PL178924B1

PL178924B1 - Konstrukt DNA, zrekombinowany wektor ekspresji, komórka transformowana i sposób wytwarzania heterologicznego polipeptydu

Info

Publication number: PL178924B1
Application number: PL94312436A
Authority: PL
Inventors: Lars Christiansen; Jens G. Litske Petersen
Original assignee: Novo Nordisk As
Priority date: 1993-07-08
Filing date: 1994-07-08
Publication date: 2000-06-30
Also published as: ZA944912B; ATE207124T1; DK0792367T3; US5726038A; UA40625C2; RU2143495C1; EP0792367B1; CA2166684A1; ES2165881T3; HU222406B1; HU9600053D0; DE69428719T2; PL312436A1; WO1995002059A1; IL110238A; KR100245173B1; JP3542604B2; DK82893D0; EP0792367A1; JPH08512202A

Abstract

1 Konstrukt DNA, znam ienny tym, ze zawiera sekwencje S'-P-SP-(LP)n-PS-HP-3' w której P oznacza sekwencje promotora, SP oznacza sekwencje DNA kodujaca peptyd sygnalowy drozdzowej proteazy asparaginowej 3 (YAP3), LP oznacza sekwencje DNA kodujaca peptyd liderowy, n równe jest 0 lub 1 PS oznacza sekwencje DNA kodujaca peptyd okreslajacy miejsce obróbki w drozdzach, a HP oznacza sekwencje DNA kodujaca polipeptyd heterologiczny dla wybranego organizmu gospodarza 10 Zrekombinowany wektor ekspresji zawierajacy konstrukt DNA obejmujacy sekwencje 5-P-SP-(LP)n-PS-HP-3' w której P oznacza sekwencje promotora, SP oznacza sekwencje DNA kodujaca peptyd sygnalowy drozdzowej proteazy asparaginowej 3 (YAP3), LP oznacza sekwencje DNA kodujaca peptyd liderowy, n równe jest 0 lub 1 PS oznacza sekwencje DNA kodujaca peptyd okreslajacy miejsce obróbki w drozdzach, a HP oznacza sekwencje DNA kodujaca polipeptyd heterologiczny dla wybranego organizmu gospodarza. 19 Komórka transformowana wektorem zawierajacym konstrukt DNA obejmujacy sekwencje 5'-P-SP-(LP)n-PS-HP-3' w której P oznacza sekwencje promotora, SP oznacza sekwencje DNA kodujaca peptyd sygnalowy drozdzowej proteazy asparaginowej 3 (YAP3), LP oznacza sekwencje DNA kodujaca peptyd liderowy, PL PL PL PL PL PL PL PL PL

Description

Przedmiotem wynalazku jest konstrukt DNA, zrekombinowany wektor ekspresji, komórka transformowana i sposób wytwarzania heterologicznego polipeptydu, zwłaszcza konstrukt DNA do wydzielania heterologicznego polipeptydu w komórce drożdży zawierającej ten konstrukt DNA oraz sposób wytwarzania heterologicznych polipeptydów w drożdżach przez ten konstrukt DNA.

Organizmy drożdżowe wytwarzają szereg białek syntetyzowanych wewnątrz komórek, ale działających poza komórką. Takie białka pozakomórkowe określane są jako białka wydzielone. Takie białka wydzielone powstają początkowo w wyniku ekspresji we wnętrzu komórki w postaci prekursora lub pre-białka i zawierająpresekwencję zapewniającą efektywne ukierunkowanie produktu ekspresji przez błonę siateczki śródcytoplazmatycznej (ER). Presekwencja, zazwyczaj określana jako peptyd sygnałowy, oszczepia się od reszty białka w czasie translokacji. Po wejściu na drogę wydzielania białko przenoszone jest do aparatu Golgiego. Z aparatu Golgiego białko może przechodzić różnymi drogami, które prowadzą do takich przedziałów jak wakuola komórkowa lub błona komórkowa, albo też może być ono skierowane poza komórkę, tak że zostaje wydzielone do zewnętrznego ośrodka (Pfeffer S. R. i Rothman J. E., Ann. Rev. Biochem. 56(1987), 829-852).

Zaproponowano szereg rozwiązań dotyczących ekspresji i wydzielania w drożdżach białek heterologicznych dla drożdży. W publikowanym zgłoszeniu patentowym europejskim nr 88 632 opisano sposób, zgodnie z którym białka heterologiczne dla drożdży są wytwarzane w wyniku ekspresji, przetwarzane i wydzielane w wyniku transformacji organizmu drożdżowego nośnikiem ekspresji z zakotwiczonym DNA kodującym pożądane białko i peptyd sygnałowy, wytwarzanie hodowli transformowanych organizmów, uprawianie hodowli i odzyskiwanie białka z ośrodka hodowli. Peptyd sygnałowy może stanowić peptyd sygnałowy samego pożądanego białka, heterologiczny peptyd sygnałowy lub hybryda naty wnego i heterologicznego peptydu sygnałowego.

Problem pojawiający się przy stosowaniu peptydów sygnałowych heterologicznych dla drożdży może być związany z tym, że heterologiczny peptyd sygnałowy nie zapewnia wydajnej translokacji i/lub rozszczepienia za peptydem sygnałowym.

/syntetyzowano S. cerevisiae MFal (czynnika) jako postać prepro o 165 aminokwasach, obejmującą sygnał lub prepeptyd o 19 aminokwasach, a następnie „lider” lub propeptyd o 64 aminokwasach, zawierający 3 N-połączone miejsca glikozylowania, oraz (LysArg(Asp/Glu, Ala)₂.₃a-czynnik)₄ (Kurjan J., Heskerowitz L, Celi 30 (1982), 933-943). Część sygnał-lider postaci prepro MFal została powszechnie wykorzystana do przeprowadzenia syntezy i wydzielenia heterologicznych białek w S. cerevisiae.

Zastosowanie peptydów sygnał/lider homologicznych dla drożdży jest znane np. z opisu patentowego USA nr 4 546 082, publikowanych zgłoszeń patentowych europejskich nr 116 201, 123 294,123 544,163 259 i 123 289 oraz ze zgłoszenia patentowego duńskiego nr DK 3614/83.

W EP 123 289 opisano wykorzystanie prekursora czynnika A S. cerevisiae, w WO 94/01153 opisano wykorzystanie peptydu sygnałowego inwertazy Saccharomyces cerevisiae, a w DK 3614/83 opisano wykorzystanie peptydu sygnałowego Saccharomyces cerevisiae PH05 do wydzielania obcych białek.

178 924

W opisie patentowym USA nr 4 546 082 oraz wEP 16 201,123 294,123 544 i 163 529 opisano sposoby wykorzystywania α-czynnika sygnał/lider z Saccharomyces cerevisiae (MFal lub MFa2) w procesie wydzielania heterologicznych białek wytworzonych w drożdżach w wyniku ekspresji. Wykazano, że w wyniku fuzji sekwencji DNA kodującej sekwencję sygnał/lider MFal S. cerevisiae z końcem 5' genu pożądanego białka zachodzi wydzielanie i obróbka pożądanego białka.

Szereg wydzielonych białek kierowanych jest tak, że zostająone wystawione na działanie układu obróbki proteolitycznej, w wyniku której może nastąpić rozszczepienie wiązania peptydowego przy końcu karboksylowym dwóch kolejnych zasadowych aminokwasów. Taka aktywność enzymatyczna jest w S. cerevisiae kodowana przez gen ΚΕΧ 2 (Julius D. A. i inni, Celi 37 (1984b), 1075). Obróbka produktu przez produkt genu ΚΕΧ 2 jest niezbędna do wydzielenia aktywnego czynnika kojarzeniowego a S.cerevisiae(MFa lub czynnika a) z tym, że nie odgrywa on roli w wydzielaniu aktywnego czynnika kojarzeniowego a S. cerevisiae.

Zastosowanie peptydu sygnałowego mysiej amylazy ślinowej (lub jego mutanta) prowadzące do wydzielania heterologicznych białek wytworzonych w wyniku ekspresji w drożdżach opisano w WO 89/02463 iwWO 90/10075. Celem wynalazku jest zapewnienie wydajniejszej ekspresji i/lub wydzielania heterologicznych białek w drożdżach.

Nieoczekiwanie stwierdzono, że peptyd sygnałowy drożdżowej proteazy asparaginowej 3 jest zdolny do zapewnienia zwiększonego wydzielania białek wytworzonych w drożdżach w wyniku ekspresji w porównaniu z peptydem sygnałowym mysiej amylazy ślinowej.

Przedmiotem wynalazku jest konstrukt DNA, charakteryzujący się tym, że zawiera sekwencję

5-P-SP-(LP)_n-PS-HP-3' w której

P oznacza sekwencję promotora,

SP oznacza sekwencję DNA koduj ącąpeptyd sygnałowy drożdżowej proteazy asparaginowej 3 (YAP3),

LP oznacza sekwencję DNA kodującąpeptyd liderowy, n równe jest 0 lub 1

PS oznacza sekwencję DNA kodującąpeptyd określający miejsce obróbki w drożdżach, a

HP oznacza sekwencję DNA kodującąpolipeptyd heterologiczny dla wybranego organizmu gospodarza.

Korzystnie, sekwencja promotora w konstrukcie DNA według wynalazku wybrana jest spośród promotorów Saccharomyces cerevisiae MFal, TPI, ADH, BARI i PGK oraz promotora Schizosaccharomyces pombe ADH, a peptyd sygnałowy YAP3 jest kodowany przez sekwencję DNA:

AGT AAA CTG AAA ACT GTA AGA TCT GCG GTC CTT TCG TC A CTC TTT GCA TCT CAG GTC CTT GGC (Seq. ID nr 1), lub jej odpowiednią modyfikację koduj ącąpeptyd o wysokim stopniu homologiczności w stosunku do peptydu sygnałowego YAP3. W konstrukcie tym korzystnie n równe jest 1, a peptyd liderowy może stanowić drożdżowy peptyd liderowy MFal lub syntetyczny peptyd liderowy. W konstrukcie według wynalazku PS stanowi sekwencja DNA kodująca Lys-Arg, Arg-Lys, Lys-Lys, Arg-Arg lub Ile-Glu-Gly-Arg.

Także korzystnie w konstrukcie DNA heterologiczny polipeptyd może być wybrany z grupy obejmującej aprotyninę, inhibitor drogi czynnika tkankowego lub inne inhibitory proteaz, insulinę lub prekursory insuliny, ludzki lub bydlęcy hormon wzrostu, interleukinę, glukagon, glukagono-podobny peptyd 1, aktywator plazminogenu tkankowego, czynnik transformacji wzrostualub β, czynnik wzrostu pochodzący z płytek krwi, enzymy, albo ich funkcyjne analogi.

Korzystnie, konstrukt DNA może zawierać ponadto sekwencję terminacji transkrypcji, która bardziej korzystnie może stanowić sekwencję terminacji transkrypcji będącej terminatorem TPI.

178 924

Przedmiotem wynalazku jest także zrekombinowany wektor ekspresji zawierający konstrukt DNA obejmujący sekwencję:

5'-P-SP-(LP)_n-PS-HP-3' w której

P oznacza sekwencję promotora,

SP oznacza sekwencję DNA kodującąpeptyd sygnałowy drożdżowej proteazy asparaginowej 3 (YAP3),

LP oznacza sekwencję DNA kodującąpeptyd liderowy, n równe jest 0 lub 1

HP oznacza sekwencję DNA koduj ącąpolipeptyd heterologiczny dla wybranego organizmu gospodarza.

W korzystnym wykonaniu wynalazku zrekombinowany wektor charakteryzuje się tym, że sekwencja promotora wybrana jest spośród promotorów Saccharomyces cerevisiae MFal, TPI, ADH, BARI i PGK oraz promotora Schizosaccharomyces pombe ADH, natomiast peptyd sygnałowy YAP3 jest kodowany przez sekwencję:

AGT AAA CTG AAA ACT GTA AGA TCT GCG GTC CTT TCG TCA CTC TTT GCA TCT CAG GTC CTT GGC (Seq. ID nr 1), lub jej odpowiednią modyfikację kodującąpeptyd o wysokim stopniu homologiczności w stosunku do peptydu sygnałowego YAP3. Korzystnie w wektorze według wynalazku w sekwencji n równe jest 1. Również korzystnie, peptyd liderowy stanowi drożdżowy peptyd liderowy MF od lub syntetyczny peptyd liderowy. Korzystnie także PS stanowi sekwencja DNA kodująca Lys-Arg, Arg-Lys, Lys-Lys, Arg-Arg lub Ile-Glu-Gly-Arg, a heterologiczny polipeptyd wybrany jest z grupy obejmującej aprotyninę, inhibitor drogi czynnika tkankowego lub inne inhibitory proteaz, insulinę lub prekursory insuliny, ludzki lub bydlęcy hormon wzrostu, interleukinę, glukagon, glukagono-podobny peptyd 1, aktywator plazminogenu tkankowego, czynnik transformacji wzrostu ot lub β, czynnik wzrostu pochodzący z płytek krwi, enzymy, albo też jego funkcyjnąpochodną.

Zawarta w zrekombinowanym wektorze sekwencja korzystnie obejmuje ponadto sekwencję terminacji transkrypcji, a najbardziej korzystnie sekwencję terminacji transkrypcji stanowi terminator TPI.

Przedmiotem wynalazku jest także komórka transformowana wektorem zawierającym konstrukt DNA obejmujący sekwencję:

5'-P-SP-(LP)_n-PS-HP-3' w której

P oznacza sekwencję promotora,

LP oznacza sekwencję DNA kodującąpeptyd liderowy, n równe jest 0 lub 1

Korzystnie, komórka według wynalazku charakteryzuje się tym, że promotor zawarty w wektorze wybrany jest spośród promotorów Saccharomyces cerevisiae MFal, TPI, ADH, BARI i PGK oraz promotora Schizosaccharomyces pombe ADH.

W korzystnym wykonaniu wynalazku komórka zawiera wektor, w którym peptyd sygnałowy YAP3 jest kodowany przez sekwencję:

AGT AAA CTG AAA ACT GTA AGA TCT GCG GTC CTT TCG TCA CTC TTT GCA TCT CAG GTC CTT GGC (Seq. ID nr 1),

178 924 lub jej odpowiednią modyfikację kodującąpeptyd o wysokim stopniu homologiczności w stosunku do peptydu sygnałowego YAP3. Także korzystnie w komórce według wynalazku w sekwencji n równe jest 1, a peptyd liderowy może być drożdżowym peptydem liderowym MFal lub syntetycznym peptydem liderowym.

Również korzystnie PS stanowi sekwencja DNA kodująca Lys-Arg, Arg-Lys, Lys-Lys, Arg-Arg lub Ile-Glu-Gly-Arg.

Także korzystnie heterologiczny polipeptyd wybrany jest z grupy obejmującej aprotyninę, inhibitor drogi czynnika tkankowego lub inne inhibitory proteaz, insulinę lub prekursory insuliny, ludzki lub bydlęcy hormon wzrostu, interleukinę, glukagon, glukagono-podobny peptyd 1, aktywator plazminogenu tkankowego, czynnik transformacji wzrostu a lub β, czynnik wzrostu pochodzący z płytek krwi, enzymy, albo też jego funkcyjnąpochodną. W komórce według wynalazku zawarta może być także ponadto sekwencja terminacji transkrypcji, w której bardziej korzystnie sekwencję terminacji transkrypcji może stanowić terminator TPI.

Komórkę według wynalazku korzystnie może stanowić komórka grzybowa, lub także korzystnie komórka drożdży. W tym ostatnim przypadku komórkę według wynalazku mogą stanowić Saccharomyces, Schizosaccharomyces, Kluyveromyces, Hansenula lub Yarrowia, a wśród nich najbardziej korzystnie Saccharomyces cerevisiae lub Schizosaccharomyces pombe.

Kolejnym przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania heterologicznego polipeptydu, polegający na tym, że hoduje się komórkę zdolnądo ekspresji heterologicznego polipeptydu, transformowaną konstruktem DNA zawierającym sekwencję:

5'-P-SP-(LP)_n-PS-HP-3' w której

P oznacza sekwencję promotora,

LP oznacza sekwencję DNA kodującąpeptyd liderowy, n równe jest 0 lub 1

HP oznacza sekwencję DNA kodującą polipeptyd heterologiczny dla wybranego organizmu gospodarza, w odpowiedniej pożywce, tak aby osiągnąć ekspresję i wydzielenie heterologicznego polipeptydu, po czym heterologiczny polipeptyd odzyskuje się z pożywki.

Korzystnie w sposobie według wynalazku stosuje się sekwencję promotora wybraną spośród promotorów Saccharomyces cerevisiae MFal, TPI, ADH, BARI i PGK oraz promotora Schizosaccharomyces pombe ADH. Także korzystnie stosuje się peptyd sygnałowy YAP3 kodowany przez sekwencję DNA:

AGT AAA CTG AAA ACT GTA AGA TCT GCG GTC CTT TCG TCA CTC TTT GCA TCT CAG GTC CTT GGC (Seq. ID nr 1), lub jej odpowiednią modyfikację kodującąpeptyd o wysokim stopniu homologiczności w stosunku do peptydu sygnałowego YAP3.

Korzystnie n równe jest 1, a jako peptyd liderowy stosuje się peptyd liderowy stanowiący drożdżowy peptyd liderowy MFal lub syntetyczny peptyd liderowy. Także korzystnie PS stanowi sekwencja DNA kodująca Lys-Arg, Arg-Lys-, Lys-Lys, Arg-Arg lub Ile-Glu-Gly-Arg.

W sposobie według wynalazku korzystnie stosuje się heterologiczny polipeptyd wybrany z grupy obejmującej aprotyninę, inhibitor drogi czynnika tkankowego lub inne inhibitory proteaz, insulinę lub prekursory insuliny, ludzki lub bydlęcy hormon wzrostu, interleukinę, glukagon, glukagono-podobny peptyd 1, aktywator plazminogenu tkankowego, czynnik transformacji wzrostu a lub β, czynnik wzrostu pochodzący z płytek krwi, enzymy, albo też jego funkcyjnąpochodną, atakże stosuje się korzystnie sekwencję terminacji transkrypcji, przy czymjako sekwencję terminacji transkrypcji stosuje się terminator TPI.

W użytym znaczeniu określenie „peptyd sygnałowy” oznacza presekwencję o zasadniczo hydrofobowym charakterze, obecną jako N-końcowa sekwencja formy prekursorowej pozako

178 924 mórkowego białka wytworzonego w wyniku ekspresji w drożdżach. Zadanie peptydu sygnałowego obejmuje umożliwienie wydalenia heterologicznego białka, tak aby przedostało się ono do siateczki śródcytoplazmatycznej. Peptyd sygnałowy jest odszczepiany w czasie tego procesu. Sekwencja sygnałowa YAP3, złączona jej natywnym genem, została opisana (patrz M. Egel-Mitani i inni, Yeast 6,1990,127-137). Uważa się natomiast, że konstrukt DNA, w którym wykonano fuzję sekwencji sygnałowej YAP3 z sekwencją sygnałową kodującąheterologiczny polipeptyd, jest nowy. Nie doniesiono dotychczas, aby peptyd sygnałowy YAP3 zapewniał wydajne wydalanie heterologicznych polipeptydów w przypadku drożdży.

W znaczeniu użytym w opisie wyrażenie „peptyd liderujący” oznacza peptyd, którego działanie polega na umożliwieniu kierowania heterologicznego polipeptydu z siateczki śródcytoplazmatycznej do aparatu Golgiego, a następnie do pęcherzyka wydzielniczego, skąd następuje wydzielenie do ośrodka (czyli wynoszenia peptydu powstałego w wyniku ekspresji przez ścianę komórki lub co najmniej przez błonę komórkową do przestrzeni periplazmatycznej w komórce).

W znaczeniu użytym w opisie wyrażenie,,heterologiczny polipeptyd” oznacza polipeptyd nie wytwarzany w naturze przez organizm gospodarza drożdżowego.

Szczegółowy opis wynalazku

W konkretnym wykonaniu peptyd sygnałowy kodowany jest przez następującą sekwencję DNA:

AGT AAA CTG AAA ACT GTA AGA TCT GCG GTC CTT TCG TCA CTC TTT GCA TCT CAG GTC CTT GGC (Seq. ID nr 1), lub jej odpowiednią modyfikację kodującą peptyd o wysokim stopniu homologii (identyczność sekwencji wynosząca co najmniej 60%, a jeszcze korzystniej co najmniej 70%) w stosunku do peptydu sygnałowego YAP3. Do przykładowych „odpowiednich modyfikacji” należą podstawienia nukleotydowe nie powodujące zmiany sekwencji aminokwasów w peptydzie, ale które mogą odpowiadać użyciu kodonu organizmu drożdżowego, do którego sekwencja DNA jest wprowadzana, albo podstawienia nukleotydów powodujące zmianę sekwencji aminokwasów peptydu (choć sekwencja aminokwasów nie powinna być zmodyfikowana w takim stopniu, że przestanie funkcjonować jako peptyd sygnałowy). Do innych przykładów możliwych modyfikacji należy insercja trzech lub wielokrotności trzech nukleotydów na którymkolwiek końcu lub wewnątrz sekwencji, albo delecja trzech lub wielokrotności trzech nukleotydów na którymkolwiek końcu lub wewnątrz sekwencji. W sekwencji 5'-P-SP-(LP)_n-PS-HP-3'n wynosi korzystnie 1.

Innymi słowy, jakkolwiekpeptyd sygnałowy YAP3 może w pewnych przypadkach sam zapewniać wydzielanie i/lub przeróbkę heterologicznego polipeptydu, to korzystnie sekwencja liderowa lub propeptydowa jest obecna. Liderem może być drożdżowy peptyd liderowy MFal lub syntetyczny peptyd liderowy, np. jeden z peptydów liderowych ujawnionych w WO 89/02463 lub WO 92/11378, bądź też jego pochodna zdolna do skutecznego wydzielania heterologicznego polipeptydu w drożdżach. Określenie „syntetyczny” oznacza, że odnośne peptydy liderowe nie występują w przyrodzie. Syntetyczne drożdżowe peptydy liderowe można np. skonstruować sposobami opisanymi w WO 89/02463 lub WO 92/11378.

Miejsce przetwarzania w drożdżach kodowane przez sekwencję DNA PS może dogodnie stanowić dowolna sparowana kombinacja Lys i Arg, np. Lys-Arg, Arg-Lys, Lys-Lys lub Arg-Arg, umożliwiająca przetwarzanie heterologicznego polipeptydu przez proteazę ΚΕΧ2 z Saccharomyces cerevisiae lub przez równoważną proreazę innego gatunku drożdży (D. A. Julius i inni, Celi 37,1984,1075 i następne). Gdy przetwarzanie przez ΚΕΧ2 nie jest właściwe, co może występować wtedy, gdy może ono doprowadzić do rozszczepienia produktu polipeptydowego, dobrać można miejsce przetwarzania dla innej proteazy, stanowiące kombinację aminokwasów nie występującą w produkcie polipeptydowym, np. miejsce przetwarzania dla FX₃, Ile-Glu-Gly-Arg (patrz Sambrook, Fritsch i Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manuał, Cold Spring Harbor, New York, 1989).

Heterologiczne białko wytworzone sposobem według wynalazku może stanowić dowolne białko, które może być z powodzeniem wytwarzane przez drożdże. Do takich białek należy przykładowo aprotynina, inhibitor drogi czynnika tkankowego lub inne inhibitory proteaz, insu

178 924 lina lub prekursory insuliny, ludzki lub bydlęcy hormon wzrostu, interleukina, glukagon, aktywator plazminogenu tkankowego, czynnik transformacji wzrostu a lub β, czynnik wzrostu pochodzący z płytek krwi, enzymy, albo też jego funkcyjna pochodna. W znaczeniu użytym w opisie określenie „funkcyjny analog” oznacza polipeptyd o podobnym działaniu jak białko natywne (przy czym należy rozumieć, że odnosi się raczej do charakteru niż do poziomu aktywności biologicznej białka natywnego). Polipeptyd może być strukturalnie zbliżony do białka natywnego i może stanowić pochodnąbiałka natywnego uzyskanąprzez dodanie jednego lub więcej aminokwasów na jednym lub obydwu z końców C i N białka natywnego, zastąpienie jednego lub więcej aminokwasów w jednym lub w szeregu różnych miejscach w natywnej sekwencji aminokwasów, delecję jednego lub więcej aminokwasów na jednym lub obydwu z końców białka natywnego albo w jednym lub w szeregu miejscach w sekwencji aminokwasów lub insercję jednego lub więcej aminokwasów w jednym lub więcej miejscach w natywnej sekwencji aminokwasów. Modyfikacje takie są znane dla szeregu białek wspomnianych powyżej.

Konstrukty DNA wytwarzać można syntetycznie z wykorzystaniem znanych sposobów, np. metodą fosfoamidynową opisaną przez S. L. Beaucage i Μ. H. Caruthersa, Tetrahedron Letters 22,1981,1859-1869, bądź też sposobem opisanym przez Matthesa i innych, EMBO Journal 3, 1984, 801-805. W metodzie fosfoamidynowej oligonukleotydy syntetyzuje się, np. w zautomatyzowanym syntetyzatorze DNA, oczyszcza, łączy, liguje i klonuje w drożdżowym wektorze ekspresji. Należy zdawać sobie sprawę, że sekwencja 5'-P-SP-(LP)_n-PS-HP-3' nie musi być wytwarzana w jednej operacji, ale może być uzyskana przez złożenie dwóch lub więcej oligonukleotydów wytworzonych syntetycznie w taki sposób.

Jedna lub więcej części sekwencji DNA 5'-P-SP-(LP)_n-PS-HP-3'może również pochodzić z genomu lub cDNA, przy czym części te uzyskuje się np. wytwarzając bibliotekę genomowąlub cDNA oraz selekcjonując ją względem sekwencji DNA kodujących taką część (zazwyczaj HP) na drodze hybrydyzacji z wykorzystaniem syntetycznych sond oligonukleotydowych, z wykorzystaniem standardowych technik (patrz Sambrook, Fritsch i Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manuał, Cold Spring Harbor, New York, 1989). W takim przypadku sekwencję genomową lub cDNA kodującą peptyd sygnałowy można połączyć z sekwencją genomową lub cDNA kodującąheterologiczne białko, po czym sekwencję DNA można zmodyfikować poprzez insercję syntetycznych oligonukleotydów kodujących sekwencję 5'-P-SP-(LP)_n-PS-HP-3', zgodnie ze znanymi procedurami.

Ponadto sekwencja DNA 5'-P-SP-(LP)_n-PS-HP-3' może pochodzić od mieszaniny fragmentów syntetycznych i genomowych, mieszaniny syntetycznych i cDNA lub mieszaniny genomowych i cDNA, przy czym uzyskuje się ją w takim przypadku przez złączenie (annealing) fragmentów pochodzenia syntetycznego, genomowego lub cDNA (zależnie od wymagań), przy czym fragmenty te odpowiadają różnym częściom całkowitej sekwencji DNA, zgodnie ze znanymi technikami. I tak można sobie wyobrazić, że sekwencja DNA kodująca peptyd sygnałowy lub polipeptyd heterologiczny może być pochodzenia genomowego lub cDNA, a sekwencja 5'-P-SP-(LP)_n-PS może zostać wytworzona syntetycznie.

Zrekombinowanym wektorem ekspresji przenoszącym sekwencję 5'-P-SP-(LP)_n-PS-HP-3' może być dowolny wektor zdolny do replikacji w organizmie drożdżowym. W wektorze tym sekwencję promotora (P) może stanowić dowolna sekwencja DNA wykazująca aktywność transkrypcyjnąw drożdżach, przy czym może ona pochodzić z genów kodujących białka homologiczne lub heterologiczne dla drożdży. Promotor korzystnie pochodzi z genu kodującego białko homologiczne dla drożdży. Do przykładowych odpowiednich promotorów należą promotory MFal, TPI, ADHI, ADHII lub PGK z Saccharomyces cerevisiae, albo odpowiednie promotory z innych gatunków drożdży, np. Schizosaccharomyces pombe. Przykładowe odpowiednie promotory zostały opisane; patrz np. Russell i Hall, J. Biol. Chem. 258, 1983, 143-149; Russell, Naturę 301, 1983, 167-169; Ammerer, Meth. Enzymol. 101, 1983, 192-201; Russell i inni, J. Biol. Chem. 258,1983,2674-2682; Hitzeman i inni, J. Biol. Chem. 255,1980,12073-12080, Kawasaki i Fraenkel, Biochem. Biophys. Res. Comm. 108,1982, orazT. Alberi G. Kawasaki, J. Mol. Appl. Genet. 1, 1982,419-434.

178 924

Sekwencje wymienione powyżej można także łączyć w sposób umożliwiający ich działanie z odpowiednim terminatorem, np. z terminatorem TPI (patrz T. Alber i G. Kawasaki, J. Mol. Appl. Genet. 1, 1982,419-434).

Zrekombinowany wektor ekspresji według wynalazku zawiera ponadto sekwencję DNA umożliwiającą replikację wektora w drożdżach. Do przykładowych sekwencji tego typu należą geny replikacji plazmidu drożdżowego 2pREP 1 -3 oraz źródło replikacji. Wektor może także zawierać wybiórczy marker, np. gen TPI z Schizosaccharomyces pombe, opisany przez P. R. Russella, Gen 40, 1985, 125-130, albo gen drożdżowy URA3.

Sposoby wykorzystywane do insercji sekwencji 5'-P-SP-(LP)_n-PS-HP-3' w odpowiednim wektorze drożdżowym zawierającym informację niezbędną do replikacji w drożdżach, są dobrze znane specjalistom (patrz np. Sambrook, Fritsch i Maniatis, op. cit.). Zrozumiałe jest, że wektor można skonstruować wytwarzając najpierw konstrukt DNA zawierającą całą sekwencję, a następnie przeprowadzając insercję tego fragmentu do odpowiedniego wektora ekspresji, albo też dokonując kolejno insercji fragmentów DNA zawierających informację genetyczną dla poszczególnych elementów (takich jak sekwencja promotora, sekwencja sygnałowa, sekwencja liderująca lub DNA kodujący heterologiczny polipeptyd), a następnie przeprowadzając ligowanie.

Organizmem drożdżowym transformowanym wektorem według wynalazku może być dowolny odpowiedni organizm drożdżowy, który w wyniku hodowania wytwarza duże ilości odpowiedniego heterologicznego polipeptydu. Do przykładowych odpowiednich organizmów drożdżowych należą szczepy Saccharomyces, takie jak Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces kluyveri lub Saccharomyces uvarum; Schizosaccharomyces, takie jak Schizosaccharomyces pombe; Kluyveromyces, takiej ak Kluyveromyces lactis; Yarrowia, takie jak Yarrowia lipolytica lub Hansenula, takie jak Hansenula polymorpha. Transformację komórek drożdżowych można np. przeprowadzić wytwarzając protoplastę, a następnie wykonując transformację w znany sposób.

Ośrodkiem stosowanym w hodowli komórek może być zwykły ośrodek przydatny do hodowli organizmów drożdżowych. Wydzielone białko heterologiczne, którego przeważająca część będzie występować w ośrodku we właściwie przetworzonej formie, można odzyskać z ośrodka znanymi sposobami obejmującymi oddzielanie komórek drożdżowych od ośrodka przez wirowanie lub filtrację, wytrącanie składnika białkowego z supematantu lub przesączu za pomocąsoli, np. siarczanu amonowego, a następnie oczyszczanie różnymi metodami chromatograficznymi, takimi jak chromatografia jonowymienna, chromatografia powinowactwa itp.

Krótki opis rysunków

Wynalazek zostanie dokładniej opisany w poniższych przykładach w nawiązaniu do załączonych rysunków, przy czym na figurach 1A i IB przedstawiono schematycznie konstruowanie plazmidu pLaC257; na fig. 2 pokazano sekwencję DNA i pochodną sekwencję aminokwasów insertu EcoRI-XbaI w pLaC257 (Seq. ID nr 2); na figurach 3A i 3B przedstawiono schematycznie konstruowanie plazmidu pLaC242pr; na fig. 4 pokazano sekwencję DNA i pochodną sekwencję aminokwasów fragmentu EcoRI-XbaI w pAPRScl, przy czym sekwencja białkowa przedstawiona kursywą pochodzi z fragmentu DNA klonowanego na drodze przypadkowej ekspresji (Seq. ID nr 4); na fig. 5 przedstawiono schematycznie konstruowanie plazmidu pLaC263; na fig. 6 pokazano sekwencję DNA i pochodną sekwencję aminokwasów fragmentu EcoRI-XbaI w pLaC263 (Seq. ID nr 6); na figurach 7A i 7B pokazano sekwencję DNA i pochodną sekwencję aminokwasów inhibitora drogi ludzkiego czynnika tkankowego (TFPI) zawierającego jego natywny peptyd sygnałowy (Seq. ID nr 8). Na figurze 8A pokazano sekwencję DNA i pochodną sekwencję aminokwasów peptydu sygnałowego spx3 i peptydu liderującego 212 (przedstawionego w WO 89/02463), połączonego końcem N z sekwencją TFPI w plazmidzie pYES-212 TFPI161-117Q (Seq. ID nr 10); na fig. 8B pokazano sekwencję DNA i pochodną sekwencję aminokwasów peptydu sygnałowego YAP3 i peptydu liderującego 212 (przedstawionego w WO 89/02463), połączonego końcem N z sekwencją TFPI w plazmidzie pYES-yk TFPI161-117Q (Seq. ID nr 12); na fig. 9 przedstawiono mapy restrykcyjne plazmidów pYES21, pP-212TFPI161 -117Q, pYES-212TFPI161 -117Q i pYES-yk TFPI 161 -117Q.

178 924

Wynalazek ilustrują poniższe przykłady.

Przykłady

Plazmidy i materiały DNA

Wszystkie plazmidy ekspresji zawierały sekwencje 2pDNA do replikacji w drożdżach, z wykorzystaniem genu URA3 S. cerevisiae lub genu izomerazy fosforanu triozy (POT) z Schizosaccharomyces pombe jako wybiórcze markery w drożdżach. Plazmidy POT opisane są w zgłoszeniu patentowym EP nr 171 142. Plazmid zawierający gen POT dostępny jest ze zdeponowanego szczepu R. coli (ATCC 39685). Plazmidy POT zawierają ponadto promotor izomerazy fosforanu triozy z S. cerevisiae oraz terminator (P_TPI i T_TP1). Są one identyczne z pMT742 (M. Egel-Mitani i inni, Gene 73, 1988, 113-120) (patrz fig. 1), z wyjątkiem obszaru określonego przez miejsca restrykcyjne SphXbaI obejmujące P_TPI i obszar kodujący sygnał/lider/produkt. Plazmid URA3 zawiera P_TP1 i terminator izo-I-cytochromu C (T_CYC1).

P_TP1 zmodyfikowano w porównaniu z sekwencją występującą w pMT742 jedynie w celu ułatwienia przeprowadzania konstrukcji. Wewnętrzne miejsce restrykcyjne SphI wyeliminowano przez rozszczepienie za pomocą SphI, usunięcie jednoniciowych ogonów i ponowne zligowanie. Ponadto sekwencje DNA w górę od jakiegokolwiek wtrętu w promotorze oraz w jego wnętrzu, zostały usunięte w wyniku obróbki endonukleaząBal31, a następnie dodanie linkera miejsca restrykcyjnego SphI. Taki konstrukt promotora obecny na fragmencie SphI-EcoRI o 373 bp określany jest jako P_TPj₈, przy czym jeśli jest on stosowany w już opisanych plazmidach, to taką modyfikację promotora zaznacza się, dodając δ do nazwy plazmidu.

Zastosowano ponadto szereg syntetycznych fragmentów DNA, przy czym wszystkie te fragmenty zsyntetyzowano w zautomatyzowanym syntetyzatorze DNA (Applied Biosystems model 3 80A) z wykorzystaniem metody fbsforamidynowej oraz dostępnych w handlu reagentów (S. L. Beaucage i Μ. H. Caruthers, Tetrahedron Letters 22, 1981,1859-1869). Oligonukleotydy oczyszczano metodą elektroforezy na żelu agarozowym w warunkach denaturacji. Przed złączeniem komplementarnych par takie pojedyncze nici DNA poddano kinazie za pomocą kinazy polinukleotydowej T4 i ATP.

Wszystkie inne sposoby i materiały są znane i powszechnie wykorzystywane (J. Sambrook i inni, Molecular Cłoning, A Laboratory Manuał, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y. 1989).

Przykład I. Zmodyfikowany peptyd sygnałowy mysiej amylazy ślinowej (MAS3_SP) (opisany w WO 89/02463) kasety ekspresji plazmidu pLSC6315D3 (opisanej w przykładzie 3 WO 92/11378), zawierający sekwencję DNA kodującą prekursor insuliny MI3 (B( 1-29)-Ala- Ala-Lys-A(l-21)) zastąpiono peptydem sygnałowym YAP3, przeprowadzając następujące etapy:

Wykonano konstrukt do łatwej wymiany peptydów sygnałowych. W wyniku miejscowo ukierunkowanej mutagenezy miejsce Asp718 wprowadzono tuż przed kodonem inicjowania sygnału w pLaC196Ó (patrz WO 89/02463, fig. 5), metodą podwójnego primera, stosując primer mutageniczny NOR494

3'-ATTTGCTGCCATGGTAęTTTCAGAAGG (Seq. Id nr 14) gdzie pogrubiane litery oznaczająmutacje, a sekwencjapodkreślona oznacza kodon inicjowania.

Uzyskany plazmid nazwano pLaC196fr-Asp718 (patrz fig. 1).

Sekwencję nukleotydową regionu pokrywającego połączenie między peptydem sygnałowym i peptydem liderującym w kasecie ekspresji w pLSC6315D3 zmodyfikowano, zastępując fragment restrykcyjny Apal-HgiAI syntetycznym łącznikiem (stretch) DNA NOR 2521/2522:

NOR2521: 5'-CAA CC A ATA GAC ACG CGT AAA GAA GGC CTA CAG CAT GAT TAC GAT AC A GAG ATC TTG GAG (Seq. ID nr 15)

NOR2522: 5'-C CAA GAT CTC TGT ATC GTA ATC ATG CTG TAG GCC TTC TTT ACG CGT GTC TAT TGG TTG GGC C (Seq. ID nr 16)

Uzyskany plazmid nazwano pLSC6315D3R (patrz fig. 1).

178 924

Fragment Sphl-Asp718 z pLaC 196ó-Asp718 zligowano z plazmidem pLSC6315D3R rozciętym za pomocą Sphl-Mlul oraz syntetycznym łącznikiem DNA kodującym peptyd sygnałowy YAP3:

YAP-spl: 5'-GT ACC AAA ATA ATG AAA CGT AAA ACT GTA AGA TCT GCG GTC CTT TCG TCA CTC TTT GCA TCT CAG GTC CTT GGC CAA CAA ATA GAC A (Seg. ID nr 17)

YAP-sp2: 5'-CG CGT GTC TAT TGG TTG GCC AAG GAC CTG AGA TGC AAA GAG TGA CGA AAG GAC CGC AGA TCT TAC AGT TTT CAG TTT CTA TAT TTT G (Seq. ID nr 18).

Uzyskany plazmid pLaC257 stanowi zasadniczo pLSC6315D3, w którym peptyd sygnałowy MSA3 został zastąpiony peptydem sygnałowym YAP3 (patrz fig. 2).

Transformowanie drożdży: Szczep S. cerevisiae MT663 (E2-7B ΧΕ11-36 a/ot, Atpi/Atpi, pep 4-3/pep 4-3) (szczep drożdży MT663 zdeponowano w Deutsche Sammling von Mikroorganismen und Zellkulturen, w związku ze zgłoszeniem WO 92/11378, gdzie nadano mu numer depozytowy DSM 6278) hodowano na pożywce YPGaL (1 % ekstraktu drożdżowego Batco, 2% peptonu Batco, 2% galaktozy, 1% laktozy) do uzyskania gęstości optycznej (OD) 0,6 przy 600 nm.

100 ml hodowli zebrano przez odwirowanie, przemyto wodą ponownie odwirowano i ponownie zawieszono w 10 ml roztworu zawierającego 1,2 M sorbitol, 25 mM Na₂EDTA o pH 8,0 i 6,7 mg/ml ditiotreitolu. Zawiesinę inkubowano w 30°C przez 15 minut, odwirowano i komórki ponownie zawieszono w 10 ml roztworu zawierającego 1,2 M sorbitol, 10 mMNa₂EDTA, 0,1 M cytrynian sodowy, pH 5,8 oraz 2 mg środka Novozym® 234. Zawiesinę inkubowano w 30°C przez 30 minut, komórki odwirowano, przemyto lOml 1,2 Msorbitolu i 10 ml roztworu CAS (1,2 M sorbitol, 10 mM CaCl₂,10 mM Tris HC1 (Tris - tris(hydroksymetylo)aminometan) o pH 7,5) i ponownie zawieszono w 2 ml CAS. W celu przeprowadzenia transformacji 1 ml zawiesiny komórek w CAS wymieszano z około 0,1 pg plazmidu pLaC2 57 i pozostawiono w temperaturze pokojowej na 15 minut. Dodano 1 ml roztworu (20% glikolu polietylenowego 4000,20 mM CaCl₂, 10 mM CaCl₂, 10 mM Tris HC1, pH 7,5) i mieszaninę pozostawiono na kolejne 30 minut w temperaturze pokoj owej. Mieszaninę odwirowano, po czym osad ponownie zawieszono w 0,1 ml SOS (1,2 M sorbitol, 33% objętościowe YPD, 6,7 mM CaCl₂,14 pg/ml leucyny) i inkubowano w 30°C przez 2 godziny. Zawiesinę odwirowano i osad ponownie zawieszono w 0,5 ml 1,2 M sorbitolu.

Następnie dodano 6 ml wierzchniego agaru (ośrodek SC Shermana i innych, Methods in Yeast Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory (1982)) (zawierającym 1,2 M sorbitol i 2,5% agaru) w 52°C i zawiesinę wylano na wierzch płytek zawierających zestalony ten sam agar z sorbitolem.

Transformowane kolonie zebrano po 3 dniach w 30°C, ponownie wydzielono i zastosowano do rozpoczęcia hodowli w cieczy. Jeden transformant wybrano do dalszych badań.

Fermentacja: Szczep drożdży MT663 transformowany plazmidem pLaC257 hodowano na pożywce YPD (1% ekstraktu drożdżowego, 2% peptonu (zDifco Laboratories) i 3% glukozy). 1 litr hodowli szczepu wytrząsano w 30°C do uzyskania gęstości optycznej 24 przy 650 nm. Po odwirowaniu wydzielono supematant.

Zastosowano komórki MT663 transformowane plazmidem pLSC6315D3 i hodowane w sposób opisany powyżej, w celu porównania wydajności prekursora insuliny MI3. Wydajności MI3 wyznaczano bezpośrednio w supematantach hodowli metodą Snela, Damgaarda i Molerupa, Chromatographia 24, 1987, 329-332. Uzyskane wyniki przedstawiono poniżej.

Plazmid	Wydajność MI3
pSCL63.15D3 (Msa3SP)	100%
pLaC257 (YAP3)	120%

Przykładu. Plazmid pSCL6315D3 zmodyfikowano w dwóch etapach. Najpierw peptyd sygnałowy MSA3 zastąpiono peptydem sygnałowym spx3 wymieniając fragment Sphl-Apal na analogiczny fragment z pLaC212spx3 (patrz WO 89/02463). Z uzyskanego plazmidu pSCL63.15spx3 wydzielono fragment EcoRI-Ddel o 302 bp i wykonano fuzję z fragmentem

178 924

Ncol-Xbal o 204 bp zpKFN1003 (WO 90/10075) zawierającym sekwencję kodującąaprotyninę, poprzez syntetyczny linker DNA NOR2101/2100 (patrz fig. 3)

NOR2101: 5'-T AAC GTC GC (Seq. ID nr 19)

NOR2100: 5'-CAT GGC GAC C (Seq. ID nr 20)

Uzyskany plazmid pLaC242-Apr (patrz fig. 3) rozszczepiono za pomocą Clal, odfosforylowano i zastosowano w klonowaniu zwisających fragmentów 5'-CG DNA wydzielonych ze szczepu S. cerevisiae MT663, zgodnie z opisempodanym w WO 92/11378. Transformację i fermentację szczepu drożdży MT663 prowadzono w sposób opisany w przykładzie I.

Z uzyskanej biblioteki transformantów drożdżowych z zakotwiczonym plazmidem pARP-Sc 1 (wytworzonej w sposób opisany w WO 92/11378) do selekcjonowania wybrano zawierające lider, którego sekwencję pokazano na fig. 4. Peptyd sygnałowy spx3 wpAPR-Sca zastąpiono peptydem sygnałowym YAP3 przez złączenie fragmentu Sphl-Styl z pLaC257, z fragmentem Nhel-Xbal o 300 bp z pAPR-Scl, za pomocą syntetycznego linkera DNA, MH1338/1339 (patrz fig. 5):

MH 1338: 5-CTT GGC CAA CCA TCG AAA TTG AAA CCA G (Seq. ID nr 21)

MH 1339: 5'-CT AGC TGG TTT CAA TTT CGA TGG TTG GC (Seq. ID nr 22).

Uzyskany plazmid nazwano pLaC263 (patrz fig. 5). Sekwencję DNA i pochodną sekwencję aminokwasów fragmentu EcoRI-XbaI z pLaC263 pokazano na fig. 6.

Plazmid	Wydajność aprotyniny
pAPR-Scl (Spx3$p)	100%
pLaC263	136%

Przykładni. Syntetyczny gen koduj ący ludzki TFPI, którego sekwencj ę DNA otrzymano z opublikowanej sekwencji cDNA kodującej inhibitor drogi ludzkiego czynnika tkankowego (TFPI) (Wu i inni, J. Biol. Chem. 263 (1988), 6001-6004) otrzymano metodą stopniowego klonowania syntetycznych fragmentów restrykcyjnych w plazmidzie pBS(+). Uzyskany gen zawarty był we fragmencie restrykcyjnym Sali o 928 parach zasad (bp). Gen zawierał 26 cichych podstawień nukleotydowych w zdegenerowanych kodonach w porównaniu z cDNA uzyskanymi w 14 unikatowych miejscach dla endonukleaz restrykcyjnych. Fragment Sali sekwencji DNA o 928 bp odpowiadający sekwencji aminokwasów ludzkiego TFPI (pre-fonna) przedstawiono na fig. 8).

Sekwencję DNA ucięto następnie, aby kodowała ona wariant TFPI złożony z pierwszych 161 aminokwasów. Nieglikozylowany wariant, TFPI_146I-117Gln, w którym kodon AAT dla Ans 117 zastąpiono kodonem CAA dla Gin skonstruowano na drodze miejscowo ukierunkowanej mutagenezy w znany sposób, stosując syntetyczne oligonukleotydy. Sekwencję DNA kodującą TFPIi.₁₆₁-117Gln poddano obróbce syntetyczną sekwencją sygnał-lider 212spx3 (patrz WO 89/02463), patrz fig. 8A. Konstrukt ten wstawiono do plazmidu pP-212TFPI161-117Q (opartego na wektorze typu POT (G. Kawasaki i L. Bell, patent USA nr 4 931 373), patrz fig. 8).

Fragment Sphl-Xbal zawierający obszar kodujący dla 213spx3-TFPI|._]6)-l 17Gln wydzielono i przeprowadzono klonowanie w plazmidzie pYES21 pochodzącym z dostępnego (Stratagene) wektora pYES2.0 (patrz fig. 8). Plazmid ten zawiera sekwencję 2pdo replikacji w drożdżach, gen drożdżowy URA3 do selekcji plazmidu w szczepach ura, gen β-laktamazy do selekcji w E. coli, źródło replikacji ColEl do replikacji w E. coli, źródło fl do odzysku jednoniciowego plazmidu DNA z superzainfekowanych szczepów E. coli i drożdżowy terminator transkrypcyjny CYC 1. Fragment Sphl-Xbal sklonowano w pYES 2,0 przed terminatorem CYC1. Uzyskany plazmid pYES-212TFPI161 -117Q (patrz fig. 9) rozszczepiono PflMI i EcoRI w celu usunięcia obszaru kodującego peptyd sygnałowy mysiej amylazy ślinowej, który zastąpiono sekwencją dwuniciowego syntetycznego oligonukleotydu kodującą peptyd sygnałowy YAP3:

MHJ 1131:5' AAT TC A AAC TAA AAA ATG AAG CTT AAA ACT GTA AGA TCT GCG GTC CTT TCG TCA CTC TTT GCA TCG CAG GTC CTA GGT CAA CCA GTC (Seq. ID nr 23)

178 924

MHJ 1132: 5' CTG GTT GAC CTA GGA CCT GCG ATG CA A AGA GTG ACG AAA GGA CCG CAG ATC TTA CAG TTT TAA GCT TCA TTT TTT AGT TTG (Seq. ID nr 24) uzyskując plazmid pYES-ykTFPI161-117Q (patrz fig. 8B i fig. 9).

Przeprowadzono transformację plazmidów pYES-212TFPI161-117Q i pYES-yk TFPI161-117Qw haploidalnym szczepie drożdży YNG318 (MATaura3-52 Ieu2-A2 ρερ4-Δ1 his4-539 [cir+]). Plazmid wykazywał selekcję względem komórek Ura+. Wydzielone transformanty hodowano w 50 ml syntetycznego pełnego ośrodka nie zawierającego uracylu (SC-ura) przez 3 dni w 30°C. Po zmierzeniu gęstości optycznej (OD₆₀₀) hodowle odwirowano i w uzyskanych supematantach oznaczono poziom wydzielonej chromogenicznej aktywności TFPI zależnej od FXa/TF/FVHa (P. M. Sandset i inni, Thromb. Res. 47,1987,389-400). Średnia aktywność dla supematantów ze szczepów zawierających plazmid pYES-212TFPI161-117Q (to znaczy plazmid zawierający sekwencję sygnałową mysiej amylazy ślinowej) wynosiła 0,65 U/ml. OD. Średnia aktywność dla supematantów ze szczepów zawierających plazmid pYES-yk TFPI161-117Q wynosiła 1,00 U/ml. OD.

Zestawienie sekwencji (1) Informacja ogólna (i) Zgłaszający (A) Nazwa: Novo Nordisk A/S (B) Ulica: Novo Alle (C) Miasto: Bagsvaerd (E) Państwo: Dania (F) Kod pocztowy (ZIP): 2880 (G) Telefon: +45 4444 8888 (H) Telefax: +45 4449 3256 (ii) Tytuł wynalazku: Konstrukt DNA kodujący peptyd sygnałowy YAP3 (iii) Liczba sekwencji: 24 (iv) Postać odczytywana komputerowo:

(A): Typ nośnika: dyskietka (B) Komputer: kompatybilny z IBM PC (C) System operacyjny: PC-DOS/MS-DOS (D) Oprogramowanie: Patentln Release #1,0, wersja

178 924 #1.25 (EPO) (2) Informacja dotycząca Seq. nr 1 (i) Charakterystyka sekwencji:

(A) długość: 63 pary zasad (B) Typ: kwas nukleinowy (C): Niciowość: pojedyncza (D) Topologia: liniowa (ii) Typ cząsteczki: cDNA (iii) Hipotetyczność: nie (iv) antysensowność: nie (vi) Źródło pochodzenia:

(A) Organizm: Saccharomyces cerevisiae (xi) Opis sekwencji: Seq. ID nr 1

AGTAAACTGA AAACTGTAAG ATCTGCGGTC CTTTCGTCAC TCTTTGCATC 60

TCAGGTCCTT GGC 63 (2) Informacja dotycząca Seq. nr 2 (i) Charakterystyka sekwencji: (A) długość: 476 par zasad (B) Typ: kwas nukleinowy (C): Niciowość: pojedyncza (D) Topologia: liniowa (ii) Typ cząsteczki: DNA (iii) Hipotetyczność: nie (iv) antysensowność: nie (vi) Źródło pochodzenia:

(A) Organizm: syntetyczna (ix) Cechy:

(A) Nazwa/Klucz: CDS

178 924 (B) Umiejscowienie: 81..452 (ίχ) Cechy:

(A) Nazwa/klucz: sig_peptide (B) Umiejscowienie: 81..293 (ix) Cechy:

(A) Nazwa/klucz: mat_peptide (B) Umiejscowienie: 294..452 (xi) Opis sekwencji: Seq. ID nr 2

GAATTCATTC AAGAATAGTT CAAACAAGAA GATTACAAAC TATCAATTTC ATACACACTA 60

TAAACGACGG TACCAAAATA ATG AAA CTG AAA ACT GTA AGA TCT GCG GCT 110

Met Lys Leu Lys Thr Val Arg Ser Ala Val

-71 -70 -65

CTT TCG TCA CTC TTT GCA TCT CAG GTC Leu Ser Ser Leu Phe Ala Ser Gin Val

-60 -55

CGT AAA GAA CGC CTA CAG CAT GAT TAC

Arg Lys Glu Gly Leu Gin His Asp Tyr

-45 -40

ATT GGA AGC GAT GAG TTA ATT TTG ΑΆΤ

Ile Gly Ser Asp Glu Leu Ile Leu Asn

ACT TTG CAA GCC ATC GAT AAC ACC ACT

Thr Leu Gin Ala Ile Asp Asn Thr Thr

-10-5

CAA CAC TTG TGC GGT TCC CAC TTGGTT

Gin His Leu Cys Gly Ser His LeuVal

510

GGT GAA AGA GGT TTC TTC TAC ACTCCT

Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr ThrPro

2025

GAA CAA TGC TGT ACC TCC ATC TGCTCC

Glu Gin Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser

TGC AAC TAGACGCAGC CCGCAGGCTC TAGA Cys Asn (2) Informacja dotycząca Seq.

(i) Charakterystyka sekwencji

CTT GGC CAA CCA ATA GAC ACG 158

Leu Gly Gin Pro Ile Asp Thr -50

GAT ACA GAG ATC TTG GAG CAC 206

Asp Thr Glu Ile Leu Glu His

-35 -30

GAA GAG TAT GTT ATT GAA AGA 254

Glu Glu Tyr Val Ile Glu Arg

-20 -15

TTG GCT AAG AGA TTC GTT AAC 302

Leu Ala Lys Arg Phe Val Asn 1

GAA GCT TTG TAC TTG GTT TGC 350 Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys

AAG GCT GCT AAG GGT ATT GTC 398 Lys Ala Ala Lys Gly Ile Val 3035

TTG TAC CAA TTG GAA AAC TAC44 6

Leu Tyr Gin Leu Glu Asn Tyr 4550

476 nr 3

178 924 (A) długość: 124 aminokwasy (B) Typ: aminokwas (D) Topologia: liniowa (ii) Typ cząsteczki: białko (xi) Opis sekwencji: Seq. ID nr 3

Met -71

Lys -70

Leu

Lys

Thr

Val

Arg -65

Ser

Ala

Val

Leu

Ser -60

Ser

Leu

Phe

Ala

Ser -55

Gin

Val

Leu

Gly

Gin -50

Pro

Ile

Asp

Thr

Arg -45

Lys

Glu

Gly

Leu

Gin -40

His

Asp

Tyr

Asp

Thr -35

Glu

Ile

Leu

Glu

His -30

Ile

Gly

Ser

Asp

Glu -25

Leu

Ile

Leu

Asn

Glu -20

Glu

Tyr

Val

Ile

Glu -15

Arg

Thr

Leu

Gin

Ala -10

Ile

Asp

Asn

Thr

Thr -5

Leu

Ala

Lys

Arg

Phe 1

Val

Asn

Gin

His 5

Leu

Cys

Gly

Ser

His 10

Leu

Val

Glu

Ala

Leu 15

Tyr

Leu

Val

Cys

Gly 20

Glu

Arg

Gly

Phe

Phe 25

Tyr

Thr

Pro

Lys

Ala 30

Ala

Lys

Gly

Ile

Val 35

Glu

Gin

Cys

Thr 40

Ser

Ile

Cys

Ser

Leu 45

Tyr

Gin

Leu

Glu

Asn 50

Tyr

Cys

Asn

(2) Informacja dotycząca Seq. nr 4 (i) Charakterystyka sekwencji:

(A) długość: 450 par zasad (B) Typ: kwas nukleinowy (C): Niciowość: pojedyncza (D) Topologia: liniowa (ii) Typ cząsteczki: DNA (iii) Hipotetyczność: nie (iv) antysensowność: nie (vi) Źródło pochodzenia:

178 924 (A) Organizm: syntetyczna (ix) Cechy:

(A) Nazwa/Klucz: CDS (B) Umiejscowienie: 76..441 (ix) Cechy:

(A) Nazwa/klucz: sig_peptide (B) Umiejscowienie: 76..267 (ix) Cechy:

(A) Nazwa/klucz: mat_peptide (B) Umiejscowienie: 268..441 (xi) Opis sekwencji: Seq. ID nr 4

GAATTCATTC AAGAATAGTT CAAACAAGAA GATTACAAAC TATCAATTTC ATACACAATA 60

TAAACGATTA AAAGA ATG AAG GCT GTT TTC TTG GTT TTG TCC TTG ATC GGA 111

Met Lys Ala Val Phe Leu Val Łeu Ser Leu Ile Gly -64 -60 -55

TTC TGC

TGG Trp -50

GCC Ala

CAA Gin

CCA Pro

TCG AAA TTG AAA CCA GCT

AGC GAT

ATA CAA

159

Phe

Cys

Ser Lys -45

Leu

Lys

Pro

Ala

Ser -40

Asp

Ile

Gin

ATT

CTT

TAC

GAC

CAT

GGT

GTG AGG

GAG

TTC

GGG

GAA

AAC

TAT

GTT

CAA

207

Ile

Leu

Tyr

Asp

His

Gly

Val Arg

Glu

Phe

Gly

Glu

Asn

Tyr

Val

Gin

-35

-30

-25

GAG

TTG

ATC

GAT

AAC

ACC

ACT TTG

GCT

AAC

GTC

GCC

ATG

GCT

GAG

AGA

255

Glu

Leu

Ile

Asp

Asn

Thr

Thr Leu

Ala

Asn

Val

Ala

Met

Ala

Glu

Arg

-20

-15

-10

-5

TTG

GAG

AAG

AGA

AGG

CCT

GAT TTC

TGT

TTG

GAA

CCT

CCA

TAC

ACT

GGT

303

Leu

Glu

Lys

Arg

Pro

Asp Phe

Cys

Leu

Glu

Pro

Tyr

Thr

Gly

1

5

10

CCA

TGT

AAA

GCT

AGA

ATC

ATC AGA

TAC

TTC

TAC

AAC

GCC

AAG

GCT

GGT

351

Pro

Cys

Lys

Ala

Arg

Ile

Ile Arg

Tyr

Phe

Tyr

Asn

Ala

Lys

Ala

Gly

15

20

25

TTG

TGT

CAA

ACT

TTC

GTT

TAC GGT

GGC

TGC

AGA

GCT

AAG

AGA

AAC

399

Leu

Cys

Gin

Thr

Phe

Val

Tyr Gly

Gly

Cys

Arg

Ala

Lys

Arg

Asn

30

35

40

TTC

AAG

TCT

GCT

GAA

GAC

TGC ATG

AGA

ACT

TGT

GGT

GCC

441

Phe

Lys

Ser

Ala

Glu

Asp

Cys Met

Arg

Thr

Cys

Gly

Ala

45

50

55

178 924

TAATCTAGA 450 (2) Informacja dotycząca Seq. nr 5 (i) Charakterystyka sekwencji:

(A) długość: 122 aminokwasy (B) Typ: aminokwas (D) Topologia: liniowa (ii) Typ cząsteczki: białko (xi) Opis sekwencji: Seq. ID nr 5

Met Lys Ala Val Phe Leu Val Leu Ser Leu Ile Gly Phe Cys Trp Ala

-64 -60 -55-50

Gin Pro Ser Lys Leu Lys Pro Ala Ser Asp Ile Gin Ile Leu TyrAsp

-45 -40-35

His Gly Val Arg Glu Phe Gly Glu Asn Tyr Val Gin Glu Leu Ile Asp -30 -25-20

Asn Thr Thr Leu Ala Asn Val Ala Met Ala Glu Arg Leu Glu Lys Arg -15 -10-5

Arg Pro Asp Phe Cys Leu Glu Pro Pro Tyr Thr Gly Pro Cys Lys Ala 15 1015

Arg Ile Ile Arg Tyr Phe Tyr Asn Ala Lys Ala Gly Leu Cys Gin Thr 20 2530

Phe Val Tyr Gly Gly Cys Arg Ala Lys Arg Asn Asn Phe Lys Ser Ala 35 4045

Glu Asp Cys Met Arg Thr Cys Gly Gly Ala 5055 (2) Informacja dotycząca Seq. nr 6 (i) Charakterystyka sekwencji:

(A) długość: 470 par zasad (B) Typ: kwas nukleinowy (C): Niciowość: pojedyncza (D) Topologia: liniowa (ii) Typ cząsteczki: DNA (iii) Hipotetyczność: nie

178 924 (iv) antysensowność: nie (vi) Źródło pochodzenia:

(A) Organizm: syntetyczna (ix) Cechy:

(A) Nazwa/Klucz: CDS (B) Umiejscowienie: 81..461 (ix) Cechy:

(A) Nazwa/klucz: sig_peptide (B) Umiejscowienie: 81..287 (ix) Cechy:

(A) Nazwa/klucz: mat_peptide (B) Umiejscowienie: 288..461 (xi) Opis sekwencji: Seq. ID nr 6

GAATTCATTC AAGAATAGTT CAAACAAGAA GATTACAAAC TATCAATTTC ATACACAATA 60

TAAACGACGG TACCAAAATA ATG AAA CTG AAA ACT GTA AGA TCT GCG GTC 110

Met Lys Leu Lys Thr Val Arg Ser Ala Val

-69 -65 -60

CTT Leu

TCG TCA

CTC Leu

TTT Phe -55

GCA TCT Ala Ser

CAG GTC Gin Val

CTT GGC CAA

CCA Pro

TCG Ser

AAA Lys -45

TTG Leu

158

Ser

Leu -50

Gly

Gin

AAA

CCA

GCT

AGC

GAT

ATA

CAA

ATT

CTT

TAC

GAC

CAT

GGT

GTG

AGG

GAG

206

Lys

Pro

Ala

Ser -40

Asp

Ile

Gin

Ile

Leu -35

Tyr

Asp

His

Gly

Val -30

Arg

Glu

TTC

GGG

GAA

AAC

TAT

GTT

CAA

GAG

TTG

ATC

GAT

AAC

ACC

ACT

TTG

GCT

254

Phe

Gly

Glu -25

Asn

Tyr

Val

Gin

Glu -20

Leu

Ile

Asp

Asn

Thr -li

Thr

Leu

Ala

AAC

GTC

GCC

ATG

GCT

GAG

AGA

TTG

GAG

AAG

AGA

AGG

CCT

GAT

TTC

TGT

302

Asn

Val -10

Ala

Met

Ala

Glu

Arg -5

Leu

Glu

Lys

Arg

Arg 1

Pro

Asp

Phe

Cys 5

TTG

GAA

CCT

CCA

TAC

ACT

GGT

CCA

TGT

AAA

GCT

AGA

ATC

AGA

TAC

350

Leu

Glu

Pro

Tyr 10

Thr

Gly

Pro

Cys

Lys 15

Ala

Arg

Ile

Arg 2C

Tyr )

TTC

TAC

AAC

GCC

AAG

GCT

GGT

TTG

TGT

CAA

ACT

TTC

GTT

TAC

GGT

GGC

398

Phe

Tyr

Asn

Ala 25

Lys

Ala

Gly

Leu

Cys 30

Gin

Thr

Phe

Val

Tyr 35

Gly Gly

178 924

TGC AGA GCT AAG AGA AAC AAC TTC AAG TCT GCT GAA GAC TGC ATG AGA 446

Cys Arg Ala Lys Arg Asn Asn Phe Lys Ser Ala Glu Asp Cys Met Arg 40 45 50

ACT TGT GGT GGT GCC TAATCTAGA 470

Thr Cys Gly Gly Ala 55 (2) Informacja dotycząca Seg. nr 7 (i) Charakterystyka sekwencji:

(A) długość: 127 aminokwasów (B) Typ: aminokwas (D) Topologia: liniowa (ii) Typ cząsteczki: białko (xi) Opis sekwencji: Seg. ID nr 7

Met -69

Lys

Leu

Lys

Thr -65

Val

Arg

Ser

Ala Val -60

Leu

Ser Ser

Leu

Phe -55

Ala

Ser

Gin

Val

Leu -50

Gly

Gin

Pro

Ser

Lys Leu -45

Lys

Pro Ala

Ser -40

Asp

Ile

Gin

Ile

Leu -35

Tyr

Asp

His

Gly

Val -30

Arg Glu

Phe

Gly Glu -25

Asn

Tyr

Val

Gin

Glu Leu -20

Ile

Asp

Asn

Thr -15

Thr

Leu Ala

Asn

Val Ala -10

Met

Ala

Glu

Arg -5

Leu

Glu

Lys

Arg

Arg 1

Pro

Asp

Phe Cys 5

Leu

Glu Pro

Pro

Tyr 10

Thr

Gly

Pro

Cys

Lys 15

Ala

Arg

Ile

Arg Tyr 20

Phe

Tyr Asn

Ala 25

Lys

Ala

Gly

Leu

Cys 30

Gin

Thr

Phe

Val

Tyr 35

Gly Gly

Cys

Arg Ala 40

Lys

Arg

Asn

Phe 45

Lys

Ser

Ala

Glu

Asp 50

Cys

Met Arg

Thr

Cys Gly 55

Gly

Ala

(2) Informacja dotycząca Seg. nr 8 (i) Charakterystyka sekwencji:

(A) długość: 928 par zasad (B) Typ: kwas nukleinowy (C): Niciowość: pojedyncza

178 924 (D) Topologia: liniowa (ii) Typ cząsteczki: cDNA (iii) Hipotetyczność: nie (iv) antysensowność: nie (vi) Źródło pochodzenia:

(A) Organizm: Homo sapiens (ix) Cechy:

(A) Nazwa/Klucz: CDS (B) Umiejscowienie: 8..919 (ix) Cechy:

(A) Nazwa/klucz: sig_peptide (B) Umiejscowienie: 8..91 (ix) Cechy:

(A) Nazwa/klucz: mat_peptide (B) Umiejscowienie: 92..919 (xi) Opis sekwencji: Seq. ID nr 8

GTCGACC ATG

ATT TAC

ACA ATG AAG ΑΆΑ GTA

CAT His -20

GCA CTT Ala Leu

TGG Trp

GCT Ala

AGC Ser -15

49

Met -28

Ile

Tyr

Thr Met -25

Lys

Lys Val

GTA

TGC CTG

CTG

CTT

AAT CTT

GCC

CCT GCC

CCT

CTT AAT

GCT

GAT

TCT

97

Val

Cys Leu

Leu

Leu -10

Asn Leu

Ala

Pro Ala -5

Pro

Leu Asn

Ala

Asp 1

Ser

GAG

GAA GAT

GAA

CAC ACA

ATT

ATC ACA

GAT

ACG GAG

CTC

CCA

145

Glu

Glu Asp 5

Glu

His Thr

Ile 10

Ile Thr

Asp

Thr Glu 15

Leu

Pro

CTG

ΑΆΑ CTT

ATG

CM

TCA TTT

TGT

GCA TTC

AAG

GCG GAT

GAT

GGG

CCC

193

Leu

Lys Leu 20

Met

His

Ser Phe 25

Cys

Ala Phe

Lys

Ala Asp 30

Asp

Gly

Pro

TGT

ΑΆΑ GCA

ATC

ATG

AAA AGA

TTT

TTC TTC

AAT

ATT TTC

ACT

CGA

CAG

241

Cys 35

Lys Ala

Ile

Met

Lys Arg 40

Phe

Phe Phe

Asn 45

Ile Phe

Thr

Arg

Gin 50

TGC

GAA GAA

TTT

ATA

TAT GGG

GGA

TGT GAA

GGA

AAT CAG

AAT

CGA

TTT

289

Cys

Glu Glu

Phe

Ile 55

Tyr Gly

Gly

Cys Glu 60

Gly

Asn Gin

Asn

Arg 65

Phe

178 924

GAA AGT CTG GAA GAG TGC AAA AAA ATG TGT ACA AGA GAT AAT GCA AAC 337

Glu Ser Leu Glu Glu Cys Lys Lys Met Cys Thr Arg Asp Asn Ala Asn 70 7580

AGG ATT ATA AAG ACA ACA CTG CAG CAA GAA AAG CCA GAT TTC TGC TTT385

Arg Ile Ile Lys Thr Thr Leu Gin Gin Glu Lys Pro Asp Phe CysPhe

9095

TTG GAA GAG GAT CCT GGA ATA TGT CGA GGT TAT ATT ACC AGG TAT TTT433

Leu Glu Glu Asp Pro Gly Ile Cys Arg Gly Tyr Ile Thr Arg TyrPhe

100 105110

TAT AAC AAT CAG ACA AAA CAG TGT GAA AGG TTC AAG TAT GGT GGA TGC481

Tyr Asn Asn Gin Thr Lys Gin Cys Glu Arg Phe Lys Tyr Gly GlyCys

115 120 125130

CTG GGC AAT ATG AAC AAT TTT GAG ACA CTC GAG GAA TGC AAG AAC ATT529

Leu Gly Asn Met Asn Asn Phe Glu Thr Leu Glu Glu Cys Lys AsnIle

135 140145

TGT GAA GAT GGT CCG AAT GGT TTC CAG GTG GAT AAT TAT GGT ACC CAG577

Cys Glu Asp Gly Pro Asn Gly Phe Gin Val Asp Asn Tyr Gly ThrGin

150 155160

CTC AAT GCT GTT AAC AAC TCC CTG ACT CCG CAA TCA ACC AAG GTT CCC625

Leu Asn Ala Val Asn Asn Ser Leu Thr Pro Gin Ser Thr Lys ValPro

165 170175

AGC CTT TTT GAA TTC CAC GGT CCC TCA TGG TGT CTC ACT CCA GCA GAT673

Ser Leu Phe Glu Phe His Gly Pro Ser Trp Cys Leu Thr Pro AlaAsp

180 185190

AGA GGA TTG TGT CGT GCC AAT GAG AAC AGA TTC TAC TAC AAT TCA GTC721

Arg Gly Leu Cys Arg Ala Asn Glu Asn Arg Phe Tyr Tyr Asn SerVal

195 200 205210

ATT GGG AAA TGC CGC CCA TTT AAG TAC TCC GGA TGT GGG GGA AAT GAA7 69

Ile Gly Lys Cys Arg Pro Phe Lys Tyr Ser Gly Cys Gly Gly Asn Glu

215 220225

AAC AAT TTT ACT AGT AAA CAA GAA TGT CTG AGG GCA TGC AAA TWA GGT817

Asn Asn Phe Thr Ser Lys Gin Glu Cys Leu Arg Ala Cys Lys Lys Gly

230 235240

TTC ATC CAA AGA ATA TCA AAA GGA GGC CTA ATT AAA ACC AAA AGA AAA8 65

Phe Ile Gin Arg Ile Ser Lys Gly Gly Leu Ile Lys Thr Lys Arg Lys

245 250255

AGA AAG AAG CAG AGA GTG AAA ATA GCA TAT GAA GAA ATT TTT GTT AAA913

Arg Lys Lys Gin Arg Val Lys Ile Ala Tyr Glu Glu Ile Phe Val Lys

260 265270

AAT ATG TGAGTCGAC928

Asn Met

275

178 924 (2) Informacja dotycząca Seq. nr 9 (i) Charakterystyka sekwencji:

(A) długość: 304 aminokwasy (B) Typ: aminokwas (D) Topologia: liniowa (ii) Typ cząsteczki: białko (xi) Opis sekwencji: Seq. ID nr 9

Met Ile Tyr Thr Met Lys Lys Val

-28-25

Leu Leu Leu Asn Leu Ala Pro Ala

-10-5

Asp Glu Glu His Thr Ile Ile Thr 510

Leu Met His Ser Phe Cys Ala Phe 25

Ala Ile Met Lys Arg Phe Phe Phe 40

Glu Phe Ile Tyr Gly Gly Cys Glu 5560

Leu Glu Glu Cys Lys Lys Met Cys 7075

Ile Lys Thr Thr Leu Gin Gin Glu 8590

Glu Asp Pro Gly Ile Cys Arg Gly 105

Asn Gin Thr Lys Gin Cys Glu Arg 120

Asn Met Asn Asn Phe Glu Thr Leu 135140

Asp Gly Pro Asn Gly Phe Gin Val 150155

Ala Val Asn Asn Ser Leu Thr Pro 165170

His Ala Leu Trp Ala Ser Val Cys

-20-15

Pro Leu Asn Ala Asp Ser Glu Glu 1

Asp Thr Gly Leu Pro Pro Leu Lys 1520

Lys Ala Asp Asp Gly Pro Cys Lys 3035

Asn Ile Phe Thr Arg Gin Cys Glu 4550

Gly Asn Gin Asn Arg Phe Glu Ser 65

Thr Arg Asp Asn Ala Asn Arg Ile 80

Lys Pro Asp Phe Cys Phe Leu Glu 95100

Tyr Ile Thr Arg Tyr Phe Tyr Asn 110115

Phe Lys Tyr Gly Gly Cys Leu Gly 125130

Glu Glu Cys Lys Asn Ile Cys Glu 145

Asp Asn Tyr Gly Thr Gin Leu Asn 160

Gin Ser Thr Lys Val Pro Ser Leu 175 180

178 924

Phe

Glu

Phe

His

Gly Pro 185

Ser

Trp

Cys

Leu 190

Thr

Pro

Ala

Asp

Arg 195

Gly

Leu

Cys

Arg

Ala 200

Asn Glu

Asn

Arg

Phe 205

Tyr

Asn

Ser

Val 210

Ile

Gly

Lys

Cys

Arg 215

Pro

Phe Lys

Tyr

Ser 220

Gly

Cys

Gly

Asn 225

Glu

Asn

Phe

Thr 230

Ser

Lys

Gin Glu

Cys 235

Leu

Arg

Ala

Cys

Lys 240

Lys

Gly

Phe

Ile

Gin 245

Arg

Ile

Ser

Lys Gly 250

Gly

Leu

Ile

Lys

Thr 255

Lys

Arg

Lys

Arg

Lys 260

Lys

Gin

Arg

Val

Lys Ile 265

Ala

Tyr

Glu

Glu 270

Ile

Phe

Val

Lys

Asn 275

Met

(2) Informacja dotycząca Seq. nr 10 (i) Charakterystyka sekwencji:

(A) długość: 234 pary zasad (B) Typ: kwas nukleinowy (C): Niciowość: pojedyncza (D) Topologia: liniowa (ii) Typ cząsteczki: DNA (iii) Hipotetyczność: nie (iv) antysensowność: nie (vi) Źródło pochodzenia:

(A) Organizm: syntetyczny (ix) Cechy:

(A) Nazwa/Klucz: CDS (B) Umiejscowienie: 76..234 (ix) Cechy:

(A) Nazwa/klucz: sig_peptide (B) Umiejscowienie: 76..222 (ix) Cechy:

(A) Nazwa/klucz: mat_peptide

178 924 (B) Umiejscowienie: 223..234 (xi) Opis sekwencji: Seq. ID nr 10

GAATTCATTC AAGAATAGTT CAAACAAGAA GATTACAAAAC TATCAATTTC ATACACAATA 60

TAAACGATTA AAAGA ATG AAG GCT GTT TTC TTG GTT TTG TCC TTG ATC GGA 111 Met Lys Ala Val Phe Leu Val Len Ser Leu Ile Gly -49 -45-40

TCC TGC TGG GCC CAA CCA GTC ACT GGC GAT GAA TCA TCT GTT GAG ATT159

Phe Cys Trp Ala Gin Pro Val Thr Gly Asp Glu Ser Ser Val GluIle

-35 -30-25

CCG GAA GAG TCT CTG ATC ATC GCT GAA AAC ACC ACT TTG GCT AAC GTC207

Pro Glu Glu Ser Leu Ile Ile Ala Glu Asn Thr Thr Leu Ala AsnVal

-20 -15-10

GCC ATG GCT AAG AGA GAT TCT GAG GAA234

Ala Met Ala Lys Arg Asp Ser Glu Glu -51 (2) Informacja dotycząca Seq. nr 11 (i) Charakterystyka sekwencji:

(A) długość: 53 aminokwasy (B) Typ: aminokwas (D) Topologia: liniowa (ii) Typ cząsteczki: białko (xi) Opis sekwencji: Seq. ID nr 11

Met -49	Lys	Ala Val Phe Leu Val Leu Ser Leu Ile Gly Phe Cys Trp Ala
-45	-40	-35
Gin	Pro	Val Thr Gly Asp Glu Ser Ser -30 -25	Val	Glu Ile Pro Glu Glu Ser -20
Leu Arg (2)	Ile Ile Ala Glu Asn Thr Thr Leu -15 -10 Asp Ser Glu Glu 1 Informacja dotycząca Seq. nr	Ala 12	Asn Val Ala Met Ala Lys -5

(i) Charakterystyka sekwencji:

(A) długość: 190 par zasad (B) Typ: kwas nukleinowy

178 924 (C): Niciowość: pojedyncza (D) Topologia: liniowa (ii) Typ cząsteczki: DNA (iii) Hipotętyczność: nie (iv) antysensowność: nie (vi) Źródło pochodzenia:

(A) Organizm: syntetyczny (ix) Cechy:

(A) Nazwa/Klucz: CDS (B) Umiejscowienie: 17..190 (ix) Cechy:

(A) Nazwa/klucz: sig_peptide (B) Umiejscowienie: 17..178 (ix) Cechy:

(A) Nazwa/klucz: mat_peptide (B) Umiejscowienie: 179..190 (xi) Opis sekwencji: Seq. ID nr 12

GAATTCAAAC ΤΑΆΑΑΑ ATG AAG CTT AAA ACT GTA AGA TCT GCG GTC CTT 49 Met Lys Leu Lys Thr Val Arg Ser Ala Val Leu -54 -50-45

TCG TCA CTC TTT GCA TCG CAG GTC CTA GGT CAA CCA GTC ACT GGC GAT97

Ser Ser Leu Phe Ala Ser Gin Val Leu Gly Gin Pro Val Thr GlyAsp

-40 -35-30

GAA TCA TCT GTT GAG ATT CCG GAA GAG TCT CTG ATC ATC GCT GAA AAC145

Glu Ser Ser Val Glu Ile Pro Glu Glu Ser Leu Ile Ile Ala GluAsn

-25 -20-15

ACC ACT TTG GCT AAC GTC GCC ATG GCT AAG AGA GAT TCT GAG GAA190

Thr Thr Leu Ala Asn Val Ala Met Ala Lys Arg Asp Ser Glu Glu

-10 -51 (2) Informacja dotycząca Seq. nr 13 (i) Charakterystyka sekwencji:

(A) długość: 58 aminokwasów

178 924 (B) Typ: aminokwas (D) Topologia: liniowa (ii) Typ cząsteczki: białko (xi) Opis sekwencji: Seq. ID nr 13

Met Lys Leu Lys Thr Val Arg Ser Ala Val Leu Ser Ser Leu Phe Ala

-54 -50 -45-40

Ser Gin Val Leu Gly Gin Pro Val Thr Gly Asp Glu Ser Ser ValGlu

-35 -30-25

Ile Pro Glu Glu Ser Leu Ile Ile Ala Glu Asn Thr Thr Leu Ala Asn

-20 -15-10

Val Ala Met Ala Lys Arg Asp Ser Glu Glu -51 (2) Informacja dotycząca Seq. nr 14 (i) Charakterystyka sekwencji:

(A) długość: 27 par zasad (B) Typ: kwas nukleinowy (C): Niciowość: pojedyncza (D) Topologia: liniowa (ii) Typ cząsteczki: DNA (vi) Źródło pochodzenia:

(A) Organizm: syntetyczny (xi) Opis sekwencji: Seq. ID nr 14

ATTTGCTGCC ATGGTACTTT CAGAAGG 27 (2) Informacja dotycząca Seq. nr 15 (i) Charakterystyka sekwencji:

(A) długość: 60 par zasad (B) Typ: kwas nukleinowy (C): Niciowość: pojedyncza (D) Topologia: liniowa (ii) Typ cząsteczki: DNA

178 924 (vi) Źródło pochodzenia:

(A) Organizm: syntetyczny (xi) Opis sekwencji: Seq. ID nr 15

CAACCAATAG ACACGCGTAA AGAAGGCCTA CAGCATGATT ACGATACAGA GATCTTGGAG 60 (2) Informacja dotycząca Seq. nr 16 (i) Charakterystyka sekwencji:

(A) długość: 62 pary zasad (B) Typ: kwas nukleinowy (C): Niciowość: pojedyncza (D) Topologia: liniowa (ii) Typ cząsteczki: DNA (vi) Źródło pochodzenia:

(A) Organizm: syntetyczny (xi) Opis sekwencji: Seq. ID nr 16

CCAAGATCTC TGTATCGTAA TCATGCTGTA GGCCTTCTTT ACGCGTGTCT ATTGGTTGGG

CC (2) Informacja dotycząca Seq. nr 17 (i) Charakterystyka sekwencji:

(A) długość: 87 par zasad (B) Typ: kwas nukleinowy (C): Niciowość: pojedyncza (D) Topologia: liniowa (ii) Typ cząsteczki: DNA (vi) Źródło pochodzenia:

(A) Organizm: syntetyczny (xi) Opis sekwencji: Seq. ID nr 17

GTACCAAAAT AATGAAACGT AAAACTGTAA GATCTGCGGT CCTTTCGTCA CTCTTTGCAT

CTCAGGTCCT TGGCCAAACA ATAGACA

178 924 (2) Informacja dotycząca Seq. nr 18 (i) Charakterystyka sekwencji:

(A) Organizm: syntetyczny (xi) Opis sekwencji: Seq. ID nr 18

CGCGTGTCTA TTGGTTGGCC AAGGACCTGA GATGCAAAGA GTGACGAAAG GACCGCAGAT 60

CTTACAGTTT TCAGTTTCTA TATTTTG 87 (2) Informacja dotycząca Seq. nr 19 (i) Charakterystyka sekwencji:

(A) długość: 9 par zasad (B) Typ: kwas nukleinowy (C): Niciowość: pojedyncza (D) Topologia: liniowa (ii) Typ cząsteczki: DNA (vi) Źródło pochodzenia:

(A) Organizm: syntetyczny (xi) Opis sekwencji: Seq. ID nr 19

TAACGTCGC 9 (2) Informacja dotycząca Seq. nr 20 (i) Charakterystyka sekwencji:

(A) długość: 10 par zasad (B) Typ: kwas nukleinowy (C): Niciowość: pojedyncza

178 924 (D) Topologia: liniowa (ii) Typ cząsteczki: DNA (vi) Źródło pochodzenia:

(A) Organizm: syntetyczny (xi) Opis sekwencji: Seg. ID nr 20

CATGGCGACC 10 (2) Informacja dotycząca Seq. nr 21 (i) Charakterystyka sekwencji:

(A) długość: 28 par zasad (B) Typ: kwas nukleinowy (C): Niciowość: pojedyncza (D) Topologia: liniowa (ii) Typ cząsteczki: DNA (vi) Źródło pochodzenia:

(A) Organizm: syntetyczny (xi) Opis sekwencji: Seg. ID nr 21

CTTGGCCAAC CATCGAAATT GAAACCAG 28 (2) Informacja dotycząca Seg. nr 22 (i) Charakterystyka sekwencji:

(A) Organizm: syntetyczny (xi) Opis sekwencji: Seg. ID nr 22

CTAGCTGGTT TCAATTTCGA TGGTTGGC

178 924 (2) Informacja dotycząca Seg. nr 23 (i) Charakterystyka sekwencji:

(A) długość: 88 par zasad (B) Typ: kwas nukleinowy (C): Niciowość: pojedyncza (D) Topologia: liniowa (ii) Typ cząsteczki: DNA (vi) Źródło pochodzenia:

(A) Organizm: syntetyczny (xi) Opis sekwencji: Seg. ID nr 23

AATTCAAACT AAAAAATGAA GCTTAAAACT GTAAGATCTG CGGTCCTTTC GTCACTCTTT

GCATCGCAGG TCCTAGGTC AACCAGTC (2) Informacja dotycząca Seg. nr 24 (i) Charakterystyka sekwencji:

(A) długość: 81 par zasad (B) Typ: kwas nukleinowy (C): Niciowość: pojedyncza (D) Topologia: liniowa (ii) Typ cząsteczki: DNA (vi) Źródło pochodzenia:

(A) Organizm: syntetyczny (xi) Opis sekwencji: Seq. ID nr 24

CTGGTTGACC TAGGACCTGC GATGCAAAGA GTGACGAAAG GACCGCAGAT CTTACAGTTT

TAAGCTTCAT TTTTTAGTTT G

178 924

Sphl (1)

Rg» la

178 924

Sphl(1) Apal (489)

488 bp Sphl-Apal

270 bp MgiAI-Zbal kb Xba!-Sphl

Sphl(l) Apal (489)

Fig. Ib

178 924

20 30 40 5060

I I I I II

GGAATTCATTCAAGAATAGTTCAAACAAGAAGATTACAAACTATCAATTTCATACACAAT

80 90 100 110120

I I I Iι

ATAAACGACGGTACCAAAATAATGAAACTGAAAACTGTAAGATCTGCGGTCCTTTCGTCA METLy s L euLy s ThrVa 1 Arg S e r Al aVa 1L eu S er $ e r -----------------ΥΑΡ3ζρ--------------130 140 150 160 170180

CTCTTTGCATCTCAGGTCCTTGGCCAACCAATAGACACGCGTAAAGAAGGCCTACAGCAT LeuPheAl aS erGlnValLeuGlyGlnProIleAspThrAr gLy sGluGlyLeuGlnHi s _________^____„„„„„_____**************-r*******ł*************

190 200 210 220 230240

I I 1 I II

GATTACGATACAGAGATCTTGGAGCACATTGGAAGCGATGAGTTAATTTTGAATGAAGAG AspiyrAspThrGluIleLeuGluHisIleGlySerAspGluLeuIlsLeuAsnGluGlu ************ it w v * * * 63.15d3 lidar *******'***’<*^χ***^*******’¹*

250 260 270 280 290 300

TATGTTATTGAAAGAACTTTGCAAGCCATCGATAACACCACTTTGGCTAAGAGATTCGTT TyrValIleGluArgThrLeuGlnAlaIleAspAsnThrThrLeuAlaLysArgPheVal k**»******-*·************************·******·*»***»**»*** *>>>>»

310 320 330 340 350 360

AACCAACACTTGTGCGGTTCCCACTTGGTTGAAGCTTTGTACTTGGTTTGCGGTGAAAGA AsnGlnHisLeuCysGlySerHisLeuValGluAlaLeuTyrLeuValCysGlyGluArg >»»»»»»»»» prekursor insulinyMI3 >»»»»»»»»>

370 380 390 400 410 420

GGTTTCTTCTACACTCCTAAGGCTGCTAAGGGTATTGTCGAACAATGCTGTACCTCCATC GlyPhePheiyrThrProLysAlaAlaLysGlylleYalGluGlnCysCysThrSerlle >»»»»»»»»»»»»»»»»»>»>>>>>»»»>>>»»»»

430 440 450 460 470 lilii TGCTCCTTGTACCAATTGGAAAACTACTGCAACTAGACGCAGCCCGCAGGCTCTAGA

CysSerLeuTyrGlnLeuGluAsniyrCysAsn--»»»>»»»»»»»»»»>»>»

Fig. 2

178 924

Sphl(1) Clal (502)

Odfosforylowany 10 kb Clal-Clal

S.c. MT663 DNA trawienie ogonami 5' CG

Biblioteka, około 10⁵ p APRSc's

Około 1 0θ transformantów drożdżowych selekcjonowano względem inhibitowania trypsyny

V wydzielony pAPRoScl

3b

178 924

20 30 40 5060

I I I I I1

GAATTCATTCAAGAATAGTTCAAACAAGAAGATTACAAACTATCAATTTCATACACAATA

80 90 100 110120

I I I I 1I

TAAACGATTAAAAGAATGAAGGCTGTTTTCTTGGTTTTGTCCTTGATCGGATTCTGCTGG METLvsAlaValPheLeuValLeuSerLeuIleGlyPheCysTrO ------------------------- _spx 3 ------------130 140 150 160 170180

I I 1 I II .JCCAACCATCGAAATTGAAACCAGCTAGCGATATACAAATTCTTTACGACCATGGTGTG AlaGlnProS erLysLeuLys ProAl aSerAspIl eGlnT leLeuTyrAspHi $GlyV$.l

190 200 210 220 230240

I I 1 I II agggagttcggggaaaactatgttcaagagttgatcgataacaccactttggctaacgtc

ArgGluFheGlj/GJ uAsniyrValGlnGl uLeuIIeAspAsnThrThrLeuAlaAsnVal

250 260 270 280 290300

I I I I II

GCCATGGCTGAGAGATTGGAGAAGAGAAGGCCTGATTTCTGTTTGGAACCTCCATACACT

AlaMetAlaGluArgLeuGluLysArgArgProAspPheCysLeuGluProProTyrThr »>»»»»»»»»»»»»»»>>

310 320 330 340 350360

I I I I II ^GTCCATGTAAAGCTAGAATCATCAGATACTTCTACAACGCCAAGGCTGGTTTGTGTCAA JlyProCysLysAlaArgllelleArgTyrPheTyrAsnAlaLysAlaGlyLeuCysGln »»»»»>>>>» Aprot^ning. »»»»»»»»>»»»»»»»»

370 380 390 400 410 420

ACTTTCGTTTACGGTGGCTGCAGAGCTAAGAGAAACAACTTCAAGTCTGCTGAAGACTGC ThrPheValTyrGlyGlyCysArgAlaLysArgAsnAsnPheLysSerAlaGluAspCys »>>»»»>»»>»»>»»»»»»»»»>»»»»»»»»»»

430 440 450

ATGAGAACTTGTGGTGGTGCCTAATCTAGA

METArgThrCy s GlyGlyAla--»»»>»»»»»»»

Fig. 4

178 924

Fig. 5

178 924

20 30 40 5060

I I I 1 II

GGAATTCATTCAAGAATAGTTCAAACAAGAAGATTACAAACTATCAATTTCATACACAAT

80 90 100 110120

ATAAACGACGGTACCAAAATAATGAAACTGAAAACTGTAAGATCTGCGGTCCTTTCGTCA METLys LeuLvsThrVa1 Ar gS er AlaValL euS e r S e r -----------------YAP3_SP-------------130 140 150 160 170180

I I I I II

CTCTTTGCATCTCAGGTCCTTGGCCAACCATCGAAATTGAAACCAGCTAGCGATATACAA ŁeuPheAla$erGlnValLeuGlyGlxiProSerLysLeuLysProAlaSerAspIleGln

190 200 210 220 230240

I I I I II

ATTCTTTACGACCATGGTGTGAGGGAGTTCGGGGAAAACTATGTTCAAGAGTTGATCGAT IleLeuTyrAspHisGlyValArgGluPheGlyGluAsniyrValGlnGluLeuIleAsp

250 260 270 280 290300

I i I II

AACACCACTTTCGCTAACGTCGCCATGGCTGAGAGATTGGAGAAGAGAAGGCCTGATTTC AsnTjirThrLeuAlaAsnValAlaMetAlaGluArgLeuGluLysArgArgProAspPhe »»»»»»

310 320 330 340 350360

I I I 1I

TGTTTGGAACCTCCATACACTGGTCCATGTAAAGCTAGAATCATCAGATACTTCTACAAC ęyŚLeuGluProProiyrThrGlyProCysLysAlaArgllelleArgiyrPheiyrAsn »»»»»>»» Aprotij.nina»»»»»»»»»»»»»»»»»

370 380 390 400 410420

I I I I II

GCCAAGGCTGGTTTGTGTCAAACTTTCGTTTACGGTGGCTGCAGAGCTAAGAGAAACAAC AlaLysAlaGlyLeuCysGlnThrPheValiyrGlyGlyCysArgAlaLysArgAsnAsn »>»>>»»>>»»»»»»»»»»»>»»»»»>»»»»>»»

430 440 450 460470 lilii TTCAAGTCTGCTGAAGACTGCATGAGAACTTGTGGTGGTGCCTAATCTAGA

Ph^LysSerAlaGluAspCysMetArgThrCysGlyGlyAla-->»»»»»»?»>>>»>>»>>»>»>»»>»»

Fig. 6

178 924

Sali Nhel

GTCGACC ATG ATT TAC ACA ATG AAG AAA GTA CAT GCA CTT TGG GCT AGC49

Met He Tyr Thr Met Lys Lys Val His Ala Leu Trp AlaSer

-28 -25 -20-15

GTA TGC CTG CTG CTT AAT CTT GCC CCT GOC CCT CTT AA.T GCT GAT TCT97

Val Cys Leu Leu Leu Asn Leu Ala Pro Ala Pro Leu Asn Ala AspSer

-10 -51

Sad

GAG GAA GAT GAA GAA CAC ACA ATT ATC ACA GAT ACG GAG CTC CCA CCA 145 Glu Glu Asp Glu Glu His Thr Ile Ile Thr Asp Thr Glu Leu Pro Pro 5 1015

Apal

CTG AAA CTT ATG CAT TCA TTT TGT GCA TTC AAG GCG GAT GAT GGG CCC-193

Leu Lys Leu Met His Ser Phe Cys Ala Phe Lys Ala Asp Asp GlyPro

2530

TGT AAA GCA ATC ATG AAA AGA TTT TTC TTC AAT ATT TTC ACT CGA CAG241

Cys Lys Ala Ile Met Lys Arg Phe Phe Phe Asn Ile Phe Thr ArgGin

40 4550

Ciał

TGC GAA GAA TTT ATA TAT GGG GGA TGT GAA GGA AAT CAG AAT CGA TTT289

Cys Glu Glu Phe Ile Tyr Gly Gly Cys Glu Gly Asn Gin Asn ArgPhe

6065

GAA AGT CTG GAA GAG TGC AAA AAA ATG TGT ACA AGA GAT AAT GCA AAC337

Glu Ser Leu Glu Glu Cys Lys Lys Met Cys Thr Arg Asp Asn AlaAsn

7580

AGG ATT ATA AAG ACA ACA CTG CAG CAA GAA AAG CCA GAT TTC TGC TTT385

Arg Ile Ile Lys Thr Thr Leu Gin Gin Glu Lys Pro Asp Phe CysPhe

9095

BamHI

TTG GAA GAG GAT CCT GGA ATA TGT CGA GGT TAT ATT ACC AGG TAT TTT 433 Leu Glu Glu Asp Pro Gly Ile Cys Arg Gly Tyr He Thr Arg Tyr Phe 100 105110

AStuI

TAT AAC AAT CAG ACA AAA CAG TGT GAA AGG TTC AAG TAT GGT GGA TGC481

Tyr Asn Asn Gin Thr Lys G1n Cys Glu Arg Phe Lys Tyr Gly GlyCys

115 120 125130

Xhol

CTG GGC AAT ATG AAC AAT TTT GAG ACA CTC GAG GAA TGC AAG AAC ATT529

Leu Gly Asn Met Asn Asn Phe Glu Thr Leu Glu Glu Cys Lys AsnIle

135 140145

Fig. 7a

178 924

ΚηρΙ

TGT GM GAT GGT CCG AAT GGT TTC CAG GTG GAT AAT TAT GGT ACC CAG577

Cys Glu Asp Gly Pro Asn Gly Phe Gin Val Aso Asn Tyr Gly ThrGin

150 155 ‘160

Hpal

CTC AAT GCT GTT AAC AAC TCC CTG ACT CCG CAA TCA ACC AAG GTT CCC625

Leu Asn Ala Val Asn Asn Ser Leu Thr Pro Gin Ser Thr Lys ValPro

165 170175

EcoRI

AGC CTT TTT GAA TTC CAC GGT CCC TCA TGG TGT CTC ACT CCA GCA GAT 673

Ser Leu Phe Glu Phe His Gly Pro Ser Trp Cys Leu Thr Pro Ala Asp

180 185190

AEcoRV

AGA GGA TTG TGT CGT GCC AAT GAG AAC AGA TTC TAC TAC AAT TCA GTC721

Arg Gly Leu Cys Arg Ala Asn Glu Asn Arg Phe Tyr Tyr Asn SerVal

195 200 205210

BspMII

ATT GGG AAA TGC CGC CCA TTT AAG TAC TCC GGA TGT GGG GGA AAT GAA769

Ile Gly Lys Cys Arg Pro Phe Lys Tyr Ser Gly Cys Gly Gly AsnGlu

215 220225

SpelSphI

AAC AAT TTT ACT AGT AAA CAA GAA TGT CTG AGG GCA TGC AAA AAA GGT 817

Asn Asn Phe Thr Ser Lys Gin Glu Cys Leu Arg Ala Cys Lys Lys Gly

230 235240

Stul

TTC ATC CAA AGA ATA TCA AAA GGA GGC CTA ATT AAA ACC AAA AGA AAA865

Phe Ile Gin Arg Ile Ser Lys Gly Gly Leu Ile Lys Thr Lys ArgLys

245 250255

AGA AAG AAG CAG AGA GTG AAA ATA GCA TAT GAA GAA ATT TTT GTT AAA913

Arg Lys Lys Gin Arg Val Lys He Ala Tyr Glu Glu Ile Phe ValLys

260 265270

Sali

AAT ATG TGAGTCGAC928

Asn Met

275

Fig. 7b

178 924

EcoRI

5361 GAATTCATTCAAGAATAGTTCAAACAAGAAGATTACAAACTATCAATTTCATACACAAT

5420 ATAAACGATTAAAAGAATGAAGGCTGTTTTCTTGGTTTTGTCCTTGATCGGATTCTGCT MetLysAIaVaIPheLeuYaILeuSerLeuIIeGIyPheCys ‘ “Spx3 peptyd sygnałów/

PfIMI BspEI Bell

5479 GGGCCCAACCAGTCACTGGCGATGAATCATCTGTTGAGATTCCGGAAGAGTCTCTGATC T rpAIaGInProValThrGlyAspGIuSerSerValGI u IIeProGIuGIuSerLeu11e ------_{++++++++++++++++++++++++++++}2i2 leader +++++++++++++++

5438 ATCGCTGAAAACACCACTTTGGCTAACGTCGCCATGGCTAAGAGAGATTCTGAGGAA 11eAIaGIuAsnThrThrLeuAIaAsnVaIAIaMetAIaLysArgAspSerGIuGI uKex2

Fig. 8a

178 924

EcoRI ΗIndl11 Bg I 11

5361 GAATTCAAACTAAAAAATGAAGCTTAAAACTGTAAGATCTGCGGTCCTTTCGTCACTCT MetLysLeuLysThrVa IArgSerA ί aVaILeuSerSerLeu ------------Yap3peptyd sygnałowy-------—--AvrII PfIM! BspEI

5420 ttgcatcgcaggtcctaggtcaaccagtcactggcgatgaatcatctgttgagattccg PheAIaSerGInValLeuGlyGInProValThrGlyAspGIuSerSerValGluli ePro -------- — - — - -----ł + + + + * + + + * + + *+ 212 terier* ⁺ + ⁺ + * + + + + + + + *·*

Bel I Ncol

5479 GAAGAGTCTCTGATCATCGCTGAAAACACCACTTTGGCTAACGTCGCCATGGCTAAGAG GluGIuSerLeullei IeAIaGIuAsnThrThrLeuAIaAsnVaIAIaMetAIaLys i_ł++<._ł. ₊ **_{tł + 4 + łt+}4_t++ + <. _{+ +} + + + ₊ + ł + ₊ + + +_{+ +} + _{+++ +} + _{+ +} *_{ł+ +} + _łłłł. _{+ ł}

5538 AGATTCTGAGGAA—

ArgAspSerGIuGIu-**+<-TFPI -Fig. 8b

178 924

Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 70 egz.

Cena 6.00 zł.

Fig. 9

Claims

Zastrzeżenia patentowe

1. Konstrukt DNA, znamienny tym, że zawiera sekwencję

5'-P-SP-(LP)_n-PS-HP-3' w której

P oznacza sekwencję promotora,

SP oznacza sekwencję DNA koduj ącąpeptyd sygnałowy drożdżowej proteazy asparaginowej 3 (YAP3),

LP oznacza sekwencję DNA kodującą peptyd liderowy, n równe jest 0 lub 1

PS oznacza sekwencję DNA kodującąpeptyd określający miejsce obróbki w drożdżach, a HP oznacza sekwencję DNA kodującąpolipeptyd heterologiczny dla wybranego organizmu gospodarza.
2. Konstrukt DNA według zastrz. 1, znamienny tym, że sekwencja promotora wybrana jest spośród promotorów Saccharomyces cerevisiae MFal, TPI, ADH, BARI i PGK oraz promotora Schizosaccharomyces pombe ADH.
3. Konstrukt DNA według zastrz. 1, znamienny tym, że peptyd sygnałowy YAP3 j est kodowany przez sekwencję DNA:

AGT AAA CTG AAA ACT GTA AGA TCT GCG GTC CTT TCG TCA CTC TTT GCA TCT CAG GTC CTT GGC (Seq. ID nr 1), lub jej odpowiedniąmodyfikację koduj ącąpeptyd o wysokim stopniu homologiczności w stosunku do peptydu sygnałowego YAP3.
4. Konstrukt DNA według zastrz. 1, znamienny tym, że n równe jest 1.
5. Konstrukt DNA według zastrz. 1, znamienny tym, że peptyd liderowy stanowi drożdżowy peptyd liderowy MFal lub syntetyczny peptyd liderowy.
6. Konstrukt DNA według zastrz. 1, znamienny tym, że PS stanowi sekwencja DNA kodująca Lys-Arg, Arg-Lys, Lys-Lys, Arg-Arg lub Ile-Glu-Gly-Arg.
7. Konstrukt DNA według zastrz. 1, znamienny tym, że heterologiczny polipeptyd wybrany jest z grupy obejmującej aprotyninę, inhibitor drogi czynnika tkankowego lub inne inhibitory proteaz, insulinę lub prekursory insuliny, ludzki lub bydlęcy hormon wzrostu, interleukinę, glukagon, glukagono-podobny peptyd 1, aktywator plazminogenu tkankowego, czynnik transformacji wzrostu a lub β, czynnik wzrostu pochodzący z płytek krwi, enzymy, albo ich funkcyjne analogi.
8. Konstrukt DNA według zastrz. 1, znamienny tym, że zawiera ponadto sekwencję terminacji transkrypcji.
9. Konstrukt DNA według zastrz. 8, znamienny tym, że sekwencję terminacji transkrypcji stanowi terminator TPI.
10. Zrekombinowany wektor ekspresji zawierający konstrukt DNA obejmujący sekwencję

5'-P-SP-(LP)_n-PS-HP-3' w której

P oznacza sekwencję promotora,

SP oznacza sekwencję DNA kodującąpeptyd sygnałowy drożdżowej proteazy asparaginowej 3 (YAP3),

LP oznacza sekwencję DNA kodującąpeptyd liderowy,

178 924 n równe jest O lub 1

PS oznacza sekwencję DNA kodującąpeptyd określający miejsce obróbki w drożdżach, a

HP oznacza sekwencję DNA kodującąpolipeptyd heterologiczny dla wybranego organizmu gospodarza.
11. Zrekombinowany wektor według zastrz. 10, znamienny tym, że sekwencja promotora wybrana jest spośród promotorów Saccharomyces cerevisiae MFal, TPI, ADH, BARI i PGK oraz promotora Schizosaccharomyces pombe ADH.
12. Zrekombinowany wektor według zastrz. 10, znamienny tym, że peptyd sygnałowy YAP3 jest kodowany przez sekwencję:

AGT AAA CTG AAA ACT GTA AGA TCT GCG GTC CTT TCG TCA CTC TTT GCA TCT CAG GTC CTT GGC (Seq. ID nr 1), lub jej odpowiednią modyfikację kodującąpeptyd o wysokim stopniu homologiczności w stosunku do peptydu sygnałowego YAP3.
13. Zrekombinowany wektor według zastrz. 10, znamienny tym, że n równe jest 1.
14. Zrekombinowany wektor według zastrz. 10, znamienny tym, że peptyd liderowy stanowi drożdżowy peptyd liderowy MFal łub syntetyczny peptyd liderowy.
15. Zrekombinowany wektor według zastrz. 10, znamienny tym, że PS stanowi sekwencja DNA kodująca Lys-Arg, Arg-Lys, Lys-Lys, Arg-Arg lub Ile-Glu-Gly-Arg.
16. Zrekombinowany wektor według zastrz. 10, znamienny tym, że heterologiczny polipeptyd wybrany jest z grupy obejmującej aprotyninę, inhibitor drogi czynnika tkankowego lub inne inhibitory proteaz, insulinę lub prekursory insuliny, ludzki lub bydlęcy hormon wzrostu, interleukinę, glukagon, glukagono-podobny peptyd 1, aktywator plazminogenu tkankowego, czynnik transformacji wzrostu a lub β, czynnik wzrostu pochodzący z płytek krwi, enzymy, albo też jego funkcyjną pochodną.
17. Zrekombinowany wektor według zastrz. 10, znamienny tym, że zawiera ponadto sekwencję terminacji transkrypcji.
18. Zrekombinowany wektor według zastrz. 17, znamienny tym, że sekwencję terminacji transkrypcji stanowi terminator TPI.
19. Komórka transformowana wektorem zawierającym konstrukt DNA obejmujący sekwencję

5'-P-SP-(LP)_n-PS-HP-3' w której

P oznacza sekwencję promotora,

SP oznacza sekwencję DNA kodującąpeptyd sygnałowy drożdżowej proteazy asparaginowej 3 (YAP3),

LP oznacza sekwencję DNA kodującąpeptyd liderowy, n równe jest 0 lub 1

PS oznacza sekwencję DNA kodującąpeptyd określający miejsce obróbki w drożdżach, a

HP oznacza sekwencję DNA kodującąpolipeptyd heterologiczny dla wybranego organizmu gospodarza.
20. Komórka według zastrz. 19, znamienna tym, że sekwencja promotora wybrana jest spośród promotorów Saccharomyces cerevisiae MFal, TPI, ADH, BARI i PGK oraz promotora Schizosaccharomyces pombe ADH.
21. Komórka według zastrz. 19, znamienna tym, że peptyd sygnałowy YAP3 jest kodowany przez sekwencję:

AGT AAA CTG AAA ACT GTA AGA TCT GCG GTC CTT TCG TCA CTC TTT GCA TCT CAG GTC CTT GGC (Seq. ID nr 1), lub jej odpowiednią modyfikację kodującąpeptyd o wysokim stopniu homologiczności w stosunku do peptydu sygnałowego YAP3.
22. Komórka według zastrz. 19, znamienna tym, że n równe jest 1.

178 924
23. Komórka według zastrz. 19, znamienna tym, że peptyd liderowy stanowi drożdżowy peptyd liderowy MFal lub syntetyczny peptyd liderowy.
24. Komórka według zastrz. 19, znamienna tym, że PS stanowi sekwencja DNA kodująca Lys-Arg, Arg-Lys, Lys-Lys, Arg-Arg lub Ile-Glu-Gly-Arg.
25. Komórka według zastrz. 19, znamienna tym, że hetero logiczny polipeptyd wybrany jest z grupy obejmującej aprotyninę, inhibitor drogi czynnika tkankowego lub inne inhibitory proteaz, insulinę lub prekursory insuliny, ludzki lub bydlęcy hormon wzrostu, interleukinę, glukagon, glukagono-podobny peptyd 1, aktywator plazminogenu tkankowego, czynnik transformacji wzrostu a lub β, czynnik wzrostu pochodzący z płytek krwi, enzymy, albo też jego funkcyjną pochodną.
26. Komórka według zastrz. 19, znamienna tym, że zawiera ponadto sekwencję terminacji transkrypcji.
27. Komórka według zastrz. 19, znamienna tym, że sekwencję terminacji transkrypcji stanowi terminator TPI.
28. Komórka według zastrz. 19, znamienna tym, że stanowi komórkę grzybową.
29. Komórka według zastrz. 28, znamienna tym, że stanowi komórkę drożdży.
30. Komórka według zastrz. 29, znamienna tym, że stanowi komórkę Saccharomyces, Schizosaccharomyces, Kluyveromyces, Hansenula lub Yarrowia.
31. Komórka według zastrz. 30, znamienna tym, że stanowi komórkę Saccharomyces cerevisiae lub Schizosaccharomyces pombe.
32. Sposób wytwarzania heterologicznego polipeptydu, znamienny tym, że hoduje się komórkę zdolną do ekspresji heterologicznego polipeptydu, transformowaną konstruktem DNA zawierającym sekwencję

5'-P-SP-(LP)_n-PS-HP-3' w której

P oznacza sekwencję promotora,

SP oznacza sekwencję DNA koduj ącąpeptyd sygnałowy drożdżowej proteazy asparaginowej 3 (YAP3),

LP oznacza sekwencję DNA kodującą peptyd liderowy, n równe jest 0 lub 1

PS oznacza sekwencję DNA kodującąpeptyd określający miejsce obróbki w drożdżach, a

HP oznacza sekwencję DNA kodującąpolipeptyd heterologiczny dla wybranego organizmu gospodarza, w odpowiedniej pożywce, tak aby osiągnąć ekspresję i wydzielenie heterologicznego polipeptydu, po czym heterologiczny polipeptyd odzyskuje się z pożywki.
33. Sposób według zastrz. 32, znamienny tym, że stosuje się sekwencję promotora wybraną spośród promotorów Saccharomyces cerevisiae MFal, TPI, ADH, BARI i PGK oraz promotora Schizosaccharomyces pombe ADH.
34. Sposób według zastrz. 32, znamienny tym, że stosuje się peptyd sygnałowy YAP3 kodowany przez sekwencję DNA:

AGT AAA CTG AAA ACT GTA AGA TCT GCG GTC CTT TCG TCA CTC TTT GCA TCT CAG GTC CTT GGC (Seq. ID nr 1), lub jej odpowiednią modyfikację kodującąpeptyd o wysokim stopniu homologiczności w stosunku do peptydu sygnałowego YAP3.
35. Sposób według zastrz. 32, znamienny tym, że n równe jest 1.
36. Sposób według zastrz. 32, znamienny tym, że stosuje się peptyd liderowy stanowiący drożdżowy peptyd liderowy MFal lub syntetyczny peptyd liderowy.
37. Sposób według zastrz. 32, znamienny tym, że PS stanowi sekwencja DNA kodująca Lys-Arg, Arg-Lys, Lys-Lys, Arg-Arg lub Ile-Glu-Gly-Arg.
38. Sposób według zastrz. 32, znamienny tym, że stosuje się heterologiczny polipeptyd wybrany z grupy obejmującej aprotyninę, inhibitor drogi czynnika tkankowego lub inne inhibitory proteaz, insulinę lub prekursory insuliny, ludzki lub bydlęcy hormon wzrostu, interleukinę,

178 924 glukagon, glukagono-podobny peptyd 1, aktywator plazminogenu tkankowego, czynnik transformacji wzrostu a lub β, czynnik wzrostu pochodzący z płytek krwi, enzymy, albo też jego funkcyjną pochodną.
39. Sposób według zastrz. 32, znamienny tym, że stosuje się sekwencję terminacji transkrypcji.
40. Sposób według zastrz. 39, znamienny tym, że jako sekwencję terminacji transkrypcji stosuje się terminator TPI.

* * *