JP2771204B2 - 遺伝子工学的手法による抗体の製造法 - Google Patents
遺伝子工学的手法による抗体の製造法Info
- Publication number
- JP2771204B2 JP2771204B2 JP63335695A JP33569588A JP2771204B2 JP 2771204 B2 JP2771204 B2 JP 2771204B2 JP 63335695 A JP63335695 A JP 63335695A JP 33569588 A JP33569588 A JP 33569588A JP 2771204 B2 JP2771204 B2 JP 2771204B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- protein
- functional
- bacterium
- antibody
- hapten
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Lifetime
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/62—DNA sequences coding for fusion proteins
- C12N15/625—DNA sequences coding for fusion proteins containing a sequence coding for a signal sequence
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/62—DNA sequences coding for fusion proteins
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
- C07K2319/02—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a signal sequence
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
- C07K2319/035—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a signal for targeting to the external surface of a cell, e.g. to the outer membrane of Gram negative bacteria, GPI- anchored eukaryote proteins
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Immunology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
- Steroid Compounds (AREA)
Description
【発明の詳細な説明】 酵母における抗体の発現については記述があるが（C.
R.Wood、M.A.Boss、J.H.Kenten、J.E.Calvert、N.A.Rob
ertsおよびJ.S.Emtage:Nature 314,446（1985））、発
現されたタンパク質のうちのごく一部が機能することが
証明されているにすぎない。大腸菌（E.coli）において
は、今までのところ、抗体タンパク質は変性したかたち
でしか得ることができていない（M.A.Boss、J.H.Kente
n、C.R.WoodおよびJ.S.Emtage:Nucleic Acids Res.12、
3791（1984）、S.Cabilly、A.D.Riggs、H.Pande、J.E.S
hively、W.E.Holmes、M.Rey、L.J.Perry、R.Wetzelおよ
びH.L.Heyneker:Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.81,3273（1
984））。酵母または他の微生物からの活性抗体または
抗体断片の精製については、開示されていなかった。今
日までに、タンパク質の折りたたみについての試みによ
って、正しく折りたたまれた組換え抗体タンパク質のご
く僅かが得られたにすぎない。さらに、所望の機能性タ
ンパク質を不要の非機能性タンパク質から分離すること
は難しい。これは、結合定数、折りたたみ率、スペクト
ル的性質などの正確な測定、および治療や産業における
使用を妨げる。とくに、再折りたたみのための確実な工
程および測定方法がないことから、折りたたみ条件を最
適にすることはしたがってきわめて難しい。
R.Wood、M.A.Boss、J.H.Kenten、J.E.Calvert、N.A.Rob
ertsおよびJ.S.Emtage:Nature 314,446（1985））、発
現されたタンパク質のうちのごく一部が機能することが
証明されているにすぎない。大腸菌（E.coli）において
は、今までのところ、抗体タンパク質は変性したかたち
でしか得ることができていない（M.A.Boss、J.H.Kente
n、C.R.WoodおよびJ.S.Emtage:Nucleic Acids Res.12、
3791（1984）、S.Cabilly、A.D.Riggs、H.Pande、J.E.S
hively、W.E.Holmes、M.Rey、L.J.Perry、R.Wetzelおよ
びH.L.Heyneker:Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.81,3273（1
984））。酵母または他の微生物からの活性抗体または
抗体断片の精製については、開示されていなかった。今
日までに、タンパク質の折りたたみについての試みによ
って、正しく折りたたまれた組換え抗体タンパク質のご
く僅かが得られたにすぎない。さらに、所望の機能性タ
ンパク質を不要の非機能性タンパク質から分離すること
は難しい。これは、結合定数、折りたたみ率、スペクト
ル的性質などの正確な測定、および治療や産業における
使用を妨げる。とくに、再折りたたみのための確実な工
程および測定方法がないことから、折りたたみ条件を最
適にすることはしたがってきわめて難しい。
完全な機能性抗体または抗体の機能性結合領域を細菌
の発現系において発現させることは、今日までに開示さ
れておらず、その実施の見通しについての評価は悲観的
である（S.L.Morrison:Science 229、1202（1985）、M.
A.BossおよびC.R.Wood、Immlnol.Today 6、12（198
5））。
の発現系において発現させることは、今日までに開示さ
れておらず、その実施の見通しについての評価は悲観的
である（S.L.Morrison:Science 229、1202（1985）、M.
A.BossおよびC.R.Wood、Immlnol.Today 6、12（198
5））。
遺伝子工学的工程が、とくに大腸菌において、完全に
確立されていることから、そのような系は非常に望まし
い。迅速な増殖によって大量生産が促進され、これは、
経済面からきわめて重要なことである。
確立されていることから、そのような系は非常に望まし
い。迅速な増殖によって大量生産が促進され、これは、
経済面からきわめて重要なことである。
ゆえに、本発明は、機能性抗体、それらの機能性フラ
グメントまたは抗体領域と他のタンパク質とからなる融
合タンパク質を、細菌中、好ましくはグラム陰性細菌、
とくに大腸菌、中で製造することに関する。本発明によ
る製造法は、抗体分子またはフラグメントの個々の鎖を
コードする遺伝子と、細胞膜を通してポリペプチド鎖を
輸送し、かつ切り離し可能なシグナル配列とをそれぞれ
連結させること、遺伝子構造物を発現させること、およ
びペリプラズム空間（periplasmic space）またはメジ
ウム（medium）から機能性タンパク質を単離することか
らなる。本発明の好ましい態様は、以下に詳記され、特
許請求の範囲に定義される通りである。
グメントまたは抗体領域と他のタンパク質とからなる融
合タンパク質を、細菌中、好ましくはグラム陰性細菌、
とくに大腸菌、中で製造することに関する。本発明によ
る製造法は、抗体分子またはフラグメントの個々の鎖を
コードする遺伝子と、細胞膜を通してポリペプチド鎖を
輸送し、かつ切り離し可能なシグナル配列とをそれぞれ
連結させること、遺伝子構造物を発現させること、およ
びペリプラズム空間（periplasmic space）またはメジ
ウム（medium）から機能性タンパク質を単離することか
らなる。本発明の好ましい態様は、以下に詳記され、特
許請求の範囲に定義される通りである。
シグナル配列を備えた個々の鎖のための遺伝子の連結
は、好ましくは、共通の調節領域によって同時発現をも
たらす可調節オペロン系のかたちで起きる。このように
して、個々のタンパク質鎖はほぼ化学量論的比率で一緒
に発現されて、ペリプラズム空間内に輸送され、ここで
結合されて機能性分子の形成がなされる。タンパク質
を、公知の方法、例えば欧州特許明細書第0,006,694号
に記載の方法などによって、細胞質から取り出す。
は、好ましくは、共通の調節領域によって同時発現をも
たらす可調節オペロン系のかたちで起きる。このように
して、個々のタンパク質鎖はほぼ化学量論的比率で一緒
に発現されて、ペリプラズム空間内に輸送され、ここで
結合されて機能性分子の形成がなされる。タンパク質
を、公知の方法、例えば欧州特許明細書第0,006,694号
に記載の方法などによって、細胞質から取り出す。
適当な調節領域としては、適当な調節可能な遺伝子調
節領域、例えば、lac、tac、trpまたは合成配列物（seq
uences）などのいかなるものでもよい。特に好ましいも
のは確実に止めることができる調節領域である。
節領域、例えば、lac、tac、trpまたは合成配列物（seq
uences）などのいかなるものでもよい。特に好ましいも
のは確実に止めることができる調節領域である。
集めた細胞に軽い浸透圧ショックを与えて、これによ
って得られた液相を限外濾過または硫安などの塩による
沈殿によって濃縮することによって、タンパク質をペリ
プラズム空間から好ましくは単離する。
って得られた液相を限外濾過または硫安などの塩による
沈殿によって濃縮することによって、タンパク質をペリ
プラズム空間から好ましくは単離する。
「軽い」浸透圧ショックによって、細胞膜はそのまま
でペリプラズム（periplasm）からの溢出が生じる。
でペリプラズム（periplasm）からの溢出が生じる。
タンパク質濃縮物を、便宜的に透析した後、適当な抗
原またはハプテンを装填した吸着剤、有利にはアフィニ
ティーカラムにしたもの、に供する。次いで、抗体また
は機能性抗体フラグメントを、適当な溶出によって、有
利には抗原またはハプテンとともに、得る。
原またはハプテンを装填した吸着剤、有利にはアフィニ
ティーカラムにしたもの、に供する。次いで、抗体また
は機能性抗体フラグメントを、適当な溶出によって、有
利には抗原またはハプテンとともに、得る。
真核細胞においては、抗体は、小胞体の内腔におい
て、おそらくはジスルフィドイソメラーゼ、プロリンシ
ス−トランス−イソメラーゼおよび可能な他の酵素また
はタンパク質との共同作用によって、形成される。細菌
細胞もまた、二つの鎖をほぼ同じ化学量論的な量でつく
り、二つの前駆タンパク質をペリプラズム空間またはそ
れを囲むメジウムに輸送し、シグナル配列を正しく除去
し、球状および可溶性領域を正しく折りたたみ、分子間
のジスルフィド結合を形成し、さらに二つの鎖を合わせ
てヘテロダイマー（heterodimer）をつくるという能力
を有することは、驚きであった。というのは、細菌細胞
がこのような性質を有するまたは同じ効果をもたらす酵
素を具備していることは有り得ないとみなされるからで
ある。このように、グラム陰性細菌の場合には、細菌ペ
リプラズムはこの点で機能的には真核細胞小胞体の内腔
と同等であることが驚いたことに明らかになった。
て、おそらくはジスルフィドイソメラーゼ、プロリンシ
ス−トランス−イソメラーゼおよび可能な他の酵素また
はタンパク質との共同作用によって、形成される。細菌
細胞もまた、二つの鎖をほぼ同じ化学量論的な量でつく
り、二つの前駆タンパク質をペリプラズム空間またはそ
れを囲むメジウムに輸送し、シグナル配列を正しく除去
し、球状および可溶性領域を正しく折りたたみ、分子間
のジスルフィド結合を形成し、さらに二つの鎖を合わせ
てヘテロダイマー（heterodimer）をつくるという能力
を有することは、驚きであった。というのは、細菌細胞
がこのような性質を有するまたは同じ効果をもたらす酵
素を具備していることは有り得ないとみなされるからで
ある。このように、グラム陰性細菌の場合には、細菌ペ
リプラズムはこの点で機能的には真核細胞小胞体の内腔
と同等であることが驚いたことに明らかになった。
本発明による方法は、次のような多くの利点を有す
る。
る。
既述したように簡単で低コストの大規模の細菌発酵が
可能であるということの他に、機能性タンパク質の直接
形成がある。これは、融合タンパク質の切断、それに続
く目的タンパク質またはタンパク質フラグメントの単
離、その酸化またはインビトロ再折りたたみの諸工程が
避けられることを意味する。
可能であるということの他に、機能性タンパク質の直接
形成がある。これは、融合タンパク質の切断、それに続
く目的タンパク質またはタンパク質フラグメントの単
離、その酸化またはインビトロ再折りたたみの諸工程が
避けられることを意味する。
また、本発明の方法によると、細胞性プロテアーゼに
関する問題も見出されなかった。つまり、通常は細菌細
胞中では、これら細胞性プロテアーゼのためにタンパク
質は融合タンパク質のかたちで、とくに不溶性の封入体
（inclusion body）として発現され、そのために上記の
複雑な諸工程が必要となることが知られている。これに
対して、本発明の製造法によると、均質物の単離および
精製は迅速で簡単である。
関する問題も見出されなかった。つまり、通常は細菌細
胞中では、これら細胞性プロテアーゼのためにタンパク
質は融合タンパク質のかたちで、とくに不溶性の封入体
（inclusion body）として発現され、そのために上記の
複雑な諸工程が必要となることが知られている。これに
対して、本発明の製造法によると、均質物の単離および
精製は迅速で簡単である。
このように、本発明によると、抗体、それらの機能性
フラグメントならびに挿入、除去および／またはアミノ
酸の交換によって天然型抗体とは異なる修飾抗体、の調
製が容易である。したがって、例えば、不都合な折りた
たみを抑制するために、システインの除去または他のア
ミノ酸による置換などを行うことができる。全く同様に
して、ネズミの抗体をヒトの抗体に変換したり、他の突
然変異を導入することも可能である。このように、可能
な薬理学的および産業的応用の他に、抗体の構造や機能
の研究および酵素的触媒の原理の研究が容易になる（V.
RasoおよびB.D.Stollar:Biochemistry 14、584（197
5）、V.RasoおよびB.D.Stollar:Biochemistr 14、591
（1975）、A.Tramontano、K.D.JandaおよびR.A.Lerner:
Science 234、1566（1986）、S.J.Pollack、J.W.Jacobs
およびP.G.Schults:Science 234、1570（1986）、J.Jac
obs、P.G.Schults、R.SugasawaraおよびM.Powell:J.Am.
Chem.Soc.109、2174（1987））。
フラグメントならびに挿入、除去および／またはアミノ
酸の交換によって天然型抗体とは異なる修飾抗体、の調
製が容易である。したがって、例えば、不都合な折りた
たみを抑制するために、システインの除去または他のア
ミノ酸による置換などを行うことができる。全く同様に
して、ネズミの抗体をヒトの抗体に変換したり、他の突
然変異を導入することも可能である。このように、可能
な薬理学的および産業的応用の他に、抗体の構造や機能
の研究および酵素的触媒の原理の研究が容易になる（V.
RasoおよびB.D.Stollar:Biochemistry 14、584（197
5）、V.RasoおよびB.D.Stollar:Biochemistr 14、591
（1975）、A.Tramontano、K.D.JandaおよびR.A.Lerner:
Science 234、1566（1986）、S.J.Pollack、J.W.Jacobs
およびP.G.Schults:Science 234、1570（1986）、J.Jac
obs、P.G.Schults、R.SugasawaraおよびM.Powell:J.Am.
Chem.Soc.109、2174（1987））。
さらに、本発明は、試験系（分析）の適用を機能性抗
体を形成した細菌細胞に対して直接的に行うことがで
き、その結果、可能な突然変異抗体の迅速な研究を可能
にする。
体を形成した細菌細胞に対して直接的に行うことがで
き、その結果、可能な突然変異抗体の迅速な研究を可能
にする。
さらに、個々の、または二、三個の、アミノ酸の代替
よる抗体分子の上記の変換の他に、他の遺伝子領域を抗
体遺伝子に挿入すること、または重要でない遺伝子領域
を部分的に交換することも可能である。この方法でマー
カー酵素（M.S.Neuberger、G.T.WilliamsおよびR.O.Fo
x:Nature 312、604（1984））、トキシン（G.Moeller
（編集）：「Antibody carriers of drugs and toxins
in tumor therapy」、Immunol.Rev.62、Munksgaard、Co
penhagen（1982））または他のクラスの免疫グロブリン
領域（M.S.Neuberger、G.T.Williams、E.B.Mitchell、
S.S.Jouhal、J.G.FlanaganおよびT.H.Rabbitts:Nature
314、268（1985））または他の種の免疫グロブリン領域
（P.T.Jones、P.H.Dear、J.Foote、M.S.Neubergerおよ
びG.Winter:Nature 321、522（1986））を抗体分子に連
結させることが可能である。
よる抗体分子の上記の変換の他に、他の遺伝子領域を抗
体遺伝子に挿入すること、または重要でない遺伝子領域
を部分的に交換することも可能である。この方法でマー
カー酵素（M.S.Neuberger、G.T.WilliamsおよびR.O.Fo
x:Nature 312、604（1984））、トキシン（G.Moeller
（編集）：「Antibody carriers of drugs and toxins
in tumor therapy」、Immunol.Rev.62、Munksgaard、Co
penhagen（1982））または他のクラスの免疫グロブリン
領域（M.S.Neuberger、G.T.Williams、E.B.Mitchell、
S.S.Jouhal、J.G.FlanaganおよびT.H.Rabbitts:Nature
314、268（1985））または他の種の免疫グロブリン領域
（P.T.Jones、P.H.Dear、J.Foote、M.S.Neubergerおよ
びG.Winter:Nature 321、522（1986））を抗体分子に連
結させることが可能である。
本発明による製造法は、フォスフォリルコリン結合性
抗体骨髄腫タンパク質McPC603の可変領域を例にとって
以下に説明する通りである。このマウス免疫グロブリン
Ａの三次構造は公知である（D.M.Segal、E.A.Padlan、
G.H.Cohen、S.Rudikoff、M.PotterおよびD.R.Davies:Pr
oc.Natl.Acad.Sci.71、4298（1974））。可変軽鎖VLお
よび可変重鎖VHの合成遺伝子を用いた。このような合成
遺伝子は独国特許公開第3,715,033号明細書および公開
された欧州特許出願第0.290,005号明細書および公開さ
れたオーストラリア特許出願第15631/88号明細書（その
表１および２）に提示されている。そのような合成遺伝
子のうちのとくに適切な遺伝子を表１に例示する。これ
には、完全な発現プラスミドのDNA配列が示されてお
り、二つの鎖のたの遺伝子がアミノ酸を示すことによっ
て強調して表わされている。これらのDNA配列の構築に
おいては、大腸菌によって利用されるだけのコードンを
除いた。さらに、それぞれ唯一の制限酵素切断部位を取
り入れ、さらにRNAの二次構造を考慮した。
抗体骨髄腫タンパク質McPC603の可変領域を例にとって
以下に説明する通りである。このマウス免疫グロブリン
Ａの三次構造は公知である（D.M.Segal、E.A.Padlan、
G.H.Cohen、S.Rudikoff、M.PotterおよびD.R.Davies:Pr
oc.Natl.Acad.Sci.71、4298（1974））。可変軽鎖VLお
よび可変重鎖VHの合成遺伝子を用いた。このような合成
遺伝子は独国特許公開第3,715,033号明細書および公開
された欧州特許出願第0.290,005号明細書および公開さ
れたオーストラリア特許出願第15631/88号明細書（その
表１および２）に提示されている。そのような合成遺伝
子のうちのとくに適切な遺伝子を表１に例示する。これ
には、完全な発現プラスミドのDNA配列が示されてお
り、二つの鎖のたの遺伝子がアミノ酸を示すことによっ
て強調して表わされている。これらのDNA配列の構築に
おいては、大腸菌によって利用されるだけのコードンを
除いた。さらに、それぞれ唯一の制限酵素切断部位を取
り入れ、さらにRNAの二次構造を考慮した。
モデルとした機能性抗体フラグメントにおいて、それ
ぞれの領域は分子内ジスルフィドブリッジ（VL内のCys2
3からCys94までおよびVH内のCys22からCys98まで）を有
する。
ぞれの領域は分子内ジスルフィドブリッジ（VL内のCys2
3からCys94までおよびVH内のCys22からCys98まで）を有
する。
鎖の間にはジスルフィドブリッジはなく、また遊離の
システインも存在しない。
システインも存在しない。
用いた発現ベクター、pASK22、は模式的に次に示す通
りである。
りである。
この中で、VLおよびVH領域の合成遺伝子は、一方を外
膜タンパク質Ａ（ompA）の細菌シグナル配列の遺伝子断
片に、他方を同じ断片のアルカリホスファターゼ（pho
A）に連結されている。二つの前駆タンパク質の遺伝子
は、lacプロモーターの下流の合成オペロン様構造内に
位置している。これによって、両遺伝子の同時誘導、同
時発現および同時分泌が確実になる。
膜タンパク質Ａ（ompA）の細菌シグナル配列の遺伝子断
片に、他方を同じ断片のアルカリホスファターゼ（pho
A）に連結されている。二つの前駆タンパク質の遺伝子
は、lacプロモーターの下流の合成オペロン様構造内に
位置している。これによって、両遺伝子の同時誘導、同
時発現および同時分泌が確実になる。
遺伝子発現の誘導の後、細胞を集めて軽い浸透圧ショ
ックを与える。このようにして得られたペリプラズムタ
ンパク質を含む液相を限外濾過で濃縮して、透析して、
アフィニティーリーガンドとしてフォスフォリルコリン
誘導体（B.ChesebroおよびH.Metzger:Biochemistr 11、
766（1972））を含むアフィニティーカラムに直接に供
する。フォスフォリルコリンによる溶出の結果、均質な
Fvフラグメントが得られた。このフラグメントは、ゲル
電気泳動的には均質である。SDSポリアクリルアミドゲ
ルから、精製されたFvフラグメントの二つの鎖は、分子
比で1:1で存在し、成熟タンパク質の期待された分子量
（VH:13,600ダルトン、VL:12,400ダルトン）を有するこ
とが推定された。二つのシグナル配列が正しく除去され
たことを証明するために、両鎖の６個のＮ−末端アミノ
酸の配列決定を行った。その結果、両鎖は、成熟タンパ
ク質の正しいＮ−末端配列をそれぞれ有していることが
明らかになった。このように、両方の異種構造のプレタ
ンパク質（preproteins）は、細菌シグナルペプチダー
ゼによって正しく切断された。不正確なプロセシングや
Ｎ−末端崩壊反応が起きたという明らかな証明は認めら
れない。
ックを与える。このようにして得られたペリプラズムタ
ンパク質を含む液相を限外濾過で濃縮して、透析して、
アフィニティーリーガンドとしてフォスフォリルコリン
誘導体（B.ChesebroおよびH.Metzger:Biochemistr 11、
766（1972））を含むアフィニティーカラムに直接に供
する。フォスフォリルコリンによる溶出の結果、均質な
Fvフラグメントが得られた。このフラグメントは、ゲル
電気泳動的には均質である。SDSポリアクリルアミドゲ
ルから、精製されたFvフラグメントの二つの鎖は、分子
比で1:1で存在し、成熟タンパク質の期待された分子量
（VH:13,600ダルトン、VL:12,400ダルトン）を有するこ
とが推定された。二つのシグナル配列が正しく除去され
たことを証明するために、両鎖の６個のＮ−末端アミノ
酸の配列決定を行った。その結果、両鎖は、成熟タンパ
ク質の正しいＮ−末端配列をそれぞれ有していることが
明らかになった。このように、両方の異種構造のプレタ
ンパク質（preproteins）は、細菌シグナルペプチダー
ゼによって正しく切断された。不正確なプロセシングや
Ｎ−末端崩壊反応が起きたという明らかな証明は認めら
れない。
McPC603の組換えFvフラグメントのアフィニティーコ
ンスタントを平衡透析によって測定した。これに用いた
条件は、マウス腹水から単離した天然抗体McPC603のア
フィニティーコンスタントの測定において用いられたも
のと同じであった。Fvフラグメントについて得られた1.
21±0.06×105M-1は、実験精度の範囲内で、天然の抗体
について報告されている値の1.6±0.4×105M-1と一致し
ている。Scatchard結合プロット（Ann.N.Y.Ncad.Sci.5
1、660（1949））は線状であって、外挿法（extrapolat
ion）によって約1molのハプテンがmol当りのFvフラグメ
ントと結合していることが示される。このことから、Fv
フラグメント当り唯一のタイプの結合部位しか存在しな
いこと、および単離されたタンパク質には非活性の成分
は存在しないことが確認される。
ンスタントを平衡透析によって測定した。これに用いた
条件は、マウス腹水から単離した天然抗体McPC603のア
フィニティーコンスタントの測定において用いられたも
のと同じであった。Fvフラグメントについて得られた1.
21±0.06×105M-1は、実験精度の範囲内で、天然の抗体
について報告されている値の1.6±0.4×105M-1と一致し
ている。Scatchard結合プロット（Ann.N.Y.Ncad.Sci.5
1、660（1949））は線状であって、外挿法（extrapolat
ion）によって約1molのハプテンがmol当りのFvフラグメ
ントと結合していることが示される。このことから、Fv
フラグメント当り唯一のタイプの結合部位しか存在しな
いこと、および単離されたタンパク質には非活性の成分
は存在しないことが確認される。
このように、驚いたことに、完全に機能的で安定なタ
ンパク質として、抗体McPC603のFvフラグメントを大腸
菌において調製することが可能であることが明らかにな
った。これは、細菌細胞のペリプラズムへの輸送が真核
細胞の小胞体の内腔への輸送と機能的に対等であること
を示している。この対等性については、今までに開示さ
れておらず、示唆すらもない。というのは、これまでに
もっともよく特徴づけられており、かつペリプラズムに
おいて可溶なヘテロダイマー（heterodimeric）のタン
パク質と定義することができる細菌タンパク質−大腸菌
ペニシリンアシラーゼ−は、タンパク質分解的プロセシ
ングによって単鎖前駆体からペリプラズムにおいて産生
される（G.Schumacher、D.Sizmann、H.Hang、P.Buckel
およびA.Boeck:Nucleic Acids Res.14、5713（198
6））。さらに、今日の知識では、真核細胞において折
りたたみに関与すると思われる酵素またはタンパク質を
細菌は有しないことが既に指摘されている。
ンパク質として、抗体McPC603のFvフラグメントを大腸
菌において調製することが可能であることが明らかにな
った。これは、細菌細胞のペリプラズムへの輸送が真核
細胞の小胞体の内腔への輸送と機能的に対等であること
を示している。この対等性については、今までに開示さ
れておらず、示唆すらもない。というのは、これまでに
もっともよく特徴づけられており、かつペリプラズムに
おいて可溶なヘテロダイマー（heterodimeric）のタン
パク質と定義することができる細菌タンパク質−大腸菌
ペニシリンアシラーゼ−は、タンパク質分解的プロセシ
ングによって単鎖前駆体からペリプラズムにおいて産生
される（G.Schumacher、D.Sizmann、H.Hang、P.Buckel
およびA.Boeck:Nucleic Acids Res.14、5713（198
6））。さらに、今日の知識では、真核細胞において折
りたたみに関与すると思われる酵素またはタンパク質を
細菌は有しないことが既に指摘されている。
また、McPC603のFvフラグメントが、もとのままの抗
体McPC603と実質的に同じフォスフォリルコリンとのア
フィニティーコンスタントを有していることも驚くべき
ことである。Fvフラグメントの機能性については文献的
に論争があることから（J.SenおよびS.Beychok:Protein
s 1、256（1986））、この知見は予期外のものである。
このことから、機能性は定常領域（constant domains）
の修飾または完全な欠失によっても保持できることが明
らかである。
体McPC603と実質的に同じフォスフォリルコリンとのア
フィニティーコンスタントを有していることも驚くべき
ことである。Fvフラグメントの機能性については文献的
に論争があることから（J.SenおよびS.Beychok:Protein
s 1、256（1986））、この知見は予期外のものである。
このことから、機能性は定常領域（constant domains）
の修飾または完全な欠失によっても保持できることが明
らかである。
Fvフラグメントの調製に用いられたこれまでの唯一の
方法、すなわち抗体のタンパク質分解、とは対照的に、
本発明の方法においては、非機能性で、間違って折りた
たまれた、間違って再結合されたまたは化学的に修飾さ
れたタンパク質に関して問題はない。さらに、抗原また
はハプテンを装填した吸着剤を用いる好ましい単離工程
は、公知の諸工程によって得られたFvフラグメントの精
製にも適している。というのは、そのような不純物は結
合されないかまたは溶出されないかのいずれかであるか
らである。
方法、すなわち抗体のタンパク質分解、とは対照的に、
本発明の方法においては、非機能性で、間違って折りた
たまれた、間違って再結合されたまたは化学的に修飾さ
れたタンパク質に関して問題はない。さらに、抗原また
はハプテンを装填した吸着剤を用いる好ましい単離工程
は、公知の諸工程によって得られたFvフラグメントの精
製にも適している。というのは、そのような不純物は結
合されないかまたは溶出されないかのいずれかであるか
らである。
例1:プラスミドpASK22の調製： 発現プラスミドpASK22を、pUC12の大きい方のEcoR I
−Hind IIIフラグメント（C.Vanisch−Perron、J.Vieir
aおよびJ.Messing:Gene 33、103（1985））から、ベク
ターpIN III−CmpA1のフラグメント（Y.Masui、J.Colem
anおよびM.Inouye:「Experimental manipulation of ge
ne expression」、M.Inouye編集、Academic Press 198
3）から、およびpHI61（H.Inouye、W.BarnesおよびJ.Be
ckwith:J.Bacteriol.149、434（1982））から、さらに
種々の合成DNAフラグメントから、公知の方法（T.Mania
tis、E.F.FritschおよびJ.Sambrook:Molecular Clonin
g、Cold Spring Harbor 1982）を用いていくつかの工程
によって構築する。得られるベクターpASK22の完全なDN
A配列が表１に示されている。
−Hind IIIフラグメント（C.Vanisch−Perron、J.Vieir
aおよびJ.Messing:Gene 33、103（1985））から、ベク
ターpIN III−CmpA1のフラグメント（Y.Masui、J.Colem
anおよびM.Inouye:「Experimental manipulation of ge
ne expression」、M.Inouye編集、Academic Press 198
3）から、およびpHI61（H.Inouye、W.BarnesおよびJ.Be
ckwith:J.Bacteriol.149、434（1982））から、さらに
種々の合成DNAフラグメントから、公知の方法（T.Mania
tis、E.F.FritschおよびJ.Sambrook:Molecular Clonin
g、Cold Spring Harbor 1982）を用いていくつかの工程
によって構築する。得られるベクターpASK22の完全なDN
A配列が表１に示されている。
ライゲーション混合液を用いて、コンピテントにした
大腸菌細胞を軽質転換させる。後者を、アンピシリン耐
性を指標にして選択する。所望の遺伝子構造を有するプ
ラスミドを、制限酵素分析および重要な接合部位の配列
決定によって特徴づけする。
大腸菌細胞を軽質転換させる。後者を、アンピシリン耐
性を指標にして選択する。所望の遺伝子構造を有するプ
ラスミドを、制限酵素分析および重要な接合部位の配列
決定によって特徴づけする。
例2:Fvフラグメントの調製 pASK22で軽質転換させた大腸菌W3110株の培養物を100
mg/リットルのアンピシリンを含むLB培地で培養して、O
D550を0.5にする。IPTGを最終濃度1mMになるように加え
て、発現を誘導する。45分の後、4,000×ｇの遠心分離
（10分間、４℃）によって細胞を集める。細胞ペレット
を原培養液１リットル当り10mlのTES緩衝液（0.2Mトリ
ス−塩酸（pH8.0）、0.5mM EDTA、0.5Mシュークロー
ス）に再懸濁させて細胞の分画を行う。水で1:4に希釈
して2mMのフォスフォリルコリンを含むTES緩衝液を原培
養液１リットル当り15mlの濃度になるように加えること
によって、細胞に軽い浸透圧ショックを与える。懸濁液
を氷上で30分間インキュベーションした後に、5,000×
ｇで10分間遠心分離して、上清液を今度は48,000×ｇで
15分間遠心分離する。全可溶性ペリプラズムタンパク質
を含む得られた上清液を、限外濾過（ＲアミコンYM5
膜）によって原培養液１リットル当り約2.5mlの容量に
まで濃縮して、BBS緩衝液（0.2Mホウ酸/NaOH（pH8.
0）、0.16M NaCl）に対して透析する。この濃縮溶液
を、フォスフォリルコリン誘導体を装填したアフィニテ
ィーカラム（B.ChesebroおよびH.Metzger:前出）（ベッ
ド容積1ml当り１〜4mlの溶液）に供する。これをBBS緩
衝液で洗浄して、純粋Fvフラグメントを1mMフォスフォ
リルコリンのBBS緩衝液溶液で溶出する。
mg/リットルのアンピシリンを含むLB培地で培養して、O
D550を0.5にする。IPTGを最終濃度1mMになるように加え
て、発現を誘導する。45分の後、4,000×ｇの遠心分離
（10分間、４℃）によって細胞を集める。細胞ペレット
を原培養液１リットル当り10mlのTES緩衝液（0.2Mトリ
ス−塩酸（pH8.0）、0.5mM EDTA、0.5Mシュークロー
ス）に再懸濁させて細胞の分画を行う。水で1:4に希釈
して2mMのフォスフォリルコリンを含むTES緩衝液を原培
養液１リットル当り15mlの濃度になるように加えること
によって、細胞に軽い浸透圧ショックを与える。懸濁液
を氷上で30分間インキュベーションした後に、5,000×
ｇで10分間遠心分離して、上清液を今度は48,000×ｇで
15分間遠心分離する。全可溶性ペリプラズムタンパク質
を含む得られた上清液を、限外濾過（ＲアミコンYM5
膜）によって原培養液１リットル当り約2.5mlの容量に
まで濃縮して、BBS緩衝液（0.2Mホウ酸/NaOH（pH8.
0）、0.16M NaCl）に対して透析する。この濃縮溶液
を、フォスフォリルコリン誘導体を装填したアフィニテ
ィーカラム（B.ChesebroおよびH.Metzger:前出）（ベッ
ド容積1ml当り１〜4mlの溶液）に供する。これをBBS緩
衝液で洗浄して、純粋Fvフラグメントを1mMフォスフォ
リルコリンのBBS緩衝液溶液で溶出する。
例3:平衡透析： 膜の両側がそれぞれ100μｌの容量の透析チャンバー
において、一方に50μｌの精製したFvフラグメントのBB
S緩衝液溶液を入れ、他方に50μｌのフォスフォリル
（メチル−14C）コリン（50mCi/mmol）のBBS緩衝液溶液
を入れた。CD205の値6.85から決定されたFvフラグメン
トの濃度は、0.22mg/mlであった（R.K.Scopes:Protein
Purification−Principles and Practice、Springer−V
erlag、New York、1982、p.241）。室温で22時間おいた
後に、平衡に達した。各溶液の20μｌの試料を、シンチ
レーションカウンター（ベックマンLS1801）で測定し
て、データをScatchardプロッティング（前出）した。
その結果得られた線の勾配から引き出されたアフィニテ
ィーコンスタントKaは、1.21±0.06×105M-1である。
において、一方に50μｌの精製したFvフラグメントのBB
S緩衝液溶液を入れ、他方に50μｌのフォスフォリル
（メチル−14C）コリン（50mCi/mmol）のBBS緩衝液溶液
を入れた。CD205の値6.85から決定されたFvフラグメン
トの濃度は、0.22mg/mlであった（R.K.Scopes:Protein
Purification−Principles and Practice、Springer−V
erlag、New York、1982、p.241）。室温で22時間おいた
後に、平衡に達した。各溶液の20μｌの試料を、シンチ
レーションカウンター（ベックマンLS1801）で測定し
て、データをScatchardプロッティング（前出）した。
その結果得られた線の勾配から引き出されたアフィニテ
ィーコンスタントKaは、1.21±0.06×105M-1である。
表１ pASK22のDNA配列、およびompA−VHおよびphoA−VLの
アミノ酸配列
アミノ酸配列
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｒ 1:19） (56)参考文献 特開 昭62−201581（ＪＰ，Ａ) 特表 平３−501321（ＪＰ，Ａ) (58)調査した分野(Int.Cl.6，ＤＢ名) ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)
Claims (6)
- 【請求項１】機能性（functional）抗体フラグメントFv
または機能性抗体領域と他のタンパク質との融合タンパ
ク質の製造法であって、重鎖および軽鎖のフラグメント
をコードするそれぞれの遺伝子構造物をシグナル配列、
すなわち細菌細胞の細胞質膜を通してポリペプチドの輸
送を促進しその後切断されるシグナル配列に連結し、該
遺伝子構造物を細菌中で発現させ、ペリプラズム空間
（periplasmic space）または生育メジウム（medium）
から機能性発現産物を単離することを特徴とする、製造
法。 - 【請求項２】細菌がグラム陰性細菌である、請求項１に
記載の製造法。 - 【請求項３】細菌が大腸菌（E.coli）である、請求項２
に記載の製造法。 - 【請求項４】二つのプレペプチドのための遺伝子を可調
節性オペロン系のかたちで連結させることを特徴とす
る、請求項１、２または３のいずれか１項に記載の製造
法。 - 【請求項５】機能性タンパク質をペリプラズム空間から
単離するために、ペリプラズムを溢出させるが細胞質を
もとのままに保持するような浸透圧ショックを分離して
おいた細菌に与えて、これによって得られた液相を遠心
分離によって濃厚富化して、さらにこの濃縮物から所望
のタンパク質を得ることを特徴とする、請求項１〜４の
いずれか１項に記載の製造法。 - 【請求項６】適当な抗原またはハプテンを装填した吸着
剤に機能性タンパク質を含む溶液を供し、所望のタンパ
ク質をこの抗原またはハプテンを含む溶液にて溶出して
単離することを特徴とする、請求項１〜５のいずれか１
項に記載の製造法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE19873744595 DE3744595A1 (de) | 1987-12-31 | 1987-12-31 | Verfahren zur gentechnischen herstellung von antikoerpern |
| DE3744595.2 | 1987-12-31 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH02799A JPH02799A (ja) | 1990-01-05 |
| JP2771204B2 true JP2771204B2 (ja) | 1998-07-02 |
Family
ID=6343878
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP63335695A Expired - Lifetime JP2771204B2 (ja) | 1987-12-31 | 1988-12-28 | 遺伝子工学的手法による抗体の製造法 |
Country Status (12)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0324162B1 (ja) |
| JP (1) | JP2771204B2 (ja) |
| KR (1) | KR970007861B1 (ja) |
| AT (1) | ATE102651T1 (ja) |
| AU (1) | AU628310B2 (ja) |
| DE (2) | DE3744595A1 (ja) |
| DK (1) | DK732988A (ja) |
| ES (1) | ES2063022T3 (ja) |
| HU (1) | HU212592B (ja) |
| IE (1) | IE62257B1 (ja) |
| PT (1) | PT89362B (ja) |
| ZA (1) | ZA889711B (ja) |
Families Citing this family (28)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4816567A (en) | 1983-04-08 | 1989-03-28 | Genentech, Inc. | Recombinant immunoglobin preparations |
| US5576195A (en) * | 1985-11-01 | 1996-11-19 | Xoma Corporation | Vectors with pectate lyase signal sequence |
| US5618920A (en) * | 1985-11-01 | 1997-04-08 | Xoma Corporation | Modular assembly of antibody genes, antibodies prepared thereby and use |
| US6916605B1 (en) | 1990-07-10 | 2005-07-12 | Medical Research Council | Methods for producing members of specific binding pairs |
| US7063943B1 (en) | 1990-07-10 | 2006-06-20 | Cambridge Antibody Technology | Methods for producing members of specific binding pairs |
| US6172197B1 (en) | 1991-07-10 | 2001-01-09 | Medical Research Council | Methods for producing members of specific binding pairs |
| GB9015198D0 (en) * | 1990-07-10 | 1990-08-29 | Brien Caroline J O | Binding substance |
| GB9206318D0 (en) * | 1992-03-24 | 1992-05-06 | Cambridge Antibody Tech | Binding substances |
| SE9101433D0 (sv) * | 1991-05-13 | 1991-05-13 | Marianne Hansson | Recombinant dna sequence and its use |
| US6492160B1 (en) | 1991-05-15 | 2002-12-10 | Cambridge Antibody Technology Limited | Methods for producing members of specific binding pairs |
| US5871907A (en) * | 1991-05-15 | 1999-02-16 | Medical Research Council | Methods for producing members of specific binding pairs |
| US5962255A (en) * | 1992-03-24 | 1999-10-05 | Cambridge Antibody Technology Limited | Methods for producing recombinant vectors |
| US6225447B1 (en) | 1991-05-15 | 2001-05-01 | Cambridge Antibody Technology Ltd. | Methods for producing members of specific binding pairs |
| US5858657A (en) * | 1992-05-15 | 1999-01-12 | Medical Research Council | Methods for producing members of specific binding pairs |
| US7018809B1 (en) | 1991-09-19 | 2006-03-28 | Genentech, Inc. | Expression of functional antibody fragments |
| US6146850A (en) * | 1991-11-04 | 2000-11-14 | Xoma Corporation | Proteins encoding gelonin sequences |
| US5837491A (en) * | 1991-11-04 | 1998-11-17 | Xoma Corporation | Polynucleotides encoding gelonin sequences |
| US5621083A (en) | 1991-11-04 | 1997-04-15 | Xoma Corporation | Immunotoxins comprising ribosome-inactivating proteins |
| ES2313867T3 (es) | 1991-12-02 | 2009-03-16 | Medical Research Council | Produccion de anticuerpos anti-auto de repertorios de segmentos de anticuerpo expresados en la superficie de fagos. |
| WO1993012246A1 (en) * | 1991-12-18 | 1993-06-24 | The University Of Calgary | Expression-secretion vectors for the production of biologically active fv fragments |
| US5733743A (en) * | 1992-03-24 | 1998-03-31 | Cambridge Antibody Technology Limited | Methods for producing members of specific binding pairs |
| US7368111B2 (en) | 1995-10-06 | 2008-05-06 | Cambridge Antibody Technology Limited | Human antibodies specific for TGFβ2 |
| GB9705376D0 (en) * | 1997-03-14 | 1997-04-30 | Harris William J | Antibody fragment formulations and assay formats for detecting the presence an d concentration of analytes |
| US6492497B1 (en) | 1999-04-30 | 2002-12-10 | Cambridge Antibody Technology Limited | Specific binding members for TGFbeta1 |
| MXPA04001566A (es) * | 2001-08-27 | 2004-05-17 | Genentech Inc | Un sistema para expresion y ensamblado de anticuerpos. |
| EP1908769A1 (en) * | 2001-08-27 | 2008-04-09 | Genentech, Inc. | A system for antibody expression and assembly |
| EP2102354B1 (en) * | 2007-01-12 | 2017-08-16 | Dow Global Technologies LLC | Apparatus and methods for osmotically shocking cells |
| US10262788B2 (en) | 2013-12-12 | 2019-04-16 | Koninklijke Philips N.V. | Method to enable standard alternating current (AC)/direct current (DC) power adapters to operate in high magnetic fields |
Family Cites Families (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| GB8308235D0 (en) * | 1983-03-25 | 1983-05-05 | Celltech Ltd | Polypeptides |
| EP0196864A3 (en) * | 1985-03-25 | 1988-03-23 | Cetus Corporation | Alkaline phosphatase-mediated processing and secretion of recombinant proteins, dna sequences for use therein and cells transformed using such sequences |
| JPS62201581A (ja) * | 1986-02-28 | 1987-09-05 | Rikagaku Kenkyusho | 新規プラスミド、微生物細胞及びヒト免疫グロブリンＧ Ｆｃ領域蛋白質の製造方法 |
| EP0234592A1 (en) * | 1986-02-28 | 1987-09-02 | Teijin Limited | Plasmid containing DNA fragment coding for human immunoglobulin G Fc region protein and use thereof for production of said protein |
| AU2263288A (en) * | 1987-07-16 | 1989-02-13 | Codon | Transfected cells containing plasmids having genes oriented in opposing directions and methods of obtaining the same |
| CA1341235C (en) * | 1987-07-24 | 2001-05-22 | Randy R. Robinson | Modular assembly of antibody genes, antibodies prepared thereby and use |
-
1987
- 1987-12-31 DE DE19873744595 patent/DE3744595A1/de not_active Ceased
-
1988
- 1988-12-24 ES ES88121675T patent/ES2063022T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1988-12-24 EP EP88121675A patent/EP0324162B1/de not_active Revoked
- 1988-12-24 AT AT88121675T patent/ATE102651T1/de not_active IP Right Cessation
- 1988-12-24 DE DE88121675T patent/DE3888337D1/de not_active Revoked
- 1988-12-28 JP JP63335695A patent/JP2771204B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1988-12-29 ZA ZA889711A patent/ZA889711B/xx unknown
- 1988-12-29 PT PT89362A patent/PT89362B/pt not_active IP Right Cessation
- 1988-12-29 KR KR1019880017762A patent/KR970007861B1/ko not_active IP Right Cessation
- 1988-12-30 HU HU886680A patent/HU212592B/hu not_active IP Right Cessation
- 1988-12-30 IE IE389388A patent/IE62257B1/en not_active IP Right Cessation
- 1988-12-30 DK DK732988A patent/DK732988A/da not_active Application Discontinuation
- 1988-12-30 AU AU27617/88A patent/AU628310B2/en not_active Ceased
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| DK732988D0 (da) | 1988-12-30 |
| JPH02799A (ja) | 1990-01-05 |
| IE883893L (en) | 1989-06-30 |
| ES2063022T3 (es) | 1995-01-01 |
| IE62257B1 (en) | 1995-01-11 |
| DK732988A (da) | 1989-07-01 |
| KR890010203A (ko) | 1989-08-07 |
| HU212592B (en) | 1996-08-29 |
| AU2761788A (en) | 1989-07-06 |
| AU628310B2 (en) | 1992-09-17 |
| EP0324162A1 (de) | 1989-07-19 |
| ATE102651T1 (de) | 1994-03-15 |
| PT89362B (pt) | 1993-08-31 |
| DE3744595A1 (de) | 1989-07-13 |
| KR970007861B1 (ko) | 1997-05-17 |
| DE3888337D1 (de) | 1994-04-14 |
| EP0324162B1 (de) | 1994-03-09 |
| PT89362A (pt) | 1989-12-29 |
| HUT49169A (en) | 1989-08-28 |
| ZA889711B (en) | 1989-09-27 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP2771204B2 (ja) | 遺伝子工学的手法による抗体の製造法 | |
| JP2766621B2 (ja) | 組み換えｇ−ｃｓｆ | |
| JP3659261B2 (ja) | 組換体タンパク質の多機能性複合体への標的化ヘテロ結合 | |
| EP0531404B1 (en) | Ubiquitin-specific protease | |
| US5318900A (en) | Method for producing antiviral protein utilizing E. coli transformant, and gene and E. coli vector used in the method | |
| JPH05268983A (ja) | 原核宿主生物によるジスルフィド架橋された蛋白質の分泌の際に天然蛋白質の立体配座の形成を向上させる方法 | |
| JPH06303987A (ja) | 細胞への核酸運搬方法 | |
| KR20030074841A (ko) | 효모에 의해 분비되는 재조합 단백질의 제조를 위한,ｎ-말단 부분이 히루딘 유도체인 융합 단백질의 용도 | |
| EP0306673B1 (en) | A method for the preparation of human growth hormone | |
| KR20030074832A (ko) | 하나 이상의 관심있는 폴리펩티드의 분비 형태의 생산 및유사한 개량의 과정에서 과분비될 수 있는 펩티드의 용도 | |
| US5037744A (en) | Process for the microbiological preparation of human serum albumin | |
| Emerick et al. | Expression of a β-lactamase preproinsulin fusion protein in Escherichia coli | |
| EP0300459A2 (en) | Human pancreatic secretory trypsin inhibitor | |
| JPH08103279A (ja) | 組換え人ミオグロビンの製造方法 | |
| JPS5944399A (ja) | 新規ｄｎａ | |
| KR0161656B1 (ko) | 글루카곤의 생산방법 | |
| JPS6030687A (ja) | Ｄνａ遺伝子，その製造法およびそれを含むプラスミド | |
| JP2540039B2 (ja) | プラスミドベクタ− | |
| US5268277A (en) | Method for the preparation of human growth hormone | |
| JP2535076B2 (ja) | シグナルペプチド、ｄｎａ配列、ベクタ―、細菌、およびポリペプチド周辺質生産法 | |
| RU2143492C1 (ru) | Рекомбинантная плазмида, кодирующая гибридный белок - предшественник инсулина человека (варианты), штамм бактерий e.coli - продуцент гибридного белка - предшественника инсулина человека (варианты), способ получения инсулина человека | |
| RIGGS et al. | Synthesis, cloning, and expression of hormone genes in Escherichia coli | |
| RU2120475C1 (ru) | Способ получения представляющего интерес полипептида, гибридная днк (варианты), слитый белок (варианты) | |
| RU2144082C1 (ru) | Рекомбинантная плазмида, кодирующая гибридный белок-предшественник инсулина человека (варианты), штамм бактерий e.coli - продуцент гибридного белка-предшественника инсулина человека (варианты) и способ получения инсулина человека | |
| JP3003135B2 (ja) | ポリペプチドの発現ベクター及びポリペプチドの製造法 |