SU1724691A1 - Рекомбинантна плазмидна ДНК @ 10FMD, кодирующа гибридный белок Р204-AS @ Р @ С @ С @ - VPI/200-213/ Р @ Р @ S @ Р @ ( 131-160) и штамм бактерий ЕSснеRIснIа coLI -продуцент гибридного белка Р204- А @ Р @ С @ С @ V PI/200-213/-Р @ Р @ S @ Р @ - VPI /131-160/ - Google Patents

Abstract

Изобретение относитс  к биотехнологии , в частности к генетической инженерии; и представл ет собой сконструированную In vitro рекомбинантную плазмидную ДНК, содержащую искусственный ген, кодирующий гибридный белок, в состав которого вход т антигенные детерминанты вируса  щура, промоторы ранней области бактериофага Т7 и синтетический участок инициации трансл ции, обуславливающий биосинтез полипептида, вызывающего при иммунизации экспериментальных животных образование вируснейтрализующих антител, защищающих от вирусной инфекции, а также штамм Е. coli - продуцент этого полипептида . Рекомбинантна  плазмидна  ДНК plOFMD кодирует иммуногенный полипептид Р204, в котором аминокислотна  последовательность фактора некроза опухолей человека своим С-концом соединена с аминокислотной последовательностью AspProCysCys-VP1(200-

Description

Изобретение относитс  к биотехнологии , в частности к генетической инженерии, и представл ет собой сконструированную In vitro рекомбинантную плазмидную ДНК, содержащую искусственный ген, кодирующий гибридный белок, в состав которого вход т антигенные детерминанты вируса  щура, промоторы ранней области бактериофага

Т7 и синтетический участок инициации трансл ции, обуславливающий биосинтез полипептида, вызывающего при иммунизации экспериментальных животных образование вируснейтрализующих антител, защищающих от вирусной инфекции, а также штамм Е. col - продуцент этого полипептида .

Вирус  щура вызывает высококонтагиозное заболевание парнокопытных сельскохоз йственных животных, нанос щее значительный ущерб. В качестве вакцины против  щура используют инактивирован- ный вирус. Технологи  приготовлени  такой вакцины требует опасного крупномасштабного культивировани  вирулентного вируса. Недостатком ее применени   вл ютс  вспышки заболевани , вызванные не полностью инактивированным вирусом.

Вирус  щура представл ет собой нукле- опротеид, состо щий из одной молекулы од- ноцепочечной значащей РНК и 60 копий каждого из капсидных белков VP1, VP2, VP3 и VP4. Поверхностный белок VP1  вл етс  главным антигеном и способен инициировать при вакцинации образование вирус- ней рализующих антител.

Однако полученный в чистом виде из вирусной частицы или технологией реком- бинантных ДНК белок VP1 вызывает слабый иммунный ответ, и поэтому не может использоватьс  в качестве субьединичной вакцины.

Альтернативный подход к созданию субьединичных вакцин против  щура вытекает из наблюдени , что синтетические пептиды , .включающие аминокислотные последовательности 141-160 и 200-213 белка VP1, при иммунизации в виде конъюгатов с белком-носителем вызывают образование значительного уровн  вируснейтрализующих антител.

Однако и в этом случае иммуногенность наиболее активного из этих пептидов остаетс  в 100-1000 раз ниже, чем иммуногенность целого вируса.

Трудности в создании субьединичной вакцины можно преодолеть, использу  дл  синтеза иммуногенного пептида технологию рекомбинантных ДНК.

Известна рекомбинантна  плазмида pFMD65, кодирующа  гибридный белок, в котором аминокислотна  последовательность /J-галактозидазы Е. coll соединена с повтор ющейс  последовательностью 141- 160 белка VP1 вируса  щура (штамм OiK). Методами иммунодиффузии и иммунофер- ментного анализа показано, что гибридный белок, продуцируемый бактери ми, содержащими рекомбинантную плазмиду

pFMD65, специфически св зываетс  с антителами к целому вирусу  щура OiK и к фрагменту 136-148 капсидного белка VP1.

Известны рекомбинантные плазмиды рМ01-71, рМ01-72, рМ01-74 и рМ01-78, кодирующие гибридные белки, в которых еди- нична илиповтор ющиес 

последовательности 137-162 поверхностного белка VP1 вируса  щура (штамм 01, BFS) слиты с последовательностью /3 -галактозидазы Е. col). Кодируемые этими плазми- дами гибридные белки способны при иммунизации морских свинок вызывать по вление вирусспецифических антител, взаимодействующих в иммуноферментном тесте

и иммуноблоттинге с рекомбинантным антигеном .

Однако данные о способности получаемых антител нейтрализовать вирус и предотвратить инфекцию отсутствуют.

По принципу конструировани  рекомбинантна  плазмида pFMD65, кодирующа  гибрид /3-галактозидаза - антигенна  детерминанта вируса  щура OiK,  вл етс  наиболее близким к предлагаемому

решением. ,

Недостатком перечисленных плазмид- ных конструкций  вл етс  то, что все они кодируют гибридные белки, в которых пептиды антигенных детерминант соединены с

/3-галактозидазой Е. coll. Однако сама бактериальна  Д-галактозидаза  вл етс  достаточно сильным иммуногеном. Кроге того, дол  пептидного фрагмента в таком сплавленном белке слишком мала, чтобы вносить

существенный вклад в иммунный ответ.

Цель изобретени  - конструирование рекомбинантной плазмидной ДНК plOFMD, кодирующей биосинтез иммуногенного полипептида Р204, которые инициируют образование нейтрализующих антител против штамма А22 вируса  щура, и бактериального штамма Е. coli SG20050/p10FMD (ВКПМ В- 5297) - продуцента этого полипептида, обеспечивающего высокий уровень его биосинтеза .

Кодируемый плазмидой plOFMD имму- ногенный полипептид состоит из аминокислотной последовательности фактора некроза опухолей человека, соединенной

своим С-концом с последовательностью универсальной антигенной детерминанты вируса  щура (последовательность 200-213 аминокислот белка VP1). котора  посредством пептидного спейсера ProProSerPro.

обеспечивающего изгиб полипептидной цепи , соединена с последовательностью главной вариабельной антигенной детерминанты вируса  щура (последовательность 131-160 белка VP1). Выбор этой последовательности обусловлен данными по локализации главного иммуногенного эпитопа вируса  щура и обеспечивает моделирование пространственной сближенности двух «-спиралей антигенных детерминант. В структуре иммуногенных полипептидов последовательность фактора некроза опухолей человека соединена с последовательностью пептидных антигенных детерминант вируса  щура через дипептид AspPro, что обеспечивает в случае необходимости возможность отщеплени  иммуно- генных пептидов в услови х м гкого кислотного гидролиза.

Рекомбинантна  плазмидна  ДНК plOFMD, кодирующа  иммуногенный полипептид Р204, характеризуетс  следующими признаками: кодирует аминокислотную последовательность гибридного белка - фактор некроза опухолей человека - AspProCysCys-VP1(200-213)-ProProSerPro -VP1(131-160); имеет мол.м. 2,49 Мд (3,81 т.п.о.); состоит изSauSAI/Hindlll -фрагмента ДНК плазмиды pTNF3l4A, содержащего тандем промоторов А2 и A3 ранней области бактериофага Т7, полусинтетический ген фактора некроза опухолей человека с искусственным участком инициации трансл ции, терминатор транскрипции фага л мбда и ген / -лзктамазы(3,66т.п.о.). SauSAI/Hlndlll - фрагмента, содержащего синтетический ген, кодирующий пептиды антигенных детерминант вируса  щура (штамм А22); а также содержит в качестве генетического маркера ген / -лактамазы, детерминирующий устойчивость трансформированных плазмидой plOFMD клеток Е. coli к пеницил- линовым антибиотикам, уникальные сайты узнавани  рестрикционными эндонуклеаза- ми, расположенными на следующих рассто ни х вправо от сайта BstEII: BamHI - 73 нуклеотида, Bglfl - 154 нуклеотида, Xhol - 174 нуклеотида, Hindlll - 241 нуклеотида, Ncol-574 нуклеотида, Pstl -2418 нуклеоти- дов.

На схеме изображены лигазные сшивки синтетических олигонуклеотидов в двухце- почечные ДНК (сегменты А и В), кодирующие пептиды - антигенные детерминанты белка оболочки VP1 вируса  щура (подтип

А22).

Дл  получени  двухцепочечных ДНК, кодирующих антигенные детерминанты вируса  щура (сегменты А и В) амидофосфит- ным способом синтезируют двенадцать олигонуклеотидов величиной от 14 до 43 нуклеотидных звеньев, которые затем соедин ют при помощи ДНК-лигазы.

Дл  дальнейшего конструировани  используют рекомбинантную плазмиду pTNF314 Л, котора   вл етс  производной плазмиды pTNF31lAc измененной с по- 5 мощью олигонуклеотид-направпенного мутагенеза С-концевой частью искусственного гена фактора некроза опухолей человека. В рез-ультате в самый С-конец гена был введен уникальный дл  этой плазмиды рестрикт- 0 ный сайт Bglll. ДНК плазмиды pTNF314A расщепл ют эндонуклеэзами ВоДИ и Hindlll, больший фрагмент выдел ют и лйгируют с избытком нефосфорилированного сегмента А. Аликвоту реакционной смеси используют

5 дл  трансформации компетентных клеток Е. coli HB101. Трансформанты высевают на LB-arap, содержащий 50 мкг/мл ампициллина , и скрининг колоний провод т гибридизацией с 5 - Р -меченным оли0 гонуклеотидом VIII. Из гибридизующихс  клонов выдел ют плазмидную ДНК p8FMD, строение которой подтверждают рестрикт- ным анализом с помощью эндонуклеаз Haell и Mspl, а также определением нукле5 отидной последовательности части плаз- мидной ДНК между сайтами рестриктаз Hindlll и BamHI.

Дл  конструировани  новой рекомби- нантной плазмиды plOFMD плазмидную

0 ДНК pSFMD сначала линеаризуют гидролизом эндонуклеазы Pstl, а затем полученную таким образом линейную форму ДНК подвергают действию рестриктазы Kpnl. Из образовавшейс  смеси фрагмент величиной

5 около 2,2 т.п.о. выдел ют электрофорезом в 1% геле легкоплавкой агарозы. С другой стороны ДНК плазмиды рТ1МР314Дгидроли- зуют смесью рестриктаз BgUI и Pstl. Выделенный электрофорезом как описано

0 Pstl/Bglll - фрагмент величиной около 1,6 т.п.о. лйгируют в присутствии большого избытка синтетического сегмента В с Pstl/Kpnl - фрагментом ДНК плазмиды pSFMD величиной около 2,2 т.п.о. Частью

5 лигазной смеси трансформируют компетентные клетки Е. coti HB101: трансформанты высевают на 1,7%-ный LB-arap, соде.ржа- щий 50 мкг/мл ампициллина. Скрининг провод т путем In situ гибридизации колоний с

0 5 - 32Р -меченным олигонуклеотидом XIII.

Выделенную из гибридизующихс  колоний

ДНК плазмиды plOFMD, анализируют при

помощи рестриктаз Mspl и НаеШ и ее струк .туру подтверждают определением нуклео5 тидной последовательности в районе клонировани  сегмента В.

Рекомбинантна  плазмида plOFMD кодирует иммуногенный полипептид Р204, который представл ет собой белок фактора

некроза опухолей человека, слитый через дипептид AspPro с последовательностью антигенной детерминанты подтипа А22 вируса  щура.

Дл  получени  бактериального штамма - продуцента иммуногенного полипептида Р204 плазмидой plOFMD трансформируют компетентные клетки Е. coli SG20050.

Полученные таким образом штаммы Е. coif 5С20050/р10РМО(ВКПМ В-5297)харак- теризуютс  следующими признаками.

Морфологические признаки.

Клетки мелкие утолщенной палочковидной формы, грамотрицательные, неспороносные .

Культуральные признаки.

Клетки хорошо растут на простых питательных средах. При росте на агаре Дифко колонии круглые, гладкие, прижаты, мутные , блест щие, серые, край ровный. При росте в жидких средах (на минимальной среде с глюкозой или LB-бульоне) образуют интенсивную ровную муть.

Физико-биологические признаки.

Клетки растут при температуре от 4 до 40°С при оптимуме рН от 6,8 до 7.0. В качестве источника азота используют как минеральные соли в аммонийной форме, так и органические соединени  в виде пептона, триптона, дрожжевого экстракта, аминокис- лот и т.д. В качестве источника углерода используют аминокислоты, глицерин, углеводы .

Устойчивость к антибиотикам.

Клетки про вл ют устойчивость к ампи- циллину (до 300 мкг/мл), обусловленную наличием плазмиды, а также к тетрациклину (до 30 мкг/мл), благодар  наличию транспо- зона.

Штамм Е. coli SG20050/p10FMD обус- лавливает конститутивный синтез больших количеств (свыше 25% тотального клеточного белка бактерий) иммуногенного полипептида Р204, способного при иммунизации животных вызывать образование антител, нейтрализующих штамм А22 вируса  щура.

П р и м е р 1. Химический синтез и лигирование олигонуклеотидов.

Синтез олигонуклеотидов выполн ют твердофазным фосфорамидитным методом на ДНК-синтезаторе System 1 (Beckman) с наращиванием олигонуклеотидной цепи в направлении от З -конца к 5 -концу с помощью защищенных фосфамидитов - 5- диметокситритил-М-эцил-2-дезоксинуклеозид-3 -0-(метоксидиизолропиламино)-фосфитов, активированных тетразолом. Синтез провод т в масштабе 0,5-0,7 мкмоль, использу  в качестве носител  пористое стекло (размер пор 500 А, размер частиц 40-80 мкм), к которому через З -сукцинатную св зь присоедин ют первое нуклеозидное звено (нагрузка 20-30 мкмоль/г). Используют описанный синтетический цикл, но после реакции конденсации провод т промывку смолы смесью тетрагидрофуран-пиридин-вода (5:3:2). После окончани  синтеза защитные группы удал ют последовательной обработкой тиофенол том триэтиламмони  и концентрированным аммиаком. При этом происходит отделение олигонуклеотида от носител . 5 -Диметокситритильную группу удал ют кислотной обработкой, и олигонук- леотид очищают электрофорезом в 20%- ном ПААГ, содержащем 7М мочевину. Выход 1-5 о.е.

Лигазную сшивку провод т следующим образом. Смесь 250 пмоль каждого из не- фосфорилированных олигонуклеотидов (I) и (X) и 200 пмоль каждого из фосфорилирован- ных олигонуклеотидов (II)-(V), (VIII) и (IX) нагревают 10 мин при 90°С в 100 мкл буфера, содержащего 20 мМ трис-HCI (рН 7,5) и 10 мМ MgCf2, затем медленно охлаждают до 15°С, прибавл ют гАТР до концентрации 0,2 мМ, дитиотреит до концентрации 5 мМ и 100 ед. Т4 ДНК-лигазы. Смесь инкубируют 6 ч при 15°С, затем депротеинизируют двукратной фенольной экстракцией фенолом. ДНК высаживают этанолом, продукты сшивки выдел ют при помощи электрофореза в 15%-ном ПААГ, содержащем 7 М мочевину. Нужный полинуклеотид выдел ют из гел  злектроэлюцией на DEAE-бумагу DE-81, которую промывают несколько раз ТЕ-буфе- ром (10 мМ трис-HCI, рН 8,0, 0,5 мМ ЕОТА) и этанолом. Нуклеотидный материал элюи- руют при помощи 1,5 М раствора NaCI в ТЕ-буфере и обессоливают на колонке с се- фадексом G-50. Выход сегмента А 180 пмоль. Аналогичным образом получают сегмент В. Выход 160 пмоль.

П р и м е р 2. Конструирование рекомби- нантной плазмидной ДНК p8FMD.

Клетки бактерий Е. coll HB101, содержащие плазмидную ДНК pTNF314A, выращивают при 37°С в LB-бульоне, содержащем 100 мкг/мл ампициллина, до стационарной фазы. Затем плазмидную ДНК выдел ют в соответствии с обычной процедурой с модификаци ми , заключающимис  в том, что к еупернатанту, полученному после подкисле- ни  ацетатом натри , прибавл ют РНКазу А до концентрации 10 мкг/мл, смесь инкубируют 20 мин при 37°С, экстрагируют дважды смесью фенол-хлороформ (1:1) и ДНК высаживают этанолом. Осадок раствор ют в ТЕ- буфере, содержащем 1 М NlaCI, прибавл ют полиэтилен гликоль PEG-6000 до концентрации 1,5%. выдерживают 1 ч при 0°С, центрифугируют 10 мин при 10000 об/мин, а осадок промывают 70%-ным этанолом, высушивают и раствор ют в ТЕ-буфере. Выход плазмидной ДНК определ ют спектрофото- метрически при 260 нм с использованием коэффициента экстинкции 20 о.е. / мг.

Раствор 2 мкг плазмиды pTNF314A в 30 мкл буфера R, содержащего 20 мМ трис-НС (рН 7,5), 50 мМ NaCI, 10 мМ MgCl2, 7 мМ меркаптоэтанол, инкубируют со смесью ре- стриктаз Hindlll и В gill (по 10 ед. каждой) в течение 1 ч при 37°С. После инкубации реакцию останавливают двукратной экстракцией смесью фенол-хлороформ (1:1) и векторный фрагмент очищают электрофоре- зом в 1 %-ном геле легкоплавкой агарозы, ДНК выдел ют методом замораживани /оттаивани  и высаживают 70%-ным этанолом. К раствору 0,2 мкг полученного таким образом вектора в 20 мкл буфера L, содержащего 20 мМ трис-HCI (рН 7,5), 10 мМ MgCIa, 0,2 мМ гАТР и 5 мМ дитиотреит, прибавл ют 0,1 мкг сегмента А и 20 ед, Т4 ДНК- лигазы. Смесь инкубируют 6 ч при 15°С, затем аликвоту (1 /4) реакционной смеси ис- пользуют дл  трансформации компетентных Е. coli. Трансформацию провод т следующим образом. Предварительно клетки Е. coli HB101 высевают на агар, содержащий среду М9, 0,2% глюкозы и 2 мкг/мл тиамина. Единичную колонию вно- с т в 50 мл .питательного бульона LB и выращивают при 37°С до мутности 0,3-0,5. Затем клетки охлаждают, осаждают центрифугированием (10 мин, 5000 об/мин), про- мывают раствором 10 мМ MgCte, центрифугируют, суспендируют в 20 мл 0,1 М раствора CaCl2 и выдерживают при 0°С в течение 30 мин. После центрифугировани  клетки ресуспендируют в 3 мл 0,1 М CaClz и через 3 ч используют дл  трансформации. С этой целью 5 мкл лигазной смеси смешивают с 50 мкл 0,05 М CaCl2, затем прибавл ют 150 мкл суспензии компетентных клеток, выдерживают при 0°С. затем 2 мин при 42°С и снова 10 мин при 0°С, после чего прибавл ют 2 мл LB-бульона, инкубируют 1 ч при 37°С и аликвоты высевают на чашки с LB- агаром, содержащим ампициллин (50 мкг/мл). Клоны бактерий, содержащие целе- вую плазмиду p8FMD, идентифицируют гибридизацией с одним из олигонуклеотидов P-VIII, вход щих в состав клонируемого сегмента А. Из гибридизующихс  с этой пробой клонов выдел ют плазмидную ДНК, строение которой подтверждают рестрикт- ным анализом с помощью рестриктаз НаеН и Mspl, Окончательно структуру рекомби- нантной плазмиды pSFMD подтверждают определением нуклеотидной последовательности плазмиды в области вставки синтетической ДНК,

Пример 3. Конструирование рекомби- нантной плазмидной ДНК plOFMD.

К раствору 10 мкг ДНК плазмиды pSFMD в 80 мкл буфера R прибавл ют 20 ед, каждой из рестрикционных нуклеаз Pstl и Kpnl и инкубируют 90 мин при 37°С. Анализ полноты гидролиза и выделение векторного Kpnl /Pstl - фрагмента (2.2 т.п.о.) провод т при помощи электрофореза в 1 %-ном геле легкоплавкой агарозы. Одновременно 10 мкг ДНК п азмиды pTNF314A в 100 мкл буфера R обрабатывают 1,5 ч при 37°С 20 ед. каждой из рестриктаз В gill и Kpnl, после чего фрагмент величиной около 1,6 т.п.о., содержащий синтетический ген антигенной детерминанты, выдел ют при помощи электрофореза в 1 %-ном геле легкоплавкой агарозы , как описано в примере 1. Далее этот фрагмент (0,2 мкг) соедин ют в присутствии 0,3 мкг сегмента В с векторной ДН К (1,5 мкг) при помощи 30 ед. Т4 ДНК лигазы в 50 мкл буфера L в течение 6 ч при 15°С. Дес тую часть реакционной смеси используют дл  трансформации компетентных клеток Е. coli НВ101, Трансформанты высевают на агари- зованную среду, содержащую ампициллин (50 мкг/мл). Скрининг бактериальных клонов , содержащих рекомбинантную плазмиду plOFMD, провод т гибридизацией колоний in situ с Р-меченным олигонукле- отидом (XIV). Из клонов, гибридизующихс  с радиоактивной пробой, выдел ют плазмидную ДНК plOFMD, строение которой подтверждают гидролизом рестриктазами Mspl и Haelll, а также определением нуклеотидной последовательности в районе вставки синтетического дуплекса.

П р и м е р 4. Получение штамма - продуцента иммуногенного полипептида, вызывающего образование антител, нейтрализующих штамм А22 вируса  щура.

Плазмидой plOFMD трансформируют компетентные клетки Е. coli SG20050 по методу , описанному в примере 1, и получают штамм Е. coli ВКПМ В-5297 - продуцент иммуногенного полйпептида, вызывающего образование антител, нейтрализующих штамм А22 вируса  щура.

П р и м е р 5. Изучение иммуногенных свойств рекомбинантного полипептида Р204 (биологические испытани ).

Дл  иммунизации лабораторных животных выделенный из биомассы штамма - продуцента рекомбинантный белок Р204 при определенной концентрации смешивают в равном объемном соотношении с неполным адъювантом Фрейнда. Группе морских свинок или кроликов массой соответственно 0.5 или 2,0 кг ввод т вакцинирующий раствор однократно или двукратно в объеме 1,0 мл в дозе 150-200 мкг. Вторую иммунизацию провод т через 38-42 дн  после первой. Вируснейтрализующие антите- ла определ ют на 47-60 день после первой иммунизации на культуре клеток свиной почки против 100 ТЦДбо вируса  щура подтипа А22.

На 47-55 день после первой иммуниза- ции морских свинок заражают введением 500 ИДго вируса  щура Ааг, адаптированного к организму морских свинок, и определ ют протективный эффект.

Данные титровани  вируснейтрализую- щих антител и протективный эффект, исследованные на кроликах и морских свинках, приведены в табл. 1 и 2 соответственно.

Таким образом, рекомбинантный белок Р204, выделенный из биомассы штамма - продуцента ВКПМ В-5296, обладает защитным действием против вируса  щура подти- па А22 и индуцирует высокий уровень вируснейтрализующих антител у кроликов и морских свинок.

Формул а изо бретени  

, Рекомбинантна  плазмидна  ДНК plOFMD, кодирующа  гибридный белок

P204-ASpProCysСуs-VP 1(200-213) ProProSerPro(131-160), мол.м. 2,49 Мд и размером 3,81 т.п.о., содержаща  Sau3A1- Hindlll - фрагмент ДНК-плаэмиды pTNF314A с тандемом промоторов А2 и A3 ранней области бактериофага Т7, полусинтетическим геном фактора некроза опухолей человека и искусственным участком инициации трансл ции, терминатором транскрипции фага л мбда и геном /3-лакта- мазы размером 3,66 т.п.о.; Hindlll-Sau3A1 - фрагмент с синтетическим геном, кодирующим пептиды антигенных детерминант вируса  щура штамм А22. генетический маркер - ген /3-лактамаэы, детерминирующий устойчивость к пенициллиновым антибиотикам; уникальные сайты узнавани  рестрикционными эндонуклеазами, расположенные на следующих рассто ни х вправо от сайта BstElhBamHI - 73 нуклеотида, Bgll) - 154 нуклеотида, Xhol - 174 нуклеотида . HlndlJI - 241 нуклеотид, Nco1 - 574 нуклеотида , Pst1 - 2418 нуклеотидов.

2. Штамм бактерий Escherlchia coli В КПМВ-5297- продуцент гибридного белка P204-AspProCysCys-VP1 (200-213) ProProSerPro-VP1 (131-160).

Таблица 1

Таблица 2

bspVroAsnGlyTlirGlyLysTyrSerAlaGlyGlyMetGlyArgArgGlyAsp

1 n ZI1 n iv

GATCCTAACGGTACCGGTAMTACTCTGCTGGTGGTATGGGCCGTAGAGGAGAT- GATTGGCATGGCCATTTATGAGACGACCACCATACCCGGCATCTCCTCTAiiU

I uGluProLeuAlaAloArgValAlaAlaGlnLeij oThrTER

n -VI11 n IX

CTAGAACCTCTGGCTGCTCGAGTTGCTGCTCAGCTTCCGACTTA GATCTTGGAGACCGACGAGCTCAACGACGAGTCGAAGGCTGAATTCGA

x СЕГМЕНТ А

bspProCysCy islysGlnLysI I ell e AI aProAlaLya

n

GATCCTTGTTGTAGACAGAAACAGAAAATCATTGCACCTGCAAAA- GAAGAACATCTCTGTTTGTCTTTTAGTAACGTGGACGTTTTxiiU

GlnLeuLeuProProSerProAsnGlyThr

XIII

CAACTTTTGCCTCCTTCTC.CTAACGGTAC GTTGAAAACGGAGGAAGAGGATTGC

vix СЕГМЕНТ В

Claims (2)

1. Ф о р м у л а и з о б р е т е н и я ! Рекомбинантная плазмидная ДНК p10FMD, кодирующая гибридный белок

   P204-ASpProCysСуs-VP 1(200-213) ProProSerPro(131-160). мол.м. 2.49 Мд и размером 3,81 т.п.о., содержащая Sau3A1Hlndlll - фрагмент ДНК-плазмиды 5 pTNF314A с тандемом промоторов А2 и АЗ ранней области бактериофага Т7, полусинтетическим геном фактора некроза опухолей человека и искусственным участком инициации трансляции, терминатором 10 транскрипции фага лямбда и геном ^-лактамазы размером 3,66 т.п.о.: Hlndlll-Sau3A1 фрагмент с синтетическим геном, кодирующим пептиды антигенных детерминант вируса ящура штамм А₂₂; генетический маркер 15 - ген Д-лактамаэы, детерминирующий устойчивость к пенициллиновым антибиотикам; уникальные сайты узнавания рестрикционными эндонуклеазами, расположенные на следующих расстояниях вправо 20 от сайта BstEII:BamH1 - 73 нуклеотида.

   Bglll - 154 нуклеотида, Xhol - 174 нуклеотида. Н Indi Л - 241 нуклеотид, Nco1 - 574 нуклеотида, Pst1 - 2418 нуклеотидов.
2. 2. Штамм бактерий Escherichia coll ВКПМ В-5297 - продуцент гибридного белка P204-AspProCysCys-VP 1 (200-2 1 3)

   ProProSerPro-VP1 (131-160).

   Таблица 1

   Г руппа животных Количество животных Доза, мкг Кратность введения Интервал введения, дни Средний титр ВНА Зодг) 1 4 150 1 - 5,2 2 4 150 2 42 6,6

   Таблица 2

   Группа животных Количество животных Доза, мкг Кратность введения Интервал введения, ДНИ Количество защищенных животных % защиты Средний титр ВНА Зод₂) 1 6 250 1 - 4 67 3,28 2 6 250 2 38 6 100 4,86

   AspPro AsnG 1 у ThrG lyLy s TyrSerA laGlyGl. у Me tGl yArgArgG I у Asp

   GATCCTAACGGTACCGGTAAA.TACTCTGCTG(9?GGTATGGGCCGTAilGGAGATGATTGCCATGGCCATTTATGAGACGACCACCATACCCGGCATCTCCTCTAn U _v

   I^uGluProLeuA '1 aAlaArgValAlaAlaGlriLeiLProThrTER

   '.VIII IX

   CTAGAACCTGTGGCTGCTCGAGTTGCTGCTCAGCTTCCGACTTA

   GATCTTGGAGACCGACGAGCTCAACGACGAGTCGAAGGCTGAATTCGA u

   СЕГМЕНТ A kspProCysCysArgHisLysGlnLysII elleAlaProAlaLys

   GATCCTTGTTGTAGACAGAAACAGAAAATcH'TGCACCTGGAAAAGAAGAACATCTCTGTTTGTCTTTTAGTAACGTGGACGTTTTXII

   GlnLeuLeuProProSerProAsnGlyThr

   XIII

   CAACTTTTGCCTCCTTCTCCTAACGGTAC

   GTTGAAAACGGAGGAAGAGGATTGC vix

   СЕГМЕНТ В