JP2003504069A - ヒト顆粒球コロニー刺激因子修飾体およびその生産方法 - Google Patents
ヒト顆粒球コロニー刺激因子修飾体およびその生産方法Info
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Abstract
(57)【要約】
配列番号：２のアミノ酸配列を有する野生型ヒト顆粒球コロニー刺激因子(human granulocyte-colony stimulating factor;ｈＧ−ＣＳＦ)の第１、第２、第３および第１７のアミノ酸の少なくとも一つのアミノ酸が他のアミノ酸で置換されることによって得られた、前記修飾ｈＧ−ＣＳＦは、修飾ｈＧ−ＣＳＦをコードする遺伝子を含む発現ベクターで形質転換された微生物を培養することによって生産され、細胞質から分泌される。
Description
【０００１】
本発明は、修飾されたヒト顆粒球コロニー刺激因子(human granulocyte-colon
y stimulating factor; ｈＧ−ＣＳＦ)、前記ペプチドをコードする遺伝子、前
記遺伝子を含む発現ベクター、前記ベクターで形質転換された微生物、および前
記微生物を用いて修飾ｈＧ−ＣＳＦを製造する方法に関する。
y stimulating factor; ｈＧ−ＣＳＦ)、前記ペプチドをコードする遺伝子、前
記遺伝子を含む発現ベクター、前記ベクターで形質転換された微生物、および前
記微生物を用いて修飾ｈＧ−ＣＳＦを製造する方法に関する。
【０００２】
コロニー刺激因子(colony stimulating factor; CSF)と称される因子は、Ｔ−
細胞、マクロファージ、繊維芽細胞および内皮細胞によって生産される顆粒球／
マクロファージ−コロニー刺激因子(ＧＭ−ＣＳＦ)、マクロファージ−コロニー
刺激因子(M-CSF)および顆粒球−コロニー刺激因子(Ｇ−ＣＳＦ)を含む。ＧＭ−
ＣＳＦは、顆粒球またはマクロファージの幹細胞を刺激して分化を誘導し、顆粒
球またはマクロファージコロニーの分化を刺激する。Ｍ−ＣＳＦおよびＧ−ＣＳ
Ｆは一次的に各々マクロファージおよび顆粒球コロニーの形成を誘導する。in v
ivoで、Ｇ−ＣＳＦは骨髄白血球細胞の分化を誘導し、成熟した顆粒球の機能を
増進させるもので、白血病の治療における臨床的重要性はよく知られている。
細胞、マクロファージ、繊維芽細胞および内皮細胞によって生産される顆粒球／
マクロファージ−コロニー刺激因子(ＧＭ−ＣＳＦ)、マクロファージ−コロニー
刺激因子(M-CSF)および顆粒球−コロニー刺激因子(Ｇ−ＣＳＦ)を含む。ＧＭ−
ＣＳＦは、顆粒球またはマクロファージの幹細胞を刺激して分化を誘導し、顆粒
球またはマクロファージコロニーの分化を刺激する。Ｍ−ＣＳＦおよびＧ−ＣＳ
Ｆは一次的に各々マクロファージおよび顆粒球コロニーの形成を誘導する。in v
ivoで、Ｇ−ＣＳＦは骨髄白血球細胞の分化を誘導し、成熟した顆粒球の機能を
増進させるもので、白血病の治療における臨床的重要性はよく知られている。
【０００３】
ヒトＧ−ＣＳＦ(ｈＧ−ＧＳＦ)は、１７４個または１７７個のアミノ酸から構
成されたタンパク質であって、高い好中球増加活性を有する変異体であることが
知られている(Morishita, K. et al., J. Biol. Chem., 262, 15208-15213(1987
))。１７４個のアミノ酸からなるｈＧ−ＣＳＦのアミノ酸配列は図１に示されて
おり、前記ｈＧ−ＣＳＦをコードする遺伝子を操作することによるｈＧ−ＧＳＦ
の大量生産に関する研究が多く行われてきた。
成されたタンパク質であって、高い好中球増加活性を有する変異体であることが
知られている(Morishita, K. et al., J. Biol. Chem., 262, 15208-15213(1987
))。１７４個のアミノ酸からなるｈＧ−ＣＳＦのアミノ酸配列は図１に示されて
おり、前記ｈＧ−ＣＳＦをコードする遺伝子を操作することによるｈＧ−ＧＳＦ
の大量生産に関する研究が多く行われてきた。
【０００４】
たとえば、中外製薬(日本)は、ｈＧ−ＣＳＦのアミノ酸配列およびこれをコー
ドする遺伝子を明らかにし(韓国特許公告第９１−５６２４号および第９２−２
３１２号)、遺伝子組換え方法を用いてｈＧ−ＣＳＦ活性を有するタンパク質の
製造方法を開示した(韓国特許第４７１７８号、第５３７２３号および第５７５
８２号)。この製造方法において、グリコシル化されたｈＧ−ＣＳＦはゲノムＤ
ＮＡ遺伝子またはｈＧ−ＣＳＦをコードするポリヌクレオチドからなるｃＤＮＡ
遺伝子を哺乳動物細胞に適用して製造される。前記グリコシル化されたｈＧ−Ｃ
ＳＦはO−グリコシドの糖鎖構造を有しているが、前記糖鎖はｈＧ−ＣＳＦ活性
に必須でないということは既に公知である(Lawrence, M. et al., Science, 232
, 61(1986))。また、哺乳動物細胞を用いてグリコシル化ｈＧ−ＣＳＦを得るた
めには、高価な培地および生産方法を必要とすることも周知の事実である。
ドする遺伝子を明らかにし(韓国特許公告第９１−５６２４号および第９２−２
３１２号)、遺伝子組換え方法を用いてｈＧ−ＣＳＦ活性を有するタンパク質の
製造方法を開示した(韓国特許第４７１７８号、第５３７２３号および第５７５
８２号)。この製造方法において、グリコシル化されたｈＧ−ＣＳＦはゲノムＤ
ＮＡ遺伝子またはｈＧ−ＣＳＦをコードするポリヌクレオチドからなるｃＤＮＡ
遺伝子を哺乳動物細胞に適用して製造される。前記グリコシル化されたｈＧ−Ｃ
ＳＦはO−グリコシドの糖鎖構造を有しているが、前記糖鎖はｈＧ−ＣＳＦ活性
に必須でないということは既に公知である(Lawrence, M. et al., Science, 232
, 61(1986))。また、哺乳動物細胞を用いてグリコシル化ｈＧ−ＣＳＦを得るた
めには、高価な培地および生産方法を必要とすることも周知の事実である。
【０００５】
また、大腸菌のような微生物を用いて非−グリコシル化ｈＧ−ＣＳＦを製造す
ることが試みられている。このような研究においては、微生物において用いられ
たＡＴＧ開始コドンによってＮ−末端位置にメチオニン残基が付加した１７５個
または１７８個のアミノ酸を有するｈＧ−ＣＳＦｓが得られる。組換えｈＧ−Ｃ
ＳＦが人体に投与される場合、付加したメチオニン残基によって人体に有害な免
疫反応が誘発され得る(ヨーロッパ特許公開第２５６,８４３号)。また、大腸菌
を用いて製造されるメチオニンを含むｈＧ−ＣＳＦの大部分は細胞内で不溶性内
包体として生成するため、リフォールディング(Refolding)工程を経て活性化さ
れた形態に変換されなければならないが、この際の収率の損失が著しい。これに
関連して、野生型ｈＧ−ＣＳＦに存在する５つのシステイン残基のうち４個はジ
スルフィド結合に関与し、残りの一つのシステイン残基はリフォールディング工
程中ｈＧ−ＣＳＦの凝集に関与し収率を低下させる。
ることが試みられている。このような研究においては、微生物において用いられ
たＡＴＧ開始コドンによってＮ−末端位置にメチオニン残基が付加した１７５個
または１７８個のアミノ酸を有するｈＧ−ＣＳＦｓが得られる。組換えｈＧ−Ｃ
ＳＦが人体に投与される場合、付加したメチオニン残基によって人体に有害な免
疫反応が誘発され得る(ヨーロッパ特許公開第２５６,８４３号)。また、大腸菌
を用いて製造されるメチオニンを含むｈＧ−ＣＳＦの大部分は細胞内で不溶性内
包体として生成するため、リフォールディング(Refolding)工程を経て活性化さ
れた形態に変換されなければならないが、この際の収率の損失が著しい。これに
関連して、野生型ｈＧ−ＣＳＦに存在する５つのシステイン残基のうち４個はジ
スルフィド結合に関与し、残りの一つのシステイン残基はリフォールディング工
程中ｈＧ−ＣＳＦの凝集に関与し収率を低下させる。
【０００６】
最近、菌体内での外来タンパク質の生産にかかわる問題を解決するために、菌
体を介して細胞外ドメインに目的タンパク質を効率的に分泌させる方法が数多く
研究されている。
体を介して細胞外ドメインに目的タンパク質を効率的に分泌させる方法が数多く
研究されている。
【０００７】
たとえば、タンパク質のＮ−末端に付加されたシグナルペプチドを用いて目的
とするタンパク質を融合タンパク質の形態で発現する方法がある。融合タンパク
質が細胞膜を通過するとき、シグナルペプチドは酵素によって除去され、目的と
するタンパク質自体だけが分泌される。分泌生産方法は、生成したアミノ酸配列
が野生型と大体同様であるという長所を有する。しかし、分泌生産方法は、膜透
過および連続的な精製過程の効率が不十分なので生産性が非常に低い。これは、
原核生物を用いて哺乳類由来のタンパク質を分泌生産すると効率が非常に低いと
いう周知の事実と一致する。これまでのところ、タンパク質のＮ−末端にメチオ
ニン残基が付加されていない可溶性ｈＧ−ＣＳＦを微生物を用いて効率的に発現
・分泌させる方法は報告されていない。
とするタンパク質を融合タンパク質の形態で発現する方法がある。融合タンパク
質が細胞膜を通過するとき、シグナルペプチドは酵素によって除去され、目的と
するタンパク質自体だけが分泌される。分泌生産方法は、生成したアミノ酸配列
が野生型と大体同様であるという長所を有する。しかし、分泌生産方法は、膜透
過および連続的な精製過程の効率が不十分なので生産性が非常に低い。これは、
原核生物を用いて哺乳類由来のタンパク質を分泌生産すると効率が非常に低いと
いう周知の事実と一致する。これまでのところ、タンパク質のＮ−末端にメチオ
ニン残基が付加されていない可溶性ｈＧ−ＣＳＦを微生物を用いて効率的に発現
・分泌させる方法は報告されていない。
【０００８】
本発明者らは、ｈＧ−ＣＳＦを生産する方法として、大腸菌(E. coli)の熱安
定性エンテロトキシンIIのシグナルペプチドを修飾して製造された新たな分泌シ
グナルペプチドを用いる方法を既に報告した(韓国特許出願公開第９８−３８０
６１号)。これは、大腸菌(E. coli)の熱安定性エンテロトキシンIIの修飾された
シグナルペプチドの３´−末端に付加されたｈＧ−ＣＳＦを含む発現ベクターを
製造し、発現ベクターで形質転換された大腸菌を用いて生物学的活性を有する野
生型(成熟)ｈＧ−ＣＳＦを発現させるものである。しかし、この方法によって発
現されたｈＧ−ＣＳＦの相当部分はペリプラズム(周辺細胞質)より細胞質内に蓄
積される。
定性エンテロトキシンIIのシグナルペプチドを修飾して製造された新たな分泌シ
グナルペプチドを用いる方法を既に報告した(韓国特許出願公開第９８−３８０
６１号)。これは、大腸菌(E. coli)の熱安定性エンテロトキシンIIの修飾された
シグナルペプチドの３´−末端に付加されたｈＧ−ＣＳＦを含む発現ベクターを
製造し、発現ベクターで形質転換された大腸菌を用いて生物学的活性を有する野
生型(成熟)ｈＧ−ＣＳＦを発現させるものである。しかし、この方法によって発
現されたｈＧ−ＣＳＦの相当部分はペリプラズム(周辺細胞質)より細胞質内に蓄
積される。
【０００９】
本発明者らは、微生物においてｈＧ−ＣＳＦを効率的に分泌できる方法を開発
するために鋭意研究した結果、野性型ｈＧ−ＣＳＦの少なくとも一つのアミノ酸
残基、特に第１７番目のシステイン残基を他のアミノ酸残基に置換して製造され
たｈＧ−ＣＳＦ修飾体が野性型の生物学的活性を有し、そのＮ−末端にメチオニ
ン残基を含まない、修飾ｈＧ−ＣＳＦは、適切な分泌シグナルペプチドを用いる
と微生物から効率的に発現・分泌されるとの知見を得た。
するために鋭意研究した結果、野性型ｈＧ−ＣＳＦの少なくとも一つのアミノ酸
残基、特に第１７番目のシステイン残基を他のアミノ酸残基に置換して製造され
たｈＧ−ＣＳＦ修飾体が野性型の生物学的活性を有し、そのＮ−末端にメチオニ
ン残基を含まない、修飾ｈＧ−ＣＳＦは、適切な分泌シグナルペプチドを用いる
と微生物から効率的に発現・分泌されるとの知見を得た。
【００１０】
したがって、本発明の目的は、微生物を用いて効率的に製造できるヒト顆粒球
刺激因子(ｈＧ−ＣＳＦ)の修飾体を提供することである。
刺激因子(ｈＧ−ＣＳＦ)の修飾体を提供することである。
【００１１】
本発明の他の目的は、前記ペプチドをコードする遺伝子および前記遺伝子を含
むベクターを提供することである。
むベクターを提供することである。
【００１２】
本発明のまた他の目的は、前記ベクターで形質転換された微生物を提供するこ
とである。
とである。
【００１３】
本発明のまた他の目的は、前記微生物を用いてアミノ末端にメチオニン残基が
付着していないｈＧ−ＣＳＦを製造する方法を提供することである。
付着していないｈＧ−ＣＳＦを製造する方法を提供することである。
【００１４】
本発明の一実施態様によって、配列番号：２のアミノ酸配列を有する野生型ヒ
ト顆粒球コロニー刺激因子(ｈＧ−ＣＳＦ)の第１、第２、第３および第１７番目
のアミノ酸の少なくとも一つのアミノ酸が他のアミノ酸で置換されていることを
特徴とする修飾ｈＧ−ＣＳＦが提供される。
ト顆粒球コロニー刺激因子(ｈＧ−ＣＳＦ)の第１、第２、第３および第１７番目
のアミノ酸の少なくとも一つのアミノ酸が他のアミノ酸で置換されていることを
特徴とする修飾ｈＧ−ＣＳＦが提供される。
【００１５】
本発明のｈＧ−ＣＳＦ修飾体は野生型ｈＧ−ＣＳＦ(配列番号：２)の一つ以上
のアミノ酸、好ましくは第１、第２、第３および第１７番目のアミノ酸の一つ以
上を他のアミノ酸で置換することによって製造され得る。より好ましくは、ｈＧ
−ＣＳＦの第１７番目のアミノ酸を中性ｐＨでイオン化しないアミノ酸で置換す
ることによって得られる。特に好ましくは、修飾ｈＧ−ＣＳＦは次の配列を除い
ては野生型ｈＧ−ＣＳＦのアミノ酸配列を有する：
のアミノ酸、好ましくは第１、第２、第３および第１７番目のアミノ酸の一つ以
上を他のアミノ酸で置換することによって製造され得る。より好ましくは、ｈＧ
−ＣＳＦの第１７番目のアミノ酸を中性ｐＨでイオン化しないアミノ酸で置換す
ることによって得られる。特に好ましくは、修飾ｈＧ−ＣＳＦは次の配列を除い
ては野生型ｈＧ−ＣＳＦのアミノ酸配列を有する：
【００１６】
(ａ)第１番目のアミノ酸はセリン；
(ｂ)第１番目のアミノ酸はセリン、第１７番目のアミノ酸はＸ；
(ｃ)第２番目のアミノ酸はメチオニン、第３番目のアミノ酸はバリン；
(ｄ)第２番目のアミノ酸がメチオニン、第３番目のアミノ酸はバリンおよび第１
７番目のアミノ酸はＸ、または (ｆ)第１７番目のアミノ酸がＸ、 ここで、Ｘは中性ｐＨで電荷を帯びないアミノ酸、好ましくはSer、Thr、Alaま
たはGly、より好ましくはSerである。
７番目のアミノ酸はＸ、または (ｆ)第１７番目のアミノ酸がＸ、 ここで、Ｘは中性ｐＨで電荷を帯びないアミノ酸、好ましくはSer、Thr、Alaま
たはGly、より好ましくはSerである。
【００１７】
ｈＧ−ＣＳＦの５つのシステイン残基のうち４個はジスルフィド結合に関与し
、第１７システイン残基はそのまま状態で結合していない。しかし、大量のｈＧ
−ＣＳＦが組換え細胞で発現される場合、第１７システイン残基は他の分子のシ
ステイン残基とジスルフィド結合を形成し、凝集して細胞質内に蓄積される。し
かし、第１７システイン残基が他のアミノ酸に置換された本発明のｈＧ−ＣＳＦ
修飾体においてはこのような問題がなく、適切な形質転換された微生物を使用す
る分泌方法によって効率的に製造できる。
、第１７システイン残基はそのまま状態で結合していない。しかし、大量のｈＧ
−ＣＳＦが組換え細胞で発現される場合、第１７システイン残基は他の分子のシ
ステイン残基とジスルフィド結合を形成し、凝集して細胞質内に蓄積される。し
かし、第１７システイン残基が他のアミノ酸に置換された本発明のｈＧ−ＣＳＦ
修飾体においてはこのような問題がなく、適切な形質転換された微生物を使用す
る分泌方法によって効率的に製造できる。
【００１８】
また、本発明の修飾ｈＧ−ＣＳＦは、アミノ末端残基はタンパク質３次構造に
直接的な影響を与えない自由な形態の構造を有すると判断されるため、分泌効率
をさらに増加させるためには、アミノ末端の残基を他の様々なアミノ酸に置換す
ることができる。
直接的な影響を与えない自由な形態の構造を有すると判断されるため、分泌効率
をさらに増加させるためには、アミノ末端の残基を他の様々なアミノ酸に置換す
ることができる。
【００１９】
本発明では、前記ｈＧ−ＣＳＦ修飾体は遺伝暗号に従って修飾ｈＧ−ＣＳＦア
ミノ酸から誘導されたヌクレオチド配列を含む遺伝子によってコードされ得る。
コドンの縮重(degeneracy)によって本発明の修飾体をコードする様々な遺伝子が
存在し、特に、アミノ酸配列に影響を与えずに大腸菌に適合するコドンを選択す
ることにより、修飾体の発現量を増加させることができる。
ミノ酸から誘導されたヌクレオチド配列を含む遺伝子によってコードされ得る。
コドンの縮重(degeneracy)によって本発明の修飾体をコードする様々な遺伝子が
存在し、特に、アミノ酸配列に影響を与えずに大腸菌に適合するコドンを選択す
ることにより、修飾体の発現量を増加させることができる。
【００２０】
前記製造された遺伝子を通常のベクターに挿入することにより、適切な宿主、
たとえば、大腸菌に導入され得る発現ベクターが得られる。また、発現ベクター
は、シグナルペプチドを含む。代表的なシグナルペプチドとしては、熱安定性大
腸菌エンテロトキシンIIシグナルペプチド(配列番号：５３)、修飾された熱安定
性大腸菌エンテロトキシンIIシグナルペプチド(配列番号：５４)、ベータラクタ
マーゼシグナルペプチド(配列番号；２４)、Gene IIIシグナルペプチド(配列番
号：４２)またはこれらの修飾体を用いることができるが、本発明に使用され得
るシグナルペプチドはこれらに限定されない。また、本発明の発現ベクターの製
造に用いられるプロモーターは、微生物宿主で異種タンパク質を発現できるもの
であれば何でも用いられ得、特に、大腸菌から発現させる場合ｌａｃプロモータ
ー、Ｔａｃプロモーターおよびアラビノースプロモーターが好ましい。
たとえば、大腸菌に導入され得る発現ベクターが得られる。また、発現ベクター
は、シグナルペプチドを含む。代表的なシグナルペプチドとしては、熱安定性大
腸菌エンテロトキシンIIシグナルペプチド(配列番号：５３)、修飾された熱安定
性大腸菌エンテロトキシンIIシグナルペプチド(配列番号：５４)、ベータラクタ
マーゼシグナルペプチド(配列番号；２４)、Gene IIIシグナルペプチド(配列番
号：４２)またはこれらの修飾体を用いることができるが、本発明に使用され得
るシグナルペプチドはこれらに限定されない。また、本発明の発現ベクターの製
造に用いられるプロモーターは、微生物宿主で異種タンパク質を発現できるもの
であれば何でも用いられ得、特に、大腸菌から発現させる場合ｌａｃプロモータ
ー、Ｔａｃプロモーターおよびアラビノースプロモーターが好ましい。
【００２１】
本発明の発現ベクターとしては、pT14SS1SG、pT14SS1S17SEG、pTO1SG、pTO1S1
7SG、pTO17SG、pTO17TG、pTO17AG、pTO17GG、pBAD2M3VG、pBAD17SGおよびpBAD2M
3V17SGがある。
7SG、pTO17SG、pTO17TG、pTO17AG、pTO17GG、pBAD2M3VG、pBAD17SGおよびpBAD2M
3V17SGがある。
【００２２】
本発明の発現ベクターは、通常の形質転換方法(Sambrook et al., the supra)
に従って微生物、たとえば、大腸菌BL21(DE3)(ノバジェン社)、大腸菌XL-1 blue
(ノバジェン社)に導入されることによって、大腸菌BL21(DE3)／pT14SS1SG(HM 10
310)、大腸菌BL21(DE3)／pT14SS1S17SEG(HM 10311)、大腸菌BL21(DE3)／pTO1SG(
HM 10409)、大腸菌BL21(DE3) ／pTO1S17SG(HM 10410)、大腸菌BL21(DE3) ／pTO1
7SG(HM 10411)、大腸菌BL21(DE3) ／pTO17TG(HM 10413)、大腸菌BL21(DE3) ／pT
O17AG(HM 10414)、大腸菌BL21(DE3) ／pTO17GG(HM 10415)、大腸菌BL21(DE3) ／
pBAD2M3VG(HM 10510)、大腸菌BL21(DE3) ／pBAD17SG(HM 10511)または大腸菌BL2
1(DE3) ／pBAD2M3V17SG(HM 10512)を得る。これらの形質転換された微生物のう
ち、大腸菌 BL21(DE3)／pT14SS1S17SEG(HM 10311)、大腸菌BL21(DE3)／pTO1S17S
G(HM 10410)、大腸菌BL21(DE3)／pTO17SG(HM 10411)、大腸菌BL21(DE3)／pBAD2M
3VG(HM 10510)が好ましく、これらを特許手続上の微生物寄託の国際的承認に関
するブダペスト条約の規定により、韓国種菌協会(Korean Culture Center of Mi
croorganism, KCCM)(120-749大韓民国ソウル西大門区延世大学工学部食品工学科
)に各々寄託番号KCCM-10154、KCCM-10151、KCCM-10152およびKCCM-10153として
１９９９年３月２４日付で寄託した。
に従って微生物、たとえば、大腸菌BL21(DE3)(ノバジェン社)、大腸菌XL-1 blue
(ノバジェン社)に導入されることによって、大腸菌BL21(DE3)／pT14SS1SG(HM 10
310)、大腸菌BL21(DE3)／pT14SS1S17SEG(HM 10311)、大腸菌BL21(DE3)／pTO1SG(
HM 10409)、大腸菌BL21(DE3) ／pTO1S17SG(HM 10410)、大腸菌BL21(DE3) ／pTO1
7SG(HM 10411)、大腸菌BL21(DE3) ／pTO17TG(HM 10413)、大腸菌BL21(DE3) ／pT
O17AG(HM 10414)、大腸菌BL21(DE3) ／pTO17GG(HM 10415)、大腸菌BL21(DE3) ／
pBAD2M3VG(HM 10510)、大腸菌BL21(DE3) ／pBAD17SG(HM 10511)または大腸菌BL2
1(DE3) ／pBAD2M3V17SG(HM 10512)を得る。これらの形質転換された微生物のう
ち、大腸菌 BL21(DE3)／pT14SS1S17SEG(HM 10311)、大腸菌BL21(DE3)／pTO1S17S
G(HM 10410)、大腸菌BL21(DE3)／pTO17SG(HM 10411)、大腸菌BL21(DE3)／pBAD2M
3VG(HM 10510)が好ましく、これらを特許手続上の微生物寄託の国際的承認に関
するブダペスト条約の規定により、韓国種菌協会(Korean Culture Center of Mi
croorganism, KCCM)(120-749大韓民国ソウル西大門区延世大学工学部食品工学科
)に各々寄託番号KCCM-10154、KCCM-10151、KCCM-10152およびKCCM-10153として
１９９９年３月２４日付で寄託した。
【００２３】
本発明の修飾ｈＧ−ＣＳＦタンパク質は修飾ｈＧ−ＣＳＦタンパク質をコード
する遺伝子を発現し、細胞質に修飾ｈＧ−ＣＳＦタンパク質を分泌するように形
質転換された微生物を培養し；細胞質から修飾ｈＧ−ＣＳＦを回収することによ
って生産できる。形質転換された微生物は通常の方法に従って培養される(Sambr
ook et al., the supra)。微生物培養液は、修飾ｈＧ−ＣＳＦタンパク質を分泌
する微生物を収集するために遠心分離するか濾過する。形質転換された微生物を
通常の方法に従って破砕することにより(Ausubel, F. M. et al., Current Prot
ocols in Molecular Biology, (1989))細胞質溶液が得られる。たとえば、微生
物を蒸留水のような等張液中で浸透衝撃によって破砕できる。細胞質溶液中で修
飾ｈＧ−ＣＳＦの回収は通常の方法(Sambrook et al., the supra)、たとえば、
イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過カラムクロマトグラフィーまたは免疫
カラムクロマトグラフィーに従って行い得る。たとえば、ｈＧ−ＣＳＦはＣＭ−
セファロースカラムクロマトグラフィーおよびフェニルセファロースカラムクロ
マトグラフィーを連続的に行うことによって精製できる。
する遺伝子を発現し、細胞質に修飾ｈＧ−ＣＳＦタンパク質を分泌するように形
質転換された微生物を培養し；細胞質から修飾ｈＧ−ＣＳＦを回収することによ
って生産できる。形質転換された微生物は通常の方法に従って培養される(Sambr
ook et al., the supra)。微生物培養液は、修飾ｈＧ−ＣＳＦタンパク質を分泌
する微生物を収集するために遠心分離するか濾過する。形質転換された微生物を
通常の方法に従って破砕することにより(Ausubel, F. M. et al., Current Prot
ocols in Molecular Biology, (1989))細胞質溶液が得られる。たとえば、微生
物を蒸留水のような等張液中で浸透衝撃によって破砕できる。細胞質溶液中で修
飾ｈＧ−ＣＳＦの回収は通常の方法(Sambrook et al., the supra)、たとえば、
イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過カラムクロマトグラフィーまたは免疫
カラムクロマトグラフィーに従って行い得る。たとえば、ｈＧ−ＣＳＦはＣＭ−
セファロースカラムクロマトグラフィーおよびフェニルセファロースカラムクロ
マトグラフィーを連続的に行うことによって精製できる。
【００２４】
本発明に従って生産される、修飾ｈＧ−ＣＳＦタンパク質はＮ−末端がメチル
化されておらず、野生型ｈＧ−ＣＳＦと同等以上の生物学的活性を有する。した
がって、様々な応用分野で使用することができる。
化されておらず、野生型ｈＧ−ＣＳＦと同等以上の生物学的活性を有する。した
がって、様々な応用分野で使用することができる。
【００２５】
下記実施例は本発明をさらに詳細に説明するためのものであり、本発明の範囲
を制限しない。 実施例１：ｈＧ−ＣＳＦをコードする遺伝子の作製 ｈＧ−ＣＳＦをコードするｃＤＮＡ遺伝子は、ｈＧ−ＣＳＦを鋳型として用い
て(R & D System, USA)、米国特許第４,８１０,６４３号で提示されたプライマ
ーを用いてｈＧ−ＣＳＦをコードするｃＤＮＡを製造した。
を制限しない。 実施例１：ｈＧ−ＣＳＦをコードする遺伝子の作製 ｈＧ−ＣＳＦをコードするｃＤＮＡ遺伝子は、ｈＧ−ＣＳＦを鋳型として用い
て(R & D System, USA)、米国特許第４,８１０,６４３号で提示されたプライマ
ーを用いてｈＧ−ＣＳＦをコードするｃＤＮＡを製造した。
【００２６】
完全なｈＧ−ＣＳＦをコードするｃＤＮＡ遺伝子を製造するために、ベクター
ｐＵＣ１９−Ｇ−ＣＳＦ(Biolabs, USA)を配列番号：３および４のプライマーを
用いてＰＣＲを行った。配列番号：３のプライマーは完成したｈＧ−ＣＳＦの第
１のアミノ酸であるトレオニンの上流に制限酵素ＮｄｅＩ認知配列である5'-CAT
ATG-3'を含むように設計され、配列番号：4のプライマーは完成したｈＧ−ＣＳ
Ｆの終了コドンの下流に制限酵素BamH I認知配列である5'-GGATCC-3'が含まれる
ように設計された。
ｐＵＣ１９−Ｇ−ＣＳＦ(Biolabs, USA)を配列番号：３および４のプライマーを
用いてＰＣＲを行った。配列番号：３のプライマーは完成したｈＧ−ＣＳＦの第
１のアミノ酸であるトレオニンの上流に制限酵素ＮｄｅＩ認知配列である5'-CAT
ATG-3'を含むように設計され、配列番号：4のプライマーは完成したｈＧ−ＣＳ
Ｆの終了コドンの下流に制限酵素BamH I認知配列である5'-GGATCC-3'が含まれる
ように設計された。
【００２７】
増幅されたｈＧ−ＣＳＦ遺伝子を制限酵素Nde IとBamH Iで切断して完全なｈ
Ｇ−ＣＳＦをコードする遺伝子を得た。ｈＧ−ＣＳＦ遺伝子をベクターpET-14b(
ノバジェン社)のNdeI/BamHI部位に挿入することによりベクターpT-CSFを作製し
た。 図２は、前記ベクターpT-CSFを作製する過程を示す。
Ｇ−ＣＳＦをコードする遺伝子を得た。ｈＧ−ＣＳＦ遺伝子をベクターpET-14b(
ノバジェン社)のNdeI/BamHI部位に挿入することによりベクターpT-CSFを作製し
た。 図２は、前記ベクターpT-CSFを作製する過程を示す。
【００２８】
実施例２：大腸菌エンテロトキシンIIシグナルペプチドをコードする遺伝子お
よび修飾ｈＧ−ＣＳＦを含むベクターの作製 (段階１)大腸菌エンテロトキシンIIシグナルペプチド遺伝子のクローニング 大腸菌エンテロトキシンIIシグナルペプチド遺伝子を製造するために、配列番号
：５および６を有する相補的なオリゴヌクレオチド対を大腸菌エンテロトキシン
IIのヌクレオチド配列に基づいて設計し、ＤＮＡ合成装置(Model 380B, Applied
Biosystem, USA)を用いて合成した。
よび修飾ｈＧ−ＣＳＦを含むベクターの作製 (段階１)大腸菌エンテロトキシンIIシグナルペプチド遺伝子のクローニング 大腸菌エンテロトキシンIIシグナルペプチド遺伝子を製造するために、配列番号
：５および６を有する相補的なオリゴヌクレオチド対を大腸菌エンテロトキシン
IIのヌクレオチド配列に基づいて設計し、ＤＮＡ合成装置(Model 380B, Applied
Biosystem, USA)を用いて合成した。
【００２９】
前記オリゴヌクレオチドは、大腸菌エンテロトキシンIIの開始コドンの上流に
制限酵素Ｎco Iと相補的な制限酵素BspHI認知配列が提供され、他の末端にはア
ミノ酸の変化なしにコドンのみを変えて制限酵素MluI認識部位を有するように設
計された。
制限酵素Ｎco Iと相補的な制限酵素BspHI認知配列が提供され、他の末端にはア
ミノ酸の変化なしにコドンのみを変えて制限酵素MluI認識部位を有するように設
計された。
【００３０】
２つのオリゴヌクレオチドを９５℃でアーニリングして大腸菌エンテロトキシ
ンIIシグナルペプチド(ＳＴII遺伝子)をコードするヌクレオチド配列を有する平
滑末端ＤＮＡ断片を得た。
ンIIシグナルペプチド(ＳＴII遺伝子)をコードするヌクレオチド配列を有する平
滑末端ＤＮＡ断片を得た。
【００３１】
ＳＴII遺伝子をベクターpUC19(Biolabs, USA)のSma I部位に挿入してベクター
pUC19STを作製した。
pUC19STを作製した。
【００３２】
(段階２) ＳＴII/ｈＧ−ＣＳＦをコードする遺伝子の製造
ＳＴII／ｈＧ−ＣＳＦをコードする遺伝子を製造するために、実施例１で得ら
れたベクターpT-CSFを配列番号：７および８のプライマーを用いてＰＣＲを行っ
た。配列番号：７のプライマーはｈＧ−ＣＳＦの第１コドンがセリンに置換され
るように設計され、配列番号：８のプライマーはｈＧ−ＣＳＦの終了コドンの下
流に制限酵素BamHI認知配列である5'-GGATCC-3'が提供されるように設計された
。
れたベクターpT-CSFを配列番号：７および８のプライマーを用いてＰＣＲを行っ
た。配列番号：７のプライマーはｈＧ−ＣＳＦの第１コドンがセリンに置換され
るように設計され、配列番号：８のプライマーはｈＧ−ＣＳＦの終了コドンの下
流に制限酵素BamHI認知配列である5'-GGATCC-3'が提供されるように設計された
。
【００３３】
増幅されたＤＮＡ断片を制限酵素MluIとBamHIで切断し、段階１で得られたpUC
19STのMluI/BamHI部位に挿入してベクターpUC19S1SGを作製した。このようにし
て得られたベクターpUC19S1SGはＳＴII−ｈＧ−ＣＳＦをコードする遺伝子(以下
、ＳＴII−ｈＧ−ＣＳＦ遺伝子という)を含む。
19STのMluI/BamHI部位に挿入してベクターpUC19S1SGを作製した。このようにし
て得られたベクターpUC19S1SGはＳＴII−ｈＧ−ＣＳＦをコードする遺伝子(以下
、ＳＴII−ｈＧ−ＣＳＦ遺伝子という)を含む。
【００３４】
ベクターpUC19S1SGを制限酵素BspH IとBamH Iで切断してＤＮＡ断片(522 bp)
を得た。ＤＮＡ断片をベクターpET14b(Novagen, USA)のNcoI/BamHI部位に挿入し
てベクターpT14S1SGを作製した。 図３は、前記ベクターpT14S1SGの作製過程を示す。
を得た。ＤＮＡ断片をベクターpET14b(Novagen, USA)のNcoI/BamHI部位に挿入し
てベクターpT14S1SGを作製した。 図３は、前記ベクターpT14S1SGの作製過程を示す。
【００３５】
(段階３)ＳＴII-hG-CSF遺伝子に大腸菌エンテロトキシンIIシャイン−ダルガ
ノ配列の付加 段階２で得られたベクターpT14S1SGを配列番号：９および１０のプライマーを
用いてＰＣＲを行った。配列番号：９のプライマーは大腸菌エンテロトキシンII
シャイン−ダルガノ配列(以下ＳＴII ＳＤ配列という)および制限酵素ＸｂａＩ
認知部位を提供するように設計され、配列番号：１０のプライマーはｈＧ−ＣＳ
Ｆの終了コドンの下流に制限酵素BamHI認知部位を提供するように設計されてＳ
ＴII SDおよびＳＴII-hG-CSF遺伝子を含むＤＮＡ断片(ＳＴII SD-ＳＴII-hG-CSF
)を得た。
ノ配列の付加 段階２で得られたベクターpT14S1SGを配列番号：９および１０のプライマーを
用いてＰＣＲを行った。配列番号：９のプライマーは大腸菌エンテロトキシンII
シャイン−ダルガノ配列(以下ＳＴII ＳＤ配列という)および制限酵素ＸｂａＩ
認知部位を提供するように設計され、配列番号：１０のプライマーはｈＧ−ＣＳ
Ｆの終了コドンの下流に制限酵素BamHI認知部位を提供するように設計されてＳ
ＴII SDおよびＳＴII-hG-CSF遺伝子を含むＤＮＡ断片(ＳＴII SD-ＳＴII-hG-CSF
)を得た。
【００３６】
ＳＴII SD-ＳＴII-hG-CSF 断片をXbaIとBamHIで切断し、ベクターpET14b(Nova
gen, USA)のXbaI／BamHI部位に挿入してベクターpT14SS1SGを作製した。 図４は、前記ベクターpT14SS1SGの作製過程を示す。
gen, USA)のXbaI／BamHI部位に挿入してベクターpT14SS1SGを作製した。 図４は、前記ベクターpT14SS1SGの作製過程を示す。
【００３７】
大腸菌BL21(DE3)(Stratagene, USA)をベクターpT14SS1SGで形質転換させて形
質転換された大腸菌HM 10310を得た。
質転換された大腸菌HM 10310を得た。
【００３８】
(段階４) ＳＴII／ｈＧ−ＣＳＦ融合タンパク質をコードする遺伝子を含むベ
クターの製造 部位特異的突然変異誘発(site directed mutagenesis)(Papworth, C. et al.,
Strategies, 9, 3(1996))に従って、前記段階３で得られたプラスミドpT14SS1S
Gの修飾ｈＧ−ＣＳＦ遺伝子の第１の位置のセリンコドンをトレオニンコドンで
置換し、修飾されたヌクレオチド配列を含むセンスプライマー(配列番号：１２)
、相補的なアンチセンスプライマー(配列番号：１３)およびpfu(ストラタジン,
USA)を用いてＰＣＲを行った。
クターの製造 部位特異的突然変異誘発(site directed mutagenesis)(Papworth, C. et al.,
Strategies, 9, 3(1996))に従って、前記段階３で得られたプラスミドpT14SS1S
Gの修飾ｈＧ−ＣＳＦ遺伝子の第１の位置のセリンコドンをトレオニンコドンで
置換し、修飾されたヌクレオチド配列を含むセンスプライマー(配列番号：１２)
、相補的なアンチセンスプライマー(配列番号：１３)およびpfu(ストラタジン,
USA)を用いてＰＣＲを行った。
【００３９】
増幅されたＤＮＡ断片を回収し、制限酵素DpnIを添加して転換されなかったプ
ラスミドを除去した。
ラスミドを除去した。
【００４０】
修飾されたプラスミドで大腸菌XL-1 blue(ノバジェン社)を形質転換させた。
形質転換されたコロニーから回収したＤＮＡの塩基配列を決定してｈＧ−ＣＳＦ
の第１のアミノ酸がトレオニンに転換されたプラスミドpT14SSG(配列番号：１１
)を得た。
形質転換されたコロニーから回収したＤＮＡの塩基配列を決定してｈＧ−ＣＳＦ
の第１のアミノ酸がトレオニンに転換されたプラスミドpT14SSG(配列番号：１１
)を得た。
【００４１】
-5 -4 -3 -2 -1 +1 +2 +3 +4 +5
Thr Asn Ala Tyr Ala Thr Pro Leu Gly Pro (配列番号：1
1) - ACA - AAT - GCC - TAC- GCG - ACA - CCC - CTG - GGC - CCT (配列番号：1
2) - TGT - TTA - CGG - ATG- CGC - TGT - GGG - GAC - CCG - GGA (配列番号：1
3)
1) - ACA - AAT - GCC - TAC- GCG - ACA - CCC - CTG - GGC - CCT (配列番号：1
2) - TGT - TTA - CGG - ATG- CGC - TGT - GGG - GAC - CCG - GGA (配列番号：1
3)
【００４２】
大腸菌BL21(DE3)(Stratagene, USA)をベクターpT14SSGで形質転換して大腸菌H
M 10301と命名された形質転換体を得た。
M 10301と命名された形質転換体を得た。
【００４３】
(段階５)修飾されたＳＴII／ｈＧ−ＣＳＦをコードする遺伝子を含むベクター
の作製 段階４で得られたベクターpT14SSGをＳＴIIの第４番目のコドンがThrに置換さ
れるように設計された配列番号：１５および１６の相補的なプライマーを用いて
段階４の方法に従ってＰＣＲを行うことにより修飾されたプラスミドを得た。
の作製 段階４で得られたベクターpT14SSGをＳＴIIの第４番目のコドンがThrに置換さ
れるように設計された配列番号：１５および１６の相補的なプライマーを用いて
段階４の方法に従ってＰＣＲを行うことにより修飾されたプラスミドを得た。
【００４４】
大腸菌XL-1 blueを修飾されたプラスミドで形質転換した。形質転換されたコ
ロニーから回収したＤＮＡの塩基配列を決定した後、ＳＴIIの第４番目のアミノ
酸がThrに修飾された遺伝子(配列番号：１４)を含むプラスミドを得た。
ロニーから回収したＤＮＡの塩基配列を決定した後、ＳＴIIの第４番目のアミノ
酸がThrに修飾された遺伝子(配列番号：１４)を含むプラスミドを得た。
【００４５】
Met Lys Lys Thr Ile Ala Phe Leu (配列番号：14)
5'-GG-TGT-TTT-ATG-AAA-AAG-ACA-ATC-GCA-TTT-CTT-C-3' (配列番号：15)
3'-CC-ACA-AAA-TAC-TTT-TTC-TGT-TAG-CGT-AAA-GAA-G-5' (配列番号：16)
【００４６】
このようにして得られたプラスミドをXbaIとMluIで切断した後、段階４で得ら
れたベクターpT14SSGのXbaI/MluI部位に挿入してプラスミドpT14SSG-4Tを得た。
れたベクターpT14SSGのXbaI/MluI部位に挿入してプラスミドpT14SSG-4Tを得た。
【００４７】
(段階６)修飾されたＳＴII／ｈＧ−ＣＳＦをコードする遺伝子を含むベクター
の作製 段階５で得られたベクターpT14SSG-4TをＳＴIIの第２２番目のコドンがGlnに
置換されるように設計された配列番号：１８および１９の相補的なプライマーを
用いて段階４の方法に従ってＰＣＲを行うことにより修飾されたプラスミドを得
た。
の作製 段階５で得られたベクターpT14SSG-4TをＳＴIIの第２２番目のコドンがGlnに
置換されるように設計された配列番号：１８および１９の相補的なプライマーを
用いて段階４の方法に従ってＰＣＲを行うことにより修飾されたプラスミドを得
た。
【００４８】
大腸菌 XL-1 blueを修飾されたプラスミドで形質転換した。形質転換されたコ
ロニーから回収したＤＮＡの塩基配列を決定した後、 ＳＴIIの第２２番目のコ
ドンがGlnに修飾された遺伝子(配列番号：１７)を含むプラスミド pT14SSG-4T22
Qを得た。
ロニーから回収したＤＮＡの塩基配列を決定した後、 ＳＴIIの第２２番目のコ
ドンがGlnに修飾された遺伝子(配列番号：１７)を含むプラスミド pT14SSG-4T22
Qを得た。
【００４９】
Asn Ala Gln Ala Thr Pro Leu Gly (配列番号：17)
5'-CA-AAT-GCC-CAA-GCG-ACA-CCC-CTG-GGC-3' (配列番号：18)
3'-GT-TTA-CGG-GTT-CGC-TGT-GGG-GAC-CCG-5' (配列番号：19)
【００５０】
(段階７)修飾されたＳＴII／ｈＧ−ＣＳＦをコードする遺伝子および修飾され
たＳＴII SDを含むベクターの作製 段階６で得られたベクターpT14SSG-4T22Qを配列番号：２０および２１の相補
的なプライマーを用いて段階４の方法に従ってＰＣＲを行うことによりＳＴII S
D配列(GAGG)およびＳＴIIの初期コドン(配列番号：７１の修飾されたＳＴII SD)
の間に６個のヌクレオチド配列を有するベクターpT14SSG-4T22Qを製造した。 図５は、ベクターpT140SSG-4T22Qの作製過程を示す。
たＳＴII SDを含むベクターの作製 段階６で得られたベクターpT14SSG-4T22Qを配列番号：２０および２１の相補
的なプライマーを用いて段階４の方法に従ってＰＣＲを行うことによりＳＴII S
D配列(GAGG)およびＳＴIIの初期コドン(配列番号：７１の修飾されたＳＴII SD)
の間に６個のヌクレオチド配列を有するベクターpT14SSG-4T22Qを製造した。 図５は、ベクターpT140SSG-4T22Qの作製過程を示す。
【００５１】
次いで、大腸菌BL21(DE3)をベクターpT140SSG-4T22Qで形質転換して大腸菌HM
10302と命名された形質転換株を得た。
10302と命名された形質転換株を得た。
【００５２】
実施例３：修飾ｈＧ−ＣＳＦをコードする遺伝子を含むベクターの製造
修飾ｈＧ−ＣＳＦ遺伝子を製造するために、大腸菌選択(E. coli-preferred)
コドンを有しており、第１７番目のアミノ酸がセリンに置換されたｈＧ−ＣＳＦ
を有するＳ１オリゴマー(配列番号：２２)およびAS1オリゴマー(配列番号：２３
)をＤＮＡ合成装置(Model 380B, Applied Biosystem, USA)を用いて合成した。
コドンを有しており、第１７番目のアミノ酸がセリンに置換されたｈＧ−ＣＳＦ
を有するＳ１オリゴマー(配列番号：２２)およびAS1オリゴマー(配列番号：２３
)をＤＮＡ合成装置(Model 380B, Applied Biosystem, USA)を用いて合成した。
【００５３】
オリゴヌクレオチドを０.５μｌ(50 pmole)ずつ取った後、９５℃で１５分間
反応させ、３時間徐々に冷やして温度を３５℃まで低めた。この混合物をエタノ
ール中で沈澱させた後SDS-PAGEゲルで電気泳動して接着末端を有する二本鎖(ds)
のオリゴマーを得た。
反応させ、３時間徐々に冷やして温度を３５℃まで低めた。この混合物をエタノ
ール中で沈澱させた後SDS-PAGEゲルで電気泳動して接着末端を有する二本鎖(ds)
のオリゴマーを得た。
【００５４】
実施例２の段階３で得られたプラスミドpT14SS1SGを制限酵素ApaIとBstXIで切
断した後、上記接着性末端を有する二本鎖のオリゴマーと連結してベクターpT14
SS1S17SEGを得た。このベクターpT14SS1S17SEGは、アミノ末端に大腸菌選好コド
ンを有しており、第１番目と第１７番目のアミノ酸が各々セリンで置換されたｈ
Ｇ−ＣＳＦをコードする遺伝子を含む。 図６は、ベクターpT14SS1S17SEGの作製過程を示す。
断した後、上記接着性末端を有する二本鎖のオリゴマーと連結してベクターpT14
SS1S17SEGを得た。このベクターpT14SS1S17SEGは、アミノ末端に大腸菌選好コド
ンを有しており、第１番目と第１７番目のアミノ酸が各々セリンで置換されたｈ
Ｇ−ＣＳＦをコードする遺伝子を含む。 図６は、ベクターpT14SS1S17SEGの作製過程を示す。
【００５５】
大腸菌 BL21(DE3)をベクターpT14SS1S17SEGで形質転換して大腸菌HM 10311と
命名された形質転換株を得、これを１９９９年３月２４日付で国際寄託機関であ
る韓国種菌協会付設韓国微生物保存センター(KCCM)寄託番号第KCCM-10154号とし
て寄託した。
命名された形質転換株を得、これを１９９９年３月２４日付で国際寄託機関であ
る韓国種菌協会付設韓国微生物保存センター(KCCM)寄託番号第KCCM-10154号とし
て寄託した。
【００５６】
実施例４：大腸菌OmpAシグナルペプチドおよび修飾ｈＧ−ＣＳＦをコードする
遺伝子を含むベクターの作製 TacプロモーターとOmpAシグナルペプチドをコードする遺伝子(配列番号：２４
)および修飾ｈＧ−ＣＳＦをコードする遺伝子を含む発現ベクターを次のように
作製した。
遺伝子を含むベクターの作製 TacプロモーターとOmpAシグナルペプチドをコードする遺伝子(配列番号：２４
)および修飾ｈＧ−ＣＳＦをコードする遺伝子を含む発現ベクターを次のように
作製した。
【００５７】Met-Lys-Lys-Thr-Ala-Ile-Ala-Ile-Ala-Val-Ala-Leu-Ala-Gly-Phe-Ala- Thr-Val-Ala-Gln-Ala-
(配列番号：24)
--- GTT-GCG-CAA-GCT-TCT-CGA--- (配列番号：25)
--- CAA-CGC-GTT-CGA-AGA-GCT--- (配列番号：26)
Hind III切断部位
【００５８】
実施例１で得られたベクターpT-CSFをｈＧ−ＣＳＦの第１番目のコドンがセリ
ンに置換されるように設計された配列番号：２７のプライマーおよび終了コドン
の下流に制限酵素EcoR I認知配列である5'-GAATTC-3'を挿入するように設計され
た配列番号：２８のプライマーを用いてＰＣＲを行うことにより修飾ｈＧ−ＣＳ
Ｆをコードする遺伝子を含むＤＮＡ断片を得た。
ンに置換されるように設計された配列番号：２７のプライマーおよび終了コドン
の下流に制限酵素EcoR I認知配列である5'-GAATTC-3'を挿入するように設計され
た配列番号：２８のプライマーを用いてＰＣＲを行うことにより修飾ｈＧ−ＣＳ
Ｆをコードする遺伝子を含むＤＮＡ断片を得た。
【００５９】
ＤＮＡ断片を制限酵素HindIIIとEcoRIで切断した後、ベクターpFlag.CTS(イー
ストマン社)のHindIII/EcoRI部位に挿入して大腸菌 OmpAシグナルペプチドおよ
び修飾ｈＧ−ＣＳＦをコードする遺伝子(配列番号：２９)を含むベクターpTO1SG
を作製した。 図７は、ベクターpTO1SGの作製過程を示す。
ストマン社)のHindIII/EcoRI部位に挿入して大腸菌 OmpAシグナルペプチドおよ
び修飾ｈＧ−ＣＳＦをコードする遺伝子(配列番号：２９)を含むベクターpTO1SG
を作製した。 図７は、ベクターpTO1SGの作製過程を示す。
【００６０】
大腸菌BL21(DE3)(Stratagene, USA)をベクターpTO1SGで形質転換して大腸菌HM
10409と命名された形質転換株を得た。
10409と命名された形質転換株を得た。
【００６１】
実施例５：大腸菌OmpAシグナルペプチドおよび修飾ｈＧ−ＣＳＦをコードする
遺伝子を含むベクターの製造 実施例４で得られたプラスミドpTO1SGをｈＧ−ＣＳＦの第１コドンがトレオニ
ンに置換されるように設計されたセンスプライマー(配列番号：３０)および相補
的なアンチセンスプライマー(配列番号：３１)を用いてＰＣＲを行うことにより
、部位特異的突然変異誘発によって修飾ｈＧ−ＣＳＦの第１コドンをThrに置換
した。
遺伝子を含むベクターの製造 実施例４で得られたプラスミドpTO1SGをｈＧ−ＣＳＦの第１コドンがトレオニ
ンに置換されるように設計されたセンスプライマー(配列番号：３０)および相補
的なアンチセンスプライマー(配列番号：３１)を用いてＰＣＲを行うことにより
、部位特異的突然変異誘発によって修飾ｈＧ−ＣＳＦの第１コドンをThrに置換
した。
【００６２】
大腸菌XL-1 blue(Novagen, USA)を修飾されたプラスミドで形質転換した。形
質転換されたコロニーから回収したＤＮＡの塩基配列を決定し、ｈＧ−ＣＳＦの
第１番目のアミノ酸がトレオニンに置換されたプラスミドpTOGを得た。
質転換されたコロニーから回収したＤＮＡの塩基配列を決定し、ｈＧ−ＣＳＦの
第１番目のアミノ酸がトレオニンに置換されたプラスミドpTOGを得た。
【００６３】
大腸菌BL21(DE3)(Stratagene, USA)をベクターpTOGで形質転換して大腸菌HM 1
0401と命名された形質転換株を得た。
0401と命名された形質転換株を得た。
【００６４】
実施例６：修飾ｈＧ−ＣＳＦの製造
(a) [Ser1, Ser17]ｈＧ−ＣＳＦの製造
前記実施例４で得られたベクターpTO1SGをｈＧ−ＣＳＦの第１７の位置のシス
テインコドンがSerコドンに置換されるように設計された配列番号：３２のセン
スプライマーおよびそれに相補的な配列番号：３３のアンチセンスプライマーを
用いて前記実施例２の段階４の方法に従ってＰＣＲを行うことにより修飾された
プラスミドを製造した。
テインコドンがSerコドンに置換されるように設計された配列番号：３２のセン
スプライマーおよびそれに相補的な配列番号：３３のアンチセンスプライマーを
用いて前記実施例２の段階４の方法に従ってＰＣＲを行うことにより修飾された
プラスミドを製造した。
【００６５】
大腸菌XL-1 blue(Novagen, USA)を修飾されたプラスミドで形質転換した。形
質転換されたコロニーから回収したＤＮＡの塩基配列を決定し、ｈＧ−ＣＳＦの
第１番目のアミノ酸および第１７番目のアミノ酸がセリンに各々置換されたプラ
スミドpTO1S17SGを得た。
質転換されたコロニーから回収したＤＮＡの塩基配列を決定し、ｈＧ−ＣＳＦの
第１番目のアミノ酸および第１７番目のアミノ酸がセリンに各々置換されたプラ
スミドpTO1S17SGを得た。
【００６６】
大腸菌BL21(DE3)(Stratagene, USA)をベクターpTO1S17SGで形質転換して大腸
菌HM 10410と命名された形質転換株を得、これを１９９９年３月２４日付で韓国
種菌協会付設韓国微生物保存センター(KCCM)に寄託番号第KCCM-10151号として寄
託した。
菌HM 10410と命名された形質転換株を得、これを１９９９年３月２４日付で韓国
種菌協会付設韓国微生物保存センター(KCCM)に寄託番号第KCCM-10151号として寄
託した。
【００６７】
(b) [Ser17] ｈＧ−ＣＳＦの製造
前記実施例５で得られたベクターpTOGをｈＧ−ＣＳＦの第１７番コドンがセリ
ンに置換されるように設計された配列番号：３２のセンスプライマーおよびそれ
に相補的な配列番号：３３のアンチセンスプライマーを用いて前記実施例２の段
階４の方法に従ってＰＣＲを行うことにより修飾されたプラスミドを製造した。
ンに置換されるように設計された配列番号：３２のセンスプライマーおよびそれ
に相補的な配列番号：３３のアンチセンスプライマーを用いて前記実施例２の段
階４の方法に従ってＰＣＲを行うことにより修飾されたプラスミドを製造した。
【００６８】
大腸菌XL-1 blue(Novagen, USA)を修飾されたプラスミドで形質転換した。形
質転換されたコロニーから回収されたＤＮＡの塩基配列を決定し、ｈＧ−ＣＳＦ
の第１７番のアミノ酸がセリンに置換された遺伝子を含むプラスミドpTO17SGを
得た。
質転換されたコロニーから回収されたＤＮＡの塩基配列を決定し、ｈＧ−ＣＳＦ
の第１７番のアミノ酸がセリンに置換された遺伝子を含むプラスミドpTO17SGを
得た。
【００６９】
大腸菌BL21(DE3)(Stratagene, USA)をベクターpTO17SGで形質転換して大腸菌H
M 10411と命名された形質転換株を得、これを１９９９年３月２４日付で韓国種
菌協会付設韓国微生物保存センター(KCCM)に寄託番号第KCCM-10152号として寄託
した。
M 10411と命名された形質転換株を得、これを１９９９年３月２４日付で韓国種
菌協会付設韓国微生物保存センター(KCCM)に寄託番号第KCCM-10152号として寄託
した。
【００７０】
(c) [Thr17] ｈＧ−ＣＳＦの製造
前記実施例５で得られたベクターpTOGをｈＧ−ＣＳＦの第１７番コドンがThr
に置換されるように設計された配列番号：３４のセンスプライマーおよびそれに
相補的な配列番号：３５のアンチセンスプライマーを用いて前記実施例２の段階
４の方法に従ってＰＣＲを行うことにより修飾されたプラスミドを製造した。
に置換されるように設計された配列番号：３４のセンスプライマーおよびそれに
相補的な配列番号：３５のアンチセンスプライマーを用いて前記実施例２の段階
４の方法に従ってＰＣＲを行うことにより修飾されたプラスミドを製造した。
【００７１】
大腸菌XL-1 blue(Novagen, USA)を修飾されたプラスミドで形質転換した。形
質転換されたコロニーから回収したＤＮＡの塩基配列を決定し、ｈＧ−ＣＳＦの
第１７番のアミノ酸がトレオニンに置換された遺伝子を有するプラスミドpTO17T
Gを得た。
質転換されたコロニーから回収したＤＮＡの塩基配列を決定し、ｈＧ−ＣＳＦの
第１７番のアミノ酸がトレオニンに置換された遺伝子を有するプラスミドpTO17T
Gを得た。
【００７２】
大腸菌ＢＬ２１(ＤＥ３)(Stratagene, USA)をベクターpTO17TG で形質転換し
て大腸菌HM 10413と命名されたと形質転換体を得た。
て大腸菌HM 10413と命名されたと形質転換体を得た。
【００７３】
(d) [Ala17] ｈＧ−ＣＳＦの製造
前記実施例５で得られたベクターpTOGをｈＧ−ＣＳＦの第１７番コドンがAla
に置換されるように設計された配列番号：３６のセンスプライマーおよびそれに
相補的な配列番号：３７のアンチセンスプライマーを用いて前記実施例２の段階
４の方法に従ってＰＣＲを行うことにより修飾されたプラスミドを製造した。
に置換されるように設計された配列番号：３６のセンスプライマーおよびそれに
相補的な配列番号：３７のアンチセンスプライマーを用いて前記実施例２の段階
４の方法に従ってＰＣＲを行うことにより修飾されたプラスミドを製造した。
【００７４】
大腸菌XL-1 blue(Novagen, USA)を修飾されたプラスミドで形質転換させた。
形質転換されたコロニーから回収したＤＮＡの塩基配列を決定し、ｈＧ−ＣＳＦ
の１７番のアミノ酸がシステインからアラニンに置換された遺伝子を有するプラ
スミドpTO17AGを得た。
形質転換されたコロニーから回収したＤＮＡの塩基配列を決定し、ｈＧ−ＣＳＦ
の１７番のアミノ酸がシステインからアラニンに置換された遺伝子を有するプラ
スミドpTO17AGを得た。
【００７５】
大腸菌ＢＬ２１(ＤＥ３)(Stratagene, USA)をベクターpTO17AG で形質転換し
て大腸菌HM 10414と命名されたと形質転換体を得た。
て大腸菌HM 10414と命名されたと形質転換体を得た。
【００７６】
(e) [Gly17] ｈＧ−ＣＳＦの製造
前記実施例５で得られたベクターpTOGをｈＧ−ＣＳＦの第１７番コドンがGly
に置換されるように設計された配列番号：３８のセンスプライマーおよびそれに
相補的な配列番号：３９のアンチセンスプライマーを用いて前記実施例２の段階
４の方法に従ってＰＣＲを行うことにより修飾されたプラスミドを製造した。
に置換されるように設計された配列番号：３８のセンスプライマーおよびそれに
相補的な配列番号：３９のアンチセンスプライマーを用いて前記実施例２の段階
４の方法に従ってＰＣＲを行うことにより修飾されたプラスミドを製造した。
【００７７】
大腸菌XL-1 blue(Novagen, USA)を修飾されたプラスミドで形質転換した。形
質転換されたコロニーから回収したＤＮＡの塩基配列を決定し、ｈＧ−ＣＳＦの
第１７番のアミノ酸がグリシンに置換された遺伝子を有するプラスミドpTO17GG
を得た。
質転換されたコロニーから回収したＤＮＡの塩基配列を決定し、ｈＧ−ＣＳＦの
第１７番のアミノ酸がグリシンに置換された遺伝子を有するプラスミドpTO17GG
を得た。
【００７８】
大腸菌ＢＬ２１(ＤＥ３)(Stratagene, USA)をベクターpTO17GG で形質転換し
て大腸菌HM 10415と命名されたと形質転換体を得た。
て大腸菌HM 10415と命名されたと形質転換体を得た。
【００７９】
(f) [Asp17]ｈＧ−ＣＳＦの製造
前記実施例５で得られたベクターpTOGをｈＧ−ＣＳＦの第１７番コドンがAsp
に置換されるように設計された配列番号：４０のセンスプライマーおよびそれに
相補的な配列番号：４１のアンチセンスプライマーを用いて前記実施例２の段階
４の方法に従ってＰＣＲを行うことにより修飾されたプラスミドを製造した。
に置換されるように設計された配列番号：４０のセンスプライマーおよびそれに
相補的な配列番号：４１のアンチセンスプライマーを用いて前記実施例２の段階
４の方法に従ってＰＣＲを行うことにより修飾されたプラスミドを製造した。
【００８０】
大腸菌XL-1 blue(Novagen, USA)を修飾されたプラスミドで形質転換した。形
質転換されたコロニーから回収したＤＮＡの塩基配列を決定し、ｈＧ−ＣＳＦの
第１７番目のアミノ酸がアスパラギン酸に置換された遺伝子を有するpTO17APGを
得た。
質転換されたコロニーから回収したＤＮＡの塩基配列を決定し、ｈＧ−ＣＳＦの
第１７番目のアミノ酸がアスパラギン酸に置換された遺伝子を有するpTO17APGを
得た。
【００８１】
大腸菌ＢＬ２１(ＤＥ３)(Stratagene, USA)をベクターpTO17APGで形質転換し
て大腸菌HM 10416と命名されたと形質転換体を得た。
て大腸菌HM 10416と命名されたと形質転換体を得た。
【００８２】
実施例７：大腸菌Gene IIIシグナルペプチドおよび修飾ｈＧ−ＣＳＦをコード
する遺伝子を含むベクターの作製 (ａ)アラビノースプロモーターおよび大腸菌Gene IIIシグナルペプチドを含む
ベクターの作製 アラビノースプロモーターと大腸菌Gene IIIシグナルペプチド(配列番号：42)
および修飾ｈＧ−ＣＳＦをコードする遺伝子を含む発現ベクターを次のように作
製した。
する遺伝子を含むベクターの作製 (ａ)アラビノースプロモーターおよび大腸菌Gene IIIシグナルペプチドを含む
ベクターの作製 アラビノースプロモーターと大腸菌Gene IIIシグナルペプチド(配列番号：42)
および修飾ｈＧ−ＣＳＦをコードする遺伝子を含む発現ベクターを次のように作
製した。
【００８３】
Met-Lys-Lys-Leu-Leu-Phe-Ala-Ile-Pro-Leu-Val-Val-Pro-
Phe-Tyr-Ser-His-Ser- (配列番号：42)
-TAT-AGC-CAT-AGC-ACC-ATG-GAG- (配列番号：43)
-ATA-TCG-GTA-TCG-TGG-TAC-CTC- (配列番号：44)
Nco I 切断部位
【００８４】
アラビノースプロモーターとGene IIIシグナルペプチドをコードする遺伝子を
含むプラスミドpBAD・gIIIA(Invitrogen, USA)を制限酵素Nco Iで切断した後シン
グルストランドＤＮＡをクレノーＤＮＡポリメラーゼで除去して平滑末端二本鎖
を作製した後、さらにBgl IIで切断して平滑末端と接着末端を有するベクター断
片を製造した。
含むプラスミドpBAD・gIIIA(Invitrogen, USA)を制限酵素Nco Iで切断した後シン
グルストランドＤＮＡをクレノーＤＮＡポリメラーゼで除去して平滑末端二本鎖
を作製した後、さらにBgl IIで切断して平滑末端と接着末端を有するベクター断
片を製造した。
【００８５】
実施例１で得られたベクターpT-CSFをｈＧ−ＣＳＦの第２〜第９のアミノ酸配
列(配列番号：４５)に対応する配列番号：４６のセンスプライマーおよびそれに
相補的な配列番号：４７のアンチセンスプライマーを用いて前記実施例２の段階
４の方法に従ってＰＣＲを行うことによりアミノ末端を平滑末端に作製し、カル
ボキシ末端にBamH Ｉ認知部位を有するｈＧ−ＣＳＦを含むＤＮＡ断片を得た。
次いで、制限酵素BamH Ｉで切断して平滑末端と接着末端を有するｈＧ−ＣＳＦ
遺伝子断片を回収した。
列(配列番号：４５)に対応する配列番号：４６のセンスプライマーおよびそれに
相補的な配列番号：４７のアンチセンスプライマーを用いて前記実施例２の段階
４の方法に従ってＰＣＲを行うことによりアミノ末端を平滑末端に作製し、カル
ボキシ末端にBamH Ｉ認知部位を有するｈＧ−ＣＳＦを含むＤＮＡ断片を得た。
次いで、制限酵素BamH Ｉで切断して平滑末端と接着末端を有するｈＧ−ＣＳＦ
遺伝子断片を回収した。
【００８６】
Pro Leu Gly Pro Ala Ser Ser Leu (配列番号：45)
5'- C-CCC-CTG-GGC-CCT-GCC-AGC-TCC-CTG-3' (配列番号：46)
3'- G-GGG-GAC-CCG-GGA-CGG-TCG-AGG-GAC-5' (配列番号：47)
【００８７】
前記で得られたベクターにｈＧ−ＣＳＦ遺伝子断片を挿入して大腸菌Gene III
シグナルペプチドおよびｈＧ−ＣＳＦをコードする遺伝子(配列番号：４８)を含
むベクターpBADGを製造した。 図８は、ベクターpBADGの作製過程を示す。
シグナルペプチドおよびｈＧ−ＣＳＦをコードする遺伝子(配列番号：４８)を含
むベクターpBADGを製造した。 図８は、ベクターpBADGの作製過程を示す。
【００８８】
大腸菌BL21(DE3)(Stratagene, USA)をベクターpBADGで形質転換して大腸菌HM
10501と命名された形質転換株を得た。
10501と命名された形質転換株を得た。
【００８９】
(b) [Met2, Val3]ｈＧ−ＣＳＦの製造
プラスミドpBAD・gIII A(インビトロゲン社)を制限酵素Nco IとBgl IIで切断し
て接着両末端を有するベクター断片を製造した。
て接着両末端を有するベクター断片を製造した。
【００９０】
実施例１で得られたベクターpT-CSFを[Met2, Val3]ｈＧ−ＣＳＦの第１〜第９
のアミノ酸配列(配列番号：４９)に対応する配列番号：５０のセンスプライマー
およびそれに相補的な配列番号：５１のアンチセンスプライマーを用いて実施例
２の段階４の方法に従ってＰＣＲを行うことによりアミノ末端を平滑末端に作製
し、カルボキシ末端にBamH I認知部位を有するｈＧ−ＣＳＦを含むＤＮＡ断片を
得た後、制限酵素Nco IとBamH Iで切断して接着両末端を有するｈＧ−ＣＳＦを
回収した。
のアミノ酸配列(配列番号：４９)に対応する配列番号：５０のセンスプライマー
およびそれに相補的な配列番号：５１のアンチセンスプライマーを用いて実施例
２の段階４の方法に従ってＰＣＲを行うことによりアミノ末端を平滑末端に作製
し、カルボキシ末端にBamH I認知部位を有するｈＧ−ＣＳＦを含むＤＮＡ断片を
得た後、制限酵素Nco IとBamH Iで切断して接着両末端を有するｈＧ−ＣＳＦを
回収した。
【００９１】
Thr Met Val Gly Pro Ala Ser Ser Leu (配列番
号：49) 5'- TAC- GCG- TCC- ATG- GTG- GGC- CCT- GCC- AGC- TCC- CTG-3' (配列番号
：50) 3'- ATG- CGC- AGG- TAC- CAC- CCG- GGA- CGG- TCG- AGG- GAC-5' (配列番号
：51) Nco I認識部位
号：49) 5'- TAC- GCG- TCC- ATG- GTG- GGC- CCT- GCC- AGC- TCC- CTG-3' (配列番号
：50) 3'- ATG- CGC- AGG- TAC- CAC- CCG- GGA- CGG- TCG- AGG- GAC-5' (配列番号
：51) Nco I認識部位
【００９２】
得られたベクターにｈＧ−ＣＳＦ遺伝子断片を挿入して大腸菌Gene IIIシグナ
ルペプチドおよび第２番目と第３番目アミノ酸が各々メチオニンとバリンに置換
されたｈＧ−ＣＳＦの遺伝子(配列番号：５２)を含むベクターpBAD2M3VGを作製
した。 図９は、このベクターpBAD2M3VGの作製過程を示す。
ルペプチドおよび第２番目と第３番目アミノ酸が各々メチオニンとバリンに置換
されたｈＧ−ＣＳＦの遺伝子(配列番号：５２)を含むベクターpBAD2M3VGを作製
した。 図９は、このベクターpBAD2M3VGの作製過程を示す。
【００９３】
大腸菌BL21(DE3)(Stratagene, USA)をベクターpBAD2M3VGで形質転換して大腸
菌HM 10510と命名された形質転換株を得、これを１９９９年３月２４日付で韓国
種菌協会付設韓国微生物保存センターに寄託番号第KCCM-10153号として寄託した
。
菌HM 10510と命名された形質転換株を得、これを１９９９年３月２４日付で韓国
種菌協会付設韓国微生物保存センターに寄託番号第KCCM-10153号として寄託した
。
【００９４】
(c) [Ser17]ｈＧ−ＣＳＦの製造
前記(a)で得られたベクターpBADGをｈＧ−ＣＳＦの第１７番コドンがSerに置
換されるように設計された配列番号：３２のセンスプライマーおよびそれに相補
的な配列番号：３３のアンチセンスプライマーを用いて実施例２の段階４の方法
に従ってＰＣＲを行うことにより修飾されたプラスミドを得た。
換されるように設計された配列番号：３２のセンスプライマーおよびそれに相補
的な配列番号：３３のアンチセンスプライマーを用いて実施例２の段階４の方法
に従ってＰＣＲを行うことにより修飾されたプラスミドを得た。
【００９５】
大腸菌XL-1 blue(Novagen, USA)を修飾されたプラスミドで形質転換した。形
質転換されたコロニーから回収したＤＮＡの塩基配列を決定し、ｈＧ−ＣＳＦの
第１７番目のアミノ酸がセリンに置換された遺伝子を有するpBAD17SGを得た。
質転換されたコロニーから回収したＤＮＡの塩基配列を決定し、ｈＧ−ＣＳＦの
第１７番目のアミノ酸がセリンに置換された遺伝子を有するpBAD17SGを得た。
【００９６】
大腸菌ＢＬ２１(ＤＥ３)(Stratagene, USA)をベクターpBAD17SG で形質転換し
て大腸菌HM 10511と命名されたと形質転換体を得た。
て大腸菌HM 10511と命名されたと形質転換体を得た。
【００９７】
(d) [Met2, Val3, Ser17]ｈＧ−ＣＳＦの製造
前記(b)で得られたベクターpBAD2M3VGをｈＧ−ＣＳＦの第１７番コドンがSer
に置換されるように設計された配列番号：３２のセンスプライマーおよびそれに
相補的な配列番号：３３のアンチセンスプライマーを用いて実施例２の段階４の
方法に従ってＰＣＲを行うことにより修飾されたプラスミドを得た。
に置換されるように設計された配列番号：３２のセンスプライマーおよびそれに
相補的な配列番号：３３のアンチセンスプライマーを用いて実施例２の段階４の
方法に従ってＰＣＲを行うことにより修飾されたプラスミドを得た。
【００９８】
大腸菌XL-1 blue(Novagen, USA)を修飾されたプラスミドで形質転換させた。
形質転換されたコロニーから回収したＤＮＡの塩基配列を決定し、ｈＧ−ＣＳＦ
の第２、第３および第１７番目のアミノ酸が各々メチオニン、バリンおよびセリ
ンに置換された遺伝子を有するpBAD2M3V17SGを得た。
形質転換されたコロニーから回収したＤＮＡの塩基配列を決定し、ｈＧ−ＣＳＦ
の第２、第３および第１７番目のアミノ酸が各々メチオニン、バリンおよびセリ
ンに置換された遺伝子を有するpBAD2M3V17SGを得た。
【００９９】
大腸菌ＢＬ２１(ＤＥ３)(Stratagene, USA)をベクターpBAD2M3V17SG で形質転
換して大腸菌HM 10512と命名されたと形質転換体を得た。
換して大腸菌HM 10512と命名されたと形質転換体を得た。
【０１００】
実施例８：ｈＧ−ＣＳＦの生産
前記実施例２〜７で製造された大腸菌形質転換体を各々ＬＢ培地(１％バクト
−トリプトン、０.５％バクト−酵母抽出物および１％ ＮａＣｌ)で培養した後
発現誘導剤(例：IPTG)を加えて３時間恒温処理するか、または誘導剤を加えずに
１５時間以上十分培養した。培養液を６０００ｒｐｍで２０分間遠心分離するこ
とによって菌体を沈澱させ、沈澱物を１０分の１量の等張液(２０％スクロース
、１ｍＭ ＥＤＴＡを含む１０ｍＭとトリス−塩酸緩衝液(ｐＨ７.０))に懸濁さ
せた。この懸濁液を３０分間室温にて放置した後、７,０００ｒｐｍで１０分間
遠心分離して菌体を回収した。次に、回収した菌体を４℃の蒸留水に懸濁させ、
７,０００ｒｐｍで１０分間遠心分離して細胞質液である上澄液を得た。細胞質
液中のｈＧ−ＣＳＦの濃度をｈＧ−ＣＳＦに対する抗体(Aland, USA)を用いたＥ
ＬＩＳＡ方法(Kato, K. et al., J. Immunol., 116, 1554(1976))に従って測定
し、その測定値から培養培地１ｌ当りのｈＧ−ＣＳＦ分泌量を換算して表１に示
す。
−トリプトン、０.５％バクト−酵母抽出物および１％ ＮａＣｌ)で培養した後
発現誘導剤(例：IPTG)を加えて３時間恒温処理するか、または誘導剤を加えずに
１５時間以上十分培養した。培養液を６０００ｒｐｍで２０分間遠心分離するこ
とによって菌体を沈澱させ、沈澱物を１０分の１量の等張液(２０％スクロース
、１ｍＭ ＥＤＴＡを含む１０ｍＭとトリス−塩酸緩衝液(ｐＨ７.０))に懸濁さ
せた。この懸濁液を３０分間室温にて放置した後、７,０００ｒｐｍで１０分間
遠心分離して菌体を回収した。次に、回収した菌体を４℃の蒸留水に懸濁させ、
７,０００ｒｐｍで１０分間遠心分離して細胞質液である上澄液を得た。細胞質
液中のｈＧ−ＣＳＦの濃度をｈＧ−ＣＳＦに対する抗体(Aland, USA)を用いたＥ
ＬＩＳＡ方法(Kato, K. et al., J. Immunol., 116, 1554(1976))に従って測定
し、その測定値から培養培地１ｌ当りのｈＧ−ＣＳＦ分泌量を換算して表１に示
す。
【０１０１】
【表１】
【０１０２】
実施例９：ｈＧ−ＣＳＦの精製
実施例６(ｂ)で製造された大腸菌形質転換株HM 10411をＬＢ培地で培養した後
、培養液を６,０００ｒｐｍで２０分間遠心分離して細胞を収穫した。実施例８
の手順を繰返すことによって、細胞から細胞質液を収穫した。
、培養液を６,０００ｒｐｍで２０分間遠心分離して細胞を収穫した。実施例８
の手順を繰返すことによって、細胞から細胞質液を収穫した。
【０１０３】
細胞質液をｐＨ５.０〜５.５に調整した後、ｐＨ５.３に予め平衡化したＣＭ
−セファロース(CM-Separose;ファーマシア社)カラムに吸着させ、カラムを２５
ｍＭ ＮａＣｌ溶液で十分洗浄した。その後５０ｍＭ、１００ｍＭ、２００ｍＭ
ＮａＣｌ溶液を含むカラム緩衝溶液を連続的に添加してｈＧ−ＳＣＦを溶出し
、ｈＧ−ＳＣＦを含む分画を集めて一緒にした。
−セファロース(CM-Separose;ファーマシア社)カラムに吸着させ、カラムを２５
ｍＭ ＮａＣｌ溶液で十分洗浄した。その後５０ｍＭ、１００ｍＭ、２００ｍＭ
ＮａＣｌ溶液を含むカラム緩衝溶液を連続的に添加してｈＧ−ＳＣＦを溶出し
、ｈＧ−ＳＣＦを含む分画を集めて一緒にした。
【０１０４】
一緒にした分画をフェニルセファロース(ファーマシア社、スウェーデン)カラ
ムクロマトグラフィーを行って９９％以上の純度を有する[Ser17]ｈＧ−ＣＳＦ
を得た。
ムクロマトグラフィーを行って９９％以上の純度を有する[Ser17]ｈＧ−ＣＳＦ
を得た。
【０１０５】
また、実施例３、４、６(ｂ)、６(ｃ)、６(ｄ)、６(ｅ)、７(ｂ)および７(ｄ)
で各々製造された形質転換株大腸菌HM 10311、HM 10409、HM 10410、HM 10413、
HM 10414、HM 10415、HM 10510およびHM 10512を用いて前記手順を繰返した。
で各々製造された形質転換株大腸菌HM 10311、HM 10409、HM 10410、HM 10413、
HM 10414、HM 10415、HM 10510およびHM 10512を用いて前記手順を繰返した。
【０１０６】
精製されたｈＧ−ＣＳＦ分画を各々ドデシル硫酸ナトリウム／ポリアクリルア
ミドゲル電気泳動を行って濃度および純度を決定し、ＥＬＩＳＡを行って細胞質
液中ｈＧ−ＣＳＦ抽出物の濃度を決定した。Ｍｅｔ−ｈＧ−ＣＳＦ(Kirin amgen
)を対照群として用いた。
ミドゲル電気泳動を行って濃度および純度を決定し、ＥＬＩＳＡを行って細胞質
液中ｈＧ−ＣＳＦ抽出物の濃度を決定した。Ｍｅｔ−ｈＧ−ＣＳＦ(Kirin amgen
)を対照群として用いた。
【０１０７】
図１０ａは、SDS-PAGe結果を示し、第１列はＭｅｔ−Ｇ−ＣＳＦ、第２列は形
質転換体大腸菌HM 10411の細胞質液、第３例は精製された[Ser17]ｈＧ−ＣＳＦ
である。図１０ｂから分かるように、[Ser17]ｈＧ−ＣＳＦの分子量は野生型ｈ
Ｇ−ＣＳＦの分子量と同一であり、形質転換体大腸菌HM 10411の細胞質液は[Ser 17 ]ｈＧ−ＣＳＦを高濃度で含む。
質転換体大腸菌HM 10411の細胞質液、第３例は精製された[Ser17]ｈＧ−ＣＳＦ
である。図１０ｂから分かるように、[Ser17]ｈＧ−ＣＳＦの分子量は野生型ｈ
Ｇ−ＣＳＦの分子量と同一であり、形質転換体大腸菌HM 10411の細胞質液は[Ser 17 ]ｈＧ−ＣＳＦを高濃度で含む。
【０１０８】
また、ｈＧ−ＣＳＦのＮ−末端アミノ酸配列を決定し、形質転換株HM 10311、
HM 10409、HM 10410、HM 10413、HM 10414、HM 10415、HM 10510およびHM 10512
を用いて生産されたｈＧ−ＣＳＦの第１〜第３２のアミノ酸をコードするヌクレ
オチド配列を配列番号：５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８および７０
に各々示す。この結果から分かるように、本発明によって製造された修飾ｈＧ−
ＣＳＦはＮ−末端がメチオニン化されていない。
HM 10409、HM 10410、HM 10413、HM 10414、HM 10415、HM 10510およびHM 10512
を用いて生産されたｈＧ−ＣＳＦの第１〜第３２のアミノ酸をコードするヌクレ
オチド配列を配列番号：５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８および７０
に各々示す。この結果から分かるように、本発明によって製造された修飾ｈＧ−
ＣＳＦはＮ−末端がメチオニン化されていない。
【０１０９】
ニトロセルロース膜(バイオレッド社、米国)をブロッティング用緩衝液(170 m
Mグリシン(glicine)、２５ｍＭ Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ(ｐＨ８)、２０％メタノール
)に十分浸した後、ゲルから分離したタンパク質をニトロセルロース膜で３時間
ウェスタンブロッティングした。その後、膜を１％カゼイン溶液に１時間放置し
、０.０５ツイーン２０を含むＰＢＳＴ溶液で３回洗浄した。膜をＰＢＳで稀釈
したヤギ抗−Ｇ−ＣＳＦ抗体(R&D System社、AB-214-NA、米国)溶液に入れ、室
温で２時間反応させた。反応が完結した後膜をＰＢＳＴ溶液で３回洗浄して反応
しなかった抗体を除去した。これに、西洋わさびペルオキシダーゼ(horseradish
peroxidase、HRP)−結合ウサギ抗−ヤギＩｇＧ(バイオレッド社、米国)溶液を
ＰＢＳで稀釈して加えた後、室温で２時間さらに反応させた。その後ＰＢＳＴで
洗浄し、ペルオキシダーゼ基質キット(バイオレッド社、米国)溶液を加えて発色
させた。前記ウェスタンブロッティング結果を図１０ｂに示すが、ここで第１列
はMet-G-CSF陽性群であり、第２例は精製された[Ser17]ｈＧ−ＣＳＦである。
図１０ｂから分かるように、[Ser17]ｈＧ−ＣＳＦの分子量は野生型ｈＧ−ＣＳ
Ｆの分子量と同じである。
Mグリシン(glicine)、２５ｍＭ Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ(ｐＨ８)、２０％メタノール
)に十分浸した後、ゲルから分離したタンパク質をニトロセルロース膜で３時間
ウェスタンブロッティングした。その後、膜を１％カゼイン溶液に１時間放置し
、０.０５ツイーン２０を含むＰＢＳＴ溶液で３回洗浄した。膜をＰＢＳで稀釈
したヤギ抗−Ｇ−ＣＳＦ抗体(R&D System社、AB-214-NA、米国)溶液に入れ、室
温で２時間反応させた。反応が完結した後膜をＰＢＳＴ溶液で３回洗浄して反応
しなかった抗体を除去した。これに、西洋わさびペルオキシダーゼ(horseradish
peroxidase、HRP)−結合ウサギ抗−ヤギＩｇＧ(バイオレッド社、米国)溶液を
ＰＢＳで稀釈して加えた後、室温で２時間さらに反応させた。その後ＰＢＳＴで
洗浄し、ペルオキシダーゼ基質キット(バイオレッド社、米国)溶液を加えて発色
させた。前記ウェスタンブロッティング結果を図１０ｂに示すが、ここで第１列
はMet-G-CSF陽性群であり、第２例は精製された[Ser17]ｈＧ−ＣＳＦである。
図１０ｂから分かるように、[Ser17]ｈＧ−ＣＳＦの分子量は野生型ｈＧ−ＣＳ
Ｆの分子量と同じである。
【０１１０】
実施例１０：ｈＧ−ＣＳＦおよび修飾ｈＧ−ＣＳＦの細胞内活性
ヒト骨髄由来の細胞株であるHL-60(ATCC CCL-240, Promyelocytic leukemia
患者／３６歳白人女性)を１０％のウシ胎児血清を含むＲＰＭＩ １６４０培地
で培養し、細胞数を約２.２ｘ１０５細胞／ｍｌになるように調整した後、ＤＭ
ＳＯ(dimethylsulfoxide, culture grade/SIGMA)を最終濃度１.２５％(v/v)にな
るように加えた。前記溶液を９６ウェルプレート(Corning/low evaporation 96
well plate)に９０μｌずつ入れてウェル当り細胞が約２ｘ１０４になるように
した後、５％二酸化炭素が供給される３７℃培養器で約４８時間培養した。
患者／３６歳白人女性)を１０％のウシ胎児血清を含むＲＰＭＩ １６４０培地
で培養し、細胞数を約２.２ｘ１０５細胞／ｍｌになるように調整した後、ＤＭ
ＳＯ(dimethylsulfoxide, culture grade/SIGMA)を最終濃度１.２５％(v/v)にな
るように加えた。前記溶液を９６ウェルプレート(Corning/low evaporation 96
well plate)に９０μｌずつ入れてウェル当り細胞が約２ｘ１０４になるように
した後、５％二酸化炭素が供給される３７℃培養器で約４８時間培養した。
【０１１１】
修飾された[Ala17]ｈＧ−ＣＳＦ、[Gly17]ｈＧ−ＣＳＦ、[Ser17]ｈＧ−ＣＳ
Ｆおよび[Thr]ｈＧ−ＣＳＦを各々最終濃度が５００ｎｇ／ｍｌになるようにＲ
ＰＭＩ １６４０培地で稀釈した後、ＲＰＭＩ １６４０培地を用いて２倍連続
稀釈を１０回ずつさらに実施した。
Ｆおよび[Thr]ｈＧ−ＣＳＦを各々最終濃度が５００ｎｇ／ｍｌになるようにＲ
ＰＭＩ １６４０培地で稀釈した後、ＲＰＭＩ １６４０培地を用いて２倍連続
稀釈を１０回ずつさらに実施した。
【０１１２】
反応溶液をウェル当り１０ｍｌずつ加え、３７℃で４８時間培養した。陰性対
照群としては、市販のｈＧ−ＣＳＦ(第一薬品)を用いた。
照群としては、市販のｈＧ−ＣＳＦ(第一薬品)を用いた。
【０１１３】
増加した細胞株の濃度は、市販のプロメガ社のCellTiter96TM(cat # G4100)を
用いて、６７０ｎｍ波長における吸光度で決定した。
用いて、６７０ｎｍ波長における吸光度で決定した。
【０１１４】
図１１から分かるように、修飾ｈＧ−ＣＳＦの細胞内活性は野生型ｈＧ−ＣＳ
Ｆである陽性対照群と同一であるかさらに高い。
Ｆである陽性対照群と同一であるかさらに高い。
【０１１５】
本発明を前記の具体的な実施態様と関連させて記述したが、添付の特許請求範
囲によって定義される本発明の範囲内で、当該分野の熟練者が本発明を多様に修
飾および変化させ得ることは勿論である。
囲によって定義される本発明の範囲内で、当該分野の熟練者が本発明を多様に修
飾および変化させ得ることは勿論である。
【０１１６】
特許手続上の微生物寄託の国際的承認に関するブダペスト条約
国際様式
受領人：Hanmi Pharma. Co., Ltd
大韓民国京畿道華城郡八灘面下楮里893-5番地
下記国際寄託機関により、規則71に基づいて発行された原寄託に関する受託証
１ 規則６.４(ｄ)が適用される場合、この日は国際寄託機関の地位を獲得した
日である：国際寄託機関の地位を獲得した後、ブダペスト条約の外で行われた寄
託をブダペスト条約に基づく寄託に転換する場合、この日は国際寄託機関が微生
物受領した日である。
日である：国際寄託機関の地位を獲得した後、ブダペスト条約の外で行われた寄
託をブダペスト条約に基づく寄託に転換する場合、この日は国際寄託機関が微生
物受領した日である。
【０１１７】
特許手続上の微生物寄託の国際的承認に関するブダペスト条約
国際様式
受領人：Hanmi Pharma. Co., Ltd
大韓民国京畿道華城郡八灘面下楮里893-5番地
下記国際寄託機関により、規則71に基づいて発行された原寄託に関する受託証
１ 規則６.４(ｄ)が適用される場合、この日は国際寄託機関の地位を獲得した
日である：国際寄託機関の地位を獲得した後、ブダペスト条約の外で行われた寄
託をブダペスト条約に基づく寄託に転換する場合、この日は国際寄託機関が微生
物受領した日である。
日である：国際寄託機関の地位を獲得した後、ブダペスト条約の外で行われた寄
託をブダペスト条約に基づく寄託に転換する場合、この日は国際寄託機関が微生
物受領した日である。
【０１１８】
特許手続上の微生物寄託の国際的承認に関するブダペスト条約
国際様式
受領人：Hanmi Pharma. Co., Ltd
大韓民国京畿道華城郡八灘面下楮里893-5番地
下記国際寄託機関により、規則71に基づいて発行された原寄託に関する受託証
１ 規則６.４(ｄ)が適用される場合、この日は国際寄託機関の地位を獲得した
日である：国際寄託機関の地位を獲得した後、ブダペスト条約の外で行われた寄
託をブダペスト条約に基づく寄託に転換する場合、この日は国際寄託機関が微生
物受領した日である。
日である：国際寄託機関の地位を獲得した後、ブダペスト条約の外で行われた寄
託をブダペスト条約に基づく寄託に転換する場合、この日は国際寄託機関が微生
物受領した日である。
【０１１９】
特許手続上の微生物寄託の国際的承認に関するブダペスト条約
国際様式
受領人：Hanmi Pharma. Co., Ltd
大韓民国京畿道華城郡八灘面下楮里893-5番地
下記国際寄託機関により、規則71に基づいて発行された原寄託に関する受託証
１ 規則６.４(ｄ)が適用される場合、この日は国際寄託機関の地位を獲得した
日である：国際寄託機関の地位を獲得した後、ブダペスト条約の外で行われた寄
託をブダペスト条約に基づく寄託に転換する場合、この日は国際寄託機関が微生
物受領した日である。
日である：国際寄託機関の地位を獲得した後、ブダペスト条約の外で行われた寄
託をブダペスト条約に基づく寄託に転換する場合、この日は国際寄託機関が微生
物受領した日である。
【配列表】
【図１】 １７４個のアミノ酸残基からなる野生型ヒト顆粒球刺激因子のヌ
クレオチド配列(配列番号：１)およびアミノ酸配列(配列番号：２)を示す。
クレオチド配列(配列番号：１)およびアミノ酸配列(配列番号：２)を示す。
【図２】 ベクターｐＴ−ＣＳＦの作製過程を示す。
【図３】 ベクターpT14S1SGの作製過程を示す。
【図４】 ベクターpT14SS1SGの作製過程を示す。
【図５】 ベクターpT140SSG-4T22Qの作製過程を示す。
【図６】 ベクターpT14SS1S17SEGの作製過程を示す。
【図７】 ベクターpTO1SGの作製過程を示す。
【図８】 ベクターpBADGの作製過程を示す。
【図９】 ベクターpBAD2M3VGの作製過程を示す。
【図１０ａ】 組換え菌株からｈＧ−ＣＳＦおよびその修飾体の発現および
発現されたタンパク質の分子量を確認したウェスタンブロッティングの結果を示
す。
発現されたタンパク質の分子量を確認したウェスタンブロッティングの結果を示
す。
【図１０ｂ】 組換え菌株からｈＧ−ＣＳＦおよびその修飾体の発現および
発現されたタンパク質の分子量を確認したウェスタンブロッティングの結果を示
す。
発現されたタンパク質の分子量を確認したウェスタンブロッティングの結果を示
す。
【図１１】 組換え菌株から生産されたｈＧ−ＣＳＦおよび修飾ｈＧ−ＣＳ
Ｆの細胞内活性を示す。
Ｆの細胞内活性を示す。
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考）
// Ａ６１Ｋ 38/00 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ
(Ｃ１２Ｎ 1/21 Ａ６１Ｋ 37/02
Ｃ１２Ｒ 1:19）
(Ｃ１２Ｐ 21/02
Ｃ１２Ｒ 1:19）
(72)発明者 ベ・スンミン
大韓民国151−054ソウル、クワナクグ、ボ
ンチュン４ドン1587−８番
(72)発明者 リー・グワンスン
大韓民国138−160ソウル、ソンパグ、カラ
クドン、コクドン・アパートメント２−
806
Ｆターム(参考） 4B024 AA01 BA30 CA06 DA06 EA04
FA02 FA18 GA11 HA01
4B064 AG02 CA02 CA19 CC24 DA01
4B065 AA26X AA99Y AC15 BA02
CA24 CA44
4C084 AA06 AA07 BA01 BA02 BA22
DA19 ZB272
4H045 AA10 BA10 CA40 DA11 EA28
FA74
Claims (21)
- 【請求項１】 配列番号：２のアミノ酸配列を有する野生型ヒト顆粒球コロ
ニー刺激因子(ｈＧ−ＣＳＦ)の第１、第２、第３および第１７番目のアミノ酸の
少なくとも一つのアミノ酸が他のアミノ酸で置換されていることを特徴とする修
飾ｈＧ−ＣＳＦ。 - 【請求項２】 修飾ｈＧ−ＣＳＦのアミノ酸配列が次の配列を除いて野生型
ｈＧ−ＣＳＦのアミノ酸配列と同じである、請求項１記載の修飾ｈＧ−ＣＳＦ： (ａ)第１番目のアミノ酸がセリン； (ｂ)第１番目のアミノ酸がセリン、第１７番目のアミノ酸はＸ； (ｃ)第２番目のアミノ酸がメチオニン、第３番目のアミノ酸はバリン； (ｄ)第２番目のアミノ酸がメチオニン、第３番目のアミノ酸はバリンおよび第１
７番目のアミノ酸はＸ、または (ｆ)第１７番目のアミノ酸がＸ、 ここで、Ｘは中性ｐＨで電荷を帯びないアミノ酸である。 - 【請求項３】 Ｘがセリン、トレオニン、アラニンまたはグリシンである、
請求項２記載の修飾ｈＧ−ＣＳＦ。 - 【請求項４】 Ｘがセリンである、請求項３記載の修飾ｈＧ−ＣＳＦ。
- 【請求項５】 請求項１〜４のいずれか１項に記載のｈＧ−ＣＳＦ修飾体を
コードするＤＮＡ。 - 【請求項６】 ｈＧ−ＣＳＦ修飾体をコードするＤＮＡの第１〜第６０のヌ
クレオチド配列が配列番号：５５、５７、５９、６１、６３、６５、６７および
６９からなる群から選ばれる、請求項５記載のＤＮＡ。 - 【請求項７】 請求項５に記載のＤＮＡを含む発現ベクター。
- 【請求項８】 修飾ｈＧ−ＣＳＦをコードするＤＮＡの５´−末端にシグナ
ルペプチドをコードするポリヌクレオチドをさらに含む、請求項７記載の発現ベ
クター。 - 【請求項９】 前記シグナルペプチドが大腸菌耐熱性エンテロトキシンIIシ
グナルペプチドまたは修飾された大腸菌耐熱性エンテロトキシンIIシグナルペプ
チドである、請求項８記載の発現ベクター。 - 【請求項１０】 前記大腸菌耐熱性エンテロトキシンIIシグナルペプチドが
配列番号：５３のアミノ酸配列を有する、請求項９記載の発現ベクター。 - 【請求項１１】 前記修飾された大腸菌耐熱性エンテロトキシンIIシグナル
ペプチドが配列番号：５４のアミノ酸配列を有する、請求項９記載の発現ベクタ
ー。 - 【請求項１２】 配列番号：７１のヌクレオチドを有する修飾された大腸菌
エンテロトキシンIIシャイン−ダルガノ配列をさらに含む、請求項９記載の発現
ベクター。 - 【請求項１３】 前記シグナルペプチドが大腸菌ベータラクタマーゼシグナ
ルペプチドまたは修飾された大腸菌ベータラクタマーゼシグナルペプチドである
、請求項８記載の発現ベクター。 - 【請求項１４】 大腸菌ベータラクタマーゼシグナルペプチドが配列番号：
２４のアミノ酸を有する、請求項１３記載の発現ベクター。 - 【請求項１５】 前記シグナルペプチドが大腸菌Gene IIIシグナルペプチド
または修飾された大腸菌GeneIIIシグナルペプチドである、請求項８記載の発現
ベクター。 - 【請求項１６】 前記大腸菌Gene IIIシグナルペプチドが、配列番号：４２
のアミノ酸を有する、請求項１５記載の発現ベクター。 - 【請求項１７】 pT14SS1SG、pT14SS1S17SEG、pTO1SG、pTO1S17SG、pTO17SG
またはpBAD2M3V17SGである、請求項７または８記載の発現ベクター。 - 【請求項１８】 請求項７または８に記載の発現ベクターで形質転換された
微生物。 - 【請求項１９】 形質転換された大腸菌である、請求項１８記載の微生物。
- 【請求項２０】 前記形質転換された大腸菌が、大腸菌BL21(DE3)/pT14SS1S
G(HM 10310)、大腸菌BL21(DE3)/pT14SS1S17SEG(HM 10311;寄託番号：KCCM-10154
)、大腸菌BL21(DE3)/pTO1SG(HM 10409)、大腸菌 BL21(DE3)/pTO1S17SG(HM 10410
;寄託番号：KCCM-10151)、大腸菌BL21(DE3)/pTO17SG(HM 10411;寄託番号：KCCM-
10152)、大腸菌 BL21(DE3)/pTO17TG(HM 10413)、大腸菌BL21(DE3)/pTO17AG(HM 1
0414)、大腸菌 BL21(DE3)/pTO17GG(HM 10415)、大腸菌 BL21(DE3)/pBAD2M3VG(HM
10510;寄託番号：KCCM-10153)、大腸菌BL21(DE3)/pBAD17SG(HM 10511)または大
腸菌 BL21(DE3)/pBAD2M3V17SG(HM 10512)である、請求項１９記載の微生物。 - 【請求項２１】 請求項１８に記載の形質転換された微生物を培養して修飾
ｈＧ−ＣＳＦを製造し、ペリプラズムに分泌させることを含む修飾ｈＧ−ＣＳＦ
の製造方法。
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1999/27418 | 1999-07-08 | ||
| KR1019990027418A KR100356140B1 (ko) | 1999-07-08 | 1999-07-08 | 인간 과립구 콜로니 자극인자 변이체 및 이의 생산 방법 |
| PCT/KR2000/000733 WO2001004329A1 (en) | 1999-07-08 | 2000-07-07 | Modified human granulocyte-colony stimulating factor and process for producing same |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2003504069A true JP2003504069A (ja) | 2003-02-04 |
| JP2003504069A5 JP2003504069A5 (ja) | 2005-12-22 |
Family
ID=36129291
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2001509533A Pending JP2003504069A (ja) | 1999-07-08 | 2000-07-07 | ヒト顆粒球コロニー刺激因子修飾体およびその生産方法 |
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| Country | Link |
|---|---|
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| ES (1) | ES2243275T5 (ja) |
| NZ (1) | NZ516476A (ja) |
| PT (1) | PT1194575E (ja) |
| RU (1) | RU2232772C2 (ja) |
| WO (1) | WO2001004329A1 (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2013540809A (ja) * | 2010-10-29 | 2013-11-07 | ハンミ サイエンス カンパニー リミテッド | 組み換え大腸菌からヒト顆粒球コロニー刺激因子を精製する方法 |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6831158B2 (en) | 2000-01-10 | 2004-12-14 | Maxygen Holdings Ltd. | G-CSF conjugates |
| DE60236522D1 (de) | 2001-07-11 | 2010-07-08 | Maxygen Inc | G-csf konjugate |
| DE60332358D1 (de) * | 2002-09-09 | 2010-06-10 | Hanall Pharmaceutical Co Ltd | Protease-resistente modifizierte interferon alpha polypeptide |
| US20090226397A1 (en) | 2003-10-24 | 2009-09-10 | Nora Therapeutics, Inc. | Compositions and methods for reducing the likelihood of implantation failure or miscarriage in recipients of artificial insemination |
| US8338373B2 (en) * | 2003-10-24 | 2012-12-25 | Nora Therapeutics, Inc. | Method for reducing the risk of spontaneous abortion in a human female subject |
| ES2405506T3 (es) * | 2003-10-24 | 2013-05-31 | Nora Therapeutics, Inc. | Un método para obtener datos útiles en la identificación de un paciente con riesgo de tener dificultad de llevar a término un embarazo |
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