JP3226289B2 - 分泌ベクター、該ベクターで形質転換した微生物及び該微生物から産生される産物の製造法 - Google Patents
分泌ベクター、該ベクターで形質転換した微生物及び該微生物から産生される産物の製造法Info
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Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、ヒルジン又はその変異
体を菌体外に大量生産するための分泌ベクターに関す
る。さらに本発明は、該分泌ベクターで形質転換された
形質転換微生物及び該形質転換微生物を用いるヒルジン
又はその変異体の製造方法に関する。
体を菌体外に大量生産するための分泌ベクターに関す
る。さらに本発明は、該分泌ベクターで形質転換された
形質転換微生物及び該形質転換微生物を用いるヒルジン
又はその変異体の製造方法に関する。
【０００２】
【従来の技術及び発明が解決しようとする課題】薬用ヒ
ル（Hirudo medicinalis) の唾液腺から分泌される抗血
液凝固因子であるヒルジンは、６５個及び６６個のアミ
ノ酸から成るペプチドの混合物である。ヒルジンの構造
はＤｏｄｔ等〔FEBS Lett. 165, 180(1984) 〕により解
明され、これはヒルジン変異体(Variant)１（ＨＶ１）
に相当し、２番目のＨＶ２〔Harvey等 Proc. Natl. Aca
d. Sci, USA,88, 1084(1986)〕はＨＶ１と９個のアミノ
酸が異なり、３番目のＨＶ３〔Dodt等 Biol. Chem. Hop
pe-Seyler, 367, 803(1986) 〕は Ser32までＨＶ２と同
一で、Ｃ末端側でアミノ酸(Ala63) の付加を含む、10個
のアミノ酸が異なる。
ル（Hirudo medicinalis) の唾液腺から分泌される抗血
液凝固因子であるヒルジンは、６５個及び６６個のアミ
ノ酸から成るペプチドの混合物である。ヒルジンの構造
はＤｏｄｔ等〔FEBS Lett. 165, 180(1984) 〕により解
明され、これはヒルジン変異体(Variant)１（ＨＶ１）
に相当し、２番目のＨＶ２〔Harvey等 Proc. Natl. Aca
d. Sci, USA,88, 1084(1986)〕はＨＶ１と９個のアミノ
酸が異なり、３番目のＨＶ３〔Dodt等 Biol. Chem. Hop
pe-Seyler, 367, 803(1986) 〕は Ser32までＨＶ２と同
一で、Ｃ末端側でアミノ酸(Ala63) の付加を含む、10個
のアミノ酸が異なる。
【０００３】これらの天然変異体以外に、遺伝子工学的
手法を用いていくつかの人工変異体が創出されており、
特に本発明者らによって提案されたキメラヒルジン（ヒ
ルジンＨＶ１Ｃ３）（特願平２−３０３０９６）は抗ト
ロンビン活性が強く、しかも出血傾向が低いことから、
抗凝血剤として有用である。これらヒルジンの天然変異
体及びヒルジンＨＶ１Ｃ３のアミノ酸配列を図１に示
す。
手法を用いていくつかの人工変異体が創出されており、
特に本発明者らによって提案されたキメラヒルジン（ヒ
ルジンＨＶ１Ｃ３）（特願平２−３０３０９６）は抗ト
ロンビン活性が強く、しかも出血傾向が低いことから、
抗凝血剤として有用である。これらヒルジンの天然変異
体及びヒルジンＨＶ１Ｃ３のアミノ酸配列を図１に示
す。
【０００４】ヒルジンの遺伝子工学的製法は種々提案さ
れているが、満足できる方法はない。特に工業的見地か
らは、生産された蛋白質を細胞外に分泌させることがで
きると、生産物が活性のある形で存在するため生産物の
分離精製が容易になるだけでなく、生産物が菌体内プロ
テアーゼで分解することを防げる等の利点があり、分泌
生産法が望まれていた。ヒルジンの分泌生産に関しては
枯草菌、酵母又は大腸菌を宿主とする方法がいくつか提
案されている。枯草菌を宿主とする方法は、一般に枯草
菌の菌体内ではプラスミドが不安定なためしばしば脱落
が起り、生産物の安定生産が困難なこと及び菌体外プロ
テアーゼによって生産物が分解され易いことが欠点とさ
れている。ヒルジンの生産に関して提案されている方法
（例えば特開平２−３５０８４）においても上述の問題
が解決されておらず、生産量は約１００ｍｇ／ｌに過ぎ
ない。酵母を宿主とする方法は、一般にカルボキシペチ
ターゼによって生産物のＣ末端アミノ酸が水解されるこ
とが知られている。先行文献（N. Riehl-Bellon et a
l., Biochemisrtry 1989, 28, 2941-2949)におけるヒル
ジンＨＶ２の生産においても、Ｃ末端から１又は２アミ
ノ酸残基の脱落した副産物が生成することが報告されて
いる。そのため、カルボキシペプチターゼの欠損した酵
母変異株を宿主として使用することが提案されているが
（特開平２−１０４２７９）、十分な生産性を得るには
至っていない。
れているが、満足できる方法はない。特に工業的見地か
らは、生産された蛋白質を細胞外に分泌させることがで
きると、生産物が活性のある形で存在するため生産物の
分離精製が容易になるだけでなく、生産物が菌体内プロ
テアーゼで分解することを防げる等の利点があり、分泌
生産法が望まれていた。ヒルジンの分泌生産に関しては
枯草菌、酵母又は大腸菌を宿主とする方法がいくつか提
案されている。枯草菌を宿主とする方法は、一般に枯草
菌の菌体内ではプラスミドが不安定なためしばしば脱落
が起り、生産物の安定生産が困難なこと及び菌体外プロ
テアーゼによって生産物が分解され易いことが欠点とさ
れている。ヒルジンの生産に関して提案されている方法
（例えば特開平２−３５０８４）においても上述の問題
が解決されておらず、生産量は約１００ｍｇ／ｌに過ぎ
ない。酵母を宿主とする方法は、一般にカルボキシペチ
ターゼによって生産物のＣ末端アミノ酸が水解されるこ
とが知られている。先行文献（N. Riehl-Bellon et a
l., Biochemisrtry 1989, 28, 2941-2949)におけるヒル
ジンＨＶ２の生産においても、Ｃ末端から１又は２アミ
ノ酸残基の脱落した副産物が生成することが報告されて
いる。そのため、カルボキシペプチターゼの欠損した酵
母変異株を宿主として使用することが提案されているが
（特開平２−１０４２７９）、十分な生産性を得るには
至っていない。
【０００５】大腸菌を宿主とする方法としてはアルカリ
フォスファターゼのシグナル配列を利用する方法が報告
されている（J. Dodt et al.,FEBS Lett. 202, 373-377
(1986) 。この方法は分泌生産とは言え、ペリプラズム
への分泌が主であり、そのため生産物の回収に際しては
浸透圧ショック等による菌体の破壊が必要であり、また
生産量も４ｍｇ／ｌと低く、満足できるものではなかっ
た。
フォスファターゼのシグナル配列を利用する方法が報告
されている（J. Dodt et al.,FEBS Lett. 202, 373-377
(1986) 。この方法は分泌生産とは言え、ペリプラズム
への分泌が主であり、そのため生産物の回収に際しては
浸透圧ショック等による菌体の破壊が必要であり、また
生産量も４ｍｇ／ｌと低く、満足できるものではなかっ
た。
【０００６】本発明者らは、大腸菌を宿主として異種蛋
白質、特にヒルジン及びその変異体を菌体外に大量生産
させる方法について鋭意検討した結果、シグナルペプチ
ドをコードするＤＮＡ配列を含む分泌ベクターの複製開
始点（ｏｒｉ）にｐＵＣプラスミドの複製開始点（ｏｒ
ｉ）を用いると、異種蛋白質が大腸菌の菌体外に大量に
分泌生産されることを見出し、本発明をなすに至った。
白質、特にヒルジン及びその変異体を菌体外に大量生産
させる方法について鋭意検討した結果、シグナルペプチ
ドをコードするＤＮＡ配列を含む分泌ベクターの複製開
始点（ｏｒｉ）にｐＵＣプラスミドの複製開始点（ｏｒ
ｉ）を用いると、異種蛋白質が大腸菌の菌体外に大量に
分泌生産されることを見出し、本発明をなすに至った。
【０００７】
【課題を解決するための手段】本発明は、特にヒルジン
又はその変異体を菌体外に大量生産するための分泌ベク
ターに関する。 また、本発明はヒルジン又はその変異
体をコードするＤＮＡ配列を含む該分泌ベクター、この
分泌ベクターによって大腸菌を形質転換した形質転換微
生物及びこの形質転換微生物を培養し、培地中から生産
物を回収する、ヒルジン又はその変異体の製造方法に関
する。
又はその変異体を菌体外に大量生産するための分泌ベク
ターに関する。 また、本発明はヒルジン又はその変異
体をコードするＤＮＡ配列を含む該分泌ベクター、この
分泌ベクターによって大腸菌を形質転換した形質転換微
生物及びこの形質転換微生物を培養し、培地中から生産
物を回収する、ヒルジン又はその変異体の製造方法に関
する。
【０００８】本発明の異種蛋白質の分泌ベクターは、ｐ
ＵＣプラスミドの複製開始点（ｏｒｉ）を含むＤＮＡ配
列、ｔａｃプロモーターまたはｔｒｐプロモーターのＤ
ＮＡ配列、アルカリ性フォスファターゼ由来のシグナル
ペプチドをコードするＤＮＡ配列及びヒルジン又はその
変異体をコードするＤＮＡ配列を含んでなる。
ＵＣプラスミドの複製開始点（ｏｒｉ）を含むＤＮＡ配
列、ｔａｃプロモーターまたはｔｒｐプロモーターのＤ
ＮＡ配列、アルカリ性フォスファターゼ由来のシグナル
ペプチドをコードするＤＮＡ配列及びヒルジン又はその
変異体をコードするＤＮＡ配列を含んでなる。
【０００９】本発明のｐＵＣプラスミドの複製開始点
（ｏｒｉ）を含むＤＮＡ配列は、市販のｐＵＣ系のプラ
スミド、例えばｐＵＣ９、ｐＵＣ１８又はｐＵＣ１９な
どを適当な組合せの制限酵素によって切断することによ
り調製することができる。例えばｐＵＣ１８を制限酵素
ＰｖｕＩあるいはＰｖｕＩとＰｖｕ IIとで切断するこ
とによって得られる複製開始点（ｏｒｉ）を含む約１４
４０塩基対のＤＮＡ配列をｐＵＣプラスミドの複製開始
点として用いることができる。
（ｏｒｉ）を含むＤＮＡ配列は、市販のｐＵＣ系のプラ
スミド、例えばｐＵＣ９、ｐＵＣ１８又はｐＵＣ１９な
どを適当な組合せの制限酵素によって切断することによ
り調製することができる。例えばｐＵＣ１８を制限酵素
ＰｖｕＩあるいはＰｖｕＩとＰｖｕ IIとで切断するこ
とによって得られる複製開始点（ｏｒｉ）を含む約１４
４０塩基対のＤＮＡ配列をｐＵＣプラスミドの複製開始
点として用いることができる。
【００１０】本発明にいうｔａｃプロモーター又はｔｒ
ｐプロモーターのフラグメントは、図２及び図３に示し
た塩基配列を有するもので、ＤＮＡ合成機等により容易
に合成することができる。従って、これらのプロモータ
ーを合成し、これをプラスミドｐＵＣ１８の複製開始点
（ｏｒｉ）のフラグメント等と組合せても良いが、市販
のプラスミドから制限酵素によって切断して得られるＤ
ＮＡ配列を結合させることにより比較的容易に調製でき
る。例えば、市販のプラスミドｐＫＫ２２３−３（ファ
ルマシア製）を制限酵素ＰｖｕＩ及びＮｒｕＩで切断し
たｔａｃプロモーターのＤＮＡ配列を含むフラグメント
と市販のプラスミドｐＵＣ１８を制限酵素ＰｖｕＩ及び
Ｐｖｕ II で切断した複製開始点（ｏｒｉ）を含むＤＮ
Ａ配列とをＴ４ ＤＮＡリガーゼで接合してプラスミド
ｐＭＫ２を得ることができる。
ｐプロモーターのフラグメントは、図２及び図３に示し
た塩基配列を有するもので、ＤＮＡ合成機等により容易
に合成することができる。従って、これらのプロモータ
ーを合成し、これをプラスミドｐＵＣ１８の複製開始点
（ｏｒｉ）のフラグメント等と組合せても良いが、市販
のプラスミドから制限酵素によって切断して得られるＤ
ＮＡ配列を結合させることにより比較的容易に調製でき
る。例えば、市販のプラスミドｐＫＫ２２３−３（ファ
ルマシア製）を制限酵素ＰｖｕＩ及びＮｒｕＩで切断し
たｔａｃプロモーターのＤＮＡ配列を含むフラグメント
と市販のプラスミドｐＵＣ１８を制限酵素ＰｖｕＩ及び
Ｐｖｕ II で切断した複製開始点（ｏｒｉ）を含むＤＮ
Ａ配列とをＴ４ ＤＮＡリガーゼで接合してプラスミド
ｐＭＫ２を得ることができる。
【００１１】一方、上記プラスミドｐＭＫ２を制限酵素
ＥｃｏＲＩ及びＥｃｏ４７ IIIで切断してｔａｃプロモ
ーターのＤＮＡ配列を含むフラグメントを除き、これに
ＤＮＡ合成機等により合成したｔｒｐプロモーターのＤ
ＮＡ配列を含むフラグメントを挿入することによりプラ
スミドｐＭＴ１を得ることができる。
ＥｃｏＲＩ及びＥｃｏ４７ IIIで切断してｔａｃプロモ
ーターのＤＮＡ配列を含むフラグメントを除き、これに
ＤＮＡ合成機等により合成したｔｒｐプロモーターのＤ
ＮＡ配列を含むフラグメントを挿入することによりプラ
スミドｐＭＴ１を得ることができる。
【００１２】本発明のシグナルペプチドをコードするＤ
ＮＡ配列としては大腸菌のペリブラズムに局在する蛋白
質、特にアルカリフォスファターゼ（ｐｈｏＡ）のよう
な酵素のシグナルペプチドをコードするＤＮＡ配列を使
用する。これらのＤＮＡ配列はＤＮＡ合成機を用いて容
易に調製できる。
ＮＡ配列としては大腸菌のペリブラズムに局在する蛋白
質、特にアルカリフォスファターゼ（ｐｈｏＡ）のよう
な酵素のシグナルペプチドをコードするＤＮＡ配列を使
用する。これらのＤＮＡ配列はＤＮＡ合成機を用いて容
易に調製できる。
【００１３】本発明は、ヒルジン及びその変異体の製造
に用いられる。このような蛋白質をコードするアミノ酸
配列としては、図１に示すようなヒルジンＨＶ１、ＨＶ
２、ＨＶ３及びＨＶ１Ｃ３のアミノ酸配列等である。
に用いられる。このような蛋白質をコードするアミノ酸
配列としては、図１に示すようなヒルジンＨＶ１、ＨＶ
２、ＨＶ３及びＨＶ１Ｃ３のアミノ酸配列等である。
【００１４】次に本発明において使用するヒルジンＨＶ
１分泌プラスミドｐＭＴＳＨＶ１及びｐＭＫＳＨＶ１を
構築するためのプラスミドｐＵＣＨＶ１、ｐＭＴ１及び
ｐＭＫ２の構築方法及びプラスミドｐＭＴＳＨＶ１Ｃ３
を構築するプラスミドｐＵＣＨＶ３の構築方法を参考例
として示す。
１分泌プラスミドｐＭＴＳＨＶ１及びｐＭＫＳＨＶ１を
構築するためのプラスミドｐＵＣＨＶ１、ｐＭＴ１及び
ｐＭＫ２の構築方法及びプラスミドｐＭＴＳＨＶ１Ｃ３
を構築するプラスミドｐＵＣＨＶ３の構築方法を参考例
として示す。
【００１５】
【参考例１】 プラスミドｐＵＣＨＶ１及びプラスミド
ｐＵＣＨＶ３の調製市販のプラスミドｐＵＣ１８ １０
μｇをＥｃｏＲＩ ３０単位、ＨｉｎｄIII ３０単位を
用いて３７℃で２時間消化した。これをアガロースゲル
電気泳動に供してベクター部分を抽出し、フェノール抽
出によりタンパクを除き、冷エタノールで沈澱させた
後、５０μｌのＴＥ緩衝液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣ
ｌ、ｐＨ８．０、１ｍＭ ＥＤＴＡ）に溶解した。この
溶液の５０ｎｇ相当量にＨＶ１又はＨＶ３の二重鎖ＤＮ
Ａを含む１０μｌ（６６ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ
７．５、５ｍＭ ＭｇＣｌ2 、５ｍＭ ＤＴＴ、１ｍＭ
ＡＴＰ、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ ３００単位）を加
え、１６℃で一晩反応させて、プラスミドｐＵＣ１８の
ＥｃｏＲＩとＨｉｎｄ IIIとの間にＨＶ１遺伝子が挿入
されたプラスミドｐＵＣＨＶ１及びＨＶ３遺伝子が挿入
されたプラスミドｐＵＣＨＶ３を得た。
ｐＵＣＨＶ３の調製市販のプラスミドｐＵＣ１８ １０
μｇをＥｃｏＲＩ ３０単位、ＨｉｎｄIII ３０単位を
用いて３７℃で２時間消化した。これをアガロースゲル
電気泳動に供してベクター部分を抽出し、フェノール抽
出によりタンパクを除き、冷エタノールで沈澱させた
後、５０μｌのＴＥ緩衝液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣ
ｌ、ｐＨ８．０、１ｍＭ ＥＤＴＡ）に溶解した。この
溶液の５０ｎｇ相当量にＨＶ１又はＨＶ３の二重鎖ＤＮ
Ａを含む１０μｌ（６６ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ
７．５、５ｍＭ ＭｇＣｌ2 、５ｍＭ ＤＴＴ、１ｍＭ
ＡＴＰ、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ ３００単位）を加
え、１６℃で一晩反応させて、プラスミドｐＵＣ１８の
ＥｃｏＲＩとＨｉｎｄ IIIとの間にＨＶ１遺伝子が挿入
されたプラスミドｐＵＣＨＶ１及びＨＶ３遺伝子が挿入
されたプラスミドｐＵＣＨＶ３を得た。
【００１６】
【参考例２】 プラスミドｐＭＫ２及びプラスミドｐＭ
Ｔ１の調製 （ａ）プラスミドｐＭＫ２の調製 市販のプラスミドｐＫＫ２２３−３（ファルマシア社
製）を制限酵素Ｐｖｕ I及びＮｒｕ Iで切断して得たｔ
ａｃプロモーターを含むフラグメントと市販のｐＵＣ１
８を制限酵素ＰｖｕＩ及びＰｖｕ II で切断して得た複
製開始点（ｏｒｉ）及びアンピシリン耐性遺伝子を含む
フラグメントとをＴ４ＤＮＡリガーゼにより結合させ
た。これを大腸菌ＪＭ１０９株に導入して培養し、アン
ピシリン耐性によりスクリーニングして、ｔａｃプロモ
ーターとｐＵＣ１８の複製開始点（ｏｒｉ）とを有する
ベクターを得た。このプラスミドをｐＭＫ２とした。
Ｔ１の調製 （ａ）プラスミドｐＭＫ２の調製 市販のプラスミドｐＫＫ２２３−３（ファルマシア社
製）を制限酵素Ｐｖｕ I及びＮｒｕ Iで切断して得たｔ
ａｃプロモーターを含むフラグメントと市販のｐＵＣ１
８を制限酵素ＰｖｕＩ及びＰｖｕ II で切断して得た複
製開始点（ｏｒｉ）及びアンピシリン耐性遺伝子を含む
フラグメントとをＴ４ＤＮＡリガーゼにより結合させ
た。これを大腸菌ＪＭ１０９株に導入して培養し、アン
ピシリン耐性によりスクリーニングして、ｔａｃプロモ
ーターとｐＵＣ１８の複製開始点（ｏｒｉ）とを有する
ベクターを得た。このプラスミドをｐＭＫ２とした。
【００１７】（ｂ）プラスミドｐＭＴ１の調製 このプラスミドｐＭＫ２ １０μｇを３０単位のＥｃｏ
ＲＩ及びＥｃｏ４７III で消化し、ｔａｃプロモーター
を含む断片を除去し、複製開始点（ｏｒｉ）を含む断片
をアガロースゲル電気泳動によって回収した。一方、ｔ
ｒｐプロモーターの塩基配列をＤＮＡ合成機で合成し
た。この断片と前記ｐＭＫ２とＥｃｏＲＩおよびＥｃｏ
４７III で消化した断片とをＴ４ＤＮＡリガーゼにより
１６℃で一晩反応させた。これを用いて大腸菌ＪＭ１０
９株を形質転換し、ｔｒｐプロモーターとｐＭＫ２の複
製開始点（ｏｒｉ）とを有するベクターを調製した。こ
のプラスミドの塩基配列はサンガー等の方法で確認し、
ｐＭＴ１とした。
ＲＩ及びＥｃｏ４７III で消化し、ｔａｃプロモーター
を含む断片を除去し、複製開始点（ｏｒｉ）を含む断片
をアガロースゲル電気泳動によって回収した。一方、ｔ
ｒｐプロモーターの塩基配列をＤＮＡ合成機で合成し
た。この断片と前記ｐＭＫ２とＥｃｏＲＩおよびＥｃｏ
４７III で消化した断片とをＴ４ＤＮＡリガーゼにより
１６℃で一晩反応させた。これを用いて大腸菌ＪＭ１０
９株を形質転換し、ｔｒｐプロモーターとｐＭＫ２の複
製開始点（ｏｒｉ）とを有するベクターを調製した。こ
のプラスミドの塩基配列はサンガー等の方法で確認し、
ｐＭＴ１とした。
【００１８】本発明の実施例を示し、本発明を具体的に
説明する。
説明する。
【実施例１】 ビルジンＨＶ１及びＨＶ１Ｃ３の生産 （１）ヒルジンＨＶ１分泌プラスミドｐＭＴＳＨＶ１の
作製 プラスミドｐＭＴＳＨＶ１は図５に示した方法に従って
構築した。まず、大腸菌のアルカリホスファターゼ（ｐ
ｈｏＡ）のシグナルペプチドとヒルジンＨＶ１のＮ末端
アミノ酸Ｖａ１1 −Ｖａ１3 に対応するＤＮＡ断片を構
築するために、図４に示す４種のオリゴヌクレオチオド
を合成した。脱保護したのち、１０％ポリアクリルアミ
ドゲル電気泳動により各オリゴヌクレオチドを精製し
た。２種のオリゴヌクレオチド（Ｓ２，Ｓ４）各５００
ｐｍｏｌをリン酸化後、４種のオリゴヌクレオチド各２
０ｐｍｏｌを混合し、アニールした。これにＴ４ＤＮＡ
リガーゼを含む溶液２０μｌ中、１６℃で一晩反応させ
た。フェノール、クロロホルムでタンパクを除き、冷エ
タノールで沈澱させ目的とする二重鎖ＤＮＡ断片を得
た。この断片１０分の１量と、制限酵素ＥｃｏＲＩとＡ
ｃｃＩとで切断したｐＵＣＨＶ１（特願平１−２０７２
００）１００ｎｇとをＴ４ＤＮＡリガーゼにより、１６
℃で一晩反応させた。これを用いて大腸菌ＪＭ１０９株
を形質転換し、ｐｈｏＡシグナルペプチドをコードする
領域の直後にヒルジンＨＶ１をコードするＤＮＡ切断が
結合した融合遺伝子を含むハイブリッドプラスミドｐＳ
ＨＶ１を得た。このプラスミドｐＳＨＶ１の塩基配列は
サンガー等の方法で確認した。
作製 プラスミドｐＭＴＳＨＶ１は図５に示した方法に従って
構築した。まず、大腸菌のアルカリホスファターゼ（ｐ
ｈｏＡ）のシグナルペプチドとヒルジンＨＶ１のＮ末端
アミノ酸Ｖａ１1 −Ｖａ１3 に対応するＤＮＡ断片を構
築するために、図４に示す４種のオリゴヌクレオチオド
を合成した。脱保護したのち、１０％ポリアクリルアミ
ドゲル電気泳動により各オリゴヌクレオチドを精製し
た。２種のオリゴヌクレオチド（Ｓ２，Ｓ４）各５００
ｐｍｏｌをリン酸化後、４種のオリゴヌクレオチド各２
０ｐｍｏｌを混合し、アニールした。これにＴ４ＤＮＡ
リガーゼを含む溶液２０μｌ中、１６℃で一晩反応させ
た。フェノール、クロロホルムでタンパクを除き、冷エ
タノールで沈澱させ目的とする二重鎖ＤＮＡ断片を得
た。この断片１０分の１量と、制限酵素ＥｃｏＲＩとＡ
ｃｃＩとで切断したｐＵＣＨＶ１（特願平１−２０７２
００）１００ｎｇとをＴ４ＤＮＡリガーゼにより、１６
℃で一晩反応させた。これを用いて大腸菌ＪＭ１０９株
を形質転換し、ｐｈｏＡシグナルペプチドをコードする
領域の直後にヒルジンＨＶ１をコードするＤＮＡ切断が
結合した融合遺伝子を含むハイブリッドプラスミドｐＳ
ＨＶ１を得た。このプラスミドｐＳＨＶ１の塩基配列は
サンガー等の方法で確認した。
【００１９】このｐＳＨＶ１（１０μｇ）を制限酵素Ｅ
ｃｏＲＩ ３０単位、Ｈｉｎｄ III８０単位を用いて分
解し、アガロースゲル電気泳動に供して、２７６ｂｐの
融合遺伝子断片を精製した。このＤＮＡ断片１００ｎｇ
と大腸菌発現ベクターｐＭＴ１（特願平１−２１２４４
２）を制限酵素ＥｃｏＲＩとＨｉｎｄ IIIとで分解した
のち、アガロースゲル電気泳動によって精製したＤＮＡ
断片１００ｎｇをＴ４ＤＮＡリガーゼにより１６℃で一
晩反応させた。この反応液を用いて大腸菌ＪＭ１０９株
を形質転換し、ｔｒｐプロモーターの下流にｐｈｏＡシ
グナルペプチドとヒルジンＨＶ１をコードする融合遺伝
子が連結したヒルジンＨＶ１分泌プラスミドｐＭＴＳＨ
Ｖ１を得た。このプラスミドｐＭＴＳＨＶ１の塩基配列
はサンガー等の方法で確認した。
ｃｏＲＩ ３０単位、Ｈｉｎｄ III８０単位を用いて分
解し、アガロースゲル電気泳動に供して、２７６ｂｐの
融合遺伝子断片を精製した。このＤＮＡ断片１００ｎｇ
と大腸菌発現ベクターｐＭＴ１（特願平１−２１２４４
２）を制限酵素ＥｃｏＲＩとＨｉｎｄ IIIとで分解した
のち、アガロースゲル電気泳動によって精製したＤＮＡ
断片１００ｎｇをＴ４ＤＮＡリガーゼにより１６℃で一
晩反応させた。この反応液を用いて大腸菌ＪＭ１０９株
を形質転換し、ｔｒｐプロモーターの下流にｐｈｏＡシ
グナルペプチドとヒルジンＨＶ１をコードする融合遺伝
子が連結したヒルジンＨＶ１分泌プラスミドｐＭＴＳＨ
Ｖ１を得た。このプラスミドｐＭＴＳＨＶ１の塩基配列
はサンガー等の方法で確認した。
【００２０】（２）ヒルジンＨＶ１分泌プラスミドｐＭ
ＫＳＨＶ１の作製 プラスミドｐＭＫＳＨＶ１は図６に示した方法に従って
構築した。上記のｐｈｏＡシグナルペプチドとヒルジン
ＨＶ１をコードする融合遺伝子と大腸菌発現ベクターｐ
ＭＫ２（特願平１−２１２４４２）を制限酵素ＥｃｏＲ
ＩとＨｉｎｄ IIIとで分解したＤＮＡ断片をＴ４ＤＮＡ
リガーゼで反応させ、大腸菌ＪＭ１０９株を形質転換
し、ｔａｃプロモーターの下流に融合遺伝子が連結した
ヒルジンＨＶ１分泌プラスミドｐＭＫＳＨＶ１を得た。
このプラスミドｐＭＫＳＨＶ１の塩基配列はサンガー等
の方法で確認した。
ＫＳＨＶ１の作製 プラスミドｐＭＫＳＨＶ１は図６に示した方法に従って
構築した。上記のｐｈｏＡシグナルペプチドとヒルジン
ＨＶ１をコードする融合遺伝子と大腸菌発現ベクターｐ
ＭＫ２（特願平１−２１２４４２）を制限酵素ＥｃｏＲ
ＩとＨｉｎｄ IIIとで分解したＤＮＡ断片をＴ４ＤＮＡ
リガーゼで反応させ、大腸菌ＪＭ１０９株を形質転換
し、ｔａｃプロモーターの下流に融合遺伝子が連結した
ヒルジンＨＶ１分泌プラスミドｐＭＫＳＨＶ１を得た。
このプラスミドｐＭＫＳＨＶ１の塩基配列はサンガー等
の方法で確認した。
【００２１】（３）ヒルジンＨＶ１分泌プラスミドによ
るヒルジンＨＶ１の分泌生産 上記（１）及び（２）で構築したプラスミドｐＭＴＳＨ
Ｖ１及びｐＭＫＳＨＶ１により形質転換された大腸菌
Ｅ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０９株を１００μｇ／ｍｌのアン
ピシリンを含む２ｘＹＴ培地（バクトトリプトン１６ｇ
／ｌ、バクトイーストエキストラクト１０ｇ／ｌ、Ｎａ
Ｃl ５ｇ／ｌ）で培養した。３７℃で２４時間培養後、
培養液１ｍｌを集菌した。沈澱した細胞の各サンプルを
１ｍｌの２５％シュークロース、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−
ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１ｍＭ ＥＤＴＡに懸濁し、室
温にて１０分間処理した。６０００×ｇにて１０分間の
遠心分離により集菌したのち、細胞を１ｍｌの冷水に懸
濁し、浸透圧ショックをかけて、細胞のペリプラズム空
間中の物質を放出させた。６０００×ｇにて１０分間の
遠心によりペリプラズム画分から細胞を除去し、上清中
の抗トロンビン活性を測定することにより、ヒルジンの
分泌蓄積量を測定した。抗トロンビン活性は、トロンビ
ンに対する合成基質クロモザイムＴＨ（トシルグリシル
プロリルアルギニン４−ニトロアニリドアセテート、ベ
ーリンガーマンハイム社製）水解活性の阻害度を比色定
量試験により測定した。
るヒルジンＨＶ１の分泌生産 上記（１）及び（２）で構築したプラスミドｐＭＴＳＨ
Ｖ１及びｐＭＫＳＨＶ１により形質転換された大腸菌
Ｅ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０９株を１００μｇ／ｍｌのアン
ピシリンを含む２ｘＹＴ培地（バクトトリプトン１６ｇ
／ｌ、バクトイーストエキストラクト１０ｇ／ｌ、Ｎａ
Ｃl ５ｇ／ｌ）で培養した。３７℃で２４時間培養後、
培養液１ｍｌを集菌した。沈澱した細胞の各サンプルを
１ｍｌの２５％シュークロース、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−
ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１ｍＭ ＥＤＴＡに懸濁し、室
温にて１０分間処理した。６０００×ｇにて１０分間の
遠心分離により集菌したのち、細胞を１ｍｌの冷水に懸
濁し、浸透圧ショックをかけて、細胞のペリプラズム空
間中の物質を放出させた。６０００×ｇにて１０分間の
遠心によりペリプラズム画分から細胞を除去し、上清中
の抗トロンビン活性を測定することにより、ヒルジンの
分泌蓄積量を測定した。抗トロンビン活性は、トロンビ
ンに対する合成基質クロモザイムＴＨ（トシルグリシル
プロリルアルギニン４−ニトロアニリドアセテート、ベ
ーリンガーマンハイム社製）水解活性の阻害度を比色定
量試験により測定した。
【００２２】該反応は、１ｍｌの反応容量において、１
００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．５）、１５０ｍ
Ｍ ＮａＣｌ、０．１％ポリエチレングリコール６００
０からなる緩衝液に０．３６Ｕのヒト−トロンビン（シ
グマ社製）を加え、標準ヒルジン又は未知のサンプルを
このトロンビン反応混合物に添加し、３７℃で３分間プ
レインキュベートした。終濃度２００μＭとなるように
基質、クロモザイムＴＨを加え、ｐ−ニトロアニリドの
遊離を波長４０５ｎｍで測定し、１分間あたりの吸収の
増加を求め、抗トロンビン活性（ＡＴＵ）を測定した。
００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．５）、１５０ｍ
Ｍ ＮａＣｌ、０．１％ポリエチレングリコール６００
０からなる緩衝液に０．３６Ｕのヒト−トロンビン（シ
グマ社製）を加え、標準ヒルジン又は未知のサンプルを
このトロンビン反応混合物に添加し、３７℃で３分間プ
レインキュベートした。終濃度２００μＭとなるように
基質、クロモザイムＴＨを加え、ｐ−ニトロアニリドの
遊離を波長４０５ｎｍで測定し、１分間あたりの吸収の
増加を求め、抗トロンビン活性（ＡＴＵ）を測定した。
【００２３】その結果、プラスミドｐＭＴＳＨＶ１を有
する株では培地１ｍｌあたり４５０ＡＴＵの抗トロンビ
ン活性が認められた。プラスミドｐＭＫＳＨＶ１を有す
る株では培地１ｍｌあたり３６０ＡＴＵの抗トロンビン
活性が認められた。また、プラスミドｐＭＴＳＨＶ１を
Ｈａｎａｈａｎ等の形質転換法により、種々の大腸菌Ｊ
Ｍ１０１、ＪＭ１０３、ＪＭ１０９、ＴＧ１、ＨＢ１０
１、ＪＡ２２１、ＩＦＯ３３０１、Ｃ６００、ＲＲ１、
ＤＨ５に導入し、分泌生産の検討を行なった結果を表１
に示した。宿主としてＲＲ１を用いた場合、約２０００
ＡＴＵ／ｍｌのＨＶ１が分泌生産された。
する株では培地１ｍｌあたり４５０ＡＴＵの抗トロンビ
ン活性が認められた。プラスミドｐＭＫＳＨＶ１を有す
る株では培地１ｍｌあたり３６０ＡＴＵの抗トロンビン
活性が認められた。また、プラスミドｐＭＴＳＨＶ１を
Ｈａｎａｈａｎ等の形質転換法により、種々の大腸菌Ｊ
Ｍ１０１、ＪＭ１０３、ＪＭ１０９、ＴＧ１、ＨＢ１０
１、ＪＡ２２１、ＩＦＯ３３０１、Ｃ６００、ＲＲ１、
ＤＨ５に導入し、分泌生産の検討を行なった結果を表１
に示した。宿主としてＲＲ１を用いた場合、約２０００
ＡＴＵ／ｍｌのＨＶ１が分泌生産された。
【００２４】
【表１】 ──────────────────────────────────── 菌 株 A660nm 活 性 生成HV1 の活性 (ATU/ml) (ATU/ml/A660nm) ──────────────────────────────────── JM101 4.12 256.4 62.2 JM103 4.12 306.7 74.4 JM109 3.06 450.5 147.2 TG1 5.77 185.2 32.1 HB101 3.76 99.0 26.3 JA221 5.72 413.2 72.2 IFO3301 2.61 148.1 56.8 C600 4.02 526.3 130.9 RR1 7.23 2000.0 276.6 DH5 7.00 10.6 1.5 ────────────────────────────────────
【００２５】（４）形質転換株Ｅ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０
９株／ｐＭＴＳＨＶ１の発酵及び培養液へのヒルジンＨ
Ｖ１の分泌 上記（３）に記載した方法と同様にして、５ lの発酵槽
において、２ lの２％グルコースを含む２ｘＹＴ培地中
でプラスミドｐＭＴＳＨＶ１で形質転換されたＥ．ｃｏ
ｌｉ ＪＭ１０９菌株（Ｅ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０９／ｐ
ＭＴＳＨＶ１）（微工研条寄第３２６６号）を、３７
℃、２４時間通気撹拌培養を行なったところ、培養液中
に１ｍｌあたり約５３００ＡＴＵのヒルジンＨＶ１の分
泌生産が認められた。
９株／ｐＭＴＳＨＶ１の発酵及び培養液へのヒルジンＨ
Ｖ１の分泌 上記（３）に記載した方法と同様にして、５ lの発酵槽
において、２ lの２％グルコースを含む２ｘＹＴ培地中
でプラスミドｐＭＴＳＨＶ１で形質転換されたＥ．ｃｏ
ｌｉ ＪＭ１０９菌株（Ｅ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０９／ｐ
ＭＴＳＨＶ１）（微工研条寄第３２６６号）を、３７
℃、２４時間通気撹拌培養を行なったところ、培養液中
に１ｍｌあたり約５３００ＡＴＵのヒルジンＨＶ１の分
泌生産が認められた。
【００２６】（５）培養液からのヒルジンＨＶ１の精製
法 発酵の後培養液１．５ lを収得し、そして遠心分離（６
０００×ｇ、１０分間）して上清から細胞を分離した。
上清の塩濃度を塩分計で測定したところ、１．３％であ
ったので、これを１０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ
７．０）で４倍希釈し、３．２μｍフィルター（ポール
社製）を通して濾過した。得られた濾液を１０ｍＭリン
酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）で平衡化させたＱＡＥ
−トヨパールカラム（４．４×７ｃｍ）にかけた。適用
後、平衡化緩衝液で洗浄後、０．２Ｍ ＮａＣｌでヒル
ジンＨＶ１を段階溶出させた。溶出液をアミコンのダイ
アフローメンプレン（ＹＭ５）を用いて濃縮し、１０ｍ
Ｍリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）で平衡化したセ
ファクリルＳ−１００のカラムでゲル濾過した。
法 発酵の後培養液１．５ lを収得し、そして遠心分離（６
０００×ｇ、１０分間）して上清から細胞を分離した。
上清の塩濃度を塩分計で測定したところ、１．３％であ
ったので、これを１０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ
７．０）で４倍希釈し、３．２μｍフィルター（ポール
社製）を通して濾過した。得られた濾液を１０ｍＭリン
酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）で平衡化させたＱＡＥ
−トヨパールカラム（４．４×７ｃｍ）にかけた。適用
後、平衡化緩衝液で洗浄後、０．２Ｍ ＮａＣｌでヒル
ジンＨＶ１を段階溶出させた。溶出液をアミコンのダイ
アフローメンプレン（ＹＭ５）を用いて濃縮し、１０ｍ
Ｍリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）で平衡化したセ
ファクリルＳ−１００のカラムでゲル濾過した。
【００２７】活性画分をさらに１０ｍＭリン酸カリウム
緩衝液（ｐＨ７．０）で平衡化したＤＥＡＥ−トヨパー
ルカラム（４．４×４０ｃｍ）に添加し十分洗浄後、３
lの平衡化緩衝液および３ lの塩化ナトリウム中の０．
３Ｍの平衡化緩衝液の直線の勾配で溶離した。最後にウ
ォーターズのデルタプレップ３０００によるＣ4 逆相Ｈ
ＰＬＣカラムでの精製を行なった。カラムを０．０６５
％（ｖ／ｖ）トリフルオロ酢酸及び１５〜３０％（ｖ／
ｖ）アセトニトリルの直線グランジェントによりカラム
からヒルジンＨＶ１を溶出させて、精製ヒルジンＨＶ１
を得た。これらの各工程におけるヒルジンＨＶ１の精製
の度合を表２に示した。
緩衝液（ｐＨ７．０）で平衡化したＤＥＡＥ−トヨパー
ルカラム（４．４×４０ｃｍ）に添加し十分洗浄後、３
lの平衡化緩衝液および３ lの塩化ナトリウム中の０．
３Ｍの平衡化緩衝液の直線の勾配で溶離した。最後にウ
ォーターズのデルタプレップ３０００によるＣ4 逆相Ｈ
ＰＬＣカラムでの精製を行なった。カラムを０．０６５
％（ｖ／ｖ）トリフルオロ酢酸及び１５〜３０％（ｖ／
ｖ）アセトニトリルの直線グランジェントによりカラム
からヒルジンＨＶ１を溶出させて、精製ヒルジンＨＶ１
を得た。これらの各工程におけるヒルジンＨＶ１の精製
の度合を表２に示した。
【表２】 ──────────────────────────────────── 精製ステップ 総蛋白質 総活性 比活性 回収率 (mg) (ATU) (ATU/mg) (％) ──────────────────────────────────── 培 養 液 13680 6030297 441 100 ＱＡＥ−トヨパール 1324 6132812 4630 101.7 Ｓ-100ＨＲ 872 6162156 7066 102.2 ＤＥＡＥ−トヨパール 821 6080019 7407 100.8 Ｃ４ＲＰ−ＨＰＬＣ 570 4675211 8202 77.5 ────────────────────────────────────
【００２８】精製されたヒルジンＨＶ１のアミノ酸組成
及びＮ末端アミノ酸配列を調べたところ、アミノ酸組成
値は表３に示すように天然型ＨＶ１の値を示し、Ｎ末端
配列は表４に示すようにＶａｌ−Ｖａｌ−Ｔｙｒであ
り、ｐｈｏＡシグナルペプチドが正しく切断されている
ことがわかった。抗トロンビン活性を測定した結果、９
６００ＡＴＵ／ｍｇであった。
及びＮ末端アミノ酸配列を調べたところ、アミノ酸組成
値は表３に示すように天然型ＨＶ１の値を示し、Ｎ末端
配列は表４に示すようにＶａｌ−Ｖａｌ−Ｔｙｒであ
り、ｐｈｏＡシグナルペプチドが正しく切断されている
ことがわかった。抗トロンビン活性を測定した結果、９
６００ＡＴＵ／ｍｇであった。
【００２９】
【表３】 ──────────────────────── HV1 HV1C3 ──────────────────────── Asx 9.00 9.95 Thr 3.86 3.84 Ser 3.70 3.67 Glx 13.78 12.65 Gly 8.89 8.86 Ala 0.00 1.06 Cys 5.40 5.40 Val 2.94 2.92 Met 0.00 0.00 Ile 1.89 1.86 Leu 4.04 8.01 Tyr 2.06 2.06 Phe 1.00 1.00 His 1.18 1.11 Lys 3.02 3.02 Arg 0.00 0.00 Pro 3.05 4.08 ────────────────────────
【００３０】
【表４】 ──────────────────────── サイクル数 アミノ酸 収量（pmol) ──────────────────────── 1 Val 310 2 Val 490 3 Tyr 189 4 Thr 138 5 Asp 42 6 Cys ── 7 Thr 44 8 Glu 99 9 Ser 436 10 Gly 205 11 Gln 131 12 Asn 66 13 Leu 148 14 Cys ── 15 Leu 174 ────────────────────────
【００３１】（６）ヒルジンＨＶ１Ｃ３分泌プラスミド
ｐＭＴＳＨＶ１Ｃ３の作製 プラスミドｐＭＴＳＨＶ１Ｃ３は図７に示す方法に従っ
て構築した。ヒルジンＨＶ１のアミノ酸残基５３位以降
のアミノ酸配列をＨＶ３の配列に置換するために、ＨＶ
１分泌プラスミドｐＭＴＳＨＶ１（１０μｇ）を制限酵
素ＫｐｎＩ ３０単位、Ｈｉｎｄ III ３０単位を用い
て分解し、アガロースゲル電気泳動に供して、２．８Ｋ
ｂｐのＤＮＡ断片を精製した。またプラスミドｐＵＣＨ
Ｖ３（特願平１−２０７２００）１０μｇも同様にＫｐ
ｎＩとＨｉｎｄ IIIで分解し、ＨＶ３のＣ末端のアミノ
酸配列を有する８０ｂｐのＤＮＡ断片を精製した。両者
のＤＮＡ断片１００ｎｇをＴ４ＤＮＡリガーゼにより１
６℃で一晩反応させ、この反応液を用いて大腸菌ＪＭ１
０９株を形質転換し、キメラヒルジンＨＶ１Ｃ３分泌プ
ラスミドｐＭＴＳＨＶ１Ｃ３を得た。このプラスミドｐ
ＭＴＳＨＶ１Ｃ３の塩基配列はサンガー等の方法で確認
した。
ｐＭＴＳＨＶ１Ｃ３の作製 プラスミドｐＭＴＳＨＶ１Ｃ３は図７に示す方法に従っ
て構築した。ヒルジンＨＶ１のアミノ酸残基５３位以降
のアミノ酸配列をＨＶ３の配列に置換するために、ＨＶ
１分泌プラスミドｐＭＴＳＨＶ１（１０μｇ）を制限酵
素ＫｐｎＩ ３０単位、Ｈｉｎｄ III ３０単位を用い
て分解し、アガロースゲル電気泳動に供して、２．８Ｋ
ｂｐのＤＮＡ断片を精製した。またプラスミドｐＵＣＨ
Ｖ３（特願平１−２０７２００）１０μｇも同様にＫｐ
ｎＩとＨｉｎｄ IIIで分解し、ＨＶ３のＣ末端のアミノ
酸配列を有する８０ｂｐのＤＮＡ断片を精製した。両者
のＤＮＡ断片１００ｎｇをＴ４ＤＮＡリガーゼにより１
６℃で一晩反応させ、この反応液を用いて大腸菌ＪＭ１
０９株を形質転換し、キメラヒルジンＨＶ１Ｃ３分泌プ
ラスミドｐＭＴＳＨＶ１Ｃ３を得た。このプラスミドｐ
ＭＴＳＨＶ１Ｃ３の塩基配列はサンガー等の方法で確認
した。
【００３２】（７）ヒルジンＨＶ１Ｃ３分泌プラスミド
によるヒルジンＨＶ１Ｃ３の分泌生産 上記（６）で構築したプラスミドｐＭＴＳＨＶ１Ｃ３に
より形質転換された大腸菌Ｅ．ｃｏｌｉ ＲＲ１株（微
工研条菌寄第３１３０号）１００μｇ／ｍｌのアンピシ
リンを含む２×ＹＴ培地で培養した。３７℃で２４時間
培養後、培養液１ｍｌを集菌し、細胞に浸透圧ショック
を与え、ペリプラズム画分の抗トロンビン活性を測定し
た。その結果、培地１ｍｌあたり３０６０ＡＴＵの抗ト
ロンビン活性が認められた。
によるヒルジンＨＶ１Ｃ３の分泌生産 上記（６）で構築したプラスミドｐＭＴＳＨＶ１Ｃ３に
より形質転換された大腸菌Ｅ．ｃｏｌｉ ＲＲ１株（微
工研条菌寄第３１３０号）１００μｇ／ｍｌのアンピシ
リンを含む２×ＹＴ培地で培養した。３７℃で２４時間
培養後、培養液１ｍｌを集菌し、細胞に浸透圧ショック
を与え、ペリプラズム画分の抗トロンビン活性を測定し
た。その結果、培地１ｍｌあたり３０６０ＡＴＵの抗ト
ロンビン活性が認められた。
【００３３】（８）形質転換株 Ｅ．ｃｏｌｉ ＪＭ１
０９／ｐＭＴＳＨＶ１Ｃ３の発酵及び培養液へのヒルジ
ンＨＶ１Ｃ３の分泌 プラスミドｐＭＴＳＨＶ１Ｃ３により形質転換された大
腸菌 Ｅ．ｃｏｌｉＪＭ１０９株（微工研条菌寄第３１
０４号）を、５ l の発酵槽において、２ lの２％グル
コースを含む２ｘＹＴ培地中で３７℃、２４時間通気撹
拌培養を行なったところ、ペリプラズム中に３５０ＡＴ
Ｕ／ｍｌ、培養液中に５７００ＡＴＵ／ｍｌ、あわせて
６０５０ＡＴＵ／ｍｌの抗トロンビン活性が認められ
た。
０９／ｐＭＴＳＨＶ１Ｃ３の発酵及び培養液へのヒルジ
ンＨＶ１Ｃ３の分泌 プラスミドｐＭＴＳＨＶ１Ｃ３により形質転換された大
腸菌 Ｅ．ｃｏｌｉＪＭ１０９株（微工研条菌寄第３１
０４号）を、５ l の発酵槽において、２ lの２％グル
コースを含む２ｘＹＴ培地中で３７℃、２４時間通気撹
拌培養を行なったところ、ペリプラズム中に３５０ＡＴ
Ｕ／ｍｌ、培養液中に５７００ＡＴＵ／ｍｌ、あわせて
６０５０ＡＴＵ／ｍｌの抗トロンビン活性が認められ
た。
【００３４】（９）ヒルジンＨＶ１Ｃ３の精製 上記（８）で得られた培養液から上記（５）に従って精
製した。精製されたヒルジンＨＶ１Ｃ３のアミノ酸配列
を調べたところ、図２に示すようにＣ末端アミノ酸配列
が変化していることが確認された。比活性は１１，２５
０ＡＴＵ／ｍｇであった。図８に精製したＨＶ１及びＨ
Ｖ１Ｃ３のＨＰＬＣ ｐｒｏｆｉｌｅを示した。この条
件は、ＶＹＤＡＣ Ｃ４（０．３７×２５ｃｍ）のカラ
ムを使用し、１５〜３０％のアセトニトリルを用いて１
ｍｌ／ｍｉｎの速度で３０分間ｌｉｎｅａｒ ｇｒａｄ
ｉｅｎｔを行ったものである。
製した。精製されたヒルジンＨＶ１Ｃ３のアミノ酸配列
を調べたところ、図２に示すようにＣ末端アミノ酸配列
が変化していることが確認された。比活性は１１，２５
０ＡＴＵ／ｍｇであった。図８に精製したＨＶ１及びＨ
Ｖ１Ｃ３のＨＰＬＣ ｐｒｏｆｉｌｅを示した。この条
件は、ＶＹＤＡＣ Ｃ４（０．３７×２５ｃｍ）のカラ
ムを使用し、１５〜３０％のアセトニトリルを用いて１
ｍｌ／ｍｉｎの速度で３０分間ｌｉｎｅａｒ ｇｒａｄ
ｉｅｎｔを行ったものである。
【００３５】
【実施例２】 ヒルジンＨＶ３の生産 （１）ヒルジンＨＶ３分泌プラスミドの創製 （ｉ）参考例１によって調製されたプラスミドｐＵＣＨ
Ｖ３を図９に示すように制限酵素ＥｃｏＲＩ及びＡｃｃ
Ｉで切断して得た複製開始点（ｏｒｉ）及びアンピシリ
ン耐性遺伝子を含むベクターフラグメントと図１０のＤ
ＮＡ配列をもつ合成アルカリフォスファターゼ（ｐｈｏ
Ａ）のシグナル配列をコードする遺伝子とをＴ４ＤＮＡ
リガーゼを用いて連結した。この結果、アルカリフォス
ファターゼ遺伝子（ｐｈｏＡ）のシグナルペプチドをコ
ードするＤＮＡ配列をＨＶ３をコードするＤＮＡ配列の
上流に連結したプラスミドｐＳＨＶ３を得た。これを大
腸菌ＪＭ１０９株に導入して培養し、アンピシリン耐性
によりスクリーニングした。 (ii) 次にプラスミドｐＳＨＶ３を制限酵素ＥｃｏＲＩ
及びＨｉｎｄIIIによって切断し、アルカリフォスファ
ターゼ遺伝子（ｐｈｏＡ）のシグナルペプチドをコード
するＤＮＡ配列をＨＶ３をコードするＤＮＡ配列の上流
に連結した２７５ｋｂの遺伝子フラグメントを得た。
Ｖ３を図９に示すように制限酵素ＥｃｏＲＩ及びＡｃｃ
Ｉで切断して得た複製開始点（ｏｒｉ）及びアンピシリ
ン耐性遺伝子を含むベクターフラグメントと図１０のＤ
ＮＡ配列をもつ合成アルカリフォスファターゼ（ｐｈｏ
Ａ）のシグナル配列をコードする遺伝子とをＴ４ＤＮＡ
リガーゼを用いて連結した。この結果、アルカリフォス
ファターゼ遺伝子（ｐｈｏＡ）のシグナルペプチドをコ
ードするＤＮＡ配列をＨＶ３をコードするＤＮＡ配列の
上流に連結したプラスミドｐＳＨＶ３を得た。これを大
腸菌ＪＭ１０９株に導入して培養し、アンピシリン耐性
によりスクリーニングした。 (ii) 次にプラスミドｐＳＨＶ３を制限酵素ＥｃｏＲＩ
及びＨｉｎｄIIIによって切断し、アルカリフォスファ
ターゼ遺伝子（ｐｈｏＡ）のシグナルペプチドをコード
するＤＮＡ配列をＨＶ３をコードするＤＮＡ配列の上流
に連結した２７５ｋｂの遺伝子フラグメントを得た。
【００３６】(iii) 一方、参考例２の方法によってプラ
スミドｐＭＴ１を調製した。このプラスミドは参考例２
に記載したようにプラスミドｐＵＣ１８の複製開始点
（ｏｒｉ）を含むＤＮＡ配列、ｔｒｐプロモータのＤＮ
Ａ配列を含んでいた。このプラスミドｐＭＴ１を制限酵
素ＥｃｏＲＩ及びＨｉｎｄ IIIで切断しベクターフラグ
メントを得た。 (iv)前記した２７５ｂｐのフラグメントとベクターフラ
グメントとをＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて結合させ、こ
れを大腸菌ＪＭ１０９株に導入して培養し、アンピシリ
ン耐性によりスクリーニングしてｐＵＣプラスミドの複
製開始点（ｏｒｉ）を含むＤＮＡ配列、ｔｒｐプロモー
ターのＤＮＡ配列、アルカリフォスファターゼ遺伝子
（ｐｈｏＡ）のシグナルペプチドをコードするＤＮＡ配
列及びＨＶ３をコードするＤＮＡ配列を含んでいる２．
８７ｋｂのＨＶ３発現ベクター、プラスミドｐＭＴＳＨ
Ｖ３を得た。
スミドｐＭＴ１を調製した。このプラスミドは参考例２
に記載したようにプラスミドｐＵＣ１８の複製開始点
（ｏｒｉ）を含むＤＮＡ配列、ｔｒｐプロモータのＤＮ
Ａ配列を含んでいた。このプラスミドｐＭＴ１を制限酵
素ＥｃｏＲＩ及びＨｉｎｄ IIIで切断しベクターフラグ
メントを得た。 (iv)前記した２７５ｂｐのフラグメントとベクターフラ
グメントとをＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて結合させ、こ
れを大腸菌ＪＭ１０９株に導入して培養し、アンピシリ
ン耐性によりスクリーニングしてｐＵＣプラスミドの複
製開始点（ｏｒｉ）を含むＤＮＡ配列、ｔｒｐプロモー
ターのＤＮＡ配列、アルカリフォスファターゼ遺伝子
（ｐｈｏＡ）のシグナルペプチドをコードするＤＮＡ配
列及びＨＶ３をコードするＤＮＡ配列を含んでいる２．
８７ｋｂのＨＶ３発現ベクター、プラスミドｐＭＴＳＨ
Ｖ３を得た。
【００３７】（２）ヒルジンＨＶ３分泌プラスミドによ
るヒルジンＨＶ３の分泌生産 上記のようにして構築したプラスミドｐＭＴＳＨＶ３に
より大腸菌Ｅ．ｃｏｌｉＲＲ１を形質転換し（Ｅ．ｃｏ
ｌｉ ＲＲ１／ｐＭＴＳＨＶ３）（寄託番号微工研菌寄
第３２６７号）、これを１００μｇ／ｍｌのアンピシリ
ンを含む２ｘＹＴ培地にグルコース２％を添加し、この
培地２ l 中で培養した。培養は、培地２ l を５ l
のジャーに入れ、３７℃で２４時間培養した。得られた
培養液中の抗トロンビン活性は６０７３ＡＴＵ／ｍｌで
あった。
るヒルジンＨＶ３の分泌生産 上記のようにして構築したプラスミドｐＭＴＳＨＶ３に
より大腸菌Ｅ．ｃｏｌｉＲＲ１を形質転換し（Ｅ．ｃｏ
ｌｉ ＲＲ１／ｐＭＴＳＨＶ３）（寄託番号微工研菌寄
第３２６７号）、これを１００μｇ／ｍｌのアンピシリ
ンを含む２ｘＹＴ培地にグルコース２％を添加し、この
培地２ l 中で培養した。培養は、培地２ l を５ l
のジャーに入れ、３７℃で２４時間培養した。得られた
培養液中の抗トロンビン活性は６０７３ＡＴＵ／ｍｌで
あった。
【００３８】（３）培養液からヒルジンＨＶ３の精製 得られた培養液を実施例１（５）と同様にして処理して
ヒルジンＨＶ３を得た。すなわち、培養液を遠心分離し
て上清から細胞を除き、上清を１０ｍＭリン酸カリウム
緩衝液（ｐＨ７．０）で４倍希釈し、濾過した。得られ
た濾液を実施例１（５）と同様にＱＡＥ−トヨパールカ
ラム（４．４×１３ｃｍ）にかけ、セファクリルＳ−１
００ＨＲのカラムでゲル濾過した。この活性画分をＤＥ
ＡＥ−トヨパールカラム（４．４×４０ｃｍ）を用い平
衡化緩衝液及び０．３Ｍ塩化ナトリウムを加えた平衡化
緩衝液の直線濃度勾配で溶解し、最後にバイダックＣ４
（Ｖｙｄａｃ Ｃ４）カラム（０．３７×２５ｃｍ）を
用い、１５〜３０％アセトニトリルの直線グラジエント
（１％／ｍｉｎ、３０分以上）で逆相ＨＰＬＣを行いカ
ラムからヒルジンＨＶ３を溶出させて精製ヒルジンＨＶ
３を得た。各工程におけるヒルジンＨＶ３の精製の度合
を表５に示す。
ヒルジンＨＶ３を得た。すなわち、培養液を遠心分離し
て上清から細胞を除き、上清を１０ｍＭリン酸カリウム
緩衝液（ｐＨ７．０）で４倍希釈し、濾過した。得られ
た濾液を実施例１（５）と同様にＱＡＥ−トヨパールカ
ラム（４．４×１３ｃｍ）にかけ、セファクリルＳ−１
００ＨＲのカラムでゲル濾過した。この活性画分をＤＥ
ＡＥ−トヨパールカラム（４．４×４０ｃｍ）を用い平
衡化緩衝液及び０．３Ｍ塩化ナトリウムを加えた平衡化
緩衝液の直線濃度勾配で溶解し、最後にバイダックＣ４
（Ｖｙｄａｃ Ｃ４）カラム（０．３７×２５ｃｍ）を
用い、１５〜３０％アセトニトリルの直線グラジエント
（１％／ｍｉｎ、３０分以上）で逆相ＨＰＬＣを行いカ
ラムからヒルジンＨＶ３を溶出させて精製ヒルジンＨＶ
３を得た。各工程におけるヒルジンＨＶ３の精製の度合
を表５に示す。
【００３９】
【表５】 ──────────────────────────────────── 精製ステップ 全蛋白質 全活性 比活性 収 率 (mg) (ATU) (ATU/mg) （％） ──────────────────────────────────── 培 養 液 15600 11034400 707 100 QAE-トヨパール 2111 9227264 4371 83.6 S-100HR 1453 9268963 6381 84 DEAE- トヨパール 1327 8597892 6478 77.9 C4 HPLC 795 6486480 8139 58.8 ────────────────────────────────────
【００４０】精製された生成物のアミノ酸組成及びＮ末
端アミノ酸配列を調べたところ、アミノ酸組成値は表６
に示すようにヒルジンＨＶ３の理論値と一致し、またＮ
末端アミノ酸配列は表７に示すように第１５番までのア
ミノ酸配列がヒルジンＨＶ３のそれと一致しており、シ
グナルペプチドが正しい位置でプロセスしており、ヒル
ジンＨＶ３であることが確認された。
端アミノ酸配列を調べたところ、アミノ酸組成値は表６
に示すようにヒルジンＨＶ３の理論値と一致し、またＮ
末端アミノ酸配列は表７に示すように第１５番までのア
ミノ酸配列がヒルジンＨＶ３のそれと一致しており、シ
グナルペプチドが正しい位置でプロセスしており、ヒル
ジンＨＶ３であることが確認された。
【００４１】
【表６】 ──────────────────────── HV3 Theory ──────────────────────── Asx 9.76 10 Thr 4.74 5 Ser 3.68 4 Glx 11.55 11 Gly 8.77 9 Ala 1.07 1 Cys 5.22 6 Val 2.03 2 Met 0.00 0 Ile 2.97 3 Leu 3.08 3 Tyr 2.04 2 Phe 1.00 1 His 1.22 1 Lys 4.03 4 Arg 0.00 0 Pro 4.06 4 ──────────────────────── Total 66 ────────────────────────
【００４２】
【表７】 ──────────────────────── サイクル数 アミノ酸 収量(pmol) ──────────────────────── 1 Ile 469 2 Thr 108 3 Tyr 106 4 Thr 102 5 Asp 122 6 Cys 7 Thr 100 8 Glu 76 9 Ser 32 10 Gly 172 11 Gln 145 12 Asn 93 13 Leu 211 14 Cys 15 Leu 189 ────────────────────────
【配列表】配列番号：１ 配列の長さ：HV1 65、HV2 65、HV3 66、HV1C3 66 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 HV1 Val Val Tyr Thr Asp Cys Thr Glu Ser Gly Gln Asn Leu Cys Leu HV2 Ile Thr Tyr Thr Asp Cys Thr Glu Ser Gly Gln Asn Leu Cys Leu HV3 Ile Thr Tyr Thr Asp Cys Thr Glu Ser Gly Gln Asn Leu Cys Leu HV1C3 Val Val Tyr Thr Asp Cys Thr Glu Ser Gly Gln Asn Leu Cys Leu 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 Cys Glu Gly Ser Asn Val Cys Gly Gln Gly Asn Lys Cys Ile Leu Cys Glu Gly Ser Asn Val Cys Gly Lys Gly Asn Lys Cys Ile Leu Cys Glu Gly Ser Asn Val Cys Gly Lys Gly Asn Lys Cys Ile Leu Cys Glu Gly Ser Asn Val Cys Gly Gln Gly Asn Lys Cys Ile Leu 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 Gly Ser Asp Gly Glu Lys Asn Gln Cys Val Thr Gly Glu Gly Thr Gly Ser Asn Gly Lys Gly Asn Gln Cys Val Thr Gly Glu Gly Thr Gly Ser Gln Gly Lys Asp Asn Gln Cys Val Thr Gly Glu Gly Thr Gly Ser Asp Gly Glu Lys Asn Gln Cys Val Thr Gly Glu Gly Thr 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 Pro Lys Pro Gln Ser His Asn Asp Gly Asp Phe Glu Glu Ile Pro Pro Asn Pro Glu Ser His Asn Asn Gly Asp Phe Glu Glu Ile Pro Pro Lys Pro Gln Ser His Asn Gln Gly Asp Phe Glu Pro Ile Pro Pro Lys Pro Gln Ser His Asn Gln Gly Asp Phe Glu Pro Ile Pro 61 62 63 64 65 66 Glu Glu Tyr Leu Gln Glu Glu Tyr Leu Gln Glu Asp Ala Tyr Asp Glu Glu Asp Ala Tyr Asp Glu 配列番号：２ 配列の長さ：153 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸合成ＤＮＡ 配列の特徴 特徴を表す記号：promoter 特徴を決定した方法：Ｓ TGT TGA CAA TTA ATC ATC GGC TCG TAT AAT GTG TGG ATT TGT GAG 45 ACA ACT GTT AAT TAG TAG CCG AGC ATA TTA CAC ACC TTA ACA CTC 90 CGG ATA ACA ATT TCA CAC AGG AAA CAG AAT TC 122 GCC TAT TGT TAA AGT GTG TCC TTT GTC TTA A 153 配列番号：３ 配列の長さ：128 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸合成ＤＮＡ 配列の特徴 特徴を表す記号：promoter 特徴を決定した方法：Ｓ GGG TGT TGA CAA TTA ATC ATC GAA CTA GTT AAC TAG TAC GCA AGT 45 CCC ACA ACT GTT AAT TAG TAG CTT GAT CAA TTG ATC ATG CGT TCA 90 TCA CGT AAA AAG GGT AG 107 AGT GCA TTT TTC CCA TCT TAA 128 配列番号：４ 配列の長さ：144 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸合成ＤＮＡ 配列の特徴 特徴を表す記号：sig peptide 特徴を決定した方法：Ｓ Met Lys Gln Ser Thr Ile Ala Leu Ala Leu Leu Pro Leu Leu Phe AA TTC ATG AAA CAA AGC ACT ATT GCC TTG GCA CTC TTA CCG TTA CTG TTT 50 G TAC TTT GTT TCG TGA TAA CGG AAC CGT GAG AAT GGC AAT GGC AAA 96 Thr Pro Val Thr Lys Ala Val Val ACC CCG GTG ACC AAA GCT GTT GT 119 TGG GGC CAC TGG TTT CGA CAA CAT A 144
【図１】ヒルジンＨＶ１、ＨＶ２、ＨＶ３及びＨＶ１Ｃ
３のアミノ酸配列を示す。
３のアミノ酸配列を示す。
【図２】本発明において使用するｔａｃプロモーターの
塩基配列を示す。
塩基配列を示す。
【図３】ｔｒｐプロモーターの塩基配列を示す。
【図４】ｐｈｏＡシグナルペプチドの塩基配列を示す。
【図５】ヒルジンＨＶ１分泌プラスミドｐＭＴＳＨＶ１
の構築方法の概念図を示す。
の構築方法の概念図を示す。
【図６】プラスミドｐＭＫＳＨＶ１の構築方法の概念図
を示す。
を示す。
【図７】ヒルジンＨＶ１Ｃ３分泌プラスミドｐＭＴＳＨ
Ｖ１Ｃ３の構築方法の概念図を示す。
Ｖ１Ｃ３の構築方法の概念図を示す。
【図８】ヒルジンＨＶ１及びＨＶ１Ｃ３のＣ４逆相ＨＰ
ＬＣによるプロフィルを示す。
ＬＣによるプロフィルを示す。
【図９】ヒルジンＨＶ３分泌プラスミドｐＭＴＳＨＶ３
の構築方法の概念図を示す。
の構築方法の概念図を示す。
【図１０】実施例２のヒルジンＨＶ３分泌用ＰｈｏＡシ
グナルペプチドの塩基配列を示す。
グナルペプチドの塩基配列を示す。
【図１１】ヒルジンＨＶ３のＣ４逆相ＨＰＬＣによる精
製の状態を示す。
製の状態を示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｐ 21/02 (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19） Ｃ１２Ｒ 1:19） Ｃ１２Ｎ 15/00 Ａ (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C12N 15/09 C07K 14/44 C12N 1/21 C12P 21/02 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＣＡ（ＳＴＮ) ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ／ＰＩＲ（ＧＥＮＥ ＴＹＸ) ＷＰＩＤＳ（ＳＴＮ)
Claims (7)
- 【請求項１】 ｐＵＣプラスミドの複製開始点（ｏｒ
ｉ）を含むＤＮＡ配列、ｔａｃプロモーターまたはｔｒ
ｐプロモーターのＤＮＡ配列、アルカリ性フォスファタ
ーゼ由来のシグナルペプチドをコードするＤＮＡ配列及
びヒルジン又はその変異体をコードするＤＮＡ配列を含
んでなることを特徴とするヒルジン又はその変異体の分
泌ベクター。 - 【請求項２】 ｐＵＣプラスミドの複製開始点（ｏｒ
ｉ）を含むＤＮＡ配列がプラスミドｐＵＣ１８を制限酵
素ＰｖｕＩ及びＰｖｕ II で切断して得られるＤＮＡ配
列である請求項１に記載の分泌ベクター。 - 【請求項３】 ヒルジン又はその変異体がヒルジンＨＶ
１である請求項１又は２のいずれかに記載の分泌ベクタ
ー。 - 【請求項４】 ヒルジン又はその変異体がヒルジンＨＶ
３である請求項１又は２のいずれかに記載の分泌ベクタ
ー。 - 【請求項５】 ヒルジン又はその変異体が下記記載のア
ミノ酸配列（以下、（式１）という）を有するヒルジン
変異体である請求項１又は２のいずれかに記載の分泌ベ
クター。 Val Val Tyr Thr Asp Cys Thr Glu Ser Gly 1 5 10 Gln Asn Leu Cys Leu Cys Glu Gly Ser Asn 15 20 Val Cys Gly Gln Gly Asn Lys Cys Ile Leu 25 30 Gly Ser Asp Gly Glu Lys Asn Gln Cys Val 35 40 Thr Gly Glu Gly Thr Pro Lys Pro Gln Ser 45 50 His Asn Gln Gly Asp Phe Glu Pro Ile Pro 55 60 Glu Asp Ala Tyr Asp Glu 65 - 【請求項６】 請求項１〜５のいずれかに記載の分泌ベ
クターを用いて大腸菌を形質転換してなる形質転換微生
物。 - 【請求項７】 請求項６の形質転換微生物を培養し、培
地中から生産物を回収することを特徴とするヒルジンＨ
Ｖ１またはＨＶ３もしくは上記（式１）で示されるヒル
ジン変異体の製造方法。
Priority Applications (23)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP4127191A JP3226289B2 (ja) | 1991-02-13 | 1991-02-13 | 分泌ベクター、該ベクターで形質転換した微生物及び該微生物から産生される産物の製造法 |
| DK95202092T DK0687731T3 (da) | 1990-11-08 | 1991-11-08 | Sekretionsvektor, transformerede mikroorganismer indeholdende vektoren og fremstilling af produkter fra denne mikroorganism |
| AT95202092T ATE176500T1 (de) | 1990-11-08 | 1991-11-08 | Sekretionsvektor, diesen enthaltene transformierte mikroorganismen und herstellung von produkten durch obigen mikroorganismus |
| ES95202092T ES2129749T3 (es) | 1990-11-08 | 1991-11-08 | Vector de secrecion, microorganismos transformados que contienen el indicado vector y produccion de un producto a partir de dicho microorganismo. |
| DK91919149.4T DK0511393T3 (da) | 1990-11-08 | 1991-11-08 | Hirudin-mutant, fremstilling af denne, antikoagulant, sekretorisk vektor, mikroorganisme transformeret af vektoren og fremstilling af produkt ud fra mikroorganismen |
| AU88466/91A AU648124B2 (en) | 1990-11-08 | 1991-11-08 | Hirudine mutant, production thereof, anticoagulant, secretory vector, microorganism transformed by said vector, and production of product from said microorganism |
| EP95202092A EP0687731B1 (en) | 1990-11-08 | 1991-11-08 | Secretion vector, transformed microorganisms containing said vector and manufacture of products from said microorganism |
| AT91919149T ATE140929T1 (de) | 1990-11-08 | 1991-11-08 | Hirudinmutante, deren herstellung, antikoagulans, sekretorischer vektor, durch besagten vektor transformierter mikroorganismus und herstellung eines produkts durch besagten mikroorganismus |
| ES91919149T ES2093717T3 (es) | 1990-11-08 | 1991-11-08 | Mutante de hirudina, su produccion, anticoagulante, vector secretor, microorganismo transformado por el indicado vector y produccion de un producto a partir de dicho microorganismo. |
| DE69130872T DE69130872T2 (de) | 1990-11-08 | 1991-11-08 | Sekretionsvektor, diesen enthaltene transformierte Mikroorganismen und Herstellung von Produkten durch obigen Mikroorganismus |
| CA002072375A CA2072375C (en) | 1990-11-08 | 1991-11-08 | Hirudin analog, method of manufacturing thereof and anti-coagulant composition, and secretion vector, transformed microorganisms containing saidvector and manufacturing method of products which is produced from said microorganism |
| EP91919149A EP0511393B1 (en) | 1990-11-08 | 1991-11-08 | Hirudine mutant, production thereof, anticoagulant, secretory vector, microorganism transformed by said vector, and production of product from said microorganism |
| DE69121192T DE69121192T2 (de) | 1990-11-08 | 1991-11-08 | Hirudinmutante, deren herstellung, antikoagulans, sekretorischer vektor, durch besagten vektor transformierter mikroorganismus und herstellung eines produkts durch besagten mikroorganismus |
| CA002255396A CA2255396A1 (en) | 1990-11-08 | 1991-11-08 | Hirudin analog, method of manufacturing thereof and anti-coagulant composition, and secretion vector, transformed microorganisms containing said vector and manufacturing method ofproducts which is produced from said microorganism |
| PCT/JP1991/001533 WO1992008736A1 (fr) | 1990-11-08 | 1991-11-08 | Mutant d'hirudine, sa production, anticoagulant, vecteur secretoire, microorganisme transforme par ledit vecteur et production d'un produit a partir dudit microorganisme |
| FI922963A FI107928B (fi) | 1990-11-08 | 1992-06-26 | Erityskuljetin hirudiinin tai hirudiinianalogin tuottamiseksi, kyseessä olevan kuljettimen sisältävät muutetut mikro-organismit, sekä hirudiinin tai hirudiinianalogin valmistusmenetelmä |
| NO922671A NO303735B1 (no) | 1990-11-08 | 1992-07-07 | Fremgangsmöte for fremstilling av en hirudinanalog, samt DNA-sekvens, sekresjonsvektor og transformerte mikroorganismer som inneholder vektoren |
| US07/910,528 US5516656A (en) | 1990-11-08 | 1992-07-08 | Production of a new hirudin analog and anticoagulant pharmaceutical composition containing the same |
| AU54701/94A AU673870B2 (en) | 1990-11-08 | 1994-01-25 | Hirudin mutant, production thereof, anticoagulant, secretory vector, and production of product from said microorganism |
| US08/348,972 US5573929A (en) | 1990-11-08 | 1994-11-28 | Secretion vector for hirudin or hirudin analog production |
| GR960402781T GR3021410T3 (en) | 1990-11-08 | 1996-10-23 | Hirudine mutant, production thereof, anticoagulant, secretory vector, microorganism transformed by said vector, and production of product from said microorganism |
| NO982207A NO982207D0 (no) | 1990-11-08 | 1998-05-14 | Fremmedproteinsekresjonsvektorer, transformerte mikroorganismer og fremgangsmÕte for fremstilling av hirudiner |
| GR990400915T GR3029824T3 (en) | 1990-11-08 | 1999-03-30 | Secretion vector, transformed microorganisms containing said vector and manufacture of products from said microorganism |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
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Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH04258294A JPH04258294A (ja) | 1992-09-14 |
| JP3226289B2 true JP3226289B2 (ja) | 2001-11-05 |
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| JP4127191A Expired - Fee Related JP3226289B2 (ja) | 1990-11-08 | 1991-02-13 | 分泌ベクター、該ベクターで形質転換した微生物及び該微生物から産生される産物の製造法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP3226289B2 (ja) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN100475965C (zh) * | 2005-07-22 | 2009-04-08 | 上海高科联合生物技术研发有限公司 | 一种大肠杆菌高效外分泌表达溶葡萄球菌酶的方法 |
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1991
- 1991-02-13 JP JP4127191A patent/JP3226289B2/ja not_active Expired - Fee Related
Non-Patent Citations (1)
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|---|
| ＦＥＢＳ ＬＥＴＴ．，Ｖｏｌ．２０２（２），ｐ．３７３−３７７（１９８６） |
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|---|---|
| JPH04258294A (ja) | 1992-09-14 |
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|---|---|---|---|
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