終結シグナルの５′側に存在する唯
一のＨｉｎｄＩＩＩ部位を含む新たなプラスミド（ｐＲ
Ｊ１７８）を与える。該ＨｉｎｄＩＩＩ部位は、Ｈｉｎ
ｄＩＩＩによる消化、ＤＮＡポリメラーゼエのクレノー
（Ｋ　ｌ　ｅ　ｎ　ｏ　ｗ　）断片による平滑末端化、
Ｂ−ａｍＨＩリンカ−の付加、自己連結によ、９Ｂａｍ
ＨＩ部位に変換され、プラスミドｐＪｃ１９３を形成す
る。このプラスミドは、Ｅ　ｃ　ｏ　ＲＩで消化され、
ＤＮＡポリメラーゼエのクレノー断片によシ平滑末端化
され、ＢｃｌＩリンカ−の付加によシ改変され、Ｂｃｌ
Ｉで消化され、アルファ接合因子遺伝子を保持する１、
　５　ｋ　ｂ　ｐ断片が、調製用ゲル電気泳動により単
離される。こうして得られたＢｃｌＩ断片は子牛腸アル
カリ性フォスファターゼにより処理され、次いでｐｃｉ
／１の唯一のＢａｍＨＩ部位に挿入され、この過程で元
来のＢａｍＨＩ部位を破壊する（プラスミドｐＪｃ１９
４）。このＤＮＡは、過剰のＢ　ａ　ｍ　ＨＩリンカ−
を除−くためにＢａｍＨＩで消化され自己連結されるこ
とにより新たなアルファ接合因子発現ベクタープラスミ
ドｐＪｃ１９７となる。上に述べたｐＵｃ１３中のプレ
Ｓ−１／プＬ、Ｓ−２／Ｓ　　ＯＲＦ！’１ＨｉｎｆＩ
およびＡｖａ■にょシ消化され、０．５ｋｂｐ　　ＯＲ
Ｆは調製用アガロースゲル電気泳動にょシ精製される。

ｐＵｃ１８は５ａｉｌおよびＢａｍＨＩで消化され、次
いで２合成オリゴヌクレオチドと連結される。

該５′オリゴヌクレオチドは５ａｌＩ末端、Ｈｉ　ｎｄ
　Ｉ　Ｉ　Ｉ部位、ＫＥＸ２開裂部位をコードするヌク
レオチド、プレＳ−１の２および３アミノ酸をコードす
るヌクレオチド、およびＨｉ　ｎｆ　Ｉ末端からなる。

該３′オリゴヌクレオチドはＡ　ｖ　ａ　Ｉ部位、プレ
Ｓ−２の最後の８アミノ酸をコードするオリゴヌクレオ
チド、停止コドン、Ｈｉ　ｎ　ｄ　Ｉ　Ｉ　Ｉ部位、お
よびＢａｍＨＩ末端を含む。該０．５ｋｂｐＯＲＦはこ
のオリゴヌクレオチド連結ｐＵＣ１８ベクター中にクロ
ーンされる。できたベクターはＨｉｎｄＩＩＩで消化さ
れＤＮＡポリメラーゼＩのクレノー断片で平滑末端化さ
れる。できた０、　５　ｋ　ｂ　ｐプＬ／Ｓ−１／プレ
ｓ−２０ＲＦは調製用アガロースゲル電気泳動によ勺精
現され、ＢａｍＨＩで消化されＤＮＡポリ・メラーゼＩ
のクレノー断片で平滑末端化されたｐＪｃ１９７中にク
ローンされ、アルファ接合因子のプレープローリーダー
配列忙機能するように連結されたプレＳ　　ＯＲＦとな
る。

アルファ接合因子プロモーターは表現型αである細胞内
でのみ活性となる。Ｓ、セレビシェにはＳＩＲとして知
られる４座位が知られてお、９ａおよびα情報の他の通
常休止しているコピーの抑制に必要な蛋白を合成してい
る。ＪＲＹ１８８株細胞（ＭＡＴｄ、５ｉｒ３−８．１
ｅｕ２−３．１ｅｕ２−１１２、ｔｒｐｌ、ｕｒａ３−
５２、ｈｉｓ４）は５ＩＲ３遺伝子産物内Ｋｔｓ欠損を
含む。その結果、３５℃で生育したＪＲＹ１８８細胞は
表現型がａ／αであシアルファ接合因子プロモーターは
活性でない：他方、２３℃で生育した細胞は表現型がα
でありしたがってアルファ接合因子プロモーターによシ
支配される発現を誘導することが出来る。組換え体プレ
５−１７プレＳ−２含有アルファ接合因子プラスミドが
Ｓ、セレビシェＪＲＹ１８８株の形質転換に用いられ、
形質転換クローンが選択される。細胞は合成選択培地（
ｌｅｕ″″〕に３５°で生育させられる；その後構胞は
Ａ　６００　＝　０．５で同じ培地に２３℃生育させら
れる。溶菌液が調製され１，５ＤＳ−ＰＡＧＥで分析さ
れ、ニトロセルロースにウェスタンプロットされる。そ
れが形質転換株にのみ存在すること、および回復期のヒ
ト血清と反応することからｐ２１産物がプレＳ−１／プ
レＳ−２に特異的であることが見いだされる。

プレＳ−１／プレＳ−２／Ｓを構成的なＧＡＰＤＨプロ
モーターから発現させるベクターがＳ、セレビシェを安
定に形質転換できないことは、構成的また高レベルのプ
レーＳ発現のＳ、セレビシェにたいする悪い生理的な効
果を明らかにする；この同じプロモーターからのＳポリ
ペプチドの発現をさせるプラスミドｐＨＢ５５６−ＧＡ
Ｐ３４７／３３はＳ。

セレビシェを効果的に形質転換し、そのような形質転換
したＳ、セレビシェは生産規模まで効率的に生育する。

この観察結果は、Ｓ。

セレビシェ中でプレＳ−含有ポリペプチドの発現をさせ
るのに、誘導可能、脱抑制の可能、あるいは活性の弱い
構成的なプロモーターを利用するシャトルベクターの有
用性を明らかにする。特にこのことは、Ｓ、セレビシェ
中でプレ５−１７プレＳ−２／Ｓの発現をさせ、るのに
ＧＡＬ１０プロモーターを利用する発現ベクターの有用
性を明らかにする。該分野の熟練者にとって、同じよう
な様式で機能する制御可能なＧＡＬＩＯプロモーターあ
るいはＧＡＬＩ、ＧＡＬ２、ＧＡＬ７またはＭＥＬ１プ
ロモーターが、宿主細胞に対する負の効果を最小にする
ようにして、組換え体蛋白の合成が始まる前に組換え体
Ｓ、セレビシェ培養の生育を生産規模体積にまで拡大さ
せることができるということは明白である。さらに該分
野の熟練者にと゛って、ＡＤＨ２およびアルファ接合因
子を含むがそれに限定されない、生理的に誘導可能なま
たは他の方法にょ勺脱抑制の可能なほかの制御可能なプ
ロモーターを含む発現ベクターがプレーＳ−含有ポリペ
プチドの発現をさせるのに利用され得ることは明白であ
る。さらに該分野の熟練者にとっては、ＣＹＣＩを含な
かそれに限定されない、ＧＡＰＤＨより強力でない構成
的なプロモーターが、過剰発現による負の生理的効果が
回避されるように、プレーＳ−含有ポリペプチドの発現
を細胞蛋白の低いパーセントにしてしまうということは
明白である。該分野の熟練者にとって、例えばウェスタ
ンプロットまたはラジオイムノアッセイのような適当な
検定系が、最大の収率を得るための培養収穫時が最適に
なるように、この系におけるプレーＳ−含有ポリペプチ
ドの発現を検定するために利用されるべきであるという
ことは明白である。

サツカロミセス属は種々の種からなっている。種々の異
種ポリペプチドの組換えＤＮＡ−仲介発現のための宿主
として最も普通に用いられるのは、サツカロミセス　セ
レビシェ、またはパン酵母、である。しかしながら、す
ツカロミセス属の他の種のあいだの分別は、常によく定
められているとはいえない。これら種の多くｉｓ、セレ
ビシェと交雑可能であシ、ＧＡＬ１０、ＡＤＨ２、そし
て／またはアルファ接合因子プロモーターを含むがそれ
咳限定されない、ｓ６セレビシエ内のプロモーターと類
似或は同一の制御可能なプロモーターを有しているよう
である。従って、該分野の熟練者にとって、プレーＳ−
含有ポリペプチドの発現のための宿主株の選択はカルス
ペルゲンシス（ｃａｒｌｓｂｅｒｇｅｎｓｉｓ　）、　
ウバルム（ｕｖａｒｕｍ　）、ルクシ（ｒｏｕｘｉｔ　
）、モンタナス（ｍｏｎｔｕｎｕａ　）、　クルベリ（
ｋｌｕｙｖｅｒｉ入エロンギスポラス（ｅｌｏｎｇｉｓ
ｐｏｒｕｓ　）、　ノルベンシス（ｎｏｒｂｅｎｓｉｓ
　）　、オビフォルミス（ｏｖｉｆｏｒｍｉｓ　）、お
よびジアスタチカス（ｄｉａｇｔａｔｉｃｕａ　）　　
を含むがそれに限定されないサツカロミセス属の他の種
にまで及ぶということは明白である。

ハンセヌラ（Ｈａｎｇｅｎｕｌａ　）、カンヂダ（Ｃａ
ｎｄｉｄａ　）、トルロプシス（Ｔｏｒｕｌｏｐｓｉｓ
λおよびピキア（Ｐｉｃｈｉａ　）のようないくつかの
酵母属は、生育のだめの唯一炭素源としてメタノールを
利用するための同様な代謝系を含むことが示されている
。この代謝系に関与している酵素であるアルコール　オ
キシダーゼの遺伝子はピキア　パストリス（Ｐｉｃｈｉ
ａｐａｓｔｏｒｉｓ　）　　から単離されている。Ｐ、
パストリス　アルコール　オキシダーゼ　プロモーター
が単離され発現のメタノール誘導に感受性であることが
示されている。そのような誘導可能なプロモーターは、
酵母内で負に選択されるポリペプチドの発現に有用であ
る。

特に、このプロモーターはプラスミド上でＰ。

パストリスにおけるＳドメインの粒状での誘導発現に活
性であることが示されている。この観察は、他の酵母属
が組換えＤＮＡ−仲介の免疫学的に活発な形でのＳポリ
ペプチドの発現のための宿主として機能する能力がある
ことを明らかにした。従って、該分野の熟練者にとって
、プレーＳ−含有ポリペプチドの発現のための、宿主株
の選択がピキア、カンヂダ、ハンセヌラ、トルロプシス
、クルベロミセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ　）　
、およびサツカロミセスを含むがそれに限定されない、
サツカロミセスおよびクリプトコカス科からの酵母の他
の属からの種にまで広がるということは明白である。

近年、酵母よシ高等な真核細胞、特に棒状ウィルス（ｂ
ａｃｕｌｏｖｉｒｕ＋ｓ　）発現ベクターでトランスフ
ェクトされた哺乳動物細胞系および昆虫細胞における組
換え蛋白の発現の目ざましい成功が報告されている。Ｓ
ドメインに連結したプレＳ−２ドメインとともにＳドメ
インそれ自体の両者の、免疫原性粒子としての成功裡の
発現が達成されている。それ故如、該分野の熟練者にと
って、酵母において完全なプレＳ−１／プレＳ−２／Ｓ
ドメインを免疫原性粒子として発現させるという考えが
、これら連結ドメインをベロ（ｖｅｒｏ　）、ＧＨ３１
Ｌｔｋ−およびＣＨＯのような哺乳動物細胞を含むがそ
れに限定されない高等真核生物の細胞内での発現にまで
容易に広がるということは明白である。

以下の例示は本発明を説明するがそれだけに限定するも
のではない。以下の例示に指摘されている各参照例の開
示はここに参考として取シ入れられている。

実施例１ プレ５−１７プレＳ−２／Ｓ遺伝子のクローン化 ゾーン粒子（サブタイプａ　ｙ　ｗ　）が、感染個体の
血漿から確立された方法（ランダース他、ジャーナル　
オブ　ヴイロロジー （Ｌａｎｄｅｒｓ　ｅｔａｌ、、　Ｊ、　Ｖｉｒｏｌｏ
ｇｙ　）　２３巻、３６８頁　１９７７年）により精製
された。

該ゲノムＤＮＡはニックの入ったギャップを官有する形
でヴイリオン中に存在する（ルスカ（Ｈｒｕｓｋａ　）
他、ジャーナル　オブ　ヴイロロジ−２１巻、６６６頁
　１９７７年）。

このＤＮＡを分子クローニング用に調製する目的で、共
有結合閉環二本鎖ＤＮＡを生産するために内在性ポリメ
ラーゼ反応が利用された（ランダース他、ジャーナル　
オブ　ヴイロロジ−２３巻、３６８頁　１９７７年〕。

該ＤＮＡは、ドデシル硫酸ナトリウムおよびプロテイナ
ーゼＫを含む緩衝液中でインキュベートした後フェノー
ル：クロロフォルム：イソアミル　アルコール（２５：
２４二１）による抽出およびエタノール沈殿による濃縮
によシ除蛋白された。この精製ＤＮＡはＥｃｏＲＩによ
シ完全消化された。Ｅ、コリ　クローニング用ベクター
ｐＢＲ３２２もまたＥｃｏＲＩで消化され、消化された
ＨＢＶ　　ＤＮＡと連結されＥ、コリに形質転換するの
に用いられた。ＨＢＶゲノムを、完全なプレＳ−１／プ
レＳ−２／Ｓコード領域を０．４ｋｂｐの５′　ドメイ
ンと０．８　ｋ　ｂ　ｐの３′　ドメインに分ける唯一
のＥｃｏＲ１部位のところで環状に入れ替わった配向性
で含む組換えプラスミド（ｐＨＢＶ／ＡＹＷ−１、第１
図〕が単離された（ガリバート（Ｇａ１ｉｂｅｒｔ　）
　　他、ネイチャー　２８１巻、６４６頁　１９７９年
）。

これら二つのドメインは、全遺伝子の偶発的な再会合の
目的でサブクローンされた。ｐＵＣ１９はＥｃｏＲＩお
よびＢａｍ）（Ｉで消化され、次いでコード領域の最後
の５ヌクレオチド、停止コドン、ＨｉｎｄＩＩＩ部位お
よび１３ａｍＨＩ末端からなる合成オリゴヌクレオチド
に連結された。このオリゴヌクレオチドは ＡＴＡＣＡＴＴＴＡＡＡＧＣＴＴＧ ＴＧＴＡＡＡＴＴＴＣＧＡＣＣＴＡＧ である。０．８ｋｂｐ　　ＥｃｏＲＩ−ＡｃｃＩ断片か
らなる、プレＳ−１／プレＳ　−２／Ｓ遺伝子の３′部
分がこのベクターにクローン化された（　ｐ　Ｕ　Ｃ１
９／　Ｄ　Ｓ　Ｄ　ｓ第１図）。

５′部分は、完全なＯＲＦが発現されるべきか、あるい
は推定上の疎水性シグナル領域（アミノ酸２−１５）が
除去されるべきかによシ、二つのどちらかの方法でｐＵ
ｃ１８中にサブクローン化された。第一の戦略では、ｐ
Ｕｃ１８はＨｉｎｄｌＩＩおよびＥｃ　ｏＲ■で消化さ
れ、末端ＡＴＧ上流のＢ　ａ　ｍ　ＨＩ部位から１０ｂ
ｐの非翻訳リーダー配列を経てＨｉｎｄ工ＩＩ対応末端
までの完全ＯＲＦを再構成する７２ｂｐ合成オリゴヌク
レオチドに連結された。このオリゴヌクレオチドの構造
は： ＊ ＡＴＧＴＴＴｒＧ′ｒＴＴＩ′ＡＣＣＣＣＧＴＣ７′７
１Ａ−π℃Ｔα万テＡＧＧＡＧＡＣＣＣＴＡ人ＭＡ（＊
天然配列はＴではなくＣを含む；上の変更はコードされ
るアミノ酸を変えることなくＨｉ　ｎ　ｆ　１部位をな
くす。〕第二の戦略では、７２ｂｐオリゴヌクレオチド
と同一の機能を持つがアミノ酸２−１５のコード領域を
失つた３０ｂｐオリゴヌクレオチドが連結された。

このオリゴヌクレオチドの構造は である。

５′　ドメインの０．４ｋｂｐ　　ＢａｍＨＩ−Ｅｃｏ
ＲＩ断片は次いで、これらオリゴヌクレオチド連結クロ
ーニング　ベクター （ＰＵＣ１８／ＵＳＤΔ、ｐＵＣｔ８／ＵＳＤＣ，第１
図）のどちらかに連結された。該５’ｐＵＣ１８および
３’　ｐＵｃ１９クローンは、Ｅ、コリー中での増殖に
より増幅され、コード領域は単離されたプラスミドから
ＨｉｎｄＩＩＩ−ＥｅｏＲＩ断片として消化された。こ
れら断片は、連結され、ＨｉｎｄＩＩＩで消化され、Ｈ
ｉｎｄＩ工Ｉ末端を有する完全ＯＲＦは、ＨｉｎｄＩＩ
Ｉで消化されたｐＵｃ１３中にクローン化されたＣｐＵ
Ｃ１３／ＰＳＳＪ、ｐＵｃ１３／ＰＳＳＣ：第１図）。

このベクターからの完全ＯＲＦは、実施例２．３および
４に記載されているようなＧＡＰＤＨまたはＧＡＬＩＯ
プロモーター（ＹＥｐ５２）またはＡＤＨ−２プロモ一
ター発現系中にクローン化するために、調製用アガロー
ス　ゲル電気泳動により精製された。

実施例２ Ｓ、セレビシェ中でプレＳ−１／プレＳ−２／Ｓの発現
をさせるためのＧＡＰＤＨプロモーターの利用 ＧＡＰＤＨ発現カセットを含むｐ　Ｂ　Ｒ３２２プラス
ミド（ホーランドおよびホーランド、ジャーナル　オブ
　バイオロジカル　ケミストリー（Ｈｏ１ｌａｎｄ　ａ
ｎｄ　）（ｏｌｌａｎｄ、　　Ｊ、　　Ｂｉｏｌ。

Ｃｈｅｍ、　　）　２５５巻、２５９６頁　１９８０年
）は唯一のＨｉ　ｎ　ｄ　Ｉ　Ｉ　Ｉクローニング部位
を有しており、そこにＨｉ　ｎ　ｄ　Ｉ　Ｉ　Ｉ末端を
持つ１．１　ｋ　ｂ　ｐプレＳ−１／プレＳ−２／ＳＯ
ＲＦ　（実施例１に記載）がクローン化された（ｐＥＧ
ＡＰ／ＰＳＳΔ、ｐＥＧＡＰ／ｐ　ｓ　ｓ　ｃ、第１図
）。該発現カセット（ＨＢＶ遺伝子含有）はプラスミド
ｐＢＲ３２２より５ｐｈＩ消化および調製用アガロース
ゲル電気泳動によシ除かれた。該発現カセットは次いで
、前もってＳｐｈ　Ｉで消化されていたシャトルベクタ
ーｐＣＩ／１（ベグス（Ｂｅｇｇｓ　）。

ネイチャー　２７５巻、１０４頁　１９７８年：ローゼ
ンバーグ他、ネイチャー３１２巻、７７頁　１９８４年
〕中年少中−ン化されたｐＹＧＡＰ／ＰＳＳΔ、ｐ　Ｙ
ＧＡＰ／Ｐ　Ｓ　ＳＣ１第１図〕。発現カセットを含む
該ｐＣ１／１プラスミドが、Ｓ、セレビシェ２１５〇−
２−３株を形質転換するのに用いられた；しかしながら
、形質転換混合物を平板に広げた後にほんの少数の安定
な組換え体酵母クローンが選択平板から回収された。プ
レーＳを含む産物のＳ、セレビシェに対する予想された
毒性は、プレーｓ工／′プレＳ−２／Ｓコード領域の除
去およびＢａｍＨＩ消化およびプラスミドの再連結によ
るフレームシフト変異の創造によシ確認された；このよ
うにして調製されたＤＮＡは効率よく酵母を形質転換し
た。

実施例３ Ｓ、セレビシェ中でプレＳ−１／プレＳ−２／Ｓの発現
をさせるためのＧＡＬＩＯブロモＹＥｐ５２　　Ｅ、コ
リ／Ｓ、セレビシェシャトルベクターは、唯一のＨｉｎ
ｄＩＩＩ部位に挿入された異種遺伝子の発現を、ガラク
トースにより誘導可能なＧＡＬＩＯプロモーターから行
わせる（ブローチ（Ｂｒｏａｃｈ　）他、エクスペリメ
ンタル　マニプレーションオブ　ジーン　エクスプレッ
ション中 （Ｉｎ　Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ　１ｌｈｎｉｐｕｌ
ａｔｉｏｎ　ｏｆ　ＧｅｎｅＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　）
、　８３頁、アカデミツク　プレス　１９８３年）。加
えて、このベクターは、Ｓ、セレビシェ中で増えるだめ
の部分的な２μ環配列（ｏｒｉおよび一つの逆縁シ返し
）、Ｓ、セレビシェ中で選択するためのＬＥＵ２、およ
びＥ、コリ中でそれぞれ増幅および選択するためのｏｒ
ｉおよびｂｌａ配列を含む。ＨｆｎｄＩＩＩ末端をもつ
該１．１ｋｂｐプレＳ−１／プレＳ−２／Ｓ　　０ＲＦ
（実施例１記載〕が唯一のＨｉｎｄＩＩＩ部位にクロー
ンされ（ｐＹＧＡＬ／ＰＳＳΔ、ｐ　Ｙ　Ｇ　Ａ　’Ｌ
　／　Ｐ　Ｓ　Ｓ　Ｃ％第１図）、できたプラスミドは
Ｓ、セレビシよりＹ−１９株を形質転換するのに用いら
れた。組換え体クローンが単離されｐｒｅＳ−１／プレ
Ｓ−２／Ｓポリペプチドの発現に関して検討された。ク
ローンは合成選択（Ｉｅｕ−）グリセロール−乳酸培地
（０，６７％（ｗ／ｖ）酵母無アミノ酸窒素基、０．９
０４％アデニン、０．００４チウラシル、１％琥珀酸、
０．００５％チロシン、０．００２％アルギニン、０．
００６％イソロイシン、０．００４％リジン、０．００
１％メチオニン、０．００６％フェニルアラニン、０、
００６％スレオニン、０．００４％トリプトファン、ｏ
、ｏｏｉ％ヒスチジン、０．６％水酸化ナトリウム、２
％（ｖ　／　ｖ　）乳酸、３チ（ｖ　／　ｖ　）グリセ
ロール）中で生育させられた。該遺伝子産物の生産は、
酵母がＡ６００＝０．３にまで生育した後にガラクトー
スを２％（ｗ／　ｖ　）まで添加することによシ誘導さ
れた。望みの抗原の発現はオースリアＲ（アボット）　
（Ａｕ５ｒｉａＲ（Ａｂｂｏｔｔ）　）　　反応性の検
出、重合ヒトアルブミン結合活性（マチダ他、ガストロ
エンテロロジ−８６巻　９１０頁１９８４年）および回
復期ヒト血清と放射能標識したスタフイロフカス　アウ
レウス（５ｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ　ａｕｒｅｕｇ
　）　Ａ蛋白を用いて明らかにされたウェスタンプロッ
トにおけるｐ３９の存在によシ確かめられた。これら組
換え体クローンは、実施例６に記載される大規模発酵お
よび単離のための種培養として使われた。

実施例４ Ｓ、セレビシェ中でのプレ５−１／プレＳ−２／Ｓの発
現をさせるためのＡＤＨ２プロモーターの利用 ｐＡＤＨ２Δ６７（−１）Ｅ、コリ　クローニングベク
ターは、Ｓ、セレビシェ中で、唯一のＨｉｎｄＩＩＩ部
位に挿入された異種遺伝子の発現をＡＤＨ２脱抑制可能
プロモーターからさせることができる（ラッセル（Ｒｕ
５ｓｅｌｌ　）他、ジャーナル　オブ　バイオロジカル
　ケミストリー　２５８巻＝ ２６７４頁　１９８３年；ヤングＥ、Ｔ、投稿中）。該
唯−のＨｉｎｄＩＩＩ部位は、５′非翻訳隣接配列のヌ
クレオチド−１とＡＤＨ２遺伝子の転写終結部位との間
に位置する。

ｐＡＤＨ２Δ６７（−１）は、ＢａｍＨＩおよびＥｃｏ
ＲＩで消化され、ＤＮＡポリメラーゼ■のクレノー断片
で平滑末端化され、ＡＤＨ２プロモーターと終結部位を
含む４．９ｋｂｐ断片は調製用アガロースゲル電気泳動
によシ精製された。ｐＵＣ７はＰｓｔＩで消化され、Ｔ
４ＤＮＡポリメラーゼにょシ平滑末端化され、該４．９
ｋｂｐＡＤＨ２断片に連結された。できたプラスミドは
５ａｌＩで消化され、４．９　ｋ　ｂ　ｐ断片は調製用
アガロースゲル電気泳動によシ精製された。ｐＵｃ１８
はＨｉｎｄＩＩＩで消化され、ＤＮＡポリメラーゼ■の
クレノー断片で平滑末端化され、自己連結された。でき
たプラスミドは５ａｌｌで消化され、４．９ｋｂｐＳａ
ｌＩ断片に連結されベクターｐＵｃ１８ΔＨｉ　ｎｄ　
Ｉ　Ｉ　Ｉ−ＡＤＨ２（第１図）をつくった。Ｈｉ　ｎ
ｄＩＩＩ末端をもつ二つの異なる１、　１　ｋ　ｂ　ｐ
プレＳ−１／プレＳ−２／Ｓ　　０ＲＦ（実施例１で記
載）は、このベクターのＨｉｎｄＩＩＩ部位に連結され
た。できたプラスミド（ｐＥＡＤＨ２／ＰＳＳΔ、ｐＥ
ＡＤＨ２／ＰＳＳＣ１（第１図）は５ａｌｌで消化され
、６．１ｋｂｐ断片はｐＣ１／ｌの５ａｌＩ部位中に連
結サレプ５スミｔ’ｐＹＡＤＨ２／ＰＳＳΔ、ｐＹＡＤ
Ｈ２／ＰＳＳＣをつくった（第１図）。

これら組換え体プラスミドは、ｓ、セレビシェ２１５０
−２−３株を形質転換するのに用いられた。組換え体ク
ローンが単離され、プレＳ−１／プレＳ−２／Ｓポリペ
プチドの発現について検討された。クローンは、０．３
％（ｗ／ｖ）グルコースを含む合成選択（ｌｅｕ−）培
地中に生育させられた。細胞は３０℃４８時間でＡ”０
ｗ１．５まで生育させられ、その間にグルコース枯渇が
ＡＤＨ２プロモー９−を脱抑制した。そうでない場合は
、該クローンは炭素源として２％グルコースを含む合成
選択（ｌｅｕ−）培地中に生育させられた。

細胞は３０℃２４時間で八〇〇〇が０．１または１．０
まで生育させられ、この時点で炭素源として１．６％グ
リコース（ｇｌｙｃｏｓｅ　）をふくむ複合培地の入っ
たより大きなフラスコまたは発酵槽に植菌された（植菌
量＝ｉｏ％　ｖｏ　ｌ／ｖｏｌ）。細胞はさらに４５時
間上述のようにＡ”’　＝　１２．０−１４．０まで生
育させられた。

この間にグルコース枯渇がＡＤＨ２プロモーターを脱抑
制していた。望みの抗原の発現はオースリア　（アボッ
ト）反応性による検出、重合ヒトアルブミン結合活性、
および回復期ヒト血清と放射標識したスタフイロフカス
アウレウスＡ蛋白を用いて明らかにされたウェスタンプ
ロットにおけるｐ３９の存在によシ確かめられた。選択
された組換え体クローンは、実施例７に記載される大規
模発酵および単離のための種培養として使われた。

実施例５ Ｓ、セレビシェ中でのプレ５−１７プレＳ−２の発現を
させるアルファ接合因子プロモーアルファ接合因子遺伝
子ＭＦα１がＳ、セレビシェ　ゲノムＤＮＡからのプラ
スミドベクター上にクローンされていた（カージャン（
Ｋｕｒｊａｎ　）他、セル　３０巻二つ３３頁１９８２
年ニシン他、ヌクレイツク　アシッド　リサーチ　１１
巻：　４０４９頁１９８３年）。できたプラスミドｐＫ
Ｈ２はＥｃｏＲＩで消化され、アルファ接合因子遺伝子
を保持する１、７ｋｂｐ断片が調製用アガロースゲル電
気泳動により精製された。プラスミドｐＲＪ１４８（Ｈ
ｉｎｄＩＩＩ部位を欠いた修飾ｐＢＲ３２２）がＥｅｏ
ＲＩで消化され、該１．７　ｋ　ｂ　ｐ断片と連結され
プラスミドｐＲ５１５９を生成した。このＤＮＡは、Ｈ
ｉｎｄＩＩＩで消化され自己連結されプラスミドｐＲＪ
１６７を形成した。このプラスミドはこれで唯一のＨｉ
ｎｄＩＩＩ部位を有する。プラスミドｐＲＪ１６７はＨ
ｉ　ｎｄ　Ｉ　Ｉ　Ｉで消化され、３種の読み取シ粋の
全てにおいてプロモーターおよびプレープローリーダー
の３′側および翻訳終結シグナルの５′側に唯一のＨｉ
ｎｄＩＩＩ部位を含む、新たなプラスミド（ｐＲＪ１７
８）を生成するように、合成オリゴヌクレオチドの挿入
にょシ修飾された（第２図）。該ＨｉｎｄＩＩＩ部位は
、ＨｉｎｄＩＩＩによる消化、ＤＮＡポリメラーゼ■の
クレノー断片による平滑末端化、ＢａｍＨＩリンカ−の
付加および自己連結にｊ、すＢａｍＨＩ部位に変換され
プラスミド。

ＪＣ１９３を形成した。このプラスミドはＥｃｏＲＩで
消化、ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノー断片による平滑
末端化、ＢｃｌＩリンカ−の付加による修飾、Ｂａ１ｌ
での消化をうけ、アルファ接合因子遺伝子を保持する１
、　５　ｋ　ｂ　ｐ断片が調製用ゲル電気泳動により単
離された。この１．５　ｋ　ｂ　ｐ断片（Ｂｅ　ｌ　Ｉ
断片）は子牛腸アルカリ性フォスファターゼで処理され
ｐｃｔ／１の唯一のＢａｍＨＩ部位に挿入された。この
過程で本来あるＢａｍＨＩ部位が破壊された（プラスミ
ドｐＪＣ１９４）。このＤＮＡは過剰のＢａｍＨＩリン
カ−を除くためにＢａｍＨＩで消化され自己連結され、
新たなアルファ接合因子発現プラスミドｐＪｃ１９７と
なった（第３図）。

ｐ　Ｕ　Ｃ１３／　Ｐ　Ｓ　Ｓ　Ｃプラスミド（実施例
１に記載〕がＨｉｎｆＩおよびＡｖａｌで消化され、０
．４５　ｋ　ｂ　ｐのＯＲＦが調製用アガロースゲル電
気泳動によシ精製された（第４図）。

ｐＵｃ１８が５ａｉｌおよびＢ　ａ　ｍ　ＨＩで消化さ
れ、次いで２合成オリゴヌクレオチドと連結された。該
５′オリゴヌクレオチドは、５ａｌＩ末端、ＨｉｎｄＩ
ＩＩ部位、ＫＥＸ２開裂部位をコードするヌクレオチド
、プレＳ−１のアミノ酸２および３をコードするヌクレ
オチド、およびＨｉ　ｎ　ｆ　Ｉ末からなる。

このオリゴヌクレオチドの構造は ＴＣＧＡＣＡＡＧＣＴＴＧＧＡＴＡＡＧＡＧＡＧＧＧＧ
ＡＧＧＴＴＣＧＡＡＣＣＴＡＴＴＣＴＣＴＣＣＣＧＴＣ
ＴＴＡである。該３′オリゴヌクレオチドは、ＡｖａＩ
部位、プレＳ−２の最後の８アミノ酸をコードするヌク
レオチド、停止コドン、ＨｉｎｄｌＩＩ部位、および３
３　ａ　ｍ　ＨＩ末を含む。このオリゴヌクレオチドの
構造はである。該０．５ｋｂｐ　　ＯＲＦがこのオリゴ
ヌクレオチド連結ｐＵ０１８ベクター中にりローン化さ
れた（第４図）。できたベクターは）ＩｉｎｄＩＩＩで
消化され、ＤＮＡポリメラーゼエのＫｌｅｎｏｗ断片に
よシ平滑末端化された。結果的にプレＳ１／プレＳ２　
０ＲＦとなる該０．５　ｋ　ｂ　ｐプレＳ−１７（ｐ　
ｙ　ｄ　ＭＦ／Ｐ　Ｓ　Ｓ第４図）が機能するようにア
ルファ接合因子プレプロ−リーダーに連結した。プレＳ
−２０ＲＦは、調製用アガロースゲル電気泳動によシ精
製され、ＢａｍＨＩで消化されＤＮＡポリメラーゼ■の
クレノー断片によル平滑末端化されたｐＪＣ１９７中に
クローン化され（ｐＹαＭＦ／ｐｓΔＳ１第４図）、機
能するようにアルファ因子プレープローリーダーに連結
したプレＳ１／プレＳ２　０ＲＦとなった。

アルファ接合因子プロモーターは表現型がαである細胞
内でのみ活性である（ブレイク他、モレキュラー　アン
ド　セルラー　バイオロジー（Ｂｒａｋｅ　ａｔａｌ、
、　Ｍｏ１．　Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏ！、　）３巻：１４４
０頁　１９８３年）。Ｓ、セレビシェには、他の通常発
現していないａおよびα情報のコピーの抑制に必要な蛋
白を合成するＳＩＲとして知られる４座位がある（ライ
ン他、ジエネチツクス（Ｒｉｎｅ　ｅｔａｌ、、　Ｇｅ
　−ｎｅｔｉｃｓ　）　９３巻＝８７７頁　１９７９年
）。

ＪＲＹ１８８株細胞ＣＭＡＴａ、ａ　ｉ　ｒ　３−８．
１ｅｕ２−３．１ｅｕ２−１１２、ｔｒｐｌ、ｕｒａ３
−５２、ｈｉｓ４）は、５ＩＲ３遺伝子産物中に温度感
受性欠損を含む。結果として、３５℃で生育したＪＲＹ
１８８細胞は表現型がａ　／　ａであシ、アルファ接合
因子プロモーターは活性でない；他方、２３℃で生育し
た細胞は表現型がαであシ従ってアルファ接合因子プロ
モーターによシ指示される発現を誘導することが出来る
〔ブレイク他、プロシーヂングス　オブ　ザ　ナショナ
ル　アカデミ−オブ　サイエンス （Ｂｒａｋｅ　ｅｔａｌ、、　　Ｐｒｏｃ、　　Ｎａｔ
ｌ、　　Ａｃａｄ、　　Ｓｃｉ、　）ＵＳＡ　　８１巻
：４６４２頁　１９８４年）。

数組換え体プレＳ−１／プレ５−２−保持アルファ接合
因子プラスミドがＳ、セレビシェ株ＪＲＹ１８８を形質
転換するのに用いられ、形質転換されたクローンが選択
された。細胞は合成選択（ｌｅｕ−）培地中で３７℃で
生育させられた；その後、Ａ６００−０．５の細胞は同
じ培地で２３℃で生育させられた。溶菌液が調製され、
５ＤＳ−ＰＡＧＥで解析され、ニトロセルロースにウェ
スタンプロットされた。ｐ２１産物が、形質転換株にの
み存在することおよび回復期ヒトＨＢ血清との反応性の
点でプレＳ−１／プレＳ−２に選択的であることが見い
だされた。

実施例６ 免疫アフイニチー　クロマトグラフィー法によるプレ５
−１７プレＳ−２／Ｓの粒状での精製 実施例３で記載されたように構築された組換え体Ｓ、セ
レビシェ（アミノ酸２−１５を含む完全プレＳ配列〕が
、実施例３で記載されたように配合した９、　０リツト
ルの合成選択グリセロール−乳酸培地を充填した１６リ
ツトルのニュー　ブルンスウイツク　サイエンチフィツ
ク発酵槽中で生育させられた。発酵条件は、２５０ｒｐ
ｎｌ攪拌、２．５リツトル工ア／分　３０℃であった。

Ａ６６°＝　０．２５にまで生育の後、産物の合成がガ
ラクトース（２％（ｗ／ｖ））の添加により誘導され、
発酵はさらに３３時間最終Ａ　８６°−２，４０まで続
けられた。該酵母細胞はアミコンＤＣ−１０ユニット中
でミクロろ過により集菌され、３０ｄのバッファーＡ　
（０，１Ｍ　　Ｎａｇ　ＨＰＯ４、ｐＨ７，２，０，５
Ｍ　Ｎａα）に懸濁され、スタンスデッド圧力容器中で
平方インチあたシフ５−８５ポンドで７回通過させるこ
とにより破壊された。該破壊細胞懸濁液（３１ｇｍ湿細
胞重量〕は、１２０−のバッファーＡで希釈され、トリ
トン（Ｔｒｉｔｏｎ　）　　Ｘ　−１００■が終濃度０
．５チＣｗ／マ）になるように添加され、１０．　ＯＯ
Ｏｘ　ｇ　２０分間４℃の遠心によシ清澄化された。該
清澄化した培養液は注がれ、抗原が樹脂上に吸着するよ
うに１９時間４℃でＨＢ　ｓ　Ａｇに対する抗体を結合
させたセファロース４Ｂ（マクアリア（Ｍｃ　ＡＬｅｅ
ｒ　）他、ネイチャー　３０７巻：１７８頁１９７８年
）とインキュベートされた。インキュベーション期間の
後、スラリーは以後の全段階のために室温まで暖められ
真空下で１５分間脱気された。脱気されたスラリーは、
２．５ｘ４００ｍカラム中へ注がれた。カラムが一杯ま
で充填されたら、結合していない蛋白はバッファーＡで
洗い出された。該抗原はバッファーＡ中の３Ｍ　　ＫＳ
ＣＮで溶出された。抗原を含む分画は、４℃で０．００
７　Ｍ　　Ｎａ２ＨＰＯ，、ｐＨ７，２，０，１５Ｍ　
ＮａｃＪ！　に対して透析され、２〇−中に１．０８１
１１１Ｆの蛋白を含む透析アフイニチー　プール（Ｄｉ
ａｌｙ＋ｓｅｄ　Ａｆｆｉｎｉｔｙ　Ｐｏｏｌ　）を形
成するように貯められた。１６−の透析アフイニチー　
プールは、５．６−の０．００６Ｍ　　Ｎａ２ＨＰＯ，
、ｐＨ７，２，０，１５ＭＮａαで４０ｍｃｇ／−に希
釈された。該産物はＭｉｌｌｅｘ　−Ｇ　Ｖ　　０．２
２　ｔｔｍ膜を通する過だよシ除菌された。透析アフィ
ニチー　プール中の産物の正体は、オースリア１反応性
によるＨＢｓＡｇの検出および重合ヒトアルブミン結合
活性によシ確認された。

実施例７ 免疫アフイニチー　クロマトグラフィー法によるプレＳ
−１／プレＳ−２／Ｓの粒状での精製 実施例４で記載されたように構築された組換え体Ｓ、セ
レビシェ（アミノ酸２−１５を含む完全プレＳ）がハイ
ソイ（アンバー）（Ｈｙｓｏｙ（ａｍｂｅｒ）　）　　
をもってペプトンに替えたことを除き記載（メソッド　
イン　イースト　ジエネチツクス（Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉ
ｎ　ＹｅａａｔＧｅｎｅｔｉｃｓ　）　　６１頁　コー
ルド　スプリングハーバ−ラボラトリ−、コールド　ス
プリング　ハーバ−、ニューヨーク中のＹＰＤ　）され
たように作られた９、　０リツトルの複合培地の充填さ
れた１６リツトルのニュー　ブルンスウィンク　サイエ
ンチフィツク発酵槽内で生育させられた。発酵条件は、
Ａ”’　＝Ｏ６６５からＡｏｏａ　ｓＩ！ｇ、　５０ま
で５００　ｒｐｍ攪拌、５．０リツトル　エアー７分　
３０℃４４時間であった。該酵母細胞は集菌され溶菌さ
れ、プレ５−１７プレＳ−２／Ｓ産物は実施例６に記載
されたように精製された。産物の正体は、（オースリア
■）反応性によるＨＢ　ａ　ＡＨの検出、重合ヒトアル
ブミン結合活性、そして回復期ヒト血清および放射能標
識したスタフィロコ力ス　アウレウ２Ａ蛋白を用いて示
されたウェスタンプロットでのｐ３９の存在により確認
された。

【図面の簡単な説明】

第１図Ａ、Ｂ及びＣはプラスミドｐ　ＹＧＡＰ／Ｐ　Ｓ
　ＳΔ、ｐＹＧＡＰ／ＰＳＳＣ，ｐｙＧＡＬ／ＰＳＳΔ
、ｐＹＧＡＩ、／ＰＳＳＣ。 ｐ　Ｙ　Ａ　Ｄ　）（２／　Ｐ　Ｓ　ＳΔ、ｐＹＡＤＨ
２／ＰＳ　Ｓ　Ｃ，およびＰ［ＪＣ１３／ＰＳＳＣの構
築を模式的に説明した図である。 第２図Ａ及びＢはプラスミドｐＹαＭＦ／ｐｓΔＳの構
築を模式的に説明した図である。 インコーホレーテッド 糟 安　　　井　　　幸　　　−辷

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、サツカロミセスまたはクリプトコカス科に由来する
   酵母種内でプラスミドの選択並 びに増幅するための酵母由来の配列、酵母 プロモーター、完全なプレＳ−２遺伝子、 少なくともＨＢＶプレＳ−１遺伝子の一部 をコードするＤＮＡ部分、酵母転写終結配 列を含むプラスミド発現ベクター。 ２、該部分がＨＢＶゲノム内のプレＳ−２遺伝子に隣接
   するプレＳ−１遺伝子内ヌクレ オチドに対応する特許請求の範囲第１項記 載のプラスミド発現ベクター。 ３、該部分がプレＳ−１ペプチドの全てをコードする特
   許請求の範囲第２項記載のプラスミド発現ベクター。 ４、加えてＨＢＶ　Ｓ遺伝子の全てを含む特許請求の範
   囲第２項記載のプラスミド発現 ベクター。 ５、加えてＨＢＶ　Ｓ遺伝子の全てを含む特許請求の範
   囲第３項記載のプラスミド発現 ベクター。 ６、該部分がプレＳ−１ペプチドのＮ−末端の１５アミ
   ノ酸を除くプレＳ−１ペプチド の全てをコードする特許請求の範囲第４項 記載のプラスミド発現ベクター。 ７、酵母プロモーターがＧＡＬ１０、ＡＤＨ２、α−接
   合因子、ＧＡＬ１、ＧＡＬ７、 ＭＥＬ１またはプラスミドが導入された宿 主に有毒でない程度の発現産物の生産を指 示するプロモーターである特許請求の範囲 第１項記載のプラスミド発現ベクター。 ８、酵母プロモーターがＧＡＬ１０、ＡＤＨ２またはα
   −接合因子である特許請求の範 囲第７項記載のプラスミド発現ベクター。 ９、特許請求の範囲第１項のプラスミドを含むサツカロ
   ミセスまたはクリプトコカス科 から由来する酵母種。 １０、種がサツカロミセス属からのものである特許請求
   の範囲第９項記載の酵母種。 １１、種がサツカロミセス　セレビシエである特許請求
   の範囲第１０項記載の酵母種。 １２、少なくともプレＳ−１ペプチドの一部およびプレ
   Ｓ−２ペプチドからなり他のＨＢ Ｖペプチドを含まないＨＢＶポリペプチド。 １３、全てのプレＳ−１ペプチドを含む特許請求の範囲
   第１２項記載のＨＢＶポリペプチ ド。 １４、加えて少なくともＳペプチドの一部を含み、他の
   ＨＢＶペプチドを含まない特許請 求の範囲第１２項記載のＨＢＶポリペプチ ド。 １５、全てのＳペプチドを含み、他のＨＢＶペプチドを
   含まない特許請求の範囲第１３項 記載のＨＢＶポリペプチド。 １６、（１）サツカロミセスまたはクリプトコカス科か
   ら選択された株の細胞を特許請求の範 囲第１項のプラスミド発現ベクターで形質 転換し、 （２）形質転換細胞を培養し、そして （３）得られた培養細胞または生育培地からペプチドを
   回収する ことからなる特許請求の範囲第１２項のペ プチドを得る方法。 １７、（１）サツカロミセスまたはクリプトコカス科か
   ら選択された株の細胞を特許請求の範 囲第１項のプラスミド発現ベクターで形質 転換し、 （２）形質転換細胞を培養し、そして （３）得られた培養細胞または生育培地からペプチドを
   回収することからなる特許請求の 範囲第１３項のペプチドを得る方法。 １８、（１）サツカロミセスまたはクリプトコカス科か
   ら選択された株の細胞を特許請求の範 囲第１項のプラスミド発現ベクターで形質 転換し、 （２）形質転換細胞を培養し、そして （３）得られた培養細胞または生育培地からペプチドを
   回収することからなる特許請求の 範囲第１４項のペプチドを得る方法。 １９、（１）サツカロミセスまたはクリプトコカス科か
   ら選択された株の細胞を特許請求の範 囲第１項のプラスミド発現ベクターで形質 転換し、 （２）形質転換細胞を培養し、そして （３）得られた培養細胞または生育培地からペプチドを
   回収することからなる特許請求の 範囲第１５項のペプチドを粒状に得る方法。 ２０、生理的に受容可能な希釈剤中の特許請求の範囲第
   １２項のポリペプチドからなるワ クチン。 ２１、生理的に受容可能な希釈剤中の特許請求の範囲第
   １３項のポリペプチドからなるワ クチン。 ２２、生理的に受容可能な希釈剤中の特許請求の範囲第
   １４項のポリペプチドからなるワ クチン。 ２３、生理的に受容可能な希釈剤中の特許請求の範囲第
   １５項のポリペプチドからなるワ クチン。