NO811609L - Dna-sekvenser, rekombinante dna-molekyler, samt fremstilling av aktive polypeptider - Google Patents

Description

Foreliggende oppfinnelse vedrører DNA sekvenser, rekombinante DNA molekyler og fremgangsmåter for fremstilling av polypeptider som er spesifikke for munn- og klovsykesykdom ("FMD") virale antigener. Mere spesielt vedrører oppfinnelsen DNA sekvenser og rekombinante DNA molekyler uttrykt i passende vertsorganismer. De åpenbare DNA sekvenser og rekombinante DNA molekyler er særpreget ved at de koder, eller innebefatter fragmenter som koder for antigene polypeptider for munn-og klovsykevirus ("FMDV") eller polypeptider med spesifisitet for munn- og klovsyke virale antiger. Som det vil forstås av det etterfølgende kan DNA sekvensene, de rekombinante DNA molekyler og fremgangsmåten i foreliggende oppfinnelse anvendes ved fremstilling av antigene polypeptider som er nyttige i blandinger og metoder for å gjøre dyr resistente mot FMDV, i det minste for en viss tidsperiode.

FMD virus er en picornavirus som påvirker hovdyr. Det er

en av de mest smittsomme og lettest overførbare sykdommer for husdyr. Sykdommen er generelt særpreget ved væskende sår på det smittede dyrs føtter og munn. Nedsettelse av dyrets tilstand senker generelt produksjonen av husdyrpro-duktene med 25%. Epidemier av FMDV forårsaker betydelige økonomiske tap ved fremstilling og markedsføring av kjøtt, meieriprodukter, ull, huder og andre produkter. F.eks. under epidemiene i Storbritannia i 1967-68 ble nesten 500 000 infiserte eller utsatt kveg, svin, sau og geit tilintetgjort for å bekjempe sykdommen.

Det er syv distinkte serotyper av FMD virus. Disse er de europeiske eller klassiske typer 0, A og C, de sør-afrikanske typer SAT1, SAT2 og SAT3 og den asiatiske type I, se eksempelvis K.J.H. Robson et al., "An Assessment By Compe-tition Hybridization Of The Sequence Homology Between The RNAs Of The Seven Serotypes Of FMDV", J. Gen. Virol, 37, s. 271-76 (1977). Typene 0, A og C er funnet i Europa, Syd-Amerika, Asia og i de nordlige deler av Afrika, men området eksp anderer .De tresyd-afrikanske typer ble først påvist i Syd-Afrika, imidlertid sprer sykdommen seg i geografisk område. Den asiatiske type finnes i asiatiske land fra Midt- Østen til den Fjerne Østen. Hver av disse serotyper kan opp-deles i serologisk forskjellige undergrupper. Vaksiner som beskytter dyr mot FMDV er tilgjengelige. Vanligvis omfatter disse vaksiner inaktiverte eller svekkede hele virus. De ad-ministreres under kjente behandlingsmåter og dosenivåer på årlig, og enkelte ganger på kvartårlig . basis. Fordi de syv forskjellige virustyper utviser en manglende kryssimmunitet (Robson et al., supra) og forskjellige områder i verden har forskjellige spektra av virustyper så utføres vaksinasjonen ofte med et bivalent eller trivalent materiale. Imidlertid er dette ikke alltid nødvendig eller tilrådelig.

Produksjon av FMD hele virus vaksiner er beheftet med mange betydelige problemer. For det første som følge av virusens smittsomme karakter må laboratoriedyrkning av virus for vaksiner utføres i isolerte områder under strikte betingelser. For det andre utviser ofte virusbaserte vaksiner en ikke ak-septerbar potensvariasjon etter fremstilling og inaktivering. For det tredje må vaksinene undersøkes under meget kontrol-lerte betingelser for å sikre riktig påvirkning eller inaktivering. Hvis ikke kan vaksinen forårsake en uønsket aktiv infeksjon eller subakutt progressiv sykdom i de behandlede dyr . Alle disse produksjonsproblemer fører til høye omkostninger for den særlige vaksinen. I tillegg til de ovenfor beskrevne produksjonsproblemer vil anvendelse av hélvirus-vaksiner resultere i et lite, men betydelig antall aller-giske sidereaksjoner i de behandlede dyr. Disse uønskede side-effekter kan trolig tilskrives mange irrelevante antigene determinanter for viral og ikke-viralproteiner som vanlig-

vis forurenser viralvaksiner.

En måte å unngå noen av problemene som produksjon og anvendelse av hele virusvaksiner er beheftet med er å anvende virale subenhetsvaksiner omfattende kapsidproteiner av FMD virus, se eksempelvis U.S. patent 4,140,763; H. L. Bachrach et al., "An Experimental Protein Vaccine For Foot-And-Mouth Disease", in Perspectives in Virology, (ed. M. Pollard), vol. 10, ka-pittel 10, s. 147-159 (1978).

FMD virus inneholder i første rekke fire kapsidproteiner identifisert som VP1, VP2, VP3 og VP4. Kapsidproteinene av FMD virus beskytter kollektivt de virale ribonukleinsyrer ("RNA") kjerne mot forskjellige inaktiveringsmidler. Det nøytrali-serende antigen av FMDV synes å være innesluttet i VPl polypeptidet (VP3 i U.S. terminologi). (H. L. Bachrach et al.,

"An Experimental Subunit Vaccine For Foot-And-Mouth Disease", International Symposium On . Foot-And-Mouth Disease, Lyon 197 6, Develop. Biol. Standard, 35, s. 155-160 (S. Karger, Basel 1977)). (Ytterligere synes det at et antigen av dette protein inneholdes i minst 1/3 av proteinet, dvs. nærest dets

COOH terminal (R. Franz et al., "Localization And Characterization Of Two Immunogenic Regions On the Coat Protein VPThrOf Foot-And-Mouth Disease Virus (FMDV) Subtype 0-jK Inducing Neutralizing Antibodies, Munich (Dec. 80)) Dette polypeptid har vært renset og anvendt for å vaksinere svin mot smitte av virus (H. L. Bachrach et al., supra). Imidlertid var det nødvendig med minst 10 ganger mere protein enn virusbaserte vaksiner for å oppnå en effektiv immunisering. Derfor er det vanligvis nødvendig med to eller flere vaksinasjoner med VPl proteinbaserte subenhet virus for å beskytte et dyr fra FMD virus.'

Anvendelse av disse subenhets vaksiner eliminerer antilege-medannelse mot de mange irrelevante antigene determinanter

av virale ikke-virale proteiner som forurenser viralvaksiner. Deres anvendelse kan derfor eliminere sideeffektene av viralvaksiner. Ytterligere mangler subenhetsvaksinene viral nuk-leinsyre og det er derfor antageligvis ingen risiko for å forårsake aktiv infeksjon eller subakutt progressiv sykdom i de behandlede dyr. Imidlertid selv om man med disse subenhetsvaksiner unngår noen av de problemene som er særpregede for vaksiner basert på hel virus er deres anvendelse beheftet med visse ulemper. For det første for å oppnå kapsidproteinet må virus kultiveres og dyrkes. Derfor unngår man ikke anvendelse av isolerte fremstillingssteder og høye produksjonsom-kostninger som for FMD virus dyrkning. For det andre må proteinene separeres fra virus og deretter høyrenses. Denne prosess er både langsom og kostbar. Ytterligere hvis proteinene ikke er tilstrekkelig renset kan den erholdte vaksine likevel

inneholde nok virus til å forårsake en tilfeldig infeksjon eller subakutt sykdom.

Nyere fremskritt innen molekylærbiologi har gjort det mulig

å innføre DNA koding for spesifikke ikke-bakterielle proteiner i bakterieceller. Generelt for DNA, bortsett fra de som er fremstilt via kjemisk syntese, innebefatter konstruksjon av slike rekombinante DNA molekyler trinnene av å fremstille en enkeltbåndet DNA kopi (cDNA) av en budbringer RNA (mRNA) mal for det ønskede protein, omdanne cDNA'et til et dobbeltbåndet DNA og knytte det erholdte DNA til en passende posisjon i en egnet kloningsbærer for å gi et rekombinant DNA molekyl og omdanne en passende vert med det rekombinante DNA molekyl. En slik tranformasjon vil gjøre det mulig for verten å fremstille det ønskede protein.

Flere ikke-bakterielle gener og proteiner er erholdt i bakterieverter under anvendelse av rekombinant DNA teknologi. Disse innbefatter eksempelvis leukocyttinterferon (S. Nagata

et al., "Synthesis In E. coli Of A Polypeptide With Human Leukocyte Interferon Activity", Nature, 284, s. 316-20 (1980)), antigener av humanhepatitt Rvirus (C. J. Burrell et al., "Expression In Escherichia coli: Of Hepatitis B Virus DNA sequences Cloned In Plasmid pBR322", Nature, 279, s. 43-7

(1979). og M. Pasek et al., "Hepatitis B Virus Genes And Their Expression In E. coli", Nature, 282, s. 575-79 (1979)), og SV40t antigenet (T. M. Roberts et al., "Synthesis Of Simian Virus 40t Antigen In Escherichia coli", Proe. Nati. Acad.

Sei. USA, 76, s. 5596-600 (1979).).

Tidligere rekombinantmetoder har vært begrenset til fremstilling av cDNA kopier av mRNA av 800-900 nukleotider (leukocyttinterferon) eller mRNA med 2000-3000 nukleotider (ovalbumin eller RNA tumorer) eller har anvendt allerede naturlig tilgjengelig DNA (hepatitt B virus, Dane partikkel DNA, SV40t antigen, SV40 DNA).

Foreliggende oppfinnelse løser generelt de ovenfor omtalte problemer ved å tilveiebringe minst en DNA sekvens som koder for et polypeptid som utviser FMDV antigenitet. Mere spesielt er det i henhold til oppfinnelsen tilveiebragt en DNA sekvens som er særpreget ved at minst en del derav koder for et polypeptid som utviser FMDV antigenitet og som ér valgt fra gruppen bestående av (a) FMDV-715, FMDV-144, FMDV-1034, FMDV-1448, FMDV-1824, FMDV-1933, (b) DNA sekvenser som hybridiserer til enhver av de ovenfor nevnte DNA sekvenser, (c) DNA sekvenser, uansett kilde, innebefattende naturlige, syntetiske eller halvsyntetiske kilder, beslektet ved mutasjon, innebefattende enkel eller multippel, basis-substitusjoner, utelatelser, innskudd og inversjoner til enhver av de ovenfor nevnte DNA sekvenser, og (d) DNA sekvenser omfattende sekvenser av kodoner som koder for et antigent virksomt polypeptid inneholdende en aminosyresekvens tilsvarende de som er kodet for av kodonene av enhver av de ovenfor nevnte DNA sekvenser.

DNA sekvensene i henhold til foreliggende oppfinnelse er slik at de er i stand til å muliggjøre syntese av et protein fra et genom på ca. 7 700 baser, som tilsynelatende er fullstendig oversatt og uten avbrudd til å produsere et totalt oversettelsesprodukt, eller "polyprotein" idet. polyproteinet ytterligere bearbeides in vivo til å gi et kapsid og andre FMD viral proteiner. Disse DNA sekvenser er også særpreget ved de rekombinante DNA molekyler og fremgangsmåter ifølge oppfinnelsen.

Som følge av foreliggende oppfinnelse er det mulig å oppnå FMD viral spesifikke nukleotidesekvenser og FMDV antigene polypeptider i betydelige mengder. DNA sekvensene og de rekombinante DNA molekyler ifølge foreliggende oppfinnelse muliggjør kopiering av FMD viral spesifikke nukleotidesekvenser og fremstilling av virale antigener mot FMDV uten at det er nødvendig å kultivere større mengder virus, rense proteinene fra disse virus eller inaktivere eller påvirke disse virus. DNA sekvensene og de rekombinante DNA molekyler og fremgangsmåter ifølge oppfinnelsen gjør det mulig å unngå de problemer som de kjente fremstillingsmetoder for FMDV vaksi-neproduksjon og de derav erholdte vaksiner er belemret med.

. Som det vil fremgå av den etterfølgende beskrivelse er det mulig med DNA sekvensene og de rekombinante DNA molekyler ifølge oppfinnelsen å rette produksjon av antigene polypeptider for FMDV i en passende vert. Duplisering av disse DNA sekvenser og rekombinante DNA molekyler i en passende vert muliggjør også produksjon av store mengder FMD viral spesifikk nukleotidesekvenser og polypeptider uten fare for tilfeldig spredning av FMDV. Molekylstrukturen og egenska-pene for disse antigene polypeptider og viralspesifikke nuk-leidesekvenser kan deretter bestemmes med sikkerhet uten de isolerte betingelser som er nødvendige for den mere vanlige FMDV analyse. De antigene polypeptider og DNA sekvenser ifølge foreliggende oppfinnelse er nyttige enten som fremstilt i verten eller etter passende derivatavledning eller modifikasjon i'blandinger og ved fremgangsmåte for påvisning, og for bedre fremstilling av disse produktene i seg selv og for anvendelse i vaksiner og andre immunologiske blandinger og fremgangsmåter ved behandling av FMD virus. Fig. 1 viser et forenklet skjema over FMD virus genomet,"polyproteinet" oversettelsesproduktet og det resulterende kapsid og andre proteiner. Lokaliseringen av de forskjellige viste proteiner er ikke absolutt i forhold til FMDV genomet fordi de er basert på relative størrelsesdata alene. Fig. 2 viser skjematisk en utførelsesform av fremgangsmåten ifølge, oppfinnelsen for fremstilling av polypeptider. som utviser FMDV antigenitet. Fig. 3 viser et begrensningskart av cDNA fremstilt i henhold til foreliggende oppfinnelse og dets tilknytning fra 3'enden av FMDV genomet. Fig. 3 viser også foreningen til cDNA, ori-enteringen og begrensningsmønsteret for DNA innskuddene av forskjellige hybridplasmider fremstilt i henhold til oppfinnelsen . Fig. 4 viser det aktuelle segment av begrensningskartet for DNA innskuddene av to rekombinante DNA molekyler fremstilt i henhold til oppfinnelsen og sekvenseringsstrategien anvendt for å bestemme den partielle nukleotidesekvens fra disse. Fig. 5 viser det aktuelle segment av en nukleotidesekvens av et rekombinant DNA molekyl i henhold til oppfinnelsen og dets tilsvarende aminosyresekvens. Fig. 6 er en skjematisk avbildning av plasmid pPLc24 og pias-' mid pFMDV-1034. Fig. 7 viser skjematisk en fremgangsmåte ved konstruksjon av en annen utførélsésform av et rekombinant DNA molekyl ifølge oppfinnelsen. Fig. 8 viser FMDV genomet og begrensningsmønsteret for DNA innskuddet FMDV-1034 og sekvenseringsstategien anvendt for å bestemme dets nukleotidesekvens. Fig. 9-10 viser en del av nukleotidesekvensen for DNA innskuddet FMDV-1034, nukleotidesekvensen for det strukturelle gen VPl, nukleotidesekvensen for DNA innskuddet av en utfør-elsesform av et rekombinant DNA molekyl i henhold til oppfinnelsen og aminosyresekvensene for polypeptider kodet for av disse nukleotidesekvenser. Fig. 11 viser en del av nukleotidesekvensen for DNA innskuddet FMDV-1448, nukleotidesekvensen for det strukturelle gen VP3, nukleotidesekvensen av en del av et DNA innskudd av en utførelsesform av et rekombinant DNA molekyl ifølge oppfinnelsen og aminosyresekvensene for polypeptider kodet for av disse nukleotidesekvenser. Fig. 12 viser skjematisk en fremgangsmåte for å utvelge og konstruere en annen utførelsesform av en DNA sekvens i henhold til oppfinnelsen.

I den etterfølgende beskrivelse er de følgende betegnelser anvendt.

Nukleotid En monomer enhet av DNA eller RNA bestående av en sukkerrest (pentose), et fosfat og en nitrogenholdig hetero-cyklisk base. Basen er knyttet til sukkergruppen via et glykosidkarbon (1' karbonet i pentosen) og denne kombinasjon av en base og et sukker er kalt et nukleosid. Basen karak-teriserer nukleotidet. De fire DNA baser er adenin ("A"), guanin ("G"), cytosin ("C") og tymin ("T"). De fire RNA baser er A, G, C og uracil ("U").

DNA sekvens En lineær rekke av nukleotider forbundet til hverandre ved fosfodiesterbindinger mellom 3' og 5' karbo-nene i tilstøtende pentoser.

Kodon En DNA sekvens av tre nukleotider (en triplett) som koder via mRNA en aminosyre, et oversettelsesstartsignal eller et oversettelsesavslutningssignal. F.eks. nukleotide-triplettene TTA, TTG, CTT, CTC, CTA og CTG koder for aminosyren leucin ("Leu"), TAG, TAA og TGA er oversettelsesstopp-signaler og ATG er oversettelsesstartsignal.

Leseramme Gruppering av kodorier under oversettelse av mRNA til aminosyresekvenser. Under oversettelsen må den riktige leseramme bibeholdes. F.eks. kan GCTGGTTGTAAG oversettes til tre leserammer eller faser som hver gir en forskjellig aminosyresekvens

GCT GGT TGT AAG—Ala-Gly-Cys-Lys

G CTG GTT GTA AG—Leu-Val-Val

. GC TGG TTG TAA G— Trp-Leu-(STOP)

Polypeptid En lineær rekke av aminosyrer forbundet til hverandre ved peptidbindinger mellom a-amino- og karboksy-gruppene av tilstøtende aminosyrer.

Genom Hele DNA for en celle eller en virus. Den innebefatter blant annet strukturelle gener som koder for polypeptider i cellen eller virusen såvel som dens operatør, promotor og ribosombinding og samspillende sekvenser, innebefattende sekvenser såsom Shine-Dalgarno sekvensene. Strukturelt gen En DNA sekvens som koder via sin mal eller budbringer RNA ("mRNA") en sekvens av aminosyrer som er særpreget for et spesifikt polypeptid.

Transkripsjon Prosessen av å fremstille mRNA fra et strukturelt gen.

Oversettelse Prosessen av å fremstille et polypeptid fra mRNA.

Ekspresjon Prosessen som et strukturelt gen undergår for å produsere et polypeptid. Det er en kombinasjon av transkripsjon og oversettelse.

Plasmid En ikke-kromosomal dobbeltbåndet DNA sekvens innebefattende et intakt "replikon" slik at plasmidet dupliseres i en vertscelle. Når plasmidet plasseres inne i en encellet organisme kan denne organismes karakter forandres eller tran-sformeres som resultater av plasmidets DNA. F.eks. et plasmid som bærer genet for tetracyklinresistens (Tet R). transformere én celle som tidligere'var følsom for tetracyklin til en som er resistent mot dette. En celle transformert av et plasmid kalles en "transformant".

Fag eller bakteriofag Bakteriell virus hvorav mange består av DNA sekvenser innelukket i en proteinkonvolutt eller et belegg ("kapsidprotein").

Klonebærer Et plasmid, fag DNA eller annen DNA sekvens som er i stand til å duplisere seg i en vertscelle, som er særpreget ved en eller et lite antall av endonuklease gjenkjenn-ings<p>osisjoner ved hvilke slike DNA sekvenser kan innskytes (cut in) på en forut bestemt måte uten et medfølgende tap av en i det vesentlige biologisk funksjon av DNA, eksempelvis dupliseririg, produksjon av beleggproteiner eller tap av promotor- eller bihdingsposisjoner og som inneholder en markør egnet for anvendelse ved identifikasjon av transformerte celler, eksempelvis tetracyklinresistens eller ampicillin resistens. En kloningsbærer er ofte kalt. en vektor. Kloning Prosessen ved erholdelse av en populasjon av orga-nismer eller DNA sekvenser erholdt fra en slik organisme el- • ler sekvens ved aseksuell reproduksjon.. . Rekombinant DNA molekyl eller Hybrid DNA Et molekyl bestående av segmenter av DNA fra forskjellige genomer som er for-enet ende til ende utenfor levende celler og som har evnen til å infisere visse vertsceller og bibeholdes deri.

Ekspresjonskontrollsekvens En sekvens av nukleotider som kontrollerer og regulerer ekspresjon av strukturelle gener når de er operativt forbundet med disse gener. De innebefatter lac systemet, trp systemet, hovedoperatør og promotorområdene av fag A , kontrollområdet for fd beleggprotein og andre sekvenser som er kjent for å kontrollere ekspresjonen av gener av prokaryotiske eller eukarytiske celler eller deres vira.

Under henvisning til fig. 1 er det vist et forenklet diagram av et FMDV genom. Dette genom av enkeltbåndet RNA enkoder for alle de genetiske informasjoner for FMD virus. Genomet består av ca. 7700 baser eller ca. 2,8 x 10 dalton. Virion RNA'et er plussbåndet av virusen og er poly A terminert ved dets 3' ende og har et lite protein (VPG) kovalent tilknyttet dets 5' avslutning.

Det er vist in vivo at kun en hovedinitieringsposisjon for proteinsyntesen forefinnes i dette genom. Genomet er derfor trolig oversatt fullstendig og uten avbrudd for å gi et totalt oversettelsesprodukt eller "polyprotein" (fig. 1)

(T. R. Doel et al., "A Re-appraisal Of The Biochemical Map Of Foot-And-Mouth Disease Virus RNA", J. Gen. Virol., 41,

s. 395-404 (1978).). Dette polyprotein blir deretter tilsynelatende ytterligere bearbeidet in vivo til å gi de tre primære produkter P 100 (122), P 55<p>g P 88 av FMDV. Et av disse primære produkter, nemlig P 88 er rapportert å være forløper for de fire kapsidproteiner VPl, VP2., VP3 og VP4 (fig. 1) for viruset (T. R. Doel et al., supra). Derfor oppstår de fire kapsidproteinene tilsynelatende fra et enkelt området i geno-

met. Imidlertid har den aktuelle struktur eller plassering av dette området av genomet (2400 basispar) ikke blitt bestemt. Heller ikke har de fullstendige strukturer for kapsidproteinene blitt bestemt. F.eks. kun de første 40 aminosyrene fra den aminoterminerte ende av VPl har blitt rapportert, nemlig Thr-Thr-Ser (?■)-Ala-Gly-Glu-Lys ( l ).-Ala-Asp-Pro-Val-Thr-Thr-Thr-Val-Glu-Asn-Tyr-Gly-Gly-Glu-Thr-Gln-Ile-Gln-Arg-Arg-Gln-His (T-) -Thr ) -Asp-Val-Trp ( l) -Phe-Ile-Met-Asp-C?)-Phe-Val—(K. Strohmaier et al., "The N-Terminal Sequence Of Three Coat Proteins Of Foot-And-Mouth Disease Virus",Biochemical&Biophysical Research Comm. ("BRCC")., 85, s. 1640-45 (1978)).

("(?)." angir en aminosyrebestemmelse som ikke er sikker).

Oppfinnelsen skal nærmere beskrives ved hjelp av det følgende eksempel.

EKSEMPEL

RNA'et anvendt ved denne utførelsesform av oppfinnelsen ble ekstrahert fra kulturer av FMDV, type 0, i det vesentlige slik som beskrevet av J.F.E. Neuman et al., "Purification And Identification Of The RNA-Dependent RNA Polymerase Of Foot-And-Mouth Disease Virus", J. Gen. Virol., 45, s. 497-507 (1979).

FMDV stamme O (Kaufbeuren) ble dyrket i BHK cellemonolaget i flere rullende flasker. Virusene ble oppsamlet fra holde-mediet ved tilsetning av polyetylenglykol 6000 (til 8%) og presipitering. Virusen ble renset ved båndinndeling i 1-1,44 g/cm<3>gradienter av cesiumklorid, i det vesentlige slik som beskrevet av K. Strohmaier og K. H. Adams, Zbl. Vet. Med., B23, s. 483-506 (1976). Etter dialyse ble virusen behandlet med proteinase, som beskrevet av M. J. Grubman et al., Virology, 97, s. 22 et seq. (1979) og RNA'et renset ved to sentri-fuge sykluser i en 15-30 % sukkrosegradient. RNA'et ble deretter presipitert fra toppfraksjonene med etanol og gjenopp-løst i vann. Det resulterende virale RNA preparat (0,78 mg/ ml) hadde en 34S sedimentasjonskoeffisient (målt med rRNA som markør) og OD2 60//°D2 8 0 ~<2>"

De tilsvarende teknikker ble anvendt ved fremstilling av RNA fra FMDV av andre serotyper. Det produserte RNA blir deretter behandlet som beskrevet i det etterfølgende til å gi de ønskede DNA molékyler. Disse molekyler er i verter i stand til ekspresjon og anvendes for fremstilling av polypeptider som utviser FMDV antigenitet og for å duplisere virus spesifikke nukleotidesekvenser.

SYNTESE AV DQBBELTBÅNDET FMDV- DNA

Det ovenfor fremstilte FMDV-RNA ble anvendt som en mal for fremstilling av komplementært FMDV-DNA ("FMDV.-cDNA") i det vesentlige slik som beskrevet av M. P. Wickens, et al., "Synthesis Of Double-Stranded DNA Complementary To Lysozyme, Ovo-mucoid And Ovalbumin mRNAs", J. Biol. Chem., 253, s. 2483-495 (1978).

Enkeltbindet cDNA ble fremstilt ved RNA-avhengig DNA polymerase (80 enheter) fra aviær myeloblastosis virus ("AMV") omvendt transkriptase, initiert med enPT12-18Primer ^ en~heter/ml, Collaborative Research), i 100 ,ul 50 mM Tris-HCl (pH 8,3)., 8 mM MgCl2, .25 mM 3~merkaptoetanol, dATP, dCTP, dGTP og dTTP (hver ved 0,5 mM) og 100 uCi<3>H-TTP (NEN), idet RNA'et (14 ug), var forbehandlet med 40 ,ul 2,5 mM CH^HgOH i 3 min. ved romtemperatur.

Blandingen ble inkubert i 5 min. ved romtemperatur og deretter i 60 min. ved 42°C. Alikvote deler (1 ;al) ble uttatt hvert 20. min. for å følge reaksjonskinetikken. Etter in-. kubasjon og koking i vannbad i 3 min. for å dissosiere cDNA-RNA hybridet ble reaksjonsblandingen raskt avkjølt i.etanol/ tørrisblanding og plassert i is'.

cDNA båndet ble gjort dobbeltbindet ved DNA'polymerase I ved å kombinere dette med 50^uCi av hver av de fire •<32>P-desoksy-tifosfatene, 100 ul 0,2 M HEPES puffer ((N-2-hydroksyetylpi-perazin-N'-2-etansulfonsyre; Sigma) pH 6,9), 90 mM KC1, 0,4 mM hver av dATP, dCTP, dGTP og dTTP og 50 enheter DNA polymer-

ase I (M. P. Wickens et al., supra).. Blandingen ble inkubert ved 15°C i 2 h. Igjen ble alikvote deler uttatt hvert 30 min. for å følge reaksjonen. For å stoppe reaksjonen ble blandingen ekstrahert med fenol og ført gjennom en "G-150 Sephadex" kolonne som var bragt i likevekt med 0,1 M NaCl, 10 mM Tris-HCl puffer (pH 7,5) og 1 mM EDTA. For å gjenvinne den radioaktive forløper ble fraksjoner inneholdende cDNA slått sammen og presipitert med etanol.

Den dobbeltbåndede "hårnåls" løkke som er tilbake i den dobbeltbåndede cDNA struktur ble åpnet ved å oppløse det presi-piterte cDNA i 675 ul Sl puffer (0,3 M NaCl, 0,03 M natriumacetat (pH 4,5) og 3 mM ZnCl2). Sl enzym (15 ^1, 0,6 Vogt enheter/^ul) ble tilsatt og blandingen inkubert ved 37°C i 130 min. Etter tilsetning av 30 ^1 0,2 M EDTA ble blandingen ekstrahert 2 ganger med fenol og presipitert som tidligere angitt med etanol.

Det således ovenfor fremstilte cDNA ble størrelsesbestemt på en 1%-ig agarosegel under anvendelse av passende markører. Mere enn 40% av cDNA lå i området 4500-3000 bp. Den gjenværende del av cDNA var kortere. cDNA ble også oppdelt ved hjelp av forskjellige begrensningsenzymer under anvendelse av standardprosedyrer. Skarpheten av begrensningsmønstere for cDNA'et indikerte en høy molekylvekt for cDNA.

På basis av disse begrensningsmønstere ble cDNA'et tilknyttet 31 enden av genomet for FMDV (fig. 3). Dette mønster og forening ble deretter utnyttet for å bestemme posisjonen i FMDV genomet for) DNA innskudd i forskjellige hybridplasmider fremstilt i henhold til oppfinnelsen. En korrelasjon av posisjonen av disse innskudd i genomet og den forventede posisjon i genomet av de kodende sekvenser for flere proteiner av FMDV muliggjorde forutsetning av hvilke FMDV proteiner sem er kodet for DNA innskuddet for et gitt hybridplasmid.

KLONING AV DOBBELTBÅNDET FMDV- cDNA

Et vidt antall verter/kloningsbærerkombinasjoner kan anvendes ved kloning av dobbeltbåndet cDNA fremstilt i henhold til oppfinnelsen. F.eks. kan nyttige kloningsbærere bestå av segmenter av kromosomal, ikke-kromosomal og syntetiske DNA sekvenser, slik som de forskjellige kjente derivater av SV40 og andre kjente bakterielle plasmider, eksempelvis plasmider fra E. coli innebefattende col El, pCRl, pBR322, pMB89 og deres derivater, bredere vertsområdeplasmider, eksempélvis RP4 og fag DNA'er, eksempelvis de mange derivater av fag eksempelvis NM989 og andre DNA fager, eksempelvis M13 og Filamenteous enkeltbåndede DNA fager og Vektorer avledet

fra kombinasjoner av plasmider og fag DNA'er såsom plasmidet som er modifisert for å anvende fag DNA eller.andre ekspresjonskontrollsekvenser eller gjærplasmider såsom 2 p plasmidet eller derivater derav. Nyttige verter kan innebefatte bakterielle verter såsom stammer av E. coli såsom E. coli HB 101, E. coli X1776, E. coli X2282, E. coli MRCI og stammer av Pseudomonas, Bacillus subtilis, Bacillus stearothermo-philus og andre E. coli, basiller, gjær -og andre sopper, ani-malske eller planteverter såsom dyr,(innebefattende mennesket)' eller planteceller i kulturer eller i andre verter. Naturligvis er ikke alle verter/vektorkombinasjoner like effektive. Det spesielle valg av vert/kloningsbærerkombinasjon- kan gjø-res av en fagmann under hensyntagen til de gitte prinsip-per.

Ytterligere innen hver spesifikk kloningsbærer kan forskjellige posisjoner velges for innføring av det dobbeltbåndede DNA. Disse posisjoner er vanligvis betegnet av det begren-sningsendonuklease som o<p>pdeler disse. F. eks. i pER 322 er Pstl lokalisert i genet for 3-laktamase, mellom nukleotide-triplettene som koder for aminosyrene 181 og 182 i dette protein. Denne posisjonen ble anvendt av S. Nagata et al., supra ved deres syntese av polypeptider som utviser en immuno-logisk og biologisk aktivitet for leukocyttinterferon. En av de to Hindll endonukleasegjenkjenningsposisjoner ligger mellom triplettene som koder for aminosyrene 101 og 102 og en av de mange Taq posisjoner ved tripletten som koder for aminosyren 45 i 3-laktamase i pBR322. På samme måte ligger EcoRI posisjonen og PvuII posisjonen i dette plasmid utenfor ethvert kodingsområde, idet EcoRI posisjonen er lokalisert mellom genene som koder for resistens mot henholdsvis tétra-cyklin og ampicillin. Disse posisjoner er velkjent for en fagmann. Det må naturligvis forstås at kloningsbæreren som er nyttig i foreliggende oppfinnelse ikke behøver å ha.en gjenkjenningsendonukleaseposisjon for innføring av det valgte DNA fragment.I steden kan bæreren deles og forenes til fragmentet på alternative måter.

Vektorén eller kloningsbæreren og den spesielt valgte posisjon deri for tilknytning av et valgt DNA fragment for å dan-ne et rekombinant DNA molekyl bestemmes av et antall faktorer, eksempelvis antallet av tilgjengelige posisjoner for et spesielt begrensningsenzym, størrelsen av proteinet som skal uttrykkes, evnen til det ønskede protein til protolytisk degra-dering av vertscelleenzymene, forurensning av proteinet som skal uttrykkes av vertscelleproteinene som er vanskelig å fjerne under rensning, ekspresjonsegenskaper såsom lokalisering av start- og stoppkodonene i forhold til vektorsek-vensene og andre faktorer som er velkjente innen teknikkens stand. Valg av en vektor og en innføringsposisjon for et spesiélt gen bestemmes ved en avbalansering av disse faktorer, idet alle valg ikke er like effektive for et gitt tilfelle.

Selv om flere metoder er kjent innen teknikkens stand for innføring av fremmed DNA i en kloningsbærer eller i en vektor til å gi et rekombinant DNA molekyl så er den foretrukne initiale kloningsmetode i henhold til foreliggende oppfinnelse særpreget ved oppslutning av plasmidet,(spesielt pBR322) med begrensningsenzymet som er spesifikt for den valgte posisjon for innføring (spesielt Pstl) og addere dG haler til 31 endene ved terminaltransferase. På samme måte kan det dobbeltbåndede cDNA forlenges ved addering av dC haler til 3<1>termi-nalene for å muliggjøre en forening til det endede "tailed" plasmid. Det endede plasmid og cDNA blir deretter sammensmeltet for å innføre cDNA i den passende posisjon i plasmidet og-for å sirkularisere hybrid DNA'et, idet den komplementære karakter av endene muliggjør deres kohesjon (fig. 2).

Det resulterende rekombinante DNA molekyl bærer nå et in-skutt gen i den valgte Pstl restriksjonsposisjon (fig 2.). Denne metode for dG-dC "tailing" for innføring av en fremmed DNA sekvens i en kloningsbærer er beskrevet av L. Villa-Komaroff et al., "A Bacterial Clone Synthesizing Proinsulin", Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 75, s. 3727-31 (1978)..

Naturligvis kan andre kjente metoder for innføring av DNA-sekvenser i kloningsbærere for å gi rekombinante DNA molekyler være like nyttig ved foreliggende oppfinnelse. De innebefatter eksempelvis dA-dT "tailing", direkte sammenknytning, syntetiske tilknyttere, eksonuklease og polymerase-forbundede gjenforeningsreaksjoner etterfulgt av sammenknytning eller forlengelse av DNA båndet med DNA polymerase og en passende enkeltbåndet mal. etterfulgt av sammenknytning.

Det bør forstås at nukleotidesekvensene eller cDNA fragmentene innskutt i den valgte posisjon av kloningsbærerene kan innbefatte nukleotider som ikke er en del av det aktuelle strukturelle gen for det ønskede polypeptid eller modent, protein og kan innebefatte kun et fragment av det fullstendige strukturelle gen for det ønskede protein eller modent protein. Det er kun viktig at det rekombinante DNA molekyl dirigerer produksjonen av et polypeptid som har spesifisitet for FMDV virale antigener i egnede verter.

Kloningsbæreren eller vektoren inneholdende det fremmede gen anvendes for å tranformere en passende vert slik at det til-lates at verten dupliserer det fremmede gen for å uttrykke proteinet som kodes for av dette gen eller del derav. Valget av en passende vert kontrolleres også av et antall faktorer som er velkjente innen teknikkens stand. Disse innebefatter eksempelvis forenligheten med den valgte vektor, toksisi-teten for proteiner kodet for av hybridplasmidet, lettheten med hvilket det ønskede protein kan utvinnes, ekspresjonsegenskaper, biosikkerhet og omkostninger. En avbalansering av disse faktorer må finnes med den forståelse at ikke alle verter kan være like effektive med hensyn til å uttrykke et spesielt rekombinant DNA molekyl.

Ved den foreliggende fremstillingsmåte er den foretrukne initiale kloningsbærer det bakterielle plasmid pBR322 og. den foretrukne initiale begrensningsendonukleaseposisjon deri er Pstl posisjonen (fig. 2). Plasmidet er et relativt lite plasmid (molekylvekt ca. 2,6 megadalton). og som bærer resistente gener mot de to antibiotika nemlig ampicillin (Amp) og tetracyklin (Tet). Plasmidet er fullt utkarakterisert(F. Boli-var, et al., "Construction And Characterization Of New Cloning Vehicles II. A Multi-Purpose Cloning System", Gene, s. 95-113 (1977); J. G. Sutcliffe, "pBR322 Restriction Map Deri-ved From The DNA Sequence: Accurate DNA Size Markers Up To 4361 Nucleotide Pairs Long", Nucleic Acids Research, 5, s. 2721-28 (1978); J. G. Sutcliffe, "Complete Nucleotide Sequence Of The Escherichia coli Plasmid pBR322", Cold Spring Harbor Symposium, 43, I, s. 77-90 (1978).). Innføring av cDNA produktet i denne posisjon tilveiebringer en bakteriell klon som inneholder en DNA sekvens som koder for et FMDV spesifikt protein.

1. Fremstilling av Pstl-spaltet

dG- forlenget pBR322

Plasmid pBR322 ble oppsluttet fullstendig ved 37°C med Pstl endonuklease (Boehringer) i 10 mM Tris-HCl (pH 7,6), 7 mM MgC^z 7mM 2-mérkaptoetanol, 50 mM NaCl. Blandingen ble ekstrahert med 1 volumdel fenol og presipitert med 2,5 volumdeler etanol.: 0,2 M natriumacetatoppløsning. Presipitatet ble vasket to ganger med 7 0%-ig etanol og oppløst i TE puffer (10 mM Tris-HCl (pH 8,0), 1 mM EDTA).

Tilsetning av homopolymere dG haler ved termodesoksynukleotidyl transferase (TdT) (BRL, 6 enheter/ul) ble utført i et 50 pl reaksjonsvolum inneholdende 1 ug oppdelt plasmid, 200 mM Na-K-kakodylat (pH 7,2), 1 mM CoCl2, 1 mM (3-merkaptoetanol,

200 mM dGTP og 12 enheter TdT. Inkubasjonstiden var 60 min. ved 37°C.

2. Fremstilling av dC- forlenget cDNA

Ca. 1 pmol dobbeltbåndet cDNA ble forlenget med dCTP rester ved.terminal desoksynuklotidyltransferase i et 50 pl reaksjonsvolum inneholdende 200 mM Na-K-kakodylat (pH 7,2) 1 mM CoCl2, 1 mM 3-merkaptoetanol, 100 mM dCTP og 15 enheter TdT (BRL, 6 enheter/pl). Inkubasjonstiden var 5 min. ved 37°C og reaksjonen ble stoppet ved nedfrysning.

3. Fremstilling av Ca<++->behandet

E. coli HB 101

Ca -behandlet E. coli HB101 ble fremstilt ved fremgangsmåten ifølge E. M. Lederberg og S. N. Cohen, "Transformation Of Salmonella Typhimurium By Plasmid Deoxyribonucleic Acid", J. Bacteriol., 119, s. 1072-74 (1974) ved inokulering av E. coli HB101 i 250 ml LB medium (10 deler baktotrypton, 5 deler gjærekstrakt og 5 deler NaCl pr. liter) og kulturen dyrket ved 37°C til O.D.65Q<=><0,>65. De ferske kulturer ble avkjølt i isvann i 5 min. og pelletisert ved 6000 omdr./min. i 10 min. ved 4°C. De erholdte pellets ble deretter resuspendert 1 100 ml iskald 0,1 M CaCl2og holdt ved 0°C i 15 min. og sentrifugert som.angitt ovenfor. De erholdte pellets ble resuspendert i 100 ml 0,1 M CaCl2som ovenfor angitt og sentrifugert før de blé opptatt i.25 ml-0,1 M CaCl2, supplementert med 2,5 ml glyserol. Kultursuspensjonene ble oppdelt i 2 ml alikvote deler og nedfrosset i flytende nitrogen og lagret ved -80°C uten tap av aktivitet (D. A. Morrison, "Transformation In Escherichia coli: Cryogenic Preservation Of Competent Cells", J. Bacteriol., 132, s. 349-51 (1977)).

4. Sammensmeltning av dG-forlenget pBR3 22 og dC-

forlenget DNA

Vektorenes og cDNA'enes komplementære dG- og dC-haler mulig-gjør sammensmeltning for resirkularisering av det ønskede hybridplasmid eller rekombinante DNA molekyl. For dette for-mål ble 20 ng (0,01 pmol) dG-"tailed" Pstl-spaltet pBR322 vektor og 0,01 pmol dC-"tailed" dobbeltbåndet cDNA blandet i 30 ;jl 1 x SSC puffer (0,15 M NaCl, 0,015 M natriumsitrat). Blandingen ble plassert i et vannbad ved 69°C og fikk henstå for avkjøling over natten til 35°C.

5. Tranformering av E. coli HB101 med

de sammensmeltede hybridplasmider

L3 "contåinment" mulighetene ble utnyttet for transformasjons-prosessen og når krevet i alle de etterfølgende trinn. Alikvote deler (15.^1) av den rekombinante DNA mplekylblanding fremstilt som ovenfor angitt ble1 inkubert i 2 H ved 0°C med 200 / il Ca<++->behandlet E. coli HB101. Kulturene ble varme-sjokkbehandlet ved 37°C i 4 min. og 0,4 ml TMg medium (10 g Bactotrypton, 5 g NaCl, 2 g MgC^ pr. liter) ble tilsatt og bakteriesuspensjonen ble direkte påført agarplater inneholdende 10 g bactotrypton, 5 g gjærekstrakt, 5 g NaCl og 14 g bactoagar pr. liter supplementert med 10 ,ug/ml tetracyklin. Platene ble inkubert i 2 dager ved 37°C.

Fordi plasmid pBR322 innebefatter genet som koder for tetracyklinresistens vil E. coli verter som er transformert med et plasmid inneholdende dette gen intakt gro i et medium inneholdende det nevnte antibiotikum, mens de bakterier som ikke

er transformert på denne måte vil ikke gro. Derfor vil vekst i et tetracyklininneholdende medium muliggjøre .utvelgelse av verter transformert med et rekombinant DNA molekyl eller en resirkulårisert kloningsvektor inneholdende hybridgenet.

De tetracyklinresistente verter ble også siktet med hensyn til ampicillinresistens ved å avsette klonene på plater inneholdende et medium supplementert med ampicillin. Selv om plasmid pBR322 innebefatter genet som koder for ampicillinresistens vil plasmider som har innskudd i Pstl posisjonen i dette genet ikke lenger gjøte bakterier ampicillinresistente. Derfor vil verter som er resistente mot tetracyklin, men som er følsomme for ampicillin inneholde plasmider med innskudd i genet for ampicillin..I dette tilfellet var ca. 87% av koloniene resistente mot tetracyklin og følsomme for ampicillin. Den gjenværende del av tetracyklinresistente kolonier var sannsynligvis transformert med plasmider som var blitt resirkulårisert uten hybridgenene.

SIKTING FOR EN KLON INNEHOLDENDE FMDV cDNA

400 ampicillinfølsomme, tetracyklinresistente kloner ble overført til veggene i mikrotiterplater. Dette klonebibliotek ble oppdelt i 8 grupper av 50 kloner (identifisert med

henholdsvis nummerene 101-150 til 801-850. Replika av hvert sett ble fremstilt på nitrocellulosefilterbelagte trypton-agarplater supplementert med 10 .ug/ml tetracyklin. Platene ble inkubert over natten ved 37°C. Nitrocellulosefilterene ble deretter anvendt for kélonihybridisering i det vesentlige slik som beskrevet av M. Grunstein og D. S. Hogness, "Colony Hybridization: A Method For The Isolation Of Cloned DNAs That Contain A Specific Gene", Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 72, s. 3961-65 (1975). En<32>P-merket total FMD virus RNA som det ble fremstilt ved merking av RNA tidligere iso-32

lert ved polynukleotidkinase ("PNK"). i nærvær av V P-ATP. Fragmentene som ble fremstilt av de små mengder ribonuklease som forurenset PNK, hadde en midlere lengde på 300 baser. Hybridisering til denne sonde ble utført i det vesentlige som beskrevet av N. Maniatis et- al., "The Isolation Of Stru-ctural Genes From Libraries Of Eucaryotic DNA", Cell, 15, s. 687-701 (1978). Autoradiografi av filterene viste tilstedeværelse av kolonier som inneholdt DNA sekvenser komplementære til autentisk FMD virus RNA. Koloniene som utviste

32

sterk hybridisering til den P-merkede sonde ble valgt for ytterligere analyse.

YTTERLIGERE ANALYSE AV KLONER INNEHOLDENDE INNSKUDD SOM HYBRIDISERER TIL FMDV DNA 20 ml kulturer av de ovenfor valgte sterkt hybridiserénde kloner ble fremstilt' ved 37°C i bactotryptofonmedium, supplementert som tidligere med tetracyklin (O.D.g[-Q = 0,6). Kulturene ble sentrifugert (10 min., 5000 omdr./min.1 og suspendert i 0,2 ml sukrose (25%-ig i 50 mM Tris-HCl (pH 8)), 0,03 ml lysozym (5 mg/ml) og fikk henstå i 5 min. i is. 25 mM EDTA (0,08 ml) ble tilsatt hvoretter blandingen igjen fikk henstå i 5 min. is. Den kalde, blanding ble deretter kombinert med 0,3 ml "Triton X100" (2% i 50 mM Tris-HCl (pH 8), 60 mM EDTA) og fikk henstå i is i 10 min. De lyserte celler ble sentrifugert i 1 h ved 17000 omdr./min. og det resulterende presipitat ble oppløst i TES puffer (1 ml). TES oppløsningen ble supplementert med 0,1 volum 10 mg/ml etidiumbromid (Serva) og CsCl til 1 g/ml og sentrifugert (35000 omdr./min., 48 h, 15°C). To DNA bånd kunne sees i røret ved UV belysning. Båndet med den høyeste densitet tilsvarte plasmidform I DNA, mens det andre bånd tilsvarte form II og form III plasmid DNA'er og noe kromosalt DNA. Det første bånd ble tatt ut av røret og etidiumbromid fjernet ved 6 ekstraksjoner med isoamylalkohol og den vandige fase fortynnet med 3 vol vann tilsatt 0,2 M natriumacetåt (pH 5,1) før DNA ble utfelt med 2,5 vol etanol. Det utfelte DNA ble gjenoppløst, ekstrahert med fenol og igjen utfelt med etanol. Form I DNA ble fullstendig oppsluttet med Pstl for å fjerne FMDV innskuddet og innskuddet ble sammenføyet, som tidligere, med den uspaltede form I DNA på en 1%-ig agarosegel under anvendelse av standardmarkører. De kloner som inneholdt innskudd av ~ 750 bp ble valgt for ytterligere analyse. De valgte kloner ble identifisert som følger:

E. coli HB101 (pBR322 (Pst)/FMDV-7 03 ).

E. coli HB101 (pBR322(Pst)/FMDV-715)

E. coli HB101 (pBR322 (Pst)/FMDV-410)..

E. coli HB101 (pBR322(Pst)/FMDV-144)

E. coli HB101 (pBR322(Pst)/FMDV-331)

E. coli HB101 (pBR322(Pst)/FMDV-217)

E. coli HB101 (pBR322 (Pst)/FMDV-118).

E. coli HB101 (pBR322(Pst)/FMDV-849)

Denne nomenklatur indikerer at klonen inneholder en E. coli HB101 vert og at det rekombinante DNA molekyl anvendt for å transformere denne vert er plasmid pBR322, inneholdende ved Pstl posisjonen et FMDV cDNA innskudd ("FMDV"), den spesielle klon ér nummerert i henhold til dens posisjon i klonebiblioteket. Eksempelvis angir "401" gruppe 4 , klon 1. For å lette identifikasjonen vil klonene i det etterfølgende bli henvist til i forkortet form. F.eks. vil E. coli HB101 (pBR322(Pst)/ FMDV-703) bli identifisert som E. coli FMDV-703, dets rekombinante DNA molekyl pFMDV-7 03 og innskuddet i det molekyl eller polypeptid kodet for av det innskutte FMDV-7 03.

Overraskende inneholdt ingen av klonene innskudd med en lengde større enn ca. 2500 bp. Fordi størrelsen av det fullstendig FMDV genom forutsatt fra FMDV RNA er ca. 7700.basis par og reversert transkripsjon av RNA til å gi cDNA begynner ved 3'enden av RNA var det forventet at ingen av disse kloner ville kode for proteiner med spesifisitet for FMDV beleggproteinene ! VP1-VP4.

For ytterligere analyse ble 100 ml kulturer av disse kloner dyrket i form I DNA isolert fra disse som angitt ovenfor.

Begrensningskart for Pstl spaltet DNA ble fremstilt under anvendelse av EcoRI, BamHI og Hindlll og størrelsen av de resulterende fragmenter bestemt som tidligere angitt. Ved sam-menligning' av disse begrensningsmønstere og størrelser med begrensningsmønstrene for cDNA tidligere bestemt kunne lokaliseringen av hvert innskudd i FMDV genomet fastlegges (fig.

3).'Fra denne rekkefølge (alignment) og ueksakte lokaliser-inger for kodesekvensene for de virale proteiner av FMDV (fig. 1), kunne man forutsi de antigene polypeptider som

kan kodes for av DNA sekvensene for hvert innskudd (fig. 3). Det var overraskende at innskuddene av de valgte kloner stam-met fra forskjellige deler av FMDV genomet og at ikke alle begynte ved 3'enden av genomet slik som man kunne forvente fra transkripsjonsmønstere fra'AMV reversert transkriptase. Ytterligere synes det som at noen av disse innskudd innebefatter en DNA sekvens som forventes å kode for en del av kapsidproteiriene av FMDV. Eksempelvis FMDV-715 og FMDV-144.

SYNTESE AV ET POLYPEPTID SOM UTVISER SPESIFISITET FOR FMD-VIRALANTIGENER AV E. COLI INNEHOLDENDE REKOMBINANTE DNA MOLEKYLER IFØLGE OPPFINNELSEN

25 ml kulturer av E. coli FMDV-703, E. coli FMDV-715, E. coli FMDV-144, E. coli FMDV-331, og som negative kontroller E. coli HBiOl og E. coli pBR322 ble dyrket som tidligere angitt til stasjonær fase. (Analyseresultatene for disse kloner er angitt i dette eksempel fordi innskuddene av disse klonene sammen utstrekker seg over en større del av FMDV genomet). Kloroform ble tilsatt hver kultur og den ble rystet i 10 min. og den vandige fase sentrifugert. Den dannede pellet ble igjen oppløst i 1 ml puffer (50 mM Tris-HCl (pH 8) eller 25

mM fosfatpuffer med natriumklorid (pH 7)) og ultralydbehandlet ("Branson B-15") i is i 3 min. Etter sentrifugering ble pelleten igjen suspendert i den tidligere puffer (1,0 ml) og

igjen ultralysebehandlet og sentrifugert. Supernantantene ble kombinert og undersøkt med hensyn til tilstedeværelse av antigene polypeptider som reagerer på.antilegemer for FMDV i flere immunobestemmelser.

1. " Sandwich"- inhiberingsbestemmelse

Brønnene i mikrotiterplater ble belagt med FMDV antilegemer (hyperimmune antilegemer ; marsvin). De belagte plater ble behandlet sekvensielt med de respektive ekstrakter, fremstilt som ovenfor angitt, FMDV og FMDV hyperimmune antilegemer kovålent bundet til alkalisk fosfatase, idet hvert bindings-trinn ble etterfulgt av vasking. Platenes farge ble etter ytterligere vasking og ved tilsetning av en oppløsning av p-nitrofenylfosfat fulgt for å bestemme en eventuell binding av polypeptidene i bakterieekstraktene til anti-FMDV antilegemene. Eventuelle tilstedeværende FMDV antigene polypeptider i bakterieekstrakter vil bindes til antilegemene i substratet. FMDV vil kun binde seg til antilegemer i substratet når de ikke er blokkert med antigene polypeptider fra bakterieekstraktet. Antilegemer kovalent bundet til alkalisk fosfatase vil binde seg i vesentlig■større grad til virus enn til eventuelle virusspesifikke polypeptider i ekstraktet, dette fordi virus har mange flere antigene determinanter enn antigene polypeptider. Reaksjonen mellom p-nitrofenylfosfat med alkalisk fosfatase danner en farge. Derfor vil en nedsettelse av farven i forhold til kontrollen indikere at ekstraktene inneholder polypeptider med spesifisitet for FMDV virale antigener. Resultatene av bestemmelsen var som følger:

2. Indirekte inhiberingsbestemmelse

To indirekte inhiberingsanalyser ble utført.

(a) Hyperimmunt antilegeme

Brønnene i mikrotiterplater ble belagt med FMDV virus og platene ble deretter behandlet med et reaksjonsprodukt av de respektive bakterieekstrakter og FMDV antilegemer (hyperimmunt antilegeme) (37°C i 30 min.). Brønnene ble vasket flere ganger og behandlet med FMDV anti-antilegeme kovalent bundet til alkalisk fosfatase og igjen vasket flere ganger. Som tidligere vil fargen av den faste fase etter behandling med oppløsningen av p-nitrofenylfosfat være indikativ for

en eventuell immun reaksjon. Ved denne bestemmelse ble kun de antilegemer som ikke var bundet til polypeptidene inneholdende FMDV ved spesifikke sekvenser tilstede i bakterieekstraktene binde til FMDV i den faste fase. Disse bundede posisjoner vil deretter tilveiebringe de eneste tilgjengelige posisjoner for anti-antilegeme binding. Derfor vil en redu-ksjon i farve indikere tilstedeværelse av FMDV spesifikke antigene polypeptider i bakterieekstraktene.

(b) Anti VPl spesifikt antilegeme

Denne bestemmelse ble utført som beskrevet ovenfor, bortsett fra at anti-VPl spesifikt antilegeme (mus) erstattet det hyperimmune antilegemet.

Resultatene for de indirekte inhibisjonsbestemmelser var som følger:

andre negative..

3. Direkte bindingsbestemmelse -

Anti VPl antilegemer

Ved en fremgangsmåte tilsvarende den for den indirekte in-hibisjonsbestemmelse ble brønnene i mikrotiterplater belagt med bakterieekstrakt fra de respektive kloner. Etter vasking ble brønnene behandlet med anti VPl spesifikt antilegeme (mus) kovalent bundet til alkalisk fosfatase og platene igjen vasket. Igjen ble immunreaksjonen fulgt ved behandling av den faste fase med en oppløsning av p-nitrofenylfosfat. Ved denne bestemmelse vil kun de VPl spesifikke antilegemer som bindes til FMDV spesifikke polypeptider i bakterieekstrakter være tilgjengelige for farvereaksjonen. I dette tilfellet vil derfor en økning av fargen indikere tilstedeværelse av FMDV spesifikke polypeptider i ekstraktet. Resultatene av denne bestemmelse var som følger:

4. Radioimmunobestemmelse

To radioimmunobestemmelser ble utført som følger:

(a) Antilegeme- belagte skiver

Polyvinylskiver ble belagt med FMDV antilegeme (hyperimmunt antilegeme), i. det vesentlige slik som beskrevet av S. Broome og W. Gilbert, "Immunological Screening Method To Detect Specific Translation Products", Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 74, 75, s. 2746-49 (1978).. Den faste fase ble behandlet i rekkefølge med de respektive bakterieekstrakter og radioaktivt merket. hyper immunant i legeme. Vasking, ble utført slik som beskrevet av S. Broome og W. Gilbert, supra, bortsett fra at 0,5% "Nonidet P4" (Fluka) ble tilsatt vaskepufferen. for vasking etter binding' av de radioaktive antilegemer. Radioaktiviteten av den faste fase ble deretter fulgt for

å bestemme immunreaksjonen. I dette tilfelle vil radioaktivt merket antilegeme kunne binde seg til posisjoner hvor et antigent polypeptid fra bakterieestraktene var bundet til antilegemet i den faste fase. Defor vil en merket.fast fase indikere tilstedeværelse av FMDV virale antigener i bakterieekstraktet.

(b) Bakterieektrakt-belagte plater -

Hyperimmunt antilegeme

•Plastikkskiver (polyvinylfilm) ble forbløtlagt over natten

i 0,2M NaHC03(pH 9,2) og vasket med vann før bruk. Dråper (~5<p>l) fortynnet bakter ieeks tr akt (1:1 med .0,4 M NaHC03) ble påført de tørre ubelagte plater. Hver plate ble deretter plassert i en enkel petriskål inneholdende fuktig filter-papir. Skålen ble deretter lukket og inkubert i 4 h ved 37°C. Skivene ble deretter fjernet og vasket 3 ganger ('^25 ml), med fosfatpufferoppløsning inneholdende 0,1% BSA og 0,5% FCS og fikk henstå til tørking. En fosfatpufferoppløsning (~1,5 ml) inneholdende 0,1% BSA, 0,5% FCS, 0,05% "Nonidet P40" ("WB/NP-6X25

40") og 5 x 10 cpm I-IgG ble påført skivene ved at disse ble satt på en nylonduk som var forvasket i vaskepufferen og inkubert over natten ved 4°C i pufferoppløsningen. Etter inkuberingen ble skivene vasket to ganger hver med 25 ml W.B/NP-40, f osf atpuf f eroppløsning inneholdende 0,5% "Nonidet P40" og vann. Skivene ble deretter tørket og plassert på en film for påvisning av radioaktivitet. Igjen indikerte merket fast fase tilstedeværelse av FMDV viral antigener i bakterieekstraktet.

Resultatene av radioimmunobestemmelsene var som følger:

Som en ytterligere kontroll ble ekstrakter av E. coli FMDV-703, E. coli FMDV-715 og E. coli FMDV-144 undersøkt etter at radioaktive antilegemer var inkubert med virus. I hver av disse bestemmelser utviste den faste fase ingen radioaktivitet, hvilket viste at alt av det merkede antilegemet tidligere var bundet til virusene og derfor ikke var tilgjengelige for binding med de FMDV spesifikke polypeptider i bakterieekstraktene.

DNA FRAGMENTKARTLEGGING OG NUKLEOTIDESEKVENSBESTEMMELSE

Bortsett fra deres anvendelse for fremstilling.av polypeptider som utviser FMDV antigenitet er de rekombinante DNA-molekyler også nyttige ved duplisering av viralspesifikke nukleotidesekvenser inneholdende alt eller en del av genomet av FMDV. FMDV DNA fremstilt på denne måte kan anvendes for å bestemme nukleotidesekvensen av deler av genomet, spesielt de posisjoner som koder for de forskjellig viral og kapsidproteiner av FMDV. Fra disse sekvenser kan struk-turen for polypeptidene i seg selv bestemmes. Kjennskap til disse sekvenser er ikke bare nyttig ved studie og forståelse av FMDV's biologi men muliggjør at det utføres modifikasjoner i de rekombinante DNA molekyler ifølge oppfinnelsen. For å forbedre utbyttet av det fremstilte protein, for å øke aktiviteten av de fremstilte proteiner eller utvide virus sero-typespektrumet for hvilket proteinene er effektive.

To av klonene, nemlig E. coli FMDV-715 og FMDV-144, hvis ekstrakter utviste en positiv bestemmelse for antigene polypeptider av FMDV ble anvendt for å bestemme nukléotidsekvensen

av området for genomet over hvilke de utstrakte seg (fig.

4 og 5). Basert på den antatte lokalisering av disse kloner

i genomet så omfatter dette området det området som koder for minst en del av kapsidproteinet VPl.

De fysikalske kart over de to innskuddene ble konstruert ved oppslutning med forskjellige begrensningsenzymer (New England Biolabs eller BRL) i de anbefalte puffere ved velkjente fremgangsmåter. Oppslutningsproduktene ble underkastet, elektroforese på 1% agarosegeler i 40 mM Tris-HOAc (pH 7,8), 2 mM EDTA. De ble analysert etter at dé ble syn-liggjort ved farging med etidiumbromid og sammenlignet med det detaljerte fysikalske kart av pBR322 (J. G. Sutcliffe, supra). Begrensningskart av forskjellige plasmider ble konstruert på basis av disse oppslutningsmønstere. Kartene ble raffinert ved sekvensering av DNA innskuddene, i det vesentlige slik som beskrevet av A. M. Maxam og W. Gilbert, "A New Method For Sequencing DNA", Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 74, s. 560-64 (1977).

Plasmid DNA ble fremstilt fra de to kloner som tidligere beskrevet og begrenset med forskjellige begrensningsenzymer. Begrenset DNA ble defosforylisert i 30 min. ved 65°C i nærvær av fosfatase fra kalveinvoller (Boehringer). Etter fenol-ekstraksjon og gelfiltrering på "Sephadex G-75" ble DNA'et 5'-terminalt merket med y- 3 2P-ATP 6000 Ci/mmol) og polynukleotidkinase.

For sekvensering ble de merkede fragmenter håndtert på to måter. Noe ble renset på polyakrylamidgel før spaltning med et andre begrensningsenzym. Andre ble umiddelbart spaltet med et andre begrensningsenzym. I begge tilfeller ble de ønskede fragmenter separert på eri polyakrylamidgel i Tris-borat-EDTA puffer. Fig. 4 viser de forskjellige begrensningsfragmenter (sirklene indikerer markeringen og pilen sekven-seringens retning) og den anvendte sekvenseringsstrategi under anvendelse av pFMDV-715 og pFMDV-14 4.

De fleste lengdene av cDNA innskuddene ble sekvensert fra begge bånd og de fleste begrensningsposisjonene som tjente som merkede ender ble sekvensert under anvendelse av et fragment som spenner over disse. Det relevante segment av nukleotidsekvensen oppnådd på denne måte for innskuddet for pFMDV-144 er vist i fig. 5. Denne sekvens utelukker ikke muligheten for modifikasjoner av sekvensen såsom mutasjoner, innebefattet enkle eller multiple,basissubstitusjoner, utelatelser, innskudd eller inversjoner som ikke allerede har funnet sted kan deretter anvendes for å modifisere dets ekspresjon, aktivitet eller effektspektrum.

Ved å sammenligne polypeptidene kodet for av dette området av FMDV genomet med sekvensen for 40 amino-terminalamino-syrer av autentisk VPl, bestemt av K. Strohmaier et al., supra, så synes det som at den valgte leseramme er korrekt og at DNA sekvensen av pFMDV-144 koder for ca. 90% av kapsidproteinet VPl av FMDV, type 0. Etter dets poly G sekvens koder DNA sekvensen av pFMDV-144 for et polypeptid hvis aminosyresekvens korresponderer til aminosyrene 23-40 av det som tidligere er bestemt for VPl. Den eneste forskjell mellom den tidligere bestemte aminosyresekvens og den som kodet for av DNA innskuddet av pFMDV-144 ligger i aminosyrene 33 og 38, hvor de tidligere bestemmelser ikke var veldefinerte og i aminosyre 37 hvor en Asn er innført i steden for det tidligere Asp, en forskjell som kan tilskrives en enkelt nukleotide-forandring.(I et senere isolert DNA fragment FMDV-1034 var nukleotidesekvensen som koder for aminosyre 37 GAC, dvs.

en kodon som koder for Asp (infra). Derfor mangler DNA innskuddet pFMDV-144 kun aminosyrene 1-22 fra dets aminoav.slut-tende ende. Resten av VPl, dvs. til dets karboksyavsluttede ende er kodet for av DNA innskuddet for pFMDV-144 ("FMDV-144") fordi innskuddet utstrekker seg meget lengre enn det som er nødvendig for å kode for 240-250 aminosyrene av VPl.

DNA innskuddet av pFMDV-715 begynner ved aminosyre 47 av VPl. Den overlapper deretter med DNA innskuddet av pFMDV^-144, eksempelvis fig. 3. Derfor vil innskuddet av pFMDV-715 kode for ca. 80% av kapsidproteinet av VPl av FMDV, type 0.

Mens ingen av innskuddene åv pFMDV-144 eller pFMDV-715 koder for den fullstendige aminosyresekvens av VPl så utviser de begge en aktivitet i overensstemmelse med viralspesifikke polypeptider av FMDV ved forskjellige undersøkelser. Derfor innebefatter hver av dem tilstrekkelig av en virus spesifikk nukleotidesekvens til å produsere et antigent polypeptid i en vert som er i stand til. å uttrykke det rekombinante DNA molekyl ifølge oppfinnelsen (supra).

IDENTIFIKASJON AV ANDRE KLONER INNEHOLDENDE DNA SEKVENSER SOM. HYBRIDISERER TIL DNA INNSKUDDENE AV DE REKOMBINANTE DNA MOLEKYLER IFØLGE OPPFINNELSEN '

Selv om DNA innskuddene av E. coli FMDV-715 og E. coli FMDV-144 ikke innebefatter den fullstendige sekvens for et spesielt viralt protein så vil hver produsere bakterieekstrakter som utviser antigenitet for virale polypeptider av FMDV. Disse kloner kan derfor anvendes for å utvelge andre kloner som kan inneholde en mere fullstendig eller ytterligere DNA sekvens og som i en vert er i stand til å uttrykke antigene polypeptider. Slik utsiktning av kloner.ble utført ved å isolere form I DNA av det aktuelle klon og anvende dets DNA innskudd for hybridisering til form I DNA fra andre kloner på tilsvarende måte som anvendt ved hybridisering av FMDV RNA i den opprinnelige kloneutsiktningsprosess (supra). For eksempel har innskuddet av pFMDV-144 vært anvendt for å lokalisere andre kloner inneholdende DNA innskudd som hybridiserer for en del av innskuddet av pFMDV-144.

Form I DNA fra pFMDV-144 ble isolert som tidligere og Pstl - Hindll fragmentet (nærmest 5'enden) isolert. Dette fragment inneholder ca. 90% av nukleotidesekvensen som koder for VPl.

I alt ble 1000 kloner (400 fra det tidligere bibliotek og

600 (12 grupper av 50 kloner) fra en andre transformering) ble siktet under anvendelse av det ovenfor nevnte fragment som sonde på tilsvarende måte som siktingen av det opprinnelige bibliotek med FMDV-RNA sonden. Seksten kloner utviste sterk hybridisering til dette fragment. De ble ytterligere analysert med Barn HI begrensningskartlegning og størrelses-bestemmelse. Tre kloner med DNA innskudd med Bam HI begren-sningsposisjoner og mer enn ca. 1000 bp i lengde ble utvalgt

(fig. 3). Disse kloner ble identifisert som tidligere ved deres tilfeldige posisjon i klonebiblioteket, nemlig E. coli HB101 (pBR322(Pst)/FMDV-1034), E. coli HB101 (pBR322(Pst)/ FMDV-1824) og E. coli HB101 (pBR322(Pst)/FMDV-1933). P.g.a. deres sterke hybridisering til FMDV-144, tilstedeværelsen av Barn HI begrensningsposisjon og størrelsen av deres Bam HI begrensningsfragmenter var. det forventet at disse kloner ville innebefatte den fullstendige nukleotidesekvens for VPl og muligens alt eller en del av nukleotidesekvensene av VP2 og VP3. I alle tilfeller kan ytterligere kloner fra et bibliotek utsiktes i henhold til foreliggende fremgangsmåte for å velge ut slike kloner.

Kulturer av disse tre kloner ble fremstilt som tidligere bg deres bakterieekstrakter analysert ved den direkte bindingsbestemmelse-anti VPl antilegemer ("3") og med bakterieekstrakt-belagte skiver-hyperimmune antilegeme radioimmunobestemmelse ("4(b)"), som tidligere beskrevet. Resultatene av disse bestemmelser var som følger:

Denne utsiktningsprosess kan naturligvis anvendes for å ut-sikte ytterligere kloner under anvendelse av FMDV-144 fragmentet for å påvise andre kloner med innskudd som hybridiserer lette fragment eller kan anvendes under anvendelse av andre fragmenter for å påvise kloner med innskudd som hybri-

diserer til disse.

KLONER INNEHOLDENDE pFMDV- 7 03 OG pFMDV- 331

Fra deres plassering i FMDV genomet' innebefatter ikke DNA innskuddene av pFMDV-703 og pFMDV-331 ikke engang en del av nukleotidesekvensen for VPl. Heller ikke hybridiserer de til FMDV-144 (supra). Derfor er de antigene polypeptider fremstilt av pFMDV-703 og pFMDV-331 i en vert som er i stand til å uttrykke polypeptider som utviser spesifikke virale antigener av FMDV ikke forventet å være identisk med VPl. Imidlertid utviser bakteriekstrakter av kulturer av FMDV-703 og FMDV-331 kloner antigen aktivitet mot hyperimmune antilegemer av VPl spesifikke antilegemer i visse bestemmelser. Det er antatt at denne aktivitet indikerer at antigene polypeptider uttrykt av E. coli FMDV-703 og E. coli FMDV-331 inneholder aminosyresekvenser som virker som antigene determinanter for VPl antilegemer. Disse antigene polypeptider kan derfdr anvendes ved fremgangsmåter og i blandinger for å gjøre dyr resistente, i det minste en tid mot FMDV.

FORBEDRING AV UTBYTTE OG AKTIVITETEN AV POLYPEPTIDER SOM UTVISER SPESIFISITET FOR VIRALE ANTIGENER AV FMDV, FREMSTILT I HENHOLD TIL OPPFINNELSEN

Produksjonsnivået for et protein styres av to hovedfaktorer: antall kopier av dets gen inne i cellen og effektiviteten med hvilken disse genekopier transkriberes og oversettes. Effektiviteten av transkripsjonen og oversettelsen (som tilsammen utgjør ekspresjon), er på sin side avhengig av nukleotidesekvensene som normalt er plassert foran den ønskede kodesekvens. Disse nukleotidesekvenser eller ekspresjonskontrollsekvenser definerer bl.a. lokaliseringen ved hvilken RNA polymerase samspiller til å initiere transkripsjon (promotor-sekvensen) og ved hvilken ribosombinding og samspill med mRNA (produktet av transkripsjon) for å initiere oversettelse. Ikke alle slike ekspresjonskontrollsekvenser virker med like stor effektivitet. Det er således en fordel å separer den spesifikke kodesekvens for det ønskede protein fra deres til-støtende nukleotidesekvenser og i stedet sammensmelte dem med andre kjente ekspresjonskontrollsekvenser for å fremme høyere nivåer av ekspresjon. Når dette er oppnådd kan det nykonstru- erte DNA fragment innføres i et flerkopiplasmid eller et bakteriofagderivat for å forøke antall genekopier inne i cellen og derved ytterligere forbedre utbyttet av det uttryk-te protein.

Flere ekspresjonskontrollsekvenser kan anvendes som beskrevet ovenfor. Disse innebefatter operatør, promotor og ribosombinding og samspillende sekvenser (innebefattende sekvenser såsom Shine-Dalgarno sekvensene) av laktoseoperonet av E. coli ("laksystemet"), de tilsvarende sekvenser av tryptofansynte-tasesystemet av E. coli ("trp systemet"), hovedoperatør og promotorområdene av fagX(0TPTog C- P*) , kontrollområdet av ;Li J_j K K;Filamenteous enkeltbåndede DNA fager, eller andre sekvenser som kontrollerer ekspresjonen av gener av prokaryotiske eller eukaryotiske celler og deres vira. Derfor for å forbedre produksjonen av et spesielt polypeptid i en passende vert kan genet som koder for dette polypeptid velges som tidligere og fjernes fra et rekombinant DNA molékyl inneholdende dette og reinnføres i et rekombinant DNA molekyl nærmere eller i et mere passende forhold til dets tidligere ekspresjonskontrollsekvens eller under kontroll av en av de ovenfor nevnte forbedrede kontrollsekvenser. Slike fremgangsmåter er kjente innen teknikkens stand. Uttrykket "forhold" kan omfatte mange faktorer, eksempelvis avstanden som adskiller ekspre-sjonsfremmende og promoterende områder av de rekombinante DNA molékyl og den innskutte DNA sekvens, transkripsjon og oversettelsesegenskapene for den innskutte DNA sekvens og andre sekvenser i selve vektoren, den spesielle nukleotidesekvens av den innskutte DNA sekvens og andre sekvenser av vektoren og de spesielle egenskaper av de ekspresjpnsfrem-mende og promoterende områder av vektoren . ;Ytterligere forøkelse av det cellulære utbyttet av ønskede produkter er avhengig av en forøkelse i antall gener som kan utnyttes i fellen. Dette kan eksempelvis oppnås ved innfør-ing av rekombinante DNA molekylerkonstruert slik som tidligere beskrevet i temperat bakteriof ag (NM989), hvilket enklest kan utføres véd oppslutning av plasmidet med et begrensningsenzym til å gi et lineært molekyl som blandes med en begreh- set fagA klonebærer (eksempelvis typen beskrevet av N. E. Murray et al., "Lambdoid Phages That Simplify The Recovery Of In Vitro Reccmbinants", Molec. gen. Genet. 150, s. 53-61 (1977) og N. ;E. Murray et al., "Molecular Clohing Of The DNA Ligase Gene from Bacteriophage T4", J. Mol. Biol., 132, s. 493-505 (1979)) hvoretter det rekombinante DNA molekyl resirkulariseres ved inkubering med DNA ligase. Det ønskede rekombinante fag blir deretter valgt som. tidligere og anvendt for lysogenisering av en vertsstaimie av E. coli. ;Spesielt nyttige klonebærere inneholder en temperaturføl-som mutasjon i represjonsgenet cl og undertrykkbare mutasjoner i gen S, hvis produkt er nødvendig for lyse av vertscellen, samt gen E hvis produkt er hovedkapsidproteinet av viruset. Med dette system dyrkes lysogene celler ved 32°C og oppvarmes deretter til 4 5°C for å indusere avdeling av profag. Forlenget dyrkning ved 37°C fører til høye produksjonsnivåer av proteinet som bibeholdes inne i cellene da disse ikke lyses av faggenet produsert på normal måte-og da faggeninnskuddet ikke er enkapsidert vil det forbli tilgjengelig for ytterligere transkripsjon. Kunstig lyse av cellene vil deretter frigjøre det ønskede produkt i høyt utbytte. ;I tillegg må det forstås at utbyttet av polypeptider som utviser FMDV antigenitet, fremstilt i henhold til oppfinnelsen, kan også forbedres ved å substituere i forskjellige kodoner for noen eller alle av kodonene tilstede i DNA sekvensene, idet de substituerte kodoner koder for aminosyrer identiske til de som er kodet for av de erstattede kodoner. ;Sluttligen kan aktiviteten av polypeptidene fremstilt av det rekombinante DNA molekyl ifølge oppfinnelsen forbedres ved fragmentering, modifisering eller derivatisering av DNA sekvensene eller polypeptidene ifølge oppfinnelsen ved velkjente måter, uten å avvike fra oppfinnelsens omfang. ;KLONER INNEHOLDENDE EN DEL AV pFMDV- 1034 DNA INNSKUDDET;Som et eksempel på en fremgangsmåte for å forbedre utbyttet og derfor aktiviteten av polypeptider som utviser spesifisitet av virale antigener av FMDV fremstilt i henhold til oppfinnelsen ble pFMDV-1034 (fig. 3 og 6) isolert fra kolonier av E. coli HB 101 (pBR322 (Pst) /FMDV-1034 ).. Dette hybridplas-raid ble anvendt som kilde for DNA sekvensen for den etterføl-gende innføring i ekspresjonskontrollvektoren pPLc24. ;! i 1. Vektor pPLc24 ;.Vektor pPLc24 (fig. 6, en gave fra Walter Fiers) inneholder 3-laktamasegenet og en del. av pBR322. Et 290 basispar Haell-EcoRI fragment inneholder P 0 regionen fra bakteriofag A . Retningen for transkripsjonen fra P promotoren er mot EcoRI., Et 431 basispar EcoRI-BamHI fragment koder for ribosombind-ingsposisjonen og de første 99 aminosyrerester av bakteriofag MS2 replikasegenet, erholdt fra plasmid pMS-7 (R. Devos et al., "Construction And Characterization Of A Plasmid Con-taining A Nearly Full-Size DNA Copy Of Bacteriophage MS2 RNA", J. Mol. Biol. 128, 595-619 (1979)). Oversettelse av MS2 re-plikaseproteinfragmenter forløper kolineært med transkripsjonen fra PT promotoren. Transkripsjon fra P Li promotoren, tilstede i plasmid pPLc24 undertrykkes ved å holde plasmidet i en E. coli stamme som synteserer et undertrykkelses<p>rotein, nemlig produktet ifølge faggen cl. Som følge av dens autoregulerende syntesemåte (M. Ptashne et al., "Autoregulation And Function Of A Repressor ln BacteriophageA", Science, 194, s. 156-61 (1976)), er en kopi av cl faggenet på kromosomet av en lysogen stamme i stand til fullt å undertrykke PT promotoren tilstede i et multikopiplasmid. 2. Fremstilling og valg av kloner inneholdende en del av pFMDV- 103 4 DNA innskuddet ;Under henvisning til fig. 7 ble vektoren pPLc24 begrenset med begrensningsenzymene BamHI og Hindlll til å gi komplementære ender for etterfølgende sammenknytning med begrenset DNA sekvens fra pFMDV-103 4. ;Kulturer av E. coli HB 101 (pBR322 (Pst)./FMDV-1034 ble fremstilt ved 37°C i baktotryptonmedium supplementert med 10/ig/ ml tetracyklin (O.D.g^Q= 0,6). Kulturene ble sentrifugert (10 min., 5000 omdr./min. ).og resuspendert i 0,2 ml sukkrose ;(25% i 50 mM Tris-HCL (pH 8)) og 0,03 ml lysozym (5 mg/ml);og fikk henstå i 5 min. i is. 25 mM EDTA (0,08 ml) ble tilsatt og blandingen fikk igjen henstå i 5 min. i is. Den kalde blandingen ble deretter kombinert med 0,3 ml "Triton XlOO." i (2% i 50 mM Tris-HCL (pH 8), 60.mM EDTA) og fikk henstå i' is i 10 min. De lysede celler ble sentrifugert i 1 h ved 17000 < omdr./min. og til den resulterende supernantant ble tilsatt 0,1 volum 10 mg/ml etidiumbromid (Serva), og CsCl til 1 g/ml og sentrifugert (35000 omdr./min., 48 h, 15°C). To DNA bånd kunne sees i røret ved UV-belysning. Båndet med den høyeste! densitet tilsvarte plasmid form I DNA (pFMDV-1034, fig. 6), det andre bånd tilsvarte form II og form III plasmid DNA'er og noe kromosomalt DNA. Det første bånd ble oppsamlet fra røret, etidiumbromid fjernet ved seks isoamylalkoholekstrak-sjoner og den vandige fase fortynnet med 1 vol vann tilsatt 0,2 M natriumacetat (pH 5,1) før DNA ble presipitert med 2,5 volumdeler etanol. ;DNA ble gjenoppløst, ekstrahert med fenol og igjen presipitert med etanol. Form I DNA ble oppsluttet fullstendig med Pstl og et fragment (FMDV-1034 ). med 1150 basispar, som rep- ' resenterte det totale DNA innskudd i pFMDV-1034 ble isolert på en 1% agarosegel under anvendelse av standardmarkører (fig. 8). Dette innskudd ble ytterligere begrenset med BamHI og Hindlll under anvendelse av konvensjonelle begrensningspro-sedyrer. BamHI-Hindlll begrensningen resulterte i et DNA fragment ("FMDV-1034 (BamHI-Hindlll)") på ca. 850 basispar, idet ca. 150 basispar var fjernet fra hver ende av Pstl-pFMDV-1034 fragmentet ved begrensningen (fig. 7-10). ;Den spaltede vektor (pPLc24 (BamHI-Hindlll)) og DNA fragmentet (FMDV-1034 (BamHI-Hindlll)) ble kombinert i forholdet 1:2 og presipitert med etanol. Presipitatet ble separert og gjenoppløst i T4 DNA ligasepuffer (3 ug vektor/ml) og sammenknytningen fikk skje over natten ved 15°C. ;CaCl~kompetent E. coli W6 (A v ) , med kromosomalA. repressor cl, slik at PT kontrollert ekspresjon ble forhindret, ble tranformert med ligaseblaridingen og ampicillinresistente kolo- ;37 nier ble valgt etter dyrkning i L-buljong tilsatt 40 ;ug/ml ampicillin. Fordi vektoren pPLc24 innebefatter genet som ;koder for 3-laktamase, vil E. coli verter transformert med et plasmid med dette gen intakt vokse i et medium inneholdende ampicillin på bekostning av de bakterier som ikke er således; transformert. 50 ampicillinresistente kloner ble tatt ut og hybridisert, slik som beskrevet av M. Grunstein og D. S. Hogness, "Colony Hybridization: A Method For The Isolation of Cloned DNAs That Contain A Specific Gene", Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 72, s. 3961-65 (1975), med en 32P-merket PstI-pFMDV-1034 sonde fremstilt ved "nick" translasjon i nærvær av E. coli 3 2 ;DNA pol I og a- P-dATP. Syv intenst positive kloner ble utvalgt. Disse syv kloner kan identifiseres som følger: ;E. coli W6 (L, -pPLc24 (BamHI-HindIII)./FMDV-1034 (BamHI-;Jl e .K S;Hindlll).. Disse kloner vil bli betegnet i det etterfølgende som henholdsvis E. coli<W6>(X r 6K, S -pPL-VPl-1), deres plasmider som pPL-VPl-1 og deres DNA innskudd som VP1-1. (En annen klon identifisert som E. coliW6 (A. r 6K , S-pPL-VPl-5). ble også utvalgt. I en etterfølgende undersøkelse ble kolonier av E. coli NF1 (An cro cIts-pPL-VPl-5) produsert bakterieekstrakter som utviste respons i overensstemmelse med tilstedeværelsen av VPl-beslektede antigener etter vekst over natten ved 37°C. ;Plasmid DNA ble isolert fra disse intenst hybridiserénde kloner som tidligere angitt og anvendt for å transformere (CaC^ ;kompetent) bakteriestammen E. coli NF1 (K12M72 lac ^ . EA2 ;_ _ _am _trp ;Sm (*cl851 N -,N n-AHI bio ) ("E. coli NF1 (AN kro~d. )")

am/ am53 ts (U. H. Bernard et al., "Construction Of Plasmid Cloning Vehicles That Promote Gene Expression From The Bacteriophage il P Promoter", Gene, 5, 59-76 (1979).). Denne stamme inneholder defekt, ikke-utkuttbart Aprofag som bærer ét mutant cl gen. Dette mutante gen koder for en temperaturfølsom repressor (cl. ), som tillater igangsetning av transkriposjon fra PT promotoren ved å forandre temperaturen, ved 28 C er repressoren aktiv og undertrykker transkripsjon, men ved 42°C inaktiveres repressoren og transkripsjon fra PT pro-

I

motoren settes i gang.

ÅHI fjernelsen av profaget fjerner en del av cro genet og alle andre gener ytterligere til høyre for cro (M. Castel-lazzi et al., "Isolation And Characterization Of Deletions IriBacteriophage AResiding As Prophage In E. coli K12", Mol. gen. Genet., 117, s. 211-18 (1972)). Fjernelse av cro genet er fordelaktig fordi akkumulering av cro protein er kjent å undertrykke transkripsjon fra P promotoren (A. Johnson I et al., "Mechanism Of Action Of The cro Protein Of BacteriophageA", Proe. Nati. Acad. Sei. U.S.A. 75, 1783-1787 (1978)) Stamme NF1 har to gule mutasjoner i N hvilket gjør den fun-ksjonelt N-negativ. Derfor i stamme NF1 forløper transkrip-, sjon i fravær av N-genproduktet.

And— re stammer, eksempelvis E. coli M5219 (kl2 M72 lac am trpan Sm (A.CI857AHI bio252). (H. Grier, "The Kil Gene ofBacterio-phageA", Virology, 66, s. 589-604 (1975).)., som uttrykker

N-genproduktet kunne også anvendes i henhold til oppfinnelser Disse N+ stammer kunne være fordelaktige i de tilfeller hvor DNA områdene som skal transkriberes inneholder transkripsjons terminatorlignende sekvenser eller forsinkende sekvenser for RNA polymerase. F.eks. er produktet av N genet kjent å virke som en anti-terminator i bakterifag h (J. W. Roberts, "Tran-scription Termination And Late Control In PhageA ", Proe» Nati. Acad. Sei. U.S.A., 72, s. 3300-04 (1975)). Anti-termineringseffekten ble også observert med terminatorsek-venser som normalt ikke er tilstede i fagADNA (dvs. den naturlige stopp ved enden av trp operonet), forutsatt at RNA transkripsjonen begynner ved P promotoren. Ytterligere ble polaritetseffekter introdusert ved tilstedeværelse av en meningsløs kodon i P transkriptet frigjort ved styrkningen av N-genproteinet (for nærmere omtale se N. Franklin og C. Yanofsky, "The N Protein Of A : Evidence Bearing On Tran-scription Termination, Polarity And The Alteration Of E. coli RNA Polymerase" in RNA Polymerase (Cold Spring Harbor Laboratory, 1976) s. 693-706).

1 Med det tidligere nevnte plasmid i en termoinduserbar bak-

J

teriell cl bakgrunn muliggjør eksperimentell av- og påset-ning av aktiviteten til P promotoren.

Kolonier av transformerte verter ble styrket i en L-buljong tilsatt 40 ,ug/ml ampicillin ved 28 o C og kloner utvalgt til-<1>■ feldig fra hver av de syv sett av transformanter. I tillegg ble kolonier av verter transformert med plasmid pPLc24 dyrket ved 28°C og kloner valgt tilfeldig fra disse transformanter. Klonene ble identifisert som følger: • ]

E. coli NF1 (XN~cro~cIts-pPL-VPl-l) E. coli NF1 (AN~cro~cI s-pPLc24)

3. Radioimmunobestemmelse av bakterielle ekstrakter fra

E. coli NF1 (AN cro cL -pPL-VPl-1)

, ts— i Radioimmunobestemmelser av bakterielle ekstrakter fra E. coli NF1 (AN~cro~cIts-pPL-VPl-l) ble.utført på følgende : måte:

(a) Anti-O^K belagte skiver --

merket anti- VPl antilegeme

To kloner av E. coli NF1 (AN~cro cl -pPL-VPl-1) ble utvalgt tilfeldig fra de ovenfor beskrevne NF1 kolonier. Disse ble • dyrket ved 28°C og 42°C som tidligere angitt i duplikat og undersøkt med hensyn til ekspresjon av antigene polypeptider av FMDV ved hjelp av Broome-Gilbert bestemmelsen under anvendelse av anti-O-^K (marsvin hyperimmunserum til FMDV, type 0, subtype 1 (Kaufbeuren))-belagte skiver (S. Broome og W. Gilbert, "Immunological Screening Method To Detect Specific Translation Products", Proe. Nati. Acad. "Sei. USA, 75, s. 27.46-49 (1978) ) .

Ekstraktene ble fremstilt fra 100 ml kulturer dyrket ved 28°( til en densitet til 6x10 g celler/ml ved hvilket punkt temperaturen ble hevet til 42°C og inkubasjonen fortsatt i 4 h. Cellene ble deretter sentrifugert ved 6000 omdr./min. i 10 min. og pelleten gjenoppløst i 1 ml puffer (50 mM Tris-HCl

(pH 8) eller 25 mM fosfatpuffer med natriumklorid (pH 7)) og ultralydbehandlet ("Branson B-15") i 'is i 1 min. Etter sentrifugering ble pelleten resuspendert i den nevnte puffer (0,1 ml) og igjen ultralydbehandlet og sentrifugert. Super-

nantantene ble kombinert og undersøkt in duplo som beskrevet i det etterfølgende. Polyvinylskiver ble belagt, i det

vesentlige slik som beskrevet av Broome og Gilbert, supra, med anti-O^K IgG fra marsin. Den faste fase ble behandlet i rekkefølge med 5 ^ul av de respektive bakterieekstrakter

125

og I-merket IgG anti-VPl fra mus som tidligere var "exhausted" med et bakterieekstrakt fra E. coli HB 101 (pBR322)

(Det<125>I-merkede IgG anti-VPl ble inkubert ved 4°C i 4-6 h med 0,5 ml av ekstraktet (=5x10 9bakterie) og sentrifugert for å fjerne eventuelle immune komplekser), slik at det kan oppnås forbedrede negative kontroller. Vasking ble utført i i det vesentlige slik som beskrevet av Broome og Gilbert,

supra, bortsett fra at 0,5% "Nonidet P4") (Fluka). ble tilsatt til vaskemiddelet etter binding av de radioaktive antilegemer. To skiver ble anvendt forhver bestemmelse.

Ved denne bestemmelse vil radioaktivt merket anti-VPl kun binde seg til posisjoner på skivene hvor et VPl beslektet antigen fra bakterieekstraktene tidligere er bundet til det hyperinmune antilegemet i den faste fase. Derfor vil en merket, fast fase indikere tilstedeværelsen av VPl beslektede

i antigener i ekstraktet. Resultatene var som følger:

I tillegg utviste de ovenfor beskrevne bakterieekstrakter av E. coli NF1 (XN cro cIts-pPL-VPl-l) positive resultater ved Broome-Gilbert bestemmelsen ved opptil 1:50 fortynning. Dette er fordelaktig sammenlignbart med den positive bestemmelse obserbert for en.1:250 fortynning av den positive l kontroll. FMDV C^K.;

I

(b) Anti-O^K belagte skiver --

virus "exhausted"merket

anti- VPl antilegeme

Under anvendelse av de ovenfor nevnte ekstrakter ble en lig-j nende bestemmelse utført bortsett fra at før behandling av antigenene fra bakterieekstraktene til den faste fase med 125 i ' I-merket IgG anti-VPl ble det merkede antilegemet "exhausted" som tidligere angitt med E. coli HB101 (pBR322) og deretter "exhausted" med FMDV, type 0,K. Ved denne bestem-meise ble de tidligere positive resultater for E. coli NF1

(\N cro clt -pPL-VPl-1). bakterieekstrakt og positive kontroller ble negative fordi alt det merkede anti-VPl var ut-armet med virus og var derfor ikke tilgjengelig for binding til noen VPl antigene determinanter bundet til antilegemene i den faste fase. Disse resultater viser klart av FMDV O-^K fullstendig binder VPl spesifikt antilegeme og at antigenene, av bakterieekstrakteb ikke binder seg til denne kombinasjon.

(c) Anti-0 K belagte skiver --

merket FMDV og

bakterieekstraktkonkurranse

Ved denne bestemmelse ble anti-0,K belagte skiver fremstilt

125

som tidligere og anvendt ved en konkurranse mellom T I-'mer-, ket FMDV, type O-^K og bakterieekstrakter fra E. coli NF1 (A.N cro cltg-pPL-VPl-l) , fremstilt som angitt. Ved denne bestemmelse vil ekstraktet hvis det inneholder eventuelle VPl antigene determinanter og merket virus.konkurrere direkte for bindingsposisjonene i den anti-O-^K bundede faste fase. Resultatene av bestemmelsene var som følger:

Derfor konkurrerer med hell bakterieekstraktet av E. coli NF1 (AN cro cl ^-pPL-VPl-1) med merket virus for binding til anti-O^K.belagte skiver. Denne konkurranse kunne ikke ob-serveres for bakterieekstrakter av E. coli NF1 (,\N cro cl, - pPLc24). Den observerte konkurranse er et ytterligere bevis på tilstedeværelsen av VPl antigene polypeptider i ekstraktene av E. coli NF1 (An cro cl, -pPL-VPl-1) og viser at disse antigener er i stand til å konkurrere med hell med autentiske VPl antigener av FMDV virus.

(d) Anti-G^K belagte skiver --

merket IgG mot

Freund' s hjelpemiddel ( adjuvant)

Under anvendelse av en fremgangsmåte som i det vesentlige i er identisk med (a) ovenfor ble anti-O^K belagte skiver behandlet i rekkefølge med de ovenfor beskrevne bakteriekstrakter og<125>I-merket IgG mot Freund's adjuvant. Ingen positive resultater ble observert. Disse resultater viser at bindin-gen av det merkede antilegemet til antigenene av bakterie-ekstråktene er spesifikk for VPl antilegemer.

4. Ekspresjon av

pPL- VPl- 1 i miniceller

E. coli DS 410 (J. N. Reeve, Mol. gen. Genetics, 158, s. 73-79 (1977)) ble transformert med form I DNA isolert som tidligere fra E. coli W6 (A , -pPL-VPl-1) og E. coli W6 (Areks~pPLc24). Disse transformasjoner ble utført i det vesentlige under identiske betingelser, med de tidligere beskrevne bortsett fra at transformeringen ble utført i nærvær: av pRK248 cl t s (en gave fra Walter Fiers) (H. Bernard og D. R. Helinski, Methods in Enzymology, under trykk (1980))

i den'hensikt å indusere en téraperaturfølsom drepressor (cl. ) i de transformerte stammer,

ts

Kolonier av transformantene ble dyrket på L-plater (28°C), tilsatt tetracyklin (10 p. g/ ml) og ampicillin (40 pjg/ml) for å utvelge koloniene med dobbelt transformerte kloner, dvs. inneholdende pPLc24 eller pPL-VPl-1 og pRK248. Da pPLc24 bærer et gen for ampicillinresistens og pRK248 bærer et gen for tetracyklinresistens vil vekst i mediumet tilsatt ampicillin og tetracyklin skille dobbelt transformerte kloner fra de som ikke er således transformert.

Flere av disse dobbelt transformerte kloner ble avsatt på L-plater, supplementert som ovenfor angitt og kolonier igjen dyrket ved 28°C. For å sikre at pPL-VPl-1 transformerte kloner fra den andre inkubasjon fremdeles inneholdt VPl-1 DNA innskuddet ble et antall av disse kloner uttatt og pias- . midform I DNA separert derfra som tidligere beskrevet. I alle tilfeller hadde form I DNA separert fra disse kloner den korrekte størrelse for pPLc24 med innskutt VPl-1 DNA.

En av klonene av E. coli DS. 410 (pPL-VPl-1) / (pRK248 ). og E. coli DS 410 (pPLc24)/(pRK248) ble valgt tilfeldig fra flere inkubasjoner som beskrevet ovenfor bg anvendt ved fremstilling av miniceller. (J.N. Reeve, Mucopeptide Biosynthesis By Minicells In Escherichia coli", J. Bacteriol., 131, s. 363-65 (1977); J.N. Reeve, Mol. gen. Genetics, 158, s. 73-o -r 79 (1977)). Cellene ble dyrket i L-buljong ved 28 C og merket under inkubasjoner ved 42°C i 30 min. med<35>S-metionini

De merkede produkter ble direkte analysert ved separsjon på 12,5% SDS-polyakrylamidgel og etterfølgende autoradiografi av den tørkede gel. Et sterkt proteinbånd ble observert i celler inneholdende plasmid pPL-VPl-1 men ikke i.celler inneholdende plasmid pPLc24.

Molekylvekten for det observerte protein (s45000-48000d). er . i god overensstemmelse med den for et sammensmeltet protein inneholdende de 99 aminosyrer av MS2, aminosyrene som er kodet for av de ca. 850 basispar VPl-1 innskuddet og den del av pBR322 (13 aminosyrer) som går forut for den første stoppkodon (fig. 7 og 9-10).

5. Antilegemepresipitering av polypeptidene syntetisert i

minicellene

De ovenfor beskrevne celler merket med<35>S-metionin ble behandlet med lysozym/NP-40 og celleekstraktene forabsorbert med "Protein A Sepharose" (Pharmacia) og sentrifugert i et "Eppendorf" rør i 2 min. Denne fremgangsmåte resulterte i ekstrakter som ikke spesifikt bindes til "Protein A Sepharose" .

I

Supernantanten fra disse rør ble inkubert i 30 min. ved 37°C med det rensede IgG fra mus anti-VPl for å binde VPl beslek- ; tede antigener i ekstraktene.

"Protein A Sepharose" ble tilsatt for å binde antilegeme-<>>antigenkomplekset og blandingen inkubert ved 4°C i 2 h. "Protein A Sepharose" ble vasket fire ganger med TNE(10 mM Tris-HCl(pH 7,4), 100 mM NaCl, ImM EDTA)/0,05% NP-40 og de tilbakeholdte produkter ble separert på en 12,5%-ig SDS-polyakrylamidgel.

i Proteinbåndene ble observert ved autoradiografi. Et sterkt j bånd ved =45000-48000d og et svakere bånd ved 325000d (even-tuelt bearbeidet VPl) ble observert fra de antilegeme bundede ekstrakter fra pPL-VPl-1 tranformerte celler. Ingen av disse bånd ble påvist i de antilegeme bundene ekstrakter fra pPlc24 transformerte cellene. Derfor inneholder bakterieekstrakter; av E. coli DS 410 (pPL-VPl-1)./(pRK248) polypeptider som kan ' presipiteres med anti-VPl antilegemer, mens polypeptidene

inneholdt de bakterieekstraktene av E coli DS 410 (pPLc24)/

(pRK248) ikke presipiteres av anti-VPl antilegemer fordi de ikke inneholder VPl spesifikke'antigener. 6. Bestemmelse av produksjon av polypeptider som utviser FMDV antigenitet For å bestemme produksjonen av proteiner av disse tranformerte verter ble det ovenfor beskrevne sterke proteinbånd, 45000-48000d-, og båndet tilsvarende til (3-laktamase (27000d) skåret ut fra gelen og hver inkubert med NCS oppløser (Amer-sham) og scintilleringsvæske for å frigjøre proteinet fra gelen. Radioaktiviteten av proteinoppløsningen ble deretter bestemt i en scintilleringsteller.

Beregninger basert på at et molekyl av det sammensmeltede polypeptid (45000-48000d) inneholder 5 metionin (molekyler)

(fra sekvensdata angitt senere og kjente sekvenser for MS2 og pBR322) og at 10 qminiceller var påført gelen (de fleste ikke inneholdende plasmider) vil en celle produsere to molekyler sammensmeltet protein og 0,5 molekyler 3-laktamase.

Forsøk under anvendelse av forsterkningsmetoden og "normale" celler (NFl) (Neidhardt et al., J. Bacteriol. juli, 1980). tillater bestemmelse av en nedre grense på ca. 100 molekyler/ celler/30 min. merking. j

Denne antatte nedre grense er i overensstemmelse med produk-> s jonsbestemmelser , nemlig .="300 molekyler/celle, basert på ekstraktfortynningene som tidligere er diskutert. Det må naturligvis forstås at disse bestemmelser er kun tilnærmede og ytterligere at merkningstiden, kulturens densitet og også den valgte vert nødvendigvis ikke har vært optimal for ekspresjon av VPl-inneholdende sammensmeltet protein.

DNA FRAGMENT KARTLEGGING OG NUKLEOTIDESEKVENSBESTEMMELSE

For å bestemme nukleotidesekvensen av genet som koder for VPl såvel som nukleotidesekvensen av VPl-1 DNA innskuddet og,

i aminosyresekvensene som er kodet for av disse gener ble pFMDV-1034 isolert fra kolonier som tidligere beskrevet og dette plasmid anvendes for å bestemme nukleotidesekvensene av FMDV innskuddet. Dette plasmid ble valgt fordi det inneholder i det minste det fulle 'strukturelle gen for VPl.

Fysikalske kart av dette FMDV området ble konstruert, som tidligere beskrevet ved oppslutning med forskjellige begrensningsenzymer (New England Biolab eller BRL) i anbefalte puffere ved velkjente fremgangsmåter. Produktene fra opp-slutningen ble underkastet elektroforese på agarosegeler i 40 mM Tris-HOAc (pH 7,8), 2 mM EDTA. De ble analysert etter å ha vært gjort synlige ved farging med etidiumbromid og sammenlignet med det detaljerte fysikalske kart for pBR322 (J. G. Sutcliffe, "Complete Nucleotide Sequence Of The Escherichia coli Plasmid pBR322", Cold Spring Harbor Symposium, 43, I, s. 77-90 (1978)). Et begrensningskart for innskuddet ble konstruert på basis av disse oppslutningsmønstere (fig. 8) og kartet forbedret ved sekvensering av begrenset DNA, i det vesentlige slik som beskrevet av A.M. Maxam og

W. Gilbert, "A New Method For Sequencing DNA", Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 74, s. 560-64 (1977). Fig. 8 viser de forskjellige begrenshingsfragmenter (sirklene indikerer merkingen og pilen sekvenseringsretningen) og den anvendte sekvenseringsstrategi. Fig. 9-10 viser de aktuelle deler av nukleotidsekvensen for DNA innskutt FMDV-1034. Ved å sammenligne polypeptidet kodet for av dette DNA innskudd med sekvensen på 4 0 aminoterminale aminosyrer av autentisk VPl, bestemt.av K. Strohmaier et al. supra, så synes det som om at den valgte leseramme er korrekt og at<:>nukleotidene 1-639 av FMDV-103 4 koder for alt av kapsidpro- ■ teinet VPl av FMDV, type 0, dvs. omfatte det strukturelle gen for VPl (fig. 9-10).

Aminosyrene 1-40 FMDV-1034 korresponderer vel med den tidligere bestemte VPl aminosyresekvens bortsett fra aminosyrene 33 og 38 hvor de tidligere bestemmelser var tvilsomme. C- ; avslutningen for VPl er usikker. Imidlertid basert på upub-i liserte resultater av Strohmaier et al. som har foreløpig rapportert COOH-terminale aminosyresekvensdata og aminosyre-sammensetningsdata for peptidfragmenter (2 0-30 aminosyrer) fra den COOH-terminale ende av VPl så synes proteinet å ut-strekke seg til ca. aminosyre '213 av den viste sekvens. Derfor består den gjenværende del av innskuddet trolig av nukleotider av FMDV genomet bortsett fra det som koder for VPl.

I tillegg muliggjør nukleotide og aminosyresekvensene vist

i fig. 9-10 bestemmelse av nukleotidesekvensen og aminosyre-' sekvensen kodet derav av DNA innskuddet VPJrl. Dette innskudd utstrekker seg fra BamHI begrensningsposisjonen i FMDV-1034, aminosyre 9 av VPl, til Hindlll begrensningsposisjonen i FMDV-1034. Den sistnevnte avkutninger lokalisert ca. 79 aminosyrer etter aminosyre 213, den antatte COOH terminus for VPl. Derfor består det FMDV beslektede innskudd i VPl-1 av ca. 852 basispar som koder for 284 aminosyrer.

Den bestemte nukleotidesekvens av VPl-1, den kjente sekvens for MS2 og pBR322 og bestemmelsen av nukleotidesekvensene for sammensmeltningen av VPl-1 til MS2 og pBR322 understøtter den konklusjon at proteiner uttrykt for av E. coli NF1 , (A.N cro cI^s~pPL-VPl-l) er et sammensmeltnihgsprodukt bestå-

I

ende av 99 aminosyrer av MS2 tilstede i pPLc24, ca. 205 aminosyrer av VPl (aminosyrene 9-213)., idet de ca. 79 amino-; syrer kodet for av de ytterligere nukleotider i FMDV genomet tilstede i VPl-1 og ca. 13 aminosyrer av pBR322 som forløper forut for det første stoppkodon i den tilsvarende leseramme.; Størrelsen av dette sammensmeltede protein er i overensstemmelse med =45000-48000d proteinet isolert fra minicellene, som tidligere diskutert. !

Det er viktig å bemerke at selv om innskuddet i pPL-VPl-1 ikke koder for den fullstendige aminosyresekvens av VPl så innbefatter den tilstrekkelig av den VPl spesifikke nukleotidesekvens til å gi et sammensmeltningsprodukt som utviser spesifisitet for et viralt antigen av FMD (supra).

i

I tillegg bør det forstås at oppfinnelsen ikke er begrenset til det spesielle sammensmeltede protein, men mere det fullstendig VPl protein eller andre antigeniske spesifikke fragmenter eller derivater derav innebefattende polypeptider inneholdende kun en del av VPl eller polypeptider som innebefatter aminosyrer i tillegg til de av VPl eller fragmenter derav, enten alene eller som en del av sammensmeltnings-proteiner kan fremstilles ved fremgangsmåter som er analoge med de som er vist ved hjelp av eksempler og anvendt i metoder og sammensetninger for å beskytte dyr i det minste for en tid fra FMD viral infeksjon. For eksempel kunne pFMDV-1034 spaltes med Pstl og Hindlll og de respektive ender av-kuttes "chewed back", eksempelvis ved eksonukleasebehandling inntil endene er nær til aminosyre 1 og 213 av VPl, dvs. til ca. aminosyre -10 og 220 eller aminosyre 15 og 150 før pre- .' parering av fragmentet for innføring av ekspresjonskontrollvektoren. Likeledes kan BamHI/Hindlll fragmentet av pFMDV-1034 hybridiseres til passende enkeltbåndet fragment av pFMVD-1034 eller annen DNA sekvens inneholdende det fulle VPl strukturelle gen og hvor dette fullstendige gen anvendes som mal for å forlenge BamHI/Hindlll fragmentet til begynnelsen, nærmere til begynnelsen eller forbi begynnelsen av VPl kodesekvensen. Sluttligen kan andre fragmenter eller derivater av VPl genet, hvis polypeptider utviser antigen aktivitet overfor FMDV fremstilles for anvendelse ved fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen, dvs. ved variasjoner av de ovenfor beskrevne manipulasjoner.

I et eksempel på slike manipulasjoner ble pPL-VPl-1 oppslut-j tet med BamHI under anvendelse av betingelsene anbefalt av

leverandøren og 40 ug av. det oppsluttéde fragment blandet med tre enheter Bal 31 (BRC] i 750 pl Bal 31. puffer (12 mM CaCl2, 12 mM MgCl2, 600 mM NaCl, 20 mM Tris-HCl (pH 8,1), 1 mM EDTA. Alikvote deler ble tatt etter henholdsvis 2, 6, 10, 14 og 20 min. inkubasjon og fenolbehandlet på vanlig måte for å øde- : legge eventuell gjenværende Bal 31 og presipitert med etanol. De resulterende DNA fragmenter ble resirkulårisert ved ende-til-ende tilknytning til å gi plasmider med forskjellige utelatte lengder på hver side av BamHI posisjonen av pPL-VPl-1. Disse plasmider ("pFMDV-1034-Bal") ble anvendt for! å tranformere E. coli M5219 som tidligere beskrevet. 400 kolonier ble utvalgt og undersøkt med hensyn til produksjonen av polypeptider som utviser spesifisitet for FMD virale antigener i henhold til Broome-Gilbert bestemmelsen. Størrelse-bestemmelse av plasmidene fra' positive kolonier underbygget av at plasmidene var opptil 400 nukleotider mindre enn utgangs pPL-VPl-1. I tillegg var de sammensmeltede proteiner fremstilt av disse positive kolonier opptil 130-150 aminosyrer mindre enn de tilsvarende proteiner fremstilt av verter tranformert med pPL-VPl-1.

Denne serie Bal 31 utelatelser underbygger at den antigene del av VPl er lokalisert nær COOH enden av VPl fordi Bal 31 utelatelsene har fjernet 60-75 aminosyrer fra den NH2avsluttede ende av VPl uten å ødelegge den antigene aktivitet for proteinet. I tillegg viser den at DNA sekvensen ifølge oppfinnelsen som inneholder kun en del av VPl nyttig kan anvendes for å produsere produkter med spesifisiteten til FMD viral antigener ved ekspresjon i passende verter.

I tillegg tilveiebringer nukleotidesekvensen ifølge oppfinnelsen tidligere utilgjengelig informasjon vedrørende aminosyresekvenser av produkter som utviser spesifisitet av FMD ! virale antigener. Denne informasjon tillater kjemisk syn tese av små peptidfragmenter hvis aminosyresekvenser tilsvarer de sekvenser som er kodet for av nukleotidsekvensene av det' antigene DNA fragment. Syntetiske proteiner kan anvendes i vaksiner over fremgangsmåter for å beskytte dyr i det minste i en viss tidsperiode mot FMDV. Det må også forstås at begge disse prosesser og produkter er en del av forelig- i gende oppfinnelse.

i Plasmidene med Bal 31 utelatelsene er også anvendt som en kilde for VPl beslektede DNA sekvenser for innføring i andre kloningsvektorer og verter. F.eks. ble et av de Bal 31 ii utarmede plasmider ("FMDV-1034-Bal-l") oppsluttet med EcoRI og Hindlll og det resulterende EcoRI-Hindlll fragment inn-ført i pBR325 til erstatning for EcoRI-Hindlll fragmentet deri. I denne vektor er transkripsjon av hybridgenet under; kontroll av kloramfenikol acetyltransferase genpromotoren. Etter transformasjon av E. coli M5219 med det' erholdte hybridplasmid og kultivering av transformerte celler ble positive kolonier som produserer VPl beslektede antigener observert ved de vanlige bestemmelser.

Selv om det ovenfor gitte eksempel i det vesentlige vedrører manipulasjoner av FMDV-1034 er ikke oppfinnelsen, tilsvarende begrenset. I steden kan andre FMDV DNA inneholdende kloner anvendes på lignende måte for å produsere hybridplasmider som i passende bakterieverter vil muliggjøre forbedret ekspresjon av antigene polypeptider som er kodet for av disse DNA sekvenser. F.eks. kan andre FMDV beslektede DNA sekvenser såsom FMDV-144, FMDV-715, FMDV-1824, FMDV-1933 eller DNA sekvenser som hybridiserer for disse behandles på tilsvarende måte som beskrevet for FMDV-1034 for å forbedre utbyttet og aktiviteten av polypeptidene som er kodet av disse.

For eksempel E. coli FMDV-1448 (fig. 3), en av klonene isolert fra det opprinnelige klonebibliotek ble anvendt som tidligere angitt for å isolere pFMDV-14 48 og DNA sekvensen FMDV-14 48. Denne DNA sekvens ble deretter anvendt for å bestemme nukleotidesekvensen av VP3 på en måte tilsvarende den anvendt ved bestemmelse av nukleotidesekvensen av VPl

1 fra FMDV-1034. Det henvises til fig. 11 hvor den foreløpige bestemte nukleotidesekvens (og dens tilsvarende aminosyresekvens) av VP3 er vist. i

j Aminosyresekvensen bestemt for VP3 ved nukleotidesekvensering av FMDV-14 4 8 korresponderer godt med den som er bestemt ved proteinsekvensering for de første 32 aminosyrer av autentisk VP3 i henhold til Strohmaier et al., supra. Fra denne sekvens kan det sees at FMDV-1448 begynner ved aminosyre 9 (Asp) åv VP3 og fortsetter inn i VPl, aminosyre 221 (Thr) i fig. 11 er bestemt å være den første aminosyre av VPl (fig. 3 og 9). Den enkle forskjell mellom aminosyresekvensen av amino-. syre 9 til 32 i FMDV-1448 og autentisk VP3 forekommer ved aminosyre 23 hvor nukleotidsekvenseringen forutsier Asp og proteinsekvenséringen ga Thr. I tillegg har nukleotidpdsi-sjonen 310 ennå ikke blitt bestemt. Følgelig kan aminosyren ved posisjon 121 være Phe, Leu, Ile eller Val. Det er usik-kert hvor VP3 avsluttes da det ikke finnes noen stoppkodon før begynnelsen av VPl.

Et annet eksempel på slike manipulasjoner er produksjon av VPl sammen med minst en av VP3, VP2 eller VP4 av FMDV type O^K til å gi et kombinert antigenprodukt. Mere foretrukket fremstilles det primære produkt P88 (se fig. 1) i en passende vert under anvendelse av DNA sekvenser, rekombinante DNA molekyler og fremgangsmåtene ifølge oppfinnelsen til å tilveiebringe et primært FMDV antigenprodukt som er nyttige i vaksiner og ved metoder ved behandling av dyr.

ANVENDELSE AV ANTIGENE POLYPEPTIDER IFØLGE OPPFINNELSEN

I IMMUNOGENE BLANDINGER IN VIVO

De mange immunobestemmelser beskrevet ovenfor viser at DNA sekvensene og de rekombinante DNA molekyler ifølge oppfinnelsen dirigerer produksjon av antigene polypeptider til FMDV. DNA sekvensen har vist at noen av disse rekombinante DNA mol-, ekyler inneholder innskudd med minst eri hoveddel av det strukturelle gen som koder for kapsidprotein VPl.

Andre av disse kloner har den fullstendige sekvens av VPl og| de fullstendige eller partielle sekvenser for VP2 og VP3. Disse data sammen med den kjente anvendelse av kapsidprotein' VPl i vaksiner mot FMDV (Bachrach et al. , supra). antyder at de antigene polypeptider fremstilt i"henhold til oppfinn-eisen er nyttige i vaksiner mot FMDV. In vivo bestemmelse av de antigene polypeptider ifølge oppfinnelsen er utført. Som forventet var resultatene avhengig av mengden og renhe-ten av det antigene produktet fremstilt av verten men disse underbygger anvendbarheten av polypeptidene og foreliggende fremgangsmåter. i

For eksempel ble urenset ekstrakt av E. coli NF1 (A.N cro cl£s~ pPL-VPl-1) injésert i mus. Serum preparert fra disse mus ga svakt positive resultater ved bestemmelse for tilstedeværelsen av FMD virale antilegemer. I tillegg ble proteinbån-det ved~45000d fra bakteriekstrakt av E. coli NFlQN~cro~ cI^g-pPL-VPl-1) separert på en polyakrylamidgel. Det resulterende bånd ble fjernet fra platen, knust og anvendt for injeksjon i en kanin og fem mus. Etter en serie på 3 immuniseringer ble serum fra disse forsøksdyr analysert med hensyn til tilstedeværelse av antilegeme til FMDV. Museserumet ga positive resultater ved direkte binding med protein

125

"sepharose"- I-merket virus og i radioimmun konkurranse-bestemmelse. Imidlertid ble negative resultater observert i enzymtilknyttet sorbantbestemmelse (ELISA) og serumet nøy-traliserte aktiv virus, muligens p.g.a. den lave antilegemetiter. Negative resultater ble observert for alle bestemmelser for kaninserumet.

Sluttligen ble supernantanten fra et celleekstrakt (som ovenfor) av ca. 10"^ bakterie/ml renset ca. 10 ganger ved sterk behandling med nuklease og kromatografi på "G100 Sephadex". Utgangsekstraktet og G-100 toppen ble anvendt for injeksjon i tre geiter. Hver geit ble injesert med tre forskjellige preparater: ekstrakt-Freunds hjelpemiddel, ekstrakt-cy-gel og ektrakt-fornettet med glutaraldehyd. Etter tre immuniseringer viste to av geitene positive immune reaksjoner (ELISA). Derfor er immunogeniteten for bakterie-fremstilt FMDV-beslektede antigener ifølge oppfinnelsen vist

i dyr som lett smittes av FMDV infeksjoner.

Trolig p.g.a. den lave antilegemetiter ble nøytralisering av| aktiv virus ikke observert. Immunisering med mere renset antigen er forventet å gi sera i dyrene som vil nøytralisere aktivt FMDV.

Derfor er produktene fremstilt i henhold til fremgangsmåtene ifølge oppfinnelsen aktive in vivo til å produsere antilege-; mer med spesifisitet for FMD virale antilegemer. Det må naturligvis forstås at produktene fremstilt ved fremgangsmåtene ifølge oppfinnelsen ikke nødvendigvis må anvendes -alene for vaksinering av dyr. I steden for kan produktene være nyttige kombinert fysikalsk, kjemisk eller ved modifi-serte konstruksjoner av DNA sekvenser som koder for disse sammen med andre velkjente forbindelser som fremmer den immunologiske effekt og vaksinasjonens varighet.

IDENTIFIKASJON.AV ANDRE PROTEINER SOM UTVISER SPESIFISITET FOR VIRALE ANTIGENER AV FMDV

Fremgangsmåtene og prosedyrene, i henhold til oppfinnelsen er naturligvis ikke begrenset til identifisering og anvendelse av DNA sekvenser og rekombinante DNA molekyler som er særpreget ved at minst en del av DNA sekvensen som koder for kapsidproteinet VPl eller andre antigene proteiner av FMDV, type 0. I steden kan disse metoder og fremgangsmåter anvendes på lignende måte av en fagmann for å velge andre DNA sekvenser og rekombinante DNA molekyler som i en passende vert dirigerer produksjonen av andre polypeptider enn de som utviser spesifisitet for FMDV antigener, uten å avvike fra oppfinnelsens omfang. Eksempelvis kan DNA sekvenser og rekombinante DNA molekyler særpreget ved en kombinasjon av DNA sekvenser som koder for flere antigene proteiner av en enkelt FMDV serotype, DNA sekvenser og rekombinante DNA molekyler særpreget ved DNA sekvenser som koder for antigene proteiner av andre FMDV serotyper, DNA sekvenser og rekombinante DNA molekyler særpreget ved en kombinasjon av DNA sekvenser som koder for forskjellige kombinasjoner av antigene polypeptider av mere enn en eller alle FMDV serotyper, samt DNA

sekvenser og rekombinante DNA molekyler særpreget ved DNA sekvenser som koder for et enkelt bredt spektrum av antigene polypeptider av flere FMDV serotyper.

F.eks. kan metoden ifølge oppfinnelsen anvendes for å isolere mRNA fra andre FMDV serotyper og at dette mRNA analy-seres og klones via dets cDNA, slik som beskrevet ifølge oppfinnelsen til å gi produkter som utviser antigenitet for , disse serotyper. Disse produkter kan deretter anvendes j alene i enverdige vaksiner eller sammen med produkter be- i slektet til andre FMDV serotyper i bivalente eller bredspek-trumsvaksiner.

Mere foretrukket anvendes DNA sekvensene og de rekombinante ! DNA molekyler ifølge oppfinnelsen direkte for å muliggjøre fremstilling av DNA sekvenser og rekombinante DNA molekyler ! som i en passende vert dirigerer produksjonen av polypeptider som utviser spesifisitet av FMD virale antigener fra andre FMDV serotyper. Denne direkte prosess er mulig for det er nå bestemt at mRNA'ene av de andre FMD virale serotyper er ganske homologe med mRNA av subtype O^K. Denne homologi finnes også i området for kapsidprotein beslektede | områder av mRNA'ene. Derfor kan DNA sekvensene og de rekombinante DNA molekyler ifølge oppfinnelsen anvendes for å dirigere syntese av DNA sekvenser fra andre FMDV serotyper.

Bredt skissert er foreliggende fremgangsmåte særpreget ved fremstilling fra FMDV-103 4 eller andre sekvenser av en serie av mindre "priming" fragmenter lokalisert nær begynnelsen av det antigene området av VPl. Disse fragmenter blir deretter anvendt for ved hjelp av hybridisering å lokalisere det tilsvarende homologe område i mRNA'er fra andre FMDV serotyper. Straks det ønskede området, av mRNA er lokalisert kan en cDNA kopi av dette fremstilles under anvendelse av det hybridiserte fragment som en "primer". cDNA kan så anvendes, som beskrevet ovenfor for å konstruere rekombinante DNA molekyler for å produsere det ønskede antigene polypeptid i passende verter. Alternativt kan nukleotidsekvensen og derfor<1>den tilsvarende aminosyresekvens av det ønskede område av mRNA eller cDNA bestemmes og denne sekvens anvendes for å fremstille det ønskede antigene produkt ved tradisjonelle kjemiske metoder for etterfølgende anvendelse i FMDV vaksiner og behandlinger.

i Eksempelvis under henvisning til fig. 12 ble FMDV-1034 klo-! net inn i fd (for å omdanne det dobbeltbåndede FMDV-103 4 DNA til et enkelt bånd) i en orientering som tillater produksjon av minus DNA bånd av FMDV-1034. Minus DNA båndet ble deretter begrenset med Haelll (se fig. 12)' og de resulterende mange små fragmenter ("FMDV-1034 (Haelll)") merket med'<32->P under anvendelse av standard prosedyrer. Disse fragmenter ble deretter hybridisert til det totale mRNA, iso- j lert som beskrevet ovenfor fra en annen FMDV serotype, eksempelvis serotype A, i fig. 12. Hybridisering tillater at arealet som forløper forut for dén VPl antigene beslek- i tede del av mRNA å bli lokalisert. Deretter ble det hybridiserte fragment anvendt som en "primer" for å fremstille

cDNA fra de respektive RNA områder ved reversert transkriptase (fig. 12). cDNA ble deretter gjort dobbeltbåndet som tidligere angitt ved DNA polymerase og innført i en passende vert, vektorkombinasjon til å gi produkter som utviste antigenitet av virale antigener av FMDV type A. Alternativt ble områdene av mRNA lokalisert ved hybridisering til det merkede fragment eller cDNA kopien derav sekvensert og denne sekvens anvendt for fremstilling av peptider ved tradisjonelle kjemiske metoder, hvilke polypeptider utviser antigeniteten for virale antigener av disse serotyper. Derfor kan metodene og produktene i henhold til oppfinnelsen være nyttige ikke bare for fremstilling av produkter som utviser antigeniteten for FMD type O^K virale antigener men også i fremgangsmåte for å produsere antigener med andre FMDV stammer .

Mikroorganismene og de rekombinante DNA molekyler ved de beskrevne fremgangsmåter er eksemplifisert ved kulturer deponert i kultursamlingen i the American Type Culture Col-lection i Rockville, Maryland, den 5. mai 1980 og er identifisert som FMDV-A til C. '

A: E. coli HB101 (pBR322(Pst)/FMDV-715) B: E. coli HB101 (pBR322(Pst)/FMDV-331)

C: E. coli HB101 (pBR322(Pst)/FMDV-144)

i I Disse kulturer ble gitt henholdsvis tilgangsnummerene ATCC j 31640, 31641 og 31642.<1>

i i Mikroorganismene og de rekombinante DNA molekyler fremstilt i ved de beskrevne fremgangsmåter er også eksemplifisert ved kulturer deponert i kultursamlingen i Deutsche Sammlung Von

Mikroorganismen i Gottingen, Vest-Tyskland,. 12.. mai 1980 og [ identifisert som FMDV-D til G.

D: E. coli HB101 (pBR322 (Pst)/FMDV-703). ;

E: E. coli HB101 (pBR322 (Pst)./FMDV-1034) f j F: E. coli HB101 (pBR322 (Pst) /FMDV--18241 G: E. coli HB101 (pBR322(Pst)/FMDV-1933)

Disse kulturer er henholdsvis gitt tilgangsnummerene DSM 1814-1817. Ytterligere mikroorganisméne og rekombinante DNA molekyler fremstilt ved de' beskrevne fremgangsmåter er eksemplifisert med kulturer deponert i kultursamlingen i • Deutsche Sammlung von Mikroorganismen i Gottingen, Vest-Tyskland, 31. juli 1980 og identifisert som FMDV-A til C..'

A: E. coli W6 ( X , -pPL-VPl-1)

B: E. coli NF1 (AjsTcro^I t s-pPL-VPl-1)

C: E. coli NF1 UN~cro cl^ ts -pPL-V.Pl-5)

Disse kulturer er henholdsvis gitt tilgangsnummerene DSM 1879-1881.

Claims (10)

1. DNA sekvens karakterisert ved åt minst en del derav koder for et polypeptid som utviser FMDV , antigenitet og er valgt fra gruppen bestående av (a) FMDV-715, FMDV-144, FMDV-1034,■FMDV-1448, FMDV-1824, FMDV-1933, (b) DNA sekvenser som hybridiserer til en hvilken som helst av de nevnte DNA sekvenser, (c). DNA sekvenser uansett kilde innebefattende naturlige, syntetiske eller halvsyntetiske j kilder, beslektet ved mutasjon, innebefattet enkel . eller multippel, basissubstitusjoner, utelatelser, innskudd og in-, versjoner til en hvilken som helst av de nevnte DNA sekvenser,og (d) DNA sekvenser omfattende sekvenser av kodoner som koder for et antigent polypeptid inneholdende en aminosyresekvens j tilsvarende de kodet for av kodonene av enhver av de nevnte i DNA sekvenser.

2. DNA sekvens i henhold til krav 1, karakterisert ved at den er valgt fra gruppen bestående av DNA sekvensene med formelen: ACCACTTCTGCGGGCGAGTCAGCGGATCCTGTCACCACCACCGTTGAAAACTACG G.TGGCGAAACACAGATCCAGAGGCGCCAACACACGGACGTCTCGTTCATCATGGA CAGATTTGTGAAGGTGACACCGCAAAACCAAATTAACATTTTGGACCTCATGCAG ATTCCATCACACACTTTGGTGGGAGCACTCCTACGCGCGTCCACTTACTACTTCT CTGACTTGGAGATAGCAGTAAAACACGAGGGAGACCTCACCTGGGTTCCAAATGG AGCGCCCGAAAAGGCGTTGGACAACACCACCAACCCAACTGCTTACCACAAGGCA CCACTCACCCGGCTTGCCCTGCCTCACACTGCGCCCCACCGCGTGTTGGCAACCG TGTACAACGGTGAGTGCAGGTACAACAGAAATGCTGTGCCCAACTTGAGAGGTGA CCTTCAGGTGTTGGCTCAAAAGGTGGCACGGACGCTGCCTACCTCCTTCAACTAC GGTGCCATCAAAGCGACCCGGGTCACCGAGTTGCTTTACCGGATGAAGAGGGCCG AAACATACTGTCCAAGGCCCTTGCTGGCAATCCACCCAACTGAAGCCAGACACAA ACAGAAAATTGTGGCACCGGTGAAACAGACTTTG, samt fragmenter og derivater derav, hvilke fragmenter og derivater koder for antigene polypeptider av FMDV.

3. DNA sekvens ifølge krav 1, karakterisert ved at den er valgt fra gruppen av DNA sekvenser med formelen : I GCGACGGCTATGGTGGCCTGGTGACCACGGACCCGAAGACGGCTGACCCCGTTT ATGGGAAAGTGTTCAACCCCCCCCGCAACCAGTTGCCGGGGCGTTTTACCAACC TCCTTGATGTGGCTGAGGCATGCCCGACGTTTCTGCGCTTCGAGGGTGGCGTAC j CGTACGTGACCACGAAAACGGACTCGGACACCCTACTTGCTCAGTTTGACATGT <!> CTTTGGCAGCAAAACAAATGTCAAACACCTTCCTCGCAGGTCTTGCGCAGTAC j TACACACAGTACAGTGGCACCATCAÅCCTGCACTTCATG? TCACAGGACCCACTG ACGCGAAGGCGCGTTACATGGTTGCC.TACGCCCCACTAGGCATGGAGCCGCCCA j j AGACACCTGAGGCGGCCGCGCACTGCATTCATGCTGAATGGGACACTGGGTTAA i i ACTCAAAGTTTACTTTTTCCATCCCCTACCTCTCGGCCGCCGATTACGCGTACA i | CCGCGTCTGGCGTGGCCGAGACCACAAATGTGCAGGGATGGGTCTGCTTGTTTC AAATTACACATGGCAAGGCCGACGGCGACGCTCTGGTCGTACTGGCTAGTGCTG GTAAAGACTTTGAGCTAAGGCTGCCGGTGGACGCCCGTGCGGAA, samt fragmenter og derivater derav, hvilke fragmenter og derivater koder for antigene polypeptider av FMDV. ] i i i i i

4. Rekombinant DNA molekyl, kara kterisertj ved en DNA sekvens i henhold til kravene 1-3.

5. Rekombinant DNA molekyl i henhold til krav 4, karakterisert ved at DNA sekvensen er operativt forbundet med en eks <p> resjonskohtrollsekvens.

6. Fremgangsmåte ved fremstilling av et polypeptid som utviser spesifisiteten for FMD virale antigener, karakterisert ved å transformere en passende vert med et rekombinant DNA molekyl i henhold til kravene 4 eller 5 kultivere verten og oppsamle det ønskede polypeptid.

7. Fremgangsmåte ved fremstilling av et polypeptid som utviser spesifisiteten for et FMD viralt antigen, karakterisert ved å kultivere en vert transformert med et DNA molekyl i henhold til krav 4 eller 5 og oppsamle det nevnte polypeptid.

8. Fremgangsmåte ved utvelgelse av en DNA sekvens som koder for et polypeptid som utviser spesifisiteten for et FMD viralt antigen fra en gruppe av DNA sekvenser, karakterisert ved å sikte DNA sekvensene for å be- , stemme hvilke som hybridiserer til DNA sekvensene ifølge i kravene 1-3.

9. Fremgangsmåte ifølge krav 8, kara k! ter ise,r t ved at DNA sekvensen som siktes velges fra gruppen be- ! stående av cDNA sekvenser fra RNA av FMDV type 0, A, C, SATl; SAT2, SAT3 og Asiatisk I. !

10. Fremgangsmåte ifølge krav 8 eller 9, karakte-; risert ved det ytterligere trinn å anvende det j hybridiserte DNA sekvens som en "primer" enten for å tillate ! at minst en del av den tilstø tende ikke hybridiserte del av j. DNA å bli transkribert ved révers transkriptase eller å tillate at minst en del av den tilstøtende uhybridiserte del av DNA å bli sekvensert. i : I