FI64813C - Foerfarande foer producering av ett utvalt aeggviteaemne och vid foerfarandet anvaenda rekombinantplasmidvektorer - Google Patents

Foerfarande foer producering av ett utvalt aeggviteaemne och vid foerfarandet anvaenda rekombinantplasmidvektorer Download PDF

Info

Publication number
FI64813C
FI64813C FI804081A FI804081A FI64813C FI 64813 C FI64813 C FI 64813C FI 804081 A FI804081 A FI 804081A FI 804081 A FI804081 A FI 804081A FI 64813 C FI64813 C FI 64813C
Authority
FI
Finland
Prior art keywords
gene
dna sequence
dna
protein
plasmid
Prior art date
Application number
FI804081A
Other languages
English (en)
Swedish (sv)
Other versions
FI64813B (fi
FI804081L (fi
Inventor
Ilkka Antero Palva
Original Assignee
Ilkka Antero Palva
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Ilkka Antero Palva filed Critical Ilkka Antero Palva
Priority to FI804081A priority Critical patent/FI64813C/fi
Priority to CH8157/81A priority patent/CH668080A5/de
Priority to CH4425/85A priority patent/CH659480A5/de
Priority to CA000392892A priority patent/CA1211726A/en
Priority to GB8138726A priority patent/GB2091268B/en
Priority to DE3152001A priority patent/DE3152001A1/de
Priority to DE3153403A priority patent/DE3153403C2/de
Priority to AT0560181A priority patent/AT380695B/de
Priority to SE8107812A priority patent/SE452632B/sv
Priority to JP56216094A priority patent/JPS57132895A/ja
Priority to FR8124482A priority patent/FR2501230B1/fr
Priority to BE0/206962A priority patent/BE891659A/fr
Priority to FI820860A priority patent/FI64814C/fi
Publication of FI804081L publication Critical patent/FI804081L/fi
Priority to FR8307570A priority patent/FR2526040B1/fr
Application granted granted Critical
Publication of FI64813B publication Critical patent/FI64813B/fi
Priority to GB08332576A priority patent/GB2133408B/en
Publication of FI64813C publication Critical patent/FI64813C/fi
Priority to AT261884A priority patent/AT380696B/de
Priority to CA000479868A priority patent/CA1211061A/en
Priority to SE8702885A priority patent/SE453513B/sv
Priority to US07/129,357 priority patent/US5010015A/en
Priority to US07/129,356 priority patent/US5010000A/en
Priority to JP2102749A priority patent/JPH03206889A/ja
Priority to US07/947,888 priority patent/US5380653A/en

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
    • C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12N9/2405—Glucanases
    • C12N9/2408—Glucanases acting on alpha -1,4-glucosidic bonds
    • C12N9/2411—Amylases
    • C12N9/2414—Alpha-amylase (3.2.1.1.)
    • C12N9/2417—Alpha-amylase (3.2.1.1.) from microbiological source
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • C07K14/555—Interferons [IFN]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/52—Genes encoding for enzymes or proenzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/74—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora
    • C12N15/75—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora for Bacillus
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/78—Hydrolases (3) acting on carbon to nitrogen bonds other than peptide bonds (3.5)
    • C12N9/86—Hydrolases (3) acting on carbon to nitrogen bonds other than peptide bonds (3.5) acting on amide bonds in cyclic amides, e.g. penicillinase (3.5.2)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/02—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a signal sequence
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/036—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif targeting to the medium outside of the cell, e.g. type III secretion
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/55—Fusion polypeptide containing a fusion with a toxin, e.g. diphteria toxin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/61—Fusion polypeptide containing an enzyme fusion for detection (lacZ, luciferase)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/70—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction
    • C07K2319/74—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction containing a fusion for binding to a cell surface receptor
    • C07K2319/75—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction containing a fusion for binding to a cell surface receptor containing a fusion for activation of a cell surface receptor, e.g. thrombopoeitin, NPY and other peptide hormones

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Description

1 6481 3 iienetelir.ä valikoidun valkuaisaineen tuottamiseksi ja menetelmässä käytettäviä rekombinanttiplasmidivektoreita
Keksinnön kohteena on menetelmä valikoidun valkuais-5 aineen tai sen osan tuottamiseksi Bacillus-subtilis bakteereissa, liittämällä DNA, joka koodittaa valikoitua valkuaisainetta tai sen biologisen aktiivisuuden kannalta olennaista osaa sinänsä tunnetulla yhdistelmä-DNA-tekniikalla re-kombinanttiplasmidivektoriin, joka on saatu katkaisemalla 10 Bacillus-suvun erittyvä valkuaisainegeeni sen säätelyosaa seuraavan erittymissignaalin tai sen erittymisen kannalta olennaisen osan jälkeen, ja liittämällä geeni Bacillus-su-vun bakteereissa useana kopiona esiintyvään plasmidiin, transformoimalla Bacillus-subtilis-isäntäbakteeri saadulla 15 yhdistelmä-DNA-molekyylillä ja viljelemällä transformoituja bakteereja sinänsä tunnetuin menetelmin erittyvän valkuaisaineen tuottamiseksi. Keksinnön kohteena on myös re-kombinanttiplasmidivektori, joka koostuu Bacillus-suvun bakteereissa useina kymmeninä kopioina esiintyvästä palsmi-20 dista, pUB 110 tai sen olennaisesta osasta, joka on modifioitu niin, että se sisältää Bacillus amyloliguefaciens* in ^-amylaasi-geenin säätely- ja erittymissignaalit, johon rekombinanttiplasmidivektoriin voidaan liittää mikä tahansa valkuaisainetta koodaava geeni. y ' 25 Näitä rekombinanttiplasmidivektoreita voidaan käyt tää minkä tahansa valkuaisaineen tuottamiseen Bacillus-su-vun bakteereissa.
Viimeaikainen kehitys molekyylibiologiassa on avannut uusia mahdollisuuksia proteiinien tuotolle bakteereis-30 sa yhdistelmä-DNA-tekniikkaa käyttäen. Yhdistelmä-DNA-tek-niikan avulla on mahdollista tuottaa prokaryootti- ja eu-karyoottisolujen proteiineja bakteereissa liittämällä halutun proteiinin geeni johonkin isäntäbakteerin oman geenin säätely-yksikköön, jolloin mikä tahansa vieras geeni saadaan 35 ilmentymään. Lisäksi halutun geenin kopioiden määrä solussa voidaan nostaa liittämällä geeni sellaiseen plasmidi- 2 6481 3 tai virusmolekyyliin, joka esiintyy solussa useana, yleensä 10 - 100 kopiona. Kun tietyn geenin kopiomäärä nousee solussa, on seurauksena yleensä myös geenin ilmentämän proteiinin synteesin vastaava lisääntyminen.
5 Useita tämäntyyppisiä kokeita on jo tehty käyttäen E. colia isäntäbakteerina. E. colin käytössä kloonausisän-tänä teollisessa proteiinituotannossa on kuitenkin seuraa-via haittoja: i) E. coli on ihmisen suolistobakteeri ja muodostaa 10 näin ollen massatuotannossa potentiaalisen terveysriskin ii) E. colia käytettäessä tuotteet jäävät solun sisään, minkä takia solut on ensin kerättävä, rikottava ja sen jälkeen haluttu tuote puhdistettava eroon solun muista komponenteista, joista osa on toksisia (E. colin endotok- 15 siini) iii) Tuotettaessa proteiineja solun sisään, voi vieras proteiini pilkkoutua solun sisäisten proteaasien vaikutuksesta tai vieras proteiini voi estää solun kasvua, jolloin kummassakin tapauksessa halutun proteiinin saanto pie- 20 nenee.
Merkittävä parannus teollisessa tuotannossa olisi, jos isäntäbakteeri pystyisi erittämään halutun geenituot-teen suoraan solun ulkopuolelle kasvualustaan ja jos voitaisiin siirtyä käyttämään E. colin sijasta jotain ei-pa-25 togeenista bakteeria. Proteiinin erittymisen solun ulkopuolelle on todettu aiheutuvan erittyvän proteiinin alkuosaa edeltävästä ns. signaalisekvenssistä ^Bloder, G. and Dob-berstein, B., J. of Cell Biology 67: 835 - 862 (1975)_7, joka on samanlainen pro- ja eukaroyyttisoluissa ^Wakesman 30 et ai., Biophysica Acta 604: 249 - 296 (1980 )_7 - Yhdistel-mä-DNA-tekniikka on tehnyt mahdolliseksi eristää minkä tahansa erittyvän proteiinin signaalisekvenssiä koodittavan DNA:n ja liittää sen haluttuun geeniin.
Patenttihakemuksessa FI 791 841 on tätä yleisperiaa-35 tetta sovellettu liittämällä vieras geeni (esimerkiksi insuliini) E. colin TEM β-laktamaasin keskellä sijaitsevaan 3 64813 restriktioentsyymin katkaisukohtaan, jolloin muodostunut fuusioproteiini saadaan erittymään E. colin kahden solu-kelmun väliseen ns. periplasmiseen tilaan. Vaikka tällä tavoin tuote voitaisiinkin suojata solun sisäisiltä pro-5 teaaseilta, säilyvät tässäkin menetelmässä E. colin käytön perusongelmat: potentiaalinen terveysriski massatuotannossa ja vaikeat eristys- ja puhdistusongelmat, koska tässäkin tapauksessa tuote jää vielä E. coli-solun sisään. Vastaavanlaisia erittyviä hybridiproteiineja on E. colissa 10 tehty myös geenifuusiotekniikalla T^asadaban, M. Proc.
Natl. Acad. Sei. USA 72: 809 - 813 (1975)J.
Bacillus-suvun bakteerien käyttö kloonausisäntänä on vasta alkamassa johtuen E. coliin verrattuna vähäisestä tiedon ja tekniikan määrästä tämän suvun bakteereista 15 ^Gryczan, T. et ai., Molecular General Genet. 177: 459-467 (1979), Keggins, K. M. et. ai., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 75: 1423 - 1427 (1978), Yoneda, Y. et ai., Biochem. Biophys. Res. Commun. 91 : 1556 - 1564 (1979)_7. Koska Bacillus-suvun bakteerit kuitenkin erittävät suoraan kasvualustaansa usei-20 ta eri proteiineja, esim. proteaaseja, ot-amylaasia, ribo-nukleaasia ja penisillinaasia priest, F., Bacteriol. Rev.
41 : 711 - 753 (1977),7 ja useat näistä bakteereista ovat apatogeeneja, muodostavat ne potentiaalisesti tärkeän kloo-nausisäntäryhmän teollista proteiinituotantoa kehitettäessä. 25 FI-hakemusessa 810 722 on vastaavaa yleisperiaatetta käytetty muodostamalla Bacillus-vektori, jossa vieras geeni on liitetty B. lieheniformiksesta peräisin olevan penP-gee-nin promoottori- ja signaaliosaan. Paitsi, että geenin il-mentymistaso on huomattavasti alhaisempi kuin esillä olevan 30 keksinnön mukaisesti käytetyllä «*-amylaasigeenillä (Palva, I. Gene, painossa) on penP-geenin tuotteen erittymissignaa-li varsin poikkeuksellinen raktenteeltaan /Lai et ai.,
Proc. Natl. Acad. Sei. USA 78: 3506 - 3510 (1981), Nielsen, J. et ai., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 78: 3511 - 3515 35 (1981).7, mistä johtunee se, että suuri osa syntetisoidusta proteiinista jää kiinni solun seinään. Penisillinaasin tai sen signaaliin liitetyn vieraan geenin tuotteen vapautumi- 4 6481 3 nen kasvualustaan ilmeisesti vaatii solun epäspesifisten eksoproteaasien vaikutusta, joista vieraan geenituotteen säilymisen takia on välttämättä päästävä eroon (Palva, I, FT väitöskirja, painossa). Niin ollen Bacilluksen käytön 5 merkittävä etu, tuotteen erittyminen suoraan kasvualustaan jää penP-geeniä käytettäessä saavuttamatta, »-amylaasi ja sen signaalisekvenssiin liitetyt tuotteet erittyvät sen sijaan tehokkaasti suoraan kasvualustaan.
Tässä keksinnössä kuvataan menetelmiä B. amylolique-10 faciens ^amylaasin promoottori- ja signaaliosan eristämisestä ja erityisen erittymisvektorin konstruoimisesta minkä tahansa vieraan proteiinin tuottamiseksi Bacillus-suvun bakteerien kasvualustaan. B. amyloliguefaciens «“-amylaasin geeni valittiin erittymisvektorin valmistamiseen, koska se 15 sisältää tehokkaan promoottoriosan ja kaikki syntetisoituva entsyymi erittyy kasvualustaan.
Kuviossa 1 on kaavio c*-amylaasia koodattavan geenin eristämisestä Bacillus amyloliquefaciens-bakteerista. Koko bakteerin genomi pilkotaan restriktioenstyymillä. Halutun 20 kokoiset DNA-pätkät liitetään yhteen restriktioenstyymillä avatun plasmidimolekyylin kanssa. Tämän keksinnön mukaisesti bakteerin genomi voidaan pilkkoa restriktioenstyymillä Mbo I ja plasmidina voidaan käyttää pUB 110:tä, joka voidaan avata restriktioentsyymillä BamH I. On huomattava, 25 että vastaava yhdistelmä-DNA-molekyyli voidaan valmistaa myös muita restriktioenstyymejä tai plasmideja käyttämällä ja alaan perehtynyt asiantuntija voi valita erilaisia res-triktioentsyyni-plasmidi-yhdistelmiä poikkeamatta tämän keksinnön piiristä.
30 DNA-pätkien ja plasmidimolekyylien yhdistämisen jäl keen syntyneet yhdistelmä-DNA-molekyylit siirretään isäntä-bakteeriin ja näiden joukosta seulotaan ne bakteerisolut, jotka ovat saaneet plasmidiin liittyneen «-amylaasia koodattavan geenin. Seulonta perustuu transformoidun solun saa-35 maan kykyyn tuottaa «-amylaasia.
Isäntäbakteerina keksinnössä käytetään B. subtilis-kantaa. Kun kantaan on siirretty em. yhdistelmä-DNA-mole- 5 64813 kyyli, esiintyy <*-amylaasia koodittava geeni kannassa noin 50 kopiona. Tämä lisää kannan <*-amylaasituotannon noin 2 500 kertaiseksi normaaliin B. subtilis-kantaan verrattuna .
5 Yhdistelmä-DNA-molekyyli eristetään B. subtilis-kan- nasta ja karakterisoidaan restriktioentsyymien ja emäsjärjestyksen määrittämisen avulla. Kuviossa 2 esitetään saadun yhdistelmä-DNA-molekyylin pKTHIO <*-amylaasi-geenissä tai sen säätelyosassa sijaitsevat ainutkertaiset restriktio-10 entsyymien katkaisukohdat ja yhdistelmä-DNA-molekyylin yleinen rakenne. Kuvioissa 3a ja b esitetään «-amylaasi-geenin täydellinen emäsjärjestys.
Keksinnön kohteena oleva rekombinanttiplasmidivek-tori koostuu Bacillus «x-amylaasi-geenin säätely- ja erit-15 tymissignaaleista ja Bacillus-suvun bakteereissa useina kopioina esiintyvästä plasmidimolekyylistä siten, että minkä tahansa valkuaisaineen geeni voidaan liittää <x-amy-laasi-geenin erittymissignaalin perään, jolloin haluttua valkuaisainetta voidaan tuottaa Bacillus-suvun bakteerissa. 20 oi-amylaasi-geenin sisältävästä yhdistelmä-DNA-mole- kyylista poistetaan ensin suurin osa ot-amylaasin rakenne-geeniä EcoR I-restriktioentsyymikäsittelyllä. Näin saatu DNA-molekyyli avataan restriktioentsyymillä ja sitä lyhennetään lopun ot-amylaasi-geenin rakenneosan poistamiseksi 25 eksonukleaasi-III:11a ja S1-nukleaasilla tai BAL31-nukle-aasilla, minkä jälkeen molekyylin päiden kaksisäikeisyys varmistetaan käänteistranskriptaasientsyymillä. Tämän jälkeen avattuun ja lyhennettyyn molekyyliin liitetään DNA-liittäjämolekyyli (DNA-linker). hiittäjämolekyylin sijain-30 ti yhdistelmä-DNA-molekyylissä määritetään tutkimalla liitoskohdan DNA-emäsjärjestys. Tähän liittäjämolekyylissä olevaan restriktioentsyymin avaamiskohtaan voidaan liittää minkä tahansa muun valkuaisaineen rakennegeeni, esimerkik-si E. colin /^-laktamaasi-geeni tai minkä tahansa <*-,/? -35 tai Y-interferonin aminohappoja koodittava DNA-jakso tai sen osa. Liitetyn geenin koodittamaa valkuaista syntyy nyt Bacillus-suvun bakteerissa ot-amylaasigeenin säätely- ja 6 6481 3 erittymissignaalien avulla.
Keksinnön avulla voidaan tuottaa mitä hyvänsä valkuaisainetta.
Seuraavassa esitetään yksityiskohtainen selostus kek-5 sinnön mukaisten yhdistelmä-DNA-molekyylien valmistamisesta ja niiden siirtämisestä isäntäbakteeriin sekä sovellutusesimerkit valikoitujen valkuaisaineiden tuottamiseksi transformoidulla isäntäbakteerilla.
Genomin eristys, puhdistus ja pilkkominen Bacillus-10 suvun bakteereista
Bakteerikantana käytettiin B. amyloliquefaciens-kan- taa. Kanta kasvatettiin yli yön rikkaassa ravintonesteessä,
solut kerättiin ja pestiin 0,0015M natriumsitraatti-0,01M
11
NaCl-puskurilla. Pestyt solut suspendoitiin (2.10 solua
15 eli 200 ml:n viljelyerä) 2 mitään 20-% w/v sakkaroosi-50mM
Tris-HCl-liuosta (pH 8,0). Tähän lisättiin 20 mg lysotsyy- (S) miä, 20 mg pronaasia ja 2 ml 1-% w/v Sarkosyl **-0,1*1 EDTA-liuosta (pH 8,0) ja inkuboitiin 15 tuntia 37°C:ssa. Saatuun lysaattiin lisättiin 6,5 ml H20 ja kiinteää CsClta sellai-20 nen määrä, että lysaatin taitekertoimeksi tuli 1,4100, jonka jälkeen lysaatti sentrifugoitiin; Beckman Ti 50-root-tori, 36 000 rpm 48 tuntia 10°C. Sentrifugoitu lysaatti jaettiin fraktioihin ja ne fraktiot, jossa bakteerin geno-mi viskositeetin perusteella arvioiden sijaitsi, kerättiin 25 talteen ja dialysoitiin 30 tuntia 10mM tris-HCl-1mM EDTA-0,1M NaCl-puskuria (pH 8,0) vastaan 4°C:ssa.
Näin saatu genomipreparaatti uutettiin kolme kertaa fenolilla ja fenoli poistettiin eetteriuutoksella. DNA puhdistettiin sentrifugoimalla lineaarisessa 15-r>30-% w/v 30 sakkaroosi-0,1M NaCl-50mM Tris-HCl-1mM EDTA, 0,1 % natrium-lauryylisulfaatti (pH 8,0)-gradientissa; Beckman SW 27-roottori, 22 000 rpm 16 tuntia 22°C, jonka jälkeen gradi-entti fraktioitiin ja ne fraktiot, joissa DNA-pätkien koko
C
oli M 5.10 daltonia, otettiin talteen ja DNA saostettiin 35 etanolilla.
Täten eristetty B. amyloliquefaciens-genomipreparaattl-pilkottiin epätäydellisesti restriktioentsyymillä Mbo I, ja 7 6481 3 pilkotut DNA-pätkät eroteltiin kokonsa mukaan yllä kuvatussa sakkaroosigradientissa, Beckman SW 27-roottori 22 000 rpm, 16 tuntia 22°C. Ne fraktiot, joissa olevien DNA-pät-kien koko oli 1,5 - 5.106 daltonia, otettiin talteen ja 5 DNA saostettiin etanolilla.
Siirtovektorin eristys ja pilkkominen restriktioent-syymillä
Siirtovektorina käytettiin plasmidia pUB 110. Plas-midi eristettiin ja puhdistettiin Bacillus subtilis-kannas-10 ta SB202, kuten aiemmin on kuvattu (Gryczan et al·., J.
Bacteriol. 134, 318 - 329, 1978). Puhdistettu plasmidipre-paraatti pilkottiin restriktioentsyymillä BamH I, jolla on ainoastaan yksi katkaisukohta plasmidimolekyylissä. Plas-midimolekyylin lineaarisuus tarkistettiin geelielektrofo-15 reesin avulla.
B. amyloliquefaciens-genomin pätkien liittäminen siirtovektoriin
Mbo I-entsyymillä pilkotut ja koon mukaan valitut B. amyloliquefaciens-genomin pätkät sekoitettiin yhteen BamH 20 I-entsyymillä avatun pUB 110 plasmidin kanssa 10mM Tris-HCl-1mM EDTA-puskurissa (pH 8,0) DNA-moolisuhteessa 1:3, kokonaistilavuuden ollessa 120 μ1 ja DNA:n kokonaiskonsen-traation ollessa 180 jug/ml. Seosta kuumennettiin viisi minuuttia 65°C:ssa ja jäähtyneeseen seokseen lisättiin 13 25 μΐ 66mM Tris-HCl-6,6mM MgCl2-10mM ditiotreitoli-1mM ATP-puskuria (pH 7,8) ja 5 jul T^-DNA-ligaasia (10 Weiss-yksik-köä). Ligaatioseosta inkuboitiin kolme tuntia 23°C:ssa ja ligaatiotapahtuman tulos tarkistettiin geelielektroforee-sin avulla.
30 Yhdistelmä-DNA-molekyylin siirto isäntäbakteeriin
Isäntäbakteerina käytettiin B. subtilis 1A197-kantaa, jonka genotyyppi oli sacA321, metB5, arol 907, amy . Kanta saatiin Bacillus Genetic Stock Center'istä (Ohio State University, USA) ja siinä oleva Amy -ilmaisu kartoitettiin 35 bakteerigeneettisillä menetelmillä mutaatioksi <*-amylaasia koodittavan entsyymin rakennegeenissä. Kanta tehtiin kompetentiksi eli kykeneväksi ottamaan sisäänsä DNA:ta aiemmin 8 6481 3 kuvatulla menetelmällä (Anagnostopoulos et ai., J. Bacte-riol. 81, 741 - 746 (1961). Edellisessä kohdassa ligaatiol-la valmistetut yhdistelmä-DNA-molekyylit sekoitettiin kompetentiksi tehtyjen isäntäbakteerien kanssa ja seosta pi-5 dettiin 30 minuuttia 37°C:ssa. Tämän jälkeen seos levitettiin bakteerimaljoille, joissa käytettiin kanamysiini-antibioottia estämään kaikkien niiden bakteerien kasvu, jotka eivät saaneet plasmidia sisäänsä. Maljoja pidettiin 30 tuntia 37°C:ssa, jolloin plasmidin tai siihen liittyneen 10 B. amyloliquefaciens-genomin pätkän saaneet isäntäbaktee-rit kasvoivat pieniksi pesäkkeiksi.
Sellaisten isäntäbakteerien löytäminen, joissa on B. amyloliguefaciensin <*-amylaasia koodittava geeni plasmidiin pUB 110 liittyneenä 15 Edellisessä kohdassa kuvatut bakteeripesäkkeet repli koitiin uusille elatusainemaljoille, jotka kasvatettiin 30 tuntia 37°C:ssa. Saadut bakteeriviljelmät käsiteltiin I-KI-liuoksella aiemmin kuvatun menetelmän mukaisesti β3. Bacterid. 1 19, 416 - 424 (1974)_7, jolloin sellaisten bakteeri-20 pesäkkeiden ympärille, jotka olivat saaneet <*-amylaasia koodittavan geenin sisältämän yhdistelmä-DNA-molekyylin, muodostui kirkas rengas. Tällaisten pesäkkeiden vastinpe-säke poimittiin alkuperäiseltä bakteerimaljalta ja siinä oleville bakteereille suoritettiin useita peräkkäisiä puh-25 distusviljelyjä.
Yhdistelmä-DNA-molekyylin pKTHlO eristys ja karakterisointi
Yhdistelmä-DNA-molekyyli pKTH10 eristettiin ja puhdistettiin isäntäbakteerista aiemmin kuvatulla menetelmällä 30 (Gryczan et ai., J. Bacteriol. 134, 318 - 329 (1978). Molekyyli karakterisoitiin eri restriktioentsyymien avulla ja «•-amylaasia koodittavan geenin sijainti määritettiin alustavasti seuraamalla geenin inaktivoitumista liitettäessä yhdistelmä-DNA-molekyylin eri kohtiin ylimäärisiä DNA-pät-35 kiä. Tämän jälkeen *-amylaasia koodittavan geenin emäsjärjestys määritettiin aiemmin kuvatulla menetelmällä (Maxam, A. ja Bilbert, W., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 74, 560-564 9 64813 (1977)7. Kuvioissa 3a ja b on merkitty οί-amylaasigeenin nukleotidisekvenssin yläsäie 5'—)3' suuntaan. Clal res-triktioentsyymin katkaisukohta on mielivaltaisesti valittu nukleotidiksi 1. Geenin koodittavan alueen aminohappojär-5 jestys on merkitty vastaavien nukleotidien yläpuolelle.
Päälleviivattuna on 5'-päästä lähtien promoottorialue, Sig-naalisekvenssialue (aminohapot -31...-1) ja transkription terminaatioalue. Tähdet kohdissa 1718, 1719 ja 1720 kuvaavat ^-amylaasigeenin translaation stop-kodonia.
10 EcoR I-fragmentin poisto plasmidista pKTHIO
Plasmidi pKHT avattiin EcoR I-katkaisukohdasta (kuvio 2) . Saadut DNA-pätkät (noin 1 Aig) ligoitiin uudelleen yhteen 66mM Tris-HCl-6,6mM MgC^-IOmM ditiotreitoli-1mM ATP-puskurissa (pH 7,8), johon lisättiin 0,5 m1 T^-DNA-ligaasia 15 (2 Weiss-yksikköä). Ligaatioseosta inkuboitiin kolme tuntia 23°C:ssa, jonka jälkeen sillä transformoitiin kompetentti B. subtilis IHO 6064-kanta (Kansanterveyslaitos, Helsinki), edellä kuvatulla tavalla. Solut levitettiin kanamysiiniä sisältäville bakteerimaljoille ja kasvatettiin yli yön 20 3 7°C: ssa. Saaduista tranformanteista seulottiin I-KI-mene- telmällä tärkkelysmaljoilla edellä kuvatulla tavalla «-amy-laasinegatiivinen pesäkse ja tästä eristettiin plasmidi edellä kuvatulla tavalla /(Sryczan et ai., J. Bacteriol. 134, 318 - 329 (1978)]. Saadusta plasmidipreparaatista pKTH29, 25 EcoR I-Kpn I-Hind III-EcoR I-fragmentin puuttuminen tarkistettiin geelielektroforeesin avulla.
Plasmidin pKTH29 pienentäminen eksonukleaasikäsitte- lyllä
Plasmidi pKTH29 (100 «1, 500 ug/ml) avattiin EcoR I 30 restriktioentsyymillä. Tämän käsittelyn jälkeen liuokseen lisättiin 0,5 Ml 1M ditiotreitolia ja 10 m1 eksonukleaasi III (0,25 yks. Biolabs.). Liuosta inkuboitiin 1-3 minuuttia 37°C:ssa ja reaktio pysäytettiin 70°C vesihauteessa. DNA saostettiin liuoksesta etanolilla ja liuotettiin 0,3M NaCl-35 0,03M natriumasetaatti-3mM ZnC^-puskuriin (pH 4,5). Tähän lisättiin 10 Ml S1-nukleaasia (25 yks./ml, Boehringer Mannheim) ja inkuboitiin 30 minuuttia 37°C:ssa ja 10 minuuttia 1° 6481 3 4°C:ssa. Inkubointien jälkeen preparaatti uutettiin fenolilla, fenoli poistettiin eetteriuutolla ja DNA saostettiin etanolilla. Kuivattu DNA liuotettiin 40 ul:aan 1OmM Tris-HCl-1mM EDTA-puskuria (pH 8,0), tähän lisättiin 10 ui 150mM 5 Tris-180mM KCl-40mM MgCl2“3,0mM ditiotreitoli-puskuria (pH 8,3), 5 ui dNTP-seosta, jossa kunkin nulkeotiditrifosfaatin 1OmM liuosta on sekoitettu ekvimolaarisessa suhteessa ja 2 ui käänteistranskriptaasientsyymiä (Beard, 13 yks./uD· Liuosta inkuboitiin 30 minuuttia 37°C:ssa ja reaktio py-10 säytytettiin inkuboimalla seitsemän minuuttia 65°C:ssa. DNA puhdistettiin preparatiivisen agaroosi-elektroforeesin avulla (LTG, Low Gelling Temperature) ja etidiumbromilla värjätyt plasmidivyöhykkeet leikattiin irti geelistä. DNA uutettiin agaroosista fenolilla 65°C:ssa, fenoliuutto tois-15 tettiin 20°C:ssa ja fenoli poistettiin eetteriuutolla. DNA saostettiin etanolilla, sakka pestiin 70-%:isella etanolilla ja kuivattiin.
Liittäjämolekyylien fosforylaatio ja liittäminen plasmidiin
20 10 ui:aan EcoR I liittäjämolekyyliliuosta (EcoR I
linker, Collaborative Research, 50 ug/ml) lisättiin 5 ui 32PY ATP (10mCi/ml, 3 000 Ci/mol), 1,7 ui 660mM Tris-HCl-66mM MgC^-IOmM ditiotreitoli-puskuria (pH 8,0) ja 0,5 ui T^-polynukleotidikinaasia. Liuosta inkuboitiin 30 minuut-25 tia 37°C:ssa, jonka jälkeen lisättiin 5 ui 10mM ATP:a ja inkubointia jatkettiin 30 minuuttia 37°C:ssa. Edellä kuvattu kuivattu eksonukleaasikäsitelty pKTH29-preparaatti liuotettiin 5 ui:aan edellä kuvattua fosforyloitua EcoR I liittä jämolekyyliä sisältävää liuosta. Liuokseen lisättiin 0,5 30 ui 1OmM ATP, 0,5 ui 1mM sperimidiiniä ja 0,5 ui T^-DNA-li-gaasia (2 Weiss-yksikköä). Liuosta inkuboitiin kolme tuntia 23°C:ssa, jonka jälkeen se laimennettiin 20 ul:ksi 40mM Tris-HCl-1OOmM NaCl-10mM MgC^-puskurilla (pH 7,6). Tähän lisättiin 15 yksikköä EcoR I entsyymiä (Biolabs.) ja liuos-35 ta inkuboitiin 12 tuntia 37°C:ssa. Reaktio pysäytettiin inkuboimalla 10 minuuttia 65°C:ssa. EcoR I-käsitelty preparaatti geelisuodatettiin 1 ml:n Sepharose 4B-pylvään läpi.
11 6481 3
Suodatuksessa käytettiin eluutiopuskurina 2mM Tris-HCl-0,1mM EDTA-puskuria (pH 7,5). Suodos kerättiin 35 /ul:n fraktioina ja plasmidia sisältävät fraktiot tunnistettiin radioaktiivisuuden perusteella, kerättiin yhteen ja kuivat-5 tiin. Kuivattu DNA liuotettiin 20 ui:aan 66mM Tris-HCl-6,6mM MgCl2-10mM ditiotreitoli-puskuria (pH 8,0) ja tähän lisättiin 1,5 ui 1OmM ATP ja 0,3 μΐ T4~DNA-ligaasia. Liuosta inkuboitiin kolme tuntia 23°C:ssa ja tämän jälkeen plasmidipreparaatilla transformoitiin kompetentti B. subti-10 lis IHO 6064-kanta (Kansanterveryslaitos, Helsinki) ja solut viljeltiin kanamysiiniä sisältäville bakteerimaljoille.
Transformaateista eristettiin plasmidit aiemmin kuvatulla menetelmällä ,/Gryczan et ai., J. Bacteriol. 134, 318 - 329 (1978)7 ja plasmidit karakterisoitiin ensin gee-15 lielektroforeesin avulla ja sitten määritettiin niiden DNA-emäsjärjestys EcoR I-liittäjämolekyylin molemmilta puolilta. Näin plasmidista pKTH29 saatiin plasmidi pKTH38, jossa EcoR I-liittäjämolekyyli sijaitsee 90 nukleotidiparia erittymissignaalin katkaisukohdan jälkeen ot-amylaasin ra-20 kennegeenin alueella. Jotta liittäjämolekyyli saataisiin erittymissignaalin liitoskohtaan tai tämän välittömään läheisyyteen, avattiin plasmidi pKTH38 EcoR I:llä. Kolme 10 ug:n erää avattua plasmidia suspendoitiin kukin 115 )ulreen 2OmM Tris, 600mM NaCl, 12mM MgCl2, 12mM CaCl2, 1mM EDTA 25 pH 8,1-puskuria. Kuhunkin plasmidierään lisättiin 10 μΐ BAL-31 entsyymiä (BRL, 40 U/ml) ja putkia inkuboitiin viisi, kuusi ja seitsemän minuuttia 30°C-vesihauteessa. Reaktio pysäytettiin lisäämällä 0,5M EDTA:a, pH 8,0 siten, että loppukonsentraatioksi tuli 12mM. BAL-31 käsitellyt DNA-30 erät yhdistettiin, uutettiin kahdesti fenolilla ja saos-tettiin etanolilla. Etanolisakka suspendoitiin 75 ui:aan 63mM Tris, 6,3mM MgCl2, pH 8,0-puskuria ja liuokseen lisättiin 5 ui 1mM dATP:a, 1mM dGTPra, ImM dCTP:a ja 1mM dTTP:a sekä lopuksi 5 ui T4-polymeraasia (PL-Biochemicals, 5 U/ 35 /ui). Liuosta inkuboitiin 80 minuuttia 11°C:ssa. Reaktio py säytettiin 0,5M EDTA:11a, kuten yllä ja seos uutettiin fenolilla ja DNA saostettiin etanolilla. Etanolisakka liuo- 12 64 81 3 tettiin 250 -ui:aan 10mM Tris, 1mM EDTA pH 8,0 -puskuria. Tästä otettiin 55 ,ul/ johon lisättiin 50 ui fosforyloitua Hind III -liittäjämolemyyliä (BRL, 75 pmol), 5 ui 660mM Tris, 100mM MgC^, 50mM ditiotreitoli, pH 7,5 -puskuria ja 5 10 ui T4-DNA-ligaasia (BRL 2 U/ul). Seosta inkuboitiin 15 tuntia 15°C:ssa ja 10 minuuttia 65°C:ssa. DNA saostettiin isopropanolilla, DNA-sakka pestiin 70-%:isella etanolilla ja vakuumikuivauksen jälkeen suspendoitiin 100 ui:aan 1 OmM Tris, 50mM NaCl, 5mM MgCl, 5mM ditiotreitoli, pH 8,0 -pus-10 kuria. Suspensioon lisättiin 3 ui Hind III -restriktioent-syymiä (10 U/ul, BRL) ja inkuboitiin neljä tuntia 37°C:ssa ja 10 minuuttia 65°C:ssa, DNA puhdistettiin elektroforeesin avulla, 0,8-%:inen LGT-agaroosigeeli (Marine Colloids Inc.), 30 V, 15 tuntia. Lineaarinen plasmidivyöhyke leikattiin 15 geelistä, DNA uutettiin 65°C:ssa fenolilla ja saostettiin etanolilla. Etanolisakka liuotettiin 35 ul:aan 66mM Tris, 10mM MgCl, 5mM ditiotreitoli, pH 7,5 -puskuria, johon lisättiin 1,5 ui, 1OmM rATP:a ja 1,5 ui T4-DNA-ligaasia (Bet-hesda Research Laboratories, 2 U/ul). Seosta inkuboitiin 20 kolme tuntia 22°C:ssa ja transformoitiin kompetenttiin B. subtilis IHO 6135 -kantaan (Kansanterveyslaitos, Helsinki) ja solut viljeltiin kanamysiiniä sisältäville elatusaine-maljoille. Transformanteista eristettiin plasmidit aiemmin kuvatulla menetelmällä ja Hind III -liittäjämolekyylin si-25 jainti plasmideissa määritettiin DNA-sekvenssoinnin avulla. Täten saatiin sarja plasmideja, joissa Hind III -liittäjä-molekyyli sijaitsee välittömästi erittymissignaalin jälkeen tai eri asemissa erittymissignaalin katkaisukohdan jälkeen o—amylaasin rakennegeenin alueella: 6481 3 1¾ jj
*8 I
-I I f I
Ö ^ ^ ^ ^
It I B I jj ^ ^ 8888 8 8
I g ^SSSSSS
igg8g§SSSS§ S
^ I g gj ο δ 6 δ δ δ δ δ I I I I I I I I I I ί
I I I I I I 1 I I I I
ι ι I ι ι ι I [ ι ι ι
I I I I I I I I I I I
ι ι ι ι ι ι ι ι ι I I
I I I I I I I I I I I
I ! ! ί ! I ! ! ! ! ί 0}¾¾¾¾¾¾¾¾¾¾¾ H+J ΟΟΟΟΟϋΟΟΟΟΟ roajKEHpfitiHtipHfc-iP' 1¾¾¾¾¾¾¾¾¾¾¾¾ oOrHCNm-^rinvot^-oocrv rHunminminmininiTiLn 14 6481 3 Näihin Hind III -liittäjämolekyylien muodostamiin katkaisu-kohtiin voidaan liittää mikä tahansa halutun valkaisuaineen aminohappoja koodittava DNA-jakso ja saada, kuten seuraavis-ta käyttöesimerkeistä ilmenee, Bacillus-suvun bakteeri tuot-5 tamaan ja erittämään kasvualustaansa ko. valkuaisainetta.
Esimerkki 1 E. colin /'-laktamaasientsyymin tuottaminen Bacillus subtilis-kannasta
Plasmidi pKTH50 avattiin Hind ΙΙΙ-entsyymillä ja 10 avauskohtaan liitettiin E.colin /3-laktamaasia koodittava geeni (luonnon geeni), josta promoottori- ja erittymis-signaalialueet on poistettu. Saatu hybridiplasmidi transformoitiin kompetenttiin B. subtilis IHO 6140-kantaan (Kansanterveyslaitos, Helsinki), valikoitiin plasmidin saaneet 15 solut kanamysiiniresistenssin perusteella ja solut viljeltiin kanamysiiniä sisältäville elatusainemaljoille. Trans-formantit seulottiin laktamaasin tuoton suhteen suspendoi-malla kukin pesäke 100 ulraan 0,1mM nitrosefiini, 0,1M K-fosfaatti, pH 7,0-liuosta. Pesäkkeistä, jotka antoivat po-20 sitiivisen tuloksen nitrosefiinitestissä (liuoksen väri muuttui punaiseksi) , tehtiin nesteviljelmät tuotetun /?-lak-tamaasientsyymin aktiivisuuden määrittämiseksi. Kontrollina käytettiin B. substilis IHO 6140-kantaa, joka oli transformoitu plasmidilla pKTH50. Kannat kasvatettiin SMS-liuokses-25 sa (Spizizen minimal salts), johon oli lisätty 0,5 % glyserolia, 1 % liukoista tärkkelystä ja 5 ug/ml kanamysiiniä. Viljelmät kasvatettiin ravistellen 37°C:ssa. Noin viisi tuntia logaritmisen kasvuvaiheen jälkeen (Klettg-^Λ/ν 250) viljelmät sentrifugoitiin 10 000 g, viisi minuuttia ja su-30 pernatantti kerättiin talteen. Solut suspendoitiin 0,1M kaliumfosfaatti-puskuriin (pH 7,0) alkuperäiseen kasvutilavuu-teensa. Solu- ja supernatanttifraktioista määritettiin β -laktamaasiaktiivisuus seuraamalla nitrosefiinin hajoamista spektrofotometrisesti. Määrityksestä saatiin seuraavat tu-35 lokset: 15 6 4 81 3 *) y£-laktamaaslaktiivisuus (U/ml) solut supernatantti B. subtilis IHO 6140/pKTH50- /3-lakt. 60 3 000 5 B. subtilis IHO 6140/pKTH50 <10 <10 *) 1U -laktamaasia hajottaa 1 yumoolin penisilliini G:tä yhdessä minuutissa 37°C:ssa 10 Esimerkki 2
Leukosyytti-interferonin tuottaminen Bacillus sub-tilis-kannasta
Plasmidi pKTH53 avattiin Hind ΙΙΙ-entsyymillä ja avauskohtaan liitettiin leukosyytti-interferonia (0^-2) koo- 15 daava DNA-jakso (luonnon IFN CA-2-lähetti-RNA:sta käänteis- transkriptaasilla valmistettu komplementaarinen DNA), josta erittymissignaalia koodittava osa on poistettu. Saatu hybridi- plasmidi transformoitiin kompetenttiin B. subtilis IHO 6140- kantaan valikoimalla plasroidin saaneet solut kanamysiinire- 20 sistenssin perusteella. Transformantit seulottiin pesäkehyb- ridisaatiomenetelmällä /Grtinstein, M. ja Hogness, D.S., Proc.
Natl. Acad. Sei. USA 72, 3961 - 3965 (1975)7 käyttäen koet-1 25 timena (probe) J-merkattua interferonia koodittavaa DNA:ta. Interferoni-DNA:ta sisältävät bakteeripesäkkeet kasvatettiin 25 Luria-liemessä, johon oli lisätty 2 I liukoista tärkkelystä ja 5 ug/ml kanamysiiniä, ravistellen 37°C.ssa. Viljelmä sent-rifugoitiin neljä tuntia logaritmisen kasvuvaiheen jälkeen (Klettg^'wSOO) 10 000 g, viisi minuuttia. Supernatantti kerättiin talteen ja solut suspendoitiin alkuperäiseen kasvatus-30 tilavuuteensa 0,9-%:iseen NaCl-liuokseen. Solu- ja superna-tanttifraktioista määritettiin interferoniaktiivisuus. Kontrollina määrityksissä käytettiin B. subtilis IHO 6140/pKTH53-kantaa. Määrityksistä saatiin seuraavat tulokset: 35 >6 6481 3
Interferoni-aktiivisuus (I .U ./ml) _solut_supernatantti B. subtilis IHO 6140/ pKTH53-IF 3 000 200 000 5 B. subtilis IHO 6140 pKTH53 <20 <20
Esimerkki 3
Semliki Forest-viruksen E1-proteiinin tuottaminen 10 B. subtilis-kannasta
Plasmidi pKTH51 avattiin Hind ΙΙΙ-entsyymillä ja avauskohtaan liitettiin Semliki Forest-viruksen E1-proteiinia koodittava geeni ( SFV-viruksen genomista käänteistrans-skritptaasilla valmistettu komplementaarinen DNA), josta oli 15 poistettu promoottori, erittymissignaali ja E1-proteiinin hydrofobista loppuosaa koodittava DNA-jakso. Saatu hybridi-plasmidi transformoitiin kompetenttiin B. subtilis IHO 6140-kantaan valikoimalla plasmidin saaneet solut plasmidin koo-dittaman kanamysiiniresistenssin perusteella. Transformantit 20 seulottiin E1-proteiinia koodittavan DNA-jakson suhteen käyttämällä Griinstein-Hogness pesäkehybridisaatiotekniikkaa. Positiivisista pesäkkeistä varmistettiin E1-insertin oikea suunta restriktioentsyymikartoituksella. Pesäkkeet kasvatettiin Luria-liemessä, johon oli lisätty 10 jug/ml kanamysiiniä ja 25 kasvatuksen loppuvaiheessa 1mM fenyylimetyylisulfonyylifluo-ridia. E1-proteiinin tuotto analysoitiin soluista ja kasvu-liemestä käyttämällä immunoelektroforeesitekniikkaa. Tulokr set on esitetty kuviossa 4, Saadun tuloksen mukaan yli 90 % syntetisoidusta E1-proteiinista erittyy suoraan kasvualus-30 taan.
35

Claims (9)

6481 3
1. Menetelmä valikoidun valkuaisaineen tai sen osan tuottamiseksi Bacillus-subtilis bakteereissa, liittämällä DNA, 5 joka koodittaa valikoitua valkuaisainetta tai sen biologisen aktiivisuuden kannalta olennaista osaa sinänsä tunnetulla yh-distelmä-DNA-tekniikalla rekombinanttiplasmidivektoriin, joka on saatu katkaisemalla Bacillus-suvun erittyvä valkuaisaine-geeni sen säätelyosaa seuraavan erittymissignaalin tai sen 10 erittymisen kannalta olennaisen osan jälkeen ja liittämällä geeni Bacillus-suvun bakteereissa esiintyvään plasmidiin, transformoimalla Bacillus-subtilis-isäntäbakteeri saadulla yhdistelmä-DNA-molekyylillä ja viljelemällä transformoituja bakteereja sinänsä tunnetuin menetelmin erittyvän 15 valkuaisaineen tuottamiseksi, tunnettu siitä, että valikoitua valkuaisainetta koodaava DNA-jakso on liitetty rekombinanttiplasmidivektoriin, joka koostuu Bacillus-suvun bakteereissa useana kopiona esiintyvästä plasmidista, kuten plas-midista pUB 110 tai olennaisesta osasta sitä, ja Bacillus 20 amylollguefaclens’ in 06-amylaasi-geenin säätelyosasta ja erit-tymissignaalista tai sen erittymisen kannalta olennaisesta osasta.
2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, t u fine t t u siitä, että valikoitua valkuaisainetta koodittava
25 DNA-jakso on mikä tahansa 06-, /S- ja TMnterferonia tai niiden biologisesti aktiivista osaa koodittava geeni (DNA-jakso) .
3. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, t u n-n e t t u siitä, että valikoitua valkuaisainetta koodittava
30 DNA-jakso on E. colin /¾-laktamaasia tai sen biologisesti aktiivista osaa koodittava geeni (DNA-jakso).
4. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että valikoidun valkuaisaineen aminohappoja koodittava DNA-jakso tai valkuaisaineen biologisen aktiivisuuden kannalta olennainen osa siitä on liitetty johonkin 0C- 35 amylaasi-geenin seuraavista nukleotidijaksoista: 6481 3
51 CTG TTA TTT GTC AGT TTG CCG ATT ACA AAA ACA TCA GCC 3' GAC AAT AAA CAG TCA AAC GGC TAA TGT TTT TGT AGT CGG 5' CTG TTA TTT GTC AGT TTG CCG ATT ACA AAA ACA TCA GCC G 3’ GAC AAT AAA CAG TCA AAC GGC TAA TGT TTT TGT AGT CGG C i 5 5' CTG TTA TTT GTC AGT TTG CCG ATT ACA AAA ACA TCA GCC GT 3' GAC AAT AAA CAG TCA AAC GGC TAA TGT TTT TGT AGT CGG CA 5' CTG TTA TTT GTC AGT TTG CCG ATT ACA AAA ACA TCA GCC GTA 3' GAC AAT AAA CAG TCA AAC GGC TAA TGT TTT TGT AGT CGG CAT 5' CTG TTA TTT GTC AGT TTG CCG ATT ACA AAA ACA TCA GCC GTA A 10 3' GAC AAT AAA CAG TCA AAC GGC TAA TGT TTT TGT AGT CGG CAT T 5' CTG TTA TTT GTC AGT TTG CCG ATT ACA AAA ACA TCA GCC GTA AA 3' GAC AAT AAA CAG TCA AAC GGC TAA TGT TTT TGT AGT CGG CAT TT jossa nuolet osoittavat Ot-amylaasigeenin signaalisekvenssin katkaisukohtaa, tai vastaavia aminohappoja koodittavista nuk-15 leotidijaksoista.
5 GGCTGAAGAA GTGGATCGAT TGTTTGAGAA AAGAAGAAGA CCATAAAAAT ACCTTGTCTG CCGACTTCTT CACCTAGCTA ACAAACTCTT TTCTTCTTCT GGTATTTTTA TGGAACAGAC TCATCAGACA GGGTATTTTT TATGCTGTCC AGACTGTCCG CTGTGTAAAA ATAAGGAATA AGTAGTCTGT CCCATAAAAA ATACGACAGG TCTGACAGGC GACACATTTT TATTCCTTAT 10 AAGGGGGGTT GTTATTATTT TACTGATATG TAAAATATAA TTTGTATAAG AAAATGAGAG TTCCCCCCAA CAATAATAAA ATGACTATAC ATTTTATATT AAACATATTC TTTTACTCTC l GGAGAGGAAA CATGATTCAA AAACGAAAGC GGACAGTTTC GTTCAGACTT GTGCTTATGT 15 CCTCTCCTTT GTACTAAGTT TTTGCTTTCG CCTGTCAAAG CAAGTCTGAA CACGAATACA GCACGCTGTT ATTTGTCAGT TTGCCGATTA CAAAAACATC AGCCGTAAAT GGCACGCTGA CGTGCGACAA TAAACAGTCA AACGGCTAAT GTTTTTGTAG TCGGCATTTA CCGTGCGACT
20 TGCAGTATTT TGAATGGTAT ACGCCGAACG ACGGCCAGCA TTGGAAACGA TTGCAGAATG ACGTCATAAA ACTTACCATA TGCGGCTTGC TGCCGGTCGT AACCTTTGCT AACGTCTTAC ATGCGGAACA TTTATCGGAT ATCGGAATCA CTGCCGTCTG GATTCCTCCC GCATACAAAG TACGCCTTGT AAATAGCCTA TAGCCTTAGT GACGGCAGAC CTAAGGAGGG CGTATGTTTC 25 GATTGAGCCA ATCCGATAAC GGATACGGAC CTTATGATTT GTATGATTTA GGAGAATTCC CTAACTCGGT TAGGCTATTG CCTATGCCTG GAATACTAAA CATACTAAAT CCTCTTAAGG AGCAAAAAGG GACGGTCAGA ACGAAATACG GCACAA
30 TCGTTTTTCC CTGCCAGTCT TGCTTTATGC CGTGTT jossa nuoli osoittaa Cfc-amylaasigeenin signaalisekvenssin aloi-tuskodonia, ja jossa tätä seuraava Oo-amylaasigeeniä koodittava sekvenssi on alleviivattu.
5. Rekombinanttiplasmidivektori, tunnettu siitä, että se sisältää Bacillus-suvun bakteereissa useana kopiona esiintyvän plasmidin, kuten plasmidin pUB 110 tai olennaisen osan siitä ja B. amyloliqucfaciens Ö/-amylaasin geenin 20 säätelyosan ja erittymisen kannalta olennaisen DNA-jakson, johon rekombinanttiplasmidivektoriin voidaan liittää valikoidun valkuaisaineen aminohappoja koodittava DNA-jakso tai ko. valkuaisaineen biologisen aktiivisuuden kannalta olennainen osa siitä.
6. Patenttivaatimuksen 5 mukainen rekombinanttiplasmi divektori, tunnettu siitä, että se sisältää seuraa-van nukleotidijärjestyksen tai osan siitä: 30 6 4 81 3 AAGCCCCGCA CATACGAAAA GACTGGCTGA AAACATTGAG CCTTTGATGA CTGATGATTT TTCGGGGCGT GTATGCTTTT CTGACCGACT TTTGTAACTC GGAAACTACT GACTACTAAA
7. Patenttivaatimusten 5 ja 6 mukainen rekombinantti-35 plasmidivektori, tunnettu siitä, että valikoitua valkuaisainetta tai sen biologisen aktiivisuuden kannalta olennaista osaa koodittava DNA-jakso liitetään johonkin patenttivaatimuksessa 4 esitetyistä OL-amylaasigeenin nukleotidijaksoista. 6481 3
8. Patenttivaatimusten 5-7 mukainen rekombinant- tiplasmidivektori, tunnettu siitä, että liitettävä DNA-jakso koodittaa mitä tahansa /3- ja ^-inter feroneista tai biologisen aktiivisuuden kannalta olennais- 5 ta osaa niistä.
9. Patenttivaatimusten 5-7 mukainen rekombinant-tiplasmidivektori, tunnettu siitä, että liitettävä DNA-jakso koodittaa E. colin yi-laktamaasia tai biologisen aktiivisuuden kannalta olennaista osaa siitä. 21 6 4 81 3
FI804081A 1980-12-31 1980-12-31 Foerfarande foer producering av ett utvalt aeggviteaemne och vid foerfarandet anvaenda rekombinantplasmidvektorer FI64813C (fi)

Priority Applications (22)

Application Number Priority Date Filing Date Title
FI804081A FI64813C (fi) 1980-12-31 1980-12-31 Foerfarande foer producering av ett utvalt aeggviteaemne och vid foerfarandet anvaenda rekombinantplasmidvektorer
CH8157/81A CH668080A5 (de) 1980-12-31 1981-12-21 Verfahren zur erzeugung eines proteins und rekombinante plasmid-vektoren.
CH4425/85A CH659480A5 (de) 1980-12-31 1981-12-21 Verfahren zur effektivierung der erzeugung von proteinen und rekombinantes dns-molekuel.
CA000392892A CA1211726A (en) 1980-12-31 1981-12-22 Recombinant dna-molecules and methods for protein production
GB8138726A GB2091268B (en) 1980-12-31 1981-12-23 Recombinant dna-molecules and methods for protein production
DE3152001A DE3152001A1 (de) 1980-12-31 1981-12-28 Kombinations-dns-molekuele und verfahren fuer die erzeugung von proteinen
DE3153403A DE3153403C2 (fi) 1980-12-31 1981-12-28
SE8107812A SE452632B (sv) 1980-12-31 1981-12-29 Rekombinantplasmidvektor samt forfarande for framstellning av proteiner medelst dna-teknik varvid anvendes bl a regleringsdelen av genen for bacillus amyloliquefaciens-alfa-amylas
JP56216094A JPS57132895A (en) 1980-12-31 1981-12-29 Production of rearranged dna molecule and protein
AT0560181A AT380695B (de) 1980-12-31 1981-12-29 Verfahren zur erzeugung eines ausgewaehlten proteins
FR8124482A FR2501230B1 (fr) 1980-12-31 1981-12-30 Procede de production de proteines au moyen de molecules d'adn recombinant et molecules d'adn s'y rapportant
BE0/206962A BE891659A (fr) 1980-12-31 1981-12-30 Molecules d'adn de recombinant et procedes d'obtention de proteines.
FI820860A FI64814C (fi) 1980-12-31 1982-03-12 Foerfarande foer effektivering av produktionen av aeggviteaemnen
FR8307570A FR2526040B1 (fr) 1980-12-31 1983-05-06 Procede d'amelioration de la production de proteines dans des bacteries de souche bacillus et molecules d'adn s'y rapportant
GB08332576A GB2133408B (en) 1980-12-31 1983-12-07 Method for improving the production of proteins in bacillus
AT261884A AT380696B (de) 1980-12-31 1984-08-13 Verfahren zur effektivierung der erzeugung von proteinen in bakterien der gattung bacillus
CA000479868A CA1211061A (en) 1980-12-31 1985-04-23 Recombinant dna-molecules and methods for protein production
SE8702885A SE453513B (sv) 1980-12-31 1987-07-16 Forfarande for effektivisering av produktionen av eggviteemne
US07/129,356 US5010000A (en) 1980-12-31 1987-11-30 Method for the preparation of a selected protein or a part thereof in Bacillus strain bacteria
US07/129,357 US5010015A (en) 1980-12-31 1987-11-30 Recombinant DNA-molecules and method for protein production
JP2102749A JPH03206889A (ja) 1980-12-31 1990-04-18 組み換えｄｎａ分子
US07/947,888 US5380653A (en) 1980-12-31 1992-09-18 Expression vectors and methods for intracellular protein production in bascillus

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
FI804081A FI64813C (fi) 1980-12-31 1980-12-31 Foerfarande foer producering av ett utvalt aeggviteaemne och vid foerfarandet anvaenda rekombinantplasmidvektorer
FI804081 1980-12-31

Publications (3)

Publication Number Publication Date
FI804081L FI804081L (fi) 1982-07-01
FI64813B FI64813B (fi) 1983-09-30
FI64813C true FI64813C (fi) 1984-01-10

Family

ID=8514019

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
FI804081A FI64813C (fi) 1980-12-31 1980-12-31 Foerfarande foer producering av ett utvalt aeggviteaemne och vid foerfarandet anvaenda rekombinantplasmidvektorer

Country Status (11)

Country Link
US (2) US5010015A (fi)
JP (2) JPS57132895A (fi)
AT (1) AT380695B (fi)
BE (1) BE891659A (fi)
CA (1) CA1211726A (fi)
CH (2) CH668080A5 (fi)
DE (2) DE3152001A1 (fi)
FI (1) FI64813C (fi)
FR (2) FR2501230B1 (fi)
GB (2) GB2091268B (fi)
SE (2) SE452632B (fi)

Families Citing this family (76)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CH657141A5 (de) * 1980-07-01 1986-08-15 Hoffmann La Roche Dns-sequenzen, rekombinante expressionsvektoren zur mikrobiellen herstellung von human-leukozyten-interferonen und transformierte mikroorganismen.
US5380653A (en) * 1980-12-31 1995-01-10 The Finnish National Public Health Institute Expression vectors and methods for intracellular protein production in bascillus
AU8300282A (en) * 1981-04-29 1982-11-04 Biogen N.V. Bacillus cloning vectors and method of expressing foreign dna
AU561343B2 (en) * 1981-10-19 1987-05-07 Genentech Inc. Human immune interferon by recombinant dna
US5582824A (en) * 1981-10-19 1996-12-10 Genentech, Inc. Recombinant DES-CYS-TYR-CYS human immune interferon
AU582112B2 (en) * 1982-02-17 1989-03-16 Lawrence E. D'antonio Purification of parasite protective antigen factors
FR2524487B1 (fr) * 1982-04-05 1985-11-22 Pasteur Institut Fragments d'adn codant pour des polypeptides contenant au moins un determinant antigenique des papillomavirus, notamment du type hpv 1a et polypeptides correspondants
US6936694B1 (en) 1982-05-06 2005-08-30 Intermune, Inc. Manufacture and expression of large structural genes
SE8204811L (sv) * 1982-08-23 1984-02-24 Sven Lofdahl Dna-fragment innefattande en signalsekvens
JPS5939899A (ja) * 1982-08-27 1984-03-05 Gakuzo Tamura 新規ベクタ−
IT1156317B (it) * 1982-09-08 1987-02-04 Anic Spa Vettori plasmidici ad espressione in bacillus subtilis e procedimento per la loro preparazione
FR2537602B2 (fr) * 1982-09-24 1986-10-24 Centre Nat Rech Scient Nouvel adn recombinant perfectionne utile dans la preparation d'a-amylase par bacillus subtilis
DE3330003A1 (de) * 1982-10-21 1984-10-31 Gesellschaft für Biotechnologische Forschung mbH (GBF), 3300 Braunschweig Dna-sequenz und dna-strukturen und sie verwendendes verfahren zur herstellung von penicillin-acylase
ATE48156T1 (de) * 1982-11-01 1989-12-15 Miles Inc Verfahren zur heterologen klonierung eines gens in einem bacillus-mikroorganismus.
DE3382547D1 (de) * 1983-01-12 1992-05-27 Chiron Corp Sekretorische expression in eukaryoten.
NO840200L (no) * 1983-01-28 1984-07-30 Cefus Corp Glukoamylase cdna.
AU569722B2 (en) * 1983-01-28 1988-02-18 Saramane Pty Ltd Expression of plasmodium falciparum polypeptides from cloned cdna
SE8300693L (sv) * 1983-02-09 1984-08-10 Sven Lofdahl Sett att framstella och isolera proteiner och polypeptider samt en hybridvektor for detta
EP0316023B1 (en) * 1983-03-08 1993-06-09 Rikagaku Kenkyusho Plasmids, methods for their construction, microorganisms carrying them and methods for the extracellular production of xylanase by cultivation of the microorganisms
US4755465A (en) * 1983-04-25 1988-07-05 Genentech, Inc. Secretion of correctly processed human growth hormone in E. coli and Pseudomonas
JPS59196092A (ja) * 1983-04-25 1984-11-07 Sanraku Inc 組換えプラスミドによる耐熱性α−アミラ−ゼの新規製造法
US4859600A (en) * 1983-04-25 1989-08-22 Genentech, Inc. Recombinant procaryotic cell containing correctly processed human growth hormone
US5310675A (en) * 1983-06-24 1994-05-10 Genencor, Inc. Procaryotic carbonyl hydrolases
JPS609487A (ja) * 1983-06-29 1985-01-18 Kunio Yamane 組換ｄｎａ分子
US4554250A (en) * 1983-06-30 1985-11-19 E. R. Squibb & Sons, Inc. Method of increased production of penicillin acylase and plasmid employed therein
US5624829A (en) * 1984-07-03 1997-04-29 Gist-Brocades, B.V. Transformed industrial bacillus strains and methods for making and using them
CA1311429C (en) * 1983-07-06 1992-12-15 Vasantha Nagarajan Vector for polypeptides in bacilli
JPS6091980A (ja) * 1983-07-06 1985-05-23 ジェネックス・コーポレイション プロテア−ゼ酵素の発現のための徴生物を製造する方法
JP2669457B2 (ja) * 1983-07-06 1997-10-27 ギスト ブロカデス ナ−ムロ−ゼ フエンノ−トチヤツプ 工業微生物種中の分子クローニングおよび発現
US4536477A (en) * 1983-08-17 1985-08-20 Cpc International Inc. Thermostable glucoamylase and method for its production
JPS6058074A (ja) * 1983-09-09 1985-04-04 Juzo Udaka バチルス・ブレビスを形質転換する方法
AU561372B2 (en) * 1983-10-10 1987-05-07 Board Of Regents Of The University Of Oklahoma, The Streptokinase-coding recombinant vectors
DD250546A1 (de) * 1983-12-16 1987-10-14 Adw Ddr Verfahren zur fermentativen herstellung einer streptokinase
MX9203641A (es) * 1983-12-16 1992-07-01 Genentech Inc Interferones gamma recombinantes que poseen estabilidad mejorada y metodos biotecnologicos para su obtencion.
US4855238A (en) * 1983-12-16 1989-08-08 Genentech, Inc. Recombinant gamma interferons having enhanced stability and methods therefor
US4784949A (en) * 1984-04-19 1988-11-15 Cetus Corporation Universal dominant selectable marker cassette
JPS60188070A (ja) * 1984-03-09 1985-09-25 Kunio Yamane シグナルペプチドをコードするｄｎａ
JPS60188093A (ja) * 1984-03-09 1985-09-25 Teruhiko Beppu 枯草菌に於ける形質発現プラスミド
GB8414271D0 (en) * 1984-06-05 1984-07-11 Cpc International Inc Recombinant dna
US5668255A (en) * 1984-06-07 1997-09-16 Seragen, Inc. Hybrid molecules having translocation region and cell-binding region
US6022950A (en) * 1984-06-07 2000-02-08 Seragen, Inc. Hybrid molecules having translocation region and cell-binding region
US4801537A (en) * 1984-06-08 1989-01-31 Genex Corporation Vector for expression of polypeptides in bacilli
JPH062074B2 (ja) * 1984-07-27 1994-01-12 國男 山根 オリゴペプチドの製法
JP2524693B2 (ja) * 1984-07-30 1996-08-14 湧永製薬株式会社 蛋白質の製造法
GB8421210D0 (en) * 1984-08-21 1984-09-26 Celltech Ltd Polypeptide and polypeptide composition
US5691181A (en) * 1984-08-21 1997-11-25 Celltech Limited DNA encoding lipase from human gastric mucosal tissue
US5126264A (en) * 1984-09-11 1992-06-30 The Walter & Eliza Hall Institute Of Medical Research The RESA and FIRA antigens of plasmodium falciparum
JPS61268183A (ja) * 1985-05-24 1986-11-27 Wakamoto Pharmaceut Co Ltd Ｄｎａ，組換体ｄｎａおよびそれらを含む微生物
US4963495A (en) * 1984-10-05 1990-10-16 Genentech, Inc. Secretion of heterologous proteins
IT1177378B (it) * 1984-12-11 1987-08-26 Anic Spa Vettore plasmidico psm112 ad espressione in bacillus subtilis
JPH0817702B2 (ja) * 1984-12-28 1996-02-28 理化学研究所 新規プラスミド及びその調製方法並びにそのプラスミドを含有する新規微生物
JP2500311B2 (ja) * 1985-03-19 1996-05-29 工業技術院長 蛋白製造法
JPS61177996A (ja) * 1985-02-02 1986-08-09 Green Cross Corp:The インタ−フエロン−γの製造法
US4783415A (en) * 1985-03-28 1988-11-08 Meiji Seika Kabushiki Kaisha Gene coding for signal peptides and utilization thereof
US4769327A (en) * 1985-03-29 1988-09-06 Biotechnica International, Inc. Secretion vector
SE459503B (sv) * 1985-05-03 1989-07-10 Excorim Kommanditbolag Hybrid-dna-molekyl innefattande dna-sekvens som kodar foer protein g samt foerfarande foer framstaellning av protein g
JPS623796A (ja) * 1985-06-28 1987-01-09 Ajinomoto Co Inc インタ−ロイキン２の製造法
JP2620852B2 (ja) * 1985-07-30 1997-06-18 理化学研究所 新規プラスミド及びそれにより形質転換された新規微生物
FR2586428B1 (fr) * 1985-08-26 1988-11-25 Pasteur Institut Polypeptides et anticorps, caracteristiques du papillomavirus et leurs applications au diagnostic in vitro, a la prevention et/ou la lutte contre des infections a papillomavirus
US5024943A (en) * 1985-11-07 1991-06-18 Gist-Brocades Regulatory region cloning and analysis plasmid for bacillus
JPH0669377B2 (ja) * 1985-11-25 1994-09-07 工業技術院長 Ｄｎａ塩基配列およびベクタ−
US5278059A (en) * 1985-12-04 1994-01-11 Kabushiki Kaisha Hayashibara Seibutsu Kagaki Kenkyujo Polypeptide possessing cyclomaltodextrin glucanotransferase activity
GB2191491B (en) * 1986-04-25 1990-12-05 Labofina Sa Dna segment coding for a specific lipase, vectors for the expression thereof, microorganisms transformed by these vectors and use of these microorganisms for
US5486473A (en) * 1986-05-06 1996-01-23 The Research Foundation For Microbial Diseases Of Osaka University A DNA coding for a Flavivirus antigen
US5200509A (en) * 1987-04-06 1993-04-06 Celtrix Pharmaceuticals, Inc. Human somatomedin carrier protein subunits and process for producing them; recombinant DNA molecules, hosts, processes and human somatomedin carrier protein-like polypeptides
US5885770A (en) * 1987-04-22 1999-03-23 Institut Pasteur Polypeptides and antibodies characteristic of papillomavirus, and diagnostic procedures and vaccines making use of them
WO1990009448A1 (en) * 1989-02-10 1990-08-23 Genesit Oy Novel expression vectors and methods for intracellular protein production
WO1990009444A1 (en) * 1989-02-10 1990-08-23 Genesit Oy A method for producing pertussis toxin subunits
US5162207A (en) * 1989-07-07 1992-11-10 E. I. Du Pont De Nemours And Company Sucrose inducible expression vectors for bacillus sp.
DK16490D0 (da) * 1990-01-19 1990-01-19 Novo Nordisk As Enzym
NL9001388A (nl) 1990-06-19 1992-01-16 Unilever Nv Recombinant dna, cel die daarvan afgeleid dna bevat, enzym waarvoor het recombinant dna codeert en toepassingen daarvan.
US5705362A (en) * 1992-05-25 1998-01-06 Gist-Brocades, N.V. Modified signal sequences
US5712118A (en) * 1993-09-29 1998-01-27 Research Foundation Of State University Of New York Vaccine for branhamella catarrhalis
US6121427A (en) * 1994-10-24 2000-09-19 Connaught Laboratories Limited Major outer membrane protein CD of branhamella
US20160367620A1 (en) 2015-06-19 2016-12-22 Harry B. Demopoulos Glutathione
CN111378646A (zh) * 2018-12-27 2020-07-07 北京贝瑞和康生物技术有限公司 一种快速单反应管提取长片段基因组dna的方法和试剂盒

Family Cites Families (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB1521032A (en) * 1974-08-08 1978-08-09 Ici Ltd Biological treatment
DE2712615A1 (de) * 1977-03-18 1978-09-21 Max Planck Gesellschaft Verfahren zur herstellung von filamentoesen phagen als vektor fuer synthetische rekombinate
YU257278A (en) * 1977-11-08 1984-02-29 Genentech Inc Process for obtaining a recombinat clone carrier
DE2759053A1 (de) * 1977-12-30 1979-07-12 Uhlin Verfahren zum herstellen von genprodukten von plasmid-dns
US4411994A (en) * 1978-06-08 1983-10-25 The President And Fellows Of Harvard College Protein synthesis
IL58308A (en) * 1978-10-23 1983-10-31 Upjohn Co Process for preparing glucose isomerase using a recombinant plasmid
GB2048894A (en) * 1979-05-11 1980-12-17 Gist Brocades Nv Plasmid
IL61982A (en) * 1980-02-15 1984-01-31 Cpc International Inc Genetically engineered microorganisms for massive production of amyloytic enzymes and process for preparing same using the corresponding recombinant dnas containing amylase coding genes
AU545912B2 (en) * 1980-03-10 1985-08-08 Cetus Corporation Cloned heterologous jive products in bacillies
ES500397A0 (es) * 1980-03-17 1982-06-01 Harvard College Un metodo de determinar la cantidad de un polipeptido enca- riotico o procariotico producido por un microorganismo
US4338397A (en) * 1980-04-11 1982-07-06 President And Fellows Of Harvard College Mature protein synthesis
JP2718033B2 (ja) * 1987-08-13 1998-02-25 日産自動車株式会社 自律走行車両制御装置

Also Published As

Publication number Publication date
CH659480A5 (de) 1987-01-30
SE8107812L (sv) 1982-07-01
FR2501230A1 (fr) 1982-09-10
GB8332576D0 (en) 1984-01-11
SE452632B (sv) 1987-12-07
JPH03206889A (ja) 1991-09-10
ATA560181A (de) 1985-11-15
FI64813B (fi) 1983-09-30
DE3153403C2 (fi) 1992-01-02
DE3152001A1 (de) 1982-07-29
DE3152001C2 (fi) 1992-05-21
CA1211726A (en) 1986-09-23
FR2501230B1 (fr) 1985-09-13
JPS57132895A (en) 1982-08-17
GB2091268A (en) 1982-07-28
US5010015A (en) 1991-04-23
GB2133408A (en) 1984-07-25
SE453513B (sv) 1988-02-08
SE8702885D0 (sv) 1987-07-16
GB2133408B (en) 1985-01-30
FR2526040B1 (fr) 1985-08-30
GB2091268B (en) 1984-12-05
FI804081L (fi) 1982-07-01
SE8702885L (sv) 1987-07-16
FR2526040A1 (fr) 1983-11-04
CH668080A5 (de) 1988-11-30
AT380695B (de) 1986-06-25
US5010000A (en) 1991-04-23
BE891659A (fr) 1982-04-16

Similar Documents

Publication Publication Date Title
FI64813C (fi) Foerfarande foer producering av ett utvalt aeggviteaemne och vid foerfarandet anvaenda rekombinantplasmidvektorer
KR860001557B1 (ko) 폴리펩티드의 제조방법
JP3220137B2 (ja) アルカリ性タンパク質分解酵素およびその製造方法
JPH0665305B2 (ja) 組換えｄｎａ含有宿主細胞の安定化法
JPS6296086A (ja) 複合プラスミド
JPH0755153B2 (ja) 組換えｄｎａ分子及びその製造方法
DK2206788T3 (en) A recombinant microorganism
WO1991018101A1 (fr) Procede de production d&#39;une proteine
JPS59501694A (ja) シグナルｄｎａ配列を含むｄｎａ断片、その製造方法およびそれにより形質転換された微生物
EP0293391A1 (en) Cloned streptococcal genes encoding protein g and their use to construct recombinant microorganisms to produce protein g
KR910001807B1 (ko) 스태필로키나아제를 생산하는 유전자를 함유하는 새로운 대장균 및 스태필로키나아제의 제조법
CN106834252B (zh) 一种高稳定型MazF突变体及其应用
EP0133321B1 (en) Dna gene, process for production thereof and plasmid containing the same
JPS62163694A (ja) 宿生バチルス属微生物の異種構造形質転換方法
DK175020B1 (da) Fremgangsåde til udtrykkelse og ekstracellulær udskillelse af proteiner i G(-)bakterie, rekombinant DNA-konstruktion og plasmidvektor kodende herfor, samt G(-)bakterie indeholdende disse
EP0183571A2 (en) Cosmid vectors
CA1275954C (en) 3&#39;-expression enhancing fragments and method
US4845031A (en) Recombinant DNA process for producing useful polypeptides
FI64814C (fi) Foerfarande foer effektivering av produktionen av aeggviteaemnen
JP2540031B2 (ja) 組換えｄｎａ分子
JPS63102684A (ja) 遺伝子およびその利用方法
SU1703691A1 (ru) Рекомбинантна плазмидна ДНК @ 14, кодирующа полипептид, со свойствами лейкоцитарного интерферона @ 2 человека, и штамм бактерий ЕSснеRIснIа coLI - продуцент полипептида со свойствами лейкоцитарного интерферона @ 2 человека
US5585260A (en) PSM112 plasmid vector for expression in bacillus subtilis
RU2054041C1 (ru) РЕКОМБИНАНТНАЯ ПЛАЗМИДНАЯ ДНК PIF16, КОДИРУЮЩАЯ ЗРЕЛЫЙ ЛЕЙКОЦИТАРНЫЙ ИНТЕРФЕРОН α2 ЧЕЛОВЕКА, ШТАММ ESCHERICHIA COLI - ПРОДУЦЕНТ ЗРЕЛОГО ЛЕЙКОЦИТАРНОГО ИНТЕРФЕРОНА α2 ЧЕЛОВЕКА
RU2105813C1 (ru) Мутантный ген ifn δ 10, кодирующий полипептид с активностью гамма-интерферона человека, рекомбинантная плазмида pif δ 10, обеспечивающая экспрессию гена ifn δ 10 в escherichia coli, и штамм escherichia coli - продуцент полипептида, обладающего активностью гамма-интерферона человека

Legal Events

Date Code Title Description
TC Name/ company changed in patent

Owner name: R!HM ENZYME FINLAND OY

PC Transfer of assignment of patent

Owner name: R!HM ENZYME FINLAND OY

MA Patent expired

Owner name: ROEHM ENZYME FINLAND OY