Patents
Search within
Search within the title, abstract, claims, or full patent document: You can restrict your search to a specific field using field names.
Use TI= to search in the title, AB= for the abstract, CL= for the claims, or TAC= for all three. For example, TI=(safety belt).
Search by Cooperative Patent Classifications (CPCs): These are commonly used to represent ideas in place of keywords, and can also be entered in a search term box. If you're searching forseat belts, you could also search for B60R22/00 to retrieve documents that mention safety belts or body harnesses. CPC=B60R22 will match documents with exactly this CPC, CPC=B60R22/low matches documents with this CPC or a child classification of this CPC.
Learn More
Title
Abstract
Claims
Full Document
Find patents
Keywords and boolean syntax (USPTO or EPO format): seat belt searches these two words, or their plurals and close synonyms. "seat belt" searches this exact phrase, in order. -seat -belt searches for documents not containing either word.
For searches using boolean logic, the default operator is AND with left associativity. Note: this means safety OR seat belt is searched as (safety OR seat) AND belt. Each word automatically includes plurals and close synonyms. Adjacent words that are implicitly ANDed together, such as (safety belt), are treated as a phrase when generating synonyms.
Learn More
Search by
Chemistry searches match terms (trade names, IUPAC names, etc. extracted from the entire document, and processed from .MOL files.)
Substructure (use SSS=) and similarity (use ~) searches are limited to one per search at the top-level AND condition. Exact searches can be used multiple times throughout the search query.
Searching by SMILES or InChi key requires no special syntax. To search by SMARTS, use SMARTS=.
To search for multiple molecules, select "Batch" in the "Type" menu. Enter multiple molecules separated by whitespace or by comma.
Learn More
Patent numbers
Search specific patents by importing a CSV or list of patent publication or application numbers.
Způsob získávání prekurzoru insulínu nebo derivátů inzulínu
CZ259898A3
Czechia
- Other languages
English - Inventor
Franz-Josef Dr. Rubröder Reinhold Dr. Keller
Description
translated from
Způsob získávání prekurzoru inzulínu nebo derivátů inzulínu
Oblast techniky
Předkládaný vynález se týká zlepšeného způsobu získávání prekurzoru inzulínu nebo inzulínových derivátů se správně spojenými cysteinovými můstky, v přítomnosti cysteinu . nebo hydrochloridu cysteinu a pomocných chaotropních látek.
Dosavadní stav techniky
Lidský inzulín je protein skládající se ze dvou aminokyselinových řetězců, které obsahuj.í dohromady 51 aminokyselinových zbytku. V obou aminokyselinových řetězcích se vyskytuje 6 cysteinových' zbytků, přičemž vždy dva cysteinové zbytky jsou navzájem svázány v disulfidovém můstku. V biologicky aktivním lidském inzulínu jsou A-řetězec a B-řetězec navzájem spojeny dvěma cysteinovými můstky a další cysteinový můstek se vyskytuje v A-řetězci. V molekule lidského inzulínu existuje statisticky vzato 15 možností k vytvoření disulfidových můstků. V biologicky účinném lidském inzulínu se vyskytuje jen jedna z těchto 15 možností. V lidském inzulínu jsou navzájem spojeny následující cysteinové zbytky:
A6 - All
A7 - B7
A20 -B19 'Písmena A a B označují jednotlivé aminokyselinové řetězce inzulínu a číslo označuje polohu, aminokyselinového zbytku, která se počítá od aminového konce ke karboxylovému konci příslušného aminokyselinového řetězce. Disulfidové můstky mohou také vzniknout mezi dvěma molekulami lidského inzulí4 *44
- 2 nu, takže mohou snadno vzniknout mnoho nepřehledných disulfidových můstků.
Známý způsob přípravy lidského inzulínu je založen na využití lidského proinzulínu. Lidský proinzilín je protein s lineárním aminokyselinovým řetězcem z 86 aminokyselin, kde jsou A- a B-řetězec lidského inzulínu navzájem spojemy C-peptidem obsahujícím 35 aminokyselinových zbytků. K vytvoření disulfidových můstků existujících v lidském inzulínu dochází prostřednictvím meziproduktu, kdy jsou cysteinové zbytky lidského inzulínu opatřeny ochrannou sírovou skupinou, např. sulfonátovou (-S-SO3’) skupinou (EP 0 037 255) . ' Dále je znám způsob získání proinzulínu se správně spojenými cysteinovými můstky (Biochemistry, 60/ 1968, s. 622-629), který vychází z proinzulínu z prasečího pankreatu, a kde cysteinové zbytky jsou k dispozici v podobě thiolových (-SH) zbytků. Pod pojmem „ správně spojené cysteinové můstky se rozumějí disulfidové můstky, které se vyskytují v biologicky aktivním inzulínu savců.
Metody genové technologie umožňují, aby se prekurzor inzulínu nebo inzulínového derivátu, zejména lidského proínzulínu nebo proinzulínu, jehož aminokyselinová sekvence a/nebo délka řetězce se odlišují od lidského inzulínu, připravil v mikroorganismech. Proinzulíny připravené v buňkách
E. coli pozměněných metodami genového inženýrství nemají správně spojené cysteinové můstky.
Způsob získání lidského inzulínu z E. coli (EP 0 055 945) se skládá ž následujících kroků;
Fermentace mikroorganismů - rozrušení buněk - izolace fúzovaných proteinů - halogenkyanové štěpení fúzovaných proteinů
- izolace štěpných produktů se sekvencí proinzulínu - ochrana cysteinových zbytků proinzulínu S-sulfonátovou skupinou chromatografické čištění S-sulfonátů - vytvoření správně
Φ & * · · · a
• · 4 ·· ·· spojených cysteinových můstků - vysolení proinzulínu - chromatografické Čištění proinzulínu se správně spojenými cysteinovými můstky - koncentrování proinzulínového roztoku chromatografické čištění koncentrovaného proinzulínového roztoku - enzymatické štěpení proinzulínu vedoucí k získání lidského inzulínu - chromatografické čištění vzniklého lidského inzulínu.
Nevýhodou tohoto způsobu je počet kroků a také ztráty při krocích čištění, které vedou k nízkému výtěžku inzulínu. Vzhledem k mnohakrokovému způsobu se musí počítat se značnými ztrátami. Od kroku izolace fúzovaného proteinu přes halogenkyanové štěpení, sulfitolýzu a čištění proinzulínu se počítá se ztrátou až 40 % proinzulínu (EP 0 055 945) ..
K podobně vysokým ztrátám může dojít v průběhu následujících kroků čištění až do vzniku konečného produktu.
Zvýšení výtěžku se při přípravě lidského inzulínu nebo inzulínových derivátů genovými technikami dá dosáhnout, pokud se významně sníží počet nezbytných kroků v celém postupu.
Z patentových přihlášek EP 0 600 372 Al (případně US
473 049) a EP 0 668 292 A2 je známo odpovídající zlepšení postupu pro získání inzulínu, při kterém se prekurzor inzulínu nebo prekurzor inzulínového derivátu, jejichž cysteinové můstky nejsou správně spojeny, přemění v přítomnosti merkaptanu, např. cysteinu, a nejméně jedné chaotropní pomocné látky, např. močoviny nebo hydrochloridu guanidinu, na prekurzor inzulínu nebo prekurzor inzulínového derivátu se správně spojenými-cystělnovými můstky. Podle tohoto známého způsobu se proteiny nejdříve rozpustí ve vodném roztoku chaotropní pomocné látky nebo směsi různých chaotropních látek o velmi· nízké koncentraci. Pak se proteinová směs smísí s vodným roztokem merkaptanu.
- 4 Překvapivě se nyní zjistilo, že výtěžek správně složených prekurzorú inzulínu nebo inzulínových derivátů se může zvýšit a reakční čas skladebného procesu zkrátit tím, že se prekurzor v počátečním kroku nerozpustí pomocí chaotropní pomocné látky, ale že se nejdřív clo vodné suspenze prekurzoru vnáší merkaptan, zejména cystein nebo hydrochlorid cysteinu, a teprve v následujícím kroku, se roztok- prekurzořu vnese do vodného roztoku chaotropní pmomocné látky, a pak se dosáhne správného složení prekurzoru naředěním směsi na výhodnou koncentraci cysteinu popřípadě hydrochloridu cysteinu vnesením směsi do odpovídajícího množství vody.
Podstata vynálezu . Předkládaný vynález se týká., způsobu získání prekurzoru inzulínu nebo inzulínového derivátu se správně spojenými . cysteinovými můstky v přítomnosti cysteinu nebo hydrochloridu cysteinu a chaotropní pomocné látky, který spočívá v tom,, že se provedou po sobě následující kroky:
a) smíchá se vodná suspenze prekurzoru inzulínu nebo inzulínového derivátu s množstvím cysteinu nebo hydrochlorisdu . cysteinu, které poskytne 1 až 15 SH-skupin cysteinu nebo hydrohloridu cysteinu na každý cysteinový zbytek prekurzoru
b) suspenze prekurzoru obsahující cystein nebo hydrochlorid cysteinu se vnese do 4 až 9M roztoku pomocné chaotropní látky při hodnotě pH přibližně 8 až 11,5 a teplotě přibližně 15 až 55 °C a směs se udržuje na této teplotě 10 až 60 minut
c) směs se vnese pří pH hodnotě přibližně 8 až 11,5 a teplotě přibližně 5 až 30 °C do množství vody, že se cystein nebo hydrochlorid cysteinu ve směsi naředí na přibližně 1 až • · ··
- 5 5mM koncentraci a pomocná chaotropní látka na 0,2 až l,0M koncentraci.
Výhodný je takový způsob, kde ve kroku a) množství cysteinu nebo hydrochloridu cysteinu odpovídá takovému množtví, které poskytuje i až 6 SH-skupin cysteinu nebo hydrochloridu cysteinu na každý cysteinový zbytek prekurzoru, v kroku b) se vnese suspenze prekurzoru obsahující cystein nebo hydrochlorid cysteinu do 4 až 9 molárního roztoku pomocné chaotropní látky při pH hodnotě 9 až 11 a teplotě 30 až 45 °C a získaná směs se udržuje na této teplotě po 20 až 40 minut, a v kroku c) se vnese směs při hodnotě pH 8 až 11 a při teplotě 15 až 20 °C do množství vody, které naředí cystein nabo hydrochlorid cysteinu ve směsi na koncentraci přibližně 1 až 5mM a· chaotropní pomocnou látku na koncentraci 0,2 až 1, 0M.
Chaotropní pomocná látka je taková sloučenina, která ve vodném roztoku ruší vodíkové můstky, jako je např. síran amonný, hydrochlorid guanidinu, etylenkarbonát, thiokyanát, dimetylsulfoxid a močovina.
Ve způsobu podle předkládaného vynálezu je výhodnou chaotropní pomocnou látkou guanidin, hydrochlorid guanidinu nebo zvláště výhodnou látkou je močovina.
Koncentrace chaotropní pomocné látka v kroku b) podle vynálezu je výhodně 7 až 9 M, teplota v kroku c) je výhodně 40 °C a pH hodnota v kroku b) je výhodně 10 až 11.
Ve způsobu podle vynálezu je pH hodnta v kroku c) výhodně 10 až 11. V kroku c) způsobu podle předkládaného vynálezu je množství vody, do kterého je vnesena směs, výhodně zvoleno tak, že poskytne naředění cysteinu nebo hydrochloridu cysteinu ve směsi na koncentraci 2,5 až 4mM a chaotropní pomocné látky na koncentraci 0,5M.
• ·*♦
4 4 4
Φ 4 * 4 ·♦· · • » » 4 ·· ·»
Zvláště výhodný je způsob podle předkládaného vynálezu, kde koncentrace chaotropní pomocné látky v kroku b) je přibližně 8M, teplota v kroku b) je přibližně 40 °C, pH hodnota ve kroku b) je přibližně 10,6, pH hodnota v kroku c) je přibližně 10,6, a množství vody v kroku c) poskytuje neředěné cysteinu nebo hydrochloridu cysteinu ve směsi na koncentraci přibližně 2,5 až 3mM a koncentraci chaotropní pomocné látky přibližně 0,5M.
Výsledkem způsobu podle předkládaného vynálezu je prekurzor inzulínu nebo inzulínového derivátu, zvláště proinzulín, jejichž cysteinové můstky jsou správně spojeny.
Inzulínové deriváty jsou deriváty přirozeně se vyskytujícího inzulínu, a sice lidského inzulínu (sekvence identifikačního čísla 1 = A-řetězec lidského inzulínu, sekvence identifikačního čísla 2 = B-řetězec lidského inzulínu, viz seznam sekvencí) nebo zvířecího inzulínu, které se odlišují od příslušné jinak shodné sekvence přirozeně se vyskytujícího inzulínu substitucí (náhradou) několika přirozeně se1 vyskytujících aminokyselinových ' zbytků a/nebo adicí (přidáním) několika aminokyselinových zbytků a/nebo organických zbytků.
Z prekurzoru inzulínu popřípadě inzulínového derivátu se správně spojenými cysteinovými můstky, získaného pomocí způsobu podle předkládaného vynálezu, se následně může vyrobit inzulín nebo inzulínový derivát se správně spojenými cysteinovými můstky způsobem popsaným v EP 0' 600 372 (případně US 5 473 040) nebo EP 0 668 292 A2, a .sice enzymatickým štěpením trypsinem nebo trypsinu podobným enzymem, případně navíc pomocí karboxypeptidázy B, a následným přečištěním na adsorpční pryskyřici,
Inzulín nebo inzulínový derivát, který je vyrobitelný z prekurzoru, je přednostně popsán vzorcem I
• ···
(AG)
.3 (A20)
Gly-Cys-Cys-Cys-Cys-r3-OH (A1) (A7) (A11) .
R1-Cys (B1) (B7)
Cys (B19)
Y-Z (B30) kde
Y znamená geneticky kódovatelný aminokyselinový zbytek,
Z je
a) aminokyselinový zbytek ze, skupiny His, Arg nebo Lys,
b) peptid se 2 nebo 3 aminokyselinovými zbytky, obsahující aminokyselinový zbytek. Arg nebo Lys na karboxylovém konci peptidu,
c) peptid se 2 až 35 geneticky kódovatelnými aminokyselinami, obsahující 1 až 5 histidinových zbytků, nebo
d) OH,
R1 je fenylalaninový zbytek (Phe) nebo kovalentní vazba,
R3 je geneticky kódovatelný aminokyselinový zbytek, přičemž zbytky A2 až A20, které nejsou pro zjednodnušení vzorce I na obrázku znázorněny, odpovídají aminokyselinové sekvenci A-řetězce lidského inzulínu, zvířecího inzulínu nebo inzulínového derivátu, a zbytky B2 až B29, které nejsou pro zjednodnušení vzorce I na obrázku znázorněny, odpovídají aminokyselinové sekvenciB-řetězce lidského inzulínu, zvířecího inzulínu nebo inzulínového derivátu.
Aminokyselinové sekvence peptidu a proteinů jsou označovány od N-konce aminokyselinového řetězce. Údaje ve vzorci I, které jsou v závorce, např. A6, A20, Bl, B7 nebo B19 « ft * . · ftft • ft·· · ··· · * = ftft
- 8 • ftftft · • · · · • ft ft ftft ftft odpovídají polohám aminokyselinových zbytků v A-řetězci nebo B-řetězci inzulínu.
Termín „geneticky kódovatelný aminokyselinový zbytek zahrnuje aminokyseliny Gly, Ala, Ser, Thr, Val, Leu, Ile, Asp, Asn, Glu, Gin, Cys, Met, Arg, Lys, His, Tyr, .Phe, Trp, Pro a selenocystein.
Pod pojmem „zbytky A2 až A2 0 a „zbytky B2 až B2 9 zvířecího inzulínu se rozumí např. aminokyselinové sekvence inzlínu z krávy, vepře nebo slepice. Pojmy „zbytky A2 až A20 a „zbytky B2 až B29 pro inzulínový derivát znamenají odpovídající., aminokyselinové sekvence lidského inzulínu, které byly vytvořeny záměnou aminokyselin jinými geneticky kódovatelnými aminokyselinami.
A-řetězec lidského inzulínu má -např. následující sekvenci (sekvence identifikačního čísla I);
Gly Ile-Val·’Glu Gin Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leů Tyr
Gin Leu Glu Asn Tyr Cys Asn.
B-řetězec lidského inzulínu má např. následující sekvenci (sekvence identifikačního čísla 2):
Phe Val Asn Gin His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala
Leu Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro
Lys Thr.
Přitom ve vzorci I je R3 asparagin (Asn) , R1 je fenylalanin (Phe),' Y je threonin (Thr) a Z je OH.
Způsob podle předkládaného vynálezu je zvláště vhodný k získání prekurzoru inzulínu nebo inzulínového derivátu podle obecného vzorce II, jehož cysteinové můstky (ve vzorci
II neznázorněné) jsou správně složeny,
R2-R1-(B2-B29)-Y-X-Gly-(A2-A20)-R3 (II)
- 9 a kde
R2 je
a) atom vodíku
b) aminokyselinový zbytek ze skupiny lysin (Lys) nebo arginin (Arg),nebo
c) peptid s 2 až 45 aminokyselinovými zbytky, obsahující aminokyselinový.zbytek lysin (Lys) nebp arginin (Arg)na karboxylovém konci peptidů,
R1 je fenylalaninový zbytek (Phe) nebo kovalentní vazba, (B2-B29) jsou aminokyselinové zbytky v polohách B2 až B29 B-řetězce- lidského inzulínu, zvířecího inzulínu nebo případně v jedné- nebo více polohách pozměněného inzulínového derivátu,
Y je geneticky kódovatelný aminokyselinový zbytek,
X je
a) aminokyselinový zbytek ze skupiny lysin (Lys) nebo arginin (Arg), nebo
b) peptid se 2 až 35 aminokyselinovými zbytky obsahující: aminokyselinový zbytek lysinu (Lys) nebo argininu (Arg) na N-konci a karboxylovém konci peptidů, nebo
c) peptid se 2 až 35 geneticky kódovatelnými aminokyselinami, obsaující 1 až 5 histidinových zbytku (His), (A2-A20) jsou aminokyselinové zbytyky v polohách A2 až A20 A-řetězce lidského inzulínu, zvířecího inzulínu nebo případně v jedně nebo více polohách pozměněného inzlínového derivátu, a
R je geneticky kódovatelný aminokyselinový zbytek.
-ΙΟΙ. Ve vzorci II mají symboly přednostně následující význam:
R2 je
a) atom vodíku nebo
b) peptid se 2 až 25 aminokyselinovými zbytky, obsahující aminokyselinový zbytek argininu (Arg) na karboxylovém konci peptidu,
R1 je fenylalaninivý zbytek (Phe), (B2-B29) jsou' aminokyselinové zbytky v polohách B2 až B29 B-řetězce lidského inzulínu,
Y je aminokyselinový zbytek ze skupiny alaninu (Ala), threoninu (Thr) nebo šeřinu (Ser),
X je aminokyselinový zbytek argininu (Arg) nebo peptid s aminokyselinovou sekvencí C-řetězce lidského inzulínu, (A2-A20) jsou aminokyselinové zbytyky v polohách A2 až A20 A-řetězce lidského·inzulínu, a
R3 je aminokyselinový zbytek ze skupny asparaginu (Asn), šeřinu (Ser) nebo glycinu (Gly).
C-řetezec lidského inzulínu má následující sekvenci aminokyselin (sekvence identifikačního čísla 3):
| Arg Arg | Glu | Ala | Glu | Asp | Leu | Gin | Val | Gly | Gin | Val | Glu | Leu |
| Gly Gly | Gly | Pro | Gly | Ala | Gly | Ser | Leu | Gin | Pro | Leu | Ala | Leu |
| Glu Gly | Ser | Leu | Gin | Lys | Arg |
2. Ve vzorci II mají symboly přednostně následující význam:
R2 je
a) atom vodíku nebo
b) peptid s 2 až 15 aminokyselinovými zbytky, na jehož karboxylovém konci se nachází aminokyselinový zbytek argininu (Arg),
R1 je fenylalaninivý zbytek (Phe),
Φ
Β
- 11 • BBB • · · • Β ··« ΒΒ· · φ · • Β ΒΒ · • φ 88
Β ΦΦ Η I Β
Φ Φ Φ
Β ΒΒ (Β2-Β29) jsou aminokyselinové zbytky v polohách B2 až B29 B-řetězce lidského inzulínu,
Y je threoninový zbytek (Thr),
X je aminokyselinový zbytek argininu (Arg) nebo peptid se 2 až 3 5 .aminokyselinovými zbytky, kde jsou na začátku i na konci peptidu dva bazické aminokyselinové zbytky, zvláště arginin (Arg) a/nebo lysin (Lys), (A2-Á20) jsou aminokyselinové zbytyky v polohách A2 až A20 A-řetězce lidského inzulínu,a
R je aminokyselinový zbytek asparaginu (Asn) nebo glycinu (Gly) .
Zbytek Z inzulínu nebo inzulínového derivátu podle vzorxe I je zpravidla část aminokyselinové sekvence X prekurzoru podle vzorce II a vzniká aktivitou proteáz jako je např. ' trypsin, trypsinu podobné enzymy nabo karboxypeptidáza B. Zbytek R3 je aminokyselinový zbytek, který v má polohu A21 v A-řetězci inzulínu. Zbytek Y je aminokyselinový zbytek, který má polohu B30 v B-řetězci inzulínu.
Trypsin nebo trypsinu podobné enzymy jsou proteázy,, které Štěpí aminokyselinový řetězec v místě argininového nebo .lysinového zbytku. Karboxypeptidáza je exoproteáza, která odštěpuje bazické aminokyselinové zbytky jako je např. Arg nebo Lys, které jsou na’karboxylovém konci aminokyselinového řetězce (Kemmler et al. , J. Biol. Chem., 246, s. 6786-6791).
Z prekurzoru jmenovaného v 1. bode je možné získat např. inzulínový derivát podle vzorce I se správně spojenými
3 cysteinovými můstky, přičemž Y, R , R , R , A2-A20 a B2-B29 máji význam popsaný v 1. bodu a Z je argininový zbytek (Arg), peptidový zbytek Arg-Arg nebo -OH skupina.
• · ·♦ ··· · · ftft ft • ft *· • ··· *
• ftft
- 12 • ft ft*
Z prekurzoru jmenovaného ve 2. bodě je možné získat např. inzulínový derivát podle vzorce I se správně spojenými cysteinovými můstky, přičemž Y, R1, R2, R3, A2-A20 a B2-B29 mají význam popsaný v 2. bodu a Z je argininový zbytek (Arg), peptidový zbytek Arg-Arg nebo nebo Lys-Lys nebo -OH skupina.
Prekurzor podle vzorce II se může tvořit pomocí mnohých genových konstruktů v mikroorganismech (viz EP 0 489 780, EP 0 347 781, EP 0· 453 969). Genové konstrukty jsou exprimovány . v mikroorganismech jako jsou např. E. coli nebo streptomycéty v průběhu , fermentace. Vytvářené proteiny se ukládají uvnitř mikroorganismů (EP 0 489 780) nebo jsou vylučovány do fermentačního roztoku.
Pro-způsob podle předkládaného vynálezu se může použít takový prekurzor inzulínu nebo inzulínového derivátu podle vzorce II, který je ještě bezprostředně po rozrušení buňky znečištěn mnohými proteiny pocházejícími z fermentačního roztoku a mikroorganismů. Prekurzor podle vzorce II se může použít také v přečištěné podobě, např. po srážení nebo chromatograf ickém čištění.
Příklady provedení vynálezu
Příklad 1 (Srovnávací příklad·, stav techniky)
Fermentaci geneticky modifikovaných buněk E. coli (EP
489 780) byl připrven fúzní protein s následující aminokyselinovou sekvencí.
* » 00 ··· · » »9 · • 0 0* • · • ··· : :
»·····
- 13 Sekvence proinzulínu 1 (sekvence identifikačního čísla 4) :
| Ala | Thr | Thr | ser | Thr | Gly | Asn | Ser | Ala | Arg | Phe | Val | Asn | Gin | His | Leu |
| Cys | Gly | Ser | His | Leu | Val | Glu | Ala | Leu | Tyr | Leu | Val | Cys | Gly | Glu | Arg |
| Gly | Phe | Phe | Tyr | Thr | Pro | Lys | Thr | Arg | Arg | Glu | Ala | Glu | Asp | Leu | Gin |
| Val | Gly | Gin | Val | Glu | Leu | Gly | Gly | Gly | Pro | Gly | Ala | Gly | Ser | Leu | Gin |
| Pro | Leu | Ala | Leu | Glu | Gly | Ser | Leu | Gin | Lys | Arg | Gly | Ile | Val | Glu | Gin |
| Cys | Cys | Thr | Ser | Ile | Cys | ser | Leu | Tyr | Gin | Leu | Glu | Asn | Tyr | Cys | Asn |
Sekvence proinzulínu. 1 odpovídá vzorci II, přičemž
X je C-peptid lidského inzulínu (sekvence i. č. 3),
Y je Thr (B30j ,
R1 je Phe (Bl) ,
R je peptid s 10 aminokyselinovými zbytky,
R3 je Asn (A21) a (A2-A20) jsou aminokyselinové ,zby.tyky (v polohách . 2 až. 20) A-řetězce lidského inzulínu a (B2-B29) jsou aminokyselinové zbytyky (v polohách 2 až 29) B-řetězce lidského inzulínu.
Fúzní protein se sekvencí proinzulínu 1 exprimovaný v buňkách E. coli se shromažďoval v buňkách a tvořil uzavřenou částici. Po skončení fermentace se buňky oddělily odtřeďováním a obvyklou vysokotlakou homogenizací rozrušily. Uvolněné.částice fúzního proteinu se pák izolovaly odstředěním. 20 kg izolovaných částic fúzního proteinu (vztaženo na suchou hmotnost po lyofilizaci, podíl fúzního proteinu obsahující inzulín byl určen pomocí HPLC a činil 50 %) se sekvencí odpovídající proinzulínu 1 se rozpustilo v 550 1 8M roztoku močoviny při pH 10,6. Po případném^ odstředění menšího mnoštví látek způsobujících zákal se čirý roztok rozmíchal v 9000 1 vodného cysteinového roztoku (5 kg hydrátu hydrochloridu cysteinu) při hodnotě pH 10,6 a teplotě 4 °C.. Po ukončení skladebné reakce asi po 24 hodinách se ve 3kg várce pomocí analytické HPLC stanovil obsah proinzulínové » » · · • 4 »· · β
··· 4 * • 4 9 • · 44 sekvence 1 se správně spojenými cysteinovymi můstky, který odpovídal 30% přeměně.
9500 1 roztoku se pomocí IN HCI upravilo na pH 5,0 a separovalo. Pak se nastavilo pH 9,0 přidáním sodného louhu. Pak se přidaly do roztoku 3' g trypsinu. Podle měření HPLC tak vzniklo 1,25 kg inzulínu s 2 argininovými zbytky na .karboxylovém konci.
Po štěpení karboxypaptidázou B vznikl lidský inzulín, který se dále Čistil pomocí chromatografických metod.
Lidský inzulín odpovídá vzorci I, přičemž Y je Thr (B30),
Z je OH,
R1 je Phe (Bl) ,
R3 je Asn (A21) a
A2TA20 jsou aminokyselinové zbytky (v polohách . 2 . až 20) A-řetězce lidského inzulínu a (B2-B29) jsou aminokyselinové zbytyky (v polohách 2 až 29) B-řetězce lidského inzulínu.
Lidský inzulín 2 se skládá ze sekvencí identifikačních čísel 1 a 2, které jsou navzájem spojeny správně spojenými cysteinovými můstky.
Roztok se zakoncentruje, jak bylo popsáno v EP 0 668 292, pomocí adsorpční pryskyřice a přečistí. Eluát obsahující inzulín 2 se bezprostředně po naředění vodou a nastavení hodnoty pH múze dále čistit na chromatografické koloně.
Analýza pomocí HPLC
0,5 g proteinu se rozpouštělo ve 40 ml roztoku o složení: 6M hydrochlorid guanidia, 50mM Tris, pH 8,5, 5mM kyselina etylendiamintetraoctová (EDTA), 1% 2-merkaptoetanol, lOmM dithiotreitol, při 95 °C po 2 minuty, a pak odstředilo 20 minut při 14000 g. 0,02 ml čirého roztoku se naneslo na HPLC kolonu.
e * • · ··· ···
Nagel, Aachen, • * 1 ·· ·
Kolona: ®Nucleogel RP 300-5/46 (Macherey a Německo)
Gradient: Pufr A: 0,1¾ kyselina trifluorooctová (TFA)
Pufr B: 0,09% TFA v acetonitrilu Teplota: 55 °C
Celkový čas běhu: 40 minut
Gradient je charakterizován následujícícím množstvím pufru B po odpovídající době běhu:
min 25 %, 12 min 60 %, 13 min 90 %, 15 min 100%
Průtok: 1 ml/min
Detekce: 215 nm
Retenční čas inzulínu: asi 19 minut
Příklad 2 (Způsob podle předkládaného vynálezu)
Fermentací geneticky modifikovaných buněk E. coli (viz EP 0 489 780) se připravil fúzní protein s aminokyselinovou sekvencí, která je uvedena v příkladu 1 (sekvence proinzulínu 1, sekvence i. č. 4). Exprimovaný fúzní protein se sekvencí proinzulínu 1 se shromažďoval v buňkách E. coli a tvořil .uzavřenou částici. Po skončení fermentace se buňky oddělily odtřeďováním a obvyklou vysokotlakou homogenizací rozrušily. Uvolněné částice fúzního proteinu se pak izolovaly odstředěním.
K vodné suspenzi fúzního proteinu obsahující 40 kg fúzního proteinu (stanoveno lyofylizací alikvotní části) se přidalo 5 kg hydrátu hydrochloridu cysteinu.
Suspenze proinzulínu 1 (podíl inzulín obsahujícího fúzního proteinu stanovený pomocí HPLC činil 50 %) se rozpustila v 550 1 8M močoviny při pH 10,2 při 40 °C. Čirý roztok se přimíchal k 9000 1 vody při pH 10,6 a teplotě 15 °C. Po ukončení skladebné rekace asi po 5 hodinách se
0
00
- 16 pomocí analytické HPLC v lOkg várce stanovil obasah proínzulínu I se správně spojenými cysteinovými můstky, který odpovídal 50% přeměně. 9500 1 roztoku se pomocí IN HCl upravilo na pH 5,0 a separovalo. Pak následovalo nastavení na pH 9,0 přidáním sodného louhu. Pak se do· roztoku přidalo 10 g trypsinu. Vznikly tak 4 kg inzulínu s 2 argininovými zbytky na kárboxylovém konci. Po štěpení karboxypeptidázou . B vznikl lidský inzulín (sekvence i. č. 1 a 2 se správně, spojenými cysteinovými můstky). Roztok se dále pomocí adsorpční pryskyřice zakoncentroval a čistil. Eluát obsahující inzulín 2 * se' bezprostředně po naředění vodou a nastavení hodnoty pH může dále čistit na chromatografická koloně.
Příklad 3 (Srovnávací příklad, stav techniky)
Fermentací geneticky modifikovaných buněk E. coli (EP 0'
489 780) byl připraven fúzní protein s následující aminokyselinovou sekvencí.
Sekvence proinzulínu 2 (sekvence i. č. 5):
| Ala | Thr | Thr | Ser | Thr | Gly | Asn | Ser | Ala | Arg | Phe | Val | Asn | Gin | His | Leu |
| Cys | Gly | Ser | His | Leu | Val | Glu | Ala | Leu | Tyr | Leu | Val | Cys | Gly | Glu | Arg |
| Gly | Phe | Phe | Tyr | Thr | Pro | Lys | Thr | Arg | Arg | Glu | Ala | Glu | Asp | Leu | Gin |
| Val | Gly | Gin | Val | Glu | Leu | Gly | Gly | Gly | Pro | Gly | Ala | Gly | Ser | Leu | Gin |
| Pro | Leu | Ala | Leu | Glu | Gly | Ser | Leu | Gin | Lys | Arg | Gly | Ile | Val | Glu | Gin |
| Cys | Cys | Thr | Ser | Ile | Cys | Ser | Leu | Tyr | Gin | Leu | Glu | Asn | Tyr | Cys | Gly |
Sekvence proinzulínu 1 odpovídá vzorci II, přičemž X je C-peptid lidského inzulínu (sekvence id. č. 3), Y je Thr (B30),
R1 je Phe (Bl) ,
R2 je peptid s 10 aminokyselinovými zbytky, • · » ·
- 17 ··· * « • · « «· ··
R3 je Gly (A21) a (A2-A20) jsou aminokyselinové zbytyky (v polohách 2 až 20) A-řetězce lidského inzulínu a (B2-B29) jsou aminokyselinové zbytky (v polohách 2 až 29) B-řetězce lidského inzulínu.
Fúzní protein se sekvencí 'proinzulínu 2 exprimovaný v buňkách B. coli se shromažďoval v buňkách a tvořil uzavřenou částici. Po skončení fermentace se buňky oddělily odstřeďováním a obvyklou vysokotlakou homogenizací rozrušily. Uvolněné částice fúzního proteinu se pak izolovaly odstředěním.
kg izolovaných částic fúzního proteinu (vztaženo na suchou hmotnost po lyofilizaci, podíl fúzního proteinu obsahující inzulín byl určen pomocí HPLC a činil 50 %) se sekvencí odpovídající proinzulínu 2 se rozpustilo v 550 1 8M roztoku močoviny při pH 10,6 a teplotě 20 °C. Čirý roztok se rozmíchal v 9000 1 vodného cysteínového roztoku (5 kg hydrátu hydrochloridu cysteinu) při hodnotě pH 10,6 a teplotě 4 °C. Po ukončení skladebné reakce asi po 24 hodinách se ve 3kg várce pomocí analytické HPLC stanovil obsah proinzulínové sekvence 2 se správně spojenými cysteinovými můstky, který odpovídal 30% přeměně.
9500 1 roztoku se pomocí IN HCI upravilo na pH 5,0 a separovalo. Pak následovalo nastavení na pH 9,0 přidáním sodného louhu. Pak se přidaly do roztoku 3 g trypsinu. Podle měření HPLC tak vzniklo 0,9 kg inzulínového derivátu se 2 argininovými zbytky na karboxylovém konci.
Tento inzulínový derivát odpovídá vzorci I, přičemž Y je Thr (B30),
Z je Arg-Arg R1 je Phe (Bl) ,
R3 je Gly (A21) a »φ φ • · φφ β
. φ
ΦΦΦ ΦΦΦ • * * φ
φ φ φ
- 18 Α2-Α20 jsou aminokyselinové zbytky (v polohách 2 až 20) Ařetězce lidského inzulínu a (B2-B29) jsou aminokyselinové zbytyky (v polohách 2 až 29) B-řetězce lidského inzulínu, a skládá se ze sekvencí identifikačních čísel 6 a 7, které jsou navzájem spojeny správně spojenými cysteinovými můstky.
Roztok se zakoncentruje pomocí adsorpční pryskyřice a přečistí. Eluát obsahující inzulínový derivát se bez-' prostředně po naředění vodou a nastavení hodnoty pH může dále čistit na chromatografické koloně.
Příklad 4 (Způsob podle předkládaného vynálezu)
Fermentací geneticky modifikovaných buněk E. coli (EP 0 489 780) byl připraven podle příkladu 3 připraven fúzní protein.se sekvencí proinzulínu 2 (sekvence i. Č. 5).
Exprimovaný fúzní protein se sekvencí proinzulínu 2 se· shromažďoval v buňkách E. coli a tvořil uzavřenou částici.
Po skončení fermentace se buňky oddělily odtřeďovánínr a obvyklou vysokotlakou homogenizací rozrušily. Uvolněné částice fúzního proteinu se pak izolovaly odstředěním.
Do vodné suspenze fúzního proteinu obsahující 40 kg fúzního proteinu (jak bylo stanoveno lyofilizací alikvotní Části) .se přidalo 5 kg hydrátu hydrochloridu cysteinu.
Suspenze s proteinem (podíl fúzního proteinu obsahující inzulín byl určen pomocí HPLC a Činil 50 %) se sekvencí odpovídající proinzulínu 2 se rozpustilo v 550 1 8M roztoku močoviny při pH 10,2 a teplotě 40 °C.' Čirý roztok se přimíchal do 9000 1 vody při hodnotě pH 10,6 a teplotě 15 °C. Po ukončení skladebné reakce asi po 5 hodinách se v lOkg várce pomocí analytické HPLC stanovil obsah proinzulínové sekvence 2 se správně spojenými cysteinovými můstky, který odpovídal 50% přeměně.
• · ·· • · · · · ·
- 19 9500 1 roztoku se pomocí IN HCl upravilo na pH 5,0 a separovalo. Pak následovalo nastavení na pH 9,0 přidáním sodného louhu. Pak se přidalo do roztoku 10. g trypsinu. Tak vzniklo 2,8 kg inzulínového derivátu (podle měření HPLC)', který se skládá ze sekvencí id. č. 6 a 7, které jsou navzájem spojeny správně spojenými cysteinovými můstky.
Roztok se zakoncentruje pomocí adsorbční pryskyřice a přečistí. Eluát* obsahující inzulínový derivát se bezprostředně po naředění vodou a nastavení hodnoty pH může dále čistit na chromatografické koloně.
·
- 20 « 44
SEZNAM SEKVENCÍ (2) INFORMACE PRO SEKVENCI Ξ IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 1:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 21 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina .(C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii)' TYP MOLEKULY: protein (vi) PŮVODNÍ ZDROJ:
(A)ORGANISMUS: Escherichia coli (ix) ZNAK:
(A) JMÉNO/OZNAČENÍ: protein (B) POZICE:1...21 (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S ID. Č. 1:
Gly Ile Val Glu Gin Cys Cys Thr 5er Ile Cys Ser Leu Tyr Gin ,Leu 1 5 10 15
Glu Asn Tyr Cys Asn 20 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 2:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 30 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: protein (vi) PŮVODNÍ ZDROJ:
(A)ORGANISMUS: Escherichia coli (ix) ZNAK:
(A) JMÉNO/OZNAČENÍ: protein (B) POZICE:1...30 (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S- ID. Č. 2:
Phe Val Asn Gin His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr 1 5 10 15
Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr 20 25 30 « 4 ·
4*4 *
- 21 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 3;
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE;
(A) DÉLKA: 35 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: protein (vi) PŮVODNÍ ZDROJ:
(A) ORGANISMUS: Escherichía coli (ix) ZNAK:
(A) JMÉNO/OZNAČENÍ: protein (B) POZICE: 1...35
| (xi) | POPIS | SEKVENCE: | SEKVENCE S | ID. | . c. | 3 : | |||
| Arg.Arg | Glu Ala | Glu Asp Leu | Gin Val Gly | Gin | Val | Glu | Leu | Gly | Gly |
| 1 | 5 | 10 | 15 | ||||||
| Gly Pro | Gly Ala | Gly Ser Leu | Gin Pro Leu | Ala | Leu | Glu | Gly | Ser | Leu |
| 20 | 25 | 30 |
| Gin Lys Arg 35 |
(2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 4:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 96 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (D) TOPOLOGIE: lineární' (ii) TYP MOLEKULY: protein (vi) PŮVODNÍ ZDROJ:
(A) ORGANISMUS: Escherichía coli (ix) ZNAK:
(A) JMÉNO/0ZNAČENÍ: protein (B) POZICE: 1...96 (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S ID. Č. 4:
| Ala | Thr | Thr | Šer | Thr | Gly | Asn | Ser | Ala | Arg | Phe | Val | Asn | Gin | His | Leu |
| 1 | 5 | 10 | 15 | ||||||||||||
| Cys | Gly | Ser | His | Leu | Val | Glu | Ala | Leu | Tyr | Leu | Val | Cys | Gly | Glu | Arg |
| 20 | 25 | 30 |
- 22 ··«
| Gly | Phe | Phe 35 | Tyr | Thr | Pro | Lys | Thr 40 | Arg | Arg | Glu | Ala | Glu 45 | Asp | Leu | Gin |
| Val | Gly 50 | Gin | Val | Glu | Leu | Gly 55 | Gly | Gly | Pro | Gly | Ala 60 | Gly | Ser | Leu | Gin |
| Pro 65 | Leu | Ala | Leu | Glu | Gly 70 | Ser | Leu | Gin | Lys | Arg 75 | Gly | Ile | Val | Glu | Gin 80 |
| Cys | Cys | Thr | Ser | Ile 85 | Cys | Ser | Leu | Tyr | Gin 90 | Leu | Glu | Asn | Tyr | Cys 95 | Asn |
(2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 5:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 96 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: protein (vi) PŮVODNÍ ZDROJ:
(A) ORGANISMUS: Escheřichia coli (ix) ZNAK:
(A) JMÉNO/OZNAČENÍ:. protein (B) POZICE: 1...96
| (xi) | POPIS | SEKVENCE: | SEKVENCE S | ID | . Č. | 5 : |
| Ala Thr 1 | Thr Ser | Thr Gly Asn 5 | Ser Ala Arg 10 | Phe | Val | Asn Gin His Leu 15 |
| Cys Gly | Ser His 20 | Leu Val Glu | Ala Leu Tyr 25 | Leu | Val | Cys Gly Glu Arg 30 |
| Gly Phe | Phe Tyr 35 | Thr Pro Lys | Thr Arg Arg 40 | Glu | Ala | Glu Asp Leu Gin 45 |
| Val Gly 50 | Gin Val | Glu Leu Gly 55 | Gly Gly Pro | Gly | Ala 60 | Gly Ser Leu Gin |
| Pro Leu 65 | Ala Leu | Glu Gly Ser 70 | Leu Gin Lys | Arg 75 | Gly | Ile Val Glu Gin 80 |
| Cys. Cys | Thr Ser | Ile Cys Ser 85 | Leu Tyr Gin 90 | Leu | Glu | Asn Tyr Cys Gly 95 |
*
I Φ · k · ·*
- 23 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 6: (i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
| (A) DÉLKA: 32 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (D) TOPOLOGIE: lineární | |||
| (ii) | TYP MOLEKULY: protein | ||
| (vi) | PŮVODNÍ ZDROJ: (A) ORGANISMUS; Escherichia coli | ||
| (ix) | ZNAK: | T - .nnh ’Φ·· |
(A) JMÉNO/OZNAČENÍ: protein (B) · POZICE: 1...32 (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S ID. Č. 6:
| Phe 1 | Val | Asn | Gin | His 5 | Leu | Cys | Gly Ser His 10 | Leu Val | Glu | Ala | Leu 15 | Tyr | |||
| Leu | Val | Cys | Gly | Glu | Arg | Gly | Phe | Phe | Tyr | Thr | Pro | Lys | Thr | Arg | Arg |
| 20 | 25 | 30 |
(2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 7:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 21 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: protein (vi) PŮVODNÍ ZDROJ:
(A). ORGANISMUS:' Escherichia coli (ix) ZNAK:
(A) JMÉNO/OZNAČENÍ : protein (B) POZICE: 1...32 (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S ID. Č. 7:
Gly Ile Val Glu Gin Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gin Leu io 15
Glu Asn Tyr Cys Gly
Claims (11)
Hide Dependent
translated from
Claims (11)
Hide Dependent
translated from
- PATENTOVÉ NÁROKY1, Způsob přípravy prekurzoru inzulínu nebo derivátu se správně spojenými cysteinovými můstky v přítomnosti cysteinu nebo hydrochloridu cysteinu a chaotropní pomocné látky, vyznačující se tí.m, že se postupně provedou následující kroky:a) smíchá se vodná suspenze prekurzoru inzulínu nebo inzulínového derivátu s' takovým množstvím cysteinu nebo hydrochloridu cysteinu, ' které poskytne 1 až 15 SH-.zbytků cysteinu nebo hydrochloridu cysteinu na každý cysteinový zbý-* tek prekurzoru,b) suspenze prekurzoru obsahující cystein nebo hydrochlorid cysteinu se vnese do 4 až 9M roztoku chaotropní pomocné látky při hodnotě pH přibližně 8 až 11,5 a teplotě při bližně 15 až 55 °C a získaná směs se udržuje na této teplotě 10 až S0 minut, ac) směs se vnese při pH hodnotě přibližně 8 až 11,5 a teplotě přibližně 5 až 30 °C do vody v takovém množství, že se cystein nebo hydrochlorid cysteinu ve směsi naředí na přibližně 1 až 5mM koncentraci a· chaotropní pomocná látka na 0,2 až l,0M koncentraci.
- 2Způsob podle nároku lvyznačující se tím, že v kroku a) množství cysteinu nebo hydrochloridu cysteinu odpovídá takovému množství, které poskytuje 1 až 6 SH-zbytků cysteinu nebo hydrochloridu cysteinu na každý cysteinový zbytek prekurzoru, v kroku b) se vnese suspenze prekurzoru obsahující cystein nebo hydrochlorid cysteinu do 4 až 9 molárního roztoku chaotropní pomocné látky při pH hodnotě 8 až 11 a teplotě 30 až • · * • ··· t- 25 « »·♦ » ·« • · ·· « *·· · · • · · · ·· ·· ··45 °C a získaná směs se udržuje na této teplotě po 20 až 40 minut, a v následujícím kroku c) se vnese směs při hodnotě pH 8 až 11 a při teplotě 15 až 20 °C do vody v takovém množství, že se cystein nebo hydrochlorid cysteinu ve směsi naředí na koncentraci přibližně 1 až 5mM a chaotropní pomocná látka na koncentraci 0,2 až 1,0 M.
- 3. Způsob podle nároku 1 nebo 2 vyznačující se tím, že chaotropní pomocná látka je guanidin nebo hydrochlorid guanidinu.
- 4. Způsob podle nároku 1 nebo 2 vyznačující se tím, že chaotropní pomocná látka je močovina.
- 5. Způsob podle jednoho nebo několika nároků 1 až 4 vyznačující se tím, že koncentrace chaotropní pomocné látky v kroku b) je 7,0 až 9,0M.
6. Způsob podle jednoho nebo několika nároků 1 v az 5 vyznač u j í c í se t í m, že teplota v kroku b) je 40 °C. 7. Způsob podle jednoho nebo ' několika nároků 1 až 6 vyznač u j í c í se t í m, že hodnota pH v kroku b) je 10 až 11. - 8. Způsob podle jednoho nebo několika nároků 1 až 7 vyznačující' se tím, že hodnota pH v krokuc) je 10 až 11.• · ·· ft·· ft ft • · ft • ft ftft • · · ·Φ · ·♦ · ftft · • ft ftft • ft·* • · · • · • ftft ···- 26
- 9. Způsob podle jednoho nebo několika nároků 1 až 8 vyznačující se tím, že v kroku c) množství vody poskytne ve směsi naředění cysteinu nebo hydrochloridu cysteinu na 2,5 až 3mM koncentraci a chaotropní pomocné látky na 0,5M koncentraci.
- 10. ' Způsob podle jednoho nebo několika z nároků 1 až 9 vyznačuj ící.....s e ' t í ni, že koncentrace chaotropní pomocné látky v kroku b)· je přibližně 8M, teplota v kroku b) je přibližně 4 0 °C, hodnota pH v kroku b) je přibližně 10,6, hodnota ' pH v kroku c) je přibližně 10,6,. * a množství vody v kroku c) poskytne ve směsi naředění cysteinu nebo hydrochloridu cysteinu na přibližně 2,5 až 3mM koncentraci a chaotropní pomocné látky na 0,5M koncentraci.
- 11. Způsob podle jednoho nebo několika nároků 1 až 10 vyznačující se tím, že prekurzor inzulínu nebo inzulínového derivátu má sekvenci podle obecného vzorce IIR2-R1-(B2-B29)-Y-X-Gly-(A2-A20)-R3 (II), kdeR2 jea) atom vodíkub) aminokyselinový zbytek ze skupiny 'lysinu (Lys) nebo argininu (Arg), neboc) peptid se 2 až 45 aminokyselinovými zbytky, obsahující aminokyselinový zbytek lysinu (Lys) nebo argininu (Arg) na'karboxylovém konci peptidu,R1 je fenylalaninový zbytek (Phe) nebo kovalentní vazba, (B2-B29) jsou aminokyselinové zbytky v polohách B2 až B29 B-řetězce lidského inzulínu, zvířecího inzulínu nebo případftft ft • ··· • ♦ • ft ·· ftft· ft · • ft · • ft * • ftft ♦ · • » • ft ··- 27 ně inzulínového derivátu pozměněného v jedné nebo více polohách,Y je geneticky kódovatelný aminokyselinový zbytek,X jea) aminokyselinový zbytek ze skupiny lysinu (Lys) nebo argininu (Arg), nebob) peptid se 2 až 35 aminokyselinovými zbytky obsahující aminokyselinový zbytek lysinu (Lys) nebo argininu (Arg) na N-konci a kárboxylovém konci peptidu, neboc) peptid se 2 až 35 geneticky kódovatelnými aminokyselinami, obsahující 1 až 5 histidinových zbytků (His), (A2-A20) jsou aminokyselinové zbytky v polohách A2 až A20 A-řetězce lidského inzulínu, zvířecího inzulínu nebo případně inzulínového derivátu pozměněného v jedné nebo více polohách , aR je geneticky kódovatelný aminokyselinový zbytek.
- 12. Způsob podle nároku 11 vyznačující se tím, že ve vzorci II R2 jea) atom vodíku nebob) peptid s 2 až 25 aminokyselinovými zbytky, obsahující aminokyselinový zbytek argininu (Arg) na kárboxylovém konci peptidu,R1 je fenylalaninový zbytek (Phe), (B2-B29) jsou aminokyselinové zbytky v polohách B2 až B29 B-řetězce lidského inzulínu,Y je aminokyselinový zbytek ze skupiny alanin (Ala), threonin,(Thr) nebo serin (Ser),X je aminokyselinový zbytek argininu (Arg), nebo peptid s aminokyselinovou sekvencí C-řetězce lidského inzulínu, • ·* « ·· · · ··· . ( « · ···» ···· » • · · · *.. » · · · ··- 28 (A2-A20) jsou aminokyselinové zbytky v polohách A2 až A20 A-řetězce lidského inzulínu, aR3 je aminokyselinový zbytek ze skupiny asparaginu (Asn), šeřinu (Ser) nebo glycinu (Gly).
- 13. Způsob podle nároku 11 vyznačující se tím, že ve vzorci ΙΓ n2 · ·· ' R jea) atom vodíku nebob) peptid s 2 až . 15 aminokyselinovými zbytky, kde na karboxylovem.konci peptidu se nachází aminokyselinový ' zbytek argininu (Arg),R1 je fenylalaninový zbytek (Phe), (B2-B29) jsou aminokyselinové zbytky v polohách B2 až B29 B-řetězce lidského inzulínu,Y je aminokyselinový zbytek threoninu (Thr),X je aminokyselinový zbytek argininu (Arg), nebo peptid se 2 až 35 aminokyselinovými zbytky, přičemž na začátku a na konci peptidu jsou dva bazické aminokyselinové zbytky,, zvláště arginin (Arg) a/nebo lysin (Lys), (A2-A20) jsou aminokyselinové zbytky v polohách A2 až A20 A-řetězce lidského inzulínu, aR3 je aminokyselinový zbytek asparaginu (Asn) nebo glycinu