JPH04258294A - 分泌ベクター、該ベクターで形質転換した微生物及び該微生物から産生される産物の製造法 - Google Patents
分泌ベクター、該ベクターで形質転換した微生物及び該微生物から産生される産物の製造法Info
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Landscapes
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、異種蛋白質の生産のた
めの分泌ベクターに関する。特にヒルジン又はその変異
体を菌体外に大量生産するための分泌ベクターに関する
。さらに本発明は、該分泌ベクターで形質転換された形
質転換微生物及び該形質転換微生物を用いるヒルジン又
はその変異体の製造方法に関する。 【０００２】 【従来の技術及び発明が解決しようとする課題】薬用ヒ
ル（Ｈｉｒｕｄｏ ｍｅｄｉｃｉｎａｌｉｓ） の唾液
腺から分泌される抗血液凝固因子であるヒルジンは、６
５個及び６６個のアミノ酸から成るペプチドの混合物で
ある。ヒルジンの構造はＤｏｄｔ等〔ＦＥＢＳ Ｌｅｔ
ｔ． １６５， １８０（１９８４） 〕により解明さ
れ、これはヒルジン変異体（Ｖａｒｉａｎｔ）１（ＨＶ
１）に相当し、２番目のＨＶ２〔Ｈａｒｖｅｙ等 Ｐｒ
ｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ， ＵＳＡ，
８８， １０８４（１９８６）〕はＨＶ１と９個のアミ
ノ酸が異なり、３番目のＨＶ３〔Ｄｏｄｔ等 Ｂｉｏｌ
． Ｃｈｅｍ． Ｈｏｐｐｅ−Ｓｅｙｌｅｒ， ３６７
， ８０３（１９８６） 〕は Ｓｅｒ３２までＨＶ２
と同一で、Ｃ末端側でアミノ酸（Ａｌａ６３） の付加
を含む、１０個のアミノ酸が異なる。 【０００３】これらの天然変異体以外に、遺伝子工学的
手法を用いていくつかの人工変異体が創出されており、
特に本発明者らによって提案されたキメラヒルジン（ヒ
ルジンＨＶ１Ｃ３）（特願平２−３０３０９６）は抗ト
ロンビン活性が強く、しかも出血傾向が低いことから、
抗凝血剤として有用である。これらヒルジンの天然変異
体及びヒルジンＨＶ１Ｃ３のアミノ酸配列を図１に示す
。 【０００４】ヒルジンの遺伝子工学的製法は種々提案さ
れているが、満足できる方法はない。特に工業的見地か
らは、生産された蛋白質を細胞外に分泌させることがで
きると、生産物が活性のある形で存在するため生産物の
分離精製が容易になるだけでなく、生産物が菌体内プロ
テアーゼで分解することを防げる等の利点があり、分泌
生産法が望まれていた。ヒルジンの分泌生産に関しては
枯草菌、酵母又は大腸菌を宿主とする方法がいくつか提
案されている。枯草菌を宿主とする方法は、一般に枯草
菌の菌体内ではプラスミドが不安定なためしばしば脱落
が起り、生産物の安定生産が困難なこと及び菌体外プロ
テアーゼによって生産物が分解され易いことが欠点とさ
れている。ヒルジンの生産に関して提案されている方法
（例えば特開平２−３５０８４）においても上述の問題
が解決されておらず、生産量は約１００ｍｇ／ｌに過ぎ
ない。酵母を宿主とする方法は、一般にカルボキシペチ
ターゼによって生産物のＣ末端アミノ酸が水解されるこ
とが知られている。先行文献（Ｎ． Ｒｉｅｈｌ−Ｂｅ
ｌｌｏｎ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｒｔｒ
ｙ １９８９， ２８， ２９４１−２９４９）におけ
るヒルジンＨＶ２の生産においても、Ｃ末端から１又は
２アミノ酸残基の脱落した副産物が生成することが報告
されている。そのため、カルボキシペプチターゼの欠損
した酵母変異株を宿主として使用することが提案されて
いるが（特開平２−１０４２７９）、十分な生産性を得
るには至っていない。 【０００５】大腸菌を宿主とする方法としてはアルカリ
フォスファターゼのシグナル配列を利用する方法が報告
されている（Ｊ． Ｄｏｄｔ ｅｔ ａｌ．，ＦＥＢＳ
Ｌｅｔｔ． ２０２， ３７３−３７７（１９８６）
。この方法は分泌生産とは言え、ペリプラズムへの分
泌が主であり、そのため生産物の回収に際しては浸透圧
ショック等による菌体の破壊が必要であり、また生産量
も４ｍｇ／ｌと低く、満足できるものではなかった。 【０００６】本発明者らは、大腸菌を宿主として異種蛋
白質を菌体外に大量生産させる方法について鋭意検討し
た結果、シグナルペプチドをコードするＤＮＡ配列を含
む分泌ベクターの複製開始点（ｏｒｉ）にｐＵＣプラス
ミドの複製開始点（ｏｒｉ）を用いると、異種蛋白質が
大腸菌の菌体外に大量に分泌生産されることを見出し、
本発明をなすに至った。 【０００７】 【課題を解決するための手段】本発明は、異種蛋白質の
生産のための分泌ベクターに関するものであり、特にヒ
ルジン又はその変異体を菌体外に大量生産するための分
泌ベクターに関する。また、本発明はヒルジン又はその
変異体をコードするＤＮＡ配列を含む該分泌ベクター、
この分泌ベクターによって大腸菌を形質転換した形質転
換微生物及びこの形質転換微生物を培養し、培地中から
生産物を回収する、ヒルジン又はその変異体の製造方法
に関する。 【０００８】本発明の異種蛋白質の分泌ベクターは、ｐ
ＵＣプラスミドの複製開始点（ｏｒｉ）を含むＤＮＡ配
列、ｔａｃプロモーターまたはｔｒｐプロモーターのＤ
ＮＡ配列、シグナルペプチドをコードするＤＮＡ配列及
び異種蛋白質をコードするＤＮＡ配列を含んでなる。 【０００９】本発明のｐＵＣプラスミドの複製開始点（
ｏｒｉ）を含むＤＮＡ配列は、市販のｐＵＣ系のプラス
ミド、例えばｐＵＣ９、ｐＵＣ１８又はｐＵＣ１９など
を適当な組合せの制限酵素によって切断することにより
調製することができる。例えばｐＵＣ１８を制限酵素Ｐ
ｖｕＩあるいはＰｖｕＩとＰｖｕ ＩＩとで切断するこ
とによって得られる複製開始点（ｏｒｉ）を含む約１４
４０塩基対のＤＮＡ配列をｐＵＣプラスミドの複製開始
点として用いることができる。 【００１０】本発明にいうｔａｃプロモーター又はｔｒ
ｐプロモーターのフラグメントは、図２及び図３に示し
た塩基配列を有するもので、ＤＮＡ合成機等により容易
に合成することができる。従って、これらのプロモータ
ーを合成し、これをプラスミドｐＵＣ１８の複製開始点
（ｏｒｉ）のフラグメント等と組合せても良いが、市販
のプラスミドから制限酵素によって切断して得られるＤ
ＮＡ配列を結合させることにより比較的容易に調製でき
る。例えば、市販のプラスミドｐＫＫ２２３−３（ファ
ルマシア製）を制限酵素ＰｖｕＩ及びＮｒｕＩで切断し
たｔａｃプロモーターのＤＮＡ配列を含むフラグメント
と市販のプラスミドｐＵＣ１８を制限酵素ＰｖｕＩ及び
Ｐｖｕ ＩＩ で切断した複製開始点（ｏｒｉ）を含む
ＤＮＡ配列とをＴ４ ＤＮＡリガーゼで接合してプラ
スミドｐＭＫ２を得ることができる。 【００１１】一方、上記プラスミドｐＭＫ２を制限酵素
ＥｃｏＲＩ及びＥｃｏ４７ ＩＩＩで切断してｔａｃプ
ロモーターのＤＮＡ配列を含むフラグメントを除き、こ
れにＤＮＡ合成機等により合成したｔｒｐプロモーター
のＤＮＡ配列を含むフラグメントを挿入することにより
プラスミドｐＭＴ１を得ることができる。 【００１２】本発明のシグナルペプチドをコードするＤ
ＮＡ配列としては大腸菌のペリブラズムに局在する蛋白
質、例えばアルカリフォスファターゼ（ｐｈｏＡ）、β
−ラクタマーゼ（ｂｌａ）のような酵素又はＯｍｐＡ、
ＯｍｐＢ、ＯｍｐＦのような外膜蛋白質などのシグナル
ペプチドをコードするＤＮＡ配列を使用することができ
る。これらのＤＮＡ配列はＤＮＡ合成機を用いて容易に
調製できる。 【００１３】本発明にいう異種蛋白質は、特に限定がな
くどのような蛋白質でもよいが、特にヒルジン及びその
変異体が好適である。このような蛋白質をコードするア
ミノ酸配列としては、図１に示すようなヒルジンＨＶ１
、ＨＶ２、ＨＶ３及びＨＶ１Ｃ３のアミノ酸配列等であ
る。 【００１４】次に本発明において使用するヒルジンＨＶ
１分泌プラスミドｐＭＴＳＨＶ１及びｐＭＫＳＨＶ１を
構築するためのプラスミドｐＵＣＨＶ１、ｐＭＴ１及び
ｐＭＫ２の構築方法及びプラスミドｐＭＴＳＨＶ１Ｃ３
を構築するプラスミドｐＵＣＨＶ３の構築方法を参考例
として示す。 【００１５】 【参考例１】 プラスミドｐＵＣＨＶ１及びプラスミ
ドｐＵＣＨＶ３の調製市販のプラスミドｐＵＣ１８
１０μｇをＥｃｏＲＩ ３０単位、ＨｉｎｄＩＩＩ
３０単位を用いて３７℃で２時間消化した。これをアガ
ロースゲル電気泳動に供してベクター部分を抽出し、フ
ェノール抽出によりタンパクを除き、冷エタノールで沈
澱させた後、５０μｌのＴＥ緩衝液（１０ｍＭ Ｔｒ
ｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、１ｍＭ ＥＤＴＡ）に溶
解した。この溶液の５０ｎｇ相当量にＨＶ１又はＨＶ３
の二重鎖ＤＮＡを含む１０μｌ（６６ｍＭ Ｔｒｉｓ
−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、５ｍＭ ＭｇＣｌ２ 、５ｍ
Ｍ ＤＴＴ、１ｍＭ ＡＴＰ、Ｔ４ ＤＮＡリガ
ーゼ ３００単位）を加え、１６℃で一晩反応させて
、プラスミドｐＵＣ１８のＥｃｏＲＩとＨｉｎｄ ＩＩ
Ｉとの間にＨＶ１遺伝子が挿入されたプラスミドｐＵＣ
ＨＶ１及びＨＶ３遺伝子が挿入されたプラスミドｐＵＣ
ＨＶ３を得た。 【００１６】 【参考例２】 プラスミドｐＭＫ２及びプラスミドｐ
ＭＴ１の調製 （ａ）プラスミドｐＭＫ２の調製 市販のプラスミドｐＫＫ２２３−３（ファルマシア社製
）を制限酵素Ｐｖｕ Ｉ及びＮｒｕ Ｉで切断して得た
ｔａｃプロモーターを含むフラグメントと市販のｐＵＣ
１８を制限酵素ＰｖｕＩ及びＰｖｕ ＩＩ で切断して
得た複製開始点（ｏｒｉ）及びアンピシリン耐性遺伝子
を含むフラグメントとをＴ４ＤＮＡリガーゼにより結合
させた。これを大腸菌ＪＭ１０９株に導入して培養し、
アンピシリン耐性によりスクリーニングして、ｔａｃプ
ロモーターとｐＵＣ１８の複製開始点（ｏｒｉ）とを有
するベクターを得た。このプラスミドをｐＭＫ２とした
。 【００１７】（ｂ）プラスミドｐＭＴ１の調製このプラ
スミドｐＭＫ２ １０μｇを３０単位のＥｃｏＲＩ及
びＥｃｏ４７ＩＩＩ で消化し、ｔａｃプロモーターを
含む断片を除去し、複製開始点（ｏｒｉ）を含む断片を
アガロースゲル電気泳動によって回収した。一方、ｔｒ
ｐプロモーターの塩基配列をＤＮＡ合成機で合成した。 この断片と前記ｐＭＫ２とＥｃｏＲＩおよびＥｃｏ４７
ＩＩＩ で消化した断片とをＴ４ＤＮＡリガーゼにより
１６℃で一晩反応させた。これを用いて大腸菌ＪＭ１０
９株を形質転換し、ｔｒｐプロモーターとｐＭＫ２の複
製開始点（ｏｒｉ）とを有するベクターを調製した。こ
のプラスミドの塩基配列はサンガー等の方法で確認し、
ｐＭＴ１とした。 【００１８】本発明の実施例を示し、本発明を具体的に
説明する。 【実施例１】 ビルジンＨＶ１及びＨＶ１Ｃ３の生産
（１）ヒルジンＨＶ１分泌プラスミドｐＭＴＳＨＶ１の
作製 プラスミドｐＭＴＳＨＶ１は図５に示した方法に従って
構築した。まず、大腸菌のアルカリホスファターゼ（ｐ
ｈｏＡ）のシグナルペプチドとヒルジンＨＶ１のＮ末端
アミノ酸Ｖａ１１ −Ｖａ１３ に対応するＤＮＡ断片
を構築するために、図４に示す４種のオリゴヌクレオチ
オドを合成した。脱保護したのち、１０％ポリアクリル
アミドゲル電気泳動により各オリゴヌクレオチドを精製
した。２種のオリゴヌクレオチド（Ｓ２，Ｓ４）各５０
０ｐｍｏｌをリン酸化後、４種のオリゴヌクレオチド各
２０ｐｍｏｌを混合し、アニールした。これにＴ４ＤＮ
Ａリガーゼを含む溶液２０μｌ中、１６℃で一晩反応さ
せた。フェノール、クロロホルムでタンパクを除き、冷
エタノールで沈澱させ目的とする二重鎖ＤＮＡ断片を得
た。この断片１０分の１量と、制限酵素ＥｃｏＲＩとＡ
ｃｃＩとで切断したｐＵＣＨＶ１（特願平１−２０７２
００）１００ｎｇとをＴ４ＤＮＡリガーゼにより、１６
℃で一晩反応させた。これを用いて大腸菌ＪＭ１０９株
を形質転換し、ｐｈｏＡシグナルペプチドをコードする
領域の直後にヒルジンＨＶ１をコードするＤＮＡ切断が
結合した融合遺伝子を含むハイブリッドプラスミドｐＳ
ＨＶ１を得た。このプラスミドｐＳＨＶ１の塩基配列は
サンガー等の方法で確認した。 【００１９】このｐＳＨＶ１（１０μｇ）を制限酵素Ｅ
ｃｏＲＩ ３０単位、Ｈｉｎｄ ＩＩＩ８０単位を用
いて分解し、アガロースゲル電気泳動に供して、２７６
ｂｐの融合遺伝子断片を精製した。このＤＮＡ断片１０
０ｎｇと大腸菌発現ベクターｐＭＴ１（特願平１−２１
２４４２）を制限酵素ＥｃｏＲＩとＨｉｎｄ ＩＩＩと
で分解したのち、アガロースゲル電気泳動によって精製
したＤＮＡ断片１００ｎｇをＴ４ＤＮＡリガーゼにより
１６℃で一晩反応させた。この反応液を用いて大腸菌Ｊ
Ｍ１０９株を形質転換し、ｔｒｐプロモーターの下流に
ｐｈｏＡシグナルペプチドとヒルジンＨＶ１をコードす
る融合遺伝子が連結したヒルジンＨＶ１分泌プラスミド
ｐＭＴＳＨＶ１を得た。このプラスミドｐＭＴＳＨＶ１
の塩基配列はサンガー等の方法で確認した。 【００２０】（２）ヒルジンＨＶ１分泌プラスミドｐＭ
ＫＳＨＶ１の作製 プラスミドｐＭＫＳＨＶ１は図６に示した方法に従って
構築した。上記のｐｈｏＡシグナルペプチドとヒルジン
ＨＶ１をコードする融合遺伝子と大腸菌発現ベクターｐ
ＭＫ２（特願平１−２１２４４２）を制限酵素ＥｃｏＲ
ＩとＨｉｎｄ ＩＩＩとで分解したＤＮＡ断片をＴ４Ｄ
ＮＡリガーゼで反応させ、大腸菌ＪＭ１０９株を形質転
換し、ｔａｃプロモーターの下流に融合遺伝子が連結し
たヒルジンＨＶ１分泌プラスミドｐＭＫＳＨＶ１を得た
。 このプラスミドｐＭＫＳＨＶ１の塩基配列はサンガー等
の方法で確認した。 【００２１】（３）ヒルジンＨＶ１分泌プラスミドによ
るヒルジンＨＶ１の分泌生産 上記（１）及び（２）で構築したプラスミドｐＭＴＳＨ
Ｖ１及びｐＭＫＳＨＶ１により形質転換された大腸菌Ｅ
．ｃｏｌｉ ＪＭ１０９株を１００μｇ／ｍｌのアン
ピシリンを含む２ｘＹＴ培地（バクトトリプトン１６ｇ
／ｌ、バクトイーストエキストラクト１０ｇ／ｌ、Ｎａ
Ｃｌ ５ｇ／ｌ）で培養した。３７℃で２４時間培養後
、培養液１ｍｌを集菌した。沈澱した細胞の各サンプル
を１ｍｌの２５％シュークロース、５０ｍＭ Ｔｒｉ
ｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１ｍＭ ＥＤＴＡに懸濁
し、室温にて１０分間処理した。６０００×ｇにて１０
分間の遠心分離により集菌したのち、細胞を１ｍｌの冷
水に懸濁し、浸透圧ショックをかけて、細胞のペリプラ
ズム空間中の物質を放出させた。６０００×ｇにて１０
分間の遠心によりペリプラズム画分から細胞を除去し、
上清中の抗トロンビン活性を測定することにより、ヒル
ジンの分泌蓄積量を測定した。抗トロンビン活性は、ト
ロンビンに対する合成基質クロモザイムＴＨ（トシルグ
リシルプロリルアルギニン４−ニトロアニリドアセテー
ト、ベーリンガーマンハイム社製）水解活性の阻害度を
比色定量試験により測定した。 【００２２】該反応は、１ｍｌの反応容量において、１
００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．５）、１５０
ｍＭ ＮａＣｌ、０．１％ポリエチレングリコール６
０００からなる緩衝液に０．３６Ｕのヒト−トロンビン
（シグマ社製）を加え、標準ヒルジン又は未知のサンプ
ルをこのトロンビン反応混合物に添加し、３７℃で３分
間プレインキュベートした。終濃度２００μＭとなるよ
うに基質、クロモザイムＴＨを加え、ｐ−ニトロアニリ
ドの遊離を波長４０５ｎｍで測定し、１分間あたりの吸
収の増加を求め、抗トロンビン活性（ＡＴＵ）を測定し
た。 【００２３】その結果、プラスミドｐＭＴＳＨＶ１を有
する株では培地１ｍｌあたり４５０ＡＴＵの抗トロンビ
ン活性が認められた。プラスミドｐＭＫＳＨＶ１を有す
る株では培地１ｍｌあたり３６０ＡＴＵの抗トロンビン
活性が認められた。また、プラスミドｐＭＴＳＨＶ１を
Ｈａｎａｈａｎ等の形質転換法により、種々の大腸菌Ｊ
Ｍ１０１、ＪＭ１０３、ＪＭ１０９、ＴＧ１、ＨＢ１０
１、ＪＡ２２１、ＩＦＯ３３０１、Ｃ６００、ＲＲ１、
ＤＨ５に導入し、分泌生産の検討を行なった結果を表１
に示した。宿主としてＲＲ１を用いた場合、約２０００
ＡＴＵ／ｍｌのＨＶ１が分泌生産された。 【００２４】 【表１】 ─────────────────────────
─────────── 菌 株
Ａ６６０ｎｍ 活
性 生成ＨＶ１ の活性
（ＡＴＵ／ｍｌ） （
ＡＴＵ／ｍｌ／Ａ６６０ｎｍ） ──────────
─────────────────────────
─ ＪＭ１０１ ４．１２
２５６．４
６２．２ ＪＭ１０３
４．１２
３０６．７ ７
４．４ ＪＭ１０９ ３
．０６ ４５０．５
１４７．２ ＴＧ１
５．７７
１８５．２
３２．１ ＨＢ１０１
３．７６ ９９．０
２６．３ Ｊ
Ａ２２１ ５．７２
４１３．２
７２．２ ＩＦＯ３３０１
２．６１ １４
８．１ ５６．８
Ｃ６００ ４．０２
５２６．３
１３０．９ ＲＲ１
７．２３
２０００．０ ２７６．
６ ＤＨ５ ７．０
０ １０．６
１．５ ─────────
─────────────────────────
──【００２５】（４）形質転換株Ｅ．ｃｏｌｉ Ｊ
Ｍ１０９株／ｐＭＴＳＨＶ１の発酵及び培養液へのヒル
ジンＨＶ１の分泌 上記（３）に記載した方法と同様にして、５ ｌの発酵
槽において、２ ｌの２％グルコースを含む２ｘＹＴ培
地中でプラスミドｐＭＴＳＨＶ１で形質転換されたＥ．
ｃｏｌｉ ＪＭ１０９菌株（Ｅ．ｃｏｌｉ ＪＭ１
０９／ｐＭＴＳＨＶ１）（微工研条寄第３２６６号）を
、３７℃、２４時間通気撹拌培養を行なったところ、培
養液中に１ｍｌあたり約５３００ＡＴＵのヒルジンＨＶ
１の分泌生産が認められた。 【００２６】（５）培養液からのヒルジンＨＶ１の精製
法 発酵の後培養液１．５ ｌを収得し、そして遠心分離（
６０００×ｇ、１０分間）して上清から細胞を分離した
。 上清の塩濃度を塩分計で測定したところ、１．３％であ
ったので、これを１０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ
７．０）で４倍希釈し、３．２μｍフィルター（ポール
社製）を通して濾過した。得られた濾液を１０ｍＭリン
酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）で平衡化させたＱＡＥ
−トヨパールカラム（４．４×７ｃｍ）にかけた。適用
後、平衡化緩衝液で洗浄後、０．２Ｍ ＮａＣｌでヒ
ルジンＨＶ１を段階溶出させた。溶出液をアミコンのダ
イアフローメンプレン（ＹＭ５）を用いて濃縮し、１０
ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）で平衡化した
セファクリルＳ−１００のカラムでゲル濾過した。 【００２７】活性画分をさらに１０ｍＭリン酸カリウム
緩衝液（ｐＨ７．０）で平衡化したＤＥＡＥ−トヨパー
ルカラム（４．４×４０ｃｍ）に添加し十分洗浄後、３
ｌの平衡化緩衝液および３ ｌの塩化ナトリウム中の
０．３Ｍの平衡化緩衝液の直線の勾配で溶離した。最後
にウォーターズのデルタプレップ３０００によるＣ４
逆相ＨＰＬＣカラムでの精製を行なった。カラムを０．
０６５％（ｖ／ｖ）トリフルオロ酢酸及び１５〜３０％
（ｖ／ｖ）アセトニトリルの直線グランジェントにより
カラムからヒルジンＨＶ１を溶出させて、精製ヒルジン
ＨＶ１を得た。これらの各工程におけるヒルジンＨＶ１
の精製の度合を表２に示した。 【表２】 ─────────────────────────
─────────── 精製ステップ
総蛋白質 総活性
比活性 回収率
（ｍｇ）
（ＡＴＵ） （ＡＴＵ／ｍｇ）
（％） ───────────────────
───────────────── 培 養
液 １３６８０
６０３０２９７ ４４１
１００ ＱＡＥ−トヨパール １
３２４ ６１３２８１２
４６３０ １０１．７ Ｓ−１００
ＨＲ ８７２
６１６２１５６ ７０６６
１０２．２ ＤＥＡＥ−トヨパール
８２１ ６０８００１９
７４０７ １００．８ Ｃ４Ｒ
Ｐ−ＨＰＬＣ ５７０ ４６
７５２１１ ８２０２
７７．５ ───────────────────
─────────────────【００２８】精製
されたヒルジンＨＶ１のアミノ酸組成及びＮ末端アミノ
酸配列を調べたところ、アミノ酸組成値は表３に示すよ
うに天然型ＨＶ１の値を示し、Ｎ末端配列は表４に示す
ようにＶａｌ−Ｖａｌ−Ｔｙｒであり、ｐｈｏＡシグナ
ルペプチドが正しく切断されていることがわかった。抗
トロンビン活性を測定した結果、９６００ＡＴＵ／ｍｇ
であった。 【００２９】 【表３】 ───────────
─────────────
ＨＶ
１ ＨＶ１Ｃ３
─────────────────
───────
Ａｓｘ ９．００
９．９５
Ｔｈｒ ３．
８６ ３．８４
Ｓｅｒ
３．７０ ３．６７
Ｇｌｘ
１３．７８
１２．６５
Ｇｌｙ ８．８９
８．８６
Ａｌａ ０．０
０ １．０６
Ｃｙｓ
５．４０ ５．４０
Ｖａｌ
２．９４
２．９２
Ｍｅｔ ０．００
０．００
Ｉｌｅ １．８９
１．８６
Ｌｅｕ
４．０４ ８．０１
Ｔｙｒ
２．０６ ２
．０６ Ｐ
ｈｅ １．００
１．００
Ｈｉｓ １．１８
１．１１
Ｌｙｓ
３．０２ ３．０２
Ａｒｇ
０．００ ０．
００ Ｐｒ
ｏ ３．０５
４．０８ ──
──────────────────────【００
３０】 【表４】 ───────────
─────────────
サイクル数 アミノ酸
収量（ｐｍｏｌ）
────────────────────────
１
Ｖａｌ
３１０
２ Ｖａｌ
４９０
３ Ｔｙｒ
１８９
４
Ｔｈｒ １３８
５
Ａｓｐ
４２
６ Ｃｙｓ
──
７ Ｔｈｒ
４４
８
Ｇｌｕ ９９
９
Ｓｅｒ ４３６
１０
Ｇｌｙ
２０５
１１ Ｇｌｎ
１３１
１２ Ａ
ｓｎ ６６
１３
Ｌｅｕ １４８
１４
Ｃｙｓ
── １
５ Ｌｅｕ
１７４ ─
───────────────────────【０
０３１】（６）ヒルジンＨＶ１Ｃ３分泌プラスミドｐＭ
ＴＳＨＶ１Ｃ３の作製 プラスミドｐＭＴＳＨＶ１Ｃ３は図７に示す方法に従っ
て構築した。ヒルジンＨＶ１のアミノ酸残基５３位以降
のアミノ酸配列をＨＶ３の配列に置換するために、ＨＶ
１分泌プラスミドｐＭＴＳＨＶ１（１０μｇ）を制限酵
素ＫｐｎＩ ３０単位、Ｈｉｎｄ ＩＩＩ ３０単
位を用いて分解し、アガロースゲル電気泳動に供して、
２．８ＫｂｐのＤＮＡ断片を精製した。またプラスミド
ｐＵＣＨＶ３（特願平１−２０７２００）１０μｇも同
様にＫｐｎＩとＨｉｎｄ ＩＩＩで分解し、ＨＶ３のＣ
末端のアミノ酸配列を有する８０ｂｐのＤＮＡ断片を精
製した。両者のＤＮＡ断片１００ｎｇをＴ４ＤＮＡリガ
ーゼにより１６℃で一晩反応させ、この反応液を用いて
大腸菌ＪＭ１０９株を形質転換し、キメラヒルジンＨＶ
１Ｃ３分泌プラスミドｐＭＴＳＨＶ１Ｃ３を得た。この
プラスミドｐＭＴＳＨＶ１Ｃ３の塩基配列はサンガー等
の方法で確認した。 【００３２】（７）ヒルジンＨＶ１Ｃ３分泌プラスミド
によるヒルジンＨＶ１Ｃ３の分泌生産 上記（６）で構築したプラスミドｐＭＴＳＨＶ１Ｃ３に
より形質転換された大腸菌Ｅ．ｃｏｌｉ ＲＲ１株（
微工研条菌寄第３１３０号）１００μｇ／ｍｌのアンピ
シリンを含む２×ＹＴ培地で培養した。３７℃で２４時
間培養後、培養液１ｍｌを集菌し、細胞に浸透圧ショッ
クを与え、ペリプラズム画分の抗トロンビン活性を測定
した。その結果、培地１ｍｌあたり３０６０ＡＴＵの抗
トロンビン活性が認められた。 【００３３】（８）形質転換株 Ｅ．ｃｏｌｉ Ｊ
Ｍ１０９／ｐＭＴＳＨＶ１Ｃ３の発酵及び培養液へのヒ
ルジンＨＶ１Ｃ３の分泌 プラスミドｐＭＴＳＨＶ１Ｃ３により形質転換された大
腸菌 Ｅ．ｃｏｌｉＪＭ１０９株（微工研条菌寄第３
１０４号）を、５ ｌ の発酵槽において、２ ｌの
２％グルコースを含む２ｘＹＴ培地中で３７℃、２４時
間通気撹拌培養を行なったところ、ペリプラズム中に３
５０ＡＴＵ／ｍｌ、培養液中に５７００ＡＴＵ／ｍｌ、
あわせて６０５０ＡＴＵ／ｍｌの抗トロンビン活性が認
められた。 【００３４】（９）ヒルジンＨＶ１Ｃ３の精製上記（８
）で得られた培養液から上記（５）に従って精製した。 精製されたヒルジンＨＶ１Ｃ３のアミノ酸配列を調べた
ところ、図２に示すようにＣ末端アミノ酸配列が変化し
ていることが確認された。比活性は１１，２５０ＡＴＵ
／ｍｇであった。図８に精製したＨＶ１及びＨＶ１Ｃ３
のＨＰＬＣ ｐｒｏｆｉｌｅを示した。この条件は、
ＶＹＤＡＣ Ｃ４（０．３７×２５ｃｍ）のカラムを
使用し、１５〜３０％のアセトニトリルを用いて１ｍｌ
／ｍｉｎの速度で３０分間ｌｉｎｅａｒ ｇｒａｄｉ
ｅｎｔを行ったものである。 【００３５】 【実施例２】 ヒルジンＨＶ３の生産（１）ヒルジン
ＨＶ３分泌プラスミドの創製（ｉ）参考例１によって調
製されたプラスミドｐＵＣＨＶ３を図９に示すように制
限酵素ＥｃｏＲＩ及びＡｃｃＩで切断して得た複製開始
点（ｏｒｉ）及びアンピシリン耐性遺伝子を含むベクタ
ーフラグメントと図１０のＤＮＡ配列をもつ合成アルカ
リフォスファターゼ（ｐｈｏＡ）のシグナル配列をコー
ドする遺伝子とをＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて連結した
。この結果、アルカリフォスファターゼ遺伝子（ｐｈｏ
Ａ）のシグナルペプチドをコードするＤＮＡ配列をＨＶ
３をコードするＤＮＡ配列の上流に連結したプラスミド
ｐＳＨＶ３を得た。これを大腸菌ＪＭ１０９株に導入し
て培養し、アンピシリン耐性によりスクリーニングした
。 （ｉｉ） 次にプラスミドｐＳＨＶ３を制限酵素Ｅｃｏ
ＲＩ及びＨｉｎｄＩＩＩによって切断し、アルカリフォ
スファターゼ遺伝子（ｐｈｏＡ）のシグナルペプチドを
コードするＤＮＡ配列をＨＶ３をコードするＤＮＡ配列
の上流に連結した２７５ｋｂの遺伝子フラグメントを得
た。 【００３６】（ｉｉｉ） 一方、参考例２の方法によっ
てプラスミドｐＭＴ１を調製した。このプラスミドは参
考例２に記載したようにプラスミドｐＵＣ１８の複製開
始点（ｏｒｉ）を含むＤＮＡ配列、ｔｒｐプロモータの
ＤＮＡ配列を含んでいた。このプラスミドｐＭＴ１を制
限酵素ＥｃｏＲＩ及びＨｉｎｄ ＩＩＩで切断しベクタ
ーフラグメントを得た。 （ｉｖ）前記した２７５ｂｐのフラグメントとベクター
フラグメントとをＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて結合させ
、これを大腸菌ＪＭ１０９株に導入して培養し、アンピ
シリン耐性によりスクリーニングしてｐＵＣプラスミド
の複製開始点（ｏｒｉ）を含むＤＮＡ配列、ｔｒｐプロ
モーターのＤＮＡ配列、アルカリフォスファターゼ遺伝
子（ｐｈｏＡ）のシグナルペプチドをコードするＤＮＡ
配列及びＨＶ３をコードするＤＮＡ配列を含んでいる２
．８７ｋｂのＨＶ３発現ベクター、プラスミドｐＭＴＳ
ＨＶ３を得た。 【００３７】（２）ヒルジンＨＶ３分泌プラスミドによ
るヒルジンＨＶ３の分泌生産 上記のようにして構築したプラスミドｐＭＴＳＨＶ３に
より大腸菌Ｅ．ｃｏｌｉＲＲ１を形質転換し（Ｅ．ｃｏ
ｌｉ ＲＲ１／ｐＭＴＳＨＶ３）（寄託番号微工研菌
寄第３２６７号）、これを１００μｇ／ｍｌのアンピシ
リンを含む２ｘＹＴ培地にグルコース２％を添加し、こ
の培地２ ｌ 中で培養した。培養は、培地２ ｌ
を５ ｌ のジャーに入れ、３７℃で２４時間培養
した。得られた培養液中の抗トロンビン活性は６０７３
ＡＴＵ／ｍｌであった。 【００３８】（３）培養液からヒルジンＨＶ３の精製得
られた培養液を実施例１（５）と同様にして処理してヒ
ルジンＨＶ３を得た。すなわち、培養液を遠心分離して
上清から細胞を除き、上清を１０ｍＭリン酸カリウム緩
衝液（ｐＨ７．０）で４倍希釈し、濾過した。得られた
濾液を実施例１（５）と同様にＱＡＥ−トヨパールカラ
ム（４．４×１３ｃｍ）にかけ、セファクリルＳ−１０
０ＨＲのカラムでゲル濾過した。この活性画分をＤＥＡ
Ｅ−トヨパールカラム（４．４×４０ｃｍ）を用い平衡
化緩衝液及び０．３Ｍ塩化ナトリウムを加えた平衡化緩
衝液の直線濃度勾配で溶解し、最後にバイダックＣ４（
Ｖｙｄａｃ Ｃ４）カラム（０．３７×２５ｃｍ）を
用い、１５〜３０％アセトニトリルの直線グラジエント
（１％／ｍｉｎ、３０分以上）で逆相ＨＰＬＣを行いカ
ラムからヒルジンＨＶ３を溶出させて精製ヒルジンＨＶ
３を得た。各工程におけるヒルジンＨＶ３の精製の度合
を表５に示す。 【００３９】 【表５】 ─────────────────────────
─────────── 精製ステップ
全蛋白質 全活性
比活性 収 率
（ｍｇ）
（ＡＴＵ） （ＡＴＵ／ｍｇ）
（％）────────────────────
──────────────── 培 養 液
１５６００
１１０３４４００ ７０７
１００ ＱＡＥ−トヨパール
２１１１ ９２２７２６４
４３７１ ８３．６
Ｓ−１００ＨＲ
１４５３ ９２６８９６３
６３８１ ８４ ＤＥＡ
Ｅ− トヨパール １３２７
８５９７８９２ ６４７８
７７．９ Ｃ４ ＨＰＬＣ
７９５
６４８６４８０ ８１３９
５８．８ ────────────────
────────────────────【００４０
】精製された生成物のアミノ酸組成及びＮ末端アミノ酸
配列を調べたところ、アミノ酸組成値は表６に示すよう
にヒルジンＨＶ３の理論値と一致し、またＮ末端アミノ
酸配列は表７に示すように第１５番までのアミノ酸配列
がヒルジンＨＶ３のそれと一致しており、シグナルペプ
チドが正しい位置でプロセスしており、ヒルジンＨＶ３
であることが確認された。 【００４１】 【表６】 ─────────────
───────────
ＨＶ３
Ｔｈｅｏｒｙ
─────────────────────
─── Ａｓｘ
９．７６
１０
Ｔｈｒ ４．７４
５
Ｓｅｒ ３．６８
４
Ｇｌｘ １１
．５５ １１
Ｇｌｙ
８．７７ ９
Ａｌａ
１．０７
１ Ｃｙｓ
５．２２
６ Ｖ
ａｌ ２．０３
２
Ｍｅｔ ０．００
０
Ｉｌｅ ２．
９７ ３
Ｌｅｕ
３．０８ ３
Ｔｙｒ
２．０４ ２
Ｐｈｅ
１．００
１ Ｈｉ
ｓ １．２２
１
Ｌｙｓ ４．０３
４
Ａｒｇ ０．０
０ ０
Ｐｒｏ
４．０６ ４
─────────────────
───────
Ｔｏｔａｌ
６６ ──
────────────────────── 【
００４２】 【表７】 ─────────────
───────────
サイクル数 アミノ酸
収量（ｐｍｏｌ） ─────
───────────────────
１
Ｉｌｅ ４６９
２
Ｔｈｒ １
０８ ３
Ｔｙｒ
１０６ ４
Ｔｈｒ
１０２
５ Ａｓｐ
１２２
６ Ｃｙ
ｓ ７
Ｔｈｒ
１００ ８
Ｇｌｕ
７６
９ Ｓｅｒ
３２
１０ Ｇｌ
ｙ １７２
１１
Ｇｌｎ １４５
１２
Ａｓｎ ９
３ １３
Ｌｅｕ
２１１ １４
Ｃｙｓ
１５
Ｌｅｕ １８９
────────────────
──────── 【配列表】配列番号：１ 配列の長さ：ＨＶ１ ６５、ＨＶ２ ６５、ＨＶ３ ６
６、ＨＶ１Ｃ３ ６６配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 １ ２ ３ ４
５ ６ ７ ８ ９ １０
１１ １２ １３ １４ １５ ＨＶ１
Ｖａｌ Ｖａｌ Ｔｙｒ Ｔｈｒ Ａｓｐ
Ｃｙｓ Ｔｈｒ Ｇｌｕ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ｇｌｎ Ａ
ｓｎ Ｌｅｕ Ｃｙｓ Ｌｅｕ ＨＶ２
Ｉｌｅ Ｔｈｒ Ｔｙｒ Ｔｈｒ Ａｓｐ Ｃｙｓ Ｔ
ｈｒ Ｇｌｕ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ｇｌｎ Ａｓｎ Ｌｅ
ｕ Ｃｙｓ Ｌｅｕ ＨＶ３ Ｉｌｅ Ｔ
ｈｒ Ｔｙｒ Ｔｈｒ Ａｓｐ Ｃｙｓ Ｔｈｒ Ｇｌ
ｕ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ｇｌｎ Ａｓｎ Ｌｅｕ Ｃｙｓ
Ｌｅｕ ＨＶ１Ｃ３ Ｖａｌ Ｖａｌ Ｔｙ
ｒ Ｔｈｒ Ａｓｐ Ｃｙｓ Ｔｈｒ Ｇｌｕ Ｓｅｒ
Ｇｌｙ Ｇｌｎ Ａｓｎ Ｌｅｕ Ｃｙｓ Ｌｅｕ
１６ １７ １８ １９
２０ ２１ ２２ ２３ ２４ ２５
２６ ２７ ２８ ２９ ３０
Ｃｙｓ Ｇｌｕ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ａｓｎ
Ｖａｌ Ｃｙｓ Ｇｌｙ Ｇｌｎ Ｇｌｙ Ａｓｎ Ｌ
ｙｓ Ｃｙｓ Ｉｌｅ Ｌｅｕ
Ｃｙｓ Ｇｌｕ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ａｓｎ Ｖａｌ Ｃ
ｙｓ Ｇｌｙ Ｌｙｓ Ｇｌｙ Ａｓｎ Ｌｙｓ Ｃｙ
ｓ Ｉｌｅ Ｌｅｕ Ｃｙｓ Ｇ
ｌｕ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ａｓｎ Ｖａｌ Ｃｙｓ Ｇｌ
ｙ Ｌｙｓ Ｇｌｙ Ａｓｎ Ｌｙｓ Ｃｙｓ Ｉｌｅ
Ｌｅｕ Ｃｙｓ Ｇｌｕ Ｇｌ
ｙ Ｓｅｒ Ａｓｎ Ｖａｌ Ｃｙｓ Ｇｌｙ Ｇｌｎ
Ｇｌｙ Ａｓｎ Ｌｙｓ Ｃｙｓ Ｉｌｅ Ｌｅｕ
３１ ３２ ３３ ３４
３５ ３６ ３７ ３８ ３９ ４０
４１ ４２ ４３ ４４ ４５
Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ａｓｐ Ｇｌｙ Ｇｌｕ
Ｌｙｓ Ａｓｎ Ｇｌｎ Ｃｙｓ Ｖａｌ Ｔｈｒ Ｇ
ｌｙ Ｇｌｕ Ｇｌｙ Ｔｈｒ
Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ａｓｎ Ｇｌｙ Ｌｙｓ Ｇｌｙ Ａ
ｓｎ Ｇｌｎ Ｃｙｓ Ｖａｌ Ｔｈｒ Ｇｌｙ Ｇｌ
ｕ Ｇｌｙ Ｔｈｒ Ｇｌｙ Ｓ
ｅｒ Ｇｌｎ Ｇｌｙ Ｌｙｓ Ａｓｐ Ａｓｎ Ｇｌ
ｎ Ｃｙｓ Ｖａｌ Ｔｈｒ Ｇｌｙ Ｇｌｕ Ｇｌｙ
Ｔｈｒ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ａｓ
ｐ Ｇｌｙ Ｇｌｕ Ｌｙｓ Ａｓｎ Ｇｌｎ Ｃｙｓ
Ｖａｌ Ｔｈｒ Ｇｌｙ Ｇｌｕ Ｇｌｙ Ｔｈｒ
４６ ４７ ４８ ４９
５０ ５１ ５２ ５３ ５４ ５５
５６ ５７ ５８ ５９ ６０
Ｐｒｏ Ｌｙｓ Ｐｒｏ Ｇｌｎ Ｓｅｒ
Ｈｉｓ Ａｓｎ Ａｓｐ Ｇｌｙ Ａｓｐ Ｐｈｅ Ｇ
ｌｕ Ｇｌｕ Ｉｌｅ Ｐｒｏ
Ｐｒｏ Ａｓｎ Ｐｒｏ Ｇｌｕ Ｓｅｒ Ｈｉｓ Ａ
ｓｎ Ａｓｎ Ｇｌｙ Ａｓｐ Ｐｈｅ Ｇｌｕ Ｇｌ
ｕ Ｉｌｅ Ｐｒｏ Ｐｒｏ Ｌ
ｙｓ Ｐｒｏ Ｇｌｎ Ｓｅｒ Ｈｉｓ Ａｓｎ Ｇｌ
ｎ Ｇｌｙ Ａｓｐ Ｐｈｅ Ｇｌｕ Ｐｒｏ Ｉｌｅ
Ｐｒｏ Ｐｒｏ Ｌｙｓ Ｐｒ
ｏ Ｇｌｎ Ｓｅｒ Ｈｉｓ Ａｓｎ Ｇｌｎ Ｇｌｙ
Ａｓｐ Ｐｈｅ Ｇｌｕ Ｐｒｏ Ｉｌｅ Ｐｒｏ
６１ ６２ ６３ ６４
６５ ６６ Ｇｌｕ Ｇｌ
ｕ Ｔｙｒ Ｌｅｕ Ｇｌｎ Ｇ
ｌｕ Ｇｌｕ Ｔｙｒ Ｌｅｕ Ｇｌｎ
Ｇｌｕ Ａｓｐ Ａｌａ Ｔｙｒ Ａｓｐ Ｇ
ｌｕ Ｇｌｕ Ａｓｐ Ａｌａ
Ｔｙｒ Ａｓｐ Ｇｌｕ 配列番号：２ 配列の長さ：１５３ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸合成ＤＮＡ 配列の特徴 特徴を表す記号：ｐｒｏｍｏｔｅｒ 特徴を決定した方法：Ｓ ＴＧＴ ＴＧＡ ＣＡＡ ＴＴＡ ＡＴＣ Ａ
ＴＣ ＧＧＣ ＴＣＧ ＴＡＴ ＡＡＴ ＧＴＧ ＴＧ
Ｇ ＡＴＴ ＴＧＴ ＧＡＧ ４５ ＡＣＡ Ａ
ＣＴ ＧＴＴ ＡＡＴ ＴＡＧ ＴＡＧ ＣＣＧ ＡＧ
Ｃ ＡＴＡ ＴＴＡ ＣＡＣ ＡＣＣ ＴＴＡ ＡＣＡ
ＣＴＣ ９０ ＣＧＧ ＡＴＡ ＡＣＡ ＡＴ
Ｔ ＴＣＡ ＣＡＣ ＡＧＧ ＡＡＡ ＣＡＧ ＡＡＴ
ＴＣ １２２ ＧＣＣ ＴＡＴ ＴＧＴ
ＴＡＡ ＡＧＴ ＧＴＧ ＴＣＣ ＴＴＴ ＧＴＣ Ｔ
ＴＡ Ａ １５３ 配列番号：３ 配列の長さ：１２８ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸合成ＤＮＡ 配列の特徴 特徴を表す記号：ｐｒｏｍｏｔｅｒ 特徴を決定した方法：Ｓ ＧＧＧ ＴＧＴ ＴＧＡ ＣＡＡ ＴＴＡ Ａ
ＴＣ ＡＴＣ ＧＡＡ ＣＴＡ ＧＴＴ ＡＡＣ ＴＡ
Ｇ ＴＡＣ ＧＣＡ ＡＧＴ ４５ ＣＣＣ Ａ
ＣＡ ＡＣＴ ＧＴＴ ＡＡＴ ＴＡＧ ＴＡＧ ＣＴ
Ｔ ＧＡＴ ＣＡＡ ＴＴＧ ＡＴＣ ＡＴＧ ＣＧＴ
ＴＣＡ ９０ ＴＣＡ ＣＧＴ ＡＡＡ ＡＡ
Ｇ ＧＧＴ ＡＧ １０７ ＡＧＴ
ＧＣＡ ＴＴＴ ＴＴＣ ＣＣＡ ＴＣＴ ＴＡＡ
１２８配列番号：４ 配列の長さ：１４４ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸合成ＤＮＡ 配列の特徴 特徴を表す記号：ｓｉｇ ｐｅｐｔｉｄｅ特徴を決定し
た方法：Ｓ Ｍｅｔ Ｌｙｓ Ｇｌｎ Ｓｅｒ Ｔｈ
ｒ Ｉｌｅ Ａｌａ Ｌｅｕ Ａｌａ Ｌｅｕ Ｌｅｕ
Ｐｒｏ Ｌｅｕ Ｌｅｕ ＰｈｅＡＡ ＴＴＣ ＡＴ
Ｇ ＡＡＡ ＣＡＡ ＡＧＣ ＡＣＴ ＡＴＴ ＧＣＣ
ＴＴＧ ＧＣＡ ＣＴＣ ＴＴＡ ＣＣＧ ＴＴＡ
ＣＴＧ ＴＴＴ ５０ Ｇ ＴＡＣ ＴＴＴ
ＧＴＴ ＴＣＧ ＴＧＡ ＴＡＡ ＣＧＧ ＡＡＣ
ＣＧＴ ＧＡＧ ＡＡＴ ＧＧＣ ＡＡＴ ＧＧＣ Ａ
ＡＡ ９６ Ｔｈｒ Ｐｒｏ Ｖａｌ Ｔｈｒ
Ｌｙｓ Ａｌａ Ｖａｌ Ｖａｌ ＡＣＣ ＣＣＧ
ＧＴＧ ＡＣＣ ＡＡＡ ＧＣＴ ＧＴＴ ＧＴ
１１９ ＴＧＧ ＧＧＣ ＣＡＣ ＴＧＧ
ＴＴＴ ＣＧＡ ＣＡＡ ＣＡＴ Ａ １４４
めの分泌ベクターに関する。特にヒルジン又はその変異
体を菌体外に大量生産するための分泌ベクターに関する
。さらに本発明は、該分泌ベクターで形質転換された形
質転換微生物及び該形質転換微生物を用いるヒルジン又
はその変異体の製造方法に関する。 【０００２】 【従来の技術及び発明が解決しようとする課題】薬用ヒ
ル（Ｈｉｒｕｄｏ ｍｅｄｉｃｉｎａｌｉｓ） の唾液
腺から分泌される抗血液凝固因子であるヒルジンは、６
５個及び６６個のアミノ酸から成るペプチドの混合物で
ある。ヒルジンの構造はＤｏｄｔ等〔ＦＥＢＳ Ｌｅｔ
ｔ． １６５， １８０（１９８４） 〕により解明さ
れ、これはヒルジン変異体（Ｖａｒｉａｎｔ）１（ＨＶ
１）に相当し、２番目のＨＶ２〔Ｈａｒｖｅｙ等 Ｐｒ
ｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ， ＵＳＡ，
８８， １０８４（１９８６）〕はＨＶ１と９個のアミ
ノ酸が異なり、３番目のＨＶ３〔Ｄｏｄｔ等 Ｂｉｏｌ
． Ｃｈｅｍ． Ｈｏｐｐｅ−Ｓｅｙｌｅｒ， ３６７
， ８０３（１９８６） 〕は Ｓｅｒ３２までＨＶ２
と同一で、Ｃ末端側でアミノ酸（Ａｌａ６３） の付加
を含む、１０個のアミノ酸が異なる。 【０００３】これらの天然変異体以外に、遺伝子工学的
手法を用いていくつかの人工変異体が創出されており、
特に本発明者らによって提案されたキメラヒルジン（ヒ
ルジンＨＶ１Ｃ３）（特願平２−３０３０９６）は抗ト
ロンビン活性が強く、しかも出血傾向が低いことから、
抗凝血剤として有用である。これらヒルジンの天然変異
体及びヒルジンＨＶ１Ｃ３のアミノ酸配列を図１に示す
。 【０００４】ヒルジンの遺伝子工学的製法は種々提案さ
れているが、満足できる方法はない。特に工業的見地か
らは、生産された蛋白質を細胞外に分泌させることがで
きると、生産物が活性のある形で存在するため生産物の
分離精製が容易になるだけでなく、生産物が菌体内プロ
テアーゼで分解することを防げる等の利点があり、分泌
生産法が望まれていた。ヒルジンの分泌生産に関しては
枯草菌、酵母又は大腸菌を宿主とする方法がいくつか提
案されている。枯草菌を宿主とする方法は、一般に枯草
菌の菌体内ではプラスミドが不安定なためしばしば脱落
が起り、生産物の安定生産が困難なこと及び菌体外プロ
テアーゼによって生産物が分解され易いことが欠点とさ
れている。ヒルジンの生産に関して提案されている方法
（例えば特開平２−３５０８４）においても上述の問題
が解決されておらず、生産量は約１００ｍｇ／ｌに過ぎ
ない。酵母を宿主とする方法は、一般にカルボキシペチ
ターゼによって生産物のＣ末端アミノ酸が水解されるこ
とが知られている。先行文献（Ｎ． Ｒｉｅｈｌ−Ｂｅ
ｌｌｏｎ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｒｔｒ
ｙ １９８９， ２８， ２９４１−２９４９）におけ
るヒルジンＨＶ２の生産においても、Ｃ末端から１又は
２アミノ酸残基の脱落した副産物が生成することが報告
されている。そのため、カルボキシペプチターゼの欠損
した酵母変異株を宿主として使用することが提案されて
いるが（特開平２−１０４２７９）、十分な生産性を得
るには至っていない。 【０００５】大腸菌を宿主とする方法としてはアルカリ
フォスファターゼのシグナル配列を利用する方法が報告
されている（Ｊ． Ｄｏｄｔ ｅｔ ａｌ．，ＦＥＢＳ
Ｌｅｔｔ． ２０２， ３７３−３７７（１９８６）
。この方法は分泌生産とは言え、ペリプラズムへの分
泌が主であり、そのため生産物の回収に際しては浸透圧
ショック等による菌体の破壊が必要であり、また生産量
も４ｍｇ／ｌと低く、満足できるものではなかった。 【０００６】本発明者らは、大腸菌を宿主として異種蛋
白質を菌体外に大量生産させる方法について鋭意検討し
た結果、シグナルペプチドをコードするＤＮＡ配列を含
む分泌ベクターの複製開始点（ｏｒｉ）にｐＵＣプラス
ミドの複製開始点（ｏｒｉ）を用いると、異種蛋白質が
大腸菌の菌体外に大量に分泌生産されることを見出し、
本発明をなすに至った。 【０００７】 【課題を解決するための手段】本発明は、異種蛋白質の
生産のための分泌ベクターに関するものであり、特にヒ
ルジン又はその変異体を菌体外に大量生産するための分
泌ベクターに関する。また、本発明はヒルジン又はその
変異体をコードするＤＮＡ配列を含む該分泌ベクター、
この分泌ベクターによって大腸菌を形質転換した形質転
換微生物及びこの形質転換微生物を培養し、培地中から
生産物を回収する、ヒルジン又はその変異体の製造方法
に関する。 【０００８】本発明の異種蛋白質の分泌ベクターは、ｐ
ＵＣプラスミドの複製開始点（ｏｒｉ）を含むＤＮＡ配
列、ｔａｃプロモーターまたはｔｒｐプロモーターのＤ
ＮＡ配列、シグナルペプチドをコードするＤＮＡ配列及
び異種蛋白質をコードするＤＮＡ配列を含んでなる。 【０００９】本発明のｐＵＣプラスミドの複製開始点（
ｏｒｉ）を含むＤＮＡ配列は、市販のｐＵＣ系のプラス
ミド、例えばｐＵＣ９、ｐＵＣ１８又はｐＵＣ１９など
を適当な組合せの制限酵素によって切断することにより
調製することができる。例えばｐＵＣ１８を制限酵素Ｐ
ｖｕＩあるいはＰｖｕＩとＰｖｕ ＩＩとで切断するこ
とによって得られる複製開始点（ｏｒｉ）を含む約１４
４０塩基対のＤＮＡ配列をｐＵＣプラスミドの複製開始
点として用いることができる。 【００１０】本発明にいうｔａｃプロモーター又はｔｒ
ｐプロモーターのフラグメントは、図２及び図３に示し
た塩基配列を有するもので、ＤＮＡ合成機等により容易
に合成することができる。従って、これらのプロモータ
ーを合成し、これをプラスミドｐＵＣ１８の複製開始点
（ｏｒｉ）のフラグメント等と組合せても良いが、市販
のプラスミドから制限酵素によって切断して得られるＤ
ＮＡ配列を結合させることにより比較的容易に調製でき
る。例えば、市販のプラスミドｐＫＫ２２３−３（ファ
ルマシア製）を制限酵素ＰｖｕＩ及びＮｒｕＩで切断し
たｔａｃプロモーターのＤＮＡ配列を含むフラグメント
と市販のプラスミドｐＵＣ１８を制限酵素ＰｖｕＩ及び
Ｐｖｕ ＩＩ で切断した複製開始点（ｏｒｉ）を含む
ＤＮＡ配列とをＴ４ ＤＮＡリガーゼで接合してプラ
スミドｐＭＫ２を得ることができる。 【００１１】一方、上記プラスミドｐＭＫ２を制限酵素
ＥｃｏＲＩ及びＥｃｏ４７ ＩＩＩで切断してｔａｃプ
ロモーターのＤＮＡ配列を含むフラグメントを除き、こ
れにＤＮＡ合成機等により合成したｔｒｐプロモーター
のＤＮＡ配列を含むフラグメントを挿入することにより
プラスミドｐＭＴ１を得ることができる。 【００１２】本発明のシグナルペプチドをコードするＤ
ＮＡ配列としては大腸菌のペリブラズムに局在する蛋白
質、例えばアルカリフォスファターゼ（ｐｈｏＡ）、β
−ラクタマーゼ（ｂｌａ）のような酵素又はＯｍｐＡ、
ＯｍｐＢ、ＯｍｐＦのような外膜蛋白質などのシグナル
ペプチドをコードするＤＮＡ配列を使用することができ
る。これらのＤＮＡ配列はＤＮＡ合成機を用いて容易に
調製できる。 【００１３】本発明にいう異種蛋白質は、特に限定がな
くどのような蛋白質でもよいが、特にヒルジン及びその
変異体が好適である。このような蛋白質をコードするア
ミノ酸配列としては、図１に示すようなヒルジンＨＶ１
、ＨＶ２、ＨＶ３及びＨＶ１Ｃ３のアミノ酸配列等であ
る。 【００１４】次に本発明において使用するヒルジンＨＶ
１分泌プラスミドｐＭＴＳＨＶ１及びｐＭＫＳＨＶ１を
構築するためのプラスミドｐＵＣＨＶ１、ｐＭＴ１及び
ｐＭＫ２の構築方法及びプラスミドｐＭＴＳＨＶ１Ｃ３
を構築するプラスミドｐＵＣＨＶ３の構築方法を参考例
として示す。 【００１５】 【参考例１】 プラスミドｐＵＣＨＶ１及びプラスミ
ドｐＵＣＨＶ３の調製市販のプラスミドｐＵＣ１８
１０μｇをＥｃｏＲＩ ３０単位、ＨｉｎｄＩＩＩ
３０単位を用いて３７℃で２時間消化した。これをアガ
ロースゲル電気泳動に供してベクター部分を抽出し、フ
ェノール抽出によりタンパクを除き、冷エタノールで沈
澱させた後、５０μｌのＴＥ緩衝液（１０ｍＭ Ｔｒ
ｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、１ｍＭ ＥＤＴＡ）に溶
解した。この溶液の５０ｎｇ相当量にＨＶ１又はＨＶ３
の二重鎖ＤＮＡを含む１０μｌ（６６ｍＭ Ｔｒｉｓ
−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、５ｍＭ ＭｇＣｌ２ 、５ｍ
Ｍ ＤＴＴ、１ｍＭ ＡＴＰ、Ｔ４ ＤＮＡリガ
ーゼ ３００単位）を加え、１６℃で一晩反応させて
、プラスミドｐＵＣ１８のＥｃｏＲＩとＨｉｎｄ ＩＩ
Ｉとの間にＨＶ１遺伝子が挿入されたプラスミドｐＵＣ
ＨＶ１及びＨＶ３遺伝子が挿入されたプラスミドｐＵＣ
ＨＶ３を得た。 【００１６】 【参考例２】 プラスミドｐＭＫ２及びプラスミドｐ
ＭＴ１の調製 （ａ）プラスミドｐＭＫ２の調製 市販のプラスミドｐＫＫ２２３−３（ファルマシア社製
）を制限酵素Ｐｖｕ Ｉ及びＮｒｕ Ｉで切断して得た
ｔａｃプロモーターを含むフラグメントと市販のｐＵＣ
１８を制限酵素ＰｖｕＩ及びＰｖｕ ＩＩ で切断して
得た複製開始点（ｏｒｉ）及びアンピシリン耐性遺伝子
を含むフラグメントとをＴ４ＤＮＡリガーゼにより結合
させた。これを大腸菌ＪＭ１０９株に導入して培養し、
アンピシリン耐性によりスクリーニングして、ｔａｃプ
ロモーターとｐＵＣ１８の複製開始点（ｏｒｉ）とを有
するベクターを得た。このプラスミドをｐＭＫ２とした
。 【００１７】（ｂ）プラスミドｐＭＴ１の調製このプラ
スミドｐＭＫ２ １０μｇを３０単位のＥｃｏＲＩ及
びＥｃｏ４７ＩＩＩ で消化し、ｔａｃプロモーターを
含む断片を除去し、複製開始点（ｏｒｉ）を含む断片を
アガロースゲル電気泳動によって回収した。一方、ｔｒ
ｐプロモーターの塩基配列をＤＮＡ合成機で合成した。 この断片と前記ｐＭＫ２とＥｃｏＲＩおよびＥｃｏ４７
ＩＩＩ で消化した断片とをＴ４ＤＮＡリガーゼにより
１６℃で一晩反応させた。これを用いて大腸菌ＪＭ１０
９株を形質転換し、ｔｒｐプロモーターとｐＭＫ２の複
製開始点（ｏｒｉ）とを有するベクターを調製した。こ
のプラスミドの塩基配列はサンガー等の方法で確認し、
ｐＭＴ１とした。 【００１８】本発明の実施例を示し、本発明を具体的に
説明する。 【実施例１】 ビルジンＨＶ１及びＨＶ１Ｃ３の生産
（１）ヒルジンＨＶ１分泌プラスミドｐＭＴＳＨＶ１の
作製 プラスミドｐＭＴＳＨＶ１は図５に示した方法に従って
構築した。まず、大腸菌のアルカリホスファターゼ（ｐ
ｈｏＡ）のシグナルペプチドとヒルジンＨＶ１のＮ末端
アミノ酸Ｖａ１１ −Ｖａ１３ に対応するＤＮＡ断片
を構築するために、図４に示す４種のオリゴヌクレオチ
オドを合成した。脱保護したのち、１０％ポリアクリル
アミドゲル電気泳動により各オリゴヌクレオチドを精製
した。２種のオリゴヌクレオチド（Ｓ２，Ｓ４）各５０
０ｐｍｏｌをリン酸化後、４種のオリゴヌクレオチド各
２０ｐｍｏｌを混合し、アニールした。これにＴ４ＤＮ
Ａリガーゼを含む溶液２０μｌ中、１６℃で一晩反応さ
せた。フェノール、クロロホルムでタンパクを除き、冷
エタノールで沈澱させ目的とする二重鎖ＤＮＡ断片を得
た。この断片１０分の１量と、制限酵素ＥｃｏＲＩとＡ
ｃｃＩとで切断したｐＵＣＨＶ１（特願平１−２０７２
００）１００ｎｇとをＴ４ＤＮＡリガーゼにより、１６
℃で一晩反応させた。これを用いて大腸菌ＪＭ１０９株
を形質転換し、ｐｈｏＡシグナルペプチドをコードする
領域の直後にヒルジンＨＶ１をコードするＤＮＡ切断が
結合した融合遺伝子を含むハイブリッドプラスミドｐＳ
ＨＶ１を得た。このプラスミドｐＳＨＶ１の塩基配列は
サンガー等の方法で確認した。 【００１９】このｐＳＨＶ１（１０μｇ）を制限酵素Ｅ
ｃｏＲＩ ３０単位、Ｈｉｎｄ ＩＩＩ８０単位を用
いて分解し、アガロースゲル電気泳動に供して、２７６
ｂｐの融合遺伝子断片を精製した。このＤＮＡ断片１０
０ｎｇと大腸菌発現ベクターｐＭＴ１（特願平１−２１
２４４２）を制限酵素ＥｃｏＲＩとＨｉｎｄ ＩＩＩと
で分解したのち、アガロースゲル電気泳動によって精製
したＤＮＡ断片１００ｎｇをＴ４ＤＮＡリガーゼにより
１６℃で一晩反応させた。この反応液を用いて大腸菌Ｊ
Ｍ１０９株を形質転換し、ｔｒｐプロモーターの下流に
ｐｈｏＡシグナルペプチドとヒルジンＨＶ１をコードす
る融合遺伝子が連結したヒルジンＨＶ１分泌プラスミド
ｐＭＴＳＨＶ１を得た。このプラスミドｐＭＴＳＨＶ１
の塩基配列はサンガー等の方法で確認した。 【００２０】（２）ヒルジンＨＶ１分泌プラスミドｐＭ
ＫＳＨＶ１の作製 プラスミドｐＭＫＳＨＶ１は図６に示した方法に従って
構築した。上記のｐｈｏＡシグナルペプチドとヒルジン
ＨＶ１をコードする融合遺伝子と大腸菌発現ベクターｐ
ＭＫ２（特願平１−２１２４４２）を制限酵素ＥｃｏＲ
ＩとＨｉｎｄ ＩＩＩとで分解したＤＮＡ断片をＴ４Ｄ
ＮＡリガーゼで反応させ、大腸菌ＪＭ１０９株を形質転
換し、ｔａｃプロモーターの下流に融合遺伝子が連結し
たヒルジンＨＶ１分泌プラスミドｐＭＫＳＨＶ１を得た
。 このプラスミドｐＭＫＳＨＶ１の塩基配列はサンガー等
の方法で確認した。 【００２１】（３）ヒルジンＨＶ１分泌プラスミドによ
るヒルジンＨＶ１の分泌生産 上記（１）及び（２）で構築したプラスミドｐＭＴＳＨ
Ｖ１及びｐＭＫＳＨＶ１により形質転換された大腸菌Ｅ
．ｃｏｌｉ ＪＭ１０９株を１００μｇ／ｍｌのアン
ピシリンを含む２ｘＹＴ培地（バクトトリプトン１６ｇ
／ｌ、バクトイーストエキストラクト１０ｇ／ｌ、Ｎａ
Ｃｌ ５ｇ／ｌ）で培養した。３７℃で２４時間培養後
、培養液１ｍｌを集菌した。沈澱した細胞の各サンプル
を１ｍｌの２５％シュークロース、５０ｍＭ Ｔｒｉ
ｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１ｍＭ ＥＤＴＡに懸濁
し、室温にて１０分間処理した。６０００×ｇにて１０
分間の遠心分離により集菌したのち、細胞を１ｍｌの冷
水に懸濁し、浸透圧ショックをかけて、細胞のペリプラ
ズム空間中の物質を放出させた。６０００×ｇにて１０
分間の遠心によりペリプラズム画分から細胞を除去し、
上清中の抗トロンビン活性を測定することにより、ヒル
ジンの分泌蓄積量を測定した。抗トロンビン活性は、ト
ロンビンに対する合成基質クロモザイムＴＨ（トシルグ
リシルプロリルアルギニン４−ニトロアニリドアセテー
ト、ベーリンガーマンハイム社製）水解活性の阻害度を
比色定量試験により測定した。 【００２２】該反応は、１ｍｌの反応容量において、１
００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．５）、１５０
ｍＭ ＮａＣｌ、０．１％ポリエチレングリコール６
０００からなる緩衝液に０．３６Ｕのヒト−トロンビン
（シグマ社製）を加え、標準ヒルジン又は未知のサンプ
ルをこのトロンビン反応混合物に添加し、３７℃で３分
間プレインキュベートした。終濃度２００μＭとなるよ
うに基質、クロモザイムＴＨを加え、ｐ−ニトロアニリ
ドの遊離を波長４０５ｎｍで測定し、１分間あたりの吸
収の増加を求め、抗トロンビン活性（ＡＴＵ）を測定し
た。 【００２３】その結果、プラスミドｐＭＴＳＨＶ１を有
する株では培地１ｍｌあたり４５０ＡＴＵの抗トロンビ
ン活性が認められた。プラスミドｐＭＫＳＨＶ１を有す
る株では培地１ｍｌあたり３６０ＡＴＵの抗トロンビン
活性が認められた。また、プラスミドｐＭＴＳＨＶ１を
Ｈａｎａｈａｎ等の形質転換法により、種々の大腸菌Ｊ
Ｍ１０１、ＪＭ１０３、ＪＭ１０９、ＴＧ１、ＨＢ１０
１、ＪＡ２２１、ＩＦＯ３３０１、Ｃ６００、ＲＲ１、
ＤＨ５に導入し、分泌生産の検討を行なった結果を表１
に示した。宿主としてＲＲ１を用いた場合、約２０００
ＡＴＵ／ｍｌのＨＶ１が分泌生産された。 【００２４】 【表１】 ─────────────────────────
─────────── 菌 株
Ａ６６０ｎｍ 活
性 生成ＨＶ１ の活性
（ＡＴＵ／ｍｌ） （
ＡＴＵ／ｍｌ／Ａ６６０ｎｍ） ──────────
─────────────────────────
─ ＪＭ１０１ ４．１２
２５６．４
６２．２ ＪＭ１０３
４．１２
３０６．７ ７
４．４ ＪＭ１０９ ３
．０６ ４５０．５
１４７．２ ＴＧ１
５．７７
１８５．２
３２．１ ＨＢ１０１
３．７６ ９９．０
２６．３ Ｊ
Ａ２２１ ５．７２
４１３．２
７２．２ ＩＦＯ３３０１
２．６１ １４
８．１ ５６．８
Ｃ６００ ４．０２
５２６．３
１３０．９ ＲＲ１
７．２３
２０００．０ ２７６．
６ ＤＨ５ ７．０
０ １０．６
１．５ ─────────
─────────────────────────
──【００２５】（４）形質転換株Ｅ．ｃｏｌｉ Ｊ
Ｍ１０９株／ｐＭＴＳＨＶ１の発酵及び培養液へのヒル
ジンＨＶ１の分泌 上記（３）に記載した方法と同様にして、５ ｌの発酵
槽において、２ ｌの２％グルコースを含む２ｘＹＴ培
地中でプラスミドｐＭＴＳＨＶ１で形質転換されたＥ．
ｃｏｌｉ ＪＭ１０９菌株（Ｅ．ｃｏｌｉ ＪＭ１
０９／ｐＭＴＳＨＶ１）（微工研条寄第３２６６号）を
、３７℃、２４時間通気撹拌培養を行なったところ、培
養液中に１ｍｌあたり約５３００ＡＴＵのヒルジンＨＶ
１の分泌生産が認められた。 【００２６】（５）培養液からのヒルジンＨＶ１の精製
法 発酵の後培養液１．５ ｌを収得し、そして遠心分離（
６０００×ｇ、１０分間）して上清から細胞を分離した
。 上清の塩濃度を塩分計で測定したところ、１．３％であ
ったので、これを１０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ
７．０）で４倍希釈し、３．２μｍフィルター（ポール
社製）を通して濾過した。得られた濾液を１０ｍＭリン
酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）で平衡化させたＱＡＥ
−トヨパールカラム（４．４×７ｃｍ）にかけた。適用
後、平衡化緩衝液で洗浄後、０．２Ｍ ＮａＣｌでヒ
ルジンＨＶ１を段階溶出させた。溶出液をアミコンのダ
イアフローメンプレン（ＹＭ５）を用いて濃縮し、１０
ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）で平衡化した
セファクリルＳ−１００のカラムでゲル濾過した。 【００２７】活性画分をさらに１０ｍＭリン酸カリウム
緩衝液（ｐＨ７．０）で平衡化したＤＥＡＥ−トヨパー
ルカラム（４．４×４０ｃｍ）に添加し十分洗浄後、３
ｌの平衡化緩衝液および３ ｌの塩化ナトリウム中の
０．３Ｍの平衡化緩衝液の直線の勾配で溶離した。最後
にウォーターズのデルタプレップ３０００によるＣ４
逆相ＨＰＬＣカラムでの精製を行なった。カラムを０．
０６５％（ｖ／ｖ）トリフルオロ酢酸及び１５〜３０％
（ｖ／ｖ）アセトニトリルの直線グランジェントにより
カラムからヒルジンＨＶ１を溶出させて、精製ヒルジン
ＨＶ１を得た。これらの各工程におけるヒルジンＨＶ１
の精製の度合を表２に示した。 【表２】 ─────────────────────────
─────────── 精製ステップ
総蛋白質 総活性
比活性 回収率
（ｍｇ）
（ＡＴＵ） （ＡＴＵ／ｍｇ）
（％） ───────────────────
───────────────── 培 養
液 １３６８０
６０３０２９７ ４４１
１００ ＱＡＥ−トヨパール １
３２４ ６１３２８１２
４６３０ １０１．７ Ｓ−１００
ＨＲ ８７２
６１６２１５６ ７０６６
１０２．２ ＤＥＡＥ−トヨパール
８２１ ６０８００１９
７４０７ １００．８ Ｃ４Ｒ
Ｐ−ＨＰＬＣ ５７０ ４６
７５２１１ ８２０２
７７．５ ───────────────────
─────────────────【００２８】精製
されたヒルジンＨＶ１のアミノ酸組成及びＮ末端アミノ
酸配列を調べたところ、アミノ酸組成値は表３に示すよ
うに天然型ＨＶ１の値を示し、Ｎ末端配列は表４に示す
ようにＶａｌ−Ｖａｌ−Ｔｙｒであり、ｐｈｏＡシグナ
ルペプチドが正しく切断されていることがわかった。抗
トロンビン活性を測定した結果、９６００ＡＴＵ／ｍｇ
であった。 【００２９】 【表３】 ───────────
─────────────
ＨＶ
１ ＨＶ１Ｃ３
─────────────────
───────
Ａｓｘ ９．００
９．９５
Ｔｈｒ ３．
８６ ３．８４
Ｓｅｒ
３．７０ ３．６７
Ｇｌｘ
１３．７８
１２．６５
Ｇｌｙ ８．８９
８．８６
Ａｌａ ０．０
０ １．０６
Ｃｙｓ
５．４０ ５．４０
Ｖａｌ
２．９４
２．９２
Ｍｅｔ ０．００
０．００
Ｉｌｅ １．８９
１．８６
Ｌｅｕ
４．０４ ８．０１
Ｔｙｒ
２．０６ ２
．０６ Ｐ
ｈｅ １．００
１．００
Ｈｉｓ １．１８
１．１１
Ｌｙｓ
３．０２ ３．０２
Ａｒｇ
０．００ ０．
００ Ｐｒ
ｏ ３．０５
４．０８ ──
──────────────────────【００
３０】 【表４】 ───────────
─────────────
サイクル数 アミノ酸
収量（ｐｍｏｌ）
────────────────────────
１
Ｖａｌ
３１０
２ Ｖａｌ
４９０
３ Ｔｙｒ
１８９
４
Ｔｈｒ １３８
５
Ａｓｐ
４２
６ Ｃｙｓ
──
７ Ｔｈｒ
４４
８
Ｇｌｕ ９９
９
Ｓｅｒ ４３６
１０
Ｇｌｙ
２０５
１１ Ｇｌｎ
１３１
１２ Ａ
ｓｎ ６６
１３
Ｌｅｕ １４８
１４
Ｃｙｓ
── １
５ Ｌｅｕ
１７４ ─
───────────────────────【０
０３１】（６）ヒルジンＨＶ１Ｃ３分泌プラスミドｐＭ
ＴＳＨＶ１Ｃ３の作製 プラスミドｐＭＴＳＨＶ１Ｃ３は図７に示す方法に従っ
て構築した。ヒルジンＨＶ１のアミノ酸残基５３位以降
のアミノ酸配列をＨＶ３の配列に置換するために、ＨＶ
１分泌プラスミドｐＭＴＳＨＶ１（１０μｇ）を制限酵
素ＫｐｎＩ ３０単位、Ｈｉｎｄ ＩＩＩ ３０単
位を用いて分解し、アガロースゲル電気泳動に供して、
２．８ＫｂｐのＤＮＡ断片を精製した。またプラスミド
ｐＵＣＨＶ３（特願平１−２０７２００）１０μｇも同
様にＫｐｎＩとＨｉｎｄ ＩＩＩで分解し、ＨＶ３のＣ
末端のアミノ酸配列を有する８０ｂｐのＤＮＡ断片を精
製した。両者のＤＮＡ断片１００ｎｇをＴ４ＤＮＡリガ
ーゼにより１６℃で一晩反応させ、この反応液を用いて
大腸菌ＪＭ１０９株を形質転換し、キメラヒルジンＨＶ
１Ｃ３分泌プラスミドｐＭＴＳＨＶ１Ｃ３を得た。この
プラスミドｐＭＴＳＨＶ１Ｃ３の塩基配列はサンガー等
の方法で確認した。 【００３２】（７）ヒルジンＨＶ１Ｃ３分泌プラスミド
によるヒルジンＨＶ１Ｃ３の分泌生産 上記（６）で構築したプラスミドｐＭＴＳＨＶ１Ｃ３に
より形質転換された大腸菌Ｅ．ｃｏｌｉ ＲＲ１株（
微工研条菌寄第３１３０号）１００μｇ／ｍｌのアンピ
シリンを含む２×ＹＴ培地で培養した。３７℃で２４時
間培養後、培養液１ｍｌを集菌し、細胞に浸透圧ショッ
クを与え、ペリプラズム画分の抗トロンビン活性を測定
した。その結果、培地１ｍｌあたり３０６０ＡＴＵの抗
トロンビン活性が認められた。 【００３３】（８）形質転換株 Ｅ．ｃｏｌｉ Ｊ
Ｍ１０９／ｐＭＴＳＨＶ１Ｃ３の発酵及び培養液へのヒ
ルジンＨＶ１Ｃ３の分泌 プラスミドｐＭＴＳＨＶ１Ｃ３により形質転換された大
腸菌 Ｅ．ｃｏｌｉＪＭ１０９株（微工研条菌寄第３
１０４号）を、５ ｌ の発酵槽において、２ ｌの
２％グルコースを含む２ｘＹＴ培地中で３７℃、２４時
間通気撹拌培養を行なったところ、ペリプラズム中に３
５０ＡＴＵ／ｍｌ、培養液中に５７００ＡＴＵ／ｍｌ、
あわせて６０５０ＡＴＵ／ｍｌの抗トロンビン活性が認
められた。 【００３４】（９）ヒルジンＨＶ１Ｃ３の精製上記（８
）で得られた培養液から上記（５）に従って精製した。 精製されたヒルジンＨＶ１Ｃ３のアミノ酸配列を調べた
ところ、図２に示すようにＣ末端アミノ酸配列が変化し
ていることが確認された。比活性は１１，２５０ＡＴＵ
／ｍｇであった。図８に精製したＨＶ１及びＨＶ１Ｃ３
のＨＰＬＣ ｐｒｏｆｉｌｅを示した。この条件は、
ＶＹＤＡＣ Ｃ４（０．３７×２５ｃｍ）のカラムを
使用し、１５〜３０％のアセトニトリルを用いて１ｍｌ
／ｍｉｎの速度で３０分間ｌｉｎｅａｒ ｇｒａｄｉ
ｅｎｔを行ったものである。 【００３５】 【実施例２】 ヒルジンＨＶ３の生産（１）ヒルジン
ＨＶ３分泌プラスミドの創製（ｉ）参考例１によって調
製されたプラスミドｐＵＣＨＶ３を図９に示すように制
限酵素ＥｃｏＲＩ及びＡｃｃＩで切断して得た複製開始
点（ｏｒｉ）及びアンピシリン耐性遺伝子を含むベクタ
ーフラグメントと図１０のＤＮＡ配列をもつ合成アルカ
リフォスファターゼ（ｐｈｏＡ）のシグナル配列をコー
ドする遺伝子とをＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて連結した
。この結果、アルカリフォスファターゼ遺伝子（ｐｈｏ
Ａ）のシグナルペプチドをコードするＤＮＡ配列をＨＶ
３をコードするＤＮＡ配列の上流に連結したプラスミド
ｐＳＨＶ３を得た。これを大腸菌ＪＭ１０９株に導入し
て培養し、アンピシリン耐性によりスクリーニングした
。 （ｉｉ） 次にプラスミドｐＳＨＶ３を制限酵素Ｅｃｏ
ＲＩ及びＨｉｎｄＩＩＩによって切断し、アルカリフォ
スファターゼ遺伝子（ｐｈｏＡ）のシグナルペプチドを
コードするＤＮＡ配列をＨＶ３をコードするＤＮＡ配列
の上流に連結した２７５ｋｂの遺伝子フラグメントを得
た。 【００３６】（ｉｉｉ） 一方、参考例２の方法によっ
てプラスミドｐＭＴ１を調製した。このプラスミドは参
考例２に記載したようにプラスミドｐＵＣ１８の複製開
始点（ｏｒｉ）を含むＤＮＡ配列、ｔｒｐプロモータの
ＤＮＡ配列を含んでいた。このプラスミドｐＭＴ１を制
限酵素ＥｃｏＲＩ及びＨｉｎｄ ＩＩＩで切断しベクタ
ーフラグメントを得た。 （ｉｖ）前記した２７５ｂｐのフラグメントとベクター
フラグメントとをＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて結合させ
、これを大腸菌ＪＭ１０９株に導入して培養し、アンピ
シリン耐性によりスクリーニングしてｐＵＣプラスミド
の複製開始点（ｏｒｉ）を含むＤＮＡ配列、ｔｒｐプロ
モーターのＤＮＡ配列、アルカリフォスファターゼ遺伝
子（ｐｈｏＡ）のシグナルペプチドをコードするＤＮＡ
配列及びＨＶ３をコードするＤＮＡ配列を含んでいる２
．８７ｋｂのＨＶ３発現ベクター、プラスミドｐＭＴＳ
ＨＶ３を得た。 【００３７】（２）ヒルジンＨＶ３分泌プラスミドによ
るヒルジンＨＶ３の分泌生産 上記のようにして構築したプラスミドｐＭＴＳＨＶ３に
より大腸菌Ｅ．ｃｏｌｉＲＲ１を形質転換し（Ｅ．ｃｏ
ｌｉ ＲＲ１／ｐＭＴＳＨＶ３）（寄託番号微工研菌
寄第３２６７号）、これを１００μｇ／ｍｌのアンピシ
リンを含む２ｘＹＴ培地にグルコース２％を添加し、こ
の培地２ ｌ 中で培養した。培養は、培地２ ｌ
を５ ｌ のジャーに入れ、３７℃で２４時間培養
した。得られた培養液中の抗トロンビン活性は６０７３
ＡＴＵ／ｍｌであった。 【００３８】（３）培養液からヒルジンＨＶ３の精製得
られた培養液を実施例１（５）と同様にして処理してヒ
ルジンＨＶ３を得た。すなわち、培養液を遠心分離して
上清から細胞を除き、上清を１０ｍＭリン酸カリウム緩
衝液（ｐＨ７．０）で４倍希釈し、濾過した。得られた
濾液を実施例１（５）と同様にＱＡＥ−トヨパールカラ
ム（４．４×１３ｃｍ）にかけ、セファクリルＳ−１０
０ＨＲのカラムでゲル濾過した。この活性画分をＤＥＡ
Ｅ−トヨパールカラム（４．４×４０ｃｍ）を用い平衡
化緩衝液及び０．３Ｍ塩化ナトリウムを加えた平衡化緩
衝液の直線濃度勾配で溶解し、最後にバイダックＣ４（
Ｖｙｄａｃ Ｃ４）カラム（０．３７×２５ｃｍ）を
用い、１５〜３０％アセトニトリルの直線グラジエント
（１％／ｍｉｎ、３０分以上）で逆相ＨＰＬＣを行いカ
ラムからヒルジンＨＶ３を溶出させて精製ヒルジンＨＶ
３を得た。各工程におけるヒルジンＨＶ３の精製の度合
を表５に示す。 【００３９】 【表５】 ─────────────────────────
─────────── 精製ステップ
全蛋白質 全活性
比活性 収 率
（ｍｇ）
（ＡＴＵ） （ＡＴＵ／ｍｇ）
（％）────────────────────
──────────────── 培 養 液
１５６００
１１０３４４００ ７０７
１００ ＱＡＥ−トヨパール
２１１１ ９２２７２６４
４３７１ ８３．６
Ｓ−１００ＨＲ
１４５３ ９２６８９６３
６３８１ ８４ ＤＥＡ
Ｅ− トヨパール １３２７
８５９７８９２ ６４７８
７７．９ Ｃ４ ＨＰＬＣ
７９５
６４８６４８０ ８１３９
５８．８ ────────────────
────────────────────【００４０
】精製された生成物のアミノ酸組成及びＮ末端アミノ酸
配列を調べたところ、アミノ酸組成値は表６に示すよう
にヒルジンＨＶ３の理論値と一致し、またＮ末端アミノ
酸配列は表７に示すように第１５番までのアミノ酸配列
がヒルジンＨＶ３のそれと一致しており、シグナルペプ
チドが正しい位置でプロセスしており、ヒルジンＨＶ３
であることが確認された。 【００４１】 【表６】 ─────────────
───────────
ＨＶ３
Ｔｈｅｏｒｙ
─────────────────────
─── Ａｓｘ
９．７６
１０
Ｔｈｒ ４．７４
５
Ｓｅｒ ３．６８
４
Ｇｌｘ １１
．５５ １１
Ｇｌｙ
８．７７ ９
Ａｌａ
１．０７
１ Ｃｙｓ
５．２２
６ Ｖ
ａｌ ２．０３
２
Ｍｅｔ ０．００
０
Ｉｌｅ ２．
９７ ３
Ｌｅｕ
３．０８ ３
Ｔｙｒ
２．０４ ２
Ｐｈｅ
１．００
１ Ｈｉ
ｓ １．２２
１
Ｌｙｓ ４．０３
４
Ａｒｇ ０．０
０ ０
Ｐｒｏ
４．０６ ４
─────────────────
───────
Ｔｏｔａｌ
６６ ──
────────────────────── 【
００４２】 【表７】 ─────────────
───────────
サイクル数 アミノ酸
収量（ｐｍｏｌ） ─────
───────────────────
１
Ｉｌｅ ４６９
２
Ｔｈｒ １
０８ ３
Ｔｙｒ
１０６ ４
Ｔｈｒ
１０２
５ Ａｓｐ
１２２
６ Ｃｙ
ｓ ７
Ｔｈｒ
１００ ８
Ｇｌｕ
７６
９ Ｓｅｒ
３２
１０ Ｇｌ
ｙ １７２
１１
Ｇｌｎ １４５
１２
Ａｓｎ ９
３ １３
Ｌｅｕ
２１１ １４
Ｃｙｓ
１５
Ｌｅｕ １８９
────────────────
──────── 【配列表】配列番号：１ 配列の長さ：ＨＶ１ ６５、ＨＶ２ ６５、ＨＶ３ ６
６、ＨＶ１Ｃ３ ６６配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 １ ２ ３ ４
５ ６ ７ ８ ９ １０
１１ １２ １３ １４ １５ ＨＶ１
Ｖａｌ Ｖａｌ Ｔｙｒ Ｔｈｒ Ａｓｐ
Ｃｙｓ Ｔｈｒ Ｇｌｕ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ｇｌｎ Ａ
ｓｎ Ｌｅｕ Ｃｙｓ Ｌｅｕ ＨＶ２
Ｉｌｅ Ｔｈｒ Ｔｙｒ Ｔｈｒ Ａｓｐ Ｃｙｓ Ｔ
ｈｒ Ｇｌｕ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ｇｌｎ Ａｓｎ Ｌｅ
ｕ Ｃｙｓ Ｌｅｕ ＨＶ３ Ｉｌｅ Ｔ
ｈｒ Ｔｙｒ Ｔｈｒ Ａｓｐ Ｃｙｓ Ｔｈｒ Ｇｌ
ｕ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ｇｌｎ Ａｓｎ Ｌｅｕ Ｃｙｓ
Ｌｅｕ ＨＶ１Ｃ３ Ｖａｌ Ｖａｌ Ｔｙ
ｒ Ｔｈｒ Ａｓｐ Ｃｙｓ Ｔｈｒ Ｇｌｕ Ｓｅｒ
Ｇｌｙ Ｇｌｎ Ａｓｎ Ｌｅｕ Ｃｙｓ Ｌｅｕ
１６ １７ １８ １９
２０ ２１ ２２ ２３ ２４ ２５
２６ ２７ ２８ ２９ ３０
Ｃｙｓ Ｇｌｕ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ａｓｎ
Ｖａｌ Ｃｙｓ Ｇｌｙ Ｇｌｎ Ｇｌｙ Ａｓｎ Ｌ
ｙｓ Ｃｙｓ Ｉｌｅ Ｌｅｕ
Ｃｙｓ Ｇｌｕ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ａｓｎ Ｖａｌ Ｃ
ｙｓ Ｇｌｙ Ｌｙｓ Ｇｌｙ Ａｓｎ Ｌｙｓ Ｃｙ
ｓ Ｉｌｅ Ｌｅｕ Ｃｙｓ Ｇ
ｌｕ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ａｓｎ Ｖａｌ Ｃｙｓ Ｇｌ
ｙ Ｌｙｓ Ｇｌｙ Ａｓｎ Ｌｙｓ Ｃｙｓ Ｉｌｅ
Ｌｅｕ Ｃｙｓ Ｇｌｕ Ｇｌ
ｙ Ｓｅｒ Ａｓｎ Ｖａｌ Ｃｙｓ Ｇｌｙ Ｇｌｎ
Ｇｌｙ Ａｓｎ Ｌｙｓ Ｃｙｓ Ｉｌｅ Ｌｅｕ
３１ ３２ ３３ ３４
３５ ３６ ３７ ３８ ３９ ４０
４１ ４２ ４３ ４４ ４５
Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ａｓｐ Ｇｌｙ Ｇｌｕ
Ｌｙｓ Ａｓｎ Ｇｌｎ Ｃｙｓ Ｖａｌ Ｔｈｒ Ｇ
ｌｙ Ｇｌｕ Ｇｌｙ Ｔｈｒ
Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ａｓｎ Ｇｌｙ Ｌｙｓ Ｇｌｙ Ａ
ｓｎ Ｇｌｎ Ｃｙｓ Ｖａｌ Ｔｈｒ Ｇｌｙ Ｇｌ
ｕ Ｇｌｙ Ｔｈｒ Ｇｌｙ Ｓ
ｅｒ Ｇｌｎ Ｇｌｙ Ｌｙｓ Ａｓｐ Ａｓｎ Ｇｌ
ｎ Ｃｙｓ Ｖａｌ Ｔｈｒ Ｇｌｙ Ｇｌｕ Ｇｌｙ
Ｔｈｒ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ａｓ
ｐ Ｇｌｙ Ｇｌｕ Ｌｙｓ Ａｓｎ Ｇｌｎ Ｃｙｓ
Ｖａｌ Ｔｈｒ Ｇｌｙ Ｇｌｕ Ｇｌｙ Ｔｈｒ
４６ ４７ ４８ ４９
５０ ５１ ５２ ５３ ５４ ５５
５６ ５７ ５８ ５９ ６０
Ｐｒｏ Ｌｙｓ Ｐｒｏ Ｇｌｎ Ｓｅｒ
Ｈｉｓ Ａｓｎ Ａｓｐ Ｇｌｙ Ａｓｐ Ｐｈｅ Ｇ
ｌｕ Ｇｌｕ Ｉｌｅ Ｐｒｏ
Ｐｒｏ Ａｓｎ Ｐｒｏ Ｇｌｕ Ｓｅｒ Ｈｉｓ Ａ
ｓｎ Ａｓｎ Ｇｌｙ Ａｓｐ Ｐｈｅ Ｇｌｕ Ｇｌ
ｕ Ｉｌｅ Ｐｒｏ Ｐｒｏ Ｌ
ｙｓ Ｐｒｏ Ｇｌｎ Ｓｅｒ Ｈｉｓ Ａｓｎ Ｇｌ
ｎ Ｇｌｙ Ａｓｐ Ｐｈｅ Ｇｌｕ Ｐｒｏ Ｉｌｅ
Ｐｒｏ Ｐｒｏ Ｌｙｓ Ｐｒ
ｏ Ｇｌｎ Ｓｅｒ Ｈｉｓ Ａｓｎ Ｇｌｎ Ｇｌｙ
Ａｓｐ Ｐｈｅ Ｇｌｕ Ｐｒｏ Ｉｌｅ Ｐｒｏ
６１ ６２ ６３ ６４
６５ ６６ Ｇｌｕ Ｇｌ
ｕ Ｔｙｒ Ｌｅｕ Ｇｌｎ Ｇ
ｌｕ Ｇｌｕ Ｔｙｒ Ｌｅｕ Ｇｌｎ
Ｇｌｕ Ａｓｐ Ａｌａ Ｔｙｒ Ａｓｐ Ｇ
ｌｕ Ｇｌｕ Ａｓｐ Ａｌａ
Ｔｙｒ Ａｓｐ Ｇｌｕ 配列番号：２ 配列の長さ：１５３ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸合成ＤＮＡ 配列の特徴 特徴を表す記号：ｐｒｏｍｏｔｅｒ 特徴を決定した方法：Ｓ ＴＧＴ ＴＧＡ ＣＡＡ ＴＴＡ ＡＴＣ Ａ
ＴＣ ＧＧＣ ＴＣＧ ＴＡＴ ＡＡＴ ＧＴＧ ＴＧ
Ｇ ＡＴＴ ＴＧＴ ＧＡＧ ４５ ＡＣＡ Ａ
ＣＴ ＧＴＴ ＡＡＴ ＴＡＧ ＴＡＧ ＣＣＧ ＡＧ
Ｃ ＡＴＡ ＴＴＡ ＣＡＣ ＡＣＣ ＴＴＡ ＡＣＡ
ＣＴＣ ９０ ＣＧＧ ＡＴＡ ＡＣＡ ＡＴ
Ｔ ＴＣＡ ＣＡＣ ＡＧＧ ＡＡＡ ＣＡＧ ＡＡＴ
ＴＣ １２２ ＧＣＣ ＴＡＴ ＴＧＴ
ＴＡＡ ＡＧＴ ＧＴＧ ＴＣＣ ＴＴＴ ＧＴＣ Ｔ
ＴＡ Ａ １５３ 配列番号：３ 配列の長さ：１２８ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸合成ＤＮＡ 配列の特徴 特徴を表す記号：ｐｒｏｍｏｔｅｒ 特徴を決定した方法：Ｓ ＧＧＧ ＴＧＴ ＴＧＡ ＣＡＡ ＴＴＡ Ａ
ＴＣ ＡＴＣ ＧＡＡ ＣＴＡ ＧＴＴ ＡＡＣ ＴＡ
Ｇ ＴＡＣ ＧＣＡ ＡＧＴ ４５ ＣＣＣ Ａ
ＣＡ ＡＣＴ ＧＴＴ ＡＡＴ ＴＡＧ ＴＡＧ ＣＴ
Ｔ ＧＡＴ ＣＡＡ ＴＴＧ ＡＴＣ ＡＴＧ ＣＧＴ
ＴＣＡ ９０ ＴＣＡ ＣＧＴ ＡＡＡ ＡＡ
Ｇ ＧＧＴ ＡＧ １０７ ＡＧＴ
ＧＣＡ ＴＴＴ ＴＴＣ ＣＣＡ ＴＣＴ ＴＡＡ
１２８配列番号：４ 配列の長さ：１４４ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸合成ＤＮＡ 配列の特徴 特徴を表す記号：ｓｉｇ ｐｅｐｔｉｄｅ特徴を決定し
た方法：Ｓ Ｍｅｔ Ｌｙｓ Ｇｌｎ Ｓｅｒ Ｔｈ
ｒ Ｉｌｅ Ａｌａ Ｌｅｕ Ａｌａ Ｌｅｕ Ｌｅｕ
Ｐｒｏ Ｌｅｕ Ｌｅｕ ＰｈｅＡＡ ＴＴＣ ＡＴ
Ｇ ＡＡＡ ＣＡＡ ＡＧＣ ＡＣＴ ＡＴＴ ＧＣＣ
ＴＴＧ ＧＣＡ ＣＴＣ ＴＴＡ ＣＣＧ ＴＴＡ
ＣＴＧ ＴＴＴ ５０ Ｇ ＴＡＣ ＴＴＴ
ＧＴＴ ＴＣＧ ＴＧＡ ＴＡＡ ＣＧＧ ＡＡＣ
ＣＧＴ ＧＡＧ ＡＡＴ ＧＧＣ ＡＡＴ ＧＧＣ Ａ
ＡＡ ９６ Ｔｈｒ Ｐｒｏ Ｖａｌ Ｔｈｒ
Ｌｙｓ Ａｌａ Ｖａｌ Ｖａｌ ＡＣＣ ＣＣＧ
ＧＴＧ ＡＣＣ ＡＡＡ ＧＣＴ ＧＴＴ ＧＴ
１１９ ＴＧＧ ＧＧＣ ＣＡＣ ＴＧＧ
ＴＴＴ ＣＧＡ ＣＡＡ ＣＡＴ Ａ １４４
【図１】ヒルジンＨＶ１、ＨＶ２、ＨＶ３及びＨＶ１Ｃ
３のアミノ酸配列を示す。
３のアミノ酸配列を示す。
【図２】本発明において使用するｔａｃプロモーターの
塩基配列を示す。
塩基配列を示す。
【図３】ｔｒｐプロモーターの塩基配列を示す。
【図４】ｐｈｏＡシグナルペプチドの塩基配列を示す。
【図５】ヒルジンＨＶ１分泌プラスミドｐＭＴＳＨＶ１
の構築方法の概念図を示す。
の構築方法の概念図を示す。
【図６】プラスミドｐＭＫＳＨＶ１の構築方法の概念図
を示す。
を示す。
【図７】ヒルジンＨＶ１Ｃ３分泌プラスミドｐＭＴＳＨ
Ｖ１Ｃ３の構築方法の概念図を示す。
Ｖ１Ｃ３の構築方法の概念図を示す。
【図８】ヒルジンＨＶ１及びＨＶ１Ｃ３のＣ４逆相ＨＰ
ＬＣによるプロフィルを示す。
ＬＣによるプロフィルを示す。
【図９】ヒルジンＨＶ３分泌プラスミドｐＭＴＳＨＶ３
の構築方法の概念図を示す。
の構築方法の概念図を示す。
【図１０】実施例２のヒルジンＨＶ３分泌用ＰｈｏＡシ
グナルペプチドの塩基配列を示す。
グナルペプチドの塩基配列を示す。
【図１１】ヒルジンＨＶ３のＣ４逆相ＨＰＬＣによる精
製の状態を示す。
製の状態を示す。
Claims (8)
- 【請求項１】 ｐＵＣプラスミドの複製開始点（ｏｒ
ｉ）を含むＤＮＡ配列、ｔａｃプロモーターまたはｔｒ
ｐプロモーターのＤＮＡ配列、シグナルペプチドをコー
ドするＤＮＡ配列及び異種蛋白質をコードするＤＮＡ配
列を含んでなることを特徴とする異種蛋白質の分泌ベク
ター。 - 【請求項２】 シグナルペプチドをコードするＤＮＡ
配列がアルカリ性フォスファターゼ由来のものである請
求項１に記載の分泌ベクター。 - 【請求項３】 ｐＵＣプラスミドの複製開始点（ｏｒ
ｉ）を含むＤＮＡ配列がプラスミドｐＵＣ１８を制限酵
素ＰｖｕＩ及びＰｖｕ ＩＩ で切断して得られるＤＮ
Ａ配列である請求項１または２に記載の分泌ベクター。 - 【請求項４】 異種蛋白質がヒルジンＨＶ１である請
求項１〜３のいずれかに記載の分泌ベクター。 - 【請求項５】 異種蛋白質がヒルジンＨＶ３である請
求項１〜３のいずれかに記載の分泌ベクター。 - 【請求項６】 異種蛋白質が下記記載のアミノ酸配列
を有するヒルジン変異体である請求項１〜３のいずれか
に記載の分泌ベクター。 Ｖａｌ Ｖａｌ Ｔｙｒ
Ｔｈｒ Ａｓｐ Ｃｙｓ Ｔｈｒ Ｇｌｕ
Ｓｅｒ Ｇｌｙ １
５
１０
Ｇｌｎ Ａｓｎ Ｌｅｕ Ｃｙｓ
Ｌｅｕ Ｃｙｓ Ｇｌｕ Ｇｌｙ Ｓｅｒ
Ａｓｎ
１５
２０
Ｖａｌ Ｃｙｓ Ｇｌｙ Ｇｌｎ Ｇｌｙ
Ａｓｎ Ｌｙｓ Ｃｙｓ Ｉｌｅ Ｌｅｕ
２５
３０ Ｇｌｙ
Ｓｅｒ Ａｓｐ Ｇｌｙ Ｇｌｕ Ｌｙｓ
Ａｓｎ Ｇｌｎ Ｃｙｓ Ｖａｌ
３５
４０ Ｔｈｒ Ｇｌｙ
Ｇｌｕ Ｇｌｙ Ｔｈｒ Ｐｒｏ Ｌｙｓ
Ｐｒｏ Ｇｌｎ Ｓｅｒ
４５
５０
Ｈｉｓ Ａｓｎ Ｇｌｎ
Ｇｌｙ Ａｓｐ Ｐｈｅ Ｇｌｕ Ｐｒｏ
Ｉｌｅ Ｐｒｏ
５５
６０
Ｇｌｕ Ａｓｐ Ａｌａ Ｔｙｒ
Ａｓｐ Ｇｌｕ
６５ - 【請求項７】
請求項１〜６のいずれかに記載の分泌ベクターを用
いて大腸菌を形質転換してなる形質転換微生物。 - 【請求項８】 請求項７の形質転換微生物を培養し、
培地中から生産物を回収することを特徴とするヒルジン
ＨＶ１またはＨＶ３もしくは（式１）で示されるヒルジ
ン変異体の製造方法。
Priority Applications (23)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP4127191A JP3226289B2 (ja) | 1991-02-13 | 1991-02-13 | 分泌ベクター、該ベクターで形質転換した微生物及び該微生物から産生される産物の製造法 |
| DE69121192T DE69121192T2 (de) | 1990-11-08 | 1991-11-08 | Hirudinmutante, deren herstellung, antikoagulans, sekretorischer vektor, durch besagten vektor transformierter mikroorganismus und herstellung eines produkts durch besagten mikroorganismus |
| PCT/JP1991/001533 WO1992008736A1 (fr) | 1990-11-08 | 1991-11-08 | Mutant d'hirudine, sa production, anticoagulant, vecteur secretoire, microorganisme transforme par ledit vecteur et production d'un produit a partir dudit microorganisme |
| DK95202092T DK0687731T3 (da) | 1990-11-08 | 1991-11-08 | Sekretionsvektor, transformerede mikroorganismer indeholdende vektoren og fremstilling af produkter fra denne mikroorganism |
| ES91919149T ES2093717T3 (es) | 1990-11-08 | 1991-11-08 | Mutante de hirudina, su produccion, anticoagulante, vector secretor, microorganismo transformado por el indicado vector y produccion de un producto a partir de dicho microorganismo. |
| CA002072375A CA2072375C (en) | 1990-11-08 | 1991-11-08 | Hirudin analog, method of manufacturing thereof and anti-coagulant composition, and secretion vector, transformed microorganisms containing saidvector and manufacturing method of products which is produced from said microorganism |
| ES95202092T ES2129749T3 (es) | 1990-11-08 | 1991-11-08 | Vector de secrecion, microorganismos transformados que contienen el indicado vector y produccion de un producto a partir de dicho microorganismo. |
| EP95202092A EP0687731B1 (en) | 1990-11-08 | 1991-11-08 | Secretion vector, transformed microorganisms containing said vector and manufacture of products from said microorganism |
| CA002255396A CA2255396A1 (en) | 1990-11-08 | 1991-11-08 | Hirudin analog, method of manufacturing thereof and anti-coagulant composition, and secretion vector, transformed microorganisms containing said vector and manufacturing method ofproducts which is produced from said microorganism |
| DE69130872T DE69130872T2 (de) | 1990-11-08 | 1991-11-08 | Sekretionsvektor, diesen enthaltene transformierte Mikroorganismen und Herstellung von Produkten durch obigen Mikroorganismus |
| EP91919149A EP0511393B1 (en) | 1990-11-08 | 1991-11-08 | Hirudine mutant, production thereof, anticoagulant, secretory vector, microorganism transformed by said vector, and production of product from said microorganism |
| DK91919149.4T DK0511393T3 (da) | 1990-11-08 | 1991-11-08 | Hirudin-mutant, fremstilling af denne, antikoagulant, sekretorisk vektor, mikroorganisme transformeret af vektoren og fremstilling af produkt ud fra mikroorganismen |
| AU88466/91A AU648124B2 (en) | 1990-11-08 | 1991-11-08 | Hirudine mutant, production thereof, anticoagulant, secretory vector, microorganism transformed by said vector, and production of product from said microorganism |
| AT91919149T ATE140929T1 (de) | 1990-11-08 | 1991-11-08 | Hirudinmutante, deren herstellung, antikoagulans, sekretorischer vektor, durch besagten vektor transformierter mikroorganismus und herstellung eines produkts durch besagten mikroorganismus |
| AT95202092T ATE176500T1 (de) | 1990-11-08 | 1991-11-08 | Sekretionsvektor, diesen enthaltene transformierte mikroorganismen und herstellung von produkten durch obigen mikroorganismus |
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| NO922671A NO303735B1 (no) | 1990-11-08 | 1992-07-07 | Fremgangsmöte for fremstilling av en hirudinanalog, samt DNA-sekvens, sekresjonsvektor og transformerte mikroorganismer som inneholder vektoren |
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Publications (2)
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|---|---|
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Cited By (1)
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|---|---|---|---|---|
| JP2009502125A (ja) * | 2005-07-22 | 2009-01-29 | シャンハイ ハイ−テク ユナイテッド バイオ−テクノロジカル リサーチ アンド デヴェロプメント カンパニー リミテッド | 高レベルでの、大腸菌におけるリソスタフィンの分泌発現の方法 |
-
1991
- 1991-02-13 JP JP4127191A patent/JP3226289B2/ja not_active Expired - Fee Related
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