JPH08205876A - 免疫グロブリン結合性タンパク質及びその製造方法 - Google Patents
免疫グロブリン結合性タンパク質及びその製造方法Info
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Abstract
リンGに対する結合特性を組み合わせて有する融合から
なる免疫グロブリン結合性タンパク質及びその製造方法
を提供する。 【解決手段】 プロテインA又はその活性フラグメント
をコードする遺伝子配列に融合されたプロテインG又は
その活性フラグメントをコードするヌクレオチド配列を
有する組換えDNAが挿入された微生物を培養し、プロ
テインAとプロテインGのイムノグロブリンGに対する
結合特性を組み合わせて有する融合タンパク質又はポリ
ペプチドを採取することからなる免疫グロブリン結合性
タンパク質の製造方法及び得られた免疫グロブリン結合
性タンパク質。
Description
属し、プロテインAとプロテインGのノムノグロブリン
Gに対する結合特性を組み合わせて有する融合タンパク
質又はポリペプチドからなる免疫グロブリン結合性タン
パク質及びその製造方法に関する。
する細菌産生タンパク質又はポリペプチドの存在は長年
に渡り公知である。このようなタンパク質の中で、最も
よく研究されているのは黄色ブドウ球菌(Staphylococcu
s aureus) 由来のプロテインAであり、これは事実上商
業的成功を収めた唯一のタンパク質である(スエーデ
ン、ウプサラ市のPharmacia AB製プロテインA及びプロ
テインASepharose R ) 。
〜76並びに米国特許第3,850,798 号明細書及び同第3,99
5,018 号明細書) は、プロテイン A−IgG 系の一つの成
分を、不溶性ポリマー上に固定した場合、別の成分を結
合するのに使用できることを発見している。これによ
り、タンパク質を大量に精製することや抗体の単離に非
常に単純且つ選択的な方法を開発することが可能になっ
た。各種の異なる免疫グロブリンに対するタンパク質の
特異性は詳細に研究されており、例えばForsgrenA.et a
l.,Staphylococci and StaphylococcalInfections 2(19
83) p.429〜479、Academic Press Inc. (London)が参照
できる。このタンパク質の顕著な特徴は、ヒト系のIgG
のサブクラスIgG3に対する親和性が低いことである。こ
のサブクラスが血清中全IgG 量の約8%の量であるとい
う事実を考慮すると、IgG の全クラスを単離するために
は補足的な精製段階を必要とする。
l. 111(5) (1973) p.1401〜6)は、C型(group C) 及び
G型(group G) 連鎖球菌もまたIgG に対する親和性を有
する成分をその表面に有していることを示している。更
に各種の実験から、この点に関する前記成分の反応が非
免疫反応であること、即ち免疫グロブリンがFab 部分内
の抗原結合部位を介して結合していないこと、及びIgG3
もこの系の中で結合されていることが判った。このFc結
合成分はタンパク質の性質を有することが後に判明し、
「プロテインG」と命名された。従って、黄色ブドウ球
菌プロテインAに加えて、又はその全部若しくは部分に
置き換わるものとして、プロテインGは、IgG クラス免
疫グロブリンのFc部分に結合できる細菌産生タンパク質
の中で、例えばIgG を精製するために(米国特許第3,99
5,018 号明細書)、当然選択することができる。しかし
このタンパク質は、その細菌からの分離に拘わる問題点
のために、それほど深く研究されていない。
9 頁に、Bjorck及びKronvallが、パパインを用いた酵素
分解によって細菌から少量の上記タンパク質を分離する
方法を発表した。この方法は特定の機能及び構造の研究
を実施できる程の材料を提供するが、その収率は、例え
ばモノクローナル抗体の精製のような商業的な使用には
低すぎる。また、そのような方法を用いて均一且つ再生
可能な生産物を獲得することは困難である。その上連鎖
球菌は病原性であり、大量培養には複雑な複合培養基を
使用する必要がある。従ってC型及びG型の連鎖球菌由
来のFc結合タンパク質又はそのフラグメントを生成する
新規な方法が必要である。
来のプロテインGと同じIgG特異性を有するタンパク
質又はポリペプチドに更にプロテインAが融合してなる
免疫グロブリン結合性をタンパク質は、免疫グロブリン
の精製に極めて有用であろう。
的は、プロテインAとプロテインGのイムノグロブリン
Gに対する結合特性を組み合せて有する融合タンパク質
又はポリペプチドからなる免疫グロブリン結合性タンパ
ク質及びその製造方法を提供することにある。
とG型連鎖球菌株G148(group G Streptococci strainG1
48)由来のプロテインGと同じIgG 特異性を有するタン
パク質又はポリペプチドとの融合タンパク質からなる免
疫グロブリン結合性タンパク質及び組換えDNA分子を
用いるその製造方法に関する。本明細書中、『活性ポリ
ペプチド』とは前記IgG 特異性を有するポリペプチドの
ことである。
には、例えばプラスミド又はファージDNA と言った適当
なクローニングビヒクル又はベクターを制限酵素の働き
で切断し、次いで所望のタンパク質又はポリペプチドを
コードするDNA 配列を切断部位に挿入して組換えDNA 分
子を形成する。この一般的な方法自体は公知であり、DN
A 配列を切断したり連結したりするための各種技術も文
献に記述してある(例えば米国特許第4,237,224 号明細
書参照)が、しかし、本発明者等の知る限りではこれら
の技術は本発明のタンパク質系には使用されていない。
所望のヌクレオチド配列の源として細菌菌株連鎖球菌G1
48を使用する場合、前記配列を単離して、下記の実験に
記述する方法で適当なベクターにそれを導入することが
可能である。
活性フラグメントを生成する微生物は、例えば大腸菌、
バチルス、連鎖球菌、ブドウ球菌、更に酵母及び培地中
の他の真核細胞の株のような細菌宿主を包含する。細菌
宿主の中でも、グラム陽性タイプのものは、細胞壁が唯
一つの膜を包含するので好ましい。タンパク質又は活性
フラグメントが系に適したシグナルペプチドと共に産生
する場合、生産物は培地中に直接分泌される。多数のシ
グナルペプチドがここ数年の間に発表された。例えばWO
84/00774号明細書である。各種細菌系中に良好に分泌す
るようなシグナルペプチドを選択して使用することが、
当業者には公知である。発現が最大になるように、プロ
モーター及びリボソーム結合配列のような調節要素を公
知の方法で変化させ得る。
プロテインGと同じIgG 特異性を有するタンパク質又は
ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を包含する
組換えDNA 分子を包含する。この明細書の実験に関する
記載部分から明らかなように、プロテインG遺伝子はIg
G 結合ポリペプチドをコードする次のヌクレオチド配列
C1、C2及びC3を有する。
列を一つ又はそれ以上包含する組換えDNA 分子に関す
る。『類似配列』とは前記IgG 特異性のポリペプチドを
コードする配列を意味する。
チド配列を有するプラスミド及びファージと言ったベク
ター、及び微生物特にその中にこのようなベクターが挿
入される例えば大腸菌、バチルス及びブドウ球菌の菌株
のような細菌を包含する。或いはまた、このようなヌク
レオチド配列を、微生物の天然遺伝子材料と一体化させ
てもよい。
インGと同じIgG 特異性を有するタンパク質又はポリペ
プチドを生産する方法に関する。この方法においては、
上記したような微生物を適当な培地中で培養し、得られ
た生産物を、不溶性キャリアに結合したIgG を用いたア
フィニティークロマトグラフィー精製によって又は別の
単離方法、例えばイオン交換クロマトグラフによって単
離する。
列を有するベクター、特にプラスミドは、都合のよいこ
とに容易に切断できる制限部位を備えている。その制限
部位で、別の生産物をコードするヌクレオチド配列がプ
ロテインGをコードするヌクレオチド配列に融合でき、
こうして所謂融合タンパク質が発現する。融合タンパク
質は、IgG への結合能を利用する方法によって単離で
き、所望により系の別の成分を融合タンパク質から分離
させる。この技術は、プロテインA系についてWO84/031
03号明細書に詳細に記載してあり、類似な方法で本発明
の内容にも適用し得る。プロテインG及びプロテインA
は、部分的に相互に相補的である結合特性を有している
ので、これらの成分の両方を含有する融合タンパク質
は、潜在的に魅力的な生産物である。
配列を、融合ベクターつまりプロテインAとプロテイン
Gの結合特性を組み合せて有する融合タンパク質をコー
ドする一つの分子の中で、プロテインA又はその活性フ
ラグメントをコードする遺伝子配列に融合させる。ここ
にいう、この特異的なヌクレオチド配列を有するベクタ
ー及び微生物も、本発明に包含される。更に、このヌク
レオチド配列によってコードされた、又は等価の方法で
生産された、プロテインAとプロテインGの結合特性を
組み合せて有する融合タンパク質又はポリペプチドも本
発明に含まれる。
プサラ市の StatensVeterinarmedicinska Anstalt(SVA)
から取得した。
soix D,J.Mol.Biol.41(1969)p.459〜472 及びJM105(Mes
sing J.及びCarlsson J., J.Biotechnol. 1(1984) p.25
3〜264)を構築すべきプラスミドの細菌宿主として使用
し、且つ菌株NM538 及びNM539 をラムダベクターEMBL3a
とクローニングするのに使用した(Frischauf A-M eta
l., J.Mol.Biol. 170(1983) p.827〜842)。使用したプ
ラスミドベクターは、pUC13 、pUC18 及びpUC19(Norran
der J. et al,Gene 26(1983) p.101〜106)、及びpBR322
(Bolivar F et al,Gene 2(1977) p.95〜113)であった。
記の量は1リットルの培地についての量を示してある。
ここでも、1リットルの培地についての量を示す。
singstoke 、Hants.、England )中で培養した。細胞を
洗浄し、次いでストレプトミセスグリセウス(Streptom
yces griseus)9179を培養した後の無細胞培地中で再浮
遊し(元の容積の20分の1 )、次いでリゾチームを濃度
1mg/ml まで加えた。ストレプトミセス菌株(Dr.W.Kohl
er,Institute fur Mikrobiologie und experimentelle
Therapie,Jena,DDR から取得) は溶菌活性を誘発させる
Zeitschrift fur allg.Mikrobiologie vol.5(4)(1965)
p.308〜314 のPrauser 及びKohlerによる方法で培養し
た。37℃で2時間連鎖球菌細胞を培地中でインキュベー
トした後、 J.Mol.Biol.3(1961) p.208〜218 にあるMar
mur J. の方法でDNA を抽出した。
出によって調製した(Birnboim HCet al., Nucleic Aci
ds Res.7(1979) p.1513〜1523)。
述されたように調製した(MolecularCloning:A Laborato
ry Manual,Cold Spring Habor Laboratory,New York 19
82)。
による方法で実施した(Methods Enzymol,68(1979) p.3
26〜311 )。
ゼ、DNA ポリメラーゼI 及びクレノウフラグメントをNe
w England Biolabs(Boston,USA) 又はBoehringer Mannh
eim(Mannheim、Federal Republic of Germany)から取得
して、各製造業者の指示に従って使用した。
するラムダクローンの単離 連鎖球菌G148の遺伝子ライブラリーを、Frischauf et a
l.(1983、上記参照)の方法に類似の方法で生成した。
化し、BamHI 切断ラムダベクターEMBL3aに連結した。連
結DNA をファージ粒子にin vitroでパッケージした。こ
のファージ粒子はE.coli NM539細胞を感染させることが
できた。得られたファージライブラリーのIgG 結合活性
を分析するために、寒天平板上でファージを滴定して、
37℃で一晩インキュベートした。翌日プラーク頻度103
〜104 を有する平板を選択して、これらの選択した平板
の各々の上にニトロセルロースフィルタ(Schleicher &
Schull,Membranefilter BA85 (0.45 マイクロメート
ル) Dassel,Federal Republic of Germany) を置いた。
室温で約10分間ブロッティングを行なってから、 0.1%
濃度までのTween20 を含有するリン酸塩緩衝塩化ナトリ
ウム溶液(PBS) 中に1時間フィルタを浸した。次いで、
フィルター紙を、0.05%Tween20 を加えたPBS(PBST) 中
に約107 cpm の125 I 標識ウサギIgG 抗体(特異活性7
mCi/mg)を含有するペトリ皿に移した。室温で2時間イ
ンキュベートした後で、フィルター紙をPBST中で10分間
に2回洗浄し、次いで乾燥した。フィルター紙のオート
ラジオグラフィ分析は、放射性抗体を結合するポリペプ
チドを生成した陽性ラムダクローンを示した。これらの
クローンを元の寒天平板上に選択して、再度分析した。
結局、『ラムダSPG1』と称されるクローンを後続処理の
ために選択した。上記系を使用することに加えて、E.co
liの適当な菌株中にラムダSPG1を増殖させて所望のタン
パク質を生成することも更に可能である。
ラグメントの両側にSalI部位が位置している構造を有し
ている。SalIを有するラムダSPG1DNA を切断すると、元
々挿入されていた連鎖球菌DNA フラグメントに由来する
それぞれ約2.1キロベースペア(Kb)及び12Kbの二つのフ
ラグメントができた。これら二つのフラグメントは、Sa
lI切断pUC19 に連結して、2.1Kb 及び12Kbフラグメント
をそれぞれ含有する二つの組換えプラスミドpSPG1 とpS
PG8 とを生成した。前記それぞれのプラスミドを含有す
るE.coli HB101の形質転換細胞を、最終濃度50マイクロ
グラム/ml までアンピリシンを加えて、ルリアブイヨン
(Maniatis et al.) 中で培養し、細胞溶解物(Lofdahl
et al.,Proc.Natl.Acad.Sci. USA 80(1983), p.697〜70
1 )のIgG 結合活性をテストした。これは、血球凝集反
応テスト(Guss etal., Eur.J.Biochem.153(1985) p.57
9〜585 )によって実施した。プラスミドpSPG1 を含有
するE.coliクローンは、このテストでは陽性であった。
IgG 結合部分を含有するプラスミドpSPG1 を、適当な制
限酵素を用いて消化した。このように形成したDNA フラ
グメントを、ファージM13 の複製型にクローンし、次い
でE.coli株JM105 に形質転換した。挿入DNA フラグメン
トのヌクレオチド配列を、所謂ジデオキシ方法(Sanger
F.,Nicklen S. 及びCoulson,AR(1977),Proc.Natl.Acad.
Sci.USA 74, 5463−5467) によって分析した。
1(a) の範囲0.28から1.73Kbにある1.5KbEcoRI/HindIII
フラグメントをpUC18 及びpUC19 にクローンして、それ
ぞれpSPG2 及びpSPG3 を作成した。これらの完全な配列
を図2(図2(a) 及び図2(b) )に示す。この配列中に
存在し得る領域を図1(b) に示すが、これは24個のアミ
ノ酸それぞれをコードする反復構造A1、A2及びA3と、そ
の間に位置するやはりこれも反復性の配列B1及びB2(51
アミノ酸) とを示す。所謂スペーサー領域Sに続いて、
55個のアミノ酸それぞれに対応する反復性の領域C1、C2
及びC3と、その間に位置する領域D1及びD2(15個のアミ
ノ酸)がある。その次は、プロテインA系の所謂Xr領域
(Guss et al.(1984) Eur.J.Biochem.138, p.413〜420
)に類似の構造を有する親水性部分Wである。
アミノ酸分析から得た結果を(図1(c) )、プロテイン
A系と比較した時に、W及びM領域の両方が細胞壁−細
胞膜相互作用に関係することが示された。その他の領域
には、多数のサブクローン、pSPG4〜pSPG7(図1(c))を
用いて更に詳細に調査を実施した。この図では、IgG結
合生成物をコードする配列を『+』符号で表し、残りを
『−』符号で表した。pSPG4 及びpSPG7 は非結合生成物
をコードしたことが判明し、つまり結合ポリペプチドを
発現する配列部分はC領域、即ちC1、C2及びC3に位置す
るのである。
比較を示している。図はC1及びD1のアミノ酸配列を示
し、C2及びC3並びにD2それぞれにおけるデビエイション
の発生を表示する。同じアミノ酸をコードする異なるヌ
クレオチド配列の箇所は、『*』で示してある。これら
のことから、ヌクレオチド配列のデビエイションが異な
るアミノ酸の発現を生じるような箇所は非常に少ないこ
とが分かる。
照)で培養した。対数期の最後に、細菌を遠心単離によ
って収穫した。収率は約100gの細菌(湿量)であった。
細菌由来の細胞壁タンパク質(プロテインG)の分離
は、Bjock 及びKronvall(上記参照)による方法で実施
した。つまり、その方法は、10mMのトリスヒドロキシエ
チルアミノメタン(Tris)、pH8.0 中に細菌(10重量%
/容積)を浮遊させることから成る。細菌を消化するた
めに、1mlの細菌浮遊液に対して、同じ緩衝液中に溶解
した100 マイクロリットルの 0.4M L-システイン(Sigm
a) 及び80マイクログラムのパパイン(Sigma 、p-312
5)を加えて、37℃で1時間振動テーブル上で混合物を
インキュベートした。反応を止めるために、ヨードアセ
トアミド(Sigma) を、最終濃度6mMになるまで加えた。
遠心単離によって約1リットルの上清を混合物から除去
し、プロテインGをクロマトグラフ分離によって分離し
た。
0 に調整し、次いで10mMのTris(HC1) 中で平衡にされた
100ml のDEAEセファセル(Sephacel)(Pharmacia AB)を加
えた。混合物を2時間撹拌して、平衡化緩衝液で洗浄し
た後のゲルをカラム(K26/40、Pharmacia AB)につめ、
500ml の0から0.5MのNaCl直線勾配溶出した。プロテイ
ンGを含有する画分をポリクローナルIgG に対する免疫
拡散によって検出し、集めて一つのサンプルを形成し
た。
を同量のPBST(30mM Na-PO4 、0.12M NaCl、pH7.2 及び
0.05% Tween20含有)で希釈し、15mlのIgG セファロー
ス4B(Pharmacia AB)と混合した。2.5 時間撹拌した後
に、ゲルをガラスフィルター上で洗浄し、K16/20カラム
(Pharmacia AB)につめた。次いでタンパク質を、0.1Mグ
リシン(HC1) 、pH2.5(流量10ml/時間) のイソクラティ
ック溶出(isocratic elution) によって、ゲル床から分
離した。PD-10 カラム(Pharmacia AB)で脱塩を施し、30
mMの Na-PO4 、pH7.2 に下げた。
AB)の分析クロマトグラフィーによってタンパク質の特
性を調べた。クロマトグラムは、結果がパパイン抽出を
実施する方法に非常に依存することを示した。プロテイ
ンG活性は、二つの大きなピークと幾つかのそれより小
さいピークを示した。SDS 電気泳動は、MW10,000及びMW
15,000に対応する二つのタンパク質帯を明らかにした。
表1は、下記の実施例3(b) による方法で得た対応する
値と、酵素によって消化した連鎖球菌G148由来のプロテ
インGの反応性を表す。
インGの精製及び特性 プラスミドpSPG1(上記参照) を含有するE.coli株を、プ
ロテインGを生産するために使用した。
記参照)中で細菌を培養した。対数期の最後に、細胞を
遠心分離で分離して、約560g(湿量)の細菌を得た。こ
れらを560ml のPBS 中に浮遊し、ミル(Dyno-mill Type
KDL,Willy A.BachofenAG,Maschinenfabrik,Switzerlan
d) 中でシュレッドした。ミリングは 0.1〜0.2mm のガ
ラスビーズを用いて、速度3,000 反転/分、流量5.7 リ
ットル/時間で撹拌して実施した。上清約1,480ml を遠
心分離で分離した。
類似の方法で実施した。主な相異点はアフィニティーク
ロマトグラフィー段階をイオン交換段階の前に実施した
ことであった。
分子量30,000及び40,000の二つの主要画分があることが
判明した。これは、パパインによって消化した連鎖球菌
の場合に得られた値10,000及び15,000とそれぞれ比較す
る必要がある。しかし、IgG反応性は同じであった。表
1を参照のこと。
来のプロテインGのアミノ酸組成物(実施例3a)、及び
(ii)E.coliから生成したタンパク質のアミノ酸組成物
(実施例3b)の比較を示す。
性について、プロテインA及びプロテインGの比較を表
す。表は、酵素−結合ポリクローナルウサギIgG と固定
化プロテインA又はプロテインGそれぞれとの間の結合
を50%阻害するのに必要とする各免疫グロブリンの量を
表す。結果から明らかにされるように、親和性における
相異から、前記プロテインA−プロテインGの融合タン
パク質は、実施例4(下記)に示したように本発明の興
味ある適用である。また、プロテインA及びプロテイン
Gの活性フラグメントを含有する融合タンパク質が意図
される。『活性』とは免疫グロブリン結合能についてで
ある。
A及びプロテインGから成る融合タンパク 質の、免疫グ
ロブリン結合活性をコードするプラスミドベクターの構
築 この実施例の構築においては、異なる制限エンドヌクレ
アーゼ及びT4 DNAポリメラーゼを入手するため、上記製
造業者に加え他の製造業者(Pharmacia AB,Sweden ,及
びIBI (Inter-national Biotechnologies Inc.,New Hav
en) )も使用した。製造業者の指示に従って酵素を使用
した。構築の各段階の間に、使用した酵素の不活性化及
び排除を行い(フェノール/クロロフォルム抽出を利
用)、続いてDNA をエタノール沈降させた。最後に、DN
A サンプルを適当な緩衝液中に再浮遊させた。
c Acids Res.12,4431-4443) を使用した。連結サンプル
をE.coli細胞に形質転換した後で、組換えクローンをア
ンピシリン耐性について選択した。
の約1.8Kb のEco RI/Sal I フラグメント(図1(c) の
0.3 から2.1 の位置)を含有するpG107 と称するサブク
ローンを使用して、プロテインGの免疫グロブリン結合
領域をコードするDNA フラグメントを単離した。図4に
概要を示したように、pG107 をTha I を用いて消化し、
続いてBam HI認識部位を有する8 マー(8-mer) のオリゴ
ヌクレオチドアダプター(Pharmacia AB,Sweden,cat.no.
27-7730-01) と連結する。連結サンプルをBst NIを用い
て切断し、続いてクレノウフラグメント及び四つのデオ
キシヌクレオチドと共にインキュベートし、Bs t NI制限
部位を満たし、それによって平滑末端を生成した。その
次に、Bam HI処理を行ない、サンプルをアガロースゲル
中で電気泳動にかけた。約830n.t. のDNA フラグメント
を取り出して、溶出及び精製した。このフラグメントの
概略図を図4に示す。先にXba I を用いて消化してある
pTZ18R(Pharmacia AB,Sweden,cat.no.27-4984-01) にこ
のフラグメントを連結し、続いてクレノウフラグメント
及び四つのデオキシヌクレオチドと共にインキュベート
し、Xba I 制限部位を満たして平滑末端を生成し、最後
にBamHIを用いて消化した。こうして、プロテインGの
免疫グロブリン結合領域を有する精製Bam HI/平滑末端
フラグメントを、生成Bam HI/平滑末端でpTZ18Rに連結
した。連結の後で、サンプルを凍結コンピテントE.coli
細胞に形質転換した。プロテインGフラグメントを有し
プロテインGの生産が陽性の、pUG26 と称するクローン
を単離した。pUG26 の概略図を図4に示す。
erminator(PharmaciaAB 、Sweden、cat.no.27-4890-0
1)と称されるオリゴヌクレオチドを含有するpTZ18Rの誘
導体を構成した。pTZ18RUTL ベクターの構築の概略を図
5に示す。 pTZ18R をPst I を用いて消化し、続いてT4
DNAポリメラーゼと共にインキュベートして粘着末端を
消化し、UTL アダプターが連結する平滑末端を生成し
た。連結の後で、サンプルを凍結コンピテントE.coli細
胞に形質転換して、修飾Pst I 部位に挿入された一つの
UTL アダプターを含有するクローンを単離し、それをpT
Z18RUTL と称した。
て消化して、消化サンプルをアガロースゲル中で電気泳
動にかけて、プロテインGの免疫グロブリン結合領域を
コードする約860n.t. のDNA フラグメントを取り出し、
溶出及び精製した。このフラグメントをEco RI/Sal I
消化pTZ18RUTL ベクターに連結した(図5)。
E.coli細胞に形質転換して、プロテインGの生産が陽性
のpUG27 と称するクローンを単離した。pUG27 の概略図
を図5に示す。
領域E、D、A、B及びCと共に、プロテインAプロモ
ーター及びリボソーム結合配列を含有するDNAフラグメ
ントを単離するために、pSPA8 と称するプラスミド(Uhl
en et al.,1983,Gene,23,369〜378)を使用した。このプ
ラスミドをBst NIを用いて消化し、続いてクレノウフラ
グメント及び四つのデオキシヌクレオチドと共にインキ
ュベートしてBst NI部位を満たし、平滑末端を生成し
た。次にこれをEco RIを用いて消化した。消化の後で、
サンプルをアガロースゲル中で電気泳動にかけた。プロ
テインAの前記領域を包含する約1200n.t.のDNA フラグ
メントを取り出し、溶出及び精製した。このフラグメン
トをEco RI/S ma I 消化pUG27 に連結した(図5)。連
結の後で、サンプルを凍結コンピテントE.coli細胞に形
質転換し、プロテインAフラグメントを含有してプラス
ミドpAG1を備えたクローンを単離した(図5)。pAG1プ
ラスミドは、図6に概略を示した融合分子をコードす
る。図6は異なる結合のより詳細な説明を包含する。
ベクターの構築 pE1 プラスミドの構築の概略を図7に示す。pEZZプラス
ミド(Nilsson et al.(1986) Protein Engineering, 印
刷中)を使用した。pEZZプラスミドをAcc I を用いて消
化し、続いて低濃度(1mg/l)で再連結してAcc I 部位
間の領域を除いた。連結サンプルを凍結コンピテントE.
coli細胞に形質転換して、二つのZZ域が欠如しているpE
1 と称するクローンを単離した。
いて消化し、消化サンプルをアガロースゲル中で電気泳
動にかけて、プロテインGの免疫グロブリン結合領域を
包含する約840n.t. のDNA フラグメントを取り出して、
溶出及び精製した。このフラグメントをBam HI/HindII
I 消化pE1 プラスミドに連結した。
グメントをBam HI/HindIII 消化pE1 に連結した後で、
サンプルを凍結コンピテントE.coli細胞に形質変換し
て、プロテインGフラグメントを含有するプロテインG
の生産が陽性の、pEG1と称するクローンを単離した。
を、アンピシリン(最終濃度100 マイクログラム/ml)
を加えた1リットルのE.coli液体培養基(上記参照)の
中で、37℃に保ち一晩増殖させた。一晩の培養でできた
増殖培地を遠心分離によって回収し、続いてNilsson et
al.(1986,Protein Engineering,印刷中) に従ってIgG
アフィニティークロマトグラフィーにかけた。
て分析すると、ヌクレオチド配列から算定した分子量と
一致した(pEG1 遺伝子生成物では約31000 、pAG1遺伝子
生成物では約66000 であった) 。
る、pAG1及びpEG1がコードするタンパク質の免疫グロブ
リン結合の親和性を、Pharmacia ABの市販プロテインA
と比較した。異なるタンパク質の免疫グロブリン結合活
性を、Gusset al.(EMBO J.5,1567〜1575(1986)) の競合
ELISA 技術を用いて分析した。異なる免疫グロブリンを
テストして、アルカリ性ホスファターゼ結合ポリクロー
ナルウサギIgG 抗体と固定化市販プロテインA及びプロ
テインAG及びGとの間の結合阻害能を調べた。これらの
研究の結果を表4及び表5に示した。ただし、これらの
表中の数字は、ポリクローナルウサギIgG に対する結合
活性について基準化したものである。
ブタ及びマウスのポリクローナルIgG に対して、プロテ
インAはpEG1から誘導したプロテインGよりも高い親和
性を有し、反対にpEG1から誘導したプロテインGはウ
シ, ウマ, ヤギ及びヒツジのポリクローナルIgG により
強い相互作用を示すことを表わしている。三つのタンパ
ク質全てが、ポリクローナルラットIgG に同じ相対的な
強さで相互反応するが、ポリクローナルチキンIgG には
結合しない。また表4はpAG1から発現した融合プロテイ
ンAGの結合活性も示す。プロテインAGは、プロテインA
及び/又はプロテインGと結合する全種類のポリクロー
ナルIgG に対して親和性を有する。従って表4に示すよ
うに、プロテインAGはプロテインA及びGの両方の結合
活性を組み合わせたものである。
プロテインA、G及びAGの親和性を表5に示す。プロテ
インAは、IgG1、IgG2及びIgG4に対して高い親和性を示
すが、IgG3にはそうでない。これに対してプロテインG
は全IgG サブクラスに対して高い親和性を示している。
プロテインAGは、IgG3を除く全サブクラスに高い親和性
を示すが、IgG3に対してはは、プロテインGよりも低い
がプロテインAよりは高い親和性をもって結合する。プ
ロテインA、G又はAGのいずれもIgM 及びIgDクラスの
骨髄腫には親和性を示さない。
てコードされるプロテインGと同じくらいの対応するIg
G 結合特異性を有するタンパク質をコードすることを示
す。
テインAGは、一つの分子の中に、二つの別々のプロテイ
ンA及びGそれぞれの組み合わせIgG 結合特異性を有す
る。
ロブリンGに対する結合特性を組み合わせて有する融合
タンパク質からなる免疫グロブリン結合性タンパク質及
びその製造方法を提供した。
す。図1(b)は、pSPG2及びpSPG3にクロー
ンニングされた1.5KbEcoRI/HindIII フ
ラグメント中に存在する領域を示す。図1(c)は、p
SPG1とこれから由来したフラグメントを示す。
「+」は、フラグメントからの生成物がIgGと結合し
たことを、「−」はフラグメントからの生成物がIgG
と結合しなかったことを、それぞれ示す。
ind IIIフラグメントの完全なヌクレオチド配列及び
アミノ酸配列を示す。
ind IIIフラグメントの完全なヌクレオチド配列及び
アミノ酸配列を示す。
較図である。
る。
を構築するための各段階を示す概略図である。
領域を有するプロテインAGの詳細を示す。
である。
Claims (8)
- 【請求項1】 プロテインA又はその活性フラグメント
をコードする遺伝子配列に融合されたプロテインG又は
その活性フラグメントをコードするヌクレオチド配列を
有する組換えDNAが挿入された微生物を培養し、プロ
テインAとプロテインGのイムノグロブリンGに対する
結合特性を組み合わせて有する融合タンパク質又はポリ
ペプチドを採取することからなる免疫グロブリン結合性
タンパク質の製造方法。 - 【請求項2】 ヌクレオチド配列が次のアミノ酸配列の
少なくとも一つをコードするものである請求項1に記載
の製造方法。 【化1】 - 【請求項3】 ヌクレオチド配列が次の塩基配列の少な
くとも一つからなる請求項1に記載の製造方法。 【化2】 - 【請求項4】 組換えDNAがプラスミド又はファージ
である請求項1に記載の製造方法。 - 【請求項5】 微生物がエシェリヒア・コリ(Esch
erichia coli)である請求項1に記載の製
造方法。 - 【請求項6】 プロテインAとプロテインGのイムノグ
ロブリンGに対する結合特性を組み合わせて有する免疫
グロブリン結合性タンパク質。 - 【請求項7】 次のアミノ酸配列の一つ又はそれ以上を
有する請求項6に記載の免疫グロブリン結合性タンパク
質。 【化3】 - 【請求項8】 プロテインA又はその活性フラグメント
をコードする遺伝子配列に融合されたプロテインG又は
その活性フラグメントをコードするヌクレオチドを有す
る組換えDNAが挿入された微生物を培養し、プロテイ
ンAとプロテインGのイムノグロブリンGに対する結合
特性を組み合わせて有する融合タンパク質又はポリペプ
チドを採取することにより得られる請求項6又は7に記
載の免疫グロブリン結合性蛋白質。
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