HU214236B - Eljárás hirudin és hirudinvariánsok előállítására - Google Patents

Eljárás hirudin és hirudinvariánsok előállítására Download PDF

Info

Publication number
HU214236B
HU214236B HU873161A HU316187A HU214236B HU 214236 B HU214236 B HU 214236B HU 873161 A HU873161 A HU 873161A HU 316187 A HU316187 A HU 316187A HU 214236 B HU214236 B HU 214236B
Authority
HU
Hungary
Prior art keywords
gene
yeast
sequence
hirudin
plasmid
Prior art date
Application number
HU873161A
Other languages
English (en)
Other versions
HUT44616A (en
Inventor
Alain Balland
Nathalie Labat
Yves Lemoine
Gerard Loison
Original Assignee
Behringwerke Ag.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from FR868610090A external-priority patent/FR2601383B2/fr
Priority claimed from FR868616722A external-priority patent/FR2607516B2/fr
Application filed by Behringwerke Ag. filed Critical Behringwerke Ag.
Publication of HUT44616A publication Critical patent/HUT44616A/hu
Publication of HU214236B publication Critical patent/HU214236B/hu

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/81—Protease inhibitors
    • C07K14/815—Protease inhibitors from leeches, e.g. hirudin, eglin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/02—Antithrombotic agents; Anticoagulants; Platelet aggregation inhibitors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/14—Fungi; Culture media therefor
    • C12N1/16—Yeasts; Culture media therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/80—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi
    • C12N15/81—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi for yeasts
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
    • C12P21/02—Preparation of peptides or proteins having a known sequence of two or more amino acids, e.g. glutathione
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/02—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a signal sequence

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)

Abstract

A találmány tárgya eljárás hirűdin vagy valamely variánsánakelőállítására, amelynek sőrán valamely alábbi élesztőkben a kívántfehérje termelését lehetővé tevő DNS fűnkciós b őkkal vagy ilyenblőkkőt tartalmazó plazmiddal transzfőrmált élesztőt fermentálnak, ésa tenyészléből a fehérjét érett főrmában vagy prekűrzőr főrmájábankinyerik, amely űtóbbit kívánt esetben in vitrő éretté alakítanak;ahől az említett fűnkciós blőkk legalább egy –Str–Lex–Scl–H-gén– szekvenciát tartalmaz, ahől H gén jelentése hirűdint vagy annak egy variánsát kódőló gén, Str jelentése a H gén élesztők által történő transzkripcióját lehetővétevő jeleket tartalmazó DNS szekvencia, Lex jelentése a géntermék kiválasztódását biztősító vezető szekvencia, Scl jelentése egyedüli, a H géntől közvetlenül fölfelé elhelyezkedőyscF prőteináz hasítási helyet kódőló DNS-szekvencia. ŕ

Description

A találmány élesztőkben hirudin-prekurzor termelését lehetővé tevő DNS funkciós blokkal vagy ezt tartalmazó plazmiddal transzformált élesztő tenyésztésével hirudin-prekurzor, valamint ebből érett hirudin előállítására vonatkozik.
A 2 593 518 lajstromszámú francia szabadalmi leírás, (amelynek megfelelőj ea2029191aj stromszámú magyar szabadalmi leírás) olyan eljárást ismertet, amelynek segítségével élesztőket, pl. S. cerevisiae-t hirudin termelésére késztetnek, amely hirudin aktív formában választódik ki a tenyészközegbe.
A találmány szerinti eljárásban új vektorok alkalmazásával hirudint, elsősorban HVl-t, javított feltételek közt állítunk elő.
Részletesebben a találmány szerinti eljárásban olyan funkciós DNS blokkot állítunk elő, amelyek segítségével élesztőkből hirudint lehet előállítani, amely blokk legalább az alábbi szekvenciát tartalmazza:
-Str-Lex-Sci-H gén, ahol
- H gén: a hirudint vagy variánsainak egyikét kódoló gén; a H gén a találmány szerint a HVl-et vagy HV2-t kódoló gén; kívánt esetben a H gént követheti valamely élesztő terminátor szekvencia, pl. a PGK gén terminátor szekvenciája;
- Str: a H gén élesztők által történő átírásához szükséges jeleket tartalmazó DNS szekvencia;
- Lex: a vezető szekvencia, amely azért szükséges, hogy a génterméket megkapjuk;
- Sci: olyan DNS szekvencia, amely az yscF proteináz által végzett hasítás helyét kódolja, amely hasítási hely egyedi és a hirudin prekurzorban közvetlenül a H géntől felfelé helyezkedik el; ezenkívül az „Sc|-H gén” elem többször ismétlődhet.
Az ilyen típusú kifejezőblokk lehetővé teszi, hogy egyedi, érett és korrekt fehérjét kapjunk.
Valójában a 2 593 518 lajstromszámú francia szabadalmi leírásban ismertetett konstrukcióban a S. cerevisiae a hirudint olyan prekurzor formájában állítja elő, amely az yscF proteináz számára - - amely a KEX2 gén terméke [AchstetterT. és WolfD.H.: EMBO Journal 4,173 (1985)] -két hasítási hellyel rendelkezik. Az yscF endopeptidáz aktivitása szükséges a hirudin prekurzor éréséhez. A hasítási műveletek azonban csak a második helyen, azaz azon a helyen, amely a prekurzor NH? végétől távolabb van, teszik lehetővé aktív hirudin kibocsátását; ezzel ellentétben amikor a hasítás az első és nem a második helyen megy végbe, hosszabb forma választódik ki, amely abban különbözik a hirudintól, hogy további aminosavakat tartalmaz az NH? végnél. Ez utóbbi, nemkívánatos forma szennyezheti az érett és korrekt hirudint a tisztítás különböző stádiumaiban, és ezáltal bonyolulttá teszi a tisztítási eljárást, és ez csökkenti a tiszta hirudin kitermelését.
A találmány szerinti eljárásban az élesztőt úgy transzformáljuk, hogy olyan hirudin prekurzort szintetizáljon, amely csupán egyetlen hasítási helyet tartalmaz az yscF számára úgy, hogy ennek a prekurzomak az érlelése hirudinná csak a kívánt formájú hirudin kiválasztásához vezet.
A Lex szekvenciák közül főleg az úgynevezett „prepro” szekvenciát említjük meg, amely lehetővé teszi az élesztő alfa-szex-feromonjának kiválsztását.
A kiválasztási rendszerpéldájaként, amint említettük, az alfa feromon kiválasztási rendszerét választjuk, ahol a Lex szekvencia az élesztő alfa szexferomonjának génjéből ered, de más rendszereket is alkalmazhatunk [pl. a „gyilkos” fehérje rendszert, lásd: Busseg H., Saville D., Greene D. és munkatársaik: Mól. Cell. Bioi. 3, 1362-1370(1983)].
Előnyös, ha az élesztők, amelyek a találmány szerinti funkciós blokkot hordozó plazmidokhoz szolgálnak gazdaszervezetként, párosodó típusúak, és ezen kívül képesek tenyészni szelekciós kényszer hiányában is.
Ilyen körülmények között a transzformált élesztők különösen előnyösek az ipari szinten való alkalmazáshoz.
Ebből a célból a találmány szerinti megoldásban, a fentebb leírt DNS kifejező blokkot alkalmazzuk, amelyben azonban az Str szekvencia egy élesztő gén olyan promotorját tartalmazza, amely az MFalfagén promotortól eltérő; ez lehet pl. az élesztő PGK gén promotorja.
Valójában a 2 593 518 lajstromszámú francia szabadalmi leírásban ismertetett konstrukciókban a hirudin prekurzor génje az MFalfalgén promotorból íródik át. Ez a promotor maximális teljesítménnyel párosodó típusú Maíalfa törzsekben működik. A gazdaszervezet kiválasztása ezért a törzsek ilyen típusára korlátozódik, amely kizárja a párosodó típusú Mata törzseket, valamint a párosodó típust nélkülöző diploid és poliploid törzseket. Ez főleg az iparban alkalmazott élesztőtörzseket záqa ki, amelyek leggyakrabban ez utóbbi kategóriába esnek. A promotor megváltoztatásával a hirudin kifejezését meg lehet úgy oldani, hogy ez független legyen a gazdatörzs párosodási jellegétől.
Általában ezeket a DNS blokkokat olyan plazmidok hordozzák, amelyek ezenkívül tartalmaznak egy élesztőkben működő replikációs origót is, pl. a 2 μ plazmid replikációs origóját.
Hogy a vektorok megalkotását megkönnyítsük, ezek a plazmidok lehetnek „kóli/élesztő ingázó” plazmidok, és tartalmazhatnak olyan elemeket, amelyek lehetővé teszik ezek replikációját E. coli-ban, pl. a pBR322 replikációs origóját, és az ampR szelekciós markert. Ezek a plazmidok tartalmazhatnak az élesztőkhöz szolgáló szelekciós markert is, pl. bizonyos toxikus vegyi anyagokra való rezisztenciát kódoló gént, vagy olyan gént, amely lehetővé teszi valamilyen auxotrófia komplementálását; így pl. az URA3 gént alkalmazhatjuk.
A WO 86/01 224 számon közzétett nemzetközi szabadalmi bejelentés szerint bizonyos mutációk bevezetése egy plazmid segítségével, amellyel egy wra+-szá transzformált ura3 törzsben 5-FU-rezisztenciát alakítottunk ki, lehetővé tette, hogy a transzformált törzsek többféle táptalajon legyenek tenyészthetők. Különösen az ipari komplex tápközegek alkalmazása volt lehetséges.
A találmány pontosabban a HV1 variáns szintézisére és kiválasztására vonatkozik.
HU 214 236 Β
A HV1 gént már kémiailag szintetizálták az E. coliban való kifejezés céljából (2 569 420 lajstromszámú francia szabadalom).
A 2 569 420 lajstromszámú francia szabadalomban alkalmazott szintetikus oligonukleotidok legtöbbjét a HV1 prekurzorát kódoló szekvencia megalkotásához vették igénybe, kivéve azokat, amelyek az olyan szekvenciákkal való különböző összekapcsolásokat teszik lehetővé, amelyek a szekvenciától lefelé és felfelé vannak fuzionálva.
A kiválasztódott hirudin termelése a kiválasztáshoz, valamint ennek a polipeptidnek az élesztőkben előforduló normális metabolikus út szerinti korrekt éréséhez szükséges információt tartalmazó prekurzor jelenlétét igényli. A 2 593 518 számú francia szabadalmi leírásban kimutatták, hogy az alfa faktor prekurzora NHi-terminális szekvenciáját lehet alkalmazni a hirudin HV2 variánsának kiválasztásához. A találmány ennek a rendszernek a HV1 variáns kiválasztásához történő alkalmazására vonatkozik.
A találmány főleg egy olyan DNS blokkra vonatkozik, amelynek segítségével hirudint lehet előállítani élesztőből; ez a blokk legalább az alábbiakat tartalmazza:
- a HV1 gént;
- egy DNS szekvenciát (Str), amely a HV1 gén élesztő által történő átírását lehetővé tevő szignálokat tartalmazza.
Ez a funkciós blokk, egy plazmidban vagy egy élesztő, előnyösen Saccharomyces nemzetségbe tartozó élesztő kromoszómáiban integrálva, az említett élesztő transzformálása után lehetővé teszi, hogy a hirudin aktív formában vagy olyan inaktív prekurzor formájában fejeződjék ki, amelyből aktiválással a hirudin képződik.
Ezek a funkciós blokkok előnyösen a következő szerkezettel bírnak:
Str _Lex Scl H gén-, ahol
- H gén: a HVl-et kódoló gén; a H gént, ahol szükséges, valamilyen élesztő terminátor szekvencia, pl. a PGK gén terminátor szekvenciája követi;
- Str: olyan szignálokat tartalmazó DNS szekvencia, amely szignálok a H gén élesztők által történő átírását teszik lehetővé...
- Lex: valamilyen vezető szekvencia, amely abból a célból szükséges, hogy a géntermék kiválasztódását elérjük;
- Sc|: egy az yscF proteináz hasítási helyét kódoló DNS szekvencia, amely ha szükséges, 3 végénél, a H gén előtt egy ATG kodont vagy Lys-Arg-ot kódoló két kodont vagy Ser-Leu-Asp-Lys-Arg-ot kódoló öt kodont tartalmaz, továbbá
- az Sc,-H gén elem többször ismétlődhet.
A Lex szekvenciák között meg kell említenünk, az élesztő alfa-szex-feromonjához tartalmazó szekvenciákat, és az Str-nél meg kell említenünk az MFalfal gén promotort és a PGK gén promotort, de más szekvenciákat is lehet alkalmazni; a kiválasztási rendszerek példájaként főleg az alfa-feromon kiválasztási szekvenciáját választjuk, azaz a fenti szekvenciában az Lex szekvencia az élesztő alfa-szex-feromonjának génjéből ered, de más rendszereket is lehet alkalmazni (pl. a „gyilkos” fehéije rendszert) [Bussey h., Saville D., Greene D. és munkatársaik: Mól. Cell. Bioi. 3, 1362-1370 (1983)].
Abból a célból, hogy a hirudin kifejeződését a tápközegbe történő kiválasztását irányítsuk, a megfelelő gén egy élesztőkhöz szolgáló vektorban vagy egy plazmidban van integrálva, amely magában foglalja a fentebb leírt funkciós blokkot, és legalább egy, élesztőkben működő replikációs origót. A plazmid előnyösen a következő elemeket tartalmazza.
- az élesztő 2 μ plazmidjának replikációs origóját;
- az ura3 gént;
- E. coli-ban működő valamilyen replikációs origót, és egy antibiotikumra való rezisztencia markert;
- az MFalfal gén 5 területét, amely magában foglalja az átírási promotort, a vezető szekvenciát, és az alfa-faktor prekurzorának prepro szekvenciáját; ez a szekvencia leolvasási fázisban van fuzionálva a HV 1 hirudint kódoló szekvenciától fölfelé;
- az élesztő PGK génjének átírási terminátorát, amely a hirudin géntől lefelé helyezkedik el.
A találmány szerinti kifejező blokkokat általában integrálni lehet élesztőkben, elsősorban Saccharomycesben vagy egy autonóm módon replikálódó plazmidban vagy az élesztő kromoszómájában.
Egy autonóm plazmid olyan elemeket tartalmaz, amelyek a plazmid replikációját lehetővé teszik, vagyis valamely replikációs origót, pl. a 2 μ plazmid replikációs origóját. Ezenkívül a plazmid tartalmazhat szelekciós elemeket is, mint pl. azURA+ vagy LEU2 gént, amelyek az ura3' vagy leu2' élesztők komplementálását végzik. Ezek a plazmidok tartalmazhatnak olyan elemeket is, amelyek lehetővé teszik replikációjukat baktériumokban, amikor a plazmidnak „ingázó” plazmidnak kell lennie, így pl. a pBR322 replikációs origóját vagy egy marker gént, pl. az Ampr-t; és/vagy más olyan elemeket, amelyek ismeretesek azok számára, akik a szakterületen jártasak.
A találmány tárgykörébe tartoznak a találmány szerinti kifejező blokk segítségével transzformált élesztők is - amely kifejező blokkot vagy egy plazmid hordozza, vagy az élesztő kromoszómáiban van integrálva -, különösen a Saccharomyces nemzetség, főleg a S. cerevisiae faj élesztői, ezen belül is főleg azok, amelyek Mata párosodó típusúak vagy pedig párosodó típustól mentes diploid vagy poliploid törzsek, de mindenekelőtt a találmány szerinti plazmiddal ura+-vá transzformált uraélesztőtörzsek, amelyek 5-fluor-uracilra rezisztenssé váltak; ezek a törzsek képesek tenyészni ipari tápközegen.
Amikor a promotor az alfa-feromonhoz szolgáló gén promotora, az élesztő előnyösen Afazalfa párosodó típusú élesztő. így pl. ha egy ura3 vagy leu2' vagy hasonló genotípusú törzset alkalmazunk, ezt olyan plazmiddal komplementáljuk, amely lehetővé teszi a plazmid fennmaradását élesztőben megfelelő szelekciós kényszerrel.
Végül a találmány tárgya eljárás hirudin vagy valamely variánsa előállítására a fentebb leírt módon transzformáit élesztő fermentálásával valamilyen tápközeg3
HU 214 236 Β ben, és a tápközegben termelt hirudin kinyerésével érett formában, vagy olyan hirudin prekurzor formájában, amely in vivő vagy in vitro képes éretté válni.
így, bár hirudint elő lehet állítani a fenti transzformált törzsek fermentálásával megfelelő tápközegben és a hirudin felgyülemlésével a sejtekben, mindazonáltal előnyös a hirudint kiválasztódásra késztetni a tápközegbe, vagy érett formában, vagy olyan prekurzor formájában, amelyet in vitro kell tovább feldolgozni.
Ezt az érlelést több stádiumban lehet végrehajtani. Az első helyen el kell hasítani bizonyos elemeket, amelyek az Lex szekvencia transzlációjából erednek; ezt a hasítást az SC|-nek megfelelő szekvencián hajtjuk végre. Az érett hirudint metionin előzheti meg, amelyet szelektíven le lehet hasítani cianogén bromiddal. Ez a módszer itt alkalmazható, mivel a hirudin szekvenciája nem tartalmaz metionint.
Célba lehet venni az N-terminális végnél a Lys-Arg dipeptidet is, amely -COOH-vá hasítható fajlagos endopeptidázzal; mivel ez az enzim aktív a kiválasztási folyamatban, az érett fehéijét ennek megfelelően közvetlenül a tenyészközegből ki lehet nyerni. Bizonyos esetekben azonban szükséges lehet enzimes hasítást is alkalmazni a kiválasztás után, fajlagos enzim hozzáadásával.
Bizonyos esetekben, különösen cianogén-bromiddal végzett hasítás után szükséges lehet a fehérjét renaturálni, vagyis helyreállítani a diszulfid hidak újra megalkotásával. Ebből a célból a peptidet pl. guanidiumkloriddal denaturáljuk, majd redukált glutation jelenlétében renaturáljuk és oxidáljuk.
Az ilyen módszerekkel kapott hirudint trombin inhibitorként lehet alkalmazni, vagyis antikoaguláns gyógyszerként, a koagulációt megakadályozó laboratóriumi készítményként és/vagy a jelzett terméket alkalmazó diagnosztikai szerként.
A HVl-et főleg gyógyászati kompozíciókban önmagában vagy más aktív anyagokkal kombinálva, vagy pedig in vivő és in vitro vizsgálatokkal, diagnosztikai készítményekkel összefüggésben alkalmazhatjuk. Az utóbbi esetben előnyös lehet a molekula jelzése, pl. a radioaktív, fluoreszcens, enzimes vagy más jelzéssel.
A találmány szerinti megoldást a következő ábrákkal és példákkal szemléltetjük. A példákban említett műveletek részleteit laboratóriumi kézikönyvek - például a „Molecular Cloning” (J. Sambrook, E.F. Fritsch; T. Maniatis; Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1982) ismertetik.
Az 1. ábra az Μ13TG897 megalkotását és szerkezetét mutatja be.
A 2. ábra az M13TG897 fág DNS-ének in vitro mutagenezisét mutatja be M13TG1827-té:
a) az oligonukleotid szerkezetét a mutagenezishez,
b) az M13TG897 DNS részleges szerkezetét az oligonukleotiddal hibridizálva,
c) a mutált szekvenciát.
A 3. ábra a pTG883 megalkotását mutatja be.
A 4. ábra a pTG892 megalkotását mutatja be.
Az 5. ábra az M13TG889 megalkotását mutatja be.
A 6. ábra a pTG 1828 éspTG1833 szerkezetét mutatja be.
A 7. ábra a különböző plazmidok által hordozott szekvenciáknak megfelelő hirudin prekurzor szerkezetét mutatja be; azaz a prekurzor NIE végéhez legközelebbi hasítási hely (Lys Arg) a HV2 hirudin érett szekvenciája (NH2-Ile-Thr- stb.) közötti kapcsolódást.
A 8. ábra a HVl-et kódoló DNS szekvencia szintéziséhez alkalmazott oligonukleotidok szekvenciáit és elhelyezését mutatja be.
A 9. és 10. ábra a HVl-et kódoló DNS szekvencia szintézisével kapcsolatban a restrikciós térképet és a szekvenciák aminosavakká való transzlációját mutatja be.
A 2 593 518 számú korábban idézett francia szabadalmi leírásban alkalmazott és leírt plazmidok és stratégiák leírását nem ismételjük meg a jelen bejelentésben.
1. PÉLDA
A pTG897 plazmid (előállítása a 202 919 sz. magyar szabadalmi leírás szerint), hordoz egy hirudin prekurzorhoz szolgáló információt, ez a prekurzor csak egy hasítási helyet tartalmaz az yscF proteináz számára. Az ennél a hasítási helynél végbemenő érlelődéssel inaktív hirudin keletkezik. Az yscF proteinázzal végzett hasítás olyan hirudin molekulát eredményez, amely az NH2 végnél négy gyökkel (Glu Alá Glu Alá) meg van hosszabbítva. Az ezen a Glu Alá Glu Alá szekvenciát kódoló DNS fragmens kiiktatás lehetővé teszi, hogy korrektül érlelt hirudinlánc képződjék ki. Ezt a kiiktatást az irányított in vitro mutagenezis technikájával hajtjuk végre.
A pTG897 plazmidot Pstl/BglII kettős emésztéssel hasítjuk el; a hirudinhez tartozó szekvenciákat magában foglaló DNS fragmenseket egy egyszálú Μ13 TG 131 fág replikatív formájába klónozzuk, így kapjuk meg az M13TG897 fágot (1. ábra).
Az alábbi szekvenciával rendelkező oligonukleotidot hibridizáljuk az M13TG897 fág genom DNS-ével:
5-TCTTTGGATAAAAGAATTACGTATACAGA-3.
Ennek az oligonukleotidnak az első fele (15 bázispár) hibridizál a kiiktatandó szekvenciától közvetlenül fölfelé levő 15 bázispáros szekvenciával, míg a másik fele a közvetlenül lefelé levő 15 bázispárral (2. ábra). Ez az oligonukleotid szolgál templátként az M13TG897 fág genom komplementer szálának in vitro szintéziséhez.
A T4 DNS ligáz működése után, amelyet úgy tervezünk, hogy kovalensen kapcsolja az újonnan képződött szálat, egy receptor baktériumot [pl. JM102 {D (Lac-Pro)Sup E Thi EndlA sbcB15 strA rk- mk+/F' TraD36 ProAB+ LacIQ LacZ DM15} törzset] fertőzünk, és az ebből a fertőzésből eredő fágokat DNS-DNS hibridizálással elemezzük, vizsgáló mintaként a fentebb leírt és kinázos kezeléssel 32P-vei jelzett oligonukleotidot alkalmazva a szokásos technikák szerint, amelyeket a szakterületen jártas szakemberek a gyakorlatban alkalmaznak [Zoller M.J. és Smith M.H. Methods in Enzym. 100, 469 (1983)]. Ez a korrekt módon mutált fág DNS a mutagenezishez használt oligonukleotiddal egy hibridizációs komplexet képez, amely nagyobb stabilitásával és szigorúbb körülmények közt mutatott nagyobb rezisz4
HU 214 236 Β tenciájával azonosítható, míg a nem mutált fág DNS és az oligonukleotid által képződött hibridizációs komplex instabil egy egyszálú DNS hurok jelenléte révén.
2. PÉLDA
A mutált fragmens átvitele egy új kifejező vektorba
ApTG883 plazmid a pTG876 plazmidból (előállítása a 202 919 sz. magyar szabadalmi leírás szerint) származik a PGK gén átírási terminátorához közel jelen levő Bglll hely egyszerű eliminálásával.
Erre a célra a pTG876 plazmidot részlegesen emésztjük BglII-vel, az E. coli DNS polimeráz I Klenow fragmensével reagáltatjuk a négy nukleotid jelenlétében, és a DNS molekulákat kovalensen összekapcsoljuk egymással T4 fág DNS ligáz segítségével. A pTG883 plazmid így csupán egy egyedi Bglll hellyel rendelkezik, amely a feromon gén promotorjától fölfelé helyezkedik el (3. ábra).
A pTG883 plazmidot (20 pg) Bglll emésztéssel linearizáljuk, majd Bal31 nukleázzal (1,4 egység, 10 perc; Boehringer Mannheim gyártmány) végzett szabályozott emésztésnek vetjük alá a szokásos technikáknak megfelelően. Az ezen a módon kezelt DNS-t fenollal és kloroform/izoamil-alkohollal végzett egymást követő extrahálásokkal tisztítjuk, és egy frakciót (5 pg) Klenow polimerázzal kezelve tompa végűvé teszünk. Az ezen a módon kezelt DNS-t nem foszforilezett BamHI kapcsolókkal (5-CGGATCCCG) ligáljuk T4 fág ligáz jelenlétében, a Lathe és munkatársai által leírt technika szerint [Lathe R., Kieny M.P., Skory S. és Lecocq J-P.: DNA 3, 173 (1984). E. coli 1106 transzformálása és ampicillinrezisztenciára végzett szelekció után a pTG892 plazmidot izoláljuk, amely hiányos az MF alfa 1 gént szegélyező 5' terület szempontjából (4. ábra); a BamHI kapcsoló egy bázistávolságban helyezkedik el az ATGtől az alábbi vázlat szerint:
5'-CGGGATCCCG A ATG AGA TTT...
BamHI kapcsoló MFalfái? kódoló rész
Az ezáltal kapott új BamHI-Sall fragmenst az M13TG120 fág BamHI-Sall helyei közé klónozzuk, így kapjuk meg az M13TG889 fágot (4. ábra). Az alfa feromont kódoló összes részt tartalmazó BamHI-BglII fragmenst izoláljuk a pTG848 plazmid nagy Bglll fragmenséből. A ligálás után kapott plazmid, a pTG892b, tartalmazza a feromon kódoló részének megfelelő BamHI-BglII fragmenst, amely a PGK gén promotor Bglll helye mögé van beiktatva.
A pTG892b DNS magában foglal egy egyedi Bglll helyet és egy egyedi Sáli helyet; a két hely közrefog egy rövid szekvenciát, amely Pstl-et foglal magában. BglIIvel és Sall-gyel végzett kettős emésztéssel, a nagy fragmens eluálásával és egy szintetikus polilinkerrel végzett ligálással a rövid szekvenciát a szintetikus polilinkerrel helyettesítjük. Ez a polilinker, amelynek szekvenciája:
5-GATCCAGCTGACATCTGCATGCG
GTCGACTGTAGACGTACGCAGTC-5' egy olyan véggel rendelkezik, amely kohezív a Bglll által felszabadított ffagmensekkel, és egy olyan véggel, amely a Sáli által felszabadított fragmensekkel kohezív, valamint felismerő helyeket tartalmaz többek között a Pvul, Bglll és Sphl enzimek számára.
Az ilyen módon nyert új vektort pTGl 89-nek nevezzük. Ennek a vektornak a DNS-t SphI-gyel és Pstl-gyel emésztjük. Ennek a kettős emésztésnek a segítségével három fragmenst kapunk: egy 6,5 kb-s Pstl-pstI, egy 1,9 kb-s Pstl-Sphl, és egy másik 0,5 kb-s SphI-PstI fragmenst.
A két hosszabb fragmenst megtisztítjuk és összekeverjük a mutált, hirudinnak megfelelő és M13TG1827ből eredő SphI-PstI fragmenssel; ilyen módon az új kifejező vektort, a pTG1828-at kapjuk (6. ábra).
3. PÉLDA
A fragmens átvitele a pTG881 vektorba: új, pTG1833 nevű plazmid
A pTG881 (előállítás a 202 919 sz. magyar szabadalmi leírás szerint) DNS Pstl-gyel végzett részleges emésztésével egy 6,1 kb-s fragmenst szabadítunk fel. Ezt a fragmenst izoláljuk, majd teljes mértékben emésztjük BglII-vel, ezáltal két fragmenst, a Pstl-PstI és Pstl-BglII fragmenseket, szabadítjuk fel. Ezt a két fragmenst a pTGl828-ból származó 0,62 kb-s Pstl-BglII fragmenssel ligáljuk. Ezzel egy új vektort alkotunk meg, amely a pTG897 plazmidtól csupán abban különbözik, hogy ebből hiányzik egy Glu Alá Glu Alá részt kódoló szekvencia. Az ilyen módon kialakított prekurzor szerkezetét a 7. ábrában mutatjuk be. Ez a pTG 1833 plazmid rendelkezik egy E. coliban való replikáláshoz alkalmas origóval, ampicillinra való rezisztencia-génnel, a S. cerevisiae Leu2 génjével, a 2 μ plazmid olyan fragmensével, amely lehetővé teszi a replikációt S. cerevisiae-ben, a prepro-t kódoló MFalfal gén promotorral és a hirudin génnel (6. ábra).
4. PÉLDA
Élesztő transzformálása apTGI828 éspTGl833 plazmidokkal
A S. cerevisiae TGYlsp 4 törzset (Matalfa ura3-25L 373-328 his3-l 1-15) (lásd 202 919 ljsz. magyar szabadalmi leírás) transzformáljuk a pTG01818, pTG1828 és pTG1833 plazmidokkal. Az
1. táblázatban rögzített eredmények azt mutatják, hogy a pTG1818 és a pTG1833 azonos szinten indukálják a hirudin aktivitás kiválasztását. Ezzel ellentétben a TGYsph pTG1828 fele annyi hirudin aktivitást választ ki, mint a másik két törzs. Egy másik törzse, a TGYlsph/pTG881-et választunk ki kontrollként; amely nem rendelkezik a hirudin genetikai információjával. A pG1828-cal vagy pTG1833-mal transzformáit S. cerevisiae (Mata) TGY14-2 törzs által kiválasztott hirudin-termeléseket szintén összehasonlítjuk (2. táblázat). Ebben a példában azt is meg kell jegyeznünk, hogy a TGY 14-2 törzs esetében (párosodó típusú Matalfa) a pTG1833 jobb hirudin-kiválasztást indukál, mint a pTG1828 plazmid. Ezzel ellentétben a TGY14-1 törzs esetében (párosodó típusú Mata), a pTG1833 nem indukál hirudin kiválasztást, amint ez várható, míg a TGY14-2 termel hirudint.
HU 214 236 Β
1. TÁBLÁZAT
Élesztőtenyészet felülúszók antitrombin aktivitása (10 ml) (48 órás tenyészet, YNBG tápközeg +0,5%
kazamino-sav)
Receptor Plazmid Teljes aktivitás
TGYlsph pTG881 (kontroll) nem mutatható ki
TGYlsp4 pTG1818 158
TGYlsp4 pTG1828 73
TGYlsp4 pTG1833 149
2. TÁBLÁZAT
Elesztőtenyészet felülúszók antitrombin aktivitása (10 ml) (72 órás tenyészet, YNBG tápközeg +0,5%
Receptor kazamino-sav) Plazmid Teljes aktivitás
TGY14-1 pTG881 nem mutatható ki
(kontroll) nem mutatható ki
TGY14-1 pTG1828 54
TGY14-1 pTG1833 nem mutatható ki
TGY14—2 (kontroll) pTG881 nem mutatható ki
TGY14-2 pTG1828 103
TGY14-2 pTG1833 210
5. PÉLDA
Komplett tápközegben a plazmidfenotípus elvesztése nélkül tenyészthető törzsek izolálása
A WO 86/01 224 számon közzétett nemzetközi szabadalmi bejelentés szerint, ha bizonyos, 5-FU-ra való rezisztenciát átadó mutációkat vezetnek be egy plazmid segítségéve] ura3 törzsbe, a törzset ura+-vá transzformálják, így a transzformált törzsek többféle tápközegen tenyészthetők; különösen fontos, hogy komplex ipari tápközegek is alkalmazhatók. A fenti WO 86/01 224 közzétételi számú szabadalmi bej elentésben leírt munkamenet szerint a TGYlsp4/pTG1833 törzsből spontán mutánsokat izolálunk, amelyek 1 mg/ml 5-fluor-uracillal kiegészített komplett tápközegen (YPG) képesek telepeket képezni. 6 mutánst tenyésztünk komplett tápközegben, ezek egyikét választjuk ki, amely nem termel olyan telepeket, amelyekből a plazmid hatásai hiányoznak, nemszelektiv körülmények között végzett növesztés több, mint 20 generációja után sem.
Ezt a mutánst, amelyet TGYsp4-3-nak nevezünk, alkalmazzuk hirudin termelésére komplett táp közegen.
6. PÉLDA
A HVl-et kódoló DNS szekvencia szintézisének stratégiája
Ennek a szekvenciának kell hordoznia azokat az elemeket, amelyek lehetővé teszik a HV1 szekvencia fázisban történő fúzióját az MFalfal prepro részével, és azokat a szignálokat, amelyek lehetővé teszik a kiválasztott hirudin korrekt érését; pontosabban a csatlakozó terület tartalmaz egy Lys-Arg párt közvetlenül a HV1 első NH2-terminálisától fölfelé.
Az alkalmazott stratégia hasonló ahhoz, amelyet a 2 569 420 számú francia szabadalmi leírásban ismertettek. A szintéziseket két külön blokkban hajtjuk végre, amelyeket azután egyesítünk BamHI kohezív végeik segítségével. Az első blokk 9 oligonukleotidból áll, amelyet 1-9. számozással látunk el, és a második blokk 10 nukleotidból áll, amelyeket 10-19. számozással látunk el. Ezek szekvenciáját és az oligonukleotidok helyzetét a 8. ábrában mutatjuk be.
A restrikciós térképet, valamint a szekvencia transzlációját aminosavakká a 9. és 10. ábrákban adjuk meg.
7.PÉLD A
A szintetikus gén összeállítása Első szintetikus blokk
A 2-8. oligonukleotidokat (8. ábra) 5'-végükön foszforilezzük, hogy elkerüljük a dimerek vagy polimerek képződését: 500-500 pikomólt az egyes oligonukleotidokból polinukleotid kinázzal (2 egység) kezelünk 25 μΐ végső térfogatban olyan oldatban, amely 60 mmól/1 trisz-HCl-t (pH 7,5), 10 mmól/1 MgCl2-t és 8 mmól/1 ditiotreitet, valamint 3,3 pmól [32P]-gamma-ATP-t (5000 Ci/nmól) tartalmaz. 15 perces 37 °C hőmérsékleten végzett inkubálás után 5 nmól nem jelzett ATP-t adunk hozzá.
°C hőmérsékleten, 30 percen át végzett inkubálás után a komplementer fragmenseket párokban hibridizáljuk az 1., 2. és 3. fragmensek kivételével, ez utóbbiakat összekeverjük egymással. Az egyes oligonukleotidokból 300 pmólt alkalmazunk 10 μΐ végső térfogatban az alábbi összetételű oldatban: 66 mmól/1 trisz-HCl (pH 7,5), 6 mmól/1 MgCl2, 100 mmól/1 NaCl, 0,5 mmól/1 spermidin és 8 mmól/1 DTT.
Ezeket a keverékeket 3 percig 100 °C hőmérsékleten hőkezeljük, majd lassan, mintegy 2 óra alatt 37 °C hőmérsékletre lehűtjük. A hibridizált 1-2-3. oligonukleotidokat összekeverjük a 4-5. oligonukleotidokkal, és inkubáljuk 37 °C hőmérsékleten 2 órán át. Hasonló módon hajtjuk végre a 6-7. oligonukleotid-pár hibridizálását a 8-9. oligonukleotidpárral. Az utolsó stádiumban az ezen a módon előkezelt 9 oligonukleotidot összekeverjük és 2 órán át inkubáljuk 37 °C hőmérsékleten 100 μΐ végső térfogatban.
Ezekből a hibridizált oligonukleotidokból 14 pmólt T4 ligázos kezelésnek vetünk alá 15 órán át 15 °C hőmérsékleten. Az M13TG131 előzőleg gélen tisztított nagy HindlII-BamHI fragmensének 50 ng-ját adjuk ezután a reakciókeverékhez. Ezt a ligálási keveréket alkalmazzuk ezután kompetens E. coli JM103 sejtek transzformálására. Az ilyen módon kapott 12 fág klónból csak egy rendelkezik a kívánt szekvenciával: az M13TG 1888.
Második szintetikus blokk
Azonos stratégiát alkalmazunk a második szintetikus blokk szintéziséhez (8. ábra), amelyet M13TG131 BamHI és Sáli helyei közé klónozunk. A 12 vizsgált klónból kettő rendelkezik a kívánt szekvenciának megfelelő beiktatással. Ezeknek a kiónoknak egyikét nevezzük M13TG1889-nek.
HU 214 236 Β
A szintetikus gén összeállítása
Az M13TG1888 és M13TG1889 kettős szálú DNSeit emésztjük HindlII-mal és BamHI-gyel, illetve BamHI-gyel és Sall-gyel, és összekeveijük a pBR322 nagy HindlII-Sall fragmensével, amelyet előzőleg gélen tisztítottunk. Ligálás után ezt a keveréket használjuk E. coli 1106 transzformálására. Ampicillinre való rezisztencia segítségével szelektálva a pTG1890 plazmidot kapjuk, amely tartalmazza a korrekt módon felépített szintetikus szekvenciát.
8. PÉLDA
A pTG1891 vektor megalkotása, amely lehetővé teszi, hogy a szintetizált hirudin kiválasztódjék
A pTGl890-nek azt a DNS fragmensét, amely a HV1 kódoló szekvenciát hordozza, kivesszük HindlII-BglII fragmens formájában (a BglII hely közvetlenül a Sáli helytől felfelé helyezkedik el, amelyet a fenti klónozásnál alkalmaztunk) és beiktatjuk a 2 593 518 lajstromszámú francia szabadalmi leírásban ismertetett pTG881 plazmid HindlII és BglII helyei közé. Az így létrejött plazmidban, a pTG1891-ben, a HV1 gén ezért az MFalfal prepro szekvenciái és az átírási terminátor közé van beiktatva; ezt a konstrukciót kell ezért a HV1 hirudin érleléséhez és kiválasztásához alkalmazni, mivel ez azonos a pTG1818-cal (2 593 518 lajstromszámú francia szabadalmi leírás) azzal a különbséggel, hogy a HV2 kódoló szekvenciája a HV1 kódoló szekvenciájával van helyettesítve.
9. PÉLDA
A TGYlsp4 törzs transzformálása a pTG1891 plazmid DNS-sel
A TGYsp4 (alfa-1 ura3-251-373, His3-ll-15) törzset a pTG1891 plazmiddal transzformáljuk; az ura+ jellemző alapján végzett szelekció révén kapott 2 kiónt tenyésztjük és meghatározzuk a tenyészközegbe kiválasztott hirudin-termelést. Kontrollként a TGYsp4/pTG1833 által azonos körülmények között kiválasztott hirudin mennyiségét is meghatározzuk.
Kétszer olyan nagy antitrombin aktivitást mérünk a TGYlsp4/pTG1891 törzs tenyészetének felülúszójában (0,9 mg/1 tenyészet felülúszó), mint a TGYlsp4/pTG1833 törzs tenyészetének felülúszójában.
A találmányt képviselő törzsek letétbe helyezése
A következő törzseket helyeztük letétbe a Pasteur Intézet keretében működő Nemzeti Mikroorganizmus Gyűjteményben (Collection Nationale de Cultures de Microorganismes):
1986. június 6-án:
Saccharomyces cerevisiae TGYlsp4/pTG1828, I569 számon;
Saccharomyces cerevisiae TGYsp4.3/pTG1833, I570 számon;
1986. november 6-án:
Saccharomyces cerevisiae TGYlsp4/pTG1891, I623 számon.

Claims (7)

  1. SZABADALMI IGÉNYPONTOK
    1. Eljárás hirudin vagy valamely variánsának előállítására, azzaljellemezve, hogy valamely alábbi, élesztőkben a kívánt fehérje termelését lehetővé tevő DNS funkciós blokkal vagy ilyen blokkot tartalmazó plazmiddal transzformált élesztőt fermentálunk, [majd a tenyészléből a fehérjét érett formában vagy prekurzor formájában kinyerjük, és kívánt esetben az utóbbit in vitro éretté alakítjuk], ahol a funkciós blokk legalább egy —S„-Lex—Scl-H génszekvenciát tartalmaz, ahol
    H gén jelentése hirudint vagy annak egy variánsát kódoló gén,
    Str jelentése a H gén élesztők által történő transzkripcióját lehetővé tevő jeleket tartalmazó DNS szekvencia,
    Lex jelentése a géntermék kiválasztódását biztosító vezető szekvencia,
    SC| jelentése egyedüli, a H géntől közvetlenül fölfelé elhelyezkedő yscF proteináz hasítási helyet kódoló DNS-szekvencia.
  2. 2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzaljellemezve, hogy az élesztők α-szexferomonjának kiválasztódását lehetővé tevő Lex szekvenciát tartalmazó élesztőt tenyésztünk.
  3. 3. Az 1. vagy 2. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy MFalfal gén promotertől eltérő élesztő gén promotert magában foglaló Str szekvenciát tartalmazó élesztőt tenyésztünk.
  4. 4. A 3. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy élesztő PGK gén promotert magában foglaló Str szekvenciát tartalmazó élesztőt tenyésztünk.
  5. 5. Az 14. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy H génként HVl-t vagy HV2-t kódoló gént tartalmazó élesztőt tenyésztünk.
  6. 6. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy replikációs origóként a 2 μ plazmid replikációs origóját tartalmazó plazmiddal transzformált élesztőt tenyésztünk.
  7. 7. A 6. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy URA3 gént is tartalmazó plazmiddal transzformált élesztőt nyerünk.
HU873161A 1986-07-10 1987-07-10 Eljárás hirudin és hirudinvariánsok előállítására HU214236B (hu)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
FR868610090A FR2601383B2 (fr) 1985-05-02 1986-07-10 Vecteurs perfectionnes d'expression de l'hirudine dans les levures, procede et produit obtenu
FR868616722A FR2607516B2 (fr) 1986-12-01 1986-12-01 Vecteurs perfectionnes d'expression d'un variant de l'hirudine dans les levures, procede et produit obtenu

Publications (2)

Publication Number Publication Date
HUT44616A HUT44616A (en) 1988-03-28
HU214236B true HU214236B (hu) 1998-03-02

Family

ID=26225387

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
HU873161A HU214236B (hu) 1986-07-10 1987-07-10 Eljárás hirudin és hirudinvariánsok előállítására

Country Status (20)

Country Link
US (2) US5591640A (hu)
EP (1) EP0252854B1 (hu)
JP (1) JP2733602B2 (hu)
KR (1) KR960013464B1 (hu)
AT (1) ATE153066T1 (hu)
AU (1) AU614933B2 (hu)
BG (1) BG80504A (hu)
CA (1) CA1341490C (hu)
CZ (1) CZ278268B6 (hu)
DE (1) DE3752063T2 (hu)
DK (1) DK175195B1 (hu)
ES (1) ES2103700T3 (hu)
FI (1) FI96966C (hu)
GR (1) GR3024368T3 (hu)
HU (1) HU214236B (hu)
MC (1) MC1834A1 (hu)
NO (1) NO179489C (hu)
PL (1) PL154118B1 (hu)
PT (1) PT85296B (hu)
RU (1) RU1776276C (hu)

Families Citing this family (23)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
MY101203A (en) * 1985-12-12 1991-08-17 Ucp Gen Pharma Ag Production of thrombin iinhibitors.
GB8530631D0 (en) 1985-12-12 1986-01-22 Ciba Geigy Ag Thrombin inhibitors
MC1834A1 (fr) * 1986-07-10 1988-06-03 Transgene Sa Bloc fonctionnel d'adn et plasmide codant pour l'hirudine,levure transformee,procede de preparation de l'hirudine,hirudine obtenue et son utilisation
US5256559A (en) * 1988-03-04 1993-10-26 Biogen, Inc. Methods and compositions for inhibiting platelet aggregation
GB8809860D0 (en) * 1988-04-26 1988-06-02 Ciba Geigy Ag Process for production of polypeptides
US5112615A (en) * 1988-08-03 1992-05-12 New England Deaconess Hospital Corporation Soluble hirudin conjugates
US5167960A (en) * 1988-08-03 1992-12-01 New England Deaconess Hospital Corporation Hirudin-coated biocompatible substance
DK105489D0 (da) * 1989-03-03 1989-03-03 Novo Nordisk As Polypeptid
FR2645175B1 (fr) * 1989-03-31 1994-02-18 Transgene Sa Souche de saccharomyces cerevisiaeproductrice d'une proteine heterologue et procede de preparation de ladite proteine heterologue par fermentation de ladite souche
US5879926A (en) * 1989-03-31 1999-03-09 Transgene S.A. Yeast strains for the production of mature heterologous proteins, especially hirudin
FR2645174B1 (fr) * 1989-03-31 1994-01-07 Transgene Sa Souches de levure ameliorees pour la production de proteines heterologues matures en particulier d'hirudine et procede de preparation d'hirudine correspondant
FR2646437B1 (fr) * 1989-04-28 1991-08-30 Transgene Sa Nouvelles sequences d'adn, leur application en tant que sequence codant pour un peptide signal pour la secretion de proteines matures par des levures recombinantes, cassettes d'expression, levures transformees et procede de preparation de proteines correspondant
US5179196A (en) * 1989-05-04 1993-01-12 Sri International Purification of proteins employing ctap-iii fusions
DE4009268A1 (de) * 1990-03-22 1991-09-26 Consortium Elektrochem Ind Sekretion von hirudinderivaten
GB9015825D0 (en) * 1990-07-18 1990-09-05 Ciba Geigy Ag In vitro processing of fusion proteins
US6514730B1 (en) 1991-03-21 2003-02-04 Consortium für elektrochemische Industrie GmbH Secretion of hirudin derivatives
US5837808A (en) * 1991-08-20 1998-11-17 Baxter International Inc. Analogs of hirudin
EP0592358B1 (en) * 1992-09-04 2000-10-11 Novartis AG Process for the production of protease inhibitors
TW282490B (hu) * 1992-12-15 1996-08-01 Ciba Geigy Ag
US5712114A (en) * 1995-06-06 1998-01-27 Basf Aktiengesellschaft Compositions for expression of proteins in host cells using a preprocollagen signal sequence
EP1049790A1 (en) 1998-01-23 2000-11-08 Novo Nordisk A/S Process for making desired polypeptides in yeast
KR100949722B1 (ko) 2002-08-12 2010-03-25 에이펙셀 (주) 마이크로 초미립 분쇄기
US7795205B2 (en) 2004-04-12 2010-09-14 Canyon Pharmaceuticals, Inc. Methods for effecting regression of tumor mass and size in a metastasized pancreatic tumor

Family Cites Families (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4356270A (en) * 1977-11-08 1982-10-26 Genentech, Inc. Recombinant DNA cloning vehicle
US4769326A (en) * 1980-02-29 1988-09-06 The Regents Of The University Of California Expression linkers
US4546082A (en) * 1982-06-17 1985-10-08 Regents Of The Univ. Of California E. coli/Saccharomyces cerevisiae plasmid cloning vector containing the alpha-factor gene for secretion and processing of hybrid proteins
NO840200L (no) * 1983-01-28 1984-07-30 Cefus Corp Glukoamylase cdna.
JPS6041487A (ja) * 1983-04-25 1985-03-05 ジエネンテツク・インコ−ポレイテツド 酵母発現系でのアルフア因子配列の使用
WO1985004418A1 (fr) * 1984-03-27 1985-10-10 Transgene S.A. Vecteurs d'expression de l'hirudine, cellules transformees et procede de preparation de l'hirudine
ATE64956T1 (de) * 1984-06-14 1991-07-15 Ciba Geigy Ag Verfahren zur herstellung von thrombininhibitoren.
DE3429430A1 (de) * 1984-08-10 1986-02-20 Hoechst Ag, 6230 Frankfurt Gentechnologisches verfahren zur herstellung von hirudin und mittel zur durchfuehrung dieses verfahrens
DE3445517C2 (de) * 1984-12-13 1993-11-18 Ciba Geigy Für ein Hirudin-ähnliches Protein codierende DNA-Sequenz und Verfahren zur Herstellung eines Hirudin-ähnlichen Proteins
FR2593518B1 (fr) * 1985-05-02 1989-09-08 Transgene Sa Vecteurs d'expression et de secretion de l'hirudine par les levures transformees
MY101203A (en) * 1985-12-12 1991-08-17 Ucp Gen Pharma Ag Production of thrombin iinhibitors.
MC1834A1 (fr) * 1986-07-10 1988-06-03 Transgene Sa Bloc fonctionnel d'adn et plasmide codant pour l'hirudine,levure transformee,procede de preparation de l'hirudine,hirudine obtenue et son utilisation

Also Published As

Publication number Publication date
JPS6485082A (en) 1989-03-30
DK175195B1 (da) 2004-07-05
FI873068A0 (fi) 1987-07-10
BG80504A (bg) 1993-12-24
DK355887A (da) 1988-01-11
MC1834A1 (fr) 1988-06-03
DE3752063D1 (de) 1997-06-19
EP0252854B1 (fr) 1997-05-14
ES2103700T3 (es) 1997-10-01
AU614933B2 (en) 1991-09-19
EP0252854A1 (fr) 1988-01-13
NO872878L (no) 1988-01-11
RU1776276C (ru) 1992-11-15
JP2733602B2 (ja) 1998-03-30
CZ278268B6 (en) 1993-11-17
KR960013464B1 (ko) 1996-10-05
US5902735A (en) 1999-05-11
AU7536687A (en) 1988-01-14
PT85296B (pt) 1995-05-31
PL266756A1 (en) 1988-06-23
FI96966B (fi) 1996-06-14
GR3024368T3 (en) 1997-11-28
DE3752063T2 (de) 1997-12-04
US5591640A (en) 1997-01-07
NO179489C (no) 1996-10-16
KR880007727A (ko) 1988-08-29
CZ527787A3 (en) 1993-08-11
NO872878D0 (no) 1987-07-10
PL154118B1 (en) 1991-07-31
NO179489B (no) 1996-07-08
CA1341490C (fr) 2005-08-30
DK355887D0 (da) 1987-07-09
HUT44616A (en) 1988-03-28
PT85296A (pt) 1988-07-29
ATE153066T1 (de) 1997-05-15
FI96966C (fi) 1996-09-25
FI873068A (fi) 1988-01-11

Similar Documents

Publication Publication Date Title
HU214236B (hu) Eljárás hirudin és hirudinvariánsok előállítására
US5324641A (en) DNA sequences encoding insulin precursors and methods of production
CA1340371C (en) Methods and products for facile microbial expression of dna sequences
FR2601383A2 (fr) Vecteurs perfectionnes d'expression de l'hirudine dans les levures, procede et produit obtenu
US5516656A (en) Production of a new hirudin analog and anticoagulant pharmaceutical composition containing the same
US5736379A (en) DNA sequences expressing mammalian α1 antitrypsin
US5260201A (en) Methods and products for facile microbial expression of DNA sequences
HU210439B (en) Process for production of hirudin-derivative
JPH01501996A (ja) 脱―表皮細胞成長因子プラスミノーゲンアクチベーター
US5464770A (en) DNA encoding (ASP 113) and (LYS 46, ASP 113) thaumatin I
US5296366A (en) Method for the isolation and expression of a gene which codes for streptokinase, nucleotide sequence obtained, recombinant DNA and transformed microorgnaisms
HU217094B (hu) Eljárás proteázinhibitorok előállítására
JP3226289B2 (ja) 分泌ベクター、該ベクターで形質転換した微生物及び該微生物から産生される産物の製造法
US5489529A (en) DNA for expression of bovine growth hormone
KR100289691B1 (ko) 콜라게네이즈 인지부위를 가진 재조합 인간 성장 호르몬
CA2043953C (en) Method for the isolation and expression of a gene which codes for streptokinase, nucleotide sequence obtained, recombinant dna and transformed microorganisms
IE53898B1 (en) Microbially produced bovine growth hormone (bgh) and its use
HUT72848A (en) Dna sequences encoding novel biosynthetic insulin precursors and process for preparation of insulin

Legal Events

Date Code Title Description
DGB9 Succession in title of applicant

Owner name: BEHRINGWERKE A.G., DE

HPC4 Succession in title of patentee

Owner name: SCHERING AKTIENGESELLSCHAFT, DE