JPH01165373A - インターロイキン２産性組換え真核細胞、その製法とベクターおよびインターロイキン２の製法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ 本発明はインターロイキン２産生組換え真核細胞に関す
る。本発明はさらにこれらの細胞を製造する方法とベク
ターに関ずろ。また、本発明はさらにこれら細胞の培養
によるインターロイキン２の製造法に関する。

［発明の構成］ 本発明による真核細胞はその発現に必要な手段と共に、
ジヒドロフオレートレダクターゼコード化ＤＮＡ配列お
よびシグナルペプチドがヒト生長ホルモン天然前駆体の
１種のそれであるインターロイキン２ハイブリッド前駆
体コード化ＤＮＡ配列を含む。

これら組換え真核細胞は、その発現に必要な手段と共に
、ジヒドロフオレートレダクターゼコード化ＤＮＡ配列
およびシグナルペプチドがヒト生長ホルモン天然前駆体
の１種のそれであるインターロイキン２ハイブリット前
駆体コード化ＤＮＡ配列を有するベクターによって真核
細胞をトランスフェクトし、次いで各々か前の培地より
も高濃度のメトトレキセートを含む連続培地中で生育さ
せることにより、インターロイキン２を産生ずるトラン
スフェクト細胞を選択することからなる方法によって得
られる。

［従来の技術および発明の課題］ インターロイキン２はリンホカインの１種である。すな
わち、それは抗原またはミトゲン化合物による活性化に
応答して捕乳類の成熟Ｔリンパ球によって分泌される。

それは免疫反応に関与する相異なるタイプの細胞の増殖
と分化に作用することによって重要な役割をはたす［ア
ール・ジェイーロブ（Ｒ，Ｊ　、ＲｏｂｂＸｌ　９８４
　）、イミュノロジー・ツディ（Ｉ　ｍｍｕｎｏｌ　、
　Ｔ　ｏｄａｙ）、５，２０１２０９］。

ヒト起源のインターロイキン２は特別によく研究されて
きている。それは３位のスレオニン残基に結合したテト
ラサツカライドを有する１３３ｇのアミノ酸からなる蛋
白質である（エイチ・ニス・コンラド（Ｈ、Ｓ　、　Ｃ
ｏｎｒａｄｔ）ら、（１９８６）、カ−ボハイドレート
・リサーチ（Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ、Ｒｅｓ、）、１４９
，４４３−４５０］。成熟Ｔリンパ球はまず１５３個の
アミノ酸の前駆体としてそれを合成分泌し、次いで小胞
体で切断して２０個のアミノ酸からなるシグナルペプチ
ドを除去し、さらにゴルジ装置でグリコジル化したのち
、グリコジル化した成熟蛋白質と称する１３３アミノ酸
の蛋白質としてそれを分泌する。

ヒト起源のインターロイキン２の生物学的性質は、ガン
、ある種の感染症、寄生虫病などの病気の冷鉄に有用な
薬物の有効成分としてそれを使用することを可能にする
。この使用には、インターロイキン２をグリコジル化し
た形で使用するのが好ましいようである。すなわち、実
際にサツカライド側鎖は蛋白質を安定化するのに役立ち
、これを患者に投与したとき、その耐性を改善するよう
に思われる。

文献には、健全な末梢リンパ球［イー・エム・ニーズ（
Ｅ　、Ｍ、Ｋｎｉｅｐ）ら、（＋９８４）、ヨーロピア
ン・ジャーナル・バイオケミストリイー（Ｅｕｒ。

Ｊ　、１３　ｉｏｃｈｅｍ）、１４３，１９９−２０３
）から、またジュカルト・ラインなどのリンパ芽球［ア
ール・ジエイ・ロブ（Ｒ，Ｊ　、Ｒｏｂｂ）ら（１９８
３）、プロシーディング・ナショナル・アカデミ−・オ
ブ・サイエンス・ニーニスニー（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、
Ａｃａｄ。

Ｓｃｉ、ＵＳＡ）、８０．５９９０−５９９４］からの
インターロイキン２の製造について記載されている。

使用されている方法は、健全なリンパ球の培養に関連し
た難点のため、また誘導体の必要性のため、不適当であ
ることが証明された。

インターロイキン２をコードする相補的なりＮＡのクロ
ーニング［ティー・タニグチ（Ｔ　、　Ｔ　ａｎｉｇｕ
ｃｈｉＸｌ　９８３）、ネイチャー　（Ｎ　ａｔｕｒｅ
）、３０２．３０５−３１０］に続いて、遺伝子工学技
術によるインターロイキン２の製造に微生物の利用が可
能となったことが報告された。ヨーロッパ特許出願Ａ−
００８９０６２は、グリコジル化ができない大腸菌（Ｅ
ｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　　ｃｏｌｉ）およびＣＯＳモン
キー細胞の使用の可能性を示している。ヨーロッパ特許
出願Ａ−０１７２６１９はとくに中国産ハムスター卵細
胞（ＣＨＯ細胞）を含む、種々の他の動物細胞の使用を
開示する。

トランスフェクションの遂行に際して、真核細胞の集団
内に、特別のベクターを現実に含有した細胞が存在する
ことを示し得るために、その発現がトランスフェクトさ
れた細胞に選択的利点を与え得るようなりＮＡ配列を有
することが前記ベクターにとって有用であることも公知
である。

［課題の解決手段］ とくに好ましいＤＮＡ配列はジヒドロフオレートレダク
ターゼ（以下、この酵素をｄｈｆｒと略す。）をコード
する配列である（スブラマニ（Ｓ　ｕｂｒａｍａｎ　ｉ
）ら、（（１９８１）、モレキュラー・セル・バイオロ
ジー（Ｍｏ１．Ｃｅ１．Ｂｉｏｌ、）、８５４−８６４
］。

発現ベクターによって運搬されるそういった配列は、機
能的な状態のｄｈｆｒを合成することができなｔ、”Ｉ
ｎ胞（Ｄ　ＨＰ　Ｒ−細胞）のトランスフェクション後
に、ヒボキサンチン、グリシンおよびチミジンを欠いた
培地中では、現実にベクターを合体させた細胞のみしか
生育しないということを可能にする。

その発現に必要な手段と共に、ｄｈｆｒをコードするＤ
ＮＡ配列を有するベクターの使用にかかる興味は、トラ
ンスフェクトされた真核細胞が機能的状態のｄｈｆｒを
合成できる（Ｄ　ＨＦ”　Ｒ子細胞）かあるいは合成で
きない（ＤＨＦＲ−細胞）にかかわりなく、その使用が
発現に必要な手段と共に前記ベクターによって運搬され
るＤＮＡ配列によってコードされた興味ある蛋白質の生
産性向上をもたらす増幅方法のはじまりとなりうるとい
う事実によって強化される。この増幅のメカニズムは具
体的にはなお不明である。ｄｈｆｒがメトトレキセート
（Ｌ−Ｎ−（４−（（２，４−ジアミノプテリジン−６
−イル）メチル）メチルアミノ）ベンゾイル）グルタミ
ン酸）として知られている化合物によって阻害されるこ
と、選択的培養培地にメトトレキセートを存在させると
大部分の細胞を殺すこと、また生残る細胞は実質的量の
ｄｈｆｒを合成することができるようになった細胞のみ
であることは、知られてぃる。さらに、その発現に必要
な手段と共に、ｄｈｆｒをコードするＤＮＡ配列および
他の蛋白質をコードするＤＮＡ配列を有するベクターを
含有した細胞中で、このｄｈｆｒの増産は前記蛋白質の
増産を伴うことが発見された［アール・ジエイ・カウフ
マン（Ｒ、Ｊ　、　Ｋ　ａｕｒｍａｎ）に（＋　９８２
）、ジャーナル・オブ・モレ上４ニラ−・バイオロジー
（Ｊ、Ｍｏ１．Ｂ１０１）、１５９，６０１−６２１１
゜ 本発明者は、その発現に必要な手段と共に、インターロ
イキン２の天然前駆体をコードするＤＮＡ配列とｄｈｆ
ｒをコードするＤＮＡ配列を同時に運搬するベクトルを
作成したところ、このベクターは、問題のベクターの１
種を合体した真核細胞（およびとくにＣＨＯ細胞）の培
養において、−時発現の条件下、すなわちその各々が前
の培地よりも高濃度のメトトレキセートを含む連続した
培地における培養によって高度な生産ラインを選択する
前では、ｄｈｆｒをコードするＤＮＡ配列およびこの配
列の発現に必要な手段を欠如する点が異なるベクターを
合体させた同じタイプの細胞の培養培地から集めた場合
よりも少ない量のインターロイキン２しか培地から集め
ることを可能にしないことを認めた。

この結果は、健全な末梢リンパ球またはリンパ芽細胞の
培養によって得られるインターロイキン２の量の点では
有望であるが、他の蛋白質、例えば肝炎Ｂウィルスの表
面抗原またはヒト生長ホルモンについてなされた観察と
は反対に、インターロイキン２の製造の場合には、その
発現に必要な手段と併用した、ｄｈｆｒをコードするＤ
ＮＡ配列の使用から期待される利点のすべてを引出すこ
とができないことを示す。

本発明者は、さらに検討を継続して、非常に驚いたこと
には、テストした最初のベクターに関して、インターロ
イキン２の前駆体をコードするＤＮＡ配列の範囲内で、
そのシグナルペプチドをコードする部分を、ヒト生長ホ
ルモン（この蛋白質は以下ｈＧＨと省略する。）の天然
前駆体の１種のシグナルペプチドをコードする配列で置
換すると、分泌レベルを改善し、ある種の構成によって
は、期待された最初のレベルを達成することが可能にな
ることを認めた、かくして、本発明者は、それに関する
判断基準を満足させ工業的規模でインターロイキン２の
製造を具体化することを可能にさせる解決を提供しよう
とするものである。

まず第一の態様として、実際に本発明は、その発現に必
要な手段と共に、ジヒドロフオレートレダクターゼをコ
ードするＤＮＡ配列および、そのシグナルペプチドがヒ
ト生長ホルモンの天然前駆体の１種のそれであるインタ
ーロイキン２のハイブリッド前駆体をコードするＤＮＡ
配列を含む、インターロイキン２を産生する組替真核細
胞に関する。

さらに本発明は、１）その発現に必要な手段と共に、ジ
ヒドロフオレートレダクターゼをコードするＤＮＡ配列
および、そのシグナルペプチドがヒト生長ホルモンの天
然前駆体の１種のそれであるインターロイキン２ハイブ
リツド館駆体をコードするＤＮＡ配列を同時に運搬する
ベクターによって真核細胞をトランスフェクトし、次い
で２）その各々が前の培地よりら高濃度のメトトレキセ
ートを含む、連続した培地中で培養して、インターロイ
キン２を産生ずるトランスフェクトした細胞を選択する
ことからなる、前記細胞の製造方法に関する。

最後に、本発明は、インターロイキン２を産生する真核
細胞を培養し、その培養培地を集め、次いで培地中に含
まれるインターロイキン２を他の成分から分離すること
からなる、インターロイキン２の製造法であって、培養
細胞が、その発現に必要な手段と共に、ジヒドロフオレ
ートレダクターゼをコードするＤＮＡ配列および、その
シグナルペプチドがヒト生長ホルモンの天然前駆体の１
種のそれであるインターロイキン２のハイブリッド前駆
体をコードするＤＮＡ配列を同時に有するベクターによ
ってトランスフェクトされ、次いでその各々が前の培地
よりも高濃度のメトトレキセートを含む、連続した培地
中での培養によって選択された真核細胞から得られるも
のである方法に関する。

特記すべきは、この製造法は、ヒト起源のインターロイ
キン２の製造に特に適するが、それのみならず、かかる
分子が、例えば、診断薬としであるいは、とくに動物用
の薬剤中の活性成分としてとくに興味があると共に、工
業的利用の価値がある限り、他の動物起源のインターロ
イキン２の製造にも利用され得る。

自明なことではあるが、この製造法は、天然に産生ずる
Ｔリンパ球から分泌されるグリコジル化されたインター
ロイキン２の製造を主として可能とすることを意図され
たものである。注目すべきことであるが、この方法は、
本発明による真核細胞の培養によって培地中に存在する
、不完全グリコジル化され、またはグリコジル化されて
いない状況のインターロイキン２を製造にも適している
。

本発明を実施するために使用される真核細胞はグリコジ
ル化ができる動物起源の細胞である。これらの細胞の中
で、その起源（中国産ハムスター卵細胞）を引用してＣ
ＨＯ細胞と通常呼ばれる細胞がとくに適している。

増殖であろうと、ベクターによるトランスフェクション
であろうと、その他、現実にト・ランスフエクトされた
細胞の選択であろうと、これら細胞の使用に関連した技
術は、当業者に知られている。

その一部を実施例の中に十分詳しく記載する。

本発明を実施するのに必要なベクターは、多様な形をと
りうる。それらは、ウィルスゲノム、とくにレトロウィ
ルス、プラスミド、その他コスミッドのゲノムの全てま
たは一部からなる。プラスミドが有利に使用される。

本発明によるベクターは、その発現に必要な手段と共に
、ジヒドロフオレートレダクターゼをコードするＤＮＡ
配列および、そのシグナルペプチドがｈＧＨの天然前駆
体の１種のそれであるインターロイキン２のハイブリッ
ド前駆体［この前駆体は以下に次の記号で略称する：（
ｐｓ−ｈＧＨ）インターロイキン２］をコードするＤＮ
Ａ配列を運搬する。

シグナルペプチドに対応するコード部分は遺伝子コード
の縮重によって認められた配列の１個を有するので、メ
チオニンを除く同じアミノ酸が、２．３．４個のコドン
、場合によっては６個のコドンによってさえコードされ
得る。シグナルペプチドｐｓ−ｈＧＨをコードする好ま
しいヌクレオチド配列を第１１図に示すが、これは対応
するアミノ酸に各々２６個のコドンを与える。

前記ＤＮＡ配列は同じ発現単位中に含まれ得る。

それぞれが自律発現単位に属するのが有利である。

これら配列の発現に必要な手段は、真核細胞のトランス
フェクションを意図したベクターの構成のために一般に
使用されるものから選ばれる。それらはＳＶ４０のゲノ
ムから好ましくは導かれるが、これからとくに初期促進
剤および／または初期アデニル化シグナルを含むＤＮＡ
配列をとくに製造することができる［ダブリュ・フイア
ーズ（Ｗ、ＦｉｅｒｓＸＩ　９７　Ｂ）、ネイチャー　
（Ｎ　ａｔｕｒｅ）、２７３．１１３−１２０　コ。

本発明によるベクターの構成は当業者に現在よく知られ
ている技術を必要とする。注目すべきことであるが、前
駆体（ｐｓ−ｈＧＨ）−インターロイキン２をコードす
るＤＮＡに関しては、インターロイキン２の天然前駆体
をコードするＴリンパ球のメツセンジャーＲＮＡに相捕
的なりＮＡ［例えば、ティー・タニグチ（Ｔ、Ｔａｎｉ
ｇｕｃｈｉ）　ｅｔ　ａｌ、（１９８３）、ネイチ＋　
−（Ｎａｔｕｒｅ）、３０２，３０５−３１０またはエ
ックス・デボス（Ｘ　、　Ｄ　ｅｖｏｓ）ら（！９８３
）、ヌクレイツク・アッシッド・リサーチ（Ｎｕｃｌｅ
ｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、）、１１．４３０７−４３
２３の業績を参照のこと。コを製造したのち、そのシグ
ナルペプチドをコードする配列を、ｈＧＨの天然前駆体
の１種のシグナルペプチドをコードする配列で置換する
ことが有利である。

ヒト起源のインターロイキン２の製造のために構成され
る２種の好ましいベクターはプラスミドｐＳＶ７２６（
第６図）およびｐＳＶ７４１（第９図）である。それら
はそれぞれｄｈｆｒの発現単位および前駆体（ｐｓ−ｈ
ＧＨ４）−インターロイキン２の発現単位を含む。これ
ら両プラスミドは発現単位におけるイントロンの存在、
性質および位置が基本的に異なる。詳述すると、プラス
ミドｐＳＶ７２６は、ｄｈｒｒをコードする配列のイン
トロン下流部ならびに前駆体（ｐＳ−ｈＧＨ）−インタ
ーロイキン２をコードする配列のイントロン下流部を運
搬する。

他方、プラスミドｐＳＶ７４１は前駆体（ｐｓ−ｈＧＨ
）−インターロイキン２をコードする配列のイントロン
上流部を運搬するが、ｄｈｒｒの発現単位の範囲にイン
トロンを持たない。

本発明のなお他の態様によれば、本発明は本発明による
ベクターを合体した真核細胞から、その各々が前の培地
よりも高濃度のメトトレキセートを含有する連続培地中
で前記細胞を培養することによって、選ばれたセルライ
ンに関する。ある培地から次の培地への継代培養は、Ｉ
Ｌ−２の構成のこれ以上の増幅が観察されなくなるまで
、続ける。

本発明の実施の態様を下記に示す。それらは勿論型なる
例示であって、・決して限定を意味するものではない。

実施例 一時の発現の条件下にテストした本発明の２種のベクタ
ーは以下に実施例として記載される高度な生産性の細胞
系の製造および次に得られるヒト起源のインターロイキ
ン２（以下、ＩＬ−２と略す。）の特徴付けを次に記載
する。

１、両ベクターの構成と一時発現の条件下におけるテス
ト プラスミドｐＳＶ７２６およびｐＳＶ７４１１、方法 Ａ／ベクターの構成 ベクターの構成は、とくに無限酵素による存在するベク
ターからＤＮＡフラグメントの単離、オリゴヌクレオチ
ドの化学合成、バクテリオファージＴ４のＤＮＡリガー
ゼなどの酵素を用いて適切な場合その末端の修飾後にこ
れら種々のフラグメントの組立て、エシェリヒア・コリ
（Ｅ　５ｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）における細菌
の形質転換後にクローニングによるベクターの選択、お
よび水にその精製を含有する。

それは当業者に周知の技術を要する。

これらの技術は、コールド・スプリング・ハーバ−、プ
レス（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｐｒｅ
ｓｓ）、米国ニューヨーク（Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ）によっ
て１９８２年に出版された、ティー・マニアチス（Ｔ、
Ｍａｎｉａｔ　ｉｓ）ら、モレキュラー・クローニング
（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｔｏｎｉｎｇ）　ニア・ラボ
ラトリ−・マニュアル（ａＬ　ａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍ
ａｎｕａｌ）の題名の著書に記載されている。

下記に記載されるベクターの構成に要する全ての制限酵
素は、とく二ニー・イングランド・バイオラプス（Ｎｅ
ｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ）（米国）により
市販されている。

バクテリアファージＴ４のＤＮＡリガーゼはニュー・イ
ングランド、ニュクレア（Ｎｅｗ　ＥｎｇｌａｎｄＮｕ
ｃｌｅａｒ）（米国）から入手できる。

ベクターの構成は第２〜ｌＯ図によって説明され、それ
らついては下記のキーが採用された。

、−一一一一　　　プラスミドｐＢＲ３２２から導かれ
るＤＮＡ配列 口：＝＝＝＝　　ＳＶ４０のゲノムから導かれろＤＮＡ
配列 区＝：ロココ　　　マウスのアルファグロビンをコード
する遺伝子から導かれるＤ ＮＡ配列 肚亡＝■　　　前駆体または、チロシン残基が２位でア
ラニン残基により置換 されているバリアントをコード する配列を構成するＤＮＡ配列 ＮＡ配列 口＝＝＝：コ　　　ｄＭｒをコードするＤＮＡ配列ヒト
Ｔリンパ球から単離された、ＩＬ−２の前駆体をコード
するメツセンジャーＲＮＡに相補するＤＮＡをクローン
した。

得られるヌクレオチド配列は、対応する前駆体のアミノ
酸を上側に示したコドンとしてヌクレオチドをグループ
化して、第１図に示されるＤＮＡ配列（５”→３°要素
）に含まれる。

Ｃ／真核細胞の使用 ａ１選定 ジー・ウルラウブ（Ｇ　、　Ｕ　ｒｌａｎｂ）とエル・
チェイシン（Ｌ、Ｃｈａｓｉｎ）［（１９８０）、プロ
シーデインゲス・ナショナル・アカデミ−・オブ・サイ
エンス・ニーニスニー（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ
、Ｓｃｉ、ＵＳＡ）、７７．４２１６−４２２０コによ
って選ばれたＤＨＦＲ−ＣＨＯ細胞のＤＸＢＩＩ菌株を
選定した。

ｂ、−時発現の操作 エル・ソンパイラック（Ｌ　、　Ｓ　ｏｍｐａｙｒａｃ
）とケイ０ダナ（Ｋ、Ｄａｎｎａ）［（１９８１）プロ
シーデインゲス・ナショナル・アカデミ−・オブ・サイ
エンス・ニーニスニー（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ’、Ａｃａ
ｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ）、７８．７５７５）によって記載
されたプロトコールを使用した。

各実験について、５％（ｖ／ｖ）子牛脂児血清（ギブゴ
（Ｇ　１ｂｃｏ））を添加したアルファーＭＥＭ（ギブ
ゴ（Ｇｉｂｃｏ）、米国）　５　ｍＱを含む、直径６ｃ
ｍのペトリ皿に５・ＩＯ２の細胞を接種する。

３７℃で２４時間培養したのち、細胞をＰＢＳ緩衝液［
アール・ダルベツコ（Ｒ、Ｉ）　ｕ　Ｉｂｅｃｃｏ）と
エム・フォーブト（Ｍ、Ｖｏｇｔ）、ジャーナル・イク
スペリメント・メデイシン（Ｊ　、Ｅｘｐ、Ｍｅｄ）、
９９（１９５４）、１６７］５ｍＣで線上し、次いでＩ
）Ｈ７，３のトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン
、ＨＣＱ（またはｔｒｉｓ−ＨＣｌ２）０．０５モル／
ρ、５０００００ダルトンのＤＥＡＥ−デキストラン（
シグマ（Ｓｉｇｍａ）、米国）　０　、２　ｍｇおよび
プラスミドＤＮＡｌ０μｇを加えたアルファーＭＥＭ１
ｍ１２を添加した。

３７℃で７時間培養を行い、細胞をＰＢＳ緩衝液５ｎ１
２で洗浄したのち、子牛脂児血清２％（Ｖ／Ｖ）を加え
たアルファーＭＥＭ５ｍＱを添加した。

次いで、細胞を３７℃で４日間培養する。続いて、培地
を集め、ＩＬ−２タイプ活性を測定するために使用する
。

Ｄ／ＩＬ−２タイプ活性の測定 ＩＬ−２−依存マウスニーリンパ球系ＣＴＬＬ−２）［
ピー・ベイカー（ｐ　、１３　ａｋｅｒ）に（１９７９
）ジャーナル・オプ・イクスペリメンタル・メディシン
（Ｊ　、Ｅｘｐ、Ｍｅｄ、）、１４９．１７３］の増殖
について、ＣＺｂ項の場合のように集めた培地の生物活
性をティー・モスマン（Ｔ、Ｍｏｓｍａｎｎ）［（１９
８３）、ジャーナル・オブ・イミュノロジカル・メッソ
ッド（Ｊ　、　ｒ　ｍｍｕｎｏｌ、Ｍｅｔｈｏｄｓ）、
６５．５５−６３コの比色テストによって測定する。リ
ンホカイン・リサーチ（Ｌｙｍｐｈｏｋｉ’ｎｅ　Ｒｅ
５ｅａｒｃｈ）［（１９８４）、４，１９３−２２７］
に記載された対照製剤を対照として使用する。

２、プラスミドｐＳＶ７２６ Ａ／胆 プラスミドｐＳＶ７２６の構成はプラスミドｐＳｖ７０
０から始める（第２図）。

プラスミドｐＳＶ７００は５個のＤＮＡ断片の組み立て
から生ずる。

−Ｓ　Ｖ　４０ゲノム［ダブリュ・フィアーズ（Ｗ。

Ｆｉｅｒｓ）（１９７８）、ネイチ＋　−（Ｎ　ａｔｕ
ｒｅ）、２７３．１１３−１２０］から導かれ、かっこ
のウィルスの初期プロモーターを含む、３４２個の塩基
対のフラグメントＰｖｕＩ［−Ｈ１ｎｄ■（以下ｂｐと
略す）、 一ヒトリンパ球の中で合成されるＩＬ−２の天然前駆体
をコードするＤＮＡ配列を含む、５０４ｂｐのフラグメ
ントＨｉｎｄＩ［［−ＢａｍＨＩ　（第１図）、 −マウスのアルファーグロブリンの遺伝子［ワイ・ニシ
オカ（Ｙ　、　Ｎ　１ｓｈｉｏｋａ）とピー・レーダー
（ＰＳＬｅｄｅｒＸｌ　９７９）、セル（Ｃｅｌｌ）、
１８．８７５−８８２］から導かれ、かつこの遺伝子の
末端イントロンを含む、３０５ｂｐのフラグメントＢａ
ｍＨＩ　−ＢａＱ　Ｉ、−９Ｖ　４０のゲノムから導か
れ、かつこのウィルスの初期アデニル化シグナルを含む
、１３ａｂｐのフラグメントＨｐａ　Ｉ　−ＢａｍＨＩ
、および プラスミドｐＢ１３２２［エフ・ポリバール（Ｆ、Ｂｏ
ｌｉｂａｒＸｌ　９７７）、ノーン（Ｇｅｎｅ）、２゜
９５−１１３）から導かれる。２６７２ｂｐのフラグメ
ントＢａｍＨｒ　−Ｐｖｕｌｌ。

次いで、フラグメントＨｉｎｄＩ［Ｉ−ＢａｍＨＩ（第
１図のコード要素の５°末端に位置するヌクレオチド配
列ＡＧＣＴＴＣＣＡＣＡＡＴＧＴＡＣＡＧＧは、コドン
ＡＴＧを封入するヌクレオチドの範囲で、エム・コザク
（Ｍ、Ｋｏｚａｋ）［（１９８４）、ヌクレイツク・ア
ッシッド・リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃａｄｓ　Ｒ
ｅｓ、）、１２．８５７−８７２］によって記載された
コンセンサス配列ＣＣＡＣＣＡＴＧＧに一致する配列を
与えるように、合成配列ＡＧＣＴＴＣＣＡＣＣＡＴＧＧ
ＣＴＡＧＧで置換される。これはプラスミドｐｓｖ７ｏ
３（第３図）を与える。

次いで、プラスミドｐＳＶ７０３のセグメントＨｉｎｄ
ｌＩＩ　−ＢａｍＨＩ　（その５°→３゛ストランドを
第１２図に示す）の上流部分に位置し、かつＩＬ−２の
天然前駆体の修飾シグナルペプチド（このシグナルペプ
チドは、コザク（Ｋｏｚａｋ）のコンセンサス配列に一
致する配列の採用のため、チロシン残基の代りに２位に
アラニン残基を含む）に対応し、同時に成熟ＩＬ−２の
第一アミノ酸に対応する配列を含むＨｉｎｄＩ［ＩとＨ
ｇ１ＡＩの制限部位の間のＤＮＡセグメントは、その５
゛→３°コード要素が第１１図に示される合成された二
本鎖オリゴヌクレオチドで置換される。

この合成配列はその９番目のヌクレオチドからｈＧＨの
天然前駆体の１種のシグナルペプチド（このシグナルペ
プチドのアミノ酸配列は第１１図に示され、各アミノ酸
は対応するコドンの上にある）（以下、ｈＧＨのシグナ
ルペプチドと略称する）および成熟ＩＬ−２の第一アミ
ノ酸をコードする。

得られたプラスミドはプラスミドｐＳＶ７０６（第４図
）である。前駆体は（ｐｓ−ｈＧ　Ｈ）　−Ｉ　Ｌ　−
２をコードする配列を有するセグメントＨｉｎｄＩＩ［
−ＢａｍＨＩを第１３図に示す。

最後に、プラスミドｐＳＶ７０６の１８５ｂｐのＥＣ０
ＲＩとＥ　ｃｏＲＶの制限部位間のフラグメントは、Ａ
ＴＣＣコレクションにＮＯ，３７１４６として寄託され
ている、プラスミドｐＳ　Ｖ　−ｄｈｆ’ｒ［ニス・ズ
ブラマ＝（Ｓ　、　Ｓ　ｕｂｒａｍａｎｉ）ら、（１９
８１）、モレキュラー・エンド・セルラー・バイオロジ
ー（Ｍ、ｏｌｅｃｕｌａｒ　ａｎｄ　Ｃｅ１ｌｕｌａｒ
　Ｂｉｏｌｏｇｙ）、１．８５４−８６４３から導かれ
る２６７７ｂｐのフラグメントＰｖｕｌＩ−ＥｃｏＲＩ
で置換される。

プラスミドｐＳＶ７２６は次のものを含む。

−前駆体（ｐｓ−ｈＧＨ）−１ｔ、　−２のための発現
単位。この単位はそのプロモーターとしてＳＶ４０の初
期促進剤を有する。それは（ｐｓ　−ｈＧＨ）ｉＬ−２
の前駆体をコードする配列の下流、マウスのアルファー
グロビンの遺伝子の第２イントロンを含む配列およびＳ
Ｖ４０の初期ポリアデニル化シグナルを含む。および 一一刊ｈ　ｆ　ｒのための発現単位。この単位はそのプ
ロモーターとしてＳＶ４０の初期プロモーターを有する
。それは、ｄｈｆｒをコードする配列の下流部、ＳＶ４
０のゲノム上にダブリュ、フィアーズ（Ｗ　、　Ｆ　１
ｅｒｓ）のメモによれば位置４６９３と４０８３におけ
るＭｂｏｒ位置間の配列を含むが、その配列はＳＶ４０
のｔ抗原イントロンを含み、およびＳＶ４０の初期ポリ
アデニル化シグナルを含む。この単位はプラスミドｐＳ
　Ｖ　２−ｄｈｆｒから導かれるフラグメントＰ　ｕｖ
ＩＩ　−ＥｃｏＲＩ中に含まれるＢ／プラスミドｐＳＶ
７２６の使用に関連した利点 比較実験を行った。

プラスミドｐＳＶ７０３、ｐＳＶ７２０（下記に示す）
およびｐＳＶ７２６を一時発現の条件下に試験した（方
法を参照）。各プラスミドによってトランスフェクトさ
れる細胞が能力としてもつＩＬ−２分泌レベルを評価す
るため、各培養上澄液のＩＬ−２タイプ活性を測定した
（上記のプロトコールによる）。

プラスミドｐＳＶ７２０（第５図）はプラスミドｐＳＶ
７０３の誘導体である。それは、プラスミド７０３の＋
８５ｂｐのＥｃｏＲＩとＥｃｏｒＶの間のフラグメント
を、プラスミドｐＳ　Ｖ　２−ｄｈｆｒから導かれる２
６７７ｂｐのフラグメントＰｖｕＵ−ＥｃｏＲ■で置換
することにより得られる。

それ故に、プラスミドｐＳＶ７２０とｐＳＶ７２６はｄ
Ｍｒのための同一発現単位を有する。両者は、ＩＬ−２
の前駆体のシグナルペプチドをコードするそれぞれのＤ
ＮＡ配列の点で異なるのみである。

この配列は、プラスミドｐＳＶ７２０の場合、ＩＬ−２
の天然前駆体のシグナルペプチドのバリアントをコード
し、プラスミドｐＳＶ７２６の場合、ｈＧＨのシグナル
ペプチドをコードする。

下記第１表はこの実験の結果を示す： 第１表 この表は、ｄｈｆｒのための発現単位をプラスミド（ｐ
ｓｖ７０３）に導入したことと関連して一時発現の条件
下に分泌の低下を示す（プラスミドｐＳＶ７２０）。そ
れは、ｒＬ−２の天然前駆体のシグナルペプチドのバリ
アントをコードする配列を、ｈＧＨのシグナルペプチド
をコードする配列（プラスミドｐＳＶ７２６）で置換す
ることによって、顕著に分泌レベルを改善し、ひいては
環プラスミド（プラスミドｐＳＶ７０３）について定量
されたものに実質的に均等なレベルに到達することが可
能となることを、明らかに意味している。

３、プラスミドｐＳＶ７４１ Ａ／観 プラスミドｐＳＶ７４１の構成はプラスミドｐＳＶ７３
９（第７図）にはじまる。

プラスミドｐＳＶ７３９は５種のＤＮＡフラグメントの
組立てにより導かれる。

−９Ｖ　４０のゲノムから導かれ、かつＳＶ４０の初期
プロモーターの一部を含む、７７７ｂｐのフラグメント
ＥｃｏＲＶ−Ｂｇｌｌ。

−プラスミドｐＬ１［エイチ・オカヤマ（Ｈ、Ｏｋａｙ
ａｍａ）とピー・バーブ（Ｐ、ＢｅｒｇＸｌ　９８３）
、モレキュラー・エンド・セルラー・バイオロジー（Ｍ
ｏｌｅｃｕｌａｒ　ａｎｄ　Ｃｅ１ｌｕｌａｒ　Ｂ　ｉ
ｏｌｏｇｙ）、３．２８０−２８９］から導かれ、かつ
、ＳＶ４０の初期プロモーターのフラグメントＥｃ。

ＲＶ−ＢｇｌＩの欠失部分および蛋白質ＶＰ２の後期メ
ツセンジャーＲＮＡ１９Ｓと蛋白質ＶＰ１［ダブリュ”
フィアーズ（Ｗ、Ｆ　１ｅｒｓ）（１９７８）、ネイチ
−？　−（Ｎ　ａｔｕｒｅ）、２７３Ｓ　１１３−１２
０］の後期メツセンジャーＲＮＡ１６ｓの両イントロン
を含む、２３９ｂｐのフラグメントＢｇｌＩ。

一すンカーＰｓｔＴ　−Ｈｌｎｄ［ｌによって拡張され
たプラスミドｐＳＶ７０６の５２１ｂｐのフラグメント
Ｈ１ｎｄｌｌＩ　−Ｂ　ａｍＨＩからなる、フラグメン
トＰｓｔ　Ｉ　−ＢａｍＨＩ　（第１３図）。このフラ
グメントは前駆体（ｐｓ−ｈＧ　Ｈ）　−ｒ　Ｌ　−２
をコードするＤＮＡ配列を含む。

−８Ｖ　４０のゲノムから導かれ、かつこのウィルスの
初期ポリアデニル化シグナルを含む９８８ｂｐのフラグ
メントＢｃｌ　Ｉ　−ＥｃｏＲＩおよび 一プラスミドｐＢＲ３２２から導かれる２２９５ｂｐの
フラグメントＥｃｏＲＩ　−Ｐｖｕｌｌ。

プラスミドｐＳＶ７４１（第９図）は、プラスミドｐＳ
Ｖ７３９のフラグメントＢ　ａｍＨＩ　−Ｅ　ｃｏＲＩ
を、フラグメントＰｖｕＩＩ−ＥｃｏＲＩで置換するこ
とによって得られるが、後者は、ＳＶ４０のゲノムから
導かれ、かっこのつ、イルスの初期ポリアデニル化シグ
ナルを含む９８８ｂｐのフラグメントＢｃｌ　Ｉ　−Ｅ
ｃｏＲＩとプラスミドのｐＳ　Ｖ　２−ｄｈｆｒから導
かれるフラグメントＰｖｕｌｌ−ＢｇｌＩＩとから組立
てて得られる。

プラスミドｐＳＶ７４１は下記のものを含むニー前駆体
（ｐｓ−ｈＧ　Ｈ）　−１Ｌ　−２の発現単位。

この単位はそのプロモーターとしてＳＶ４０の初期プロ
モーターを有する、それは、ＩＬ−２の訂駆体をコード
する配列の上流部、ＳＶ４０の２個のイントロンからな
る配列およびこの配列の下流部、ＳＶ４０の初期ポリア
デニル化シグナルを有する。および −ｄｈｆｒのための発現単位。この単位はＳＶ４０の初
期プロモーター、ｄｈｆｒをコードするＤＮＡ配列、お
よびこの配列の下流部、中間体イントロンなしのＳＶ４
０の初期ポリアデニル化シグナルを含有する。

Ｂ／プラスミドｐＳＶ７４１の使用に関連した利点 比較実験を実施した。

プラスミドｐＳＶ７３９、ｐＳＶ７４１およびｐｓｖ７
４２（下記参照）を−時発現の条件下（方法参照）にテ
ストした。

各プラスミドによってトランスフェクトされた細胞が可
能とするＩＬ−２分泌レベルを評価するため、各培養培
地のＩＬ−２−タイプ活性を測定した（上記プロトコー
ルに従う。）。

プラスミドｐＳＶ７４２（第１０図）はプラスミドｐＳ
Ｖ７３９から構成された。

プラスミドｐＳＶ７３９（第１３図）の２６０ｂｐのフ
ラグメントＨｉｎｄｌｌＩ　−Ｘｂａ　Ｉは、プラスミ
ドｐＳＶ７０３（第３図）の２４４　ｂｐ（第１２図）
のフラグメントＨｉｎｄＩＩＩ−ＸｂａＩによって置換
された。

得られるプラスミドはプラスミドｐＳＶ７４０（第８図
）である。

プラスミドｐＳＶ７４２は、プラスミドｐＳＶ７４０の
フラグメントＥｃｏＲＩ　−ＢａｍＨＩをフラグメント
ＰｖｕＩＩ　−ＥｃｏＲＩで置換することによって得ら
れるが、後者はプラスミドｐＳ　Ｖ　２−ｄｈｆｒから
導かれる１１０３ｂｐのフラグメントＢｇｌＩＩ−ｐｖ
ｕＩＩとＳＶ４０のゲノムから導かれ、かっこのウィル
スの初期ポリアデニル化シグナルを含む、９８８ｂｐの
フラグメントＥｃｏＲＩ　−Ｂｘｃ　１１との組立てか
ら導かれる。

それ故に、プラスミドｐＳＶ７４１とＩ）Ｓ　Ｖ　７４
２はｄＭｒのための同一の発現単位を有する。両者はＩ
Ｌ−２の前駆体のシグナルペプチドをコードするそれぞ
れのＤＮＡ配列の組成の点で異なるのみである。この配
列は、プラスミドｐＳＶ７４２の場合、ＩＬ−２の天然
前駆体のシグナルペプチドのバリアントをコードし、プ
ラスミドｐＳＶ７４１の場合、ｈＧＨのシグナルペプチ
ドをコードする。

この表は、ｄｈｆｒのための発現単位をプラスミドｐＳ
Ｖ７４０に導入することに関連して一時発現の条件下に
分泌の低下を示す（プラスミドｐＳＶ７４２）。それは
、ｒＬ−２の天然面駆体のシグナルペプチドのバリアン
トをコードする配列を、ｈＧ　Ｈのシグナルペプチドを
コードする配列（プラスミドｐＳＶ７４１）で置換する
ことによって、ＩＬ−２分泌レベルを顕著に改善するこ
とが可能となることを明らかに示す。

■、高高度生産性のあるセルラインの調整ＤＸＢＩＩの
Ｄ　ＨＰ　Ｒ−〇　ＨＯ細胞はプラスミドｐＳＶ７２６
とＩ）ＳＶ７４１のいずれかでトランスフェクトされた
。

エフ・グラハム（Ｆ　、　Ｇ　ｒａｈａｍ）　トエー・
ファン・デル・ニブ（Ａ、Ｖａｎ　ｄｅｒ　Ｅｂ）［（
１９７３）、ピロロジー（Ｖ　ｉｒｏｌｏｇｙ）、５４
，４３６−５３９）に記載された操作に従うた。

細胞を、１０％（Ｖ／Ｖ）子牛脂児血清、ゲンタマイシ
ン２０μｇ／ｍ１２．チロシン６０μｇ／ｍ（ｌおよび
し一グルタミン３００μｇ／ｎ＋Ｑを含む。アルファー
ＭＥＭ（ギブコ（Ｇ　１ｂｃｏ）Ｘ以下、非選択的培地
という。）中で最初に増殖させた。

洗浄過程を経て、直径１０ｃｍのペトリ皿に０゜８・１
０６の割合で前日に接種した細胞に非選択培地を加え、
さらにサケ精子ＤＮＡを加えることなしに、リン酸カル
シウムの存在下でプラスミドＩＯμｇを加える。このよ
うにして得られた細胞を３７℃で７時間培養する。

次いで、子牛脂児血清５％（ｖ／ｖ）を含む、アルファ
ーＭＥＭ中で、細胞を３７℃で３日間培養する。この培
養が終ったとき、細胞を、添加塩を含む最小必須の培地
からなり、製品Ｎｏ、０４１−１０９５でギブコ（Ｇ　
１ｂｃｏ）によって市販されている、培地を含むペトリ
皿に、皿当り５・１０５の割合で、分配する。にこで使
用される培地に添加したのは次のものである。ギブゴ（
Ｇｉｂｃｏ）の透析子牛胎児血清（１０％、ｖ／ｖ）、
ゲンタマイシン（２０μｇ／ｍＱ）、チロシン（５０μ
ｇ／ｍ□、Ｌ−グルタミン（３００μｇ／ｍｃ）および
Ｌ−プロリン（１５０μｇ／ｍ（２）。このように補足
して、この培地は、下に引用する選択的培地を構成する
。

このようにして得られた細胞は３７℃で２週間培養され
、なお選択的培地は３日ごとに更新する。

この培養が終ったときに観察されるコロニーは実際にプ
ラスミドを合体した細胞から主として導かれる。これら
のコロニーは分離され、再び別々に培養し、ＩＬ−２を
産生ずる能力を確認するために、ＩＬ−２タイプ活性を
測定することによりテストされる。

かくして、トランスフェクション後に、プラスミドｐＳ
Ｖ７２６を有する、３４７コロニーを単離し、陽性であ
ることを認めた。

最も生産性が高いコロニー（初期細胞数４・１０５から
始まり、４日後に測定したところ、ＩＬ−２３５０００
〜５００００単位／ｍ（２）を培養した。細胞を４種の
組成の選択培地で連続して継代培養し、各培地は、エフ
・アルド（Ｆ、Ａｌｔ）ら、［（１９７８）、ジャーナ
ル・オブ・バイオロジカル・ケミストリイー（Ｊｏｕｒ
ｎａｌ　ｏｆ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｃｈｅｍｉｓｔ
ｒｙ）、２５３．１３５７−１５７０３により記載され
た方法にて、前の培地よりも高濃度（０゜０２．０．０
５，０．１、次いで０．２μＭ）のメトトレキセート（
アメトブテリン、シグマ（Ｓ　ｉｇｍａ））を含有した
。この操作の終末段階で、数種の高生産性ラインを選ぶ
ことができた。

すなわち、プラスミドｐＳＶ７２６でトランスインフェ
クトされた、ライン１０９．１２は、培養４日後に、活
性で表現して、ＩＬ−２分泌レベル２５００００単位／
ｍ（ｌの能力がある。

■、ラインによって分泌されたＩＬ−２の特徴付丈 ■章に記載した高生産性ラインの大規模培養は培養した
上澄液を処理し、他の成分を分離したのち、特徴付けが
できる程度の十分な量の、細胞によって分泌された蛋白
質を提供した。

１、ＩＬ−２の精製 ＩＬ−２は培養上清１リツトルから精製した。

上澄液をまず蟲縮し、予め０．０５Ｍ酢酸アンモニウム
でｐＨ４，５に平衡化したセファロース（Ｓｅｐｈａｒ
ｏｓｅ）　（商標）アガローズ（エスーファストフロウ
ーファルマシア・ファイン・ケミカル（Ｐｈａｒｍａｃ
ｉａ　Ｐｉｎｅ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ）、スウェーデン）
のカラムによるイオン交換クロマトグラフィーで最初の
精製に付す。溶出は、０．５ＭのＮａＣσ、次いで０゜
５ＭのＮａＣｌ２を加えた。０．０５Ｍ酢酸アンモニウ
ム（ｐＨ５、５）を用いて行われる。

ＩＬ−２タイプ活性の測定により生物学的に活性がある
と認められた、溶出フラクションを合せ、合せたフラク
ションのプールを逆相カラムによる液体クロマトグラフ
ィーに付す。選ばれた担体はＣ３−グラフトしたシリカ
ゲルである。カラム寸法は１．０Ｘ２５．ｏｃｍである
。

溶出は、０．１％Ｃｖ／ｖ）のトリフルオロ酢酸を含む
水溶液中５〜１００％（Ｖ／Ｖ）直線勾配のアセトニト
リルで流速４ｍ１２／ｍｉｎで８０分間行う。

生物学的に活性な溶出フラクションを合せ、合せたフラ
クションのプールを、寸法２．ｌＸｌ０゜Ｏｃｍのカラ
ム中Ｃｉ−グラフトしたシリカゲルにて、上記と同じ条
件、とくに溶出条件で上記と同じタイプのクロマトグラ
フィーに付す。

生物学的活性をもち、ドデシル硫酸ナトリウムの存在下
にポリアクリルアミドゲルによる電気泳動（レムリ（Ｌ
ａｅｍｌｉＸｌ　９７０）、ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ
）、２７７．６８０−６８５３の結果によればＩＬ−２
純度９５％以上を有する、このクロマトグラフィーから
集めた溶出フラクションのプールは、ＩＬ−２を特徴付
ける物質を構成する。

２．７ミノ末端配列の定量によるＩＬ−２の特徴付は 処理すべきサンプルを、ヘキサジメスリンプロミド（ま
たはポリブレン）フィルターの表面上におく。フィルタ
ーを、クロマトグラフ（モデル１３０Ａ−アプライド・
バイオシステムズ（Ａ　ｐｐｌ　１ｅｄＢ　ｉｏｓｙｓ
ｔｅｍｓ））を備えた蛋白質シークエンサー（モデル４
７０Ａ、アプライド、バイオシステムズ、米国）に導入
する。これは結局生成したフェニルチオヒダントイン酸
誘導体を分析する。

この定量の結果は、天然物について既に公開されている
配列と一致する［アール・ロッゾ（Ｒ，Ｒ。

ｂｂ）ら（１９８４）、プロシーデインゲス・ナショナ
ル・アカデミ−・オブ・サイエンス・ニーニスニー（Ｐ
ｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ）、８１
，６４８６−６４９０　コ。

この配列のはじめの１０個のアミノ酸は次のとおりであ
る； Ａ　１ａ−Ｐｒｏ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−３ｅｒ−
Ｔｈｒ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−ＴｈｒアラニンはＮ−末端の
位置で検出される唯一の残基である。これは、前駆体（
ｐｓ−ｈＧＨ）　−Ｉ　Ｌ−２が分泌中に誤りなく切断
されることを確認させる。

結論として、これらの実施例は、発現に必要な手段を用
いて、ジヒドロフオレートレダクターゼをコードする配
列を有するベクターによる細胞トランスフェクションに
基づいて、選択および／または増幅のシステムに固有の
性質を利用することによって、インターロイキン２の製
造のために確信をもって真核細胞の使用を可能とする、
発明の価値を明白に示す。

【図面の簡単な説明】

第１図は、ヒトＴリンパ球ＩＬ−２前駆体を暗号化する
メツセンジャーＲＮＡに相捕的なりＮＡをクローンして
得たＤＮＡ配列である。 第２−１０図は、それぞれ、ベクターｐＳＶ７００、ｐ
ＳＶ７０３、ｐＳＶ７２０、ｐＳＶ７０６、ｐＳＶ７２
６、ｐＳＶ７３９、ｐＳＶ７４１．ｐｓｖ７４０および
ｐＳＶ７４２の構成を示す図である。 第１１図は、ＨｉｎｄＩ［［と８ｇ１ＡＩ制限部位間の
ＤＮＡセグメントを置換する合成２本鎖オリゴヌクレオ
チドを示す。 第１２図は、ｐＳＶ７０３のセグメントＨｉｎｄＩ［Ｉ
−ＢａｍＨＩのストランドを示す。 第１３図は、前駆体（ｐｓ−ｈＧ　Ｈ）　−Ｉ　Ｌ　−
２コ一ド配列をもつセグメントＨ１ｎｄＩＩ［−Ｂ　ａ
ｍｌ−１１を示す。 第１３図はプラスミドｐＳＶ７０６の５２１ｂｐフラグ
メントＨ１ｎｄＩＩＩ　−Ｂ　ａｍＨＩの配列を示す。 ＭＥＴ　ＴＹＲＡＲＧ　Ｍε ５’　　　ＡＧＣＴＴＣＣＡＣＡ　　　ＡＴＧ　　ＴＡ
ＣＡＧＧ　　ＡＴしＥＵ　　ＳＥＲＬＥＵ　　ＡＬＡ　
　ＬＥＵ　　ＶＡＬ　　ＴＨＲＡＳＮＣＴＡ　ＡＧＴ　
ＣＴＴ　ＧＣＡ　ＣＴＴ　ＧＴＣＡＣＡ　ＡＡＣＡＣＡ
　　Ｌｙｓ　　ＬＹＳ　　ＴＨＲＧＬｒｌ　　ＬＥＵ　
　ＧＬＨＬＥＬＪＡＣＡ　ＡＡＧ　ＡＡＡ　ＡＣＡ　Ｃ
ＡＧ　ＣＴＡ　ＣＡＡ　ＣＴＧＧＬＮ　ｌ’ｔεＴ　Ｉ
ＬＥ　ＬＥｕ　ＡＳＮ　ＧＬＹ　ＩＬＥ　ＡｓＮＣＡＧ
　　ＡＴＧ　　ＡＴＴ　　ＴＴＧ　　ＡＡＴ　ＧＧＡ　
　ＡＴＴ　　ＡＡＴＴＨＲＡＲＧ　１４εＴＬευＴ）
ＩＲＰ）ＩＥ　ＬＹＳ　Ｐ）ｌεＡＣＣＡＧに　ＡＴＧ
　ＣＴＣＡＣＡ　ＴＴＴ　ＡＡＧ　ＴＴＴＧＬＵ　　Ｌ
ＥＵ　　Ｌｙｓ　　ＨＩＳ　　ＬＥＵ　　ＧＬｒＪ　　
Ｃｙｓ　　ＬＥＵＧＡＡ　ＣＴＧ　ＡＡＡ　ＣＡＴ　Ｃ
ＴＴ　ＣＡＧ　ＴＧＴ　ＣＴＡＴ　ＧＬＮ　ＬＥＵ　Ｌ
ＥＵ　ＳＥｓ　ＣＹＳ　ＩＬＥ　ＡＬＡＧ　ＣＡＡ　Ｃ
ＴＣＣＴＧ　ＴＣＴ　ＴＧＣＡＴＴ　ＧＣＡＳＥＲＡＬ
Ａ　ＰＲＯＴＨＲＳＥＲＳＥＲ５ＥＲＡＧＴ　ＧＣＡ　
ＣＣＴ　ＡＣＴ　ＴＣＡ　ＡＧＴ　ＴＣＴＧＬＵ　　）
Ｉｔｓ　　ＬＥＵ　　ＬＥＬＩ　　ＬＥＵ　　ＡＳＰ　
　ＬＥＬＪＧＡＧ　ＣＡＴ　ＴＴＡ　ＣＴＴ　ＣＴＧ　
ＧＡＴ　ＴＴＡＡｓＮ　ＴＹＲＬ、ＹＳ　ＡＳＮ　ＰＲ
ｏ　Ｌｙｓ　ＬＥＵＡＡＴ　　ＴＡＣＡＡＧ　　ＡＡＴ
　　ＣＣＣＡＡＡ　　Ｃ丁ＣＴＹＲＭＥＴ　ＰＲＯＬｙ
ｓ　　ＬＹＳ　　ＡＬＡ　　ＴＨＲＴＡＣＡＴＧ　ＣＣ
ＣＡＡＧ　ＡＡＧ　ＧＣＣＡＣＡＧＬＬＪ　　ＧＬＵ　
　ＧＬＵ　　ＬＥＵ　　ＬＹＳ　　ＰＲＯＬＥＵＧＡＡ
　ＧＡＡ　ＧＡＡ　ＣＴＣＡＡＡ　ＣＣＴ　ＣＴＧＯよ Ｕ− （Ｄｄ− −ｂ　　　　　　　　　　　　　目 ”ＲＧＬＹ　ＳＥＲＡＲＧ　Ｔ）ＩＲＳＥＲＬεＵＡＣ
Ａ　ＧＧＣＴＣＣＣＧＧ　ＡＣＧ　ＴＣＣＣＴＧしＥＵ
　　ＰＲＯ丁ＲＰ　　ＬＥＵ　　ＧＬＮ　　ＧＬＵ　　
ＧＬＹＣＴＧ　（ＣＣＴＧＧ　ＣＴＴ　ＣＡＡ　ＧＡＧ
　ＧＧＣＴ）ＩＲＬＹＳ　　ＬＹＳ　　Ｔ）（ＲＧ＋−
Ｎ　　ＬＥＵ　　ＧＬＮＡＣＡ　ＡＡＧ　ＡＡＡ　ＡＣ
Ａ　ＣＡＧ　ＣＴＡ　ＣＡＡＧＬＮ　ＭＥＴ　ＩＬ５　
ＬＥＵ　ＡＳＮ　ＧＬＹ　　ＩＬＥＣＡＧ　ＡＴＧ　Ａ
ＴＴ　ＴＴＧ　ＡＡＴ　ＧＧＡ　ＡＴＴＴＨＲＡＲＧ　
　ＭＥＴ　しευ　丁）（ＲＰＨＥ　　ＬｙｓＡＣＣＡ
ＧＧ　ＡＴＧ　ＣＴＣＡＣＡ　ＴＴＴ　ＡＡＧＥＴＡＬ
Ａ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 （１）発現に必要な手段と共に、ジヒドロフオレートレ
   ダクターゼコード化ＤＮＡ配列およびシグナルペプチド
   がヒト生長ホルモン天然前駆体の１種のそれであるイン
   ターロイキン２ハイブリッド前駆体コード化ＤＮＡ配列
   を含む、インターロイキン２産生真核細胞。 （２）ハイブリッド前駆体コード化ＤＮＡ配列が、シグ
   ナルペプチドがヒト生長ホルモン天然前駆体の１種のそ
   れであるヒト起源インターロイキン２コード化ＤＮＡ配
   列である、請求項１記載の真核細胞。 （３）ＣＨＯ細胞である、請求項１または請求項２記載
   の真核細胞。 （４）発現に必要な手段と共に、ジヒドロフオレートレ
   ダクターゼコード化ＤＮＡ配列およびシグナルペプチド
   がヒト生長ホルモン天然前駆体の１種のそれであるイン
   ターロイキン２ハイブリッド前駆体コード化ＤＮＡ配列
   を同時に有するベクターによって真核細胞をトランスフ
   ェクトし、次いで各々が前の培地よりも高濃度のメトト
   レキセートを含む連続培地中で生育させることにより、
   インターロイキン２を産生するトランスフェクト細胞を
   選択することからなる、請求項１〜３のいずれか１項記
   載のインターロイキン２産生真核細胞の製造法。 （５）真核細胞がＣＨＯ細胞である、請求項４記載の方
   法。 （６）ベクターがジヒドロフオレートレダクターゼおよ
   びインターロイキン２前駆体に対する１個の発現単位の
   みを有する、請求項４または請求項５記載の方法。 （７）ベクターが、一方がジヒドロフオレートレダクタ
   ーゼに対するもので他方がインターロイキン２前駆体に
   対するものである２個の別々の発現単位を有する、請求
   項４または請求項５記載の方法。 （８）ハイブリッド前駆体が、シグナルペプチドがヒト
   生長ホルモン天然前駆体の１種のそれであるヒト起源イ
   ンターロイキン２コード化ＤＮＡ配列である、請求項４
   〜７のいずれか１項記載の方法。 （９）ベクターがプラスミドｐＳＶ７２６およびｐＳＶ
   ７４１のいずれか一方の特徴を有する、請求項４〜８の
   いずれか１項記載の方法。 （１０）発現に必要な手段と共に、ジヒドロフオレート
   レダクターゼコード化ＤＮＡ配列およびシグナルペプチ
   ドがヒト生長ホルモン天然前駆体の１種のそれであるイ
   ンターロイキン２ハイブリッド前駆体コード化ＤＮＡ配
   列を有する、発現ベクタ（１１）ジヒドロフオレートレ
   ダクターゼおよびインターロイキン２前駆体に対する１
   個の発現単位のみを有する、請求項１０記載のベクター
   。 （１２）一方がジヒドロフオレートレダクターゼに対す
   るもので他方がインターロイキン２前駆体に対するもの
   である２個の別々の発現単位を有する、請求項１０記載
   のベクター。 （１３）プラスミドｐＳＶ７２６およびｐＳＶ７４１の
   いずれか一方の特徴を有する、請求項１０〜１２のいず
   れか１項記載のベクター。 （１４）インターロイキン２産生真核細胞を培養し、そ
   の培養培地を集め、培地中に含まれるインターロイキン
   ２を他の成分から分離することからなる方法であって、
   培養細胞が、発現に必要な手段と共に、ジヒドロフオレ
   ートレダクターゼコード化ＤＮＡ配列およびシグナルペ
   プチドがヒト生長ホルモン天然前駆体の１種のそれであ
   るインターロイキン２ハイブリッド前駆体コード化ＤＮ
   Ａ配列を同時に有するベクターによってトランスフェク
   トされ、次いで、各々が前の培地よりも高濃度のメトト
   レキセートを含む連続培地中での培養によって選択され
   た、真核細胞に由来するものである、インターロイキン
   ２の製造法。 （１５）請求項１４の方法によって得られたインターロ
   イキン２。