JPS62187495A - 新規ｄｎａおよびポリペプチド - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 奮泉上久豆凰公互 本発明は新規ＤＮＡおよびポリペプチドに関する。

来の　　および　日が　　しようとする、１　代ヒトＢ
型肝炎は、ＤＮＡウィルスの１種であるＢ型肝炎ウィル
ス（Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ　　Ｂ　　Ｖｉｒｕｓ：以下、
ＨＢＶと称することもある）の感染によって発症する。

ＨＢＶは、デン粒子としてその性状が知られており、こ
のウィルス粒子の表面にはＨＢＶ表面抗原（以下、ＨＢ
　ｓ　Ａ　ｇと略称する）１粒子内部に一部分単鎖部分
をもつ二重鎖環状ＤＮＡ、ＨＢＶコア抗原（以下、ＨＢ
ｃＡｇと略称する）、ＨＢＶｅ抗原（ＨＢｅＡｇ）が存
在し、また二重鎖ＤＮＡの単鎖部分を修復する酵素とし
て内存性ＤＮＡ合成酵素の活性が検出されている。ＨＢ
Ｖ　ＤＮＡは分子量２．ｌＸｌ０’ダルトンで約３，２
００の塩基対を有する。ＨＢｓ　Ａ　ｇの抗原性は共通
抗原のａを中心にａｄｒ。

ａｄｗ、ａｙｒ、ａｙｗの４種類が知られている。

ＨＢ　ｃ　Ａ　ｇはＨＢＶ感染の早期診断のための診断
用試薬として使用できる。すなわち、ＨＢＶに感染する
と抗ＨＢｓ抗体が血中に現われる前に。

抗ＨＢｃ抗体が出現するので、これを検出することによ
りＨＢＶ感染の有無を早期に判定できる。

また、ＨＢｃＡｇは最近、ＨＢＶの感染防御に有効であ
るとの報告もなされている。

一方、ＨＢｅＡｇを含有する血液はデン粒子の含有量も
多く、ＨＢＶの感染性のある血液として危険性が高い、
それ故、ＨＢ　ａ　Ａ　ｇの存在の有無を知ることはＨ
ＢＶ感染患者の治療においても重要であり、ＨＢＶ感染
の診断に必須である。

しかしながら、ＨＢ　ｃ　Ａ　ｇおよびＨＢ　ｅ　Ａ　
ｇを得るには一度デン粒子を集め、この中のＨＢ　ｃ　
Ａｇ、ＨＢｅＡｇを分離しなければならないが、チン粒
子中に含まれるＨ　Ｂ　ｃ　Ａ　ｇおよびＨＢ　ｅ　Ａ
　ｇは微量であるため、これらを安全に、しかも大量に
得る方法の確立が望まれていた。

ｊｊｊ　　鑞を解　するための手 本発明は （１）微生物により生産されるＢ型肝炎ウィルスｅ抗原
性を示すポリペプチド、 （２）プロモーターの下流に、翻訳開始コドン、Ｂ型肝
炎ウィルスｅ抗原性を示すポリペプチドをコードするＤ
ＮＡおよびその直後に停止コドンを連結してなる組換え
ＤＮＡ、 （３）プロモーターの下流に、翻訳開始コドン、Ｂ型肝
炎ウィルスＣ抗原性を示すポリペプチドをコードするＤ
ＮＡおよびその直後に停止コドンを連結してなる組換え
ＤＮＡにおいて、上記プロモーターのＳＤ配列と翻訳開
始コドンとの間の配列がＡＴＣＧＧＧＣであることを特
徴とする組換えＤＮＡ、および （４）プロモーターの下流に、翻訳開始コドン、Ｂ型肝
炎ウィルスＣ抗原性を示すポリペプチドをコードするＤ
ＮＡおよびその直後に停止コドンを連結してなる組換Ｄ
ＮＡにおいて、上記プロモーターのＳＤ配列と翻訳開始
コドンとの間の配列がＡＴＣＧＧＧＧである組換えＤＮ
Ａを保持する形質転換体を培養することを特徴とするＢ
型肝炎ウィルスＣ抗原性を示すポリペプチドの製造法、
を提供するものである。

本発明のＢ型肝炎ウィルスｅ抗原性を示すポリペプチド
を生産する微生物としてはＢ型肝炎ウィルスｅ抗原性を
示すポリペプチドを生産する能力を有するものであれば
いかなるものであってもよいが、プロモーターの下流に
、翻訳開始コドン、Ｂ型肝炎ウィルスｅ抗原性を示すポ
リペプチドをコードするＤＮＡおよびその直後に停止コ
ドンを連結してなる組換えＤＮＡを保持する大゛腸菌、
酵母などがあげられるが、なかでも上記組換えＤＮＡを
保持する大腸菌が好ましい。

プロモーターとしては、ＲＮＡポリメラーゼが結合する
ことによってｍＲＮＡ合成を開始させるのに必要な部位
を含むものであれば、いかなるものであってもよい。た
とえば大腸菌を宿主として用いる場合に使用するプロモ
ーターとしてはｔｒｐプロモーター、ｒｅｃＡプロモー
ター、ｌａｃプロモーター、λＰＬプロモーター、ｔｕ
ｆＢプロモーターなどがあげられ、とりわけｔｒｐプロ
モーターが好適である。

さらに好ましくは、プロモーター中のＳＤ（シャインー
ダルガーノ（Ｓｈｉｎｅ−Ｄａｌｇａｒｎｏ）　）配列
と、後述の翻訳開始コドンとの間の配列がＡＴＩＣＧＧ
ＧＣであるプロモーターがあげられる。

たとえば酵母を宿主として使用する場合においては酵母
で機能しうるプロモーターであればいかなるものであっ
てもよい。

翻訳開始コドンとしては好ましくはＡＴＧがあげられる
。

Ｂ型肝炎ウィルスＣ抗原性を示すポリペプチドをコード
するＤＮＡとしてはいかなるサブタイプのＢ型肝炎ウィ
ルスＣ抗原性を示すポリペプチドをコードするＤＮＡで
あってもよいが、第２図に示されるポリペプチドをコー
ドするＤＮＡ（ａｄＷ型）が好ましい。さらに好ましく
は、第１図（ａｄｗ型ＨＢＶ　ＤＮＡの全塩基配列を示
す）に示される塩基配列順序１９０１〜２４５５のＤＮ
Ａ（ａｄｗ型）がさらに好ましい。

Ｂ型肝炎ウィルスｅ抗原性を示すポリペプチドをコード
するＤＮＡとしてはいかなるサブタイプのＢ型肝炎ウィ
ルスｅ抗原性を示すポリペプチドをコードするＤＮＡで
あってもよいが、第２図に示されるアミノ酸配列順序１
より始まり９５ないし１８４のポリペプチド（ａｄｗ型
）をコードするＤＮＡが好ましい。さらに好ましくは、
第１図゛に示される塩基配列順序１９０１より始まり２
２６３　（２２６３番目の塩基はＣでもよい）ないし２
３５６のＤＮＡ（ａｄｗ型）がさらに好ましい。

Ｂ型肝炎ウィルスＣ抗原性またはｅ抗原性を示すポリペ
プチドをコードするＤＮＡは、生産されるポリペプチド
の抗原性が失なわれない限り、一部のアミノ酸、ペプチ
ドを欠除、他のアミノ酸。

ペプチドへの置換、あるいは他のアミノ酸、ペプチドの
付加がなされているポリペプチドをコードするＤＮＡで
あってもよい。

停止コドンとしてはＴＡＡ、ＴＡＧ、ＴＧＡがあげられ
る。

たとえばａｄｗ型ＨＢｃ抗原性を示すポリペプチドをコ
ードするＤＮＡは、ヌクレイツク・アシッズ・リサーチ
（Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、）、　１１巻
。

１７４７頁（１９８３年）に記載されているｐＢＲ３２
２−ＥｃｏＲＩ／ＨＢＶ９３３　（ｐＨＢＶ９３３と略
称）を制限酵素Ｈｈａｌ消化により断片化し、得られる
ＤＮＡ断片のうちＨＢｃ抗原性を示すポリペプチドをコ
ードするＤＮＡを含有する約１キロ塩基対のＤＮＡを分
離し、ＥｃｏＲＩリンカ−を結合した後、トリプトファ
ンプロモーターを含むｐｔｒｐ７８１　（ｐｔｒｐ７０
１　（ヨーロッパ特許公開第００６８７１９号公報参照
）を制限酵素ＥｃｏＲＩ消化後、Ｃ１ａｌで部分分解し
、生じたのりしろ部分をＤＮＡポリメラーゼ■ラージフ
ラグメントで修復し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを用いて環状
化されたプラスミドであって、ＥａｏＲＩ部位に近い方
のＣｌａｌ部位がこわれたもの〕のＥ　ｃ　ｏ　Ｒ１部
位に結合されたプラスミドｐＨＥ１を得る。さらに該プ
ラスミドｐＨＥ１をＥｃｏＲＩ消化し、さらにヌクレア
ーゼＢａ１３１で消化した後、Ｃ１ａｌリンカ−を結合
させ、ｔｒｐプロモーターを含むｐｔｒｐ７７１（ヨー
ロッパ特許公開第００６８７１９号公報参照）のＣｌａ
Ｉ部位に挿入すれば目的のＨＢｃ抗原性を示すポリペプ
チドをコードするＤＮＡを含有するプラスミドｐＴ８３
６８を得ることができる（第４図参照）、該プラスミド
で大腸菌（ＤＨｌ、χ１７７６、Ｃ６００など）を形質
転換することによりＨＢｃ抗原性を示すポリペプチドの
生産能を有する大腸菌株が得られる。

ａｄｗ型ＨＢｅ抗原性を示すポリペプチドをコードする
ＤＮＡは、たとえば適当な制限酵素（例、Ａｖａｌ、Ａ
ｖａＩＩ）でプラスミドＰＴ８３６８を切断し、必要に
よりさらにヌクレアーゼＢａ１３１で消化した後、停止
コドンを含む適当なリンカ−を結合させ、ｐｔｒｐ　　
７７１に組み込むことにより、目的のＨＢｅ抗原性を示
すポリペプチドをコードするＤＮＡ含有するプラスミド
を得ることができる。得られたプラスミドで大腸菌（Ｄ
ＨＩ、χ１７７６、Ｃ６００など）を形質転換すること
によりＨＢｅ抗原性を示すポリペプチドの生産能を有す
る大腸菌株が得られる（第５図参照）。

ａｄｗ型以外のサブタイプのＨＢｃ抗原性あるいはＨＢ
ｅ抗原性を示すポリペプチドをコードするＤＮＡも上記
と同様にして得ることができ、また、大腸菌以外の微生
物を宿主として用いる場合においても、該宿主において
機能しうるプロモーターを含有するプラスミドに上記Ｄ
ＮＡを挿入することにより目的とするポリペプチドの生
産能を有する微生物が得られる。

プロモーターのＳＤ配列と翻訳開始コドンとの間の配列
がＡＴＣＧＧＧＧである組換えＤＮＡはたとえば、適当
な制限酵素（例、ＥｃｏＲＩ）で処理した後、ＳＬヌク
レアーゼを作用させ、ライゲーション反応を行うことに
より得ることもできるが、オリゴヌクレチ、オド・ミュ
ータジエネシス（ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ　ｍ
ｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）などの公知の方法を用いて作製
することもできる。

得られた大腸菌の形質転換体は自体公知の培地で培養す
ることができる。培地としてはＬブロス。

ペナセイ（Ｐｅｎａｓｓａｙ）ブロス、グルコース、カ
ザミノ酸を含むＭ−９培地などの公知の培地があげられ
る。必要によりプロモーターを効率よく働かせるために
、たとえば、３β−インドリルアクリル酸のような薬剤
を加えることができる。培養は通常１５〜４３℃、好ま
しくは２８〜４０℃で２〜２４時間、好ましくは３〜８
時間行い、必要により通気や撹拌を加えることもできる
。

培養後、公知の方法で菌体を集め、緩衝液に懸濁し、超
音波処理、リゾチームおよび（または）凍結融解によっ
て菌体を破壊したのち、遠心分離により目的とするポリ
ペプチドを含む抽出液を得る方法などの公知の方法を用
いることができる。

また抽出液からの目的とするポリペプチドの分離、精製
も自体公知の方法により行なわれる。

大腸菌以外の微生物の場合も同様にして目的とするポリ
ペプチドを得ることができる。

務凰 本発明のＨＢｃ抗原性あるいはＨＢｅ抗原性を示すポリ
ペプチドは天然由来のＨＢｃ、ＨＢｅ抗原と同様にＢ型
肝炎の診断剤、Ｂ型肝炎ウィルスの感染の防御（予防）
剤として使用することができる。

プロモーターのＳＤ配列と翻訳開始コドンとの間の配列
がＡＴＣＧＧＧＣである組換えＤＮＡにおいては、ＨＢ
ｃ抗原性あるいはＨＢｅ抗原性を示すポリペプチドの生
産量が増大し、ＨＢｃ抗原あるいはＨＢｅ抗原の製造に
有利である。

来１■ 以下に実施例を示して本発明をさらに具体的に説明する
が１本発明はこれらに限定されるべきものではない。

実施例１ プラスミドｐＨＢＶ９３３を制限酵素ＥｃｏＲ■および
ＨｈａＩで切断し、１％アガロースゲル電気泳動により
、ＨＢ　ｃ抗原遺伝子を含むＤＮＡ断片（１００５ｂｐ
）を分離した。緩衝液中（１０ｍ　Ｍ酢酸ナトリウム、
　１５０　ｍ　Ｍ　Ｎ　ａ　Ｃ１。

０．０５ｍＭ　ＺｎＳＯ４，ｐＨ４，０）でヌクレアー
ゼＳ１処理した後、Ｅ　ｃ　ｏ　ＲＩリンカ−ｄ（ＧＧ
ＡＡＴＴＣＣ）を結合し、さらにＥ’ｃｏＲＩ処理した
。このＤＮＡ断片をプラスミドｐｔｒｐ７８１のＥｃｏ
Ｒ１部位に挿入した後、これを用いて大腸菌ＤＨＩを形
質転換した。ＨＢａＡｇ遺伝子が組み込まれたプラスミ
ド（ｐＨＢｃＨＥｌ）を保持するクローンよりプラスミ
ドを抽出し、該プラスミドよりＥｃｏＲＩＤＮＡ断片を
切り出した。５μｇの該ＤＮＡ断片を緩衝液中（６００
ｍ　Ｍ　Ｎ　ａ　Ｃ１、２０ｍ　Ｍ　トリス−ＨＣｌ、
ｐＨ８，０，１２ｍＭ　ＣａＣ１，，１２ｍＭ　ＭｇＣ
Ｌ、１．０ｍＭ　ＥＤＴＡ）で２ユニツトのＢａ１３１
で２４℃、１分間処理した＠　Ｃ１ａ　Ｉリンカ−ｄ　
（ＣＡＴＣＧＡＴＧ）を結合したのち、Ｃｌ　ａ　Ｉで
消化した。該ＤＮＡ断片をｐｔｒｐ７７１のＣ１ａ　Ｉ
部位に挿入し、これを用いて大腸菌ＤＨＩを形質転換さ
せ、テトラサイクリン耐性の形質転換体（Ｅｓｃｈｅｒ
ｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　Ｄ　Ｈ１／　ｐＴＢ　３６８）
を得た。

実施例２ 実施例１で得られた形質転換体を８μｇ　／　ｍ　Ｑの
テトラサイクリンを含むＭ−９培地（１０ｍＱ）中、３
７℃で培養し、クレット・ユニット（Ｋｌｅｔｔｕｎｉ
ｔ）　　［５８０ｎ　ｍの吸光度コが１８０〜２゜Ｏの
時、３β−インドリルアクリル酸を２５μｇ／　ｍ　Ｑ
の濃度に加えて、培養をさらに２〜３時間続けた。

培養液を５０００ｒｐｍ、１０分間遠心分離して菌体を
集め、１ｍＱの緩衝液（２０ｍＭ　　トリス・ＨＣＱ、
ｐＨ７，６，２０％シミ糖）に懸濁し、リゾチーム（３
ｍｇ／ｍＱ）、ＥＤＴＡ　（最終濃度５ｍＭ）およびＰ
ＭＳＦ　（最終濃度１ｍＭ）を添加して、よく撹拌した
のち、４℃で１時間静置した。超音波破砕により菌体を
さらに破壊し、１５０００ｐｐｍで２０分間遠心を行い
（２回）、得られた上清（抽出液）をアボット社のＨＢ
　ｅリアキットを使用してＨＢａ抗原価の測定に使用し
た。その結果、該形質転換体はＨＢｃ抗原発現クローン
であることがわかった。

該形質転換体の菌体抽出液を生理食塩水で希釈し、その
抗原価を測定した結果、少なくとも２５００倍希釈の濃
度でもＨＢ　ｃ抗原の検出は可能であった６ 実施例３ 上記形質転換体（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　
Ｄ　Ｈ１／ｐ　Ｔ　Ｂ　３６８　）よりプラスミド（ｐ
Ｔ８３６８）を抽出し、該プラスミドを制限酵素Ａｖａ
Ｉで切断し、ヌクレアーゼＢａｌ　　３１で３０〜９０
秒間処理した。停止コドンを有するＥ　ｃ　ｏ　ＲＩリ
ンカ−を結合し、ｐｔｒｐ７７１のＣ１ａＩ−ＥｃｏＲ
Ｉ部位に挿入したのち、大腸菌ＤＨＩを形質転換した。

得られた形質転換体をＭ−９培地で培養し、実施例２に
記載の方法でＨＢ　ｅ抗原価を測定した。ＨＢｅ抗原を
産生ずる形質転換体（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌ
ｉ　Ｄ　Ｈ１／　ｐ　Ｔ　Ｂ　４４１　、　Ｅｓｃｈａ
ｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　Ｄ　Ｈ１／　ｐ　Ｔ　Ｂ　４
４９　、　Ｈｓｃｈｅｒｉｅｈｉａ　ｃ。

１ｉ　ＤＨＩ／ｐＴＢ５５２）を得た。

実施例４ 形質転換体の菌体抽出液を生理食塩水で５倍に希釈し、
アボット社のＨＢｅリアキットで抗原価を測定した。結
果を以下に示す。

ｃｐＩＩＰ／Ｎ ポジティブ・コントロール　　　４９４２ネガテイブ・
コントロール　　　　９７９Ｅ、ｃｏｌｉ　ＤＨＩ／　
ｐ　Ｔ　Ｂ　３６８　　４９７３６　５０．８Ｅ、ｃｏ
ｌｉ　ＤＨＩ／　ｐＴ　Ｂ　４４１　　　１９００３　
１９．４Ｅ、ｃｏｌｉ　ＤＨＩ／　ｐ　Ｔ　Ｂ　４４９
　　　１１７７４　１２．ＯＥ！、ｃｏｌｉ　ＤＨＩ／
　ｐ　Ｔ　Ｂ　５５２　　　７０３４　　７．１実施例
５ １）大腸菌Ｄ　Ｈ１／　ｐ　Ｔ　Ｂ　３６８の菌体抽出
液をベックマン超遠心機（ＳＷ５５０−ター）で４０゜
００Ｏｒｐｍ、４℃で６時間遠心し、沈殿物を緩衝液（
２０ｍＭトリス・ＨＣＩ、１ｍＭ　ＥＤＴＡ、０．１５
Ｍ　ＮａＣ１，ｐＨ７，６）に溶解した。

試料５０μＱに２倍濃度のＳＤＳポリアクリルアミド用
緩衝液（０，１５Ｍトリス・ａ　ｃ　１　ｅ　ｐＨ６，
８，４％ＳＤＳ、２０％グリセロール、１０％　２−メ
ルカプトエタノール、０．００２％ブロモフェノールブ
ルー）５０μＱを加え、１００℃、５〜１０分間加熱し
た後、ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行った。ニト
ロセルロースフィルターに上記の分離された蛋白を電気
的に吸着させ、１″ＳＩ−抗−ＨＢｅ抗血清を反応させ
、洗浄後オートラジオグラフを取った。その結果、該形
質転換体が産生ずる蛋白は分子量が２１，５００〜２２
，０００ダルトンと推定された（第６図参照）。

…）大腸菌Ｄ　Ｈ１／　ｐ　Ｔ　Ｂ　３６８の菌体抽出
液に固形のセシウムクロリドを加え、平均ρ＝１．２０
となるようにした後、３８．ＯＯＯｒｐｍで７２時間遠
心し、分画した後、ＨＢｃ抗原の抗原性の存在する分画
を検討した結果、ＨＢｃ抗原はρ＝１．３４付近にピー
クとして分画された（第７図参照）。

以上、ｉ、ｉｉの結果から、該形質転換体の産物はＨＢ
ｃＡｇの粒子を形成していると推定される。

ｉ）大腸菌Ｄ　Ｈ１／　ｐ　Ｔ　Ｂ　３６８　、大腸菌
ｐＴＢ４４１の菌体抽出液０．５ｍＱを５〜２５％のシ
ョ糖濃度勾配液（２０ｍＭ　　トリス、ｐＨ７，６゜０
．１５ＭＮａＣ１，Ｏ，ＯＯＩＭ　ＥＤＴＡ）３５ｍＱ
上に重層し、２４．ＯＯＯｒｐｍｔ　４℃で４時間遠心
した後、３０本に分画した。それぞれの分画の２００μ
ΩずつをＨＢ　ｃ　Ａ　ｇのＥＩＡ（Ｅｎｚｙｍｅ　Ｉ
＋＋ｍｕｎｏａｓｓａｙキット、アボット社）法により
ＨＢｃＡｇ、ＨＢｅＡｇの検出を行った。

大腸菌Ｄ　Ｈ１／　ｐ　Ｔ　Ｂ　３６８の産物は主に分
画９．１０に、大腸菌Ｄ　）（１／　ｐ　Ｔ　Ｂ　４４
１の産物は分画２０，２１．２２．２３に分画され（第
８図参照）、前者は粒子状、後者は粒子の形態をとらな
いペプチドと推定された。

ｉｖ）大腸菌ＤＨＩ／ｐＴＢ３６８の菌体抽出液にＨＢ
Ｖ感染チンパンジーの肝臓から抽出したＨＢｃＡｇ粒子
で免疫して得た抗ＨＢｃ抗血清を加えた後、抗体価の減
少を抗ＨＢｃ測定用キット（アボット社）で測定した結
果、抽出物は抗ＨＢｃ抗体と反応し、抗ＨＢｃ抗体を中
和することが明らかとなった。

一方、大腸菌ＤＨ１／ｐＴＢ４４１．　　大腸菌ＤＨＩ
／ｐＴＢ４４９．大腸菌Ｄ　Ｈ１／　ｐ　Ｔ　Ｂ　５５
２　の菌体抽出物は殆ど抗ＨＢｃ抗体と反応しなかった
。

各形質転換体の抽出物と１２５１−抗−ＨＢｃ抗体とを
反応させ、１２ｇ　Ｉ−抗−ＨＢｃ抗体の残存量を抗Ｈ
Ｂｃ　　測定用キット（アボット社）で検討した結果を
以下に示す。

１ｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ネガティブ・コントロール　　　１２０１３　　０Ｅ、
ｃｏｌｉ　Ｄ旧／ｐＴＢ３６８　　　３６０１　　７２
Ｅ、ｃｏｌｉ　ＤＨＩ／　ｐ　Ｔ　Ｂ　４４１　　　１
２９２０　−８．３Ｌｃｏｌｉ　ＤＨＩ／　ｐ　Ｔ　Ｂ
　４４９　　　１１９０５　　０．９Ｅ、ｃｏｌｉ　Ｄ
ＨＩ／　ｐ　Ｔ　Ｂ　５５２　　１２８３２　−７．０
実施例７ 予め、約２００００ｃｐｍを示すよう生理食塩水で希釈
した菌体抽出物（大腸菌Ｄ　ＨＬ　／　ｐ　Ｔ　Ｂ５６
８．６４倍希釈；大腸菌Ｄ　Ｈ１／　ｐ　Ｔ　Ｂ　４４
１．４倍希釈）および血清ＨＢｅＡｇ　（未希釈）１０
０４　Ｑ　Ｌ：＝、生理食塩水で１００倍、５００倍。

１０００倍に希釈したウサギ抗ＨＢｃ抗体およびコント
ロールとして生理食塩水、固相ＨＢｅ（ＨＢｃ）抗体を
加え、室温−晩反応後、同相に結合した抗原を測定した
。結果はコントロールとして生理食塩水を加えた系のカ
ウントを１００％として％（パーセント）で第１０図に
示した。なお、コントロールのカウントは各々、大腸菌
ＤＨＩ／ｐＴＢ３６８，２２３４０ｃｐｍ、大腸菌ＤＨ
Ｉ／ｐＴＢ４４１ｔ　２３４７１ａｐｍ、血清ＨＢｓＡ
ｇ、９４９１ｃｐｍであった。

血清ＨＢ　ｅ　Ａ　ｇはカウントで、他の約１７２量の
抗原しか加えていないのにもかかわらず、第１０図から
明らかなように抗ＨＢｃ抗体を添加してもカウントは最
大１０％程度しか低下しなかった。

従ってこの抗ＨＢｃ抗体はＨＢ　ｃ　Ａ　ｇの検出には
ほとんど影響を及ぼぎないものと考えられる。

大腸菌Ｄ　Ｈ１／　ｐ　Ｔ　Ｂ　３６８抽出物では抗Ｈ
ＢＣ抗体の添加により明らかにカウントの低下がみられ
、産生物がＨＢｃ抗原性を有していることがわかる。大
腸菌ＤＨＩ／ｐＴＢ４４１抽出物では大腸菌ＤＨＩ／ｐ
ＴＢ３６８抽出物のような明らかなカウントの低下はみ
られず、産生物は主にＨＢｅ抗原性を示していることが
示唆される。

実施例８ プラスミドｐＴＢ４４１．ｐＴＢ４４９およびｐＴＢ５
５２に挿入されているＨＢａＡｇをコードするＤＮＡの
３′末端側の塩基配列を以下に示す。

１）ｐＴＢ４４１ ［ｉｌｕ　　　Ａｒｇ　　　Ａｌａ　　　Ｓｅｒ　　　
　−すなわち、該プラスミドにより生産されるペプチド
はＨＢｃＡｇのＣ末端側のアミノ酸４７個が欠損（天然
のＨＢｅＡｇのＣ末端側のアミノ酸７個が欠損）し、９
個の別のアミノ酸が付加したものである。

１ｔ）ｐＴＢ４４９ ＴＴＣ−ＴＴＧ　−ＡＡＧ−ＡＣＧ　−ＡＡＡ・ＧＧＧ
　−ＣＣＴ−ＣＧＴ−ＧＡＴ−ＡＣＧ・ＣＣＴ−ＡＴＴ
、・ＴＴＴΦＡＴＡ−ＧＧＴ・ＡＡ すなわち、ＨＢｃＡｇのＣ末端側のアミノ酸３３個が欠
損し、１６個の別のアミノ酸が付加している。

１ｉｉ）ｐＴＢ５５２ ＧＴＣ，−ＴＣＣ−ＴＡＧ すなわち、ＨＢｃＡｇのＣ末端側のアミノ酸６４個を欠
損している。

実施例９ プラスミドｐＴ８３６８を制限酵素Ｅ　ｃ　ｏ　ＲＩで
切断した後、エクソヌクレアーゼＢａＱ３１で処理した
。次に、Ｐｓｔｌリンカ−ｄ　（ＧＣＴＧＣＡＧＣ）を
結合し、Ｃ１ａＩおよびＰｓｔｌで処理してＨＢ　ｃ　
Ａ　ｇ遺伝子を含むＣ１ａｌ・Ｐｓｔ　Ｉ　ＤＮＡ断片
を得た。該ＤＮＡ断片をｐｔｒｐ７７１のＣ１ａ［−Ｐ
ｓｔ１部位に組込んだ後。

Ｃ１ａｌで切断し、ＥｃｏＲＩリンカ−ｄ　（ＧＧＡＡ
ＴＴＣＣ）を結合させ、ＥｃｏＲＩおよびＰｓｔｌ処理
で得られたＤＮＡ断片をｐｔｒｐ７８１のＥｃｏＲ１部
位に組込み、これを用いて大腸菌ＤＨＩを形質転換させ
、プラスミドＰＴＢ　（４）３６８−１を保持する形質
転換体（ｔＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ　ＤＨＩ／
ｐＴＢ　（４）３６８−１）を得た。

該形質転換体をＭ−９培地で培養し、菌体抽出物のＨＢ
　ｃ　Ａ　ｇ産生量を測定した結果、該形質転換体は大
腸菌Ｄ　Ｈ１／　ｐ　Ｔ　Ｂ　３６８の約１０倍のＨＢ
ｃＡｇ生産量が確認された。

プラスミドｐＴＢ　（４）３６８−１のプロモータ一部
位のＳＤ配列からＨＢ　ｃ　Ａ　ｇ遺伝子の翻訳開始コ
ドンまでの塩基配列を調べた結果、以下のとおり１４ｂ
ｐであった。

５’　　ＡＡＡＡＧＧＧＴＡＴＣＧＡＡＧＧＣＣＧＤ ＧＣＡＴＧ ＳＤ配列とＡＴＧとの間の塩基数を減らすためにｐＴＢ
　（４）３６８−１をＥｃｏＲＩで切断し。

Ｓ１ヌクレアーゼ処理した後、ライゲーション（ｌｉｇ
ａｔｉｏｎ）反応を行い、該反応液を用いて、大腸菌Ｄ
ＨＩを形質転換し、プラスミドＰＴＢ　（４）３６９を
保持する大腸菌／ｐＴＢ　（４）３６９を得た。

該形質転換体のＨＢｃＡｇ生産量を測定した結果、大腸
菌ＤＨＩ／ｐＴＢ３６８（７）１０５倍量のＨＢ　ｃ　
Ａ　ｇを生産することがわかった。

プラスミドｐＴＢ　（４）３６９のＳＤ配列とＡＴＧと
の間の塩基配列は以下のとおり７ｂｐであった。

実施例１０ （ｉ）プラスミドｐＴＢ　（４）３６９をＡｖａｌで切
断し、Ｋｌｅｎｏｖフラグメントで単鎖部分を二重鎖と
した後、Ｐｓｔｌで処理し、大断片を分離し、Ｐｓｔｌ
認識部位を有するＰｓｔｌストップリンカ− を結合した。Ｐｓｔｌで処理し、大断片を分離し、ライ
ゲーション反応を行い、プラスミドｐＴＢ（４）３６９
−４を得た（第１１図参照）。

（ｉｔ）また、ｐＴＢ　（４）３６９を５ｔｙｌで処理
し、小断片を得、該断片をＡ　ｖ　ａ　ＩＩで処理した
後、Ｋｌｅｎｏ％Ｉフラグメントで修復した。前記のＰ
ｓｔｌストップリンカ−を結合した後、Ｈｐａｌおよび
Ｐｓｔｌで処理し、５０２ｂｐ断片を分離し、該断片を
ｐｔｒｐ７８１のＨｐａＩ−Ｐｓｔ１部位に組込み、ｐ
ＴＢ　（４）３６９−３２を得た（第１２図参照）。

（ｉｉｉ）また、ｐＴＢ　（４）３６９（７）Ｓｔｙｌ
処理で得られた小断片をＨｐ　ａ　Ｕで処理した後、　
ＫｌｅｎＯｖフラグメントで修復した。前記のＰｓｔｌ
ストップリンカ−を結合した後、Ｈｐ　ａ　ＩおよびＰ
ｓｔｌで処理し、４７２ｂｐ断片を分離し、該断片をｐ
ｔｒｐ７７１のＨｐａｌ・ＰｓｔＩ部位に組込み、ｐＴ
Ｂ　（４）３６９−４１を得た（第１２図参照）。

（ｔｖ）ｐＴＢ４４１のＨＢｅＡｇ遺伝子中に２つ存在
するＢｇＱｎ部位の５′側のＢｇｆｉ１１部位とベクタ
ー中のＰｓｔＩ部位間のＤＮＡ断片をｐＴＢ　（４）３
６９のＢ　ｇ　Ｑ　ＩＩ　（５’側）　　・ＰｓｔＩ部
位に組込み、ｐＴＢ　（４）４４１−１を得た（第１３
図参照）。

（ｖ）ＰＴＢ４４１のＨＢ　ｅ　Ａ　ｇ遺伝子中に２つ
存在するＢｇｌｎ部位の３′側のＢｇＱＵ部位とベクタ
ー中のＰｓｔ１部位間のＤＮＡ断片をｐＴＢ　（４）３
６９のＢ　ｇ　Ｑ　ｎ　（５’側）　　・Ｐｓｔ１部位
に組込み、ｐＴＢ　（４）４４１−８を得た（第１４図
参照）。

（ｖｉ）ｐＴＢ５５２のＨＢ　ｅ　Ａ　ｇ遺伝子中に２
つ存在するＢｇＱＴ１部位の５′側のＢｇＱＴ１部位と
ベクター中のＰｓｔ１部位間のＤＮＡ断片をｐＴＢ　（
４）３６９のＢｇＱｎ（５’側）・Ｐｓｔ■部位に組込
み、ｐＴＢ　（４）５５２−８を得た（第１５図参照）
。

実施例１１ 実施例９および１０で得られたプラスミドを保持する大
腸菌ＤＨＩを実施例２と同様に培養した後、菌体を集め
、ＥＤＴＡおよびリゾチームを加え、超音波破砕により
菌体抽出液を得た。

アボット社のＨＢｅ−ＥＩＡおよびコアザイム（Ｃｏｒ
ｚｙｍｅ）を用いてＨＢ　ｃ　Ａ　ｇおよびＨＢ　ｅ　
Ａｇの測定を行った結果、ｐＴＢ（４）３６９．ｐ’ｒ
Ｂ（４）３６９−４．ｐＴＢ（４）３６９−３２または
ｐＴＢ（４）３６９−４１を保持する大腸菌ＤＨ１はＨ
Ｂ　ｃ　Ａ　ｇおよびＨＢｅＡｇを産生していることが
、また、ｐＴＢ（４）４４１−１またはｐ’ｒＢ（４）
５５２−８を保持する大腸菌ＤＨＩはＨＢｅ　Ａ　ｇを
産生していることがわかった。

ｐＴＢ　（４）４４１−８を保持する大腸菌ＤＨ１の菌
体抽出液を希釈し、アボット社のＲＩＡＨＢ　ｅ測定キ
ットで抗原価を測定した。結果を以下に示す。

希釈倍率　　　　ｐＴＢ　（４）４４１−８実施例１２ プラスミドｐＴＢ　（４）３６９−４．ｐＴＢ（４）３
６９−３２および　ｐＴＢ３６９−４１に挿入されてい
るＨ　Ｂ　ｓ　Ａ　ｇをコードするＤＮＡの３′末端側
の塩基配列を以下に示す。

（ｉ）ｐＴＢ　　（４）３６９−４ （ｉｔ）ｐＴＢ　　（４）３６９−３２（ｉｆ）ｐＴＢ
　　（４）３６９−４１プラスミドｐＴＢ　（４）４４
１−８はＨＢｃＡｇ遺伝子中の２９〜８２番目のアミノ
酸をコードする部位が欠損し、Ｃ末端側のアミノ酸４７
個をコードする部分が欠損し、９個の別のアミノ酸をコ
ードする塩基配列を有している。

実施例１３ ＰＴＢ　（４）４４１−１またはＰＴＢ　（４）５５２
−８を保持する大腸菌ＤＨＩのＨＢａＡｇ抗原性を示す
産生物の分子量を１２ｓ１−抗ＨＢｅ抗血清を使用した
ウェスタン・プロッテング（Ｗｅｓｔｅｒｎ　ｂｌｏｔ
ｔｉｎｇ）法（Ｔｏｗｂｉｎ、Ｈ，ｒプロシージングオ
ブナショナルアカデミーオブサイエンス（Ｐｒｏｃ、Ｎ
ａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、υ、Ｓ、Ａ、）　７６巻、
９号、４３５０〜４３５４頁（１９７９））およびヒト
抗ＨＢｅ抗血清を使用した免疫沈降法により決定した。

すなわち、ウェスタン・プロッテング　法によりｐＴＢ
　（４）４４１−１を保持する大腸菌の産生物の分子量
は１５，０００〜１５，５００ダルトンであることがわ
かった（第１６図参照）。

また、ｐＴＢ　（４）５５２−８を保持する大腸菌１を
１４０−アミノ酸存在下にＭ−９培地で培養し、菌体抽
出物にヒト抗ＨＢａ抗血清を加えて３７℃で反応させた
後、ＰｒｏｔｅｉｎＡ　（１０％溶液）を加えて抗原抗
体反応物を回収し、ポリアクリルアミドゲル（１７％）
Ｗ！気泳動を行い、オートラジオグラフィーにより、産
生物の分子量を測定した結果１３，０００〜１３，５０
０ダルトンであることがわかった（第１７図）。

なお、形質転換体の寄託機関および受託番号は以下のと
おりである。

ＩＦＯＦＥＲＭ Ｅ、ｃｏｌｉＤＨ１／ｐＴＢ３６８　　１４４６７　０
Ｐ−１１４７Ｅ、ｃｏｌｉＤＨ１／ｐＴＢ４４１　　１
４４６８　　ＢＰ−１１４８Ｅ、ｃｏｌｉＤＨ１／ｐＴ
Ｂ５５２　　１４４６９　　ＢＰ−１１４９Ｅ、ｃｏｌ
ｉ　　Ｃ６００１４４１０ＢＰ−８０８Ｅ、ｃｏｌｉ　
　ＤＨ１／　Ｐ　Ｔ　Ｂ　（４）３６９　　１４５３３
　８Ｐ−１１５３Ｅ、ｃｏｌｉ　　Ｄ　Ｈ１／　ｐ　Ｔ
　Ｂ　（４）４４１−１　１４５３４　　ＢＰ−１１５
４Ｅ、ｃｏｌｉ　　Ｄ　Ｈ１／　ｐ　Ｔ　Ｂ　（，４）
４４１−８　１４５３５　　ＢＰ−１１５５Ｅ、ｃｏｌ
ｉ　　Ｄ　Ｈ１／　Ｐ　Ｔ　Ｂ　（４）５５２−８　１
４５３６　　ＢＰ−１１５６なお、大腸菌ＤＨＩは公知
の微生物である（Ｓｅｌｓｏｎ、Ｍ、Ｅ、ら、ネイ゛チ
ャー、第２１７巻、１１１０頁（１９６８年）〕。

ＩＦＯは財団法人発酵研究所の受託番号を、ＦＥＲＭは
通商産業省工業技術院微生物工業技術研究所の受託番号
を表す。

見匪立腹来 ＨＢｃ抗ＪＪ（、ＨＢｅ抗原は天然にはＨＢＶ感染後の
ヒトあるいはチンパンジーのみから得ることしかできず
、量的にも制約されてきた。また、これらの疾患動物の
取扱いはＨＢＶ感染の危険を伴い、不都合であった。本
発明はこれらの問題を解決し１本発明によれば抗原性が
天然のものに近く、安価で、安全で、しかも大量にＨＢ
　ｃ抗原性あるいはＨＢｅ抗原性を示すポリペプチドが
得られる。

【図面の簡単な説明】

第１図はａｄｗｉＪ：！ＨＢＶ　ＤＮＡの全塩基配列を
示し、第２図はａｄｗ型ＨＢ　ｃ　Ａ　ｇのアミノ酸配
列を示し、第３−はａｄｗ型ＨＢ　ｃ　Ａ　ｇをコード
するＤＮＡの塩基配列を示す。 第４図はｐＴＢ３６８の構築図を示し、第５図はＨＢｅ
Ａｇ発現用プラスミドの構築図を示す。 第６図はレーン１．２とも大腸菌Ｄ　Ｈ１／　ｐ　ＴＢ
３６８の産生物のウェスタン・プロッティング（ｗｅｓ
ｔａｒｎ　ｂｌｏｔｔｉｎｇ）の結果を示す。 第７図は大腸菌ＤＨＩ／ｐＴＢ３６８の産生物のセシウ
ムクロリド平衡密度勾配遠心による解析結果を示す。 第８図は大腸菌ＤＨＩ／ＰＴＢ３６８の産生物のショ糖
濃度勾配遠心による解析結果を、第９図は大腸菌Ｄ　Ｈ
１／　ｐ　Ｔ　Ｂ　４４１の産生物のショ糖濃度勾配遠
心による解析結果を示す。 第１０図はウサギ抗ＨＢｃ抗体によるＨ　Ｂ　ｅ（ＨＢ
ｃ）ＲＩＡの中和試験結果を示す。 第１１図はＰＴＢ　（４）３６９−４の構築図を、第１
２図はｐＴＢ　（４）３６９−３２及びＰＴＢ（４）３
６９−４１の構築図を、第１３図はｐ’ｒＢ（４）４４
１−１の構築図を、第１４図はｐ’ｒＢ　（４）４４１
−８の構築図を、そして第１５図はＰＴＢ　（４）５５
２−８の構築図をそれぞれ示す。 第１６図は本発明産生物の分子量のウェスタン・プロッ
ティング法による解析図であり、第１７図は本発明産生
物の分子量の免疫沈降法による解析図である。

Claims (4)

【特許請求の範囲】
1. （１）微生物により生産されるＢ型肝炎ウィルスｅ抗原
   性を示すポリペプチド。
2. （２）プロモーターの下流に、翻訳開始コドン、Ｂ型肝
   炎ウィルスｅ抗原性を示すポリペプチドをコードするＤ
   ＮＡおよびその直後に停止コドンを連結してなる組換え
   ＤＮＡ。
3. （３）プロモーターの下流に、翻訳開始コドン、Ｂ型肝
   炎ウィルスｃ抗原性を示すポリペプチドをコードするＤ
   ＮＡおよびその直後に停止コドンを連結してなる組換え
   ＤＮＡにおいて、上記プロモーターのＳＤ配列と翻訳開
   始コドンとの間の配列がＡＴＣＧＧＧＣであることを特
   徴とする組換えＤＮＡ。
4. （４）プロモーターの下流に、翻訳開始コドン、Ｂ型肝
   炎ウィルスｃ抗原性を示すポリペプチドをコードするＤ
   ＮＡおよびその直後に停止コドンを連結してなる組換え
   ＤＮＡにおいて、上記プロモーターのＳＤ配列と翻訳開
   始コドンとの間の配列がＡＴＣＧＧＧＣである組換えＤ
   ＮＡを保持する形質転換体を培養することを特徴とする
   Ｂ型肝炎ウィルスｃ抗原性を示すポリペプチドの製造法
   。