DE3049831C2 - Vektoren enthaltend eine f}r das Oberfl{chenantigen des Hepatites B-Virus kodierende Nucleotidsequenz, Verwendung dieser Vektoren zur Herstellung von Peptiden, Impfstoffe enhaltend dabei erhaltende Peptide als Antigen - Google Patents

Vektoren enthaltend eine f}r das Oberfl{chenantigen des Hepatites B-Virus kodierende Nucleotidsequenz, Verwendung dieser Vektoren zur Herstellung von Peptiden, Impfstoffe enhaltend dabei erhaltende Peptide als Antigen

Info

Publication number
DE3049831C2
DE3049831C2 DE19803049831 DE3049831T DE3049831C2 DE 3049831 C2 DE3049831 C2 DE 3049831C2 DE 19803049831 DE19803049831 DE 19803049831 DE 3049831 T DE3049831 T DE 3049831T DE 3049831 C2 DE3049831 C2 DE 3049831C2
Authority
DE
Germany
Prior art keywords
sequence
vector according
nucleic acid
peptide
amino acid
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Lifetime
Application number
DE19803049831
Other languages
English (en)
Other versions
DE3049831T1 (de
Inventor
Francis Galibert
Pierre Tiollais
Patrick Charnay
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM
Original Assignee
Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from FR7921811A external-priority patent/FR2464269B1/fr
Application filed by Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM filed Critical Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM
Publication of DE3049831T1 publication Critical patent/DE3049831T1/de
Application granted granted Critical
Publication of DE3049831C2 publication Critical patent/DE3049831C2/de
Anticipated expiration legal-status Critical
Expired - Lifetime legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A61K39/29—Hepatitis virus
    • A61K39/292—Serum hepatitis virus, hepatitis B virus, e.g. Australia antigen
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
    • C12P21/02—Preparation of peptides or proteins having a known sequence of two or more amino acids, e.g. glutathione
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/70—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving virus or bacteriophage
    • C12Q1/701—Specific hybridization probes
    • C12Q1/706—Specific hybridization probes for hepatitis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/10011—Adenoviridae
    • C12N2710/10111—Atadenovirus, e.g. ovine adenovirus D
    • C12N2710/10134—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2730/00—Reverse transcribing DNA viruses
    • C12N2730/00011—Details
    • C12N2730/10011—Hepadnaviridae
    • C12N2730/10111—Orthohepadnavirus, e.g. hepatitis B virus
    • C12N2730/10122—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2730/00—Reverse transcribing DNA viruses
    • C12N2730/00011—Details
    • C12N2730/10011—Hepadnaviridae
    • C12N2730/10111—Orthohepadnavirus, e.g. hepatitis B virus
    • C12N2730/10134—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S530/00—Chemistry: natural resins or derivatives; peptides or proteins; lignins or reaction products thereof
    • Y10S530/808—Materials and products related to genetic engineering or hybrid or fused cell technology, e.g. hybridoma, monoclonal products
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S530/00—Chemistry: natural resins or derivatives; peptides or proteins; lignins or reaction products thereof
    • Y10S530/82—Proteins from microorganisms
    • Y10S530/826—Viruses
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S930/00—Peptide or protein sequence
    • Y10S930/01—Peptide or protein sequence
    • Y10S930/22—Viral peptide or viral protein
    • Y10S930/223—Hepatitis related

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Description

Die Erfindung betrifft die in den Ansprüchen 1 bis 16 angegebenen Vektoren, enthaltend eine Nucleinsäure, die eine Nucleotidsequenz enthält, welche in der Lage ist, für eine immunogene Peptidsequenz zu kodieren, die dem Oberflächenantigen des Virus der Virushepatitis B entspricht, sowie deren Verwendung nach Anspruch 17 und die erhaltenen Peptide nach Anspruch 18 sowie Hybridproteine nach Anspruch 19 sowie diese enthaltende Arzneimittel nach Anspruch 20 und Impfstoff nach Anspruch 21. Beschrieben wird auch ein Verfahren, das die Gewinnung einer solchen Nucleinsäure ermöglicht.
Die Hepatitis B ist eine Viruserkrankung, die besonders häufig im tropischen Afrika, in Südostasien und im fernen Orient auftritt.
Das äthiologische Agens ist ein Virus (HBV) oder Dane-Partikel, das eine Hülle (Australia-Antigen oder HBs-Antigen), ein Kapsid (HBc-Antigen), eine endogene Polymerase und ein ringförmiges, teilweise einsträngiges DNA-Molekül enthält, der längere Strang dieses DNA-Moleküls weist etwa 3200 Nucleotide auf (J. Summers, A. O'Connell und I. Millman, Proc. Nat. Acad. Sci., USA 72 [1975], S. 4597-4601).
Die endogene DNA-Polymerase kann zur in-vitro-Reparatur des kürzeren Strangs verwendet werden (T. A. Landers, H. B. Greenbert und J. S. Robinson, J. Virol. 23 [1977], S. 368-376).
Die elektrophoretische Analyse der Hüllproteine hat die Anwesenheit von 2 bis 7 Polypeptiden gezeigt, von denen die wichtigsten Polypeptid I und Polypeptid II genannt werden (D. L. Peterson, I. M. Roberts und G. N. Vyas, Proc. Nat. Acad. Sci., USA 74 [1977], S. 1530-1534, sowie D. L. Peterson, D. Y. Chien, G. N. Vyas, D. Nitecki und H. Bond [1978] in Viral Hepatitis, Herausg. G. Vyas, S. Cohen und R. Schmid, The Franklin Institute Press, Philadelphia, S. 569-573).
Das Polypeptid I hat ein Molekulargewicht von 22 000 bis 26 000 Daltons. Das Polypeptid II ist glykosiliert und hat ein Molekulargewicht von 28 000 bis 30 000 Daltons. Die Aminosäurezusammensetzung dieser beiden Polypeptide ist sehr ähnlich. Die Sequenzen, die ihre ersten 15 Aminosäuren (beginnend am N-terminalen Ende) und ihre letzten drei Aminosäuren bilden, sind identisch, so daß die Hypothese aufgestellt wurde, daß sich das Polypeptid II vom Polypeptid I nur durch eine Glycosilierung unterscheiden könnte.
Die Untersuchung des Virus ist besonders erschwert im Hinblick darauf, daß man über kein Zellkultursystem verfügt, das die Vermehrung des Virus ermöglicht. Diese Schwierigkeit ist schon teilweise umgangen worden, insbesondere was den Serotyp ayw betrifft. Die gesamte DNA (Genom) des Virus wurde identifiziert und nach ihrem vorherigen Einspleißen in die einzige EcoRI-Schnittstelle eines Vektors λgt.WES.λB kloniert, insbesondere in E. coli, gemäß dem Verfahren von A. Fritsch, C. Pourcel, P. Charnay und P. Tiollais, C. R. Acad. de Paris, 287 (1978), S. 1453-1456.
Bis zu diesem Tag wurde die Sequenz der Polypeptide I und II selbst und die Lage der für diese Peptide kodierenden Sequenz in der viralen DNA nicht aufgeklärt.
Aufgabe der Erfindung ist die Gewinnung von Vektoren mit einer viel kleineren DNA-Sequenz als die virale DNA selbst, welche die Sequenz enthält, die in der Lage ist, für die Peptidsequenz mit den immunogenen Eigenschaften zu kodieren. Diese Peptidsequenz kann, wenn sie in einen lebenden Wirtsorganismus eingebracht wird, die Erzeugung von Antikörpern durch diesen induzieren, welche fähig sind, den nämlichen Wirt letztlich vor dem Virus der Virushepatitis B zu schützen, insbesondere wenn dieser sich im virulenten Stadium befindet.
Die Erfindung beruht nicht nur auf der vollständigen Nucleotidanalyse des Genoms des Dane-Partikels, welche die Erfinder vorgenommen haben, sondern auch auf der Idee, die sie zur Identifizierung des Gens hatten, welches für die oben erwähnten Polypeptide kodiert (nachstehend als "S-Gen" bezeichnet), nämlich in der derart vorbestimmten vollständigen Nucleotidstruktur des Genoms des Dane-Partikels diejenigen Nucleotidsequenzen zu suchen, die befähigt sind, für die bekannten proximalen und terminalen Peptidsequenzen dieser Polypeptide zu kodieren.
Man wird sich erinnern, daß Peterson und Mitarbeiter berichtet haben, insbesondere in den Aufsätzen, deren Zitate vorstehend wiedergegeben wurden, daß die proximale Sequenz (erste Aminosäure N-terminal) der ersten 15 Aminosäuren im Prinzip wie folgt analysiert wurde:
Met Glu Asn Ile Thr Ser Gly Phe Leu Gly Pro Leu Leu Val Ser
und daß die terminale Sequenz der gleichen Polypeptide (letzte Aminosäure C-terminal) die folgende ist:
Val Tyr Ile
Burrell et al. (Nature 279 [1979], Seiten 43 bis 47) beschreiben Derivate von pBR322, die EcoRI- bzw. BamHI-Fragmente der HBV-DNA des Serotyps adyw in der EcoRI- bzw. der BamHI-Spaltstelle tragen. Ferner wurden diese Fragmente und andere Restriktionsfragmente der HBV-DNA des Serotyps adyw in die PstI-Spaltstelle von pBR322 unter Verwendung von Oligonucleotiden eingebaut.
Die Fig. 1 ist eine schematische Karte des Genoms des Dane-Partikels. Sie enthält zwei Stränge b₁ und b₂; der kürzere von ihnen (b₂) enthält normalerweise nicht den Teil, der in der Zeichnung durch eine gestrichelte Linie wiedergegeben ist.
Es ist bekannt, daß diese DNA nur eine einzige EcoRI-Schnittstelle aufweist.
Der Pfeil f₁ bezeichnet die Richtung der Numerierung der Nucleotide, aus denen der längere Strang b₁ besteht. Der Pfeil f₂ bezeichnet die Richtung der Transcription der Virus-DNA, insbesondere durch die zelluläre Maschinerie der vom Hepatitis-B-Virus befallenen Zellen, soweit es die Expression des S-Gens betrifft.
Die EcoRI-Schnittstelle kann demnach mit 0 numeriert werden oder, wie es jetzt für diejenige des zum Serotyp ayw gehörenden Hepatitis-B-Virus genauer bestimmt wurde, mit 3182.
Der innere Kreis mit ausgezogener Linie e stellt die Skala in Prozent für die Länge der DNA dar und erlaubt die Bestimmung der Lage bestimmter Teile von ihr.
Die Ziffern 3′, 5′ und 5′, 3′ im unteren Teil der Karte bezeichnen die terminalen Enden, die die gleichen Zahlen in den üblichen Wiedergaben der Kettenenden von Nucleinsäuren tragen.
Erfindungsgemäß wurde gezeigt, daß das S-Gen im wesentlichen das Fragment des längeren Strangs b₁ darstellt, das sich zwischen den Positionen 73,6 und 95,1 der schematischen Karte von Fig. 1 befindet. Die Abkürzungen "Start" und "Stop" bezeichnen den Start- bzw. Haltepunkt der Transkription des S-Gens.
Die Fig. 2A, 2B und 2C stellen den terminalen Teil des vorstehend genannten Genoms dar, enthalten insbesondere den zwischen den Positionen 60,4 und 100 (in % der Länge der DNA).
Jeder der in der Fig. 2 erscheinenden Buchstaben entspricht in üblicher Weise einer der vier Nucleotidbasen der DNA:
A: Adenin
G: Guanin
T: Thymin
C: Cytosin
Die unteren Zeilen in jedem der Zeilenpaare, aus denen die Fig. 2A, 2B und 2C bestehen, entsprechen der Nucleinsäure, die mit der Nucleotidkette b₂ übereinstimmt.
Das zur Aufstellung der stärker aufgegliederten Karte, die in den Fig. 2A, 2B und 2C wiedergegeben ist, benutzte Analysenverfahren wird nachstehend kurz erläutert.
Die Charakterisierung der Nucleotidsequenz des S-Gens, wie sie im Rahmen der vorliegenden Erfindung vorgeschlagen wird, und deren proximales Ende p "S" und terminales Ende t "S" in den Fig. 2A, 2B und 2C angegeben sind, ergibt sich aus der Feststellung, daß:
  • - die 14 ersten Tripletts (in der Leserichtung f₂), beginnend mit dem gegenüber dem terminalen EcoRI-Ende mit 3030 numerierten Nucleotid, sind entsprechend in der Lage, für die 14 ersten Aminosäuren der proximalen Sequenz der 15 ersten Aminosäuren der vorstehend genannten Polypeptide zu kodieren;
  • - die 4 letzten Tripletts GTA TAC ATT TAA, gelesen auf der zu der transkribierten Kette b₁ komplementären Kette b₂, entsprechen den 3 terminalen Aminosäuren der oben erwähnten Polypeptide und einem Stop-Kodon;
  • - diese Nucleotidsequenz (678 Nucleotide) enthält kein Stop-Kodon, zumindest wenn man den Leserahmen anwendet, bei dem das erste von der Zellmaschinerie auf der DNA gelesene Triplett AUG ist (entsprechend ATG auf dem Komplementärstrang);
  • - die vollständige Übersetzung der genetischen Information, welche mit dem Start-Kodon ATG beginnt, führt zu einem theoretischen Polypeptid von 226 Aminosäuren, das ein Molekulargewicht von 25 422 Daltons aufweist.
Die Nucleotidsequenz des S-Gens sowie die Polypeptidkette, die durch Übersetzung des S-Gens erhalten wird, sind in den Fig. 3A, 3B und 3C dargestellt.
Diese Werte sind vollständig im Einklang mit den analytischen Daten, die aufgrund der elektrophoretischen Wanderungsgeschwindigkeit des Polypeptids I auf Polyacrylamidgelen erhalten werden, welche von den vorstehenden Autoren bereits beschrieben wurden (Literaturstellen 9 bis 12 im Literaturverzeichnis, das sich am Ende der Beschreibung der vorliegenden Patentanmeldung befindet).
Der Unterschied, der an der Stelle der 15. Aminosäure der proximalen Peptidsequenz des Polypeptids I beobachtet wird:
Leucin nach den vorstehend erwähnten Sequenzdarstellungen der Fig. 2A, 2B, 2C und 3A, 3B, 3C, und nicht Serin, wie in den Feststellungen der vorstehend genannten Verfasser, kann vielleicht der Tatsache zugeschrieben werden, daß diese Verfasser mit einer genetischen Variante gearbeitet haben, die sich von derjenigen unterscheidet, die Gegenstand der vorliegenden Untersuchung war. Man wird bemerken, daß der Unterschied auf die Substitution eines einzigen Nucleotids in dem in Frage kommenden Triplett "TTA" in dem betreffenden S-Gen zurückgeführt werden kann, das in den Fig. 2A, 2B, 2C und 3A, 3B, 3C dargestellt ist, anstelle von "TCA", das eines der Tripletts ist, die in der Lage sind, in Serin übersetzt zu werden.
Die Erfindung betrifft deshalb insbesondere Vektoren mit Nucleinsäurefragmenten, die aus der DNA des Dane-Partikels herausgeschnitten werden können, wobei diese Fragmente insbes. dadurch gekennzeichnet sind, daß sie den Teil des S-Gens enthalten, der in der Lage ist, für den Teil des Hüllproteins des Virus zu kodieren, der verantwortlich ist für die immunologischen Eigenschaften des Hepatitis-B-Virus.
In dieser Hinsicht betrifft die Erfindung demnach einen Vektor, der eine Nucleinsäure-Insertion mit den folgenden Merkmalen aufweist:
  • a) sie hat eine Länge von mindestens etwa 1000 bis 1100 Nucleotiden;
  • b) sie codiert ein immunogenes Peptid, das die in-vivo-Bildung von Antikörpern induzieren kann, die aktiv gegen das Hepatitis-B-Virus sind, und das die in den Fig. 3A, 3B und 3C dargestellte Aminosäuresequenz aufweist; und
  • c) das codierte Peptid enthält die Aminosäuresequenz Alanin (N-terminal)-Glutamin-Glycin-Threonin-Serin (C-terminal);
wobei die Nucleinsäure-Insertion so in den Vektor eingebaut ist, daß die Ablesephase eine Expression des codierten Peptids gestattet, und sie in einem transformierten Mikroorganismus oder einer eukaryontischen Zelle exprimierbar ist.
Bei der Expression in einem Mikroorganismus oder in eukariotischen Zellen gilt die Maßgabe, daß bei der genetischen Verknüpfung die Ablesephase des S-Gens beibehalten wird.
Die erfindungsgemäß verwendeten Nucleotidsequenzen weisen im Verhältnis zueinander eine Veränderlichkeit auf, die bei ihrer Expression zur Entstehung von Determinanten führt, die je nach dem Subtyp des Hepatitis-B-Virus variieren (Subtypen d, w, y, r der Gruppe a).
Bei der Peptidsequenz, die in den Fig. 3A, 3B und 3C dargestellt ist, wird man feststellen, daß die erste Aminosäure der vorstehend erläuterten Sequenz: Methionin, N-terminal, und daß die Aminosäure des entgegengesetzten Endes: Isoleucin, C-terminal ist.
Die Erfindung betrifft insbesondere auch Vektoren mit in den Fig. 4A und 4B wiedergegebenen Nucleotidsequenzen, die für eine solche Peptidsequenz kodiert, wie sie aus Fig. 5 hervorgeht.
Es versteht sich von selbst, daß ohne Schwierigkeiten äquivalente Peptidsequenzen, d. h. solche Peptidsequenzen verwendet werden können, in denen bestimmte Teile nicht streng identisch mit den entsprechenden Teilen der in den Fig. 3A, 3B, 3C und 5 wiedergegebenen Peptidsequenz sein können, wobei diese Variationen auf lokale Mutationen zurückzuführen sein können, welche den allgemeinen immunogenen Charakter des Proteins nicht beeinflussen, oder auf Modifikationen der Struktur, die auf den unterschiedlichen Serotypen beruhen, unter denen die Proteine der in Frage stehenden Art in Erscheinung zu treten vermögen (insbesondere die Serotypen adw, adr und ayr).
Die Erfindung betrifft insbesondere Vektoren, enthaltend eine Nucleotidsequenz, welche für eine derartige Peptidsequenz kodiert, wie sie in Fig. 6 dargestellt ist.
Insbesondere betrifft die Erfindung auch folgende Peptidsequenzen (vgl. in diesem Zusammenhang Ansprüche 1, 4 und 5):
Im ersten der vorstehend aufgeführten Peptide ist das Alanin-Ende N-terminal und Serin-Ende C-terminal. Im zweiten und dritten der vorstehend aufgeführten Peptide ist das Threonin-Ende N-terminal und das Serin-Ende C-terminal.
Beispielsweise kann man insbesondere das Pentapeptid ausgehend vom C-terminalen Serin herstellen, an das man das Threonin nach dem von Castro in Tetrahedron Letters, 1975, Nr. 14, S. 1219-1222 beschriebenen Verfahren anhängt. Anschließend werden die Aminosäuren Glycin, Glutamin und Alanin nach dem wiederholten gemischten Anhydridverfahren (Methode Rema) angehängt, welches von Beierman in Chemistry and Biology of Peptides, Herausg. J. Meienhofer, Ann. Arbour Science Publ., Ann, Arb. Mich. (1972), S. 351 beschrieben wurde.
Die Erfindung betrifft auch die Produkte, die sich aus der Anheftung von Polypeptiden, die die Sequenz des oben genannten Pentapeptids enthalten, an ein größeres Trägermolekül, insbesondere vom Polypeptid- oder Proteintyp, ferner Mittel, welche dieses Pentapeptid aufweisende Polypeptid in Form der Verknüpfungsprodukte enthalten, insbesondere zusammen mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger und weiter insbesondere Impfstoffe gegen die Hepatitis B. Die pharmazeutischen Träger sind in an sich üblicher Weise der ausgewählten Verabreichungsart angepaßt, die insbesondere oral, parenteral, rektal oder durch Aufsprühen auf die Schleimhäute, insbesondere der Nase, erfolgen kann.
Das Hexapeptid und das Polypeptid aus 7 Aminosäuren können nach den üblichen Verfahren der Peptidsynthese hergestellt werden.
Diese Peptide sind, gemäß vorliegender Erfindung, vermutlich die Stellen mit Antigenwirkung der größeren, vorstehend erläuterten Polypeptide und verantwortlich für die Vaccinwirkung der viralen Hülle (Journal of Biol. Stand. 4 [1976], S. 295 bis 304, RAO und VYAS "Biochemical Characterization of Hepatitis B Surface Antigen in Relation to Serologic Activity").
Für die Herstellung dieses Pentapeptids, Hexapeptids und Polypeptids mit 7 Aminosäuren kodieren folgende DNA-Fragmente:
  • - Für das Pentapeptid insbesondere das Polynucleotid der Formel:
  • - Für das Hexapeptid insbesondere das Polynucleotid der Formel:
  • - Für das Polypeptid aus 7 Aminosäuren das Polynucleotid der Formel:
oder in jedem der drei Fälle das zu den drei jeweiligen vorstehenden Polynucleotiden komplementäre Polynucleotid, oder auch solche Polynucleotide, in denen jedes der Tripletts durch irgendein analoges Triplett ersetzt sein kann, das in der Lage ist, für die Herstellung der gleichen Aminosäure zu kodieren.
Die Nucleinsäure der Vektoren kann ferner mindestens einen der zwei wechselseitig komplementären Stränge einer DNA-Sequenz enthalten, wie sie in den Fig. 4A und 4B dargestellt ist (in denen die Ziffern, die den Positionen der ersten Nucleotide jedes der aufeinanderfolgenden Fragmente von 10 Nucleotiden entsprechen, ebenfalls hinsichtlich der EcoRI-Stelle, die in der Figur nicht dargestellt ist, aufgeführt sind:
natürlich haben diese Zahlen keinen Einfluß auf die Charakterisierung der Nucleotidsequenz der in Frage stehenden Art). Das DNA-Fragment ist von 2 HincII-Schnittstellen begrenzt.
Man wird anerkennen, daß diese Nucleotidsequenz der genetischen Information entspricht, deren Übersetzung zu der Peptidsequenz führt, die in Fig. 5 dargestellt ist.
Ohne Schwierigkeiten verwendbar sind die äquivalenten, einsträngigen oder doppelsträngigen Nucleotidsequenzen, darunter insbesondere der Strang mit der Sequenz, die sich aus der Folge der unteren Zeilen der Fig. 4A und 4B ergibt, die entsprechende doppelsträngige DNA oder die entsprechenden Boten-RNAs, insbesondere diejenige, die durch die Komplementärketten der Nucleotide wiedergegeben wird, die aus den unteren Linien der Linienpaare der Fig. 4A und 4B bestehen (Richtung des Pfeils f₂).
Ebenfalls einsetzbar sind die Nucleotidketten, die sich von den vorstehenden durch bestimmte Tripletts oder kurze Triplettsequenzen unterscheiden, mit der Maßgabe, daß diese Nucleotidsequenzen befähigt bleiben, für ein Polypeptid zu kodieren, das die immunogenen Eigenschaften bewahrt, die für den Virus der Virushepatitis B charakteristisch sind. Allgemein handelt es sich um Nucleotidketten, die gegebenenfalls nach Denaturierung der doppelsträngigen DNA zur Erzeugung der entsprechenden einsträngigen Nucleinsäuren die Fähigkeit behalten, sich auf mindestens etwa 90% ihrer Länge mit einem der DNA-Stränge der Fig. 4A und 4B zu hybridisieren.
Bevorzugt eingesetzt werden Nucleinsäuren, die aus der DNA des Hepatitisvirus herausgeschnitten werden können und die, falls sie doppelsträngig sind, durch die Existenz einer HincII-, HhaI-, AvaI- oder EcoRI-Schnittstelle an dem einen ihrer Enden und durch eine AvaIII-, HincII- oder HhaI-Schnittstelle an ihrem anderen Ende gekennzeichnet sind.
Die Lagen dieser verschiedenen Enden im Vergleich zur EcoRI-Schnittstelle sind schematisch in den Fig. 2A, 2B und 2C angegeben.
Die Nucleinsäure ist für den Einbau in einen Vektor bestimmt, der ihre Expression in einem Bakterium und in eukaryotischen Zellen ermöglicht, insbesondere im Hinblick auf die Herstellung eines Proteins oder eines Peptids, das in der Lage ist, in einem lebenden Wirtsorganismus die Herstellung von Antikörpern zu induzieren, die gegen das Virus der Virushepatitis B aktiv sind. Das aus der Übersetzung der Nucleotidsequenz gemäß der Erfindung hervorgehende Protein oder Peptid kann als Impfstoff oder als Hilfsmittel zur Diagnose verwendet werden.
Die beschriebenen Nucleinsäuren können auch als Reagenz verwendet werden, um in Blut- oder Serumproben die Anwesenheit oder Abwesenheit des Dane-Partikels des Antigens HBs oder von Fragmenten davon und dergl. festzustellen (nach dem üblichen Verfahren der DNA-DNA-Hybridisierung).
Natürlich wird auf die Zeichnungen Bezug genommen, deren Figuren bereits in den vorangehenden Ausführungen in Betracht gezogen wurden. Die Ziffern oder Zahlen in Klammern entsprechen den Zitaten im Literaturverzeichnis, das der vorliegenden Beschreibung angefügt ist.
Die Erfindung betrifft auch besondere Vektoren, die die Expression der vorstehend beschriebenen Nucleotidsequenzen ermöglichen, insbesondere in Form eines Hybridproteins, in welchem ein Proteinfragment, das die immunologischen Eigenschaften des HBsAg aufweist, an ein Trägermolekül gebunden ist, wobei dem Ganzen immunogene oder immunoreaktive Eigenschaften verliehen werden, die es dazu befähigen, die Produktion von Antikörpern zu induzieren, die im Wirtsorganismus, in den dieses Protein vorher eingebracht wurde, eine Schutzwirkung gegen die virale Infektion ausüben.
Insbesondere betrifft die Erfindung einen Vektor - Phage oder Plasmid -, der mindestens einen Teil des Lactose-Operons enthält, insbesondere den Promotor und das Z-Gen dieses Operons. Dieser Vektor ist dadurch gekennzeichnet, daß er modifiziert ist für den phasengerechten Einbau eines der DNA-Fragmente, insbesondere derjenigen, die den größeren Teil des S-Gens enthalten, in eine geeignete Stelle des Z-Gens, wie die EcoRI-Schnittstelle.
Die Erfindung betrifft auch diejenigen dieser modifizierten Vektoren, in denen mindestens ein Teil des Fragments der DNA, die für den größeren Teil der β-Galactosidase kodiert, durch ein DNA-Fragment ersetzt ist, das in der Lage ist, für irgendein anderes nicht-immunogenes Trägermolekül zu kodieren, oder für ein Molekül, dessen mögliche immunologischen Eigenschaften, falls solche existieren, nicht diejenigen des Peptidteils beeinflussen, welcher die immunologischen Eigenschaften des HBsAg aufweist, beispielsweise hauptsächlich diejenige, die sich in Leserichtung von seiner HhaI-Schnittstelle weg erstreckt.
Die Erfindung bezieht sich insbesondere auch auf ein Hybridprotein, das dadurch gekennzeichnet ist, daß es eine Polypeptidsequenz enthält, welche die spezifischen immunologischen Eigenschaften des HBsAg enthält. Dieses Hybridprotein ist mit einer Polypeptidsequenz verbunden, die aus dem größeren Teil der β-Galactosidase besteht, welche die Rolle eines Trägerproteins spielt.
Es ist offensichtlich, daß nicht nur dieses besondere Hybridmolekül, dessen wesentliche Rolle darin besteht, ein Beispiel für ein Protein darzustellen, das nach dem Verfahren der Gentechnik aufgebaut wurde und die charakteristischen immunogenen und immunoreaktiven Eigenschaften des Antigens HBsAg aufweist, herstellbar ist. Vielmehr kann auch jedes andere Hybridprotein, in dem der ganze oder ein Teil des β-Galactosidaseanteils durch irgendein anderes Trägermolekül ersetzt sein kann, das nicht immunogen ist, oder dessen mögliche immunologische Eigenschaften, wenn solche existieren, nicht diejenigen des Peptidteils beeinflussen, der die immunologischen Eigenschaften des HBsAg aufweist, verwendet werden.
Weitere Merkmale der Erfindung werden noch im Verlauf der Beschreibung der bevorzugten Beispiele in Kombinationen mit den Zeichnungen erscheinen, in denen
die Fig. 1a bis 1h schematisch die aufeinanderfolgenden Stufen der Herstellung eines Vektors vom Plasmidtyp darstellen, wobei ein Fragment der HBV-DNA eingebaut wird;
die Fig. 2a bis 2c schematisch die Ausgangsstrukturen des verwendeten Vektors (Fig. 2a), des erhaltenen modifizierten Vektors (Fig. 2b) und diejenige des Hybridproteins zeigen, das sich aus der Expression dieses modifizierten Vektors in E. coli ergibt (Fig. 2c).
A. Nucleotidsequenzen Die Produkte und die angewendeten Verfahren Die verwendeten Enzyme und chemischen Verbindungen
Die verwendeten Restriktionsenzyme: BamHI, HhaI, HincII, HaeIII, XbaI, MboI, HinfI, HpaII, XhoI, DNA-Polymerase I, bakterielle alkalische Phosphatase und Polynucleotid-Kinase. Die chemischen Verbindungen waren die folgenden:
Dimethylsulfat; Hydrazin; Acrylamid und Bisacrylamid (zweifach kristallisiert); Dideoxynucleotidtriphosphat und Deoxynucleotidtriphosphat; Piperidin, unter Vakuum redestilliert.
Herstellung der HBV-DNA
Das gesamte HBV-Genom (Untertyp ayw) wurde in E. coli kloniert, wobei die einzige EcoRI-Schnittstelle des Vektors λgt.WES.λB (14) benutzt wurde. Die klonierte DNA wird nachstehend als "Eco HBV DNA" bezeichnet.
Der rekombinante Bakteriophage wurde in einer Petrischale auf Agar vermehrt. Die gesuchte DNA wurde in an sich bekannter Weise extrahiert. Nach Verdauung der DNA mit dem Restriktionsenzym EcoRI wurde die Sequenz Eco HBV DNA durch Ultrazentrifugieren in einem Sucrosegradienten gemäß dem Verfahren gereinigt, das in den Literaturzitaten (16, 17) beschrieben ist.
Herstellung der 5′³²P-markierten DNA-Fragmente
10 bis 20 Picomol der Eco HBV DNA wurden unter den vom Hersteller empfohlenen Bedingungen mit den verschiedenen Restriktionsenzymen vollständig hydrolysiert. Die DNA-Fragmente wurden durch die alkalische Phosphatase dephosphoryliert, welche danach durch eine alkalische Behandlung inaktiviert wurde. Sodann wurde die DNA nach dem in dem Aufsatz (18) beschriebenen Verfahren mit Äthanol ausgefällt. Nach dem Wiederauflösen in einem Puffer auf der Basis von Spermidin wurden die DNA's an ihren 5′-Enden mit einem ATP (γ³²P) (3000 Ci/mM) und mit Polynucleotid-Kinase markiert (nach dem im Aufsatz [19] beschriebenen Verfahren).
Die Restriktionsfragmente der DNA wurden durch Elektrophorese in Polyacrylamidgel getrennt und danach eluiert. Die markierten Enden wurden in an sich bekannter Weise durch Spaltung mit einem anderen Restriktionsenzym oder durch Denaturierung der DNA-Fragmente der in Frage stehenden Art durch Elektrophorese in Polyacrylamidgel voneinander getrennt.
Bestimmung der Struktur der Nucleotidsequenzen der DNA
Die Primärstruktur der doppelsträngigen oder einsträngigen DNA-Fragmente wurde im wesentlichen nach dem von Maxam und Gilbert (19) beschriebenen Verfahren bestimmt. Es wurde auch das Verfahren der terminalen Ketteninhibitoren benutzt, das von Sanger und Mitarb. (20) beschrieben und von Maat und Smith (21) für doppelsträngige Fragmente abgewandelt wurde, die an einem ihrer 5′-Enden markiert sind.
Die Produkte der chemischen und enzymatischen Umsetzung wurden durch Elektrophorese in Acrylamid-Sequenzierungsgelen von 8, 16 oder 25% und 1 mm Dicke analysiert.
Die Verfahren und die Ergebnisse der Analyse
Um zu bestimmen, ob das HBV-Genom in der Lage ist, für die Polypeptide I und II zu kodieren, wurden alle HaeIII-Fragmente (die HaeIII-Schnittstellen des HBV-Gemons sind in Fig. 1 durch kleine Pfeile angezeigt) an ihren 5′-Enden markiert. Erhebliche Teile ihrer Primärstruktur wurden nach dem Verfahren von Maxam und Gilbert bestimmt. Die Nucleotidsequenzen, die befähigt sind, für die proximalen und terminalen Aminosäuresequenzen der Polypeptide I und II zu kodieren, wurden in den Fragmenten HaeIII E und HaeIII F lokalisiert, welche vorher auf der Restriktionskarte des HBV-Genoms lokalisiert wurden (nach dem in der Literaturstelle [17] beschriebenen Verfahren). Dies sind die Nucleotidsequenzen, von denen aus den bereits angegebenen Gründen angenommen wurde, daß sie die Enden des S-Gens enthalten, welche selbst die Positionen 73,6 und 95,1 gegenüber der EcoRI-Schnittstelle (Fig. 1) besetzen.
Die Nucleotidsequenz zwischen diesen beiden Positionen wurde analysiert, wobei bekannte chemische Verfahren benutzt wurden, insbesondere durch das Verfahren des chemischen Abbaus mit Dimethylhydrazinsulfat und das Verfahren der Kettenbeendigung. Unter den verschiedenen, von Maxam und Gilbert vorgeschlagenen chemischen Umsetzungen wurden die teilweise Depurinierung mit Ameisensäure und die Spaltung mit Piperidin benutzt. Dies sind Verfahren, die Banden gleicher Intensität bei den Autoradiogrammen für die Fragmente ergeben, die mit einem Guanin und mit einem Adenin enden. Es wurden auch die Umsetzungen mit Hydrazin durchgeführt, gefolgt von einer Spaltung mit Piperidin, um Banden gleicher Intensität zu erhalten für die Nucleotide Cytosin und Thymidin. Die elektrophoretische Auftrennung der Produkte dieser beiden Umsetzungen ergibt für jede Base einen Fleck in einer der beiden Spuren des verwendeten Gels. Dieses Verfahren erleichtert die Ablesung des Autoradiogramms des Gels. Die Umsetzung mit Hydrazin in Gegenwart von Natriumchlorid, die spezifisch für das Cytosin ist, ermöglicht die Unterscheidung dieses Nucleotids vom Thymidin. Die Umsetzung mit Dimethylsulfat, gefolgt von einer Spaltung mit Piperidin, die spezifisch für Guanin ist, ermöglicht die Unterscheidung dieses letztgenannten Nucleotids von Adenin.
Um einen möglichst hohen Grad an Genauigkeit sicherzustellen, wurden durch Hydrolyse der Eco HBV DNA mit verschiedenen Restriktionsenzymen: BamHI, HinfI, HpaII, HaeIII und HincII verschiedene Nucleotidsequenzen hergestellt, die unterschiedliche, sich gegenseitig übergreifende Fragmente bilden.
Auf diese Weise wurde die Analyse jeder der Schnittstellen, die als Ausgangspunkt für die Untersuchung der ersten Fragmente benutzt wurden, durch die Analyse unterschiedlicher Fragmente bestätigt, in denen sich die Schnittstellen des ersten Fragments zwischen den neuen Enden dieser anderen Fragmente befinden.
Das S-Gen, das in den Fig. 3A, 3B und 3C dargestellt ist und das mit dem Startkodon ATG beginnt, enthält227 Tripletts, darunter ein Stopkodon TAA. Die drei Kodons, die den drei Aminosäuren am carboxyterminalen Ende des korrespondierenden Polypeptids entsprechen, befinden sich im gleichen Leserahmen, unmittelbar vor dem Stopkodon TAA. Der eine der beiden anderen Leserahmen (entsprechend versetzt gegenüber dem vorangehenden um ein und zwei Nucleotide) weist ebenfalls kein Stopkodon auf, kodiert jedoch für ein Protein, das vollständig verschieden von den vorstehend beschriebenen Polypeptiden I und II ist. Der dritte Leserahmen enthält 10 Stopkodons (5 TAG, 4 TGA, 1 TAA). Auf dem anderen Strang der DNA werden die drei Leserahmen durch 11, 11 bzw. 6 Stopkodons unterbrochen, die über die DNA-Sequenz verteilt sind.
Wie vorstehend bereits angegeben wurde, führt die vollständige Übersetzung der genetischen Information, beginnend mit dem Startkodon ATG, zu einem theoretischen Polypeptid mit 226 Aminosäuren, entsprechend einem Molekulargewicht von 25 422 Daltons.
Es ist wichtig zu unterscheiden, daß die Nucleotidsequenz, die dem S-Gen entspricht, normalerweise vollständig im Verlauf der Übersetzung abgelesen werden muß.
Eingesetzt werden können auch Nucleotidketten von der Art des vorstehend beschriebenen S-Gens, die kleine zusätzliche Sequenzen tragen, welche bis zu etwa 100 Nucleotide enthalten können, oder denen im Gegenteil auch solche kleine Sequenzen fehlen können, ohne daß deshalb die entsprechende genetische Information verändert wird (22, 23).
Die verschiedenen Fragmente der Erfindung, die vorstehend definiert wurden, können ausgehend von der DNA-Sequenz der genannten Eco HBV DNA erhalten werden. Dabei werden die entsprechenden Restriktionsenzyme und die bekannten Trennverfahren für DNA-Fragmente angewendet, insbesondere in Polyacrylamidgelen, und es werden ihre unterschiedlichen Wanderungsstrecken ausgenutzt, die eine Funktion ihres Molekulargewichts sind. So kann man beispielsweise ein Fragment enthalten, von dem ein Ende durch eine EcoRI-Schnittstelle und das andere Ende durch eine AvaIII-Schnittstelle begrenzt ist, indem man eine Spaltung der Eco HBV DNA mit den Enzymen EcoRI und AvaIII durchführt, wobei das gesuchte Fragment das kleinere Fragment ist (eine einzige AvaIII-Schnittstelle in der Eco HBV DNA).
Das Fragment, das durch gegenüberliegende EcoRI- und HhaI-Enden begrenzt wird, wird durch Hydrolyse der Eco HBV DNA zunächst mit EcoRI und danach durch teilweise Hydrolyse mit dem Restriktionsenzym HhaI erhalten. Man gewinnt dann aus den Spaltungsprodukten dasjenige, das die AvaIII-Schnittstelle enthält.
Diese Spaltungsverfahren wurden natürlich nur als Beispiele vorgeschlagen, wobei klar ist, daß der Fachmann selbst die Reihenfolge der Behandlung mit den Restriktionsenzymen bestimmen kann, um insbesondere ausgehend von Eco HBV DNA die Fragmente zu isolieren, die wertvolle Restriktionsenden aufweisen.
Jedenfalls wird man sich erinnern, daß diese Spaltungsverfahren in einem Puffer durchgeführt werden können, der 10 mmol/l Tris vom pH-Wert 7,8, 6 mmol/l MgCl₂ und 6 mmol/l β-Mercaptoäthanol enthält. Der gleiche Puffer enthält außerdem vorzugsweise 50 mmol/l NaCl, wenn EcoRI benutzt wird.
Die beschriebenen DNA-Fragmente können auch als Reagens verwendet werden, das die Diagnose der Anwesenheit von Dane-Partikeln oder davon abgeleiteten Teilchen im Serum ermöglicht, welche eine DNA enthalten, die in der Lage ist, für ein für Hepatitis B charakteristisches immunogenes Protein zu kodieren.
Die DNA der Erfindung kann auch in einen Vektor eingebaut sein, der die Expression dieser DNA in einem Bakterium oder einem anderen Mikroorganismus oder in eukariotischen Zellen ermöglicht, wenn der Einbau in Phase durchgeführt wurde.
B. Vektoren, die eine Nucleotidsequenz des Antigens HBs enthalten Herstellung eines rekombinanten Bakteriophagen λlac HBs-1
Die Produkte der verschiedenen Stufen dieses Herstellungsverfahrens sind in den Fig. 1a bis 1h dargestellt. Sie sind auch mit den Zahlen 1a bis 1h bezeichnet.
In der Fig. 1a sind die Positionen des S-Gens und bestimmte Restriktionsenzym-Schnittstellen angegeben.
Nach der Behandlung der HBV-DNA mit dem Restriktionsenzym HhaI trennt man ein DNA-Fragment (1b), das 1084 Basenpaare und insbesondere das gesamte S-Gen enthält, durch Elektrophorese in Agarosegel und Elektroelution ab (Fig. 1b). Man bereitet, ausgehend von diesem Unterfragment, das vorher mit der Endonuclease S1 behandelt wurde, ein Unterfragment (1c) (Fig. 1c), das durch Verlängerung des Unterfragments (1b) an seinen Enden mit DNA-Elementen erhalten wird, welche als "EcoRI Linker" bezeichnet werden und folgende Formel aufweisen:
Das erhaltene Fragment wird nach Bildung von kohäsiven EcoRI-Enden in das Plasmid pBR322 kloniert.
Das erhaltene Plasmid, das nachstehend als pBRHBs (Fig. 1d) bezeichnet wird, enthält nur eine XbaI-Restriktionsstelle, die sich in der Nähe des Kopfes des Gens S befindet.
Durch Verdauung des rekombinierten Plasmids pBRHBs mit einem Enzymgemisch aus EcoRI und XbaI erhält man ein DNA-Fragment, das etwa 980 Basenpaare aufweist und den größeren Teil des S-Gens enthält (Fig. 1e). Dieses Fragment wird abgetrennt und durch Elektrophorese in Agarosegel gereinigt. Das erhaltene Fragment wird erneut mit Endonuclease S1 behandelt, danach wieder mittels der vorstehend erwähnten EcoRI-Linker mit EcoRI-Enden versehen und danach einer Behandlung mit der Endonuclease EcoRI unterzogen, um die entsprechenden kohäsiven Enden wieder zu erhalten. Das Fragment der Fig. 1e, das etwa 980 Basenpaare enthält, wird danach in vitro in die EcoRI-Schnittstelle des Plasmids pBR322 eingebaut, wobei das Plasmid pXbaHBs erhalten wird (Fig. 1f). Dieses Plasmid wird in üblicher Weise wie das Plasmid pBR322 kloniert.
Es wurden mehrere Klone erhalten. Nach der Behandlung der DNA's von drei dieser Klone, pXbaHBs-1, pXbaHBs-2 und pXbaHBs-3 (Fig. 1g), mit EcoRI werden die Fragmente, die nachstehend als "HBs-Fragmente" bezeichnet werden (Fig. 1h), extrahiert und gereinigt.
Die Nucleotidsequenzen der Enden der vorstehend bezeichneten Fragmente (die normalerweise im Inneren des S-Gens erhalten werden) werden unter Anwendung des von Maxam und Gilbert beschriebenen Verfahrens bestimmt (Proc. Nat. Acad. Sci. USA 74 [1977], S. 560 bis 564). Diese Bestimmungen haben ergeben, daß die Nucleotidsequenzen der terminalen Enden, die dem S-Gen entsprechen, in den drei Klonen nicht identisch sind (Fig. 1g), wobei die Unterschiede wahrscheinlich auf Heterogenitäten beruhen, die im Verlauf der Verdauung mit der Endonuclease S1 entstanden sind.
Die von pXbaHBs-1 und pXbaHBs-2 stammenden Fragmente werden durch Verknüpfung in vitro in das Genom des Bakteriophagen λplac 5-1 (21) eingebaut, welcher nur eine einzige EcoRI-Schnittstelle aufweist, die in der Nähe des Endes des lac Z-Gens liegt. Aufgrund des Leserahmens des lac Z-Gens, wie er aus der Aminosäuresequenz der β-Galactosidase abgeleitet werden kann (23), stellt man fest - und der Versuch wird es bestätigen -, daß der Einbau des HBs-Fragments von pXbaHBs-1 in die EcoRI-Schnittstelle des lac Z-Gens des λplac 5-1 zur Beibehaltung der zum S-Gen gehörenden Lesephase führen muß. Im Gegenteil müßte sich beim Einbau des HBs-Fragments von pXbaHBs-2 ergeben, daß es nicht unter Beibehaltung des richtigen Leserahmens in den vorstehend genannten Vektor eingebaut werden kann. Es wurde trotzdem zur Kontrolle in den folgenden Versuchen verwendet.
Diese Versuche wurden unter Verwendung bekannter Techniken durchgeführt. Insbesondere wurden die HBs-Fragmente von pXbaHBs-1 und pXbaHBs-2 mit Hilfe einer Ligase in die DNA von λplac 5-1 eingebaut, welche vorher mit EcoRI geschnitten wurde. Die Gemische der erhaltenen DNA-Fragmente wurden dann zur Transfektion des Stamms C600RecBC rk¯mk¯ von E. coli verwendet. Die Klone des Bakteriophagen, die infolge des Einbaus der HBs-Fragmente in die EcoRI-Schnittstelle des lac Z-Gens lac¯ geworden sind, werden vermehrt und nach dem in (21) beschriebenen Verfahren gereinigt.
Die DNA's von verschiedenen Bakteriophagen wurden extrahiert und die Orientierungen der eingebauten DNA-Fragmente durch elektrophoretische Analyse ihrer BamHI-Restriktionsfragmente bestimmt. Man kann so feststellen, daß zwei mit λlacHBs-1 und λlacHBs-2 bezeichnete Phagen, die den Plasmiden pXbaHBs-1 und pXbaHBs-2 entsprechen, ein HBs-Fragment in richtiger Orientierung enthalten.
Die Fig. 2a ist eine schematische Karte des Vektors λplac 5-1 vor seiner Modifizierung mit dem aus pXbaHBs-1 stammenden HBs-1.
Die Fig. 2c ist eine schematische Karte eines Teils des gleichen Vektors, welche die in seinem Z-Gen durch Einschub des oben erwähnten Fragments HBs-1 in seine EcoRI-Schnittstelle eingeführte Modifikation zeigt.
Die Fig. 2c zeigt schematisch die Struktur des als Ergebnis der Expression des modifizierten Vektors gemäß Fig. 2b erhaltenen Hybrid-Polypeptids.
Die Expression wurde durch Transfektion eines Bakterienstamms E. coli, insbesondere des Stammes HfrΔlacX74, erhalten.
E.-coli-Stämme, insbesondere ein Stamm E. coli HfrΔlacX74, wurden mit plac 5-1, λlacHBs-1 bzw. λlacHBs-2 transformiert. Nach der Kultivierung werden die Zellen lysiert, und die erhaltenen Lysate werden durch Elektrophorese auf Polyacrylamidgel SDS (24) analysiert. Die Proteine werden durch Anfärbung mit Coomassie-Blau aufgezeigt. Man findet eine stärkere Bande unter den Expressionsprodukten von λplac 5-1 auf Höhe der Position der β-Galactosidase (Molekulargewicht 116 248), welche als Marker benutzt wurde. Unter den Expressionsprodukten von λlacHBs-1 findet man eine andere Bande (nicht anwesend unter den Expressionsprodukten von λlacHBs-2), die einem neuen Protein mit einem Molekulargewicht in der Größenordnung von 135 000 bis 141 000 entspricht.
Die Proteine, die von den sowohl mit λlacHBs-1 als auch mit λplac 5-1 transformierten Bakterien synthetisiert worden sind, werden durch (³⁵S) Methionin markiert. Das Zusammenbringen dieser Proteine mit einem Anti-HBsAg-Serum und die Aufnahme eines Autoradiogramms eines SDS-Polyacrylamidgels zeigen nur unter den Expressionsprodukten von λlacHBs-1 die Anwesenheit einer Bande, der keine äquivalente Bande unter den Expressionsprodukten der anderen Vektoren entspricht. Diese Bande verschwindet in spezifischer Weise, wenn die Immunopräzipitation in Gegenwart von nicht markiertem HBsAg durchgeführt wird. Man beobachtet noch die gleiche Bande unter den Expressionsprodukten von λlacHBs-1, wenn die Immunopräzipitation mit einem Antiserum gegen die β-Galactosidase durchgeführt wird.
Die vermutete Struktur des Teils des erhaltenen Hybridproteins an der Verbindungsstelle zwischen dem lac Z-Gen und dem Fragment HBs-1 ergibt sich aus der Fig. 2c. Diese Figur zeigt das Fragment "β-gal", das der β-Galactosidase (1005 Aminosäuren) entspricht, und das Fragment HBsAg (192 Aminosäuren), wobei diese Fragmente durch eine Aminosäure Prolin getrennt sind, die einem Teil des "EcoRI Linker" entspricht, der im Vektor λlacHBs-1 enthalten ist.
C. Verfahren zur Herstellung eines immunogenen Moleküls unter Verwendung des Vektors der Erfindung
Die Erfindung kann deshalb die Herstellung eines Proteins mit geringerer molekularer Masse als die vorstehend erläuterten Polypeptide I oder II ermöglichen, das die gleichen immunogenen Eigenschaften aufweist.
Die Ergebnisse zeigen, daß E. coli oder jeder andere geeignete Mikroorganismus, wie Bakterien oder Kulturen von eukaryotischen Zellen, durch das λlacHBs-1 infiziert werden können und ein Protein mit einem Molekulargewicht in der Größenordnung von 138 000 synthetisieren können, welches die Antigen-Determinanten sowohl von HBsAg als auch von β-Galactosidase besitzt. Dieses Molekül ist repräsentativ für Hybrid-Polypeptide, die nach den Verfahren der Erfindung erhalten werden können, in dem HBsAg an ein Trägerprotein gebunden wird (das aus der teilweisen oder vollständigen Substitution des β-Galactosidase-Fragments stammt), wobei diese Hybride trotzdem die Antigeneigenschaften von HBsAg besitzen. Diese neuen Moleküle sind zur Herstellung von Arzneistoffen geeignet, die gegen die Virushepatitis B aktiv sind.
Wie sich von selbst versteht und wie bereits aus den vorstehenden Ausführungen hervorgeht, ist die Erfindung keinesfalls auf die Anwendungsformen und praktischen Ausführungen beschränkt, die genauer erläutert wurden; sie umfaßt im Gegenteil auch alle Variationen.
Im Anhang zu dieser Beschreibung erscheinen das Literaturverzeichnis und insbesondere die Literaturstellen, die im Rahmen der vorliegenden Beschreibung zitiert wurden.
Literaturverzeichnis
 1 - B. S. Blumberg, Science 197 (1977), S. 17-25
 2 - D. S. Dane, C. H. Cameron und M. Briggs, Lancet 1 (1970), S. 695-698
 3 - Who Technical Report series, Nr. 602 (1976)
 4 - J. Summers, A. O'Connel und I. Millman, Proc. Nat. Acad. Sci., USA 72 (1975), S. 4597-4601
 5 - J. F. Hruska, D. A. Clayton, J. L. R. Rubenstein und W. S. Robinson, J. Virol. 21 (1977), S. 666-682
 6 - T. A. Landers, H. B. Greenberg und W. S. Robinson, J. Virol. 23 (1977), S. 368-376
 7 - P. Charnay, C. Pourcel, A. Louise, A. Fritsch und P. Tiollais, Proc. Nat. Acad. Sci., USA 76 (1979), S. 2222-2226
 8 - G. R. Dreesman, F. B. Hollinger, J. R. Surians, R. B. Fujioka, J- P. Brunschwig und J. L. Melnick, J. Virol. 10 (1972), S. 469-476
 9 - J. L. Gerin (1974) in Mecanisms of virus disease; Herausgeber W. S. Robinson, C. R. Fox, S. 215-24, Menlo Park: W. A. Benjamin
10 - G. R. Dreesman, R. Chairez, M. Suarez, F. B. Hollinger, R. S. Courtney und J. L. Melnick, J. Virol. 16 (1975), S. 508-515
11 - J. W. Shih und J. L. Gerin, J. Virol. 21 (1977), S. 1219-1222
12 - D. L. Peterson, I. M. Roberts und G. N. Vyas, Proc. Nat. Acad. Sci., USA 74 (1977), S. 1530-1534
13 - D. L. Peterson, D. Y. Chien, G. N. Vyas, D. Nitecki und H. Bond (1978) in Viral Hepatitis, Herausgeber G. Vyas, S. Cohen und R. Schmid, The Franklin Institute Press, Philadelphia, S. 569-573
14 - A. Fritsch, C. Pourcel, P. Charnay und P. Tiollais, C. R. Acad. Sc., Paris 287 (1978), S. 1453-1456
15 - C. J. Burrell, P. Mackay, P. J. Greenaway, P. H. Hofschneider und K. Murray, Nature 279 (1979), S. 43-47
16 - P. Tiollais, M. Perricaudet, U. Pettersson und L. Philipson, Gène 1 (1976), S. 49-63
17 - J. H´riss´, G. Courtois und F. Galibert, Gène 4 (1978), S. 279-294
18 - W. D. Kroeker und M. S. R. Laskowski, Anal. Biochem. 79 (1977), S. 63-72
19 - A. M. Maxam und W. Gilbert, Proc. Nat. Acad. Sci., USA 74 (1977), S. 560-564
20 - F. Sanger, S. Nicklen und A. R. Coulson, Proc. Nat. Acad. Sci., USA 74 (1977), S. 5463-5467
21 - J. Maat und A. J. W. Smith, Nucleic Acid Res. 5 (1978), S. 4537-4545
22 - S. M. Berget, C. Moore und P. A. Sharp, Proc. Nat. acad. Sci., USA 74 (1977), S. 3171-3175
23 - L. T. Chow, R. E. Gelinas, T. R. Broker und J. Roberts, Cell 12 (1977), S. 1-8
24 - H. Shiraishi, T. Kohama, R. Shirachi und N. Ishida, J. Gen. Virol. 36 (1977), S. 207-210
25 - D. K. Struck, W. J. Lennarz und K. Brew, J. Biol. Chem. 253 (1978), S. 5786-5794
26 - V. B. Reddy, B. Thimmappaya, R. Char, K. N. Subramanian, B. S. Zain, J. Pan, C. L. Celma und S. M. Weissmann, Science 200 (1978), S. 494-502
27 - W. Fiers, R. Contreras, G. Hargeman, R. Rogiers, A. Van de Voorde, H. Van Henverswyn, J. Van Herreweghe, G. Volchaerts und M. Ysebaert, Nature 273 (1978), S. 113-117
28 - F. Sanger, G. M. Air, B. G. Barrell, N. L. Brown, A. R. Coulson, J. C. Fiddes, C. A. Hutchison III, P. M. Slocombe und M. Smith, Nature 265 (1977), S. 687-691
29 - B. G. Barrell, D. C. Shaw, J. E. Walker, F. D. Northrop, G. N. Godson und J. C. Fiddes, Biochem. Soc. Trans. 6 (1978), S. 63-67
30 - W. Szmuness, Am. J. Path. 81 (1975), S. 629-649
31 - J. J. Sninsky, A. Siddiqui, W. S. Robinson und S. N. Cohen, Nature 279 (1979), S. 346-348
32 - P. Valenzuela und Mitarb., Nature 280 (1979), S. 815-819
33 - P. Charnay und Mitarb., Nucl. Acids Res. 7 (1979), S. 335-346
34 - F. Galibert, E. Mandart, F. Fitoussi, P. Tiollais und P. Charnay, Nature 281 (1979), S. 646-650
35 - M. Pasek und Mitarb., Nature 282 (1979), S. 575-579
36 - G. N. Vyas, E. W. Williams, G. G. B. Klaus und H. Bond, J. Immunol. 108 (1972), S. 1114-1118
37 - F. B. Hollinger, G. R. Dreesman, Y. Sanchez, G. Cabral und J. L. Melnick in Viral Hepatitis (Herausgeber G. N. Vyas, S. N. Cohen und R. Schmid), Franklin Institute, Philadelphia (1978)
38 - R. H. Purcell und J. L. Gerin, Am. J. Med. Sci. 270 (1975), S. 395-399
39 - M. R. Hilleman und Mitarb., Am. J. Med. Sci. 270 (1975), S. 401-404
40 - P. Maupas, P. Coursaget, A. Goudeau und J. Drucker, Lancet 1 (1976), S. 1367-1370
41 - J. S. Emtage und Mitarb., Nature 283 (1980), S. 171-174
42 - K. Itakura und Mitarb., Science 198 (1977), S. 1056-1063
43 - D. V. Goeddel und Mitarb., Prox. Nat. Acad. Sci., USA 76 (1979), S. 106-110
44 - C. Pourcel, C. Marchal, A. Louise, A. Fritsch und P. Tiollais, Molec. Gen. Genet. 170 (1979), S. 161-169
45 - F. Bolivar und Mitarb. Gene 2 (1977), S. 95-113
46 - A. V. Fowler und I. Zabin, Proc. Nat. Acad. Sci., USA 74 (1977), S. 1507-1510
47 - U. K. Laemmli, Nature 227 (1970), S. 680-685
48 - R. R. Burgess, J. Biol. Chem., 244 (1969), S. 6168-6176
49 - W. M. Bonner und R. A. Laskey, Eur. J. Biochem. 46 (1974), S. 83-88
50 - R. A. Laskey und A. D. Mills, Eur. J. Biochem. 56 (1975), S. 335-341
51 - Y. Iwakura, K. Ito und A. Ishihama, Molec. Gen. Genet. 133 (1974), S. 1-23
52 - G. P. Talwai und Mitarb., Proc. Nat. Acad. Sci., USA 73 (1976), S. 218-222

Claims (22)

1. Vektor, der eine Nucleinsäure-Insertion mit den folgenden Merkmalen aufweist:
  • a) sie hat eine Länge von mindestens etwa 100 bis 1100 Nucleotiden;
  • b) sie codiert ein immunogenes Peptid, das die in-vivo-Bildung von Antikörpern induzieren kann, die aktiv gegen das Hepatitis-B-Virus sind, und das die in den Fig. 3A, 3B und 3C dargestellte Aminosäuresequenz aufweist; und
  • c) das codierte Peptid enthält die Aminosäuresequenz Alanin (N-terminal)-Glutamin-Glycin-Threonin-Serin (C-terminal);
wobei die Nucleinsäure-Insertion so in den Vektor eingebaut ist, daß die Ablesephase eine Expression des codierten Peptids gestattet und sie in einem transformierten Mikroorganismus oder einer eukaryontischen Zelle exprimierbar ist, wobei die genannten Figuren Bestandteil dieses Anspruchs sind.
2. Vektor nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß seine Nucleinsäure-Insertion eine Nucleotidsequenz enthält, die in den Fig. 4A und 4B dargestellt ist und ein Peptid mit der in Fig. 5 dargestellten Aminosäuresequenz codiert, wobei die genannten Figuren Bestandteil dieses Anspruchs sind.
3. Vektor nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß seine Nucleinsäure-Insertion eine Nucleotidsequenz enthält, die ein Peptid mit der in Fig. 6 dargestellten Aminosäuresequenz codiert, wobei die Fig. 6 Bestandteil dieses Anspruchs ist.
4. Vektor nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß das codierte Peptid die Aminosäuresequenz Threonin (N-terminal)-Alanin-Glutamin-Glycin-Threonin-Serin (C-terminal) enthält.
5. Vektor nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß das codierte Peptid die Aminosäuresequenz Threonin (N-terminal)-Threonin-Alanin-Glutamin-Glycin-Threonin-Serin (C-terminal) enthält.
6. Vektor nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß die Nucleinsäure-Insertion mindestens einen der beiden in den Fig. 4A und 4B dargestellten komplementären Stränge einer DNA-Sequenz enthält oder einen Strang, der mit den vorstehenden Strängen hybridisiert, wobei die genannten Figuren Bestandteil dieses Anspruchs sind.
7. Vektor nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß die Nucleinsäure-Insertion mindestens einen der beiden in den Fig. 3A, 3B und 3C dargestellten komplementären Stränge einer DNA-Sequenz enthält oder einen Strang, der mit den vorstehenden Strängen hybridisiert, wobei die genannten Figuren Bestandteil dieses Anspruchs sind.
8. Vektor nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß die Nucleinsäure-Insertion doppelsträngig ist und an einem ihrer Enden durch eine HincII-, HhaI-, AvaI- oder EcoRI-Spaltstelle und am anderen Ende durch eine AvaIII-, HincII- oder HhaI-Spaltstelle begrenzt ist.
9. Vektor nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Nucleinsäure-Insertion die Sequenz 5′ GCT CAA GGA ACC TCT 3′,die zu dieser Sequenz komplementäre Sequenz oder eine Sequenz enthält, in der mindestens eines der genannten Tripletts durch ein anderes Triplett ersetzt ist, das dieselbe Aminosäure codiert.
10. Vektor nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß die Nucleinsäure-Insertion die Sequenz 5′ ACT GCT CAA GGA ACC TCT 3′,die zu dieser Sequenz komplementäre Sequenz oder eine Sequenz enthält, in der mindestens eines der genannten Tripletts durch ein anderes Triplett ersetzt ist, das dieselbe Aminosäure codiert.
11. Vektor nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß die Nucleinsäure-Insertion die Sequenz 5′ ACT ACT GCT CAA GGA ACC TCT 3′,die zu dieser Sequenz komplementäre Sequenz oder eine Sequenz enthält, in der mindestens eines der genannten Tripletts durch ein anderes Triplett ersetzt ist, das dieselbe Aminosäure codiert.
12. Vektor nach einem der Ansprüche 1 bis 11, vorzugsweise vom Typ der Phagen oder Plasmide, der ferner mindestens einen Teil des Lactose-Operons, insbesondere den Promotor und das Z-Gen dieses Operons enthält, wobei die Nucleinsäure-Insertion in eine Spaltstelle im Z-Gen, beispielsweise in die EcoRI-Spaltstelle erfolgt ist, wobei diese Spaltstelle für den phasengerechten Einbau geeignet ist.
13. Vektor nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß mindestens ein Teil des DNA-Fragments, das für den größeren Teil der β-Galactose codiert, durch ein DNA-Fragment ersetzt ist, das irgendein anderes Trägermolekül codiert, das nicht immunogen ist oder dessen mögliche immunologischen Eigenschaften, falls solche existieren, nicht diejenigen des Peptidteils beeinflussen, der die immunologischen Eigenschaften des HBsAg aufweist.
14. Vektor nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß das genannte ersetzende DNA-Fragment sich in Leserichtung von der HhaI-Spaltstelle weg erstreckt, die vorher in dem für den größeren Teil der β-Galactosidase codierenden DNA-Fragment enthalten war.
15. Vektor nach einem der Ansprüche 1 bis 14, dadurch gekennzeichnet, daß er vom Plasmid pBR322 abgeleitet ist.
16. Vektor nach einem der Ansprüche 1 bis 15, dadurch gekennzeichnet, daß die eingebaute Nucleinsäure-Insertion durch EcoRI-Spaltstellen begrenzt ist und das HhaI/XbaI-Fragment aus dem Genom des Hepatitis-B-Virus enthält, das den größeren Teil des S-Gens aufweist.
17. Verwendung eines Vektors nach einem der Ansprüche 1 bis 16 in einem durch diesen Vektor transformierbaren Mikroorganismus oder einer transformierbaren eukaryontischen Zelle zur Herstellung eines Peptids oder Hybridproteins, das eine durch die Nucleinsäure-Insertion kodierte Peptidsequenz enthält.
18. Peptid, dadurch gekennzeichnet, daß es eine durch eine Nucleinsäure-Insertion eines Vektors nach einem der Ansprüche 1 bis 16 codierte Aminosäuresequenz enthält.
19. Hybridprotein, dadurch gekennzeichnet, daß es von einem Vektor nach einem der Ansprüche 1 bis 16 codiert wird.
20. Arzneimittel, insbesondere Impfstoff gegen Hepatitis B oder Reagens für die Diagnose von Hepatitis B, enthaltend im Gemisch mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger ein Peptid nach Anspruch 18, das gegebenenfalls an ein Trägermolekül gebunden ist, vorzugsweise an ein Polypeptid oder ein Protein.
21. Impfstoff enthaltend als Wirkstoff ein Hybridprotein nach Anspruch 19.
DE19803049831 1979-08-30 1980-08-29 Vektoren enthaltend eine f}r das Oberfl{chenantigen des Hepatites B-Virus kodierende Nucleotidsequenz, Verwendung dieser Vektoren zur Herstellung von Peptiden, Impfstoffe enhaltend dabei erhaltende Peptide als Antigen Expired - Lifetime DE3049831C2 (de)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
FR7921811A FR2464269B1 (fr) 1979-08-30 1979-08-30 Sequence nucleotidique codant l'antigene de surface du virus de l'hepatite b, procede permettant son obtention et antigene obtenu
FR8009039A FR2480779B2 (fr) 1979-08-30 1980-04-22 Vecteur contenant une sequence nucleotidique de l'antigene de surface du virus de l'hepatite b et procede de fabrication d'une molecule immunogene mettant en oeuvre ce vecteur

Publications (2)

Publication Number Publication Date
DE3049831T1 DE3049831T1 (de) 1982-06-16
DE3049831C2 true DE3049831C2 (de) 1992-08-27

Family

ID=26221334

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
DE19803049831 Expired - Lifetime DE3049831C2 (de) 1979-08-30 1980-08-29 Vektoren enthaltend eine f}r das Oberfl{chenantigen des Hepatites B-Virus kodierende Nucleotidsequenz, Verwendung dieser Vektoren zur Herstellung von Peptiden, Impfstoffe enhaltend dabei erhaltende Peptide als Antigen

Country Status (12)

Country Link
US (1) US4428941A (de)
JP (1) JPS6362198B2 (de)
BE (1) BE884988A (de)
CA (1) CA1163585A (de)
CH (1) CH663796A5 (de)
DE (1) DE3049831C2 (de)
FR (1) FR2480779B2 (de)
GB (1) GB2070621B (de)
LU (1) LU88365I2 (de)
NL (1) NL192880C (de)
SE (3) SE8102726L (de)
WO (1) WO1981000577A1 (de)

Families Citing this family (76)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6416996B1 (en) * 1978-12-18 2002-07-09 Institut Pasteur Nucleotide sequence comprising the genome of hepatitis b virus, nucleotide sequence coding the surface antigen of the hepatitis b virus, vectors containing the nucleotide sequences, process for the preparation thereof, and antigen obtained thereby
US6297355B1 (en) 1978-12-22 2001-10-02 Biogen, Inc. Polypeptides displaying HBV antigenicity or hbv antigen specificity
NO794196L (no) * 1978-12-22 1980-06-24 Biogen Nv Fremgangsmaate ved fremstilling av et rekombinert dna molekyl
EP0182442B2 (de) * 1978-12-22 1996-04-03 Biogen, Inc. Rekombinante DNS-Moleküle und Verfahren zur Herstellung derselben
US5196194A (en) * 1979-05-24 1993-03-23 The Regents Of The University Of California Vaccines containing Hepatitis B S-protein
IE52036B1 (en) * 1979-05-24 1987-05-27 Univ California Non-passageable viruses
USRE34705E (en) * 1979-08-30 1994-08-23 Institut Pasteur Nucleotidic sequence coding the surface antigen of the hepatitis B virus, vector containing said nucleotidic sequence, process allowing the obtention thereof and antigen obtained thereby
DE3176404D1 (en) * 1980-04-22 1987-10-08 Pasteur Institut Vaccine against viral hepatitis b, method and transformed eucaryotic cells for the preparation of this vaccine
NZ199722A (en) * 1981-02-25 1985-12-13 Genentech Inc Dna transfer vector for expression of exogenous polypeptide in yeast;transformed yeast strain
US4769238A (en) 1981-08-04 1988-09-06 The Regents Of The University Of California Synthesis of human virus antigens by yeast
ZW18282A1 (en) * 1981-08-31 1983-03-23 Genentech Inc Preparation of polypeptides in vertebrate cell culture
US4741901A (en) * 1981-12-03 1988-05-03 Genentech, Inc. Preparation of polypeptides in vertebrate cell culture
DE3275998D1 (en) * 1981-12-22 1987-05-14 Baylor College Medicine Immunological composition and method for hepatitis b virus
US4593002A (en) * 1982-01-11 1986-06-03 Salk Institute Biotechnology/Industrial Associates, Inc. Viruses with recombinant surface proteins
JPS5931799A (ja) * 1982-08-16 1984-02-20 Science & Tech Agency Ｂ型肝炎ウイルス遺伝子を組込んだ組換えプラスミド
US4820642A (en) * 1983-04-04 1989-04-11 The Regents Of The University Of California Amplified expression vector
US4575495A (en) * 1983-05-12 1986-03-11 New York Blood Center, Inc. Synthetic antigenic peptide derived from Hepatitis B surface antigen
US5324513A (en) * 1984-03-07 1994-06-28 Institut Pasteur Composition useful for the fabrication of vaccines
US4847080A (en) * 1984-03-07 1989-07-11 New York Blood Center, Inc. Pre-S gene coded peptide hepatitis B immunogens, vaccines, diagnostics, and synthetic lipide vesicle carriers
US4861588A (en) * 1985-02-05 1989-08-29 New York Blood Center, Inc. Pre-S gene coded peptide hepatitis B immunogens, vaccines, diagnostics, and synthetic lipid vesicle carriers
US5204096A (en) * 1984-03-07 1993-04-20 New York Blood Center, Inc. Pre-S gene coded peptide hepatitis B immunogens, vaccines, diagnostics, and synthetic lipid vesicle carriers
US4599231A (en) * 1984-03-09 1986-07-08 Scripps Clinic And Research Foundation Synthetic hepatitis B virus vaccine including both T cell and B cell determinants
WO1985004103A1 (en) * 1984-03-09 1985-09-26 Scripps Clinic And Research Foundation Synthetic hepatitis b virus vaccine including both t cell anc b cell determinants
US4599230A (en) * 1984-03-09 1986-07-08 Scripps Clinic And Research Foundation Synthetic hepatitis B virus vaccine including both T cell and B cell determinants
SU1470739A1 (ru) * 1984-07-16 1989-04-07 Всесоюзный кардиологический научный центр АМН СССР Гексапептид, обладающий гепатопротективным действием
US4743553A (en) * 1984-07-18 1988-05-10 W. R. Grace & Co. Synthetic genes for bovine parainfluenza virus
US4722840A (en) * 1984-09-12 1988-02-02 Chiron Corporation Hybrid particle immunogens
JPH0745514B2 (ja) * 1985-08-20 1995-05-17 武田薬品工業株式会社 新規蛋白質およびその製造法
US4895800A (en) * 1985-11-26 1990-01-23 Phillips Petroleum Company Yeast production of hepatitis B surface antigen
JPH01500515A (ja) * 1986-06-20 1989-02-23 スクリップス　クリニック　アンド　リサーチ　ファウンデーション Ｂ型肝炎ウィルス表面抗原のプレｓ領域のｔ及びｂ細胞エピトープ
US4778784A (en) * 1987-01-07 1988-10-18 Baylor College Of Medicine Cyclic peptide and method of use for inducing an immunological response to hepatitis B virus
DE10299017I2 (de) 1987-06-22 2005-05-25 Medeva Holdings Bv Hepatitis-B-Oberfl{chenantigen enthaltendes Peptid.
US5162226A (en) 1987-08-24 1992-11-10 University Of Tennessee Research Corp. (U.T.R.C.) Therapeutic compositions against streptococcal infections, transformed hosts, methods of immunization and genetically engineered products
US5359100A (en) * 1987-10-15 1994-10-25 Chiron Corporation Bifunctional blocked phosphoramidites useful in making nucleic acid mutimers
WO1990002762A1 (en) 1988-09-02 1990-03-22 The Rockefeller University Macrophage-derived inflammatory mediator (mip-2)
JP3156200B2 (ja) * 1989-09-15 2001-04-16 国立予防衛生研究所長 新規のｈｃｖ分離株
EP0491077A1 (de) * 1990-12-19 1992-06-24 Medeva Holdings B.V. Zusammensetzung verwendbar als therapeutisches Mittel gegen chronische virale Leberkrankheiten
US5484719A (en) 1991-08-26 1996-01-16 Edible Vaccines, Inc. Vaccines produced and administered through edible plants
US6322789B1 (en) * 1991-08-26 2001-11-27 Epimmune, Inc. HLA-restricted hepatitis B virus CTL epitopes
US6607727B1 (en) * 1991-08-26 2003-08-19 The Scripps Research Institute Peptides for inducing cytotoxic T lymphocyte responses to hepatitus B virus
US6419931B1 (en) 1991-08-26 2002-07-16 Epimmune Inc. Compositions and methods for eliciting CTL immunity
US5612487A (en) * 1991-08-26 1997-03-18 Edible Vaccines, Inc. Anti-viral vaccines expressed in plants
US5780036A (en) * 1991-08-26 1998-07-14 The Scripps Research Institute Peptides for inducing cytotoxic T lymphocyte responses to hepattis B virus
US20010053367A1 (en) * 1991-08-26 2001-12-20 Prodigene, Inc. Vaccines expressed in plants
US20110097352A9 (en) * 1992-01-29 2011-04-28 Pharmexa Inc. Inducing cellular immune responses to hepatitis B virus using peptide and nucleic acid compositions
US7611713B2 (en) * 1993-03-05 2009-11-03 Pharmexa Inc. Inducing cellular immune responses to hepatitis B virus using peptide compositions
US6689363B1 (en) 1992-01-29 2004-02-10 Epimmune Inc. Inducing cellular immune responses to hepatitis B virus using peptide and nucleic acid compositions
US6235288B1 (en) * 1992-08-26 2001-05-22 The Scripps Research Institute Peptides for inducing cytotoxic T lymphocyte responses to hepatitis B virus
WO1994020079A1 (en) 1993-03-10 1994-09-15 Smithkline Beecham Corporation Human brain phosphodiesterase
AU6976296A (en) * 1995-09-15 1997-04-01 John A Howard Expression cassettes and methods for delivery of animal vaccines
US6087128A (en) * 1998-02-12 2000-07-11 Ndsu Research Foundation DNA encoding an avian E. coli iss
WO2002080848A2 (en) * 2001-04-09 2002-10-17 Mayo Foundation For Medical Education And Research Methods and materials for cancer treatment
US8029803B2 (en) 2002-06-20 2011-10-04 Paladin Labs, Inc. Chimeric antigens for eliciting an immune response
US8025873B2 (en) 2002-06-20 2011-09-27 Paladin Labs, Inc. Chimeric antigens for eliciting an immune response
US20040057969A1 (en) * 2002-09-20 2004-03-25 Smith Mark L Compositions containing stabilized hepatitis antigen and methods of their use
US8007805B2 (en) * 2003-08-08 2011-08-30 Paladin Labs, Inc. Chimeric antigens for breaking host tolerance to foreign antigens
US20090238822A1 (en) * 2005-10-13 2009-09-24 Virexx Medical Corp. Chimeric Hepatitis C Virus Antigens For Eliciting an Immune Response
US8969033B2 (en) 2005-11-02 2015-03-03 Battelle Energy Alliance, Llc Alteration and modulation of protein activity by varying post-translational modification
JP4685674B2 (ja) * 2006-03-20 2011-05-18 株式会社東海理化電機製作所 ウエビング巻取装置
US9732330B2 (en) 2008-01-25 2017-08-15 Battelle Energy Alliance, Llc Methods of combined bioprocessing and related microorganisms, thermophilic and/or acidophilic enzymes, and nucleic acids encoding said enzymes
WO2009094187A1 (en) 2008-01-25 2009-07-30 Battelle Energy Alliance, Llc Thermal and acid tolerant beta-xylosidases, genes encoding, related organisms, and methods
US8492114B2 (en) 2008-01-25 2013-07-23 Battelle Energy Alliance, Llc Methods of combined bioprocessing and related microorganisms, thermophilic and/or acidophilic enzymes, and nucleic acids encoding said enzymes
US8557557B2 (en) 2008-01-31 2013-10-15 Battelle Energy Alliance, Llc Thermophilic and thermoacidophilic biopolymer-degrading genes and enzymes from Alicyclobacillus acidocaldarius and related organisms, methods
US8426185B2 (en) 2008-01-31 2013-04-23 Battelle Energy Alliance, Llc Thermophilic and thermoacidophilic biopolymer-degrading genes and enzymes from Alicyclobacillus acidocaldarius and related organisms, methods
JP2011510657A (ja) 2008-01-31 2011-04-07 バテル エナジー アライアンス，エルエルシー アリサイクロバチルス・アシドカルダリウスおよび関連生物体に由来する好熱性および好熱好酸性バイオポリマー分解遺伝子および酵素、方法
US8497110B2 (en) 2008-01-31 2013-07-30 Battelle Energy Alliance, Llc Thermophilic and thermoacidophilic biopolymer-degrading genes and enzymes from alicyclobacillus acidocaldarius and related organisms, methods
WO2009137145A2 (en) 2008-02-22 2009-11-12 Battelle Energy Alliance, Llc Transcriptional control in alicyclobacillus acidocaldarius and associated genes, proteins, and methods
CA2712101A1 (en) 2008-02-26 2009-12-03 Battelle Energy Alliance, Llc Thermophilic and thermoacidophilic sugar transporter genes and enzymes from alicyclobacillus acidocaldarius and related organisms, methods
CN102046802A (zh) 2008-02-27 2011-05-04 巴特勒能源同盟有限公司 来自酸热脂环酸杆菌的嗜热的与嗜热嗜酸的糖基化基因和酶以及相关生物、方法
AU2009251767A1 (en) 2008-02-28 2009-12-03 Battelle Energy Alliance, Llc Thermophilic and thermoacidophilic metabolism genes and enzymes from Alicyclobacillus acidocaldarius and related organisms
US8858952B2 (en) 2009-02-19 2014-10-14 Mayo Foundation For Medical Education And Research Methods and materials for generating T cells
EP2409155A1 (de) 2009-03-15 2012-01-25 Technion Research and Development Foundation, Ltd. Lösliche hla-komplexe zur verwendung bei der krankheitsdiagnose
US20110275135A1 (en) 2010-05-05 2011-11-10 Battelle Energy Alliance, Llc Genetic elements, proteins, and associated methods including application of additional genetic information to gram (+) thermoacidophiles
AU2013221309B2 (en) 2012-02-17 2017-03-30 Mayo Foundation For Medical Education And Research Methods and materials for generating CD8+ T cells having the ability to recognize cancer cells expressing a HER2/neu polypeptide
EP3211002B1 (de) 2012-03-21 2020-05-13 Ben-Gurion University of The Negev Npk44 ectodomäne abgeleitete peptide
CA3149557A1 (en) 2019-09-30 2021-04-08 Scott J. Balsitis Hbv vaccines and methods treating hbv

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
YU257278A (en) * 1977-11-08 1984-02-29 Genentech Inc Process for obtaining a recombinat clone carrier
FR2422685A1 (fr) * 1978-04-14 1979-11-09 Pasteur Institut Vecteurs, derives du bacteriophage lambda, permettant l'insertion et l'expression d'un gene, procaryote ou eucaryote, sous le controle du promoteur et de l'operateur de l'operon lactose de la bacterie escherichia coli
FR2428075A1 (fr) * 1978-06-08 1980-01-04 Pasteur Institut Procede de production de proteines par expression des genes correspondants dans des bacteries et vecteurs susceptibles d'etre mis en oeuvre dans de tels procedes
FR2444713A1 (fr) * 1978-12-18 1980-07-18 Pasteur Institut Procede de production d'un adn comprenant le genome du virus de l'hepatite b et vecteur le comportant
NO794196L (no) * 1978-12-22 1980-06-24 Biogen Nv Fremgangsmaate ved fremstilling av et rekombinert dna molekyl
IE52036B1 (en) * 1979-05-24 1987-05-27 Univ California Non-passageable viruses

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
NICHTS ERMITTELT *

Also Published As

Publication number Publication date
JPS6362198B2 (de) 1988-12-01
WO1981000577A1 (fr) 1981-03-05
SE460727B (sv) 1989-11-13
CA1163585A (fr) 1984-03-13
CH663796A5 (fr) 1988-01-15
DE3049831T1 (de) 1982-06-16
US4428941A (en) 1984-01-31
JPS56501128A (de) 1981-08-13
FR2480779B2 (fr) 1986-07-18
SE8303463D0 (sv) 1983-06-16
BE884988A (fr) 1981-03-02
GB2070621B (en) 1983-05-18
SE462530B (sv) 1990-07-09
GB2070621A (en) 1981-09-09
SE463459B (sv) 1990-11-26
SE8102726L (sv) 1981-04-29
NL8020315A (nl) 1981-07-01
LU88365I2 (fr) 1994-05-04
FR2480779A2 (fr) 1981-10-23
NL192880C (nl) 1998-04-02
NL192880B (nl) 1997-12-01
SE8303463L (sv) 1983-06-16

Similar Documents

Publication Publication Date Title
DE3049831C2 (de) Vektoren enthaltend eine f}r das Oberfl{chenantigen des Hepatites B-Virus kodierende Nucleotidsequenz, Verwendung dieser Vektoren zur Herstellung von Peptiden, Impfstoffe enhaltend dabei erhaltende Peptide als Antigen
DE3788902T3 (de) Hepatitis-Delta-Diagnostika und Impfstoffe, ihre Herstellung und Verwendung.
DE3072205T2 (de) Dns-transfer-vektor, damit transformierter wirt, impfstoff und ihre herstellung.
DE2950995C2 (de)
DD147855A5 (de) Verfahren zur erzeugung mindestens eines hbv-antigenwirkung aufweisenden polypeptids
DE3789399T2 (de) Herstellung von Vakkzinen gegen Hepatitis B-Virus.
DE68910354T2 (de) Menschliches mutantes Angiogenin (Angiogenese-Faktor mit überlegener Angiogenin-Aktivität), Gene dafür und Methode zur Expression.
DD212748A5 (de) Verfahren zur bildung doppelstraengiger, hybride human-leukozyten-interferone kodierender dns
DD285612A5 (de) Verfahren zur herstellung eines hiv-impfstoffes
CH663032A5 (de) Doppelstraengige dna, replizierbare plasmidische expressionstraeger zur mikrobiellen herstellung von hybrid human-leukozyten-interferon und transformierte mikroorganismen.
DE3687769T2 (de) Vakzine und diagnostika, die vom bovine-diarrhea-virus stammen.
DD219505A5 (de) Verfahren zur herstellung von schweine-wachstumshormonaehnlichen polypeptiden
DE3641040C2 (de)
WO1988006184A1 (en) Viral antigen, process for its production, and application in diagnosis and therapy (vaccine)
DE3382704T2 (de) Rekombinante DNS-Moleküle die Hepatitis-B-Oberflächenantigen kodieren, deren Herstellung und abgeleitete Vakzine.
DE3650319T2 (de) Klonierung und expression von wirtsschützenden immunogenen des infektioesen bursavirus (ibdv).
DD160279A5 (de) Verfahren zur herstellung eines die spezifitaet von mks-virus-antigenen aufweisenden polypeptits
DE69122098T2 (de) Methoden zur verhinderung von viralen replikationen
DE3688924T2 (de) Synthetisches Schutzpeptid gegen Malaria und Kodierendes Gen.
DE3137300A1 (de) Zur expression von proteinen von maul- und klauen-seuchen-viren geeignetes dna-molekuel, verfahren zu seiner herstellung und seine verwendung zur erzeugung von proteinen und impfstoffen
EP0180012A1 (de) Immunogene Polypeptidsequenz des Hepatitis B-Virus
DE69217614T2 (de) Hybride, lösliche und nicht gespaltene gp160-variante
EP0284791B1 (de) DNA- und RNA-Moleküle des westlichen Subtyps des FSME-Virus, Polypeptide, die von diesen Molekülen codiert werden, und deren Verwendung
WO1992011370A2 (de) Von proteinen des hepatitis c-virus abgeleitete polypeptide und deren verwendung
US6096879A (en) Nucleotide sequence comprising the genome of hepatitis B virus, nucleotide sequence coding the surface antigen of the hepatitis B virus, vectors containing the nucleotide sequences, process for the preparation thereof, and antigen obtained thereby