CZ259898A3 - Způsob získávání prekurzoru insulínu nebo derivátů inzulínu - Google Patents
Způsob získávání prekurzoru insulínu nebo derivátů inzulínu Download PDFInfo
- Publication number
- CZ259898A3 CZ259898A3 CZ982598A CZ259898A CZ259898A3 CZ 259898 A3 CZ259898 A3 CZ 259898A3 CZ 982598 A CZ982598 A CZ 982598A CZ 259898 A CZ259898 A CZ 259898A CZ 259898 A3 CZ259898 A3 CZ 259898A3
- Authority
- CZ
- Czechia
- Prior art keywords
- amino acid
- cysteine
- insulin
- arg
- peptide
- Prior art date
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
- C07K1/12—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length by hydrolysis, i.e. solvolysis in general
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/575—Hormones
- C07K14/62—Insulins
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
- A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
- A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P5/00—Drugs for disorders of the endocrine system
- A61P5/48—Drugs for disorders of the endocrine system of the pancreatic hormones
- A61P5/50—Drugs for disorders of the endocrine system of the pancreatic hormones for increasing or potentiating the activity of insulin
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
- C07K1/02—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length in solution
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
- C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Diabetes (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Endocrinology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Public Health (AREA)
- Zoology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Obesity (AREA)
- Emergency Medicine (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)
Description
Způsob získávání prekurzoru inzulínu nebo derivátů inzulínu
Oblast techniky
Předkládaný vynález se týká zlepšeného způsobu získávání prekurzoru inzulínu nebo inzulínových derivátů se správně spojenými cysteinovými můstky, v přítomnosti cysteinu . nebo hydrochloridu cysteinu a pomocných chaotropních látek.
Dosavadní stav techniky
Lidský inzulín je protein skládající se ze dvou aminokyselinových řetězců, které obsahuj.í dohromady 51 aminokyselinových zbytku. V obou aminokyselinových řetězcích se vyskytuje 6 cysteinových' zbytků, přičemž vždy dva cysteinové zbytky jsou navzájem svázány v disulfidovém můstku. V biologicky aktivním lidském inzulínu jsou A-řetězec a B-řetězec navzájem spojeny dvěma cysteinovými můstky a další cysteinový můstek se vyskytuje v A-řetězci. V molekule lidského inzulínu existuje statisticky vzato 15 možností k vytvoření disulfidových můstků. V biologicky účinném lidském inzulínu se vyskytuje jen jedna z těchto 15 možností. V lidském inzulínu jsou navzájem spojeny následující cysteinové zbytky:
A6 - All
A7 - B7
A20 -B19 'Písmena A a B označují jednotlivé aminokyselinové řetězce inzulínu a číslo označuje polohu, aminokyselinového zbytku, která se počítá od aminového konce ke karboxylovému konci příslušného aminokyselinového řetězce. Disulfidové můstky mohou také vzniknout mezi dvěma molekulami lidského inzulí4 *44
- 2 nu, takže mohou snadno vzniknout mnoho nepřehledných disulfidových můstků.
Známý způsob přípravy lidského inzulínu je založen na využití lidského proinzulínu. Lidský proinzilín je protein s lineárním aminokyselinovým řetězcem z 86 aminokyselin, kde jsou A- a B-řetězec lidského inzulínu navzájem spojemy C-peptidem obsahujícím 35 aminokyselinových zbytků. K vytvoření disulfidových můstků existujících v lidském inzulínu dochází prostřednictvím meziproduktu, kdy jsou cysteinové zbytky lidského inzulínu opatřeny ochrannou sírovou skupinou, např. sulfonátovou (-S-SO3’) skupinou (EP 0 037 255) . ' Dále je znám způsob získání proinzulínu se správně spojenými cysteinovými můstky (Biochemistry, 60/ 1968, s. 622-629), který vychází z proinzulínu z prasečího pankreatu, a kde cysteinové zbytky jsou k dispozici v podobě thiolových (-SH) zbytků. Pod pojmem „ správně spojené cysteinové můstky se rozumějí disulfidové můstky, které se vyskytují v biologicky aktivním inzulínu savců.
Metody genové technologie umožňují, aby se prekurzor inzulínu nebo inzulínového derivátu, zejména lidského proínzulínu nebo proinzulínu, jehož aminokyselinová sekvence a/nebo délka řetězce se odlišují od lidského inzulínu, připravil v mikroorganismech. Proinzulíny připravené v buňkách
E. coli pozměněných metodami genového inženýrství nemají správně spojené cysteinové můstky.
Způsob získání lidského inzulínu z E. coli (EP 0 055 945) se skládá ž následujících kroků;
Fermentace mikroorganismů - rozrušení buněk - izolace fúzovaných proteinů - halogenkyanové štěpení fúzovaných proteinů
- izolace štěpných produktů se sekvencí proinzulínu - ochrana cysteinových zbytků proinzulínu S-sulfonátovou skupinou chromatografické čištění S-sulfonátů - vytvoření správně
Φ & * · · · a
• · 4 ·· ·· spojených cysteinových můstků - vysolení proinzulínu - chromatografické Čištění proinzulínu se správně spojenými cysteinovými můstky - koncentrování proinzulínového roztoku chromatografické čištění koncentrovaného proinzulínového roztoku - enzymatické štěpení proinzulínu vedoucí k získání lidského inzulínu - chromatografické čištění vzniklého lidského inzulínu.
Nevýhodou tohoto způsobu je počet kroků a také ztráty při krocích čištění, které vedou k nízkému výtěžku inzulínu. Vzhledem k mnohakrokovému způsobu se musí počítat se značnými ztrátami. Od kroku izolace fúzovaného proteinu přes halogenkyanové štěpení, sulfitolýzu a čištění proinzulínu se počítá se ztrátou až 40 % proinzulínu (EP 0 055 945) ..
K podobně vysokým ztrátám může dojít v průběhu následujících kroků čištění až do vzniku konečného produktu.
Zvýšení výtěžku se při přípravě lidského inzulínu nebo inzulínových derivátů genovými technikami dá dosáhnout, pokud se významně sníží počet nezbytných kroků v celém postupu.
Z patentových přihlášek EP 0 600 372 Al (případně US
473 049) a EP 0 668 292 A2 je známo odpovídající zlepšení postupu pro získání inzulínu, při kterém se prekurzor inzulínu nebo prekurzor inzulínového derivátu, jejichž cysteinové můstky nejsou správně spojeny, přemění v přítomnosti merkaptanu, např. cysteinu, a nejméně jedné chaotropní pomocné látky, např. močoviny nebo hydrochloridu guanidinu, na prekurzor inzulínu nebo prekurzor inzulínového derivátu se správně spojenými-cystělnovými můstky. Podle tohoto známého způsobu se proteiny nejdříve rozpustí ve vodném roztoku chaotropní pomocné látky nebo směsi různých chaotropních látek o velmi· nízké koncentraci. Pak se proteinová směs smísí s vodným roztokem merkaptanu.
- 4 Překvapivě se nyní zjistilo, že výtěžek správně složených prekurzorú inzulínu nebo inzulínových derivátů se může zvýšit a reakční čas skladebného procesu zkrátit tím, že se prekurzor v počátečním kroku nerozpustí pomocí chaotropní pomocné látky, ale že se nejdřív clo vodné suspenze prekurzoru vnáší merkaptan, zejména cystein nebo hydrochlorid cysteinu, a teprve v následujícím kroku, se roztok- prekurzořu vnese do vodného roztoku chaotropní pmomocné látky, a pak se dosáhne správného složení prekurzoru naředěním směsi na výhodnou koncentraci cysteinu popřípadě hydrochloridu cysteinu vnesením směsi do odpovídajícího množství vody.
Podstata vynálezu . Předkládaný vynález se týká., způsobu získání prekurzoru inzulínu nebo inzulínového derivátu se správně spojenými . cysteinovými můstky v přítomnosti cysteinu nebo hydrochloridu cysteinu a chaotropní pomocné látky, který spočívá v tom,, že se provedou po sobě následující kroky:
a) smíchá se vodná suspenze prekurzoru inzulínu nebo inzulínového derivátu s množstvím cysteinu nebo hydrochlorisdu . cysteinu, které poskytne 1 až 15 SH-skupin cysteinu nebo hydrohloridu cysteinu na každý cysteinový zbytek prekurzoru
b) suspenze prekurzoru obsahující cystein nebo hydrochlorid cysteinu se vnese do 4 až 9M roztoku pomocné chaotropní látky při hodnotě pH přibližně 8 až 11,5 a teplotě přibližně 15 až 55 °C a směs se udržuje na této teplotě 10 až 60 minut
c) směs se vnese pří pH hodnotě přibližně 8 až 11,5 a teplotě přibližně 5 až 30 °C do množství vody, že se cystein nebo hydrochlorid cysteinu ve směsi naředí na přibližně 1 až • · ··
- 5 5mM koncentraci a pomocná chaotropní látka na 0,2 až l,0M koncentraci.
Výhodný je takový způsob, kde ve kroku a) množství cysteinu nebo hydrochloridu cysteinu odpovídá takovému množtví, které poskytuje i až 6 SH-skupin cysteinu nebo hydrochloridu cysteinu na každý cysteinový zbytek prekurzoru, v kroku b) se vnese suspenze prekurzoru obsahující cystein nebo hydrochlorid cysteinu do 4 až 9 molárního roztoku pomocné chaotropní látky při pH hodnotě 9 až 11 a teplotě 30 až 45 °C a získaná směs se udržuje na této teplotě po 20 až 40 minut, a v kroku c) se vnese směs při hodnotě pH 8 až 11 a při teplotě 15 až 20 °C do množství vody, které naředí cystein nabo hydrochlorid cysteinu ve směsi na koncentraci přibližně 1 až 5mM a· chaotropní pomocnou látku na koncentraci 0,2 až 1, 0M.
Chaotropní pomocná látka je taková sloučenina, která ve vodném roztoku ruší vodíkové můstky, jako je např. síran amonný, hydrochlorid guanidinu, etylenkarbonát, thiokyanát, dimetylsulfoxid a močovina.
Ve způsobu podle předkládaného vynálezu je výhodnou chaotropní pomocnou látkou guanidin, hydrochlorid guanidinu nebo zvláště výhodnou látkou je močovina.
Koncentrace chaotropní pomocné látka v kroku b) podle vynálezu je výhodně 7 až 9 M, teplota v kroku c) je výhodně 40 °C a pH hodnota v kroku b) je výhodně 10 až 11.
Ve způsobu podle vynálezu je pH hodnta v kroku c) výhodně 10 až 11. V kroku c) způsobu podle předkládaného vynálezu je množství vody, do kterého je vnesena směs, výhodně zvoleno tak, že poskytne naředění cysteinu nebo hydrochloridu cysteinu ve směsi na koncentraci 2,5 až 4mM a chaotropní pomocné látky na koncentraci 0,5M.
• ·*♦
4 4 4
Φ 4 * 4 ·♦· · • » » 4 ·· ·»
Zvláště výhodný je způsob podle předkládaného vynálezu, kde koncentrace chaotropní pomocné látky v kroku b) je přibližně 8M, teplota v kroku b) je přibližně 40 °C, pH hodnota ve kroku b) je přibližně 10,6, pH hodnota v kroku c) je přibližně 10,6, a množství vody v kroku c) poskytuje neředěné cysteinu nebo hydrochloridu cysteinu ve směsi na koncentraci přibližně 2,5 až 3mM a koncentraci chaotropní pomocné látky přibližně 0,5M.
Výsledkem způsobu podle předkládaného vynálezu je prekurzor inzulínu nebo inzulínového derivátu, zvláště proinzulín, jejichž cysteinové můstky jsou správně spojeny.
Inzulínové deriváty jsou deriváty přirozeně se vyskytujícího inzulínu, a sice lidského inzulínu (sekvence identifikačního čísla 1 = A-řetězec lidského inzulínu, sekvence identifikačního čísla 2 = B-řetězec lidského inzulínu, viz seznam sekvencí) nebo zvířecího inzulínu, které se odlišují od příslušné jinak shodné sekvence přirozeně se vyskytujícího inzulínu substitucí (náhradou) několika přirozeně se1 vyskytujících aminokyselinových ' zbytků a/nebo adicí (přidáním) několika aminokyselinových zbytků a/nebo organických zbytků.
Z prekurzoru inzulínu popřípadě inzulínového derivátu se správně spojenými cysteinovými můstky, získaného pomocí způsobu podle předkládaného vynálezu, se následně může vyrobit inzulín nebo inzulínový derivát se správně spojenými cysteinovými můstky způsobem popsaným v EP 0' 600 372 (případně US 5 473 040) nebo EP 0 668 292 A2, a .sice enzymatickým štěpením trypsinem nebo trypsinu podobným enzymem, případně navíc pomocí karboxypeptidázy B, a následným přečištěním na adsorpční pryskyřici,
Inzulín nebo inzulínový derivát, který je vyrobitelný z prekurzoru, je přednostně popsán vzorcem I
• ···
(AG)
.3 (A20)
Gly-Cys-Cys-Cys-Cys-r3-OH (A1) (A7) (A11) .
R1-Cys (B1) (B7)
Cys (B19)
Y-Z (B30) kde
Y znamená geneticky kódovatelný aminokyselinový zbytek,
Z je
a) aminokyselinový zbytek ze, skupiny His, Arg nebo Lys,
b) peptid se 2 nebo 3 aminokyselinovými zbytky, obsahující aminokyselinový zbytek. Arg nebo Lys na karboxylovém konci peptidu,
c) peptid se 2 až 35 geneticky kódovatelnými aminokyselinami, obsahující 1 až 5 histidinových zbytků, nebo
d) OH,
R1 je fenylalaninový zbytek (Phe) nebo kovalentní vazba,
R3 je geneticky kódovatelný aminokyselinový zbytek, přičemž zbytky A2 až A20, které nejsou pro zjednodnušení vzorce I na obrázku znázorněny, odpovídají aminokyselinové sekvenci A-řetězce lidského inzulínu, zvířecího inzulínu nebo inzulínového derivátu, a zbytky B2 až B29, které nejsou pro zjednodnušení vzorce I na obrázku znázorněny, odpovídají aminokyselinové sekvenciB-řetězce lidského inzulínu, zvířecího inzulínu nebo inzulínového derivátu.
Aminokyselinové sekvence peptidu a proteinů jsou označovány od N-konce aminokyselinového řetězce. Údaje ve vzorci I, které jsou v závorce, např. A6, A20, Bl, B7 nebo B19 « ft * . · ftft • ft·· · ··· · * = ftft
- 8 • ftftft · • · · · • ft ft ftft ftft odpovídají polohám aminokyselinových zbytků v A-řetězci nebo B-řetězci inzulínu.
Termín „geneticky kódovatelný aminokyselinový zbytek zahrnuje aminokyseliny Gly, Ala, Ser, Thr, Val, Leu, Ile, Asp, Asn, Glu, Gin, Cys, Met, Arg, Lys, His, Tyr, .Phe, Trp, Pro a selenocystein.
Pod pojmem „zbytky A2 až A2 0 a „zbytky B2 až B2 9 zvířecího inzulínu se rozumí např. aminokyselinové sekvence inzlínu z krávy, vepře nebo slepice. Pojmy „zbytky A2 až A20 a „zbytky B2 až B29 pro inzulínový derivát znamenají odpovídající., aminokyselinové sekvence lidského inzulínu, které byly vytvořeny záměnou aminokyselin jinými geneticky kódovatelnými aminokyselinami.
A-řetězec lidského inzulínu má -např. následující sekvenci (sekvence identifikačního čísla I);
Gly Ile-Val·’Glu Gin Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leů Tyr
Gin Leu Glu Asn Tyr Cys Asn.
B-řetězec lidského inzulínu má např. následující sekvenci (sekvence identifikačního čísla 2):
Phe Val Asn Gin His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala
Leu Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro
Lys Thr.
Přitom ve vzorci I je R3 asparagin (Asn) , R1 je fenylalanin (Phe),' Y je threonin (Thr) a Z je OH.
Způsob podle předkládaného vynálezu je zvláště vhodný k získání prekurzoru inzulínu nebo inzulínového derivátu podle obecného vzorce II, jehož cysteinové můstky (ve vzorci
II neznázorněné) jsou správně složeny,
R2-R1-(B2-B29)-Y-X-Gly-(A2-A20)-R3 (II)
- 9 a kde
R2 je
a) atom vodíku
b) aminokyselinový zbytek ze skupiny lysin (Lys) nebo arginin (Arg),nebo
c) peptid s 2 až 45 aminokyselinovými zbytky, obsahující aminokyselinový.zbytek lysin (Lys) nebp arginin (Arg)na karboxylovém konci peptidů,
R1 je fenylalaninový zbytek (Phe) nebo kovalentní vazba, (B2-B29) jsou aminokyselinové zbytky v polohách B2 až B29 B-řetězce- lidského inzulínu, zvířecího inzulínu nebo případně v jedné- nebo více polohách pozměněného inzulínového derivátu,
Y je geneticky kódovatelný aminokyselinový zbytek,
X je
a) aminokyselinový zbytek ze skupiny lysin (Lys) nebo arginin (Arg), nebo
b) peptid se 2 až 35 aminokyselinovými zbytky obsahující: aminokyselinový zbytek lysinu (Lys) nebo argininu (Arg) na N-konci a karboxylovém konci peptidů, nebo
c) peptid se 2 až 35 geneticky kódovatelnými aminokyselinami, obsaující 1 až 5 histidinových zbytku (His), (A2-A20) jsou aminokyselinové zbytyky v polohách A2 až A20 A-řetězce lidského inzulínu, zvířecího inzulínu nebo případně v jedně nebo více polohách pozměněného inzlínového derivátu, a
R je geneticky kódovatelný aminokyselinový zbytek.
-ΙΟΙ. Ve vzorci II mají symboly přednostně následující význam:
R2 je
a) atom vodíku nebo
b) peptid se 2 až 25 aminokyselinovými zbytky, obsahující aminokyselinový zbytek argininu (Arg) na karboxylovém konci peptidu,
R1 je fenylalaninivý zbytek (Phe), (B2-B29) jsou' aminokyselinové zbytky v polohách B2 až B29 B-řetězce lidského inzulínu,
Y je aminokyselinový zbytek ze skupiny alaninu (Ala), threoninu (Thr) nebo šeřinu (Ser),
X je aminokyselinový zbytek argininu (Arg) nebo peptid s aminokyselinovou sekvencí C-řetězce lidského inzulínu, (A2-A20) jsou aminokyselinové zbytyky v polohách A2 až A20 A-řetězce lidského·inzulínu, a
R3 je aminokyselinový zbytek ze skupny asparaginu (Asn), šeřinu (Ser) nebo glycinu (Gly).
C-řetezec lidského inzulínu má následující sekvenci aminokyselin (sekvence identifikačního čísla 3):
| Arg Arg | Glu | Ala | Glu | Asp | Leu | Gin | Val | Gly | Gin | Val | Glu | Leu |
| Gly Gly | Gly | Pro | Gly | Ala | Gly | Ser | Leu | Gin | Pro | Leu | Ala | Leu |
| Glu Gly | Ser | Leu | Gin | Lys | Arg |
2. Ve vzorci II mají symboly přednostně následující význam:
R2 je
a) atom vodíku nebo
b) peptid s 2 až 15 aminokyselinovými zbytky, na jehož karboxylovém konci se nachází aminokyselinový zbytek argininu (Arg),
R1 je fenylalaninivý zbytek (Phe),
Φ
Β
- 11 • BBB • · · • Β ··« ΒΒ· · φ · • Β ΒΒ · • φ 88
Β ΦΦ Η I Β
Φ Φ Φ
Β ΒΒ (Β2-Β29) jsou aminokyselinové zbytky v polohách B2 až B29 B-řetězce lidského inzulínu,
Y je threoninový zbytek (Thr),
X je aminokyselinový zbytek argininu (Arg) nebo peptid se 2 až 3 5 .aminokyselinovými zbytky, kde jsou na začátku i na konci peptidu dva bazické aminokyselinové zbytky, zvláště arginin (Arg) a/nebo lysin (Lys), (A2-Á20) jsou aminokyselinové zbytyky v polohách A2 až A20 A-řetězce lidského inzulínu,a
R je aminokyselinový zbytek asparaginu (Asn) nebo glycinu (Gly) .
Zbytek Z inzulínu nebo inzulínového derivátu podle vzorxe I je zpravidla část aminokyselinové sekvence X prekurzoru podle vzorce II a vzniká aktivitou proteáz jako je např. ' trypsin, trypsinu podobné enzymy nabo karboxypeptidáza B. Zbytek R3 je aminokyselinový zbytek, který v má polohu A21 v A-řetězci inzulínu. Zbytek Y je aminokyselinový zbytek, který má polohu B30 v B-řetězci inzulínu.
Trypsin nebo trypsinu podobné enzymy jsou proteázy,, které Štěpí aminokyselinový řetězec v místě argininového nebo .lysinového zbytku. Karboxypeptidáza je exoproteáza, která odštěpuje bazické aminokyselinové zbytky jako je např. Arg nebo Lys, které jsou na’karboxylovém konci aminokyselinového řetězce (Kemmler et al. , J. Biol. Chem., 246, s. 6786-6791).
Z prekurzoru jmenovaného v 1. bode je možné získat např. inzulínový derivát podle vzorce I se správně spojenými
3 cysteinovými můstky, přičemž Y, R , R , R , A2-A20 a B2-B29 máji význam popsaný v 1. bodu a Z je argininový zbytek (Arg), peptidový zbytek Arg-Arg nebo -OH skupina.
• · ·♦ ··· · · ftft ft • ft *· • ··· *
• ftft
- 12 • ft ft*
Z prekurzoru jmenovaného ve 2. bodě je možné získat např. inzulínový derivát podle vzorce I se správně spojenými cysteinovými můstky, přičemž Y, R1, R2, R3, A2-A20 a B2-B29 mají význam popsaný v 2. bodu a Z je argininový zbytek (Arg), peptidový zbytek Arg-Arg nebo nebo Lys-Lys nebo -OH skupina.
Prekurzor podle vzorce II se může tvořit pomocí mnohých genových konstruktů v mikroorganismech (viz EP 0 489 780, EP 0 347 781, EP 0· 453 969). Genové konstrukty jsou exprimovány . v mikroorganismech jako jsou např. E. coli nebo streptomycéty v průběhu , fermentace. Vytvářené proteiny se ukládají uvnitř mikroorganismů (EP 0 489 780) nebo jsou vylučovány do fermentačního roztoku.
Pro-způsob podle předkládaného vynálezu se může použít takový prekurzor inzulínu nebo inzulínového derivátu podle vzorce II, který je ještě bezprostředně po rozrušení buňky znečištěn mnohými proteiny pocházejícími z fermentačního roztoku a mikroorganismů. Prekurzor podle vzorce II se může použít také v přečištěné podobě, např. po srážení nebo chromatograf ickém čištění.
Příklady provedení vynálezu
Příklad 1 (Srovnávací příklad·, stav techniky)
Fermentaci geneticky modifikovaných buněk E. coli (EP
489 780) byl připrven fúzní protein s následující aminokyselinovou sekvencí.
* » 00 ··· · » »9 · • 0 0* • · • ··· : :
»·····
- 13 Sekvence proinzulínu 1 (sekvence identifikačního čísla 4) :
| Ala | Thr | Thr | ser | Thr | Gly | Asn | Ser | Ala | Arg | Phe | Val | Asn | Gin | His | Leu |
| Cys | Gly | Ser | His | Leu | Val | Glu | Ala | Leu | Tyr | Leu | Val | Cys | Gly | Glu | Arg |
| Gly | Phe | Phe | Tyr | Thr | Pro | Lys | Thr | Arg | Arg | Glu | Ala | Glu | Asp | Leu | Gin |
| Val | Gly | Gin | Val | Glu | Leu | Gly | Gly | Gly | Pro | Gly | Ala | Gly | Ser | Leu | Gin |
| Pro | Leu | Ala | Leu | Glu | Gly | Ser | Leu | Gin | Lys | Arg | Gly | Ile | Val | Glu | Gin |
| Cys | Cys | Thr | Ser | Ile | Cys | ser | Leu | Tyr | Gin | Leu | Glu | Asn | Tyr | Cys | Asn |
Sekvence proinzulínu. 1 odpovídá vzorci II, přičemž
X je C-peptid lidského inzulínu (sekvence i. č. 3),
Y je Thr (B30j ,
R1 je Phe (Bl) ,
R je peptid s 10 aminokyselinovými zbytky,
R3 je Asn (A21) a (A2-A20) jsou aminokyselinové ,zby.tyky (v polohách . 2 až. 20) A-řetězce lidského inzulínu a (B2-B29) jsou aminokyselinové zbytyky (v polohách 2 až 29) B-řetězce lidského inzulínu.
Fúzní protein se sekvencí proinzulínu 1 exprimovaný v buňkách E. coli se shromažďoval v buňkách a tvořil uzavřenou částici. Po skončení fermentace se buňky oddělily odtřeďováním a obvyklou vysokotlakou homogenizací rozrušily. Uvolněné.částice fúzního proteinu se pák izolovaly odstředěním. 20 kg izolovaných částic fúzního proteinu (vztaženo na suchou hmotnost po lyofilizaci, podíl fúzního proteinu obsahující inzulín byl určen pomocí HPLC a činil 50 %) se sekvencí odpovídající proinzulínu 1 se rozpustilo v 550 1 8M roztoku močoviny při pH 10,6. Po případném^ odstředění menšího mnoštví látek způsobujících zákal se čirý roztok rozmíchal v 9000 1 vodného cysteinového roztoku (5 kg hydrátu hydrochloridu cysteinu) při hodnotě pH 10,6 a teplotě 4 °C.. Po ukončení skladebné reakce asi po 24 hodinách se ve 3kg várce pomocí analytické HPLC stanovil obsah proinzulínové » » · · • 4 »· · β
··· 4 * • 4 9 • · 44 sekvence 1 se správně spojenými cysteinovymi můstky, který odpovídal 30% přeměně.
9500 1 roztoku se pomocí IN HCI upravilo na pH 5,0 a separovalo. Pak se nastavilo pH 9,0 přidáním sodného louhu. Pak se přidaly do roztoku 3' g trypsinu. Podle měření HPLC tak vzniklo 1,25 kg inzulínu s 2 argininovými zbytky na .karboxylovém konci.
Po štěpení karboxypaptidázou B vznikl lidský inzulín, který se dále Čistil pomocí chromatografických metod.
Lidský inzulín odpovídá vzorci I, přičemž Y je Thr (B30),
Z je OH,
R1 je Phe (Bl) ,
R3 je Asn (A21) a
A2TA20 jsou aminokyselinové zbytky (v polohách . 2 . až 20) A-řetězce lidského inzulínu a (B2-B29) jsou aminokyselinové zbytyky (v polohách 2 až 29) B-řetězce lidského inzulínu.
Lidský inzulín 2 se skládá ze sekvencí identifikačních čísel 1 a 2, které jsou navzájem spojeny správně spojenými cysteinovými můstky.
Roztok se zakoncentruje, jak bylo popsáno v EP 0 668 292, pomocí adsorpční pryskyřice a přečistí. Eluát obsahující inzulín 2 se bezprostředně po naředění vodou a nastavení hodnoty pH múze dále čistit na chromatografické koloně.
Analýza pomocí HPLC
0,5 g proteinu se rozpouštělo ve 40 ml roztoku o složení: 6M hydrochlorid guanidia, 50mM Tris, pH 8,5, 5mM kyselina etylendiamintetraoctová (EDTA), 1% 2-merkaptoetanol, lOmM dithiotreitol, při 95 °C po 2 minuty, a pak odstředilo 20 minut při 14000 g. 0,02 ml čirého roztoku se naneslo na HPLC kolonu.
e * • · ··· ···
Nagel, Aachen, • * 1 ·· ·
Kolona: ®Nucleogel RP 300-5/46 (Macherey a Německo)
Gradient: Pufr A: 0,1¾ kyselina trifluorooctová (TFA)
Pufr B: 0,09% TFA v acetonitrilu Teplota: 55 °C
Celkový čas běhu: 40 minut
Gradient je charakterizován následujícícím množstvím pufru B po odpovídající době běhu:
min 25 %, 12 min 60 %, 13 min 90 %, 15 min 100%
Průtok: 1 ml/min
Detekce: 215 nm
Retenční čas inzulínu: asi 19 minut
Příklad 2 (Způsob podle předkládaného vynálezu)
Fermentací geneticky modifikovaných buněk E. coli (viz EP 0 489 780) se připravil fúzní protein s aminokyselinovou sekvencí, která je uvedena v příkladu 1 (sekvence proinzulínu 1, sekvence i. č. 4). Exprimovaný fúzní protein se sekvencí proinzulínu 1 se shromažďoval v buňkách E. coli a tvořil .uzavřenou částici. Po skončení fermentace se buňky oddělily odtřeďováním a obvyklou vysokotlakou homogenizací rozrušily. Uvolněné částice fúzního proteinu se pak izolovaly odstředěním.
K vodné suspenzi fúzního proteinu obsahující 40 kg fúzního proteinu (stanoveno lyofylizací alikvotní části) se přidalo 5 kg hydrátu hydrochloridu cysteinu.
Suspenze proinzulínu 1 (podíl inzulín obsahujícího fúzního proteinu stanovený pomocí HPLC činil 50 %) se rozpustila v 550 1 8M močoviny při pH 10,2 při 40 °C. Čirý roztok se přimíchal k 9000 1 vody při pH 10,6 a teplotě 15 °C. Po ukončení skladebné rekace asi po 5 hodinách se
0
00
- 16 pomocí analytické HPLC v lOkg várce stanovil obasah proínzulínu I se správně spojenými cysteinovými můstky, který odpovídal 50% přeměně. 9500 1 roztoku se pomocí IN HCl upravilo na pH 5,0 a separovalo. Pak následovalo nastavení na pH 9,0 přidáním sodného louhu. Pak se do· roztoku přidalo 10 g trypsinu. Vznikly tak 4 kg inzulínu s 2 argininovými zbytky na kárboxylovém konci. Po štěpení karboxypeptidázou . B vznikl lidský inzulín (sekvence i. č. 1 a 2 se správně, spojenými cysteinovými můstky). Roztok se dále pomocí adsorpční pryskyřice zakoncentroval a čistil. Eluát obsahující inzulín 2 * se' bezprostředně po naředění vodou a nastavení hodnoty pH může dále čistit na chromatografická koloně.
Příklad 3 (Srovnávací příklad, stav techniky)
Fermentací geneticky modifikovaných buněk E. coli (EP 0'
489 780) byl připraven fúzní protein s následující aminokyselinovou sekvencí.
Sekvence proinzulínu 2 (sekvence i. č. 5):
| Ala | Thr | Thr | Ser | Thr | Gly | Asn | Ser | Ala | Arg | Phe | Val | Asn | Gin | His | Leu |
| Cys | Gly | Ser | His | Leu | Val | Glu | Ala | Leu | Tyr | Leu | Val | Cys | Gly | Glu | Arg |
| Gly | Phe | Phe | Tyr | Thr | Pro | Lys | Thr | Arg | Arg | Glu | Ala | Glu | Asp | Leu | Gin |
| Val | Gly | Gin | Val | Glu | Leu | Gly | Gly | Gly | Pro | Gly | Ala | Gly | Ser | Leu | Gin |
| Pro | Leu | Ala | Leu | Glu | Gly | Ser | Leu | Gin | Lys | Arg | Gly | Ile | Val | Glu | Gin |
| Cys | Cys | Thr | Ser | Ile | Cys | Ser | Leu | Tyr | Gin | Leu | Glu | Asn | Tyr | Cys | Gly |
Sekvence proinzulínu 1 odpovídá vzorci II, přičemž X je C-peptid lidského inzulínu (sekvence id. č. 3), Y je Thr (B30),
R1 je Phe (Bl) ,
R2 je peptid s 10 aminokyselinovými zbytky, • · » ·
- 17 ··· * « • · « «· ··
R3 je Gly (A21) a (A2-A20) jsou aminokyselinové zbytyky (v polohách 2 až 20) A-řetězce lidského inzulínu a (B2-B29) jsou aminokyselinové zbytky (v polohách 2 až 29) B-řetězce lidského inzulínu.
Fúzní protein se sekvencí 'proinzulínu 2 exprimovaný v buňkách B. coli se shromažďoval v buňkách a tvořil uzavřenou částici. Po skončení fermentace se buňky oddělily odstřeďováním a obvyklou vysokotlakou homogenizací rozrušily. Uvolněné částice fúzního proteinu se pak izolovaly odstředěním.
kg izolovaných částic fúzního proteinu (vztaženo na suchou hmotnost po lyofilizaci, podíl fúzního proteinu obsahující inzulín byl určen pomocí HPLC a činil 50 %) se sekvencí odpovídající proinzulínu 2 se rozpustilo v 550 1 8M roztoku močoviny při pH 10,6 a teplotě 20 °C. Čirý roztok se rozmíchal v 9000 1 vodného cysteínového roztoku (5 kg hydrátu hydrochloridu cysteinu) při hodnotě pH 10,6 a teplotě 4 °C. Po ukončení skladebné reakce asi po 24 hodinách se ve 3kg várce pomocí analytické HPLC stanovil obsah proinzulínové sekvence 2 se správně spojenými cysteinovými můstky, který odpovídal 30% přeměně.
9500 1 roztoku se pomocí IN HCI upravilo na pH 5,0 a separovalo. Pak následovalo nastavení na pH 9,0 přidáním sodného louhu. Pak se přidaly do roztoku 3 g trypsinu. Podle měření HPLC tak vzniklo 0,9 kg inzulínového derivátu se 2 argininovými zbytky na karboxylovém konci.
Tento inzulínový derivát odpovídá vzorci I, přičemž Y je Thr (B30),
Z je Arg-Arg R1 je Phe (Bl) ,
R3 je Gly (A21) a »φ φ • · φφ β
. φ
ΦΦΦ ΦΦΦ • * * φ
φ φ φ
- 18 Α2-Α20 jsou aminokyselinové zbytky (v polohách 2 až 20) Ařetězce lidského inzulínu a (B2-B29) jsou aminokyselinové zbytyky (v polohách 2 až 29) B-řetězce lidského inzulínu, a skládá se ze sekvencí identifikačních čísel 6 a 7, které jsou navzájem spojeny správně spojenými cysteinovými můstky.
Roztok se zakoncentruje pomocí adsorpční pryskyřice a přečistí. Eluát obsahující inzulínový derivát se bez-' prostředně po naředění vodou a nastavení hodnoty pH může dále čistit na chromatografické koloně.
Příklad 4 (Způsob podle předkládaného vynálezu)
Fermentací geneticky modifikovaných buněk E. coli (EP 0 489 780) byl připraven podle příkladu 3 připraven fúzní protein.se sekvencí proinzulínu 2 (sekvence i. Č. 5).
Exprimovaný fúzní protein se sekvencí proinzulínu 2 se· shromažďoval v buňkách E. coli a tvořil uzavřenou částici.
Po skončení fermentace se buňky oddělily odtřeďovánínr a obvyklou vysokotlakou homogenizací rozrušily. Uvolněné částice fúzního proteinu se pak izolovaly odstředěním.
Do vodné suspenze fúzního proteinu obsahující 40 kg fúzního proteinu (jak bylo stanoveno lyofilizací alikvotní Části) .se přidalo 5 kg hydrátu hydrochloridu cysteinu.
Suspenze s proteinem (podíl fúzního proteinu obsahující inzulín byl určen pomocí HPLC a Činil 50 %) se sekvencí odpovídající proinzulínu 2 se rozpustilo v 550 1 8M roztoku močoviny při pH 10,2 a teplotě 40 °C.' Čirý roztok se přimíchal do 9000 1 vody při hodnotě pH 10,6 a teplotě 15 °C. Po ukončení skladebné reakce asi po 5 hodinách se v lOkg várce pomocí analytické HPLC stanovil obsah proinzulínové sekvence 2 se správně spojenými cysteinovými můstky, který odpovídal 50% přeměně.
• · ·· • · · · · ·
- 19 9500 1 roztoku se pomocí IN HCl upravilo na pH 5,0 a separovalo. Pak následovalo nastavení na pH 9,0 přidáním sodného louhu. Pak se přidalo do roztoku 10. g trypsinu. Tak vzniklo 2,8 kg inzulínového derivátu (podle měření HPLC)', který se skládá ze sekvencí id. č. 6 a 7, které jsou navzájem spojeny správně spojenými cysteinovými můstky.
Roztok se zakoncentruje pomocí adsorbční pryskyřice a přečistí. Eluát* obsahující inzulínový derivát se bezprostředně po naředění vodou a nastavení hodnoty pH může dále čistit na chromatografické koloně.
·
- 20 « 44
SEZNAM SEKVENCÍ (2) INFORMACE PRO SEKVENCI Ξ IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 1:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 21 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina .(C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii)' TYP MOLEKULY: protein (vi) PŮVODNÍ ZDROJ:
(A)ORGANISMUS: Escherichia coli (ix) ZNAK:
(A) JMÉNO/OZNAČENÍ: protein (B) POZICE:1...21 (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S ID. Č. 1:
Gly Ile Val Glu Gin Cys Cys Thr 5er Ile Cys Ser Leu Tyr Gin ,Leu 1 5 10 15
Glu Asn Tyr Cys Asn 20 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 2:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 30 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: protein (vi) PŮVODNÍ ZDROJ:
(A)ORGANISMUS: Escherichia coli (ix) ZNAK:
(A) JMÉNO/OZNAČENÍ: protein (B) POZICE:1...30 (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S- ID. Č. 2:
Phe Val Asn Gin His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr 1 5 10 15
Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr 20 25 30 « 4 ·
4*4 *
- 21 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 3;
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE;
(A) DÉLKA: 35 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: protein (vi) PŮVODNÍ ZDROJ:
(A) ORGANISMUS: Escherichía coli (ix) ZNAK:
(A) JMÉNO/OZNAČENÍ: protein (B) POZICE: 1...35
| (xi) | POPIS | SEKVENCE: | SEKVENCE S | ID. | . c. | 3 : | |||
| Arg.Arg | Glu Ala | Glu Asp Leu | Gin Val Gly | Gin | Val | Glu | Leu | Gly | Gly |
| 1 | 5 | 10 | 15 | ||||||
| Gly Pro | Gly Ala | Gly Ser Leu | Gin Pro Leu | Ala | Leu | Glu | Gly | Ser | Leu |
| 20 | 25 | 30 |
| Gin Lys Arg 35 |
(2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 4:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 96 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (D) TOPOLOGIE: lineární' (ii) TYP MOLEKULY: protein (vi) PŮVODNÍ ZDROJ:
(A) ORGANISMUS: Escherichía coli (ix) ZNAK:
(A) JMÉNO/0ZNAČENÍ: protein (B) POZICE: 1...96 (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S ID. Č. 4:
| Ala | Thr | Thr | Šer | Thr | Gly | Asn | Ser | Ala | Arg | Phe | Val | Asn | Gin | His | Leu |
| 1 | 5 | 10 | 15 | ||||||||||||
| Cys | Gly | Ser | His | Leu | Val | Glu | Ala | Leu | Tyr | Leu | Val | Cys | Gly | Glu | Arg |
| 20 | 25 | 30 |
- 22 ··«
| Gly | Phe | Phe 35 | Tyr | Thr | Pro | Lys | Thr 40 | Arg | Arg | Glu | Ala | Glu 45 | Asp | Leu | Gin |
| Val | Gly 50 | Gin | Val | Glu | Leu | Gly 55 | Gly | Gly | Pro | Gly | Ala 60 | Gly | Ser | Leu | Gin |
| Pro 65 | Leu | Ala | Leu | Glu | Gly 70 | Ser | Leu | Gin | Lys | Arg 75 | Gly | Ile | Val | Glu | Gin 80 |
| Cys | Cys | Thr | Ser | Ile 85 | Cys | Ser | Leu | Tyr | Gin 90 | Leu | Glu | Asn | Tyr | Cys 95 | Asn |
(2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 5:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 96 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: protein (vi) PŮVODNÍ ZDROJ:
(A) ORGANISMUS: Escheřichia coli (ix) ZNAK:
(A) JMÉNO/OZNAČENÍ:. protein (B) POZICE: 1...96
| (xi) | POPIS | SEKVENCE: | SEKVENCE S | ID | . Č. | 5 : |
| Ala Thr 1 | Thr Ser | Thr Gly Asn 5 | Ser Ala Arg 10 | Phe | Val | Asn Gin His Leu 15 |
| Cys Gly | Ser His 20 | Leu Val Glu | Ala Leu Tyr 25 | Leu | Val | Cys Gly Glu Arg 30 |
| Gly Phe | Phe Tyr 35 | Thr Pro Lys | Thr Arg Arg 40 | Glu | Ala | Glu Asp Leu Gin 45 |
| Val Gly 50 | Gin Val | Glu Leu Gly 55 | Gly Gly Pro | Gly | Ala 60 | Gly Ser Leu Gin |
| Pro Leu 65 | Ala Leu | Glu Gly Ser 70 | Leu Gin Lys | Arg 75 | Gly | Ile Val Glu Gin 80 |
| Cys. Cys | Thr Ser | Ile Cys Ser 85 | Leu Tyr Gin 90 | Leu | Glu | Asn Tyr Cys Gly 95 |
*
I Φ · k · ·*
- 23 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 6: (i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
| (A) DÉLKA: 32 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (D) TOPOLOGIE: lineární | |||
| (ii) | TYP MOLEKULY: protein | ||
| (vi) | PŮVODNÍ ZDROJ: (A) ORGANISMUS; Escherichia coli | ||
| (ix) | ZNAK: | T - .nnh ’Φ·· |
(A) JMÉNO/OZNAČENÍ: protein (B) · POZICE: 1...32 (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S ID. Č. 6:
| Phe 1 | Val | Asn | Gin | His 5 | Leu | Cys | Gly Ser His 10 | Leu Val | Glu | Ala | Leu 15 | Tyr | |||
| Leu | Val | Cys | Gly | Glu | Arg | Gly | Phe | Phe | Tyr | Thr | Pro | Lys | Thr | Arg | Arg |
| 20 | 25 | 30 |
(2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 7:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 21 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: protein (vi) PŮVODNÍ ZDROJ:
(A). ORGANISMUS:' Escherichia coli (ix) ZNAK:
(A) JMÉNO/OZNAČENÍ : protein (B) POZICE: 1...32 (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S ID. Č. 7:
Gly Ile Val Glu Gin Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gin Leu io 15
Glu Asn Tyr Cys Gly
Claims (11)
- PATENTOVÉ NÁROKY1, Způsob přípravy prekurzoru inzulínu nebo derivátu se správně spojenými cysteinovými můstky v přítomnosti cysteinu nebo hydrochloridu cysteinu a chaotropní pomocné látky, vyznačující se tí.m, že se postupně provedou následující kroky:a) smíchá se vodná suspenze prekurzoru inzulínu nebo inzulínového derivátu s' takovým množstvím cysteinu nebo hydrochloridu cysteinu, ' které poskytne 1 až 15 SH-.zbytků cysteinu nebo hydrochloridu cysteinu na každý cysteinový zbý-* tek prekurzoru,b) suspenze prekurzoru obsahující cystein nebo hydrochlorid cysteinu se vnese do 4 až 9M roztoku chaotropní pomocné látky při hodnotě pH přibližně 8 až 11,5 a teplotě při bližně 15 až 55 °C a získaná směs se udržuje na této teplotě 10 až S0 minut, ac) směs se vnese při pH hodnotě přibližně 8 až 11,5 a teplotě přibližně 5 až 30 °C do vody v takovém množství, že se cystein nebo hydrochlorid cysteinu ve směsi naředí na přibližně 1 až 5mM koncentraci a· chaotropní pomocná látka na 0,2 až l,0M koncentraci.
- 2Způsob podle nároku lvyznačující se tím, že v kroku a) množství cysteinu nebo hydrochloridu cysteinu odpovídá takovému množství, které poskytuje 1 až 6 SH-zbytků cysteinu nebo hydrochloridu cysteinu na každý cysteinový zbytek prekurzoru, v kroku b) se vnese suspenze prekurzoru obsahující cystein nebo hydrochlorid cysteinu do 4 až 9 molárního roztoku chaotropní pomocné látky při pH hodnotě 8 až 11 a teplotě 30 až • · * • ··· t- 25 « »·♦ » ·« • · ·· « *·· · · • · · · ·· ·· ··45 °C a získaná směs se udržuje na této teplotě po 20 až 40 minut, a v následujícím kroku c) se vnese směs při hodnotě pH 8 až 11 a při teplotě 15 až 20 °C do vody v takovém množství, že se cystein nebo hydrochlorid cysteinu ve směsi naředí na koncentraci přibližně 1 až 5mM a chaotropní pomocná látka na koncentraci 0,2 až 1,0 M.
- 3. Způsob podle nároku 1 nebo 2 vyznačující se tím, že chaotropní pomocná látka je guanidin nebo hydrochlorid guanidinu.
- 4. Způsob podle nároku 1 nebo 2 vyznačující se tím, že chaotropní pomocná látka je močovina.
- 5. Způsob podle jednoho nebo několika nároků 1 až 4 vyznačující se tím, že koncentrace chaotropní pomocné látky v kroku b) je 7,0 až 9,0M.
6. Způsob podle jednoho nebo několika nároků 1 v az 5 vyznač u j í c í se t í m, že teplota v kroku b) je 40 °C. 7. Způsob podle jednoho nebo ' několika nároků 1 až 6 vyznač u j í c í se t í m, že hodnota pH v kroku b) je 10 až 11. - 8. Způsob podle jednoho nebo několika nároků 1 až 7 vyznačující' se tím, že hodnota pH v krokuc) je 10 až 11.• · ·· ft·· ft ft • · ft • ft ftft • · · ·Φ · ·♦ · ftft · • ft ftft • ft·* • · · • · • ftft ···- 26
- 9. Způsob podle jednoho nebo několika nároků 1 až 8 vyznačující se tím, že v kroku c) množství vody poskytne ve směsi naředění cysteinu nebo hydrochloridu cysteinu na 2,5 až 3mM koncentraci a chaotropní pomocné látky na 0,5M koncentraci.
- 10. ' Způsob podle jednoho nebo několika z nároků 1 až 9 vyznačuj ící.....s e ' t í ni, že koncentrace chaotropní pomocné látky v kroku b)· je přibližně 8M, teplota v kroku b) je přibližně 4 0 °C, hodnota pH v kroku b) je přibližně 10,6, hodnota ' pH v kroku c) je přibližně 10,6,. * a množství vody v kroku c) poskytne ve směsi naředění cysteinu nebo hydrochloridu cysteinu na přibližně 2,5 až 3mM koncentraci a chaotropní pomocné látky na 0,5M koncentraci.
- 11. Způsob podle jednoho nebo několika nároků 1 až 10 vyznačující se tím, že prekurzor inzulínu nebo inzulínového derivátu má sekvenci podle obecného vzorce IIR2-R1-(B2-B29)-Y-X-Gly-(A2-A20)-R3 (II), kdeR2 jea) atom vodíkub) aminokyselinový zbytek ze skupiny 'lysinu (Lys) nebo argininu (Arg), neboc) peptid se 2 až 45 aminokyselinovými zbytky, obsahující aminokyselinový zbytek lysinu (Lys) nebo argininu (Arg) na'karboxylovém konci peptidu,R1 je fenylalaninový zbytek (Phe) nebo kovalentní vazba, (B2-B29) jsou aminokyselinové zbytky v polohách B2 až B29 B-řetězce lidského inzulínu, zvířecího inzulínu nebo případftft ft • ··· • ♦ • ft ·· ftft· ft · • ft · • ft * • ftft ♦ · • » • ft ··- 27 ně inzulínového derivátu pozměněného v jedné nebo více polohách,Y je geneticky kódovatelný aminokyselinový zbytek,X jea) aminokyselinový zbytek ze skupiny lysinu (Lys) nebo argininu (Arg), nebob) peptid se 2 až 35 aminokyselinovými zbytky obsahující aminokyselinový zbytek lysinu (Lys) nebo argininu (Arg) na N-konci a kárboxylovém konci peptidu, neboc) peptid se 2 až 35 geneticky kódovatelnými aminokyselinami, obsahující 1 až 5 histidinových zbytků (His), (A2-A20) jsou aminokyselinové zbytky v polohách A2 až A20 A-řetězce lidského inzulínu, zvířecího inzulínu nebo případně inzulínového derivátu pozměněného v jedné nebo více polohách , aR je geneticky kódovatelný aminokyselinový zbytek.
- 12. Způsob podle nároku 11 vyznačující se tím, že ve vzorci II R2 jea) atom vodíku nebob) peptid s 2 až 25 aminokyselinovými zbytky, obsahující aminokyselinový zbytek argininu (Arg) na kárboxylovém konci peptidu,R1 je fenylalaninový zbytek (Phe), (B2-B29) jsou aminokyselinové zbytky v polohách B2 až B29 B-řetězce lidského inzulínu,Y je aminokyselinový zbytek ze skupiny alanin (Ala), threonin,(Thr) nebo serin (Ser),X je aminokyselinový zbytek argininu (Arg), nebo peptid s aminokyselinovou sekvencí C-řetězce lidského inzulínu, • ·* « ·· · · ··· . ( « · ···» ···· » • · · · *.. » · · · ··- 28 (A2-A20) jsou aminokyselinové zbytky v polohách A2 až A20 A-řetězce lidského inzulínu, aR3 je aminokyselinový zbytek ze skupiny asparaginu (Asn), šeřinu (Ser) nebo glycinu (Gly).
- 13. Způsob podle nároku 11 vyznačující se tím, že ve vzorci ΙΓ n2 · ·· ' R jea) atom vodíku nebob) peptid s 2 až . 15 aminokyselinovými zbytky, kde na karboxylovem.konci peptidu se nachází aminokyselinový ' zbytek argininu (Arg),R1 je fenylalaninový zbytek (Phe), (B2-B29) jsou aminokyselinové zbytky v polohách B2 až B29 B-řetězce lidského inzulínu,Y je aminokyselinový zbytek threoninu (Thr),X je aminokyselinový zbytek argininu (Arg), nebo peptid se 2 až 35 aminokyselinovými zbytky, přičemž na začátku a na konci peptidu jsou dva bazické aminokyselinové zbytky,, zvláště arginin (Arg) a/nebo lysin (Lys), (A2-A20) jsou aminokyselinové zbytky v polohách A2 až A20 A-řetězce lidského inzulínu, aR3 je aminokyselinový zbytek asparaginu (Asn) nebo glycinu
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE19735711A DE19735711C2 (de) | 1997-08-18 | 1997-08-18 | Verfahren zur Herstellung eines Vorläufers von Insulin oder Insulinderivaten mit korrekt verbundenen Cystinbrücken |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CZ259898A3 true CZ259898A3 (cs) | 1999-03-17 |
| CZ295679B6 CZ295679B6 (cs) | 2005-09-14 |
Family
ID=7839275
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CZ19982598A CZ295679B6 (cs) | 1997-08-18 | 1998-08-17 | Způsob získávání inzulinu nebo derivátů inzulinu se správně spojenými cysteinovými můstky |
Country Status (20)
| Country | Link |
|---|---|
| US (3) | US5986048A (cs) |
| EP (2) | EP0980874B1 (cs) |
| JP (1) | JP4291900B2 (cs) |
| KR (2) | KR100537842B1 (cs) |
| CN (3) | CN1483831B (cs) |
| AR (1) | AR016821A1 (cs) |
| AT (2) | ATE217636T1 (cs) |
| AU (1) | AU744824B2 (cs) |
| BR (2) | BRPI9816233B8 (cs) |
| CA (1) | CA2245151C (cs) |
| CZ (1) | CZ295679B6 (cs) |
| DE (3) | DE19735711C2 (cs) |
| DK (2) | DK0906918T3 (cs) |
| ES (2) | ES2176870T3 (cs) |
| HU (2) | HU228203B1 (cs) |
| ID (1) | ID20717A (cs) |
| PL (1) | PL191901B1 (cs) |
| PT (2) | PT980874E (cs) |
| RU (2) | RU2205836C2 (cs) |
| TR (1) | TR199801587A2 (cs) |
Families Citing this family (34)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE19735711C2 (de) | 1997-08-18 | 2001-04-26 | Aventis Pharma Gmbh | Verfahren zur Herstellung eines Vorläufers von Insulin oder Insulinderivaten mit korrekt verbundenen Cystinbrücken |
| DE19930676B4 (de) * | 1999-07-02 | 2006-01-19 | Sanofi-Aventis Deutschland Gmbh | Verfahren zur Stabilisierung von Insulin, Insulinderivaten und/oder deren Vorläufer in komplexen Mischungen bei deren Lagerung in wäßrigen Lösungsmitteln |
| AU2151401A (en) | 1999-12-22 | 2001-07-03 | Novo Nordisk A/S | Method for extractive refolding of scrambled single-chain polypeptides |
| US20030212248A1 (en) * | 2000-07-12 | 2003-11-13 | Furman Thomas Charles | Process to increase protein stability |
| DE10235168A1 (de) * | 2002-08-01 | 2004-02-12 | Aventis Pharma Deutschland Gmbh | Verfahren zur Reinigung von Preproinsulin |
| DE102004015965A1 (de) * | 2004-04-01 | 2005-10-20 | Aventis Pharma Gmbh | Verfahren zur Gewinnung von Insulinen durch verbesserte Luftbegasung der Faltung |
| EP1973942B1 (en) | 2005-12-22 | 2011-02-09 | Genentech, Inc. | Recombinant production of heparin binding proteins |
| SG162834A1 (en) | 2006-07-14 | 2010-07-29 | Genentech Inc | Refolding of recombinant proteins |
| KR20110016430A (ko) * | 2007-07-03 | 2011-02-17 | 암젠 인코퍼레이티드 | 봉입체 건량을 이용한 단백질 측정 |
| RU2451750C2 (ru) * | 2007-09-24 | 2012-05-27 | Общество С Ограниченной Ответственностью "Герофарм" | Способ получения рекомбинантного с-пептида проинсулина человека |
| ES2613152T3 (es) | 2008-01-09 | 2017-05-22 | Sanofi-Aventis Deutschland Gmbh | Nuevos derivados de insulina con perfil tiempo/acción extremadamente retardado |
| WO2009133529A2 (en) * | 2008-04-30 | 2009-11-05 | Wockhardt Research Centre | Processes for refolding of insulin |
| CR20170369A (es) | 2008-10-17 | 2017-11-01 | Sanofi Aventis Deutschland | COMBINACIÓN DE UNA INSULINA Y UN AGONISTA DE GLP-1 (Divisional 2011-0188) |
| WO2011058082A1 (de) | 2009-11-13 | 2011-05-19 | Sanofi-Aventis Deutschland Gmbh | Pharmazeutische zusammensetzung umfassend einen glp-1-agonisten und methionin |
| PL2498802T3 (pl) | 2009-11-13 | 2015-06-30 | Sanofi Aventis Deutschland | Kompozycja farmaceutyczna zawierająca agonistę GLP-1, insulinę i metioninę |
| SG187904A1 (en) | 2010-08-30 | 2013-04-30 | Sanofi Aventis Deutschland | Use of ave0010 for the manufacture of a medicament for the treatment of diabetes mellitus type 2 |
| US9821032B2 (en) | 2011-05-13 | 2017-11-21 | Sanofi-Aventis Deutschland Gmbh | Pharmaceutical combination for improving glycemic control as add-on therapy to basal insulin |
| TWI559929B (en) | 2011-09-01 | 2016-12-01 | Sanofi Aventis Deutschland | Pharmaceutical composition for use in the treatment of a neurodegenerative disease |
| US12157766B2 (en) * | 2012-08-05 | 2024-12-03 | Absci Corporation | Cytoplasmic expression system |
| WO2014099577A1 (en) | 2012-12-17 | 2014-06-26 | Merck Sharp & Dohme Corp. | Process for purifying insulin and analogues thereof |
| PE20151409A1 (es) * | 2013-02-26 | 2015-10-07 | Hanmi Pharm Ind Co Ltd | Analogo de insulina novedoso y su uso |
| CN103694339B (zh) * | 2013-12-04 | 2017-10-13 | 珠海联邦制药股份有限公司 | 一种甘精胰岛素前体的复性方法 |
| US10407483B2 (en) | 2014-03-14 | 2019-09-10 | Merck Sharp & Dohme Corp. | Purifying insulin using cation exchange and reverse phase chromatography in the presence of an organic modifier and elevated temperature |
| EP3229828B1 (en) | 2014-12-12 | 2023-04-05 | Sanofi-Aventis Deutschland GmbH | Insulin glargine/lixisenatide fixed ratio formulation |
| TWI748945B (zh) | 2015-03-13 | 2021-12-11 | 德商賽諾菲阿凡提斯德意志有限公司 | 第２型糖尿病病患治療 |
| TW201705975A (zh) | 2015-03-18 | 2017-02-16 | 賽諾菲阿凡提斯德意志有限公司 | 第２型糖尿病病患之治療 |
| CN104911203A (zh) * | 2015-06-30 | 2015-09-16 | 成都易胜科生物科技有限公司 | 一种重组人胰岛素的工业制备方法 |
| EP3344651B1 (en) | 2015-09-02 | 2022-03-02 | Merck Sharp & Dohme Corp. | A process for obtaining insulin with correctly formed disulfide bonds |
| WO2017205309A1 (en) * | 2016-05-25 | 2017-11-30 | Merck Sharp & Dohme Corp. | Insulin receptor partial agonists |
| WO2018018613A1 (zh) | 2016-07-29 | 2018-02-01 | 广东东阳光药业有限公司 | 一种提高抗体纯度的细胞培养基和培养方法 |
| CN113773391B (zh) * | 2020-06-09 | 2023-10-20 | 宁波鲲鹏生物科技有限公司 | 一种门冬胰岛素的制备方法 |
| CN113773400B (zh) * | 2020-06-09 | 2023-08-18 | 宁波鲲鹏生物科技有限公司 | 一种门冬胰岛素衍生物及其应用 |
| CN113773396A (zh) * | 2020-06-10 | 2021-12-10 | 宁波鲲鹏生物科技有限公司 | 一种地特胰岛素衍生物及其应用 |
| JP7749397B2 (ja) * | 2021-09-30 | 2025-10-06 | キヤノン株式会社 | 超音波ファントム及び超音波ファントムの製造方法 |
Family Cites Families (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| NZ199391A (en) * | 1981-01-02 | 1985-12-13 | Genentech Inc | Chimeric polypeptides comprising a proinsulin sequence,and preparation by recombinant dna technique;production of human insulin |
| DE3501641A1 (de) * | 1985-01-19 | 1986-07-24 | Hoechst Ag, 6230 Frankfurt | Verfahren zur gewinnung von insulin-vorlaeufern aus reaktionsgemischen, die bei der faltung von insulin-vorlaeufern aus den entsprechenden s-sulfonaten anfallen |
| GR1005153B (el) * | 1989-08-29 | 2006-03-13 | The General Hospital Corporation | Πρωτεινες συντηξεως, παρασκευη τους και χρηση τους. |
| RU2045535C1 (ru) * | 1991-06-18 | 1995-10-10 | Институт биоорганической химии им.М.М.Шемякина и Ю.А.Овчинникова РАН | Способ получения проинсулина человека |
| ES2097426T3 (es) * | 1992-12-02 | 1997-04-01 | Hoechst Ag | Procedimiento para la obtencion de proinsulina con puentes de cistina correctamente unidos. |
| DE4405179A1 (de) * | 1994-02-18 | 1995-08-24 | Hoechst Ag | Verfahren zur Gewinnung von Insulin mit korrekt verbundenen Cystinbrücken |
| RU2081122C1 (ru) * | 1994-06-16 | 1997-06-10 | Институт биоорганической химии им.М.М.Шемякина и Ю.А.Овчинникова РАН | Способ выделения и очистки инсулина или его биотехнологических предшественников |
| JP4624495B2 (ja) * | 1994-12-29 | 2011-02-02 | フェリング・インターナショナル・センター・エス．・エー． | ヒト・インスリンの生成 |
| DE19735711C2 (de) | 1997-08-18 | 2001-04-26 | Aventis Pharma Gmbh | Verfahren zur Herstellung eines Vorläufers von Insulin oder Insulinderivaten mit korrekt verbundenen Cystinbrücken |
-
1997
- 1997-08-18 DE DE19735711A patent/DE19735711C2/de not_active Expired - Lifetime
-
1998
- 1998-08-11 ES ES98115048T patent/ES2176870T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1998-08-11 ES ES99115386T patent/ES2177178T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1998-08-11 EP EP99115386A patent/EP0980874B1/de not_active Expired - Lifetime
- 1998-08-11 DK DK98115048T patent/DK0906918T3/da active
- 1998-08-11 AT AT98115048T patent/ATE217636T1/de active
- 1998-08-11 DE DE59804121T patent/DE59804121D1/de not_active Expired - Lifetime
- 1998-08-11 PT PT99115386T patent/PT980874E/pt unknown
- 1998-08-11 EP EP98115048A patent/EP0906918B1/de not_active Expired - Lifetime
- 1998-08-11 DE DE59803985T patent/DE59803985D1/de not_active Expired - Lifetime
- 1998-08-11 AT AT99115386T patent/ATE217012T1/de active
- 1998-08-11 DK DK99115386T patent/DK0980874T3/da active
- 1998-08-11 PT PT98115048T patent/PT906918E/pt unknown
- 1998-08-14 ID IDP981136A patent/ID20717A/id unknown
- 1998-08-14 CA CA002245151A patent/CA2245151C/en not_active Expired - Lifetime
- 1998-08-14 AR ARP980104052A patent/AR016821A1/es active IP Right Grant
- 1998-08-17 TR TR1998/01587A patent/TR199801587A2/xx unknown
- 1998-08-17 CZ CZ19982598A patent/CZ295679B6/cs not_active IP Right Cessation
- 1998-08-17 HU HU0600287A patent/HU228203B1/hu unknown
- 1998-08-17 AU AU80763/98A patent/AU744824B2/en not_active Expired
- 1998-08-17 JP JP23036898A patent/JP4291900B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1998-08-17 CN CN031523307A patent/CN1483831B/zh not_active Expired - Lifetime
- 1998-08-17 CN CN98117909A patent/CN1132845C/zh not_active Expired - Lifetime
- 1998-08-17 RU RU98116259/04A patent/RU2205836C2/ru active
- 1998-08-17 BR BRPI9816233A patent/BRPI9816233B8/pt not_active IP Right Cessation
- 1998-08-17 CN CN2006101000625A patent/CN101186940B/zh not_active Expired - Lifetime
- 1998-08-17 BR BR9803755-2A patent/BR9803755A/pt not_active Application Discontinuation
- 1998-08-17 US US09/134,836 patent/US5986048A/en not_active Expired - Lifetime
- 1998-08-17 HU HU9801886A patent/HU228161B1/hu unknown
- 1998-08-18 KR KR1019980033384A patent/KR100537842B1/ko not_active Expired - Lifetime
- 1998-08-18 PL PL328108A patent/PL191901B1/pl unknown
-
1999
- 1999-08-31 US US09/386,303 patent/US6380355B1/en not_active Expired - Lifetime
-
2001
- 2001-09-07 US US09/947,563 patent/US6727346B2/en not_active Expired - Lifetime
-
2002
- 2002-10-07 RU RU2002126598/15A patent/RU2302882C2/ru active
-
2005
- 2005-05-27 KR KR1020050044974A patent/KR100574580B1/ko not_active Expired - Lifetime
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CZ259898A3 (cs) | Způsob získávání prekurzoru insulínu nebo derivátů inzulínu | |
| JP3863579B2 (ja) | 正しく連結されたシスチン架橋を有するインシュリンを得る方法 | |
| US5491216A (en) | Tri-arginine insulins | |
| US20100210815A1 (en) | Insulin production methods and pro-insulin constructs | |
| FI79860B (fi) | Foerfarande foer framstaellning av humaninsulin des-pheb1-humaninsulin eller derivat daerav ur svininsulin, des-pheb1-svininsulin eller derivat daerav. | |
| DK172242B1 (da) | Fremgangsmåde til fremstilling af insulinderivater | |
| EP2838915B1 (en) | Solid phase peptide synthesis of insulin using side chain anchored lysine | |
| US7659363B2 (en) | Process for the preparation of insulin or an insulin derivative in the presence of oxygen | |
| MXPA98006666A (en) | Improved procedure for the obtaining of insulin precursors with cistina bridges correctly uni | |
| HK1119449B (en) | Process for obtaining insulin or insulin derivatives having correctly bonded cystine bridges | |
| Davies et al. | Insulin Semisynthesis | |
| HK1010457B (en) | Process to obtain insulin with correct cystin bridges |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PD00 | Pending as of 2000-06-30 in czech republic | ||
| MK4A | Patent expired |
Effective date: 20180817 |