JPH02104598A - ヒト顆粒球コロニー刺激因子ポリペプチド誘導体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ 本発明は、１７番目のシスティン残基がアラニン残基又
はグリシン残基に変換されていることを特徴とするヒト
顆粒球コロニー刺激因子ポリペプチド誘導体に関するも
のである。

［従来の技術］ ヒト顆粒球コロニー刺激因子（以下、ｈＧ−Ｃ８Ｆとい
う。）は多分化能性前駆細胞の増殖および分化を促進す
る物質として知られ、癌の放射線治療による白血球減少
症の治療及び骨髄移植俊速やかに白血球を増殖させる目
的で使用することができる。

ｈ　Ｇ　’−ＣＳ　Ｆの遺伝子は既にクローニングされ
ており、更に、該遺伝子が動物細胞及び大腸菌内に於い
て発現されている（１９８６年８月２２日出願、ＰＣＴ
／ＵＳ８６１０１７０８．１９８７年２月２７日公開、
公開番号−０８７１０１１３２参照）。

天然及びこの様に発現させたｈＧ−Ｃ３Ｆには第１７．
３６．４２．６４及び７４番目にシスティン残基があり
、そのうち第３６及び４２番目並びに第６４及び７４番
目のシスティン残基は夫々ジスルフィド結合を形成して
いる。

ところで、大腸菌を利用した生産方法は動物細胞を利用
するものに比べて効率的且つ経済的であるが、一方、大
腸菌内で産生されたｈＧ−Ｃ８Ｆは菌体外に分泌されな
い為に菌体内に蓄積・凝集してしまう。そこで、これを
回収後に、変性剤を用いて該タンパク質を溶解し、ジス
ルフィド結合を還元剤によって一旦開裂した侵に、硫酸
銅を用いて再酸化を行ってから、以降の精製操作にかけ
ている。

上記の再酸化に際して、ジスルフィド結合に関与してい
ない１７番目のシスティン残基が存在することにより、
二量体が一部形成されてしまい、以降の精製操作に於け
る収率低下の主な原因となっている。

又、大腸菌内で産生されたｈＧ−Ｃ８Ｆは溶液中に於い
て安定性が低く、ｐＨ７，０，４０℃、１０日間のイン
キュベートによって、その生物学的活性が１７３以下に
低下してしまう。

［発明が解決しようとする課題］ 本発明は、大腸菌内で産生されたｈＧ−Ｃ３Ｆの精製操
作に於ける収率を上げ、さらにはｈＧ−Ｃ８Ｆの安定性
及び活性を向上させ、その結果、１１Ｇ−Ｃ３Ｆの生産
性及び有用性を高めることを目的とするものである。

し課題を解決する為の手段］ 本発明は、上記課題を解決する為に、１７番目のシステ
ィン残基がアラニン残基又はグリシン残基に変換されて
いることを特徴とするｈＧ−Ｃ８Ｆ（ポリペプチド）誘
導体を提供するものである。

本発明のｈＧ−Ｃ８Ｆポリペプチド誘導体をコードする
ＤＮＡ分子は、後述の実施例中で詳述するように、ｈＧ
−Ｃ８ＦをコードするＤＮＡ分子に対する、該遺伝子の
１７番目のシスティン残基を含む領域について相補的で
あるがそのコドン中に塩基変化を有するオリゴヌクレオ
チドブライマーを使用する部位特異的突然変異法によっ
て得ることができる。

ここで使用するｈＧ−Ｃ８ＦをコードするＤＮＡ分子と
は、天然ｈＧ−Ｃ３Ｆの生物学的活性の１以上を有する
ポリペプチドを発現し得、システィン残基及びそれらの
ジスルフィド結合に関して天然ｈＧ−Ｃ３Ｆと同等の構
造を有しているものであるならば、いかなるＤＮＡ分子
をも含有し得る。

即ち、該ＤＮＡ分子は選択された非哺乳動物宿主による
発現に適した優先コドンが組込まれているものであり得
る。さらに、該ＤＮＡ分子はその全てを化学合成によっ
て作製することもできる。

また、１以上のアミノ酸残基の同−性及び位置に関して
天然ｈＧ−Ｃ８Ｆと異なるが天然ｈＧ−Ｃゝ　ＳＦの生
物学的活性の１以上を有するポリペプチドを発現し得る
、いわゆるｈＧ−Ｃ８Ｆポリペプチド類縁体をコードす
るＤＮＡ分子も本発明で使用するｈＧ−Ｃ８Ｆをコード
するＤＮＡ分子である。

好ましくは、本発明で使用する、ｈＧ−Ｃ８Ｆをコード
するＤＮＡ分子は大腸菌優先コドンを有する化学合成Ｄ
ＮＡ分子である。該化学台成ＤＮＡ分子の一例を第１図
に示す。

本発明のｈＧ−Ｃ８Ｆポリペプチド誘導体は当業者に公
知の方法に従って、適当なベクター内に挿入されて大腸
菌等の原核もしくはチャイニーズハムスター卵巣細胞等
の真核宿主細胞内で発現される。宿主細胞としては大腸
菌が好ましい。

発現させたｈＧ−Ｃ８Ｆポリペプチド誘導体の精製は当
業者に公知の方法でおこなうことができる。

以下、実施例により本発明を詳説する。

実施例　１ ｈＧ−Ｃ８ＦＩＩ伝子の旧３ｍρ１９への挿入ｈＧ−Ｃ
３Ｆ遺伝子は、ｈＧ−Ｃ３Ｆの成熟蛋白質のアミノ酸配
列に対応して化学的に合成した遺伝子（第１図）を含む
ブラ’：）、　ミドＤＣＦＨ１１５６ｈＧ−Ｃ３Ｆ（Ｐ
ＣＴ／ｕ３８６１０１７０８）より単離した。

３埒のｐｃＦＨｌ　１５６ｈＧ−Ｃ３Ｆを５００Ｉｉｉ
の反応液［１０ｎ＋ＨＴｒｉｓ−ＨＣｌ）　、　ｐＨ７
，５，１０ｉＨＮｏα２．１ｍＨＤＴＴ、５０ｉＨＮａ
Ｃρ、５０ユニツ１−のＸｂａＩ（ベーリンガー・マン
ハイム社）、５０ユニツトのＥｃｏＲＴ（宝酒造）］中
、３７℃４時間反応させた。０．８％アガロースを用い
た電気泳動を行ない、ｈＧ−Ｃ３ＦをコードするＤＮＡ
鎖を含むＤＮＡ断片５５９塩基対を分離した。

このＤＮＡ断片を透析チューブに入れ、泳動緩衝液中で
電気泳動することで溶出した。溶出液にエタノールを加
えて沈澱させ、２０〃のＴＥ溶液［１０ｉＨＴｒｉｓ−
Ｉｃｅ、　１１１ＨＥ（ｌＴＡ　ｐｔｌ　８．０１にて
溶解した。

一方、１埒のＨ１３ｕ１９　　（宝酒造）を３０成の反
応液［１０１８Ｔｒｉｓ−ＨＣｊ）　、　ＤＨ７，５，
１０１８Ｈ（ＪＣｅ２．１１ＨＤＴＴ、　５０ｉＨＨａ
（１！、　１０ユニツトの＞（ｂａｔ（ベーリンガーマ
ンハイム社）、１０ユニツトのＥｃｏＲｉ（宝酒造）中
、３７℃４時間反応させた。０，８％アガロースを用い
た電気泳動を行ない、大フラグメントを分離した。ゲル
片を透析チューブに入れ、電気泳動！１衝液中で電気泳
動することにより溶出した。

溶出液にエタノールを加え沈澱させ、２ＱｄのＴＥ溶液
にて溶解した。

上記８１３ｍｐ１９大フラグメ大フラグメント溶液７成
にｈＧ−Ｃ３ＦをコードするＤＮＡ鎖を含むＴＥ溶液５
１１１、２ｍの［５００ｓＨＴｒｉｓ−ｔｌＧ、　ｐＨ
７，４，１００ｍＨＨ（ｌα２］溶液、１βの１０１１
８　ＡＴＰ、　３ｐ！（３ユニツト）のＴ４リガーゼ（
ペーリンガー・マンハイム社）、オートクレーブ水２／
／ｊ！を加え、１５℃にて１４°時間反応させた。

この反応液を用いて、大腸菌ＪＨ１０９株（Ｃ。

Ｙａｎｉｓｈ−Ｐｅｒｒｏｎ他Ｇｅｎｅ　３３　ｐ１０
３−１１９　（１９８５））を既知の方法（Ｄ、Ｈａｎ
ａｈａｎ　Ｊ、　Ｈｏ１．Ｂｉｏｌ　ｐ５５７〜５８０
（１９８０１）　）により形質転換させた。その際プレ
ートには、Ｈ寒天培地を用い、また上層寒天としては、
目上層寒天を用いた。

１２個のプラークより、対数増殖期にあるＪＨ１０９株
に感染させ、３７℃にて５時間培養した。菌体を集め、
ＲＦ　（ｒｅｐｌｉｃａｔｉｖｅ　ｆｏｒｍ）　Ｄ　Ｎ
　Ａをアルカリ法（Ｔ、　Ｈａｎｉａｔｉｓ他、Ｍｏ１
ｅｃｕｌａｒ　ｃｌｏｎｉｎｇ　ｐ３６８〜３６９　（
１９８２）　Ｃｏ１ｄ　ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ）に
て分離し、Ｘ　ｂａ　Ｉ及びＥｃｏＲＩ制限酵素ニテ消
化し、ｈＧ−Ｃ３Ｆを含むＭ１３フ？−ジの１クローン
をＭ　１３８１２と命名した。

実施例　２ 変異オリゴヌクレオチドの合成と部位特異的突然変異 ｈＧ−Ｃ８Ｆの１７番目のＣｙＳコドンＴＧＴをＡｌａ
　コドンＧＣ丁に変異させる為にオリゴヌクレオチド（
２１塩基長）５°ＣＴＧＴＴＣＣＡＧＡＧＣＴＴＴＣＡ
ＧＣＡＧ　３°を合成した。合成はホスホアミダイト法
（Ｂｅａｕｃａａｅ他、丁ｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ　　Ｌ
ｅｔｔｅｒｓ　　２２　　１８５９〜１９６２　　（１
９８１））を用いたＤＮＡ自動合成ｍ＜アブライドバイ
オシステムズ社製３８ＯＡ型、Ｈ，１ｉｕｎｋａｐｉｌ
ｌｅｒ＠、Ｎａｔｕｒｅ３１０　１０５〜１１１　（１
９８４））を用いて行なった。

合成゛終°了後、濃アンモニア水で６０℃で５時間処理
して、塩基の保護基を除き、かつコントロール・ボアグ
ラスからオリゴヌクレオチドを切出した。

こうして得られたオリゴヌクレオチドを５ｅｐｈａｄｅ
ｘＧ−２５ＮＡＰ　１０カラム（ｐｈａｒｍａｃｉａ）
にかけゲル濾過した。この溶出液を８Ｍ尿素を含む１２
％ポリアクリルアミドを用いた電気泳動にかけた。泳動
模蛍光色素を含むＴＬＣプレートをゲルの下に置き、Ｕ
■クランプ用いて、目的のバンドの存在を確認した。目
的とするオリゴヌクレオチドを含むゲル片を透析チュー
ブに入れ、該オリゴヌクレオチドをゲルから電気的に溶
出した。この透析チューブ内液を５ｅｐｈａｄｅｘ　Ｇ
−２５（ｐｈａｒｍａｃｉａ）のゲル濾過カラム（φ　
１．５Ｘ４３α）にかけ、０．０５Ｍ　トリエチルアミ
ン重炭酸Ｍ衝液（ｐＨ７，５）にて溶出し脱塩した。

目的とするオリゴヌクレオチドを含む溶出液を減圧濃縮
して純粋なオリゴヌクレオチドを得た。

塩基配列を確認する為のオリゴヌクレオチド（１８塩基
長）５°ＣＴＣＴＴＣＣＧＧＡＴＧＧＣＡＣＡＧ３°及
びｈＧ−Ｃ３Ｆをコードする遺伝子の３°末端のＥＣ０
ＲＩ制限酵素部位をＸｈｏｌ制限酵素部位に変異させる
為のオリゴヌクレオチド（２２塩基長）　５’ＣＧＡＣ
ＧＧＣＣＣＴＣＧＡＧＴＴＣＴＡＴＴＡ３°も同様に合
成し精製した。

Ｍ　１３３１２の１本鎖ファージを培養上清より調製し
た（Ｈ，Ｊ、　Ｚｏｌｌｅｒら、Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ
　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ１００ｐ４６８〜５００）。上
記のように合成したｃｙｓよりＡｌａに変異させるオリ
ゴヌクレオチド１ｐ９を１０屑のリン酸化反応液（５０
ａＨ丁ｒｉｓ−ＭＣＩ！、　ｐＨ７，４，１０ａＨＨｇ
Ｃｉ！　　、　　１０ａＨＤＴＴ、　１０ａＨＡＴＰ、
　　１５ｔニツトのＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ（ベ
ーリンガー・マンハイム）］中で３７℃１時間反応させ
５゛末端をリン酸化した。

この反応液４ｉ１１をＭ　１３Ｓ　１２１本鎖７ァージ
１埒を含むＴＥ溶液４屑に加え、更にＴ４ポリメラーゼ
緩衝液［３３０ｍＨ，Ｔｒｉｓ−Ｈ（Ｊ）　、　ｐＨ７
，４，６６０ｍＨＫＣｊ！。

５０ａＨＤＴＴ、　１００ＩＩＩＨＨ（ＩｃＩ！２コ２
塵、及びオートクレーブ水１成を加えた。１００℃にて
５分間処理後。

３１℃にて５分インキュベート模氷水に入れた。この溶
液に４成（１６ユニツト）のＴ４ポリメラーゼ（宝酒造
）、１度（１ユニツト）のＴ４リガーゼ（ベーリンガー
・マンハイム）、１ρ（１０ｓ）のＴ　４　Ｇｅｎｅ　
３２　Ｐｒｏｔｅｉｎ　（Ｐｈａｒｍａｃ＋ａ）を加え
３７℃にて２時間反応させた。（Ｃ１Ｓ、Ｃｒａｉｋ他
、５ｃｉｅｎｃｅ岨８　、２９１−２９７頁、（１９８
５））反応後、１０１１１を０．８％アガロースにて電
気泳動し、反応が完結した事を確認した。反応液１ＪＪ
ｉを用いてＪＨ１０９株を形質転換した。

３６個のプラークより、ＪＨ１０９培養液に感染後３７
℃で５時間培養した。遠心分離後菌体を除き、ニトロセ
ルロースフィルターに５ＩＩＩづつスポットした。この
ニトロセルロースフィルターを用いて、ドツトプロット
ハイブリダイゼーション（Ｈ，Ｊ。

Ｚｏｌｌｅｒ　＆　Ｈ，Ｓｍ１ｔｈ　Ｈｅｔｈｏｄｓ　
ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏａｙ、　　１００ｐ４６８〜５
００）を行った。プローブとしては、３２Ｐγ−ＡＴＰ
によりラベル化した変異用オリゴヌクレオチドを用いた
。ドツトプロットハイブリダイゼーションによって陽性
となったクローンをＭ　１３Ｓ１２２１と命名した。

ｈＧ−Ｃ３Ｆ遺伝子の３°末端のＥＣ０ＲＩ制限酵素部
位をＸ　ｈｏ　［制限酵素部位に変換した。Ｍ　１３８
１２２１の一本鎖）７−ジに対して、ＥＣ０ＲＩよりＸ
　ｈａ　Ｉへの変換用オリゴヌクレオチドを用いて、部
位特異的突然変異を同様に行なった。３６個のプラーク
よりＪＨ１０９株に感染させ、ＲＦを得た。ＥＣ０ＲＩ
によって切断されず、Ｘ　ｈｏ　Ｉによって切断される
クローンＭ　１３Ｓ　１２２１１を得た。反応は０．３
埒のＲＦを１０１１１の反応液［５０ａＨＴｒｉｓ−Ｈ
Ｃ４）　、　ｐＨ７，５，１０ａＨＨｆＪα２．１ｍＨ
ＤＴＴ、　１００ｍＨＮａＣ１＋　、　１０ｔ　ニット
のＥｃｏＲＩ又はＸｈｏｌ（いづれも宝酒造）］にて３
３７２２時間なった。

Ｍ　１３Ｓ　１２２１１の１本鎖ファージについて、塩
基配列確認用ブライマーを用いてジデオキシ法（Ｊ。

Ｍｅｓｓｉｎｇ　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏ
ｌｏｇｙ、　１０１　　ｐ２０〜７８゜１９８３）によ
り塩基配列を読み、１７番目のＣｙｓ（ＴＧＴ）がＡｌ
ａ（ＧＣＴ）に変換されていることを確フした（以下、
「ａｌａ　１７　ｈＧ−Ｃ３Ｆ遺伝子」という。）。

実施例　３ ａｌａ　１７　ｈＧ−Ｃ８Ｆ発現ベクターの構築３ＪＪ
３のＭ　１３８１２２１１のＲＦを５００ρの反応液［
１０ｎ＋ＨＴｒｉｓ−ＨｔＪｌ　、　ｐＨ７，５，１０
ｍＭ　ｔ４ＧｃＪ！２，１ｍＨＤＴＴ。

５０ｍＭ　　Ｎａｐ！　、　５０１ニツトのＸｂａｌ（
ベーリンガー・マンハイム社）］９３３７４４時間反さ
せた。

・更に５ｍの５ＨＮａＣ１，及び５ｐＩｌ（５Ｑユニｙ
　ｔ”　）　（７）ＸｈＯＩ（宝酒造）を加え３７℃３
時間反応さけた。

・　　　１７番目のアミノ酸残基をＣｙｓよりＡｌａに
変換したａｌａ　１７　ｈＧ−Ｃ３Ｆ　３ｆｌ伝子を含
む小フラグメントを得た。

１ＪＩｇのｐｃｉ’８５３Ｇ　（米国特許筒４．７１０
．４７３号。

ＡＴＣＣＮｏ、３９９３４　）を１００成の反応液［１
０ｍＭ　Ｔｒｉｓ　−１１（Ｊｌ　、　ｐＨ７，５，１
０ｍＭ　ＨｇＣ＋！２．１ｍＨＤＴＴ、　５０ｍＭ　Ｎ
ａＣ１！。

３０ユニツトのＸｂａｌ（ベーリンガー・マンハイム社
）］９３３７４４時間反させた。更に１１Ｉｉの５ＨＮ
ａＣｉ！及び３ｍ（３０１ニツト）のＸｈＯＩ（宝酒造
）を加え３７℃で３時間反応させた。０．８％アガロー
ス電気泳動にて大フラグメントを得た。

ａｌａ　１７　ｈＧ−Ｃ８Ｆ　３伝子を含むＴＥ溶液５
ｍにｐｃＦＨ５３６大フラグメントを含むＴＥ溶液７屑
、２成の［５００ｍＨ’Ｔｒｉｓ−ＨＧ、　ｐＨ７，４
，１００ｍＨＨＱＣＩ２］溶液、１１Ｉ１．の１０ｍＭ
　ＡＴＰ、　３／ｎ　（３ユニツ１−）Ｔ４リガーゼ（
ベーリンガーマンハイム）、２成のオートクレーブ水を
加えて１５℃にて１４時間反応させた。

この反応液を用いて、λＣＩ　　をを含むブラスミドｐ
ＭＷ　１　（ＡＴＣＣＮｏ、３９９３３）を有する大腸
菌ΔＭ７を形質転換した。アンピシリン及びカナマイシ
ン耐性のコロニーより、プラスミドを単離し、ＸｂａＩ
及びＸ　ｈｏ　Ｉにて切断してａｌａ　１７　ｈＧ−Ｃ
３Ｆ　遺伝子が挿入されている事をｒｌｌ認した。得ら
れた菌株をｐ　Ｓ　Ａ　２１１６／　Ａ　Ｍ　７とした
。

実施例　４ ｈＧ−Ｃ３Ｆ誘導体の製造法 前記のｐＳ△２１１６／　Ａ　Ｍ　７をアンピシリン及
びカナマイシンを含むし培地にて２８℃で一晩振罎培養
した。この培養液２５Ｉｄ！を５００ｄのＬ培地に加え
、２８℃で４時間振盪培養した。予め６０℃にしておい
たし培地５００ｄを培養液に加え、４２℃にして更に３
時間振盪培養した。得られた大腸菌の一部をす、ンブル
緩衝液で煮沸く５分）し、煮沸液について５ＤＳ−ポリ
アクリルアミドゲル電気泳動を行ない、ａｌａ　１７　
ｈＧ−Ｃ３Ｆの含有量を調べた。この条件においてａｌ
ａ　１７　ｈＧ−Ｃ３Ｆは、大腸菌細胞蛋白質の約３０
％であった。

更に、培養液を遠心分離して約２０ｇの菌体を得た。１
４０ｄの次式水を加え懸濁した模、最終濃度１ｍＨにな
る様に１８　ＤＴＴを加えた。この間溶液は４℃に保持
した。フレンチプレスを用いて菌体を破砕し、沈澱を集
めた。この沈澱を１％デオキシコール酸、５＋ｎＨＥＤ
ＴＡ、　５ｍＨＤＴＴを含む５０ＩｌｌＨトリス−塩酸
緩衝液（ｐＨ９，２）　１４０＋＋ｅにて再懸濁した後
、遠心分離し沈澱を集めた。更に次式水にて沈澱を洗浄
した後、１％ドデシル−Ｎ−サルコシンナトリウムを含
む２０ｍＭ　トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８，２）を用い
沈澱を可溶化した。更に硫酸銅を約０．００１％になる
様に加えた後、１晩室温にて攪拌した。この水溶液に　
１００−の次式水と２００７の２０ｆｆ１Ｍトリスー塩
酸！１衝液（ｐＨ７，７）及ｒｊ　１００ｇノＤｏｗｅ
ｘ　１　ｘ　４　ｍ脂を加え、約１時間攪拌した後、ｅ
過し、Ｄｏｖｅｘ１×４樹脂を除いた。この水溶液を予
め２０１Ｈトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７，７）にて平衡
化したＤＥＡＥ−セルロース（ワットマン社ＤＥ５２）
カラム（φ２．６Ｘ３．２ｃａ＋）に添加した。２０１
１１８　トリス−１！！緩衝液（ｐｌ−１７，７）にて
充分洗浄した後、次いで３ｓｍＨ塩化すトリウムを含む
２０ｍＨトリス−塩酸ＷＪ衝液（ｐＨ７，７）にてａｌ
ａ　１７　ｈＧ−Ｃ３Ｆを含む蛋白質を溶出した。この
溶液に５０％酢酸を加えてｐＨを５．４にした。更にこ
の溶液に最終濃度を１Ｏｎ＋Ｈになる様に１Ｍ酢酸ナト
リウム！ｌｉｉ液（ｐＨ５，４）を加えた。予め２０ｍ
Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５，４）にて平衡化した
ＣＭ−セファロース（ファルマシア社Ｆａｓｔ−ＦＩＯ
Ｗ）カラム（φ２．６．ｘ　２．８　ｃｍ　）にこの溶
液を添加した。

２０ｍＭ酢酸ナトリウム！！衝液（ａｌ１５．４）にて
充分洗、浄した後、３７．５ｍＭ塩化ナトリウムを含む
２０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ａｌ１５．４＞を用い
てａｌａ　１７　ｈＧ−Ｃ３Ｆを溶出することにより精
製した。１０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４，０）
に対して透析を一晩４℃にて行ない、透析内液を集めて
濃度を０．５ＩＩｒｇ／　ｄになる様に１０ｍＭ酢酸ナ
トリウム緩衝液（ｐＨ４，０）にて調整した。

更に、実施例２と同様な方法を用いて、ｈＧ−Ｃ３Ｆの
１７番目のシスティンコドンをグリシン、イソロイシン
、チロシン、アルギニンに相当するコドンに置きかえる
か、又は、システィンコドンを欠失させたオリゴヌクレ
オチドを合成した。これらのオリゴヌクレオチドを用い
て、実施例３及び上述の方法と同様な方法を用いて、ｈ
Ｇ−Ｃ３「の１７番目のアミノ酸残基がそれぞれグリシ
ン、イソロイシン。

チロシン、アルギニン残基に置きかわるか、又は１７番
目のアミノ酸残基が欠失したｈＧ−Ｃ３Ｆ誘導体を１９
だ。以下これらの誘導体をそれぞれＱＩＶ　１７　ｈＧ
−Ｃ３Ｆ、　ｉｌｅ　１７　ｈＧ−Ｃ３Ｆ、　ｔｙｒ　
１７　ｈＧ−Ｃ３Ｆ、　ａｒｇ　１７　ｈＧ−Ｃ３Ｆ及
びｄｅｌ　１７　ｈＧ−Ｃ３Ｆと称す。

実施例　５ ａｌａ　１７　ｈＧ−Ｃ３Ｆの二量体形成割合上記した
ａｌａ　１７　ｈＧ−Ｃ３Ｆを７４３３する際、Ｄｏｗ
ｅｘ１Ｘ４樹脂にて処理した水溶液の１部をとり、メル
カプトエタノールを除いたサンプル緩衝液中で煮沸し、
煮沸液についてＳＯ３−ポリアクリルアミドゲル（１５
％）電気泳動を行なった。電気泳動後ゲルをＣＢＢ　（
クーマジー・ブリリアント・ブルー）染色した復、画像
処理電気泳動解析システム（イムノメゾイカ社）を用い
て蛋白質バンドの定量を行ない、ｈＧ−Ｃ３Ｆの単量体
と二量体の吊を比較した。≠の結果、精製過程における
二量体／＋ｔｌｆｉ体の比が、ａｌａ　１７　ｈＧ−Ｃ
３Ｆでは０．０３３と低く抑えられているのに対し、１
７番目がＣｙｓＴＡＭのままのｈＧ−Ｃ３Ｆではその比
が０．１６９にも達していることが判明した。

実施例　６ ｈＧ−Ｃ３Ｆ誘導体のＮ末端アミノ酸　　及び）７ミノ
酸分析 実施例４で得た各ｈＧ−Ｃ３Ｆ誘導体を用いて気相タン
パク質シークエンサー（Ａｐｐｌｉｅｄ　ａｒｏｓｙｓ
ｔｅｍｓ社、４７０Ａ型）によって、Ｎ末端アミノｉ配
列を気相タンパク質シークエンサー（Ａｐｐｌｉｅｄ　
Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社、４７０Ａ型）および逆相高圧
液体クロマ（・グラフィー（Ｓｐｅｃｔｒａ　Ｐｈｙｓ
ｉｃｓ社８１００型、使用カラム：センシュパック５Ｅ
Ｑ−４カラム、　　４．６ｘ　３００　ａｍ　）によっ
て同定した。

その結果以下の様に塩基配列から予測されるアミノ酸配
列（−文字表記）と一致した。

ｈＧ　−Ｃ３Ｆ　　　　　ＨＴＰＬＧＰＡＳＳＬＰＱＳ
ＦＬＬにＣＬＥＱａｌａ　１７　ｈＧ−Ｃ３Ｆ　　ＨＴ
ＰＬＧＰＡＳＳＬＰＱＳＦＬＬＫＡＬＥＱ（ｌｌｙ　　
１７　　ｈＧ−Ｃ３Ｆ　　　　ＨＴＰＬＧＰＡＳＳＬＰ
ＱＳＦＬＬＫＧＬＥＱｉｌｅ　１７　ｈＧ−Ｃ３Ｆ　　
ＨＴＰＬＧＰＡＳＳＬＰＱＳＦＬＬにＩＬＥＱｔｙｒ　
１７　ｈＧ−Ｃ３Ｆ　　ＨＴＰＬＧＰＡＳＳＬＰＱＳＦ
ＬＬにＹＬＥＱａｒｇ　１７　ｈＧ−Ｃ３Ｆ　　ＨＴＰ
ＬＧＰＡＳＳＬＰＱＳＦＬＬにＲＬＥＱｄｅｌ　１７　
ｈＧ−Ｃ３Ｆ　　ＨＴＰＬＧＰＡＳＳＬＰＱＳＦＬＬＫ
　ＬＥＱまたヨウドアセ］・アミドを用いてカルボキシ
メチル化シタ各ｈＧ−Ｃ３ｒ誘導体ヲ６８　ＨＯ！　２
００ＩＪｉ中ニオいて　１１０℃で２４時間加水分解を
行なった後、アミノ酸分析装置（日立８３５型；カスタ
ム＃　２ｔ３１フイオン交！！Ｉ！樹脂）にかけアミノ
酸分析を行なった。

実施例　７ ｈＧ−Ｃ３Ｆ誘導体の活性 ｈＧ−Ｃ３Ｆ活性はＲａ１ｐｈ　Ｐ等の方法（Ｂｆｏｏ
ｄ、　６８巻、６３３−６３９頁、１９８６年）、およ
びＨｏｏｒｅ　Ｒ，Ｎ、等の方法（Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏ
ｌｏｇｙ、　１３１巻、２３７４−２３７８頁、１９８
３年）に準じて、［３Ｈ］チミジンの取り込み伍を指標
とする方法により求めた。すなわち、Ｂａ１ｂ／Ｃ（メ
ス）マウスの骨髄細胞浮遊液０．１ｄ（４〜８×１０４
有核細胞）、および１０％牛脂児血清を含むＨｃＣｏｙ
’ｓ　５ＡＰｉ養液（ＧＩＢＣＯ社製）で適当に希釈し
たｈＧ−Ｃ３Ｆ標準品、又はｈＧ−Ｃ３Ｆ誘導体試料０
．１ｍを混合し、９６穴平底マイクロプレート（Ｂｅｃ
ｔｏｎ　Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社製）に入れて３７℃　５
％炭酸ガス／９５％空気、１００χ湿度の条件下で３日
間培養した。次いで、１μＣｉの［３Ｈ１チミジンを添
加し、上記条件下でさらに５時間培養を行なった。

その後、細胞をガラス繊維フィルター（ワットマン社製
）上に移し、液体シンチレータ−（ＮＵＮＲｅｓｅａｒ
ｃｈ　ＰｒｏｄｌｌＣｔＳ社ｖＪ）を加え、細胞に取り
込まれた放射活性を液体シンチレーションカウンターに
て測定した。被検試料のｈＧ−Ｃ３Ｆ活性は、あらかじ
めコロニーアッセイ法（軟寒天法）で力価を定めた標準
品との比較による平行線検定法（中村悦部、木村都共著
、生物検定法と応用推計学、廣Ｉｌｌ　１店、昭和６１
年、第３版）により求めた。

尚、上記のマウス骨髄細胞浮遊液は）ＩｃＣｏｙ’ｓ　
５Ａｃｏｍｐｌｅｔｅ培養液を用いて調製した。

［ＨｃＣｏｙ’ｓ　５Ａ　ｃｏｍｐｌｅｔｅ　Ｉｇ　養
液］ＨｃＣｏｙ’ｓ　５八培地（Ｍｏｄｉｆｉｅｄ）粉
末２，４シに炭酸水素ナトリウム０．４４ｇ、　ＨＥＭ
アミノ酸溶液（ＳＯＸ）１．６　ｄ、　ＨＥＭピルヒン
酸ナトリウム（１００ｍＨ）　２ｍ。

ＨＥＨノンエツセンシャルアミノ酸溶液（１０ｍＨ）（
１００Ｘ）　０．８ｄ、炭酸水素ナトリウム溶液（７，
５％）１．２　ｄ、　ＨＥＨビタミン溶液（１００ｘ）
　０．８ｄ、　Ｌ−グルタミン（２００＋ｎＨ）（１０
０ｘ）　１．２　ｒｔｄ！、　Ｌ−セリン（０，２１ｇ
１５０ｍ）　　０．４ｔｄ、　Ｌ−アスパラギン（０，
４グ１５０耐）０．４　（ｄ、　Ｇｅｎｔａｍｉｃｉｎ
（５０％／ｄ）　　０．２ｍを加え、［１を２００ａｅ
としてミリポアフィルタ−でｅ過滅菌を行なった。尚、
し−セリン、［−アスパラギン。

炭酸水素ナトリウム、およびＧｅｎｔａｍｉｃｉｎはシ
グマ社製、これ以外はＧｒＢＣＯ社製を使用した。

その結果を下記に示す。ａｌａ　１７　ｈＧ−Ｃ３Ｆ及
びｇｌｙ　１７　ｈＧ−Ｃ３Ｆ誘導体は１７位にＣｙｓ
が存在するｈＧ−Ｃ８Ｆと比較して、同等もしくはそれ
以上の活性を有していることが示された。

サンプル名　　　　生物学的活性ｕ／　ｍｇｈＧ−Ｃ８
Ｆ　　　　　　　　１．４ｘ　１０８ａｌａ　１７　ｈ
Ｇ−Ｃ３Ｆ　　　　　２．１ｘ１０８ｇｌｙ　１７　ｈ
Ｇ−Ｃ３Ｆ　　　　　１．９ｘ１０８ｉｌｅ　１７　ｈ
Ｇ−Ｃ３Ｆ　　　　　１．２ｘ　１０８ｔｙｒ　１７　
ｈＧ−Ｃ３Ｆ　　　　　７．６ｘ　１１０７ａｒ　１７
　ｈＧ−Ｃ８Ｆ　　　　　４．８ｘ１０７ｄｅｌ　１７
　ｈＧ−Ｃ８Ｆ　　　　　１．４ｘ１０７実施例　８ ａｌａ　１７　ｈＧ−Ｃ３Ｆの安定性 精製したａｌａ　１７　ｈＧ−Ｃ３Ｆ約４５０／ｉを１
−の２Ｏｎ＋Ｈクエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７、１
０Ｑａ＋Ｈ塩化ナトリウム）に溶解し、４０℃で１０日
間加温した後、実施例７の方法で活性を測定した。その
結果、下記のように、ａｌａ　１７　ｈＧ−Ｃ３Ｆ　ハ
ｈＧ−Ｃ３Ｆ、Ｊ：　Ｖ）も安定テあることが判明した
。

サアフ／Ｌ、名１０日間加温後の　１０日間加温後活性
残存率（χ）の活性　Ｕ／Ｒｇ ｈＧ　−Ｃ３Ｆ　　　　　　２７．１　　　　　３．８
ｘ　１０７ａｌａ　１７　ｈＧ−Ｃ３Ｆ　　　９０．５
　　　　　１．９ｘ１０８さらに、４０℃で１０日間加
温後のサンプル各２０７Ｊを５ＤＳ−ポリアクリルアミ
ド（１２，５％）ゲル電気泳動により分析した。還元条
件下でサンプルを分析する場合は、８０ｍＭジチオスレ
イト−ル、５ＸＳＤＳ、１０％グリゼロールを含む０．
２５Ｍ　Ｉ−リス−塩酸緩衝液（ｐＨ６８）中で、６５
℃で１０分間加熱処理復、サンプルをゲルへ注入した。

非還元条件下で分析する場合は、５ＸＳＤＳ、ＩＯＸグ
リセロールのみを含む０．２５Ｍ１−リス−塩酸緩衝液
（ｐＨ６，８）とサンプルを混合後、直ちにサンプルを
ゲルへ注入した。泳動後のゲルは１．２５％クマシーブ
リリアントブルーＲ−２５０（半柱化学）を含む４０％
メタノール、１０％酢酸混液で染色した。

染色後のゲルを、島津クロマトスキャナーＯ８−９３０
型を用いて波（％　５３０ｎｍでスキャンニングし、未
変性物（モノマー）に相当するバンドのピーク面積を求
めた。精製ａｌａ　１７　ｈＧ−Ｃ３Ｆを還元処理した
ものには、オリゴマーを全く認めなかったので、このピ
ーク面積の平均を１００％として、非還元条件下の各サ
ンプル中の七ツマ−の割合（％）を算出したところ、以
下の様な結果を得た。

サンプル各　　　七ツマ−に相当するピークの面積の割
合（％） ｈＧ−Ｃ３Ｆ　　　　　　　　　２４．２ａｌａ　１７
　ｈＧ−Ｃ３Ｆ　　　　　　９７．０この結果より、ａ
ｌａ　１７　ｈＧ−Ｃ３Ｆは、熱に対して安定であるこ
とが示された。

［効　果］ 以上の記載から明らかなように、本発明のｈＧ−ＣＦＳ
誘導体は、１７番目のシスティン残基をアラニン残基又
はグリシン残基に変換することにより、ｈＧ−ＣＳＦ分
子内でジスフィルド結合に関与しないシスティン残基を
除去したものである。この結果、′ｆＩＭｌシスティン
残基による二重体の形成が著しく減少し、ｈＧ−Ｃ３Ｆ
に較べて本発明のｈＧ−ＣＳ［誘導体の精製効率、安定
性及び活性が大幅に上昇するという効果を奏効し得たも
のである。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明で用いるｈＧ−Ｃ３ＦをコードするＤＮ
Ａ分子の一列を示す。 第２図はｐＳ　Ａ　２１１６の作成工程を示す。

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. （１）１７番目のシステイン残基がアラニン残基又はグ
   リシン残基に変換されていることを特徴とするヒト顆粒
   球コロニー刺激因子ポリペプチド誘導体。
2. （２）大腸菌により発現されることを特徴とする請求項
   第１記載のポリペプチド誘導体。（３）ヒト顆粒球コロ
   ニー刺激因子ポリペプチド誘導体が大腸菌優先コドンを
   有する化学合成ＤＮＡ分子にコードされていることを特
   徴とする請求項第２に記載のポリペプチド誘導体。