JP2535076B2 - シグナルペプチド、ｄｎａ配列、ベクタ―、細菌、およびポリペプチド周辺質生産法 - Google Patents

シグナルペプチド、ｄｎａ配列、ベクタ―、細菌、およびポリペプチド周辺質生産法

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Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は、シグナルペプチド、そのDNA暗号化配列、
これらの配列を有する発現ベクター、これらのベクター
を導入されたグラム陰性細菌およびポリペプチドの周辺
質生産に関する。
（従来の技術） グラム陰性菌は細胞質中で前駆物質の形で合成された
ポリペプチドを産生し、細胞質膜と細菌壁の間の空間−
周辺質（ペリプラスム）−に放出、そこで成熟ポリペプ
チド、すなわち、特異的生化学的作用を保証し得るポリ
ペプチドとして蓄積されることが知られている。これら
のポリペプチドは特にアルカリホスファターゼのような
酵素を含む。
グラム陰性菌は、天然に周辺質中に異種のポリペプチ
ドを産生し得ることが知られている。この周辺質生産
は、細胞質中の蓄積を伴う生産の場合に要求されるよう
に、細胞質中の他の成分からポリペプチドを分離するよ
りも、周辺質の他の構成成分から上記ポリペプチドを分
離する方がより容易であるため、この種の周辺質生産は
非常に有利である。ポリペプチドは、いずれ除去されな
ければならないＮ−末端メチオニンの付加なしに、およ
び好ましくない第２次構造を採ることなく、成熟体で構
築されることも有利である。
産生が周辺質で行なわれる場合、一般に15-30個のア
ミノ酸からなるシグナルペプチドと呼ばれるペプチドに
よりＮ−末端が延長される成熟ポリペプチドに対応する
前駆物質の形で、、ポリペプチド合成されなければなら
ないことが知られている。このシグナルペプチドは蛋白
の分泌において決定的な役目を果たし、その過程中に開
裂し、その際周辺質中に成熟ポリペプチドを放出する。
異質のポリペプチド、特に、真核細胞由来のポリペプチ
ドの生産における細菌の採用に関する最初の研究は、上
記ポリペプチドの天然の前駆体を暗号化（コード）する
DNA配列を有する発現ベクターによって細菌を形質転換
することであった。この方法は、量に関して産業的生産
には適していないことが繰り返し照明された。
ポリペプチドの天然のシグナルペプチドを前駆体の形
で合成した細菌性ポリペプチドのシグナルペプチドに置
換する試みは満足すべき解決法を与える。ヨーロッパ特
許公開第0177343号はこのようなシグナルペプチドを用
いる方法を開示している。
（発明が解決しようとする課題） 本発明者は、細菌のシグナルペプチドの選択が、異種
のポリペプチド（特に真核由来の）前駆体による不適当
な第２次構造形成を、上記前駆体が細菌中で合成される
際に決定し得るとの知見に基づいて、生化学的に活性な
異種ポリペプチドの好収率な周辺質生産を与える新規な
シグナルペプチドをデザインした。
本発明は、従って一般式、 MXKSTLLLLFLLLCLPSWNAGA ［式中、 Ａ＝アラニン Ｍ＝メチオニン Ｃ＝システイン Ｎ＝アスパラギン Ｆ＝フェニルアラニン Ｐ＝プロリン Ｇ＝グリシン Ｓ＝セリン Ｋ＝リジン Ｔ＝スレオニン Ｌ＝ロイシン Ｗ＝トリプトファン およびＸはＭとＫとの間の直接結合、遺伝子コードの
20個のアミノ酸を含む群から選ばれるアミノ酸、または
各々他から独立して、遺伝コードの20個のアミノ酸を含
む群から選ばれる２、３または４個のアミノ酸を含むペ
プチドを表す。
特に、好ましいシグナルペプチドは式中、ＸがＭとＫ
の間の直接結合を表すか、配列がAPSGのペプチドの全部
または部分を表す場合である。
本発明の他の目的は、本発明のシグナルペプチドを暗
号化したDNA配列に関する。遺伝子コードの変質によっ
て許容されるどんな配列も使用することができる。つぎ
のような２個の配列が特に有利である。
５′−ATG−GCT−CCA−TCT− GGC−AAA−TCC−ACG− CTG−CTT−CTC−TTA− TTT−CTG−CTC−CTG− TGC−CTG−CCC−TCT− TGG−AAC−GCC−GGC− GCT−３′ これは、式（１）、 MAPSGKSTLLLLFLLLCLPSWNAGAのシグナルペプチドを暗号
化したものである： および ５′−ATG−AAA−TCC−ACG− CTG−CTT−CTC−TTA− TTT−CTG−CTC−CTG− TGC−CTG−CCC−TCT− TGG−AAC−GCC−GGC− GCT−３′ これは式（２）、 MKSTLLLLFLLLCLPSWNAGAのシグナルペプチドを暗号化し
たものである。
さらに本発明は、ポリペプチドの前駆物質を暗号化し
たDNA配列を有する発現ベクターに関し、シグナルペプ
チドを暗号化したこの配列のその部分は本発明の配列で
ある。
本発明のシグナルペプチド、これを暗号化したDNA配
列およびこれらの配列を有する発現ベクターはこれらの
ベクターを形質転換されたグラム染色試験に陰性反応す
る細菌（いわゆるグラム陰性細菌）によるポリペプチド
の周辺質生産に適用することができる。
従って、本反応はさらに上記で定義されたベクターに
よって形質転換されたグラム陰性に関する。これらの細
菌のうち、エシェリキア・コリ（Escherichia coli）が
有効である。後者は１個またはそれ以上の変異（もしで
きるなら安定である）、例えば、cya遺伝子および／ま
たはcrp遺伝子に影響を及ぼす欠失による変異を伴って
いるのが好ましい。
本発明の他の目的は、ポリペプチドの周辺質生産方法
に関する。上記で定義したグラム陰性細菌の細胞を培養
し、浸透圧ショックを与え、浸透圧ショックの上清から
組換えポリペプチドを分離するものである。
本発明の方法は、前駆物質を暗号化したDNA配列の発
現が誘導プロモーターの制御のもとに行なわれる誘導モ
ード（inducible mode）による生産に適合しており、ま
た形質転換された菌の培養が始まるやいなやポリペチド
の生産が連続的に行なわれる構成モードによる生産に適
合している。
本発明による方法は、用いられる菌種によって異種性
であるあらゆる種類のポリペプチドの生産に適してい
る。すなわち、真核起源のポリペチドの生産に適してい
る。これらは、厳密な意味でひと成長ホルモン（hm
H）、または特にヒルジンの天然体または変異体、例え
ば、変形（Lys47）HV2のような小型のペプチドの生産に
している。
本発明を添付の５種類の図面に関連する３つの実施例
によってさらに詳細に説明する。
第１図は、プラスミドp163.1の制限地図である。種々
の制限セグメントを任意につぎの記号表によって表示す
る： 第２図は、プラスミドp160.1の制限地図であり、その
PvuI−XhoI−BamHIおよびPvuI−ORI−BamHI（２）フラ
グメントは各プラスミドp163.1およびpBR327に由来し、
その小さいBamHI（２）−BamHI（１）フラグメントは下
記の実施例１に記載のフラグメント３である。
第３図は、プラスミドp380.1およびp373.2に共通の制
限地図である。種々の制限セグメントを任意につぎの記
号表によって表示する： 第４図は、プラスミドp400.18の制限地図である。種
々の制限セグメントを任意につぎの記号表によって表示
する： 第５図は、プラスミドp460の制限地図である。種々の
制限セグメントを任意につぎの記号表によって表示す
る： 実施例1:式、 MAPSGKSTLLLLFLLLCLPSWNAGA（１）のシグナルペプチド
を有するひと成長ホルモンの周辺質生産 使用する菌種はヨーロッパ特許出願公開第0245138号
に記載の菌種と直接関連する菌エシェリキア・コリ（Es
cherichia coli）であり、1986年２月17日にコレクシオ
ン・ナシオナル・ド・キュルチュル・ド・ミクロオルガ
ニスムス（CNCM パリ、フランス）に寄託番号I-529で
寄託されている。この菌は欠失によるcya変異および欠
失によるcrp変異を伴っている。
シグナルペプチドが本発明の式（１）−MAPSGKSTLLLL
FLLLCLPSWNAGAである、hmHの前駆体を暗号化したDNA配
列を有するプラスミドを製造した。このプラスミドはp3
98という。
1.プラスミドp398の構築 1a）プラスミドp373.2の構築 採用した方法は一般に利用し得る既存のプラスミドか
ら得たフラグメントおよび現在周知の技術による合成に
より製造したフラグメントを用いた。採用したクローニ
ング技術はティー・マニアチス、イー・エフ・フリッチ
ュおよびジェイ・サムブルック、モルキユラー・クロー
ニング、ア・ラボラトリー・マニュアル（Molcular clo
ning,a laboratory manual）、（コールド・スプリング
・ハーバー・ラボラトリー、1984年）に記載のものであ
る。オリゴヌクレオチドはバイオサーチ4600DNAシンセ
サイザーを使用して合成した。
プラスミドp163.1（第１図）は、ヨーロッパ特許出願
公開第0245138号に記載されており（上記出願公開の第
２図に示されており、ここに添付の第１図に示されてい
るBamHI（２）部位をマーク指定していない）、1986年
２月17日にI-530の寄託番号でCNCMに寄託された菌の中
に存在し、酵素PvuIおよびBamHIで切断された。このプ
ラスミドはhmHの遺伝子コードを含んでいる。PvuI-BamH
I（２）フラグメント−以下、フラグメント１という−
は、第１図に示すように、制限酵素XhoIの作用部位を含
んでおり、これを精製した。
同じく、プラスミドpBR327は、当業者にとって周知で
あり（ソベロン・エクス．ら、ジェネ（Gene）第９巻第
287-305頁（1980年）参照）、酵素、PvuIおよび−BamHI
によって切断された。PvuI−BamHI（２）フラグメント
−以下、フラグメント２という−は、複製開始点を含ん
でおり、これを精製した。
ついで、フラグメント３を製造した；これは、1aci遺
伝子およびそのプロモーターを含む合成BamHI（１）お
よびBamHI（２）フラグメントであり、つぎのようなDNA
配列を含み、その上に、鎖の二つの端を第２および３図
に記載のプラスミド中のフラグメントの方向性を特定す
るために１および２の数字によって識別する。
ついで、第２図に示すように、フラグメント１、２お
よび３を結合し、プラスミドpBR327を得る。このプラス
ミドは制限酵素HincIIおよびPstIで部分的に切断処理し
た。この大きいHincII−PstIフラグメントは複製開始点
を含んでおり、ついで、第２図に示すように、下記に示
すフラグメント４に結合した。これは、hmHの天然前駆
体の最初の44個のアミノ酸およびこの配列の上流に調節
シグナルを暗号化した配列を有する合成DNAフラグメン
トである。
このフラグメントにおいて、アミノ酸をつぎのような
略号による文字で示す。
Ａ＝アラニン Ｍ＝メチオニン Ｃ＝システイン Ｎ＝アスパラギン Ｄ＝アスバラギン酸 Ｐ＝プロリン Ｅ＝グルタミン酸 Ｑ＝グルタミン Ｆ＝フェニルアラニン Ｒ＝アルギニン Ｇ＝グリシン Ｓ＝セリン Ｈ＝ヒスチジン Ｔ＝スレオニン Ｉ＝イソロイシン Ｖ＝バリン Ｋ＝リジン Ｗ＝トリプトファン Ｌ＝ロイシン Ｙ＝チロジン プロモーターの配列の配列−35（TTGCTT）および−10
（TATAAT）、および当業者に周知のシャイン−ダルガル
ノ（Shine-Dargarno）配列は、このフラグメント中でそ
の順番に下線で示す。
プラスミドp380.1はこの方法で得る。
ついで、プラスミドp381.1（第３図）は、制限酵素ClaI
およびNdeIで切断し、上記のフラグメント４の小さいCl
aI-NdeIフラグメントを除去し、これを下記のClaI-NdeI
フラグメントで置換した： 得られたプラスミドはプラスミドp373.2である（第３
図）。
1b）プラスミドp398の構築 最終的に、プラスミドp373.2を制限酵素NdeIおよびXb
aIで切断し、上記のフラグメント４のNdeI-XbaIフラグ
メントを除去し、これを下記に示す合成NdeI-XbaIフラ
グメントで置換した。
このようにして得られたプラスミドp398は、式（１）
のシグナルペプチドを暗号化した特に有利なDNA配列を
含む。この配列は上記の二つの矢印で画する。
2.一般的方法 実験はプラスミドp398の６個のクローン（クローン
２、３、５、６、７および８）で行なわれ、結果をプラ
スミドp373.2に対して評価した。プラスミドp373.2はhm
Hの天然の前駆体を暗号化したDNA配列を含む。実験は前
もって製造した当該宿主ベクターを、十分なバイオマス
（2.2参照）で得、導入処理した細胞がhmHを産生（2.4
参照）するような条件で培養し、浸透圧ショック（2.4
参照）で周辺質空間に含まれる蛋白質を集め、細菌を全
融解処理し、2.4で集めた周辺質hmHを測定し、2.4およ
び2.5で得られた上清をウェスタン・ブロット・テクニ
ク（2.7参照）によって分析することにより行った。
2.1 宿主ベクター系の製造 宿主ベクター系は当業者に周知の細菌形質転換により
製造した。これは具体的に、つぎのような文献に記載さ
れている。
−モルキュラー・クローニング（Molecular cloning）
−ア・ラボラトリー・マニュアル（A labolatory Manua
l）−ティ・マニアティス、イー・エフ・フリッチュお
よびジェイ・サムブルック−コールド・スプリング・ハ
ーバー・ラボラトリー−1982年 −イクスペリメンツ・イン・モルキュラー・ジェネティ
ックス（Experiments in Molecular Genetics）−ジェ
イ・エイチ・ミラー−コールド・スプリング・ハーバー
・ラボラトリー−1972年 2.2 培養 ａ）接種 固体培地（LB培地＋寒天）で得られた分離コロニーを
培地（LB培地）5ml中に懸濁させた。
− 使用したLB培地はつぎのような特徴を有する。高圧
滅菌前に導入された成分は、 バクトトリプトン 10g 酵母抽出液 5g 塩化ナトリウム 5g 蒸留水 全量１ − 高圧滅菌前に、pHを7.2に調整する。
− 高圧滅菌後に、アンピシリン100μg/mlの割合で添
加する。
ｂ）インキュベーション ａ）で調製した懸濁液を37℃にて18時間インキュベー
ションし、安定生長期に達するまで培養した。得られた
濃厚懸濁液をLB培地で希釈し、光学密度を600nmにて−6
00nmにおけるOD-0.03に近付け、ついで、この細菌懸濁
液を37℃にて撹拌しつつ、600nmにおけるODを0.3のオー
ダーになるまでインキュベートした。
2.3 導入 2.2bで得られた細菌懸濁液にイソプロピル−β−Ｄ−
チオガラクトース（またはIPTG）を最終濃度がImMに等
しくなるような量で添加する;IPTGはここで通常ラクト
ース・オペレーターに結合するリプレッサーの作用を中
和することによってhmHの前駆体の合成を始動および維
持するために使用した。
この懸濁液は添加したIPTGとともに37℃にて２時間30
分撹拌した。
2.4 浸透圧ショック エヌ・ジー・ノッサールおよびエル・エー・ヘッペ
ル、ザ・ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミスト
リー（The Journal Biological Chemistry）第241巻第3
055-3063頁（1966年）に記載のプロトコルを明細書の記
載として挿入する。
ａ）TrisおよびEDTAでの洗浄 導入後に2.3で得られた懸濁液のサンプルを採り、600
0gで５分間遠心分離した。
残渣を、得られた懸濁液が600nmのODを10のオーダー
になるような容量のpH7の緩衝液に添加した（Ａ液）
（上記参照）。使用した緩衝液は蒸留水につぎのものを
添加して製造した。
・トリ（ヒドロキシメチル）アミノメタン−HCl、また
はTris-HClを最終濃度が30mMになるように添加した。
・エチレンジアミンテトラ酢酸、またはEDTAを最終濃度
が1mMになるように添加する。
ｂ）スクロースの作用 2.4aで得られた懸濁液を6000gで５分間遠心分離し
た。残渣を注意深く等量の、Ａ液に対してスクロースを
100ml当たり15g添加し、用時調製のＢ液中に加えた。
懸濁液を10分間20℃にて放置した。ついで、6000gに
て５分間遠心分離した。遠心分離管を氷水中に入れた。
上清を注意深く除去し、氷水温度に前以て冷却した脱
塩水（同量で）で置換した。
このように調製した上清（600nmにおけるオーダーが1
0を有する）を０℃にて５分間放置した。
ｃ）周辺質中に存在する蛋白質の収集 2.4bで得られた懸濁液を18000gにて１分間遠心分離し
た。
上清は、周辺質中の蛋白質を含んでおり、これを収集
した。
2.5 全融解 導入後2.3で得られた懸濁液のサンプルを採り、エッ
ペンドルフ管中6000gにて５分間遠心分離した。
残渣を、懸濁液の1mlが600nmのODが0.2となるような
量の緩衝液に懸濁した。
緩衝液は蒸留水中つぎのものを含む溶液を２回遠心分
離した緩衝液から調製した。
−Tris−HCl 0.125M、pH6.8; −ドデシル硫酸ナトリウム（４％（W/V））； −グリセリン（20％（W/V））； −β−メルカプトエタノール（10％（W/V））； −ブロモフェノール・ブルー（0.02％（V/V））。
管を100℃の湯浴中に10分間入れ、ついで、懸濁液を6
000gにて５分間遠心分離し、上清を集めた。
2.6 周辺質hGHの同定 2.4cで得られた上清を、検量注入器および220nmの検
知器を備えた装置を高圧液体クロマトグラフィーにかけ
た。
つぎのものを使用した： ・長さ10cmおよび直径4.6mmのスティール製のC8-300オ
ングストローム逆相カラム（シンクロム、製品番号C8-R
103-10）、 ・20分間にS1液70容とS2液30容からS1液40容とS2液60容
に直線こう配で通過する移動相。
S1液およびS2液はつぎのような特徴を有する： ・S1＝0.1％（V/V）のトリフルオロ酢酸を含む精製水、 ・S2＝0.8％（V/V）のトリフルオロ酢酸を含むHPLCのた
めのアセトニトリル 流速は１分当たり1mlである。
分画液の光学密度を測定し、周辺質hGHの量を上清1ml
当たり、マイクログラムであらわし、先に確定した検量
曲線と比較して測定する。
2.7 ウエスタン・ブロット・テクニクによる分析 継続して次のような操作を行った： −ゲル電気泳動による2.4cおよび2.5により得られた各
上清に含まれる種々の蛋白質の分離（レミリ、ユー．ケ
ー．、ネイチュア（Nature）第227巻第680-685頁（1970
年）記載のプロトコルによる）；使用したゲルは0.5％
のドデシル硫酸ナトリウムを含むポリアクリルアミドゲ
ル（15％W/V）である； −ゲル中に含まれる上部蛋白質のニトロセルロース膜の
透過（エイチ．タウビンら、プロシーディング・オブ・
ナショナルアカデミー・オブ・サイエンス（Proc.Natl.
Acad.Sci.USA）第76巻第4350-4354頁（1979年）； −バーネットの操作による免疫検出（ダブリュ．ダブリ
ュ．バーネット、アナリティカル・バイオケミストリー
（Anal.Biochem.）第112巻第195-203頁（1981年））；
これは次の連続操作を含む： −緩衝液Ａ（Tris−HC1 10mM、NaCl 170mM、KI 1mM）で
ニトロセルロース・フィルターを10分間洗浄する。； −緩衝液Ｂ（ウシ血清アルブミンを100m当たり3gの割合
で添加した緩衝液Ａ）をニトロセルロース・フィルター
に接触させる； −20℃にて18時間、ニトロセルローズ・フィルターを免
疫血清（成熟hGHおよびその前駆体を検出するポリクロ
ーナル抗体）に接触させる； −緩衝液Ｂでニトロセルローズ・フィルターを洗浄； −1ml当たり0.1マイクロキュリーの割合のヨード125で
ラベルした蛋白質Ａ液とニトロセルローズ・フィルター
と20℃にて６時間接触させる； −フィルターを緩衝液Ａで洗浄； −２枚の吸収シート間でフィルターを乾燥； −フィルターをＸ線フィルムと接触させる； −フィルムを現像。
3.結果 3.1周辺質hGHの固定 結果を下記の表に示す： プラスミド398はプラスミド373,2が産生するのに比べ
ておよそ２倍の周辺質産生を行うことが明らかである。
3.2 ウエスタン・ブロット・テクニックによる分析 オートジオグラフフィルム分析は、前駆体がプラスミ
ドp398で形質転換した細菌の全融解後得られた抽出物中
に検出されないが、クローンp373,2で形質転換した細菌
の全融解後得られた抽出物中には検出されることを示し
ている。これは本発明のシグナルペプチドが、前駆体を
高い効率で細胞質膜を通過させ、同時成熟を可能にする
ことを示している。
これらの結果は本発明の式（１）のシグナルペプチド
をひと成長ホルモンなどの蛋白の周辺質生産に用いる大
きな利点を強調している。
実施例2:式 MAPSGKSTLLLLFLLLCLPSWNAGA（１）シグナルペプチドを
用いたヒルジン変異体の周辺質生産 1.菌種およびプラスミド 実施例１記載の菌種を使用する。
p400と称されるプラスミドをp373,2から構築する。ヨ
ーロッパ特許出願公開第0273800号に記載の変異体（Lys
47）HV2を暗号化したDNA配列を用いた。この式を次に示
す： 上記DNA配列が、式（１）の本発明のシグナルペプチ
ドを暗号化した配列に続いている。
プラスミド400の構築 この変異体（最初の３個のアミノ酸を除外）を暗号化
した配列を含む合成AccI−HindIIIフラグメント（フラ
グメント５）を調製した。下記に示すが、最後のアミノ
酸に対応するコドンは矢印で示してある： プラスミドp373,2を制限酵素NdeIおよびHindIIIで切
断し、第３図に示すように複製開始点を含むNdeO−Hind
IIIフラグメント（フラグメント６）を精製した。
合成NdeI−AccIフラグメント（フラグメント７）を調
製する；そのフラグメントを次に示す： このフラグメントは、式（１）のシグナルペプチドを
暗号化した特に有利なDNA配列を含んでおり、この配列
は２つの矢印で画しており、ヒルジン変異体（Lys47）H
V2の最初の３個のコドンに対応するヌクレオチド５、６
および７を結合する；得られたプラスミドがプラスミド
p400でありこれを第４図に示す。
2.一般的方法 プラスミド400は、実施例１記載の細菌への形質転換
により導入した。
実験は実施例１の2.1および2.2の項に記載の方法によ
り２種の異なるクローン（クローンp400,18およびp400,
24）に平行して行った。培養は実施例１の2.3項に示し
た方法により誘導し、２種類の修正を行った：誘導は、
培養物が600nmにてODがおよそ0.5に達したときIPTGを添
加して始め、第１の実験では３時間30分間維持し、第２
の実験では17時間維持した。
誘導後、細胞を浸透圧ショック処理し（実施例１、
２、４参照）、集められた上清中のヒルジンの抗トロン
ビン活性を測定した。
この活性は、マークウォード、エフ．ら、（トロムボ
シス・アンド・ヘモスタシス（Thromb.Haemostas）第52
巻（19）第160-163頁）記載およびハーベイ、アール・
ピーら、（プロシーディング・オブ・ナショナル・アカ
デミー・オブ・サイエンス（Proc.Natl.Acid.Sci.USA）
第83巻第1084-1088頁（1986年）において研究されてい
る技術により測定した。
クローンの１つから得られたヒルジン変異体を高圧液
体クロマトグラフィーにより精製し、そのNH2−末端配
列を決定した。
3.結果 結果を下記の表に示す。浸透圧ショック後に収集した
上清を、濁度を600nmにおけるOD＝10にもっていき、ml
当たりの抗トロンビンで表現した。
ヒルジンの特異的抗トロンビン値は既知であり、ヒルジ
ン1mg当たり13000と177000抗トロンビン単位の間にある
から（ロイソン、ジー．ら、バイオテクノロジー（Bio/
Technology）第６巻第72-77頁（1988年））、誘導17時
間後、600nm当たりのOD＝１の上清１リットル当たり、
ヒルジンが5-10mg抽出されることが判明した。
この量はドッド、ジェイ．ら、エフ・イー・ビー・エ
ス（FEBS）第202巻第373-377頁記載の量よりも非常に多
い。これは、ヒルジンのハイブリッド前駆体を暗号化し
た配列を有するプラスミドで形質転換したエシェリキア
・コリ（E.coli）菌中の周辺質中に産生するヒルジンHV
I変異体を伴っており、このシグナルペプチドはアルカ
リホスファターゼのものである。
さらに、クローンp400.18により産生したヒルジンは
変異体（Lys47）HV2のNH2−末端特徴を有している。
これらの結果は、式（１）の本発明のシグナルペプチ
ドがヒルジン変異体（Lys47）HV2のようなペプチドの効
果的な周辺室生産に適していることを示している。
実施例3:式、 MKSTLLLLFLLLCLPSWNAGAのシグナルペプチドを有するヒ
ルジン変異体の周辺質生産 1.菌種およびプラスミド 実施例１に記載の菌を使用した。
プラスミドp460の構築のために採用した方法は、ヨーロ
ッパ特許出願公開第0273800号に記載のヒルジン（Ly
s47）HV2を暗号化した配列を含んでおり、この配列は本
発明の式（２）： MKSTLLLLFLLLCLPSWNAGAによるシグナルペプチドを暗号
化した配列に続くものであるが、実施例２に記載したプ
ラスミドp400.18およびアメルシャム（Amersham）でマ
ークしたファージM13mp19中に変異誘発して得られたフ
ラグメントを使用した。
プラスミドp460の構築 1a）プラスミドp400.18から得られたフラグメント α）プラスミドp400.18を酵素PstおよびEcoRIで切断し
た。複製の開始点を含む3868bpのPst−EcoRIフラグメン
ト、以下、フラグメント８という（第５図中F8として表
す）を精製した。
β）プラスミドp400.18を酵素NruIおよびPstIで切断し
た。プロモーターを含む1062bpの小さいNruI−PstIフラ
グメントは、以下、フラグメント９という（第５図中、
F9として示す）を精製した。
1b）ファージM13から得られたNruI−EcoRフラグメント α）酵素XhoIおよびEcoRIで切断および精製によりプラ
スミドp400.18から誘導された650bpのXhoI−EcoRIフラ
グメントは、式（１）のシグナルペプチドを暗号化した
配列を含み、これを制限部位、SalI/EcoRIにあるファー
ジM13mp19（Amersham）のポリリンカー（クローニング
・ポリサイト）中に導入した。XhoIおよびSalI部位の連
結はこれら二つの部位を消滅させた。
β）つぎの配列を有する63ヌクレオチドのオリゴヌクレ
オチド ５′−ATG−AAA−TCC−ACG−CTG −CTT−CTC−TTA−TTT−CTG −CTC−CTG−TGC−CTG−CCC −TCT−TGG−AAC−GCC−GGC −GCT−３′ を合成した。この配列は式（２）のシグナルペプチドを
暗号化したものである。
インビトロで変異誘発を目的とする技術を、アメルシ
ャム1523キットを用いて、α）にて得られたフラグメン
トに関連し、シグナルペプチドを暗号化した配列に関し
て、変異を有するフラグメントを構築した。
この技術は、このキットに添付のパンフレットに、詳
細に記載されており、ファージM13の二重鎖に650bp（上
記α）の項参照）のXhoI−EcoRIの導入、この組換えフ
ァージの一重鎖の精製、63ヌクレオチドの上述のオリゴ
ヌクレオチドのハイブリッド形成、DNAポリメラーゼの
クレナウフラグメント、および組換えファージの二重鎖
円形を形成するためのT4リガーゼの作用からなる。
γ）変異DNAフラグメントを含むファージは酵素NruI
およびEcoRIで切断した。式（２）のシグナルペプチド
を暗号化した配列およびヒルジン変異体（Lys47）HV2を
暗号化した配列を含むNruI−EcoRIフラグメント、以
下、フラグメント10という（第５図にF10として示す）
を精製した。
フラグメント８、９および10を連結する；得られたプ
ラスミドはプラスミドp460であり、これを第５図に示
す。
2.一般的方法 プラスミドp460を実施例１に記載の細菌に形質導入し
た。実験は平行して２種類のクローン（クローンp460.2
およびp460.4）で行い、これらには、63ヌクレオチドの
上述の配列の存在が認められている。クローンp400.18
の制御は実施例１の2.1および2.2の項に記載の方法のと
おりに行った。培養は実施例１の2.3の項に示された方
法で２つの修正をして誘導した：培養物が600nmにてOD
がおよそ0.5に達したとき、IPTGを添加して誘導を行
い、２時間維持した。
誘導後、細胞を浸透圧ショックにかけ（実施例10の2.
4の項）、上清中に遊離したヒルジン変異体（Lys47）HV
2をHPLCにて測定した。
ヒルジン変異体（Lys47）HV2の測定 浸透圧ショック後、得られた上清を、検量注入器およ
び220nmの検知器を備えた装置を高圧液体クロマトグラ
フィーHPLC、にかけた。
つぎのものを使用した： ・長さ10cmおよび直径4.6mmのスティール製のC8-300Å
逆相カラム（シンクロム、製品番号C8-R103-10）、 ・10分間にS1液85容とS2液15容からS1液50容とS2液50容
に直線こう配で通過する移動相。
S1液およびS2液は継ぎのような特徴を有する： ・S1＝0.1％（V/V）のトリフルオロ酢酸を含む精製水、 ・S2＝0.8％（V/V）のトリフルオロ酢酸を含むHPLCのた
めのアセトニトリル 流速は１分当たり2mlである。
分画液の光学密度を測定し、周辺質変異体（Lys47）H
V2の量を上清1ml当たり、ミリグラムで表し、変異体（L
ys47）HV2の標準溶液と比較して測定した。
3.結果 結果を次の表に示す。
結果を浸透圧ショック後、600nmにおける光学密度を
１とし、集めた上清のmg/lで示す。
プラスミド460.2および460.4により産生したヒルジン
変異体（Lys47）HV2の周辺質生産はかなりプラスミド40
0.18により産生したものより多いことが上記の表から明
らかである。
これらの結果は、式（２）の本発明のシグナルペプチ
ドがヒルジン変異体（Lys47）HV2のようなヘプチドの効
果的な周辺質生産にかなり適していることを示してい
る。
【図面の簡単な説明】
第１図は、プラスミドp163.1の制限地図である。 第２図は、プラスミドp160.1の制限地図である。 第３図は、p380.1およびp373.2に共通の制限地図であ
る。 第４図は、プラスミドp400.18の制限地図である。 第５図は、プラスミドp460の制限地図である。
フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｒ 1:19） Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｐ 21/00 (Ｃ１２Ｐ 21/00 Ｃ１２Ｒ 1:19） Ｃ１２Ｒ 1:19） (72)発明者 エヴリーヌ・ジョゼフ―リオーザン フランス国 31650 サン・トーラン・ ド・ガムヴィル、リュ・デュ・パレー ８番 (72)発明者 ジェラール・ロワソン フランス国 31300 トゥールーズ、リ ュ・フランソワ・リカルディ 15番 (72)発明者 ビレム・ロスカム フランス国 31450 モンジスカール、 マジュレ（番地の表示なし)

Claims (15)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】一般式、 MXKSTLLLLFLLLCLPSWNAGA ［式中、 Ａ＝アラニン Ｍ＝メチオニン Ｃ＝システイン Ｎ＝アスパラギン Ｆ＝フェニルアラニン Ｐ＝プロリン Ｇ＝グリシン Ｓ＝セリン Ｋ＝リジン Ｔ＝スレオニン Ｌ＝ロイシン Ｗ＝トリプトファン およ
    び、 Ｘは、ＭとＫ間の直接結合、遺伝コードの20個のアミノ
    酸を含む群から選ばれるアミノ酸、または各々他から独
    立して、遺伝コードの20個のアミノ酸を含む群から選ば
    れる２、３または４個のアミノ酸を含むペプチドを表
    す］ で示されるシグナルペプチド。
  2. 【請求項２】Ｘが、ＭとＫ間の直接結合を表すか、また
    は配列APSGのペプチドのすべて、または部分を表す、請
    求項１記載のシグナルペプチド。
  3. 【請求項３】Ｘが、直接結合を表す、請求項２記載のシ
    グナルペプチド。
  4. 【請求項４】Ｘが、配列APSGのペプチドを表す、請求項
    ２記載のシグナルペプチド。
  5. 【請求項５】請求項1-4のいずれか１項記載のシグナル
    ペプチドをコードしたDNA配列。
  6. 【請求項６】式、 ５′−ATG−AAA−TCC−ACG−CTG−CTT−CTC− TTA−TTT−CTG−CTC−CTG−TGC−CTG− CCC−TCT−TGG−AAC−GCC−GGC−GCT−３′ を有する請求項５記載の配列。
  7. 【請求項７】式、 ５′−ATG−GCT−CCA−TCT−GGC−AAA−TCC−ACG−CTG
    −CTT−CTC−TTA−TTT−CTG−CTC−CTG−TGC−CTG−CCC
    −TCT−TGG−AAC−GCC−GGC−GCT−３′ を有する請求項５記載の配列。
  8. 【請求項８】ポリペプチドの前駆体をコードしたDNA配
    列を有する発現ベクターにおいて、シグナルペプチドを
    コードした配列の部分が請求項5-7のいずれか１項に記
    載の配列である、発現ベクター。
  9. 【請求項９】請求項８に記載のベクターによって形質転
    換されたグラム陰性細菌。
  10. 【請求項１０】エシェリキア・コリ（Escherchia col
    i）菌種に属する、請求項９記載の細菌。
  11. 【請求項１１】欠失によるcya変異及び欠失によるcrp変
    異を有する、請求項10記載の細菌。
  12. 【請求項１２】ポリペプチドがヒルジンの天然体または
    変異体である、請求項９または10記載の細菌。
  13. 【請求項１３】ヒルジン変異体が（Lys47）HV2である、
    請求項12記載の細菌。
  14. 【請求項１４】ポリペプチドがひと生長ホルモンであ
    る、請求項９または10記載の細菌。
  15. 【請求項１５】ポリペプチドの前駆体の発現ベクターに
    より形質転換してグラム陰性細菌細胞を培養し、細胞を
    浸透圧ショック処理し、浸透圧ショック上清から組換え
    ポリペプチドを分離する、ポリペプチドのペリプラズム
    生産の方法において、グラム陰性細菌が請求項9-14のい
    ずれか１項に記載の細菌であることを特徴とする方法。
JP1220106A 1988-08-24 1989-08-24 シグナルペプチド、ｄｎａ配列、ベクタ―、細菌、およびポリペプチド周辺質生産法 Expired - Lifetime JP2535076B2 (ja)

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