JP4291900B2

JP4291900B2 - 正しく結合したシスチン橋を有するインスリン前駆体を取得するための改良された方法

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Publication number: JP4291900B2
Application number: JP23036898A
Authority: JP
Inventors: フランツ−ヨーゼフ・ルプレーダー; ラインホルト・ケラー
Original assignee: サノフィ−アベンティス・ドイチュラント・ゲゼルシャフト・ミット・ベシュレンクテル・ハフツング
Priority date: 1997-08-18
Filing date: 1998-08-17
Publication date: 2009-07-08
Anticipated expiration: 2018-08-17
Also published as: ATE217636T1; ES2176870T3; DE59803985D1; BRPI9816233B1; JPH11130798A; CZ259898A3; EP0906918A2; DE19735711C2; EP0980874A1; PL191901B1; CA2245151A1; CN101186940B; TR199801587A2; ID20717A; DK0980874T3; EP0906918A3; CN1209437A; US6380355B1; KR19990023651A; PT906918E

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、正しく結合したシスチン橋を有するインスリンまたはインスリン誘導体の前駆体をシステインまたはシステイン塩酸塩およびカオトロピック補助剤の存在下に得る改良された方法に関する。
【０００２】
【従来技術】
ヒトインスリンは、両者で５１個のアミノ酸残基を有する２個のアミノ酸鎖からなるタンパク質である。２個のアミノ酸鎖中には６個のシステイン残基が見出され、それぞれ２個のシステイン残基は互いにジスルフィド橋を介して結合している。生物活性ヒトインスリンでは、ＡおよびＢ鎖は互いに２個のシスチン橋を介して結合し、さらに１個のシスチン橋がＡ鎖中に見出される。ヒトインスリン分子内には、統計学的にみて、ジスルフィド橋の形成には１５の可能性がある。生物活性ヒトインスリンには、１５の可能性中の１個のみが認められる。ヒトインスリンでは、以下のシステイン残基が互いに連結している。
Ａ６−Ａ11
Ａ７−Ｂ７
Ａ20−Ｂ19
ＡおよびＢの文字はそれぞれのインスリンアミノ酸鎖を示し、数字はそれぞれのアミノ酸鎖のアミノ末端からカルボキシル末端に向けて数えたアミノ酸残基の位置を表す。ジスルフィド橋は２個のヒトインスリン分子の間に形成されることも可能で、無数に多数の異なるジスルフィド橋が容易に生成できる。
【０００３】
ヒトインスリンの既知の製造方法はヒトプロインスリンの使用に基づくものである。ヒトプロインスリンは８６アミノ酸残基の直鎖状アミノ酸鎖を有するタンパク質であり、ヒトインスリンのＢおよびＡ鎖は３５個のアミノ酸残基を有するＣペプチドを介して互いに結合している。ヒトインスリンに見出されるジスルフィド結合の形成は、ヒトインスリンのシステイン残基が硫黄保護基たとえばＳ−スルホネート（−Ｓ−ＳＯ₃ ^-）基で提供される中間体を介して起こる（EP 0 037 255号）。正しく結合したシスチン橋を有するプロインスリンを得る方法も同じく知られていて（Biochemistry, 60, 1968；622−629）、システイン残基がチオール残基（−ＳＨ）として存在するブタ膵臓から得られるプロインスリンに出発する。「正しく結合したシスチン橋」の語は哺乳動物からの生物活性インスリン中に見出されるジスルフィド橋を意味するものと理解すべきである。
【０００４】
組換えＤＮＡ法は、インスリンまたはインスリン誘導体の前駆体、とくにヒトプロインスリンまたはヒトインスリンとは異なるアミノ酸配列および／またはアミノ酸鎖長を有するプロインスリンの微生物における製造を可能にする。遺伝子修飾された大腸菌細胞から調製されるプロインスリンは正しく結合したシスチン橋をもたない。大腸菌を用いてヒトインスリンを取得する方法は以下の工程に基づくものである（EP 0 055 945号）。すなわち、微生物の発酵−細胞の破砕−融合タンパク質の単離−融合タンパク質のシアノーゲンハライドによる切断−プロインスリン配列を有する切断生成物の単離−プロインスリンのシスチン残基のＳ−スルホネート基による保護−Ｓ−スルホネートのクロマトグラフィーによる精製−正しく結合したシスチン橋の形成−プロインスリンの脱塩−正しく結合したシスチン橋を有するプロインスリンのクロマトグラフィーによる精製−プロインスリン溶液の濃縮−濃縮されたプロインスリン溶液のクロマトグラフィーによる精製−プロインスリンの酵素的切断によるヒトインスリンの取得−得られたヒトインスリンのクロマトグラフィーによる精製である。
【０００５】
この方法の欠点は、工程数と精製工程における損失によるインスリンの低収率である。多段階過程経路のために、かなりの損失を見込まねばならない。単離された融合タンパク質のシアノーゲンハライドによる切断、スルフィトリシスおよびプロインスリンの精製の段階から、プロインスリンの４０％までの損失が見込まれる（EP 0 055 945号）。同様に、以後の精製工程から最終生成物までの経過で多量の損失が起こり得る。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
必要な工程数を有意に減らすことがでれば、ヒトインスリンまたはインスリン誘導体の組換えＤＮＡ法による製造の収率の上昇を達成することができる。
【０００７】
EP 0 600 372 A1号（またはUS 5,473,049号）および EP 0 668 292 A2号には、インスリンまたはインスリン誘導体を得る適切に改良された方法において、シスチン橋が正しい連結型で存在しないインスリン前駆体またはインスリン誘導体の前駆体を、メルカプタンたとえばシステイン、ならびに少なくとも１種のカオトロピック補助剤たとえば尿素またはグアニジン塩酸塩の存在下に反応させて正しく結合したシスチン橋を有するインスリン前駆体またはインスリン誘導体の前駆体を得る方法が開示されている。この既知の方法においては、これらのタンパク質は最初１種のカオトロピック補助剤または様々なカオトロピック補助剤の混合物の水溶液にきわめて低濃度で溶解される。タンパク質混合物はついでメルカプタン水溶液と混合される。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
驚くべきことに、前駆体を最初の工程でカオトロピック補助剤を用いて溶液にせず、最初にメルカプタンを導入することにより、すなわちシステインまたはシステイン塩酸塩を前駆体の水性懸濁液中に導入し、前駆体を溶解させたのちに初めて、次の工程でカオトロピック補助剤の水溶液中に導入し、最後に、混合物を適当な量の水に導入して好ましいシステインまたはシステイン塩酸塩濃度に希釈して正しくフォールディングした前駆体に導くと、正しくフォールディングしたインスリンまたはインスリン誘導体の前駆体の収率を上昇させ、フォールディング過程の反応時間を短縮できることが見出されたのである。
【０００９】
したがって、本発明は、正しく結合したシスチン橋を有するインスリンまたはインスリン誘導体の前駆体をシステインまたはシステイン塩酸塩およびカオトロピック補助剤の存在下に得る方法において、
(ａ) インスリンまたはインスリン誘導体の前駆体の水性懸濁液を、その前駆体のシステイン残基あたりシステインまたはシステイン塩酸塩の１〜１５ＳＨ残基を生じる量のシステインまたはシステイン塩酸塩と混合し、
(ｂ) ｐＨ約８〜約１１.５、温度約１５〜約５５℃においてカオトロピック補助剤の４〜９モル溶液中に、前駆体のシステインまたはシステイン塩酸塩含有懸濁液を導入し、得られた混合物をこの温度に約１０〜６０分間保持し、
(ｃ) ｐＨ約８〜約１１.５、温度約５〜約３０℃の混合物を、混合物中のシステインまたはシステイン塩酸塩の濃度を約１〜５ｍＭ、カオトロピック補助剤の濃度を０.２〜１.０Ｍに希釈する量の水に導入する
各工程を連続的に実施することからなる方法に関する。
【００１０】
好ましくは、本発明の方法は、
工程(ａ)においては、システインまたはシステイン塩酸塩の量は前駆体のシステイン残基あたりシステインまたはシステイン塩酸塩の１〜６ＳＨ残基を生じる量に相当し、
工程(ｂ)においては、前駆体のシステインまたはシステイン塩酸塩含有懸濁液をｐＨ８〜１１、温度３０〜４５℃においてカオトロピック補助剤の４〜９モル溶液中に導入し、得られた混合物をこの温度に約２０〜４０分間保持し、
工程(ｃ)においては、混合物をｐＨ８〜１１、温度１５〜２０℃で、混合物中のシステインまたはシステイン塩酸塩の濃度を約１〜５ｍＭ、カオトロピック補助剤の濃度を０.２〜１.０Ｍに希釈する量の水に導入する方法である。
【００１１】
カオトロピック補助剤は、水溶液中において水素橋を破壊する化合物であり、たとえば硫酸アンモニウム、グアニジン塩酸塩、エチレンカルボネート、チオシアナート、ジメチルスルホキシドおよび尿素である。
【００１２】
本発明の方法において用いられるカオトロピック補助剤は、好ましくはグアニジン、グアニジン塩酸塩、またはとくに好ましくは尿素である。
【００１３】
本発明の方法の工程(ｂ)におけるカオトロピック補助剤の濃度は好ましくは７.０〜９Ｍであり、工程(ｂ)の温度は好ましくは４０℃であり、工程(ｂ)におけるｐＨは好ましくは１０〜１１である。
【００１４】
本発明の方法において、工程(ｃ)におけるｐＨは好ましくは１０〜１１である。本発明の工程(ｃ)においては、混合物が導入される水の量は好ましくは混合物中のシステインまたはシステイン塩酸塩の濃度を２.５〜３ｍＭ、カオトロピック補助剤の濃度を０.５Ｍに希釈するように選択される。
【００１５】
本発明の方法ではとくに好ましくは、工程(ｂ)におけるカオトロピック補助剤の濃度は約８Ｍであり、工程(ｂ)における温度は約４０℃であり、工程(ｂ)におけるｐＨは約１０.６であり、工程(ｃ)におけるｐＨは約１０.６であり、工程(ｃ)における水の量は混合物中のシステインまたはシステイン塩酸塩の濃度を約２.５〜３ｍＭ、カオトロピック補助剤の濃度を０.５Ｍに希釈する方法である。
【００１６】
本発明の方法の結果は、インスリンまたはインスリン誘導体の前駆体であり、とくにそのシスチン橋が正しく結合したプロインスリンである。
【００１７】
インスリン誘導体は、天然に存在するインスリンすなわちヒトインスリン（配列表参照、配列番号：１＝ヒトインスリンのＡ鎖、配列番号：２＝ヒトインスリンのＢ鎖）または動物インスリンの誘導体であり、天然に存在するアミノ酸残基の少なくとも１個の置換および／または少なくとも１個のアミノ酸残基および／または有機残基の付加によって異なり、相当する他の点では天然に存在するインスリンと同一の誘導体である。
【００１８】
本発明の方法を使用して得られ、正しく結合したシスチン橋を有するインスリンまたはインスリン誘導体の前駆体から最終的に EP 0 600 372 A1号（またはUS 5,473,049号）または EP 0 668 292 A2号に記載の方法に従い、トリプシンまたはトリプシン様酵素を用い、また所望によりさらにカルボキシペプチダーゼＢを用いる酵素分解ついで吸着樹脂上での精製により、正しく結合したシスチン橋を有するインスリンまたはインスリン誘導体を調製することができる。
【００１９】
前駆体から調製できるインスリンまたはインスリン誘導体は、好ましくは式Ｉ：
【化１】

［式中、
Ｙは、遺伝子によってコ−ド可能なアミノ酸残基であり、
Ｚは、
ａ）Ｈis、ＡrgおよびＬysよりなる群からのアミノ酸残基であるか、
ｂ）ペプチドのカルボキシル末端はアミノ酸残基ＡrgまたはＬysからなる２または３個のアミノ酸残基を有するペプチドであるか、
ｃ）遺伝子によってコ−ド可能な２〜３５個のアミノ酸残基を有し、１〜５個のヒスチジン残基からなるペプチドであるか、
ｄ）ＯＨであり、
Ｒ¹は、フェニルアラニン残基（Ｐhe）または共有結合であり、
Ｒ³は、遺伝子によってコ−ド可能なアミノ酸残基であり、
ヒトインスリンのＡ鎖のアミノ酸配列の残基Ａ2−Ａ20（式Ｉの簡略化のために示していない）は動物インスリンまたはインスリン誘導体に相当し、ヒトインスリンのＢ鎖のアミノ酸配列の残基Ｂ2−Ｂ29（式Ｉの簡略化のため示していない）は動物インスリンまたはインスリン誘導体に相当する］
によって記載することができる。
【００２０】
ペプチドおよびタンパク質のアミノ酸配列は、アミノ酸鎖のＮ−末端から前方に指示される。括弧内の式Ｉの細部たとえばＡ６、Ａ20、Ｂ１、Ｂ７またはＢ19はインスリンのＡまたはＢ鎖におけるアミノ酸残基の位置に相当する。
【００２１】
「遺伝子によってコ−ド可能なアミノ酸残基」の語は、アミノ酸Ｇly、Ａla、Ｓer、Ｔhr、Ｖal、Ｌeu、Ｉle、Ａsp、Ａsn、Ｇlu、Ｇln、Ｃys、Ｍet、Ａrg、Ｌys、Ｈis、Ｔyr、Ｐhe、Ｔrp、Ｐroおよびセレノシステインを表す。
【００２２】
動物インスリンの「残基Ａ2−Ａ20」および「残基Ｂ2−Ｂ29」の語はたとえば、ウシ、ブタまたはニワトリからのインスリンのアミノ酸配列の意味として理解される。インスリン誘導体の「残基Ａ2−Ａ20」および「残基Ｂ2−Ｂ29」の語はアミノ酸の遺伝子によってコ−ド可能な他のアミノ酸による置換によって形成されるヒトインスリンの相当するアミノ酸配列を表す。
【００２３】
ヒトインスリンのＡ鎖は、たとえば以下の配列（配列番号：１）：
Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln Leu
Glu Asn Tyr Cys Asn
を有する。
ヒトインスリンのＢ鎖は、たとえば以下の配列（配列番号：２）：
Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr
Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr
を有する。
この場合、式ＩにおいてＲ³はアスパラギン（Ａsn）、Ｒ¹はフェニルアラニン(Ｐhe）、Ｙはスレオニン（Ｔhr）、ＺはＯＨである。
【００２４】
本発明の方法はしたがって、式II：
Ｒ²−Ｒ¹−(Ｂ2−Ｂ29)−Ｙ−Ｘ−Ｇly−(Ａ2−Ａ20)−Ｒ³ (II)
［式中、
Ｒ²は、
ａ）水素原子、
ｂ）リジン（Ｌys）およびアルギニン（Ａrg）よりなる群からのアミノ酸残基、または
ｃ）ペプチドのカルボキシル末端はアミノ酸残基リジン（Ｌys）またはアルギニン（Ａrg）である２〜４５個のアミノ酸残基を有するペプチドであり、
Ｒ¹は、フェニルアラニン残基（Ｐhe）または共有結合であり、
(Ｂ2−Ｂ29) は、ヒトインスリン、動物インスリンまたはこれらの位置の１個または２個以上が任意に変化したインスリン誘導体のＢ鎖の位置Ｂ2−Ｂ29におけるアミノ酸残基であり、Ｙは、遺伝子によってコ−ド可能なアミノ酸残基であり、
Ｘは、
ａ）リジン（Ｌys）およびアルギニン（Ａrg）よりなる群からのアミノ酸残基であるか、または
ｂ）ペプチドのＮ−末端およびカルボキシル末端はアミノ酸残基リジン（Ｌys）またはアルギニン（Ａrg）である２〜３５個のアミノ酸残基を有するペプチドであるか、または
ｃ）遺伝子によってコ−ド可能な２〜３５個のアミノ酸を有し、１〜５個のヒスチジン残基からなるペプチドであり、
(Ａ2−Ａ20) は、ヒトインスリン、動物インスリンまたはこれらの位置の１個または２個以上が任意に変化したインスリン誘導体のＢ鎖の位置Ａ2−Ａ20におけるアミノ酸残基であり、
Ｒ³は、遺伝子によってコ−ド可能なアミノ酸残基である］
を有し、そのシスチン橋（式IIには示していない）が正しくフォールデフィングされているインスリンまたはインスリン誘導体の前駆体の取得にとくに適している。
【００２５】
１. 式IIにおいては、好ましくは
Ｒ²は、
ａ）水素原子、または
ｂ）ペプチドのカルボキシル末端はアミノ酸残基アルギニン（Ａrg）である２〜２５個のアミノ酸残基を有するペプチドであり、
Ｒ¹は、フェニルアラニン残基（Ｐhe）であり、
(Ｂ2−Ｂ29) は、ヒトインスリンのＢ鎖の位置Ｂ2−Ｂ29におけるアミノ酸残基であり、
Ｙは、アラニン（Ａla）、スレオニン（Ｔhr）およびセリン（Ｓer）よりなる群からのアミノ酸残基であり、
Ｘは、アミノ酸残基（Ａrg）であるか、ヒトインスリンのＣ鎖のアミノ酸配列を有するペプチドであり、
(Ａ2−Ａ20) は、ヒトインスリンのＢ鎖の位置Ａ2−Ａ20におけるアミノ酸残基であり、
Ｒ³は、アスパラギン（Ａsn）、セリン（Ｓer）およびグリシン（Ｇly）よりなるアミノ酸残基である。
【００２６】
ヒトインスリンのＣ鎖は以下の配列（配列番号：３）：
Arg Arg Glu Ala Glu Asp Leu Gln Val Gly Gln Val Glu Leu Gly Gly
Gly Pro Gly Ala Gly Ser Leu Gln Pro Leu Ala Leu Glu Gly Ser Leu
Gln Lys Arg
を有する。
【００２７】
２．式IIにおいては、好ましくは
Ｒ²は、
ａ）水素原子、または
ｂ）カルボキシル末端はアルギニン（Ａrg）である２〜１５個のアミノ酸残基を有するペプチドであり、
Ｒ¹は、フェニルアラニン残基（Ｐhe）であり、
(Ｂ2−Ｂ29) は、ヒトインスリンのＢ鎖の位置Ｂ2−Ｂ29におけるアミノ酸残基であり、
Ｙは、スレオニン残基（Ｔhr）であり、
Ｘは、アミノ酸残基アルギニン（Ａrg）、またはペプチドの最初および末端に２個の塩基性アミノ酸残基とくにアルギニン（Ａrg）および／またはリジン（Ｌys）がある２〜３５個のアミノ酸残基を有するペプチドであり、
(Ａ2−Ａ20) は、ヒトインスリンのＢ鎖の位置Ａ2−Ａ20におけるアミノ酸残基であり、
Ｒ³は、アミノ酸残基、アスパラギン(Ａsn）またはグリシン(Ｇly）である。
【００２８】
式Ｉのインスリンまたはインスリン誘導体の残基Ｚは、一般に、式IIの前駆体のＸのアミノ酸配列の部分であり、プロテアーゼたとえばトリプシン、トリプシン様酵素またはカルボキシペプチダーゼＢの活性により生成する。基Ｒ³はインスリンのＡ鎖の位置Ａ21に存在するアミノ酸残基である。基ＹはインスリンのＢ鎖の位置Ｂ30に存在するアミノ酸残基である。
【００２９】
トリプシンまたはトリプシン様酵素はアルギニンまたはリジン残基でアミノ酸鎖を切断するプロテアーゼである。カルボキシペプチダーゼＢはアミノ酸鎖のカルボキシル末端に存在するＡrgまたはＬysのような塩基性アミノ酸を除去するエキソプロテアーゼである（Kemmlerら、J. Biol. Chem., 246：6786-6791)。
【００３０】
項１に述べた前駆体から、たとえば、正しく連結したシスチン橋を有する式Ｉ(式中、Ｙ、Ｒ¹、Ｒ²、Ｒ³、Ａ2−Ａ20 およびＢ2−Ｂ29 は項１において述べた意味を有し、Ｚは、アルギニン残基（Ａrg)、ペプチド残基Ａrg−Ａrg、または−ＯＨである）のインスリンまたはインスリン誘導体を得ることができる。
【００３１】
項２に述べた前駆体から、たとえば、正しく連結したシスチン橋を有する式Ｉ(式中、Ｙ、Ｒ¹、Ｒ²、Ｒ³、Ａ2−Ａ20 およびＢ2−Ｂ29 は項２において述べた意味を有し、Ｚは、アルギニン残基（Ａrg）、ペプチド残基Ａrg−Ａrg、もしくはＬys−Ｌysまたは−ＯＨである）のインスリンまたはインスリン誘導体を得ることができる。
【００３２】
式IIの前駆体は、多数の遺伝子構築体を用いて微生物中で形成させることができる（EP 0 489 780号、EP 0 347 781号、EP 0 453 969号）。遺伝子構築体は大腸菌または放線菌のような微生物の発酵時に発現される。形成されるタンパク質は微生物の内部に沈積するか（EP 0 489 780号）、または発酵溶液中に分泌される。
【００３３】
本発明の方法には、式IIのインスリンまたはインスリン誘導体の前駆体を、細胞破砕後直ちに、発酵溶液および微生物に由来する多数のタンパク質が夾雑したまま使用することができる。しかしながら、式IIの前駆体はたとえば沈殿またはクロマトグラフィー精製後の前精製型で使用することもできる。
【００３４】
【実施例】
実施例１（比較例、従来技術）
遺伝子修飾された大腸菌細胞の発酵（EP 0 489 780号）により、以下のアミノ酸配列を有する融合タンパク質：プロインスリン配列１（配列番号：４）
Ala Thr Thr Ser Thr Gly Asn Ser Ala Arg Phe Val Asn Gln His Leu
Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg
Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr Arg Arg Glu Ala Glu Asp Leu Gln
Val Gly Gln Val Glu Leu Gly Gly Gly Pro Gly Ala Gly Ser Leu Gln
Pro Leu Ala Leu Glu Gly Ser Leu Gln Lys Arg Gly Ile Val Glu Gln
Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln Leu Glu Asn Tyr Cys Asn
を調製する。
プロインスリン配列１は式IIに相当し、この式において、
Ｘは、ヒトインスリンからのＣ−ペプチド（配列番号：３）であり、
Ｙは、Ｔhr（Ｂ30）であり、
Ｒ¹は、Ｐhe（Ｂ１）であり、
Ｒ²は、１０アミノ酸残基を有するペプチドであり、
Ｒ³は、Ａsn（Ａ21）であり、
Ａ2−Ａ20は、ヒトインスリンのＡ鎖のアミノ酸配列（アミノ酸残基２〜２０)であり、Ｂ2−Ｂ29はヒトインスリンのＢ鎖のアミノ酸配列（アミノ酸残基２〜２９）である。
【００３５】
プロインスリン配列１を有する発現した融合タンパク質は大腸菌内に集まり、封入体を形成する。発酵完了後、これらの細胞を遠心分離によって分離し、慣用の高圧ホモジナイゼーションによって破砕する。放出された融合タンパク質封入体を遠心分離で単離する。
【００３６】
プロインスリン配列１を有する単離された融合タンパク質封入体２０kg（凍結乾燥後の乾燥材料に基づく。インスリン含有融合タンパク質の割合はＨＰＬＣを用いて測定する。５０％）をｐＨ１０.６で８Ｍ尿素溶液５５０Ｌに溶解する。必要に応じて濁りを生じる少量の物質を遠心分離したのち、澄明な溶液をｐＨ１０.６、温度４℃で９０００Ｌのシステイン（システイン塩酸塩水和物５kg）の水溶液中に攪拌しながら加える。２４時間後、フォールディング反応が完結したのち、反応バッチ中の正しく結合したシスチン橋を有するプロインスリン配列１の含量は、分析用ＨＰＬＣを用いて３.０kgと測定され、３０％の変換に相当する。
【００３７】
この９５００Ｌの溶液を１ＮＨＣｌを用いてｐＨ５.０に調整して分離する。ついで１Ｎ水酸化ナトリウム溶液を加えてｐＨを９にセットする。この溶液にトリプシン３ｇを加える。ＨＰＬＣで測定すると、２−カルボキシ末端アルギニン残基を有するインスリン１.２５kgが得られる。
【００３８】
カルボキシペプチダーゼＢを用いて切断したのち、ヒトインスリンが得られ、これをクロマトグラフィー法を用いてさらに精製する。ヒトインスリンは式Ｉに相当し、この式において、
Ｙは、Ｔhr（Ｂ30）であり、
Ｚは、ＯＨであり、
Ｒ¹は、Ｐhe（Ｂ１）であり、
Ｒ³は、Ａsn（Ａ21）であり、
Ａ2−Ａ20は、ヒトインスリンのＡ鎖のアミノ酸配列（アミノ酸残基２〜２０)であり、Ｂ2−Ｂ29はヒトインスリンのＢ鎖のアミノ酸配列（アミノ酸残基２〜２９）である。
【００３９】
ヒトインスリン２は配列番号：１および２から構成され、それらは互いに正しく結合したシスチン橋を介して連結している。
EP 0 668 292号に記載されているように、溶液を濃縮し、吸着樹脂を用いて精製する。インスリン２を含有する溶出液は、水で希釈し、ｐＨを調整したのち直ちに、さらにクロマトグラフィーカラム上で精製することができる。
【００４０】
ＨＰＬＣ分析
０.５ｇのタンパク質を、６Ｍのグアニジン塩酸塩、５０ｍＭＴris、ｐＨ８.５、５ｍＭエチレンジアミン四酢酸塩（ＥＤＴＡ）、１％の１,２−メルカプトエタノール、１０ｍＭジチオスレイトールの溶液４０ml中に９５℃で２分間溶解し、ついで１４０００ｇで２０分間遠心分離した。澄明な上清０.０２mlを高速液体クロマトグラフィーカラムに適用する。
カラム：Nucleogel（登録商標）RP 300−5／46（Macherey & Nage, Aachen, Germany）
勾配：
緩衝液Ａ：０.１％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）
緩衝液Ｂ：アセトニトリル中０.０９％ＴＦＡ
温度：５５℃
総溶出時間：４０分
勾配は、相当する溶出時間後に緩衝液Ｂの以下の量によって設定する：
１０分２５％、１２分６０％、１３分９０％、１５分１００％
流速：１ml／分
検出：２１５nm
インスリンの保持時間：約１９分
【００４１】
実施例２（本発明の方法）
遺伝子修飾された大腸菌細胞の発酵（EP 0 489 780号）により、実施例１に示したアミノ酸配列を有する融合タンパク質を調製する（プロインスリン配列１、配列番号：４）
【００４２】
プロインスリン配列１を有する発現した融合タンパク質は大腸菌内に集まり、封入体を形成する。発酵完了後、これらの細胞を遠心分離によって分離し、慣用の高圧ホモジナイゼーションによって破砕する。放出した融合タンパク質封入体を遠心分離で単離する。
【００４３】
融合タンパク質４０kg（アリコートの凍結乾燥によって測定）を含有する融合タンパク質の水性懸濁液に５kgのシステイン塩酸塩水和物を加える。
プロインスリン配列１を有する懸濁液（インスリン含有融合タンパク質の割合はＨＰＬＣで測定する。５０％）を４０℃、ｐＨ１０.２で８Ｍ尿素溶液５５０Ｌに溶解する。澄明な溶液をｐＨ１０.６、温度１５℃で９０００Ｌの水に攪拌しながら加える。約５時間後、フォールディング反応が完結したのち、反応バッチ中の正しく結合したシスチン橋を有するプロインスリン配列１の含量は分析用ＨＰＬＣを用いて１０.０kgと測定され、５０％の変換に相当する。
【００４４】
この９５００Ｌの溶液を１ＮＨＣｌを用いてｐＨ５.０に調整して分離する。ついで１Ｎ水酸化ナトリウム溶液を加えてｐＨを９にセットする。この溶液にトリプシン１０ｇを加える。２−カルボキシ末端アルギニン残基を有するインスリン４kgが得られる。カルボキシペプチダーゼＢを使用して切断すると、ヒトインスリン（正しく結合したシスチン橋を有する配列番号：１および２）が生じる。
【００４５】
溶液を濃縮し、吸着樹脂を用いて精製する。
ヒトインスリンを含有する溶出液は水で希釈し、ｐＨを調整したのち直ちに、さらにクロマトグラフィーカラム上で精製することができる。
【００４６】
実施例３（比較例、従来技術）
遺伝子修飾された大腸菌細胞の発酵（EP 0 489 780号）により、以下のアミノ酸配列を有する融合タンパク質：プロインスリン配列２（配列番号：５）
Ala Thr Thr Ser Thr Gly Asn Ser Ala Arg Phe Val Asn Gln His Leu
Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg
Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr Arg Arg Glu Ala Glu Asp Leu Gln
Val Gly Gln Val Glu Leu Gly Gly Gly Pro Gly Ala Gly Ser Leu Gln
Pro Leu Ala Leu Glu Gly Ser Leu Gln Lys Arg Gly Ile Val Glu Gln
Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln Leu Glu Asn Tyr Cys Gly
を調製する。
プロインスリン配列２は式IIに相当し、この式において、
Ｘは、ヒトインスリンのＣ−ペプチド（配列番号：３）であり、
Ｙは、Ｔhr（Ｂ30）であり、
Ｒ¹は、Ｐhe（Ｂ1）であり、
Ｒ²は、１０アミノ酸残基を有するペプチドであり、
Ｒ³は、Ｇly（Ａ21）であり、
Ａ2−Ａ20は、ヒトインスリンのＡ鎖のアミノ酸配列（アミノ酸残基２〜２０)であり、Ｂ2−Ｂ29はヒトインスリンのＢ鎖のアミノ酸配列（アミノ酸残基２〜２９）である。
【００４７】
プロインスリン配列２を有する発現した融合タンパク質は大腸菌内に集まり、封入体を形成する。発酵完了後、これらの細胞を遠心分離によって分離し、慣用の高圧ホモジナイゼーションによって破砕する。放出した融合タンパク質封入体を遠心分離で単離する。
【００４８】
プロインスリン配列２を有する単離された融合タンパク質封入体２０kg（凍結乾燥後の乾燥材料に基づく。インスリン含有融合タンパク質の割合はＨＰＬＣを用いて測定する。５０％）を、２０℃、ｐＨ１０.６において８Ｍ尿素溶液５５０Ｌに溶解する。澄明な溶液をｐＨ１０.６、温度４℃で９０００Ｌのシステイン（システイン塩酸塩水和物５kg）の水溶液中に攪拌しながら加える。２４時間後フォールディング反応が完結したのち、反応バッチ中の正しく結合したシスチン橋を有するプロインスリン配列２の含量は分析用ＨＰＬＣを用いて３.０kgと測定され、３０％の変換に相当する。
【００４９】
この９５００Ｌの溶液を１ＮＨＣｌを用いてｐＨ５.０に調整して分離する。ついで１Ｎ水酸化ナトリウム溶液を加えてｐＨを９にセットする。この溶液にトリプシン３ｇを加える。ＨＰＬＣで測定すると、２−カルボキシ末端アルギニン残基を有するインスリン誘導体０.９８kgが得られる。このインスリン誘導体は式Ｉに相当し、この場合、
Ｙは、Ｔhr（Ｂ30）であり、
Ｚは、Ａrg−Ａrgであり、
Ｒ¹は、Ｐhe（Ｂ１）であり、
Ｒ³は、Ｇly（Ａ21）であり、
Ａ2−Ａ20は、ヒトインスリンのＡ鎖のアミノ酸配列（アミノ酸残基２〜２０）であり、Ｂ2−Ｂ29はヒトインスリンのＢ鎖のアミノ酸配列（アミノ酸残基２〜２９）であり、これらは互いに正しく結合したシスチン橋を介して連結する配列番号：６および７から構成される。
【００５０】
溶液を濃縮し、吸着樹脂を用いて精製する。
インスリン誘導体を含有する溶出液は、水で希釈し、ｐＨを調整したのち直ちに、さらにクロマトグラフィーカラム上で精製することができる。
【００５１】
実施例４（本発明の方法）
遺伝子修飾された大腸菌細胞の発酵（EP 0 489 780号）により、実施例３に従ってプロインスリン配列２（配列番号：５）を有する融合タンパク質を調製する。
【００５２】
プロインスリン配列２を有する発現した融合タンパク質は大腸菌内に集まり、封入体を形成する。発酵完了後、これらの細胞を遠心分離によって分離し、慣用の高圧ホモジナイゼーションによって破砕する。放出した融合タンパク質封入体を遠心分離で単離する。
【００５３】
融合タンパク質４０kg（アリコートの凍結乾燥によって測定）を含有する融合タンパク質の水性懸濁液に５kgのシステイン塩酸塩水和物を加える。
プロインスリン配列２を有する懸濁液（インスリン含有融合タンパク質の割合はＨＰＬＣで測定する。５０％）を４０℃、ｐＨ１０.２で８Ｍ尿素溶液５５０Ｌに溶解する。澄明な溶液をｐＨ１０.６、温度１５℃で９０００Ｌの水に攪拌しながら添加する。約５時間後、フォールディング反応が完結したのち、反応バッチ中の正しく結合したシスチン橋を有するプロインスリン配列Ｉの含量は分析用ＨＰＬＣを用いて１０.０kgと測定され、５０％の変換に相当する。
【００５４】
この９５００Ｌの溶液を１ＮＨＣｌを用いてｐＨ５.０に調整して分離する。ついで１Ｎ水酸化ナトリウム溶液を加えてｐＨを９にセットする。この溶液にトリプシン１０ｇを加える。２.８kgのインスリン誘導体が生じ、これらは互いに正しく結合したシスチン橋を介して連結する配列番号：６および７から構成される。
【００５５】
溶液を濃縮し、吸着樹脂を用いて精製する。
インスリン誘導体を含有する溶出液は、水で希釈し、ｐＨを調整したのち直ちに、さらにクロマトグラフィーカラム上で精製することができる。
【００５６】
【配列表】

【００５７】

【００５８】

【００５９】

【００６０】

【００６１】

【００６２】

Claims

（ａ）インスリンまたはインスリン誘導体の前駆体の水性懸濁液をその前駆体のシステイン残基あたりシステインまたはシステイン塩酸塩の１〜１５ＳＨ残基を生じる量のシステインまたはシステイン塩酸塩と混合し、
（ｂ）ｐＨ１０〜１１、温度３０〜４５℃においてカオトロピック補助剤の７.０〜９モル溶液に前駆体のシステインまたはシステイン塩酸塩含有懸濁液を導入し、得られた混合物をこの温度に１０〜６０分保持し、ついで
（ｃ）ｐＨ１０〜１１、温度１５〜２０℃で混合物を混合物中のシステインまたはシステイン塩酸塩の濃度を１〜５ｍＭ、カオトロピック補助剤の濃度を０.２〜１.０Ｍに希釈する量の水に導入する
各工程を連続的に実施することからなる、正しく結合したシステイン橋を有するインスリンまたはインスリン誘導体の前駆体をシステインまたはシステイン塩酸塩およびカオトロピック補助剤の存在下に取得する方法。
工程(ａ)において、システインまたはシステイン塩酸塩の量は前駆体のシステイン残基あたりシステインまたはシステイン塩酸塩の１〜６ＳＨ残基を生じる量に相当し、
工程(ｂ)において、前駆体のシステインまたはシステイン塩酸塩含有懸濁液をｐＨ１０〜１１、温度３０〜４５℃でカオトロピック補助剤の７.０〜９モル溶液に導入し、得られた混合物をこの温度に２０〜４０分保持し、
工程(ｃ)において、混合物をｐＨ１０〜１１、温度１５〜２０℃で、混合物中のシステインまたはシステイン塩酸塩の濃度を１〜５ｍＭ、カオトロピック補助剤の濃度を０.２〜１.０Ｍに希釈する量の水に導入する請求項１に記載の方法。
カオトロピック補助剤はグアニジンまたはグアニジン塩酸塩である請求項１または２に記載の方法。
カオトロピック補助剤は尿素である請求項１または２に記載の方法。
工程(ｂ)における温度は４０℃である請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
工程(ｃ)における水の量は混合物中のシステインまたはシステイン塩酸塩の濃度を２.５〜３ｍＭ、カオトロピック補助剤の濃度を０.５Ｍに希釈する請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
工程(ｂ)におけるカオトロピック補助剤の濃度は８Ｍとし、工程(ｂ)における温度は４０℃であり、工程(ｂ)におけるｐＨは１０.６であり、工程(ｃ)におけるｐＨは１０.６であり、工程(ｃ)における水の量は混合物中のシステインまたはシステイン塩酸塩の濃度を２.５〜３ｍＭ、カオトロピック補助剤の濃度を０.５Ｍに希釈する請求項１〜６のいずれかに記載の方法。
インスリンまたはインスリン誘導体の前駆体は式II：
Ｒ²−Ｒ¹−(Ｂ2−Ｂ29)−Ｙ−Ｘ−Ｇly−(Ａ2−Ａ20)−Ｒ³ (II)
［式中、
Ｒ²は、
ａ）水素原子、または
ｂ）ペプチドのカルボキシル末端はアミノ酸残基アルギニン（Ａrg）である２〜25個のアミノ酸残基からなるペプチドであり、
Ｒ¹は、フェニルアラニン残基（Ｐhe）であり、
(Ｂ2−Ｂ29) は、ヒトインスリンのＢ鎖の位置Ｂ2−Ｂ29におけるアミノ酸残基であり、
Ｙは、アラニン（Ａla）、スレオニン（Ｔhr）およびセリン（Ｓer）よりなる群からのアミノ酸残基であり、
Ｘは、アミノ酸残基アルギニン（Ａrg）であるかまたはペプチドの最初および末端に２個の塩基性アミノ酸残基がある２〜35個のアミノ酸残基からなるペプチドであり、
(Ａ2−Ａ20) は、ヒトインスリンのＡ鎖の位置Ａ2−Ａ20におけるアミノ酸残基であり、
Ｒ ³ は、アスパラギン（Ａsn）、セリン（Ｓer）およびグリシン（Ｇly）よりなる群からのアミノ酸残基である］
の配列からなる請求項１〜７のいずれかに記載の方法。
式IIにおいて、
Ｒ²は、
ａ）水素原子、または
ｂ）カルボキシル末端はアルギニン（Ａrg）である２〜１５個のアミノ酸残基からなるペプチドであり、
Ｒ¹は、フェニルアラニン残基（Ｐhe）であり、
(Ｂ2−Ｂ29) は、ヒトインスリンのＢ鎖の位置Ｂ2−Ｂ29におけるアミノ酸残基であり、
Ｙは、スレオニン残基（Ｔhr）であり、
Ｘは、アミノ酸残基アルギニン（Ａrg）またはヒトインスリンのＣ鎖のアミノ酸配列を有するペプチドであり、
(Ａ2−Ａ20) は、ヒトインスリンのＡ鎖の位置Ａ2−Ａ20におけるアミノ酸残基であり、
Ｒ³は、アミノ酸残基アスパラギン（Ａsn）またはグリシン（Ｇly）である、請求項８に記載の方法。
請求項１〜９のいずれかの方法で得られた、正しく結合したシステイン橋を有するインスリンまたはインスリン誘導体の前駆体から、正しく結合したシステイン橋を有するインスリンまたはインスリン誘導体を製造する方法であって、
該前駆体から、トリプシンまたはトリプシン様酵素を用い、場合によっては、さらにカルボキシペプチダーゼＢを用いる、酵素分解により、および、続く吸着樹脂上での精製により、インスリンまたはインスリン誘導体を得る、上記方法。
式Ｉ：

［式中、
Ｙは、アラニン（Ａla）、トレオニン（Ｔhr）またはセリン（Ｓer）であり、
Ｚは、
ａ）アルギニン（Ａrg）であるか、
ｂ）２個のアルギニン残基（Ａrg−Ａrg）または２個のリシン残基（Ｌys−Ｌys）からなるジペプチドであるか、
ｃ）ＯＨであり、
Ｒ¹は、フェニルアラニン残基（Ｐhe）であり、
Ｒ ³ は、アスパラギン（Asn）、セリン（Ｓer）またはグリシン（Ｇly）であり、
ここで、Ａ2−Ａ20基は、ヒトインスリンのＡ鎖に対応し、および、Ｂ2−Ｂ29基は、ヒトインスリンのＢ鎖に対応する]
のインスリンまたはインスリン誘導体が得られる請求項１０に記載の方法。
式Ｉにおいて、
Ｙは、トレオニン（Ｔhr）であり、
Ｚは、
ａ）アルギニン（Ａrg）であるか、
ｂ）２個のアルギニン残基（Ａrg−Ａrg）からなるジペプチドであるか、
ｃ）ＯＨであり、
Ｒ³は、アスパラギン（Asn）、グリシン（Ｇly）である、
請求項１１に記載の方法。
式Ｉにおいて、
Ｙは、トレオニン（Ｔhr）であり、
Ｚは、ＯＨであり、
Ｒ³は、アスパラギン（Asn）である、
請求項１１または１２に記載の方法。
式Ｉにおいて、
Ｙは、トレオニン（Ｔhr）であり、
Ｚは、２個のアルギニン残基（Ａrg−Ａrg）からなるジペプチドであり、
Ｒ³は、グリシン（Ｇly）である、
請求項１１または１２に記載の方法。