SE459662B - Hybrid-dna-molekyl som kodar foer ett protein med samma igg specificitet som protein g, plasmid innehaallande densamma samt foerfarande foer framstaellning av proteinet - Google Patents

Description

459 662 detta system. Denna Fc-bindande komponent har sedermera visat sig vara av proteinnatur och benämnts “protein G". För att komplettera eller helt eller delvis ersätta Staphylo- coccus aureus protein A skulle protein G därför vara ett naturligt val bland bakterieproducerade proteiner med "förmåga att binda till Fc-delen hos immunglobuliner av IgG-klass", t ex vid rening av IgG (US 3995018). Problemen att frigöra proteinet från bakterien har dock medfört att det studerats i mycket liten grad.

I Journal of Immunol l33(2) sid 969 publicerade Björck och Kronvall 1984 en metod där man genom enzymatisk nedbrytning med papain frigjorde små mängder av proteinet fràn bakterien.

Denna metod ger material som möjliggör begränsade funktio- nella och strukturella studier men däremot är utbytena långt ifrån acceptabla för ett kommersiellt utnyttjande, t ex för rening av monoklonala antikroppar. Vidare kan det rent generellt vara svårt att få en homogen och reproducerbar produkt med ett sådant förfarande. Streptokockerna är dessutom patogena och ställer krav på komplexa odlingsmedier vilket medför komplikationer vid storskalig odling. Det föreligger således ett behov av en ny produktionsmetod för Fc-bindande proteiner eller fragment därav från streptokocker av typ C och G.

Föreliggande uppfinning avser en hybrid-DNA-molekyl som innefattar en eller flera nukleotidsekvenser från grupp G streptokocker, stam Gl48 som kodar för ett protein eller en polypeptid med IgG-specificitet. Den naturliga källan för denna nukleotidsekvens är naturligtvis nämnda bakteriestam men speciellt för de aktiva polypeptiderna kan man naturligt- vis tänka sig syntetiskt producerade molekyler. Med aktiva polypeptider avses i detta sammanhang sådana polypeptider som uppvisar nämnda IgG-specificitet.

Vid framställning av en hybrid-DNA-molekyl enligt uppfinningen kan någon lämplig kloningsbärare eller vektor, t ex en 459 662 plasmid eller fag-DNA, klyvas med hjälp av ett restriktions- enzym varefter den DNA-sekvens som kodar för det önskade proteinet eller polypeptiden införes på klyvningsstället för att bilda hybrid-DNA-molekylen. Detta generella förfarande är i och för sig känt och olika tekniker för att klyva och _ koppla ihop DNA-sekvenser finns beskrivna i litteraturen (se _ t ex US 4237224), men har oss veterligen ej kommit till användning i detta proteinsystem. Om bakteriestammen Strepto- coccus Gl48 användes som källa för den önskade nukleotid- sekvensen kan denna isoleras och införas i en lämplig vektor pà sätt som vi har beskrivit i den experimentella delen nedan.

Användbara värdar, dvs mikroorganismer som fås att producera det aktuella proteinet eller aktiva fragment därav, kan innefatta bakterievärdar, såsom stammar av t ex Escherichia, Bacillus, Streptococcus och Staphylococcus, samt jäst och andra eukaryota celler i kultur. Bland bakterievärdarna är sådana av den grampositiva typen att föredraga pà grund av att deras vägg endast innehåller ett membransystem. Om proteinet eller det aktiva fragmentet produceras i kombination med en för systemet lämplig s k signalpeptid utsöndras produkten i sådana fall direkt ut i mediet. Ett stort antal signalpeptider har publicerats under de senaste åren, se t ex WO 84/00774 och det är en för fackmannen välkänd teknik att välja och utnyttja sådana för att få god sekretion i olika bakteriesystem. För att uppnå maximal expression kan regulatoriska element såsom promoter och ribosombindande sekvenser varieras pà känt sätt.

Med uppfinningen avses således hybrid-DNA-molekyler inne- hållande en eller flera nukleotidsekvenser frán Streptococcus G148 som kodar för ett protein eller en polypeptid med IgG-specificitet. Som framgår av den experimentella delen, nedan, uppvisar protein G-genen följande nukleotidsekvenser, Cl, C2 och C3, som kodar för:IgG~bindande polypeptider: _ 4 _ 459 662 Cl ACT TAC AAA TTA ATC CTT AAT GGT AAA ACA TTG AAA GGC GAA ACA ACT ACT GAA GCT GTT GAT GCT GCT ACT GCA GAA AAA GTC TTC AAA CAA TAC GCT AAC GAC AAC GGT GTT GAC GGT GAA TGG ACT TAC GAC GAT GCG ACT AAG'ACC TTT ACA GTT ACT GAA ' ACT TAC AAA CTT GTT ATT AAT GGT AAA ACA TTG AAA GGC GAA ACA ACT ACT GAA GCT GTT GAT GCT GCT ACT GCA GAA AAA GTC TTC AAA CAA TAC GCT AAC GAC AAC GGT GTT GAC GGT GAA TGG ACT TAC GAC GAT GCG ACT AAG ACC TTT ACA GTT ACT GAA och C3 ACT TAC AAA CTT GTT ATT AAT GGT AAA ACA TTG AAA GGC GAA ACA ACT ACT AAA GCA GTA GAC GCA GAA ACT GCA GAA AAA GCC TTC AAA CAA TAC GCT AAC GAC AAC GGT GTT GAT GGT GTT TGG ACT TAT GAT GAT GCG ACT AAG ACC TTT ACG GTA ACT GAA - Unpfinníngen avser således hybrid-DNA-molekyler som innehåller en eller flera av nämnda nukleotidsekvenser. Vidare avses plasmider innehållande en sådan nukleotidsekvens. Ansökan avser vidare ett förfarande för produktion av ett protein eller en polypeptid med samma IgG specificitet som protein G från Streptococcus GI48. Förfarandet innebär att E. coli, i vilken införts en hybrid-DNA-molekyl enligt ovan, ovan odlas i ett lämpligt medium, varefter den bildade produkten isoleras genom affinitetskromatografisk rening med hjälp av IgG bundet till en olöslig bärare, eller med någon annan separationsmetod, t ex jonbyteskromatografi. 459 662 I samtliga fall undantages från uppfinningen EMBL3-lambdafag ATCC nr 40176, som beskrivs i svenska patentansökan SE-A-8502162-4.

Vektorer, speciellt plasmider, innehållande den protein G kodande nukleotidsekvensen, kan med fördel förses med ett lätt klyvbart restriktionsställe som medger att en nukleotid- sekvens som kodar för en annan produkt kan fuseras till den protein G-kodande nukleotidsekvensen, pà sådant sätt att ett s k fusionsprotein uttrycks. Fusionsproteinet kan isoleras genom utnyttjande av dess IgG bindande förmåga, varefter den andra komponenten i systemet ev kan frigöras från fusions- proteinet. Denna teknik är utförligt beskriven i WO 84/03103 vad avser protein A systemet och kan analogt användas här.

Eftersom protein G och protein A har bindningsegenskaper som delvis kompletterar varandra, utgör ett fusionsprotein innehållande båda dessa komponenter en potentiellt intressant produkt.

Utgângsmaterial och generella förfaranden Streptococcus G148, som är en human grupp G stam erhölls från Statens Veterinärmedicinska Anstalt (SVA), Uppsala, Sverige.

E. coli stam HB101 (Boyer, HW and Roulland-Dussoix, D, J Mol Biol 41 (1969) 459-72) och JMIOS (Messing, J och Carlsson, J, J Biotechnol 1 (1984) sid 253-64) användes som bakteriella värdar för de plasmider som konstruerades och stammarna NM538 och NM539 utnyttjades vid kloning med lambdavektorn EMBL3a (Frischauf, A-M et al J Mol Biol 170 (1983) sid 827-842). De plasmidvektorer som användes var pUCl3, pUCl8 och pUCl9 (Norrander, J et al, Gene 26 (1983), sid 101-106) och pBR322 (Bolivar, F et al Gene 2 (1977) sid 95-113). 459 ss: ' 6 " Qêšiæsëæeëieë Vid odling av E.coli bakterier användes följande medium. De ingående mängderna avser l l medium.

Trypton Soy Broth (Oxoid Ltd Basingstoke, Hants., England) 30 g Yeast Extract (Oxoid) 10 g D-glukos 40 g NH4Cl 2,5 9 Na2HPO4.2H20 7,5 g Knzpoé 3,0 g Na2SO4.l0H2O 2,5 g MgS04.7H2O 0,2 g CaCl2.2H2O 0,5 mg Feclyenzo 16,7 mg ZnS04.7H2O 0,18 mg cusoïsnzo 0,16 mg MnSO4.4H2O 0,15 mg CoCl2 - 0,10 mg NaBDTA 20,1 mg Vid odling av Streptococcus Gl48 användes följande medium.

Som ovan anger mängerna innehållet per liter odlingsmedium.

Yeast Extract (0xoid) S0 g Trypton Soy Broth (Oxoid) 30 g L-alanin 0,69 g L-asparagin 0,30 g L-arginin 0,50 9 L-glutamin 0,43 Q glycin 0,23 9 L-histidin 0,15 g L-isoleucin 0,22 g L-leucin 0,33 g L-lysin 0,27 g L-metionin 0.09 g L-fenylalanin 0,35 g _ 7 _ 459 662 L-prolin 0,50 9 L-serin 0,25 9 L-treonin 0,20 g L-tryptofan 0,07 g L-tyrosin 0,03 9 L-valin 0,25 9 Pëêsazeessëëieaez Streptococcus Gl48-celler odlades i Todd~Hewitt medium (Oxoid Ltd Basingstoke, Hants., England). Cellerna tvättades och resuspenderades därefter i ett cellfritt medium från Streptomyces griseus 9179 (1/20 av den ursprungliga volymen) varefter lysozym tillsattes till koncentrationen 1 mg/ml.

Streptomycesstammen, som erhållits från Dr. W. Köhler, Institute für Mikrobiologie und experimentelle Therapie, Jena, DDR) hade odlats på sätt som beskrivits av Prauser och Köhler (Zeitschrift für allg. Mikrobiologie, Band 5 (4) (1965) sid 308-314) för inducering av lytisk aktivitet.

Sedan streptokockcellerna inkuberats i mediet under 2 tim vid 37 OC extraherades DNA enligt Marmur, J, J Mol Biol 3 (1961) sid 208-218.

Plasmid-DNA från E. coli preparerades genom alkalisk extraction (Birnboim HC et al Nucleic Acids Res 7 (1979) sid 1513-1523).

Lambda-DNA preparerades enligt Maniatis et al (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 1982).

Plasmidtransformationer genomfördes pá sätt som beskrivits av Morrison et al (Methods Enzymol 68 (1979) sid 326-331).

Restriktionsendonukleaser, T4 DNA-ligas, DNA-polymeras I och Klenow fragment erhölls från New England Biolabs (Boston, USA) eller Boehringer Mannheim (Mannheim, Västtyskland) och användes i enlighet med tillverkarens anvisningar. 459 662 Exempel 1 Isolering av en lambdaklon som kodar för 3 1 pplypeptider med IgG bindande aktivitet ' Ett genbibliotek för Streptococus Gl48, framställdes analogt med det sätt som beskrivits av Frischauf et al (1983, se ovan).

Streptokock-DNA digererades partiellt med Sau3a och ligerades in i BamHI-kluven lambda-vektor EMBL3a. Det ligerade DNA in vitro packades i fagpartiklar varpå dessa tilläts infektera E. coli NM539-celler. Det resulterande fagbiblioteket analyserades därefter med avseende på förekomsten av IgG bindande aktivitet. Fagerna titrerades därvid på agarplattor vnka inklubaradaa över nam-_ i 37 °c. Följande dag valdes plattor ut vilka hade en plaquefrekvens av 103-104. Pâ varje sádan platta placerades ett nitrocellulosafilter (Schleicher & Schüll, Membran filter BA85 (0.45 mikrometer) Dassel, Västtyskland). Den s k stämplingen fick fortgå vid rums- temperatur under ca 10 min varpâ filtren placerades under l tim i fosfatbuffrad koksaltlösning (PBS) innehållande Tween 20 till koncentrationen 0,1 %. Filterpapperen överfördes sedan till en petriskàl innehållande approximativt l07cpm 1251-märkta kanin-IgG-antikroppar (specifik aktivitet: 7 mCi/mg) i PBS med en tillsats av 0,05 % Tween 20 (PBST).

Efter 2 tim inkubering vid rumstemperatur tvättades filter- papperen 2 gånger under 10 minuter i PBST och torkades därefter. Autoradiografisk analys av filterpapperen indikerade de positiva lambdakloner vilka producerade polypeptider vilka band de radioaktiva antikropparna. Dessa selekterades på den ursprungliga agarplattan och analyserades på nytt.

Slutligen valdes en klon kallad lambda SPG1, för det fortsatta arbetet. Möjlighet föreligger naturligtvis att jämte ovan uppräknade system även använda propagering av lambda SPGl i lämpliga stammar av E.coli för produktion av proteinet i fråga. ' 459 662 Exempel 2 DNA-sekvensbestämning Em BL 3a lambdavektorn är konstruerad pâ sådant sätt att DNA-fragment, som lígeras in i BamH1-sites, pá båda sidor flankeras av SalI-sites. Klyvning av lambda SPGI-DNA med Sall gav tvâ fragment om approximativt 2.1 kilobaspar (kb) resp 12 kb härrörande från det ursprungligen insatta streptokock-DNA-fragmentet_ Dessa två fragment ligerades in i SalI-kluven pUCl9, vilket resulterade i rekombinant- plasmiderna pSPGl och pSPG8, innehållande 2.1 resp 12 kb fragment. Transformanter av E.coli HBIO1, innehållande resp plasmid odlades i Luria broth (Maniatis et al) med tillsats av ampillicin till slutkoncentrationen 50 mikrogram/ml, varefter cellysatet (Löfdahl et al, Proc. Natl. Acad. Sci.

USA 80 (1983), sid 697-701) testades på IgG-bindande aktivi- tet med hjälp av hämagglutinatíonstest (Guss et al, Eur. J.

Biochem. 153 (1985), sid 579-585). E.coli-klon innehållande plasmid pSPGl var positiv i detta test.

Plasmiden pSPGl, som innehöll en IgG bindande del av protein G genen från Streptococcus Gl48, digererades med lämpliga restriktionsenzymer och de bildade DNA~fragmenten klonades in i den replikativa formen av fagen Ml3 och transformerades därefter till E. coli stam JMIOS. Nukleotidsekvensen hos de införda DNA fragmenten analyserades med hjälp av den s k dideoxytekniken (Sanger F, Nicklen, S och Coulson AR (1977) Proc Natl Acad Sci USA 74, 5463-5467).

I Fig l(a) redovisas restriktionsenzymkartan för pSPG1. Ett 1,5 kb EcoRI/HindIII fragment som täcker intervallet 0,28 till 1,73 kb i Fig l(a) klonades in i pUCl8 och pUCl9 och gav pSPG2 respektive pSPG3. Den fullständiga sekvensen hos dessa är redovisad i Fig 2. De regioner som kan lokaliseras i denna sekvens är markerade i Fig l(b) som visar repetitiva strukturer Al, A2 och A3, vardera kodande för 24 aminosyror, vilka avbryts av likaledes repeterande sekvenserna Bl och B2 (51 aminosyror). Efter en s k "spacer-region" S följer de repetitiva regionerna Cl, C2 och C3, vardera motsvarande _ 10 _ 459 662 55 aminosyror, avbrutna av regionerna Dl och D2 (15 aminosyror).

Därefter följer en hydrofil struktur, ; W, som uppvisar en liknande struktur som den s k Xr-regionen i protein A systemet (Guss et al (1984) Eur. J. Biochem. 138, sid 413-420).

Resultaten av aminosyraanalysen av produkterna från pSPGl, pSPG2 och pSPG3 (Fig lo) indikerade vid jämförelse med protein A systemet att såväl W- som M-regionerna är invol- verade i cellväqgs- och cellmembraninteraktion. Med hjälp av ett antal subkloner, pSPG4 - pSPG7 (Fig l(c)) kunde de övriga regionerna studeras närmare. I figuren indikeras de sekvenser som kodar för en IgG-bindande produkt med "+" och övriga med "-“. pSPG4 liksom pSPG7 visade sig därvid koda för icke-bindande produkter och den del av sekvensen som uttrycker bindande polypeptider är således lokaliserad till C-regionerna, d v s Cl, C2 och C3.

I Fig 3 jämförs dels de homologa regionerna Cl, C2 och C3 och dels Dl och D2. I figuren redovisas aminosyrasekvensen för Cl respektive Dl och de avvikelser som C2 och C3 respektive D2 uppvisar har markerats. I de fall en annan nukleotidsekvens kodar för samma aminosyra har detta markerats med “*". Som synes är de fall där avvikelser i nukleotidsekvens även lett till att en annan aminosyra uttrycks mycket få. _ 11 _ 459 662 Exemgel 3 a) Rening av protein G från Streptococcus G 148 Bakterien odlades i ett trypton medium (se ovan) i en 12 l fermentor. Vid slutet av den logaritmiska fasen skördades bakterierna genom centrifugering. Ytbytet var ca 100 g bakterier (vâtvikt). Frigörandet av cellväggs- proteinet (protein G) från bakterien genomfördes på det sätt som Björk och Kronvall beskrivit (referens enl ovan). I korthet innebär detta att bakterierna suspen- derades (10 % vikt/volym) i 10 mM trishydroxyetylamino- metan (TRIS), pH 8.0. För digerering av bakterierna tillsattes, per ml bakteriesuspension, 100 mikroliter 0.4 M L-cystein (Sigma) och 80 mikrogram papain (Sigma, P-3125) löst i samma buffert. Blandningen inkuberades under 1 tim vid 37 OC pà skakbord. För att avbryta reaktionen tillsattes jodoacetamid (Sigma) till en slutlig koncentration av 6 mM. Supernatanten som utgjorde ca 1 l centrifugerades ifrån blandningen och protein G isolerades därefter genom kromatografisk separation.

I ett första steg justeras provets pH till 8.0 med NaOH varefter 100 ml DEAE Sephacel (Pharmacia AB), jämviktad i 10 mM Tris (HC1) pH 8.0, tillsattes. Blandningen omrördes under 2 tim, varefter gelen, tvättad med jämviktningsbufferten, packades på en kolonn (K26/40, Pharmacia AB), vilken eluerades med en linjär gradient, 500 ml, från 0 till 0.5 M NaCl. De protein G inne- hållande fraktionerna, detekterade genom immundiffusion mot polyklonalt IgG, sammanfördes till ett prov.

I ett andra steg späddes nämnda prov, (Ca 220 ml) med en lika stor volym PBST (30 mM Na-P04, 0.12 M NaCl, pH 7.2 och innehållande 0.05 % Tween 20) och blandades med 15 ml IgG-Sepharose® 4B (Pharmacia AB). Efter omrörning under 2,5 tim tvättades gelen på glasfilter b) ..l2_ 459 662 och packades i en Kl6/20 kolonn (Pharmacia AB).

Proteinet frigjordes därefter från gelbädden genom isokratisk eluering med 0.1 M glycin(HCl) pH 2.5 (flödeshastighet 10 ml/tim). Avsaltning skedde med hjälp av en PD-10 kolonn (Pharmacia AB) till 30 mM Na-P04, pH 7.2.

Proteinet karakteriserades därefter genom analytisk kromatografi på en Mono Q HR 5/5 kolonn (Pharmacia AB) och kromatogrammen indikerade att resultatet var starkt beroende av hur papaínextraktionen hade utförts. Två markerade toppar och ytterligare nâgra mindre toppar med protein G aktivitet noterades. SDS elektrofores indikerade att det var fråga om tvâ proteinband mot- svarande molekylvikterna 10 000 och 15 000. Reaktivi- teten hos protein G från enzymdigererad Streptococcus G 148 är redovisad i Tabell 1, tillsammans med motsva- rande värden för protein producerat enligt Exempel 3(b), nedan.

Rening och karakterisering av protein G producerat av en E. coli stam E. coli, stam innehållande plasmiden pSPGl (se ovan) användes för produktion av protein G.

Bakterien odlades i en 12 1 fermentor i ett standard E.'coli medium (se ovan). I slutet av den logaritmiska fasen fránskiljdes cellerna genom centrifugering. Ca 560 g bakterier (vátvikt) erhölls och dessa resuspen- derades i 560 ml PBS och sönderdelades i en kvarn ._13- 459 662 (Dyno-Mill Type KDL, Willy A. Bachofen AG, Maschinen- fabrik, Schweiz). Malningen skedde med 0.1-0.2 mm glaspärlor under omrörning med en hastighet av 3 000 varv per min och en flödeshastighet av 5.7,l/tim.

Supernatanten, ca 1 480 ml, avskiljdes genom centri~ fugering.

Den kromatografiska reningen skedde analogt med den i Exempel 3a beskrivna, men med den huvudsakliga skill- naden att det affinitetskromatografiska steget genom- fördes före jonbytessteget.

Analysen av det renade proteinet visade på förekomsten av 2 huvudfraktioner med molekylvikten 30 000 resp 40 000. Detta skall jämföras med de 10 000 resp 15 000 som noterades i fallet papaindigererad streptokock- bakterie. IgG reaktiviteten, se Tabell l, var emeller- tid den samma som noterades i det förra fallet.

I Tabell 2 redovisas en jämförelse mellan aminosyra- innehållet hos protein G från papainextraherad Strepto- coccus G148 (Exempel 3(a)) och E.coli producerat protein (Exempel 3(b)).

I Tabell 3 jämförs protein A och protein G med avseende pà deras affinitet för olika immunglobuliner. Tabellen redovisar den mängd av ett visst immunglobulin som krävs för 50 %-ig inhibering av bindningen mellan enzymkonjugerat polyklonalt kanin IgG och immobiliserat protein A resp protein G. De skillnader i affinitet som resultaten indikerar gör det tidigare nämnda fusions- proteinet mellan protein A och protein G till en intressant applikation vid utövandet av denna uppfinning.

Analogt avses även fusionspolypeptider innehållande aktiva fragment av protein A resp protein G, aktiva med avseende på immunglobulinbindande förmåga. 459 662 " I” Tabell l Affiníteten hos protein G från papaínextraherad Strepto- coccus G148 respektive E. coli med protein G kodañde plasmid enligt Exempel för immunglobuliner. Bestämningen har skett genom immundiffusíon och redovisas som direkt precipitation (2) eller som förmåga till inhibering av precipitationen mellan polyklonalt bovint IgG och protein G (1) samt vare sig inhibering eller precipitation (0). lgfklass Streptococci E. coli 29lzEl9§ël§_š9§ human 2 2 kanin 1 1 ko 2 2 häst 2 2 get 2 2 marsvin 2 2 får 2 2 hund 0 0 svin 2 2 råtta 0 0 mus 2 2 kyckling 0 0 ¥9a95l9§§l§_š9_âsêe_@s§1) (human IgE) (tpa) za (chl, c.c17) 2a (Gc, 5293.A57) Za (Gc, Rll.B6) 2a (Gc, Wl6.A30) 2b (GC, C3.D1) 2b (Gc, F6.C6) 3 (Gc, C3.D14) (Gc, V15.A13) N nl N na N mstv H *J W N nn N ha N hà N *“ ^* F -l5...

Ig-klass Streptococci E. coli §É@ÉEÉL¶YÉl9@ë-P§9ÉÉɧ IgG 1 lambda 2 2 1 kappa 2 2 2 lambda 2 2 2 kappa 2 2 3 lambda *) *) 3 kappa 2 2 4 lambda 2 2 4 kappa 2 2 IgM 0 IgA 0 *) IgD 0 0 *) Ej bestämt 1) Angivna med namnen på de olika monoklonalerna. 459 662 Tabell 2 _ 15 _ Jämförelse mellan aminosyrainnehället hos renat protein G bestämt pá de två huvudfraktíonerna, från papainextraherad streptococcus G148 respektive E. coli med protein G kodande plasmid enligt Exempel 3(b). Resultaten ges i molprocent.

Aminosyra Streptococci Gl48 E. coli Frakt I Frakt II Frakt I Frakt II asparagin + asparaginsyra 13,8 12,7 7,6 8,4 treonin 18,2 21,5 15,8 18,3 serin 2,0 - 2,5 2,4 glutamin + glutaminsyra 12,0 9,4 10,7 10,9 prolín 3,2 2,1 6,5 4,8 glycin 5,9 6,6 6,0 6,1 alanin 11,3 10,7 15,9 15,5 valin 8,6 10,4 8,2 8,6 metionin - 1,7 1,1 0,5 isoleucin 2,3 1,7 1,9 1,7 leucin 4,8 4,7 4,4 4,1 tyrosin 4,4 4,7 2,7 3,0 fenylalanin 2,9 3,0 3,0 3,0 lysin 10,6 10,7 12,7 12,1 histidin - - 0,4 0,2 arginin - - 0,6 0,4 cystein l) 1) 1) 1) tryptofan 1) l) 1) 1) 1) Ej bestämt. 459 662 Tabell 3 Jämförelse mellan protein A och protein G med avseende på deras affinitet för olika immunglobuliner. Tabellen redovisar den mängd av ett visst immunglobulin som krävs för 50 %-ig inhibering av bindningen mellan enzymkonjugerat polyklonalt IgG och immobiliserat protein A resp protein G. Icke-reaktivitet är markerad “-".

Immunglobulin Mängd (ng) som krävs för 50 %-ig inhibering Protein G Protein A š9è!ëè9§ë¿§-š¶§ humant 556 263 kanin ' 151 154 kO 294 3 125 häst 227 >lO 000 get 217 l 333 marsvin 2 500 454 får 357 >lO 000 hund 5 556 400 svin 456 179 råtta >10 000 - mus l 020 333 kyckling - - ë2æëaë_@x§l9æë:2r9§§¿a IgG1 lambda 250 174 l kappa 185 111 2 lambda 208 , 256 2 kappa 227 ,- 256 3 kappa _ 345 7 404 4 lambda 210 635 4 kappa 256 250 IgM - '

Claims (1)

1. 459 662 Hybrid-DNA-molekyl, med undantag för EMBL3-lambdafag (Q KRAV ATCC nr 40176, innehållande en eller flera av följande nukleotidsekvenser ACT ACA TTC ACT ACT ACA TTC ACT ACT ACA TTC ACT som IgG TAC ACT AAA TAC TAC ACT AAA TAC TAC ACT AAA TAT AAA ACT CAA GAC ACT CAA GAC AAA ACT CAA GAT TTA GAA TAC GAT CTT GAA TAC GAT CTT AAA TAC GAT ATC GCT GCT GCG GTT GCT GCT GCG GTT GCA GCT GCG CTT GTT AAC ACT ATT GTT AAC ACT ATT GTA AAC ACT AAT GAT GAC AAG AAT GAT GAC AAG AAT GAC GAC AAG GGT GCT AAC ACC GGT GCT AAC ACC GGT GCA AAC ACC GCT GGT TTT GCT GGT TTT AAA GAA GGT TTT ACA ACT GTT ACA ACA ACT GTT ACA ACA ACT GTT ACG TTG GCA GAC GTT TTG GCA GAC GTT TTG GCA GAT GTA GAA GGT ACT GAA GGT ACT AAA GAA GGT ACT GGC GAA GAA GGC GAA GAA GGC AAA GTT GAA, GAA GTC TGG GAA GTC TGG GAA GCC TGG koder för ett protein eller en polypeptid med samma specificitet som protein G från Streptococcus GI48. Plasmid innehållande en eller flera nukleotidsekvenser enligt krav

1. Sätt att producera ett protein eller en polypeptid med samma IgG specificitet som protein G från Streptococcus Gl48, k ä n n e t e c k n a t av att minst en hybrid-DNA-molekyl enligt krav l införes 1 E. coli 'Q 459 662 nämnda E. coli odlas i ett lämpligt medium det bildade proteinet isoleras genom affinitets- kromatografisk rening med hjälp av IgG bundet till en olöslig bärare.