JP2749010B2 - 新規ｄｎａおよびそれを用いたポリペプチドの製造法 - Google Patents
新規ｄｎａおよびそれを用いたポリペプチドの製造法Info
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Description
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は新規ＤＮＡ、該ＤＮ
Ａを有する形質転換体および該形質転換体を用いるポリ
ペプチドの製造法に関する。 【０００２】 【従来の技術】ヒトＢ型肝炎は、ＤＮＡウイルスの１種
であるＢ型肝炎ウイルス（Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｂ Ｖ
ｉｒｕｓ；以下、ＨＢＶと称することもある）の感染に
よって発症する。ＨＢＶは、デン粒子としてその性状が
知られており、このウイルス粒子の表面にはＨＢＶ表面
抗原（以下、ＨＢｓＡｇと略称する）、粒子内部に一部
分単鎖部分をもつ二重鎖環状ＤＮＡ、ＨＢＶコア抗原
（以下、ＨＢｃＡｇと略称する）、ＨＢＶｅ抗原（ＨＢ
ｅＡｇ）が存在し、また二重鎖ＤＮＡの単鎖部分を修復
する酵素として内存性ＤＮＡ合成酵素の活性が検出され
ている。ＨＢＶ ＤＮＡは分子量２．１×１０6ダルトン
で約３,２００の塩基対を有する。ＨＢｓＡｇの抗原性
は共通抗原のａを中心にａｄｒ，ａｄｗ，ａｙｒ，ａｙ
ｗの４種類が知られている。ＨＢｃＡｇはＨＢＶ感染の
早期診断のための診断用試薬として使用できる。すなわ
ち、ＨＢＶに感染すると抗ＨＢｓ抗体が血中に現われる
前に、抗ＨＢｃ抗体が出現するので、これを検出するこ
とによりＨＢＶ感染の有無を早期に判定できる。また、
ＨＢｃＡｇは最近、ＨＢＶの感染防御に有効であるとの
報告もなされている。一方、ＨＢｅＡｇを含有する血液
はデン粒子の含有量も多く、ＨＢＶの感染性のある血液
として危険性が高い。それ故、ＨＢｅＡｇの存在の有無
を知ることはＨＢＶ感染患者の治療においても重要であ
り、ＨＢＶ感染の診断に必須である。 【０００３】 【発明が解決しようとする課題】しかしながら、ＨＢｃ
Ａｇを得るには一度デン粒子を集め、この中のＨＢｃＡ
ｇを分離しなければならないが、デン粒子中に含まれる
ＨＢｃＡｇは微量であるため、これを安全に、しかも大
量に得る方法の確立が望まれていた。 【０００４】 【課題を解決するための手段】本発明者等は上記課題を
解決すべく研究を重ねた結果、ＨＢｃＡｇを遺伝子工学
的方法により、これを大量に得る方法を提供することに
成功したものである。即ち、本発明はＢ型肝炎ウイルス
ｃ抗原性を示すポリペプチドをコードするＤＮＡを含有
する組換えＤＮＡ、該組換えＤＮＡを含有する形質転換
体、該形質転換体を培養するＢ型肝炎ウイルスｃ抗原性
を示すポリペプチドの製造法に関し、更に詳しくは
（１）プロモーター、該プロモーターの下流に、翻訳開
始コドン、Ｂ型肝炎ウイルスｃ抗原性を示すポリペプチ
ドをコードするＤＮＡおよびその直後に停止コドンを連
結してなる組換えＤＮＡにおいて、該プロモーターのＳ
Ｄ配列と翻訳開始コドンとの間の配列がＡＴＣＧＧＧＣ
であることを特徴とする組換えＤＮＡ、（２）次のプラ
スミド： ｐＴＢ(４)３６９（ＦＥＲＭ ＢＰ−１１５３） ｐＴＢ(４)３６９−４ ｐＴＢ(４)３６９−３２および ｐＴＢ(４)３６９−４１ から選ばれるものである、（１）記載の組換えＤＮＡ、
（３）プロモーター、該プロモーターの下流に、翻訳開
始コドン、Ｂ型肝炎ウイルスｃ抗原性を示すポリペプチ
ドをコードするＤＮＡおよびその直後に停止コドンを連
結してなる組換えＤＮＡであって、該プロモーターのＳ
Ｄ配列と翻訳開始コドンとの間の配列がＡＴＣＧＧＧＣ
であることを特徴とする組換えＤＮＡを含有する形質転
換体、および（４）プロモーター、該プロモーターの下
流に、翻訳開始コドン、Ｂ型肝炎ウイルスｃ抗原性を示
すポリペプチドをコードするＤＮＡおよびその直後に停
止コドンを連結してなる組換えＤＮＡにおいて、該プロ
モーターのＳＤ配列と翻訳開始コドンとの間の配列がＡ
ＴＣＧＧＧＣであることを特徴とする組換えＤＮＡを含
有する形質転換体を培養し、該培養物からＢ型肝炎ウイ
ルスｃ抗原性を示すポリペプチドを回収することを特徴
とする、Ｂ型肝炎ウイルスｃ抗原性を示すポリペプチド
の製造法、を提供するものである。 【０００５】また本発明のＢ型肝炎ウイルスｃ抗原性を
示すポリペプチドに密接に関連するＢ型肝炎ウイルスｅ
抗原性を示すポリペプチドに関する次のものについても
参考のために記載している。 （１）次のアミノ酸配列： Met Asp Ile Asp Pro Tyr Lys Glu Phe Gly Ala Thr Val Glu Leu Leu Ser Phe Leu Pro Ser Asp Phe Phe Pro Ser Val Arg Asp Leu Leu Asp Thr Ala Ser Ala Leu Tyr Arg Glu Ala Leu Glu Ser Pro Glu His Cys Ser Pro His His Thr Ala Leu Arg Gln Ala Ile Leu Cys Trp Gly Glu Leu Met Thr Leu Ala Thr Trp Val Gly Asn Asn Leu Gln Asp Pro Ala Ser Arg Asp Leu Val Val Asn Tyr Val Asn Thr Asn Met Gly Leu Lys Ile Arg Gln Leu Leu Trp Phe His Ile Ser Cys Leu Thr Phe Gly Arg Glu Thr Val Leu Glu Tyr Leu Val Ser Phe Gly Val Trp Ile Arg Thr Pro Pro Ala Tyr Arg Pro Pro Asn Ala Pro Ile Leu Ser Thr Leu Pro Ile Thr Asn、 Met Asp Ile Asp Pro Tyr Lys Glu Phe Gly Ala Thr Val Glu Leu Leu Ser Phe Leu Pro Ser Asp Phe Phe Pro Ser Val Arg Asp Leu Leu Asp Thr Ala Ser Ala Leu Tyr Arg Glu Ala Leu Glu Ser Pro Glu His Cys Ser Pro His His Thr Ala Leu Arg Gln Ala Ile Leu Cys Trp Gly Glu Leu Met Thr Leu Ala Thr Trp Val Gly Asn Asn Leu Gln Asp Pro Ala Ser Arg Asp Leu Val Val Asn Tyr Val Asn Thr Asn Met Gly Leu Lys Ile Arg Gln Leu Leu Trp Phe His Ile Ser Cys Leu Thr Phe Gly Arg Glu Thr Val Leu Glu Tyr Leu Val Ser Phe Gly Val Trp Ile Arg Thr Pro Pro Ala Tyr Arg Pro Pro Asn Ala Pro Arg Ile Leu Glu Asp Glu Arg Ala Ser、 Met Asp Ile Asp Pro Tyr Lys Glu Phe Gly Ala Thr Val Glu Leu Leu Ser Phe Leu Pro Ser Asp Phe Phe Pro Ser Val Arg Asp Leu Val Val Asn Tyr Val Asn Thr Asn Met Gly Leu Lys Ile Arg Gln Leu Leu Trp Phe His Ile Ser Cys Leu Thr Phe Gly Arg Glu Thr Val Leu Glu Tyr Leu Val Ser Phe Gly Val Trp Ile Arg Thr Pro Pro Ala Tyr Arg Pro Pro Asn Ala Pro Arg Ile Leu Glu Asp Glu Arg Ala Ser、または Met Asp Ile Asp Pro Tyr Lys Glu Phe Gly Ala Thr Val Glu Leu Leu Ser Phe Leu Pro Ser Asp Phe Phe Pro Ser Val Arg Asp Leu Leu Asp Thr Ala Ser Ala Leu Tyr Arg Glu Ala Leu Glu Ser Pro Glu His Cys Ser Pro His His Thr Ala Leu Arg Gln Ala Ile Leu Cys Trp Gly Glu Leu Met Thr Leu Ala Thr Trp Val Gly Asn Asn Leu Gln Asp Pro Ala Ser Arg Asp Leu Val Val Asn Tyr Val Asn Thr Asn Met Gly Leu Lys Ile Arg Gln Leu Leu Trp Phe His Ile Ser Cys Leu Thr Phe Gly Arg Glu Thr Val Leu Glu Tyr Leu Val Ser 、 を有するＢ型肝炎ウイルスｅ抗原性を示すポリペプチ
ド、（２）プロモーター、該プロモーターの下流に、翻
訳開始コドン、Ｂ型肝炎ウイルスｅ抗原性を示すポリペ
プチドをコードするＤＮＡおよびその直後に停止コドン
を連結してなる組換えＤＮＡを含有する形質転換体を培
養し、該培養物からＢ型肝炎ウイルスｅ抗原性を示すポ
リペプチドを回収することを特徴とする、Ｂ型肝炎ウイ
ルスｅ抗原性を示すポリペプチドの製造法、および
（３）プロモーターのＳＤ配列と翻訳開始コドンとの間
の配列がＡＴＣＧＧＧＣである、（２）記載のＢ型肝炎
ウイルスｅ抗原性を示すポリペプチドの製造法。 【０００６】Ｂ型肝炎ウイルスｅ抗原性を示すポリペプ
チドを生産する形質転換体の宿主たる微生物としてはＢ
型肝炎ウイルスｅ抗原性を示すポリペプチドを生産する
能力を有するものであればいかなるものであってもよい
が、プロモーターの下流に、翻訳開始コドン、Ｂ型肝炎
ウイルスｅ抗原性を示すポリペプチドをコードするＤＮ
Ａおよびその直後に停止コドンを連結してなる組換えＤ
ＮＡを保持する大腸菌、酵母などがあげられるが、なか
でも上記組換えＤＮＡを保持する大腸菌が好ましい。プ
ロモーターとしては、ＲＮＡポリメラーゼが結合するこ
とによってｍＲＮＡ合成を開始させるのに必要な部位を
含むものであれば、いかなるものであってもよい。たと
えば大腸菌を宿主として用いる場合に使用するプロモー
ターとしてはｔｒｐプロモーター，ｒｅｃＡプロモータ
ー，ｌａｃプロモーター，λＰLプロモーター，ｔｕｆ
Ｂプロモーターなどがあげられ、とりわけｔｒｐプロモ
ーターが好適である。さらに好ましくは、プロモーター
中のＳＤ〔シャイン−ダルガーノ（Shine-Dalgarno)〕
配列と、後述の翻訳開始コドンとの間の配列がＡＴＣＧ
ＧＧＣであるプロモーターがあげられる。たとえば酵母
を宿主として使用する場合においては酵母で機能しうる
プロモーターであればいかなるものであってもよい。翻
訳開始コドンとしては好ましくはＡＴＧがあげられる。
本発明のＢ型肝炎ウイルスｃ抗原性を示すポリペプチド
をコードするＤＮＡとしてはいかなるサブタイプのＢ型
肝炎ウイルスｃ抗原性を示すポリペプチドをコードする
ＤＮＡであってもよいが、図２に示されるポリペプチド
をコードするＤＮＡ（ａｄｗ型）が好ましい。さらに好
ましくは、図１（ａｄｗ型ＨＢＶ ＤＮＡの全塩基配列
を示す）に示される塩基配列順序１９０１〜２４５５の
ＤＮＡ（ａｄｗ型）がさらに好ましい。Ｂ型肝炎ウイル
スｅ抗原性を示すポリペプチドをコードするＤＮＡとし
てはいかなるサブタイプのＢ型肝炎ウイルスｅ抗原性を
示すポリペプチドをコードするＤＮＡであってもよい
が、図２に示されるアミノ酸配列順序１より始まり９５
ないし１８４のポリペプチド（ａｄｗ型）をコードする
ＤＮＡが好ましい。さらに好ましくは、図１に示される
塩基配列順序１９０１より始まり２２６３（２２６３番
目の塩基はＣでもよい）ないし２３５６のＤＮＡ（ａｄ
ｗ型）がさらに好ましい。Ｂ型肝炎ウイルスｃ抗原性を
示すポリペプチドをコードするＤＮＡは、生産されるポ
リペプチドの抗原性が失なわれない限り、一部のアミノ
酸，ペプチドを欠除、他のアミノ酸，ペプチドへの置
換、あるいは他のアミノ酸，ペプチドの付加がなされて
いるポリペプチドをコードするＤＮＡであってもよい。
停止コドンとしてはＴＡＡ，ＴＡＧ，ＴＧＡがあげられ
る。 【０００７】たとえばａｄｗ型ＨＢｃ抗原性を示すポリ
ペプチドをコードするＤＮＡは、ヌクレイック・アシッ
ズ・リサーチ（Nucleic Acids Res.)，１１巻，１７４
７頁（１９８３年）に記載されているｐＢＲ３２２−Ｅ
ｃｏＲＩ／ＨＢＶ９３３（ｐＨＢＶ９３３と略称）を制
限酵素ＨｈａＩ消化により断片化し、得られるＤＮＡ断
片のうちＨＢｃ抗原性を示すポリペプチドをコードする
ＤＮＡを含有する約１キロ塩基対のＤＮＡを分離し、Ｅ
ｃｏＲＩリンカーを結合した後、トリプトファンプロモ
ーターを含むｐｔｒｐ７８１〔ｐｔｒｐ７０１（ヨーロ
ッパ特許公開第００６８７１９号公報参照）を制限酵素
ＥｃｏＲＩ消化後、ＣｌａＩで部分分解し、生じたのり
しろ部分をＤＮＡポリメラーゼＩラージフラグメントで
修復し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを用いて環状化されたプラ
スミドであって、ＥｃｏＲＩ部位に近い方のＣｌａＩ部
位がこわれたもの〕のＥｃｏＲＩ部位に結合されたプラ
スミドｐＨＥ１を得る。さらに該プラスミドｐＨＥ１を
ＥｃｏＲＩ消化し、さらにヌクレアーゼＢａｌ ３１で
消化した後、ＣｌａＩリンカーを結合させ、ｔｒｐプロ
モーターを含むｐｔｒｐ７７１（ヨーロッパ特許公開第
００６８７１９号公報参照）のＣｌａΙ部位に挿入すれ
ば目的のＨＢｃ抗原性を示すポリペプチドをコードする
ＤＮＡを含有するプラスミドｐＴＢ３６８を得ることが
できる（図４参照）。該プラスミドで大腸菌（ＤＨ１，
χ１７７６，Ｃ６００など）を形質転換することにより
ＨＢｃ抗原性を示すポリペプチドの生産能を有する大腸
菌株が得られる。ａｄｗ型ＨＢｅ抗原性を示すポリペプ
チドをコードするＤＮＡは、たとえば適当な制限酵素
（例、ＡｖａＩ，ＡｖａII）でプラスミドｐＴＢ３６８
を切断し、必要によりさらにヌクレアーゼＢａｌ ３１
で消化した後、停止コドンを含む適当なリンカーを結合
させ、ｐｔｒｐ ７７１に組み込むことにより、目的の
ＨＢｅ抗原性を示すポリペプチドをコードするＤＮＡ含
有するプラスミドを得ることができる。得られたプラス
ミドで大腸菌（ＤＨ１，χ１７７６，Ｃ６００など）を
形質転換することによりＨＢｅ抗原性を示すポリペプチ
ドの生産能を有する大腸菌株が得られる（図５参照）。
ａｄｗ型以外のサブタイプのＨＢｃ抗原性を示すポリペ
プチドをコードするＤＮＡも上記と同様にして得ること
ができ、また、大腸菌以外の微生物を宿主として用いる
場合においても、該宿主において機能しうるプロモータ
ーを含有するプラスミドに上記ＤＮＡを挿入することに
より目的とするポリペプチドの生産能を有する微生物が
得られる。プロモーターのＳＤ配列と翻訳開始コドンと
の間の配列がＡＴＣＧＧＧＣである組換えＤＮＡはたと
えば、適当な制限酵素（例、ＥｃｏＲＩ）で処理した
後、Ｓ１ヌクレアーゼを作用させ、ライゲーション反応
を行うことにより得ることもできるが、オリゴヌクレチ
オド・ミュータジェネシス（oligonucleotide mutagene
sis）などの公知の方法を用いて作製することもでき
る。 【０００８】得られた大腸菌の形質転換体は自体公知の
培地で培養することができる。培地としてはＬブロス，
ペナセイ（Penassay）ブロス，グルコース，カザミノ酸
を含むＭ−９培地などの公知の培地があげられる。必要
によりプロモーターを効率よく働かせるために、たとえ
ば、３β−インドリルアクリル酸のような薬剤を加える
ことができる。培養は通常１５〜４３℃、好ましくは２
８〜４０℃で２〜２４時間、好ましくは３〜８時間行
い、必要により通気や攪拌を加えることもできる。培養
後、公知の方法で菌体を集め、緩衝液に懸濁し、超音波
処理、リゾチームおよび（または）凍結融解によって菌
体を破壊したのち、遠心分離により目的とするポリペプ
チドを含む抽出液を得る方法などの公知の方法を用いる
ことができる。また抽出液からの目的とするポリペプチ
ドの分離、精製も自体公知の方法により行なわれる。大
腸菌以外の微生物の場合も同様にして目的とするポリペ
プチドを得ることができる。 【０００９】 【作用】本発明の製造法で得られるＨＢｃ抗原性を示す
ポリペプチドは天然由来のＨＢｃ抗原と同様にＢ型肝炎
の診断剤，Ｂ型肝炎ウイルスの感染の防御（予防）剤と
して使用することができる。プロモーターのＳＤ配列と
翻訳開始コドンとの間の配列がＡＴＣＧＧＧＣである組
換えＤＮＡにおいては、ＨＢｃ抗原性を示すポリペプチ
ドの生産量が増大し、ＨＢｃ抗原の製造に有利である。 【００１０】 【例】以下に例を示して本発明をさらに具体的に説明す
るが、本発明はこれらに限定されるべきものではない。
また本発明のＨＢｃ抗原と密接に関連しているＨＢｅ抗
原についても参考のために記載している。 例１ プラスミドｐＨＢＶ９３３を制限酵素ＥｃｏＲＩおよび
ＨｈａＩで切断し、１％アガロースゲル電気泳動によ
り、ＨＢｃ抗原遺伝子を含むＤＮＡ断片（１００５ｂ
ｐ）を分離した。緩衝液中（１０ｍＭ酢酸ナトリウム，
１５０ｍＭ ＮａＣｌ，０．０５ｍＭ ＺｎＳＯ4，ｐＨ
４．０）でヌクレアーゼＳ１処理した後、ＥｃｏＲＩリ
ンカー ｄ（ＧＧＡＡＴＴＣＣ）を結合し、さらにＥｃ
ｏＲＩ処理した。このＤＮＡ断片をプラスミドｐｔｒｐ
７８１のＥｃｏＲＩ部位に挿入した後、これを用いて大
腸菌ＤＨ１を形質転換した。ＨＢｃＡｇ遺伝子が組み込
まれたプラスミド（ｐＨＢｃＨＥ１）を保持するクロー
ンよりプラスミドを抽出し、該プラスミドよりＥｃｏＲ
Ｉ ＤＮＡ断片を切り出した。５μｇの該ＤＮＡ断片を
緩衝液中（６００ｍＭ ＮａＣ１，２０ｍＭトリス・Ｈ
Ｃ１，ｐＨ８．０，１２ｍＭ ＣａＣ１2，１２ｍＭ Ｍ
ｇＣ１2，１．０ｍＭ ＥＤＴＡ）で２ユニットのＢａｌ
３１で２４℃，１分間処理した。Ｃ１ａＩリンカー ｄ
（ＣＡＴＣＧＡＴＧ）を結合したのち、Ｃ１ａＩで消化
した。該ＤＮＡ断片をｐｔｒｐ ７７１のＣ１ａＩ部位
に挿入し、これを用いて大腸菌ＤＨ１を形質転換させ、
テトラサイクリン耐性の形質転換体（Escherichia coli
ＤＨ１／ｐＴＢ３６８）を得た。 【００１１】例２ 例１で得られた形質転換体を８μｇ／ｍｌのテトラサイ
クリンを含むＭ−９培地（１０ｍｌ）中、３７℃で培養
し、クレット・ユニット(Klett unit）［５８０ｎｍの
吸光度］が１８０〜２００の時、３β−インドリルアク
リル酸を２５μｇ／ｍｌの濃度に加えて、培養をさらに
２〜３時間続けた。培養液を５０００ｒｐｍ，１０分間
遠心分離して菌体を集め、１ｍｌの緩衝液（２０ｍＭ
トリス・ＨＣｌ，ｐＨ７．６，２０％ショ糖）に懸濁
し、リゾチーム（３ｍｇ／ｍｌ），ＥＤＴＡ（最終濃度
５ｍＭ）およびＰＭＳＦ（最終濃度１ｍＭ）を添加し
て、よく攪拌したのち、４℃で１時間静置した。超音波
破砕により菌体をさらに破壊し、１５０００ｒｐｍで２
０分間遠心を行い（２回）、得られた上清（抽出液）を
アボット社のＨＢｅリアキットを使用してＨＢｃ抗原価
の測定に使用した。その結果、該形質転換体はＨＢｃ抗
原発現クローンであることがわかった。該形質転換体の
菌体抽出液を生理食塩水で希釈し、その抗原価を測定し
た結果、少なくとも２５００倍希釈の濃度でもＨＢｃ抗
原の検出は可能であった。 【００１２】例３ 上記形質転換体（Escherichia coli ＤＨ１／ｐＴＢ３
６８）よりプラスミド（ｐＴＢ３６８）を抽出し、該プ
ラスミドを制限酵素ＡｖａΙで切断し、ヌクレアーゼＢ
ａｌ ３１で３０〜９０秒間処理した。停止コドンを有
するＥｃｏＲΙリンカーを結合し、ｐｔｒｐ７７１のＣ
ｌａΙ・ＥｃｏＲΙ部位に挿入したのち、大腸菌ＤＨ１
を形質転換した。得られた形質転換体をＭ−９培地で培
養し、例２に記載の方法でＨＢｅ抗原価を測定した。Ｈ
Ｂｅ抗原を産生する形質転換体（Escherichia coli Ｄ
Ｈ１／ｐＴＢ４４１，Escherichia coli ＤＨ１／ｐＴ
Ｂ４４９，Escherichia coli ＤＨ１／ｐＴＢ５５２）
を得た。 例４ 形質転換体の菌体抽出液を生理食塩水で５倍に希釈し、
アボット社のＨＢｅリアキットで抗原価を測定した。結
果を以下に示す。 Ｐ／Ｎ＝（ポジティブ ｃｐｍ）／（ネガティブ・コン
トロール ｃｐｍ）。 【００１３】例５ ｉ）大腸菌ＤＨ１／ｐＴＢ３６８の菌体抽出液をベック
マン超遠心機（ＳＷ５５ローター）で４０，０００ｒｐ
ｍ，４℃で６時間遠心し、沈殿物を緩衝液（２０ｍＭト
リス・ＨＣ１，１ｍＭ ＥＤＴＡ，０．１５Ｍ ＮａＣ
１，ｐＨ７．６）に溶解した。試料５０μｌに２倍濃度
のＳＤＳポリアクリルアミド用緩衝液（０．１５Ｍトリ
ス・ＨＣ１，ｐＨ６．８，４％ＳＤＳ，２０％グリセロ
ール，１０％ ２−メルカプトエタノール，０．００２
％ブロモフェノールブルー）５０μｌを加え、１００
℃，５〜１０分間加熱した後、ポリアクリルアミドゲル
電気泳動を行った。ニトロセルロースフィルターに上記
の分離された蛋白を電気的に吸着させ、125Ι−抗−Ｈ
Ｂｅ抗血清を反応させ、洗浄後オートラジオグラフを取
った。その結果、該形質転換体が産生する蛋白は分子量
が２１,５００〜２２,０００ダルトンと推定された（図
６参照）。 ii）大腸菌ＤＨ１／ｐＴＢ３６８の菌体抽出液に固形の
セシウムクロリドを加え、平均ρ＝１．２０となるよう
にした後、３８,０００ｒｐｍで７２時間遠心し、分画
した後、ＨＢｃ抗原の抗原性の存在する分画を検討した
結果、ＨＢｃ抗原はρ＝１．３４付近にピークとして分
画された（図７参照）。以上、ｉ，iiの結果から、該形
質転換体の産物はＨＢｃＡｇの粒子を形成していると推
定される。 【００１４】iii）大腸菌ＤＨ１／ｐＴＢ３６８，大腸
菌ｐＴＢ４４１の菌体抽出液０．５ｍｌを５〜２５％の
ショ糖濃度勾配液（２０ｍＭ トリス，ｐＨ７．６，
０．１５ＭＮａＣｌ，０．００１Ｍ ＥＤＴＡ）３５ｍ
ｌ上に重層し、２４，０００ｒｐｍ，４℃で４時間遠心
した後、３０本に分画した。それぞれの分画の２００μ
ｌずつをＨＢｃＡｇのＥＩＡ（Enzyme Immunoassayキッ
ト，アボット社）法によりＨＢｃＡｇ，ＨＢｅＡｇの検
出を行った。大腸菌ＤＨ１／ｐＴＢ３６８の産物は主に
分画９，１０に、大腸菌ＤＨ１／ｐＴＢ４４１の産物は
分画２０，２１，２２，２３に分画され（図８参照）、
前者は粒子状、後者は粒子の形態をとらないペプチドと
推定された。 iv）大腸菌ＤＨ１／ｐＴＢ３６８の菌体抽出液にＨＢＶ
感染チンパンジーの肝臓から抽出したＨＢｃＡｇ粒子で
免疫して得た抗ＨＢｃ抗血清を加えた後、抗体価の減少
を抗ＨＢｃ測定用キット（アボット社）で測定した結
果、抽出物は抗ＨＢｃ抗体と反応し、抗ＨＢｃ抗体を中
和することが明らかとなった。一方、大腸菌ＤＨ１／ｐ
ＴＢ４４１， 大腸菌ＤＨ１／ｐＴＢ４４９，大腸菌Ｄ
Ｈ１／ｐＴＢ５５２ の菌体抽出物は殆ど抗ＨＢｃ抗体
と反応しなかった。各形質転換体の抽出物と125Ι−抗
−ＨＢｃ抗体とを反応させ、125Ι−抗−ＨＢｃ抗体の
残存量を抗ＨＢｃ 測定用キット（アボット社）で検討
した結果を以下に示す。 【００１５】例７ 予め、約２００００ｃｐｍを示すよう生理食塩水で希釈
した菌体抽出物（大腸菌ＤＨ１／ｐＴＢ３６８，６４倍
希釈；大腸菌ＤＨ１／ｐＴＢ４４１，４倍希釈）および
血清ＨＢｅＡｇ（未希釈）１００μｌに、生理食塩水で
１００倍，５００倍，１０００倍に希釈したウサギ抗Ｈ
Ｂｃ抗体およびコントロールとして生理食塩水，固相Ｈ
Ｂｅ（ＨＢｃ）抗体を加え、室温一晩反応後、固相に結
合した抗原を測定した。結果はコントロールとして生理
食塩水を加えた系のカウントを１００％として％（パー
セント）で図１０に示した。なお、コントロールのカウ
ントは各々、大腸菌ＤＨ１／ｐＴＢ３６８，２２３４０
ｃｐｍ，大腸菌ＤＨ１／ｐＴＢ４４１，２３４７１ｃｐ
ｍ，血清ＨＢｅＡｇ，９４９１ｃｐｍであった。血清Ｈ
ＢｅＡｇはカウントで、他の約１／２量の抗原しか加え
ていないのにもかかわらず、図１０から明らかなように
抗ＨＢｃ抗体を添加してもカウントは最大１０％程度し
か低下しなかった。従ってこの抗ＨＢｃ抗体はＨＢｃＡ
ｇの検出にはほとんど影響を及ぼさないものと考えられ
る。大腸菌ＤＨ１／ｐＴＢ３６８抽出物では抗ＨＢｃ抗
体の添加により明らかにカウントの低下がみられ、産生
物がＨＢｃ抗原性を有していることがわかる。大腸菌Ｄ
Ｈ１／ｐＴＢ４４１抽出物では大腸菌ＤＨ１／ｐＴＢ３
６８抽出物のような明らかなカウントの低下はみられ
ず、産生物は主にＨＢｅ抗原性を示していることが示唆
される。 【００１６】例８ プラスミドpＴＢ４４１，ｐＴＢ４４９およびｐＴＢ５
５２に挿入されているＨＢeＡgをコードするＤＮＡの
3′末端側の塩基配列を以下に示す。 ｉ)pＴＢ４４１ ＣＣＡ・ＣＣＡ・ＡＡＴ・ＧＣＣ・ＣＣＴ・ＡＧＡ・ＡＴＴ・ＣＴＴ・ Pro Pro Asn Ala Pro Arg Ile Leu (134) ＧＡＡ・ＧＡＣ・ＧＡＡ・ＡＧＧ・ＧＣＣ・ＴＣＧ・ＴＧＡ Glu Asp Glu Arg Ala Ser − すなわち、該プラスミドにより生産されるペプチドはＨ
ＢcＡgのＣ末端側のアミノ酸47個が欠損（天然のＨＢe
ＡgのＣ末端側のアミノ酸 7個が欠損)し、9個の別のア
ミノ酸が付加したものである。 ii）pＴＢ４４９ ＡＧＡ・ＣＧＡ・ＣＧＧ・ＣＴＡ・ＧＡＡ・ＴＴＣ・ＴＴＧ・ＡＡＧ・ (2348) ＡＣＧ・ＡＡＡ・ＧＧＧ・ＣＣＴ・ＣＧＴ・ＧＡＴ・ＡＣＧ・ＣＣＴ・ ＡＴＴ・ＴＴＴ・ＡＴＡ・ＧＧＴ・ＴＡＡ すなわち、ＨＢcＡgのＣ末端側のアミノ酸33個が欠損
し、１６個の別のアミノ酸が付加している。 iii）pＴＢ５５２ ＧＴＡ・ＣＴＴ・ＧＡＡ・ＴＡＴ・ＴＴＧ・ＧＴＣ・ＴＣＣ・ＴＡＧ (2243) すなわち、ＨＢcＡgのＣ末端側のアミノ酸64個を欠損し
ている。 【００１７】例９ プラスミドｐＴＢ３６８を制限酵素ＥｃｏＲΙで切断し
た後、エクソヌクレアーゼＢａｌ３１で処理した。次
に、ＰｓｔＩリンカーｄ（ＧＣＴＧＣＡＧＣ）を結合
し、ＣｌａＩおよびＰｓｔＩで処理してＨＢｃＡｇ遺伝
子を含むＣｌａＩ・ＰｓｔＩＤＮＡ断片を得た。該ＤＮ
Ａ断片をｐｔｒｐ７７１のＣｌａＩ・ＰｓｔＩ部位に組
込んだ後、ＣｌａＩで切断し、ＥｃｏＲＩリンカーｄ
（ＧＧＡＡＴＴＣＣ）を結合させ、ＥｃｏＲＩおよびＰ
ｓｔＩ処理で得られたＤＮＡ断片をｐｔｒｐ７８１のＥ
ｃｏＲＩ・ＰｓｔＩ部位に組込み、これを用いて大腸菌
ＤＨ１を形質転換させ、プラスミドｐＴＢ（４）３６８
−１を保持する形質転換体（Escherichia coli ＤＨ１
／ｐＴＢ（４）３６８−１）を得た。 該形質転換体を
Ｍ−９培地で培養し、菌体抽出物のＨＢｃＡｇ産生量を
測定した結果、該形質転換体は大腸菌ＤＨ１／ｐＴＢ３
６８の約１０倍のＨＢｃＡｇ生産量が確認された。プラ
スミドｐＴＢ（４）３６８−１のプロモーター部位のＳ
Ｄ配列からＨＢｃＡｇ遺伝子の翻訳開始コドンまでの塩
基配列を調べた結果、１４ｂｐであった。ＳＤ配列とＡ
ＴＧとの間の塩基数を減らすためにｐＴＢ（４）３６８
−１をＥｃｏＲＩで切断し、Ｓ１ヌクレアーゼ処理した
後、ライゲーション（ligation)反応を行い、該反応液
を用いて、大腸菌ＤＨ１を形質転換し、プラスミドｐＴ
Ｂ（４）３６９を保持する大腸菌／ｐＴＢ（４）３６９
を得た。該形質転換体のＨＢｃＡｇ生産量を測定した結
果、大腸菌ＤＨ１／ｐＴＢ３６８の１０５倍量のＨＢｃ
Ａｇを生産することがわかった。プラスミドｐＴＢ
（４）３６９のＳＤ配列とＡＴＧとの間の塩基配列は以
下のとおり７ｂｐであった。 ５’ＡＡＡＡＧＧＧＴＡＴＣＧＧＧＣＡＴＧＳＤ。 【００１８】例１０ （ｉ）プラスミドｐＴＢ（４）３６９をＡｖａＩで切断
し、Klenow フラグメントで単鎖部分を二重鎖とした
後、ＰｓｔＩで処理し、大断片を分離し、ＰｓｔＩ認識
部位を有するＰｓｔＩストップリンカー5 'ＡＴＡＡＣＴＡＡＣＴＡＡＣＴＧＣＡ3'3 'ＴＡＴＴＧＡＴＴＧＡＴＴＧ5' を結合した。ＰｓｔＩで処理し、大断片を分離し、ライ
ゲーション反応を行い、プラスミドｐＴＢ（４）３６９
−４を得た（図１１参照）。 （ii）また、ｐＴＢ（４）３６９をＳｔｙＩで処理し、
小断片を得、該断片をＡｖａIIで処理した後、Klenow
フラグメントで修復した。前記のＰｓｔＩストップリン
カーを結合した後、ＨｐａＩおよびＰｓｔＩで処理し、
５０２ｂｐ断片を分離し、該断片をｐｔｒｐ７８１のＨ
ｐａＩ・ＰｓｔＩ部位に組込み、ｐＴＢ（４）３６９−
３２を得た（図１２参照）。 （iii）また、ｐＴＢ（４）３６９のＳｔｙＩ処理で得
られた小断片をＨｐａIIで処理した後、Klenow フラグ
メントで修復した。前記のＰｓｔＩストップリンカーを
結合した後、ＨｐａＩおよびＰｓｔＩで処理し、４７２
ｂｐ断片を分離し、該断片をｐｔｒｐ７７１のＨｐａＩ
・ＰｓｔＩ部位に組込み、ｐＴＢ（４）３６９−４１を
得た（図１２参照）。 （iv）ｐＴＢ４４１のＨＢｅＡｇ遺伝子中に２つ存在す
るＢｇｌII部位の５’側のＢｇｌII部位とベクター中の
ＰｓｔＩ部位間のＤＮＡ断片をｐＴＢ（４）３６９のＢ
ｇｌII（５’側）・ＰｓｔＩ部位に組込み、ｐＴＢ
（４）４４１−１を得た（図１３参照）。 （ｖ）ｐＴＢ４４１のＨＢｅＡｇ遺伝子中に２つ存在す
るＢｇｌII部位の３’側のＢｇｌII部位とベクター中の
ＰｓｔＩ部位間のＤＮＡ断片をｐＴＢ（４）３６９のＢ
ｇｌII（５’側）・ＰｓｔＩ部位に組込み、ｐＴＢ
（４）４４１−８を得た（図１４参照）。 （vi）ｐＴＢ５５２のＨＢｅＡｇ遺伝子中に２つ存在す
るＢｇｌII部位の５’側のＢｇｌII部位とベクター中の
ＰｓｔＩ部位間のＤＮＡ断片をｐＴＢ（４）３６９のＢ
ｇｌII（５’側）・ＰｓｔＩ部位に組込み、ｐＴＢ
（４）５５２−８を得た（図１５参照）。 【００１９】例１１ 例９および１０で得られたプラスミドを保持する大腸菌
ＤＨ１を例２と同様に培養した後、菌体を集め、ＥＤＴ
Ａおよびリゾチームを加え、超音波破砕により菌体抽出
液を得た。アボット社のＨＢｅ・ＥＩＡおよびコアザイ
ム（Corzyme）を用いてＨＢｃＡｇおよびＨＢｅＡｇの
測定を行った結果、ｐＴＢ(４)３６９，ｐＴＢ(４)３６
９−４，ｐＴＢ(４)３６９−３２またはｐＴＢ(４)３６
９−４１を保持する大腸菌ＤＨ１はＨＢｃＡｇおよびＨ
ＢｅＡｇを産生していることが、また、ｐＴＢ(４)４４
１−１またはｐＴＢ(４)５５２−８を保持する大腸菌Ｄ
Ｈ１はＨＢｅＡｇを産生していることがわかった。ｐＴ
Ｂ（４）４４１−８を保持する大腸菌ＤＨ１の菌体抽出
液を希釈し、アボット社のＲＩＡ ＨＢｅ測定キットで
抗原価を測定した。結果を以下に示す。 【００２０】例１２ プラスミドｐＴＢ（４）３６９−４，ｐＴＢ（４）３６
９−３２および ｐＴＢ３６９−４１に挿入されている
ＨＢｅＡｇをコードするＤＮＡの３’末端側の塩基配列
を以下に示す。 （ｉ）ｐＴＢ（４）３６９−４ ＡＴＡ・ＡＣＴ・ＡＡＣ・ＴＡＡ Ile Thr Asn − (182) （ii）ｐＴＢ（４）３６９−３２ ＡＴＡ・ＡＣＴ・ＡＡＣ・ＴＡＡ Ile Thr Asn − (154) （iii）ｐＴＢ（４）３６９−４１ ＡＴＡ・ＡＣＴ・ＡＡＣ・ＴＡＡ Ile Thr Asn − (145) プラスミドｐＴＢ（４）４４１−８はＨＢｃＡｇ遺伝子
中の２９〜８２番目のアミノ酸をコードする部位が欠損
し、Ｃ末端側のアミノ酸４７個をコードする部分が欠損
し、９個の別のアミノ酸をコードする塩基配列を有して
いる。 【００２１】例１３ ｐＴＢ（４）４４１−１またはｐＴＢ（４）５５２−８
を保持する大腸菌ＤＨ１のＨＢｅＡｇ抗原性を示す産生
物の分子量を125Ｉ−抗ＨＢｅ 抗血清を使用したウエ
スタン・ブロッテング（Western blotting）法〔Towbi
n,H, 「プロシージング オブ ナショナル アカデミー オ
ブ サイエンス(Proc.Natl.Acad.Sci. U.S.A.)７６巻、
９号、４３５０〜４３５４頁(１９７９)〕およびヒト抗
ＨＢｅ抗血清を使用した免疫沈降法により決定した。す
なわち、ウエスタン・ブロッテング 法によりｐＴＢ
（４）４４１−１を保持する大腸菌の産生物の分子量は
１５，０００〜１５，５００ダルトンであることがわか
った（図１６参照）。また、ｐＴＢ（４）５５２−８を
保持する大腸菌１を14Ｃ−アミノ酸存在下にＭ−９培地
で培養し、菌体抽出物にヒト抗ＨＢｅ抗血清を加えて３
７℃で反応させた後、ＰｒｏｔｅｉｎＡ（１０％溶液）
を加えて抗原抗体反応物を回収し、ポリアクリルアミド
ゲル（１７％）電気泳動を行い、オートラジオグラフィ
−により、産生物の分子量を測定した結果１３，０００
〜１３，５００ダルトンであることがわかった（図１
７）。なお、形質転換体の寄託機関および受託番号は以
下のとおりである。 なお、大腸菌ＤＨ１は公知の微生物である〔Selson,M.
E.ら，ネイチャー，第２１７巻，１１１０頁（１９６８
年）〕。ＩＦＯは財団法人発酵研究所の受託番号を、Ｆ
ＥＲＭは通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所
の受託番号を表す。 【００２２】 【発明の効果】ＨＢｃ抗原は天然にはＨＢＶ感染後のヒ
トあるいはチンパンジーのみから得ることしかできず、
量的にも制約されてきた。また、これらの疾患動物の取
扱いはＨＢＶ感染の危険を伴い、不都合であった。本発
明はこれらの問題を解決し、本発明によれば抗原性が天
然のものに近く、安価で、安全で、しかも大量にＨＢｃ
抗原性を示すポリペプチドが得られる。 【００２３】 【配列表】 配列番号：１ 配列の長さ：147 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク質 配列 Met Asp Ile Asp Pro Tyr Lys Glu Phe Gly Ala Thr Val Glu Leu Leu 1 5 10 15 Ser Phe Leu Pro Ser Asp Phe Phe Pro Ser Val Arg Asp Leu Leu Asp 20 25 30 Thr Ala Ser Ala Leu Tyr Arg Glu Ala Leu Glu Ser Pro Glu His Cys 35 40 45 Ser Pro His His Thr Ala Leu Arg Gln Ala Ile Leu Cys Trp Gly Glu 50 55 60 Leu Met Thr Leu Ala Thr Trp Val Gly Asn Asn Leu Gln Asp Pro Ala 65 70 75 80 Ser Arg Asp Leu Val Val Asn Tyr Val Asn Thr Asn Met Gly Leu Lys 85 90 95 Ile Arg Gln Leu Leu Trp Phe His Ile Ser Cys Leu Thr Phe Gly Arg 100 105 110 Glu Thr Val Leu Glu Tyr Leu Val Ser Phe Gly Val Trp Ile Arg Thr 115 120 125 Pro Pro Ala Tyr Arg Pro Pro Asn Ala Pro Ile Leu Ser Thr Leu Pro 130 135 140 Ile Thr Asn 145。 【００２４】配列番号：１ 配列の長さ：147 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク質 配列 Met Asp Ile Asp Pro Tyr Lys Glu Phe Gly Ala Thr Val Glu Leu Leu 1 5 10 15 Ser Phe Leu Pro Ser Asp Phe Phe Pro Ser Val Arg Asp Leu Leu Asp 20 25 30 Thr Ala Ser Ala Leu Tyr Arg Glu Ala Leu Glu Ser Pro Glu His Cys 35 40 45 Ser Pro His His Thr Ala Leu Arg Gln Ala Ile Leu Cys Trp Gly Glu 50 55 60 Leu Met Thr Leu Ala Thr Trp Val Gly Asn Asn Leu Gln Asp Pro Ala 65 70 75 80 Ser Arg Asp Leu Val Val Asn Tyr Val Asn Thr Asn Met Gly Leu Lys 85 90 95 Ile Arg Gln Leu Leu Trp Phe His Ile Ser Cys Leu Thr Phe Gly Arg 100 105 110 Glu Thr Val Leu Glu Tyr Leu Val Ser Phe Gly Val Trp Ile Arg Thr 115 120 125 Pro Pro Ala Tyr Arg Pro Pro Asn Ala Pro Arg Ile Leu Glu Asp Glu 130 135 140 Arg Ala Ser 145。 【００２５】配列番号：３ 配列の長さ：93 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク質 配列 Met Asp Ile Asp Pro Tyr Lys Glu Phe Gly Ala Thr Val Glu Leu Leu 1 5 10 15 Ser Phe Leu Pro Ser Asp Phe Phe Pro Ser Val Arg Asp Leu Val Val 20 25 30 Asn Tyr Val Asn Thr Asn Met Gly Leu Lys Ile Arg Gln Leu Leu Trp 35 40 45 Phe His Ile Ser Cys Leu Thr Phe Gly Arg Glu Thr Val Leu Glu Tyr 50 55 60 Leu Val Ser Phe Gly Val Trp Ile Arg Thr Pro Pro Ala Tyr Arg Pro 65 70 75 80 Pro Asn Ala Pro Arg Ile Leu Glu Asp Glu Arg Ala Ser 85 90。 【００２６】配列番号：４ 配列の長さ：121 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク質 配列 Met Asp Ile Asp Pro Tyr Lys Glu Phe Gly Ala Thr Val Glu Leu Leu 1 5 10 15 Ser Phe Leu Pro Ser Asp Phe Phe Pro Ser Val Arg Asp Leu Leu Asp 20 25 30 Thr Ala Ser Ala Leu Tyr Arg Glu Ala Leu Glu Ser Pro Glu His Cys 35 40 45 Ser Pro His His Thr Ala Leu Arg Gln Ala Ile Leu Cys Trp Gly Glu 50 55 60 Leu Met Thr Leu Ala Thr Trp Val Gly Asn Asn Leu Gln Asp Pro Ala 65 70 75 80 Ser Arg Asp Leu Val Val Asn Tyr Val Asn Thr Asn Met Gly Leu Lys 85 90 95 Ile Arg Gln Leu Leu Trp Phe His Ile Ser Cys Leu Thr Phe Gly Arg 100 105 110 Glu Thr Val Leu Glu Tyr Leu Val Ser 115 120。
Ａを有する形質転換体および該形質転換体を用いるポリ
ペプチドの製造法に関する。 【０００２】 【従来の技術】ヒトＢ型肝炎は、ＤＮＡウイルスの１種
であるＢ型肝炎ウイルス（Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｂ Ｖ
ｉｒｕｓ；以下、ＨＢＶと称することもある）の感染に
よって発症する。ＨＢＶは、デン粒子としてその性状が
知られており、このウイルス粒子の表面にはＨＢＶ表面
抗原（以下、ＨＢｓＡｇと略称する）、粒子内部に一部
分単鎖部分をもつ二重鎖環状ＤＮＡ、ＨＢＶコア抗原
（以下、ＨＢｃＡｇと略称する）、ＨＢＶｅ抗原（ＨＢ
ｅＡｇ）が存在し、また二重鎖ＤＮＡの単鎖部分を修復
する酵素として内存性ＤＮＡ合成酵素の活性が検出され
ている。ＨＢＶ ＤＮＡは分子量２．１×１０6ダルトン
で約３,２００の塩基対を有する。ＨＢｓＡｇの抗原性
は共通抗原のａを中心にａｄｒ，ａｄｗ，ａｙｒ，ａｙ
ｗの４種類が知られている。ＨＢｃＡｇはＨＢＶ感染の
早期診断のための診断用試薬として使用できる。すなわ
ち、ＨＢＶに感染すると抗ＨＢｓ抗体が血中に現われる
前に、抗ＨＢｃ抗体が出現するので、これを検出するこ
とによりＨＢＶ感染の有無を早期に判定できる。また、
ＨＢｃＡｇは最近、ＨＢＶの感染防御に有効であるとの
報告もなされている。一方、ＨＢｅＡｇを含有する血液
はデン粒子の含有量も多く、ＨＢＶの感染性のある血液
として危険性が高い。それ故、ＨＢｅＡｇの存在の有無
を知ることはＨＢＶ感染患者の治療においても重要であ
り、ＨＢＶ感染の診断に必須である。 【０００３】 【発明が解決しようとする課題】しかしながら、ＨＢｃ
Ａｇを得るには一度デン粒子を集め、この中のＨＢｃＡ
ｇを分離しなければならないが、デン粒子中に含まれる
ＨＢｃＡｇは微量であるため、これを安全に、しかも大
量に得る方法の確立が望まれていた。 【０００４】 【課題を解決するための手段】本発明者等は上記課題を
解決すべく研究を重ねた結果、ＨＢｃＡｇを遺伝子工学
的方法により、これを大量に得る方法を提供することに
成功したものである。即ち、本発明はＢ型肝炎ウイルス
ｃ抗原性を示すポリペプチドをコードするＤＮＡを含有
する組換えＤＮＡ、該組換えＤＮＡを含有する形質転換
体、該形質転換体を培養するＢ型肝炎ウイルスｃ抗原性
を示すポリペプチドの製造法に関し、更に詳しくは
（１）プロモーター、該プロモーターの下流に、翻訳開
始コドン、Ｂ型肝炎ウイルスｃ抗原性を示すポリペプチ
ドをコードするＤＮＡおよびその直後に停止コドンを連
結してなる組換えＤＮＡにおいて、該プロモーターのＳ
Ｄ配列と翻訳開始コドンとの間の配列がＡＴＣＧＧＧＣ
であることを特徴とする組換えＤＮＡ、（２）次のプラ
スミド： ｐＴＢ(４)３６９（ＦＥＲＭ ＢＰ−１１５３） ｐＴＢ(４)３６９−４ ｐＴＢ(４)３６９−３２および ｐＴＢ(４)３６９−４１ から選ばれるものである、（１）記載の組換えＤＮＡ、
（３）プロモーター、該プロモーターの下流に、翻訳開
始コドン、Ｂ型肝炎ウイルスｃ抗原性を示すポリペプチ
ドをコードするＤＮＡおよびその直後に停止コドンを連
結してなる組換えＤＮＡであって、該プロモーターのＳ
Ｄ配列と翻訳開始コドンとの間の配列がＡＴＣＧＧＧＣ
であることを特徴とする組換えＤＮＡを含有する形質転
換体、および（４）プロモーター、該プロモーターの下
流に、翻訳開始コドン、Ｂ型肝炎ウイルスｃ抗原性を示
すポリペプチドをコードするＤＮＡおよびその直後に停
止コドンを連結してなる組換えＤＮＡにおいて、該プロ
モーターのＳＤ配列と翻訳開始コドンとの間の配列がＡ
ＴＣＧＧＧＣであることを特徴とする組換えＤＮＡを含
有する形質転換体を培養し、該培養物からＢ型肝炎ウイ
ルスｃ抗原性を示すポリペプチドを回収することを特徴
とする、Ｂ型肝炎ウイルスｃ抗原性を示すポリペプチド
の製造法、を提供するものである。 【０００５】また本発明のＢ型肝炎ウイルスｃ抗原性を
示すポリペプチドに密接に関連するＢ型肝炎ウイルスｅ
抗原性を示すポリペプチドに関する次のものについても
参考のために記載している。 （１）次のアミノ酸配列： Met Asp Ile Asp Pro Tyr Lys Glu Phe Gly Ala Thr Val Glu Leu Leu Ser Phe Leu Pro Ser Asp Phe Phe Pro Ser Val Arg Asp Leu Leu Asp Thr Ala Ser Ala Leu Tyr Arg Glu Ala Leu Glu Ser Pro Glu His Cys Ser Pro His His Thr Ala Leu Arg Gln Ala Ile Leu Cys Trp Gly Glu Leu Met Thr Leu Ala Thr Trp Val Gly Asn Asn Leu Gln Asp Pro Ala Ser Arg Asp Leu Val Val Asn Tyr Val Asn Thr Asn Met Gly Leu Lys Ile Arg Gln Leu Leu Trp Phe His Ile Ser Cys Leu Thr Phe Gly Arg Glu Thr Val Leu Glu Tyr Leu Val Ser Phe Gly Val Trp Ile Arg Thr Pro Pro Ala Tyr Arg Pro Pro Asn Ala Pro Ile Leu Ser Thr Leu Pro Ile Thr Asn、 Met Asp Ile Asp Pro Tyr Lys Glu Phe Gly Ala Thr Val Glu Leu Leu Ser Phe Leu Pro Ser Asp Phe Phe Pro Ser Val Arg Asp Leu Leu Asp Thr Ala Ser Ala Leu Tyr Arg Glu Ala Leu Glu Ser Pro Glu His Cys Ser Pro His His Thr Ala Leu Arg Gln Ala Ile Leu Cys Trp Gly Glu Leu Met Thr Leu Ala Thr Trp Val Gly Asn Asn Leu Gln Asp Pro Ala Ser Arg Asp Leu Val Val Asn Tyr Val Asn Thr Asn Met Gly Leu Lys Ile Arg Gln Leu Leu Trp Phe His Ile Ser Cys Leu Thr Phe Gly Arg Glu Thr Val Leu Glu Tyr Leu Val Ser Phe Gly Val Trp Ile Arg Thr Pro Pro Ala Tyr Arg Pro Pro Asn Ala Pro Arg Ile Leu Glu Asp Glu Arg Ala Ser、 Met Asp Ile Asp Pro Tyr Lys Glu Phe Gly Ala Thr Val Glu Leu Leu Ser Phe Leu Pro Ser Asp Phe Phe Pro Ser Val Arg Asp Leu Val Val Asn Tyr Val Asn Thr Asn Met Gly Leu Lys Ile Arg Gln Leu Leu Trp Phe His Ile Ser Cys Leu Thr Phe Gly Arg Glu Thr Val Leu Glu Tyr Leu Val Ser Phe Gly Val Trp Ile Arg Thr Pro Pro Ala Tyr Arg Pro Pro Asn Ala Pro Arg Ile Leu Glu Asp Glu Arg Ala Ser、または Met Asp Ile Asp Pro Tyr Lys Glu Phe Gly Ala Thr Val Glu Leu Leu Ser Phe Leu Pro Ser Asp Phe Phe Pro Ser Val Arg Asp Leu Leu Asp Thr Ala Ser Ala Leu Tyr Arg Glu Ala Leu Glu Ser Pro Glu His Cys Ser Pro His His Thr Ala Leu Arg Gln Ala Ile Leu Cys Trp Gly Glu Leu Met Thr Leu Ala Thr Trp Val Gly Asn Asn Leu Gln Asp Pro Ala Ser Arg Asp Leu Val Val Asn Tyr Val Asn Thr Asn Met Gly Leu Lys Ile Arg Gln Leu Leu Trp Phe His Ile Ser Cys Leu Thr Phe Gly Arg Glu Thr Val Leu Glu Tyr Leu Val Ser 、 を有するＢ型肝炎ウイルスｅ抗原性を示すポリペプチ
ド、（２）プロモーター、該プロモーターの下流に、翻
訳開始コドン、Ｂ型肝炎ウイルスｅ抗原性を示すポリペ
プチドをコードするＤＮＡおよびその直後に停止コドン
を連結してなる組換えＤＮＡを含有する形質転換体を培
養し、該培養物からＢ型肝炎ウイルスｅ抗原性を示すポ
リペプチドを回収することを特徴とする、Ｂ型肝炎ウイ
ルスｅ抗原性を示すポリペプチドの製造法、および
（３）プロモーターのＳＤ配列と翻訳開始コドンとの間
の配列がＡＴＣＧＧＧＣである、（２）記載のＢ型肝炎
ウイルスｅ抗原性を示すポリペプチドの製造法。 【０００６】Ｂ型肝炎ウイルスｅ抗原性を示すポリペプ
チドを生産する形質転換体の宿主たる微生物としてはＢ
型肝炎ウイルスｅ抗原性を示すポリペプチドを生産する
能力を有するものであればいかなるものであってもよい
が、プロモーターの下流に、翻訳開始コドン、Ｂ型肝炎
ウイルスｅ抗原性を示すポリペプチドをコードするＤＮ
Ａおよびその直後に停止コドンを連結してなる組換えＤ
ＮＡを保持する大腸菌、酵母などがあげられるが、なか
でも上記組換えＤＮＡを保持する大腸菌が好ましい。プ
ロモーターとしては、ＲＮＡポリメラーゼが結合するこ
とによってｍＲＮＡ合成を開始させるのに必要な部位を
含むものであれば、いかなるものであってもよい。たと
えば大腸菌を宿主として用いる場合に使用するプロモー
ターとしてはｔｒｐプロモーター，ｒｅｃＡプロモータ
ー，ｌａｃプロモーター，λＰLプロモーター，ｔｕｆ
Ｂプロモーターなどがあげられ、とりわけｔｒｐプロモ
ーターが好適である。さらに好ましくは、プロモーター
中のＳＤ〔シャイン−ダルガーノ（Shine-Dalgarno)〕
配列と、後述の翻訳開始コドンとの間の配列がＡＴＣＧ
ＧＧＣであるプロモーターがあげられる。たとえば酵母
を宿主として使用する場合においては酵母で機能しうる
プロモーターであればいかなるものであってもよい。翻
訳開始コドンとしては好ましくはＡＴＧがあげられる。
本発明のＢ型肝炎ウイルスｃ抗原性を示すポリペプチド
をコードするＤＮＡとしてはいかなるサブタイプのＢ型
肝炎ウイルスｃ抗原性を示すポリペプチドをコードする
ＤＮＡであってもよいが、図２に示されるポリペプチド
をコードするＤＮＡ（ａｄｗ型）が好ましい。さらに好
ましくは、図１（ａｄｗ型ＨＢＶ ＤＮＡの全塩基配列
を示す）に示される塩基配列順序１９０１〜２４５５の
ＤＮＡ（ａｄｗ型）がさらに好ましい。Ｂ型肝炎ウイル
スｅ抗原性を示すポリペプチドをコードするＤＮＡとし
てはいかなるサブタイプのＢ型肝炎ウイルスｅ抗原性を
示すポリペプチドをコードするＤＮＡであってもよい
が、図２に示されるアミノ酸配列順序１より始まり９５
ないし１８４のポリペプチド（ａｄｗ型）をコードする
ＤＮＡが好ましい。さらに好ましくは、図１に示される
塩基配列順序１９０１より始まり２２６３（２２６３番
目の塩基はＣでもよい）ないし２３５６のＤＮＡ（ａｄ
ｗ型）がさらに好ましい。Ｂ型肝炎ウイルスｃ抗原性を
示すポリペプチドをコードするＤＮＡは、生産されるポ
リペプチドの抗原性が失なわれない限り、一部のアミノ
酸，ペプチドを欠除、他のアミノ酸，ペプチドへの置
換、あるいは他のアミノ酸，ペプチドの付加がなされて
いるポリペプチドをコードするＤＮＡであってもよい。
停止コドンとしてはＴＡＡ，ＴＡＧ，ＴＧＡがあげられ
る。 【０００７】たとえばａｄｗ型ＨＢｃ抗原性を示すポリ
ペプチドをコードするＤＮＡは、ヌクレイック・アシッ
ズ・リサーチ（Nucleic Acids Res.)，１１巻，１７４
７頁（１９８３年）に記載されているｐＢＲ３２２−Ｅ
ｃｏＲＩ／ＨＢＶ９３３（ｐＨＢＶ９３３と略称）を制
限酵素ＨｈａＩ消化により断片化し、得られるＤＮＡ断
片のうちＨＢｃ抗原性を示すポリペプチドをコードする
ＤＮＡを含有する約１キロ塩基対のＤＮＡを分離し、Ｅ
ｃｏＲＩリンカーを結合した後、トリプトファンプロモ
ーターを含むｐｔｒｐ７８１〔ｐｔｒｐ７０１（ヨーロ
ッパ特許公開第００６８７１９号公報参照）を制限酵素
ＥｃｏＲＩ消化後、ＣｌａＩで部分分解し、生じたのり
しろ部分をＤＮＡポリメラーゼＩラージフラグメントで
修復し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを用いて環状化されたプラ
スミドであって、ＥｃｏＲＩ部位に近い方のＣｌａＩ部
位がこわれたもの〕のＥｃｏＲＩ部位に結合されたプラ
スミドｐＨＥ１を得る。さらに該プラスミドｐＨＥ１を
ＥｃｏＲＩ消化し、さらにヌクレアーゼＢａｌ ３１で
消化した後、ＣｌａＩリンカーを結合させ、ｔｒｐプロ
モーターを含むｐｔｒｐ７７１（ヨーロッパ特許公開第
００６８７１９号公報参照）のＣｌａΙ部位に挿入すれ
ば目的のＨＢｃ抗原性を示すポリペプチドをコードする
ＤＮＡを含有するプラスミドｐＴＢ３６８を得ることが
できる（図４参照）。該プラスミドで大腸菌（ＤＨ１，
χ１７７６，Ｃ６００など）を形質転換することにより
ＨＢｃ抗原性を示すポリペプチドの生産能を有する大腸
菌株が得られる。ａｄｗ型ＨＢｅ抗原性を示すポリペプ
チドをコードするＤＮＡは、たとえば適当な制限酵素
（例、ＡｖａＩ，ＡｖａII）でプラスミドｐＴＢ３６８
を切断し、必要によりさらにヌクレアーゼＢａｌ ３１
で消化した後、停止コドンを含む適当なリンカーを結合
させ、ｐｔｒｐ ７７１に組み込むことにより、目的の
ＨＢｅ抗原性を示すポリペプチドをコードするＤＮＡ含
有するプラスミドを得ることができる。得られたプラス
ミドで大腸菌（ＤＨ１，χ１７７６，Ｃ６００など）を
形質転換することによりＨＢｅ抗原性を示すポリペプチ
ドの生産能を有する大腸菌株が得られる（図５参照）。
ａｄｗ型以外のサブタイプのＨＢｃ抗原性を示すポリペ
プチドをコードするＤＮＡも上記と同様にして得ること
ができ、また、大腸菌以外の微生物を宿主として用いる
場合においても、該宿主において機能しうるプロモータ
ーを含有するプラスミドに上記ＤＮＡを挿入することに
より目的とするポリペプチドの生産能を有する微生物が
得られる。プロモーターのＳＤ配列と翻訳開始コドンと
の間の配列がＡＴＣＧＧＧＣである組換えＤＮＡはたと
えば、適当な制限酵素（例、ＥｃｏＲＩ）で処理した
後、Ｓ１ヌクレアーゼを作用させ、ライゲーション反応
を行うことにより得ることもできるが、オリゴヌクレチ
オド・ミュータジェネシス（oligonucleotide mutagene
sis）などの公知の方法を用いて作製することもでき
る。 【０００８】得られた大腸菌の形質転換体は自体公知の
培地で培養することができる。培地としてはＬブロス，
ペナセイ（Penassay）ブロス，グルコース，カザミノ酸
を含むＭ−９培地などの公知の培地があげられる。必要
によりプロモーターを効率よく働かせるために、たとえ
ば、３β−インドリルアクリル酸のような薬剤を加える
ことができる。培養は通常１５〜４３℃、好ましくは２
８〜４０℃で２〜２４時間、好ましくは３〜８時間行
い、必要により通気や攪拌を加えることもできる。培養
後、公知の方法で菌体を集め、緩衝液に懸濁し、超音波
処理、リゾチームおよび（または）凍結融解によって菌
体を破壊したのち、遠心分離により目的とするポリペプ
チドを含む抽出液を得る方法などの公知の方法を用いる
ことができる。また抽出液からの目的とするポリペプチ
ドの分離、精製も自体公知の方法により行なわれる。大
腸菌以外の微生物の場合も同様にして目的とするポリペ
プチドを得ることができる。 【０００９】 【作用】本発明の製造法で得られるＨＢｃ抗原性を示す
ポリペプチドは天然由来のＨＢｃ抗原と同様にＢ型肝炎
の診断剤，Ｂ型肝炎ウイルスの感染の防御（予防）剤と
して使用することができる。プロモーターのＳＤ配列と
翻訳開始コドンとの間の配列がＡＴＣＧＧＧＣである組
換えＤＮＡにおいては、ＨＢｃ抗原性を示すポリペプチ
ドの生産量が増大し、ＨＢｃ抗原の製造に有利である。 【００１０】 【例】以下に例を示して本発明をさらに具体的に説明す
るが、本発明はこれらに限定されるべきものではない。
また本発明のＨＢｃ抗原と密接に関連しているＨＢｅ抗
原についても参考のために記載している。 例１ プラスミドｐＨＢＶ９３３を制限酵素ＥｃｏＲＩおよび
ＨｈａＩで切断し、１％アガロースゲル電気泳動によ
り、ＨＢｃ抗原遺伝子を含むＤＮＡ断片（１００５ｂ
ｐ）を分離した。緩衝液中（１０ｍＭ酢酸ナトリウム，
１５０ｍＭ ＮａＣｌ，０．０５ｍＭ ＺｎＳＯ4，ｐＨ
４．０）でヌクレアーゼＳ１処理した後、ＥｃｏＲＩリ
ンカー ｄ（ＧＧＡＡＴＴＣＣ）を結合し、さらにＥｃ
ｏＲＩ処理した。このＤＮＡ断片をプラスミドｐｔｒｐ
７８１のＥｃｏＲＩ部位に挿入した後、これを用いて大
腸菌ＤＨ１を形質転換した。ＨＢｃＡｇ遺伝子が組み込
まれたプラスミド（ｐＨＢｃＨＥ１）を保持するクロー
ンよりプラスミドを抽出し、該プラスミドよりＥｃｏＲ
Ｉ ＤＮＡ断片を切り出した。５μｇの該ＤＮＡ断片を
緩衝液中（６００ｍＭ ＮａＣ１，２０ｍＭトリス・Ｈ
Ｃ１，ｐＨ８．０，１２ｍＭ ＣａＣ１2，１２ｍＭ Ｍ
ｇＣ１2，１．０ｍＭ ＥＤＴＡ）で２ユニットのＢａｌ
３１で２４℃，１分間処理した。Ｃ１ａＩリンカー ｄ
（ＣＡＴＣＧＡＴＧ）を結合したのち、Ｃ１ａＩで消化
した。該ＤＮＡ断片をｐｔｒｐ ７７１のＣ１ａＩ部位
に挿入し、これを用いて大腸菌ＤＨ１を形質転換させ、
テトラサイクリン耐性の形質転換体（Escherichia coli
ＤＨ１／ｐＴＢ３６８）を得た。 【００１１】例２ 例１で得られた形質転換体を８μｇ／ｍｌのテトラサイ
クリンを含むＭ−９培地（１０ｍｌ）中、３７℃で培養
し、クレット・ユニット(Klett unit）［５８０ｎｍの
吸光度］が１８０〜２００の時、３β−インドリルアク
リル酸を２５μｇ／ｍｌの濃度に加えて、培養をさらに
２〜３時間続けた。培養液を５０００ｒｐｍ，１０分間
遠心分離して菌体を集め、１ｍｌの緩衝液（２０ｍＭ
トリス・ＨＣｌ，ｐＨ７．６，２０％ショ糖）に懸濁
し、リゾチーム（３ｍｇ／ｍｌ），ＥＤＴＡ（最終濃度
５ｍＭ）およびＰＭＳＦ（最終濃度１ｍＭ）を添加し
て、よく攪拌したのち、４℃で１時間静置した。超音波
破砕により菌体をさらに破壊し、１５０００ｒｐｍで２
０分間遠心を行い（２回）、得られた上清（抽出液）を
アボット社のＨＢｅリアキットを使用してＨＢｃ抗原価
の測定に使用した。その結果、該形質転換体はＨＢｃ抗
原発現クローンであることがわかった。該形質転換体の
菌体抽出液を生理食塩水で希釈し、その抗原価を測定し
た結果、少なくとも２５００倍希釈の濃度でもＨＢｃ抗
原の検出は可能であった。 【００１２】例３ 上記形質転換体（Escherichia coli ＤＨ１／ｐＴＢ３
６８）よりプラスミド（ｐＴＢ３６８）を抽出し、該プ
ラスミドを制限酵素ＡｖａΙで切断し、ヌクレアーゼＢ
ａｌ ３１で３０〜９０秒間処理した。停止コドンを有
するＥｃｏＲΙリンカーを結合し、ｐｔｒｐ７７１のＣ
ｌａΙ・ＥｃｏＲΙ部位に挿入したのち、大腸菌ＤＨ１
を形質転換した。得られた形質転換体をＭ−９培地で培
養し、例２に記載の方法でＨＢｅ抗原価を測定した。Ｈ
Ｂｅ抗原を産生する形質転換体（Escherichia coli Ｄ
Ｈ１／ｐＴＢ４４１，Escherichia coli ＤＨ１／ｐＴ
Ｂ４４９，Escherichia coli ＤＨ１／ｐＴＢ５５２）
を得た。 例４ 形質転換体の菌体抽出液を生理食塩水で５倍に希釈し、
アボット社のＨＢｅリアキットで抗原価を測定した。結
果を以下に示す。 Ｐ／Ｎ＝（ポジティブ ｃｐｍ）／（ネガティブ・コン
トロール ｃｐｍ）。 【００１３】例５ ｉ）大腸菌ＤＨ１／ｐＴＢ３６８の菌体抽出液をベック
マン超遠心機（ＳＷ５５ローター）で４０，０００ｒｐ
ｍ，４℃で６時間遠心し、沈殿物を緩衝液（２０ｍＭト
リス・ＨＣ１，１ｍＭ ＥＤＴＡ，０．１５Ｍ ＮａＣ
１，ｐＨ７．６）に溶解した。試料５０μｌに２倍濃度
のＳＤＳポリアクリルアミド用緩衝液（０．１５Ｍトリ
ス・ＨＣ１，ｐＨ６．８，４％ＳＤＳ，２０％グリセロ
ール，１０％ ２−メルカプトエタノール，０．００２
％ブロモフェノールブルー）５０μｌを加え、１００
℃，５〜１０分間加熱した後、ポリアクリルアミドゲル
電気泳動を行った。ニトロセルロースフィルターに上記
の分離された蛋白を電気的に吸着させ、125Ι−抗−Ｈ
Ｂｅ抗血清を反応させ、洗浄後オートラジオグラフを取
った。その結果、該形質転換体が産生する蛋白は分子量
が２１,５００〜２２,０００ダルトンと推定された（図
６参照）。 ii）大腸菌ＤＨ１／ｐＴＢ３６８の菌体抽出液に固形の
セシウムクロリドを加え、平均ρ＝１．２０となるよう
にした後、３８,０００ｒｐｍで７２時間遠心し、分画
した後、ＨＢｃ抗原の抗原性の存在する分画を検討した
結果、ＨＢｃ抗原はρ＝１．３４付近にピークとして分
画された（図７参照）。以上、ｉ，iiの結果から、該形
質転換体の産物はＨＢｃＡｇの粒子を形成していると推
定される。 【００１４】iii）大腸菌ＤＨ１／ｐＴＢ３６８，大腸
菌ｐＴＢ４４１の菌体抽出液０．５ｍｌを５〜２５％の
ショ糖濃度勾配液（２０ｍＭ トリス，ｐＨ７．６，
０．１５ＭＮａＣｌ，０．００１Ｍ ＥＤＴＡ）３５ｍ
ｌ上に重層し、２４，０００ｒｐｍ，４℃で４時間遠心
した後、３０本に分画した。それぞれの分画の２００μ
ｌずつをＨＢｃＡｇのＥＩＡ（Enzyme Immunoassayキッ
ト，アボット社）法によりＨＢｃＡｇ，ＨＢｅＡｇの検
出を行った。大腸菌ＤＨ１／ｐＴＢ３６８の産物は主に
分画９，１０に、大腸菌ＤＨ１／ｐＴＢ４４１の産物は
分画２０，２１，２２，２３に分画され（図８参照）、
前者は粒子状、後者は粒子の形態をとらないペプチドと
推定された。 iv）大腸菌ＤＨ１／ｐＴＢ３６８の菌体抽出液にＨＢＶ
感染チンパンジーの肝臓から抽出したＨＢｃＡｇ粒子で
免疫して得た抗ＨＢｃ抗血清を加えた後、抗体価の減少
を抗ＨＢｃ測定用キット（アボット社）で測定した結
果、抽出物は抗ＨＢｃ抗体と反応し、抗ＨＢｃ抗体を中
和することが明らかとなった。一方、大腸菌ＤＨ１／ｐ
ＴＢ４４１， 大腸菌ＤＨ１／ｐＴＢ４４９，大腸菌Ｄ
Ｈ１／ｐＴＢ５５２ の菌体抽出物は殆ど抗ＨＢｃ抗体
と反応しなかった。各形質転換体の抽出物と125Ι−抗
−ＨＢｃ抗体とを反応させ、125Ι−抗−ＨＢｃ抗体の
残存量を抗ＨＢｃ 測定用キット（アボット社）で検討
した結果を以下に示す。 【００１５】例７ 予め、約２００００ｃｐｍを示すよう生理食塩水で希釈
した菌体抽出物（大腸菌ＤＨ１／ｐＴＢ３６８，６４倍
希釈；大腸菌ＤＨ１／ｐＴＢ４４１，４倍希釈）および
血清ＨＢｅＡｇ（未希釈）１００μｌに、生理食塩水で
１００倍，５００倍，１０００倍に希釈したウサギ抗Ｈ
Ｂｃ抗体およびコントロールとして生理食塩水，固相Ｈ
Ｂｅ（ＨＢｃ）抗体を加え、室温一晩反応後、固相に結
合した抗原を測定した。結果はコントロールとして生理
食塩水を加えた系のカウントを１００％として％（パー
セント）で図１０に示した。なお、コントロールのカウ
ントは各々、大腸菌ＤＨ１／ｐＴＢ３６８，２２３４０
ｃｐｍ，大腸菌ＤＨ１／ｐＴＢ４４１，２３４７１ｃｐ
ｍ，血清ＨＢｅＡｇ，９４９１ｃｐｍであった。血清Ｈ
ＢｅＡｇはカウントで、他の約１／２量の抗原しか加え
ていないのにもかかわらず、図１０から明らかなように
抗ＨＢｃ抗体を添加してもカウントは最大１０％程度し
か低下しなかった。従ってこの抗ＨＢｃ抗体はＨＢｃＡ
ｇの検出にはほとんど影響を及ぼさないものと考えられ
る。大腸菌ＤＨ１／ｐＴＢ３６８抽出物では抗ＨＢｃ抗
体の添加により明らかにカウントの低下がみられ、産生
物がＨＢｃ抗原性を有していることがわかる。大腸菌Ｄ
Ｈ１／ｐＴＢ４４１抽出物では大腸菌ＤＨ１／ｐＴＢ３
６８抽出物のような明らかなカウントの低下はみられ
ず、産生物は主にＨＢｅ抗原性を示していることが示唆
される。 【００１６】例８ プラスミドpＴＢ４４１，ｐＴＢ４４９およびｐＴＢ５
５２に挿入されているＨＢeＡgをコードするＤＮＡの
3′末端側の塩基配列を以下に示す。 ｉ)pＴＢ４４１ ＣＣＡ・ＣＣＡ・ＡＡＴ・ＧＣＣ・ＣＣＴ・ＡＧＡ・ＡＴＴ・ＣＴＴ・ Pro Pro Asn Ala Pro Arg Ile Leu (134) ＧＡＡ・ＧＡＣ・ＧＡＡ・ＡＧＧ・ＧＣＣ・ＴＣＧ・ＴＧＡ Glu Asp Glu Arg Ala Ser − すなわち、該プラスミドにより生産されるペプチドはＨ
ＢcＡgのＣ末端側のアミノ酸47個が欠損（天然のＨＢe
ＡgのＣ末端側のアミノ酸 7個が欠損)し、9個の別のア
ミノ酸が付加したものである。 ii）pＴＢ４４９ ＡＧＡ・ＣＧＡ・ＣＧＧ・ＣＴＡ・ＧＡＡ・ＴＴＣ・ＴＴＧ・ＡＡＧ・ (2348) ＡＣＧ・ＡＡＡ・ＧＧＧ・ＣＣＴ・ＣＧＴ・ＧＡＴ・ＡＣＧ・ＣＣＴ・ ＡＴＴ・ＴＴＴ・ＡＴＡ・ＧＧＴ・ＴＡＡ すなわち、ＨＢcＡgのＣ末端側のアミノ酸33個が欠損
し、１６個の別のアミノ酸が付加している。 iii）pＴＢ５５２ ＧＴＡ・ＣＴＴ・ＧＡＡ・ＴＡＴ・ＴＴＧ・ＧＴＣ・ＴＣＣ・ＴＡＧ (2243) すなわち、ＨＢcＡgのＣ末端側のアミノ酸64個を欠損し
ている。 【００１７】例９ プラスミドｐＴＢ３６８を制限酵素ＥｃｏＲΙで切断し
た後、エクソヌクレアーゼＢａｌ３１で処理した。次
に、ＰｓｔＩリンカーｄ（ＧＣＴＧＣＡＧＣ）を結合
し、ＣｌａＩおよびＰｓｔＩで処理してＨＢｃＡｇ遺伝
子を含むＣｌａＩ・ＰｓｔＩＤＮＡ断片を得た。該ＤＮ
Ａ断片をｐｔｒｐ７７１のＣｌａＩ・ＰｓｔＩ部位に組
込んだ後、ＣｌａＩで切断し、ＥｃｏＲＩリンカーｄ
（ＧＧＡＡＴＴＣＣ）を結合させ、ＥｃｏＲＩおよびＰ
ｓｔＩ処理で得られたＤＮＡ断片をｐｔｒｐ７８１のＥ
ｃｏＲＩ・ＰｓｔＩ部位に組込み、これを用いて大腸菌
ＤＨ１を形質転換させ、プラスミドｐＴＢ（４）３６８
−１を保持する形質転換体（Escherichia coli ＤＨ１
／ｐＴＢ（４）３６８−１）を得た。 該形質転換体を
Ｍ−９培地で培養し、菌体抽出物のＨＢｃＡｇ産生量を
測定した結果、該形質転換体は大腸菌ＤＨ１／ｐＴＢ３
６８の約１０倍のＨＢｃＡｇ生産量が確認された。プラ
スミドｐＴＢ（４）３６８−１のプロモーター部位のＳ
Ｄ配列からＨＢｃＡｇ遺伝子の翻訳開始コドンまでの塩
基配列を調べた結果、１４ｂｐであった。ＳＤ配列とＡ
ＴＧとの間の塩基数を減らすためにｐＴＢ（４）３６８
−１をＥｃｏＲＩで切断し、Ｓ１ヌクレアーゼ処理した
後、ライゲーション（ligation)反応を行い、該反応液
を用いて、大腸菌ＤＨ１を形質転換し、プラスミドｐＴ
Ｂ（４）３６９を保持する大腸菌／ｐＴＢ（４）３６９
を得た。該形質転換体のＨＢｃＡｇ生産量を測定した結
果、大腸菌ＤＨ１／ｐＴＢ３６８の１０５倍量のＨＢｃ
Ａｇを生産することがわかった。プラスミドｐＴＢ
（４）３６９のＳＤ配列とＡＴＧとの間の塩基配列は以
下のとおり７ｂｐであった。 ５’ＡＡＡＡＧＧＧＴＡＴＣＧＧＧＣＡＴＧＳＤ。 【００１８】例１０ （ｉ）プラスミドｐＴＢ（４）３６９をＡｖａＩで切断
し、Klenow フラグメントで単鎖部分を二重鎖とした
後、ＰｓｔＩで処理し、大断片を分離し、ＰｓｔＩ認識
部位を有するＰｓｔＩストップリンカー5 'ＡＴＡＡＣＴＡＡＣＴＡＡＣＴＧＣＡ3'3 'ＴＡＴＴＧＡＴＴＧＡＴＴＧ5' を結合した。ＰｓｔＩで処理し、大断片を分離し、ライ
ゲーション反応を行い、プラスミドｐＴＢ（４）３６９
−４を得た（図１１参照）。 （ii）また、ｐＴＢ（４）３６９をＳｔｙＩで処理し、
小断片を得、該断片をＡｖａIIで処理した後、Klenow
フラグメントで修復した。前記のＰｓｔＩストップリン
カーを結合した後、ＨｐａＩおよびＰｓｔＩで処理し、
５０２ｂｐ断片を分離し、該断片をｐｔｒｐ７８１のＨ
ｐａＩ・ＰｓｔＩ部位に組込み、ｐＴＢ（４）３６９−
３２を得た（図１２参照）。 （iii）また、ｐＴＢ（４）３６９のＳｔｙＩ処理で得
られた小断片をＨｐａIIで処理した後、Klenow フラグ
メントで修復した。前記のＰｓｔＩストップリンカーを
結合した後、ＨｐａＩおよびＰｓｔＩで処理し、４７２
ｂｐ断片を分離し、該断片をｐｔｒｐ７７１のＨｐａＩ
・ＰｓｔＩ部位に組込み、ｐＴＢ（４）３６９−４１を
得た（図１２参照）。 （iv）ｐＴＢ４４１のＨＢｅＡｇ遺伝子中に２つ存在す
るＢｇｌII部位の５’側のＢｇｌII部位とベクター中の
ＰｓｔＩ部位間のＤＮＡ断片をｐＴＢ（４）３６９のＢ
ｇｌII（５’側）・ＰｓｔＩ部位に組込み、ｐＴＢ
（４）４４１−１を得た（図１３参照）。 （ｖ）ｐＴＢ４４１のＨＢｅＡｇ遺伝子中に２つ存在す
るＢｇｌII部位の３’側のＢｇｌII部位とベクター中の
ＰｓｔＩ部位間のＤＮＡ断片をｐＴＢ（４）３６９のＢ
ｇｌII（５’側）・ＰｓｔＩ部位に組込み、ｐＴＢ
（４）４４１−８を得た（図１４参照）。 （vi）ｐＴＢ５５２のＨＢｅＡｇ遺伝子中に２つ存在す
るＢｇｌII部位の５’側のＢｇｌII部位とベクター中の
ＰｓｔＩ部位間のＤＮＡ断片をｐＴＢ（４）３６９のＢ
ｇｌII（５’側）・ＰｓｔＩ部位に組込み、ｐＴＢ
（４）５５２−８を得た（図１５参照）。 【００１９】例１１ 例９および１０で得られたプラスミドを保持する大腸菌
ＤＨ１を例２と同様に培養した後、菌体を集め、ＥＤＴ
Ａおよびリゾチームを加え、超音波破砕により菌体抽出
液を得た。アボット社のＨＢｅ・ＥＩＡおよびコアザイ
ム（Corzyme）を用いてＨＢｃＡｇおよびＨＢｅＡｇの
測定を行った結果、ｐＴＢ(４)３６９，ｐＴＢ(４)３６
９−４，ｐＴＢ(４)３６９−３２またはｐＴＢ(４)３６
９−４１を保持する大腸菌ＤＨ１はＨＢｃＡｇおよびＨ
ＢｅＡｇを産生していることが、また、ｐＴＢ(４)４４
１−１またはｐＴＢ(４)５５２−８を保持する大腸菌Ｄ
Ｈ１はＨＢｅＡｇを産生していることがわかった。ｐＴ
Ｂ（４）４４１−８を保持する大腸菌ＤＨ１の菌体抽出
液を希釈し、アボット社のＲＩＡ ＨＢｅ測定キットで
抗原価を測定した。結果を以下に示す。 【００２０】例１２ プラスミドｐＴＢ（４）３６９−４，ｐＴＢ（４）３６
９−３２および ｐＴＢ３６９−４１に挿入されている
ＨＢｅＡｇをコードするＤＮＡの３’末端側の塩基配列
を以下に示す。 （ｉ）ｐＴＢ（４）３６９−４ ＡＴＡ・ＡＣＴ・ＡＡＣ・ＴＡＡ Ile Thr Asn − (182) （ii）ｐＴＢ（４）３６９−３２ ＡＴＡ・ＡＣＴ・ＡＡＣ・ＴＡＡ Ile Thr Asn − (154) （iii）ｐＴＢ（４）３６９−４１ ＡＴＡ・ＡＣＴ・ＡＡＣ・ＴＡＡ Ile Thr Asn − (145) プラスミドｐＴＢ（４）４４１−８はＨＢｃＡｇ遺伝子
中の２９〜８２番目のアミノ酸をコードする部位が欠損
し、Ｃ末端側のアミノ酸４７個をコードする部分が欠損
し、９個の別のアミノ酸をコードする塩基配列を有して
いる。 【００２１】例１３ ｐＴＢ（４）４４１−１またはｐＴＢ（４）５５２−８
を保持する大腸菌ＤＨ１のＨＢｅＡｇ抗原性を示す産生
物の分子量を125Ｉ−抗ＨＢｅ 抗血清を使用したウエ
スタン・ブロッテング（Western blotting）法〔Towbi
n,H, 「プロシージング オブ ナショナル アカデミー オ
ブ サイエンス(Proc.Natl.Acad.Sci. U.S.A.)７６巻、
９号、４３５０〜４３５４頁(１９７９)〕およびヒト抗
ＨＢｅ抗血清を使用した免疫沈降法により決定した。す
なわち、ウエスタン・ブロッテング 法によりｐＴＢ
（４）４４１−１を保持する大腸菌の産生物の分子量は
１５，０００〜１５，５００ダルトンであることがわか
った（図１６参照）。また、ｐＴＢ（４）５５２−８を
保持する大腸菌１を14Ｃ−アミノ酸存在下にＭ−９培地
で培養し、菌体抽出物にヒト抗ＨＢｅ抗血清を加えて３
７℃で反応させた後、ＰｒｏｔｅｉｎＡ（１０％溶液）
を加えて抗原抗体反応物を回収し、ポリアクリルアミド
ゲル（１７％）電気泳動を行い、オートラジオグラフィ
−により、産生物の分子量を測定した結果１３，０００
〜１３，５００ダルトンであることがわかった（図１
７）。なお、形質転換体の寄託機関および受託番号は以
下のとおりである。 なお、大腸菌ＤＨ１は公知の微生物である〔Selson,M.
E.ら，ネイチャー，第２１７巻，１１１０頁（１９６８
年）〕。ＩＦＯは財団法人発酵研究所の受託番号を、Ｆ
ＥＲＭは通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所
の受託番号を表す。 【００２２】 【発明の効果】ＨＢｃ抗原は天然にはＨＢＶ感染後のヒ
トあるいはチンパンジーのみから得ることしかできず、
量的にも制約されてきた。また、これらの疾患動物の取
扱いはＨＢＶ感染の危険を伴い、不都合であった。本発
明はこれらの問題を解決し、本発明によれば抗原性が天
然のものに近く、安価で、安全で、しかも大量にＨＢｃ
抗原性を示すポリペプチドが得られる。 【００２３】 【配列表】 配列番号：１ 配列の長さ：147 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク質 配列 Met Asp Ile Asp Pro Tyr Lys Glu Phe Gly Ala Thr Val Glu Leu Leu 1 5 10 15 Ser Phe Leu Pro Ser Asp Phe Phe Pro Ser Val Arg Asp Leu Leu Asp 20 25 30 Thr Ala Ser Ala Leu Tyr Arg Glu Ala Leu Glu Ser Pro Glu His Cys 35 40 45 Ser Pro His His Thr Ala Leu Arg Gln Ala Ile Leu Cys Trp Gly Glu 50 55 60 Leu Met Thr Leu Ala Thr Trp Val Gly Asn Asn Leu Gln Asp Pro Ala 65 70 75 80 Ser Arg Asp Leu Val Val Asn Tyr Val Asn Thr Asn Met Gly Leu Lys 85 90 95 Ile Arg Gln Leu Leu Trp Phe His Ile Ser Cys Leu Thr Phe Gly Arg 100 105 110 Glu Thr Val Leu Glu Tyr Leu Val Ser Phe Gly Val Trp Ile Arg Thr 115 120 125 Pro Pro Ala Tyr Arg Pro Pro Asn Ala Pro Ile Leu Ser Thr Leu Pro 130 135 140 Ile Thr Asn 145。 【００２４】配列番号：１ 配列の長さ：147 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク質 配列 Met Asp Ile Asp Pro Tyr Lys Glu Phe Gly Ala Thr Val Glu Leu Leu 1 5 10 15 Ser Phe Leu Pro Ser Asp Phe Phe Pro Ser Val Arg Asp Leu Leu Asp 20 25 30 Thr Ala Ser Ala Leu Tyr Arg Glu Ala Leu Glu Ser Pro Glu His Cys 35 40 45 Ser Pro His His Thr Ala Leu Arg Gln Ala Ile Leu Cys Trp Gly Glu 50 55 60 Leu Met Thr Leu Ala Thr Trp Val Gly Asn Asn Leu Gln Asp Pro Ala 65 70 75 80 Ser Arg Asp Leu Val Val Asn Tyr Val Asn Thr Asn Met Gly Leu Lys 85 90 95 Ile Arg Gln Leu Leu Trp Phe His Ile Ser Cys Leu Thr Phe Gly Arg 100 105 110 Glu Thr Val Leu Glu Tyr Leu Val Ser Phe Gly Val Trp Ile Arg Thr 115 120 125 Pro Pro Ala Tyr Arg Pro Pro Asn Ala Pro Arg Ile Leu Glu Asp Glu 130 135 140 Arg Ala Ser 145。 【００２５】配列番号：３ 配列の長さ：93 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク質 配列 Met Asp Ile Asp Pro Tyr Lys Glu Phe Gly Ala Thr Val Glu Leu Leu 1 5 10 15 Ser Phe Leu Pro Ser Asp Phe Phe Pro Ser Val Arg Asp Leu Val Val 20 25 30 Asn Tyr Val Asn Thr Asn Met Gly Leu Lys Ile Arg Gln Leu Leu Trp 35 40 45 Phe His Ile Ser Cys Leu Thr Phe Gly Arg Glu Thr Val Leu Glu Tyr 50 55 60 Leu Val Ser Phe Gly Val Trp Ile Arg Thr Pro Pro Ala Tyr Arg Pro 65 70 75 80 Pro Asn Ala Pro Arg Ile Leu Glu Asp Glu Arg Ala Ser 85 90。 【００２６】配列番号：４ 配列の長さ：121 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク質 配列 Met Asp Ile Asp Pro Tyr Lys Glu Phe Gly Ala Thr Val Glu Leu Leu 1 5 10 15 Ser Phe Leu Pro Ser Asp Phe Phe Pro Ser Val Arg Asp Leu Leu Asp 20 25 30 Thr Ala Ser Ala Leu Tyr Arg Glu Ala Leu Glu Ser Pro Glu His Cys 35 40 45 Ser Pro His His Thr Ala Leu Arg Gln Ala Ile Leu Cys Trp Gly Glu 50 55 60 Leu Met Thr Leu Ala Thr Trp Val Gly Asn Asn Leu Gln Asp Pro Ala 65 70 75 80 Ser Arg Asp Leu Val Val Asn Tyr Val Asn Thr Asn Met Gly Leu Lys 85 90 95 Ile Arg Gln Leu Leu Trp Phe His Ile Ser Cys Leu Thr Phe Gly Arg 100 105 110 Glu Thr Val Leu Glu Tyr Leu Val Ser 115 120。
【図面の簡単な説明】
【図１−１】ａｄｗ型ＨＢＶ ＤＮＡの全塩基配列を示
し、図１−２に続く。 【図１−２】ａｄｗ型ＨＢＶ ＤＮＡの全塩基配列を示
し、図１−３に続く。 【図１−３】ａｄｗ型ＨＢＶ ＤＮＡの全塩基配列を示
し、図１−４に続く。 【図１−４】ａｄｗ型ＨＢＶ ＤＮＡの全塩基配列を示
し、図１−５に続く。 【図１−５】ａｄｗ型ＨＢＶ ＤＮＡの全塩基配列を示
し、図１−６に続く。 【図１−６】ａｄｗ型ＨＢＶ ＤＮＡの全塩基配列を示
し、図１−７に続く。 【図１−７】ａｄｗ型ＨＢＶ ＤＮＡの全塩基配列を示
し、図１−１から図１−７にて完了する。 【図２】ａｄｗ型ＨＢｃＡｇのアミノ酸配列を示す。 【図３】ａｄｗ型ＨＢｃＡｇをコードするＤＮＡの塩基
配列を示す。 【図４】ｐＴＢ３６８の構築図である。 【図５】ＨＢｅＡｇ発現用プラスミドの構築図である。 【図６】レーン１，２とも大腸菌ＤＨ１／ｐＴＢ３６８
の産生物のウエスタン・ブロッティング（Western blot
ting）の結果を示す。 【図７】大腸菌ＤＨ１／ｐＴＢ３６８の産生物のセシウ
ムクロリド平衡密度勾配遠心による解析結果を示す。 【図８】大腸菌ＤＨ１／ｐＴＢ３６８の産生物のショ糖
濃度勾配遠心による解析結果を示す。 【図９】大腸菌ＤＨ１／ｐＴＢ４４１の産生物のショ糖
濃度勾配遠心による解析結果を示す。 【図１０】ウサギ抗ＨＢｃ抗体によるＨＢｅ（ＨＢｃ）
ＲＩＡの中和試験結果を示す。 【図１１】ｐＴＢ（４）３６９−４の構築図である。 【図１２】ｐＴＢ（４）３６９−３２及びｐＴＢ（４）
３６９−４１の構築図である。 【図１３】ｐＴＢ（４）４４１−１の構築図である。 【図１４】ｐＴＢ（４）４４１−８の構築図である。 【図１５】ｐＴＢ（４）５５２−８の構築図である。 【図１６】本発明産生物の分子量のウェスタン・ブロッ
ティング法による解析図である。 【図１７】本発明産生物の分子量の免疫沈降法による解
析図である。
し、図１−２に続く。 【図１−２】ａｄｗ型ＨＢＶ ＤＮＡの全塩基配列を示
し、図１−３に続く。 【図１−３】ａｄｗ型ＨＢＶ ＤＮＡの全塩基配列を示
し、図１−４に続く。 【図１−４】ａｄｗ型ＨＢＶ ＤＮＡの全塩基配列を示
し、図１−５に続く。 【図１−５】ａｄｗ型ＨＢＶ ＤＮＡの全塩基配列を示
し、図１−６に続く。 【図１−６】ａｄｗ型ＨＢＶ ＤＮＡの全塩基配列を示
し、図１−７に続く。 【図１−７】ａｄｗ型ＨＢＶ ＤＮＡの全塩基配列を示
し、図１−１から図１−７にて完了する。 【図２】ａｄｗ型ＨＢｃＡｇのアミノ酸配列を示す。 【図３】ａｄｗ型ＨＢｃＡｇをコードするＤＮＡの塩基
配列を示す。 【図４】ｐＴＢ３６８の構築図である。 【図５】ＨＢｅＡｇ発現用プラスミドの構築図である。 【図６】レーン１，２とも大腸菌ＤＨ１／ｐＴＢ３６８
の産生物のウエスタン・ブロッティング（Western blot
ting）の結果を示す。 【図７】大腸菌ＤＨ１／ｐＴＢ３６８の産生物のセシウ
ムクロリド平衡密度勾配遠心による解析結果を示す。 【図８】大腸菌ＤＨ１／ｐＴＢ３６８の産生物のショ糖
濃度勾配遠心による解析結果を示す。 【図９】大腸菌ＤＨ１／ｐＴＢ４４１の産生物のショ糖
濃度勾配遠心による解析結果を示す。 【図１０】ウサギ抗ＨＢｃ抗体によるＨＢｅ（ＨＢｃ）
ＲＩＡの中和試験結果を示す。 【図１１】ｐＴＢ（４）３６９−４の構築図である。 【図１２】ｐＴＢ（４）３６９−３２及びｐＴＢ（４）
３６９−４１の構築図である。 【図１３】ｐＴＢ（４）４４１−１の構築図である。 【図１４】ｐＴＢ（４）４４１−８の構築図である。 【図１５】ｐＴＢ（４）５５２−８の構築図である。 【図１６】本発明産生物の分子量のウェスタン・ブロッ
ティング法による解析図である。 【図１７】本発明産生物の分子量の免疫沈降法による解
析図である。
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(51)Int.Cl.6 識別記号 ＦＩ
Ｃ１２Ｒ 1:19）
(Ｃ１２Ｐ 21/02
Ｃ１２Ｒ 1:19）
微生物の受託番号 ＦＥＲＭ ＢＰ−１１５６
(56)参考文献 ＪＯＵＲＮＡＬ ＯＦ ＩＭＭＵＮＯ
ＬＯＧＹ，ＶＯＬ．130〜６！（1983)
Ｐ．2903−2907
ＮＡＴＵＲＥ，ＶＯＬ．282（1979−
ＤＥＣ−６）Ｐ．575−579
(58)調査した分野(Int.Cl.6，ＤＢ名)
C12N 15/09 ZNA
C12N 1/21
C12P 21/02
C07K 14/02
ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ)
ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)
Claims (1)
- (57)【特許請求の範囲】 １．プロモーター、該プロモーターの下流に、翻訳開始
コドン、Ｂ型肝炎ウイルスｃ抗原性を示すポリペプチド
をコードするＤＮＡおよびその直後に停止コドンを連結
してなる組換えＤＮＡにおいて、該プロモーターのＳＤ
配列と翻訳開始コドンとの間の配列がＡＴＣＧＧＧＣで
あることを特徴とする組換えＤＮＡ。 ２．次のプラスミド： ｐＴＢ(４)３６９（ＦＥＲＭ ＢＰ−１１５３） ｐＴＢ(４)３６９−４ ｐＴＢ(４)３６９−３２および ｐＴＢ(４)３６９−４１ から選ばれるものである、請求項１記載の組換えＤＮ
Ａ。 ３．プロモーター、該プロモーターの下流に、翻訳開始
コドン、Ｂ型肝炎ウイルスｃ抗原性を示すポリペプチド
をコードするＤＮＡおよびその直後に停止コドンを連結
してなる組換えＤＮＡであって、該プロモーターのＳＤ
配列と翻訳開始コドンとの間の配列がＡＴＣＧＧＧＣで
あることを特徴とする組換えＤＮＡを含有する形質転換
体。 ４．プロモーター、該プロモーターの下流に、翻訳開始
コドン、Ｂ型肝炎ウイルスｃ抗原性を示すポリペプチド
をコードするＤＮＡおよびその直後に停止コドンを連結
してなる組換えＤＮＡにおいて、該プロモーターのＳＤ
配列と翻訳開始コドンとの間の配列がＡＴＣＧＧＧＣで
あることを特徴とする組換えＤＮＡを含有する形質転換
体を培養し、該培養物からＢ型肝炎ウイルスｃ抗原性を
示すポリペプチドを回収することを特徴とする、Ｂ型肝
炎ウイルスｃ抗原性を示すポリペプチドの製造法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP9055857A JP2749010B2 (ja) | 1985-10-03 | 1997-03-11 | 新規ｄｎａおよびそれを用いたポリペプチドの製造法 |
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP60-221518 | 1985-10-03 | ||
| JP22151885 | 1985-10-03 | ||
| JP9055857A JP2749010B2 (ja) | 1985-10-03 | 1997-03-11 | 新規ｄｎａおよびそれを用いたポリペプチドの製造法 |
Related Parent Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP7067521A Division JP2648122B2 (ja) | 1985-10-03 | 1995-03-27 | 新規ポリペプチドおよびその製造法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH104983A JPH104983A (ja) | 1998-01-13 |
| JP2749010B2 true JP2749010B2 (ja) | 1998-05-13 |
Family
ID=26396752
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP9055857A Expired - Fee Related JP2749010B2 (ja) | 1985-10-03 | 1997-03-11 | 新規ｄｎａおよびそれを用いたポリペプチドの製造法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2749010B2 (ja) |
-
1997
- 1997-03-11 JP JP9055857A patent/JP2749010B2/ja not_active Expired - Fee Related
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| ＪＯＵＲＮＡＬ ＯＦ ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＹ，ＶＯＬ．１３０〜６！（１９８３）Ｐ．２９０３−２９０７ |
| ＮＡＴＵＲＥ，ＶＯＬ．２８２（１９７９−ＤＥＣ−６）Ｐ．５７５−５７９ |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH104983A (ja) | 1998-01-13 |
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