DD160279A5 - Verfahren zur herstellung eines die spezifitaet von mks-virus-antigenen aufweisenden polypeptits - Google Patents

Abstract

Die Erfindung bezieht sich auf die Herstellung von Polypeptiden mit der Spezifitaet von Antigenen gegen Maul- und Klauenseuchenviren (FMDV). Die Erfindung ermoeglicht die Erzeugung von wirksamen Virus-Antigenen gegen FMDV, ohne dass grosse Mengen Viren gezuechtet, Proteine von den Viren gereinigt oder die Viren inaktiviert oder abgeschwaecht werden muessen. Erfindungsgemaess wird in ein Cloningvehigel eine DNA-Sequenz aus der Gruppe FMDV-715; FMDV-144; FMDV-1034; FMDV-1448; FMDV-1824 oder FMDV-1933, die zumindest fuer ein FMDV-Antigenwirkung aufweisendes Polypeptid kodiert und zusaetzlich eine Expressions-Kontroll-Sequenz eingefuegt, wobei die Kontroll-Sequenz so eingefuegt wird, dass sie die Expression der DNA-Sequenz kontrolliert und reguliert.

Description

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Verfahren zur Herstellung von Polypeptiden

Anwendungsgebiet der Erfindung:

Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Herstellung von Polypeptiden mit der Spezifität von Virus« Antigenen gegen Maul- und Klauenseuche (FMD), die in einem geeigneten Wirtsorganismus verwirklicht werden. Wie aus der folgenden Beschreibung hervorgeht, wird die Erfindung für die Erzeugung antigenischer Polypeptide eingesetzt, die sich als nützlich in Zusammensetzungen und bei Methoden erwiesen haben, durch die Tiere zumindest eine Zeit lang resistent gegenüber PMDV gemacht werden können.

Charakteristik der bekannten technischen Lösungen;

Der PMD-Virus ist ein Picornavirus, der Paarzeher befällt. Es ist dies eine der infektiösesten und am leichtesten zu übertragenden Krankheiten bei Viehbeständen. Die Krankheit ist allgemein durch Vesiculärläsionßn an den Püßen und am Maul des infizierten Tieres gekennzeichnet. Durch eine Verschlechterung des körperlichen Zustandes wird die Produktion an tierischen Produkten im allgemeinen um 25 % verringert. PMDV-Seuchen führen zu großen wirtschaftlichen Verlusten in der Produktion und dem Angebot an Fleisch, Molkereiprodukten, Wolle, Häuten und anderen Dingen. Beispielsweise gingen bei der Seuche in Großbritannien im Jahre 1967-68 fast 500 000 infizierte Rinder,

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Schafe und Ziegen im Laufe der Krankheitsbekämpfung ein.

Es gibt sieben bestimmte Serotypen des FMD-Virus. Das sind die europäischen oder klassischen Typen O¹, A'und C, die Typen des südafrikanischen Territoriums SAT1, SAT2 und SAT3 und der asiatische Typ I. Siehe K.J.H· Robson, u.a., "An Assessment By Competition Hybridization Of The Sequence Homology Between The RKAs Of The Seven Serotypes Of FMDV" (Einschätzung der Sequenzhomologie durch Konkurrenz-Hybridisierung zwischen den RNAn der sieben Serotypen von FMDV), J. Gen. Virol., 37, S. 271 - 276 _;; (1977)· Die Typen 0, A und C wurden in Buropa, Südamerika, Asien , und im nördlichen Teil von Afrika gefunden, aber das Gebiet ' ί dehnt sich weiter aus. Die drei Typen des südafrikanischen Territoriums wurden zuerst in Südafrika entdeckt, aber auch da breitet sich dieser Krankheitstyp in andere geographische Regionen aus. Der asiatische Typ tritt in den Ländern Asiens vom östlichen Mittelmeer bis zum Fernen Osten auf.Jeder derartige Serotyp kann serologisch in verschiedene Untertypen unterteilt werden.

Impfstoffe zum Schütze von Tieren gegen FMDV stehen zur Verfügung. Am häufigsten bestehen diese Impfstoffe aus inaktivierten oder abgeschwächten ganzen Viren. Sie werden nach bekannten Plänen und Bedingungen auf einer jährlichen oder manchmal vierteljährlichen Basis verabreicht. Da die sieben Virustypen fehlende KreuzImmunität zeigen (Robson, u.a., supra) und die verschiedenen Gebiete der Welt ein unterschiedliches Spektrum von Virustypen aufweisen, wird die Vakzination manchmal mit einem bivalenten oder trivalenten Material ausgeführt. Aber das ist nicht immer erforderlich oder ratsam.

Die Produktion von FMD-Ganz-Virus-Vakzinen ist mit verschiedenen Problemen verbunden. Erstens muß die Züchtung von Viren für

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Impfstoffe wegen des infektiösen Charakters des Virus im Laboratorium in isolierten Einrichtungen unter guter Abschirmung durchgeführt werden. Zweitens zeigen die auf Viren basierenden Impfstoffe häufig eine unannehmbare Veränderung in der Potenz nach der Herstellung und Inaktivierung. Drittens müssen Vakzine unter sehr genau kontrollierten Bedingungen getestet werden, um einen genauen Grad der Abschwächung oder Inaktivierung zu gewährleisten. Andernfalls könnten Impfstoffe versehentlich eine aktive Infektion oder einen subakuten Krankheitsverlauf bei den behandelten Tieren hervorrufen. Alle diese Produktionsprobleme führen zu einem höheren Preis des fertigen Impfstoffes. Neben den oben angeführten Produktionsproblemen resultiert die Anwendung von Ganz-Virus-Vakzinen zu einigen, aber doch signifikanten allergischen Nebenwirkungen bei den behandelten Tieren. Diese unerwünschten Nebenwirkungen werden vermutlich durch die vielen irrelevanten antigenischen Determinanten der Virus- und Nicht-Virus-Proteine, die gewöhnlich die Virusvakzine verunreinigen, hervorgerufen.

Eine Möglichkeit für die Ausschaltung der bei der Produktion und Anwendung von Ganz-Virus-Vakzinen auftretenden Probleme ist die Verwendung von Virus-Subeinheits-Impfstoffen, die die Capsid-Proteine des EMD-Virus enthalten. Siehe US-PS 4.140.762» H.L. Bachrach, u.a., "An Experimental Protein Vaccine for Footand-Mouth Disease¹¹ (Ein Versuchs-Protein-Vakzin für die Maul- und Klauenseuche) in Perspectives in Virology (Herausgeber M. Pollard), Bd. 10, Kap. 10, S. 147 - 159 (1978).

Der !E¹MD-ViTUS enthält hauptsächlich vier Capsidproteine, die als VP1, VP2, VP3 und VP4 bezeichnet werden. Die Capsidproteine des FMD-Virus schützen gemeinsam den Kern von Vixus-Ribonucleinsäure ("BNA") gegenüber verschiedenen Inaktivierungsmitteln. Das neutralisierende Antigen von 5¹MDV scheint in das VPI-PoIypeptid eingebettet zu sein (VP5 in der Terminologie der Vereinigten Staaten) (H.L. Bachrach, u.a., "An Experimental Subunit

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Vaccine For Foot-And-Mouth Disease" (Ein experimenteller Subeinheits-Impfstoff für Maul- und Klauenseuche), International Symposium On Foot-And-Mouth Disease. Lyon 1976« Develop« Biol. Standard, 35, S. 155 - 160 (S. Karger» Basel 1977))^x)* (^Außerdem scheint der antigenische Teil'die'ses Proteins in dem letzten 1/3 des Proteins vorhanden zu sein, d.h. ganz in der Nähe seines COOH-Terminus (R. Franzi u.a., "Localization And Characterization Of Two Immunogenic Regions On The Coat Protein VPf₁JJ_1x, Of Foo t -And-Mouth Disease Virus (FBiDV) Subtype 0^K Inducing Neutralizing Antibodies" (Lokalisierung und Charakterisierung zweier immunogenetis eher Bereiche an dem Coat-Protein

_Thr des Maul- und Klauenseuche-Virus (FMDV) Untertyp 0^K, die neutralisierende Antikörper induzieren), e (Dezember 1980) Dieses Polypeptid wurde gereinigt und zum Impfen von Schweinen gegen VirusInfektionen verwendet (H,L. Bachrach, u.a.» supra). Um eine Immunisierung zu erreichen, war jedoch i0mal mehr Protein als auf Viren basierende Vakzine erforderlich. Daher sind in den meisten Fällen zwei oder mehr Impfungen mit dem auf VP1-Protein basierenden Subeinheits-Virus erforderlich, um ein Tier gegen FMD-Virus zu schützen.

Durch die Verwendung dieser Subeinheits-Vakzine wird die Antikörper-Bildung gegen die vielen irrelevanten antigenischen Determinanten der Virus- und Nicht-Virus-Proteine, die die Virus-Impfstoffe verunreinigen, ausgeschaltet. Ihre Anwendung kann daher die Nebenwirkungen von Virus-Vakzinen beseitigen. Außerdem besitzen die Subeinheits-Vakzine keine Virus-Nucleinsäure, und daher besteht vermutlich keine Gefahr, daß sie eine aktive Infektion oder eine subakute fortlaufende Erkrankung bei den behandelten Herden hervorrufen. Obwohl durch diese Subeinheits-Vakzine einige der Probleme ausgeschaltet werden, die für Ganz-Virus-Vakzine typisch sind, sind mit ihrer Anwendung doch noch eine Reihe von Nachteilen verbunden. Zunächst muß der Virus zur Gewinnung des Capsidproteins gezüchtet und vermehrt werden. Somit werden die isolierten Einrichtungen und die für die Züchtung des FMD-Virus im großen erforderlichen abgeschlossenen

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Räume nicht vermieden. Zweitens müssen die Proteine von dem Virus getrennt und sehr gut gereinigt werden. Dieser Prozeß dauert nicht nur lange, sondern er ist auch teuer. Wenn die Proteine nicht gut genug gereinigt wurden,«dann kann der resultierende Impfstoff immer noch so viel Viren enthalten, daß eine unbeabsichtigte Infektion oder eine subakute Erkrankung erfolgen kann.

Durch neue Fortschritte auf dem. Gebiet der Molekularbiologie ist es möglich geworden, die für spezifische nicht-bakterielle Proteine kodierende DNA in Bakterienzellen einzubauen. Bei DNA, aber nicht bei der über die chemische Synthese erzeugten, umfaßt die Konstruktion derartiger Rekombinant-DNA-Moleküle im allgemeinen die folgenden Schritte: Herstellung einer einsträngigen DNA-Kopie (cDNA) einer Messenger-RNA (rnRNA)-Template für das verlangte Protein; Umwandlung der cDNA in doppelsträngige DNA; Verknüpfung der DNA mit einer entsprechenden Stelle in einem entsprechenden Cloningvehikel zur Bildung eines Rekombinant-Moleküls und Transformieren eines entsprechenden Wirtes mit diesem Rekoinbinant-DNA-Molekül. Durch eine solche Transformation wird dem Wirt ermöglicht, das verlangte Protein zu erzeugen.

Unter Anwendung der Rekombinant-DNA-Technologie sind mehrere nicht-bakterielle Gene und Proteine in Bakterienwirten gewonnen worden. Diese umfassen zum Beispiel Leukozyten-Interferon (S, Nagata, u.a., "Synthesis in E. coli Of A Polypeptide With Human Leukocyte Interferon Activity" (Synthese eines Polypeptide mit Humanleukozyten-Interferon-Aktivität in E. coli). Nature, 284, S. 316 - 320 (1980)), Antigene des Human-Hepatitis-B-Virus (C. J. Burrell, u.a., "Expression In Escherichia coli: Of Hepatitis B Virus DNA Sequences Cloned In Plasmid pBR322" (Expression von in Plasmid pBR322 geclonten Hepatitis-B-Virus-DNA-Sequenzen) in Escherichia coli: Nature, 279, S. 43 - 47 (1979) und M. Pasek, u.a., "Hepatitis B Virus Genes And Their Expression in E. coli" (Hepatits-B-Virus-Gene und ihre Expression in E. coli), Nature,

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282, S. 575-579 (1979)), und SV40t-Antigen (T.M. Roberts,, u.a., "Synthesis Of Simian Virus 40t Antigen In Escherichia coli" (Synthese von Katzenvirus 40t Antigen in Efccherichia coli), Proc. HatI^ Acad. Sei. USA, 76, S. 5596-5600 (1979)).

Frühere Rekombinant-Schemata waren auf die Erzeugung von c DNA -Kopien von mRNA von 800-900 Nucleotiden (Leukozyten-Interferon) oder mRNA von 2OOO-3OOO Nucleotiden (Ovalbumin oder RNA-Tumore) beschränkt oder haben bereits in der Natur vorhandene DNA verwendet (Nepatits B Virus, Dane Partikel DNA; SV40t Antigen, SV40 DNA).

Ziel der Erfindung;

Mit Hilfe der Erfindung ist es möglich, I¹MD-Virus-spezifische Nucleotidsequenzen und FMDV-antigenische Polypeptide in beträchtlichen Mengen zu gewinnen. Die erfindungsgemäßen DNA-Sequenzen und Rekombinant-DNA-Moleküle ermöglichen die Replikation von PMD-Virus-spezifischen Nucleotidsequenzen und die Erzeugung von Virus-Antigenen gegen PMDV, ohne daß große Mengen Viren gezüchtet, Proteine von den Viren gereinigt oder die Viren inaktiviert oder abgeschwächt werden müssen. Die Erfindung schaltet somit die Probleme aus, die mit den anderen bekannten Verfahren der PMDV-Vakzinproduktion und den mit ihrer Hilfe erzeugten Impfstoffen verbunden sind.

Darlegung; des Wesens der Erfindung:

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, die vorstehend aufgezeigten Probleme zu lösen und ein vorteilhaftes, kostengünstiges Verfahren zur Herßtellung des eingangs charakterisierten Polypeptids zu entwickeln. Das V/esen der Erfindung besteht in der Züchtung eines Wirtes, der durch ein Rekombinant-DNA-Molekül transformiert wurde, das durch Einfügen einer aus der Gruppe,

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bestehend aus: (a) FMDV-715, FMDV-144, EMDV-I448, FMDV- -1824, PMDV-1933, (b) DNA-Sequenzen, die zu einer der vorstehenden DNA-Sequenzen hybridisieren, (c) DNA-Sequenzen, gleich aus welcher Quelle stammend, einschließlich natürlicher, synthetischer oder halbsynthetischer Quellen, verwandt durch Mutation, einschließlich einfacher oder mehrfacher, Basensubstitutionen, Deletionen, Insertionen und Inversionen mit einer der vorstehenden DNA-Sequenzen, und (d) DNA-Sequenzen, die Sequenzen von Codons aufweisen, die für ein Antigen-Polypeptid kodieren, das eine ähnliche Aminosäuresequenz wie die durch die Codons einer der vorstehenden DNA-Sequenzen kodierten enthält, ausgewählten DNA-Sequenz in ein Cloningvehikel erzeugt wurde; und Sainmeln des Polypeptids.

Die erfindungsgemäßen DNA-Sequenzen sind so beschaffen, daß sie die Synthese eines Proteins von einem Genom von etwa 7 700 B_asen ermöglichen, das anscheinend vollständig und ohne Unterbrechung zur Erzeugung eines Totaltranslationsproduktes oder von "Polyprotein" übersetzt wird, wobei das Polyprotein dann weiter in vivo zur Erzeugung;^ eines Capsid- und anderer EMD-Virusproteine verarbeitet wird. Diese DNA-Sequenzen kennzeichnen auch die erfindungsgemäßen Rekombinant-DNA-Moleküle und Prozesse.

Wie aus der folgenden Beschreibung deutlich hervorgehen wird, sind die erfindungsgemäßen DNA-Sequenzen und Rekombinant-DNA-Moleküle in einem entsprechenden Wirt in der Lage, die Erzeugung antigenischer Polypeptide von PMDV zu dirigieren. Durch die Replikation dieser DNA-Sequenzen und Rekombinant-DNA-Moleküle in einem entsprechenden Wirt ist auch die Erzeugung von FMD-Virus-spazifischen Nucleotidsequenzen und Polypeptiden in großen Mengen ohne die Gefahr einer versehentlichen Verbreitung von PMDV möglich. Die Molekülstruktur und die Eigenschaften dieser antigenip sehen Polypeptide und virus-spezifischen Nucleotidsequenzen können dann sicher ohne die Isolationsbedingungen, wie sie für die üblichere PMDV-Analyse erforderlich

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sind, bestimmt werden. Die erfindungsgemäßen antigenischen Polypeptide und DNA-Sequenzen sind, entweder in der im Wirt erzeugten Form oder nach entsprechender Derivatisierung oder Modifikation, für Zusammensetzungen und Nachweismethoden sowie

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zur Verbesserung der Erzeugung dieser Produkte selbst und für die Verwendung in Impfstoffen und anderen immunogenetisehen Zusammensetzungen und Behandlungsmethoden für den FMD-Virus von Nutzen.

Ausführungsbeisgiel:

Fig. 1 ist ein vereinfachtes Schema des FMD-Virusgenoms, des "Polyprotein"-Translationsproduktes und des resultierenden Capsid- und anderer Proteine. Die für die verschiedenen Proteine angegebenen Stellungen sind in bezug auf das FMDV-Genom nicht absolut, da sie lediglich auf Angaben der relativen Größe basieren.

Fig. 2 ist eine schematische Darstellung einer Ausführungsform eines erfindungsgemäßen Prozesses zur Erzeugung von Polypeptiden, die FMDV-Antigenwirkung aufweisen.

Fig. 3 zeigt die Restriktionskarte von erfindungsgemäß hergestellter cDNA und ihre Ausrichtung vom J¹-Ende des FMDV-Genoms« Fig. 3 zeigt gleichfalls die Ausrichtung der cDNA, die Orientierung und den Restrikt ionsverlauf des DNA-Inserts von verschiedenen Hybridplasmiden, die erfindungsgemäß hergestellt wurden.

Fig. 4 zeigt das relevante Segment einer Eestriktionskarte des DNA-Inserts von zwei erfindungsgemäß erzeugten Rekombinant-DNA-Molekülen und die Sequenzierungsstrategie, die zur Bestimmung ihrer Partialnucleotidsequenz angewandt wurde.

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Fig. 5 zeigt das relevante Segment einer Nucleotidsequenz eines erfindungsgemäßen Rekombinant-DNA-Moleküls und seine entsprechende Aminosäuresequenz.

Fig. 6 ist eine schematische Beschreibung von Plasmid pPLc24 und Plasmid pFLIDV-1034.

Fig. 7 zeigt die schematische Darstellung eines Verfahrens für die Konstruktion einer anderen Aus fiihrungs form eines erfindungsgemäßen Rekombinant-DNA-Moleküls.

Fig. 8 zeigt das FMDY-Genom und das Restriktionsmuster von DNA-Insert FMDV-1O34 und die Sequenzierungsstrategie, die zur Bestimmung seiner Nucleotidsequenz angewandt wurde.

Fig. 9 und 10 zeigen einen Teil der Nucleotidsequenz von DNA-Insert FMDV-1034-, der Nucleotidsequenz für das Strukturgen für VP1, der Nucleotidsequenz des DNA-Inserts einer Ausführungsform des erfindungsgemäßen Rekombinant-DNA-Moleküls und die Aminosäuresequenzen der durch diese Nucleotidsequenzen kodierten Polypeptide.

Fig. 11 zeigt einen Teil der Nucleotidsequenz von DNA-Insert EMDV-1448, der Nucleotidsequenz für das Strukturgen von VP3, der Nucleotidsequenz eines Abschnittes eines DNA-Inserts einer Ausführungsform eines erfindungsgemäßen Rekombinant-DNA-Moleküls und die Aminosäuresequenzen der durch diese Nucleotidsequenzen kodierten Polypeptide·

Fig. 12 zeigt eine schematische Darstellung eines Verfahrens für die Selektion und Konstruktion einer anderen Ausführungsform einer erfindungsgemäßen DNA-Sequenz.

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Zum besseren Verständnis der hier dargelegten Erfindung folgt eine ausführliche Beschreibung.

In der Beschreibung werden folgende Bezeichnungen verwendet:

Nucleotid - Eine Monomereinheit von DNA oder ENA, bestehend aus einer Zuckerkomponente (Pentose), einem Phosphat und einer stickstoffhaltigen heterozyklischen Base. Die Base ist über den Glycosidkohlenstoff (1 * Kohlenstoff der Pentose) mit der Zuckerkomponente verknüpft, und diese Kombination von Base und Zucker wird ein Nucleosid genannt. Die Base kennzeichnet das Nucleotid. Die vier DNA-Basen sind Adenin ("A"), Guanin ("G"), Cytosin ("C") und Thymin (¹¹T") · Die vier RNA-Basen sind A, G, C und Uracil ("U").

DNA-Sequenz - Eine lineare Anordnung von Nucleotiden, die miteinander durch Phosphodiester-Bindungen zwischen dem 3¹ und 5*- Kohlenstoff benachbarter Pentosen verbunden sind.

Godon - Eine DNA-Sequenz von drei Nucleotiden (ein Triplett), das durch mRNA eine Aminosäure, ein' Translationsinitiierungssignal oder ein Translationsterminationssignal kodiert. Beispielsweise kodieren die Nucleotid-Tripletts O)TA, TTG, OTT, GTO, GTA und GTG für das Aminosäureleueiη ("Leu")» TAG, TAA und TGA sind Translationsterminations signale und ATG ist ein Translationsinitiierungssignal.

OrientierunKssystem (reading frame) - Die Gruppierung von Godon s während der Translation von mRNA in Aminosäuresequenzen· Während der Translation muß das richtige Orientierungssystem beibehalten werden. Zum Beispiel kann die Sequenz GOTGGTTGTAAG in drei Orientierungssysteme oder Phasen übersetzt werden, von denen jede eine andere Aminosäuresequenz ergibt

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GCT GGT TGT AAG — Ala-Gly-Cys-Lys G CTG GTT GTA AG ~ Leu-Val-Val GC TGG TTG TAA G — Trp-Leu-(STOP)

Polyp eptid - Eine lineare Anordnung von Aminosäuren, die miteinander durch Peptidbindungen zwischen den -Amino- und Carboxygruppen benachbarter Aminosäuren verbunden sind.

Genom - Die gesamte DNA einer Zelle oder eines Virus. Es enthält unter anderem die für die Polypeptide der Zelle oder des Virus kodierenden Strukturgene sowie ihre Operator-, Promotor- und Ribosombinde- und -Wechselwirkungssequenzen, einschließlich Sequenzen wie die Shine-Dalgarno-Sequenzen.

Strukturp;en - Eine DNA-Sequenz, die durch ihre Template,-Messenger-ΕΝΑ ("mRNA") eine Sequenz von An^qsäu£€|n_?i^pci ein spezifische Polypeptid charakteris^pQh" Ι^ίφ» kodj-ert.

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Transcription - Der Prozeß zur Erzeugung von mRNA von einem Strukturgen.

Translation - Der Prozeß zur Erzeugung eines Polypeptids von

Expression - Der Prozeß, den ein Strukturgen zur Erzeugung eines Polypeptids durchläuft. Es ist eine Kombination von Transcription und Translation.

Plasmid - Eine nicht-chromosome doppelsträngige DNA-Sequenz, die ein intaktes "Replicon" aufweist, so daß sich das Plasmid

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in einer Wirtszelle repliziert. Wenn das Plasmid in einem einzelligen Organismus untergebracht wird, können die Charakteristika dieses Organismus infolge der DNA des Plasmids verändert oder transformiert werden. Zum Beispiel transformiert ein das Gen für Tetracyclin-Resistenz (Tetr)'tragendes Plasmid eine Zelle, die vorher gegenüber Tetracyclin sensitiv war, in eine, die dagegen resistent ist. Eine durch ein Plasmid transformierte Zelle wird als "Transformant" bezeichnet.

Phage oder Bacteriophage - Bakterienviren, von denen viele aus DNA-Sequenzen bestehen, die in eine Proteinhülle oder ein Coat ("Gapsidprotein") eingehüllt sind.

Cloningvehikel - Ein Plasmid, eine Phagen-DNA oder eine andere DNA-Sequenz, die sich in einer Wirtszelle replizieren kann, gekennzeichnet durch eine oder eine geringe Anzahl von Endonuclaese-Erkennungsstellen, an denen derartige DNA-Sequenzen in einer vorausbestimmbaren Weise abgebrochen werden können, ohne daß sich daraus der Verlust einer wesentlichen biologischen Funktion, der DNA ergibt, z.B. Replikation, Erzeugung eines Coat-Proteins oder Verlust von Promotor- oder Bindestellen, und die eine Markierungssubstanz enthalten, die sich zur Verwendung bei der Identifizierung transformierter Zellen eignet, z.B. Tetracyclin-Resistenz oder Ampicillin-Resistenz. Ein Cloningvehikel ' wird häufig als Vektor bezeichnet.

Cloning - Der Prozeß zur Gewinnung einer Population von Organismen oder DNA-Sequenzen, die von einem derartigen Organismus oder einer derartigen Sequenz durch asexuelle Vermehrung abgeleitet wurden.

Rekombinant-DNA-Mo1ekül oder gybrid-DNA - Ein Molekül, das aus Segmenten von DNA von verschiedenen Genomen besteht, die außer-

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halb lebender Zellen hintereinander miteinander verbunden wurden und die Fähigkeit besitzen, einige Wirtszellen zu infizieren und darin festgehalten werden können.

Expressions-Kontroll-Sequenz - Eine Sequenz von Nucleotiden, die die Expression von Strukturgenen kontrollieren und regulieren, wenn sie operativ mit diesen Genen verknüpft sind. Sie enthalten das lac-System, das trp-System, Hauptoperator- und Promotorregionen von Phage 7\ , die Kontrollregion von fd-Coat-Protein und andere Sequenzen, von denen bekannt ist, daß sie die Expression von Genen prokaryotischer oder eukaryotischer Zellen oder deren Viren kontrollieren.

In Fig. 1 wird ein vereinfachtes Diagramm eines FMDV-Genoms gezeigt. Dieses Genom von einsträngiger BNA kodiert alle genetischen Informationen des FMD-Virus. Das Genom besteht aus etwa 7 700 Basen oder etwa 2,8 χ 10 Dalton. Die virale RNA ist der Plus-Strang des Virus und weist eine Poly-A-Termination an ihrem 3'-Ende auf und hat ein kleines kovalent an ihren 5'-Terminus angefügtes Protein (VPG)

Es konnte in vivo demonstriert werden, daß in dem Genom nur eine Hauptinitiierungsstelle für die Proteinsynthese vorhanden ist. Daher wird das Genom wahrscheinlich vollständig und ohne Unterbrechung übersetzt, um ein Totaltranslationsprodukt oder ¹¹PoIyprotein" zu erzeugen (Fig. 1) (T.R. Doel, u.a., ¹¹A Re-appraisal Of The Biochemical Map Of Foot-And-Mouth Disease Virus RNA" (Eine Neubewertung der biochemischen Karte der Maul- und Klauenseuchevirus-fiNA), J. Gen. Virol. 41, S. 395 - 404 (1978);. Dieses Polyprotein wird dann offensichtlich in vivo weiter verarbeitet, damit die drei Primärprodukte P 100 (122), P 55 und P des M)V erzeugt werden. Von einem dieser Primärprodukte P 88 wurde berichtet, daß es der Vorläufer der vier Gapsidproteine VP1, VP2, VP3 und VP4- (3?ig. 1) des Virus sei (T.R. Doel, u.a.,

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supra). Daher müßten die vier Capsidproteine eigentlich aus einer einzigen Region des Genoms stammen. Die wirkliche Struktur oder Lage dieser Region des Genoms (etwa 2 400 Basenpaare) wurde jedoch nicht bestimmt. Auch die vollständigen Strukturen der Capsidproteine wurden nicht bestimmt.· Beispielsweise wurden nur die ersten 40 Aminosäuren von dem Aminoterminationsende von VP1 — Thr-Thr-Ser(?)-Ala-Gly-Blu-Lys(?)-Ala-Asp-Pro-Val-Thr-Thr-Thr-Val~Glu~Asn-Q}yr-Gly-Gly-Glu--Thr-Gln-Ile-Gln-Arg~Arg-Gln-His(?)-Thr(?)-Asp-Val-Trp(?)-Phe-Ile-Met-Asp-( ?)~Phe-Val~ angegeben (K. Strohmaier, u.a., "The N-Terminal Sequence Of Three Goat Proteins Of Foot-And-Mouth Disease Virus" (Die N-Terminal-Sequenz von drei Coat-Proteinen des Maul- und Klauenseuche-Virus), Biochemical & Biophysical Research Gomm. ("BRCC"), 85, S. 1640 - 1645 (1978))^X). (^x)tI(?)" bezeichnet eine Aminosäure-Bestimmung, die nicht endgültig ist).

Zum besseren Verständnis der Erfindung wird das folgende Beispiel einer Ausführungsform, angeführt.

Beispiel

Die bei dieser erfindungsgemäßen Ausführungsform verwendete RHA wurde von Kulturen von FMDV, Typ 0, extrahiert, und zwar im wesentlichen wie von J.F.E. Neuman, u.a.. "Purification And Identification Of The RHA-Dependent RNA Polymerase Of Foot-And-MoutL· Disease Virus¹· (Reinigung und Identifizierung der KUA-abhangigeE RKA-Polymerase des Maul- und Klauenseuchevirus), J. Gen. Virol.» 45, S. 497 - 50? (1979) beschrieben wurde.

IMDV-St amm 0 (Kaufbeuren) wurde in BHK-Z el len-Mo no schicht en in verschiedenen Rollflaschen gezüchtet. Der Virus wurde aus dem Kulturmedium durch die Zugabe von Polyäthylenglycol 6000 (bis 8 %) und Ausfällung gesammelt. Der Virus wurde durch Bandenentwicklung in 1 bis 1,44 g/cnr Gradienten von Cäsiumchlorid im wesentlichen so gereinigt, wie von K. Strohmaier und Κ·Η. Adams, ZbI. Vet. Med., B23, S. 485 - 506 (1976) beschrieben wurde. Nacl

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der Dialyse wurde der Virus mit Proteinase behandelt, wie M.J. Grubman, u.a., Virologyi 97, S. 22 ff. (1979) beschrieben hat, und die MA wurde durch zwei Zentrifugationszyklen in 15 bis 30%igem Saccharose-Gradienten gereinigt. Die ENA wurde dann aus den Peakfraktionen mit Äthanol ausgefällt und wieder in Wasser gelöst. Das resultierende Virus-RNA-Präparat (0,78 mg/ml) wies einen 34S Sedimentationskoeffizienten (gemessen mit rRNA als Markierungssubstanz) und

Ähnliche Techniken werden zur Darstellung von ENA von FMDV anderer Serotypen verwendet. Die erzeugte ENA wird dann wie unten beschrieben zur Erzeugung der vorgesehenen Rekombinant-DNA-Moleküle behandelt. Diese in Wirten zur Expression fähigen Moleküle werden zur Erzeugung von Polypeptiden, die FMDV-Antigenwirkung besitzen, und zum Replizieren von virus-spezifischen Nucleotidsequenzen benutzt.

Oben hergestellte FMDV-RNA wurde als Template für die Herstellung von komplementärer FMDV-DNA ("FMDV-cDNA") im wesentlichen nach der Beschreibung von M.P. Wickens, u.a., "Synthesis Of Double-Stranded DNA Complementary To Lysozyme, Ovomucoid And Ovalbumin mRNAs" (Synthese doppelsträngiger DNA, die zu Lysozym-, Ovomucoid- und Ovalbumin-mRNAn komplementär ist), J. Biol. Chem., 255» S. 2483 - 2495 (1978), verwendet.

Einsträngige cDNA wurde durch ΕΝΑ-abhängige DNA-Polymerase (80 Einheiten) von Vogelmyeloblastosisvirus (¹¹AMV") Reverstranscriptase hergestellt, die durch einen pT-j₂-18~ Primer (1 Einheit/ml, Collaborative Research) in 100 /il 50 mM Tri-HCl (pH-Wert 8,3), 8 mM MgCl₂, 25 mM ß-Mercaptoäthanol, dATP, dCTP, dGTP und dTTP (je zu 0,5 mM) und 100 /uCi%-T!EP (NEN) initiiert wurde, wobei die RNA (14 ug) mit 40/il 2,5 mM CH,HgOH 3 Minuten lang bei Raumtemperatur vorbehandelt worden war.

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Das Gemisch wurde 5 min lang bei Raumtemperatur und anschließend 60 min lang bei 42⁰G inkubiert. Aliquoten (1yul) wurden alle 20 min zur Überprüfung der Reaktionskinetik entnommen. Nach der Inkubation und dem Kochen in einem Wasserbad über einen Zeitraum von 3 min zur Dissoziierung des cDNA-RNA-Hybrids wurde das Reaktions gemisch schnell in Äthanol/Kohlendioxid abgekühlt und in Eis gestellt.

Der cDNA-Strang wurde mit Hilfe von DNA-Polymerase I doppelsträi

52 gig gemacht, indem er mit 50 /uOi von jedem der vier ^ P-Desoxy~ triphosphaten, 100 yiil 0,2 M HEPES-Pu ff er (N-2-hydroxyäthylpiperazin-N^l-2~äthansulfonsäure; Sigma) pH-Wert 6,9), 90 mM KCl, 0,4 mM von je dATP, dCTP, dGTP und dTTP und 50 Einheiten DNA-Polymerase I vereinigt wurde (M.P. Wickens, u.a., supra). Das Gemisch wurde 2 h lang bei 15°C inkubiert. Es wurden wieder alle 30 min Aliquoten zur Überwachung der Reaktion entnommen. Zui Abbruch der Reaktion wurde das Gemisch mit Phenol extrahiert und durch eine Säule von G-I50 Sephadex geleitet, die mit 0,1 M NaGl, 10 mM Tri-HCl-Puffer (pH-Wert 7,5) und 1 mM EDTA äquilibriert worden war. Zur Entfernung der radioaktiven Vorläufer, wurden die cDNA enthaltenden Fraktionen zusammengenommen und mit Äthanol ausgefällt.

Die einsträngige Haarnadelschleife, die in der doppelsträngigec cDNA-Struktur zurückbleibt, wurde durch Lösen der ausgefällten cDNA in 675yul S1-Puffer (0,3 M NaCl, 0,03 M Natriumacetat (pH-Wert 4,5) und 3 mM ZnGl₂) geöffnet. S1-Enzym (15/al, 0,6 Vogt-Einheiten/ yUl) wurde zugegeben, und das Gemisch wurde I30 min lang bei 37⁰G inkubiert. Nach der Zugabe von 3O/1I 0,2 M EDTA wurde das Gemisch zweimal mit Phenol extrahiert und wie zuvor mit Äthanol ausgefällt»

Die oben hergestellte cDNA wurde auf 1#igem Agarosegel unter Anwendung entsprechender Markierer gemessen. Mehr als 40 % der

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cDNA hatten zwischen 4-500 und 8000 bp (Basenpaare). Der Rest der cDNA war kürzer» Die cDNA wurde auch mit verschiedenen Restriktionsenzymen unter Anwendung von Standardverfahren abgebrochen. Die Schärfe des Restriktionsmusters der cDNA wies auf die hohe relative Molekülmasse der cDNA hin.

Auf der Basis dieser ßestriktionsmuster wurde die cDNA mit dem 5'-Ende des G_enoms für FMDV ausgerichtet (Fig. 3). Dieses Muster und die Ausrichtung wurden anschließend zur Bestimmung der Position in dem FMDV-Genom der DNA-Inserts in verschiedenen erfindungsgemäß hergestellten Hybridplasmiden verwendet. Eine Korrelation der Position dieser Inserts in dem Genom und die vorausgesagte Position in dem Genom der Kodierungssequenzen für verschiedene PiOteine von FMDV gestattet die Voraussage, welche FMDV-Proteine durch den DNA-Insert eines bestimmten Hybridplasmids kodiert werden.

Gloning__dO££elsträngiger_FMDV-cDNA

Eine große Vielzahl Wirt/Cloningvehikel-Kombinationen kann für das Oloning der erfindungsgemäß erzeugten doppelsträngigen cDNA verwendet werden. Zum Beispiel können nützliche Gloningvehikel aus Segmenten von Chromosomen-, Nicht-Chromosomen- und synthetischen DNA-Sequenzen bestehen, wie verschiedenen bekannten Derivaten von SV40 und bekannten Bakterienplasmiden, z.B. Plasmiden von E. coli, einschließlich col El, pCR1, pBR$22, pMB89, und ihren Derivaten, Plasmiden eines breiteren Wirtsbereichs, z.B. EPA·, und Phagen-DNAn, z.B. den zahlreichen Derivaten von Phage λ , z.B. NM989, und anderen DNA-Phagen z.B. M13 und FiIamenteous einsträngigen DNA-Phagen, und Vektoren, die von Kombinationen von Plasmiden Phagen-DNAn stammen, wie Plasmiden, die zur Verwendung von Phagen-DNA oder anderen Expressions-Kontroll-Sequenzen modifiziert wurden, oder Hefeplasmiden, wie dem 2 yu Plasmid oder Derivaten davon. Nützliche Wirte können Bakterienwirte umfassen wie Stämme von E. coli. z.B. E. coli HB101,

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E. coli X1??6, E, coli X2282₈ E*_coli MHCI und Stämme von Pseudomonas _f Bacillus subtilis. Bacillus stearothermgphilus und andere E, coli, Bazillen j Hefearten und andere Fungi, tierische oder pflanzliche Wirte wie Tier- ₍(einschließlich Human-) oder Pflanzenzellen in Kultur oder andere Wirte. Natürlich müssen nicht alle Wirt/Vektor-Kombinationen gleich wirksam sein. Die betreffende Selektion der Wirt/Gloningvehikel-Kombination wird vom Fachmann unter entsprechender Berücksichtigung der oben genannten Prinzipien vorgenommen werden, ohne vom Rahmen der Erfindung abzuweichen.

Des weiteren können innerhalb jedes spezifischen Gloningvehikels verschiedene Stellen für die Insertion der doppelsträngigen DNA ausgewählt werden. Diese Stellen werden normalerweise durch die Restriktions-Endonuclease, die sie abbricht, bezeichnet. Zum Beispiel liegt in pBB522 die Pstl-Stelle in dem Gen für ß-Lactamase zwischen den Nucleotid-Tripletts, die für die Aminosäuren 181 und 182 dieses Proteins kodieren. Diese Stelle wurde von S. Nagata, u.a., supra in ihrer Synthese von Polypeptiden, die eine immunologische oder biologische Aktivität von Leukozyten-Interferon aufweisen, verwendet. Eine der beiden Hindll-Bndonuclease-Erkennungsstellen liegt zwischen den für die Aminosäuren 101 und 102 kodierenden Tripletts und einer der verschiedenen Tag-Stellen an dem für Aminosäure 45 von ß-Lactamase in pBRJ22 kodierenden Triplett. In ähnlicher Weise liegen die EcoRI-Stelle und die PvuII-Stelle in diesem Plasmid außerhalb irgendeiner Kodierungsregion, wobei die EcoRI-Stelle zwischen den für Resistenz gegenüber Tetracyclin bzw. Ampicillin kodierenden Genen liegt. Diese Stellen sind den Fachleuten gut bekannt. Es sollte natürlich beachtet werden, daß ein erfindungsgemäß nützliches Cloningvehikel nicht über eina. Restriktions-Endonuclease-Stelle zur Insertion des gewählten DNA-Fragmentes verfügen muß. Stattdessen könnte das Vehikel abgebrochen werden und mit dem Fragment durch andere Mittel verknüpft werden.

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Der Vektor oder das Cloningvehikel und vor allem die darin für die Anfügung eines ausgewählten DNA-Fragmentes zur Bildung eines ßekombinant-DNA-Moleküles gewählte Stelle wird von einer Reihe verschiedener Faktoren bestimmt, z.B. die Anzahl der für ein bestimmtes Restriktionsenzym empfänglichen Stellen, die Größe des zu verwirklichenden Proteins, die Suszeptibilität des verlangten Proteins für proteolytischen Abbau durch Wirtszellenenzyiae, die Contamination des zu verwirklichenden Proteins durch iVirtszellenproteine, die während der Reinigung schwer zu entfernen sind, die Expressionscharakteristika wie die Lage der Initiierungs- und Terminations co do ns in bezug auf die Vektor-Sequenzen und andere dem Fachmann bekannte Faktoren. Die Wahl eines Vektors und einer Insertionsstelle für ein bestimmtes Gen werden durch eine Ausgewogenheit dieser Faktoren bestimmt, wobei nicht alle Selektionen für einen bestimmten Fall gleich wirkungsvoll sein werden.

Obwohl im Fachgebiet mehrere Methoden für diel·Insertion von Fremd-DNA in ein Cloningvehikel oder einen Vektor zjur $i|.dung eines Rekombinant-DNA-Moleküls bekannt sind, ist die in Übereinstimmung mit der Erfindung bevorzugte Initialcloningmethode dadurch;, gekennzeichnet, daß das Plasmid (vor allem pBR322) mit dem für ,,die gewählte Insertionsstelle (vor allem Pst]) spezifischen Restriktionsenzym digeriert wird und dG-Schweife zu den 5'-Termini durch Terminaltransferase hinzugefügt werden. In ähnlicher Weise wird die doppelsträngige cDNA durch die Anfügung von dC-Schweifen an den 3'-Termini verlängert, um die Verknüpfung mit dem geschweiften Plasmid zu ermöglichen. Das geschweifte Plasmid und die cDNA werden dann verstärkt (annealed), um die cDNA in die entsprechende Stelle des Plasmids einzufügen und die Hybrid-DNA zu zirkularisieren, wobei der komplementäre Charakter Schweife ihre Kohäsion ermöglicht (Fig. 2). Das resultierende Rekombinant-DNA-Molekül trägt nun ein an der gewählten Pstl-Restriktionsstelle eingefügtes Gen (Fig. 2). Diese Methode der dG-dO-Schweifung für die Insertion einer Fremd-DNA-Seqaenz in ein Cloningvehikel wird von L. Villa-Komaroff, u.a., beschrieben "A Bacterial Clone Synthe-

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sizing Proinsulin" (Ein Proinsulin synthetisierendes Bakterienclon) Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 75, S. 5727 - 3751 (1978).

Selbstverständlich mögen sich andere bekannte Methoden für die Insertion von DNA-Sequenzen in Cloningvehikel zur Bildung von Rekombinant-DNA-Molekülen gleich gut im Rahmen der Erfindung eignen. Diese umfassen beispielsweise dA-dT-Schweifbildung, direkte Ligation, synthetische Linker, Exonuclease- und Polymerase-verknüpfte Reparaturreaktionen mit anschließender Ligation, oder Erweiterung des DNA-Stranges mit DNA-Polymerase und einer entsprechenden einsträngigen Template mit anschließender Ligation.

Es sollte auch beachtet werden, daß die an der ausgewählten Stelle des Cloningvehikels eingefügten Nucleotid-Sequenzen oder ,.,, cDNA-Fragmente auch Nucleotide enthalten können, die kein Teil·'. des tatsächlichen Strukturgens für das vorgesehene oder ausgereifte Protein sind, oder daß sie ημτ ein^Fragment des vollständigen Strukturgens für das vorgesehene Protein oder ausgereiftes Protein enthalten,können. Wichtig ist nur, daß das Rekombinant-DNA-ü4Qj.ekiil die Erzeugung eines Polypeptide dirigiert, das die Spezifität von FMD-Yirus-Antigenen in entsprechenden Wirten aufweist.

Das das fremde Gen enthaltende Cloningvehikel oder der dieses enthaltende Vektor wird zum Transformieren eines entsprechenden Wirtes verwendet, damit der Wirt das fremde Gen replizieren und das durch das fremde Gen oder einen Teil desselben kodierte Protein verwirklichen kann. Die Selektion eines entsprechenden Wirtes wird auch durch eine Reihe von im Fachgebiet bekannten Faktoren gesteuert. Diese umfassen beispielsweise die Kompatibilität mit dem gewählten Vektor, die Toxizität der durch das Hybridplasmid kodierten Proteine, die leichte Rückgewinnung des

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vorgesehenen Proteins, die Expressions-Charakteristika, Biosicherheit und Kosten. Ein Gleichgewicht zwischen diesen Faktoren muß unter dem Gesichtspunkt gesucht werden, daß nicht alle Wirte gleich wirksam für die Expression eines bestimmten Eekombinant-DNA-Moleküls sein müssen.

In der vorliegenden Synthese ist das bevorzugte Initialcloningvehikel das Bakterienplasmid pBR522 und die bevorzugte Initial-Eestriktions-Endonucleasestelle darin ist die Pstl-Stelle (Fig. 2). Das Plasmid ist ein kleines (realtive Molekülmasse etwa 2,6 Megadalton) Plasmid, das die Eesistenzgene für die Antibiotika Ampicillin (Amp) und Tetracyclin (Tet) trägt. Das Plasmid ist vollständig charakterisiert worden (F. Bolivar, u.a., "Construction And Characterization Of New Cloning Vehicles II. AMulti-Purpose Cloning System" (Konstruktion und Charakterisierung neuer Cloningvehikel II. Ein Mehrzweck-Cloningsystem) Gene, S. 95 bis 115 (1977)» J.G. Sutcliffe, "pBR522 Restriction Map Derived From The DHA Sequence; Accurate DNA Size Markers Up To 4561 Nucleotide Pairs Long" (pBR522-Restriktionskarte, abgeleitet von der DNA-Sequenz: Genaue DNA-Größenmarkierer bis zu 4-361 Basenpaare lang) Nucleic Acids Research, 5i S. 2721, -,2729,1^9^) |:_?j ;, J.G. Sutcliffe "Complete Nucleotide Sequence^? Ot'Wlaefi. Ejajfaarlchia coli Plasmid pBR522" (Vollständige Nucleotid-Sequenz des Escherichia coli Plasmids pBR522), Cold Spring Harbor Symposium, 45, I, S. 77 - 90 (1978)). Durch die Insertion des cDNA-Produktes an dieser Stelle wird ein Bakterienclon geschaffen, das eine für ein FMDV-spezifisches Protein kodierende DNA-Sequenz enthält.

1· Darstellung von Pstl-^espaltenem, dG-verlänpertem pBR522 Plasmid pBR522 wurde bei 57°C vollständig mit Pstl-Endonuclease (Boehringer) in 10 mM Tri-HCl (pH-Wert 7,6), 7 mM MgCl₂, 7 mM 2-Mercaptoäthanol, 50 mM NaCl digeriert. Das Gemisch wurde mit 1 VoI Phenol extrahiert und mit 2,5 VoI Äthanol: 0,2 M Natriumacetat-Lösung ausgefällt· Das Präzipitat wurde zweimal mit 70%-igem Äthanol gewaschen und in TE-Puffer gelöst (10 mM Tri-HCl (pH-Wert 8,0), 1 mM EDTA).

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Die Zugabe von homopolymeren dG-Schweifen durch Terminaldesoxynucleotid-Transferase (TdT) (BBL, 6 Einheiten/ytil) erfolgte in einem 50-^1-Reaktionsvolumen, das 1 Xig abgebrochenes Plasmid, 200 mM Na-K-Cacodylat (pH-Wert 7,2), 1 mM GoGl₂, 1 mM ß-Mercaptoäthanol, 200 mM dGTP und 12 Einheiten Td)E enthielt. Die Inkubation erfolgt 60 min lang bei 37⁰G.

2. Darstellung von dC-verländerter cDNA Annähernd 1 pMol doppelsträngige cDNA wurde mit dCTP-Eesiduen durch Terminaldesoxynucleotid-Transferase in einem 50-pUl-Reaktionsvolumen, das 200 mM Na-K-Cacodylat (pH-Wert 7,2), 1 mM CoGl₂, 1 mM ß-Meroaptoäthanol, 100 mM dCTP und 15 Einheiten TdT (BRL, 6 Einheiten/ul) enthielt, verlängert· Die Inkubation erfolgte 5 min lang bei 37°G, worauf die Reaktion durch Einfrosten abgebrochen wurde.

3. Darstellung von Ga^-behandelten E. coli HB101 Ca⁺⁺-behandelte E. coli HB101 wurde nach der Methode von E.M. Lederberg und S.N. Cohen "Transformation Of Salmonella Typhimurium By Plasmid Deoxyribonucleic Acid¹¹ (Transformation von Salmonella Typhimurium durch Plasmid-Desoxyribonucleinsäure) J. Bacteriol., 119, S. 1072 - 1074 (1974) durch Impfen von E^ coli HB101 in 250 ml LB-Medium (10 Teile Bactotrypton, 5 Teile Hefeextrakt und 5 Teile NaCl je Liter) hergestellt, und die Kulturen wurden bei 37°C bis zu einer O.D.^cq = 0,65 gezüchtet, Die frischen Kulturen wurden 5 iain lang in Eiswasser abgeschreckt und dann 10 min lang bei 4-⁰C mit 6 000 U/min pelettisierb. Die Pellets wurden danach in 100 ml eiskaltem 0,1 M CaCl₂ resuspendiert und 15 min lang auf O⁰C gehalten und wie zuvor zentrifugiert. Die Pellets wurden wie zuvor in 100 ml 0,1 M CaCl₂ resuspendiert und vor ihrem Aufnehmen in 25 ml 0,1 M GaCl₂, das einen Zusatz von 2,5 ml Glycerin aufwies, zentrifugiert. Die Kultursuspension wurde in 2-ml-Aliquoten aufgeteilt und in flüssigem N₂ gefrostet und bei -80⁰C ohne Einbuße an Aktivität aufbewahrt (D.A. Morrison, "Transformation In

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Escherichia coli; Cryogenic Preservation Of Competent Cells" (Transformation in Escherichia coli: Tieftemperaturkonservierung kompetenter Zellen), J. Bacteriol, 132, S. 34-9 - 351 (1977))

4. Verstärkung (annealing) von dG-verlängertem pBR322 und dC-

verlängerter DNA ____>_______

Die komplementären dG- und dC-Schweife des Vektors und der cDNA gestatten die Verstärkung (annealing) zur Rezirkularisierung des erwünschten Hybridplasmids oder Rekombinant-DNA-Moleküls· Zu diesem Zweck wurden 20 ng (0,01 pMol) dG-geschweifter, Pstlgespaltener pBB322-Vektor und 0,01 pMol dC-geschweifte doppelsträngige cDNA in JO μΐ 1 χ SSC-Puffer (0,15 M HaCl, 0,015 M Natriumeitrat) vermischt. Das Gemisch wurde in ein Wasserbad von 69⁰C gesetzt und zum Abkühlen auf 35°C über Nacht stehen gelassen.

5. Transformation von E. coli HB101 mit den verstärkten Hybrid-

plasmiden

LJ-Behältereinrichtungen wurden für den Transformationsprozeß und nach Bedarf bei allen anschließenden Schritten verwendet. Aliquoten (15 yül) des oben hergestellten Rekombinant-DNA-Molekül-Gemischs wurden 2 h lang bei O⁰C mit 200yül Ca⁺⁺-behandel^tem B* coli HB101 inkubiert. Die Kulturen wurden 4 min lang bei 37⁰C hitzegeschockt, und 0,4 ml TMg-Medium (10 g Bactotrypton, 5 g NaCl, 2 g MgCl₂ je Liter) wurden zugegeben, und die Bakteriensuspension wurde direkt auf Agarplatten ausgestrichen, die 10 g Bactotrypton, 5 g Hefeextrakt, 5 g NaCl und 14 g Bactoagar je Liter mit einem Zusatz von 10/ig/ml Tetracyclin enthielten. Die Platten wurden 2 Tage lang bei 37°O inkubiert.

Da Plasmid pBE322 das für Tetracyclin-Resistenz kodierende Gen enthält, werden sich E. coli Wirte, die mit einem Plasmid, in dem dieses Gen intakt vorhanden ist, transformiert wurden, in dieses Antibiotikum enthaltendem Medium vermehren, mit Ausnahme

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derjenigen Bakterien, die nicht in dieser Weise transformiert wurden. D_aher ermöglicht die Züchtung in tetracyclinhaltigem Medium die Selektion von Wirten, die mit einem Rekombinant-DNA-Molekül transformiert wurden, oder von rezirkuliertem Oloningvektor, der das Hybridgen enthält·

Die tetracycl in-resist ent en V/irte wurden auch in bezug auf Ampicillin-Resistenz durch erneutes Ausstreichen von Clonen auf Platten, die Medium mit Ampicillinzusatz enthielten, ausgesondert. Obwohl Plasmid pBR322 das für Ampicillin-Eesistenz kodierende Gen enthält, machen Plasmide, die Inserts an der Pstl-Stelle in diesem Gen aufweisen, Bakterien nicht mehr ampicillinresistent. D_aher enthalten Wirte, die gegenüber Tetracyclin resistent aber gegenüber Ampicillin sensitiv sind, Plasmide, die Inserts in dem Gen für Ampicillin aufweisen. Hier waren etwa 87 % der Kolonien gegenüber Tetracyclin resistent und gegenüber Ampicillin sensitiv. Der Rest der tetracyclinesistenten Kolonien wurde wahrscheinlich mit Plasmiden transformiert, die ohne Hybridgene zirkularisiert worden waren.

Screening hinsichtlich eines ffMDV-cDNA enthaltenden Clons Vierhundert der ampicillin-sensitiven, tetracyclin-resistenten Clone wurden in die Vertiefungen von Mikrotiterplatten gegeben. Diese Sammlung von Clonen wurde in 8 Gruppen von 50 Clonen unterteilt (identifiziert durch die Nummern 101 bis 150 bzw. 801 bis 850). Duplikate jeder Gruppe wurden auf Nitrocellulosefilter-beschichteten Trypton-Agarplatten, die einen Zusatz von 10 yug/ml Tetracyclin enthielten, hergestellt· Die Platten wurden bei 37⁰G über Nacht inkubiert. Die Nitrocellulosefilter wurden anschließend zur Kolonie-Hybridisierung verwendet, und zwar im wesentlichen wie von M. Grunstein und D.S. Hognes beschrieben, "Colony Hybridization: A Method Tor The Isolation Of Cloned DMAs That Contain A Specific Gene" (Kolonie-Hybridisierung: Ein Verfahren für die Isolierung von geclonten DNAn, die ein spezifisches Gen enthalten), Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 72, S. 3961

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3965 (1975). Eine ⁵²P-markierte Total-FMD-Virus-RNA-Sonde wurde durch Markieren der zuvor isolierten ENA durch Polynucleotid-Kinase (¹¹PIiK") in Gegenwart von /^²P-ATP hergestellt. Die Fragmente, die durch die geringen Mengen Ribonucleasei die PNK verunreinigte, erzeugt worden waren, hatten eine durchschnittliche Länge von 300 Basen. Die Eybridisierung zu dieser Sonde wurde im wesentlichen nach der Beschreibung von N. Maniatis, u.a.. "The Isolation Of Structural Genes Prom Libraries Of Eucaryotic DNA" (Die Isolierung von Strukturgenen aus der Sammlung eukaryotischer DNA), Cell, 1£, S. 687 - 701 (1978) durchgeführt. Die Autoradiographie der Filter ergab die Anwesenheit von Kolonien, die DNA Sequenzen enthielten, die zu authentischer FMD-Virus-DNA komplementär waren. Kolonien, die eine starke Hybridisierung zu der ^J P-markierten Sonde ergaben, wurden für die weitere Analyse ausgewählt. .;

Weitere Analyse von Clonen, die zu FMDV-DNA hybridisierende In-

serts enthalten

20-ml-Kulturen der oben selektierten stark hybridisierenden Clone wurden bei 37⁰C in Bactotrapton-Medium, das wie zuvor mit einem Zusatz von Tetracyclin (0.D.^₁-Q = 0,6) versehen worden war, hergestellt. Die Kulturen wurden zentrifugiert (10 min, 500.0 U/min) und in 0,2 ml Saccharose (25 % in 50 mM Tri-HCl (pH-Wert 8))» 0,03 ml Lysozym (5 mg/ml) suspendiert und 5 coin lang in Eis stehen gelassen. Es wurden 25 mM EDTA (0,08 ml) zugegeben, und das Gemisch wurde wieder 5 niin lang in Eis stehen gelassen. Das kalte Gemisch wurde anschließend mit 0,3 ml Triton X100 (2 % in 50 mid Tri-HCl (pH-Wert 8), 60 mM EDTA) kombiniert und 10 min lang in Eis stehen gelassen. Die lysierten Zellen wurden 1 h lang mit 17 000 U/min zentrifugiert, und das resultierende Präzipitat wurde in TES-Puffer (1 ml) gelöst. Die TES-Lösung wurde mit 0,1 VoI 10 mg/ml Äthidiumbromid (Serva) und CsCl bis 1 g/ml ergänzt und zentrifugiert (35 000 U/min, 48 h, 15⁰C). Unter UV-Beleuchtung konnten in dem Röhrchen zwei DNA-Bänder beobachtet werden. Das Band mit der höchsten Dichte entspricht Plasmid Form I DNA} das zweite Band entspricht Form II

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und Form III Plasmid-DNAn und etwas Chromosomen-DNA. Das erste Band wurde aus dem BÖhrchen entnommen, Äthidiumbromid wurde durch sechs Isoamylalkohol-Extraktionen entfernt, und die wäßrige Phase wurde mit 2 VoI Wasser mit einem Zusatz von 0,2 M Natriumacetat (pH-Wert 5,1) vor d*er DNA-Präzipitation mit 2,5 VoI Äthanol verdünnt. Die DNA wurde erneut gelöst, mit Phenol extrahiert und wieder mit Äthanol ausgefällt. Die Form I DNA wurde bis zur Vollständigkeit mit PstI digeriert, um den FMDV-Insert zu entfernen, und der Insert wurde wie zuvor zusamme.n mit der ungespaltenen Form I DNA auf einem 1%igen Agarosegel unter Anwendung von Standardmarkierern gemessen. Diejenigen Clone, die Inserts von etwa rye Basenpaaren enthielten, wurden zur weiteren Analyse ausgewählt. Die gewählten Clone wurden wie folgt identifiziert:

E. coli HB101 (pBR322 (Pst)/FMDV-7O3)

E. coli HB 101 (pBR522 (Pst)/FMDV-715)'

E. coli HB1Q1 (pBr322 (Pst)/FMDV-41O)

E. coli HB101 (pBR322 (Pst)/FMDV-144)

E. coli HB101 (pBRJ22 (Pst)/FMDV-331)

E. coli HB101 (pBR322 (Pst)/FMDV-21?)

E. coli HB101 (pBR322 (Pst)/FMDV-118)

E. coli HB101 (pBR322 (Pst)/FMDV-849)

Diese Nomenklatur zeigt, daß das Clon einen E. coli HB101 Wirt enthielt, und daß das zur Transformation dieses Wirtes verwendete Rekombinant-DNA-Molekül Plasmid pBR322 ist, das an der Pstl-Stelle einen FMDY-cDNA-Insert ("FMDY") enthält, wobei das betreffende Clon willkürlich von seiner Stellung in der Sammlung der Clone numeriert wird. Zum Beispiel bezeichnet "401" Gruppe 4, Clon 1. Zur leichteren Identifizierung sollen diese Clone anschließend in abgekürzter Form genannt werden. Zum Beispiel wird E. coli HB101 (pBR322 (Pst)/FMDV-7O3) als E. coli FMDV-703 bezeichnet, sein Rekombinant-DNA-Molekül pFMDV-703 und der Insert in diesem Molekül oder dem durch den Insert FMDV-703 kodierten Polypeptid.

229 9 46 O

Überraschenderweise enthielt keines der Clone Inserts, die in der Länge mehr als etwa 2500 Basenpaare aufwiesen. Da die Größe des vollständigen FMDV-Genoms, die von der PMDV-HNA vorausgesagt wurde? etwa 7700 Basenpaare beträgt und die Reverstranseription von BNA zur Erzeugung von CD¹NA am 3'-Ende der BNA beginnt, war zu erwarten, daß keines dieser Olone für Proteine kodieren würde, die die Spezifität der FMDV Goat-Proteine VP1-VP4· aufweisen.

Zur weiteren Analyse wurden 100 ml-Kulturen dieser Clone gezüchtet und die Form I DNA wie oben dapaus isoliert. Es wurden Bestriktionskarten der Pst!-gespaltenen DNA unter Verwendung von EcoRI, BamHI und Hindlll vorbereitet, wobei die Große der resultierenden Fragmeiite wie zuvor bestimmt wurde. Durch Vergleich , dieser Eestriktionsmuster und Größen mit den Restiktionsmustern der vorher bestimmten cDNA konnte die Lage jedes Inserts in dem FMDV-Genom ermittelt werden (Fig. 3)· Aus dieser Ausrichtung und den ungenauen Stellungen der Kodierungssequenzen für die Virusproteine von FMDV (Fig. 1), könnten die antigenischen Polypeptide, die von den DNA-Sequenzen jedes Inserts kodiert werden können, vorausgesagt werden (Fig. 3). Überraschenderweise' entstanden die Inserts der gewählten Clone ursprünglich von verschiedenen Teilen des FMDV-Genoms und begannen nicht alle am 3'-Ende dieses Genqms wie es bei dem erwarteten Transcriptasemuster von AMV-Reverstranscriptase der Fall sein würde. Außerdem schienen einige dieser Inserts eine DNA-Sequenz zu enthalten, von der vorausgesagt wurde, daß sie für eine Portion des Capsidproteins von FMDV kodiert, z.B. FMDV-715 und FMDV-144.

Synthese eines die Spezifität von FMD-Virus-Antigenen aufweisenden Polypeptide durch E. coli, das erfindungsgemäße Rekom-

binant-DNA-Moleküle enthält

25-ml-Kulturen von E. coli FMDV-703, E. coli F-MDV-715, E. coli FMDV-144, E. coli FMDV-331 und als negative Kontrollen E. coli HB101 und E. coli pBB322 wurden wie zuvor bis zur stationären

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Phase vermehrt ^J . ir^J Die Analysenergebnisse dieser Clone werden in diesem Beispiel genannt, weil sich die Inserts dieser Clone zusammen über einen großen Abschnitt des FMDV-rGenoms erstrecken. Zu jeder Kultur wurde Chloroform gegeben, und sie'wurde 10 min lang geschüttelt und die wäßrige Phase wurde zentrifugiert. Das Pellet wurde wieder in 1 ml Puffer (50 mM Tri-HCl (pH-Wert 8) oder 25 mM Phosphatpuffer mit Natriumchlorid (pH-Wert 7)) gelöst und 3 min lang in Eis mit Ultraschall behandelt (Branson B-15). Nach dem Zentrifugieren wurde das Pellet in dem vorhergehenden P fer (1,0 ml) resuspendiert und wieder mit Ultraschall behandelt und zentrifugiert. Die Obenstehenden wurden zusammengenommen und auf die Anwensenheit von antigenischen Polypeptiden, die zu Antikörpern von FMDV in verschiedenen Immunoanalysen reagieren, analysiert.

1· Sandwich —> Inhibitionsanalyse , /,., ,, , / Die Vertiefungen von Mikrotiterpiatten_;,wurden"mit pern bedeckt (hyper|.mmuni Antikörper, Meerschweinchen^. beschichteten Platten wurden anschließend naQheinander mit; den jeweiligen, oben hergestellten Extrakten^iMDV und Fffl)V-hyperimmunen Antikörpern, die kovalent mit al^fliscke^ Phosphatase verknüpft waren, behandelt; wobei eine Wäsche jedem Bindungsschritt folgte. Die Farbe der Platten nach weiterem Waschen und der Zugabe einer Lösung von p-Nitrophenylphosphat wurde verfolgt, um jegliche Bindung der Polypeptide in dem Bakterienextrakt an Anti-FMDV-Antikörper zu bestimmen. Alle in dem Bakterienextrakt vorhandenen FMDV-antigenischen Polypeptide werden sich an die Antikörper der Unterlage binden. FMDV wird sich nur an Antikörper der Unterlage binden, wo sie nicht mit den antigenischen Polypeptiden von dem Bakterienextrakt blockiert worden sind. Kovalent mit alkalischer Phosphatase verknüpfte Antikörper werden sich in weit größerem Maße mit Viren verbinden als alle virus-spezifisehen Polypeptide des Extraktes, da der Virus viel mehr antigenische Determinanten als das antigenische Polypeptid hat. Die Reaktion von p-Nitrophenylphosphat mit der alkalischen Phosphatase erzeugt eine Färbung. Daher

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wird durch .eine Verringerung der Farbe der Kontrolle angezeigt, daß der Extrakt Polypeptide mit der Spezifität von FMDV-Virus-Antigenen enthält. Die Ergebnisse dieser Analyse sind wie folgt:

Extrakt Analyse

E. coli FMDV-703 ' -*

E. coli-MBV-715 +

E. coli

E. coli

E. coli pBR522 - (negative Kontrolle)

E. coli HB1O1 - (negative Kontrolle)

FMD? +++ (positive Kontrolle)

^x Infra

2. Indirekte Inhibitions-Analyse

Es wurden zwei indirekte Inhibitions-Analysen vorgenommen

Vertiefungen von Mikro tit erplatten wurden mit FMDV-Virus bestrichen und die Platten anschließend mit einem Keaktionsprodukt des betreffenden Bakterienextraktes und FMDV-Antikörpern (hyperimmune Antikörper) behandelt (37⁰C, JO min lang). Die Vertiefungen wurden mehrmals gewaschen und mit kovalent mit alkalischer Phosphatase verknüpftem FMDV-Anti-Antikörper behandelt und wieder mehrmals gewaschen. Wie zuvor war die Farbe der festen Phase nach der Behandlung mit einer Lösung von p-Nitrophenolphosphat ein Anzeichen für irgendeine Immunreaktion. Bei dieser Analyse werden sich nur die Antikörper, die nicht durch Polypeptide, die in dem Bakterienextrakt vorhandene FMDV-spezifische Sequenzen enthalten, gebunden sind, mit I¹MDV an der festen Phase verbinden. Diese Bindungsstellen werden dann die einzigen Stellen darstellen, die für die Anti-Antikörper-Bindung zur Verfugung stehen. Durch eine Verringerung der Farbe wird somit das Vorhandensein von FMDV-spezifischen antigenischen Polypeptiden in den Bakterienextrakten angezeigt.

-229946 0

(b) Anti-VjPI-spezifische Antikörper

Diese Analyse wurde nach obiger Beschreibung durchgeführt, nur wurde anstelle des hyperimmunen Antikörpers Anti-VP1-spezifischer Antikörper (Mäuse) verwende};. .

Bei den indirekten Inhibitions-Analysen wurden folgende Ergebnisse erzielt:

Extrakt Analyse

(a) (b)

E. coli FMDV-703

E. coli FMDV-715 + +

E. coli FMDV-144 ± ^x - ^X

JS. coli FMDV 351 + 4-

E. coli HB1O1 - - (negative Kontrolle)

E. coli HB1O1 (pBE322) - - (negative Kontrolle)

FMDV - (positive nicht durch

geführte Kontrolle)

⁺ "£" bedeutet, daß einige Analysen schwach positiv und andere negativ waren.

3· Direkt-Bindungs-Analyse - Anti-YPI-Antikörper In einem ähnlichen Verfahren wie dem der indirekten Inhibitionsanalyse wurden Vertiefungen von Mikrotiterplatten mit Bakterienextrakt von den betreffenden Glonen bestrichen. Nach dem Waschen wurden die Vertiefungen mit kovalent an alkalische Phosphatase gebundenem Anti-VPi-spezifischem Antikörper (Mäuse) behandelt und die Platten erneut gewaschen. Die Immunreaktion wurde wieder durch Behandlung der festen Phase mit einer Lösung von p-Nitrophenylphosphat verfolgt. Bei dieser Analyse werden nur diejenigen VPI-spezifischen Antikörper, die sich an die FMDV-spezifischen Polypeptide in dem Bakterienextrakt binden, für die Farbreaktion zur Verfugung stehen. Daher zeigt bei dieser Analyse eine Verstärkung der Farbe das Vorhandensein von FMDV-spe-

229946

zifischen Polypeptiden in dem Extrakt an. Die Ergebnisse dieser Analyse waren folgendermaßen:

Analyse

Extrakt'	coil	PMDV-7O5X
E.	coli	FMDV-715
E.	co Ii	PMDV-715:o:
E.	coli	!MDV-W
E.	coli	FMDV-331
E.	coli	HB101
" E.	coli	HB101 (pBR$22)
E.	in I	©101 Extrakt
VFl VP1
x Infra XX-V

- (negative Kontrolle)

- (negative Kontrolle) +++ (positive Kontrolle) +++ (positive Kontrolle)

In diesem Clon war die Orientierung des DNA-Insert im Vergleich zum üblichen pFMDV-715 umgekehrt.

4. Radioimmunanalyse

Es wurden zwei Hadioimmunanalysen wie folgt durchgeführt:

(a) Mii

Polyvinyl-Scheiben wurden mit FMDV-Antikörper (hyperimmunem Antikörper) nach der Beschreibung von S. Broome und W. Gilbert, "Immunological Screening Method To Detect Specific Translation Products" (Immunologische Screening-Methode zum Nachweis spezifischer Translationsprodukte), Proc. Hatl. Acad. Sei. USA, 74, 75, S. 2746 - 2749 (1978) beschichtet. Die feste Phase wurde nacheinander mit dem jeweiligen Bakterienextrakt und radioaktiv markiertem hyperimmunem Antikörper behandelt. Das Waschen erfolgte im wesentlichen nach der Beschreibung von S. Broome und W. Gilbert, supra, nur wurden 0,5 % Nonidet P4· (Fluka) dem Vüaschpuffer für das Waschen nach der Bindung von radioaktiven Antikörpern zugegeben. Die Radioaktivität der festen Phase wurde anschließend zur Bestimmung der Immunreaktion verfolgt. Hier

22 9 94 6*0

wird sich der radioaktiv markierte Antikörper nur an Stellen binden, an denen ein antigenisch.es Polypeptid von dem Bakterienextrakt an den Antikörper der festen Phase gebunden wurde. Daher gibt die markierte feste Phase das Vorhandensein von FMDV-Virus-Antigenen in dem Bakterienextrakt' an·

(b) Mit Bakterienextrakt beschichtete Scheiben - hyperimmuner Antikörper

Plastescheiben (Polyvinylfolie) wurden über Nacht in 0,2 M NaHCO, (pH-Wert 9,2) eingeweicht und vor Gebrauch mit Wasser gewaschen. Tropfen (~5 /il) von verdünntem Bakterienextrakt (1:1 mit 0,4 M NaHCO,) wurden auf die trockenen unbeschichteten Scheiben aufgebracht. Jede Scheibe wurde danach in eine nasses Filterpapier enthaltende Petrischale gelegt. Die Schale wurde geschlossen und 4 h lang bei 57°C inkubiert. Die Scheibe wurde dann entnommen und dreimal (~25 ml) mit Phosphatpufferlösung, die 0,1 % BSA und 0,5 % FCS enthielt, gewaschen und zum Trocknen stehen gelassen. Eine Phosphatpufferlösung (~1,5 ml), die 0,1 % BSA, 0,5 % PCS, 0,05 % Nonidet P40 ("WB/NP-40") und 5 x 10⁶ opm ¹²⁵I-IgG enthielt, wurde auf die Scheibe aufgetragen, indem die Scheibe auf ein Nylonsieb gesetzt wurde, das in Waschpuffer vorgeweicht worden war und über Nacht bei 4⁰C in der Pufferlösung inkubiert wurde. Nach der Inkubation wurde die Scheibe zweimal mit je 25 ml WB/NP-40, Phosphatpufferlösung, die 0,5 % Nonidet P40 enthielt, und Wasser gewaschen. Die Scheiben wurden danach getrocknet und auf einen Film zum Nachweis der Radioaktivität gelegt. Wieder zeigt die markierte feste Phase das Vorhandensein von FMDV-Virus-Antigenen in dem Bakterienextrakt an. Die Ergebnisse der Radioimmunoanalysen waren wie folgt:⁴"·' (⁴^ Als weitere Kontrolle wurden die Extrakte von E. coli FMDV-7°3> E. coli FMDV-715 und E. coli FMDV-144 analysiert, nachdem der radioaktive Antikörper mit dem Virus inkubiert worden war. In jeder dieser Analysen zeigte die feste Phase keine Radioaktivität, wodurch demonstriert wurde, daß der gesamte markierte Antikörper vorher an den Virus gebunden wurde und daher nicht

. 229 9 46 0

für die Bindung mit den FMDV-spezifischen Polypeptiden der Bakterienextrakte zur Verfügung stand)·

Extrakt	coli FMDV-703	Analyse
E.	coli FMDV-715	(a) (b) I ·
E,	coli FMDV-144	+ +
E.	+ +

E. coli FMDV-331 I + '

E. coli HB1O1 (pBR322) - - (negative Kontrolle)

E. coli HB1O1 - - (negative Kontrolle)

FMDV . +++ +++ (positive Kontrolle)

DNA-Fra^ent-Kartierung und Nucleotid-Sequenz-Bestimmune Neben ihrer Verwendung zur Erzeugung von,FMDV-Antigenwirkung aufweisenden Polypeptiden sind die erfindungsgemäßen Rekombinant-DNA-Moleküle auch für die Replikation von virus-spezifischen Nucleotidsequenzen, die das gesamte oder einen Teil des Genoms von FMDV enthalten, nützlich. Auf diese Weise hergestellte FMDV-DNA kann zur Bestimmung der Nucleotidsequenz von Portionen des Genoms, vor allem derjenigen Portionen, die für die verschiedenen Virus- und Capsidproteine von FMDV kodieren, verwendet werden. Von diesen Sequenzen kann die Struktur der Polypeptide selbst bestimmt werden. Die Kenntnis dieser Sequenzen hilft nicht nur bei der Untersuchung und dem Verständnis der Biologie von FMDV, sondern sie ermöglicht auch, daß Modifikationen in den erfindungsgemäßen Rekonibinant-DNA-Molekülen vorgenommen werden können, um die Ausbeute des erzeugten Proteins zu verbessern, die Aktivität der erzeugten Proteine zu verstärken oder das Virus-Serotyp-Spektrum, für das die Proteine wirksam sind, zu erweitern.

Zwei der Clone, E. coli FMDV-715 und FMDV-144, deren Extrakte positive Analysen hinsichtlich antigenischer Polypeptide von FMDV ergaben, wurden zur Bestimmung der Nucleotidsequenz der Region des Genoms, über die sie sich erstrecken, verwendet (Fig. 4 und 5). Auf der Grundlage der vorausgesagten Lage die-

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ser Clone in dem Genom enthält diese Hegion diejenige Region, die für wenigstens eine Portion von Gapsidprotein VP1 kodiert.

Die physikalischen Karten der beiden· Inserts wurden durch Digestion mit verschiedenen Eestriktionsenzymen (New England Biolabs oder BRL) in dem empfohlenen Puffer nach allgemein bekannten Verfahren konstruiert. Die Digestionsprodukte, wurden auf 1%igen Agarosegelen in 40 mM Tri-HOAc (pH-Wert 7,8), 2 mM EDTA der Elektrophorese unterzogen. Sie wurden nach der Betrachtung durch Färben mit Äthidiumbromid analysiert und mit der ausführlichen physikalischen Karte von pBR322 verglichen (J. Sutcliffe, supra). Restriktionskarten der verschiedenen Plasmide wurden auf der B_asis dieser Digestionsmuster konstruiert. Die Karten wurden durch Sequenzierung der DNA-Inserts verfeinert, im wesentlichen wie von A.M. Maxam und ff. Gilbert, "A New Method For Sequencing DNA" (Eine neue Methode zur Sequenzierung von DNA), Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 7A-, S. 560 - 564 (1977) beschrieben worden ist.

Plasmid-DNA wurde wie zuvor beschrieben von den beiden Glonen hergestellt und durch verschiedene Restriktionsenzyme eingeschränkt. Eingeschränkte DNA wurde 30 min lang bei 65°0 in Gegenwart von Kalbs-Intestinal-Phosphatase (Boehringer) dephosphoryliert. Nach der Phenol-Extraktion und der Gelfiltration auf Sephadex G-75 wurde die DNA 5'-terminal mittf-^²P-ATP ( 6000 Ci/mMol) und Polynucleotid-Kinase markiert.

Für die Sequenzierung wurden markierte Fragmente auf zwei Arten behandelt. Einige wurden vor der Spaltung mit einem zweiten Restriktionsenzym auf einem Polyacrylamidgel gereinigt. Andere wurden sofort mit einem zweiten Eestriktionsenzym gespalten. In jedem Fall wurden die verlangten Fragmente auf einem Polyacrylamidgel in Triborat-EDTA-Puffer getrennt. Fig. 4 zeigt die verschiedenen Restriktionsfragmente (die Kreise geben die Markie-

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rung und der Pfeil die Richtung der Sequenzierung an) und die Sequenzierungs-Strategie, die unter Verwendung von pFMDV-715 und pFMDV-144 eingehalten wurde.

Die meisten Verlängerungen des cDNA-Inserts wurden von beiden Strängen sequenziert, und die meisten Restriktionsstellen, die als markierter Terminus dienten, wurden unter Verwendung eines sie überspannenden Fragmentes sequenziert. Das auf diese Weise für den Insert von pFMDV-144 gewonnene relevante Segment der Nucleotidsequenz ist in Fig. 5 dargestellt. Diese Sequenz schließt nicht die Möglichkeit aus, daß nicht bereits bei der Sequenz stattgefundene Modifikationen wie Mutationen, einschließlich einfacher oder mehrfacher, Basensubstitutionen, Deletionen, Insertionen oder Inversionen nicht anschließend zur Veränderung ihrer .Expression, Aktivität oder ihres wirksamen Spektrums angewandt werden könnten.

Vergleicht man das durch diese Region des FMDV-Genoms kodierte Polypeptid mit der Sequenz von 40 Amino-Terminal-Aminosäuren von authentischem VP1, bestimmt von K. Strohmaier, u.a., supra, so hat es den Anschein, als ob das gewählte Orientierungssystem (reading frame) stimmt und die DNA-Sequenz von pFMDV-144 für etwa 90 % des Capsidproteins VP1 von FMDV, Typ 0, kodiert. Nach ihrer PoIy-G-Sequenz kodiert die DNA-Sequenz von pFMDV-144 für ein Polypeptid, dessen Aminosäuresequenz den Aminosäuren 23 40 von der zuvor für VPI bestimmten entspricht. Die einzigen Unterschiede zwischen der zuvor bestimmten Aminosäuresequenz und der durch den DNA-Insert von pFMDV-144 kodierten liegen in den Aminosäuren 35 und 58, bei denen die vorherigen Bestimmungen nicht endgültig waren, und in Aminosäure 37» bei der ein Asn durch das vorherige Asp ersetzt worden war, ein Unterschied, der sich durch einen einzigen Nucleotidaustausch erklären läßt⁺). (⁺) in dem später isolierten DNA-Fragment FMDV-1034 war die für Aminosäure 37 kodierende Nucleotidsequenz GAC, d.h. ein für Asp kodierendes Codon I infra)). Daher fehlen dem DNA-

-*- 229946 Ö

Insert pFMDV-144 nur die Aminosäuren 1 - 22 an seinem Amino-Terminal-Ende. Der Rest von VPI, d.h. bis zu seinem Carboxy-Terainal-lönde, wird durch den DNA-Insert von pFMD,V-'144 ("FMDV-144") kodiert, weil sich der Insert viel weiter erstreckt als für das Kodieren der 240 - 250 Aminosäuren von VP1 erforderlich ist.

Der DHA-Insert von piMDV-715 beginnt an Aminosäure 4-7 von VP1. Anschließend überlappt er den DNA-Insert von pFMDV-144. Siehe Pig. 5. Daher kodiert der Insert von pPMDV-715 für etwa 80 % des Capsidproteins von VP1 von PMDV, Typ 0.

Obwohl keiner der Inserts von pFMDV-144 oder pFMDV-715 für die vollständige Aminosäuresequenz von VPI kodiert, zeigen beide eine Aktivität, die der von virus-spezifischen Polypeptiden

von FMDV bei verschiedenen Analysen entspricht. »Jeder enthält somit genug von einer virus-spezifischen Nucleotidsequenz, um ein antigenisches Polypeptid in einem Wirt, der die erfindungsgemäßen Bekombinant-DNA-Bfoleküle verwirklichen kann (supra), erzeugen zu können.

Identifikation von anderen Clonen, die DNA-Inserts enthalten, die zu den DNA-Inserts der erfindungsgemäßen Rekombinant-DNA-

Moleküle hybridisieren .

Obwohl die DNA-Inserts von E. coIi PMDV-715 und E. coil PMDV-144nicht die vollständige Sequenz für ein bestimmtes Virusprotein enthalten, erzeugt jeder Bakterienextrakte, die die Antigenwirkung von Viruspolypeptiden von FMDV aufweisen. Diese Clone können daher für die Selektion anderer Clone verwendet werden, die vollständigere und zusätzliche DNA-Sequenzen enthalten können und die in einem Wixt in der Lage sind, antigenische Polypeptide zu verwirklichen. Ein derartiges Screening von Clonen wurde so ausgeführt, daß die Form I DNA von dem be-

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treffenden Clon isoliert und sein DNA-Insert verwendet wurde,: um die Form I DNA von anderen Clonen in einer ähnlichen Weise zu hybridisieren wie sie zur Hybridisierung der FMDV-BNA in dem Original-Clonscreening-Proζeß .angewandt wurde (supra)» Zum Beispiel wurde der Insert von pFMDV-fl44·verwendet, um andere Clone zu lokalisieren, die DNA-Inserts enthalten, die zu einem Teil

des Inserts von pFMDV-144 hybridisieren. j

Form I DNA von pFMDV-144 wurde wie zuvor isoliert, und das | Pstl-Hindlll-Fragment (am dichtesten am 5'-Ende) wurde isoliert. Dieses Fragment enthält etwa 90 % der für VPi kodierenden Nucleotidsequenz. Insgesamt wurden 1000 Clone (400 aus der obigen Sammlung und 600 (12 Gruppen zu 50 Clone) aus einer zweiten Transformation) einem Screening-Pxozeß unter Verwendung des obigen Fragmentes als Sonde in einer ähnlichen Weise unterzogen, wie sie beim Screening der Originalsammlung mit der FMDV-RNA-Sonde angewandt wurde. Sechzehn Clone zeigten eine starke Hybridisierung zu diesem Fragment. Sie wurden weiterhin durch BamHI-Restriktionskartierung und GrößenbeStimmung analysiert. Es wurden drei Clone-ausgewählt, die DNA-Inserts mit BamHI-Eestriktionsstellen und eine Länge von mehr als etwa 1000 Basenpaare haben (Fig. 3)· Diese Clone wurden wie zuvor durch ihre willkürliche Position in der Sammlung der Clone identifiziert — ^E* ^coli H⁸¹⁰¹ (pBR322(Pst)/FMDV-iO34), E. coli HB101 (pBR322 (Pst)/FMDV-1824) und E. coli HB101 (pBR322(Pst)/FMDV-1$>23). Wegen ihrer starken Hybridisierung zu FMDV-144, der Gegenwart der BamHI-Restriktionsstelle und der Größe ihrer BamHI-Restriktionsfragmente wurde von diesen Clonen angenommen, daß sie die vollständige Nucleotidsequenz von VP1 und vielleicht alle oder einen Teil der Nucleotidsequenzen von VP2 und VPJ enthalten müßten. Auf jeden Fall können zusätzliche Clone von einer Sammlung einem Screening nach den erfindungsgemäßen Prozessen zur Auswahl derartiger Clone unterzogen werden.

Kulturen der drei Clone wurden wie zuvor hergestellt, und ihre

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Bakterienextrakte wurden mit Hilfe der Direkt-Bindungs-Analyse-Ant 1-Vl³I-Antikörper ("3") und der Bakterienextrakt-beschichteten Scheiben-hyperimmun-Antikörper-Radioimmun-Analyse ("4Cb)") wie oben beschrieben analysiert. Diese Analysen brachten folgende Ergebnisse:

Extrakt Analyse

E. coli FMDV-1034 E. coli FMDV-1824 E. coli FMDV-I933 E. coli HB 101

(pBE322)

E. coli HB101

1"¹IvEDV

VPI in HB101 Extrakt

- (negative Kontrolle) nicht vorgenommen (negative Kontrolle)

nicht vor genommen

(positive Kontrolle) nicht vorgenommen (positive Kontrolle) nicht vorgenommen (positive Kontrolle)

Dieser Screening-Prozeß kann natürlich zum Aussondern zusätzlicher Clone angewandt werden, wobei das FMDV-144-Fragment zum Nachweis anderer Clone, die zu diesem Fragment hybridisierende Inserts haben, benutzt wird, oder erkann unter Anwendung anderer Fragmente zum Nachweis von Clonen, die zu ihnen hybridisierende Inserts haben, angewandt werden.

pFMDV-703 und pFMDV-331 enthaltende Clone Aufgrund ihrer Lage in dem FMDV-Genom enthalten die DNA-Inserts von pFMDV-703 und pFMDV-331 nicht einmal einen Teil der Nucleotidsequenz von VPl. Sie hybridisieren auch nicht zu FMDV-144 (supra). Daher kann nicht angenommen werden, daß die antigenischen Polypeptide, die durch pFMDV-703 und pFMDV-331 in einem Wirt erzeugt wurden, der in der Lage ist, Polypeptide zu ver-

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wirklichen, die die Spezifität von Virus-Antigenen von FMDY aufweisen, mit VFI identisch sind. Allerdings weisen Bakterienextrakte von Kulturen von FMDV-703 und FMDV-331 antigenische Aktivität gegenüber hype3?immunem Antikörper und VP1-spezifischem Antikörper bei einigen Analysen auf. Man ist der Meinung, daß diese Aktivität ein Anzeichen dafür ist, daß die durch E. coli FMDV-703 und E. coli FMDV-321 verwirklichten antigenischen Polypeptide Aminosäuresequenzen enthalten, die als antigenische Determinanten für VP1-Antikörper wirken. Daher können diese antigenischen Polypeptide für Verfahren und Zusammensetzungen angewandt werden, durch die Tiere zumindest eine Zeit lang gegenüber FMDV resistent gemacht werden können*

Verbesserung; der Ausbeute und Aktivität von erfindungsgemäß erzeugten Polypeptiden, die die Spezifität von Virus-Antigenen von FIvU)V aufweisen ·

Die Erzeugungsmenge eines Proteins wird durch zwei wesentliche Faktoren bestimmt: Die Anzahl von Kopien seines Gens innerhalb der Zelle und den Wirkungsgrad, mit dem diese Genkopien transcribiert und übersetzt werden. Der Wirkungsgrad von Transcription und Translation (die zusammen die Expression darstellen) ist seinerseits von den Nucleotidsequenzen abhängig, die normalerweise vor der erwünschten Kodierungssequenz sitzen. Diese Nucleotidsequenzen oder Expressions-Kontroll-Sequenzen definieren unter anderem die Stelle, an der RNA-Polymerase zur Initiierung der Transcription (der Promotor-Sequenz) wirksam wird und an der Ribosomen sich binden und mit der mKNA (dem Transcriptionsprodukt) zur Initiierung der Translation in Wechselwirkung treten. Nicht alle derartigen Expressions-Kontroll-Sequenzen funktionieren mit dem·gleichen Wirkungsgrad. Es empfiehlt sich daher, die spezifischen Kodierungssequenzen für das verlangte Protein von ihren benachbarten Nucleotidsequenzen zu trennen und sie stattdessen mit anderen bekannten Expressions-Kontroll-Sequenzen zu verschmelzen, so daß höhere Sxpressionsgrade erzielt werden können. Wenn das erfolgt ist, kann das neu geschaf-

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fene DNA-Fragment in ein Multikopie-Plasmid oder ein Bakteriophagenderivat eingesetzt werden, um die Anzahl der Genkopien innerhalb der Zelle zu erhöhen und dadurch die Ausbeute an verwirklichtem Protein weiter zu verbessern.

Verschiedene Expressions-Kontroll-Sequenzen können wie oben beschrieben verwendet werden. Diese umfassen die Operator-, Promotor- und Ribosombinde- und -Wechselwirkungssequenzen (einschließlich Sequenzen wie die Shine-Dalgarno-Sequenzen) des Lactose-Operons von E. coIi ("das lac-System"), die entsprechenden Sequenzen des Tryptophan-Synthetase-Systems von E. coli ("das trp-Systein"), die Haupt operator- und -promot orregionen von PhageA ⁰R¹R '' ^{die ΚοηΪΓο1ΐΓβ}δ^{1οη von} Filamenteous einsträn-

R giger DNA, Phagen oder anderen Sequenzen, die die Expression von Genen prokaryotischer oder eukäryotischer Zellen und deren Viren steuern. Zur Verbesserung der Erzeugung eines bestimmten Polypeptids in einem entsprechenden Wirt kann daher das für dieses Polypeptid kodierende Gen wie zuvor ausgewählt und aus einem dieses enthaltenden Sekombinant-DNA-Molekül entfernt und wieder in Rekombinant-DHA-Molekül dichter oder in einer passenderen Beziehung*' zu seiner früheren Expressions-Kontroll-Sequenz oder unter Kontrolle einer der obigen verbesserten Expressions-Kontroll-Sequenzen eingefügt werden· Derartige Methoden sind im Fachgebiet bekannt.

("*"' In der hier gebrauchten Bedeutung kann "Beziehung" viele Faktoren umfassen, z.B. den Abstand, der die die Expressionsverstärkungs- und Förderungsregionen des Rekombinant-DNA-Moleküls und der eingefügten DNA-Sequenz trennt, die Transcriptions- und Translationsmerkmale der eingefügten DNA-Sequenz oder anderer Sequenzen in dem Vektor selbst, die betreffende Nucleotidsequenz der eingefügten DNA-Sequenz und anderer Sequenzen des Vektors und die entsprechenden Merkmale der die Expression verstärkenden und fördernden Regionen des Vektors).

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Weitere Steigerungen der Zellausbeute der vorgesehenen Produkte sind von einer Erhöhung der Anzahl von Genen, die in der Zelle ausgenutzt werden können, abhängig. Für Erläuterungszwecke wird das dadurch erreicht, daß in der oben beschriebenen Weise geschaffene Rekombinant-DNA-Moleküle in die gemäßigte Bakteriophage 7\ (NM989) am einfachsten durch Digestion des Plasmids mit einem Restrikt ions enzym eingefügt wird, um ein lineares Molekül zu erhalten, das dann mit einem eingeschränkten Phage Λ -CIoningvehikel vermischt wird (z.B. des vom N.E. Murray, u.a., "Lambdoid Phages That Simplify The Recovery Of In Vitro Recombinant s" (Lambda-Phagen, die die Gewinnung von in vitro Rekombinanten vereinfachen), Molec. sen. Genet.« 150, S. 53 - 61 (1977) und N.E. Murray, u.a., "Molecular Cloning Of The DNA Ligase Gene From Bacteriophage T4" (Molekular Cloning des DNA-Ligase-Gens von Bacteriophage T4), J. Mol. Biol., 132, S. 493 505 (1979) beschriebenen Typ) und das Rekombinant-DNA-Molekül durch Inkubation mit DNA-Ligase rezirkularisiert wird. Die vorgesehene Rekombinant-Phage wird dann wie zuvor selektiert und zum Lysogenieren eines Wirtsstammes von E. coli verwendet.

Besonders nützliche Λ-Cloningvehikel enthalten eine temperaturempfindliche Mutation in dem Repressions gen c_I und suppressible Mutationen in Gen S, deren Produkt für die Lysis der Wirtszelle erforderlich ist, und Gen E, dessen Produkt das Hauptcapsidprotein des Virus ist. Mit Hilfe dieses Systems werden die Iysogenen Zellen bei 32⁰C gezüchtet und anschließend auf 45 ⁰C erhitzt, um die Exzision der Prophage zu induzieren. Längeres Züchten bei 37°C ergibt hohe Produktionsertrage des Proteins, das in den Zellen festgehalten wird, da diese nicht in der normalen Weise durch Phagen-Genprodukte lysiert werden, und da der Phagen-Gen-Insert nicht eingekapselt ist, bleibt er für die weitere Transcription verfügbar. Durch künstliche Lysis der Zellen wird dann das verlangte Produkt in großen Mengen freigesetzt.

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Außerdem ist zu beachten, daß die Ausbeute an erfindungsgemäß hergestellten, FMDV-Antigenwirkung aufweisenden Polypeptiden auch dadurch verbessert werden kann, daß verschiedene Codons für einige oder alle Codons der vorliegenden DNA-Sequenzen substituiert werden können, wobei diese substituierten Codons dann für Aminosäuren kodieren, die mit denen durch die ersetzten Codons kodierten identisch sind.

Schließlich kann die Aktivität der durch die erfindungsgemäßen Rekombinant-DNA-Moleküle erzeugten Polypeptide durch Fragmentieren, Modifizieren oder Derivatisieren der erfindungsgemäßen DNA-Sequenzen oder Polypeptide durch allgemein bekannte Mittel verbessert werden, ohne vom Geltungsbereich der Erfindung abzuweichen.

Clone, die einen Teil des pgMDV-^/l05^/t- DNA-Inserts enthalten

Als Beispiel für ein Verfahren zur Verbesserung der Ausbeute und daher der Aktivität von erfindungsgemäß hergestellten Polypeptiden, die die Spezifität von Virus-Antigenen von I¹MDV aufweisen, wurde pFMDV-1034 (Fig. 3 und 6) von Kolonien von E. coli HB1O1 CpBRJ22(Pst)/FMDV-iO34) isoliert. Dieses Hybridplasmid wurde als die Quelle einer DNA-Sequenz für die anschließende Insertion in den Expressions-Kontroll-Vektor pPLc24 verwendet.

Vektor pPLc24 (Fig. 6, ein Geschenk von Walter Fiers) enthält das ß-Lactamase-Gen und einen Teil von pBR322. Ein 290-Basenpaar-Hae_II-EcoRI-Fragment enthält die PtCv-Region von BakteriophageA · Die Richtung der Transcription von dem P^-Promotor geht zu EcoRI. Ein 431-Basenpaar-EcoRI-BamHI-Fragment kodiert für die Ribosombindestelle und die ersten 99 Aminosäureresiduen des Bakteriophage-MS2-Replikasegens, das von Plasmid pMS7 gewonnen wurde (R. Devos, u.a., "Construction And Charac-

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terization Of A Plasmid Containing A Nearly Full-Size DNA Copy Of Bacteriophage ES2 RNA^TI (Konstruktion und Charakterisierung eines Plasmids, das eine DNA-Kopie von Bakteriophage MS2-RNA fast voller Größe enthält), J. Mol. Biol., 128, S. 595 - 619 (1979)). Die Translation des MS2 Replikase-Proteinfragments läuft kolinear mit der Transcription von dem P,.-Promotor.

Die Transcription von dem Pj-Promotor - an Plasmid pPLc24 vorhanden - wird unterdrückt, indem das Plasmid in einem E. coli . Stamm festgehalten wird, der ein Repressor-Protein synthetisiert, das Produkt von dem Phagen-Gen c_I. Infolge des selbstregelnden Ablaufs seiner Synthese (M. Ptashne, u.a., "Autoregulation And Function Of A Repressor In Bacteriophage λ" (Selbstregulierung und Funktion eines Repressors in Bakteriophagen), Science, 194, S. 156 - 161 (1976), kann eine Kopie des cl-Pha-, gen-Gens an dem Chromosom eines lysogenen Stammes den in einem' Multikopie-Plasmid vorhandenen Ρχ-Promotor vollkommen unterdrücken.

2. Darstellung und Selektion von Clonen, die einen Teil des

pPMDV-1034 DNA-Inserts enthalten

Nach Fig. 7 wurde Vektor pPLc24 mit den Restriktionsenzymen BamHI und Hindlll eingeschränkt, um komplementäre Enden für die anschließende Ligation mit eingeschränkter DNA-Sequenz von pFMDV-1034 zu erhalten.

Kulturen von E. coli HB1O1 (pBRJ22(Pst)/FMDV-iO54) wurden bei 57⁰C in Bactotrypton-Medium mit einem Zusatz von 10 /ig/ml Tetracyclin (O.D._65O = 0,6) hergestellt. Die Kulturen wurden zentrifugiert (10 min, 5000 U/min) und in 0,2 ml Saccharose (25 % in 50 mM Tri-HCl (pH-Wert 8)) und 0,OJ ml Lysozym (5 mg/ml) resuspendiert und 5 min lang in Eis stehen gelassen. 25 mM EDTA '

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(0,08 ml) wurden augesetzt, und das Gemisch wurde wieder 5 min lang in JEis stehen gelassen. Das kalte Gemisch wurde anschliessend mit 0,3 ml Triton 3C100 (2 % in 50 mM Tri-HCl (pH-Wert 8), 60 mM KDTA) vereinigt und 10 min lang in Eis stehen gelassen. Die lysierten Zellen wurden 1 h lang'mit 17 000 U/min zentrifugiert, und das gewonnene Obenstehende wurde durch 0,1 VoI 10 mg/ml Äthidiumbromid (Serva) und GsCl bis 1 g/ml ergänzt und zentrifugiert (35 000 U/min, 48 h, 15⁰C). Unter UV-Beleuchtung waren in dem Röhrchen zwei DNA-Bänder zu erkennen. Das Band mit der höchsten Dichte entspricht Plasmid Form I DNA (pPMDV-1034, Fig. 6), das zweite Band entspricht Form II und Form III Plasmid-DNAn und etwas Chromosomen-DNA. Das erste Band wurde aus dem Röhrchen entfernt, Ähtidiumbromid durch sechs Isoamylalkohol-Extraktionen entfernt, und die wäßrige Phase wurde mit 1 VoI Wasser mit einem Zusatz von 0,2 M Natriumacetat (pH-Wert 5,1) vor der DNA-Präzipitation mit 2,5 VoI Äthanol verdünnt. Die DNA wurde wieder gelöst, mit Phenol extrahiert und erneut mit Äthanol ausgefällt. Die Form I DNA wurde bis zur Vollständigkeit mit Pstl digeriert, und ein Fragment (FMDV-1024) von 1150 Basenpaaren, das den gesamten DNA-Insert von pFMDV-1034- darstellt, wurde auf einem 1%igen Agarosegel unter Anwendung von Standardgrößenmarkierern isoliert (Fig. 8). Dieser Insert wurde danach weiter unter Anwendung herkömmlicher Restriktionsverfahren mit BamHI und Hindlll eingeschränkt. Die BamHI-Hindlll-Restriktion führt zu einem DNA-Fragment ("FMDV-1034 (BamHi-Hindlll)") von etwa 850 Basenpaaren, wobei etwa 150 Basenpaare von jedem Ende des PsjbI-pFMDV-1034-Fragmentes durch die Restriktion entfernt worden sind (Fig. 7 bis 10). Der gespaltene Vektor (pPLc24 (BamHI-Hindlll)) und das DNA-Fragment (FMDV-1034 (BamHI-Hindlll)) wurden in einem Verhältnis von 1:2 zusammengenommen und mit Äthanol ausgefällt. Das Präzipitat wurde abgetrennt und erneut in T4 DNA Ligasepuffer (3 JUg Vektor/ml) gelöst, und die Ligation lief über Nacht bei 15 C ab.

CaCl₀ kompetentes E. coli W6 (λ_._ν), das den Chromosomen λ-Re-

ei ι ι ι J₁ ρ j£

pressor C_-I zur Verhütung von Px-gesteuerter Expression aufweist,

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wurde mit dem Ligasegemisch transformiert, und ampicillin-resistente Kolonien wurden nach der Züchtung in L.Bouillon mit einem Zusatz von 40 p.g/ml Ampicillin selektiert. Da der Vektor pPLc24 das für ß-Lactamase kodierende Gen enthält, werden sich E. coIi Wirte, die mit einem Plasmid, in dem das Gen intakt ist, transformiert wurden, in einem Ampicillin enthaltenden Medium bis zum Ausschluß der nicht auf diese V/eise transformierten Bakterien vermehren.

50 ampicillin-resistente Clone wurden ausgewählt und nach der Beschreibung von M. Grunstein und D.S. Hogness "Colony Hybridization: A Method For The Isolation Of Cloned DNAs That Contain A Specific Gene" (Kolonie-Hybridisierung: Eine Methode zur Isolierung von geclonten DNAn, die ein spezifisches Gen enthalten), Proc» Natl. Acad. Sei. USA ₁ 72, S. 3961 - 3965 (1975)f mit einer * P-markierten Pstl-pFMDV-lOJ^-Sonde hybridisiert, die durch Nick-Translation in Gegenwart von E. coli DNA pol I und#-^²P-dATP hergestellt wurde. Es wurden sieben stark positive Clone ausgewählt. Diese .sieben Clone können wie folgt identifiziert werden: E. coli W6 (λ _rex-pPLc24 (BamHI-Hindlll)/FMD7-1Q34 (BamHI-Hindlll). Diese Clone werden anschließend als E. coli W6 (A_10x-PPIi-VPI-I) bezeichnet, ihre Plasmide als pPL-VPi-1 und ihre DNA-Inserts als ⁺)

(⁺) Es wurde auch ein zweites als E. coli W6 ( identifiziertes Clon ausgewählt. Bei anschließenden Analysen erzeugten Kolonien von E. coli NF1 (AN""cro~cI_ts-pPL-VPi-5) Bakterienextrakte, die nach Züchtung über Nachtbei 37⁰C Reaktionen zeigten, die auf das Vorhandensein von VP1-verwandten Antigenen hinweisen)·

Plasmid-DNA wurde von diesen stark hybridisierenden Clonen wie zuvor isoliert und zum Transformieren von (CaCl₂ kompetentem) Bakterienstamm E. coli NF1 (K12M72 lac_Qm dtrp EA2 Sm^R (AcI851

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^Nam7^Naim53^{A HI bio}~⁾ C"B. coll HFI ^\N"cro""cI_ts)") verwendet (U.H. Bernard, u.a., "Construction Of Plasmid Cloning Vehicles That Promote G_ene Expression Form The Bacteriophage ΛIV Promoter" (Konstruktion von Plasmid-Clonigvehikels, die die Gen-Expression von dem Bacteriophage P, Promotor fördern), Gene, 5» S. 59-76 (1979)). Dieser Stamm enthält eine defekte, nichtausschneidbare )\Prophage, die ein Mutanten cI-Gen trägt. Das Mutanten-Gen kodiert für einen temperaturempfindlichen Repressor (d-fcg)» so daß die Transcription von dem P^ Promotor durch Verändern der Temperatur in Gang gebracht werden kann - bei 28⁰C ist der ßepressor aktiv und unterdrückt die Transcription, aber bei 42⁰C ist der Eepressor inaktiv und die Transcription von dem P. Promotor ist in vollem Gange.

Die δ HI-DeIetion der Prophage entfernt einen Teil des cro-Gens und alle anderen weiter rechts von cro liegenden Gene (M. Castellazzi, u.a., "Isolation And Characterization Of Deletions In Bacteriophage Λ Eesiding As Prophage In E. coli |< 12" (Isolierung und Charakterisierung von Deletionen in Bakteriophage J\ , die als Prophage in E. coli K 12 vorliegt), Mol, sen. Genet., 117, S. 211 - 218 (1972)).. Die Deletion des cro-Gens ist vorteilhaft, weil die Ansammlung, des cro- Proteins bekanntlich die Transcription von dem Pt Promotor unterdrückt (A. Johnson, u.a., "Mechanism Of Action Of The ci?o Protein Of Bacteriophage λ " (Wirkungsmechanismus des cro-Proteins von Bakteriophageλ ), Proc. Natl. Acad. Sei USA, 75, S. 1785 - 1787 (1978)). Stamm Ni¹I hat zwei Amber-Mutationen in N, wodurch es funktionell N-negativ wird. Daher geht in Stamm NFl die Transcription in Abwesenheit des N-Genproduktes vor sich.

Andere Stämme, z.B. E. coli M5219 (Ki2 M72 ^^ (λ cl857ÄHIbio252)) (H. Grier, "The KiI Gene Of Bacteriophage Λ" (Das kil-Gen von Bakteriophagen), Virology, 66, S. 589 604 (1975)), die das N-Genprodukt verwirklichen, können gleichfalls in dieser Erfindung verwendet werden. Diese N+-Stämme

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könnten in den Fällen vorteilhaft sein, in denen die zu transcribierenden DNA-Regionen Transcriptions-Terainator-ähnliche Sequenzen oder Verlängsamungs—Sequenzen für die RNA-Polymerase enthalten. Beispielsweise wirkt das Produkt des N-Gens bekanntlich als ein Anti-Terminator in Bakteriophagen (J.W. Roberts, "Transcription Termination And Late Control In Phage^ ⁿ (Transcriptions-Termination und Spätkontrolle in Phage9\ ")» Proc. Natl. Acad. Sei. USA« 72, S. 3JOO - 3504 (1975)). Der Anti-Terminationseffekt wurde gleichfalls bei Terminatorsequenzen beobachtet, die von Natur aus nicht an Phagen ">\-DNA vorhanden sind (z.B. der natürliche Stopp am Ende des trp Operon), vorausgesetzt, daß der RNA-Transcript an dem P_x Promotor beginnt. Außerdem wurden Polaritätseffekte, die durch das Vorhandensein eines Nonsense-Godons in dem P^ Transcript eingeführt wurden, unter der Wirkung des N-Gen-Proteins abgeschwächt (zur Information siehe N. Franklin und G. Yanofsky, "The N Protein Of A : Evidence Bearing On Transcription Termination, Polarity And The Alteration Of E. coli RNA Polymerase" (Das N Protein von Λ : Nachweis aufgrund der Transcription-Termination, Polarität und der Veränderung von E. coli RNA Polymerase), in RNA Polymerase (Gold Spring Harbor Laboratory, 1976), S. 693 - 706).

Ist das oben genannte Plasmid in einem thermisch induzierbaren Bakterien-cT-Untergrund vorhanden, kann die Aktivität des P_x^ Promotors experimentell eingeleitet oder abgestellt werden.

Kolonien der transformierten Wirte wurden in L-Bouillon mit einem Zusatz von 40/u/ml Ampicillin bei 28⁰C gezüchtet, und Clone wurden willkürlich aus jeder der sieben Gruppen von Transformanten ausgewählt. Außerdem wurden Kolonien von mit Plasmid pPLc24 transformierten Wirten bei 28⁰G gezüchtet und Clone willkürlich aus diesen Tr ans formant en ausgewählt. Diese Clone wurden wie folgt identifiziert:

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E. coli NF1 ( Λ Κ

E, coli NE¹I (7\ N~cro~cl^ -pPLc24)

5. Radioiramunoanalyse von Bakterienextrakten von E. coli

(7V N""cro"cI_t „-pPL-VP1-1)

Radioimmunoanalysen von Bakterienextrakten von E. coli NF1 (TN N~cro~cI_ts-pPL-VP1-1) wurden wie folgt ausgeführt:

(a) Anti-ΟηΚ beschichtete Scheiben - markierte Anti-VP-1-Anti-

Zwei Clone von E. coli HP1 (7\ N~cro"~cl. -pPL-VPi-1) wurden willkürlich aus den oben beschriebenen NF1-Kolonien ausgewählt. Diese wurden wie zuvor als Duplikate bei 28⁰C und 42⁰C gezüchtet und hinsichtlich der Expression von antigenischen Polypeptiden von FMDY mit Hilfe der Broome-Gilbert-Analyse unter Verwendung von Anti-O^K"¹"' beschichteten Scheiben getestet (S. Broome und W. Gilbert "Immunological Screening Method To Detect Specific Translation Products" (Immunologische Screening-Methode zum Nachweis spezifischer Translationsprodukte), Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 75, S. 2746 - 2749 (1978)).

(^+>) Hyperimmunes Meerschweinchenserum für FMDV, Typ O, Untertyp 1 (Kaufbeuren)).

Die Extrakte wurden von 100-ml-Kulturen hergestellt, die bei 28⁰C bis zu einer Dichte von 6 χ 10 Zellen/ml gezüchtet worden waren, und deren Temperatur dann auf 42⁰C erhöht wurde, und die Inkubation wurde 4 h lang durchgeführt. Die Zellen wurden anschließend 10 min lang mit 6000 U/min zentrifugiert, und das Pellet wurde wieder in 1 ml Puffer (50 mM Tri-HOl (pH-Wert 8) oder 25 mM Phosphatpuffer mit Natriumchlorid (pH-Wert 7) gelöst und 1 min lang in Eis Ultraschalleinwirkung (Branson

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B-15) ausgesetzt. Nach dem Zentrifugieren wurde das Pellet in dem vorhergehenden Puffer (0,1 ml) resuspendiert und wieder ultraschallbehandelt und zentrifugiert. Die Obenstehenden wurden zusammengenommen und wie unten beschrieben Duplikatanalysen unterzogen. .

Polyvinylscheiben wurden im wesentlichen wie von Broome und Gilbert, supra, beschrieben mit Anti-O^K IgG von Meerschweinchen beschichtet. Die feste Phase wurde nacheinander mit 5 μΐ der jeweiligen Bakterienextrakte und ^I-markiertem IgG Anti-VP1 von Mäusen behandelt, die zuvor mit einem Bakterienextrakt von B^ coil HB101 (pBR522)⁺⁺ν behandelt worden waren, so daß verbesserte negative Kontrollen erzielt werden könnten. (⁺⁺'⁾ Das ⁵I-markierte IgG-VPi wurden 4 bis 6 h lang bei 4⁰C mit 0,5 ml des Extraktes (= 5 χ 10° Bakterien) inkubiert und zur .Entfernung aller Immun-Komplexe zentrifugiert). Das Waschen erfolgte im wesentlichen nach der Beschreibung von Broome und Gilbert, supra, nur wurden 0,5 % Nonidet P4 (Fluka) zu dem Waschwasser nach dem Binden der radioaktiven Antikörper zugegeben. Für jede Analyse wurden zwei Scheiben benutzt.

Bei dieser Analyse wird sich radioaktiv markiertes Anti-Vp1 nur an Stellen an den Scheiben binden, an denen ein VP1-verwandtes Antigen von dem Bakterienextrakt zuvor an den hyperimmunen Antikörper der festen Phase gebunden war. Daher zeigt die markierte feste Phase das Vorhandensein von VPI-verwandten Antigenen in dem Extrakt an. Ss wurden folgende Ergebnisse erzielt:

Analyse Extrakt Scheibe 1 Scheibe 2

Hr. 1 Nr. 2 Nr. 3 Nr.

NFl (AN""cro""cI_ts-pPL~VPl-l)

NFl ON~cro~cI_ts-pPLc24) - - -

0^K (positive Kontrolle)*' +++ +++ +++ +++

//8<f«T P-BR322 (negative Kontrolle) - -

FMDV, Typ O, Untertyp 1 (Kaufbeuren), 5 ill (0,4 mg/ml).

-229946 0

Außerdem zeigten die oben beschriebenen Bakterienextrakte von JS. coli MFl (AN^-CrO^-Ol^₃-PPL-YPI-I) bei der Broome-Gilbert-Analyse bei einer Verdünnung bis zu 1:50 positive Ergebnisse. Das stimmt gut mit der bei einer Verdünnung von 1:250 der positiven Kontrolle FMDV 0^K beobachteten positiven Analyse überein.

(b) Anti-O^K beschichtete Scheiben - Virus-erschöpfte markierte

Unter Verwendung der oben hergestellten Bakterienextrakte wurde eine ähnliche Analyse vorgenommen, nur wurdeivor der Behandlung | die in der festen Phase gebundenen Antigene von dem Bakterien- i

125 extrakt mit -^-markiertem IgG Anti-VP1, der markierte Anti- \ körper wie zurvor mit E. coli HB 101 (pBR322) erschöpft und dann' mit FiCDV, Typ 0^K erschöpft. Bei dieser Analyse waren die zuvor i positiven Ergebnisse für E. coli KB¹I (Λ N~cro~cI_ts-pPL-VPi-1) Bakterienextrakt und die positive Kontrolle negativ, da das ge- ; samte markierte Anti-VPI mit Virus erschöpft worden war und da- \ her nicht für die Bindung an irgendwelche VP1-antigenische De- : terminanten, die an die Antikörper der festen Phase gebunden wa-| ren, zur Verfügung stand. Diese Ergebnisse demonstrieren ganz ·· deutlich, daß FMDV O^K VP1-spezifische Antikörper vollständig ; bindet und daß die Antigene des Bakterienextraktes sich nicht j an diese Kombination binden. :

(c) Anti-0-ηΚ beschichtete Scheiben - Konkurrenz von markiertem

Für diese Analyse wurden Anti-0/,Κ beschichtete Scheiben wie zu-

125

vor vorbereitet und für eine Konkurrenz zwischen ^I-markiertem FIvIDV, Typ OxjK, und zuvor hergestelltem Bakterien extrakt von E. coli ΚΕΙ (λ N-cro-cI^g-pPL-VPI-i) verwendet. Bei dieser Analyse konkurrieren der Extrakt, wenn er irgendwelche VPi-antigenische Determinanten enthält, und markierter Virus direkt um die Bindungsstellen an der Anti-O^K gebundenen festen Phase.

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Die Ergebnisse der Analyse waren wie folgt:

Extrakt Analyse

NF1 (λ N""cro""cI_ts-pPL-VP1-1)/¹²⁵I-FMDV O₁K +

MFI(λN~crcTcI. -PPLC24)/¹²⁵I-EMDV 0-K +++

'lpe; üb I

^IFMDV O₁K (positive Kontrolle) +++

Daher konkurriert der Bakterienextrakt von E» coli NF1

₁J₀-I) erfolgreich mit markiertem Virus um die Bindung an die Anti-0^K beschichteten Scheiben. Diese Konkurrenz ist bei dem Bakterienextrakt von E. coli KF 1 U-T~cro"*cl. -

pPLc24) nicht festzustellen.

Diese beobachtete Konkurrenz ist ein weiterer Beweis für das Vorhandensein von VPI-antigenischen Polypeptiden in den Bakterienextrakten von E. coli NF1 0\_i~cro""cl. -pPL-VPI-1) und de-

monstriert, daß diese Antigene in der Lage sind, erfolgreich den ptjaent^c^pn^ Y^-Anti-genen des FMDV-Virus zu konkur

rieren.

(d) AjItI-O₁K beschichtete Scheiben, - IgG markiert gegen Freund-Ad^uvans _^_ _

Unter Anwendung einer im wesentlichen der oben unter (a) angewandten Verfahrensweise identischen wurden Anti O₁K beschichtete Scheiben nacheinander mit den oben beschriebenen Bakte-

125

rienextrakten und ^I-markiertem IgG gegen Freund-Adjuvans behandelt. Es wurden keine positiven Ergebnisse festgestellt. Diese Ergebnisse zeigen, daß die Bindung von markiertem Antikörper an die Antigene des Bakterien extrakt es spezifisch für VPi-Antikörper ist.

4* Expression von pPL-VP1-»1 in Minizellen

E. coli DS 410 (J.N. Reeve, Mol, sen. Genetics, 158, S. 73 - 79

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(1977)) wurde mit Form I DNA transformiert, die wie zuvor von W 6 O\ -pPL-VPi-1) und E. coli W 6 (7\ -PPLC24) iso-

liert worden war. Diese Transformationen wurden unter Bedingungen ausgeführt, die im wesentlichen den oben beschriebenen identisch waren, nur wurden die Transformationen in Anwesenheit von pRK248 cl_ts (einem Geschenk von Walter Fiers) durchgeführt (H. Bernard und D. R. Helinski, Methods in Enzymology, in Druck (1980)), um einen temperatur-empfindlichen/\-Repressor (Cl^₃) in die transformierten Stämme einzuführen.

Kolonien der Trans formant en wurden auf L-Platten (28⁰O) mit einem Zusatz von Tetracyclin (10 yug/ml) und Ampicillin (40yug/ml) gezüchtet,um die Kolonien mit doppelt-transformierten*- Clonen zu selektieren, d.h. die pPLc24 oder pPL-VP1-1 und pRK24-8 enthielten. Da pPLc24· das Gen für Ampicillin-Resistenz trägt und pRK248 das Gen für Tetracyclin-Resistenz, wird durch die Züchtung in dem obigen Medium mit Ampicillin- und Tetracyclinzusatz zwischen doppelt-transformierten Clonen und nicht in dieser Form transformierten unterschieden.

Mehrere dieser doppelt-transformierten Clone wurden auf L-Platten mit dem obigen Zusatz auf getüpfelt, und es wurden wieder Kolonien bei 28⁰G gezüchtet· Um zu gewährleisten, daß die pPL-VP1-1 transformierten Clone von der zweiten Inkubation auch noch den VP1-1 DNA-Insert enthielten, wurde eine Anzahl dieser Clone ausgewählt und Plasmid Form I DNA wie oben beschrieben daraus abgetrennt. In allen Fällen hatte die von diesen Clonen abgetrennte Form I DNA die richtige Größe für pPLc24 mit eingefügter VP1-1 DNA.

Ein Clon von E. coli DS 4-10 (pPL-VKl-1-)/(pRK248) und ein Clon von E. coli DS 410 (pPLc24)/(pRK24B) wurden willkürlich aus den verschiedenen, oben beschriebenen Inkubationen ausgewählt und zur Erzeugung von Minizellen verwendet. (J.N. Reeve, "Mucopeptide Biosynthesis By Minicells In Escherichia coli" (Mukopep-

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tid-Biosynthese durch Minizellen in Escherichia ooli) J. Bacteriol.. 1511 S. 363 - 3^5 (1977)5 J.N, Eeeve, Mol, sen. Genetics, 15a, S. 73 - 79 (1977)). Zellen wurden in L-Bouillon bei 28⁰G gezüchtet und während 30-min-Inkubationen bei 42⁰C mit ^S-Methionin markiert.

Die markierten Produkte wurden direkt durch Trennung auf einem 12,5 % SDS-Polyacrylamidgel und anschließende Autoradiographie des getrockneten Gels analysiert. In Zellen, die das Plasmid pPL-VPi-1 tragen, wurde ein starkes Proteinband beobachtet, jedoch nicht in Zellen, die Plasmid pPLc24 tragen· Die relative Molekülmasse des ermittelten Proteins C= 45 000 - 48 000 d) stimmt gut mit der eines !fusionsproteine überein, das aus den 99 Aminosäuren von MS2 besteht, wobei die Aminosäuren durch den etwa 850 Basenpaare aufweisenden VP1-1-Insert und den Teil von pBR322 (13 Aminosäuren), der dem ersten Stopp-Codon vorausgeht, kodiert waren (Fig. 7 und 9 - 10).

5. Antikörper-Präzipitation der in Minizellen synthetisierten .;

Polypeptide

Die oben beschriebenen ^S-Methionin-markierten Zellen wurden mit Lysozym/NP-40 behandelt und die Zellextrakte mit Protein A Sepharose (Pharmacia) präadsorbiert und 2 min lang in einem Eppendorf-RÖhrchen zentrifugiert. Dieses Verfahren ergibt Extrakte, die unspezifisch an Protein A Sepharose gebunden sind.

Das Obenstehende aus diesen Röhrchen wurde 30 min lang bei 37⁰C mit gereinigtem IgG von Mäuse-Anti-VPi inkubiert, um die VP1-verwandten Antigene der Extrakte zu binden. Zur Bindung des Antikörper-Antigen-Komplexes wurde Protein A Sepharose zugesetzt und das Gemisch 2 h lang bei 4⁰C inkuüert. Die Protein A Sepharose wurde viermal mit TNE (10 mM Tri-HCl (pH-Wert 7,4), 100 mM NaCl, 1 mM EDTA/0,05 % NP-40 gewaschen, und die zurück-

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gehaltenen Produkte wurden auf einem 12,5 % SDS-PoIyacrylamidgel getrennt.

Die Proteinbänder wurden mit Hilfe der Autoradiographie beobachtet. Ein starkes Band bei = 45 000 bis 48 000 d und ein schwächeres Band bei = 25 000 d (vielleicht verarbeitetes VP1) wurden bei den Antikörper-gebundenen Extrakten von pPL-VP1-1-transformierten Zellen beobachtet. Keines dieser Bänder wurde in den Antikörper-gebundenen Extrakten von pPLc24 transformierten Zellen nachgewiesen. Daher enthalten die Bakterienextrakte von E. coli DS 410 (pPL-VP1-1)/(pRK248) Polypeptide, die mit Anti-VP1-Antikörpern ausgefällt werden können, während die in den Bakterienextrakten von E. coli DS 410 (pPLc24)/ (pRK248) enthaltenen Polypeptide durch Anti-VP1-Antikörper nicht ausgefällt werden, weil sie keine VP1-spezifischen Antigene enthalten.

Wenn beispielsweise das Kulturextraktionsverfahren Harnstoff enthält, ist zu erwarten, daß 100 000 bis 500 000 Moloküle/Zelle, die in Wirten hergestellt wurden, sich mit pPL-VP1-1 transformieren.

Die FMDV-Antigene haben folglich den Anschein, daß sie sich an die Membranproteine der Wirtzelle binden. Harnstoff unterbricht jedoch solche Bindung.

6. Einschätzung der Erzeugung von FMDV-Antigenwirkung aufweisenden Polypeptiden

Zur Einschätzung der Erzeugung von Proteinen durch diese transformierten Wirte wurden das oben beschriebene stärkere Proteinband - 45 000 - 48 000 d - und das ß-Lactamase entsprechende Band (27 000 d) aus dem Gel ausgeschnitten und jeweils mit NCS-Lösungsbeschleuniger (Amersham) und Scintillationsflüssigkeit zur Freisetzung des Proteins von dem Gel inkubiert. Die Radioaktivität

-54a-

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der Proteinlösungen wurde anschließend in einem Scintillationszähler bestimmt.

Berechnet man, daß ein Molekül d*es verschmolzenen Proteins (45 000 - 48 000 d) 5 Methionine enthält (aus den später aufgeführten Sequenzdaten und den bekannten Sequenzen von MS2 und pBR322) und daß 10 Minizellen auf das Gel aufgetragen wurden (von denen die meisten keine Plasmide enthielten), dann müßte eine Zelle Moleküle verschmolzenes Protein und 0,5 Moleküle

-55-

.#.229946 O

ß-Lactamase erzeugen.

Experimente unter· Anwendung der Ajnplifikätionsmethode und "normaler" Zellen (KB¹I) (Neidhart, u.a., J. Bacteriol., Juli 198o) ermöglichten die Bestimmung einer unteren Grenze von etwa 100 Molekülen/Zelle/30 min Markierung.

Diese geschätzte untere Grenze stimmt mit den Schätzungen der Proteinerzeugung - =T 500 Moleküle/Zelle - überein, die auf der Basis der zuvor erläuterten Extraktverdünnungen vorgenommen wurden. Natürlich muß beachtet werden, daß diese Schätzungen nur angenähert sind und daß darüber hinaus die Markierungszeit, die Dichte der Kultur und sogar der gewählte Wirt nicht für die Expression eines VP1-enthaltenden Fusionsproteins optimal sein müssen.

DNA-ffragment Kartierung und Nucleotidsequenz-Bestimmung

Zur Bestimmung der Nucleotidsequenz des für YFi kodierenden Gens sowie der Nucleotidsequenz des VP1-1 DNA-Inserts und der durch diese Gene kodierten Aminosäuresequenzen wurde pFKCDV-iO3A· von Kolonien wie oben beschrieben isoliert und dieses Plasmid zur Bestimmung der Nucleotidsequenzen des IFMDV-Inserts verwendet. Dieses Plasmid wurde gewählt, weil es zumindest das volle Strukturgen für VP1 enthält.

Die physikalische Karte dieser FMDV-Region wurde wie zuvor beschrieben durch Digestion mit verschiedenen Restriktionsenzymen (New England Biolab oder BRL) in den empfohlenen Puffern nach bekannten Verfahren konstruiert. Die Digestionsprodukte wurden auf Agarosegelen in 40 mM Tri-HOAc (pH-Wert 7,8), 2 mM EDTA der Elektrophorese unterzogen. Sie wurden nach der visuellen Beurteilung durch Eärben mit Ithidiumbromid analysiert und mit

δψ

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der ausführlichen physikalischen Karte von pBR322 verglichen (J.G. Sutcliffe,"Complete Nucleotide Sequence Of The Eseherichia coli Plasmid pBR322" ("Vollständige Nucleotidsequenz des Bscherichia coli Plasmids pBR322)₍, Cold Spring Harbor Symposium, 43, I, S. 77 - 90 (1978)). Eine Restriktionskarte des Inserts wurde auf der Basis dieser Digestionsmuster konstruiert (Fig. 8), und die Karte wurde durch Sequenzierung der eingeschränkten DNA verfeinert, und zwar im wesentlichen wie von A.M. Maxan und W. Gilbert, "A New Method For Sequencing DNA" (Eine neue Methode zur Sequenzierung von DNA), Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 74, S. 560 - 564 (1977) beschrieben.

Fig. 8 zeigt die verschiedenen Restriktionsfragmente (die Kreise deuten die Markierung und die Pfeile die Richtung der Sequenzierung an) und die angewandte Sequenzierungsstrategie. Fig. 9 und 10 zeigen den relevanten Abschnitt der Nucleotidsequenz des DNA-Inserts FMDV-1034. Vergleicht man das durch diesen DNA-Insert kodierte Polypeptid mit der Sequenz von 40 Amino-terminal-Aminosäuren von authentischem VP1, bestimmt von K. Strohmaier, u.a., supra, so hat ep ^; den Ans eh. ein, als ob das gewählte Orientierungssystem (reading frame) stimmt und die Nucleotide 1 - 639 von FMDV--1034 für das gesamte Capsidprotein VPI von FMDV, Typ 0, kodieren, d.h. das Strukturgen von VP1 enthalten (Fig. 9 und 10).

Aminosäuren 1-40 FMDV-1034 entspricht vollkommen der zuvor bestimmten VPI-Aminosäuresequenz, außer an den Aminosäuren 33 und 38, an denen die früheren Bestimmungen fraglich sind. Der C-Terminus von V'P1 ist unbestimmt. Auf der Basis unveröffentlichter Ergebnisse von Strohmaier, u.a., der vorläufige COOH-Terminal-Aminosäuresequenzdaten und Aminosäurezusammensetzungswerte für Peptidfragmente (20 bis 30 Aminosäuren) von dem COOH-Terminalende von VP1 vorlegt, scheint sich das Protein etwa 213 Aminosäuren weit von der dargestellten Sequenz zu erstrecken.

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Daher besteht der Rest des Inserts höchst wahrscheinlich aus anderen Nucleotiden des FMDV-Genoms, als den für VP1 kodierenden.

Außerdem gestatten die in Fig. 9 und 10 gezeigten Nucleotid- und Aminosauresequenzen die Bestimmung der dadurch von DNA-Insert VP1-1 kodierten Nucleotidsequenz und Aminosäuresequenz. Dieser Insert erstreckt sich von der BamHI-Restriktionsstelle in FMDV-1024 - Aminosäure 9 von VP1 - bis zur Hindlll-Restriktionsstelle in FMDV-1034. Dieser letztere Abbruch befindet sich etwa 79 Aminosäuren hinter Aminosäure 213, dem geschätzten COOH-Terminus von VFl. Daher besteht der FMDV-verwandte Insert in VFi-1 aus etwa 852 Basenpaaren, die für 284 Aminosäuren kodieren.

Die bestimmte Nucleotidsequenz von VF1-1, die bekannte Sequenz von MS2 und pBR322 und eine Bestimmung der Nucleotidsequenzen an der Fusion von VP1-1 mit MS2 und pBR322 bestätigen die Schluf folgerung, daß es sich bei dem durch E. coli NF1 (AN^prp^cL..-*

Ji- «·. . bygi :

pPL-VPi-1) verwirklichten Protein um ein Fusionsprpdukt handelt, das aus den 99 Aminosäuren von in pPLc24 vorhandenem pS2, jlön ; etwa 205 Aminosäuren von VFl (Aminosäuren 9 bis 213), den etwa 79 Aminosäuren, die durch die zusätzlichen Nucleotide des in VP1-1 vorhandenen FMDV-Genoms kodiert wurden, und den etwa 13 Aminosäuren von pBR322, die dem ersten Stoppcodon in dem richtigen Orientierungssystem (reading frame) vorausgehen, besteht. Die Größe dieses Fusionsproteins stimmt mit dem ~ 45 000 48 000 d Protein überein, das in den oben erläuterten Minizellen isoliert wurde.

Wichtig ist die Feststellung, daß der Insert in pPL-VPI-1, obwohl er nicht für die vollständige Aminosäuresequenz von VP1 kodiert, genügend der VFl-spezifischen Nucleotidsequenz enthält, um ein Fusionsprodukt zu erzeugen, das die Spezifität eines Virus-Antigens von FMD aufweist (supra).

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Außerdem sollte man sich darüber im klaren sein, daß die Erfindung nicht auf das bestimmte Fusionsprotein beschränkt ist. Stattdessen können das vollständige VP1-Protein oder andere antigenisch spezifische Fragmente' oder Derivate davon einschließlich Polypeptide, die nur einen Teil von VP1 enthalten, oder Polypeptide, die Aminosäuren zusätzlich zu denen von VP1 oder E'ragmente davon, entweder alleine oder als Teil von Fusionsproteinen enthalten, durch Methoden erzeugt werden, die den oben anhand von Beispielen erläuterten analog sind, und für Methoden und Zusammensetzungen verwendet werden, durch die Tiere zumindest eine Zeit lang gegen FMD-Virusinfektion geschützt werden können. Zum Beispiel könnte pFMDV-1034 mit Pstl und HindiII gespalten werden und die jeweiligen Enden z.B. durch Exonuclease-Behandlung zurückgezogen (chewed back) werden, bis die Enden dicht bei Aminosäure 1 und 212 von VP1 liegen, z.B. bis etwa Aminosäure -10 und 220 oder Aminosäure 15 und 150, bevor das Fragment für die Insertion in den Expressions-Kontroll-Vektor vorbereitet wird. In gleicher Weise könnte das BamHI/ Hindlll-Fragment von pFMDV-1034 zu einem entsprechenden einsträngigen Fragment von pFMDV-1054- oder einer anderen DNA-Sequenz hybridisiert werden, die das volle VP1-Strukturgen und das volle Gen enthält, das als Template zur Verlängerung der BamHI/ Hindlll-Fragmentes bis zum Beginn, dichter an den Beginn heran oder über den Beginn der VP1-Kodierungssequenz hinaus verwendet wird. Schließlich könnten andere Fragmente oder Derivate des VPi-Gens, dessen Polypeptide antigenische Aktivität gegenüber FMDV besitzen, für die Verwendung in den erfindungsgemäßen Prozessen erzeugt werden, z.B. durch Veränderung der oben beschriebenen Manipulationen.

In einem Beispiel derartiger Manipulationen wurde pPL-VPI-1 mit BamHI unter Anwendung der von Lieferanten empfohlenen Bedingungen digeriert und 40 /ug des digerierten Fragmentes mit drei Einheiten BaI 31 (BRO) in 750/ul BaI 3I Puffer (12 mM GaCl₂, 12 ml MgOl , 600 mM HaOl, 20 mM Tri-HCl (pH-Viert 8,1), 1 mM EDTA)

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vermischt. Nach Inkubationszeiten von 2, 6, 10, 14- und 20 Minuten wurden Aliquoten entnommen und wie üblich zur Zerstörung von etwa zurückgebliebenem BaI 31 phenolisiert und mit BtOH ausgefällt. Die resultierenden DNA-Fragmente wurden durch Stump! Enden-Ligation rezirkularisiert, um Plasmide zu bilden, die Deletionen verschiedener Länge an beiden Seiten der BamHI-Stelle von pPL-VPi-1 haben. Diese Plasmide ("pFMDY-1034-Bal") wurden zum Transformieren von E. coIi M5219 wie zuvor beschrieben verwendet. Vierhundert Kolonien wurden selektiert und auf die Erzeugung von Polypeptiden mit der Spezifität von FMD-Virus-Antigenen mit Hilfe der Broome-Gilbert-Analyse getestet. Die Größenbestimmung der Plasmide von den positiven Kolonien bestätigte, daß die Plasmide bis zu 400 Nucleotide kleiner waren als das Ausgangs-pPL-VPI-1. Außerdem waren die durch diese positiven Kolonien erzeugten Fusionsproteine bis zu 1JO - 150 Aminosäuren kleiner als die entsprechenden Proteine, die durch die pPL-VP1-1 transformierte Wirte erzeugt worden waren.

Diese S_erie von BaI 3>1 Deletionen bestätigt, daß der antigenische T_eil von VP1 nahe dem COOH-Terminus von VFi liegt, weil die BaI J1 Deletionen 60 bis 75 Aminosäuren von dem NH₂ Terminalende von VP1 entfernt wurden, ohne die Antigenwirkung des Proteins zu zerstören. Außerdem zeigt sie, daß erfindungsgemäße DNA-Sequenzen, die nur einen Teil von VP1 enthalten, erfolgreich für die Erzeugung von Produkten, die die Spezifität von FMD~Virus-Antigenen haben, durch Expression in entsprechenden Wirten verwendet werden können. Desweiteren liefern die erfindungsgemäßen Nucleotidsequenzen bisher nicht verfügbare Informationen über die Aminosäuresequenzen von Produkten, die die Spezifität von FMD-Virus-Antigenen aufweisen. Diese Information ermöglicht dann die chemische Synthese von kleinen Peptidfragmenten, deren Aminosäuresequenzen denjenigen Sequenzen entsprechen, die durch die Nucleotidsequenzen des antigenischen DNA-Fragmentes kodiert wurden. Diese synthetischen Proteine kön nen dann für Impfstoffe und Methoden verwendet werden, durch di

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Tiere zumindest eine Zeit lang gegen FMDV geschützt werden können. Es ist klar, daß diese Verfahren und diese Produkte einen Teil der Erfindung bilden.

Die Plasmide mit den BaI y\ Deletionen sind auch als Quelle von VPI-verwandten DNA-Sequenzen für die Insertion in andere CIoningvektoren und Wirte verwendet worden. Zum Beispiel wurde eines der Plasmide mit BaI 31 Deletionen (¹¹S¹MDV-1O34-Bal-1^M) mit EcoRI und Hindlll digeriert und das resultierende EcoRI-Hindlll-Pragment in pBR325 als Ersatz für das darin befindliche EcoRI-HindIII-Fragment eingefügt. In diesem Vektor erfolgt die Transcription des Hybridgens unter der Kontrolle des Chloramphenicol-Acetyltransferase-Genpromotors. Nach der Transformation von E. coli M 5219 mit dem resultierenden Hybridplasmid und Züchten der transformierten Zellen wurden bei den üblichen Analysen positive Kolonien beobachtet, die VP1 verwandte Antigene erzeugen.

Obwohl sich das obige Beispiel vorwiegend mit Manipulationen von I¹IiDV-IOJA- befaßt, ist die Erfindung nicht darauf beschränkt. Stattdessen können auch andere IPMDV-DNA enthaltende Clone in einer ähnlichen Weise zur Erzeugung von Hybridplasmiden verwendet werden, die in entsprechenden Bakterienwirten die verbesserte Expression von durch solche DNA-Sequenzen dafür kodierten antigenischen Polypeptiden ermöglichen. Zum Beispiel können andere FMDV-verwandte DNA-Sequenzen wie FMDV-144, FMDV-7I5, FMDV-1824, PMDV-I933 oder zu ihnen hybridisierende DNA-Sequenzen in einer ähnlichen Weise wie der für FMDV-1034- beschriebenen behandelt werden, um die Ausbeute und Aktivität von durch sie kodierten Polypeptiden zu verbessern.

Zum Beispiel wurde E. coli FMDV-1448 (Fig. 3)» einer der von der anfänglichen Sammlung von Clonen isolierten Clone wie oben verwendet, um pMDV-1448 und DNA-Sequenz FMDV-1448 zu isolie-

.St'- 2299A6 O

ren. Diese DNA-Sequenz wurde dann zur Bestimmung der Nucleotidsequenz von VP3 in einer ähnlichen Weise verwendet, wie sie zur Bestimmung der Nucleotidsequenz von VPI von EMDV-1034 angewandt wurde. In Fig. 11 wird die kürzlich bestimmte Nucleotidsequenz (und ihre entsprechende Aminosäuresequenz) von VP3 gezeigt.

Die durch Nucleotidsequenzierung von FMDV-1448 bestimmte Aminosäuresequenz für VP3 entspricht durchaus der durch Proteinsequenzierung für die ersten 32 Aminosäuren von authentischem VP3 durch K. Strohmaier, u.a., supra, "bestimmten. Bei dieser Sequenz hat es den Anschein, als ob FMDV-1448 an Aminosäure 9 (Asp) von VPJ beginnt und sich in VP1 fortsetzt, wobei Aminosäure 221 (Thr) von Fig. 11 als die erste Aminosäure von VP1 bestimmt worden ist (Fig. 3 und 9)· Der einzige Unterschied zwischen der Aminosäuresequenz der Aminosäuren 9 bis 32 von FMDV-1448 und authentischem VP3 tritt an Aminosäure 23 auf, wo die Nucleotidsequenzierung Asp vorausgeht und die Proteinsequenzierxing Thr ergab. Außerdem wurde das Nucleotid an Position 310 bisher noch' nich^ ^s^impvf;. -Daher .kann die Aminosäure an Position 121 Phe, Leu, He oder VaX S^n. ?s ist ungewiß, wo VP3 endet, da kein Stopp-Codon vor d^m Beginn von VP1 vorhanden ist. ' '

Ein weiteres Beispiel für derartige Manipulationen ist die Erzeugung von VPi zusammen mit mindestens einem VP3, VP2 oder VP4 von FMDV, (Typ O^jK, um ein kombiniertes antigenisches Produkt herzustellen. Am besten wird das Primärprodukt P88 (siehe Fig. 1) in einem entsprechenden Wirt erzeugt, wobei die erfindungsgemäßen DNA-Sequenzen, Eekombinant-DNA-Moleküle und Verfahren angewandt werden, um ein antigenisches FMDV-Primärprodukt zu erzeugen, das für Impfstoffe und Methoden zur Behandlung von Tieren nützlich ist.

229946 O

Anwendung der erfindungsgemäßen antigenischen Polypeptide für immunogenetische Zusammensetzungen in vivo

Die verschiedenen oben beschriebenen Immunoanalysen bestätigen, daß die erfindungsgemäßen DNA-Sequenzen und Rekombinant-DNA-Moleküle die Erzeugung von antigenischen Polypeptiden gegen FMDV bestimmen. Die DNA-Sequenzierung hat ergeben, daß einige dieser Rekombinant-DEA-Moleküle Inserts enthalten, die zumindest einen großen Anteil des für Capsidprotein VP1 kodierenden Strukturgens aufweisen. Andere dieser Clone haben die vollständige Sequenz von VP1 und die vollständigen oder partiellen Sequenzen von VP2 und VP3, Diese Angaben in Verbindung mit der bekannten Nützlichkeit von Capsidprotein VP1 in Impfstoffen gegen FMDV (Bachrach, u.a., supra) deuten darauf hin, daß die erfindungsgemäß erzeugten antigenischen Polypeptide nützlich für Impfstoffe gegen FMDV sein werden. Es sind in vivo Versuche mit den erfindungsgemäßen antigenischen Polypeptiden vorgenommen worden. Wie zu erwarten war, sind die Ergebnisse von der Menge und Reinheit des von dem Wirt erzeugten antigenischen Produktes abhängig, sie bestätigen aber die Nützlichkeit der erfindungsgemäßen Polypeptide und Verfahren.

Beispielsweise wurde der nicht gereinigte Extrakt von E. coli NF1 CAN-cro-cI^-pPL-VPI-i) in Mäuse injiziert. Von diesen Mäusen erzeugtes Serum brachte schwach positive Ergebnisse bei Analysen hinsichtlich der Anwesenheit von FMD-Virus-Antikörpern, Außerdem wurde das Proteinband bei ^45 000 d von dem Bakterienextrakt von E. coli NF1 G)N^-CrO^-Cl^-PPL-VPi-I) auf einem PoIyacrylamidgel abgetrennt. Das resultierende Band wurde von der Platte entfernt, zerkleinert und zum Impfen von einem Kaninchen und fünf Mäusen verwendet. Nach einer Serie von drei Immunisierungen wurde Serum von diesen Versuchstieren auf die Anwesenheit von Antikörpern gegen FMDV hin analysiert. Das Mäuseserum

125

brachte bei der direkten Bindung mit Protein-Sepharose- "Ί-markiertem Virus und bei Radioimmuno-Konkurrenzanalysen positive Ergebnisse. Dagegen wurden negative Ergebnisse bei der

229946 O

J^zym-verknüpften-Sorpti onsm.it tel-Analyse (ELISA) erzielt, und das Serum neutralisierte nicht aktive Viren, was vermutlich auf seinen niedrigen Antikörper-Titer zurückzuführen ist. Negative Ergebnisse wurden bei allen Analysen mit dem Kaninchenserum erzielt.

Schließlich wurde das Obenstehende von einem Zellextrakt (wie

11

oben) von annähernd 10 Bakterien/ml etwa 10-fach durch umfassende Behandlung mit Nucleasen und Chromatographie auf G100 Sephadex gereinigt. Der Ausgangsextrakt und der G-100-Peak wurden darin zum Impfen von drei Ziegen verwendet. Jede Ziege wurde mit drei verschiedenen Präparaten geimpft: Extrakt-Freund-Adjuvans, Extrakt-c tf -Gel und Extrakt-vernetzt mit Glutaraldehyd. Mach drei Immunisierungen zeigten zwei der Ziegen eine positive Immunreaktion (ELISA). Somit ist die Immunogenetik der erfindungsgemaß von Bakterien erzeugten FMDV-verwandten Antigen bei Tieren demonstriert worden, die für FMDV-Infektionen empfän lieh sind. Die Neutralisation von aktiven Viren konnte wahrscheinlich wegen des niedrigen Antikörpertiters nicht beobachtet werden. Die Immunisierung mit noch besser gereinigtem Antigen wird vielleicht zu Seren in Tieren führen, die aktive FMDV neutralisieren. Die nach erfindungsgemäßen Verfahren erzeugten Produkte sind somit in vivo aktiv und erzeugen Antikörper, die die Spezifität von FMD-Virus-Antikörpern haben. Es muß natürlich beachtet werden, daß die nach den erfindungsgemäßen Verfah ren gewonnenen Produkte nicht alleine zur Vakzination von Tiere verwendet werden müssen. Stattdessen können die Produkte physikalisch, chemisch oder durch eine modifizierte Konstruktion der für sie kodierenden DNA-Sequenzen, mit anderen allgemein bekann ten Verbindungen, die die immunologische Wirkung und die Haltbarkeit des Impfstoffes verbessern, kombiniert werden.

Identifikation von anderen, die Spezifität von Virus-Antigenen von FMDV aufweisenden Proteinen '

2 9 9 4 6 O

Die erfindangsgemäßen Methoden und Verfahren sind selbstverständlich nicht auf die Identifikation und die Anwendung von DNA-Sequenzen und Recombinant-DNA-Molekülen beschränkt, die durch mindestens einen Abschnitt der_#DNA-Sequenz gekennzeichnet sind, die für das Gapsidprotein VPI oder die anderen antigenischen Proteine von S¹HaIDV₅ Typ 0, kodiert. Diese Methoden und Verfahren können auch in gleicher Weise von Fachleuten dazu angewandt werden, andere DNA-Sequenzen und Rekombinant-DNA-Moleküle, die in entsprechenden Wirten die Produktion von anderen, die Spezifität von FMDV-Antigenen aufweisenden Polypeptiden dirigieren, zu selektieren und einzusetzen,ohne vom Geltungsbereich der Erfindung abzuweichen, z»B_e DNA-Sequenzen und Rekombinant-DNA-Moleküle^· die durch eine Kombination von DNA-Sequenzen, die für verschiedene antigenische Proteine eines einzigen FidDV-Serotyps kodieren, gekennzeichnet sind, DNA-Sequenzen und Rekombinant-DNA-Moleküle, die durch DNA-S e;quenz en, die für antigenische Proteine anderer FMDV-Serotypen kodieren, gekennzeichnet sind, DNA-Sequenzen und Rekombinant-DNA-Moleküle, die durch eine Kombination von DNA-Sequenzen, die für verschiedene Kombinationen von antigenischen Polypeptiden von mehr als einem IMDV-Serotyp oder allen FMDV-Serοtypen kodieren, gekennzeichnet sind, und DNA-Sequenzen und Rekombinant-DNA-Moleküle, die durch DNA-Sequenzen, die für ein einziges breites Spektrum antigenischer Polypeptide verschiedener FIvIDV-S er ο typ en kodieren, gekennzeichnet sind«

Beispielsweise können die erfindungsgemäßen Methoden dazu angewandt werden, die mRNA von anderen FMDV-Serotypen zu isolieren, und diese mRNA, die wie in der Erfindung beschrieben, durch ihre cDNA analysiert und geclont wurde, zur Erzeugung von Produkten verwenden, die gegenüber diesen Serotypen Antigenwirkung aufweisen. Diese Produkte können dann alleine in monovalenten Impfstoffen oder zusammen mit Produkten, die mit den anderen FMDV-Serotypen verwandt sind, in bivalenten Impfstoffen oder solchen mit einem breiteren Spektrum eingesetzt werden.

-»-229946

Noch besser ist es, wenn die erfindungsgemäßen DNA-Sequenzen unc Rekombinant-DNA-Moleküle direkt verwendet werden, um die Herstellung von DNA-Sequenzen und Rekombinant-DNA-Molekiilen zu ermöglichen, die in entsprechenden Wirten die Erzeugung von Polypeptiden dirigieren, die die Spezifität von FMD-Virus-Antigenen von anderen FMDV-Serotypen aufweisen· Dieses direkte Verfahren ist möglich, weil jetzt ermittelt worden ist, daß die mRNAn der anderen FMD-Virus-Serotypen der mRNA von Untertyp 0^K vollkoromen homolog sind. Diese Homologie ist auch in dem Bereicl der Capsidprotein-verwandten Segionen der mRNAn zu finden. Dahei können die erfindungsgemäßen DNA-Sequenzen und Rekombinant-DNA-Moleküle eingesetzt werden, um die Synthese von DNA-Sequenzen von den anderen FMDV-Serotypen zu dirigieren.

In groben Zügen ist dieses Verfahren dadurch gekennzeichnet, daJ von FMDV-1034- oder einer anderen Sequenz eine Reihe von kleinen "Starter"-Fragnienten, die nahe am Beginn der antigenischen Region von VPI liegen, erzeugt wird. Diese Fragmente werden dann dazu verwendet, durch Hybridisierung die entsprechende homologe Region in den inRNAn von anderen FMDV-Serotypen zu·lokalisieren. Sobald diese vorgesehene Region der mRNA lokalisiert worden ist wird von ihr eine cDNA-Kopie unter Verwendung des hybridisierte] Fragmentes als "Primer" hergestellt. Die cDNA kann dann wie obej beschrieben zur Konstruktion von Rekombinant-DNA-Molekülen und zur Erzeugung des verlangten antigenischen Polypeptids in entsprechenden Wirten verwendet werden. Alternativ kann die Nucleo tidsequenz und daher die entsprechende Aminosäuresequenz der verlangten Region der mRNA oder cDNA bestimmt werden und diese Sequenz zur Herstellung des verlangten antigenischen Produktes mit Hilfe herkömmlicher chemischer Verfahren für die anschliess ende Verwendung in FKIDV-Impf stoffen und Behandlungen verwendet werden.

In.Fig. 12 wird gezeigt, wie zum Beispiel FMDV-10J4 in fd ge-

Ό Γ $% ä. Λ, fb λ Λ.

/MHAh

clont wurde (um die doppelsträngige FMDV-1034- DNA einsträngig zu machen), und zwar in einer Orientierung, die die Erzeugung des Minus-DNA-Stranges von FMDV-1034 ermöglichte. Der Mimis-DNA-Strang wurde anschließend mit Haelll eingeschränkt (siehe Fig_e 12) und die resultierenden verschiedenen kleinen Fragmente ("FMDV-1O34- (Haelll)¹¹) wurden unter Anwendung von Standardverfahren mit ^ -P markiert» Diese Fragmente wurden dann zu der Total-mRNA hybridisiert, und wie oben .'beschrieben von einem anderen l''iv'£D\T-Serotypj Z₀B_n Serotyp A, in Figo. 12 isoliert. Durch die Hybridisierung kann der Bereich, der unmittelbar der VP1 antigenisch verwandten Portion von mBMA vorausgeht, lokalisiert werden. Dann wurde das hybridisierte fragment als "Primer" zur Herstellung von cDNA von den jeweiligen ENA-Hegionen mit Beverstranscriptase verwendet (Fig® 12). Die cDNA wurde dann wie zuvor mit DJMA-Polymerase doppelsträngig gemacht und in eine entsprechende vVirt/Vektor-Kombination zur Erzeugung von Produkten eingefügt, die die Antigenwirkung von Virus-Antigenen von FMDV, Typ A, aufweisen«, Alternativ warden die Regionen der mRNA, die durch Hybridisierung an dem markierten Fragment oder der cDNA-Kopie davon lagen, sequenziert, und diese Sequenz wurde dazu verwendet, um durch herkömmliche chemische Verfahren Peptide herzustellen, die die Antigenwirkung der Virus-Antigene dieser Serotypen aufweisen» Die erfindungsgemäßen Methoden und Produkte sind somit nicht nur für die Herstellung von Produkten, die die Antigenwirkung von FMD Typ 0^K Virus-Antigenen aufweisen, sondern auch für Verfahren zur Herstellung von Antigenen gegen andere FMDV-Stämme.

Nach den hier beschriebenen Verfahren hergestellte Mikroorganismen und Rekombinant-DNA-Moleküle sind durch Kulturen vertreten, die in der Kultur'ensammlung der American Type Culture Collection in Rockville, Maryland_s am 5» Mai 1980 hinterlegt und als FMDV-A bis C identifiziert wurden«

A: Eo coli HFl01 (pBR322(Pst)/FMDV-7i5 Bs E. coli HFI01 (pBR322(Pst)/EMDV-331 Gs E. coil HFI01 (pBEJ22(Pst)/FMDV~i44

8- 22 9 94 6

Diese Kulturen erhielten die Zugangsnummern ATGC 31640, 31641 bzw. 31642.

Nach den hier beschriebenen Verfahren hergestellte Mikroorganismen und Rekombinant-DNA-Moleküle sind auch durch Kulturen vertreten, die in der Kulturensammlung von Deutsche Sammlung von Mikroorganismen in Göttingen, Westdeutschland, am 12. Mai 1980 hinterlegt und als PMDV-D bis G identifiziert wurden D: E. coli HB101 (pBR322(Pst)/PMDV-703) ^E* ^E· coli HB101 (pBR322(Pst)/PMW-1034) HB101 (pBR322(Pst)/PMDV-1824)

G: E. coli HB101 (pBR322(Pst)/PMDV-1933)

Diese Kulturen erhielten die Zugangsnummern DSM 1814 bis 1817. Nach den hier beschriebenen Verfahren hergestellte Mikroorganismen und Rekombinant-DNA-Moleküle sind auch durch Kulturen vertreten, die in der Kulturensammlung von Deutsche Sammlung von Mikroorganismen in Göttingen, Westdeutschland, am 31· Juli 1980 hinterlegt und als PMDV-A bis G identifiziert wurden. ^A* a» coli W6 B: E. coli NP1

0: E. coli Nff1 (^lCcro""cI_ts-pPL-VP1-5)

Diese Kulturen wurden mit den Zugangsnummern 1879 bis 1881 versehen. Obwohl vorstehend eine Reihe von Ausführungsformen der Erfindung beschrieben wurde, so ist klar, daß die grundlegende Konstruktion verändert werden kann, um andere Ausführungsformen unter Anwendung der erfindungsgemäßen Verfahren und Zusammensetzungen zu schaffen. Daher wird der Geltungsbereich der Erfindung durch die angefügten Ansprüche und nicht durch die oben anhand von Beispielen erläuterten speziellen Ausführungsfoimen begrenzt.

Claims (15)

1. 2ΊΠΠ / C Λ /a 34b

   544 56 οβ

   Erfindunffsanspruch g

   1. Verfahren zur Herstellung eines die Spezifität von FB©~7irus-Antigenen aufweisenden Polypeptide, gekennzeich»- net durch die Schrittes Süchtea siaes Wirtes* der durch ein Rekombinant-DNA-Molekül transformiert wurde, das durch Einfügen einer aus der Gruppe, bestehend aass (a) FMDV- -7151 FMDV-144, FMDV~1034_s FMDV-1448, FMDV-1824, E¹MDV-IgSS, (b) DNA-Sequenzen^ die zu einer der vorstehenden DNA-Sequenzen hybridisiereng (c) DNA-Sequenzen, gleich aus welcher Quelle stammend.} einschließlich natürlicher, synthetischer oder halbsynthetischer Quellen^ verwandt durch Mutation., einschließlich einfacher oder mehrfacher, Basensubstitutionen_s Deletionen_s Insertionen und Inversionen mit einer der vorstehenden DNA-Sequenzeng und (d) DNA-Sequenzen₈ die Sequenzen von Codons aufweisen, die für ein Antigen-Polypeptid kodieren, das eine ähnliche Aminosäuresequenz wie die durch die Codons einer der vorstehenden DMA-Sequenzen kodierten enthält, ausgewählten DNA-Sequenz in ein Cloningvehikel erzeugt wurdet und Sammeln des Polypeptide _β ,

   2» Verfahren nach Punkt 1, gekennzeichnet dadurch, daß die zu mindestens einer der DNA-Sequenzen (a) hybridisierende DNA-Sequenz (b) aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus (e) VP-I₉ VPI-1, VP1-»5_S FMDV-1034-Bal, PMDV-103^Bal (EooEI-Hindlll), (f) DNA-Sequenzen, die zu einer der vorstehenden DNA-Sequenzen hybridisieren (g) DNA-Sequenzen, gleich aus welcher Quelle stammend, einschließlich natürlicher_s synthetischer oder halbsynthetischer Quellen, verwandt durch Mutation,, einschließlich einfacher oder mehrfachers, Basensiibstitutionen, Deletionen_s Insertionen und

   _J?_ 2299Λ6 α

   Inversionen mit einer der vorstehenden DNA-Sequenzen, und (h) DNA-Sequenzen, die Sequenzen von Codons aufweisen, die für ein Antigen-Polypeptid kodier&n, das eine ähnliche Aminosäuresequenz wie die durch die Oodons einer der vorstehenden DNA-Sequenzen kodierten enthält.
2. 3. Verfahren nach Punkt 1 oder 2, gekennzeichnet dadurch, daß die für mindestens eine der DNA-Sequenzen (a) oder

   (e) hybridisierende DNA-Sequenz (b) oder (f) aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus (i) Haelll-Fragmenten von FMDV-715, FMDV-144-, FMDV-1O34, E¹MDV-IW, FMDV-1824, FMDV- -19331 VPi-1, VPI-51 FMDV-1034-Bal, FMDV-1034-Bal-i (EcoRI-Hindlll), und (3) Sequenzen, die zu einer der vorstehenden DNA-Sequenzen hybridisieren· ^:
3. 4. Verfahren nach einem der Punkte 1 bis 3i gekennzeichnet dadurch, daß die für mindestens eine der DNA-Sequenzen (a), (e) oder (i) hybridisierende DNA-Sequenz (b), (f) oder (j) aus der Gruppe ausgewählt wurde, bestehend aus DNA-Sequenzen, die für ein einziges Antigen-Polypeptid eines einzig gen FMDV-Serotyps kodieren, DNAfSeqi,ie,p|n_? die -für. ei&er ^f Kombination von Antigen-Polypeptiden §in$s einzigen FMDV- -Serotyps kodieren, DNA-Sequenzen, die für eine Kombination von Antigen-Polypeptiden von mehr als einem FMDV-Serotyp kodieren, und DNA-Sequenzen, die für ein einziges Antigen- -Polypeptid von mehr als einem FMDV-Serotyp kodieren.
4. 5. Verfahren nach Punkt 4, gekennzeichnet dadurch, daß der FMDV-Serotyp aus der FMDV-Typ 0, A, C, SAT 1, SAT 2, SAT 3 und Asian Typ 1 umfassenden Gruppe ausgewählt wurde·

   46 O

   6« Verfahren nach, einem der Punkte 1 bis 5₉ gekennzeich net dadurchg daß die DNA~-3equenz aus der aus DHA--Seguenzen der folgenden Formel ·

   ACCAOTTCTGOGG-GOGAGTCAGCGGATOOTGTCACOAGCAOOGTTGAAMOTAOG GTGGOGAAAOAOA(XATCUAGAGGCGGOiACAGAOGGACGTGEC" TTOi ^O ATGGA OAGATTTGTGAAG-GTGAGAGOGCAAAiXJCMATT-AAGATT¹ITGGACOT-GATGCAG ATTCGATGACAGiGTTTGGTGGGAGGAGTOGTAOGGGCGTGCACEBAumCTTCT CTGAGTTGGAGATiLGGAGTM.AAGAOGAGGGAGAOGTGAGG^GGGTTCOAMTGG AGCGGGOG-MAAGGCGTTGGACM-GAOOAGGAA-OCGM-GTGGTTACCAGMGGOa CCACTCAOCCGGOTTGGCCTGCCTOACAGTGOGGCGGAGGGGGTGTTGGOMOCg tgtacmcggtgagtggaggtagmoagamtgotgtggogmottgagaggtga cgttgaggtgttgggtgaamggtgggacggaggctgogtaggtocttomotao ggtggoatcmagggaggcgggtgaccgagttgotttaggggatgmgagggoog aaacatactgtggaaggcgcttgotggcmtcgacccmotgmgocagagaom AGAGMAiITTGTGGGAGGGGTGAMGAGAGTTTG und Fragmenten und Derivaten davon bestehenden Gruppe ausgewählt wurde_s wobei die Fragmente und Derivate für Antigen-Polypeptide von FMDV kodieren»

   7* Verfahren nach einem der Punkte 1 bis 5» gekennzeichnet dadurch, daß die DHA-Sequenz aus der DNA-Sequenzen der Formels
   GCGACXIGOTATG(MGGOCTOGTcGAOOAC i^! I

   atgggaaagtgttoaagggggcgcg-omggagttgcgggggcgtttoiacomcg tccttgatgtgggtgagggatgogggacgtttgtgggcttogagggtggcgtao ogtacgtgacgacgaaaagggagtgggagacggtacttggtgagtttgaoatgt ctttgggagcamagamtgtgmaoagcttogtcgoaggtgttgoggagtao tagaoagagtagagtgggaogatcaaggtggagttoatgttcagaggaogoaotg acgcgaaggggggttagatggttgcgtaggggggactagggatggagooggcga agacaggtgagggggggggggaotggattgatgctgaatgggaoagtgggttm actcaaagtttagtttttgcatcgcgtacotgtcggcggocgattaogogtaoa cggcgtgtggggtgggcgagacoaoamtgtggagggatgggtgtgottgttto

   .£.229946

   AAATTAOACAOJGGOAAGKiOCGACGGCXiACGCTOaXSGTCGa^OTGGOTAGTGOTG GTAAAGACTOiTOAGCTAAGKiOaXlOOGKjaiGGAOGOCCJGTGCIGGAA und Fragmente und Derivate davon umfassenden Gruppe ausgewählt wurde, wobei die Fragmente und Derivate für Antigen-Polypeptide von FMDV kodieren·

   8· Verfahren nach einem der vorstehenden Punkte, gekennzeichnet dadurch, daß die DNA-Sequenz ausgewählt wird aus der Gruppe, bestehend aus FMDV-703, FMDV-331, DNA-Sequenzen, die zu einer der vorstehenden DNA-Sequenzen hybridisieren, DNA-Sequenzen, gleich aus welcher Quelle stammend, einschließlich natürlicher, synthetischer oder halbsynthetischer Quellen, verwandt durch Mutation, einschließlich einfacher oder mehrfacher, Basensubstitutionen, Deletionen, Insertionen und Inversionen mit einer der vorstehenden DNA-Sequenzen, und DNA-Sequenzen, die Sequenzen von Codons aufweisen, die für Antigen-Polypeptide kodieren, die eine ähnliche Aminosäuresequenz wie die durch die Codons einer der vorstehenden DNA-Sequenzen kodierten enthalten.

   9· Verfahren nach einem der vorstehenden Punkte, gekennzeichnet dadurch, daß es den zusätzlichen Schritt der Einfügung einer Expressions-Kontroll-Sequenz in das Cloningvehikel umfaßt, wobei die Expressions-Kontroll-Sequenz so in das Cloningvehikel eingefügt wird, daß die Expression der DNA-Sequenz kontrolliert und reguliert wird·
5. 10. Verfahren nach Punkt 9i gekennzeichnet dadurch, daß die Expressions-Kontroll-Sequenz ausgewählt wird aus der Gruppe bestehend aus dem E« coli lac-System, dem E. coli trp-System, den Hauptoperator- und Promotorregionen von Phage > , der Kontrollregion von Filamenteοus einsträn-

   4 6 O

   gigen DNA-Phagen, dem ^-Laofeatoase-System von E₈ coli
   Plasmiden oder anderen Sequenzen, die die Expression von Genen prokaryotischer oder eukaryotischer Zellen und deren Viren steuern«,
6. 11. Verfahren nach. Punkt 9 oder 10_? soweit diese Punkte von Punkt 1 abhängen» gekennzeichnet dadurch_? daß das erzeugte Rekombiaant-DNA-MoIeMl aus der pE'MDV-715, pFMDV- -144, pFMDV».1034_s pffMDV-1448, pFMDV-1824 und pPMDV-1933 umfassenden Gruppe ausgewählt wird«
7. 12. Verfahren nach Punkt 9 oder 10, soweit diese Punkte von Punkt 2 abhängen, gekennzeichnet dadurch, daß das erzeugte Rekombinant-DNA-Molekül aus der pPL-VPI-1,
   pPL-VFl-5, pFMDV-1034-Bal und pPI«tDV«-1034-Bal»»1 (EcoRI-

   -Hindlll) umfassenden. Gruppe.; ausgewählt wird«,

   13« Verfahren nach Punkt 9 oder 10, soweit diese Punkte von Punkt 8 abhängen, gekennzeichnet dadurch, daß das erzeugte Rekombinant-DNA-Molekül aus der pPMDV-703 und

   pFMDV-331 umfassenden Gruppe ausgewählt wird„

   14-, Verfahren nach Punkt 1, gekennzeichnet dadurch^ daß die FMD-Virus-Antigene aus der Gruppe von Antigenen für die PMDV-rSerotypen O, A, G₉ SATI₅, SAT2* SAT3, Asian I
   und Kombinationen davon ausgewählt werden,

   15» Verfahren nach Punkt 1, gekennzeichnet dadurch, daß zumindest ein Teil des Polypeptide durch eine aus der
   FMDV-715, PMDV-144, EMDV-IO34, FMDV-1448, MDV-1824-,
   ΡΜ>ν-Ί933 und Fragmente und Derivate davon umfassenden
   Gruppe ausgewählte DNA-Sequenz kodiert wird, wobei das
   Polypeptid die Antigenwirkung von EMD-Virus-Antigenen
   aufweist«,
8. 16. Verfahren nach Punkt 1, gekennzeichnet dadurch, daß zumindest ein Teil des Polypeptide durch eine aus der VP-1, VP1-1, VP1-5, FMDV-1034-Bal, PMDV-1O34-Bal-1 (EcoRI- -Hindlll) und Fragmente und Derivate davon umfassenden Gruppe ausgewählte DNA-Sequenz kodiert vard, wobei das Polypeptid die Antigenwirkung von FMD-Virus-Antigenen aufweist.
9. 17. Verfahren nach Punkt 1, gekennzeichnet dadurch, daß zumindest ein Teil des Polypeptide aus der THRTHRSERAMGLYGLUSERALAASPPROVAMH^ GLYGLUTHRGHTn^LNARGARGGLiraiSTHRASm PHEVAlZiYSVAI/DHRPROGimSNlM

   SERHISTHRLBUVALGLYAIiAIjEULEUARGAIjASERTHRTYRTYEP^ GLUILBAMVAiiYSHISGLUGLYASPLEUTHRTRPVAIiPROASNGLYAMPROGLU LYSAMLEUASPASNTHRTHRASNPROTHRAMTYRHISlÄSAMmOLEUTH^ LEUAMLEUPROHLSTHRAIuAPROHT^ARGVAIZ^AMTHRVAI/K^^ OYSARGTYRASNARGASNAMVALPROASNLEUARGGLYASPIEUGLNVa]J^

   ARGVALTHRGLULEULEUTYRARGMETLYSARGAMGLUTHRTYEC^P^^ LEULEUAMILMISPROTHRGLUAIiAARGHISEYSGLNLYSII^ALAMPROV LYSGLNTHRLEU, ASPPROVALTHRTHRTHRVALGLUASNTYRGLYGLYGLUTHR GLNIIEGLNARGARGKlTjnD^THRASPVAIßERPHEILEMETASPARGPH^ VALTHEPRC^LNASNGl^ra^lASiraijELEUASPIEU^ T.-WTTVA TAT.Y α τ,α T,TnTTT_fTCTTA τ?α Α τ.Α κτφΤΗΒΤΥ^ΤΥΒ'ΡΗ^'Ρΐ? Α ^ΡΤ^τΓτΤ,ττττ^ α τ,α VATJJYSHKGLUGLYASILEUTHRTRWALPROASNGLYAMPROGLULYSAML^^^ ASPASNTHRTHEASNPROTHRAMTYRHKLYSAMI^OLEUTHRARGLEUAIiAJEilU mOHT^THRAMPROHISARGVALLEUAMTHRVATJEYRASNGLYGLUCT^ ASNARGASNAMVALmOASNl^UARGGLYASPIEUGLNVA T.T.TCUAMGLNLYSVAL A τ.Α ΑΤ?αΦΤΠ?τ.·κττρρηΦΤΤΤ?^Κ^ WT,A RNTYP^T-YA T,A tt.t^.YR A J.A ΦΗΤ? A T?flVA T/PHR GLULEULEUTYRARGMETLYSARGAMGLUTHRTYRCTSmOARGPROLEULE^ ILEHT^PROTHRGLUAMARGHT^LYSGLNLYSTJ^AMMPROVALLYSGTJJ

   is

   GLUGLYASELEUTHR^

   OGL·^ SElEffjYSI^

   AI^

   GaHRGianMI^

   LEU und Fragmente und Derivate davon, umfassenden Gruppe ausgewählt wird_ä wobei das Polypeptid die Antigenwirkung von FMD'-Yirus-Antigenen aufweist»

   18* Verfahren nach Punkt 1, gekennzeichnet dadurch^ daß zumindest ein Teil des Polypeptide aus der AspGlyiEyrGly GlyLeuValThxThrAspI^oLysThrAlaAspProYaia^xGlyLysYalPheAsii ProProArgAs nGlriLe uitoDGlyArgPheTh^AB^LjiJiiuAij»ya^A J,§.f |pA|La CJysProThrPheLe uArgPheGluGlyGlyValPr oTyrYalThiKDhrLysThrAsp SerAspThrLe uLeuAlaGlnPheAspMetSerLeuAlaAlaLysGlnMetSerAsn ThrPheLe uAlaGlyLeailaGlnTyrOiyrThrGlnTyrSerGlyThrlleAsnLe u HisPheMet(?)ThrGlyProThrAspAlaLysAlaArgTyrMetValAlaTyrAla ProLe uGlyMe tGluProProLysThrProGluAlaAlaAlaHisOysIleHisAla GluTrpAspThJ^lyLeuÄ-snSerLysPheThrPheSerlleProTyrLeuSerAla AlaAspTyrAlaTyrThrAlaSerGlyYalAlaGluThrThrAsnYalGlnGlyTrp YalGysLeuPheGlnlleThrHisGlyLysAlaAspGlyAspAlaLeuValYalLeu AlaSerAlaGlyLysAspPheGluLe uArgLe uProYalAspAlaArgAlaGlu und Fragmente und Derivate davon umfassenden Gruppe ausge-

   - 22 9 9 46 Uf

   wählt wird, wobei das Polypeptid die Antigenwirkung von FMD-Virus-Antigenen aufweist,

   19· Verfahren nach Punkt 1, gekennzeichnet dadurch} daß zumindest ein Teil des Polypeptide aus der FMDV-7O3i FMDV- -331 und Fragmente und Derivate davon umfassenden Gruppe ausgewählt wird, wobei das Polypeptid die Antigenwirkung von FMD-Virus-Antigenen aufweist.
10. 20. Verfahren nach einem der Punkte 1 bis 20, gekennzeichnet dadurch, daß der Wirt aus der Stämme von E, coli _t Pseudomonas, Bacillus subtilis, Bacillus stearothermophilus« andere Bazillen, Hefen, andere Fungi, tierische oder pflanzliche Wirte und Humangewebezellen umfassenden Gruppe ausgewählt wird.
11. 21. Verfahren nach Punkt 1, gekennzeichnet dadurch, daß der erzeugte transformierte Wirt aus der E. coli HB101 (pBR322(Pst)/FMDV-715), E. coli HB101 (pBR322(Pst)/FMDV- -144), E. coli HB101 (pBR322(Pst)/FMDV-1034), E. coli HB101 (pBR322(Pst)/FMDV-1448), E. coli HB101 (pBR322(Pst)/ FMDV-1824-) und E. coli HB101 (pBR322(Pst)/FMDV-1933) umfassenden Gruppe ausgewählt wird.
12. 22. Verfahren nach Punkt 1, gekennzeichnet dadurch, daß der erzeugte transformierte Wirt aus der E. coli NF1 (>N~cro~cI_ts-pPL-VR1-1), E. coli M5219 (>N⁺cro""cI_ts- -pPL-VPI-1), E. coli W6 (>*_rex-pPL-VP1-5), E. coli M5219 (>-N⁺cro'"cI_ts-pFMDV-1O34-Bal) und E. coli M5219 (?-N⁺cro~ cI_tspFMDV-1034-Bal-1 (EcoRI-Hindlll)) umfassenden Gruppe ausgewählt wird.

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    23· Verfahren nach Punkt 1, gekennzeichnet dadurch, daß der erzeugte transformierte Wirt aus der E. coli ΉΒΛΟΛ (pBR322(Pst)/FMDV-7O3) und E. colj HB1O1 (pBE322(Pst)/ FMDV-33O umfassenden Gruppe ausgewählt wird.

    24_e Verfahren nach Punkt 1, gekennzeichnet dadurch, daß eine für ein die Spezifität von FMD~Virus-Antigenen aufweisendes Polypeptid kodierende DNA-Sequenz aus einer Gruppe von DNA-Sequenzen durch den Schritt: Screening der DNA-Sequenzen zur Bestimmung, welche zu den DNA-Sequenzen nach einem der Punkte 1 bis 8 hybridisieren, ausgewählt wird»
13. 25. Verfahren nach Punkt 24, gekennzeichnet dadurch, daß die ausgesonderte DNA-Sequenz aus der DNA-Sequenzen von natürlichen Quellen, synthetische DNA-Sequenzen, DNA-Sequenzen von Rekombinant-DNA-Molekülen und DNA-Sequenzen, bei denen es sich um eine Kombination einer der vorstehenden DNA-Sequenzen handelt, umfassenden Gruppe ausgewählt wird»
14. 26. Verfahren nach Punkt 25, gekennzeichnet dadurch, daß die ausgesonderte DNA-Sequenz aus der cDNA-Sequenzen von RNA vota FMDV-Typ O, A, C, SAT1, SAT2, SAT3 und Asian I umfassenden Gruppe ausgewählt wird.
15. 27. Verfahren nach einem der Punkte 24 bis 26, gekennzeichnet durch den weiteren Schritt der Verwendung der hybridisierten DNA-Sequenz als Primer, damit entweder zumindest ein Teil des benachbarten unhybridisierten Abschnittes der DNA durch Reverstranscriptase transcribiert werden kann, oder damit zumindest ein Teil des benachbarten unhybridisierten Abschnittes der DNA sequenziert werden kann.

    - Hierzu 12 Blatt Darstellungen -