JP2694840B2 - ポリペプチドを微生物により発現させる方法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】本発明は、細菌宿主の形質転換に適したプ
ラスミッドを包含する、哺乳動物ホルモン、例えばソマ
トスタチン(somatostatin)およびその他のポリペプチド
の発現を暗号化(コード)しているヘテロローガス(heter
ologous)ＤＮＡを含有している組換え型微生物クローニ
ングビーイクルを用いてポリペプチドを生産する方法に
関する(このプラスミッドは、形質転換されていない状
態における宿主にとってホモローガス(homologous)な制
御領域を含んでおり、その解読相内にヘテロローガスＤ
ＮＡの構造遺伝子を含んでいる)。

【０００２】本発明はまた、(a)ポリペプチドハプテン
および発現された生成物に免疫原性を付与するに十分な
大きさの付加的タンパク質からなるタンパク質(これは
分析のために該ハプテンに対する抗体を産生させたり、
ワクチン類を製造するのに使用し得る)、および(b)所望
の生成物を開裂することができる該所望のポリペプチド
生成物と付加的タンパク質からなるタンパク質などの、
微生物による発現を暗号化しているクローニングビーイ
クルを用いてタンパク質を生産する方法に関する。

【０００３】本発明はさらに、微生物クローニングシス
テムでの哺乳動物ポリペプチド類の発現を暗号化してい
る合成構造遺伝子を調製する方法を提供する。

【０００４】遺伝情報は、ＤＮＡの暗号鎖がその繰返し
のヌクレオチド成分の特徴的な塩基をあらわす配列順序
によって、二本鎖デオキシリボ核酸に暗号化されてい
る。ポリペプチドを産生するための暗号化された情報の
「発現」は、２段階の過程からなる。即ち、遺伝子中の調
節領域である「制御領域」の命令によって、ＲＮＡポリメ
ラーゼが暗号鎖に沿って移動しメッセンジャーＲＮＡ
(リボ核酸)が産生される。この過程を転写という。続く
「翻訳」過程において、転移ＲＮＡと結合している細胞リ
ボソームがメッセンジャーＲＮＡ(mＲＮＡ)のメッセー
ジをポリペプチドに変換する。mＲＮＡがＤＮＡから転
写した情報には、該ポリペプチドを構成するアミノ酸の
同定と配列のための信号と共に、リボソーム翻訳の開始
および終止のための信号が含まれている。ＤＮＡ暗号鎖
は、ヌクレオチドの特徴的な塩基が特定の情報ビットを
暗号づけるので「コドン」と称せられるヌクレオチド三連
子の長い連鎖からなっている。例えば、ＡＴＧ(アデニ
ン−チミン−グアニン)と読まれる３個のヌクレオチド
は、mＲＭＡには「翻訳はじめ」のシグナルとして解読さ
れ、終止コドンであるＴＡＧ、ＴＡＡおよびＴＧＡは
「翻訳止め」と解読される。この開始コドンおよび終止コ
ドンの間には、いわゆる構造遺伝子が存在し、このコド
ンは最終的に翻訳されるアミノ酸配列を決定する。この
決定は、既によく解明されている「遺伝暗号」に従って行
なわれる。これについては例えば、種々のアミノ酸に対
するコドンを記載したＪ．Ｄ．Ｗatson のＭolecular
Ｂiology ofthe Ｇene(Ｗ．Ａ．Ｂenjamin Ｉnc.,
Ｎ．Ｙ., ３rd ed．１９７６)参照。この遺伝暗号は、
異なったコドンが同じアミノ酸を産生するという意味で
は「縮退」であるが、個々のアミノ酸に対しては１個また
はそれ以上のコドンが存在し、それだけであるという意
味において正確である。従って、例えば、ＴＴＴ、ＴＴ
Ｃ、ＴＴＡおよびＴＴＧなどのコドンは全て、そのよう
に読まれる時はセリンを指定し、それ以外のアミノ酸を
指定しない。転写の際には、適切な解読相、即ち、読み
取り枠が保持されなければならない。このことは、例え
ば・・・・・・ ＧＣＴＧＧＴＴＧＴＡＡＧ・・・ という配列において、ＲＮＡポリメラーゼによる転写物
が、コドン(下線部分)の始まりを異なった塩基から読み
はじめられた場合(下式)を考えれば理解できる。・・・・・・ GCT GGT TGT AAG・・・→ Ala-Gly-Cys-Lys・・・・・・ GCTG GTT GTA AG・・・→ Leu-Val-Val・・・・・・ GC TGG TTG TAA G・・・→ Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−（ｓ
ｔｏｐ）

【０００５】このように、最終的に製造されるポリペプ
チドは、構造遺伝子と制御領域との空間的関係に重大な
影響を受ける。

【０００６】遺伝的発現の過程を、より良く理解させる
ために、遺伝子の成分について以下に定義する。オペロン ポリペプチド発現のための構造遺伝子および
この発現を調節するための調節領域、即ち「制御領域」
からなる遺伝子。プロモーター 転写を開始するために、ＲＮＡポリメラ
ーゼが結合しなければならない上記制御領域内にある遺
伝子。オペレーター レプレッサータンパク質が結合すること
ができる遺伝子であり、この結合により、ＲＮＡポリメ
ラーゼがこのオペレーターに隣接するプロモーターと結
合するのが阻害される。誘発物質 レプレッサータンパク質を不活性化する物質
であって、これによってオペレーターが遊離されるので
ＲＮＡポリメラーゼはプロモーターに結合することがで
き、転写が開始される。異化代謝産物活性化タンパク質(ＣＡＰ)結合部位 ＣＡ
Ｐの仲介により、環状アデノシンモノ燐酸(c−ＡＭＰ)
と結合する遺伝子であって、これもまた、通常は、転写
の開始に必要である。このＣＡＰ結合部位は、特殊な場
合には不要である。例えば、ファージλplac ＵＶ５の
ラクトースオペロン(lac−オペロンと略す)にプロモー
ター突然変異が起こると、発現のためにc−ＡＭＰおよ
びＣＡＰを必要としなくなる(Ｊ．Ｂeckwith etal,
Ｊ．Ｍol．Ｂiol．６９, ＩＳＳ−１６０(１９７２))。プロモーターオペレーターシステム ここでは、ＣＡＰ
結合部位を含むかどうかに関係なく、また、レプレッサ
ータンパク質の発現を暗号づけする能力を有するかどう
かにも関係なく、遺伝子操作することのできるオペロン
の調節領域をいう。

【０００７】さらに、後記の組み換え型ＤＮＡについて
の議論に必要な用語についても以下に定義する。クローニングビーイクル 形質転換と呼ばれる過程によ
り単細胞生物「マイクローブ」に入れられた場合、複製
可能な無傷のレプリコンを含有する非染色体性二本鎖Ｄ
ＮＡ。このようにして形質転換された生物を転換体(tra
nsformant)という。プラスミッド 本発明においては、ウイルスまたはバク
テリア由来のクローニングビーイクルであって、バクテ
リアの場合はバクテリア(細菌)プラスミッドという。相補性 一本鎖ＤＮＡの塩基配列が持っている特性であ
って、それぞれの鎖上の相補的塩基間の水素結合によっ
て二本鎖ＤＮＡが形成されることを可能にしている性
質。アデニン(Ａ)はチミン(Ｔ)と相補性があり、グアニ
ン(Ｇ)はシトシン(Ｃ)と相補性がある。

【０００８】生化学の最近の進歩により、例えばプラス
ミッドに外来性(exogenous)ＤＮＡを含ませた「組み換え
型」クローニングビーイクルを組み立てる(構築する)こ
とが可能となった。特殊な場合には、この組み換え体は
ヘテロローガスＤＮＡを含んでいてもよい。ヘテロロー
ガスＤＮＡとは、組み換え型ビーイクルによって形質転
換される生物によって通常は産生されないポリペプチド
を暗号化しているＤＮＡを意味する。例えば結合し得る
末端を有する直線(線状)ＤＮＡを得るためにプラスミッ
ドを開裂する。これを結合可能な末端を有する外来性遺
伝子と結合させ、そのままのレプリコンと所望の表現型
特性をもった、一つの生物学的機能部分を得る。この組
換え型部分を微生物に挿入して形質転換し、この転換体
を単離し、クローンし、新しい遺伝情報を発現すること
のできる大きな集団を得る。組換え型クローニングビー
イクルを形成させ、これで微生物を形質転換する方法や
手段は多くの文献に記載されている。

【０００９】本明細書で言及する文献などを参考までに
以下に列挙する。Ｈ.Ｌ.Ｈeynecker et al, Ｎature ２
６３, ７４８−７５２(１９７６); Ｃohenet al, Ｐro
c．Ｎat.Ａcad.Ｓci.ＵＳＡ ６９, ２１１０(１９７
２); 同７０１２９３(１９７３); 同７０, ３２４０(１
９７３); 同７１ １０３０(１９７４); Ｍorrow et a
l, Ｐroc.Ｎat.Ａcad.Ｓci.ＵＳＡ ７１, １７４３、
(１９７４); Ｎovick, Ｂacteriological Ｒev．３３,
２１０(１９６９); Ｈershfield et al, Ｐroc．Ｓoc．
Ｎat'l．Ａcad．Ｓci．ＵＳＡ ７１, ３４５５(１９７
４)およびＪackon et al, 同, ６９, ２９０４(１９７
２)。

【００１０】ＤＮＡの組み換えには、分離したＤＮＡフ
ラグメントの隣接末端を何らかの方法で修理し、結合さ
せやすくするための種々の方法を利用することができ
る。この結合(ligation)とは、隣接するヌクレオチド間
に燐酸ジエステル結合を形成させることを言い、最も普
通には酵素Ｔ₄ ＤＮＡリガーゼ(合成酵素)によって結合
する。このようにして、平滑末端(blunt end)も直接結
合させることができる。あるいはまた、それらの隣接末
端に相補的一本鎖を含有するフラグメントを有する場
合、それぞれの末端をその後の結合のために位置づける
水素結合によって、結合は有利に行なわれる。粘着末端
(または相補末端)と呼ばれるこのような一本鎖は、末端
転移酵素を用いて平滑末端にヌクレオチドを付加するこ
とによって形成してもよく、場合により平滑末端の一方
の鎖をλ−エクソヌクレアーゼの如き酵素を用いて単に
破壊することによって形成してもよい。また、むしろ最
も普通には、長さが約４ないし６の塩基ペアの特定のヌ
クレオチド配列の内部および周囲の燐酸ジエステル結合
を解裂する制限エンドヌクレアーゼ(restriction endon
ucleases)によってもよい。多くの制限エンドヌクレアー
ゼおよびそれらの認識部位が知られており、いわゆるＥ
co ＲＩエンドヌクレアーゼが最も広く使用されてい
る。二本鎖ＤＮＡを、回転対象の回文「回帰点」(palindr
omes)で開裂させる制限エンドヌクレアーゼは、粘着末
端を残す。従って、プラスミッドまたは他のクローニン
グビーイクルを開裂してそれぞれが半分の制限エンドヌ
クレアーゼ認識部位からなる末端を残すようにすること
ができる。同じ制限エンドヌクレアーゼによって得た外
来性ＤＮＡの開裂生成物は、そのプラスミッド末端のそ
れらと相補性の末端を有することになろう。あるいはま
た、後記するように、粘着末端を有する合成ＤＮＡを、
この開裂したビーイクルに挿入することができる。外来
性ＤＮＡを挿入するまで、ビーイクルの粘着末端が再結
合するのを阻止するために、この末端をアルカリ性ホス
ファターゼで消化(digest)してもよく、この結果、外来
性フラグメントの混入を終結させるための分子選択が行
なわれる。ビーイクルの他の方向に関して適切な方向性
を有するフラグメントの挿入は、このフラグメントが、
２個の異なった制限エンドヌクレアーゼによって除去さ
れたビーイクルＤＮＡにとってかわり、それ自身が、そ
れぞれ、その異なったエンドヌクレアーゼの認識配列の
半分を構成している末端からなる場合には増強され得
る。

【００１１】組換え型ＤＮＡに関して、最近、広範囲に
研究されているが、直ちに、そして実際に応用し得る成
果はほとんど得られていない。このことは常套の手段に
よって、ヌクレオチドを１つづつ組み立てたものであ
れ、単離したm−ＲＮＡから逆転写によって得たもの(相
補的、cＤＮＡ)であれ、「合成ＤＮＡ」によって暗号化さ
れたポリペプチドなどを発現する試みに失敗していると
いう点において特にそうである。

【００１２】本明細書では、合成遺伝子からの、機能を
有するポリペプチド生成物の最初の発現の例であると思
われるものについて、および広範囲の応用を約束する関
連の新事実について記載する。この生成物とは、生長ホ
ルモン分泌阻害剤であるソマトスタチン(Ｇuillemin
Ｕ.Ｓ.Ｐ.３,９０４,５９４)、インシュリンおよびグル
カゴンであり、その成果は先端疼痛、先端巨大症、急性
膵炎およびインシュリン依存糖尿病の治療への応用を示
唆している(Ｒ.Ｇuillemin et al, Ａnnual Ｒev.Ｍe
d．２７３７９(１９７６)参照)。

【００１３】添付の図面および以下に詳述する記載から
明らかなように、ここに述べるソマトスタチンモデル
は、ここに記載された新事実が多くの有益な面に応用さ
れ得ることを示している。

【００１４】図面についての説明 添付の図面は、本発明の好ましい実施形式、即ち、組換
え型プラスミッドを含有するバクテリア形質転換体によ
る、ソマトスタチンホルモンおよびヒトインシュリンの
発現に利用される１つの脈絡を例示したものである。

【００１５】図１ 方法の概要模式図。化学的なＤＮＡ
合成によって調製したソマトスタチンのための遺伝子
を、プラスミッドpＢＲ３２２上の大腸菌(Ｅ．coli)β
−ガラクトシダーゼ遺伝子と融合させる。大腸菌への形
質転換の後、この組換え型プラスミッドは、インビトロ
において臭化シアンによりメチオニン残基を選択的に開
裂することができ、かくして活性な哺乳動物のポリペプ
チドホルモンを生成させることができるタンパク質前駆
体の合成を指示する。Ａ、Ｔ、ＣおよびＧは、ソマトス
タチン遺伝子の暗号鎖中のデオキシリボヌクレオチドの
特有の塩基を表わす(それぞれＡはアデニン、Ｔはチミ
ン、Ｃはシトシン、Ｇはグアニンを表わす)。

【００１６】図２ 構造遺伝子の模式的構造。その暗号
鎖(即ち上方の鎖)は、ソマトスタチンのアミノ酸配列の
ためのコドンからなる(図に示されている)。

【００１７】図３ 構造遺伝子を組み立てるのに使用す
るヌクレオチドトリマーの好ましい調製方法を模式的に
示したもの。図３において、ヌクレオチドを描写するの
に通常の表示法を用い、下記に示すように５'ＯＨは左
側に、３'ＯＨは右側に描いた。

【化１】

【００１８】図４ 親プラスミッドとしてpＢＲ３２２
を用い、ソマトスタチン(図中ＳＯＭで表わす)含有タン
パク質を発現し得る組換え型プラスミッド(例えばpＳＯ
Ｍ１１−３)を調製するためのフローチャート。図４に
おいて、各プラスミッドの近似的分子量をダルトン(d)
で表わした。Ａp^r およびＴc^r はそれぞれアンピシリン
およびテトラサイクリン耐性のための遺伝子を表わし、
Ｔc^s は、Ｔc^r 遺伝子の一部分を切り取ったことに由来
するテトラサイクリン感受性を表わす。プラスミッド上
の開裂部位に特異的な種々の制限エンドヌクレアーゼの
相対的な位置を図に示した(例えば、Ｅco ＲＩ、ＢamＨ
Ｉなど)。

【００１９】図５ＡおよびＢ ２個のプラスミッドの主
要な箇所のヌクレオチド配列を示した。また、メッセン
ジャーＲＮＡ(mＲＮＡ)転写の方向も示してある。この
転写は必ず暗号鎖の５'末端から開始される。制限エン
ドヌクレアーゼ基質部位も示されている。描写してある
配列は、それぞれlac(ラクトース)−オペロンの調節要
素およびソマトスタチンのアミノ酸配列(イタリック)を
発現するためのコドンの両者を含有している。β−ガラ
クトシダーゼ(以降、β−galという)のためのアミノ酸
配列番号は角括弧に示してある。

【００２０】図６〜図８ 後述する実験の部で詳細に記
載するが、これらの図は、放射免疫分析の比較実験の結
果を示しており、組換え型プラスミッドによって発現さ
れた生成物のソマトスタチン活性を示している。

【００２１】図９ その暗号鎖がヒトインシュリンのＡ
鎖およびＢ鎖のアミノ酸配列のためのコドンからなる合
成遺伝子の模式構造。

【００２２】図１０ ヒトインシュリンのＢ鎖を発現す
ることのできる組換え型プラスミッドを組み立てるため
のフローチャート。

【００２３】詳細な説明 １．異種ポリペプチドを暗号化している遺伝子の調製 アミノ酸配列が知られているポリペプチドを暗号化して
いるＤＮＡは、「遺伝暗号」に従ってコドンを選択するこ
とによって調製することができる。精製などを容易にす
るために、例えば約１１ないし約１６個のヌクレオチド
からなるオリゴデオキシリボヌクレオチドフラグメント
を別々に調製し、次いでこれらを所望の配列に組み立て
る。即ち、好都合な大きさの第１組および第２組のオリ
ゴデオキシリボヌクレオチドフラグメントを調製する。
この第１組は、適切な配列で結合させると、ポリペプチ
ド発現のためのＤＮＡ暗号鎖となる(例えば図２のフラ
グメントＡ、Ｂ、ＣおよびＤ参照)。第２組は、同様に適
切な順序で結合させると、暗号鎖と相補性のある鎖とな
る(例えば図２のフラグメントＥ、Ｆ、ＧおよびＨ参
照)。それぞれの鎖のフラグメントは、相補性によっ
て、フラグメントブロックの粘着末端(相補末端)が水素
結合することにより、自動的に集合するように、好都合
に重なり合う。集合に続いて、通常の方法で結紮(結
合、ligation)することにより、この構造遺伝子が完成
する。

【００２４】あるアミノ酸配列に対するコドンの選択に
際しては、遺伝暗号の縮退によって、かなりの自由度が
許される。しかし、本発明の目的に沿うには、コドンの
選択は以下の３つの条件に従って決定するのが好都合で
あった。先ず第１は、所望の遺伝子中で互いに隣接する
フラグメントを除いては、フラグメントどうしの不適当
な相補性を避けるようにコドンおよびフラグメントを選
択し、フラグメント集合を行なった。第２は、転写が早
まって終結しないように、ＡＴ塩基ペアに富む(例えば
約５またはそれ以上)配列を避けることであり、ＧＣ塩
基ペアに富んだ配列が先に存在する場合には特にそうで
ある。第３は、少なくとも選ばれた大部分のコドンが、
微生物ゲノムの発現に好ましいものであること(例えば
Ｗ.Ｆiers,et al, Ｎature ２６０ ５００(１９７
６)参照)である。本発明において、微生物ゲノムを発現
するのに好適なコドンを以下に定義する。

【００２５】

【表１】好ましいコドンの指定 第１文字(5'末端) 第２文字(十文字に交差して読む) 第３文字(3'末端) (下へ読む) Ｔ Ｃ Ａ Ｇ (下へ読む) phe − − cys Ｔ Ｔ phe ser tyr − Ｃ leu − 終止 終止 Ａ − ser 終止 trp Ｇ leu pro his arg Ｔ Ｃ leu pro his arg Ｃ leu pro gln − Ａ − pro gln − Ｇ ile thr asn − Ｔ Ａ ile thr asn ser Ｃ − − − − Ａ met(開始) thr lys − Ｇ val ala asp gly Ｔ Ｇ val − asp − Ｃ val − glu − Ａ val ala glu − Ｇ

【００２６】ソマトスタチンの場合の最も好ましいアミ
ノ酸（コドン）と構造遺伝子の関係は以下の通りであ
る。gly(ＧＧＴ)、cys(ＴＧＴ)、lys(ＡＡＧ)、trp(Ｔ
ＧＧ)、ala(ＧＣＴ、ＧＣＧ)、asn(ＡＡＴ、ＡＡＣ)、p
he(ＴＴＣ、ＴＴＴ)、thr(ＡＣＴ、ＡＣＧ)、ser(ＴＣ
Ｃ、ＴＣＧ)

【００２７】所望のポリペプチドの構造遺伝子を、その
まま、発現のためにクローニングビーイクルに挿入する
場合、この遺伝子の前には開始コドン(例えばＡＴＧ)を
置き、直後に１またはそれ以上の終結、即ち終止コドン
を置く(図２参照)。

【００２８】そのまま発現するに適した構造遺伝子とし
ては、リー・シー（Ｌi,Ｃ.）のプロシーディングス・
オブ・ナショナル・アカデミー・サイエンス（Ｐroc.Ｎ
atl.Acad.Ｓci.）７３巻、１４７６〜１４７９、１９７
６年に開示されているヒト成長ホルモンの成熟アミノ酸
配列に基づいて、本発明と同様にして合成し得るＤＮ
Ａ、またはヒグチらのプロシーディングス・オブ・ナシ
ョナル・アカデミー・サイエンス、ＵＳＡ、７３巻、３
１４６〜３１５０、１９７６年に開示されている、ウサ
ギベータ−グロブリンを暗号化している遺伝子、などが
あげられる。しかし、後述するように、特定のポリペプ
チドのアミノ酸配列は、先行する、そして／または後続
する付加的なタンパク質と共に発現してもよい。

【００２９】本明細書においては、開始および終止コド
ンを伴った所望のポリペプチドの構造遺伝子を「ヘテロ
ローガスポリペプチドのアミノ酸配列を暗号化している
ＤＮＡ」と呼称し、該ＤＮＡのみによる発現産物を「所
望のヘテロローガスポリペプチド自体」、ホモローガス
遺伝子またはその断片が付加した該ＤＮＡの発現産物を
「前駆体ポリペプチド」という。この前駆体ポリペプチ
ドに於いて、そのポリペプチドの使用目的からして、付
加的タンパク質を切断する必要がある場合には、隣接し
たポリペプチド一付加的タンパク質コドンの接合点に適
当な開裂部位を暗号づける。即ち、例えば図１において
は、発現産物はソマトスタチンおよびβ−ガラクトシダ
ーゼポリペプチドの大部分の両者からなるタンパク質前
駆体である。この場合、翻訳を開始するためにＡＴＧを
暗号化する必要はない。何故なら、リボソームによる付
加的なβ-galタンパク質の解読が、ソマトスタチン構造
遺伝子にまで通読されていくからである。しかし、臭化
シアンによって特異的に開裂されるアミノ酸であるメチ
オニンを調製する暗号を与えるＡＴＧ信号を挿入する
と、タンパク質前駆体を所望のポリペプチドに簡単に変
換することができるようになる。

【００３０】図２はまた、組換えに使用する異種ＤＮＡ
にとって好ましいもう１つの特徴、即ち、好都合に、制
限エンドヌクレアーゼ認識部位の二本鎖の片方からなる
粘着末端が存在していることを示している。既述した理
由により、この両末端は、組換えに際してそれぞれ異な
った認識部位を形成するようにデザインするのが好まし
い。

【００３１】ここに述べる新事実はソマトスタチンモデ
ルを用いて好適に例示されるが、実際にアミノ酸配列が
既知であれば、どのようなものであっても、それに対す
るヘテロローガスＤＮＡ暗号を、必要な変更を加えて、
使用することができることは容易に理解されるはずであ
る。例えば、既に記述した、および以下に記載する技術
は、必要な変更を加えることによって、ポリロイシンお
よびポリアラニンの如きポリ(アミノ)酸類、酵素類、血
清タンパク質、痛みの閾値をかえるβ−エンドルフイン
(β−endorphins)の如き鎮痛性ポリペプチドなどの製造
に利用することができる。最も好ましくは、このように
して製造されるポリペプチド類は哺乳動物のホルモン類
またはその中間体であろう。このようなホルモン類とし
ては、例えばソマトスタチン、ヒトインシュリン、ヒト
および牛の成長ホルモン、間質細胞刺激ホルモン、ＡＣ
ＴＨ、膵臓ポリペプチドなどが含まれる。中間体として
は、例えばヒトプレプロインシュリン、ヒトプロインシ
ュリン、ヒトインシュリンのＡ鎖およびＢ鎖などであ
る。異種ＤＮＡとしては、インビトロで調製されるＤＮ
Ａの外に、mＲＮＡからの逆転写によって得られるcＤＮ
Ａも包含されてよい(例えばＵllrich et al．Ｓcience
１９６ １３１３(１９７７)参照)。

【００３２】２．タンパク質前駆体の発現を暗号化して
る組換え体 図１において模式的に描かれた過程では、発現によっ
て、特異なヘテロローガス構造遺伝子によって暗号づけ
られたポリペプチド(ソマトスタチン)と、付加的なタン
パク質(β−ガラクトシダーゼ酵素のタンパク質からな
る)の両者からなるタンパク質前駆体が産生される。次
いでソマトスタチンアミノ酸配列に隣接する選択的な開
裂部位によって、所望のポリペプチドを不必要(余分)な
タンパク質から分離することができる。例示したケース
は、ここに記載する技術によって使用することのできる
種々の方法の代表的なものである。

【００３３】大抵の場合、開裂はプラスミッドまたは他
のビーイクルの複製環境の外で、例えば微生物培養体の
収穫の後で行なう。このようにすれば、小さなポリペプ
チドと不要なタンパク質との一時的な接合により、例え
ばインビボにおいて固有の酵素によってこの小さなポリ
ペプチドが、分解されるのを防ぐことができる。同時
に、この付加的なタンパク質は通常、細胞外で開裂する
までこの所望のポリペプチドの生物活性を失効させるの
で、操作中の生物学的安全性を増す効果がある。勿論、
特殊な場合には細胞内で開裂させるのが望ましい場合も
ある。例えば、前駆体の発現を暗号化しているＤＮＡと
直列的に処理して、インシュリン前駆体を活性形にかえ
る酵素を暗号づけしたＤＮＡをクローニングビーイクル
に付与することもできる。

【００３４】好ましいのは、目的とする特定のポリペプ
チドが、不要のタンパク質を脱離するのに用いる開裂部
位に相当する開裂部位を分子内に含有していないことで
ある(勿論、この条件が満たされていなくても、競合反
応によって、低収率であるとはいえ、その所望の生成物
が得られることは理解されるであろう)。目的生成物が
メチオニンを含んでいない場合、所望の配列に隣接する
メチオニンのところで臭化シアンを用いて開裂するのが
非常に効果的であるということがわかった。同様に、生
成物がアルギニンおよびリシンを含まない場合は、例え
ばトリプシンまたはキモトリプシンを用い、所望の配列
に隣接するarg−arg、lys−lysなどの開裂部位を酵素的
に開裂させることができる。開裂によって、例えば不要
のアルギニンが付着した目的生成物が得られた場合に
は、このアルギニンはカルボキシペプチダーゼによる消
化によって除去することができる。arg−argを開裂する
のにトリプシンを用いる場合は、目的とするポリペプチ
ド中のリシン部位は、無水マレイン酸または無水シトラ
コン酸などによって、あらかじめ保護することができ
る。例示的にここに述べた開裂技術は多くの変法の代表
的なものに過ぎないことは、本明細書に照らして当業者
には容易に理解されるであろう。

【００３５】開裂され得るタンパク質は、特定のポリペ
プチドのＣ−末端またはＮ−末端のいずれかに隣接して
発現されてもよく、あるいは、プロインシュリンとイン
シュリンを区別する封入配列(included sequence)の場
合のように、ポリペプチド自身の内部に発現されてもよ
い。また、使用するビーイクルは、目的とするポリペプ
チドの繰り返しの配列からなり、それぞれのペプチドが
特異な開裂部位で隔てられているようなタンパク質を発
現するように暗号づけされていてもよい。しかし、図に
例示した場合のように、目的生成物の構造遺伝子の前
に、不要のタンパク質のためのコドンが翻訳されるのが
最も好ましい。いずれの場合においても、制御領域に対
して適切な解読枠(解読相)を維持するように注意しなけ
ればならない。

【００３６】３．免疫原性物質(lmmunogens)の発現 特定のポリペプチドおよび不要のタンパク質の両者を発
現し得るということは、免疫原性物質を調製する有力な
手段となり得る。ポリペプチド「ハプテン」(付着体、即
ち、抗体などと特異的に結合する決定子を持っている
が、通常は免疫反応を示すには小さ過ぎる物質)は、免
疫原性能を付与するに十分な大きさの付加的タンパク質
との接合体として発現することができる。事実、一例と
してここで調製したβ−gal−ソマトスタチン接合体は
免疫原性能を有する大きさであり、ソマトスタチンハプ
テンと結合する抗体を産生するものと期待し得る。１０
０個以上のアミノ酸、最も普通には２００個以上のアミ
ノ酸からなるタンパク質は免疫原性能を有する。

【００３７】前記した方法で調製された接合体は、ハプ
テンの放射免疫分析(radioimmune assay)または他の分
析に、あるいはまたワクチンの製造に有用な抗体を産生
する。以下に後者の応用例について述べる。臭化シアン
またはウイルスの外殻タンパク質の他の開裂物質によ
り、そのタンパク質自体に対して産生された抗体に結合
するオリゴペプチドが産生する。このようなオリゴペプ
チドハプテンのアミノ酸配列がわかれば、そのためのヘ
テロローガスＤＮＡを免疫原性能を付与する付加的タン
パク質との接合体として発現させることができる。この
ような接合体をワクチンとして使用すれば、免疫をつけ
るために外殻タンパク質自体を使用する場合に併発する
副作用を減少することができると期待される。

【００３８】４．調節要素 図１は、形質転換生物が、その形質転換されていない状
態の生物にとってホモローガスな制御領域のコントロー
ル下で、挿入されたヘテロローガスＤＮＡからポリペプ
チド生成物を発現する過程を表わしている。即ち、ラク
トース依存性大腸菌の染色体ＤＮＡは、なかんずく、酵
素β−ガラクトシダーゼをつくり上げることにより、ラ
クトース消化を行なうラクトースオペロン、即ち、lac
−オペロンを含んでいる。例示したこの例では、このla
c−調節要素は、大腸菌に感染するバクテリオファージ
λplac５から得られる。一方、このファージのlac−オ
ペロンは、同じ細菌種からの形質導入(transduction)に
よって誘導されたものであり、従って「ホモロギー」であ
る。記載した方法において好適に使用されるホモローガ
スな制御領域は、また、その生物由来のプラスミッドＤ
ＮＡから誘導されてもよい。

【００３９】このlac−プロモーター−オペレーターシ
ステムは、簡便であり効率がよいので、前述の系に用い
るのが望ましい。このシステムはまた、その機能(能力)
がＩＰＴＧ(イソプロピルチオ−β−Ｄ−ガラクトシダ
ーゼ)によって誘発(induce)される点からも望ましい。
勿論、その他のオペロンまたはその一部、例えばラムダ
(lambda)プロモーター−オペレーター、アラビアノース
オペロン[ファイ８０ダラ(phi ８０dara)]またはコリシ
ン(colicine)Ｅ１、ガラクトース、アルカリ性ホスファ
ターゼあるいはトリプトファンのオペロンなども使用す
ることができる。トリプトファンオペロン(trpオペロ
ン)由来のプロモーター−オペレーターは、誘発(induct
ion)(インドールアクリル酸による)および収穫まで１０
０％抑制すると期待される。

【００４０】５．プラスミッド組み立て全般について 図４に模式的に示した処置法の詳細については実験の部
で述べる。ここでは、好ましい実施形式の組換え型プラ
スミッドを組み立てるために用いられる種々の技法につ
いて簡単に述べておく。

【００４１】合成ソマトスタチン遺伝子のクローニング
および発現には、２個のプラスミッドを使用した。それ
ぞれのプラスミッドは、β−ガラクトシダーゼ構造遺伝
子領域の異なった領域にＥco ＲＩ基質部位を有する
(図４および図５参照)。これらのプラスミッドのＥco
ＲＩ部位に、合成ソマトスタチンＤＮＡフラグメントを
挿入すると、lac−オペロン調節要素のコントロール下
で、そのフラグメント中の遺伝情報が発現される。ソマ
トスタチンフラグメントをこれらのプラスミッドに挿入
すると、翻訳によって、１０個のアミノ酸(pＳＯＭ１)
または実質上全β−ガラクトシダーゼサブユニット構造
(pＳＯＭ１ １−３)のいずれかに先導されたソマトスタ
チンポリペプチドが得られる。

【００４２】このプラスミッド組み立て設計は、良く性
質が解明されているクローニングビーイクルであるプラ
スミッドpＢＲ３２２を用いて開始する。プラスミッド
にlac−要素を導入するには、lac−プロモーター、ＣＡ
Ｐ(環状ＡＭＰ受容タンパク質)結合部位、オペレータ
ー、リボソーム結合部位およびβ−ガラクトシダーゼ構
造遺伝子の最初の７個のアミノ酸コドンを備えているＨ
aeIII制限エンドヌクレアーゼフラグメント(２０３ヌク
レオチド)を挿入することにより行なった。このＨaeIII
フラグメントはλplac５ＤＮＡから得た。その末端がＴ
₄ ＤＮＡポリメラーゼおよびデオキシリボヌクレオチド
３燐酸で修復されたＥcoＲＩ−開裂pＢＲ３２２プラス
ミッドを、このＨaeIIIフラグメントと平滑末端結紮
し、挿入点にＥcoＲＩ末端を生成させた。これらＨaeII
Iおよび修復ＥcoＲＩ末端の結合によって、それぞれの
末端にＥcoＲＩ制限部位が形成される(図４および図５
参照)。このＤＮＡを持ったＥ．coli ＲＲＩの形質転
換体は、５−ブロモ−４−クロロ−インドリルガラクト
シド(Ｘ−gal)培地上、テトラサイクリン(Ｔc)およびア
ンピシリン(Ａp)に対する耐性によって選択した。この
指示培地上において、レプレッサーと結合する(titrati
ng)lac−オペレーターの数が増加したことによって、β
−ガラクトシダーゼを構成的に合成することのできるコ
ロニーは、それが青色になることで同定される。ＨaeII
Iフラグメントは、２つの方向づけが可能であるが、こ
れらは、フラグメント中のＨha制限部位が非対象に存在
することによって区別される。プラスミッドpＢＨ１０
をさらに修正して、lac−オペレーターの遠位部のＥco
ＲＩエンドヌクレアーゼ部位を除去した(pＢＨ２０)。

【００４３】８個の化学的に合成したオリゴデオキシリ
ボヌクレオチド（図２）の５'末端[³²Ｐ]−γ−ＡＴＰ
を用いてポリヌクレオチドキナーゼでラベルし、Ｔ₄ Ｄ
ＮＡリガーゼにより結合させる。重なり合うフラグメン
ト間の水素結合により、ソマトスタチン遺伝子は自動的
に集合し、最終的には、粘着制限部位末端によって重合
し、より大きな分子となる。この結合した生成物をＥco
ＲＩおよびＢamＨＩ制限エンドヌクレアーゼで処理し、
図２に示したようなソマトスタチン遺伝子を生成させ
る。

【００４４】ＥcoＲＩおよびＢamＨＩ末端を有するこの
合成ソマトスタチン遺伝子フラグメントを、あらかじめ
ＥcoＲＩおよびＢamＨＩ制限エンドヌクレアーゼならび
にアルカリ性ホスファターゼで処理したpＢＨ２０プラ
スミッドと結合させる。このようにアルカリ性ホスファ
ターゼで処理すると、挿入されたフラグメントを備えて
いるプラスミッドのための分子選択を行なうことができ
る。こうして得られた、この結合ＤＮＡを有するアンピ
シリン耐性の形質転換体を、テトラサイクリン感受性に
ついてスクリーニングし、あるものについては適切な大
きさのＥcoＲＩ−ＢamＨＩフラグメントが挿入されてい
るかどうかについて試験した。

【００４５】２個のクローン(分枝系)からのＥcoＲＩ−
ＢamＨＩフラグメントの両方の鎖を、ＢamＨＩおよびＥ
coＲＩ部位から開始するヌクレオチド配列分析により分
析した。この配列分析をlac−調節要素にまで延長し
た。その結果、lac−フラグメント配列はそのままであ
った。そして１つのケース、pＳＯＭ１の場合は、両鎖
のヌクレオチド配列は別々に決定されたが、それぞれ図
５Ａに示した配列を示した。

【００４６】lac−調節要素を有するpＳＯＭ１プラスミ
ッドのＥcoＲＩ−Ｐstフラグメントを除去し、pＢＲ３
２２のＥcoＲＩ−Ｐstフラグメントで置き換え、プラス
ミッドpＳＯＭ１１を調製した。lac−オペロン調節領域
および大部分のβ−ガラクトシダーゼ構造遺伝子を備え
たλplac５のＥcoＲＩフラグメントを、pＳＯＭ１１の
ＥcoＲＩ部位に挿入した。λplac５のＥcoＲＩ lac−
フラグメントには２つの方向性が考えられる。この２つ
の方向性の一方はソマトスタチン遺伝子にまで適切な読
み取り枠を維持するがもう一方はそうではない。別々に
単離したクローンを、ソマトスタチン活性を有するかど
うかについて分析し、適切な方向性を有する遺伝子を含
有しているクローンを同定した。それはpＳＯＭ１１−
３と認定したクローンであった。

【００４７】６．微生物について 形質転換を行なうための候補になり得るものとしては種
々の単細胞微生物、例えば細菌類、真菌類および藻類な
どが挙げられる。即ち、培養または発酵によって増殖し
得る単細胞生物である。細菌類は、大抵の場合、最も処
理し易い生物である。形質転換され易い細菌類は、腸内
細菌群(Ｅnterobacteriaceae)、例えば大腸菌(Ｅscheri
chia Ｃoli)株およびサルモネラ(Ｓalmonella)株、バ
チルス科(Ｂacillaceae)のもの、例えば枯草菌(Ｂacill
us subtilis)、肺炎球菌(Ｐneumococcus)、連鎖球菌
(Ｓtreptococcus)およびインフルエンザ菌(Ｈaemophilu
s influenzae)などである。

【００４８】以下に述べるソマトスタチン実験において
選択した微生物は、遺伝子型がＰro⁻Ｌeu⁻Ｔhi⁻ＲＢ
⁻ＭＢ recＡ^＋Ｓtr^ｒＬacy⁻の大腸菌株ＲＲＩ(Ｅ．
Ｃoli．strain ＲＲＩ)であった。Ｅ．Ｃoli ＲＲＩ
は、高頻度組換型供与菌(Ｈfrdonor)としてのＥ．Ｃoli
Ｋ１２株ＫＬ１６と交配させることにより、Ｅ．Ｃol
i ＨＢ１０１(Ｈ．Ｗ．Ｂoyer et al, Ｊ．Ｍol．Ｂio
l．(１９６９)４１ ４５９〜４７２)から得られる。こ
れについてはＪ．Ｈ．Ｍilley, Ｅxperiments in Ｍole
cular Ｇenetics(Ｃold Ｓpring Ｈarbor,Ｎew Ｙork,
１９７２)参照。

【００４９】Ｅ．Ｃoli ＲＲＩおよびＥ．Ｃoli．ＲＲ
Ｉ(pＢＲ３２２)両者の培養菌はＡmerican Ｔype Ｃu
lture Ｃollection(ＡＴＣＣ)に寄託された。これらの
菌株はそれぞれＡＴＣＣ番号３１３４３および３１３４
４の番号で入手可能である。ソマトスタチン産生菌、
Ｅ．Ｃoli．ＲＲＩ(pＳＯＭ１１−３)もまた、寄託され
た(ＡＴＣＣ番号; ３１４４７)。

【００５０】ヒトインシュリンについては、ＡおよびＢ
鎖遺伝子は、Ｅ.Ｃoli Ｋ１２株２９４endＡ(エンドヌ
クレアーゼＡ)、thi⁻、hsr⁻、hsmＫ^＋[ＡＴＣＣ番号;
３１４４６]でクローン(clone)した。そしてこの微生
物をＡ鎖の発現に用いた(Ｅ．Ｃoli Ｋ１２株２９４
[ＰＩＡ１][ＡＴＣＣ番号; ３１４４８]。ヒトインシュ
リンのＢ鎖は、先ずＨＢ１０１の誘導体、即ちＥ.Ｃoli
Ｋ１２株Ｄ１２１０ lac^＋(iＱo^＋z^ty^＋)中で発現さ
れた。このＢ遺伝子含有生物Ｅ.ＣoliＫ１２ Ｄ１２１
０(pＩＢ１)も同様に寄託された(ＡＴＣＣ番号; ３１４
４９)。あるいはまた、Ｂ遺伝子は、最初に述べた生
物、即ち、株２９４に挿入し、それから発現してもよ
い。

【００５１】またこれらのＥ.Ｃoli菌株は茨城県筑波郡
谷田部町東１丁目１番３号に住所を有する工業技術院微
生物工業技術研究所に寄託されている。それぞれの菌株
の受託番号は以下の通りである。菌株 寄託番号 Ｅ.Ｃoli ＲＲＩ ................４７０９ Ｅ.Ｃoli ＲＲＩ(pＢＲ322) ......４７１１ Ｅ.Ｃoli Ｋ−12 294 ............４７１０ Ｅ.Ｃoli ＲＲＩ(pＳＯＭ11-3)....４７１２ Ｅ.Ｃoli Ｋ−12 294(pＩＡ1).....４７１４ Ｅ.Ｃoli Ｋ−12 Ｄ1210(pＩＢ1)..４７１３

【００５２】実 験 I．ソマトスタチン １．ソマトスタチン遺伝子フラグメントの構成 図２に示した、それぞれＡ〜Ｈと名付けた８つのオリゴ
デオキシリボヌクレオチドを、主としてケイ・イタクラ
(Ｋ．Ｉtakura)らの、ザ・ジャーナル・オブ・ジ・アメ
リカン・ケミカル・ソサイエティ(Ｊ.Ａm.Ｃhem.Ｓoc.)
第９７巻、７３２７頁(１９７５年)の改良トリエステル
法によってまず構成した。しかしながら、フラグメント
Ｃ、ＥおよびＨの場合は、より長いオリゴデオキシリボ
ヌクレオチドを組み立てる基本単位として、完全に保護
されたトリマーをまず製造することからなる改良技術に
頼らなければならなかった。この改良技術の概略を示し
た図３において、Ｂはチミン、Ｎ−ベンゾイル化アデニ
ン、Ｎ−ベンゾイル化シトシンまたはＮ−イソブチリル
化グアニンである。要するに、図３に示すように、強力
な結合剤、即ち、２,４,６−トリイソプロピルベンゼン
スルホニルテトラゾリド(ＴＰＳＴe、４ミリモル; ２)
の存在下で、過剰のI(２ミリモル)とII(１ミリモル)と
のカップリング反応を６０分間で殆んど完了させた。
５'−保護基を２％ベンゼンスルホン酸溶液を用いて除
去した後、５'−水酸基ダイマーＶは、ＣＨＣl₃中ＮaＨ
ＣＯ₃水溶液で溶媒抽出することにより過剰の３'−燐酸
ジエステルモノマーIVから簡単に分離することができ
た。次いで、完全に保護されたトリマーブロックを、
５'−水酸基ダイマーＶ、I(２ミリモル)およびＴＰＳＴ
e(４ミリモル)から製造し、シリカゲルを用いたクロマ
トグラフィーにより単離した(ビイ・ティ・フント(Ｂ．
Ｔ．Ｈunt)ら、ケミストリィ・アンド・インダストリィ
(Ｃhem．and Ｉnd.)１９６７巻、１８６８頁(１９６７
年))。この改良技術で製造したトリマーの収率を表２に
示す。

【００５３】

【表２】完全に保護されたトリマーの収率配列 収率 配列 収率 ＴＴＴ ８１％ ＡＴＧ ６９％ ＴＴＴ ７５％ ＧＣＣ ６１％ ＧＧＡ ４１％ ＣＣＡ ７２％ ＡＧＡ ４９％ ＣＡＡ ７２％ ＡＴＣ ７１％ ＴＴＡ ７１％ ＣＣＴ ６１％ ＣＡＴ ５２％ ＡＣＡ ６３％ ＣＣＣ ７３％ ＡＣＣ ６５％ ＡＡＣ ５９％ ＣＧＴ ５１％ ＧＡＴ ６０％

【００５４】すべての保護基を除去した後、８つのオリ
ゴデオキシリボヌクレオチドをパーマフェース(Ｐermap
hase)ＡＡＸを用いた高圧液体クロマトグラフィーで精
製した[アール・エイ・ヘンリィ(Ｒ．Ａ.Ｈenry)ら、
Ｊ.Ｃhrom.Ｓci．第II巻、３５８頁(１９７３年)]。各
オリゴマーの純度は、ポリヌクレオチドキナーゼの存在
下、オリゴマーを[γ−³²Ｐ]−ＡＴＰで標識した後、薄
層ＤＥＡＥ−セルロースを用いたホモクロマトグラフィ
ーおよび２０％アクリルアミドスラブ中での電気泳動で
チェックした。一つの主要な標識生成体が各ＤＮＡフラ
グメントから得られた。

【００５５】２．ソマトスタチンＤＮＡの結合(ligatio
n)およびアクリルアミドゲル分析 化学的に合成したフラグメントＡ〜Ｈの５'ＯＨ末端
を、Ｔ₄ ポリヌクレオチドキナーゼで別々に加燐酸化し
た。反応生成体をオートラジオグラフィーで追跡できる
ように加燐酸化反応に[³²Ｐ]−γ−ＡＴＰを用いたが、
オートラジオグラフィーに頼らず、標識していないＡＴ
Ｐを用いることもできることは容易に理解されるはずで
あるが、キナーゼ反応の直前に、[γ−³²Ｐ]ＡＴＰ ２
５μＣi(約１５００Ｃi／ミリモル)[マキシム(Ｍaxam)
およびギルバート(Ｇilbert)、プロシーディングス・オ
ブ・ザ・ナショナル・アカデミィ・オブ・サイエンシズ
・オブ・ザ・ユーナイテッド・ステイツ・オブ・アメリ
カ(Ｐroc.Ｎat.Ａcad.Ｓci.Ｕ.Ｓ.Ａ.)第７４巻、１５
０７頁(１９７７年)]を０.５mlのエッペンドルフ(Ｅppe
ndorf)チューブ中で蒸発乾固した。フラグメント５μg
を、Ｔ₄ ＤＮＡキナーゼ(ヒドロキシルアパタイト(水酸
燐灰石)画分、２５００単位／ml）２単位と、全量１５
０μlのpＨ７.６のトリス塩酸７０ミリモル、ＭgＣl₂
１０ミリモル、ジチオトレイット５ミリモル中で２０分
間３７℃でインキュベートした。結合の目的に使用する
このフラグメントを、可能な限り確実に加燐酸化するた
めに、pＨ７.６のトリス塩酸７０ミリモル、ＭgＣl₂ １
０ミリモル、ジチオトレイット５ミリモル、ＡＴＰ０.
５ミリモルおよびＤＮＡキナーゼ２単位からなる混合物
１０μlを加え、さらに７℃で２０分間インキュベート
を続けた。このフラグメント(２５０μg／μl)を、それ
以上処理しないで−２０℃で保存した。キナーゼ反応を
行なったフラグメントＡ、Ｂ、ＥおよびＦ(各１.２５μ
g)を全量５０μlのpＨ７.６のトリス塩酸２０ミリモ
ル、ＭgＣl₂１０ミリモル、ジチオトレイット１０ミリ
モル、ＡＴＰ０.５ミリモルおよびＴ₄ ＤＮＡリガーゼ
(ヒドロキシルアパタイト画分、４００単位／ml)中で、
４℃で１６時間結合させた。フラグメントＣ、Ｄ、Ｇお
よびＨも同様の条件下で結合させた。サンプル２μlを
とり、１０％ポリアクリルアミドゲルで電気泳動し、次
いでオートラジオグラフィーで分析した[エッチ・エル
・ハイネカー(Ｈ.Ｌ.Ｈeyneker)ら、ネイチャー(Ｎatur
e)第２６３巻、７４８頁(１９７６年)]。未反応のＤＮ
Ａフラグメントは早い泳動物質として現われ、結合した
フラグメントのモノマー体は、ブロムフェノールブルー
染料(ＢＰＢ)と共に泳動する。結合したフラグメント
Ａ、Ｂ、ＥおよびＦならびに結合したフラグメントＣ、
Ｄ、ＧおよびＨの粘着末端によって、いくらか二量化が
起こる。これらの二量化体(ダイマー)は最も遅い泳動物
質となって現われ、制限エンドヌクレアーゼＥcoＲＩお
よびＢamＨＩによってそれぞれ開裂され得る。

【００５６】この二つの半分の分子(結合したＡ＋Ｂ＋
Ｅ＋Ｆおよび結合したＣ＋Ｄ＋Ｇ＋Ｈ)を、４℃で１６
時間、１５０μlの最終容量で行なう追加の結合過程に
よって結合させた。１μlを分析用に採取した。Ｔ₄ Ｄ
ＮＡリガーゼを不活性化するために反応混合物を６５℃
で１５分間加熱した。この加熱処理は、ＤＮＡ混合物の
泳動パターンに影響を与えない。十分な量の制限エンド
ヌクレアーゼＢamＨＩを反応混合物に加え、３０分間で
３７℃でソマトスタチンＤＮＡの多量体(マルチマー形)
を開裂させた。ＮaＣl１００ミリモルを加えた後、この
ＤＮＡをＥcoＲＩエンドヌクレアーゼで消化した。この
制限エンドヌクレアーゼによる消化は、このＤＮＡをフ
ェノール−クロロホルムで抽出することにより終了させ
た。ソマトスタチンＤＮＡフラグメントを、未反応の、
および部分的に結合したＤＮＡフラグメントから分離す
るため、１０％ポリアクリルアミドゲルを用いた分取用
(preparative)電気泳動にかけて精製した。ソマトスタ
チンＤＮＡフラグメントを含有する帯をゲルから切取
り、このゲルを小片に薄く切り、ＤＮＡを溶離用緩衝液
(酢酸アンモニウム０.５モル、ＭgＣl₂ １０ミリモル、
ＥＤＴＡ０.１ミリモル、ＳＤＳ(ドデシル硫酸ナトリウ
ム０.１％)を用い、６５℃で一夜抽出することによりこ
のＤＮＡを溶離した。このＤＮＡをエタノール２倍容量
を加えて沈澱させ、遠心分離し、pＨ７.６の１０ミリモ
ルのトリス塩酸２００μlに再溶解し、同じ緩衝液に対
して透析するとソマトスタチンＤＮＡ濃度は４μg／ml
となった。

【００５７】３．組換え型プラスミッドの構成 図４はソマトスタチン遺伝子を含む組換え型プラスミッ
ドを構成する方法の概略を示したものであり、これにつ
いて以下に詳述する。

【００５８】Ａ．親プラスミッドpＢＲ３２２ 実験的ソマトスタチンクローニングに選んだプラスミッ
ドはpＢＲ３２２であり、これは、抗生物質アンピシリ
ン(Ａp)およびテトラサイクリン(Ｔc)に対する耐性遺伝
子を有する小さな(分子量約２.６メガダルトン)プラス
ミッドである。図４に示したごとく、アンピシリン耐性
遺伝子には、制限エンドヌクレアーゼＰstIによる開裂
部位が存在し、テトラサイクリン耐性遺伝子には、制限
エンドヌクレアーゼＢamＨＩによる同様の開裂部位が存
在しており、ＥcoＲＩ部位はＡp^rとＴc^rの間に位置して
いる。このプラスミッドpＢＲ３２２は、５.８メガダル
トンのＡp^rＴc^rＣol^immプラスミッドであるpＢＲ３１３
から誘導される[アール・エル・ロドリクエツ(Ｒ.Ｌ.Ｒ
odriquez)ら、アイ・シィ・エヌ−ユウ・シィ・エル・
エイ・シンポジア・オン・モレキュラー・アンド・セル
ラー・バイオロジィ(ＩＣＮ−ＵＣＬＡ Ｓymposia on
Ｍloecular and Ｃellular Ｂiology)第５巻、４７１〜
７７頁(１９７６年); モレキュラー・メカニズムス・イ
ン・ザ・コントロール・オブ・ジーン・エクスプレッシ
ョン(Ｍolecular Ｍechanisms in theＣontrol of Ｇen
eＥxpression)４７１〜７７頁、アカデミック・プレ
ス、インコーポレイテッド(Ａcademic Ｐress,Ｉnc．１
９７６年)

【００５９】Ｂ．プラスミッドpＢＨ１０の構成 プラスミッドpＢＲ３２２ＤＮＡ５μgを３７℃で３０分
間pＨ７.６のトリス塩酸１００ミリモル、ＮaＣl１００
ミリモル、ＭgＣl₂ ６ミリモル中で制限エンドヌクレア
ーゼＥcoＲＩ１０単位を用いて消化した。反応をフェノ
ール−クロロホルム抽出により終了させ、次いでＤＮＡ
を２.５倍容量のエタノールを加えて沈澱させ、Ｔ₄ Ｄ
ＮＡポリメラーゼ緩衝液[pＨ８.８のトリス塩酸６７ミ
リモル、ＭgＣl₂６.７ミリモル、(ＮＨ₄)₂ＳＯ₄１６.６
ミリモル、ウシの血清アルブミン１６７μg／ml、dＮＴ
Ｐ(デオキシヌクレオシドトリホスフェート)各５０マイ
クロモル;エイ・パネット(Ａ．Ｐanet)ら、ビオケミス
トリィ(Ｂiochem．)第１２巻、５０４５頁(１９７３年)
参照]５０μl中に再懸濁した。Ｔ₄ ＤＮＡポリメラーゼ
２単位を加えて反応を開始させた。３０分間３７℃でイ
ンキュベートした後、ＤＮＡをフェノール−クロロホル
ムで抽出して反応を終了させ、次いでエタノールで沈澱
させた。λplac⁵ＤＮＡ[シャピロ(Ｓhapiro)ら、ネイチ
ャー(Ｎature)第２２４巻、７６８頁(１９６９年)]３μ
gを、最終容量２０μlのpＨ７.６のトリス塩酸６ミリモ
ル、ＭgＣl₂６ミリモル、β−メルカプトエタノール６
ミリモル中で、制限酵素ＨaeIII(３単位)を用いて３７
℃で１時間消化した。６５℃で１０分間加熱してこの反
応を終了させた。pＢＲ３２２処理ＤＮＡを、ＨaeIIIで
消化したλplac⁵ＤＮＡと混合し、最終容量３０μlで、
pＨ７.６のトリス塩酸２０ミリモル、ＭgＣl₂１０ミリ
モル、ジチオトレイット１０ミリモル、ＡＴＰ０.５ミ
リモル中、１２℃で１２時間、Ｔ₄ＤＮＡリガーゼ(ヒド
ロキシルアパタイト画分;エイ・パネットら、前出)１.
２単位を用いて平滑末端を結合した。この結合したＤＮ
Ａ混合物をpＨ７.６のトリス塩酸１０ミリモルに対して
透析しＥ．coli菌株ＲＲIの形質転換に用いた。形質転
換株は、５−ブロモ−４−クロロ−インドリルガラクト
シド(Ｘ−gal)培地[ジェイ・エッチ・ミラー(Ｊ.Ｈ．Ｍ
iller)、エクスペリメンツ・イン・モレキュラー・ジー
ネティックス(Ｅxperiments in Ｍolecular Ｇeneti
cs)、コールド・スプリング・ハーバー(Ｃold Ｓpling
Ｈarbor)、ニューヨーク、１９７２年]４０μg／mlを含
有する最少培地プレート上でテトラサイクリンおよびア
ンピシリン耐性のものを選んだ。β−ガラクトシダーゼ
合成能を有するコロニーは、その青色で同定した。それ
ぞれ独立に単離した４５の青色コロニーをスクリーニン
グした結果、そのうちの３つが約２００の塩基対で隔て
られた２つのＥcoＲＩ部位を有するプラスミッドＤＮＡ
を含有することを見出した。２０３b.p.ＨaeIII lac−
調節フラグメント中で非対称に存在するＨhaIフラグメ
ント[ダブリュー・ギルバート(Ｗ．Ｇilbert)ら、プロ
テイン−リガンド・インターアクションズ(Ｐrotein−
Ｌigand Ｉnteractions)、エッチ・サンド(Ｈ．sand)
およびジイ・ブラウエル(Ｇ．Ｂlauer)共編、ドウ・グ
ルイテル(Ｄe Ｇruyter)、ベルリン、(１９７５年)１９
３〜２１０頁]の位置によって、これらのプラスミッド
中のＨaeIIIフラグメントの方向、ここではＥcoＲＩフ
ラグメントの方向を決定することができる。プラスミッ
ドpＢＨ１０は、lac−制御領域フラグメントを所望の方
向に含んでいること、即ち、このlac−制御領域フラグ
メントの支配下に、テトラサイクリン耐性遺伝子にまで
転写が進んでいくことがわかった。

【００６０】Ｃ．プラスミッドpＢＨ２０の構成 次に、lac−オペーレーター末端のＥcoＲＩ部位を除く
ため、プラスミッドpＢＨ１０の修飾を行なった。これ
は僅か約４０個の塩基ペアで隔てられているＴc^rとlac
−プロモーター間に位置するもう１つのＥcoＲＩ部位を
ＲＮＡポリメラーゼによって部分的に保護しつつ、この
末端部位をＥcoＲＩエンドヌクレアーゼで選択的に開裂
することによって行った。ＲＮＡポリメラーゼを結合さ
せた後、このＤＮＡ(５μg)を最終容量１０μl中でＥco
ＲＩ(１単位)を用いて３７℃で１０分間消化した。６５
℃で１０分間加熱してこの反応を終了させた。このＥco
ＲＩ粘着末端を、pＨ４.５の酢酸ナトリウム２５ミリモ
ル、ＮaＣl３００ミリモル、ＺnＣl₂１ミリモル中でＳ
１ヌクレアーゼを用いて２５℃で５分間消化した。この
反応混合物をＥＤＴＡ(最終１０ミリモル)およびpＨ８
のトリス塩酸(最終５０ミリモル)を加えて終了させた。
ＤＮＡをフェノール−クロロホルムで抽出し、エタノー
ルで沈澱させ、Ｔ₄ ＤＮＡ結合緩衝液１００μlに再懸
濁した。Ｔ₄ ＤＮＡリガーゼ(１μl)を加え、この混合
物を１２℃で１２時間インキュベートした。結合したＤ
ＮＡをＥ．coli菌株ＲＲＩに入れて形質転換し、Ａp^rＴ
c^r形質転換株をＸ−gal抗生物質培地上で選択した。１
０個の単離した青色のコロニーからスクリーニングした
ＤＮＡを制限酵素分析した結果、これらのクローンは一
つのＥcoＲＩ部位を備えたプラスミッドＤＮＡを有する
ことがわかった。これらのコロニーのうち７つはlac(ラ
ック)およびＴc^rプロモーター間に位置するＥcoＲＩ部
位を保持していた。これらのプラスミッドの一つ、pＢ
Ｈ２０の、ＥcoＲＩ部位からlac−調節領域へのヌクレ
オチド配列順序が確認された。このプラスミッドを、次
にソマトスタチン遺伝子のクローンに用いた。

【００６１】Ｄ．プラスミッドpＳＯＭ１の構成 ２０μgのプラスミッドpＢＨ２０を、最終容量５０μl
中で、制限エンドヌクレアーゼＥcoＲＩおよびＢamＨＩ
によって完全に消化した。細菌性アルカリ性フォスファ
ターゼを加え[ワーシントン(Ｗorthington)ＢＡＰＥ０.
１単位]、６５℃で１０分間インキュベートを続けた。
フェノール−クロロホルム抽出によって反応を終了さ
せ、ＤＮＡを２倍容量のエタノールで沈澱させ、遠心分
離し、１ミリモルＥＤＴＡ、pＨ７.６の１０ミリモルト
リス塩酸５０μlに溶解した。このアルカリ性フォスフ
ァターゼ処理はＥcoＲＩ、ＢamＨＩ処理したpＢＨ２０
ＤＮＡの自己結合を有効に防ぐが、それでもなお、結合
によって、ソマトスタチンＤＮＡを含有する環状組換え
型プラスミッドは生成させることができる。Ｅ．coliＲ
ＲＩの直線プラスミッドＤＮＡによる形質転換は非常に
効率が低いので、この形質転換株の大部分は組換え型プ
ラスミッドを含有するだろう。ソマトスタチンＤＮＡ
(４μg／ml)５０μlを、pＨ７.６のトリス塩酸２０ミリ
モル、ＭgＣl₂１０ミリモル、ジチオトレイット１０ミ
リモル、ＡＴＰ０.５ミリモルおよびＴ₄ＤＮＡリガーゼ
４単位を含有する全容量５０μl中２２℃でＢamＨＩ、
ＥcoＲＩおよびアルカリ性フォスファターゼで処理した
２５μlのpＢＨ２０ＤＮＡと結合させた。１０、２０お
よび３０分後、ソマトスタチンＤＮＡ(４０ng)を反応混
合物に追加した(ソマトスタチンＤＮＡを徐々に加える
ことは、プラスミッドとの結合を自己結合より優先させ
るために好ましい。)。結合反応を１時間続け、次いで混
合物をpＨ７.６のトリス塩酸１０ミリモルに対して透析
した。対照実験として、ＢamＨＩ、ＥcoＲＩ、アルカリ
性フォスファターゼで処理したpＢＨ２０ＤＮＡを、ソ
マトスタチンＤＮＡの非存在下で、同様の条件下で結合
させた。両方の調製品をそれ以上処理せずにＥ．coliＲ
ＲＩの形質転換に用いた。形質転換実験は、Ｐ３物理的
収納設備(Ｐ３physical containment facility)で行
なった。[ナショナル・インスティテューツ・オブ・ヘ
ルス、ユウ・エス・エイ(Ｎational Ｉnstitutes of
Ｈealth Ｕ.Ｓ.Ａ. リコンビナントＤＮＡリサーチ
・ガイドラインス (Ｒecombinant ＤＮＡ Ｒesearch
Ｇuidelines)１９７６年]。形質転換株をＡp２０μg／
mlおよびＸ−gal４０μg／mlを含有する最少培地プレー
ト上で選んだ。すべてＴcに感受性を有する１０個の形
質転換株を単離した。照合のため、これらをpＳＯＭ
１、pＳＯＭ２・・・・・・・・・pＳＯＭ１０と命名した。対照
実験では形質転換株は得られなかった。１０個の形質転
換株のうち４つはＥcoＲＩ部位およびＢamＨＩ部位の両
方を有するプラスミッドを含有していた。これらの組換
え型プラスミッドの小さなＥcoＲＩ、ＢamＨＩフラグメ
ントのサイズは、４例全てにおいて、試験管内で製造し
たソマトスタチンＤＮＡのサイズと同様であった。マキ
サム(Ｍaxam)およびギルバート(Ｇilbert)の、プロシー
ディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミイ・オブ
・サイエンシズ・オブ・ザ・ユーナイテッド・ステーツ
・オブ・アメリカ(Ｐroc．Ｎat．Ａcad．Ｓci．Ｕ.Ｓ.
Ａ.)第７４巻、５６０頁(１９７７年)による塩基配列分
析の結果、プラスミッドpＳＯＭ１が所望のソマトスタ
チンＤＮＡフラグメントを挿入されたことがわかった。

【００６２】プラスミッドpＳＯＭ１を有するクローン
のＤＮＡ配列分析の結果、このクローンはソマトスタチ
ンからなるペプチドを生産するはずであることが予想さ
れる。しかしながら、ソマトスタチン放射免疫活性が細
胞ペレット抽出物または培養上澄液の抽出物中に検出さ
れず、また、増殖培地に直接７０％ギ酸および臭化シア
ンを加えた場合にもソマトスタチンの存在が検出されな
かった。Ｅ．coliＲＲＩ抽出液は外因性のソマトスタチ
ンを非常に早く品質低下させることが観察されている。
従ってプラスミッドpＳＯＭ１を有するクローンにソマ
トスタチン活性が存在しないのは、内因性蛋白分解酵素
による細胞内での分解によるものであると考えることが
できる。従って、このプラスミッドpＳＯＭ１を用い
て、ソマトスタチンを含有し、タンパク分解に抵抗する
と期待するに十分な大きさの前駆体タンパク質のための
暗号を備えたプラスミッドを組み立てることにした。

【００６３】Ｅ．プラスミッドpＳＯＭ１１およびpＳＯ
Ｍ１１−３の構成。 翻訳の位相を保って(in phase)、ソマトスタチン遺伝
子がβ−ガラクトシダーゼ遺伝子のＣ−末端に位置し得
るプラスミッドを組み立てた。この遺伝子のＣ−末端の
近くにＥcoＲＩ部位が存在することおよびこのタンパク
質のアミノ酸配列がわかっているので[ビイ・ポリスキ
イ(Ｂ．Ｐolisky)ら、プロシーディングス・オブ・ザ・
ナショナル・アカデミイ・オブ・サイエンシズ・オブ・
ザ・ユゥナイテッド・ステーツ・オブ・アメリカ(Ｐro
c．Ｎat．Ａcad．Ｓci．Ｕ.Ｓ.Ａ.)第７３巻、３９００
頁(１９７６年)、エイ・ヴイ・ホウラー(Ａ．Ｖ．Ｆowl
er)ら、同上、第７４巻、１５０７頁(１９７６年)、エ
イ・アイ、ブクハリ(Ａ．Ｉ．Ｂukuhari)ら、ネイチャ
ー・ニュゥ・バイオロジイ(Ｎature Ｎew Ｂiology)
第２４３巻、２３８頁(１９７３年)およびケイ・イー・
ラングレイ(Ｋ．Ｅ．Ｌangley)、ジャーナル・オブ・バ
イオロジカル・ケミストリィ(Ｊ．Ｂiol．Ｃhem．)第２
５０巻、２５８７頁(１９７５年)]、適切な解読枠を維
持しながら、ＥcoＲＩ ＢamＨＩソマトスタチン遺伝子
をＥcoＲＩ部位に挿入することができた。このようなプ
ラスミッドを構成するために、pＳＯＭ１ＤＮＡ(５０μ
g)を、最終容量１００μg中に制限酵素ＥcoＲＩおよび
ＰstＩで消化した。分取用５％ポリアクリルアミドゲル
を用いて、lac−調節要素を備えた小さいフラグメント
とソマトスタチン遺伝子を備えた大きいＰst−ＥcoＲＩ
フラグメントを分離した。この大きい帯をゲルから切取
り、このゲルを小片に薄く切り、ＤＮＡを６５℃で一夜
抽出することにより、このＤＮＡを溶離した。同様な方
法で、プラスミッドpＢＲ３２２ＤＮＡ(５０μg)をＰst
ＩおよびＥcoＲＩ制限エンドヌクレアーゼで消化し、こ
の様にして得られた２つのＤＮＡフラグメントを分取用
５％ポリアクリルアミドゲルを用いた電気泳動により精
製した。pＢＲ３２２から得た小さいＰstＩ−ＥcoＲＩ
フラグメント(１μg)を、pＳＯＭ１から得た大きいＰst
Ｉ−ＥcoＲＩＤＮＡフラグメント(５μg)と、Ｔ₄ＤＮＡ
リガーゼ１単位を用いて、最終容量５０μlで１２時間
１２℃で結合させた。この結合した混合物を、Ｅ．coli
ＲＲＩの形質転換に用い、転換株をＸ−gal培地上、ア
ンピシリン耐性について選択した。予期した通り、ほと
んどすべてのＡp^r転換株(９５％)はＸ−gal指示プレー
ト上に白いコロニー(lac−オペレーターがない)を与え
た。この様にして得られたプラスミッドpＳＯＭ１１
を、プラスミッドpＳＯＭ１１−３の構成に用いた。pＳ
ＯＭ１１ＤＮＡ５μgとλplac５ＤＮＡ５μgの混合物
を、ＥcoＲＩ(１０単位、３７℃で３０分間)で消化し
た。この制限エンドヌクレアーゼによる消化を、フェノ
ール−クロロホルム抽出で終了させた。次いでこのＤＮ
Ａをエタノールで沈澱させ、Ｔ₄ ＤＮＡリガーゼ緩衝液
(５０μl)に再懸濁した。Ｔ₄ ＤＮＡリガーゼ(１単位)
をこの混合物に加え、１２℃で１２時間インキュベート
した。この結合した混合物を、pＨ７.６の１０ミリモル
のトリス塩酸に対して透析し、Ｅ．coli菌株ＲＲＩの形
質転換に用いた。転換株をアンピシリンを含有するＸ-g
alプレート上でＡp^r について選択し、構成的なβ−ガ
ラクトシダーゼ生産能についてスクリーニングした。コ
ロニーの約２％が青色(pＳＯＭ１１−１、１１−２な
ど)であった。これらのコロニーから得られたプラスミ
ッドＤＮＡを制限酵素分析した結果、このすべてのプラ
スミッドは約４.４メガダルトンの新しいＥcoＲＩフラ
グメントを有し、これはlac−オペロン調節部位および
β−ガラクトシダーゼ遺伝子の大部分を有することがわ
かった。このＥcoＲＩフラグメントには二つの指向(方
向性)が可能であるので、ＨindIII制限部位が非対称に
配置していることを、これらのコロニーの何れが、ソマ
トスタチン遺伝子へとlac−転写が進行していくＥcoＲ
Ｉフラグメントを有するかを決定するのに用いた。Ｈin
dIII−ＢamＨＩの二重消化の結果、プラスミッドpＳＯ
Ｍ１１−３、pＳＯＭ１１−５、pＳＯＭ１１−６および
pＳＯＭ１１−７を有するクローンのみが、この方向性
を有するＥcoＲＩフラグメントを含有することがわかっ
た。

【００６４】４．ソマトスタチン活性の放射免疫分析 ソマトスタチンの標準的放射免疫分析法(ＲＩＡ)[エイ
・アリムラ(Ａ．Ａrimura)ら、プロシーディングス・オ
ブ・ザ・ソサイエティ・フォア・エクスペリメンタル・
バイオロジィ・アンド・メディシン(Ｐroc．Ｓoc．Ｅx
p．Ｂiol．Ｍed．)第１４８巻。７８４頁(１９７５年)]
を、アッセイ容量を減じ、燐酸緩衝液を用いることによ
り修正した。Ｔyr¹¹ソマトスタチンをクロラミンＴ法を
用いてヨウ素化した(同上)。ソマトスタチンを分析する
ために、通常、臭化シアン５mg／mlを含有する７０％ギ
酸中に入れたサンプルを、円錐形のポリプロピレンチュ
ーブ[０.７ml、サルステット(Ｓarstedt)]中で、湿った
ＫＯＨ上、減圧下で乾燥する。ＰＢＳＡ緩衝液(ＮaＣl
７５ミリモル;燐酸ナトリウム７５ミリモル(pＨ７.２);
ウシの血清アルブミン１mg／mlおよびアジ化ナトリウム
０.２mg／ml)２０μlを加え、次いで[¹²⁵Ｉ]ソマトスタ
チン「カクテル」４０μlおよびウサギの抗ソマトスタチ
ン免疫血清Ｓ３９[ヴァール(Ｖale)ら、メタボリズム
(Ｍethabolism)第２５巻、１４９１頁(１９７６年)]を
ＰＢＳＡ中に１,０００倍希釈した液２０μlを加えた。
[¹²⁵Ｉ]ソマトスタチンカクテルはＰＢＳＡ緩衝液１ml
当り、正常ウサギのγグロブリン[アンチボディズ・イ
ンコーポレイテッド(Ａntibodies,Ｉnc．)]２５０μg、
プロテアーゼインヒビター[「トラシロール」(“Ｔrasylo
l")、カルビオケム(Ｃalbiochem)]１５００単位および[
¹²⁵Ｉ]Ｔyr¹¹−ソマトスタチン約１００,０００カウン
トを含有していた。室温で、少なくとも１６時間経過後
に、ＰＢＳＡ緩衝液中のヤギの抗−ウサギγグロブリン
(アンチボディズ・インコーポレイテッド・Ｐ＝０.０
３)０.３３３mlをサンプルチューブに加えた。この混合
物を３７℃で２時間インキュベートし、５℃に冷却し、
次いで１０,０００×gで５分間遠心分離した。上澄液を
除き、ベレットをγカウンターでカウントした。用いた
抗血清の量で、カウントの２０％が非標識競合ソマトス
タチンなしで沈降した。多量のソマトスタチン(２００n
g)でのバックグラウンドは普通３％であった。半最大競
合は、ソマトスタチン１０pgで得られた。Ｅ．coli菌株
ＲＲＩ(受容菌株)の抽出液での最初の実験の結果、ソマ
トスタチン１０pg以下が、臭化シアン処理細菌タンパク
質１６μgまたはそれ以上の存在下で容易に検出しうる
ことがわかった。ギ酸処理した細菌抽出液からのタンパ
ク質２μg以上は、バックグラウンドの増加によってい
くらか妨害するが、臭化シアン開裂は、この妨害を非常
に減少させた。再組立て実験は、ソマトスタチンは臭化
シアン処理した抽出液中で安定であることを示した。

【００６５】Ａ．細菌抽出液による競合 菌株Ｅ．ＣoliＲＲＩ(pＳＯＭ１１−５)およびＥ．Ｃol
iＲＲＩ(pＳＯＭ１１−４)をルリア(Ｌuria)ブロス中
で、３７℃で５×１０⁸細胞／mlまで増殖させた。次に
ＩＰＴＧ１ミリモルを加え、増殖を２時間続けた。その
一部(アリクオット)である１mlをエッペンドルフ(Ｅppe
ndorf)遠心分離機中で数秒間遠心分離し、このペレット
を臭化シアン５mg／mlを含有する７０％ギ酸５００μl
に懸濁させた。室温で約２４時間経過後、このアリクオ
ットを水で１０倍に希釈し、図６に示した容量で３回ソ
マトスタチンを測定した。図６で、[Ｂ／Ｂo]はサンプ
ルの存在下に結合した[¹²⁵Ｉ]ソマトスタチンの、競合
するソマトスタチンの非存在下で結合した[¹²⁵Ｉ]ソマ
トスタチンに対する比である。記号１はＥ.coli ＲＲＩ
（pＳＯＭ１１−４）、２はＥ.coli ＲＲＩ（pＳＯＭ１
１−５）を示している。各点は３本のチューブの平均で
ある。希釈していないサンプルのタンパク質含量は、
Ｅ．ＣoliＲＲＩ(pＳＯＭ１１−５)では２.２mg／ml、
Ｅ．ＣoliＲＲＩ(pＳＯＭ１１−４)では１.５mg／mlで
あった。

【００６６】Ｂ．ソマトスタチン用pＳＯＭ１１クロー
ンの最初のスクリーニング １１クローン(pＳＯＭ１１−２、pＳＯＭ１１−３など)
の臭化シアン処理抽出液を、図６の場合について記載し
た如くして調製した。各抽出液３０μlを採取し、３回
放射免疫分析した。その結果を図７に示す。図では分析
値の範囲を示してある。ソマトスタチンのピログラム値
は、同じ実験の一部として得られた標準曲線から読み取
った。

【００６７】今までに述べた放射免疫分析の結果は、次
のように要約することができる。pＳＯＭ１での実験結
果とは違って、４つのクローン(pＳＯＭ１１−３、１１
−５、１１−６および１１−７)は、容易に検出しうる
ソマトスタチン放射活性を有することがわかった(図６
および図７)。制限フラグメント分析の結果、pＳＯＭ１
１−３、pＳＯＭ１１−５、pＳＯＭ１１−６およびpＳ
ＯＭ１１−７は所望のlac−オペロン方向性を有し、一
方pＳＯＭ１１−２および１１−４は反対の方向性を有
することがわかった。この様に、正しいlac−オペロン
の方向性とソマトスタチン放射免疫活性の産生との間に
は完全な相関が存在する。

【００６８】Ｃ．陽性および陰性クローンに及ぼすＩＰ
ＴＧ誘導及びＣＮＢr開裂の影響 このソマトスタチンプラスミッドのデザインにおいて、
ソマトスタチンはlac−オペロンのコントロール下に合
成されることを予想した。lac−リプレッサー遺伝子
は、このプラスミッド中に包含されておらず、受容株
(Ｅ．ＣoliＲＲＩ)は、細胞当り、僅か１０〜２０のリ
プレッサー分子を生産する野生型染色体lac−リプレッ
サー遺伝子を含有している。このプラスミッドのコピー
数(従ってlac−オペレーターの数)は、細胞当たり約２
０〜３０であるので、完全な抑制は不可能である。下記
の表３に示すように、Ｅ.coliＲＲＩ(pＳＯＭ１１−３)
中のソマトスタチンの比活性は、lac−オペロンの誘導
物質であるＩＰＴＧによって増加した。予期したごと
く、誘導レベルは低く、２.４〜７倍であった。実験７
(表３)で、β−ガラクトシダーゼの最初の９２のアミノ
酸の指標であるα活性もまた、２倍となった。いくつか
の実験では、ソマトスタチン放射免疫活性は、全細胞タ
ンパク質を臭化シアンで開裂する前には検出できなかっ
た。放射免疫分析に用いた抗血清Ｓ３９は、遊離のＮ末
端アラニンを必要とするので、臭化シアンによる開裂前
には活性は期待されなかった。

【００６９】

【表３】ソマトスタチン放射免疫比活性 略語:ルリア(Ｌuria)ブロス、ＬＢ; イソプロピルチオ
ガラクトシド、ＩＰＴＧ; 臭化シアン、ＣＮＢr; ソマ
トスタチン、ＳＳ。タンパク質は、ブラッドホード(Ｂr
adford)、アナティカル・ビオケミストリィ(Ａnal．Ｂi
ochem.)第７２巻、２４８頁(１９７６年)の方法によっ
て測定した。 実験 IPTG CNBr pgSS/μg 番号 菌株 培地 1mM 5mg/ml タンパク質 １ 11-2 LB ＋ ＋ ＜0.1 11-3 LB ＋ ＋ 12 11-4 LB ＋ ＋ ＜0.4 11-5 LB ＋ ＋ 15 ２ 11-3 LB ＋ ＋ 12 11-3 LB ＋ − ＜0.1 ３ 11-3 LB ＋ ＋ 61 11-3 LB − ＋ 8 11-3 LB ＋ − ＜0.1 ４ 11-3 LB ＋ ＋ 71 11-3 VB＋グリ セロール＊ ＋ ＋ 62 ５ 11-3 LB＋グリ セロール ＋ ＋ 250 ６ 11-3 LB ＋ ＋ 320 11-2 LB ＋ ＋ ＜0.1 ７ 11-3 LB ＋ ＋ 24 11-3 LB − ＋ 10 ＊フォーゲル・ボンネル(Ｖogel−Ｂonner) 最少培地
＋グリセロール。

【００７０】Ｄ．臭化シアン処理抽出液のゲル濾過 陽性クローン(pＳＯＭ１１−３、１１−５、１１−６お
よび１１−７)のギ酸および臭化シアン処理抽出液をプ
ールし(全容量２５０μl)、乾燥し、５０％酢酸０.１ml
に再懸濁した。[³Ｈ]ロイシンを加え、このサンプルを
５０％酢酸中、セファデックスＧ−５０をつめた０.７
×４７cmのカラムにかけた。カラムの画分の一部である
５０μlをとり、ソマトスタチンについて分析した。プ
ールした陰性のクローン抽出液(１１−２、１１−４お
よび１１−１１)を同様にして処理した。結果を図８に
示す。記号３はプールした陽性クローン、４は対照とし
て用いた³Ｈ−Ｌeu、５はプールした陰性クローンを示
している。同じカラムで既知のソマトスタチン[ベック
マン・コーポレイション(Ｂeckman Ｃorp)]が、図中、
矢印(６)で示されるように溶離する。この系において、
ソマトスタチンは、除外された大きなペプチドおよび完
全に包含された小さな分子から良好に分離される。ソマ
トスタチンについて陽性のクローンの抽出液のみが、カ
ラム画分に放射免疫活性を示し、この活性部は化学的に
合成したソマトスタチンと同じ位置に溶離して来る。

【００７１】活性情報の要約 ソマトスタチンのアミノ酸配列を含有するポリペプチド
合成を行なうための情報は、次のように要約される。
(１)ソマトスタチン放射免疫活性は、証明された正しい
配列のソマトスタチン遺伝子を含有し、正しい方向性の
lac−ＥcoＲＩ ＤＮＡフラグメントを有するプラスミッ
ドpＳＯＭ１１−３を含有するＥ.coli細胞に存在する。
同じソマトスタチン遺伝子を有するが、lac−ＥcoＲＩ
フラグメントの方向が反対である、これと関連したプラ
スミッドpＳＯＭ１１−２を有する細胞は、検出しうる
ソマトスタチン活性を示さない。(２)デザイン案で予想
されたように、細胞抽出液を臭化シアンで処理するまで
は、ソマトスタチン放射免疫活性は観察されない。(３)
ソマトスタチン活性は、lac−オペロンの誘導物質であ
るＩＰＴＧによって誘導されることから明らかなよう
に、lac−オペロンによってコントロールされる。(４)
ソマトスタチン活性部は、既知のソマトスタチンとセフ
ァデックスＧ−５０において、一緒にクロマトグラフィ
ーされる。(５)クローンしたソマトスタチン遺伝子のＤ
ＮＡ配列は正しい。翻訳の位相がずれていれば、どの位
置においてもソマトスタチンと異なっているペプチドが
産生されるであろう。放射免疫活性が検出されたこと
は、ソマトスタチンに密接に関連したポリペプチドの産
生を示しており、従って翻訳は相中(in phase)にある
に違いないことを示している。翻訳が位相からはずれず
に起こるので、遺伝暗号は正しい配列順序のソマトスタ
チンを有するペプチドの製造を指令する。(６)最後に、
Ｅ.coliＲＲＩ(pＳＯＭ１１−３)抽出液の前記サンプル
は、ラットの脳下垂体細胞からの成長ホルモンの分泌を
抑制するが、一方同様にして製造された、同じタンパク
質濃度のＥ.coliＲＲＩ(pＳＯＭ１１−２)のサンプル
は、生長ホルモンの分泌に何ら影響を及ぼさない。

【００７２】ソマトスタチンの安定性、収率および精製 ＥcoＲＩlac−オペロンフラグメント(pＳＯＭ１１−
２、pＳＯＭ１１−３など)を有する菌株は、プラスミッ
ドの表現型に関して分かれてくる。たとえば、約１５世
代後、Ｅ.coliＲＲＩ(pＳＯＭ１１−３)培養体の約半分
は、β−ガラクトシダーゼを構成し(すなわちlac−オペ
レーターを有する)、これらの約半分はアンピシリン耐
性であった。ソマトスタチン陽性(pＳＯＭ１１−３)お
よび陰性(pＳＯＭ１１−２)の菌株は不安定である。従
って、この増殖が不利である理由は、大きいがしかし、
不完全で不活性なガラクトシダーゼの過剰生産によるも
のと思われる。ソマトスタチンの収率は、多分、lac−
領域を欠いたプラスミッドを有する培養体から細胞を選
択する結果と思われるが、全細胞タンパク質に対して
０.００１〜０.０３％の間で変動した(表３)。ソマトス
タチンの最高の収率は、単一のアンピシリン耐性菌から
増殖をはじめた場合、即ち構成コロニーから得られる。
これらの場合でも、収穫期の細胞の３０％はlac−領域
を欠いていた。従って凍結状態(凍結乾燥)で貯蔵し、単
一のこのようなコロニーから増殖させて収穫する方法が
これまでに記載した系として示される。前駆体タンパク
質の発現が、誘導および収穫前までは基本的には全く抑
制されるような、lac−リプレッサーを過剰に生産する
細菌株を選ぶことによって収率を増加させてもよい。あ
るいは、前述したごとく、通常全く抑制されているトリ
プトファンまたはその他のオペレーター−プロモーター
系を用いてもよい。

【００７３】たとえばイートン・プレス(Ｅaton Ｐres
s)中で細胞破壊することによって得られる粗抽出液中に
は、β−ガラクトシダーゼ−ソマトスタチン前駆体タン
パク質は不溶であるので、最初の低速度の遠心分離のペ
レット中に見い出される。この活性体は７０％ギ酸、６
モル塩酸グアニジジウムまたは２％ナトリウムドデシル
硫酸に溶解させることができる。しかしながら、イート
ンプレスからの粗抽出液を８モルの尿素で抽出し、残渣
を臭化シアンで開裂するのが最も好ましい。最初の実験
で、Ｅ.coli菌株ＲＲＩ(pＳＯＭ１１−３)から得たソマ
トスタチン活性は、開裂生成物をアルコールで抽出し、
５０％酢酸を用いてセファデックスＧ−５０でクロマト
グラフィーすることによって約１００倍に上昇した。生
成物を再びセファデックスＧ−５０でクロマトグラフィ
ーし、次いで高圧液体クロマトグラフィーにかければ、
実質的に純粋なソマトスタチンが得られる。

【００７４】II ヒトインシュリン 次に、上に述べた技術を、ヒトインシュリンの製造に応
用した。即ち、インシュリンＢ鎖(１０４塩基ペア)のた
めの遺伝子およびインシュリンＡ鎖(７７塩基ペア)のた
めの遺伝子を、ヒトポリペプチドのアミノ酸配列からデ
ザインした。それぞれの鎖は、ＥcoＲＩおよびＢamＨＩ
制限エンドヌクレアーゼのための一本鎖粘着末端を有す
る様に、そして別々にpＢＲ３２２プラスミッドに挿入
する様にデザインした。組み立て用のブロックとしてト
リヌクレオチドを用い、ブロック燐酸トリエステル法に
よって、合成フラグメントであるデカーないしペンタデ
カヌクレオチドを合成し、最後に高性能液体クロマトグ
ラフィー(ＨＰＬＣ)により精製した。次いで、このヒト
インシュリンＡおよびＢ鎖合成遺伝子をプラスミッドp
ＢＲ３２２中で別々にクローンした。このクローンした
合成遺伝子を、先に述べた様にしてＥ.coliβ−ガラク
トシダーゼと融合させ、有効に転写、翻訳を行ない、安
定な前駆体タンパク質を得た。β−ガラクトシダーゼ前
駆体からインシュリンペプチドを開裂させ、放射免疫分
析によって検出し、精製した。次いでインシュリン放射
免疫活性を、Ｅ.coli生産物と混合することにより産生
せしめた。

【００７５】１．ヒトインシュリン遺伝子のデザインと
合成 ヒトインシュリンのために組み立てられた遺伝子を図９
に示す。ヒトインシュリンのための遺伝子、Ｂ鎖および
Ａ鎖は、ヒトのポリペプチドのアミノ酸配列からデザイ
ンした。それぞれの遺伝子をプラスミッドpＢＲ３２２
に正しく挿入するために、それぞれの遺伝子の５'末端
には、ＥcoＲＩおよびＢamＨＩ制限エンドヌクレアーゼ
のための一本鎖粘着末端が存在する。全Ｂ鎖遺伝子を構
成する前に、アミノ酸配列Ｇlu−alaによって、それぞ
れ半分の遺伝子を増幅(amplification)および確認し得
る様に、ＨindIIIエンドヌクレアーゼ認識部位をＢ鎖遺
伝子の中央に挿入した。このＢ鎖およびＡ鎖遺伝子は、
デカマーからペンタデカマーに渡る２９の異なったオリ
ゴデオキシリボヌクレオチドから組み立てられる様にデ
ザインした。それぞれの矢印は改良燐酸トリエステル法
によって合成されたフラグメントを表わしている。Ｈ₁
ないしＨ₈およびＢ₁ないしＢ₁₀はＢ鎖遺伝子用であり、
Ａ₁ないしＡ₁₂はＡ鎖遺伝子用である。

【００７６】２．オリゴデキシリボヌクレオチドの化学
合成 オリゴデキシリボヌクレオチド合成のための方法及び原
料については、以下に述べる変更を除いては、基本的に
はイタクラ等により報告されている(Ｉtakura,Ｋ.et al
(１９７５)Ｊ．Ｂiol．Ｃhem．２５０ ４５９２および
Ｉtakura, Ｋ.et al(１９７５)Ｊ．Ａmer．Ｃhem．Ｓo
c．９７, ７３２７)。

【００７７】a) 完全に保護されたモノヌクレオチド、
５'−Ｏ−ジメトキシトリチル−３'−p−クロロフェニ
ル−β−シアノエチルホスフェートは、１−メチルイミ
ダゾールの存在下でアセトニトリル中、単官能性燐酸化
剤、p−クロロフェニル−β−シアノエチルホスホロク
ロリデート(１.５モル当量)を用いて、ヌクレオチド誘
導体から合成した(ＶamＢoom, Ｊ．Ｈ．et al (１９７
５)Ｔetrahedron ３１, ２９５３)。生成物は、分取用
液体クロマトグラフィー(Ｐrep ５００ＬＣ、Ｗaters
Ａssociates)により、大規模に(１００〜３００g)単離
した。

【００７８】b) 溶媒抽出法(Ｈirose, Ｔ．et al (１９
７８)Ｔetrahedron Ｌetters, ２４４９)を用いて、３
２個の２官能性トリマー(表４参照)は５〜１０ミリモル
スケールで、３'−末端ブロックとしての４個のダイマ
ー、３個のテトラマーおよび１３個のトリマーは、１ミ
リモルスケールで合成した。完全に保護されたトリマー
の同質性(homogeneity)は、２種のメタノール／クロロ
ホルム溶媒系、即ち、溶媒aは５％Ｖ／Ｖ、溶媒bは１０
％Ｖ／Ｖ(表４参照)を用い、シリカゲルによる薄層クロ
マトグラフィーにより確認した。この化合物群から出発
して、一定の配列を持った２９個のオリゴデオキシリボ
ヌクレオチド、即ち１８個はＢ鎖、１１個はＡ鎖遺伝子
用のもの、を合成した。

【００７９】ポリヌクレオチドを構成するために使用し
た塩基単位は、２種類のトリマーブロック、即ち表４の
２官能性トリマーブロックおよび３'−水酸基をアニソ
イル基で保護した相当する３'−末端トリマーであっ
た。この２官能性トリマーは、ピリジン−トリエチルア
ミン−水(３:１:１Ｖ／Ｖ)混合物によって相当する３'
−燐酸ジエステル成分に、そしてまた、２％ベンゼンス
ルホン酸により相当する５'−水酸基成分に加水分解し
た。先に述べた３'−末端ブロックは２％ベンゼンスル
ホン酸で処理して相当する５'−水酸基体とした。過剰
のこの３'−燐酸ジエステルトリマー(１.５モル当量)と
５'−水酸基成分(１モル当量)との縮合反応は、２,４,
６−トリイソプロピルベンゼンスルホニルテトラゾリド
(ＴＰＳＴe、３〜４当量)の存在下で行なわれ、３時間
でほとんど完全に終了した。過剰の３'−燐酸ジエステ
ルブロック反応体を除去するために、この反応混合物を
半融ガラス濾過器上にセットした短いシリカゲルカラム
に通した。このカラムから、副産物及び縮合剤を溶出す
るために最初はクロロホルムで溶離洗浄し、次いでＣＨ
Ｃl₃:ＭeＯＨ(９５:５Ｖ／Ｖ)で溶出すると、ほとんど
大部分の完全に保護されたオリゴマーが溶離した。この
条件下で、カラムに通した３'−燐酸ジエステルブロッ
ク反応体はカラムに残存した。同様にして、所望の長さ
が得られるまでブロック結合を繰り返した。

【００８０】

【表４】 ＊ 完全に保護されたトリデオキシヌクレオチド;
５−０−ジメチキシトリチル−３'−p−クロロフェニル
−β−シアノエチル燐酸 ＊＊ 収率は、５'−水酸基モノマーから計算した通
算収率である。 ＊＊＊ ＨＰＬＣ分析に基づく。

【００８１】オリゴヌクレオチド合成に際し、a)それぞ
れのトリマーおよびテトラマーブロックの分析、b)中間
体フラグメント(ヘキサマー、ノナマーおよびデカマー)
の分析、c)最後の縮合反応の分析、d)最終産物の精製、
のために高性能液体クロマトグラフィー(ＨＰＬＣ)を広
範囲に利用した。このＨＰＬＣは、Ｓpectra−Ｐhysics
３５００Ｂ液体クロマトグラフを使用して行なった。
全ての保護基を、５０℃で濃ＮＨ₄ＯＨにより(６時
間)、そして室温で８０％ＡcＯＨにより(１５分)除去し
た後、溶媒Ａ(０.０１Ｍ ＫＨ₂ＰＯ₄、pＨ４.５)中、
溶媒Ｂ(０.０５ＭＫＨ₂ＰＯ₄−１.０Ｍ ＫＣl、pＨ４.
５)による直線傾斜法を用い、パーマフェイズＡＡＸ(ジ
ュポン)[Ｖan Ｂoom, Ｊ．et al (１９７７)Ｊ．Ｃhr
omatography １３１１６９]カラム(１m×２mm)で化合
物を分析した。緩衝液Ａから開始し、１分毎に３％の緩
衝液Ｂを加えることにより、こう配をつけた。溶出は６
０℃で、１分当たり２mlの流速で行なった。２９個の最
後のオリゴヌクレオチドの精製もまた、パーマフェイズ
ＡＡＸで、上記と同じ条件下で行なった。目的とするピ
ークのものを集め、透析により脱塩し、凍結乾燥した。
Ｔ₄ポリヌクレオチドキナーゼを用い、(γ−³²Ｐ)ＡＴ
Ｐで５'−末端を標識した後、それぞれのオリゴヌクレ
オチドの同質性を２０％ポリアクリルアミドゲルによる
電気泳動によりチェックした。

【００８２】３．Ｂ鎖遺伝子およびＡ鎖遺伝子の組み立
ておよびクローニング インシュリンのＢ鎖のための遺伝子は、左末端にＥcoＲ
Ｉ制限部位、中央にＨindIII部位、および右末端にＢam
ＨＩ部位を有する様にデザインした。これは、両者の半
分づつ、即ち左のＥcoＲＩ−ＨindIII半分体(ＢＨ)およ
び右のＨindIII−ＢamＨＩ半分体(ＢＢ)を、別々に好適
なクローニングビーイクルpＢＲ３２２中でクローン
し、それらの配列を確かめた後、結合させて完全なＢ遺
伝子とすることができる様にするために行なった(図１
０)。このＢＢ半分体は、図９においてＢ１ないしＢ１
０と記号付けした、燐酸トリエステル化学合成によって
製造した１０個のオリゴデオキシリボヌクレオチドを結
合することによって組み立てた。これらのフラグメント
が粘着末端(ＨindIIIおよびＢamＨＩ)によって、望まし
くない重合を起こさない様に、Ｂ１とＢ１０は燐酸化し
なかった。分取用アクリルアミドゲル電気泳動によって
精製し、最も大きなＤＮＡ帯を溶離した後、このＢＢフ
ラグメントを、ＨindIIIおよびＢamＨＩで開裂したプラ
スミッドpＢＲ３２２に挿入した。このＤＮＡから誘導
されたアンピシリン耐性コロニーの約５０％は、テトラ
サイクリンに対する感受性を有しており、これは非プラ
スミッドＨindIII−ＢamＨＩフラグメントが挿入された
ことを示している。これらのコロニーの内、４個(pＢＢ
１０１〜pＢＢ１０４)からの小さなＨindIII−ＢamＨＩ
フラグメントの配列を決定した結果、デザイン通り正し
いことがわかった。

【００８３】ＢＨフラグメントも同様にして調製し、Ｅ
coＲＩおよびＨindIII制限エンドヌクレアーゼで開裂し
たpＢＲ３２２に挿入した。アンピシリン耐性のプラス
ミッドから、３個のテトラサイクリン感受性形質転換体
(pＢＨ１〜pＢＨ３)を分析した。この小さなＥcoＲＩ−
ＨindIIIフラグメントは、所望のヌクレオチド配列を有
することがわかった。

【００８４】Ａ鎖遺伝子は３つの部分から組み立てた。
左側の４個、中央の４個および右側の４個のオリゴヌク
レオチド(図９参照)を別々に結合し、次いでこれらを混
合、結合した(オリゴヌクレオチドＡ１およびＡ１２は
燐酸化しなかった)。組み立てたＡ鎖遺伝子を燐酸化
し、ゲル電気泳動によって精製し、pＢＲ３２２の、Ｅc
oＲＩ−ＢamＨＩ部位にクローンした。２個のアンピシ
リン耐性、テトラサイクリン感受性クローン(pＡ１０お
よびpＡ１１)からのＥcoＲＩ−ＢamＨＩフラグメントは
所望のＡ遺伝子配列を含んでいた。

【００８５】４．ＡおよびＢインシュリン遺伝子の発現
のためのプラスミッドの組み立て 図１０は、lac−インシュリンＢプラスミッド(pＩＢ１)
の組み立てを示したものである。プラスミッドpＢＨ１
およびpＢＢ１０１はＥcoＲＩおよびＨindIIIエンドヌ
クレアーゼで消化した。pＢＨ１のこの小さいＢＨフラ
グメントおよびpＢＢ１０１の大きいフラグメント(ＢＢ
フラグメントおよびpＢＲ３２２の大部分を含有してい
る)をゲル電気泳動によって精製し、混合し、ＥcoＲＩ
で開裂したλplac５の存在下で結合させた。このλplac
５のメガダルトンＥcoＲＩフラグメントはlac−調節領
域およびβ−ガラクトシダーゼ構造遺伝子の大部分を含
んでいる。この制限部位の配置によりＢＨのＢＢへの正
しい結合が保証される。このlac−ＥcoＲＩフラグメン
トの挿入方向は２通りある。従って、形質転換後に得ら
れるクローンの半分だけが望ましい方向性を有している
はずである。１０個の、アンピシリン耐性を示し、β−
ガラクトシダーゼを構成的に産生するクローンの方向性
を制限分析によって調べた。これらのコロニーの内、５
個が完全なＢ遺伝子配列およびβ−ガラクトシダーゼ遺
伝子からＢ鎖遺伝子に至る正しい読み取り枠を備えてい
た。その１つ、pＩＢ１を次の実験用として選んだ。

【００８６】同様の実験によって、λplac５からの４.
４メガダルトンのlac−フラグメントをpＡ１１プラスミ
ッドのＥcoＲＩ部位に導入し、pＩＡ１を得た。pＩＡ１
は、Ａ遺伝子フラグメントがＢ遺伝子フラグメントの代
わりとして置き替わっていることを除けばpＩＢ１と同
じである。ＤＮＡ配列分析の結果、正しいＡおよびＢ鎖
遺伝子配列がそれぞれpＩＡ１およびpＩＢ１に保持され
ていることがわかった。

【００８７】５．発現 β−ガラクトシダーゼに正しく付着したインシュリン遺
伝子を含有する菌株は、両者ともβ−ガラクトシダーゼ
大のタンパク質を多量に産生する。全細胞タンパク質の
約２０％がこのβ−ガラクトシダーゼ−インシュリンＡ
またはＢ鎖混成物であった。この混成タンパク質は不溶
性であり、第１低速ペレット中に存在し、そこでこれら
はタンパク質の約５０％を占める。

【００８８】インシュリンＡおよびＢ鎖の発現を検出す
るために、本発明者らは、この別々の鎖から完全なイン
シュリンを復元することに基づく放射免疫分析(ＲＩＡ)
を使用した。２７μl分析容量 (assay volume)を採用し
ているＫatsoyannisらのインシュリン復元方法(Ｋatsoy
annis et al (１９６７)Ｂiochemistry ６, ２６４２−
２６５５)は非常に好適なアッセイ法である。インシュ
リン鎖を混合し、Ｓ−スルホン化(Ｓ−Ｓulfonated)誘
導体を復元した後、インシュリン活性は容易に検出され
る。インシュリンの別々のＳ−スルホン化鎖は、還元お
よび酸化後、用いた抗インシュリン抗体と有意に反応し
ない。

【００８９】この復元分析法を使用するために、β−ガ
ラクトシダーゼ−ＡまたはＢ鎖混成タンパク質の一部を
精製し、臭化シアンで開裂し、Ｓ−スルホン化誘導体を
形成させた。

【００９０】ヒトインシュリン用の、化学的に合成した
遺伝子から正しい発現が得られたという証拠は以下の如
く要約することができる。a) 両方の鎖に放射免疫活性
が検出された。b) クローニング後に得られたＤＮＡ配
列およびプラスミッド構成は、デザイン通り正しいこと
が直接確かめられた。放射免疫活性が得られるので、翻
訳は相内にある(in phase)に違いない。従って、遺伝
暗号は、ヒトインシュリンの配列を有するペプチドが産
生されていく様に命令する。c) 臭化シアンで開裂した
後のＥ.coli産生物は、異なった原理に基づく３種の異
なったクロマトグラフィー系(ゲル濾過、イオン交換お
よび逆相ＨＰＬＣ)において、インシュリン鎖としての
挙動を示した。d) Ｅ.coli産生Ａ鎖はＨＰＬＣにより小
規模で精製された。そしてこれは正しいアミノ酸組成を
有する。

【図面の簡単な説明】

【図１】 図１は生物学的にソマトスタチンを産生する
ためのフローチャートである。

【図２】 図２は構造遺伝子の模式構造を示す図であ
る。

【図３】 図３はヌクレオチドトリマー調製のためのフ
ローチャートである。

【図４】 図４は親プラスミッドpＢＲ３２２から組換
え型プラスミッドpＳＯＭ１１−３を調製するためのフ
ローチャートである。

【図５】 図５は２個のプラスミッドの要所となるヌク
レオチド配列を示す図である。

【図６】 図６は組換え型プラスミッドによって発現さ
れた生成物のソマトスタチン活性を示すグラフである。

【図７】 図７は組換え型プラスミッドによって発現さ
れた生成物のソマトスタチン活性を示すグラフである。

【図８】 図８は組換え型プラスミッドによって発現さ
れた生成物のソマトスタチン活性を示すグラフである。

【図９】 図９はヒトインシュリンのＡ鎖およびＢ鎖の
アミノ酸配列のためのコドンからなる合成遺伝子の模式
構造を示す図である。

【図１０】 図１０はヒトインシュリンのＢ鎖を発現す
る組換え型プラスミッドを組みたてるためのフローチャ
ートである。 １・・・pＳＯＭ１１−４、２・・・pＳＯＭ１１−５、３・・・
プールした陽性クローン、４・・・³Ｈ−Ｌeu、５・・・プー
ルした陰性クローン、６・・・既知のソマトスタチンが溶
離する位置を示す矢印。

フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｒ 1:19） (56)参考文献 ＰＲＯＣ．ＮＡＴＬ．ＡＣＡＤ．ＳＣ Ｉ．ＵＳＡ，ＶＯＬ．73，ＮＯ．11 （1976） Ｐ．3900−3904 ＳＣＩＥＮＣＥ，ＶＯＬ．196（17 ＪＵＮＥ 1977） Ｐ．1313−1319

Claims (1)

1. (57)【特許請求の範囲】 １．あらかじめ定められた機能的哺乳動物ポリペプチド
   またはその中間体ポリペプチドを含んでいるポリペプチ
   ドを微生物細胞培養中で生産する方法であって、 （ｉ）該ポリペプチドをコードしており該微生物細胞に
   とってホモローガスな発現制御領域のコントロール下に
   あるＤＮＡを含んでいる複製可能なクローニングビーイ
   クルで形質転換された微生物により該ポリペプチドを発
   現させ、次いで （ii）該ポリペプチドを該細胞培養から回収する、こと
   からなる方法。 ２．ＤＮＡがcＤＮＡである請求項１に記載の方法。 ３．ＤＮＡがインビトロで化学合成されたものである請
   求項１に記載の方法。 ４．微生物が細菌であり、ＤＮＡが細菌にとって好まし
   いコドンを含んでいるものである請求項３に記載の方
   法。 ５．発現制御領域が誘導可能なものであり、ポリペプチ
   ドの発現が、発現が誘導されるまでは発現制御領域によ
   り抑制されている請求項１に記載の方法。 ６．ポリペプチドが血清タンパクを含んでいる請求項１
   に記載の方法。 ７．ポリペプチドがホルモンとして活性な哺乳動物ホル
   モンである請求項１に記載の方法。 ８．発現制御領域がオペロンの一部を含んでいる請求項
   １に記載の方法。 ９．ポリペプチドが実質的にヒトインシュリンのＡ鎖ま
   たはＢ鎖からなる哺乳動物ポリペプチドを含んでいる請
   求項１に記載の方法。 １０．ポリペプチドを微生物から、不溶性形体で回収す
   る請求項１に記載の方法。 １１．ポリペプチドが哺乳動物ポリペプチドおよび該哺
   乳動物ポリペプチドに隣接した選択的開裂部位を含んで
   いる請求項１に記載の方法。 １２．血清タンパクが、それに先行する、あるいは後続
   する付加的タンパクを伴うことなく発現され、該微生物
   の内因性タンパク分解酵素による細胞内分解に抵抗し得
   るものである請求項６に記載の方法。 １３．該ＤＮＡの前には開始コドンがあり、該ＤＮＡの
   直後には１またはそれ以上の終止コドンがある請求項１
   に記載の方法。 １４．ポリペプチドがそれ自身として生産される請求項
   １３に記載の方法。 １５．ＤＮＡがインビトロに於いて化学的に合成された
   ものである請求項１に記載の方法。 １６．ポリペプチドが、先行する、そして／または後続
   する付加的タンパクを伴っていない哺乳動物ポリペプチ
   ドであって、該微生物の内因性タンパク分解酵素による
   細胞内分解に抵抗し得るものであり、発現制御領域がオ
   ペロンの一部を含んでいるものである請求項１５に記載
   の方法。 １７．発現制御領域が誘導し得るものであり、ポリペプ
   チドの発現は発現の誘導前は、発現制御領域により制御
   されている請求項１６に記載の方法。 １８．微生物が細菌であり、ＤＮＡが細菌にとって好ま
   しいコドンからなっている請求項１７に記載の方法。 １９．ポリペプチドが血清タンパクを含んでいる請求項
   １６に記載の方法。 ２０．ポリペプチドがホルモンとして活性な哺乳動物ホ
   ルモンを含んでいる請求項１６に記載の方法。 ２１．ポリペプチドが哺乳動物ポリペプチドおよび該ポ
   リペプチドに隣接した選択的開裂部位を含んでいる請求
   項１５に記載の方法。 ２２．哺乳動物ポリペプチドがヒトインシュリンのＡ鎖
   またはＢ鎖である請求項２１に記載の方法。 ２３．ポリペプチドが該微生物から、不溶性の形体で回
   収される請求項１８に記載の方法。 ２４．ポリペプチドが細胞培養から不溶性の形体で回収
   される請求項１に記載の方法。 ２５．ＤＮＡがcＤＮＡを含んでいる請求項２４に記載
   の方法。 ２６．ＤＮＡがインビトロに於いて化学的に合成される
   請求項２４に記載の方法。 ２７．ＤＮＡが細菌にとって好ましいコドンを含んでい
   る請求項２６に記載の方法。 ２８．ポリペプチドが哺乳動物ポリペプチドおよび該ポ
   リペプチドに隣接した選択的開裂部位を含んでいる請求
   項２４に記載の方法。 ２９．ポリペプチドが、先行する、そして／または後続
   する付加的タンパクを伴っていない哺乳動物ポリペプチ
   ドであって、該微生物の内因性タンパク分解酵素による
   細胞内分解に抵抗し得るものである請求項２４に記載の
   方法。 ３０．ポリペプチドが、実質的にヒトインシュリンのＡ
   鎖またはＢ鎖からなる哺乳動物ポリペプチドを含んでい
   る請求項２８に記載の方法。 ３１．ポリペプチドが血清タンパクを含んでいる請求項
   ２８に記載の方法。 ３２．ポリペプチドがホルモン活性を有する哺乳動物ホ
   ルモンを含んでいる請求項２８に記載の方法。 ３３．発現制御配列がオペロンの一部を含んでいる請求
   項２４に記載の方法。 ３４．ＤＮＡが、先行する、そして／または後続する付
   加的タンパクを伴っていない哺乳動物ポリペプチドであ
   って、該微生物の内因性タンパク分解酵素による細胞内
   分解に抵抗し得るポリペプチドをコードしている請求項
   １に記載の方法。 ３５．ポリペプチドが哺乳動物ポリペプチドであり、該
   微生物から不溶性の形体で回収される請求項３４に記載
   の方法。 ３６．ＤＮＡがcＤＮＡを含んでいる請求項３５に記載
   の方法。 ３７．ＤＮＡがインビトロに於いて化学的に合成された
   ものである請求項３５に記載の方法。 ３８．微生物が細菌であり、ＤＮＡが細菌にとって好ま
   しいコドンを含んでいる請求項３７に記載の方法。 ３９．発現制御配列が誘導し得るものであり、ポリペプ
   チドの発現が、発現の誘導以前は、発現制御領域の下に
   抑制されている請求項３５に記載の方法。 ４０．ポリペプチドが血清プロテインを含んでいる請求
   項３８に記載の方法。 ４１．ポリペプチドがホルモンとしての活性を有する哺
   乳動物ホルモンである請求項３８に記載の方法。 ４２．発現制御領域がオペロンの一部を含んでいる請求
   項４１に記載の方法。 ４３．複製可能なクローニングビーイクルがpＩＡ１で
   ある請求項２２〜請求項３０のいずれかに記載の方法。 ４４．複製可能なクローニングビーイクルがpＩＢ１で
   ある請求項２２〜請求項３０のいずれかに記載の方法。 ４５．該ＤＮＡが（a）先行する、そして／または後続
   する付加的タンパクを伴っておらず、該微生物の内因性
   のタンパク分解酵素による細胞内分解に抵抗し得るポリ
   ペプチドをコードしており、（b）インビトロで化学的
   に合成されたものであり、該ポリペプチドが、細胞培養
   から不溶性の形体で回収される請求項１に記載の方法。 ４６．あらかじめ定められた機能的哺乳動物ポリペプチ
   ドを含んでいるポリペプチドを微生物細胞培養中で生産
   する方法であって、 （ｉ）先行する、および／または後続する付加的タンパ
   クを伴っていないポリペプチドであって、該微生物の内
   因性タンパク分解酵素による細胞内分解に抵抗し得るポ
   リペプチドをコードしているＤＮＡをインビトロに於い
   て化学的に合成し、 （ii）該ＤＮＡを、該微生物にとってホモローガスな発
   現制御配列のコントロール下にくる様、複製可能なクロ
   ーニングビーイクルに結合させ、 （iii）該クローニングビーイクルで形質転換した微生
   物中で該ポリペプチドを発現させ、 （iv）該ポリペプチドを細胞培養から回収する、ことか
   らなる方法。