JPS6362198B2 - - Google Patents
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Description
請求の範囲
１ デーン粒子のクローン化されたゲノムの二本
鎖DNA断片で構成されたインサートが挿入・融
合されているベクターであつて、 (a) 前記インサートの各ストランドが、式： 【表】 【表】 【表】 で表わされるヌクレオチド配列を有する大きいス
トランドまたはこの大きいストランドの一部から
成り、 (b) 前記大きいストランドが、式： 【表】 で表わされるポリペプチドをコードしているポリ
ヌクレオチドを含有しており、 (c) 前記大きいストランドの前記一部が、少なく
ともアラニン―グルタミン―グリシン―トレオ
ニン―セリンというペンタペプチドをコードし
ているポリヌクレオチドを含有しており、 (d) 前記インサートが、HBs抗原の免疫学的特
性を有するポリペプチドをコードしているヌク
レオチド配列を含有しており、 (e) 前記ポリペプチドをコードしている前記ヌク
レオチド配列が、前記ベクター内で解読相にあ
ることを特徴とする前記ベクター。 ２ 前記インサートがポリヌクレオチド配列： を含有することを特徴とする請求の範囲第１項に
記載のベクター。 ３ 前記大きいストランドが、式： 【表】 【表】 で表わされるポリヌクレオチドを含有することを
特徴とする請求の範囲第１項に記載のベクター。 ４ 前記インサートがその一端にHinｃ，Hha
，AvaまたはEcoＲ制限部位を、他端に
Ava，HinｃまたはHha制限部位を有する
ことを特徴とする請求の範囲第１項に記載のベク
ター。 ５ 前記インサートの各ストランドがそれぞれ最
大で1100ヌクレオチドのサイズを有することを特
徴とする請求の範囲第１項に記載のベクター。 ６ 前記インサートのストランドが、式： 【表】 【表】 で表わされるヌクレオチド配列を含有することを
特徴とする請求の範囲第１項に記載のベクター。 ７ 前記インサートの各ストランドがそれぞれ最
大で1000ヌクレオチドのサイズを有することを特
徴とする請求の範囲第１項に記載のベクター。 ８ 前記インサートのストランドが、式： 【表】 【表】 で表わされるヌクレオチド配列を含有することを
特徴とする請求の範囲第５項に記載のベクター。 ９ 前記インサートのストランドが、式： 【表】 で表わされる蛋白質をコードしているポリヌクレ
オチドから成ることを特徴とする請求の範囲第１
項に記載のベクター。 １０ 前記インサートがＳ―遺伝子を含有するこ
とを特徴とする請求の範囲第９項に記載のベクタ
ー。 １１ 前記インサートがＳ―遺伝子から成ること
を特徴とする請求の範囲第１項に記載のベクタ
ー。 １２ 前記インサートが、式： 【表】 で表わされるポリヌクレオチド配列を有すること
を特徴とする請求の範囲第１０項に記載のベクタ
ー。 １３ 前記インサートが、式： 【表】 で表わされるポリヌクレオチドから成ることを特
徴とする請求の範囲第１項に記載のベクター。 １４ 前記インサートが、式： 【表】 【表】 で表わされるポリペプチドをコードしているヌク
レオチド配列を含有することを特徴とする請求の
範囲第１項に記載のベクター。 １５ 前記インサートが、式： 【表】 【表】 で表わされるポリヌクレオチドから成ることを特
徴とする請求の範囲第１４項に記載のベクター。 １６ インサートがデーン粒子のゲノムの断片か
ら成り、この断片が、次のデーン粒子の概略図に
示した前記ゲノムのEcoＲ制限部位からの位置
73.6と95.1の間に位置することを特徴とする請求
の範囲第１項に記載のベクター。 １７ 前記インサートが、アラニン―グルタミン
―グリシン―トレオニン―セリン（ただしアラニ
ンがＮ―末端で、セリンがＣ―末端である）、ト
レオニン―アラニン―グルタミン―グリシン―ト
レオニン―セリン（ただしトレオニンがＮ―末端
で、セリンがＣ―末端である）、およびトレオニ
ン―トレオニン―アラニン―グルタミン―グリシ
ン―トレオニン―セリン（ただしトレオニンがＮ
―末端で、セリンがＣ―末端である）で構成され
るグループの中から選択されるペプチド配列をコ
ードしていることを特徴とする請求の範囲第１項
に記載のベクター。 １８ 前記インサートが、 および で構成されるグループの中から選択されることを
特徴とする請求の範囲第１７項に記載のベクタ
ー。 １９ プラスミドであることを特徴とする請求の
範囲第１項〜第１８項のいずれかに記載のベクタ
ー。 ２０ フアージであることを特徴とする請求の範
囲第１項〜第１８項のいずれかに記載のベクタ
ー。 ２１ ラクトースオペロンの一部分を含んでお
り、この部分がプロモーターおよび前記オペロン
のＺ遺伝子の少なくとも一部を含み、かつ、イン
サートがＺ遺伝子の前記一部と融合していること
を特徴とする請求の範囲第１項に記載のベクタ
ー。 ２２ インサートがＺ遺伝子中のEcoＲ部位に
融合していることを特徴とする請求の範囲第２１
項に記載のベクター。 ２３ 前記インサートがβ―ガラクトシダーゼの
主要部によつて構成されるポリペプチド配列をコ
ードしている別のDNA断片に連続して繋がつて
おり、ただし、このβ―ガラクトシダーゼは前記
インサートがコードしているポリペプチド配列に
対して非免疫原性の担体であることを特徴とする
請求の範囲第２１項に記載のベクター。 ２４ 前記インサートに加えて、(a)非免疫原性で
ある担体分子、または(b)前記インサートがコード
しているポリペプチドの免疫学的特性に干渉しな
い免疫学的特性を有する担体分子をコードしてい
るDNA断片も含んでいることを特徴とする請求
の範囲第２３項に記載のベクター。 ２５ 前記インサートが、Ｓ―遺伝子の内、この
遺伝子のXba部位から解読方向に延びる部分を
含んでいることを特徴とする請求の範囲第２１項
に記載のベクター。 ２６ プラスミドであつて、このプラスミドが、
(a)遺伝子Ｓの内、HBs抗原の免疫学的特性を有
するポリペプチドをコードしている部分と、(b)
pBR322との組換え体であることを特徴とする請
求の範囲第１９項に記載のベクター。 明細書 本発明は、Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原に対応す
る免疫原性ペプチド配列をコードしうるヌクレオ
チド配列を含む核酸、及び得られたポリペプチド
とペプチドに関係する。 本発明はまたこのような核酸を得ることを可能
にする方法にも関する。 Ｂ型肝炎は特に熱帯アフリカ、東南アジア及び
極東において多発するウイルス性疾患である。 病因はウイルス（HBV）すなわちデーン粒子
であつて、エンベロープ（オーストラリア抗原す
なわちHBs抗原）、キヤプシド（HBc抗原）、内
因性のDNAポリメラーゼ、及び部分的に一本鎖
の環状DNA分子からなり、このDNA分子の最長
のストランドは約3200個のヌクレオチドを有する
（Summers J.O′Connell A.and Millman I.
（1975）Proc.Nat.Acad.Sci.USA 72，4567―
4597）。 内因性のDNAポリメラーゼは、試験管内
（invitro）で短い方のストランドを修復するため
に使用することができる（T.A.Landers，H.B.
Greenbert and J.S.Robinson，J.Virol.，23，
1977，p.368―376）。 エンベロープ蛋白質の電気泳動分析によつて２
乃至７個のポリペプチドの存在が示されており、
そのうち主要なものはポリペプチド及びポリペ
プチドと呼ばれている（Peterson D.L.，
Roberts I.M.and Vyas G.N.（1977）Proc.Nat.
Acad.Sci.，USA，74，1530―1534，及び
Peterson D.L.，Chien D.Y.，Vyas，G.N.，
Nitechki D.and Bond H.（1978）In Viral
Hepatitis，ed.G.Vyas，S.Cohen and R.
Schmid，The Franklin Institute Press，
Philadelphia，569―573）。 ポリペプチドは分子量が22000乃至26000ダル
トンであり、ポリペプチドはグリコシル化され
ており分子量は28000乃至30000ダルトンである。
これら二種のポリペプチドのアミノ酸組成は非常
に類似しており、（Ｎ―末端から）最初の15個の
アミノ酸及び最後の３個のアミノ酸はそれぞれ同
一である。従つてポリペプチドはグリコシル化
されている点でのみポリペプチドと異なるとい
う仮説が立てられた。 このウイルスの研究は、その増殖を可能にする
細胞培養系がないという点において非常に困難で
ある。この困難は部分的には、特に血清型aywに
関してはすでにゆるめられている。このウイルス
のDNA全体（ゲノム）は、Fritsch A.，Pourcel
C.，Charnay P.and Tiollais P.（1978）C.R.
Acad.de Paris，287，1453−1456に記載の技術
によつて、特にλgt.WES.λBベクターの唯一の
EcoＲ部位に予め挿入した後E.coli中で同定さ
れ、クローン化されている。 今日までのところポリペプチド及び自体の
配列決定、並びにこれらのペプチドをコードして
いる配列のウイルスDNA中の位置決定は実現さ
れていない。 本発明の目的は、免疫特性を有するペプチド配
列をコードするように適合された配列を含有し、
ウイルスDNA自体よりもはるかに小さいDNA配
列を得ることであり、前記ペプチド配列が生体宿
主の体内に入ると、特に毒性（ビルレント）状態
にあるＢ型肝炎ウイルスに対して以後この宿主を
保護しうる抗体がこの宿主によつて産生される。 本発明は、デーン粒子のゲノムの完全なヌクレ
オチド分析（本発明者等が達成した）に基づくも
のであるがそれだけではなく、前記ポリペプチド
をコードしている遺伝子（以後“Ｓ遺伝子”とい
う）を同定するために本発明者等が持つていたア
イデアにも基づくものであり、このアイデアによ
つて、上のようにあらかじめ決定されたデーン粒
子ゲノムの完全なヌクレオチド構造中で、前記の
ポリペプチドの公知の基部（proximal）及び末
端のペプチド配列をコードし得るヌクレオチド配
列の構造を探求する。 Peterson等により、特に上で引用した文献中
で、15個の最初のアミノ酸からなる基部配列（Ｎ
―末端の最初のアミノ酸）が原則的にmet glu
asnile thr ser gly phe leu leu gly pro leu
valserであり、同じポリペプチドの末端配列（Ｃ
末端の最後のアミノ酸）がval tyr ileであると報
告されていることを想起されたい。 第１図はデーン粒子のゲノムの概略図である。
デーン粒子は二本のストランドb1及びb2を有し、
これらの短い方b2は通常図の点線で表わされた部
分を欠いている。 このDNAはEcoＲ部位を１個しかもたない
ことが知られている。 矢印f1は長い方のストランドb1を構成するヌク
レオチドの番号付の方向であり、矢印f2は遺伝子
Ｓの発現に関するウイルスのDNAの転写の方向、
特にＢ型肝炎ウイルスに侵された細胞のメカニズ
ムによる転写方向である。 EcoＲ部位は番号０を付け得、または血清型
aywに属するＢ型肝炎ウイルスのEcoＲ部位に
対してもつと正確に決定されているように3182と
番号付け得る。 内部にある実線の円ｅはDNAの全長に対する
目盛を％で示すスケールであり、DNAの諸部の
位置を明確に表わすことができる。 第１図の下部にある数3′，5′及び5′，3′は核酸
鎖の末端の慣用的表現で、鎖末端を示している。 本発明によつて、“遺伝子Ｓ”は本質的に第１
図の説明図の位置73.6と95.1の間にある長い方の
ストランドb1の断片を構成していることが示され
た。図中“スタート”及び“ストツプ”は“遺伝
子Ｓ”の転写の開始及び終結点を表わす。 第２Ａ，２Ｂ，２Ｃ図は前記ゲノムの末端部を
表わし、特に位置60.4から100（DNAの全長に対
する％）までを示す。第２図中の各文字は従来通
りDNAの４種の基本ヌクレオチドすなわち Ａ：アデニン Ｇ：グアニン Ｔ：チミン Ｃ：シトシン の一つに対応する。 第２Ａ，２Ｂ，２Ｃ図中の１対の配列の下側の
配列はヌクレオチド鎖b2に対応する核酸を示す。 第２Ａ，２Ｂ，２Ｃ図の表わす詳細な地図を製
作するために用いられる分析技術を想起されるべ
く以下に簡単に記述しよう。 本発明の範囲内で提案されている如き“遺伝子
Ｓ”のヌクレオチド（その基部側末端ｐ“Ｓ”及
び末端側末端ｔ“Ｓ”が第２Ａ，２Ｂ，２Ｃ図中
に示されている）の特定決定は次の観察の結果で
ある。すなわち ― EcoＲ末端から第3030番のヌクレオチドか
ら（f2の解読方向で）最初の14個のトリプレツ
トはそれぞれ前記ポリペプチドの最初の15個の
アミノ酸からなる基部配列の最初の14個のアミ
ノ酸をコードし得る。 ― 転写される鎖b1に対して相補的な鎖b2上で読
取られる最後の４個のトリプレツトGTA
TAC ATT TAAがそれぞれ前記ポリペプチ
ドの３個の末端アミノ酸及び終結コドンに対応
する。 ― このヌクレオチド配列（678個のヌクレオチ
ド）は、少なくとも、細胞のメカニズムによつ
てDNA上で“読み取られる”最初のトリプレ
ツトがAUG（ATGと相補的なストランドに対
応する）となるような解読枠（reading
frame）を採用した場合には、終結コドンを全
く含まない。 ― 開始コドンATGで始まる遺伝情報を完全に
翻訳すると、分子量25422ダルトンを有するア
ミノ酸226個の理論上のポリペプチドが得られ
ることになる。 “遺伝子Ｓ”のヌクレオチド構造並びに“遺伝
子Ｓ”の翻訳の結果得られるポリペプチド鎖を第
３Ａ，３Ｂ，３Ｃ図に示す。 上記の値はすでに報告されているポリアクリル
アミドゲル上でのポリペプチドの電気泳動で得
られた分析データとよく一致する（本明細書末尾
に挙げた参考文献一覧表中の文献番号９−12）。 ポリペプチドの基部ペプチド配列の15番目の
アミノ酸のレベルで観察される相違すなわち上記
文献の著者諸氏によるセリンではなく、前述の第
２Ａ，２Ｂ，２Ｃ図及び第３Ａ，３Ｂ，３Ｃ図で
はロイシンとなつていることは、これらの著者が
用いた変異体が本発明で用いた変異体とは異なる
遺伝子変異体であつたためと思われる。この相違
はまた、セリンに翻訳され得るトリプレツトの一
つ“TCA”の代りに第２Ａ，２Ｂ，２Ｃ図及び
第３Ａ，３Ｂ，３Ｃ図に示した特定の“遺伝子
Ｓ”中ではトリプレツト“TTA”となつている
ように、ヌクレオチド１個の置換に起因し得るこ
とに注目されたい。 従つて本発明は特にデーン粒子のDNAから切
り出され得る核酸の断片に関係し、これらの断片
は特にＢ型肝炎ウイルスの免疫学的特性を生じる
原因であるウイルスのエンベロープの蛋白質の一
部分をコードし得る“遺伝子Ｓ”の一部分を含む
ことを特徴とする。 従つて本発明は、多くとも1000−1100個程度の
ヌクレオチドからなる核酸に関係し、特にこの核
酸が免疫原性ペプチド配列をコードするように適
合されていることと、このペプチド配列自体がＢ
型肝炎ウイルスに対して活性な抗体の生体内
（invivo）生成を誘発するように適合されている
ことと、このペプチド配列が本質的に第３Ａ，３
Ｂ，３Ｃ図に示した構造または同等な免疫原特性
を有する任意のペプチド配列を含むこととを特徴
とする。 本発明はまた、微生物中または真核生物細胞中
で前記ヌクレオチド配列を発現させるためのベク
ターに係り、この際遺伝子融合は“遺伝子Ｓ”の
解読相（reading phase，読み取り枠）を保つて
行われる。 本発明によつて用いられるヌクレオチド配列は
互いにその発現の際にＢ型肝炎ウイルスのサブタ
イプ（群ａのサブタイプｄ，ｗ，ｙ，ｒ）によつ
て変化する決定基の形成に導く変異を有する。 第３Ａ，３Ｂ，３Ｃ図に表わされたペプチド配
列の一つでは、前記配列の第一アミノ酸すなわち
メチオニンがＮ―末端であり、反対の端のアミノ
酸すなわちイソロイシンがＣ末端である。 本発明はまた特に第５図に示した如きペプチド
配列をコードしている第４Ａ，４Ｂ図に表わされ
たヌクレオチド配列または同等な免疫原特性をも
つ類似の任意のペプチド配列に関する。 上述の“同等なペプチド配列”という用語は、
言うまでもなく、第３Ａ，３Ｂ，３Ｃ図及び第５
図に表わされたペプチド配列中の対応する部分と
厳密に同一ではないいくつかの部分の存在する全
ペプチド配列を意味するのであつて、これらの変
化は蛋白質の一般的免疫原形質に影響しない局部
的突然変異に起因し、または問題の種類の蛋白質
が見い出され得る種々の血清型（特に血清型
adw，adr及びayr）に応じた構造上の修飾
（modification）を伴う。 本発明は特に第６図に表わされる如きペプチド
配列または同等な免疫原特性をもつ類似の任意の
ペプチド配列を含有するヌクレオチド配列に関す
る。 本発明は特にまた次のペプチド配列に関する。
すなわち、 アラニン―グルタミン―グリシン―トレオニン
―セリン、 トレオニン―アラニン―グルタミン―グリシン
―トレオニン―セリン、 トレオニン―トレオニン―アラニン―グルタミ
ン―グリシン―トレオニン―セリン。 上に示した第一のペプチド中、アラニン末端が
Ｎ―末端であり、セリン末端がＣ―末端である。 上記の第二と第三のペプチドではトレオニンが
Ｎ―末端でセリンがＣ―末端である。 例として特にＣ―末端のセリンから始まるペン
タペプチドを製造することが可能であり、その場
合、Tetrahedron Letters，1975，No.14，1219−
1222頁に記載のカストロ（Castro）法によつて
Ｃ―末端セリンに、トレニオンを連結する。次
に、Beierman，Chemistry and Biology of
Peptides，Ed.J.Meienhofer，Ann.Arbour
Science Publ.，Ann.Arb.Mich.341（1972）に記
載の所謂反復混合無水物法（レマ（rema）法）
によつて、グリシン，グルタミン，アラニンのア
ミノ酸を付加する。 本発明はまた、大きめの担体分子、特にポリペ
プチドまたは蛋白質の形態の担体分子へ前記ペン
タペプチドを固定した結果得られる生成物、特に
薬剤上許容し得るベヒクルと共に固定生成物中の
ペンタペプチドを含有する組成物、とりわけＢ型
肝炎に対するワクチンに係る。これらの薬剤ベヒ
クルは従来、特に経口、非経口、経直腸及び粘膜
特に鼻粘膜への噴霧から選ばれた投与法に適して
いる。 ヘキサペプチド及び７個のアミノ酸を有するポ
リペプチドは古典的なペプチド合成法によつて製
造することができる。 これらのペプチドは、本発明によると上記で考
察したサイズの大きいポリペプチドの抗原部位で
あると思われ、ウイルスエンベロープのワクチン
化能の主因である（Journal of Biol.
Stand.1976，４，295−304，RAO及びVYAS
“Biochemical Characterization of Hepatitis
Ｂ Surface Antigen in Relation to Serologic
Activity”。 本発明はまたこのようなペンタペプチド，ヘキ
サペプチド，及び７個のアミノ酸を有するポリペ
プチドの産生をコードし得るDNA断片にも関す
る。すなわち、 ― ペンタペプチド配列については、特に式 のポリヌクレオチド、 ― ヘキサペプチドについては、特に式 のポリヌクレオチド、 ― ７個のアミノ酸を有するポリペプチドについ
ては、式 のポリヌクレオチド、 または前記三つの場合の各々において、先の３
個のそれぞれのポリヌクレオチドに関する相補的
ポリヌクレオチド、またはその中の各トリプレツ
トが同じアミノ酸の産生をコードし得る類似の任
意のトリプレツトによつて置換されているすべて
のポリヌクレオチドである。 本発明による核酸はまた、第４Ａ，４Ｂ図に表
わされる如きDNA配列の相互に相補的な二本の
ストランドの少なくとも一本を含むことを特徴と
し得る（第４Ａ，４Ｂ図は、この図には示してな
い位置EcoＲに対して番号付けした、一連の10
個ずつのヌクレオチドの断片の各々の第一のヌク
レオチドの位置に対応する番号も表わし、これら
の番号は問題の種類のヌクレオチド配列の特性決
定の観点からは考慮する必要がないことは言うま
でもない）。このDNA断片の両端はHinＣ部位
になつている。 このヌクレオチド配列は、翻訳すると第５図に
示されたペプチド配列が得られる遺伝情報に対応
する。 本発明は勿論一重ストランド（特にこのストラ
ンドは、第４Ａ，４Ｂ図の下側の配列の構造を有
する）または二重ストランドを有する同等なヌク
レオチド配列、または対応する二重ストランド
DNA、または対応するメツセンジヤーRNA、特
に第４Ａ，４Ｂ図（矢印f2の向き）の下側の配列
によつて構成されるヌクレオチドの相補鎖によつ
て表わされるヌクレオチド配列に関する。 同様に、前出のヌクレオチド鎖とはいくつかの
トリプレツト又はトリプレツトの小配列が異なる
が、Ｂ型肝炎ウイルスの特徴的免疫原活性を保有
するポリペプチドをコードするように適合されて
いるヌクレオチド鎖も本発明の範囲に含まれる。
一般に、これらは、対応する単一ストランドの核
酸が生成するように二重ストランドのDNAを変
性した後で、その長さの少なくとも約90％に亘つ
て、第４Ａ，４Ｂ図のDNAストランドの１個と
ハイブリダイズし得るヌクレオチド鎖を意味す
る。 更に本発明の好ましい核酸として、肝炎ウイル
スのDNAから切り出すことが可能であり、且つ
二重ストランドになつているときに１端がHinｃ
，Hha，Ava又はEcoＲ末端で他端が
Ava，Hinｃ又はHha末端であることを特
徴とする核酸を挙げることができる。 EcoＲ部位に対するこれらの種々の末端の位
置を第２Ａ，２Ｂ，２Ｃ図に概略的に示した。 本発明の核酸は、特に生体宿主の体内でＢ型肝
炎のウイルスに対して活性のある抗体の産生を誘
導し得る蛋白質又はペプチドを生産するために、
細菌及び真核細胞中で発現し得るベクターに組込
まれるべく構成されている。本発明のヌクレオチ
ド配列の翻訳により得られる蛋白質又はペプチド
は、ワクチン又は診断用薬剤として使用され得
る。 本発明の核酸は更に、血液サンプル又はテスト
血清サンプルの中にデーン粒子、HBs抗原又は
該抗原の断片等が存在するか否かを（従来の
DNA―DNAハイブリダイゼーシヨン技術を用い
て）追跡するためのプローブとして使用され得
る。 本発明の別の特徴は、本発明のDNA断片の分
析、同定及び産生技術に関する下記の簡単な記載
により明らかになるであろう。当然図面を参照さ
れるであろうが、図中の記号に関しては前記に於
いてすでに説明した。括弧内の数字は本明細書末
尾の参考文献の番号に対応する。 本発明はまた、前記のヌクレオチド配列を特に
ハイブリツド蛋白質の形状で発現し得るベクター
に係る。該ハイブリツド蛋白質に於いてHBsAg
の免疫学的特性を有する蛋白質断片は、この蛋白
質を導入した宿主生体中でウイルス感染に対する
保護抗体の産生を誘導し得る免疫原性すなわち免
疫反応性をこのハイブリツド全体に付与する担体
分子に付加されている。 特に本発明は、ラクトースオペロンの少なくと
も１部特に該オペロンのプロモーター及びＺ遺伝
子を含むベクターすなわちフアージ又はプラスミ
ドに係る。このベクターの特徴は、本発明の
DNA断片の任意の１個特に“遺伝子Ｓ”の最大
部分を含むDNA断片の任意の１個が、EcoＲ
部位の如きＺ遺伝子の適当な部位に位相を合わせ
て（in phase）挿入されるように修飾されている
ことである。本発明は更に、これらの修飾された
ベクターのうちで、β―ガラクトシダーゼの最大
部分をコードしているDNA断片の少なくとも１
部が、免疫原性でない任意の別の担体分子、又
は、たとえ免疫学的特性が存在しているとしても
HBsAgの免疫学的特性を持つペプチド部分の免
疫学的特性例えば本質的にHha部位から解読方
向に伸びるペプチド部分の免疫学的特性を妨害し
ない担体分子をコードするように適合された
DNA断片によつて置換されているベクターに係
る。 更に、本発明はより詳細には、HBsAgの特定
の免疫学的特性を有するポリペプチド配列を含ん
でおり、該配列が、担体蛋白質の機能を果すβ―
ガラクトシダーゼの大部分から成るポリペプチド
配列と連続して結合していることを特徴とするハ
イブリツド蛋白質に係る。 本発明の範囲は単に、遺伝子工学の方法で構築
され且つHBsAg抗原の特徴たる免疫原性及び免
疫反応性を備えた蛋白質のモデルの構成を主機能
とする特別なハイブリツド分子に及ぶのみでな
く、β―ガラクトシダーゼの全部又は１部が非免
疫原性の任意の別の担体分子又は例え免疫学的特
性が存在していてもこれらの免疫特性がHBsAg
の免疫学的特性を有するペプチド配列部分の免疫
学的特性を妨害しない任意の別の担体分子によつ
て置換されている任意の別のハイブリツド蛋白質
にも及ぶ。 本発明の別の特徴は、添付図面に基づいてなさ
れる好ましい実施例の記載により一層明らかにな
るであろう。 ― 第１ａ図乃至第１ｈ図は、HBV DNA断片
を組込んだプラスミド型のベクターの製造工程
を概略的に示す。 ― 第２ａ図乃至第２ｃ図は、使用したベクター
の最初の構造（第２ａ図）と、得られた修飾ベ
クターの最終構造（第２ｂ図）と、この修飾ベ
クターがE.coli中で発現した結果得られたハイ
ブリツド蛋白質の構造（第２ｃ図）とを示す。 Ａ ヌクレオチド配列 使用した原材料及び方法 ― 使用酵素及び化学品 使用制限酵素：BamＨ，Hha，Hinｃ，
Hae，Xba，Mbo，Hinｆ，Hpa，
XhoはBIOLABSにより製造された酵素であ
る。BOEHRINGERのDNA―ポリメラーゼを
使用した。細菌性アルカリホスフアターゼとポリ
ヌクレオチド―キナーゼはP.L.
BIOCHEMICALSにより供給された。下記の化
学薬品を使用した。 ● 硫酸ジメチル（ALDRICH）， ● ヒドラジン（EASTMAN KODAK）， ● アクリルアミド及びビス―アクリルアミド
（２回結晶化―SERVA）， ● ジデオキシヌクレオチドトリホスフエート及
びデオキシヌクレオチドトリホスフエート（P.
L.BIOCHEMICALS）， ● 減圧下で再蒸留したピペリジン（MERCK）。 ― DNA HBVの調製 λgt.WES.λBベクター（14）の唯１つの制限部
位EcoＲを使用してE.coli中で全HBVゲノム
（ayw亜型）をクローン化した。クローン化した
DNAを以後“Eco HBV DNA”と指称する。 組換えバクテリオフアージをペトリ皿の寒天上
で増殖させ、それ自体公知の方法で所望のDNA
を抽出した。EcoＲ制限酵素によるDNAの消
化後、参考文献（16，17）に記載の方法でスクロ
ース濃度勾配超遠心によりEco HBV DNA配列
を精製した。 ― 5′32Pで標識されたDNA断片の調製 製造業者が勤める条件を用い種々の制限酵素に
よつてEco HBV DNA10乃至20ピコモルを完全
に加水分解した。このDNA断片をアルカリ性ホ
スフアーゼによつて脱リン酸化し、次に該ホスフ
アターゼをアルカリ処理によつて不活性化した。
次に論文（18）に記載の方法によりDNAをエタ
ノールで沈澱させた。スペルミジンをベースにし
た緩衝液に再溶解後、（論文（19）に記載の方法
により）ATP｛λ32P｝（NEW ENGLAND
NUCLEARにより製造された3000Ci／mM）と
ポリヌクレオチド―キナーゼによつて5′末端で
DNAを標識した。 このDNA制限断片をポリアクリルアミドゲル
電気泳動により分離し次に溶離した。別の酵素に
よる制限後のそれ自体公知の方法によるポリアク
リルアミドゲル電気泳動、又は問題の種類の
DNA断片の変性によつて、標識された末端を分
離（segregation）した。 ― DNAのヌクレオチド配列の構造の決定 二重ストランド（二本鎖）又は単一ストランド
（一本鎖）のDNA断片の一次構造は、主として
MAXAM及びGILBERTによつて記載された方
法（19）により決定された。更に、5′末端の１個
で標識された二重ストランドの断片に関しては
SANGER等（20）により記載され、MAAT及び
SMITH（21）により応用された末端鎖阻害法
（the method of terminal chain inhibiters）を
使用した。 化学反応及び酵素反応の生成物の分析は、厚み
１mmで８，16又は25％のアクリルアミドゲル内で
順次電気泳動して行なわれた。 分析の方法及び結果 HBVゲノムがポリペプチド及びをコード
し得るか否かを決定するために、Hae断片全部
（HBVゲノムのHae制限部位は第１図に小さい
矢印で示した）を5′末端で標識した。それらの一
次構造のかなりの部分はMAXAM及び
GILBERTの方法により決定した。ポリペプチド
及びの基部及び末端のアミノ酸配列をコード
し得るヌクレオチド配列は、参考文献（17）に記
載の方法によつて既にHBVゲノムの制限地図上
で位置が決定されているHae断片Ｅ及びHae
断片Ｆに局在していた。すでに記載の理由によ
り、EcoＲ制限部位に対して73.6から95.1まで
の位置（第１図）を占める“遺伝子Ｓ”の末端に
存在すると考えられるのはこれらのヌクレオチド
配列である。 これらの両位置間のヌクレオチド配列を、公知
の化学的方法、特に硫酸ジメチル／ヒドラジンに
よる化学的分解方法及びチエインターミネーシヨ
ン法により分析した。MAXAM及びGILBERT
により提案された種々の化学反応のうちで、蟻酸
による部分的変性（depurination）とピペリジン
による開裂とを使用した。これらの方法は、グア
ニン及びアデニンを末端にもつ断片に対しオート
ラジオグラムで等しい強度のバンドを与える。ま
た、シトシン及びチミジンヌクレオチドに対して
等しい強度のバンドを得るために、ヒドラジンに
よる反応とそれに続くピペリジンによる開裂を使
用した。これらの２種の反応の生成物の電気泳動
分画を行なうと、すべての塩基に対し、使用ゲル
カラムの１方又は他方にスポツトが生じる。この
方法によれば、ゲルのオートラジオグラムの解読
が容易である。シトシンに対して特異的な塩化ナ
トリウムの存在中でヒドラジンによる反応を行な
うこのヌクレオチドをチミジンから区別し得る。
硫酸ジメチルによる反応後グアニンに対して特異
的なピペリジンによる開裂を行なうと、グアニン
ヌクレオチドをアデニンから区別し得る。 可能な最高精度を確保するために、互いにまた
がつて重なる種々の断片を形成する別々のヌクレ
オチド配列を、下記の種々の制限酵素によるEco
HBVDNAの加水分解によつて製造した。Bam
Ｈ，Hinｆ，Hpa，Hae及びHinｃ。 このようにして、第１試験断片の出発点として
用いた制限部位の夫々の分析結果は、別の断片
（これらの別の断片に於いては第１断片の制限部
位がこの別の断片の新しい末端と末端の間に存在
している）の分析により確認された。 第３Ａ，３Ｂ，３Ｃ図（図中の用語サイトは部
位の意）に示された“遺伝子Ｓ”は開始コドン
ATGから始まり、終結コドンTAAを含めて227
個のトリプレツトからなる。対応ポリペプチドの
カルボキシ末端の３個のアミノ酸に対応する３個
のコドンは、終結コドンTAAの直前で同じ解読
枠内に位置している。別の２個の解読枠（夫々、
前記解読枠とはヌクレオチド１個及び２個だけず
れている）の一方も終結コドンを持たないが、前
記ポリペプチド及びとは全く異なる蛋白質を
コードしている。第３の解読枠は10個の終結コド
ンを含む（TAG5個，TGA4個，TAA1個）。
DNAの別のストランド上では、３個の解読枠は
DNA配列に沿つて分布した夫々11，11及び６個
の終結コドンにより閉鎖されている。 すでに前記に於いて示したように、開始コドン
ATGから始まる遺伝情報の完全な翻訳は、分子
量25422ダルトンに相応する226個のアミノ酸から
なる理論的ポリペプチドに至る。 “遺伝子Ｓ”に相応するヌクレオチド配列が通
常は、翻訳過程で完全に読み取られるということ
は興味深い。 前記の“遺伝子Ｓ”型のヌクレオチド鎖であつ
て、約100個までのヌクレオチドを含有し得る補
足的小配列を含むヌクレオチド鎖、又は、逆に相
応する遺伝情報を変更せずにヌクレオチドが除去
され得る（22，23）ヌクレオチド鎖もまた本発明
の１部である。 前記に於いて定義した本発明の種々の断片は、
DNA配列即ちEcoHBV DNAから得ることがで
きる。このときに、相応する制限酵素を使用し、
DNA断片の公知の分画方法を使用する。この分
画方法は特にポリアクリルアミドゲル上で行なわ
れ、DNA断片が自身の分子量の関数たる距離だ
け移動することを利用している。したがつて、例
えば、酵素AvaによりEcoHBV DNAを制限
開裂すると、１個の末端がEcoＲ部位から形成
され別の末端がAva部位から形成された断片を
得ることができる。所望の断片は得られた最小断
片である（EcoHBV DNA中のAva部位は１
個だけである）。 対向する両末端が夫々EcoＲ及びHhaによ
り形成される断片は、EcoHBV DNAを、最初
にEcoＲで加水分解し、次に制限酵素Hhaで
部分加水分解して得られる。このときに、制限生
成物の中からAva部位を含む生成物を回収す
る。 これらの制限方法は例として示しただけであ
り、当業者は勿論、有用な制限末端を持つ断片
を、特にEcoHBV DNAから単離するための制
限酵素による処理順序を決定し得る。 有用である限り、これらの制限操作は10mMト
リス（Tris）緩衝液，PH7.8，MgCl26mM，β―
メルカプトエタノール6mMの中で行なうことが
でき、EcoＲを使用するときは好ましくはこの
媒質が更にNaCl50mMを含有することを指摘し
ておきたい。 すで説明したように、本発明は、デーン粒子又
はその派生粒子が血清中に存在するか否かを診断
し得るプローブとしての前記DNA断片の使用に
係る。これらの粒子はＢ型肝炎に特微的な免疫原
蛋白質をコードし得るDNAを担持している。 本発明のDNAは更にベクターに組込むことが
可能である。このようなベクターは、組込みが同
位相（in phase）で行なわれるならば、細菌その
他の微生物又は真核細胞の中でこのDNAを発現
させ得るベクターである。 Ｂ HBs抗原のヌクレオチド配列を含むベクタ
ー 組換えバクテリオフアージλlacHBs―１の構
築 この構築の種々の段階のレベルに於ける生成物
は第１ａ乃至１ｈ図に示されている。これらの生
成物を１ａ乃至１ｈの符号で示す。 第１ａ図に於いて、“遺伝子Ｓ”といくつかの
制限酵素部位の位置が示されている。 HBV DNAを制限酵素Hhaで処理した後ア
ガロースゲル上の電気泳動及び電気溶離によつて
1084個の塩基対（図ではp.b.と記載）を含有する
DNA断片（1b）、すなわち、“遺伝子Ｓ”の全体
を分離した（第１ｂ図）。こうして得られた断片
をエンドヌクレアーゼS1によつて処理した後、
断片（1b）の末端を、式 で示される“EcoＲリンカー”と指称される
DNA要素で延長して、断片（1c）（第１ｃ図）を
製造した。 得られた断片を、EcoＲ付着端の形成後プラ
スミドpBR322中でクローン化した。 こうして得られ、以後pBRHBsと指称される
プラスミド（第１ｄ図）は、“遺伝子Ｓ”の頭部
の近傍に位置する唯１個の制限部位Xbaを含
む。 EcoＲ及びXbaの酵素混合物で組換えプラ
スミドpBRHBsを消化して、約980塩基対を含み
且つ“遺伝子Ｓ”の大部分を含むDNA断片を作
成した（第１ｅ図）。この断片をアガロースゲル
上の電気泳動によつて分離精製した。得られた断
片をエンドヌクレアーゼS1によつて再び処理し、
次に前記“EcoＲリンカー”を用いてEcoＲ
末端を再び作り、次にエンドヌクレアーゼEcoＲ
によつて処理し、相応する付着端を再形成し
た。ここで、約980塩基対を含む第１ｅ図の断片
をin vitro融合によつてプラスミドpBR322のEco
Ｒ部位に挿入し、プラスミドpXbaHBsを形成
した（第１ｆ図）。このプラスミドをプラスミド
pBR322と同様に常法でクローン化した。 数個のクローンが得られた。 これらのクローンのうちの３個、すなわち
pXbaHBs−１，pXbaHBs−２，pXbaHBs−３
（第１ｇ図）のDNAをEcoＲによつて処理した
後、以下で“HBs断片”（第１ｈ図）と呼ぶ断片
を抽出精製した。 上記断片（通常は“遺伝子Ｓ”の内部）の末端
のヌクレオチド配列を、MAXAM及び
GILBERTによつて記載された方法（Pro.Nat.
Acad.Sci.USA 74，560−564（1977））を用いて
決定した。この結果、“遺伝子Ｓ”に相当する末
端のヌクレオチド配列が３個のクローンで同一で
はないことが示され（第１ｇ図）、この相違は明
らかにエンドヌクレアーゼS1による消化過程中
に生起する変化に依る。 pXbaHBs−１とpXbaHBs−２とから得られ
た２種の断片を、試験管内融合によりバクテリオ
フアージλplac5−１（21）のゲノム中に挿入し
た。このフアージゲノムは、lacZ遺伝子の末端近
傍に位置するEcoＲ部位を１個しか有していな
い。β−ガラクトシダーゼ（23）のアミノ酸配列
から誘導推論されるようなlacZ遺伝子の解読枠か
ら、pXbaHBs−１のHBs断片をλplac5−１の
lacZ遺伝子のEcoＲ部位中に挿入すると「遺伝
子Ｓ」の的確な解読相（reading phase）が維持
されることが観察され、かつ実験によつて確認さ
れる。これに対して、pXbaHBs−２のHBs断片
は、適切な解読枠を維持しながら上述のベクター
中に挿入されるのは不可能であると証明された。
しかしながら前記断片は後の実験に於ける対照
（コントロール）として使用された。 これらの操作は、既知の技術を使用して実施さ
れた。特にpXbaHBs−１，pXbaHBs−２の
「HBs断片」は、リガーゼを使用して、前もつて
EcoＲにより開裂されているλplac5−１の
DNA中に挿入された。次いで、かくして得られ
たDNA断片の混合物を用いてE.coli菌株
C600Rec BC rk-mk-をトランスフエクシヨンし
た。HBs断片がlacZ遺伝子のEcoＲ部位中に挿
入された結果lac-となつたバクテリオフアージの
クローンは、（21）に記載した方法に従つて増殖
及び精製される。 異なるバクテリオフアージのDNAを抽出し、
挿入されたDNA断片の配向（orientation）をそ
れらのBamHI制限断片の電気泳動分析により決
定した。この結果、プラスミドpXbaHBs−１と
pXbaHBs−２とに対応させて名付けた２個のフ
アージλlacHBs−１とλlacHBs−２とが正確に
配向されたHBs断片を含んでいることが決定で
きた。 第２ａ図は、pXbaHBs−１から得られたHBs
−１断片による修飾以前のベクターλplac5−１
の概略図である。 第２ｂ図は、同一ベクターの一部の概略図であ
り、上記HBs−１断片をEcoＲ部位中に挿入す
ることにより遺伝子Ｚ中に導入された修飾（部）
を示す。 第２ｃ図は、第２ｂ図の修飾されたベクターの
発現の結果得られるハイブリツドポリペプチドの
構造を略示する。 この発現は、E.coliの細菌菌株、特にHfr△
lacX74のトランスフエクシヨンによつて達成し
た。 E.coliの菌株、特にE.coliの菌株Hfr△lacX74
を、plac5−１，λlacHBs−１及びλlacHBs−２
によりそれぞれ形質転換した。培養後、細胞を溶
解し、得られた溶解物をSDSポリアクリルアミド
ゲル（24）上で電気泳動により分析し、蛋白質を
クーマシーブルーで染色して検出した。対照とし
てのλplac5−１の発現産物中には、β−ガラク
トシダーゼ（分子量116，248）に相当する位置に
より強度なバンドが存在し、λlacHBs−１の発
現産物中には分子量約135000乃至141000を有する
新規な蛋白質に相当する顕著なバンドが存在する
（λlacHBs−２の発現産物中には存在しない）。 λlacHBs−１及びλplac5−１によつてトラン
スフエクシヨンした細菌が合成する蛋白質を
（35S）メチオニンで標識した。該蛋白質を抗−
HBsAg血清と接触させSDSポリアクリルアミド
ゲルのオートラジオグラムを実施すると、
λlacHBs−１の発現産物中のみに、他のベクタ
ーの発現産物中の等価のバンドに対応しない１個
のバンドの存在が示された。当該バンドは、非標
識HBsAgの存在下で免疫沈降を実施すると特異
的に消滅した。β−ガラクトシダーゼに対する抗
血清を用いて免疫沈降を実施すると、λlacHBs
−１の発現産物中にはやはり同一のバンドが再び
観察された。 lacZ遺伝子とHBs−１断片との間の融合で得
られるハイブリツド蛋白質部分の推定される構造
を第２ｃ図に示す。「β−gal」断片はβ−ガラク
トシダーゼ（アミノ酸1005個）に相当する。
HBsAg断片（アミノ酸192個）も示されている。
これら２個の断片は、ベクターλlacHBs−１中
に含まれる“EcoＲリンカー”の一部に相当す
るアミノ酸であるプロリンにより分離されてい
る。 Ｃ 本発明に従うベクターを使用する免疫原分子
の製造方法 したがつて本発明は、上記のポリペプチドも
しくはより分子量が小さく同等の免疫原特性を
有する蛋白質の製法を提供しうる。 本発明の結果が示すところによれば、E.coliも
しくは細菌或いは真核生物細胞培養物の如き他の
あらゆる好ましい微生物は、λlacHBs−１で感
染させることができ、約138000の分子量を有する
と共に、同時にHBsAgとβ−ガラクトシダーゼ
との抗原決定基を有する蛋白質を合成しうる。当
該蛋白質分子は、本発明方法によつて獲得されう
るハイブリツドポリペプチドの代表例であり、こ
れらのハイブリツドポリペプチドに於いて、
HBsAgは（β−ガラクトシダーゼ断片の部分的
もしくは全体的置換の結果として）支持蛋白質と
結合しているにもかかわらず、これらのハイブリ
ツドはHBsAgの抗原特性を有する。これらの新
規分子は、Ｂ型肝炎ウイルスに対して活性なワク
チンを製造するために有益である。 自明のこととして、また上述の事実から既に明
らかなように、本発明は、特に考察された適用方
法及び実施方法に何ら限定されず、逆にあらゆる
変形に及んでいる。 以上の記載に加えて、特に発明に関して引用し
た参考文献を以下に示す。 参考文献 １―Blumberg，B.S.（1977）Science 197，17―
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鎖DNA断片で構成されたインサートが挿入・融
合されているベクターであつて、 (a) 前記インサートの各ストランドが、式： 【表】 【表】 【表】 で表わされるヌクレオチド配列を有する大きいス
トランドまたはこの大きいストランドの一部から
成り、 (b) 前記大きいストランドが、式： 【表】 で表わされるポリペプチドをコードしているポリ
ヌクレオチドを含有しており、 (c) 前記大きいストランドの前記一部が、少なく
ともアラニン―グルタミン―グリシン―トレオ
ニン―セリンというペンタペプチドをコードし
ているポリヌクレオチドを含有しており、 (d) 前記インサートが、HBs抗原の免疫学的特
性を有するポリペプチドをコードしているヌク
レオチド配列を含有しており、 (e) 前記ポリペプチドをコードしている前記ヌク
レオチド配列が、前記ベクター内で解読相にあ
ることを特徴とする前記ベクター。 ２ 前記インサートがポリヌクレオチド配列： を含有することを特徴とする請求の範囲第１項に
記載のベクター。 ３ 前記大きいストランドが、式： 【表】 【表】 で表わされるポリヌクレオチドを含有することを
特徴とする請求の範囲第１項に記載のベクター。 ４ 前記インサートがその一端にHinｃ，Hha
，AvaまたはEcoＲ制限部位を、他端に
Ava，HinｃまたはHha制限部位を有する
ことを特徴とする請求の範囲第１項に記載のベク
ター。 ５ 前記インサートの各ストランドがそれぞれ最
大で1100ヌクレオチドのサイズを有することを特
徴とする請求の範囲第１項に記載のベクター。 ６ 前記インサートのストランドが、式： 【表】 【表】 で表わされるヌクレオチド配列を含有することを
特徴とする請求の範囲第１項に記載のベクター。 ７ 前記インサートの各ストランドがそれぞれ最
大で1000ヌクレオチドのサイズを有することを特
徴とする請求の範囲第１項に記載のベクター。 ８ 前記インサートのストランドが、式： 【表】 【表】 で表わされるヌクレオチド配列を含有することを
特徴とする請求の範囲第５項に記載のベクター。 ９ 前記インサートのストランドが、式： 【表】 で表わされる蛋白質をコードしているポリヌクレ
オチドから成ることを特徴とする請求の範囲第１
項に記載のベクター。 １０ 前記インサートがＳ―遺伝子を含有するこ
とを特徴とする請求の範囲第９項に記載のベクタ
ー。 １１ 前記インサートがＳ―遺伝子から成ること
を特徴とする請求の範囲第１項に記載のベクタ
ー。 １２ 前記インサートが、式： 【表】 で表わされるポリヌクレオチド配列を有すること
を特徴とする請求の範囲第１０項に記載のベクタ
ー。 １３ 前記インサートが、式： 【表】 で表わされるポリヌクレオチドから成ることを特
徴とする請求の範囲第１項に記載のベクター。 １４ 前記インサートが、式： 【表】 【表】 で表わされるポリペプチドをコードしているヌク
レオチド配列を含有することを特徴とする請求の
範囲第１項に記載のベクター。 １５ 前記インサートが、式： 【表】 【表】 で表わされるポリヌクレオチドから成ることを特
徴とする請求の範囲第１４項に記載のベクター。 １６ インサートがデーン粒子のゲノムの断片か
ら成り、この断片が、次のデーン粒子の概略図に
示した前記ゲノムのEcoＲ制限部位からの位置
73.6と95.1の間に位置することを特徴とする請求
の範囲第１項に記載のベクター。 １７ 前記インサートが、アラニン―グルタミン
―グリシン―トレオニン―セリン（ただしアラニ
ンがＮ―末端で、セリンがＣ―末端である）、ト
レオニン―アラニン―グルタミン―グリシン―ト
レオニン―セリン（ただしトレオニンがＮ―末端
で、セリンがＣ―末端である）、およびトレオニ
ン―トレオニン―アラニン―グルタミン―グリシ
ン―トレオニン―セリン（ただしトレオニンがＮ
―末端で、セリンがＣ―末端である）で構成され
るグループの中から選択されるペプチド配列をコ
ードしていることを特徴とする請求の範囲第１項
に記載のベクター。 １８ 前記インサートが、 および で構成されるグループの中から選択されることを
特徴とする請求の範囲第１７項に記載のベクタ
ー。 １９ プラスミドであることを特徴とする請求の
範囲第１項〜第１８項のいずれかに記載のベクタ
ー。 ２０ フアージであることを特徴とする請求の範
囲第１項〜第１８項のいずれかに記載のベクタ
ー。 ２１ ラクトースオペロンの一部分を含んでお
り、この部分がプロモーターおよび前記オペロン
のＺ遺伝子の少なくとも一部を含み、かつ、イン
サートがＺ遺伝子の前記一部と融合していること
を特徴とする請求の範囲第１項に記載のベクタ
ー。 ２２ インサートがＺ遺伝子中のEcoＲ部位に
融合していることを特徴とする請求の範囲第２１
項に記載のベクター。 ２３ 前記インサートがβ―ガラクトシダーゼの
主要部によつて構成されるポリペプチド配列をコ
ードしている別のDNA断片に連続して繋がつて
おり、ただし、このβ―ガラクトシダーゼは前記
インサートがコードしているポリペプチド配列に
対して非免疫原性の担体であることを特徴とする
請求の範囲第２１項に記載のベクター。 ２４ 前記インサートに加えて、(a)非免疫原性で
ある担体分子、または(b)前記インサートがコード
しているポリペプチドの免疫学的特性に干渉しな
い免疫学的特性を有する担体分子をコードしてい
るDNA断片も含んでいることを特徴とする請求
の範囲第２３項に記載のベクター。 ２５ 前記インサートが、Ｓ―遺伝子の内、この
遺伝子のXba部位から解読方向に延びる部分を
含んでいることを特徴とする請求の範囲第２１項
に記載のベクター。 ２６ プラスミドであつて、このプラスミドが、
(a)遺伝子Ｓの内、HBs抗原の免疫学的特性を有
するポリペプチドをコードしている部分と、(b)
pBR322との組換え体であることを特徴とする請
求の範囲第１９項に記載のベクター。 明細書 本発明は、Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原に対応す
る免疫原性ペプチド配列をコードしうるヌクレオ
チド配列を含む核酸、及び得られたポリペプチド
とペプチドに関係する。 本発明はまたこのような核酸を得ることを可能
にする方法にも関する。 Ｂ型肝炎は特に熱帯アフリカ、東南アジア及び
極東において多発するウイルス性疾患である。 病因はウイルス（HBV）すなわちデーン粒子
であつて、エンベロープ（オーストラリア抗原す
なわちHBs抗原）、キヤプシド（HBc抗原）、内
因性のDNAポリメラーゼ、及び部分的に一本鎖
の環状DNA分子からなり、このDNA分子の最長
のストランドは約3200個のヌクレオチドを有する
（Summers J.O′Connell A.and Millman I.
（1975）Proc.Nat.Acad.Sci.USA 72，4567―
4597）。 内因性のDNAポリメラーゼは、試験管内
（invitro）で短い方のストランドを修復するため
に使用することができる（T.A.Landers，H.B.
Greenbert and J.S.Robinson，J.Virol.，23，
1977，p.368―376）。 エンベロープ蛋白質の電気泳動分析によつて２
乃至７個のポリペプチドの存在が示されており、
そのうち主要なものはポリペプチド及びポリペ
プチドと呼ばれている（Peterson D.L.，
Roberts I.M.and Vyas G.N.（1977）Proc.Nat.
Acad.Sci.，USA，74，1530―1534，及び
Peterson D.L.，Chien D.Y.，Vyas，G.N.，
Nitechki D.and Bond H.（1978）In Viral
Hepatitis，ed.G.Vyas，S.Cohen and R.
Schmid，The Franklin Institute Press，
Philadelphia，569―573）。 ポリペプチドは分子量が22000乃至26000ダル
トンであり、ポリペプチドはグリコシル化され
ており分子量は28000乃至30000ダルトンである。
これら二種のポリペプチドのアミノ酸組成は非常
に類似しており、（Ｎ―末端から）最初の15個の
アミノ酸及び最後の３個のアミノ酸はそれぞれ同
一である。従つてポリペプチドはグリコシル化
されている点でのみポリペプチドと異なるとい
う仮説が立てられた。 このウイルスの研究は、その増殖を可能にする
細胞培養系がないという点において非常に困難で
ある。この困難は部分的には、特に血清型aywに
関してはすでにゆるめられている。このウイルス
のDNA全体（ゲノム）は、Fritsch A.，Pourcel
C.，Charnay P.and Tiollais P.（1978）C.R.
Acad.de Paris，287，1453−1456に記載の技術
によつて、特にλgt.WES.λBベクターの唯一の
EcoＲ部位に予め挿入した後E.coli中で同定さ
れ、クローン化されている。 今日までのところポリペプチド及び自体の
配列決定、並びにこれらのペプチドをコードして
いる配列のウイルスDNA中の位置決定は実現さ
れていない。 本発明の目的は、免疫特性を有するペプチド配
列をコードするように適合された配列を含有し、
ウイルスDNA自体よりもはるかに小さいDNA配
列を得ることであり、前記ペプチド配列が生体宿
主の体内に入ると、特に毒性（ビルレント）状態
にあるＢ型肝炎ウイルスに対して以後この宿主を
保護しうる抗体がこの宿主によつて産生される。 本発明は、デーン粒子のゲノムの完全なヌクレ
オチド分析（本発明者等が達成した）に基づくも
のであるがそれだけではなく、前記ポリペプチド
をコードしている遺伝子（以後“Ｓ遺伝子”とい
う）を同定するために本発明者等が持つていたア
イデアにも基づくものであり、このアイデアによ
つて、上のようにあらかじめ決定されたデーン粒
子ゲノムの完全なヌクレオチド構造中で、前記の
ポリペプチドの公知の基部（proximal）及び末
端のペプチド配列をコードし得るヌクレオチド配
列の構造を探求する。 Peterson等により、特に上で引用した文献中
で、15個の最初のアミノ酸からなる基部配列（Ｎ
―末端の最初のアミノ酸）が原則的にmet glu
asnile thr ser gly phe leu leu gly pro leu
valserであり、同じポリペプチドの末端配列（Ｃ
末端の最後のアミノ酸）がval tyr ileであると報
告されていることを想起されたい。 第１図はデーン粒子のゲノムの概略図である。
デーン粒子は二本のストランドb1及びb2を有し、
これらの短い方b2は通常図の点線で表わされた部
分を欠いている。 このDNAはEcoＲ部位を１個しかもたない
ことが知られている。 矢印f1は長い方のストランドb1を構成するヌク
レオチドの番号付の方向であり、矢印f2は遺伝子
Ｓの発現に関するウイルスのDNAの転写の方向、
特にＢ型肝炎ウイルスに侵された細胞のメカニズ
ムによる転写方向である。 EcoＲ部位は番号０を付け得、または血清型
aywに属するＢ型肝炎ウイルスのEcoＲ部位に
対してもつと正確に決定されているように3182と
番号付け得る。 内部にある実線の円ｅはDNAの全長に対する
目盛を％で示すスケールであり、DNAの諸部の
位置を明確に表わすことができる。 第１図の下部にある数3′，5′及び5′，3′は核酸
鎖の末端の慣用的表現で、鎖末端を示している。 本発明によつて、“遺伝子Ｓ”は本質的に第１
図の説明図の位置73.6と95.1の間にある長い方の
ストランドb1の断片を構成していることが示され
た。図中“スタート”及び“ストツプ”は“遺伝
子Ｓ”の転写の開始及び終結点を表わす。 第２Ａ，２Ｂ，２Ｃ図は前記ゲノムの末端部を
表わし、特に位置60.4から100（DNAの全長に対
する％）までを示す。第２図中の各文字は従来通
りDNAの４種の基本ヌクレオチドすなわち Ａ：アデニン Ｇ：グアニン Ｔ：チミン Ｃ：シトシン の一つに対応する。 第２Ａ，２Ｂ，２Ｃ図中の１対の配列の下側の
配列はヌクレオチド鎖b2に対応する核酸を示す。 第２Ａ，２Ｂ，２Ｃ図の表わす詳細な地図を製
作するために用いられる分析技術を想起されるべ
く以下に簡単に記述しよう。 本発明の範囲内で提案されている如き“遺伝子
Ｓ”のヌクレオチド（その基部側末端ｐ“Ｓ”及
び末端側末端ｔ“Ｓ”が第２Ａ，２Ｂ，２Ｃ図中
に示されている）の特定決定は次の観察の結果で
ある。すなわち ― EcoＲ末端から第3030番のヌクレオチドか
ら（f2の解読方向で）最初の14個のトリプレツ
トはそれぞれ前記ポリペプチドの最初の15個の
アミノ酸からなる基部配列の最初の14個のアミ
ノ酸をコードし得る。 ― 転写される鎖b1に対して相補的な鎖b2上で読
取られる最後の４個のトリプレツトGTA
TAC ATT TAAがそれぞれ前記ポリペプチ
ドの３個の末端アミノ酸及び終結コドンに対応
する。 ― このヌクレオチド配列（678個のヌクレオチ
ド）は、少なくとも、細胞のメカニズムによつ
てDNA上で“読み取られる”最初のトリプレ
ツトがAUG（ATGと相補的なストランドに対
応する）となるような解読枠（reading
frame）を採用した場合には、終結コドンを全
く含まない。 ― 開始コドンATGで始まる遺伝情報を完全に
翻訳すると、分子量25422ダルトンを有するア
ミノ酸226個の理論上のポリペプチドが得られ
ることになる。 “遺伝子Ｓ”のヌクレオチド構造並びに“遺伝
子Ｓ”の翻訳の結果得られるポリペプチド鎖を第
３Ａ，３Ｂ，３Ｃ図に示す。 上記の値はすでに報告されているポリアクリル
アミドゲル上でのポリペプチドの電気泳動で得
られた分析データとよく一致する（本明細書末尾
に挙げた参考文献一覧表中の文献番号９−12）。 ポリペプチドの基部ペプチド配列の15番目の
アミノ酸のレベルで観察される相違すなわち上記
文献の著者諸氏によるセリンではなく、前述の第
２Ａ，２Ｂ，２Ｃ図及び第３Ａ，３Ｂ，３Ｃ図で
はロイシンとなつていることは、これらの著者が
用いた変異体が本発明で用いた変異体とは異なる
遺伝子変異体であつたためと思われる。この相違
はまた、セリンに翻訳され得るトリプレツトの一
つ“TCA”の代りに第２Ａ，２Ｂ，２Ｃ図及び
第３Ａ，３Ｂ，３Ｃ図に示した特定の“遺伝子
Ｓ”中ではトリプレツト“TTA”となつている
ように、ヌクレオチド１個の置換に起因し得るこ
とに注目されたい。 従つて本発明は特にデーン粒子のDNAから切
り出され得る核酸の断片に関係し、これらの断片
は特にＢ型肝炎ウイルスの免疫学的特性を生じる
原因であるウイルスのエンベロープの蛋白質の一
部分をコードし得る“遺伝子Ｓ”の一部分を含む
ことを特徴とする。 従つて本発明は、多くとも1000−1100個程度の
ヌクレオチドからなる核酸に関係し、特にこの核
酸が免疫原性ペプチド配列をコードするように適
合されていることと、このペプチド配列自体がＢ
型肝炎ウイルスに対して活性な抗体の生体内
（invivo）生成を誘発するように適合されている
ことと、このペプチド配列が本質的に第３Ａ，３
Ｂ，３Ｃ図に示した構造または同等な免疫原特性
を有する任意のペプチド配列を含むこととを特徴
とする。 本発明はまた、微生物中または真核生物細胞中
で前記ヌクレオチド配列を発現させるためのベク
ターに係り、この際遺伝子融合は“遺伝子Ｓ”の
解読相（reading phase，読み取り枠）を保つて
行われる。 本発明によつて用いられるヌクレオチド配列は
互いにその発現の際にＢ型肝炎ウイルスのサブタ
イプ（群ａのサブタイプｄ，ｗ，ｙ，ｒ）によつ
て変化する決定基の形成に導く変異を有する。 第３Ａ，３Ｂ，３Ｃ図に表わされたペプチド配
列の一つでは、前記配列の第一アミノ酸すなわち
メチオニンがＮ―末端であり、反対の端のアミノ
酸すなわちイソロイシンがＣ末端である。 本発明はまた特に第５図に示した如きペプチド
配列をコードしている第４Ａ，４Ｂ図に表わされ
たヌクレオチド配列または同等な免疫原特性をも
つ類似の任意のペプチド配列に関する。 上述の“同等なペプチド配列”という用語は、
言うまでもなく、第３Ａ，３Ｂ，３Ｃ図及び第５
図に表わされたペプチド配列中の対応する部分と
厳密に同一ではないいくつかの部分の存在する全
ペプチド配列を意味するのであつて、これらの変
化は蛋白質の一般的免疫原形質に影響しない局部
的突然変異に起因し、または問題の種類の蛋白質
が見い出され得る種々の血清型（特に血清型
adw，adr及びayr）に応じた構造上の修飾
（modification）を伴う。 本発明は特に第６図に表わされる如きペプチド
配列または同等な免疫原特性をもつ類似の任意の
ペプチド配列を含有するヌクレオチド配列に関す
る。 本発明は特にまた次のペプチド配列に関する。
すなわち、 アラニン―グルタミン―グリシン―トレオニン
―セリン、 トレオニン―アラニン―グルタミン―グリシン
―トレオニン―セリン、 トレオニン―トレオニン―アラニン―グルタミ
ン―グリシン―トレオニン―セリン。 上に示した第一のペプチド中、アラニン末端が
Ｎ―末端であり、セリン末端がＣ―末端である。 上記の第二と第三のペプチドではトレオニンが
Ｎ―末端でセリンがＣ―末端である。 例として特にＣ―末端のセリンから始まるペン
タペプチドを製造することが可能であり、その場
合、Tetrahedron Letters，1975，No.14，1219−
1222頁に記載のカストロ（Castro）法によつて
Ｃ―末端セリンに、トレニオンを連結する。次
に、Beierman，Chemistry and Biology of
Peptides，Ed.J.Meienhofer，Ann.Arbour
Science Publ.，Ann.Arb.Mich.341（1972）に記
載の所謂反復混合無水物法（レマ（rema）法）
によつて、グリシン，グルタミン，アラニンのア
ミノ酸を付加する。 本発明はまた、大きめの担体分子、特にポリペ
プチドまたは蛋白質の形態の担体分子へ前記ペン
タペプチドを固定した結果得られる生成物、特に
薬剤上許容し得るベヒクルと共に固定生成物中の
ペンタペプチドを含有する組成物、とりわけＢ型
肝炎に対するワクチンに係る。これらの薬剤ベヒ
クルは従来、特に経口、非経口、経直腸及び粘膜
特に鼻粘膜への噴霧から選ばれた投与法に適して
いる。 ヘキサペプチド及び７個のアミノ酸を有するポ
リペプチドは古典的なペプチド合成法によつて製
造することができる。 これらのペプチドは、本発明によると上記で考
察したサイズの大きいポリペプチドの抗原部位で
あると思われ、ウイルスエンベロープのワクチン
化能の主因である（Journal of Biol.
Stand.1976，４，295−304，RAO及びVYAS
“Biochemical Characterization of Hepatitis
Ｂ Surface Antigen in Relation to Serologic
Activity”。 本発明はまたこのようなペンタペプチド，ヘキ
サペプチド，及び７個のアミノ酸を有するポリペ
プチドの産生をコードし得るDNA断片にも関す
る。すなわち、 ― ペンタペプチド配列については、特に式 のポリヌクレオチド、 ― ヘキサペプチドについては、特に式 のポリヌクレオチド、 ― ７個のアミノ酸を有するポリペプチドについ
ては、式 のポリヌクレオチド、 または前記三つの場合の各々において、先の３
個のそれぞれのポリヌクレオチドに関する相補的
ポリヌクレオチド、またはその中の各トリプレツ
トが同じアミノ酸の産生をコードし得る類似の任
意のトリプレツトによつて置換されているすべて
のポリヌクレオチドである。 本発明による核酸はまた、第４Ａ，４Ｂ図に表
わされる如きDNA配列の相互に相補的な二本の
ストランドの少なくとも一本を含むことを特徴と
し得る（第４Ａ，４Ｂ図は、この図には示してな
い位置EcoＲに対して番号付けした、一連の10
個ずつのヌクレオチドの断片の各々の第一のヌク
レオチドの位置に対応する番号も表わし、これら
の番号は問題の種類のヌクレオチド配列の特性決
定の観点からは考慮する必要がないことは言うま
でもない）。このDNA断片の両端はHinＣ部位
になつている。 このヌクレオチド配列は、翻訳すると第５図に
示されたペプチド配列が得られる遺伝情報に対応
する。 本発明は勿論一重ストランド（特にこのストラ
ンドは、第４Ａ，４Ｂ図の下側の配列の構造を有
する）または二重ストランドを有する同等なヌク
レオチド配列、または対応する二重ストランド
DNA、または対応するメツセンジヤーRNA、特
に第４Ａ，４Ｂ図（矢印f2の向き）の下側の配列
によつて構成されるヌクレオチドの相補鎖によつ
て表わされるヌクレオチド配列に関する。 同様に、前出のヌクレオチド鎖とはいくつかの
トリプレツト又はトリプレツトの小配列が異なる
が、Ｂ型肝炎ウイルスの特徴的免疫原活性を保有
するポリペプチドをコードするように適合されて
いるヌクレオチド鎖も本発明の範囲に含まれる。
一般に、これらは、対応する単一ストランドの核
酸が生成するように二重ストランドのDNAを変
性した後で、その長さの少なくとも約90％に亘つ
て、第４Ａ，４Ｂ図のDNAストランドの１個と
ハイブリダイズし得るヌクレオチド鎖を意味す
る。 更に本発明の好ましい核酸として、肝炎ウイル
スのDNAから切り出すことが可能であり、且つ
二重ストランドになつているときに１端がHinｃ
，Hha，Ava又はEcoＲ末端で他端が
Ava，Hinｃ又はHha末端であることを特
徴とする核酸を挙げることができる。 EcoＲ部位に対するこれらの種々の末端の位
置を第２Ａ，２Ｂ，２Ｃ図に概略的に示した。 本発明の核酸は、特に生体宿主の体内でＢ型肝
炎のウイルスに対して活性のある抗体の産生を誘
導し得る蛋白質又はペプチドを生産するために、
細菌及び真核細胞中で発現し得るベクターに組込
まれるべく構成されている。本発明のヌクレオチ
ド配列の翻訳により得られる蛋白質又はペプチド
は、ワクチン又は診断用薬剤として使用され得
る。 本発明の核酸は更に、血液サンプル又はテスト
血清サンプルの中にデーン粒子、HBs抗原又は
該抗原の断片等が存在するか否かを（従来の
DNA―DNAハイブリダイゼーシヨン技術を用い
て）追跡するためのプローブとして使用され得
る。 本発明の別の特徴は、本発明のDNA断片の分
析、同定及び産生技術に関する下記の簡単な記載
により明らかになるであろう。当然図面を参照さ
れるであろうが、図中の記号に関しては前記に於
いてすでに説明した。括弧内の数字は本明細書末
尾の参考文献の番号に対応する。 本発明はまた、前記のヌクレオチド配列を特に
ハイブリツド蛋白質の形状で発現し得るベクター
に係る。該ハイブリツド蛋白質に於いてHBsAg
の免疫学的特性を有する蛋白質断片は、この蛋白
質を導入した宿主生体中でウイルス感染に対する
保護抗体の産生を誘導し得る免疫原性すなわち免
疫反応性をこのハイブリツド全体に付与する担体
分子に付加されている。 特に本発明は、ラクトースオペロンの少なくと
も１部特に該オペロンのプロモーター及びＺ遺伝
子を含むベクターすなわちフアージ又はプラスミ
ドに係る。このベクターの特徴は、本発明の
DNA断片の任意の１個特に“遺伝子Ｓ”の最大
部分を含むDNA断片の任意の１個が、EcoＲ
部位の如きＺ遺伝子の適当な部位に位相を合わせ
て（in phase）挿入されるように修飾されている
ことである。本発明は更に、これらの修飾された
ベクターのうちで、β―ガラクトシダーゼの最大
部分をコードしているDNA断片の少なくとも１
部が、免疫原性でない任意の別の担体分子、又
は、たとえ免疫学的特性が存在しているとしても
HBsAgの免疫学的特性を持つペプチド部分の免
疫学的特性例えば本質的にHha部位から解読方
向に伸びるペプチド部分の免疫学的特性を妨害し
ない担体分子をコードするように適合された
DNA断片によつて置換されているベクターに係
る。 更に、本発明はより詳細には、HBsAgの特定
の免疫学的特性を有するポリペプチド配列を含ん
でおり、該配列が、担体蛋白質の機能を果すβ―
ガラクトシダーゼの大部分から成るポリペプチド
配列と連続して結合していることを特徴とするハ
イブリツド蛋白質に係る。 本発明の範囲は単に、遺伝子工学の方法で構築
され且つHBsAg抗原の特徴たる免疫原性及び免
疫反応性を備えた蛋白質のモデルの構成を主機能
とする特別なハイブリツド分子に及ぶのみでな
く、β―ガラクトシダーゼの全部又は１部が非免
疫原性の任意の別の担体分子又は例え免疫学的特
性が存在していてもこれらの免疫特性がHBsAg
の免疫学的特性を有するペプチド配列部分の免疫
学的特性を妨害しない任意の別の担体分子によつ
て置換されている任意の別のハイブリツド蛋白質
にも及ぶ。 本発明の別の特徴は、添付図面に基づいてなさ
れる好ましい実施例の記載により一層明らかにな
るであろう。 ― 第１ａ図乃至第１ｈ図は、HBV DNA断片
を組込んだプラスミド型のベクターの製造工程
を概略的に示す。 ― 第２ａ図乃至第２ｃ図は、使用したベクター
の最初の構造（第２ａ図）と、得られた修飾ベ
クターの最終構造（第２ｂ図）と、この修飾ベ
クターがE.coli中で発現した結果得られたハイ
ブリツド蛋白質の構造（第２ｃ図）とを示す。 Ａ ヌクレオチド配列 使用した原材料及び方法 ― 使用酵素及び化学品 使用制限酵素：BamＨ，Hha，Hinｃ，
Hae，Xba，Mbo，Hinｆ，Hpa，
XhoはBIOLABSにより製造された酵素であ
る。BOEHRINGERのDNA―ポリメラーゼを
使用した。細菌性アルカリホスフアターゼとポリ
ヌクレオチド―キナーゼはP.L.
BIOCHEMICALSにより供給された。下記の化
学薬品を使用した。 ● 硫酸ジメチル（ALDRICH）， ● ヒドラジン（EASTMAN KODAK）， ● アクリルアミド及びビス―アクリルアミド
（２回結晶化―SERVA）， ● ジデオキシヌクレオチドトリホスフエート及
びデオキシヌクレオチドトリホスフエート（P.
L.BIOCHEMICALS）， ● 減圧下で再蒸留したピペリジン（MERCK）。 ― DNA HBVの調製 λgt.WES.λBベクター（14）の唯１つの制限部
位EcoＲを使用してE.coli中で全HBVゲノム
（ayw亜型）をクローン化した。クローン化した
DNAを以後“Eco HBV DNA”と指称する。 組換えバクテリオフアージをペトリ皿の寒天上
で増殖させ、それ自体公知の方法で所望のDNA
を抽出した。EcoＲ制限酵素によるDNAの消
化後、参考文献（16，17）に記載の方法でスクロ
ース濃度勾配超遠心によりEco HBV DNA配列
を精製した。 ― 5′32Pで標識されたDNA断片の調製 製造業者が勤める条件を用い種々の制限酵素に
よつてEco HBV DNA10乃至20ピコモルを完全
に加水分解した。このDNA断片をアルカリ性ホ
スフアーゼによつて脱リン酸化し、次に該ホスフ
アターゼをアルカリ処理によつて不活性化した。
次に論文（18）に記載の方法によりDNAをエタ
ノールで沈澱させた。スペルミジンをベースにし
た緩衝液に再溶解後、（論文（19）に記載の方法
により）ATP｛λ32P｝（NEW ENGLAND
NUCLEARにより製造された3000Ci／mM）と
ポリヌクレオチド―キナーゼによつて5′末端で
DNAを標識した。 このDNA制限断片をポリアクリルアミドゲル
電気泳動により分離し次に溶離した。別の酵素に
よる制限後のそれ自体公知の方法によるポリアク
リルアミドゲル電気泳動、又は問題の種類の
DNA断片の変性によつて、標識された末端を分
離（segregation）した。 ― DNAのヌクレオチド配列の構造の決定 二重ストランド（二本鎖）又は単一ストランド
（一本鎖）のDNA断片の一次構造は、主として
MAXAM及びGILBERTによつて記載された方
法（19）により決定された。更に、5′末端の１個
で標識された二重ストランドの断片に関しては
SANGER等（20）により記載され、MAAT及び
SMITH（21）により応用された末端鎖阻害法
（the method of terminal chain inhibiters）を
使用した。 化学反応及び酵素反応の生成物の分析は、厚み
１mmで８，16又は25％のアクリルアミドゲル内で
順次電気泳動して行なわれた。 分析の方法及び結果 HBVゲノムがポリペプチド及びをコード
し得るか否かを決定するために、Hae断片全部
（HBVゲノムのHae制限部位は第１図に小さい
矢印で示した）を5′末端で標識した。それらの一
次構造のかなりの部分はMAXAM及び
GILBERTの方法により決定した。ポリペプチド
及びの基部及び末端のアミノ酸配列をコード
し得るヌクレオチド配列は、参考文献（17）に記
載の方法によつて既にHBVゲノムの制限地図上
で位置が決定されているHae断片Ｅ及びHae
断片Ｆに局在していた。すでに記載の理由によ
り、EcoＲ制限部位に対して73.6から95.1まで
の位置（第１図）を占める“遺伝子Ｓ”の末端に
存在すると考えられるのはこれらのヌクレオチド
配列である。 これらの両位置間のヌクレオチド配列を、公知
の化学的方法、特に硫酸ジメチル／ヒドラジンに
よる化学的分解方法及びチエインターミネーシヨ
ン法により分析した。MAXAM及びGILBERT
により提案された種々の化学反応のうちで、蟻酸
による部分的変性（depurination）とピペリジン
による開裂とを使用した。これらの方法は、グア
ニン及びアデニンを末端にもつ断片に対しオート
ラジオグラムで等しい強度のバンドを与える。ま
た、シトシン及びチミジンヌクレオチドに対して
等しい強度のバンドを得るために、ヒドラジンに
よる反応とそれに続くピペリジンによる開裂を使
用した。これらの２種の反応の生成物の電気泳動
分画を行なうと、すべての塩基に対し、使用ゲル
カラムの１方又は他方にスポツトが生じる。この
方法によれば、ゲルのオートラジオグラムの解読
が容易である。シトシンに対して特異的な塩化ナ
トリウムの存在中でヒドラジンによる反応を行な
うこのヌクレオチドをチミジンから区別し得る。
硫酸ジメチルによる反応後グアニンに対して特異
的なピペリジンによる開裂を行なうと、グアニン
ヌクレオチドをアデニンから区別し得る。 可能な最高精度を確保するために、互いにまた
がつて重なる種々の断片を形成する別々のヌクレ
オチド配列を、下記の種々の制限酵素によるEco
HBVDNAの加水分解によつて製造した。Bam
Ｈ，Hinｆ，Hpa，Hae及びHinｃ。 このようにして、第１試験断片の出発点として
用いた制限部位の夫々の分析結果は、別の断片
（これらの別の断片に於いては第１断片の制限部
位がこの別の断片の新しい末端と末端の間に存在
している）の分析により確認された。 第３Ａ，３Ｂ，３Ｃ図（図中の用語サイトは部
位の意）に示された“遺伝子Ｓ”は開始コドン
ATGから始まり、終結コドンTAAを含めて227
個のトリプレツトからなる。対応ポリペプチドの
カルボキシ末端の３個のアミノ酸に対応する３個
のコドンは、終結コドンTAAの直前で同じ解読
枠内に位置している。別の２個の解読枠（夫々、
前記解読枠とはヌクレオチド１個及び２個だけず
れている）の一方も終結コドンを持たないが、前
記ポリペプチド及びとは全く異なる蛋白質を
コードしている。第３の解読枠は10個の終結コド
ンを含む（TAG5個，TGA4個，TAA1個）。
DNAの別のストランド上では、３個の解読枠は
DNA配列に沿つて分布した夫々11，11及び６個
の終結コドンにより閉鎖されている。 すでに前記に於いて示したように、開始コドン
ATGから始まる遺伝情報の完全な翻訳は、分子
量25422ダルトンに相応する226個のアミノ酸から
なる理論的ポリペプチドに至る。 “遺伝子Ｓ”に相応するヌクレオチド配列が通
常は、翻訳過程で完全に読み取られるということ
は興味深い。 前記の“遺伝子Ｓ”型のヌクレオチド鎖であつ
て、約100個までのヌクレオチドを含有し得る補
足的小配列を含むヌクレオチド鎖、又は、逆に相
応する遺伝情報を変更せずにヌクレオチドが除去
され得る（22，23）ヌクレオチド鎖もまた本発明
の１部である。 前記に於いて定義した本発明の種々の断片は、
DNA配列即ちEcoHBV DNAから得ることがで
きる。このときに、相応する制限酵素を使用し、
DNA断片の公知の分画方法を使用する。この分
画方法は特にポリアクリルアミドゲル上で行なわ
れ、DNA断片が自身の分子量の関数たる距離だ
け移動することを利用している。したがつて、例
えば、酵素AvaによりEcoHBV DNAを制限
開裂すると、１個の末端がEcoＲ部位から形成
され別の末端がAva部位から形成された断片を
得ることができる。所望の断片は得られた最小断
片である（EcoHBV DNA中のAva部位は１
個だけである）。 対向する両末端が夫々EcoＲ及びHhaによ
り形成される断片は、EcoHBV DNAを、最初
にEcoＲで加水分解し、次に制限酵素Hhaで
部分加水分解して得られる。このときに、制限生
成物の中からAva部位を含む生成物を回収す
る。 これらの制限方法は例として示しただけであ
り、当業者は勿論、有用な制限末端を持つ断片
を、特にEcoHBV DNAから単離するための制
限酵素による処理順序を決定し得る。 有用である限り、これらの制限操作は10mMト
リス（Tris）緩衝液，PH7.8，MgCl26mM，β―
メルカプトエタノール6mMの中で行なうことが
でき、EcoＲを使用するときは好ましくはこの
媒質が更にNaCl50mMを含有することを指摘し
ておきたい。 すで説明したように、本発明は、デーン粒子又
はその派生粒子が血清中に存在するか否かを診断
し得るプローブとしての前記DNA断片の使用に
係る。これらの粒子はＢ型肝炎に特微的な免疫原
蛋白質をコードし得るDNAを担持している。 本発明のDNAは更にベクターに組込むことが
可能である。このようなベクターは、組込みが同
位相（in phase）で行なわれるならば、細菌その
他の微生物又は真核細胞の中でこのDNAを発現
させ得るベクターである。 Ｂ HBs抗原のヌクレオチド配列を含むベクタ
ー 組換えバクテリオフアージλlacHBs―１の構
築 この構築の種々の段階のレベルに於ける生成物
は第１ａ乃至１ｈ図に示されている。これらの生
成物を１ａ乃至１ｈの符号で示す。 第１ａ図に於いて、“遺伝子Ｓ”といくつかの
制限酵素部位の位置が示されている。 HBV DNAを制限酵素Hhaで処理した後ア
ガロースゲル上の電気泳動及び電気溶離によつて
1084個の塩基対（図ではp.b.と記載）を含有する
DNA断片（1b）、すなわち、“遺伝子Ｓ”の全体
を分離した（第１ｂ図）。こうして得られた断片
をエンドヌクレアーゼS1によつて処理した後、
断片（1b）の末端を、式 で示される“EcoＲリンカー”と指称される
DNA要素で延長して、断片（1c）（第１ｃ図）を
製造した。 得られた断片を、EcoＲ付着端の形成後プラ
スミドpBR322中でクローン化した。 こうして得られ、以後pBRHBsと指称される
プラスミド（第１ｄ図）は、“遺伝子Ｓ”の頭部
の近傍に位置する唯１個の制限部位Xbaを含
む。 EcoＲ及びXbaの酵素混合物で組換えプラ
スミドpBRHBsを消化して、約980塩基対を含み
且つ“遺伝子Ｓ”の大部分を含むDNA断片を作
成した（第１ｅ図）。この断片をアガロースゲル
上の電気泳動によつて分離精製した。得られた断
片をエンドヌクレアーゼS1によつて再び処理し、
次に前記“EcoＲリンカー”を用いてEcoＲ
末端を再び作り、次にエンドヌクレアーゼEcoＲ
によつて処理し、相応する付着端を再形成し
た。ここで、約980塩基対を含む第１ｅ図の断片
をin vitro融合によつてプラスミドpBR322のEco
Ｒ部位に挿入し、プラスミドpXbaHBsを形成
した（第１ｆ図）。このプラスミドをプラスミド
pBR322と同様に常法でクローン化した。 数個のクローンが得られた。 これらのクローンのうちの３個、すなわち
pXbaHBs−１，pXbaHBs−２，pXbaHBs−３
（第１ｇ図）のDNAをEcoＲによつて処理した
後、以下で“HBs断片”（第１ｈ図）と呼ぶ断片
を抽出精製した。 上記断片（通常は“遺伝子Ｓ”の内部）の末端
のヌクレオチド配列を、MAXAM及び
GILBERTによつて記載された方法（Pro.Nat.
Acad.Sci.USA 74，560−564（1977））を用いて
決定した。この結果、“遺伝子Ｓ”に相当する末
端のヌクレオチド配列が３個のクローンで同一で
はないことが示され（第１ｇ図）、この相違は明
らかにエンドヌクレアーゼS1による消化過程中
に生起する変化に依る。 pXbaHBs−１とpXbaHBs−２とから得られ
た２種の断片を、試験管内融合によりバクテリオ
フアージλplac5−１（21）のゲノム中に挿入し
た。このフアージゲノムは、lacZ遺伝子の末端近
傍に位置するEcoＲ部位を１個しか有していな
い。β−ガラクトシダーゼ（23）のアミノ酸配列
から誘導推論されるようなlacZ遺伝子の解読枠か
ら、pXbaHBs−１のHBs断片をλplac5−１の
lacZ遺伝子のEcoＲ部位中に挿入すると「遺伝
子Ｓ」の的確な解読相（reading phase）が維持
されることが観察され、かつ実験によつて確認さ
れる。これに対して、pXbaHBs−２のHBs断片
は、適切な解読枠を維持しながら上述のベクター
中に挿入されるのは不可能であると証明された。
しかしながら前記断片は後の実験に於ける対照
（コントロール）として使用された。 これらの操作は、既知の技術を使用して実施さ
れた。特にpXbaHBs−１，pXbaHBs−２の
「HBs断片」は、リガーゼを使用して、前もつて
EcoＲにより開裂されているλplac5−１の
DNA中に挿入された。次いで、かくして得られ
たDNA断片の混合物を用いてE.coli菌株
C600Rec BC rk-mk-をトランスフエクシヨンし
た。HBs断片がlacZ遺伝子のEcoＲ部位中に挿
入された結果lac-となつたバクテリオフアージの
クローンは、（21）に記載した方法に従つて増殖
及び精製される。 異なるバクテリオフアージのDNAを抽出し、
挿入されたDNA断片の配向（orientation）をそ
れらのBamHI制限断片の電気泳動分析により決
定した。この結果、プラスミドpXbaHBs−１と
pXbaHBs−２とに対応させて名付けた２個のフ
アージλlacHBs−１とλlacHBs−２とが正確に
配向されたHBs断片を含んでいることが決定で
きた。 第２ａ図は、pXbaHBs−１から得られたHBs
−１断片による修飾以前のベクターλplac5−１
の概略図である。 第２ｂ図は、同一ベクターの一部の概略図であ
り、上記HBs−１断片をEcoＲ部位中に挿入す
ることにより遺伝子Ｚ中に導入された修飾（部）
を示す。 第２ｃ図は、第２ｂ図の修飾されたベクターの
発現の結果得られるハイブリツドポリペプチドの
構造を略示する。 この発現は、E.coliの細菌菌株、特にHfr△
lacX74のトランスフエクシヨンによつて達成し
た。 E.coliの菌株、特にE.coliの菌株Hfr△lacX74
を、plac5−１，λlacHBs−１及びλlacHBs−２
によりそれぞれ形質転換した。培養後、細胞を溶
解し、得られた溶解物をSDSポリアクリルアミド
ゲル（24）上で電気泳動により分析し、蛋白質を
クーマシーブルーで染色して検出した。対照とし
てのλplac5−１の発現産物中には、β−ガラク
トシダーゼ（分子量116，248）に相当する位置に
より強度なバンドが存在し、λlacHBs−１の発
現産物中には分子量約135000乃至141000を有する
新規な蛋白質に相当する顕著なバンドが存在する
（λlacHBs−２の発現産物中には存在しない）。 λlacHBs−１及びλplac5−１によつてトラン
スフエクシヨンした細菌が合成する蛋白質を
（35S）メチオニンで標識した。該蛋白質を抗−
HBsAg血清と接触させSDSポリアクリルアミド
ゲルのオートラジオグラムを実施すると、
λlacHBs−１の発現産物中のみに、他のベクタ
ーの発現産物中の等価のバンドに対応しない１個
のバンドの存在が示された。当該バンドは、非標
識HBsAgの存在下で免疫沈降を実施すると特異
的に消滅した。β−ガラクトシダーゼに対する抗
血清を用いて免疫沈降を実施すると、λlacHBs
−１の発現産物中にはやはり同一のバンドが再び
観察された。 lacZ遺伝子とHBs−１断片との間の融合で得
られるハイブリツド蛋白質部分の推定される構造
を第２ｃ図に示す。「β−gal」断片はβ−ガラク
トシダーゼ（アミノ酸1005個）に相当する。
HBsAg断片（アミノ酸192個）も示されている。
これら２個の断片は、ベクターλlacHBs−１中
に含まれる“EcoＲリンカー”の一部に相当す
るアミノ酸であるプロリンにより分離されてい
る。 Ｃ 本発明に従うベクターを使用する免疫原分子
の製造方法 したがつて本発明は、上記のポリペプチドも
しくはより分子量が小さく同等の免疫原特性を
有する蛋白質の製法を提供しうる。 本発明の結果が示すところによれば、E.coliも
しくは細菌或いは真核生物細胞培養物の如き他の
あらゆる好ましい微生物は、λlacHBs−１で感
染させることができ、約138000の分子量を有する
と共に、同時にHBsAgとβ−ガラクトシダーゼ
との抗原決定基を有する蛋白質を合成しうる。当
該蛋白質分子は、本発明方法によつて獲得されう
るハイブリツドポリペプチドの代表例であり、こ
れらのハイブリツドポリペプチドに於いて、
HBsAgは（β−ガラクトシダーゼ断片の部分的
もしくは全体的置換の結果として）支持蛋白質と
結合しているにもかかわらず、これらのハイブリ
ツドはHBsAgの抗原特性を有する。これらの新
規分子は、Ｂ型肝炎ウイルスに対して活性なワク
チンを製造するために有益である。 自明のこととして、また上述の事実から既に明
らかなように、本発明は、特に考察された適用方
法及び実施方法に何ら限定されず、逆にあらゆる
変形に及んでいる。 以上の記載に加えて、特に発明に関して引用し
た参考文献を以下に示す。 参考文献 １―Blumberg，B.S.（1977）Science 197，17―
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J.L.R.and Robinson W.S.（1977）J.Virol.
21，666−682 ６―Landers T.A.，Greenberg H.B.and
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