PT88372B - Celulas eucarioticas recombinamtes produtoras de interleuquina-2,processo e vectores para a sua obtencao e processo para a obtencao de interleuquina-2 - Google Patents

Description

PROCESSO PARA A OBTENÇÃO DE CÉLULAS EUCARIÓTICAS RECOMBINANTES PRODUTORAS DE INTERLEUQUINA-2, VECTORES PARA A SUA OBTENÇÃO E PROCESSO PARA A OBTENÇÃO DE INTERLEUQUINA-2»

invento dis respeite igualnonfce ao processo o aos vectores para a obtenqão destas · células assim coso ao processo de ©btoagão da interleuquina-2 a partir daquelas# í

prosonto invento dis respeito a có lulas oucarióticas reoosMnatttos produtoras d© interlouquina-2. Dis respeito igualmente a toa processo e voctores para a obtenção destas células. ?inalmento, ta© tamfoém co;;ío objectivo a obtenção de intcrlouquina-2 pondo om cultura as referidas células*

As células oucarióticas de accrd oom o invento contos» com os maios necessários à sua esspressão, uma sequência d© SITA codificadora da di-hidro£olato rodutaso © uma sequência do 3ΠΑ codificadora do um precursor Mbrido da intorleuquina 2 o cujo peptideo sinal ó o do ura dos precursores naturais da hormona de crescimento umana.

As células cncariáticas recorabinantos são obtidas polo processo qu© consiste em transfectar células eucariéticas cora a ajuda de w vector tendo, com os meios necessários à sua expressão, mia sequência do DITA codificadora da di-hidrofolato redutase o uma sequência do DITA codificadora de um precursor híbrido da interlouquina 2 cujo poiitidoo sinal o o do um dos precursores naturais da hormona do crescimento humana e em seleooio nar as células transformadas» produtoras d© interleqnina 2, por croscimonto era nexos sucessivos, apresentando cada um era relação ao anterior uma concentração acrescida d© mofcotrexafco»

A intorloucuina 2 é uma linfoquina ϊ é secrotada pelos liafóoitos T maduros de raaraiferos como rosposfca a uma activação por ura antigénio ou um composto mitosonico. 31a dosemponha ura papel essencial ao agir sobro a proliferação © diferenciação do diferentes tipos de células implicadas nas respostas imunitárias (Aobb, A.J, (148¾) Immonola J3» 203-209).

Δ intorlougwina 2 do origem humana foi mais pax-ticulasmonto estudada, Dis-so qu© so trata do uma pro boina do 133 aminoácidos tondo, fisado no residuo trooniua da posição 3, ua iotra-saoárido (conraât, IX, S, ot al., (193=5) Oarbohydr. &©s. l4õs ^13-^50). Os linfócitos f maduros sintetizai-se prissiiO sob a forma de um precursor do 153 aminoácidos o socrotam-na após eliminação por corto, ao nivol ao roticulo ondoplasmático do poptidoo sinal do 20 aminoácidos, depois após glicosilação ao aparo lho do Oolgo, sob a forma do uma protoina do 133 Sfflinoácidos-designada protoina madura glicosilada.

&& propriedades biológicas da inicrlouquina-2 do origem humana dostiaam-na a uma uti lifiação como principio activo do medicamentos uiois no tratamento do doenças tais como canoros o cortas doonças infecoi) sas ou parasitoros. Para esta utilisação pareço preferivel dispor de intorlouquina-2 sob a forma glicosiladas a cadeia lateral dc açúcar pároco contribuir cora ©feito para ostabilisar a protoina o para melhorar a tolerância quando da sua administração a pacientes*

A obtenção do interleu.quin.a-2 a partir do linfócitos periféricos sãos (Kriep, Β.M. et al (l9SA*) 3ur. J. Biochem. 1^3, 199“203) seja do uma linha co lular linfobastóido como soja a linha Jutfkai (itobb, S.J, ot al (1983) froc. Hatl. icad. Sei, USA, CO, 5990-599¾) foi descrita.

Os métodos utilisados são gs gorai pouco adaptados devido às dificuldades ligadas à cultura do linfócitos sãos o à necessidade cie uma fase ds indução.

Conseguiivamente à clonagem do ura ΠΒΛ complementar codificador do iatafleuguina 2 (Tanigucbi, f, et al (l>f3), Kature, 302, 303-310) foi descrita a utilização do microorgaaiemes tomados aptos para a produção dc interXo«quina 2 graças a técnicas do engenharia genética. 0 podido do patonto 25?» A»0039 0é2 mostra a possibilidade do utilisar além da bactéria Bachoriobia coli incapas de glicosilaçao células cie macaco COS. 0 pedido do patonto BP-A-0172619 apresenta a «ti lisa-cão de diversas outras células animais, ©atro as quais principalmont© as células dc ovário de hamster chinês (células ΟϊΐΟ).

Sabe-se ainda que para permitir numa tranfseção por em evidência, dentro do «ma população d© células oucariéticas, as células qu© integraram efectivcwaenfco um vector particular, © util que o referido vector soja portador do una sequência do ΙΈ-ΐΛ cuja expressão possa conferir as células transfectadas uma vantagem selectiva»

Wa sequência d© 381 particular» monte adequada é ima sequência codificadora da di-hidrofolato redutaso (ensina daqui em diante designada pela abreviatura dlifr); descrita por Subranani, et al (l38l) Mol. Col. Biol. 89&-S04) tal sequência, inserida num vector de expressão, permito apos transfocção do células incapazes do sintotisar sob uma forma funcional a dhfr (células DIER*) o croscimonto num meio deficiente em hipoxantina, era glicina o em timidina, as únicas células qu© incorporaram efoct ivamente o vector.

interesso relativo à utilis&çã do ura voctor tendo, cora os meios necessários à sua espressão, uma sequência de ΞΗΑ codificadora da dhfr é acentuado polo facto que cia podo estar na erigem quer a células eucariotica tranafectada soja oapas (células ®Κφ) ou não (cábulas DIlPíC) do eintetisar sob «ma forma funcional a dhfr do ura procosso de araplificação que condusa à obtenção aumentada do uma proteína coa in&orosse codificada por uma sequência do DNA inserida, eoc os meios necessários à sua expressão, ao referido vector, 0 mecanismo desta amplificação não á conhecido. Saho-se quo a dhfr é inibida polo composto conhecido pela designação metotroxate (áoido Σ7-{ (((diamino-2,^-ptericliail-ó)motil)mQti lamino-)k» -bonuoil)L-f lutêxuico) o quo a presença do mototrexatc num meio do cultura solectivo eondus à morte da maior parto das células o que só sobrevives a© células capasoo do sinteti* ar quantidades suportantos do dhfr. Poi constatado (Kaufman, P_MJ. ot al (1982) J. Hol, Siol. 159, SOl-<$2l) nas células tendo incorporado usa vector contendo, con os roios necessários à aua expressão, uma sequência do DNA codificadora da dhfr e uma soqaônoia de SNA codificadora do uma outra proteína, ano esta produção amplificada da referida protoi.ua, roquox’onto, tendo construído vectores tendo simultaneamente, coe os meios necessários à sua oxprossão, una sequência de DNA codificadora de w precursor natural de «ma iaterleuquina 2 0 na sequência de DNA codificadora da dhfr, constatou quando â& cultura de células ouearioticas (0 particularmente células Clíõ) tendo incorporado um dos vootoros referidos, que tais veetoros nao permitiam, os condições de expressão transitória, ou so^a ant os da selecção do um linha altament© produtora por cultura em meios sucessivos apresentando um on relação ao antoriox¹ um concentração acrescida de nefcotroxato, a recolha a partir do moio do cultura senão de quantidades do ixitorleuqui.ua. 2 inferiores às recolhidas do meio de cultura do células da mosraa naturosa tendo incorporado vector diferindo apenas na ausência da sequência do DNA codificador da dhfr o meios necessários à expressão dosta sequência.

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3stes resultados, se bem qu© oncorajadores rolativasaente às qnantidades d© interleuquáLna 2 obtidas após cultura do linfóoitos periféricos sãos ou células lir.fobhstéides, mostraram quo oontrax’iamente ao quo fvt constatado oom outras pretoiaas tais como o antigénio do superfície do vírus da hepatite S ou hormona de eroscimor.to humana, não foi possivel para a obtenção de interleuqulna 2 tirar todo o interesse esperado da utillssaÇão do uma sequência cie DJTA codificadora da dhfr acompanhada dos meios noeossários a sua onpressão.

Prosseguindo as suas investigações o roquorento dosto podido do patente constatou, do maneira surpreendente, a substituição, nos primeiros ναοί ores tostados, ao nivol da sequência de 1SU codificador do precursor da intorleuquina 2 da parte codificadora do seu poptideo sinal por um sequência codificadora do peptidoo sinal do un dos prooursoiOs naturais da Siomona de croscirionto humana (protoina daqui es dianto designada pela abroviatura hGZí), xaermitiu melhorar de maneira significativa o uivo? do secreção o aosmo, oom cortas construções encontrar o nivol inicial esperado, 0 requerente desoreve assim uma solução quo, satisfasendo os critérios quo lhe cabem, pormito considerar uma produção à osoala industrial do infcorlouqr.ina-X .

Be acordo oom um primeiro aspecto, o invento ostá relacionado piOoisamente com células eucariotas recombinantes produtoras de intorleuquina 2 quo conton, com os meios necessários a sua expressão, um sequência de DNA codificadora da dí-hidrofolato rodutaso o uma sequência de 35J7Â codificadora de m precursor híbrido da interleuquina 2 cujo popti&oo sinal o o de um dos precursores naturais da hormona de crescimento humana.

Tem igualmente por objectivo um procosso do olrionção das roferidas células consistindo on l) transfoctar células eucariéticas oom a ajuda do um vootor tondo, con os meios necessários à sua expressão, uma sequência do DDA codificadora do di»Mdro&oXato redutase o uma sequência. do 53ΠΑ codificadora do ps»o cursor híbrido da intorleuquian 2 cujo poptidoo sinal é o do taa dos precur soros naturais da hormona do crescimento humana, seguido do 2) solocoionar as células transfeotadas produtoras d® interleuquina 2 por cultura em meios sucessivos apresentou’o um em relação ao outro anterior «na concentração acrescida do metotrexato,

Dirulmexbo, teia non objectivo o procosso de obtenção do interlenquira 2 consistindo oa pôr em cultura células oucariéticas produtoras da interlenquina-2, recolher o meio de cultura e separar a interleuquina 2 dos outros constituintes do roforido meio, processo no qual as células postas em cultura derivam d© células encarioticas transfoctadas com a ajuda do um vector tendo por sua vos, com os meios necessários à sua expressão, uma sequência de 3ΪΙΑ codificadora da di-hidrofolato rodutase © uma sequência do DÃTA codificadora do ua precursor híbrido na intorlouquina 2 cujo xieptideo sinal é o de um dos precursores naturais da Ixomona de crescimento humana, depois seleccionadas pela cultuta om meios sucessivos tendo um es relação ao anterior uma concentração acrescida do metotrexato.

Deve-se precisar que o referido procosso pode sor aplicado, não somente o de maneira particularmonte adoquada ã obtenção de ínterlouquina 2 humana, mas iguoJncnto na obtenção do interleuquina 2 de outras origens animais, na medida em que tais moléculas poderão apresentar un interesso «articular justificando uma aplicação industrial, por oxoraplo na qualidade de agente do. diagnóstico ou do principio activo d© um medicamento principalmento para usar ©a veterinária

ISsfco processo do st ina- se pzin* cipalmonto a permitir a obtenção do interleuquina 2 glicosilada tal oomo ó socrotada polos linfécitoo T produtoras naturais. Dovo-oe notar ano esto procosso é igminonte adequado à obtenção do formas incompletaiaente glicosilados ou não glicosiladoc do int orla uqnina 2 presentes no moío após cultura do células oucaríóticas do acordo cos o invento»

As células eucarióticas úteis na oxccução do invento são células do origem anisai capazes do fazer glicosílação. Entre estas células» as células vulgarmonte designadas cem o nome 030 por referencia à sua origon (células do ovário do hamster chinês) são particularmente adequadas.

As técnicas ligadas â utilização dostas células, quor se trate da sua propagação ou da sua tranofoeção polos vootoros oa ainda da selecção das células ©fioaznente transfeotadas, sao conhecidas dos familiarizados con a matéria. Algumas delas serão descritas dotalbadanont© suando da apresentação dos exemplos.

Os vectores necessários à execução do invento podes apresentar diversas formas« Podo-so tratar de todo um gonoma virai ou parte dele & particularmente do gonosia de um rotrovirus ou de um plasmídeo oa ainda do ua cossdCdeo. 2$ vantajosa a realização do invento cor; na plasmidoo.

Os vectores de acordo com o invento portadores dos meios nocossários â oxprossão do una sequência do SNA codificando a di-hidrofolato redutase o uma soqnencia dc DBi codificadora de um precursor híbrido da intorlouquina 2 (procnrsos fiaínxi om diante designado sxn^élicanan&o polu notação j (ps-2ιΉ)-intorlouquina 2) cujo po’->«.id”io sinal ό o do tua dos precursoras naturais da hGn.

Λ part© codificadora correspondendo ao peptideo sinal podo tor isn das sequências quo P'mito a degenerescência do código gonóticos «a mo smo aminoácido- oxcepto a motionina - podendo sor codificado por 2,3 4 ou mosmo, para alguns, 6 codSos. Ote. sequência do nuclooti-Όοσ proferida codificando o peptideo sinal ps-hGÍI 4 a apro sentada na figura 11 onde foi anotado para cada um dos 2ó coclóos, o aminoácido correspondente· xis referidas sequências d©

DNA podon sor inclusas numa laosrna unidade do expressão.

Do uma manoira vantajosa cada uma d©las pertence a uma unidade do oxprossâo autónoma» Os moios nocossários para a oxprossão dootas sequências sao escolhidos entro os goraimonto utiliuadoo para a construção do vootoros destinados à transfocção do cólulas eucarioticas* Do urna manoira pre* fox-ida elas dorivan do gonoma do vírus SV4o a partir do qual podom ser preparadas sequências de DNA incluindo em particular o promotor precoco e/ou o sinal proooco de poliadonilapão (?iors, TT. (l$7S) Kature, 2?3, 113-120),

A construção do vectores de acox* do com o invento utilina técnicas do conhecimento geral»

Devo-so notar que ao quo respoita à sequência do DITA codificadora do precursor (ps-hfr^Tl)«intorlouquina 2, ó intorossanto preparai ukí DNA comple montar (rofoi-inde-so per exemplo aos trabalhos de Taniguchi f. ot al ((1923) Nature» 302, 305-310) ou ainda aos do Dovos. A. et al ((l<?83) Nuclclc Acids Aos. 11, 4307-4323) do RITA mensageiro de linfócitos T codificadores cio precursor natural da intorlouquina 2 © dopeis substituir a sequência codificadora do sou xxoptidoo sinal por uma sequência cedi· ficadora do poptidoo sinal do ur?. dos precursores naturais da hGH.

Dois voctoros proferidos, cons* truidos tondo ora vista a obtenção do intorlcuquina 2 de origem humana são os jilasnidoos pSV (figura ó) o pSV7’êl (figura 9). Dlos possuora cada um, uma unidade de expressão para α dhfr o uma ruiidado do expressão para ura precursor (ps-hGhJ-interlouquina-SJ Os dois plasmídeos diferem principlaraonte pela presença, naturosa o posição de intrões nas unidados do eanrossão. liais xn-ocisaraonto o plasmideo pSV7&á possui ura intrão a jusante da soquoneia codificadora do precursor (ps-hGn)-intorlouquina 2 assim como ura intrão a jusante da sequencia codificadora da dhfx·. O plasmideo pSV7*íl possui ao contrário ura intrão a montante da sequencia codificadora do procursor (ps-hGH)-intorlcuquina S o não apresenta qualquer intrão ao nivol da sua subunidado de expressão para a dhfr.

De acordo ainda cora ura outro aspecto, o invonto dia rospoito a linhas celulares soleccionadas a partir de oólulas eucarióticas» toado incorporado um voctor do acordo com o invento, pola cultura das reforidas cólulas ora raoios sucossivoo, apresentando um om relação ao anterior uraa concentração acrescida do raotetroxato. Prossoguo-so as passagens do ura meio a outro ate não so constatar mais amplificação da secreção de 1D-2» □oguo-so a apresentação de exemplos de execução do invento. Dlos são dados apenas a titulo ilustrativo o não são liraitantos era caso algara.

EXEMPLOS

São aqui apresentados seguidamonto a titulo do exemplos dois voctoros de acordo eom o invonto tostados om condições de expressão transitória*

Λ obtonção do linhas celulares altanonto produtoras seguida da caractorisação da intorlouquina % de origem humana (daqui em dianto designada pela abreviatura. XL-2) produzida são om soguida descritas»

I- Construção o Ensaio em condições de expressão transitória do dois vectoresí Os plasmídeos PSV ?2Ó o PSV

1. Métodos

A/ Construção .dos Vootoros

A construção doo vootores comproonde particularmentc o isolamento de fragmentos do DNA com a ajuda de enzimas de restrição a partir de vectoros pro-oxistenfes» a sintose por via quimica de oligonuclootideos, montagem- ovontualmonte anos modificação dos seus extremos- dos diversos fragmentos utilisando uma enzima como soja a DNA-ligase do haetoriéfago ft, a selecção por clonagem - apos transformação bacteriana cm Sschorlchla coli - dos vectores seguido da sua purificação.

À construção utilisa técnicas bom conhecidas

Bstas técnicas estão descritas na obra intitulada Holecular Clonlng; a Laboratory Manual do

Ilaniatis, ot al publicada era 193-7 pelas Skliçoes Qold

Spring Harbor Xtross eia Hov? York (3.U.A. ).

conjunto de onniraas de restrição necessário à construção dos vectores atrás apresentados o coraorcialiaado principalraonto pela Sociedade Hev Bngland Biolabs ).

A XJHA-ligase do. baoteriáfago T4 pode sor adquirido á Sociedade ZTor Sngland Huclear (3.V.A.).

Λ construção dos vectores © explicada cora a ajuda das íguras 3 a 10 para as quais se adoptou a legenda seguinte:

sequência do DNA retirada do plasmideo pBS322 sequência do 32Ά derivada do genoma do vírus SY^O sequência de DNA derivada do seno codificador da alfa-globina de murganho.

HindIII BamHI

HindIII BamHI

EMSAS3 sequência de DNA constituindo a sequência codificadora do procur sor natural da interXouqúina 2 humana ou a sua variante em quo um residuo alanina foi substituído por um residuo tirosina na posição 2.

sequência de DNA constituindo a sequência codificadora do precursor (ps-liGH)-IL-2.

sequência do DNA codificadora da dhfr.

Obtenção de tuna sequência dc DXiA codificadora do Precursor natural da intcrlouquina 2 do origem humana».

Olcnou-sc «is WA complementar do PITA mensageiro codificando α 21—2 isolado a partir cie linfócitos T humanos.

A sequência nucleotidica assim obtida, os nuclootideos sendo agrupados por codões por cima dos quais so colocou os aminoácidos correspondentes do precursor, ostá inclusa na sequência do DITA (cadeia 5’-3’} apresentada na figura 1.

C/ Manipulação do Oólulas Shxcari óticas a-Uscolha

A escolha recaiu sobro a estirpo Dx3 11 do cólulas CHO DIEPE-soleccionada por TJrlauh,

G. o Chasin, 1. ((ipSO) Proc. Matl. Acad. Sei. USA, 77, 4216-^220).

b- Modo do obtenção da expressão transitória protocolo descrito por Sompayrac, L o Danna, K. ((ipGl) Proc. ITatl. Sei. USA, 78, 7575) foi posto em pratica.

Para cada ensaioí 5 X 10^ células são somaadas nuna caixa cie Potri de 6 ca de diâmetro contendo 5 ml do meio alfa-MM (Gibco, B.U.A,) a que se adicionou 5/· (v/v) de soro fetal de vitela (Gibco).

Apés 24 horas do incubação a 3?2C as células foram lavadas com 5 ml de tampão PBS (R. Dulbocco o ll. Vogt, J. Bxp. Hod. 44 (1554) lé?) depois cobertas com 1 ml de meio alfa-MB-i a que se adicionou 0,05 M do tris (hidroximetil) aminomotans-HOl (ou Tris-SGl) a pil 7,3, 0,2 r.ig de DBA3 doxtram do 500 000 daltons (Signa,

2.U.Á.) o 10 y.% do DMA de plasmídeo.

Brocodou-so a uma incubação de 7h a 37°C ao fim da qual as células foram lavadas com 5 ml do tampão P3S depois cobertas oom 5 ml de meie alfa*®í a quo so adicionou 20 (v/v) de soro 'abai de vitela.

As células são então incubadas a 37°C durante 4 dias. 0 meio de cultura é em seguida recolhido o serve para medir a actividade do tipo XL-2.

B/ Medida da Actividade Tído Xh-2

Kedo-se a actividade biologiea dos moios do cultura colhidas como 110 i^aragrafo c/b - de acordo com o tosto colorinétrico do Mosmann, T. (1983) <T. Immunol. Methods, 65, 55-63) - sobro a profiloração da linha do linfécitos T do ratinho dependente cie IL-2 OILL-2 (Sabor P. nl (ί???) J. Bxp. Mod., l4ç, 173), Como testemunha utilisou-so a preparação de referencia descrita em Lymphohino Research ((1934), 4, 153-227).

2. Plasmídeo P8V 72 ú

Λ/ Construção

A construção do plasmídeo pSV

726 tem por ponto do partida 0 plasmídeo pSV 700 (figura 2)

O plasmídeo p3V 700 rosulta da montagem do 5 fragmentos cio DXTAí

- Um fragmento Pvu XX-Bind III do 3*’··2 pares do Passa (daqui ora diante pb) derivado do genoma do virus SV 4θ (fíers,

U, (197S) Uaturo, 273, 1X3-120) o contendo o promotor prococo dosto virus*

- Um fragmonto HindlII-Bam Τ.ΓΕ do 50ft (figura l) contendo uma soquoncia do DUA codificando o precursor natural da IL-2 tal como sintetisado oa Xinfocitos humanos.

- Ura fragmento Barfíl-Ball d© 305 pb derivado do gene da alfa-globina do ratinho (HisMoha, X. e Leder, P. (1979) Coli, 18, 873-332) o que conterá o intrão distai deste gene.

- Ura fragmento Hpal-Bam IK de 133 pb derivado do genoma, do virus SV4o e contendo o sinal proc000 de poliadonilação desto virus.

- Um fragmento BaraEEE-Wu II de 2672 pb derivado do piasraidoo pBS 322 (Solivar, P. (1977) Gene, 2, 95-1X3),

A soquoacia de nucleotídeos AGCTXCCACAATGfAOAGG· situada na extremidade 3’ da cadeia codificadora do fragmento HindlII-BaraBI (figura l) foi en seguida substituída pela soquencía sintética ÁGCTWCâCCàTGGCfAGG Ίο maneira a ter-so, ao nivel dos nuclootideos codificadoros do codão ATG, uma sequência conforme a sequência consonsas CCACCAfGG descrita por Kosàk, K. ((X9S4)

Nuchic Acids Nos., 12, 837-S72). 0 plasmideo p3Y7O3 ® assim obtida (figura 3)· — 3.8 — segmento de DNA compreendido ontro os sitios do rostriçao I-Iindlll o Hgi AX situado a nontanto do segmento ílindlll-Dam ΠΣ (cuja cadeia 5^-3¹ está representada na figura 12} do plasmideo pSY 703 o conten do a sequencia correspondente ao peptidoo sinal modificado (olo possui uri residuo alanina na posição 2 em ves do resíduo tirosina dorido à adopção do uma sequência conforme a sequência consonsas de lionak) fio precursor natural da IL-2 o ao ^primeiro aminoácido da IX/-2 madura., q em seguida substituido por um oligonucleotideo de cadeia dupla sintático cuja cadoia codificadora 3’ - 3’ está representada na figura 11.

Dsta sequência sintática codifi ca a partir do sou nono nucleotideo o peptidoo sinal de um dos precursores naturais da bGH (a sequência de aminoácidos dosto poptidoo sinal está apresentada na figura 3-1, cada um dos aminoácidos em fronte do codão correspondente), daqui em diante designado peptidoo sinal da bGH e o primoio aminoácidc da IL—2 madura.

piasmídeo obtido e o plasmidao pSY 70 á (figura h), 0 seu segmento HlndXXX-BawHX que possui a sequência codificadora do precursor (ps-MH)*3X-2 está representado na figura 13»

Pinalmonto, o fragmento comproonclido ontro os sitios de restrição AcoAX o ΒοοΣΐΥ de 183 pb do plasnidoo pSY 706 á substituido por ura fragmento Pvu II-BcoBI do 26/7 pb derivado do piasmídeo, pSY2-dbfr (Subramani, 3. ot al (1981) Ho lecular anti Oollular Biology 1, 83'-864) depositado na colocção ÍJSQC com a referencia 37TJi6. 0 plasoidoo obtido á o plasmideo pSV 726 (figura 6), plasmidoo pSV 736 contém:

- Uma unidade de expressão para o precursor (ps-hSS)-11,-3 Ssta unidade tem por prosaotor o promotor precoce do vírus S’í4o; ela comporta, a jusante da sequência codificadora do precursor do (ps-b£2X)-XX.-3, uma sequência qus contem o segundo intrão do gono da alfa-globina de ratinho seguido do sinal precoce de poliadonilação do vírus 5V4O.

- Una unidade de expressão para a dbfr. Bota unidade tom por promotor o promotor prococc do viras SV&0$ ela comporta a jusante da sequência codificadora da dhfr, a sequência compreendida ontxc es sitios í-íbo X nas posiç~os 4693 o 4083 - dc acordo com a notação de Slors,

U. - sobro o gonoma do virus Sv4o o contendo ura intrão para o antigénio ? do virus SV4o seguido do sinal precoce do poliadenilação do virus SV4q. Ssta unidade está contida no fragmento Pvu XX-3eoSX derivado do plasmideo pSV2-dfcfr,

B/Vantagons Ligadas à Utiliaação do Plasmideo pST .736

Xioalisou-se wn ensaio comparativo.

Os plasmídeos pSV 703, pSV 720 (apresentados a soguir) o jaSV726 foram testados nas condiçõos de oxprossão transitória (cf. métodos). Mediu-so a

actividade (do acordo con o j-rctocclo indicado mais ã frsn• to) do tipo TL·-.?, do cada an dos sobrona.do.nt os das culturas ! de maneira a avaliar o nivel de secreção da 3X-2 das ce» lulas transfoctadas com cada ua dos plasmidoos, plasraide© pSV 720 (figura 5} ó ura derivado do ulassd.deo j>SV 7‘0f» foi obtido substituindo um fragmento compreendido entre os sities de restrição EcoRT o 30o 2.7 do 185 pb do plasmídeo pSV 703 por um fragmento PvuTT~EcoP.T do 2677 pb derivado do plasmídeo pSV2»dhfr.

Os plasmídeos pSV?20 e pSV 726 | possuem assim a mesma unidade de expressão para a dhfr, * Elos diferem apenas nas respectivas sequências de DNA oodi| ficadoras do peptideo sinal do precursor da XL-2,

I ! Ssta ssquencia codifica no caso do plasr.3id.00 pOV 720, uma variante do peptideo sinal do procursor natural da 11—2 e no caso do plasmidoo ySV 726 i o pantidoo sinal da ãSíX» i

f : 0 quadro 1 a seguir apresenta il os resultados deste ensaio:

;uadx»o 1

PLÁ3MXD30

ÀCOTXDA53 3X-2 (u/aX) :>37 703 pSV 720 pSV 72ó

228 - 112

3¾ - 29 158 - óS

Zísto quadro mostra a oai::a do secreção - em condiçoos do expressão transitória - ligada à introdução num plasmidoo (ρ^;Ζ7 703) do uma unidade do oxprossão para a dhfr (plasmídeo pS7 7*~o). 31o indica do modo claro quo a substituição na sequência codificadora pela variante do poptidoo sinal do precursor natural da IL-2 da soquoncia codificadora do peptideo sinal da bGH (plasmidoo pSV 726) permito melhorar do modo significativo c nivol dc socroção e mesmo encontrar um nivel sensivelmen te equivalonto ao determinado para o plasmidoo de origem (plasmidoo pSV 703)»

3. Plasmidoo pSV 7’il

Á/Construçao

A construção do plasniidco pSV

741 tem por ponto do partida o plasmido© pS¥ 739 (figura 7).

plaomidoo pSV 739 resulta da montagem do 5 fragmentos de DnA:

- Um fragmento Doo ΖΓ7- 3gl I do 777 pb dorivado do genoma do virus SV4O o contendo uma parte do promotor precoce do vírus SV4g«

- Um fragmento BglX-PstX do 239 P& derivado do plasmidoo pLl (Okayama, II. o 3arg, 1?» )1983) ϊ-íolocular and OellulaT Biology, 3» 2S0-289) « contando a parto gue falta no frag monto deo B7~3gl X do promotor preoooo do virus SV&O e os 2 introos do ΒΠΔ mensageiro tardio 19 3 da proteina 7P2 ο ο Γ2ΤΑ mensageiro tardio 16 3 da proteina YPX (SUors U. (1973) Haturo 273, 113-120).

- Um fragmento Pst X-Bam UX do 525 pb constituído pelo fragmento IlinõXXX-Bam SE do 521 po do plasmido0 pSV 7θ6 (ef figura 13) a quo está ligado um adaptador Pst X-Xíind XXX; este fragmento contem a sequencia do DHA codificadora do piOôursor (ps-hGS)-3X-2.

- Um fragmento 3c 1 X-Bco BX de 933 pb derivado do genoma do virus SV4o o contendo 0 sinal precoce do poliadsnilaçâo deste vírus.

- Um fragmento BcoBX-PvUXX de 2295 pb derivado de piasnidoo pBB322, plasraidoo 'pSV 7&I (figura 9) foi obtido substituindo o fragmento BaraBl-ScoHX do plasiaidoo pSV 732 por ura fragmento PvtíIX*3coS,l resultando olo próprio da nontagem de un fragmento ScXI-BcoBI de 288 pb derivado do gonoma do virus SV4o e contendo o sinal precoce do poliadouilaoão dosto virus o do nm fragmento Pvu II-Bgl II do 1103 pb derivado ao plasmideo pSV2-dbfr, plasmideo pSiyfel ccntsss

- Una unidade do onprossão para o procursor (ps-2xGB)~IX»~2, Esta unidade tora por promotor o promotor precoce do vírus SV4o. 31a inclui, a montante da sequência codificadora do procursor da IL-2, uraa sequência constituída por dois introos do vírus SV^o o a jusante desta sequência, o sinal precoce do poliadonilação do virus SV4o.

- Uraa unidade do expressão para a dhfr. Beta unidade inclui o promotor precoce do virus SY^-O, um sequência do ®A codificando a dhfr o» a jusante desta sequência, sem intrão intorraodiário, o sinal precoce de poliadonilação do vírus SV4o,

3/ Vantagens ligadas à Utillcação do Plasraidoo pSV 7^1

Boalisoa-so ura ensaio comparativo.

Os plasmídeos p3V733, pSV?4l e pSV?42 (cf, adianto) f orara tostados nas condições de expressão trnsitória (cf. métodos).

Mediu-s© (do acorde cora o pro

2¾ tocolo indicado mais acima) a 'xviaano ao

Air-2 do cada noio cio cultm’a dc maneira a aprooiar o nivel de socre ção da IL-2 do quo são capastes as células transfeetadas com cada um dos plaomidoos.

Poi construído a xrtir do plasmídeo pST7-*2 (figura 10) slasmidoo pS¥739.

-Xbal do 2d0 pb do plasmido© pSV 759 fragmento HindllX-XboZ do 2¾¾ pb (fi; pSV 705 (figura 3)* 0 plasmídeo obti 7^0 (figura S).

(figura 13) pelo gura 12) do plasmídeo 5.0 é o plasmídeo pSV plasmídeo pSV 7^2 foi obtido substituindo o fragmento ScolS-SsxrflX do plasmídeo pSV 7^-0 por urs fragnonto 3?vn II~3co8X resultante <2a montagem de um fragmento BglXI-fvuXX do 1103 pb derivado do plasmídeo nSV2-dh.fr o do nm fragmento ΕοοΒΣ-ΏοΙΪΧ do $33 pb derivado do gonoma do vírus SV^O o contendo o sinal precoce da poliadouilaçao dosto vírus.

fj plasmídeos pST 7^1 o nSV

7¾2 tem assim a mesma unid •ado ae nprossao -cara a

Elos diforom apo. ias na do DI7à codificadora do composição da rospoctlva sequência poptidoo sinal do precursor ds. 1L-2»

Esta sequência codifica no caso do plasmidoo pS7 7^2 «aa variante do poptidoo sinal do precursor natural da IL-2 no caso do plasmídeo p3Y 7^1 para o poptldoo sinal da hGH* quebro aprosenta os resultados deste ensaio quadro

PLASMÍDEO

AOOTIDÀBS XL~2 (u/ml) psv 74o pSV ?4l pSV 742

171 ~ 10 * 4

7-2 .'3ato quadro mostra a baixa do secreção - ©a condições d© expressão transitória - ligada à introdução no plasmidoo n3V 74 0 do uma unidade do expressão para a dlifr (plasmidoo pSV-742). SX© indica do manoira clara quo a substituição da sequência codificadora do rata variante do poptidoo sinal do precursor natural da IL-2 por waa sequência codificadora do peptidoo sinal da hGII (plasmldeo pSV 741) pormito melhorar do modo signif cativo o nivol de secreção da IL-2.

II. Obtenção do.. linhas celulares altamouto produtoras

Células CHO M- da estirpe

DxB 11 foram transfectadas cora wn ou outro dos plasmídeos pSV 726 o _PSV 7-4l.

Soglu-sc o método descrito por

Grãhart, f. o Van. dor Sb, A*. ((1373) Virology, 54, 53^559).

As células são os primeiro lugar propagadas em meio alfa«I-SS-Â (Gibão) a quo s© adicionou lod (v/v) do soro fetal do vitela, 20 pg/ml do gentaiaicina 60 pg/ml do tilocina o 300 pg/mX do L-glutamina (designado moio não seloctivo).

Após uma fasõ do lavagem, as células sonioadas do véspora - a rasão do 0,8 X 10 por placa do Potri do 10 cn do diâmetro - são cobertas com meio não seloctivo o adiciona-se 10 VS do um dos plasmideos om presença do fosfato do cálcio mas soa SNA do esperma de salmão. As células assim preparadas são incubadas 7 hora© a 37°G.

As células são oa seguida cultivadas om noio alfa-LEAl a quo so adicionou 5^fp (ν/v) de soro fotal dc vitela durante 3 dias a 37°C« A seguir a esta incubação, olas são repartidas a 5 x 10 células por Caixa, nas caixas do Potri contendo meio que, constituído per meio mininio essencial contendo sais, é comercializado pela Sociodaõo Gibco sob a. referência 041-1093; este moio é aqui utilisado adicionado de soro fetal de vitela dialisado Gibco (10/ v/v) gontanieina (20 μς/ml), tilocina (50 çig/ml)., glutaiaina (300 ;xg/ml) e prolina (l50 jsg/ml). Bste meio assim completado consttitui o moio seloctivo aqui citado.

As células assim preparadas são incubada© a 37°O durante 2 semanas renovando o maio seleotive do 3 em. 3 dias. As colónias observadas a seguir a esta incubação são em principio activo derivadas de células tendo oficasrao.nto incorporado um plasmido o, Sstas colónias são repicadas antooipadamento o postas ea cultura separadamente era meio seloctivo o tostadas através da medição de actividade do tipo Ii-2 para assegurar a sua capacidade para produsiΪΟΠ IL-2.

Ê assim ςχι© após transf©c ção puderam sor isoladas o verificadas como positivas 3^7 colónias con o plasmidoo pSV 78-5.

As colónias mais produtoras (35 000 a 50 000) nr.ida.dos do XL-2/nl nodiclo ao fia d© k dias, partindo do uma população inicial d© h x 10 cólulas foram postas om cultura. As cólulas foram repicadas suoessi vamente do 4 mro^aracõos do moio solcctivo apresontand© cada um om ro lação ao anterior ama concentração acrescida (0,02, 0,05, 0,1 o 0,2 ^¢1) do metotrexato (ametopterina, Sigma) como descrito por Alt. 7, ot al ((137®) Journal of IHological Chemistry, 253, 1357-1570).

A seguir a ©sta faso puderam sor soloccionadas várias linhas altamonto produtoras· assim quo a linha 103.12 transfoctada com o plasmidoo p37 72ó ó capas d© um nivol do socroção d© IL-2, após 4 dias ©ra cultura, exprimindo om tomo do actividade, do 250 000 unidades /ral.

III

Caracterização da IS—2. secretada co las linhas.

Δ cultura a uma escala maior das linhas alt©mente produtoras descritas no paragrafo II pomitiu disuor por tratamento dos oohronadantos d© cultura npós separação dos outros constituintes, da protoina soer©tada polas cólulas om quantidade suficiente para permitir a c ar ac t ori zaç ão .

1. Purificação da IL-2

A IL-2 purificeida a partir d© um litro do sobronadanto de cultura.

Procodon-so primeiro a uma. concentração o a uma primeira purificação submetendo o sobrenadante a tim cromatografia de permuta iónica numa coluna do agarose Sciiliarooo* (S*Past f Xov-PLarmacia fino Chemical - Suécia) nróviamente equilibrada com acetato do amónio 0,05 Π ο pH ft,5* A oluição foi realisada, coa a ajuda do acetato do amónio 0,05M (pH 5,5) a que se adicionou ZíaOl de me laridade Q,G5K seguido do Õ,5&.

&í3 fracoa©s oluidaS, quo se mostraram biológicaraonto activas após medição da sua aoti* vidado tipo IL-2, são reunidas o submetido o conjunto a uma cromatografia liquida de alta pressão numa coluna do fases rovorsas. 0 suporto oscolbido á ua gel do silica imolantada em Q„, A coluna tom por dimensões 1,0 κ 25,0 cia.

j

A eluição foi realizada com ura gradiente linear do acetonitifLlo variando do 5 a 100$ (v/v) numa solução aquosa do 0,3$ (v/v) do ácido trifluorcacetioe ora 80 min com ura débito do 4 ral/rain.

As fracções elnidus, biológica* monte activas, foram reunidas e o seu conjunto submetido a uma ororaatografia do raosrao tipo que a realiaada atrás, nas condições do eluição idênticas, nua gol d© silica implantado on 0-_o numa coluna de dimensõesj 2,1 χ 10,0 ora.

♦Vvz conjunto de fracções ©luidas recolhidas quando desta cromatografia, biologicamente acii vas, o apresentando, seguindo os resultados do uma eleotro, foroso era gol do poliacrilamida era presença do dodecilsulfato do sódio (LaemaXi, (1970) UatuiO, 277, 6SO-ÓS5) numa puroaa on XL-2 supsi'ios* a 95'p constitui o material sobre o qual so ofoctuou a caractorisação da 3X-2»

Caras terinação da 1L-2 per determinação cia Sequência ârí η o - Tormin al

As amostras a tostar são coloca^fhs oa s aporfiei o do ura filtro elo brometo do be^adimotrina (ou polibrono). 0 filtro g introdusido num soquonciador do proteínas (modelo ^70 A comcrcialinado pola Sociedade Applied Uiosystoais (3.ΊΓ.Α. ) equipado con um cromatograf o (Uodolo 130 A- Applied Siosystcms) qu© analisa finamoato os derivados fonilt oidantóleos formados*

Go resultados dosta doterminaçSo ostão do acordo com a sequência já publicada para o produto natural (Ztobb, S. ot al (158¾) Proc* Hatl. Acad* dci. 7.C.A. Cl, $ίθό-ό*:·90).

Ssta soqnoroia oscrevo-s© para os seus dos prinoir© aminoácidosϊ

Ala-Pro-fre-Sor-Sor-Sor-iro-nis-Lis-frô

A alaniaa © o único residuo detestado em po. que o precursor ueao A

A.iÂ.'

-terminal. Isto trás a coafirnagão l)-3X-2 foi oorroctamento cortado quando da socr^ão.

Sm conclusão, estes exemplos poõn on evidência o interesse utilinação convincente paro a io invento que permite uma, produção do interleuquiaa

lo células eucarióticas tirando partido das qualidades próprias do sistema do so loc ção o/ov. amplif icação fundamontando-se na transfocção do células por tua veotor tendo, com os meios nocossórios à sua expressão -uma sequência codificadora da di-ftidrofolato rodutase»

Claims (11)

1. REIVINDICAÇÕES:

   l^â. - Processo para a obtenção de células eucarióticas produtoras de interleuquina-2 que contêm, juntamente com os meios necessários à sua expressão, uma sequência de DNA codificadora da di-hidrofolato reductase e uma sequência de DNA codificadora de um precursor hibrido da interleuquina-2 cujo peptídeo sinal é o de um dos precursores naturais da hormona de crescimento humana, caracterizado por se transfectar células eucarióticas com a ajuda de um vector portador por sua vez, com os meios necessários à sua expressão, uma sequência de DNA codificadora da di-hidrofolato reductase e uma sequência de DNA codificadora de um precursor hibrido da interleuquina-2 cujo peptídeo sinal é o de um dos precursores naturais da hormona de crescimento humana, depois se seleccionar as células transfectadas produtoras da interleuquina-2 por cultura em meios sucessivos tendo um em relação ao anterior uma concentração acrescida de metotrexato.
2. 2^â. - Processo de acordo com a Reivindicação 1, caracterizado por as células eucarióticas serem as células CHO (células de ovário do hamster chinês).
3. 3^à. - Processo de acordo com uma das Reivindicações 1 ou 2, caracterizado por o vector ser portador de uma única unidade de expressão para a di-hidrofolato reductase e precursor da interleuquina-2.
4. 4-. - Processo de acordo com uma das Reivindicações 1 ou 2, caracterizado por o vector ser portador de duas unidades de expressão distintas, uma para a di-hidrofolato reductase e outra para o precursor da interleuquina-2 .
5. 5^a. - Processo de acordo com qualquer uma das Reivindicações la 4, caracterizado por o precursor hibrido ser a sequência de DNA codificadora da interleuquina-2 de origem humana cujo peptídeo sinal é o de um dos precursores naturais da hormona de crescimento humana.
6. 6^a. - Processo de acordo com qualquer uma das Reivindicações 1 a 5, caracterizado por o vector possuir as características de um dos plasmídeos pSV 726 e pSV 741.
7. 7^a. - Processo para a obtenção de um vector de expressão que possui, com os meios necessários à sua expressão, uma sequência de DNA codificadora da di-hidrofolato reductase e uma sequência de DNA codificadora de um precursor hibrido da interleuquina-2 cujo peptídeo sinal é o de um dos precursores naturais da hormona de crescimento humana, caracterizado por se isolar os fragmentos de DNA com ajuda de enzimas de restrição a partir de vectores pré-existentes, se acoplar eventualmente depois da substituição das sequências nucleotídicas situadas nas suas extremidades por sequências nucleotídicas, sintéticas - os fragmentos, utilizando uma enzima tal como a DNA-ligase do bacteriófago T , se seleccionar por cloragem um vector - depois de transformação bacteriana era E.coli - e se purificar, em seguida, este vector.
8. 8^a. - Vector obtido pelo processo de acordo com a Reivindicação 7, caracterizado por possuir uma única unidade de expressão para a di-hidrofolato reductase e o precursor da interleuquina-2.
9. 9^a. - Vector obtido pelo processo de acordo com a Reivindicação 7, caracterizado por possuir duas unidades de expressão distintas, uma para a di-hidrofolato reductase e outra para o precursor da interleuquina-2.
10. 10^a. - Vector obtido pelo processo de acordo com a Reivindicação 7, caracterizado por possuir as características de um dos plasmídeos pSV 726 e pSV 741.
11. 11^â. - Processo para a obtenção da interleuquina-2 consistindo em se pôr em culturas células eucarióticas produtoras de interleuquina-2, se colher o meio de cultura e se separar dos outros constituintes a interleuquina-2 contida no referido meio, caracterizado por as células postas em cultura derivarem de células eucarióticas transfectadas com um vector portador, com os meios necessários à sua expressão, uma sequência de DNA codificadora da di-hidrofolato reductase e uma sequência de DNA codificadora de um precursor híbrido da interleuquina-2 cujo peptídeo sinal é o de um dos precursores naturais da hormona de crescimento humana, depois seleccionadas por cultura em meios sucessivos apresentando um em relação ao anterior uma concentração acrescida de mototroxato.