PT85296B

PT85296B - Bloco funcional de adn, e plasmideo que codifica para a hirudina, e respectivo processo de preparacao

Info

Publication number: PT85296B
Application number: PT85296A
Authority: PT
Original assignee: Transgene Sa
Priority date: 1986-07-10
Filing date: 1987-07-09
Publication date: 1995-05-31
Also published as: HUT44616A; DK175195B1; NO179489C; CA1341490C; FI96966C; US5591640A; PT85296A; EP0252854A1; GR3024368T3; KR960013464B1; HU214236B; DK355887D0; RU1776276C; NO179489B; CZ527787A3; JP2733602B2; FI873068A; DE3752063T2; FI96966B; KR880007727A

Description

Descrição

PROCESSO PARA A PREPARAÇÃO DA HIRUDINA A PARTIR DE LEVEDURAS E DE BLOCOS FUNCIONAIS DE ADN

O presente invento refere-se a aperfeiçoamentos introduzidos no pedido de patente francesa n° 85 06672. O mesmo refere-se a vectores de expressão duma proteína que tem a actividade da hirudina de sanguessuga. {H. medicinalis).

Mod. 71 · 20.000 e«. · 92/12

O pedido de patente n° . 85 06672 descreve um processo que permite fazer produzir por meio de leveduras tais como S. cerevisiae, hirudina segregada no meio de cultura sob forma activa.

O presente invento refere-se a novos vectores que asseguram a produção de hirudina, designadamente HV1 em melhores condições.

Mais particularmente, a presente invenção refere-se a blocos funcionais de ADN que permitem a preparação de hirudina a partir de leveduras, caracterizados por compreenderem pelo menos a sequência:

- S_tr - L_ex - S_C1 - gene H sendo o gene H aquele que codifica para a hirudina ou uma das suas variantes; o gene H é, de preferência, de acordo com o presente invento, o gene que codifica para HV1 ou HV2; eventualmente, o gene H pode ser seguido de uma sequência de terminador de levedura, por exemplo o gene PGK;

. S_tr é uma sequência de ADN que compreende sinais que asseguram a transcrição do gene H pela levedura,

-135

L_ex é uma sequência principal para se obter a excreção do produto do gene;

S_C1 é uma sequência de ADN que codifica para o local de clivagem pela proteinase yscF, local de clivagem que é único e situado no precursor da hirudina imediatamente a montante do gene H; além disso, o elemento S_cl- gene H pode ser repetido várias vezes.

Este tipo de bloco de expressão permite obter uma proteína única, madura e correcta.

Mod. ?l · 20.000 e< · 92/12

Com efeito, a construção descrita no pedido de patente n° . 85 06672, S. cerevisiae produz a hirudina sob a forma de um precursor que apresenta dois locais de corte para a proteinase yscF, produto do gene KEX2, (1) . A actividade endo-peptidase de yscF é necessária para a maturação deste precursor da hirudina. Contudo, somente os incidentes de corte no segundo local, o mais afastado da 20 extremidade NH₂ do precursor, permite a libertação da hirudina activa; pelo contrário, quando o corte tem lugar no primeiro local e não no segundo, é uma forma mais longa que é segregada e que difere da hirudina por uma extensão de resíduos aminoácidos na extremidade NH₂. Esta última 25 forma, não desejável, pode contaminar a hirudina madura e correcta no decurso de diferentes etapas de purificação e por este facto complicar o processo de purificação e arrastar uma baixa de rendimento na preparação da hirudina pura.

Mediante o presente invento, faz-se sintetizar com a levedura um precursor da hirudina que não possui senão um único local de corte para yscF, de modo a que a sua maturação em hirudina não conduza a segregar senão a forma procurada.

27. JjJí. í?94

Mod. 71 - 20.000 e«. · 92/12

Entre as sequências L_ex, deve citar-se em particular a sequência denominada pre-pro que permite a excreção da feromona sexual alfa de levedura.

Escolheu-se como exemplo de sistema de secreção, o da feromona alfa, isto é, que na sequência anterior, a sequência L_ex provém do gene da feromona sexual alfa de levedura, mas outros sistemas poderiam ser utilizados (por exemplo o sistema da proteína Killer) (4).

De maneira preferencial, é interessante que as leveduras hospedeiras dos plasmidos que compreendem blocos funcionais de acordo com o invento possam ser de um tipo sexual qualguer e possam, além disso, ser cultivadas na ausência de uma pressão de selecção.

Nestas condições, as leveduras transformadas podem ser realizadas no estado industrial de maneira particularmente cómoda.

Para esse fim, o presente invento propõe blocos de expressão de ADN tais como os descritos anteriormente mas nos quais a sequência S_tr compreende um promotor de um gene de levedura diferente do promotor do gene MFalfal; pode tratar-se, por exemplo, do promotor do gene PGK da levedura .

Com efeito, nas construções descritas no pedido de patente n° 85 06672, o gene do precursor da hirudina é transcrito a partir do promotor do gene MFalfal. Este promotor funciona no máximo da sua potência nas estirpes de tipo sexual (Matalfa. A escolha do hospedeiro restringe-se portanto a este tipo de estirpe, o que exclui as estirpes do tipo sexual Mata assim como as diplóides ou n-»

Ci.

poliplóides desprovidas de tipo sexual. Em particular, isto exclui as estirpes de levedura utilizadas na indústria que entram na maioria dos casos nesta última categoria. Mudando de promotor, pode obter-se uma expressão da hirudina independente do sinal sexual da estirpe hospedeira .

De um modo geral, estes blocos de ADN serão levados por plasmidos que compreendem, além disso, uma origem de réplica nas leveduras, por exemplo a origem de réplica do plasmido 2 μ.

Mod. 71 - 20.000 e< · 92/12

Para facilitar a construção dos vectores, estes plasmidos póderão ser lançadeiras coli-levedura e compreender os elementos que permitem a sua réplica no E. coli, por exemplo uma origem de réplica tal como a de pBR322 e um marcador de selecção como amp^R. Estes plasmidos compreenderão igualmente um marcador de selecção para a levedura, por exemplo um gene que codifica para a resistência a certos compostos químicos tóxicos que permitem complementar uma auxotrofia; utilizar-se-á mais particularmente o gene URA 3.

Com efeito, mostrou-se na patente WO 66/01224 que a introdução de certas mutações que conferem resistência ao 5-FU numa estirpe ura3 transformada em ura+ pela inclinação de um plasmido que permitia uma maior escolha de meios para a cultura destas estirpes transformadas; poderse-á em particular utilizar os meios complexos industriais .

O presente invento refere-se mais particularmente à sintese e à secreção da variante HV1.

O gene HV1 foi já sintetizado quimicamente com vista à sua expressão no E. coli (patente francesa n° 84 13250) .

A maior parte dos oligonucleótidos sintéticos utilizados na patente n° 84 13 250 foram conservados para a construção da sequência que codifica para o precursor de HV1, com excepção dos que permitem as diferentes junções com as sequências que serão fundidas a montante e a jusante da sequência.

Mod. 71 20.000 e<. 92/12

A obtenção de uma hirudina segregada necessita da presença de um precursor contendo as informações necessárias à secreção e à maturação correcta deste polipéptido, seguindo o .caminho metabólico normal da levedura. No pedido de patente n° 85 06672, mostrou-se que a sequência NH₂-terminal do precursor do factor alfa podia ser utilizado para a secreção da variante HV2 da hirudina. 0 presente invento refere-se à aplicação deste sistema à secreção da 20 variante HV1.

invento refere-se em particular a um bloco funcional de ADN que permite a preparação da hirudina a partir de levedura, caracterizado por compreender pelo menos: . o gene de HV1;

. uma sequência de ADN (S_tr) que compreende os sinais que asseguram a transcrição do gene HV1 pela levedura.

Este bloco funcional, integrado num plasmido ou nos cromossomas de uma levedura, de preferência do género Saccharomyces, poderá permitir, depois da transformação da referida levedura, a expressão da hirudina, quer sob a forma activa, quer sob a forma de um precursor inactivo, podendo regenerar a hirudina por activação.

27. Ϊ994

Mod. 71 20.000 e<. · 92/12

Estes blocos funcionais apresentam, de preferência, a estrutura seguinte:

- S_tr - L _ex - S_C1 - gene H . sendo o gene H aquele que codifica para HV1; o gene H é, no caso considerado, seguido por uma sequência de termi nador de levedura tal como a do gene PGK;

. S_cr é uma sequência de ADN que compreende os sinais que asseguram a transcrição do gene H pela a levedura;

. L_ex é uma sequência principal necessária para obter a excreção do produto do gene;

. S_C1 é uma sequência de ADN que codifica para um local de clivagem que compreende, no caso considerado, a extremi dade 3', antes do gene H, um codão ATG ou dois codões que codificam para Lys-Arg ou cinco codões que codificam para Ser-Leu-Asp-Lys-Arg;

. além disso, o elemento S_cl-gene H pode ser repetido várias vezes.

Entre as sequências L_ex, é necessário citar o da feromona sexual alfa de levedura, e para S_cr, é necessário citar o promotor do gene MFalfal e igualmente o promotor do gene PGK, mas outras sequências podem ser utilizadas, em particular escolheu-se como exemplo de sistema de secreção o da feromona alfa, quer dizer que, na sequência precedente, a sequência L_ex provém do gene da feromona sexual alfa de levedura, mas outros sistemas poderiam ser utilizados (por exemplo o sistema da proteína Killer) (4).

Para dirigir a expressão e a secreção da hirudina no meio de cultura, o gene correspondente é integrado num vector de levedura ou um plasmido que compreende o bloco funcional descrito acima e pelo menos uma origem de réplica nas

21JLX i?94

Mod. 7! · 20.000 β«. · 92/12 leveduras. O plasmido compreende de preferência os elementos seguintes:

. a origem da réplica do plasmido de levedura 2 μ, . o gene ura3, . uma origem de réplica em £. coli e um marcador de resistência a um antibiótico, . a região 5' do gene MFalfal que compreende o promotor de transcrição, a sequência principal e a sequência pre-pro do precursor do factor alfa, esta sequência será fusio nada, em fase, a montante da sequência que codifica da hirudina HV1, . o terminador de transcrição do gene PGK da levedura que será colocado a jusante do gene da hirudina.

De um modo geral, os blocos de expressão de acordo com o invento popderão ser integrados numa levedura, em particular Saccharomyces, quer num plasmido com réplica autónoma, quer no cromossoma da levedura.

Quando o plasmido é autónomo, ele comportará elementos que asseguram a sua réplica, isto é uma origem de réplica tal como a do plasmido 2 μ. Além disso, poderá compreender elementos de selecção tais como o gene URA3 ou LEU2 que asseguram a complementação de leveduras ura3‘ ou leu2*. Estes plasmidos podem igualmente compreender elementos que asseguram a sua réplica nas bactérias, quando o plasmido deve ser um plasmido lançadeira, por exemplo uma origem de réplica tal como a de pBR322, um gene marcador tal como Amp^r e/ou outros elementos conhecidos do perito nesta matéria.

O presente invento refere-se igualmente às leveduras transformadas por um bloco de expressão de acordo com o invento, quer suportado por um plasmido, quer integrado

J&í nos seus cromossomas, em particular as estirpes de Saccharomyces e especialmente as estirpes de 5. cerevisiae designadamente do tipo sexual Mata ou então as estirpes diploides ou poliplóides desprovidas de tipo sexual, mas sobretudo as estirpes de levedura ura' transformadas ura* por um plasmido de acordo com o invento e tornadas resistentes ao 5 -fluorouracilo, podendo estas estirpes ser cultivadas sobre meio industrial.

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Quando o promotor é o do gene da feromona alfa, a levedura será de preferência de tipo sexual Matalfa. Utilizar-se-á, por exemplo, uma estirpe de genotipo ura3‘ ou leu2' ou outra, complementada pelo plasmido para assegurar a'manutenção do plasmido na levedura por uma pressão de selecção apropriada.

Finalmente, o presente invento refere-se a um processo para a preparação de hirudina ou de uma das suas 20 variantes por fermentação de uma levedura transformada tal como descrita anteriormente sobre um meio de cultura e recuperação da hirudina produzida no meio de cultura sob a forma madura ou sob a forma de um precursor da hirudina que pode maturar in vitro ou tn vivo, assim como a hirudina ou 25 suas variantes obtidas por este processo.

Assim, se bem que seja possível preparar a hirudina por fermentação das estirpes transformadas precedentes sobre um meio de cultura adaptado, por acumulação de hirudina nas células, é no entanto preferível fazer segregar a hirudina no meio, quer sob a forma madura, quer sob a forma de um precursor que deverá ser processado tn vitro.

Esta maturação pode ser realizada em várias etapas.

Z7J3U994

Primeiramente, pode ser necessário clivar determinados elementos provenientes da tradução da sequência L_ex, esta clivagem será efectuada ao nível da sequência que cor5 responde a S_C1. A hirudina madura pode ser precedida de uma metionina que será cortada selectivamente pelo brometo de cianogéneo. Este processo é utilizável porque a sequência que codifica da hirudina não compreende metionina.

Mod. 71 20.(XX) e<. · 92/12

É geralmente possível prever na extremidade Ν o dipéptido Lys-Arg que é cortado em COOH por uma endopeptidase específica; sendo esta enzima activa no processo de secreção, pode, assim, obter-se directamente a proteína madura no meio. Mas, em certos casos, pode ser necessário prever uma clivagem enzimática depois da secreção adicionando uma enzima específica.

Em certos casos, em particular depois de um tratamento com brometo de cianogéneo, pode ser necessário renaturar a proteína criando de novo os pontos de dissulfureeto. Para tanto, o pêptido é desnaturado, por exemplo com cloridrato de guanidínio, depois renaturado na presença glutatião reduzido e oxidado.

Finalmente, o presente invento refere-se à hirudina obtida pelos processos de acordo com o invento.

A hirudina assim obtida pode ser utilizada a título de inibidor da trombina, como medicamento anti-coagulante, como produto de laboratório para impedir a coagulação e/ou como agente de diagnóstico utilizando o produto marcado.

Em particular, a HV1 pode ser utilizada em composições farmacêuticas, isolada ou em combinação com outros princípios activos, ou ainda no quadro de testes ou de

Μ ί·794 diagnóstico, in vitro ou in vivo. Neste último caso pode ser interessante marcar a molécula, por exemplo mediante uma marcação radioactiva, fluorescente, enzimática ou outra.

Os exemplos seguintes ilustrarão outras características e vantagens do presente invento.

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Nas figuras anexas:

. a figura 1 representa a construção e a estrutura de M13TG897 . a figura 2 representa a mutagénese in vitro da ADN fágica de M13TG897 em M13TG1827:

a) sequência do oligonucleótido da mutagénese,

b) sequência parcial da ADN de M13TG897 que se torna híbrida com o oligonucleótido,

c) sequência mutada, . a figura 3 representa a construção de pTG883, . a figura 4 representa a construção de pTG892, . a figura 5 representa a construção de M13TG889, . a figura 6 representa a estrutura de pTG1828 e pTG1833, . a figura 7 representa a estrutura do precursor da hirudina que corresponde às sequências suportadas por plasmidos diferentes; representou-se a junção entre a) o local de clivagem (lys arg) o mais próximo da extremi dade NH₂ do precursor e b) a sequência madura da hirudina HV2 (NH₂-Ile-Thr etc.).

a figura 8 representa as sequências e a posição dos oligonucleótidos utilizados para a síntese da sequência da ADN que codifica para HV1, . as figuras 9 e 10 representam a carta de restrição e a tradução da sequência em amino-ácidos por ocasião da síntese da sequência de ADN que codifica para HV1.

cl.

Os plasmidos e estratégias utilizados e descritos no pedido de patente n° 85 06672 não são retomados no presente pedido.

EXEMPLO 1

Mod. 71 · 20.000 e<. - 92/12

O plasmido pTG897 contém a informação para um precursor da hirudina que não contém mais que um único local de clivagem para a proteinase yscF. A maturação neste local de clivagem liberta uma hirudina inactiva. 0 corte para a proteinase yscF liberta uma molécula de hirudina alongada em NH₂ por 4 resíduos Glu Ala Glu Ala. A delecção do fragmento de ADN que codifica para esta sequência Glu Ala Glu Ala permitiu libertar uma cadeia de hirudina correctamente processada. Esta delecção foi realizada pela técnica de mutagénese dirigida in vitro.

plasmido pTG897 foi recortado por duplas digestões PstI-BqlII; o fragmento de ADN que compreende a sequência da hirudina foi clonado na forma replicativa do fage de porção simples M13TG131 para dar o fage M13TG897. (figura 1) ·

Tornou-se híbrido um oligonucleótido de sequência:

5' -TCTTTGGATAAAAGAATTACGTATACAGAC- 3' com a ADN genómica deste fage M13TG897. Este oligonucleótido torna-se híbrido na sua primeira metade (15 pares de bases) com a sequência de 15 pares de bases directamente a montante da sequência a eliminar e na sua segunda metade com a sequência de 15 pares de bases directamente a jusante (figura 2). Este oligonucleótido serviu como matriz para a síntese in z-itro da pequena haste complementar do genoma do fage M13TG897. Depois da acção da T4 ADN

Mod. 71 20.000 e«. 92/12 ligase destinada a fechar de novo de maneira covalente a haste novamente formada, transfecta-se uma bactéria receptora, por exemplo JM103 (/\ (Lac-Pro) SupE Thi EndlA sbcB15 strA rk- mk+/F' TraD36 ProAB+ LacI^Q LacZ Δ. M15) e analizam-se os fages desta transfecção por hibridação ADNADN utilizando como sonda o oligonucleótido descrito anteriormente e marcado no ³²p por quinação, segundo as técnicas habituais praticadas pelo perito nesta matéria (2) . Este ADN fágico correctamente mutado forma com o oligonucleótido da mutagénese um complexo de hibridação assinalável pela sua grande estabilidade, a sua maior resistência às condições de estringência ao passo que o complexo de hibridação formado pelo ADN fágico não mutado e o oligonucleótido é desestabilizado pela presença de um anel de ADN de haste simples.

EXEMPLO 2

Transferência do fragmento mutado num novo vector de expressão

O plasmido pTG883 deriva do plasmido pTG876 por simples supressão do local BglII, encontrando-se próximo do terminador de transcrição do gene PGK.

Para este efeito, digeriu-se parcialmente este plasmido pTG876 mediante BglII, depois fez-se actuar o fragmento Klenow da ADN polimerase I de E.Coli em presença de 4 nucleótidos e ligou-se de maneira covalente as moléculas de ADN sobre elas próprias devido à acção da ADN ligase do fage T4. 0 plasmido pTG883 não possui mais que um único local BglII, situado a montante do promotor do gene da feromona (figura 3) .

O plasmido pTG883 (20 /xg) foi linearizado por

Mod. 71 · 20.000 e< · 92/12 digestão BglII, depois submetido a uma digestão praticada pela nuclease Ball31 (1.4 unidades, 10 minutos - Boehringer Mannheim) segundo as técnicas habituais. 0 ADN assim tratado foi purificado por extracções sucessivas com fenol e clorofórmio - álcool isoamílico, depois uma fracção (5 ^g) foi submetida à acção da polimerase Klenow a fim de se obter um máximo de extremidades livres. 0 ADN assim tratado feito ligar com ligadores (linkers) BamHl não fosforilados (5'-CGGATCCCG) na presença da ligase do fage T4 segundo a técnica descrita por Lathe e al. (3) . Depois da transformação de Exoli 1186 e selecção para a resistência à ampicilina, isolou-se um plasmido pTG892 deletado paía a região 5' flanqueando o gene MFalfal (figura 4), estando o ligador BamHl localizado numa base a montante do ATG segundo o esquema:

5' - CGGGATCCCG

Ligador BamHl

ATG AGA TTT

Parte que codifica MTalfa^ novo fragmento BamHl-Sall assim obtido foi clonado entre os locais BamHI-SalI do fage M13TG120 para dar o fage M13TG889 (figura 4) . A partir do fage M13TG889, o fragmento BamHI-BglII contendo toda a parte que codifica a feromona alfa foi isolado para ser ligado ao grande fragmento BglII do plasmido pTG848. 0 plasmido obtido depois da ligação, pTG892b, contém o fragmento BamHI-BglII que corresponde à parte que codifica a feromona inserida atrás do local BglII do promotor do gene PGK.

O ADN de pTG892b compreende um local único BglII, um local único Sal I, os dois Iccais enquadram uma curta sequência que compreende um local PstI. Por dupla digestão

BglII e Sall. eluição do grande fragmento e ligação com um

poliligador sintético, substitui-se a curta sequência pelo poliligador sintético. Este poliligador de sequência:

5'-GATCCAGCTGACATCTGCATGCG

GTCGACTGTAGACGTACGCAGCT-5'

Mod. 71 20.000 e«. · 92/12 apresenta uma extremidade coesiva com os fragmentos libertados por BglII, uma extremidade coesiva com os fragmentos libertados por Sall, assim como locais de reconhecimento para, entre outros, os enzimas Pvul, BglII e Sphl.

O novo vector assim obtido foi denominado pTG1819. 0 ADN deste vector foi digerido pelos enzimas Sphl e PstI. Mediante esta dupla digestão, obtêm-se três fragmentos: um PstI-PstI de 6,5 kb, um PstI-Sphl de 1,9 kb e um outro Sphl-PstI de 0,5 kb.

Os dois fragmentos mais longos foram purificados e misturados com o fragmento Sphl-PstI que correspondem à hirudina mutada e provenientes do fage M13TG1827, e obteve-se assim um novo vector de expressão: pTG1828 (figura 6)

EXEMPLO 3

Transferência do fragmento no vector PTG881 : novo plasmido PTG1833

ADN de pTG881 foi parcialmente digerido por PstI, de modo a libertar um fragmento de 6,1 kb. Este fragmento foi isolado e depois digerido totalmente por BglII, o que liberta dois fragmentos PstI-PstI e PstI-BglII. Estes dois fragmentos foram ligados com o fragmento PstI-BglII de 0,62 kb saído de pTG1828. Reconstitui-se assim um novo vector pTG1833 que não difere do plasmido pTG897 senão

27. SS 1?94 pela delecção das sequências que codificam para Glu Ala Glu Ala. A estrutura do precursor assim formado está representada na figura 7. Este plasmido pTG1833 possui uma origem de replicação para E. coli, um gene de resistência à amplicilina, o gene Leu 2 de S. cerevisiae, um fragmento do plasmido 2μ que permite a replicação no S. cerevisiae, o promotor do gene MFalfa!^ que codifica para pre-pro e o gene da hirudina (figura 6).

EXEMPLO 4

Transformação da levedura pelos plasmidos pTG1828 epTG1833

Mod. 71 20.000 e«. 92/12

Transformou-se a estirpe S. cerevisiae TGYlsp4 (Matalfa ura3-251-373'-328 his3-ll-15) pelos plasmidos pTG1818, pTG1828 e pTG1833. Os resultados indicados no quadro 1 indicam que pTG1818 e pTG1833 provocam actividade hirudina.

a secreção de um mesmo nível de

Pelo contrário,

TGYlsp4 pTG1818 hirudina que as segrega duas vezes menos actividade duas outras estirpes. Como controle, inclui-se uma estirpe TGYlsp4 pTG881 que não possui informação genética oara a hirudina. Comparou-se igualmente a produção de hirudina segregada pelas estirpes de 5.

cerevisiae (Mat a) TGY14-1 transformada quer por pTG1828 quer por pTG1833 e TGY14-2 transformada pelos mesmos plasmidos (quadro 2) . Lá ainda, assinala-se que no caso da estirpe TGY14-2 (tipo sexual Matalfa), o plasmido pTG1833 induz uma melhor secreção de hirudina que o plasmido pTG1828. Pelo contrário, no caso da estirpe TGY14-1 (tipo sexual Mat a) pTG1833 não induz secreção de hirudina, como esperado, ao passo que TGY14-2 produz a hirudina.

7 £S.

QUADRO 1

Actividade antitrombina dos sobrenadantes de culturas de levedura (10 ml) (48 h de cultura, meio YNBG e casamino-ácidos 0,5%)

Receptora	Plasmido	Actividade total
TGYlsp4	pTG881	não detectável
	pTG1818	158
	pTG1828	73
	pTG1833	149

Mod. 71 · 20.000 e«. · 92/12

Actividade	OUADRO 2
antitrombina dos	spbrenadantes de cultura de
levedura (	10 ml)
(72 h de	cultura, meio YNBG + casamino-ácidos 0,5%)
Receptora	Plasmido	Actividade total
TGY14-1	pTG881	não detectável
	pTG1828	54
	pTG1833	não detectável
TGY14-2	pTG881	não detectável
	pTG1828	103
	pTG1833	210
EXEMPLO 5
Isolamento	de estirpes que	podem ser cultivadas em meio
completo sem que o fenotioo	plasmídico sei a perdido

Mostrou-se na patente WO 86/01224 que a introdução de certas mutações que conferem a resistência ao 5-FU na estirpe ura3 transformada em ura+ por inclinação de um

plasmido permitiu uma maior escolha de meios para a cultura destas estirpes transformadas; poder-se-ia em particular utilizar os meios complexos industriais. A partir da estirpe TGYlspà pTG1833 isolaram-se mutantes espontâneos capazes de formar colónias sobre meio completo (YGP) suplementado com 5-Fluorouracilo 1 mg/ml segundo o protocolo descrito na patente WO 86/01224. 6 Mutantes foram cultivados em meio completo e deles foi escolhido um que não apresentava qualquer colónia curada para o plasmido depois de 20 gerações de crescimento em condições não selectivas.

mutante, denominado TGYlsp4-3, pode ser utilizado para a produção de hirudina em meio completo.

Mod. 71 · 20.000 e<. · 92/12

EXEMPLO 6

Estratégia de síntese da sequência de ADN crue codifica para HV1

Esta sequência deverá compreender os elementos que permitem a fusão em fase da sequência de HV1 com a parte pre-pro de MFalfal e os sinais que permitem uma maturação correcta da hirudina segregada; em particular a região de junção conterá um par Lys-Arg precisamente a montante do primeiro resíduo NH₂-terminal de HV1.

A estratégia utilizada é semelhante à descrita na patente francesa n° 84 13250. A síntese faz-se em dois blocos separados que são em seguida reunidos devido às suas extremidades coesivas BamHI. 0 primeiro bloco compreende 9 oligonucleótidos numerados de 1 a 9 e o segundo bloco compreende 10 nucleótidos de 10 a 19. As suas sequências e a posição dos oligonucleótidos estão representadas na figura 8.

A carta de restrição assim como a tradução da sequência em amino-ácidos são dados nas figuras 9 e 10.

EXEMPLO 7

Montagem do gene sintético . Primeiro bloco sintético

Mod. ?! · 20.000 e«. - 92/12

Os oligonucleótidos 2 a 8 (figura 8) foram fosfo lados nas suas extremidades 5' para evitar a formação dímeros ou de polímeros: 500 picomoles de cada oligonuc ótido foram tratados com o polinucleótido quinase num volume final de 25 μΐ de Tris HC1 60 mM, lOmM, ditiotreitol 8 mM, contendo 3,3 pmoles ³² ,P (5 000 Ci/nmole) ; passados 15 minutos a 37°C adicionam-se 5 nmoles de ATP não marcado.

unidades)

7,5 MgCl₂gama-ATP incubação (2

PH de de

Depois de incubação a 37°C durante 30 minutos, os híbridos dois a

3, sendo estes pmoles de cada

NaCl 100 mM, esperfragmentos complementares foram tornados dois, à excepção dos fragmentos 1, 2 e últimos misturados conjuntamente. 300 oligonucleótido foram utilizados num volume final 10 μΐ de tris HC1 66 mM, pH 7,5, MgCl₂ 6 mM, midina 0,5 mM, DTT 8mM.

durante 3 minutos são

37°C durante 2 horas.

Estas misturas aquecidas a 100° em seguida arrefecidas lentamente a

Os oligonucleótidos 1-2-3 tornados híbridos foram misturados com os oligonucleótidos 4-5 e incubados a 37°C durante 2 horas. Da mesma maneira, procedeu-se à hibridação dos pares de oligonucleótidos 6-7 com 8-9. Numa última etapa, reuniram-se os 9 oligonucleótidos assim pré-tratados, que se tinham incubado durante 2 horas a 37°C num volume final de 100 μΐ.

27. JN. i?9<

Mod. 71 · 20.000 e*. - 92/12 pMoles destes oligonucleótidos tornados híbridos foram submetidos a um tratamento pela ligase de T4 durante 15 horas a 15°C. Em seguida adicionou-se à mistura reaccional 50 ng do grande fragmento HindIII-BamHI do M13TG131 prêviamente purificado sobre gel. A mistura de ligação foi em seguida utilizada para transformar células competentes de E.coli JM103. Entre 12 clones fágicos assim obtidos, um único apresentava a sequência procurada : M13TG1888.

. Secrundo bloco sintético

Utilizou-se a mesma estratégia para sintetizar o segundo bloco (figura 8) que foi clonado entre os locais BamHI e Sall do fage M13TG 131. Dois clones dos 12 testados apresentaram uma inserção que corresponde à sequência procurada. Um destes clones foi denominado M13TG1889.

. Montagem do gene sintético

Os dois ADN de haste dupla de M13TG1888 e de M13TG1889 foram dirigidos por HindIII e BamHI e por BamHi e Sall respectivamente, e misturados com o grande fragmento HindIII-SalI de pBR322 purificado sobre gel. Depois de ligação a mistura serviu para transformar E. coli 1106. Por selecção para a resistência à ampicilina obteve-se o plasmido pTG1890 que contém a sequência sintética correctamente reconstituída.

EXEMPLO 8

Construção do vector OTG1391 gue permite a secreção da hirudina sintetizada fragmento de ADN de pTG1890 que compreende a sequência que codifica HV1 é retomado sob a forma de fragmento HindiII-BglII (estando o local BglII situado precisamente a montante do local Sall que serviu para a

FR» clonagem precedente) para ser inserido entre os locais HindIII e BglII do plasmido pTG881 descrito no pedido de patente n° 85 06672. No plasmido resultante, pTG1891, o 5 gene HV1 encontra-se portanto inserido entre as sequências pre-pro de MFalfal e o terminador de transcrição; esta construção deve portanto assegurar a maturação e a secreção da hirudina HV1 visto que ela é idêntica à pTG1818 (patente n° 85 06672) à excepção das sequências 10 que codificam de HV2 que são substituídas pelas HV1.

Mod. 71 · 20.000 e< 92/12

EXEMPLO 9

Transformação de uma estirpe TGYlsp4 por ADN do plasmido pTG1891

A estirpe TGYlsp4 (alfa-1 ura-3-251-373-328, His311-15) foi transformada pelo plasmido pTG1891; dois clones obtidos por selecção para o carácter ura* foram postos em cultura e a sua produção de hidrulina, segregada no meio de cultura, foi determinada. Como controle, doseou-se nas mesmas condições e quantidade de hirudina segregada por TGYlsp4 pTG1818.

Mede-se duas vezes mais a actividade antitrombina no sobrenadante de cultura da estirpe TGYlsp4 pTG1891 (0,9 mg/1 de sobrenadante de cultura) do que a da estirpe TGYlsp4 pTG1833.

Depósito de estirpes representativas do invento

As estirpes seguintes foram depositadas na Colecção Nacional de Culturas de Microrganismos do Instituto Pasteur, 28, rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cédex 15:

* 6 de Junho de 1986 :

. Saccharomyces cerevisiae TGYlsp4 pTG1828, sob o n° I569 . Saccharomyces cerevisiae TGY1SP4.3 pTG1833, sob ο n° I570 .

Mod. 71 · 20.000 ·«. 92/12 * 6 de Novembro de 1986 :

. Saccharomyces cerevisiae TGY1SP4 pTG1891 sob o n° 1-623 REFERÊNCIAS

1) Achstetter, T. e Wolf, D.H. (1985) EMBO Joumal 4., 173.

2) Zoller, M.J. e Smith M.H. (1983) Meths in Enzym. 100, 469.

3) Lathe, R. ; Kieny, M.P. ; Skory, S. e Lecocq J-P (1984) DNA 2, 173.

4) Bussey H., Saville D., Greene D. et al. (1983) Mol.

Cell. Biol. 2, 1362-1370

Lisboa, . 2ZJ^(|994

Por TRANSGENE S.A. Sociáté Anonyme

VASCO MARO0E5 lett?

Age .ie O|‘<iol

d. Propriedade Indujmei e«»r|.-Juc· ·« ConceicA·. 3. L*-I1N UNM*

21. Μ.

DUPLA DIGESTÃO IPSTI-BGLII

FIG.1

HIBRIDAÇÃO DO DNA DE Μ13Τ6Θ97 COM O OLIGON DA MUTAGENESE (a) 5 TCTTTGGATAAAA6AAT7ACGTATACAGAC- 3 ’ (b) 3’......TTCCCCATAGAAACCTATTTTCTTAATSCATATGTCTGACQ......5'

ALONGAMENTO DA HASTE COMPLEMENTAR PELA POLIMERASE DE KLENOW

I

LIGAÇAO TRANSFORMAÇÃO E.coli í

(c) 3’......TTCCCCATAGAAACC7ATTTTCTTAATCCATATGTCTBACG......5’ : MUTAGENESE IN VITRO

smai7ecori°

BGLII

ECORI

DIGESTÃO PARCIAL

KLENOW

LIGAÇÃO

SMA1*/ECOR1^e

FIG.3

-Abertura por BglII

'.Geração de delecções por acção de Bal31

-Inserção de um local BamHI T par de base a montante de ATGiniciador de MFaipnai

PTG863

PTG89Í

FIG.4 . digestão do DNA de pTG892 por Sal I BamHI.

. Isolamento do fragmento de DNA mais curto

Clonagem deste fragmento entre os locaisSaH eh BamHI do polylínker de M13hg120.

ESTRUTURA DE Μ13Τ6Θ89

Sequência

M13TG12O i ·-- · ---ifragmento Sall- BamH pTG892

FIG.5

BAMHI* BGLII °

HINDIII

2u

PT51626

PGK TERM

URA3 5 * PROM PGK

Prepro

HIR

ORI

LEU2

ECORI _PSTI

ECORI

HINDIII

XBAI

KPNI

Lsphi bglii pyui

PVUII-HINDIII⁰

FIG 6 ί 6. ClF 1994

YSCF

FERCtlQNJl* ......... ...

Lys Arg Glu Ala Glu Ala Trp His ...

pTC885 ... Lys Arg Glu Ala Glu Ala Trp Leu Gin Vai Asp Gly Ser Met Ile Thr ...

pTG897 - .· Lys Arg Glu Ala Glu Ala Ile Thr...

pTC16O5 ... Lys Arg Glu Ala Glu Ala Lys Arg Ile Thr...

pTGieifl ... Lys Arg Glu Ala Glu Ala 5er Leu Asp Lys Arg lie Thr...

pTG1820

... Lys Arg Ile Thr ...

pTG1833

FIG.7

27. JiX i?94

FIG.8

Hl ND III

AG CTTCTTTGGATAAAAGAGTCGTATACACTGA^TGCACCGAATCCGGTCAGAA..

AGAAACCTATTTTCTCAGCATATGTGACTGACGTGGCTTAGGCCAGTCTT.. 2 t 3 ¹ 5 .

CCTG^GCCTGTGCGAAGGTTCTAACGTTT^CGGTCAGGGTAACAAA..

GGACACGGACACC^TT CCAAGATTGCAAACGCCAGTCÇCATTGTTT..

tgcatcctcg^atccgacg^tgaaaaaaaccagt^cgttaÈaggtgaa..

ACGTAGGAGCCTAG^CTGCCACTTTTTTTGGTCACGCAATGTC^CTT..

G GTACTCCGAA^CCGCAGTCTCATAACGACGGTGACT?CGAA..

C CATGAGG CTTTGGCGTCAGAÊTATTGCTG CCACTGAAG CTT.. 13 ’ 15 , 19

GAAATTCCAGAAGAATCTTGCAGTAATAAGATCTG CTTIAAGGTCTTCTTAGAACGTCATTATTCTAGACAGÇT '16 '18 SalI

27. Μ. ^;?94

FIG- 9,1

1-AluI

V

1-HinfI

1-AccI U V

2-HinfI

1-HpaII

U V

AGCTTCTTTGGATAAAACAGTCGTATACACTGACTGCACCGAATCCGGTC

23 45

41 .

1-HaeIII

1-MaeII 1-NsiI

V U V 100

AGAACCTGTGCCTGTGCGAAGGTTCTAACGTTTGCGGTCAGGGTAACAAA 73 100

1- Sau3A

2- EirJ

1-XhoII

1-N1alV

1-E.irJ

I-Fbb.HI

1-HnlI

1-FokI

1-SfaNI

1-HphI

101 VV V UV V l-Rsal

2-MaeIII

2-HphI

V V V

TGCATCCTCGGATCCGACGGTGAAAAAAACCAGTGCGTTACAGGTGAAGGTACT

119

102

103

106

110

111

143

137

150 *£>f

FIG-9-2

1-ΧπιΓιΙ

1-MboII

1-TaqI

1-AsuII

3-MaeIII
	3-HphI	2-KboII
	UV VU V	V 200
	CCGAAACCGCAGTCTCATAACGACGGTGACTTCGAAGAAATTCCAG
	179	200
	180
	185 186 188 188

2-Sau3A

2-XhoII l-EglII

201 VV

AAGAATACTTGCAGTAATAAGATCTG

220

221

I

FIGJO

ATG	GTA	GTT	TAT	ACC	GAC	TGC	ACC	GAA	TCC
Met	Val	Val	Tyr	Thr	Asp	Cys	Thr	Glu	Ser
4Ϊ-
GGT	CAG	AAC	CTG.	TGC	CTG	TGC	GAA	GGT	TCT
Gly	Gin	Asn	Leu	Cys	Leu	cys	Glu	Gly	Ser
71
AAC	GTT	TGC	GGT	CAG	GGT	AAC	AAA	TGC	ATC
Asn	Val	cys	Gly	Gin	Gly	Asn	Lys	Cys	Ile
10Í

CTC GGA TCC GAC GGT GAA AAA AAC CAG TGC

Leu Gly Ser Asp Gly Glu Lys Asn Gin Cys

131

GTT ACA GGT GAA GGT ACT CCG AAA CCG CAG

Val Thr Gly Glu Gly Thr Fro Lys Fro Gin

161

TCT CAT AAC GAC GGT GAC TTC

Ser His Asn Asp Gly Asp Fhe

GAA GAA ATT

Glu Glu Ile

191

CCA GAA GAA TAT TTA CAA TGA AAA ATG AAA
Fro	Glu	Glu	Tyr	Leu	Gin	xxx Lys	Hei	Lys

nn i	251
GAA	TAT	CAA	TCA	TAG	AGA	ATT	TTG	ATT	T
Glu	Tyr	Gin	Ser	XXX	Arg	Ile	Leu	Ile	XXX

JX-994

Mod. 71 - 20.000 ex. · 92/12

Claims

I^a. Processo para a preparação da hirudina ou uma das suas variantes caracterizado por se fazer a fermentação de uma 5 levedura que recupera a hirudina produzida no meio da cultura sob a forma madura ou sob a forma de um precursor que se pode maturar in vitro ou in vivo.
2^a. Processo para a preparação da hirudina caracterizado por a levedura ser transformada por um plasmido ou por um bloco funcional de ADN.
3^a . Processo para a preparação da hirudina de acordo com a reivindicação 2 caracterizado por o plasmido compreender : J

- a origem de replicação do plasmido de levedura 2 μ,

- o gene ura3,

- uma origem de replicação no E. coli e um marcador de resistência a um antibiótico,

- a região 5' do gene MFalfal que compreende o promotor de transcrição, a sequência principal e sequência pre-pro do precursor do factor alfa,

- o terminador de transcrição do gene PGK da levedura colocado a jusante do gene da hirudina.
4^a. Processo para a preparação da hirudina, de acordo com as reivindicações 1 e 2 no qual a levedura é caracterizada por se tratar de estirpes de Saccharomyces.
5^a. Processo para a preparação da hirudina, de acordo com as reivindicações 1 e 2 no qual a levedura é caracterizada por se tratar de estirpes de S. cerevisiae.

Processo para a preparação de hidrudina, de acordo com
6.GÍI7. Í994 as reivindicações 4 e 5 no qual a levedura é caracterizada por se tratar de estripe do tipo sexual Mata ou então de uma estirpe diplóide ou poliplóide desprovida do tipo sexual.
7^a. Processo para a preparação da hirudina, de acordo com as reivindicações 4, 5 e 6 no qual a levedura é caracterizada por se tratar de uma estirpe que depois de transformada, resiste ao 5-fluorouracilo.

Mod. 71 . 20.000 ·<. · 92/12
8 ^a . Processo para a preparação da hirudina de acordo com as reivindicações 1 e 2 e caracterizado por _ o bloco funcional de ADN que permite a preparação da hirudina ç*compreender pelo menos asequencia: - -··, ~' - - gene H . ser uma sequência de ADN que compreende os sinais que asseguram a transcrição do gene H pela levedura;

. L_a ser sequência principal necessária para obter a excreção do produto do gene, . S_cl ser uma sequência de ADN que codifica para o local de clivagem situado no precursor da hirudina imediatamente a montante do gene H . sendo o gene H-o que codifica a hirudina ou uma das suas variantes.
9^a. Processo para a preparação da hirudina de acordo com a reivindicação 8 caracterizado por a sequência L_a ser aquela que permite a secreção da feromona sexual alfa de levedura.
10^a. Processo para a preparação da hirudina de acordo com a reivinsdicação 8 caracterizado por a sequência S_tr compreender o promotor de gene PGK de levedura.

Γ.
11*. Processo para a preparação da hirudina de acordo com a reivindicação 8 caracterizado por o gene H ser seguido de uma sequência final de levedura tal como a do gene PGK e ser o gene que codifica para HV1 ou HV2.