SE459503B - Hybrid-dna-molekyl innefattande dna-sekvens som kodar foer protein g samt foerfarande foer framstaellning av protein g - Google Patents

Description

459 503 10 15 20 25 30 35 'human IgG 3. 2..

Tekniken går ut på att man med hjälp av s.k. vektorer överför genetisk information, proteinet, egenskaper. som kodar för från en cell till en annan som därigenom erhåller förmågan att producera detta protein. En sådan metod är känd för framställning av protein A (cellväggs- protein hos S. aureus) och beskrivs i de båda svenska patentansökningarna nr 8204810-9 och 8204811-7 samt de båda europeiska patentansökningarna nr 0 107 509 resp 0 124 374.

I jämförelse med protein A har protein G väsentliga fördelar, i synnerhet såsom terapeutiskt medel vid extra- korporeal behandling av blod i samband med vissa auto- immuna sjukdomar för att avlägsna s.k. immunkomplex från blodet.

Exempelvis binder protein G till samtliga IgG- subklasser, medan protein A saknar förmåga att binda till Vidare är protein G en mer selektiv Fc- receptor än protein A, eftersom den inte binder IgA och Igfl.

Ett ändamål med uppfinningen är därför att med hjälp i och för sig känd hybrid-DNA-teknik åstadkomma en metod att framställa protein G och/eller fragment av BV protein G med väsentligen samma egenskaper som protein G vad gäller förmågan att binda IgG.

Detta och andra ändamål med uppfinningen uppnås på det sätt som anges i efterföljande patentkrav och som kommer att beskrivas närmare i det följande.

BESKRIVNING AV UPPFINNINGEN Enligt uppfinningen åstadkommes en hybrid-DRA- molekyl, i vilken införts en DNA-sekvens, som kodar för ett i en mikroorganism uttryckbart protein. Hybrid-DNA- molekylen kännetecknas av att DNA-sekvensen är av det slag som kan utvinnas från streptokocker och kodar för protein G och/eller fragment av protein G med väsentligen samma egenskaper som protein G vad gäller förmågan att binda IgG. 10 15 20 25 30 35 3 459 sus Enligt uppfinningen åstadkommes även en mikroorganism som transformerats med en hybrid-DNA-molekyl, i vilken införts en DNA-sekvens, som kodar för ett i mikroorga- nismen uttryckbart protein. Mikroorganismen kännetecknas av, att DNA-sekvenaen kodar för protein G och/eller fragment av protein G med väsentligen samma egenskaper som protein G vad gäller förmågan att binda IgG.

Enligt uppfinningen åstadkommes dessutom ett sätt att framställa protein G ochleller fragment av protein G med väsentligen samma egenskaper som protein G vad gäller förmågan att binda IgG. Sättet inbegriper att i en mikro- organism införa en hybrid-DNA~molekyl, vilken innehåller en DNA-sekvens, som kodar för ett i mikroorganismen i uttryckbart protein, och kännetecknas av, att DNA- sekvensen kodar för protein G och/eller fragment av protein G med väsentligen samma egenskaper som protein G vad gäller förmågan att binda IgG.

Enligt uppfinningen används företrädesvis ett DNA- fragment erhållet ur en DNA-molekyl som isolerats från streptokockbakterier, exempelvis grupp A, C och G strep- tokocker, företrädesvis tillhörande grupp C och/eller grupp G streptokocker. Härvid utnyttjas konventionell teknik med användning av kända s.k. restriktionsenzymer, som spjälkar den isolerade DNA-molekylen i lämpligt stora DNA-fragment. Storleken på användbara DNA-fragment enligt _ uppfinningen kan variera, och beror bl a på vilken typ av vektor som skall användas.

Exempel på vektorer, som kan användas för kloning av 'dylika protein G-kodande DNA-fragment, omfattar bakte- riella plasmider (t ex plasmider från E.coli), fag-DNA (t ex fagÄ eller derivat av;\, såsom EMBL 3 och gt ll, vektorer erhållna från kombinationer av plasmíder och fag-DNA, jästplasmider etc. Det speciella valet av vektor sker med hänsyn till den använda mikroorganismen (värden) och kan utan vidare göras av fackmannen på området. 10 15 20 25 30 35 459 503 H _ Sättet att införa det protein G-kodande DNA- frag- mentet i den använda vektorn för att erhålla hybrid- DNA-molekylen enligt uppfinningen är också konventionellt på omrâdet och sker med användning av s.k. ligerings- enzymer.

Lämpliga värdorganismer, transformeras med hybrid dvs mikroorganismer som kan -DNA-molekylen enligt uppfinningen och som därigenom erhåller förmågan att producera nämnda protein G och/eller fragment därav, omfattar gramnegativa bakterier (företrädesvis E.coli) , grampositiva bakterier, jâstceller, växtceller etc.

Följande exempel är enbart ägnat att belysa ett praktiskt tillvägagångssätt att utöva uppfinningen och skall icke uppfattas såsom någon begränsning. 1. Isolering av kromosomalt streptokock-DNA Som utgångsmaterial valdes en grupp G streptokockstam (GI48) på grund av dess höga protein G-halt.

En kultur av Gl48-bakterier i Todd-Hewitt (T-H) medium fick växa över natt i 37°C. 3,0 ml av kulturen sattes till 225 ml T-H och inkuberades 3 timmar i 37°C. 13,6 ml 10% cystein och 11,25 ml 0,42 DL- sattes. threonin till- Efter inkubation 1 timme i 37°C tillsattes 125 ml 152 glycin. Efter ytterligare inkubation i 45 minuter i 37°C tvättades cellerna 3 ggr i 0,2 M Na0Ac och resuspen- derades i 10 ml 0,1 M TRIS-BCI buffert, pH 8,0, hållande 252 glukos och 10 mH EDTA. inne- 20 mg lysozym löst i 2,0 ml TE-buffert (0,0l M IRIS-HCl, pH 7,4, innehållande 1,0 mM EDTA) tillsattes. Därefter inkuberades i en timme vid 31°c, varefter 1,1 m1 xoz sns 1ast i rs-buffert tillsattes. 500 mikroliter proteinas R (Merck, Darmstadt, Västtyskland) löst i 0,01 H TRIS-HCI, pH 7,4, i en koncen- tration av 20fmg/ml och autodigererad 2 timmar vid 37°C, tillsattes. Efter inkubation över natt i rumstemperatur uixlsazzes 4o ml Iz-buffert och 5 ml 3 n naolc, pH 7,4. 150 ml absolut alkohol tillsattes, varefter lösningen 14 4A 10 15 20 25 30 35 5 459 505 inkuberades vid -20°C över natt. Efter centrifugering vid 2000 g i 30 minuter avhälldes supernatanten. Pelleten tvättades med 802 alkohol 2 ggr och indunstades med kvävgas och löstes i 4 ml TE-buffert. 500 mikroliter R Nase-A från bovin pankress (Sigma, Mo, USA), 2 mg/ml i 0,15 H NaCl uppvärmt till 80°C före användning, till- sattes. Efter inkubation i 2 timmar vid 37°C tillsattes 200 mikroliter proteinas K (se ovan). Efter ytterligare inkubation över natt vid rumstemperatur fenolextraherades lösningen 2 ggr och dialyserades 3 ggr mot TE-buffert. 3 M Na0Ac tillsattes till en koncentration av 0,3 M, varefter 3 volymer absolut alkohol tillsattes. Efter inkubation vid -2050 över natt centrifugerades vid 2000 g i 30 minuter¿ Pelleten tvättades 2 ggr med 802 alkohol och indunstades med kvävgas. Därefter löstes pelleten i 25 ml TE-buffert. 25 g cesiumklorid (BEL, Bethesda USA) och l ml ethidium- bromid (5 mg/ml) (Sigma, Ho, USA) tillsattes. Efter centrifugering vid 138000 g i 20 timmar avsögs DNA-bandet som i UV-ljus är visualiserat med ethidiumbromid. Extrak- tion 2 ggr med absolut hutanol följdes av dialys av under- fasen mot TE-buffert, varefter Na0Ac tillsattes till 0,3 M. Därefter alkoholprecipiterades med absolut alkohol och tvättades 2 ggr med 802 alkohol. Pelleten löstes i destil- lerat vatten. 2. Kloning av streptokock-DNA i EMBL 3 -vektor Ett derivat av faglà användes som vektor för det renade och med restriktonsenzymer fragmenterade %trepto~ kock-DNAt. Derivatet, EMBL 3, finns-kommersiellt till- gängligt (Promega Biotec, NI, USA) och proceduren för hur fagens DNA och det främmande DNAt prepareras ock klyvs med restriktionsenzymer samt hur DNA-bitarna binds ihop (ligans) finšs beskrivet i aennj i J.n°1.si<>1. 170, 827, 1983. I enlighet med denna kända procedur inkorporerades streptokock-DNA-fragment med en storlek av 10-25 kb (bestämd med gelelektrofores i 1% agaros) i EMBL 3-DNAt. 459, 505 10 15 20 25 30 35 fagerna, 'W 6 -streptokock-hybrid-DNA-molekylerna inneslöts i det proteinhölje som utmärker en int fagÄ. Hur detta sker beskrivs (benämnd Promega Biotec, akt och ínfektionskapabel i Promega Biotecs katalog Molecular Biologicals). Slut- resultatet blev feg). innehâllandeÄ-DNA-molekyler i vilka olika stora fragment av streptokock-DNA inkorporerats. 3. Infektion av E.coli-bakterier med EMBL SÄÄ-fager innehållande streptokock-DNA Som värdceller för de framställda>\-streptokock- hybrid-DNA-molekylerna valdes de två E.colí S38_0ch NM 539. -stammarna NH Dessa stammar kan infekteras av EMBL 3-fager och finns beskrivna i detalj i J.Hol.Biol. 170,' 827, 1983. Stammarna erhölls från Promega Biotec, WI, USA. över natt i vardera 20 ml LB-medium (10 g NaCl, 10 g Dífco trypton, 5 g Difco jästextrakt, En bakteriekoloni av vardera stammen inockulerades pH justerat till 7,4 med 5 M Na0H) innehållande 0,52 maltos. 100 mikroliter fag- lösning (enligt 2 ovan) blandades med 200 míkroliter NM 538- och HN 539-bakterier.

Därefter inkuberades 30 minuter vid 37°c.

Till de båda rören sattes 3 ml LB innehållande 10 mM MgCl (so°c) hällde; ut på Ls innehållande 1,52 agar) -maltosmedium 2 och 0,72 agaros. Lösningarna -plattor (tillverkade av LB~medium , varvid ett tunt agarosskikt bildades när agarosen stelnade. natt vid 37°C.

Plattorna inkuberades över Om bakterierna inte infekteras skulle en jämn matta av celler täcka plattorna, medan det i händelse av tion bildas hål, infek- s.k. plaques, i cellmattan. Dessa plaques formas genom att infekterade colibakterier lyseras av varvid cellerna faller sönder och fager och annat intracellulärt material svämmar ut.

På våra plattor uppträdde 500-2000 plaques/platta.

Under förutsättning av EMBL 3-fagerna innehåller strepto- kock-DNA kodande för protein G och under förutsättning att detta DNA kan replikeras och uttryckas i E.coli, kan också 10 15 20 25 30 35 Ä- 459 503 produktion av protein G ske i de infekterade bakterierna, varvid protein G skall kunna detekteras i motsvarande plaque, när bakterierna på grund av fag-infektion sprängs och släpper ut sitt innehåll.

Hed tanke på att de streptokock-DNA-bitar som inkor- porerats i EMBL 3-DNA-molekylerna är ca 20 kb stora och streptokockgenomet är flera tusen kb stort, skulle sta- tistiskt endast ett fåtal av plaquen innehålla protein G. 4. Identifiering av protein G-innehållande plaques För detektion av protein G i nämnda plaques utnytt- jades molekylens förmåga att binda IgG. Ovanpå plattorna med plaquen placerades nitrocellulosafilter (BA 85 Mem- branfilter, Schleicher und Schuell, Daaael, Västtyskland) under 10 minuter vid rumstemperatur. Proteiner, fager och annat material från plattorna sugs därvid upp i filtren.

För att blockera filtrens fortsatta möjlighet att binda proteiner placerades filtren i en speciell a.k. bloc- keringsbuffert (3l,l ml 5 H NaCl, 10,0 ml 1 M IRIS-HCI, pH 7,4, 50 ml Tween 20, tillsätt destillerat H20 till 1 1 samt 0,25 g gelatin). Bufferten byttes 4 ggr var tionde minut (100 ml buffert/gång), varefter filtren placerades i 100 ml blockeringsbuffert innehållande 200 mikroliter per- oxidasmärkt kanin-IgG (DAKO-Immunoglobulins A/S, Danmark) under 30 minuter på skakbord vid rumstemperatur. Om protein G har absorberats till filtren kommer de per- oxidasmärkta IgG-antikropparna att bindas till filtren.

Filtren tvättades åter 4 ggr med blockeringabuffert och placerades därefter i en färsk färgningslösning (4 ml 1% Ä-amino-9-etylcarbazol + 100 ml 50 mM Na0Ac, pH 5,1 + 10 4 mikroliter B202), varvid de peroxidasmärkta IgG-anti- kropparna, som bundit till filtren, skulle framträda som klart lysande röda prickar. På de undersökta filtren sågs sammanlagt 26 röda, lysande knappnålshuvudstora prickar svarande mot totalt ca 6000 plaques. Som positiv kontroll användes ett filter på vilket 0,25 mikrogram rent protein 459 503 3 10 15 20 25 30 35 G (isolerat enligt J.Immunol. 133, 969, 1984) i en mikro- liter destillera: vatten applícerad es, varefter filtret behandlades på samma sätt som de övriga. En klart lysande röd prick uppträdde där protein G hade applicerats, medan filtret i övrigt var vitt.

Från ursprungsplattorna plockades därefter med Pasteurpipett de plaques, som motsvarade de tio kraf- tigaste röda prickarna på filtren. Detta material slam- mades i tio rör innehållande vardera 1 ml SM-buffert (20 mM TRIS-HC1, pH 8,0, 0,1 M NaC1, gelatin) och användes till att åt NM 539-bakterier. falk 10 mH HgCl2 och 0,12 er infektera NH 538- och Hela proceduren upprepades och i detta blev på åtta av de tio plattorna > SOZ av plaquen röda, dvs protein G-innehållande. Nya plaques plockades och hela förfarandet upprepades ytterligare 2 ggr, var- efter det på tre av plattorna fanns röda prickar mot- svarande samtliga plaques. Resultatet var alltså EHBL 3-fagpreparatíoner bestående av fager som samtliga inne- höll protein G-genen. En av dessa preparationer (benämnd ÄPGM) har aeponerars den 29 mars 1985 hos ucc under nummer 40176. 5. Produktion av protein G genom infektion av E.coli- bakterier med hybrid-DNA-molekyler bestående av stren- tokock-DNA och EMBL 3 fag-DNA De enligt ovan framställda och renade EHBL 3-fagerna innehållande protein G-genen användes för att_infektera NM 538- och NM 539-bakterier. Till två bägare innehållande vardera 100 ml LB-maltosmedium innehållande 10 mH HgCl2 sattes en koloni NH 538 resp. en koloni NM S39. Till båda bägarna sattes även 100 mikroliter EMBL 3-fager inne- hållande protein G-genen. Bägarna inkuberades 8 timmar under skakning vid 37°C. Bakterier och bakterierester centrifugerades ner (l0000 g i 20 minuter). Supernatanten analyserades med avseende på protein G med hjälp av peroxidasmärkta antikroppar och med rent protein G som 10 15 20 25 30 35 q 459 505 standard. I supernatanten fanns 5-10 nanogram protein G/ml. Detta protein G har analyserats med Western blot- proceduren utnyttjande radioaktivt märkt IgG som probe och molekylvikten har bestämts till ca 60.000. 6. Kloning av protein G-genen i.Ä gt ll-vektor EMBL 3-DNA innehållande det 20 kb stora protein G-DNA-fragmentet isoleras från lytiska plaques. EMBL 3-DNA som ej innehåller något främmande DNA kan ej klyvas med restriktionsenzymet EcoRI (saknar EcoRI-site). Däremot förelåg en möjlighet att det 20 kb stora fragmentet skulle kunna klyvas med detta enzym. Om EcoRI klyver utanför protein G-genen skulle vi härigenom kunna isolera ett mindre DNA-fragment innehållande protein G-genen. Det EcoRI-behandlade DNA-materialet ligerades därefter med DNA från Ä fagen gt ll. Ligering och efterföljande uppbyggnad av en intakt fag-partikel gjordes på samma sätt som beskrivits ovan för EMBL 3. Därefter infekterades E.co1i- stammen Yl090 (ATCC Rockville, Maryland, USA) med dessa;Ä gt ll-fager, också enligt proceduren beskriven för EMBL 3.

Vid analys av plattorna visade sig samtliga plaques innehålla protein G. Från plattorna renades Ä gt ll-fager på konventionellt sätt. Pag-DNA isoleras och det strepto- kock-DNA som har'ligerats med fag-DNA skärs åter ut med Ecokl. Analys med agarosegelelektrofores visar att detta DNA-fragment innehållande protein G-genen är 4,4 kb stort.

Hybrid-DNA-molekylen uppbyggd av Ä gt ll-DNA och detta 10,4 kb stora DNA-fragment har också använts för att infektera en annan E.co1i-stam (Yl089 ATCC). Denna stam möjliggör ëtt ett inkorporerande av hybrid-DNA-molekylen i E.co1i- genomet, varvid stabil lysogeni har uppnåtts.

Det sammanfattande resultatet är alltså att det enligt uppfinningen är möjligt att införliva protein G-genen med bakteriofag-DNA och att med de konstruerade hybrid-DNA-molekylerna infektera E.coli-bakterier, som därigenom bibringats förmågan att producera protein G.

Claims (7)

459 5U3 PATENTKRAV

1. Hybrid-DNA-molekyl i vilken införts en DNA-sekvens, som kodar för ett i en mikroorganism uttryckbar protein, kânnete av, att DNA-sekvensen är av det slag som kan utvinnas frán streptokocker och kodar för protein G och/eller fragment av protein G med väsentligen samma egenskaper som protein G vad gäller bindningsförmàga till IgG, närmare bestå PG4B deponerad under nr ATCC 40176. cknad mt bakteriofagen,Å

2. Míkroorganism, kânnetecknad av, att den transformerats med en hybrid-DNA-molekyl enligt kravet 1 med sådan effekt att den producerar protein G och/eller fragment av protein G med väsentligen samma egenskaper som protein G vad gäller bin- dningsförmâga till IgG.

3. Mikroorganism enligt kravet 2, kânnetecknad av, att den valts bland gramnegativa bakterier, grampositiva bakterier, jâstceller och vâxtceller.

4. Mikroorganism enligt kravet 2 eller 3, kânnetecknad av, att den är en stam av E.coli.

5. Sätt att framställa en transformerad mikroor något av kraven 2-4, kännetecknad av, känt sätt transformerar mikroorganisme enligt kravet 1. ganism enligt att man pà i och för sig n med en hybrid-DNA-molekyl

6. Sätt att framställa protein G och/eller fragment av protein G med väsentligen samma egenskaper som protein G vad gäller bindingsförmåga till IgG, kânnetecknat av att DNA och/eller fragment av DNA av det slag som kodar för poteín G avskiljes frán streptokocker genom nedbr ytning av streptokockens cellvägg, att denna DNA och/eller fragment av DNA avskiljes från streptokockresterna och spjâlkas i :indre delar, för att därefter införas i en vektor för bildande av bakteriofagen Å PG4B deponerad under nr ATCC 40176, som i sin tur utnyttjas för transformering av en mikroorganísm, som normalt icke har förmågan 11 i ' 459 5Ûa att producera protein G, för att ge mikroorganismen denna förmåga, varefter den transformerade mikroorganismen odlas och protein G och/eller nämnda fragment av protein G avskiljes från odlingen.

7. Sätt enligt kravet 6, kânnetecknat av att protein G- producerande exemplar av den transformerade mikroorganismen identifieras genom sin förmåga att binda IgG och isoleras frán resten av mikroorganismen för att därefter utnyttjas för infektion av en renodlad stam av icke transformerad mikroorganísm av samma eller annat slag. 8I Sätt enligt kravet 7, kånnetecknat av att märkt IgG utnyttjas för identifieringen, t ex peroxidasmärkt kanin-Igš eller radioaktivt IgG.