PL233560B1 - Sposób otrzymywania insuliny lub analogu insuliny z prekursora rekombinowanego białka - Google Patents

Description

Opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku jest sposób otrzymywania rekombinowanego białka z prekursora, korzystnie insulin ssaczych, w tym insulin ludzkich i ich analogów, na drodze wysoce specyficznej proteolizy w warunkach pozakomórkowych (in vitro) z udziałem proteazy serynowej innej niż trypsyna lub proteazy serynowej innej niż trypsyna i karboksypeptydaza B. Ujawniony wynalazek znajduje zastosowanie w biotechnologii oraz w przemyśle farmaceutycznym.

Na całym świecie na cukrzycę cierpi ponad 382 miliony osób, z czego 56 milionów to mieszkańcy Europy. Według prognoz, prowadzonych przez międzynarodowe biura statystyczne, liczba zachorowań na świecie w 2035 roku wzrośnie do ok. 592 milionów. Większość chorych na cukrzycę jest w wieku 40-59 lat i w 80% zamieszkuje kraje nisko- i średnio-rozwinięte. W roku 2013 z powodu tej choroby odnotowano 5,1 miliona zgonów na całym świecie, co stanowi 11% wzrost w stosunku do danych z 2011 roku. Przykładowo, według najbardziej aktualnych statystyk National Vital Statistics Reports, w samych Stanach Zjednoczonych zmarło na nią w roku 2010 ponad 69 tysięcy osób. Cukrzyca jest chorobą wywołaną przez zaburzenia pracy trzustki przejawiające się zbyt niską produkcją hormonu regulującego poziom cukru we krwi zwanego insuliną (cukrzyca typu I zwana insulinozależną), lub brakiem zdolności do wykorzystania przez organizm wyprodukowanej insuliny (cukrzyca typu II). Według WHO w 2030 roku cukrzyca będzie siódmą przyczyną śmierci na świecie. Powyższe dane epidemiologiczne i techniczne jednoznacznie wskazują jak istotny jest postęp w rozwoju rekombinowanych białek terapeutycznych, bez których terapie chorób takich jak cukrzyca byłyby mniej efektywne.

Aby zrozumieć korzyści jakie wynikają z przedmiotowego wynalazku, należy prześledzić dotychczas dostępne metody produkcji insulin i ich analogów. Tradycyjna technologia produkcji insuliny bazowała na izolowaniu tego hormonu z tkanek zwierzęcych, a następnie oczyszczaniu chromatograficznym. W celu inaktywacji i usunięcia trypsyny, enzymu który mógł degradować insulinę, trzustki bydlęce lub świńskie cięto, poddawano działaniu etanolu i zakwaszano do pH 2 przy użyciu HCI lub H2SO4. Następnie, w celu neutralizacji, dodawano węglanu wapnia, po czym roztwór zagęszczano w próżni w niskich temperaturach, a następnie wytrącano solą, rozpuszczano w wodzie i ponownie wytrącano przez ustalenie pH do punktu izoelektrycznego insuliny.

Potrzeba produkcji insuliny typowo ludzkiej spowodowała rozwój kilku różnych technologii jej uzyskiwania. Pierwszym podejściem była ekstrakcja hormonu z ludzkiej trzustki, ale w praktyce możliwe to jest tylko na skalę analityczną. Inną propozycją była synteza chemiczna, której wadą jest zdecydowanie konieczność łączenia dwóch oddzielnie syntetyzowanych łańcuchów insuliny i zbyt wysoki koszt. Ostatecznie sprawdziły się dwa kolejne podejścia, czyli konwersja insuliny świńskiej do ludzkiej oraz uzyskiwanie insuliny rekombinowanej. Technologia produkcji insuliny ludzkiej na zasadzie konwersji, w skali komercyjnej została rozwinięta przez Novo Nordisk i polegała na podstawieniu alaniny w pozycji B-30 występującej w insulinie świńskiej na treoninę w pięciu krokach. Na początku insulinę ekstrahuje się z zamrożonych świńskich trzustek, następnie oczyszczoną świńską insulinę konwertuje się w ludzką w medium zawierającym niewielką ilość wody i trypsyny oraz duże ilości rozpuszczalników organicznych i estrów treoniny. Trypsyna hydrolizuje insulinę pomiędzy pozycjami Lys29-AlaB30 jednocześnie katalizuje reakcję, w której ester treoniny zastępuje alaninę w pozycji B30. Po reakcji enzymatycznej przeprowadza się oczyszczanie chromatograficzne w celu usunięcia proinsuliny oraz innych reagentów, a następnie wykonuje się formulację i porcjowanie produktu w warunkach sterylnych. Obecnie jednak, najbardziej powszechnym sposobem na uzyskiwanie insulin jest wykorzystanie technologii rekombinowanego DNA. Pionierami w tej dziedzinie były firmy Eli Lilly and Co. (Indianapolis) i Genentech (San Francisco), które wspólnie rozwijały pierwszą rekombinowaną insulinę. W roku 1978 uzyskano ekspresję hormonu w komórkach Escherichia coli K12, używając wektora ekspresyjnego pBR322, z sukcesem zwiększono skalę procesu, a w roku 1982 uzyskano dopuszczenie do obrotu. Ten pierwszy proces opierał się na uzyskiwaniu łańcucha A i B jako białek fuzyjnych z β-galaktozydazą w oddzielnych kulturach bakteryjnych. Produkty te były wewnątrzkomórkowe, występowały w cytoplazmie jako ciałka inkluzyjne. Cząsteczki białek fuzyjnych po odzyskaniu z ciałek inkluzyjnych były poddawane trawieniu CNBr, które zachodziło przy metioninie oddzielającej β-galaktozydazę od łańcucha insuliny, a następnie oczyszczano. Kolejnym krokiem było mieszanie łańcucha A i B w stosunku 2:1 (formy S-sulfonowane) w obecności merkaptanu. Po 24 godzinach wydajność syntezy insuliny wynosiła około 60% w odniesieniu do ilości łańcucha B. Dużą wadą tej technologii było ograniczenie wydajności uzyskiwania samych łańcuchów A i B (o długości odpowiednio 21 lub 30 aminokwasów) spowodowane dużą dysproporcją masy w stosunku do połączonej z nimi β-galaktozydazy (około 1000 aminokwasów). Dalszy rozwój

PL 233 560 B1 technologii produkcji insuliny przebiegał w kierunku podwyższania wydajności produkcji łańcuchów A i B poprzez skracanie peptydów fuzyjnych, np. zamiana operonu lac (system β-galaktozydazy) na tryptofanowy (Trp), w którym białko fuzyjne miało już tylko około 190 aminokwasów.

Najnowszym podejściem technologicznym jest uzyskiwanie rekombinowanej proinsuliny, zbudowanej z peptydów A, B i C z jednego klonu komórkowego, a następnie obróbka enzymatyczna powodująca przekształcenie proinsuliny w insulinę. Płynie z niego wiele korzyści, wystarczy jeden proces fermentacyjny, a następnie jeden proces oczyszczania białka po fermentacji zamiast dwóch oddzielnych dla łańcuchów A i B. To podejście zostało wykorzystane do produkcji w skali przemysłowej po raz pierwszy w roku 1986.

Obróbka enzymatyczna najczęściej polega na użyciu dwóch enzymów, trypsyny i karboksypeptydazy B. T rypsyna jest proteazą serynową tnącą wiązania peptydowe od strony C-końca aminokwasów dodatnio naładowanych (argininy i lizyny) jeżeli następnym aminokwasem nie jest prolina. W przypadku proinsuliny ludzkiej, trypsyna przerywa wiązanie peptydowe pomiędzy lizyną i argininą na C-końcu rekombinowanej proinsuliny, karboksypeptydaza B odcina aminokwasy zasadowe na C-końcu, które powstały po zadziałaniu trypsyny. Wadą tego podejścia jest fakt, iż wynikiem cięcia będą też różne pochodne insuliny, stanowiące zanieczyszczenia, A21-desamido insulina, des-treonino-(B30) insulina, arginylo-(A0) insulina i diarginylo-(B31,B32) insulina.

Najbardziej istotnymi z tych zanieczyszczeń są des-amido insulina oraz des-treonino insulina (wynik eliminacji Thr(B30) przez trypsynę). Dużym problemem jest to, że des-treonino insulina posiada taki sam ładunek netto jak insulina. Jedyną różnicą są niewielkie różnice w hydrofobowości, zatem usuwanie tego zanieczyszczenia jest możliwe w kilku krokach chromatograficznych. Możliwością minimalizacji tego typu zanieczyszczeń jest blokowanie powstawania des-treonino insuliny przez cytrakonylację ale stanowiłoby to dodatkowy etap w procesie.

Ostatnio coraz większe znaczenie kliniczne zyskują analogi insuliny dające różne dodatkowe korzyści kliniczne w porównaniu do zwykłej insuliny ludzkiej. Najważniejsze z rynkowego punktu widzenia to Humalog - nazwa substancji czynnej insulin lispro (Eli Lilly), który pojawił się na rynku w roku 1996, NovoMix - z substancją czynną insulin aspart (NovoNordisk, 1999) oraz Lantus - z substancją czynną insulin glargine (Sanofi Aventis, 2000). Insulin lispro to analog o przyspieszonym działaniu, charakteryzujący się zamienionymi kolejnością aminokwasami w pozycjach B28 (prolina) i B29 (lizyna). Aspart charakteryzuje się proliną B28 zastąpioną kwasem asparaginowym, również jest analogiem o przyspieszonym działaniu. Insulin glargine posiada zamienioną asparaginę A21 na glicynę, oraz łańcuch B wydłużony o dwie argininy. Jego dużą zaletą jest wydłużone działanie, co przekłada się na podwyższenie komfortu pacjenta przez redukcję liczby iniekcji do jednej dziennie.

Analogi insuliny uzyskuje się z wykorzystaniem technologii rekombinowanego DNA. Zamiany kolejności aminokwasów, bądź substytucje nie stanowią większego problemu, wystarczy prosta inżynieria sekwencji, pozostała część procesu może pozostać bez zmian. Zdecydowanie trudniejsze jest uzyskiwanie analogów z dodanymi aminokwasami na końcach, a w szczególności aminokwasami zasadowymi, np. Insulinum Glargine. W tym przypadku konieczne jest użycie trypsyny, a następnie dodatkowe modyfikacje chemiczne i dosyntetyzowanie argininy.

W zgłoszeniu P 391 975 ujawniono zastosowanie innych enzymów niż trypsyna i karboksypeptydaza B w celu selektywnego trawienia proinsuliny i prekursorów analogów insuliny ludzkiej. Ujawniony proces uzyskiwania białek z ich prekursorów, w tym insulin i ich analogów z użyciem enzymów innych niż trypsyna i karboksypeptydaza B, polegał na wprowadzaniu do prekursora pojedynczych bądź więcej aminokwasów rozpoznawanych przez proteazy/peptydazy, a następnie wykorzystanie tych enzymów do usunięcia zbędnych fragmentów i uformowanie prawidłowego białka docelowego. Zastosowanie enterokinazy i endoproteinzay Asp-N w przypadku konwersji proinsuliny lub analogu proinsuliny do, odpowiednio, insuliny lub analogu insuliny umożliwia uzyskiwanie cząsteczki insuliny lub jej analogu. Enterokinaza rozpoznaje z wysoką specyficznością sekwencję aminokwasową (DDDDK), która została dla niej wprowadzona pomiędzy C' koniec C-peptydu a łańcuch A. Przy pomocy endoproteinazy Asp-N i wprowadzeniu dodatkowego aminokwasu (D = Asp), rozpoznawanego przez proteazę, następowało odseparowanie łańcucha B insuliny od N' końca C-peptydu. Hydroliza wiązania peptydowego w tym miejscu zachodzi specyficznie.

Niniejszy wynalazek umożliwia jednak jeszcze bardziej wydajną proteolizę niż opartą o użycie endoproteinazy Asp-N enterokinazy. Endoproteinaza Asp-N (zarówno ta z Flavobacterium meningosepticum jak i z Pseudomonas fragi) jest enzymem, który hydrolizuje wiązania peptydowe, poprzedzające takie aminokwasy jak: C = Cys, E = Glu, F = Phe, Y = Tyr. Wszystkie z wymienionych aminokwasów

PL 233 560 B1 są obecne w sekwencji proinsulin lub analogach proinsulin. Stąd, w wyniku aktywności endoproteinazy Asp-N powstaje szereg produktów niespecyficznych.

Jak powszechnie wiadomo, cząsteczki białek są bardzo zróżnicowane zarówno pod względem budowy jak i właściwości. Pojęcie uniwersalności procesu nie jest właściwe w kontekście uzyskiwania leków biotechnologicznych. Unikalna sekwencja aminokwasowa każdego białka nadaje mu charakterystyczne cechy, dzięki którym możliwe jest zaprojektowanie procesu jego uzyskiwania, począwszy od etapu fermentacji po etap ostatecznej puryfikacji. Nierzadko, możliwe jest wykorzystanie niektórych etapów procesu do uzyskiwania białek o podobnych właściwościach. Nie zdarza się jednak by zastosowanie wszystkich kroków procesowych mogło w pełni i bez dodatkowych modyfikacji zostać wykorzystywane podczas uzyskiwania innego produktu białkowego. Nawet niewielka zmiana sekwencji aminokwasowej może wpłynąć pozytywnie lub negatywnie na właściwości fizyko-chemiczne białka i tym samym na np. wydajność jego oczyszczania. Stąd, kolejną korzyścią płynącą z zastosowania niniejszego wynalazku jest również ograniczenie zakresu modyfikacji sekwencji natywnych. Projekt sekwencji aminokwasowej cząsteczki proinsuliny (SEQ. ID. Nr 4) polegał na wprowadzeniu dodatkowych aminokwasów, rozpoznawanych przez proteazy: Asp-N i enterokinazę. Wydłużono tym samym C-peptyd aż o sześć aminokwasów, z czego pięć stanowiły aminokwasy naładowane ujemnie, zmieniło to znacznie ładunek cząsteczki białka. Kluczową rolą C-peptydu jest połączenie łańcucha A insuliny z łańcuchem B oraz umożliwienie tworzenia mostków disiarczkowych pomiędzy łańcuchami. C-peptyd jest potwierdzonym przykładem wewnątrz cząsteczkowego „opiekuna” fałdowania proinsuliny. Sekwencje aminokwasowe C-peptydów proinsulin różnią się w zależności od pochodzenia gatunkowego. Niemniej jednak konserwatywne fragmenty C-peptydu są istotne dla zachowania prawidłowej struktury i rozpuszczalności prekursora niezależnie od gatunku. Należą do nich między innymi N' końcowy region kwasowy oraz C' końcowy pentapeptyd. Mutacja punktowa, któregokolwiek z aminokwasów z N' końca (EAED), znacząco wpływa na obniżenie wydajności fałdowania białka in vitro w stosunku do proinsuliny, w której sekwencja C-peptydu nie była modyfikowana. Stąd, za obniżenie wydajności fałdowania białka może być odpowiedzialna zmiana wartości punktu izoelektrycznego białka. W przypadku cząsteczki proinsuliny P_MabionHI_1 mamy zatem do czynienia z ingerencją w wartość pl białka. Z analizy sekwencji proinsulin różnych gatunków ssaków, w tym ludzkiej, wynika że maksymalna ilość aminokwasów kwasowych, obecnych w C-peptydzie, to pięć. Konsekwencją zwiększenia zawartości kwasowych aminokwasów do dziesięciu jest obniżenie efektywności tworzenia mostków disiarczkowych. Potwierdzeniem tego mogą być wyniki uzyskane na podstawie analizy proteolizy proinsuliny P_MabionHI_1, gdzie przeważającą ilość produktów trawienia stanowiły wolne łańcuchy A i B w stosunku do właściwych cząsteczek insuliny. W opisywanym wynalazku wykorzystano natywną sekwencję cząsteczki proinsuliny ludzkiej lub analogów proinsuliny ludzkiej. Brak ingerencji w jakościowy i ilościowy skład aminokwasowy C-peptydu zapewnia uzyskanie możliwie najwyższej wydajności składania mostków disiarczkowych podczas fermentacji.

W stanie techniki znane jest zastosowanie proteazy serynowej Kex2, naturalnie występującej m.in. w drożdżach, do otrzymywania insuliny. Ze względu na lokalizację komórkową oraz charakterystyczną specyficzność trawienia, proteaza Kex2 jest zaangażowana w proteolityczną obróbkę prekursorów białek komórki drożdży, np. polegającą na konwersji pro-czynnika a i pro-toksyny do aktywnych cząsteczek. Procesowanie prekursorów białek drożdżowych odbywa się w aparacie Golgiego, w którego błonie zlokalizowana jest proteaza Kex2. Oprócz endogennych białek drożdżowych, proteaza wydajnie konwertuje białka rekombinowane, powstające na drodze ekspresji genu wprowadzonego do komórki zewnętrznie w postaci konstruktu genetycznego - cDNA/wektor ekspresyjny. Takim białkiem jest np. rekombinowana proalbumina. Wysoka specyficzność Kex2 polega na trawieniu białka, w którego sekwencji obecne są dwa specyficznie rozpoznawane aminokwasy (w zależności od rodzaju pary aminokwasów Kex2 wykazuje różną wydajność trawienia), które rozpoznaje i dokładnie za drugim aminokwasem z danej pary od strony C końca dokonuje hydrolizy wiązania peptydowego.

Drożdże są bardzo często wykorzystywane do produkcji białek rekombinowanych. Proces polega w większości przypadków na sekrecji białka do medium komórkowego. Mechanizm sekrecji jest kilkuetapowy i wymaga odpowiedniego przygotowania docelowej cząsteczki białka rekombinowanego. Standardową modyfikacją jest zastosowanie sekwencji lidera (czynnika a, produkt genu MFa1). Czynnik a jest powszechnie stosowany jako dodatek (pełniący funkcję peptydu sygnalnego) do białek produkowanych w drożdżach, a następnie kierowanych do medium. Proinsulina w formie natywnej nie ulega łatwej ekspresji w Saccharomyces cerevisae. Komórki drożdżowe nie posiadają cech charakterystycznych dla ssaczych komórek β, czyli dużej ilości szorstkiego retikulum endoplazmatycznego, wysokiego stężenia

PL 233 560 B1 jonów cynku i pęcherzyków magazynowych, służących do akumulacji insuliny w postaci pół-krystalicznej. Wszystko to jest niezbędne do właściwego i wydajnego wydzielania insuliny. W związku z tym, przy użyciu systemu drożdżowego cząsteczkę proinsuliny należy wyjściowo poddać niezbędnym modyfikacjom, tak aby możliwa była wydajna jej synteza i produkcja. Nie jest to konieczne w przypadku zastosowania systemu ekspresyjnego innego niż drożdżowy, tak jak w opisie proponowanego wynalazku. Zarówno cząsteczka insuliny, jak i jej prekursora, mają charakter hydrofobowy, a co za tym idzie bardzo łatwo ulegają agregacji w neutralnym pH. Glikozylacja cząsteczki uzyskiwanej w tym systemie ekspresji jest zatem istotna do tworzenia poprawnej konformacyjnie proinsuliny oraz zajścia prawidłowej biosyntezy. Jest to rodzaj modyfikacji post-translacyjnej, naturalnie występującej w komórkach drożdży. Istotne jest jednak miejsce wspomnianej glikozylacji w przypadku cząsteczek proinsuliny. Stąd ważną zmianą wprowadzaną do białek rekombinowanych jest, w przypadku używania systemów drożdżowych, dodanie sekwencji liderowej - czynnika a do sekwencji proinsuliny. Ulega on glikozylacji w trzech miejscach, nadając całości prekursora hydrofilowy charakter i chroniąc ją tym samym przed agregacją. Dodatkowo dodanie czynnika a do cząsteczki proinsuliny umożliwia jej swobodne przekraczanie granic poszczególnych kompartmentów komórki, zaangażowanych w procesowanie białek. Nie jest to jednak wystarczająco skuteczna modyfikacja do osiągnięcia maksymalnej wydajności produkcji białka o właściwej konformacji. Konieczna jest dodatkowo zmiana sekwencji samej cząsteczki proinsuliny. Często znacznemu skróceniu poddaje się sekwencję C-peptydu (nawet do trzech aminokwasów, np. AAK). Kluczowa jest również delecja treoniny z łańcucha B (ThrB30), która może ulec glikozylacji w drożdżach. W tym konkretnym przypadku glikozylacja nie jest pożądana, ponieważ cząsteczka insuliny w ostatecznej formulacji nie posiada żadnych modyfikowanych aminokwasów. Wszystkie te cząsteczki insulin y, posiadające reszty cukrowe związane z ThrB30, stanowiłyby zatem produkt uboczny fermentacji narażając całość procesu na straty. Finalnie uzyskuje się proinsulinę, ulegającą ekspresji na zadowalającym poziomie przy zachowaniu wysokiej wydajności formowania mostków disiarczkowych. Fragment umożliwiający sekrecję łączy się z właściwą cząsteczką proinsuliny za pomocą pary aminokwasów KR/RR. Umożliwia to wykorzystanie aktywności proteazy Kex2, naturalnie występującej w aparacie Golgiego. Kex2 rozpoznaje specyficzne dla swojej aktywności proteolitycznej miejsce pomiędzy peptydem sygnalnym a łańcuchem B (KR/RR). Proinsulina następnie ulega wydajnej sekrecji poza komórkę drożdży. Podsumowując, w powyższym procesie fermentacji uzyskuje się prekursor insuliny_Thr30B^- (czyli prekursor desThr30B insuliny). Następnie prekursor ten poddaje się proteolizie z udziałem trypsyny, której celem jest usunięcie sekwencji łączącej łańcuch A i B. Dodatkowo stosuje się dwustopniowy etap jakim jest odtworzenie brakującej treoniny (Thr30B^-). Wstępnie ma miejsce reakcja desThr30B insuliny z estrem treoniny, a następnie usunięcie estru na drodze chemicznej hydrolizy. Produkcja proinsuliny w takiej postaci jest przedmiotem wynalazków zgłoszeń patentowych US 4 916 212, WO 95/02059 oraz WO 90/10075. Wszystkie wymienione modyfikacje, niezbędne do zastosowania w celu wydajnego do wytwarzania proinsuliny i insuliny w drożdżach, nie są konieczne w przypadku zastosowania innych systemów ekspresyjnych, np. bakteryjnych.

Proteaza Kex2 może być również wykorzystana do pełnej konwersji proinsuliny ludzkiej lub analogu proinsuliny ludzkiej do insuliny lub jej analogu w warunkach komórki drożdżowej, jak to wynika z opisu zgłoszenia patentowego US 2011/0111460 A1. Sekwencja C-peptydu została zaprojektowana tak, aby jego długość była optymalna do osiągnięcia maksymalnej wydajności fałdowania. Przede wszystkim jednak, sekwencja ta posiadała dwa miejsca (pary aminokwasów KR lub RR) specyficznie rozpoznawane przez proteazę Kex2, umożliwiające usunięcie C-peptydu. Istotą tej technologii jest sekrecja cząsteczek insuliny ludzkiej lub jej analogów do medium hodowlanego. Do osiągnięcia tego założenia stosuje się drugą, naturalnie występującą w drożdżach proteazę, Kex1. Usuwa ona specyficznie z C' końca łańcucha B dwa aminokwasy pozostałe po trawieniu Kex2. Zaproponowane rozwiązanie umożliwia otrzymywanie insuliny oraz analogów insuliny w formie ostatecznej, nie wymagającej kroku proteolizy w warunkach in vitro. Głównym zagrożeniem, wynikającym z zastosowania takiego podejścia technologicznego jest niska wydajność procesu, co jest bezpośrednio związane ze specyfiką komórek drożdżowych. Gospodarz ten, przede wszystkim ze względu na panujące w jego komórce warunki pH, nie jest zdolny do utrzymywania monomerycznej formy cząsteczek insulin. Ponadto zastosowanie gospodarza drożdżowego do produkcji białek rekombinowanych niesie ze sobą, wspomniane wcześniej, zagrożenie związane z występowaniem modyfikacji postranslacyjnej, jaką jest glikozylacja. Obecne w Saccharomyces cerevisae mannozylotransferazy dołączają fragmenty oligosacharydowe do hydroksylowych reszt seryny i treoniny, zarówno białek endogennych jak i rekombinowanych. Stąd część cząsteczek proinsuliny, ulegająca sekrecji do medium komórkowego, jest glikozylowana. Rozwiązania

PL 233 560 B1 zaproponowane i opisane w US 4 916 212, WO 95/02059, WO 90/10075 oraz US 2011/0111460A1 nie odnoszą się do kwestii związanej z zanieczyszczeniem puli cząsteczek proinsulinowych lub insulin owych glikozylowanymi pochodnymi tych cząsteczek. W przypadku insulin oraz ich analogów glikozylowane pochodne stanowią istotne zanieczyszczenie związane z produktem, a co z tym związane znaczne trudności w procesie. Po pierwsze występują straty związane z koniecznością odczyszczania form glikozylowanych, po drugie samo oczyszczanie jest skomplikowane i kosztowne. Komórka drożdżowa nie jest zatem gospodarzem idealnym do procesu produkcji insulin lub analogów insulin, zarówno jeśli chodzi o ilość dodatkowych etapów procesu, polegających na znoszeniu sztucznie wprowadzonych modyfikacji białka, jak również zmianie profilu dodatkowych zanieczyszczeń pochodnych produktu głównego. Sumarycznie wpływa to niekorzystanie na wydajność procesu oraz jego czas trwania i koszt.

Pomimo dostępności znanych sposobów uzyskiwania insuliny i jej analogów istnieje nadal potrzeba dostarczenia sposobu, który pozwalałby na otrzymywanie tych białek i był pozbawiony opisanych powyżej mankamentów cechujących znane sposoby. Istnieje zwłaszcza potrzeba dostarczenia sposobu bardziej specyficznego względem już istniejących jak również bardziej wydajnego.

Przedmiotem wynalazku jest sposób otrzymywania insuliny lub analogu insuliny z prekursora rekombinowanego białka, obejmujący następujące etapy:

a. ekspresja prekursora rekombinowanego białka w E. Coli;

b. otrzymanie prekursora rekombinowanego białka z bakterii;

c. izolowanie i opcjonalnie wstępne oczyszczanie prekursora;

d. trawienie enzymatyczne otrzymanego prekursora rekombinowanego białka; charakteryzujący się tym, że używa się proteazy Kex2 w warunkach in vitro hydrolizującej jedno lub więcej wiązań peptydowych znajdujących się w tym białku, przy czym proteaza przerywa wiązanie peptydowe od strony C końca aminokwasu zasadowego, kiedy aminokwas ten występuje jako drugi w kolejności po innym zasadowym lub obojętnym aminokwasie a kolejność ta umożliwia specyficzne rozpoznanie obydwu aminokwasów przez proteazę, zaś prekursor zawiera na końcu N' insuliny lub analogu insuliny dwa aminokwasy wybrane z grupy składającej się z lizyny - argininy (KR) i argininy - argininy (RR).

Korzystnie otrzymane po działaniu proteazy białko poddaje się działaniu drugiej proteazy, którą stanowi egzopeptydaza hydrolizująca jedno lub więcej wiązań peptydowych aminokwasu zasadoweg o znajdującego się na C końcu białka.

Korzystnie parę aminokwasów stanowią aminokwas obojętny i zasadowy.

Również korzystnie parę aminokwasów rozpoznawaną przez proteazę stanowią dwa aminokwasy zasadowe takie jak lizyna - arginina albo arginina - arginina albo lizyna - lizyna.

Dodatkowo korzystnie egzopeptydazę stanowi Kex1 albo karboksypeptydaza B w zastosowaniu in vitro.

Korzystnie reakcja proteolizy przebiega w warunkach buforu TrisHCI. Korzystniej stężenie buforu TrisHCI wynosi 30-100 mM.

Korzystnie pH wynosi 7,0-8,5.

Korzystnie, gdy reakcja proteolizy przebiega w obecności NaCI o stężeniu 0-50 mM.

Korzystnie, gdy reakcja proteolizy przebiega w obecności CaCl2 o stężeniu 1-10 mM.

Korzystnie, gdy reakcja proteolizy przebiega w obecności glicerolu o stężeniu 5-15%.

Korzystnie, gdy reakcja proteolizy przebiega przy stosunku ilościowym prekursora białka rekombinowanego do proteazy wynoszącym 1:10-1:400.

Zaletą rozwiązania według niniejszego wynalazku jest zastosowanie w warunkach in vitro enzymu o specyficzności wyższej niż dotychczas stosowane (np. trypsyna lub endopeptydaza Asp-N) charakteryzującego się tym, że uzyskuje się wysoką specyficzność trawienia białka prekursorowego. Zastosowanie wynalazku istotnie ogranicza ilość produktów ubocznych trawienia, które wpływają na obniżenie wydajności procesu, wydłużają go, jak i zwiększają jego koszt. Nowym enzymem zastosowanym w procesie otrzymywania insulin i analogów insulin z odpowiednich prekursorów w warunkach in vitro jest proteaza Kex2. Oprócz wysokiej specyficzności proteaza ta charakteryzuje się również stabilnością proteolityczną (brakiem aktywności wykraczającej poza opisaną specyficzność) nawet w przypadku przedłużonej inkubacji z substratem. Wszystko to ma ogromny wpływ na redukcję ilości produktów ubocznych reakcji i tym samym brak konieczności zastosowania dodatkowych etapów puryfikacj i białka. Należy zwrócić szczególną uwagę na sposób uzyskiwania analogu insuliny - insulin glargine, w którego przypadku proteolityczna obróbka prekursora z wykorzystaniem proteazy Kex2 jest jednoetapowa. W przypadku insuliny i analogów insulin innych niż insulin glargine, stwierdzono że para proteaz

PL 233 560 B1

Kex2 + karboksypeptydaza B lub Kex2 + Kex1 zapewni bardziej specyficzny sposób otrzymywania insuliny i jej analogów niż jakakolwiek dotychczas stosowana proteaza/para proteaz. Ponadto, zaletą otrzymywania insulin i analogów insuliny z zastosowaniem Kex2 jest brak konieczności wprowadzania modyfikacji w cząsteczce proinsuliny na poziomie cząsteczki DNA, gdyż naturalnie zawiera ona sekwencje aminokwasów rozpoznawalne przez ten enzym. Niezwykłym i niespotykanym w przypadku innych proteaz jest fakt aktywności enzymatycznej ściśle związanej z występowaniem cięcia tylko w przypadku zgodności dwóch, następujących po sobie aminokwasów, argininy (P1), od strony której ma miejsce hydroliza oraz kolejnej lizyny lub argininy (P2). Arginina w P1 jest konieczna, ale zmiany w P2 są możliwe. Wystąpienie jednak innego aminokwasu niż lizyna w P2 obniża prawdopodobieństwo hydrolizy wiązania peptydowego z dwukrotnego dla argininy w P2 do 10^-6 razy dla tryptofanu. W cząsteczce proinsuliny naturalnie występują dwie pary aminokwasów RR (arginina-arginina) i KR (lizyna-arginina), które umożliwiają odcięcie C-peptydu i utworzenie właściwej cząsteczki insuliny. Wysoka specyficzność proteazy Kex2 jest gwarancją dużej wydajności trawienia dla insuliny i jej wszystkich analogów, przy czym dla insuliny i większości jej analogów innych niż insulin glargine konieczne jest zastosowanie drugiego enzymu, egzopeptydazy odcinającej aminokwasy z C-końca cząsteczki białka (specyficznie K, R lub H). Będą to korzystnie proteaza Kex1 lub karboksypeptydaza B.

Dodatkową korzyścią płynącą z zastosowania wynalazku jest możliwość dodania dowolnej sekwencji aminokwasów (np. peptydu sygnalnego) przed łańcuchem B prekursora z możliwością łatwego, specyficznego pozbycia się go w trakcie etapu proteolizy prekursora. Dodanie dwóch aminokwasów np. KR, do których Kex2 ma najwyższe powinowactwo, przed pierwszy aminokwas N' końca łańcucha B pro insuliny, a za fragmentem sekwencji pomocniczych (SEQ. ID. Nr 7), jest jedyną, mało istotną dla struktury przestrzennej, ingerencją w sekwencję proinsuliny lub analogu proinsuliny. Dzięki niej w jednym kroku proteolitycznym z prekursora insuliny lub analogu insuliny usuwamy fragment sekwencji pomocniczych oraz C-peptyd. W przypadku procesu otrzymywania analogu insulin glargine to jedyny krok proteolityczny, prowadzący do uzyskania w pełni funkcjonalnej cząsteczki. Żadna z wymienionych modyfikacji nie wpływa niekorzystnie na ładunek właściwej cząsteczki proinsuliny lub analogu proinsuliny i tym samym zdolność do formowania mostków disiarczkowych. Wprowadzenie modyfikacji do cząsteczki prekursora insulin nie generuje dodatkowych etapów procesowania cząsteczki (jak np. cytrakonylacja, hydroliza chemiczna czy dodatkowy etap puryfikacji).

Wydajna i specyficzna proteoliza umożliwia znaczne obniżenie kosztów puryfikacji insuliny lub analogów insuliny przede wszystkim poprzez redukcję ilości etapów oczyszczan ia. Standardowo puryfikacja to etap, który generuje najwyższe koszty w całym procesie uzyskiwania leku białkowego. Są one nieporównywalnie wyższe od tych, które ponosi się na etapie fermentacji. W przypadku insuliny i analogów insuliny, otrzymywanych według standardowych metod, do odczyszczenia właściwego produktu proteolizy od C-peptydu dochodzi dodatkowe odczyszczenie go od jego pochodnych wygenerowanych na skutek niepożądanej aktywności trypsyny czy powstałych podczas cytrakonylacji/decytrakonylacji. W przypadku proteolizy z udziałem Kex2 lub Kex2 i karboksypeptydazy B problem zanieczyszczeń związanych z pochodnymi produktu nie jest istotny, a oczyszczanie insuliny lub jej analogów jest często możliwe nawet w jednym kroku chromatograficznym, stąd możliwość redukcji kosztów, która wpływa korzystnie na ekonomię całego procesu. Zastosowana proteaza jest stabilna i nie zmienia swojej aktywności w czasie, co stanowi swoistą nowość w porównaniu z powszechnie stosowanymi enzymami. Nawet przy wydłużonym czasie reakcji trawienia nie obserwuje się produktów ubocznych niespecyficzności proteazy Kex2. Zapewnia to bezpieczeństwo cząsteczkom insulin lub jej analogom w trakcie etapu proteolizy. Na redukcję tego kosztu będzie również wpływał fakt braku glikozylowanych pochodnych cząsteczek insulin związany z zastosowaniem gospodarza bakteryjnego do produkcji białka. Odseparowanie glikozylowanych pochodnych insuliny lub jej analogów stwarzałoby konieczność wprowadzenia dodatkowego kroku chromatograficznego i przeprowadzenie, niełatwego i narażonego, na straty etapu oczyszczania końcowego produktu.

Przedmiot wynalazku w przykładach wykonania został odtworzony na rysunku, na którym fig. 1 przedstawia schemat struktury prekursora proinsuliny ludzkiej, fig. 2 przedstawia schemat proteolizy prekursora insuliny z udziałem trypsyny i karboksypeptydazy B, fig. 3 przedstawia chromatogram rozdziału produktów proteolizy P_mMabionlGlargine_1 ,C4 (HPLC), fig. 4 zaś przedstawia chromatogram rozdziału produktów proteolizy P_mMabionlGlargine_1 (MS), fig. 5 przedstawia wydajność proteolizy P_mMabionlGlargine_1 z udziałem proteazy Kex2 - proteoliza w czasie, fig. 6 przedstawia schemat proteolizy prekursora insuliny Glargine z udziałem Kex2, fig. 7 przedstawia schemat proteolizy prekursora analogu insuliny (Lispro) z udziałem Kex2 i karboksypeptydazy, fig. 8 przedstawia wynik analizy

PL 233 560 B1 struktury Il-rzędowej insuliny P_mMabionLGIargine_1 w porównaniu z insuliną Glargine (Sanofi Aventis), fig. 9 przedstawia insulinę Glargine po rekacji proteolizy i oczyszczania z zastosowaniem jednego kroku chromatograficznego, fig. 10 przedstawia określenie masy produktów proteolizy i porównanie uzyskanych wartości z teoretycznymi, fig. 11 przedstawia schemat proteolizy insuliny z udziałem trypsyny i karboksypeptydazy B (cytrakonylacja), fig. 12 przedstawia schemat proteolizy prekursora insuliny z udziałem enterokinazy i endopeptydazy Asp-N, fig. 13 przedstawia schemat struktury Met-His-Proins, fig. 14 przedstawia wizualizację rozdziału produktów proteolizy enzymatycznej P_mMabionlGlargine_1 w 18% żelu tricinowym, fig. 15 przedstawia chromatogram rozdziału produktów proteolizy Met-His_Proins, C4 (MS), fig. 16 natomiast przedstawia stabilność i specyficzność proteolizy P_mMabionlGlargine_1 w czasie dłuższym niż optymalny.

Niniejszy wynalazek zostanie opisany w przykładach poniżej, które nie ograniczają zastrzeganego zakresu ochrony.

P r z y k ł a d 1.

Uzyskanie ludzkiej insuliny z ludzkiej proinsuliny - proteoliza z udziałem trypsyny i karboksypeptydazy B

Sekwencja aminokwasowa prekursora insuliny ludzkiej została przedstawiona jako SEQ. ID. nr 1. Sekwencja aminokwasowa białka odpowiada sekwencji referencyjnej, nie była modyfikowana. Prekursor ludzkiej insuliny, IL_1, uzyskano w komórkach Eschericha coli. Do reakcji proteolizy zastosowano dwie proteazy. Trypsyna jest endopeptydazą zaangażowaną w etap proteolitycznej obróbki proinsuliny, polegający na usunięciu C-peptydu z prekursora. Endopeptydaza specyficznie rozpoznaje pojedynczo występujące w sekwencji aminokwasy zasadowe: argininę (R) i lizynę (K) i hydrolizuje wiązanie peptydowe yR-|-x lub yK-|-x, gdzie x stanowi dowolny aminokwas. Wydajność cięcia determinuje obecność aminokwasu z N' końca R lub K (aminokwasu y), może on znacząco wpłynąć na częstość wystąpienia hydrolizy wiązania peptydowego z C' końca R lub K. Cząsteczka proinsuliny ludzkiej zawiera w swojej sekwencji zarówno argininy jak i lizyny. Preferowane miejsca proteolizy, nie są niestety jedynymi rozpoznawanymi przez trypsynę. W sekwencji cząsteczki proinsuliny, a dokładnie w jej łańcuchu B, znajduje się lizyna [LysB29], która również stanowi miejsce rozpoznawane przez trypsynę. Niestety trawienie to nie jest pożądane. Drugim enzymem zastosowanym do tej reakcji jest karboksypeptydaza B, egzopeptydaza usuwająca specyficznie z C' końca białka aminokwasy zasadowe R, K i H. Reakcję proteolizy 10 μg prekursora Pre_IL_1 przeprowadzono w warunkach 50 mM buforu Tris-HCI, 1 mM CaCl2, pH 7,6. Trypsyna została użyta w stosunku masowym równym 1:400, natomiast karboksypeptydaza B w stosunku masowym równym 1:2000. Przy czym, w zadanych stosunkach masowych, poszczególnej proteazy użyto w ilości, odpowiednio, 400 lub 2000 razy mniej niż proinsuliny. Reakcja przebiegała w temperaturze 37°C przez 1 godzinę. Analiza wyniku reakcji przeprowadzona na drodze chromatografii wysokociśnieniowej odwróconych faz (zastosowano złoże chromatograficzne C4 Vydac, Phenomenex) oraz spektroskopii mas potwierdziły obecność właściwej cząsteczki insuliny. Wykazano również obecność innych cząsteczek, tzw. pochodnych właściwego produktu insuliny, które znacząco wpłynęły na ostateczną wydajność reakcji. Ich obecność jest niekorzystna, gdyż stanowią zanieczyszczenie związane z produktem. Obniżenie wydajności reakcji proteolizy wynika bezpośrednio ze specyficzności zastosowanej endoproteazy, trypsyny. W wyniku jej aktywności, oprócz insuliny, produktami reakcji proteolizy były również: insulina-des-ThrB30 oraz insulina-Arg65. W związku z obecnością dodatkowych cząsteczek (szczególnie w przypadku insuliny-des-ThrB30), kolejny etap, polegający na puryfikacji właściwej cząsteczki insuliny, wymaga zastosowania dodatkowego kroku chromatograficznego. Wpływa to zarówno na koszt procesu, jak również jego długość i wydajność.

P r z y k ł a d 2.

Uzyskanie ludzkiej insuliny z ludzkiej proinsuliny - proteoliza z udziałem trypsyny i karboksypeptydazy B (dodatkowe etapy procesu - cytrakonylacja/decytrakonylacja)

Sekwencja aminokwasowa prekursora insuliny ludzkiej została przedstawiona jako SEQ. ID. nr 1. Sekwencja aminokwasowa białka odpowiadała sekwencji referencyjnej, nie była modyfikowana. Prekursor ludzkiej insuliny, Pre_IL_1, uzyskano w komórkach Eschericha coli. Do reakcji proteolizy zastosowano dwie proteazy. Trypsyna jest endopeptydazą zaangażowaną w etap proteolitycznej obróbki proinsuliny, polegający na usunięciu C-peptydu z prekursora. Endopeptydaza specyficznie rozpoznaje pojedynczo występujące w sekwencji aminokwasy zasadowe: argininę (R) i lizynę (K) i hydrolizuje wiązanie peptydowe yR-|-x lub yK-|-x, gdzie x stanowi dowolny aminokwas. Wydajność cięcia determinuje obecność aminokwasu z N' końca R lub K (aminokwasu y), może on znacząco wpłynąć na częstość

PL 233 560 B1 wystąpienia hydrolizy wiązania peptydowego z C' końca R lub K. Cząsteczka proinsuliny ludzkiej zawiera w swojej sekwencji zarówno argininy jak i lizyny. Preferowane miejsca proteolizy nie są niestety jedynymi rozpoznawanymi przez trypsynę. W sekwencji cząsteczki proinsuliny, a dokładnie w jej łańcuchu B, znajduje się lizyna [LysB29], która również stanowi miejsce rozpoznawane przez trypsynę. Niestety trawienie to nie jest pożądane. Drugim enzymem zastosowanym do tej reakcji jest karboksypeptydaza B, egzopeptydaza usuwająca specyficznie z C' końca białka aminokwasy zasadowe R, K i H. Celem zwiększenia specyficzności i tym samym pożądanego działania trypsyny wprowadzono dodatkowy etap procesu, składający się z dwóch reakcji. Ich wynikiem jest charakterystyczna modyfikacja cząsteczki prekursora insuliny (cytrakonylacja/decytrakonylacja). Cytrakonylację przeprowadzono przed reakcją proteolizy. Prekursor IL_1 poddano działaniu bezwodnika kwasu cytrakonylowego lub maleinowego, w wyniku którego na drodze reakcji acetylacji nastąpiło zablokowanie reszty lizynowej (LysB29). Zmiana dodatniego ładunku aminokwasu (Lys29B) na ujemny uniemożliwia hydrolizę wiązania peptydowego K^--|-T w łańcuchu B. Warunki przeprowadzonej cytrakonylacji: 10 μg prekursora IL_1, 30 μg bezwodnika kwasu cytrakonylowego lub maleinowego, 50 mM buforu Tris-HCI, pH 8,4-8,5, 25°C, 2 h. Reakcję proteolizy 10 μg prekursora 1L_1 przeprowadzono w warunkach 50 mM buforu Tris-HCI, 1 mM CaCl2, pH 7,6. Trypsyna została użyta w stosunku masowym równym 1:400, natomiast karboksypeptydaza B w stosunku masowym równym 1:2000. Przy czym, w zadanych stosunkach masowych, poszczególnej proteazy użyto w ilości, odpowiednio, 400 lub 2000 razy mniej niż Pre_|L_1. Reakcja przebiegała w temperaturze 37°C przez 1 godzinę. Decytrakonylacja, przeprowadzona po proteolizie prekursora, polegała na odblokowaniu reszty Lys29B i przywróceniu jej wyjściowego ładunku dodatniego. Zmiana ładunku Lys29B była możliwa poprzez zmianę pH mieszaniny białka do wartości skrajnie kwasowej, równej 2,5 i inkubacji proinsuliny w tych warunkach przez 3 h. Analiza wyniku reakcji przeprowadzona na drodze chromatografii wysokociśnieniowej odwróconych faz (zastosowano złoże chromatograficzne C4 Vydac, Phenomenex) oraz spektroskopii mas potwierdziły obecność właściwej cząsteczki insuliny. W dalszym ciągu jednak obserwowano obecność innych cząsteczek, tzw. pochodnych właściwego produktu insuliny lub zanieczyszczeń związanych z produktem, które negatywnie wpłynęły na ostateczną wydajność reakcji. Mimo iż udało się zredukować ilość pochodnej, insuliny-des-ThrB30 o 5-10% w stosunku do ilości uzyskiwanych przy braku modyfikacji LysB29 nadal jest ona obecna, podobnie jak insulina-Arg65. W związku z obecnością dodatkowych cząsteczek (szczególnie w przypadku insuliny-des-ThrB30), kolejny etap, polegający na puryfikacji właściwej cząsteczki insuliny, wymaga zastosowania dodatkowego kroku chromatograficznego. Wpływa to zarówno na koszt procesu, jak również jego długość i wydajność.

P r z y k ł a d 3.

Uzyskanie ludzkiej insuliny z ludzkiej proinsuliny - proteoliza z udziałem enterokinazy i endoproteinazy Asn

Sekwencja aminokwasowa prekursora insuliny ludzkiej została przedstawiona jako SEQ. ID. nr 1. Sekwencję tę zmodyfikowano poprzez wprowadzenie dodatkowych aminokwasów: DDDDK przed pierwszy aminokwas łańcucha A insuliny oraz D za ostatnim aminokwasem łańcucha B (Thr30B), tak jak przedstawiono poniżej - SEQ. ID. nr 2. Dodatkowe aminokwasy DDDDK w cząsteczce proinsuiny, podobnie jak te DDDDK, znajdujące się we fragmencie sekwencji pomocniczych, są specyficznie rozpoznawane przez enterokinazę, natomiast D przez endoproteinazę Asp-N. Fragment pomocniczy, złożony z peptydów ułatwiających puryfikację białka, wpływających korzystnie na rozpuszczalność białka, umożliwiających puryfikację białka za pomocą chromatografii powinowactwa oraz trawienie za pomocą enterokinazy, został przedstawiony jako SEQ. ID. nr 3 i dodany przed właściwą cząsteczkę prekursora insuliny ludzkiej. Prekursor insuliny ludzkiej wraz z fragmentem sekwencji pomocniczych to SEQ. ID. nr 4. Prekursor ludzkiej insuliny, P_MabionHI_1, uzyskano w komórkach Eschericha coli. W trakcie przebiegu reakcji trawienia nr I (z udziałem enterokinazy) wydajnie usuwany jest fragment sekwencji pomocniczych lub inny fragment połączony z cząsteczką insuliny lub innym białkiem za pomocą DDDDK. Usunięcie C-peptydu jest możliwie dzięki przeprowadzeniu reakcji trawienia nr II (z udziałem endoproteinzy Asp-N). Enterokinaza rozpoznaje sekwencje aminokwasów DDDDK z wysoką specyficznością. Wiązanie peptydowe hydrolizowane w trakcie reakcji to DDDDK-|-x, gdzie x to dowolny aminokwas, Endoproteinza Asp-N hydrolizuje wiązanie peptydowe z N' końca kwasu asparaginowego: x-|-D, gdzie x to dowolny aminokwas. Endoproteinza Asp-N wykazuje również aktywność proteolityczną wobec N' końcowego wiązania peptydowego takich aminokwasów jak: cysteina (C), kwas glutaminowy (E), fenyloalanina (F), tyrozyna (Y), przy czym najwyższą aktywność wykazuje w stosunku do kwasu asparaginowego (D). Reakcję nr I proteolizy 10 μg prekursora P_MabionHI_1 przeprowadzono w warunkach 50 mM buforu

PL 233 560 B1

Tris-HCI, pH 8,0. Enterokinaza została użyta w ilości 0,05 μο. Reakcja przebiegała w temperaturze 37°C przez 16 godzin. Rekcja nr II z udziałem endopeptydazy Asp-N przebiegała w warunkach 50 mM buforu Tris-HCI, 2,5 mM ZnSO4, pH 8,0, w temperaturze 25°C przez dwie godziny. Do mieszaniny białka, po reakcji nr I dodano odpowiednią ilość endopeptydazy Asp-N - 0,15 μ9. Analiza wyniku obydwu reakcji przeprowadzona na drodze chromatografii wysokociśnieniowej odwróconych faz (zastosowano złoże chromatograficzne C4 Vydac, Phenomenex) oraz spektroskopii mas potwierdziła obecność właściwej cząsteczki insuliny. W mieszaninie reakcyjnej występuje również duża pula peptydów, powstałych na skutek niespecyficznego działania endopeptydazy Asp-N. Zmiana długości C-peptydu spowodowała brak lub niepoprawnie utworzone połączenia S-S, wynikiem czego po reakcji trawienia w mieszaninie obserwuje się wolne łańcuchy A i B lub/oraz fragmenty wolnych łańcuchów A i B. Ocena wydajności powyższych reakcji proteolizy (nr I i nr II) jest utrudniona ze względu na dużą ilość produktów niespecyficznych. Ilość oraz różnorodność zanieczyszczeń związanych z produktem znacznie utrudniają zarówno zaprojektowanie jak i przeprowadzenie efektywnego etapu oczyszczania insuliny. Konieczność wprowadzenia dodatkowych kroków chromatograficznych wydłuża czas całego procesu oczyszczania i znacząco zwiększa jego koszt.

P r z y k ł a d 4.

Uzyskanie Met-HisTag-proinsuliny ludzkiej z modyfikowanej ludzkiej proinsuliny - proteoliza z udziałem Kex2

Sekwencja aminokwasowa prekursora Met-HisTag-proinsuliny ludzkiej została przedstawiona jako SEQ. ID. nr 5. Obecne w sekwencji prekursora insuliny aminokwasy w układzie: KR, podobnie jak para aminokwasów RR, są specyficznie rozpoznawane przez proteazę Kex2. Dzięki temu możliwe jest usunięcie C-peptydu w pojedynczej reakcji. Fragment pomocniczy w tym przypadku stanowiący Met oraz peptyd HisTag nie są istotne w analizie, prawdopodobnie umożliwiły ekspresję genu i puryfikację prekursora. Prekursor ludzkiej insuliny, Met-HisTag-proinsulina, komercyjnie dostępny (R&D Systems) przygotowano zgodnie z zaleceniami producenta. Uzyskanie ludzkiej Met-HisTag-insuliny z prekursora jest możliwe dzięki zastosowaniu niezwykle specyficznej reakcji proteolizy. W trakcie przebiegu reakcji trawienia wydajnie usuwany jest C-peptyd prekursora. Usunięcie C-peptydu jest możliwie dzięki dipeptydom, odpowiednio dwie argininy (RR) na N' końcu C-peptydu oraz lizynę i argininę (KR) na C' końcu C-peptydu, natywnie występującym w cząsteczce prekursora insuliny ludzkiej. Proteaza Kex2 rozpoznaje dipeptydy RR i KR z wysoką specyficznością. Wiązanie peptydowe hydrolizowane w tra kcie reakcji to odpowiednio, RR-|-x lub KR-|-x, gdzie x to dowolny aminokwas, za wyjątkiem waliny (V). Reakcję proteolizy 3 μg prekursora Met-HisTag-proinsuliny przeprowadzono w warunkach 50 mM buforu TrisHCI, 1 mM CaCl2, pH 7,0. Proteaza Kex2 została użyta w ilości 0,3 μl [0,3 μg/0,3 μί], przy czym 1 μg enzymu stanowi 0,04U. Reakcja przebiegała w temperaturze 37° C przez 16 godzin. Analiza wyniku reakcji przeprowadzona na drodze chromatografii wysokociśnieniowej odwróconych faz (zastosowano złoże chromatograficzne C4 Vydac, Phenomenex) oraz spektroskopii mas potwierdziła założenie eksperymentu. Proteaza Kex2 oddzieliła cząsteczkę insuliny ludzkiej (łańcuch M-HisTag-B - RR i A) od C-peptydu w sposób wydajny i z wysoką specyficznością. Nie zidentyfikowano żadnych produktów ubocznych, stanowiących zanieczyszczenia związane z produktem.

P r z y k ł a d 5.

Uzyskanie ludzkiej insuliny z modyfikowanej ludzkiej proinsuliny - proteoliza z udziałem Kex2 i karboksypeptydazy B

Sekwencja aminokwasowa prekursora insuliny ludzkiej została przedstawiona jako SEQ. ID. Nr 1. Sekwencję aminokwasową zmodyfikowano poprzez wprowadzenie dodatkowych dwóch aminokwasów KR (lizyny i argininy) przed pierwszy aminokwas łańcucha B insuliny, tak jak przedstawiono poniżej SEQ. ID. nr 6. Dodatkowe aminokwasy (KR), podobnie jak para aminokwasów RR, są specyficznie rozpoznawane przez proteazę Kex2. Dzięki temu możliwe jest usunięcie fragmentu sekwencji pomocniczych oraz C peptydu w pojedynczej reakcji. Fragment pomocniczy, złożona z peptydów ułatwiających puryfikację białka, wpływających korzystnie na rozpuszczalność białka, umożliwiających puryfikację białka za pomocą chromatografii powinowactwa, została przedstawiona jako SEQ. ID. nr 3 i dodany przed właściwą cząsteczkę prekursora insuliny ludzkiej. Prekursor insuliny ludzkiej wraz fragmentem sekwencji pomocniczych to SEQ. ID. nr 7. Prekursor ludzkiej insuliny, P_mMabionlL_1, uzyskano w komórkach Eschericha coli. W trakcie przebiegu reakcji trawienia wydajnie usuwany jest fragment sekwencji pomocniczych lub inny fragment połączony z cząsteczką insuliny lub innym białkiem za pomocą par aminokwasów: lizyny i argininy (KR) lub dwóch arginin (RR), jak również C-peptyd prekursora. Usunięcie C-peptydu jest możliwie dzięki dipeptydom, odpowiednio dwóm argininom (RR) na N' końcu

PL 233 560 B1

C-peptydu oraz lizynie i argininie (KR) na C' końcu C-peptydu, natywnie występującym w cząsteczce prekursora insuliny ludzkiej. Proteaza Kex2 rozpoznaje dipeptydy RR i KR z wysoką specyficznością. Wiązanie peptydowe hydrolizowane w trakcie reakcji to odpowiednio, RR-|-x lub KR-|-x, gdzie x to dowolny aminokwas, za wyjątkiem waliny (V). Reakcję nr I proteolizy 10 gg prekursora P_mMabionlL_1 przeprowadzono w warunkach 25 mM buforu Tris-HCI, 1 mM CaCl2, pH 7,7. Proteaza Kex2 została użyta w ilości 1 gl [1 gg/1 gl], przy czym 1 gg enzymu stanowi 0,04 U. Reakcja przebiegała w temperaturze 37°C przez 16 godzin. Analiza wyniku reakcji nr I przeprowadzona na drodze chromatografii wysokociśnieniowej odwróconych faz (zastosowano złoże chromatograficzne C4 Vydac, Phenomenex) oraz spektroskopii mas potwierdziła założenie eksperymentu. Proteaza Kex2 oddzieliła cząsteczkę insuliny ludzkiej (łańcuch B - RR i A) od C-peptydu oraz fragmentu sekwencji pomocniczych. Usunięcie dwóch arginin z C' końca łańcucha B umożliwiło zastosowanie egzopeptydazy - karboksypeptydazy B lub Kex1, specyficznie usuwającej aminokwasy zasadowe (argininę) R, lizynę (K) i histydynę (H) z C' końca cząsteczki białka. Mieszanina reakcyjna po reakcji nr I proteolizy stanowiła roztwór wyjściowy białka do reakcji nr II. Do środowiska reakcyjnego dodano NaCI do końcowego stężenia 0,1 M oraz karboksypeptydazę B w stosunku masowym 1:2000 (zakładając aktywność enzymu w zakresie 90,0% - 99,9%) przeprowadzono reakcję proteolizy przez jedną godzinę w temperaturze 37°C. W wyniku reakcji nr II uzyskano właściwą cząsteczkę ludzkiej insuliny (SEQ. ID. Nr 8), co potwierdzono analizą sekwencji i masy. Nie zidentyfikowano żadnych produktów ubocznych, stanowiących zanieczyszczenia związane z produktem.

P r z y k ł a d 6.

Uzyskanie analogów ludzkiej insuliny z modyfikowanych analogów ludzkiej proinsuliny proteoliza z udziałem Kex2 i karboksypeptydazy B (na przykładzie analogu Lispro)

Sekwencja aminokwasowa prekursora insuliny ludzkiej została przedstawiona jako SEQ. ID. nr 1. Sekwencję aminokwasową zmodyfikowano poprzez zamianę ProB28B z LysB29 oraz wprowadzenie dodatkowych dwóch aminokwasów KR (lizyny i argininy) przed pierwszy aminokwas łańcucha B insuliny, tak jak przedstawiono poniżej - SEQ. ID. nr 9. Dodatkowe aminokwasy (KR), podobnie jak para aminokwasów, arginin (RR), są specyficznie rozpoznawane przez proteazę Kex2. Dzięki temu możliwe jest usunięcie fragmentu sekwencji pomocniczych oraz C-peptydu w pojedynczej reakcji. Fragment pomocniczy, złożona z peptydów ułatwiających puryfikację białka, wpływających korzystnie na rozpuszczalność białka, umożliwiających puryfikację białka za pomocą chromatografii powinowactwa, została przedstawiona jako SEQ. ID. nr 3 i dodany przed właściwą cząsteczkę prekursora insuliny ludzkiej. Prekursor insuliny ludzkiej wraz fragmentem sekwencji pomocniczych to SEQ. ID. nr 10. Prekursor ludzkiej insuliny, P_mMabionlLispro_1, uzyskano w komórkach Eschericha coli. Uzyskanie ludzkiej insuliny z prekursora insuliny jest możliwe dzięki zastosowaniu niezwykle specyficznej reakcji proteolizy. W trakcie przebiegu reakcji trawienia wydajnie usuwany jest fragment sekwencji pomocniczych lub inny fragment połączony z cząsteczką insuliny lub innym białkiem za pomocą KR lub RR, jak również C-peptyd prekursora. Usunięcie C-peptydu jest możliwie dzięki dipeptydom, odpowiednio RR na N' końcu C-peptydu oraz KR na C' końcu C-peptydu, natywnie występującym w cząsteczce prekursora insuliny ludzkiej. Proteaza Kex2 rozpoznaje dipeptydy RR i KR z wysoką specyficznością. Wiązanie peptydowe hydrolizowane w trakcie reakcji to odpowiednio, RR-|-x lub KR-|-x, gdzie x to dowolny aminokwas, za wyjątkiem waliny (V). Reakcję nr I proteolizy 10 gg prekursora P_mMabionlLispro_1 przeprowadzono w warunkach 25 mM buforu Tris-HCI, 1 mM CaCl2, pH 7,7. Proteaza Kex2 została użyta w ilości 1 gl [1 gg/1 gl], przy czym 1 gg enzymu stanowi 0,04 U. Reakcja przebiegała w temperaturze 37°C przez 16 godzin. Analiza wyniku reakcji nr 1 przeprowadzona na drodze chromatografii wysokociśnieniowej odwróconych faz (zastosowano złoże chromatograficzne C4 Vydac, Phenomenex) oraz spektroskopii mas potwierdziła założenie eksperymentu. Proteaza Kex2 oddzieliła cząsteczkę insuliny ludzkiej (łańcuch B - RR i A) od C-peptydu oraz fragmentu sekwencji pomocniczych. Usunięcie dwóch arginin z C' końca łańcucha B umożliwiło zastosowanie egzopeptydazy - karboksypeptydazy B lub Kex1, specyficznie usuwającej aminokwasy zasadowe (argininę) R, lizynę (K) i histydynę (H) z C' końca cząsteczki białka. Mieszanina reakcyjna po reakcji nr I proteolizy stanowiła roztwór wyjściowy białka do reakcji nr II. Do środowiska reakcyjnego dodano NaCl do końcowego stężenia 0,1 M oraz karboksypeptydazy B w stosunku masowym 1:2000 (zakładając aktywność enzymu w zakresie 90,0% - 99,9%) przeprowadzono reakcję proteolizy przez jedną godzinę w temperaturze 37°C. W wyniku reakcji nr II uzyskano właściwą cząsteczkę ludzkiej insuliny (SEQ. ID. Nr 11), co potwierdzono analizą sekwencji i masy. Nie zidentyfikowano żadnych produktów ubocznych, stanowiących zanieczyszczenia związane z produktem.

PL 233 560 B1

P r z y k ł a d 7.

Uzyskanie analogu ludzkiej insuliny o wydłużony działaniu (Insulin Glargine)

Sekwencja aminokwasowa prekursora insuliny ludzkiej została przedstawiona jako SEQ. ID. nr 1. Sekwencję aminokwasową zmodyfikowano poprzez wprowadzenie dodatkowych dwóch aminokwasów KR (lizyny i argininy) przed pierwszy aminokwas łańcucha B insuliny oraz zmianę aminokwasu A21N na A21G, tak jak przedstawiono poniżej - SEQ. ID. nr 12. Dodatkowe aminokwasy (KR) są specyficznie rozpoznawane przez proteazę Kex2, dzięki czemu możliwe jest usunięcie fragmentu sekwencji pomocniczych w pojedynczej reakcji. Fragment pomocniczy, złożona z peptydów ułatwiających puryfikację białka, wpływających korzystnie na rozpuszczalność białka, umożliwiających puryfikację białka za pomocą chromatografii powinowactwa, została przedstawiona jako SEQ. ID. nr 3 i dodany przed właściwą cząsteczkę prekursora insuliny ludzkiej. Prekursor analogu insuliny ludzkiej wraz fragmentem sekwencji pomocniczych to SEQ. ID. nr 13. Prekursor ludzkiej insuliny, P_mMabionlGlargine_1, uzyskano w komórkach Eschericha coli. Uzyskanie analogu ludzkiej insuliny z prekursora analogu insuliny jest możliwe dzięki zastosowaniu niezwykle specyficznej reakcji proteolizy. W trakcie jej przebiegu wydajnie usuwany jest fragment sekwencji pomocniczych lub inny fragment połączony z cząsteczką insuliny lub innym białkiem za pomocą KR lub RR, jak również C-peptyd prekursora. Usunięcie C-peptydu jest możliwie dzięki dipeptydom, odpowiednio RR na N' końcu C-peptydu oraz KR na C' końcu C-peptydu natywnie występującym w cząsteczce prekursora insuliny ludzkiej. Proteaza Kex2 rozpoznaje dipeptydy RR i KR z wysoką specyficznością. Wiązanie peptydowe hydrolizowane w trakcie reakcji to odpowiednio, RR-|-x lub KR-|-x, gdzie x to dowolny aminokwas, za wyjątkiem waliny (V). Reakcję nr I proteolizy 10 gg prekursora P_mMabionlGlargine_1 przeprowadzono w warunkach 25 mM buforu Tris-HCI, 1 mM CaCl2, pH 7,4. Proteaza Kex2 została użyta w ilości 1 gl [1 gg/1 gl], przy czym 1 gg enzymu stanowi 0,04 U. Reakcja przebiegała w temperaturze 37°C przez 16 godzin. Analiza wyniku reakcji nr I na drodze chromatografii wysokociśnieniowej odwróconych faz (zastosowano złoże chromatograficzne C4 Vydac, Phenomenex) oraz MS potwierdziła założenie eksperymentu. Proteaza Kex2 oddzieliła cząsteczkę insuliny ludzkiej (łańcuch B - RR i A) od C-peptydu oraz fragmentu sekwencji pomocniczych. Nie zidentyfikowano żadnych produktów ubocznych, stanowiących zanieczyszczenia związane z produktem. W przypadku tego analogu insuliny reakcja nr I jest jedynym krokiem proteolitycznym niezbędnym do konwersji prekursora analogu insuliny (SEQ. ID. nr 14) do właściwej cząsteczki analogu insuliny.

Bibliografia

1. IDF Diabetes Atlas 6th edition, 2013, International Diabetes Federation.

2. Deaths: Final Data for 2010 Statistics Reports, vol 61 no 4, 08.05.2013., CDC, National Center for Health Statistics.

3. WHO, Diabetes Fact sheet no 312, October 2013.

4. Dolan-Heitinger J., Recombinant DNA and Biosynthetic Human Insulin, A Source Book, Eli Lilly and Co.: Indianapolis, 1982; Barfoed H.C., Insulin Production Technology, Chem.Eng.Prog., 1987, 83 (10), 49-54.

5. Marglin A., Insulin and solid chase synthesis, 1964-1970, Peptide Science 2007, 90 (3), 200-2002.

6. Barfoed H.C., Insulin Production Technology, Chem.Eng.Prog., 1987, 83 (10), 49-54.

7. Ladish M.R., Kohlmann K.L., Recombinant Human Insulin, Biotechnol. Prog., 1992, 8 (6), 469-478.

8. Johnson I.S., Human Insulin from Recombinant DNA Technology, 1983, Science, 219, 632-637.

9. Williams D.C., Van Frank R.M., Muth W.L., Burnett J.P., Cytoplasmic inclusion Dobies in Escherichia coli producing biosynthetic human insulin proteins, 1982, Science, 215 (5), 687-689.

10. Chance R.E., Kroeff E.P., Hoffman J.A., W: insulins, Growth Hormone and Recombinant DNA Technology, Raven Press, New York, 1981, pp. 71-85.

11. Ladish M.R., Kohlmann K.L., Recombinant Human Insulin, Biotechnol. Prog., 1992, 8 (6), 469-478.

12. Chance R., Glazer N., Wishner K., Insulin Lispro (Humalog). W: Walsh G., Murphy B. (red) Biopharmaceuticals, an industrial perspective, Kluwer, Dordrecht 1999, pp 149-172.

PL 233 560 B1

13. Son YJ, Kim CK, Kim YB, Kweon DH, Park YC, Seo JH, Effects of Citraconylation on Enzymatic Modification of Human Proinsulin Using Trypsin and Carboxypeptidase B, 2009, Biotechnol. Prog., 25 (4), 1064-1070.

14. Nielsen R.G., Sittampalam G.S., Rickard E.C., Capillary zone elec-trophoresis of insulin and growth-hormone, 1989, Anal Biochem., 177, 20-26.

15. Habermann P., Zacher F., Method for producing insulin analogs having a dibascic chain B terminus, US Patent Application Publication no US 2009/0192073 A1.

16. Shahravan SH, Qu X, Chan I, Shin JA, 2008, Protein Expr Purif., 59 (2), 314-319.

17. Tarentino AL, Quinnes G, Grimwood BG, Hauer CR, Plummer TH, Molecular cloning and sequence analysis of Flavastacin: An O-Glycosylated Procaryotic Zinc Metalloendopeptidase, 1995, Archives of Biochemistry and Biophisics, 319 (1), 281-285.

18. Substrate Specificity of a Proteolytic Enzyme Isolated from a Mutant of Pseudomonas fragi. Drapeau GR, 1980, The Journal of Biological Chemistry, 255 (3), 839-840), (Ingrosso D, Fowler AV, Bleibaum J, Clarke S, 1989, Specificity of endoproteinase Asp-N (Pseudomonas fragi): cleavage at glutamyl residues in two proteins. Biochemical and Biophysical Research Communications, 162 (3), 1528-1534.

19. Qiao Z, Min C, Hua Q, Weiss MA, Feng Y, 2003, In Vitro Refolding of Human Proinsulin, The Journal of Biological Chemistry, 278 (20), 17800-17809.

20. Chen L, Yang X, Tang J, 2002, Acidic Residues on the N-terminus of Proinsulin C-Peptide Are Important for the Folding of Insulin Precursor, J. Biochem, 131, 855-859.

21. Steiner DF, 2004, The Proinsulin C-peptide - A Multirole Model, Experimental Diab., 5, 7-14.

22. Fuller RS, Brake A, Thorner J, 1988, Yeast prohormone processing enzyme (Yeast prohormone processing nzyme (KEX2 gene product) is a Ca^2+- dependent serine protease, Proc. Natl. Acad. Sci., 86, 1434-1438.

23. Wilcox CA, Fuller RS, 1991, Posttranslational Processing of the Prohormone-cleaving Kex2 Protease in the Saccharomyces cerevisae Secretory Pathway, The Journal of Cell Biology, 115 (2), 297-307.

24. Ledgerwood EC, George PM, Peach FU, Brennan SO, 1995, Endoproteolytic processing of recombinant proalbumin variants by the yeast Kex2 protease, Biochem. J., 308, 321-325.

25. Kjeldsen T, Balschmidt P, Diers I, Hach M, Kaarsholm NC, Ludvigsen S, 2001, Expression of Insulin In Yeats: The importance of Molecular Adaptation for Secretion and Conversion, Biotechnology and Engineering Reviews, 18.

26. Kjeldsen T, Frost Pettersson A, Hach M, 1999, Secretory expression and characterization of insulin in Pichia pastoris.

27. Gentzsch M, Tanner W, 1997, Protein-O-glycosylation in yeast: protein-specific mannosyltronsferases, Glycobiology, 7 (4), 481-486.

28. Kjeldsen T, 2000, Yeast secretory expression of insulin precursors, Appl. Microbiol. Biotechnol., 54, 277-286.

29. Bevan A, Brenner C, Fuller AS, 1998, Quantitative assessment of enzyme specificity in vivo: P2 recognition by Kex2 protease defined in a genetic system, Biochemistry, 95, 10384-10389.

PL 233 560 Β1

Lista sekwencji

SEQ. ID. nr 1

FVNQHLCGSHL

EDLQVGQVELG

EQCCTSICSLY

VEALYLVCGE

GGPGAGSLQP

Q L E N Y C N

RGFFYTPKT m| E A LALEGSLQ g|| G I V

Identyfikator sekwencji: sekw. Nr 1

Długość sekwencji: 86

Typ sekwencji; aminokwasowa

Organizm: syntetyczna

Inne informacje: ludzka proinsulina (Pre IL 1)

SEQ. ID. nr 2

FVNQHLCGSHL

AEDLQVGQVEL

GIVEQCCT

Identyfikator sekwencji: sekw.

Długość sekwencji: 92

Typ sekwencji: aminokwasowa

Organizm: syntetyczna

Inne informacje: MabionHI_l

VEALYLVCGE

GGGPGAGSLQ SICSLYQLEN

Nr 2

RGFFYTPKT| E

PLALEGSLQ ^1 BB

Y C N

SEQ. ID. nr 3

M

S

D

K

I

I

H

L

T

D

D

S

F

D

T

D

V

L

K

A

D

G

A

I

L

V

D

F

W

A

E

W

C

G

P

C

K

M

I

A

P

I

L

D

E

Ξ

A

D

E

Y

Q

G

K

L

T

V

A

K

L

N

I

D

Q

N

P

G

T

A

P

K

Y

G

I

R

G

I

P

T

L

L

L

F

K

N

G

E

V

A

A

T

K

V

G

A

L

s

K

G

Q

L

K

E

F

L

D

A

N

L

A

G

s

G

S

G

H

M

H

H

H

H

H

H

S

S

G

G

M

K

E

T

A

A

A

K

F

E

R

Q

H

M

D

S

P

D

L

G

T

Identyfikator sekwencji: sekw. Nr 3

Długość sekwencji: 153

Typ sekwencji: aminokwasowa

Organizm: syntetyczna

Inne informacje: Fragment sekwencji pomocniczych (z pET32a(+))

SEQ. ID. nr 4

M

S

D

K

I

I

H

L

T

D

D

S

F

D

T

D

V

L

K

A

D

G

A

I

L

V

D

F

W

A

E

W

c

G

P

c

K

M

I

A

P

I

L

D

E

I

A

D

E

Y

Q

G

K

L

T

V

A

K

L

N

I

D

Q

N

P

G

T

A

P

K

Y

G

I

R

G

I

P

T

L

L

L

F

K

N

G

E

V

A

A

T

K

V

G

A

L

S

K

G

Q

L

K

E

F

L

D

A

N

L

A

G

s

G

S

G

H

M

H

H

H

H

H

H

S

S

G

-

Y

P

R.

G

G

M

K

E

T

A

A

A

K

F.

E

R

Q

H

M

D

S

P

D

L

G

T

D

F

V

N

Q

H

L

C

G

s

H

L

V

E

A

L

Y

L

V

C

G

E

R

G

F

F

Y

T

P

K

T

1

M

E

A

E

D

L

Q

V

G

Q

V

E

L

PL 233 560 Β1

GGGPGAGSLQPLALEGSLQ g D D D Si GIVEQCCT SICSLYQLENYCN

Identyfikator sekwencji: sekw. Nr 4

Długość sekwencji: 251

Typ sekwencji: aminokwasowa Organizm: syntetyczna

Inne informacje: P_MatoionHI_l

SEQ. ID. nr 5

MHHHHHHKFVNQHLCGSH

LVEALYLVCGERGF

Y T P K T UH EAEDLQVGQVELGGGPGAGSLQPLAL

E G S L Q igg; GIVEQCCTSICSLYQLENYCN

Identyfikator sekwencji: sekw. Nr 5

Długość sekwencji: 94

Typ sekwencji: aminokwasowa

Organizm: syntetyczna

Inne informacje: Met-HisTag-proinsulina

SEQ. ID. nr 6 ||fvnqhlcgshlvealylvcgergffytpkt

EAEDLQVGQVELGGGPGAGSLQPLALEGSLQKRG

IVEQCCTSICSLYQLENYCN

Identyfikator sekwencji: sekw. Nr 6

Długość sekwencji: 88

Typ sekwencji: aminokwasowa

Organizm; syntetyczna

Inne informacje: mMabionIIj_l

SEQ. ID. nr 7

MSDKIIHLTDDSFDTDVLKADGAILVDFWAEWCGP CKMIAPILDEIADEYQGKLTVAKLNIDQNPGTAPK YGIRGIPTLLLFKNGEVAATKVGALSKGQLKEFLD ANLAGSGSGHMHHHHHHSSG j&Y OFgH GMKE TAAAK fe.rqhmdspdlgt||fvnqhlcgshlvealylvcg ERGFFYTPKT EAEDLQVGQVELGGGPGAGSLQ

PLALEGSLQ GIVEQCCTSICSLYQLENYCN

Identyfikator sekwencji: sekw. Nr 7

Długość sekwencji: 241

Typ sekwencji: aminokwasowa

Organizm: syntetyczna

PL 233 560 Β1

Inne informacje: P_mMabionIL 1

SEQ. ID. nr 8

FVNQHLCGS

HLVEALYLVCGERGFFYT

QCCTSICSLYQLENYCN

Identyfikator sekwencji: sekw. Nr 8

Długość sekwencji: 51

Typ sekwencji: aminokwasowa

Organizm: syntetyczna

Inne informacje: MabionlL^l

SEQ. ID. nr 9

I I F V N QH

E A E D L QV

I V E Q C CT ari a

G S L Q G

L C G S H L

G Q V E L G S I C S L Y sekw. Nr 9

Identyfikator sekwencji:

Długość sekwencji: 88

Typ sekwencji: aminokwasowa

Organizm: syntetyczna

Inne informacje

SEQ. ID. nr 10

M

s

D

K

I

I

H

L

T

D

D

S

F

D

T

D

V

P

c

K

M

I

A

P

I

L

D

E

I

A

D

E

Y

Q

P

K

Y

G

I

R

G

I

P

T

L

L

L

F

K

N

G

F

L

D

A

N

L

A

G

S

G

S

G

H

M

H

H

H

A

A

A

K

F

E

R

Q

H

M

D

S

P

D

L

G

T

Y

L

V

c

G

E

R

G

F

F

Y

T

T

iaa

A

G

S

L

Q

P

L

A

L

E

G

s

L

Q

i

G

Y

C

N

Identyfikator sekwencji: sekw. Nr 10

Długość sekwencji: 241

Typ sekwencji: aminokwasowa Organizm: syntetyczna

LKADGAILVDFWAEWCG

GKLTVAKLNIDQNPGTA EVAATKVGALSKGQLKE Η Η H S S G G Μ K E T ||fvnqhlcgshlveal

EAEDLQVGQVELGGGPG IVEQCCTSICSLYQLEN

Inne informacje: P mMabionILisPro 1

SEQ. ID. nr 11

FVNQHLCGSHLVEALY

QCCTSICSLYQLENYC

LVCGERGFFYT Mi T G I V E

N

Identyfikator sekwencji: sekw. Nr 11

PL 233 560 Β1

Długość sekwencji: 51

Typ sekwencji: aminokwasów

Organizm: syntetyczna

Inne informacje: MabionILisPro_l

SEQ. ID. nr 12

MM FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYT

EAEDLQVGQVELGGGPGAGSLQPLALEGS

IVEQCCTSICSLYQLENYCG

Identyfikator sekwencji: sekw. Nr 12

Długość sekwencji: 88

Typ sekwencji: aminokwasowi

Organizm: syntetyczna

Inne informacje: mMabionIGlargine_l

SEQ. ID. nr 13

IHLTDDSFDTDVLKADGAT

LVDFWAEWCG

PCKMIAPILDE

IADEYQGKLTVAKLNT

PKYGIRGIPTLLLFKNGE FLDANLAGSGSGHMHHHH TAAAKFERQHMD. ŚPDLGT LYLVCGERGFFYTPKTRR GAGSLQPLALEGSLQ Mi G

VAATKVGALSKGQLKE

HHSSGŁ*' PŁe S G Met K E

Mi FVNQHLCGSHLVEA

EAEDLQVGQVELGGGP IVEQCCTSICSLYQLE

Identyfikator sekwencji: sekw. Nr 13

Długość sekwencji: 241

Typ sekwencji: aminokwasowa

Organizm: syntetyczna

Inne informacje: ?jnMabionIGlargine_l

SEQ. ID. nr 14

FVNQHLCGSHLVEALYL

GIVEQCCTSICSLYQLE

YCGERGFFYTPKT

N Y C G

Identyfikator sekwencji: sekw. Nr 14

Długość sekwencji: 53

Typ sekwencji: aminokwasowa

Organizm: syntetyczna

Inne informacje: MabionIGlargine_l

Claims (12)

1. Zastrzeżenia patentowe

   1. Sposób otrzymywania insuliny lub analogu insuliny z prekursora rekombinowanego białka, obejmujący następujące etapy:

   a. ekspresja prekursora rekombinowanego białka w E. Coli;

   b. otrzymanie prekursora rekombinowanego białka z bakterii;

   c. izolowanie i opcjonalnie wstępne oczyszczanie prekursora;

   d. trawienie enzymatyczne otrzymanego prekursora rekombinowanego białka;

   znamienny tym, że używa się proteazy Kex2 w warunkach in vitro hydrolizującej jedno lub więcej wiązań peptydowych znajdujących się w tym białku, przy czym proteaza przerywa wiązanie peptydowe od strony C końca aminokwasu zasadowego, kiedy aminokwas ten występuje jako drugi w kolejności po innym zasadowym lub obojętnym aminokwasie a kolejność ta umożliwia specyficzne rozpoznanie obydwu aminokwasów przez proteazę, zaś prekursor zawiera na końcu N' insuliny lub analogu insuliny dwa aminokwasy wybrane z grupy składającej się z lizyny - argininy (KR) i argininy - argininy (RR).
2. 2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że otrzymane po działaniu proteazy białko poddaje się działaniu drugiej proteazy, którą stanowi egzopeptydaza hydrolizująca jedno lub więcej wiązań peptydowych aminokwasu zasadowego znajdującego się na C końcu białka.
3. 3. Sposób według zastrzeżenia 1 albo 2, znamienny tym, że parę aminokwasów stanowią aminokwas obojętny i zasadowy.
4. 4. Sposób według zastrzeżenia 1 albo 2, znamienny tym, że parę aminokwasów rozpoznawaną przez proteazę stanowią dwa aminokwasy zasadowe takie jak lizyna - arginina albo arginina - arginina albo lizyna - lizyna.
5. 5. Sposób według zastrz. 2, znamienny tym, że egzopeptydazę stanowi Kex1 albo karboksypeptydaza B w zastosowaniu in vitro.
6. 6. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że reakcja proteolizy przebiega w warunkach buforu TrisHCl.
7. 7. Sposób według zastrz. 6, znamienny tym, że stężenie buforu TrisHCl wynosi 30-100 mM.
8. 8. Sposób według zastrz. 6, znamienny tym, że pH wynosi 7,0-8,5.
9. 9. Sposób według zastrz. 6, znamienny tym, że stężenie NaCI wynosi 0-50 mM.
10. 10. Sposób według zastrz. 6, znamienny tym, że stężenie CaCl2 wynosi 1-10 mM.
11. 11. Sposób według zastrz. 6, znamienny tym, że stężenie glicerolu wynosi 5-15%.
12. 12. Sposób według zastrz. 6, znamienny tym, że stosunek ilościowy prekursora białka rekombi- nowanego do proteazy wynosi 1:10-1:400.