PL191901B1 - Sposób wytwarzania prekursorów insuliny i pochodnych insuliny - Google Patents
Sposób wytwarzania prekursorów insuliny i pochodnych insulinyInfo
- Publication number
- PL191901B1 PL191901B1 PL328108A PL32810898A PL191901B1 PL 191901 B1 PL191901 B1 PL 191901B1 PL 328108 A PL328108 A PL 328108A PL 32810898 A PL32810898 A PL 32810898A PL 191901 B1 PL191901 B1 PL 191901B1
- Authority
- PL
- Poland
- Prior art keywords
- amino acid
- cysteine
- insulin
- arg
- residue
- Prior art date
Links
- NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N insulin Chemical compound N1C(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(NC(=O)CN)C(C)CC)CSSCC(C(NC(CO)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CSSCC(NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2NC=NC=2)NC(=O)C(CO)NC(=O)CNC2=O)C(=O)NCC(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)NC(C(C)O)C(=O)N3C(CCC3)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C)C(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(O)=O)=O)NC(=O)C(C(C)CC)NC(=O)C(CO)NC(=O)C(C(C)O)NC(=O)C1CSSCC2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)CC1=CN=CN1 NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 title claims abstract description 123
- 102000004877 Insulin Human genes 0.000 title claims abstract description 47
- 108090001061 Insulin Proteins 0.000 title claims abstract description 47
- 229940125396 insulin Drugs 0.000 title claims abstract description 44
- 239000002243 precursor Substances 0.000 title claims abstract description 39
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 47
- XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N L-Cysteine Chemical compound SC[C@H](N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N 0.000 claims abstract description 40
- QIJRTFXNRTXDIP-UHFFFAOYSA-N (1-carboxy-2-sulfanylethyl)azanium;chloride;hydrate Chemical compound O.Cl.SCC(N)C(O)=O QIJRTFXNRTXDIP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 34
- 229960001305 cysteine hydrochloride Drugs 0.000 claims abstract description 34
- 229960002433 cysteine Drugs 0.000 claims abstract description 33
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 claims abstract description 33
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 33
- 230000003196 chaotropic effect Effects 0.000 claims abstract description 31
- 239000004026 insulin derivative Substances 0.000 claims abstract description 27
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims abstract description 26
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 claims abstract description 25
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 16
- 125000000151 cysteine group Chemical group N[C@@H](CS)C(=O)* 0.000 claims abstract description 11
- 239000000725 suspension Substances 0.000 claims abstract description 8
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims abstract description 7
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims abstract description 7
- 239000007900 aqueous suspension Substances 0.000 claims abstract description 5
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 claims description 68
- PBGKTOXHQIOBKM-FHFVDXKLSA-N insulin (human) Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H]1CSSC[C@H]2C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@H](C(N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)N[C@@H](CSSC[C@H](NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=3C=CC(O)=CC=3)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=3NC=NC=3)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)CNC1=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O)=O)CSSC[C@@H](C(N2)=O)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CN)[C@@H](C)CC)[C@@H](C)CC)[C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)C1=CN=CN1 PBGKTOXHQIOBKM-FHFVDXKLSA-N 0.000 claims description 35
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 35
- 101000976075 Homo sapiens Insulin Proteins 0.000 claims description 34
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 30
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 28
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 21
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims description 21
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 claims description 19
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 claims description 19
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 claims description 18
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N L-phenylalanine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 claims description 18
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 18
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 16
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 claims description 12
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 claims description 11
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 claims description 8
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 claims description 8
- 101500025353 Homo sapiens Insulin A chain Proteins 0.000 claims description 7
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 claims description 7
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 claims description 7
- 238000010790 dilution Methods 0.000 claims description 7
- 239000012895 dilution Substances 0.000 claims description 7
- 125000000637 arginyl group Chemical group N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)* 0.000 claims description 6
- 125000004435 hydrogen atom Chemical class [H]* 0.000 claims description 6
- 229960000789 guanidine hydrochloride Drugs 0.000 claims description 5
- PJJJBBJSCAKJQF-UHFFFAOYSA-N guanidinium chloride Chemical compound [Cl-].NC(N)=[NH2+] PJJJBBJSCAKJQF-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N phenylalanine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N Asparagine Natural products OC(=O)C(N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 claims description 4
- ZRALSGWEFCBTJO-UHFFFAOYSA-N Guanidine Chemical compound NC(N)=N ZRALSGWEFCBTJO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 235000009582 asparagine Nutrition 0.000 claims description 4
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 claims description 4
- 102000003746 Insulin Receptor Human genes 0.000 claims description 3
- 108010001127 Insulin Receptor Proteins 0.000 claims description 3
- 101500021084 Locusta migratoria 5 kDa peptide Proteins 0.000 claims description 3
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 claims description 3
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 claims description 3
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 claims description 3
- 125000000341 threoninyl group Chemical group [H]OC([H])(C([H])([H])[H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 claims description 3
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 claims description 2
- CHJJGSNFBQVOTG-UHFFFAOYSA-N N-methyl-guanidine Natural products CNC(N)=N CHJJGSNFBQVOTG-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 claims description 2
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 claims description 2
- SWSQBOPZIKWTGO-UHFFFAOYSA-N dimethylaminoamidine Natural products CN(C)C(N)=N SWSQBOPZIKWTGO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 229960004198 guanidine Drugs 0.000 claims description 2
- 125000000487 histidyl group Chemical group [H]N([H])C(C(=O)O*)C([H])([H])C1=C([H])N([H])C([H])=N1 0.000 claims description 2
- 108010076181 Proinsulin Proteins 0.000 description 32
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 26
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 25
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 25
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 22
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 22
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 22
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 18
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 15
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 13
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 12
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 11
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 11
- 235000013351 cheese Nutrition 0.000 description 10
- 210000003000 inclusion body Anatomy 0.000 description 10
- 101500025354 Homo sapiens Insulin B chain Proteins 0.000 description 8
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 8
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 8
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 7
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 7
- 108010049041 glutamylalanine Proteins 0.000 description 7
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 7
- DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N Trifluoroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(F)(F)F DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- CDKZJGMPZHPAJC-ULQDDVLXSA-N Tyr-Leu-Val Chemical compound CC(C)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 CDKZJGMPZHPAJC-ULQDDVLXSA-N 0.000 description 6
- 108010068380 arginylarginine Proteins 0.000 description 6
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 6
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 6
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 5
- CCDFBRZVTDDJNM-GUBZILKMSA-N Ala-Leu-Glu Chemical compound [H]N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O CCDFBRZVTDDJNM-GUBZILKMSA-N 0.000 description 5
- 108090000087 Carboxypeptidase B Proteins 0.000 description 5
- 102000003670 Carboxypeptidase B Human genes 0.000 description 5
- COVXELOAORHTND-LSJOCFKGSA-N Gly-Ile-Val Chemical compound NCC(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O COVXELOAORHTND-LSJOCFKGSA-N 0.000 description 5
- IASQBRJGRVXNJI-YUMQZZPRSA-N Leu-Cys-Gly Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)NCC(O)=O IASQBRJGRVXNJI-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 5
- YVKSMSDXKMSIRX-GUBZILKMSA-N Leu-Glu-Asn Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O YVKSMSDXKMSIRX-GUBZILKMSA-N 0.000 description 5
- 239000003463 adsorbent Substances 0.000 description 5
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 5
- 238000011097 chromatography purification Methods 0.000 description 5
- 108010016616 cysteinylglycine Proteins 0.000 description 5
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 5
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 5
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 5
- WTXCNOPZMQRTNN-BWBBJGPYSA-N Cys-Thr-Ser Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CS)N)O WTXCNOPZMQRTNN-BWBBJGPYSA-N 0.000 description 4
- NLKVNZUFDPWPNL-YUMQZZPRSA-N Glu-Arg-Gly Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(O)=O NLKVNZUFDPWPNL-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 4
- JBCLFWXMTIKCCB-UHFFFAOYSA-N H-Gly-Phe-OH Natural products NCC(=O)NC(C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 JBCLFWXMTIKCCB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- AIMGJYMCTAABEN-GVXVVHGQSA-N Leu-Val-Glu Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O AIMGJYMCTAABEN-GVXVVHGQSA-N 0.000 description 4
- GOUWCZRDTWTODO-YDHLFZDLSA-N Phe-Val-Asn Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O GOUWCZRDTWTODO-YDHLFZDLSA-N 0.000 description 4
- AOIZTZRWMSPPAY-KAOXEZKKSA-N Tyr-Thr-Pro Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)N1CCC[C@@H]1C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC2=CC=C(C=C2)O)N)O AOIZTZRWMSPPAY-KAOXEZKKSA-N 0.000 description 4
- 238000004440 column chromatography Methods 0.000 description 4
- VPZXBVLAVMBEQI-UHFFFAOYSA-N glycyl-DL-alpha-alanine Natural products OC(=O)C(C)NC(=O)CN VPZXBVLAVMBEQI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108010081551 glycylphenylalanine Proteins 0.000 description 4
- 238000000265 homogenisation Methods 0.000 description 4
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 4
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 4
- 230000001810 trypsinlike Effects 0.000 description 4
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- OMLWNBVRVJYMBQ-YUMQZZPRSA-N Arg-Arg Chemical group NC(N)=NCCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(O)=O OMLWNBVRVJYMBQ-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 3
- UXJCMQFPDWCHKX-DCAQKATOSA-N Arg-Arg-Glu Chemical compound NC(N)=NCCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O UXJCMQFPDWCHKX-DCAQKATOSA-N 0.000 description 3
- HPKSHFSEXICTLI-CIUDSAMLSA-N Arg-Glu-Ala Chemical compound [H]N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O HPKSHFSEXICTLI-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 3
- HAVKMRGWNXMCDR-STQMWFEESA-N Arg-Gly-Phe Chemical compound [H]N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(O)=O HAVKMRGWNXMCDR-STQMWFEESA-N 0.000 description 3
- KOHBWQDSVCARMI-BWBBJGPYSA-N Cys-Cys-Thr Chemical compound [H]N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O KOHBWQDSVCARMI-BWBBJGPYSA-N 0.000 description 3
- GCDLPNRHPWBKJJ-WDSKDSINSA-N Cys-Gly-Glu Chemical compound [H]N[C@@H](CS)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O GCDLPNRHPWBKJJ-WDSKDSINSA-N 0.000 description 3
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 3
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 3
- XMVLTPMCUJTJQP-FXQIFTODSA-N Glu-Gln-Cys Chemical compound C(CC(=O)O)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCC(=O)N)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)O)N XMVLTPMCUJTJQP-FXQIFTODSA-N 0.000 description 3
- BUEFQXUHTUZXHR-LURJTMIESA-N Gly-Gly-Pro zwitterion Chemical compound NCC(=O)NCC(=O)N1CCC[C@H]1C(O)=O BUEFQXUHTUZXHR-LURJTMIESA-N 0.000 description 3
- DURWCDDDAWVPOP-JBDRJPRFSA-N Ile-Cys-Ser Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)O)N DURWCDDDAWVPOP-JBDRJPRFSA-N 0.000 description 3
- CQGSYZCULZMEDE-UHFFFAOYSA-N Leu-Gln-Pro Natural products CC(C)CC(N)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)N1CCCC1C(O)=O CQGSYZCULZMEDE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- VHTIZYYHIUHMCA-JYJNAYRXSA-N Leu-Tyr-Gln Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(O)=O VHTIZYYHIUHMCA-JYJNAYRXSA-N 0.000 description 3
- NPBGTPKLVJEOBE-IUCAKERBSA-N Lys-Arg Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCNC(N)=N NPBGTPKLVJEOBE-IUCAKERBSA-N 0.000 description 3
- LSDPWZHWYPCBBB-UHFFFAOYSA-N Methanethiol Chemical compound SC LSDPWZHWYPCBBB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- YBAFDPFAUTYYRW-UHFFFAOYSA-N N-L-alpha-glutamyl-L-leucine Natural products CC(C)CC(C(O)=O)NC(=O)C(N)CCC(O)=O YBAFDPFAUTYYRW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108010079364 N-glycylalanine Proteins 0.000 description 3
- DLPXTCTVNDTYGJ-JBDRJPRFSA-N Ser-Ile-Cys Chemical compound OC[C@H](N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CS)C(O)=O DLPXTCTVNDTYGJ-JBDRJPRFSA-N 0.000 description 3
- JWOBLHJRDADHLN-KKUMJFAQSA-N Ser-Leu-Tyr Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(O)=O JWOBLHJRDADHLN-KKUMJFAQSA-N 0.000 description 3
- XBWKCYFGRXKWGO-SRVKXCTJSA-N Tyr-Cys-Asn Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O XBWKCYFGRXKWGO-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 3
- ROLGIBMFNMZANA-GVXVVHGQSA-N Val-Glu-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCC(=O)O)NC(=O)[C@H](C(C)C)N ROLGIBMFNMZANA-GVXVVHGQSA-N 0.000 description 3
- IOUPEELXVYPCPG-UHFFFAOYSA-N Valylglycine Chemical compound CC(C)C(N)C(=O)NCC(O)=O IOUPEELXVYPCPG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108010024078 alanyl-glycyl-serine Proteins 0.000 description 3
- ZVDPYSVOZFINEE-BQBZGAKWSA-N alpha-Asp-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O ZVDPYSVOZFINEE-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 3
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 3
- 108010004073 cysteinylcysteine Proteins 0.000 description 3
- FSXRLASFHBWESK-UHFFFAOYSA-N dipeptide phenylalanyl-tyrosine Natural products C=1C=C(O)C=CC=1CC(C(O)=O)NC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 FSXRLASFHBWESK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 3
- 108010057083 glutamyl-aspartyl-leucine Proteins 0.000 description 3
- 108010038088 glutamyl-glycyl-seryl-leucyl-glutamine Proteins 0.000 description 3
- 108010051307 glycyl-glycyl-proline Proteins 0.000 description 3
- 108010050848 glycylleucine Proteins 0.000 description 3
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 description 3
- 108010073093 leucyl-glycyl-glycyl-glycine Proteins 0.000 description 3
- 108010048818 seryl-histidine Proteins 0.000 description 3
- XWTNPSHCJMZAHQ-QMMMGPOBSA-N 2-[[2-[[2-[[(2s)-2-amino-4-methylpentanoyl]amino]acetyl]amino]acetyl]amino]acetic acid Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)NCC(=O)NCC(=O)NCC(O)=O XWTNPSHCJMZAHQ-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 2
- KUFVXLQLDHJVOG-SHGPDSBTSA-N Ala-Thr-Thr Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)O)NC(=O)[C@H](C)N)O KUFVXLQLDHJVOG-SHGPDSBTSA-N 0.000 description 2
- XTMZYFMTYJNABC-ZLUOBGJFSA-N Asn-Ser-Ala Chemical compound C[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC(=O)N)N XTMZYFMTYJNABC-ZLUOBGJFSA-N 0.000 description 2
- XTHUKRLJRUVVBF-WHFBIAKZSA-N Cys-Gly-Ser Chemical compound SC[C@H](N)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O XTHUKRLJRUVVBF-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 2
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- IWUFOVSLWADEJC-AVGNSLFASA-N Gln-His-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC1=CNC=N1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O IWUFOVSLWADEJC-AVGNSLFASA-N 0.000 description 2
- GURIQZQSTBBHRV-SRVKXCTJSA-N Gln-Lys-Arg Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O GURIQZQSTBBHRV-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 2
- XQDGOJPVMSWZSO-SRVKXCTJSA-N Gln-Pro-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@@H]1CCCN1C(=O)[C@H](CCC(=O)N)N XQDGOJPVMSWZSO-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 2
- BBFCMGBMYIAGRS-AUTRQRHGSA-N Gln-Val-Glu Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O BBFCMGBMYIAGRS-AUTRQRHGSA-N 0.000 description 2
- QGWXAMDECCKGRU-XVKPBYJWSA-N Gln-Val-Gly Chemical compound CC(C)[C@H](NC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O)C(=O)NCC(O)=O QGWXAMDECCKGRU-XVKPBYJWSA-N 0.000 description 2
- ITYRYNUZHPNCIK-GUBZILKMSA-N Glu-Ala-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O ITYRYNUZHPNCIK-GUBZILKMSA-N 0.000 description 2
- ZJICFHQSPWFBKP-AVGNSLFASA-N Glu-Asn-Tyr Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(O)=O ZJICFHQSPWFBKP-AVGNSLFASA-N 0.000 description 2
- JVSBYEDSSRZQGV-GUBZILKMSA-N Glu-Asp-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O JVSBYEDSSRZQGV-GUBZILKMSA-N 0.000 description 2
- FUESBOMYALLFNI-VKHMYHEASA-N Gly-Asn Chemical compound NCC(=O)N[C@H](C(O)=O)CC(N)=O FUESBOMYALLFNI-VKHMYHEASA-N 0.000 description 2
- WNGHUXFWEWTKAO-YUMQZZPRSA-N Gly-Ser-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)CN WNGHUXFWEWTKAO-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 2
- TWROVBNEHJSXDG-IHRRRGAJSA-N His-Leu-Val Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CNC=N1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O TWROVBNEHJSXDG-IHRRRGAJSA-N 0.000 description 2
- TVHCDSBMFQYPNA-RHYQMDGZSA-N Lys-Thr-Arg Chemical compound [H]N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O TVHCDSBMFQYPNA-RHYQMDGZSA-N 0.000 description 2
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 2
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 2
- CLNJSLSHKJECME-BQBZGAKWSA-N Pro-Gly-Ala Chemical compound OC(=O)[C@H](C)NC(=O)CNC(=O)[C@@H]1CCCN1 CLNJSLSHKJECME-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 2
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 2
- PURRNJBBXDDWLX-ZDLURKLDSA-N Ser-Thr-Gly Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)NCC(=O)O)NC(=O)[C@H](CO)N)O PURRNJBBXDDWLX-ZDLURKLDSA-N 0.000 description 2
- DSGIVWSDDRDJIO-ZXXMMSQZSA-N Thr-Thr Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O DSGIVWSDDRDJIO-ZXXMMSQZSA-N 0.000 description 2
- WITCOKQIPFWQQD-FSPLSTOPSA-N Val-Asn Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC(N)=O WITCOKQIPFWQQD-FSPLSTOPSA-N 0.000 description 2
- UPJONISHZRADBH-XPUUQOCRSA-N Val-Glu Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCC(O)=O UPJONISHZRADBH-XPUUQOCRSA-N 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 2
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 2
- -1 cyanogen halide Chemical class 0.000 description 2
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 2
- 229940071106 ethylenediaminetetraacetate Drugs 0.000 description 2
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 2
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 2
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 2
- 108010005636 polypeptide C Proteins 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- FDKWRPBBCBCIGA-REOHCLBHSA-N (2r)-2-azaniumyl-3-$l^{1}-selanylpropanoate Chemical compound [Se]C[C@H](N)C(O)=O FDKWRPBBCBCIGA-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- BMLMGCPTLHPWPY-REOHCLBHSA-N (4R)-2-oxo-4-thiazolidinecarboxylic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H]1CSC(=O)N1 BMLMGCPTLHPWPY-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- SLQQPJBDBVPVQV-JYJNAYRXSA-N Arg-Phe-Val Chemical compound [H]N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O SLQQPJBDBVPVQV-JYJNAYRXSA-N 0.000 description 1
- SJPZTWAYTJPPBI-GUBZILKMSA-N Asn-Gln-His Chemical compound C1=C(NC=N1)C[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCC(=O)N)NC(=O)[C@H](CC(=O)N)N SJPZTWAYTJPPBI-GUBZILKMSA-N 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- 101001011741 Bos taurus Insulin Proteins 0.000 description 1
- FDKWRPBBCBCIGA-UWTATZPHSA-N D-Selenocysteine Natural products [Se]C[C@@H](N)C(O)=O FDKWRPBBCBCIGA-UWTATZPHSA-N 0.000 description 1
- KMTRUDSVKNLOMY-UHFFFAOYSA-N Ethylene carbonate Chemical compound O=C1OCCO1 KMTRUDSVKNLOMY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000018389 Exopeptidases Human genes 0.000 description 1
- 108010091443 Exopeptidases Proteins 0.000 description 1
- 101000976092 Gallus gallus Insulin Proteins 0.000 description 1
- 101710186643 Insulin-2 Proteins 0.000 description 1
- HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N L-histidine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- LHSGPCFBGJHPCY-UHFFFAOYSA-N L-leucine-L-tyrosine Natural products CC(C)CC(N)C(=O)NC(C(O)=O)CC1=CC=C(O)C=C1 LHSGPCFBGJHPCY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000000510 L-tryptophano group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C2N([H])C([H])=C(C([H])([H])[C@@]([H])(C(O[H])=O)N([H])[*])C2=C1[H] 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
- FQZPTCNSNPWHLJ-AVGNSLFASA-N Leu-Gln-Lys Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(O)=O FQZPTCNSNPWHLJ-AVGNSLFASA-N 0.000 description 1
- TUIOUEWKFFVNLH-DCAQKATOSA-N Leu-Val-Cys Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CS)C(O)=O TUIOUEWKFFVNLH-DCAQKATOSA-N 0.000 description 1
- 101100205180 Neurospora crassa (strain ATCC 24698 / 74-OR23-1A / CBS 708.71 / DSM 1257 / FGSC 987) leu-6 gene Proteins 0.000 description 1
- 108010005991 Pork Regular Insulin Proteins 0.000 description 1
- CICQXRWZNVXFCU-SRVKXCTJSA-N Ser-His-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC1=CNC=N1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O CICQXRWZNVXFCU-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- 241001655322 Streptomycetales Species 0.000 description 1
- NINIDFKCEFEMDL-UHFFFAOYSA-N Sulfur Chemical group [S] NINIDFKCEFEMDL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ZMZDMBWJUHKJPS-UHFFFAOYSA-M Thiocyanate anion Chemical compound [S-]C#N ZMZDMBWJUHKJPS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 1
- FQNUWOHNGJWNLM-QWRGUYRKSA-N Tyr-Cys-Gly Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)NCC(O)=O FQNUWOHNGJWNLM-QWRGUYRKSA-N 0.000 description 1
- XGJLNBNZNMVJRS-NRPADANISA-N Val-Glu-Ala Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O XGJLNBNZNMVJRS-NRPADANISA-N 0.000 description 1
- 108010005233 alanylglutamic acid Proteins 0.000 description 1
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 238000011033 desalting Methods 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 1
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 description 1
- 125000002228 disulfide group Chemical group 0.000 description 1
- VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N dithiothreitol Chemical compound SC[C@@H](O)[C@H](O)CS VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N 0.000 description 1
- 230000002349 favourable effect Effects 0.000 description 1
- 239000012467 final product Substances 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 101150089730 gly-10 gene Proteins 0.000 description 1
- JMANVNJQNLATNU-UHFFFAOYSA-N glycolonitrile Natural products N#CC#N JMANVNJQNLATNU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010010147 glycylglutamine Proteins 0.000 description 1
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010025306 histidylleucine Proteins 0.000 description 1
- ZMZDMBWJUHKJPS-UHFFFAOYSA-N hydrogen thiocyanate Natural products SC#N ZMZDMBWJUHKJPS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010012058 leucyltyrosine Proteins 0.000 description 1
- 108010054155 lysyllysine Chemical group 0.000 description 1
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 1
- 125000000962 organic group Chemical group 0.000 description 1
- 210000000496 pancreas Anatomy 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 108010029020 prolylglycine Proteins 0.000 description 1
- 108010090894 prolylleucine Proteins 0.000 description 1
- 238000000164 protein isolation Methods 0.000 description 1
- 230000007026 protein scission Effects 0.000 description 1
- 230000035484 reaction time Effects 0.000 description 1
- ZKZBPNGNEQAJSX-UHFFFAOYSA-N selenocysteine Natural products [SeH]CC(N)C(O)=O ZKZBPNGNEQAJSX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000016491 selenocysteine Nutrition 0.000 description 1
- 229940055619 selenocysteine Drugs 0.000 description 1
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 125000003396 thiol group Chemical class [H]S* 0.000 description 1
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
- C07K1/12—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length by hydrolysis, i.e. solvolysis in general
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/575—Hormones
- C07K14/62—Insulins
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
- A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
- A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P5/00—Drugs for disorders of the endocrine system
- A61P5/48—Drugs for disorders of the endocrine system of the pancreatic hormones
- A61P5/50—Drugs for disorders of the endocrine system of the pancreatic hormones for increasing or potentiating the activity of insulin
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
- C07K1/02—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length in solution
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
- C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Diabetes (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Endocrinology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Hematology (AREA)
- Emergency Medicine (AREA)
- Obesity (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)
Abstract
1. Sposób wytwarzania prekursorów insuliny i pochodnych insuliny o prawidlowo zwiazanych mostkach disiarczkowych, w obecnosci cysteiny lub chlorowodorku cysteiny i chaotropowej sub- stancji pomocniczej, znamienny tym, ze przeprowadza sie kolejno nastepujace etapy: (a) do wodnej zawiesiny prekursora insuliny lub pochodnej insuliny dodaje sie taka ilosc cy- steiny lub chlorowodorku cysteiny, ze 1-15 grup SH cysteiny lub chlorowodorku cysteiny przypada na jedna grupe cysteinowa prekursora, (b) do 4-9 molowego roztworu chaotropowej substancji pomocniczej o pH 8-11,5 w tempera- turze 15-55°C wprowadza sie zawiesine prekursora zawierajaca cysteine lub chlorowodorek cyste- iny i utrzymuje sie uzyskana mieszanine przez 10-60 minut w tej temperaturze, po czym (c) wprowadza sie te mieszanine o pH 8-11,5 w temperaturze 5-30°C do takiej ilosci wody, któ- ra powoduje rozcienczenie cysteiny lub chlorowodorku cysteiny w mieszaninie do stezenia 1-5 mM i chaotropowej substancji pomocniczej do stezenia 0,2-1,0 M. PL PL PL
Description
Opis wynalazku
Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania prekursorów insuliny i pochodnych insuliny o prawidłowo związanych mostkach disiarczkowych, w obecności cysteiny lub chlorowodorku cysteiny i chaotropowej substancji pomocniczej.
Ludzka insulina jest białkiem o dwóch łańcuchach aminokwasowych mających łącznie 51 reszt aminokwasowych. W obu łańcuchach aminokwasowych występuje 6 grup cysteinowych, przy czym dwie grupy cysteinowe są ze sobą związane poprzez mostek disiarczkowy. W biologicznie aktywnej insulinie ludzkiej łańcuchy A i B są ze sobą związane dwoma mostkami disiarczkowymi, a inny mostek disiarczkowy występuje w łańcuchu A. Ze statystycznego punktu widzenia w cząsteczce insuliny ludzkiej jest 15 różnych możliwości utworzenia mostków disiarczkowych. W biologicznie czynnej insulinie ludzkiej występuje tylko jedna z 15 możliwości. W ludzkiej insulinie są ze sobą połączone następujące grupy cysteinowe: A6-A11; A7-B7; A20-B19.
Duże litery A iB oznaczają łańcuchy aminokwasowe insuliny, a liczba oznacza pozycję reszty aminokwasu, liczoną w każdym łańcuchu aminokwasowym od końca aminowego do końca karboksylowego. Mostki disiarczkowe mogą również powstawać pomiędzy dwiema cząsteczkami ludzkiej insuliny, tak więc mostków disiarczkowych może powstać niezmiernie dużo.
Znany sposób wytwarzania insuliny ludzkiej polega na zastosowaniu ludzkiej proinsuliny. Ludzka proinsulina jest białkiem o liniowym łańcuchu aminokwasowym składającym się z 86 reszt aminokwasów, przy czym łańcuchy B i A insuliny ludzkiej są ze sobą połączone poprzez ugrupowanie peptydu C o 35 resztach aminokwasów. Mostki disiarczkowe występujące w insulinie ludzkiej tworzy się poprzez produkt pośredni, przy czym grupę cysteinową insuliny ludzkiej zabezpiecza się grupą zabezpieczającą siarkę, np. jako S-sulfonian (-S-SO3) (EP0 037 255). Znany jest również sposób wytwarzania proinsuliny o prawidłowo związanych mostkach disiarczkowych (Biochemistry, 60, (1968), str. 622-629), w którym jako substancję wyjściową stosuje się proinsulinę uzyskaną ze świńskiej trzustki, w której grupa cysteinowa istnieje w postaci grupy tiolowej (-SH). Pod pojęciem „prawidłowo związane mostki disiarczkowe” rozumie się mostki disiarczkowe występujące w biologicznie aktywnej insulinie ssaków.
Inżynieria genetyczna umożliwia wytwarzanie przez mikroorganizmy prekursorów insuliny lub pochodnych insuliny, mających odmienną od ludzkiej insuliny sekwencję aminokwasów i/lub odmienną długość łańcucha aminokwasów. Proinsulina wytwarzana przez genetycznie zmienione komórki Escherichia coli nie ma prawidłowo związanych mostków disiarczkowych. Proces wytwarzania ludzkiej insuliny za pomocą E. coli (EP 0055 945) obejmuje następujące etapy: fermentacja z użyciem mikroorganizmów - roztwarzanie komórek -wyodrębnienie białka fuzyjnego - rozszczepienie białka fuzyjnego z użyciem chlorowcocyjanu - wyodrębnienie produktów rozszczepienia o sekwencji proinsuliny zabezpieczenie grup cysteinowych grupami S-sulfonianowymi - chromatograficzne oczyszczenie S-sulfonianów -utworzenie prawidłowo związanych mostków disiarczkowych -odsalanie proinsuliny chromatograficzne oczyszczenie proinsuliny o prawidłowo związanych mostkach disiarczkowych zatężenie roztworu proinsuliny - chromatograficzne oczyszczenie stężonego roztworu proinsuliny enzymatyczne rozszczepienie proinsuliny w celu uzyskania insuliny ludzkiej - chromatograficzne oczyszczenie powstałej insuliny ludzkiej.
Wadą tego procesu jest duża liczba etapów i straty w etapach oczyszczania, toteż otrzymuje się insulinę z niewielką wydajnością. Ze względu na wieloetapowość procesu trzeba pogodzić się ze znacznymi stratami. Od etapu wyodrębniania białka fuzyjnego, poprzez rozszczepienie z użyciem chlorowcocyjanu, siarczynolizę i oczyszczanie proinsuliny należy się liczyć z 40% stratą proinsuliny (EP 0055 945). Podobnie wysokie straty mogą wystąpić w następnych etapach oczyszczania, aż do otrzymania produktu końcowego.
Zwiększenie wydajności procesu wytwarzania insuliny ludzkiej lub pochodnych insuliny metodą inżynierii genetycznej można osiągnąć przy znacznym zmniejszeniu liczby niezbędnych etapów procesu.
Z opisów patentowych EP 0600 372 A1(lub US 5 473 049) i EP 0668 292 A2 znany jest ulepszony sposób wytwarzania insuliny lub pochodnych insuliny, w którym prekursor insuliny lub pochodnej insuliny o nieprawidłowo związanych mostkach disiarczkowych przeprowadza się w obecności merkaptanu, np. cysteiny i co najmniej jednej substancji chaotropowej, np. mocznika lub chlorowodorku guanidyny, w prekursor insuliny lub w prekursor pochodnej insuliny o prawidłowo związanych mostkach disiarczkowych. W tym znanym sposobie białka te najpierw rozpuszcza się w wodnym roztworze chaotroPL 191 901 B1 powej substancji pomocniczej lub w mieszaninie różnych chaotropowych substancji pomocniczych o bardzo niskim stężeniu. Następnie miesza się mieszaninę białek z wodnym roztworem merkaptanu.
Obecnie nieoczekiwanie stwierdzono, że wydajność prekursorów insuliny lub pochodnych insuliny o prawidłowym sfałdowaniu zwiększa się, a czas reakcji do zajścia procesu fałdowania zmniejsza się, gdy w pierwszym etapie prekursora nie rozpuszcza się z udziałem substancji chaotropowej, lecz najpierw do wodnej zawiesiny prekursora wprowadza się merkaptan, a mianowicie cysteinę lub chlorowodorek cysteiny, a dopiero w następnym etapie roztwór prekursora wprowadza się do wodnego roztworu chaotropowej substancji pomocniczej, po czym doprowadza się do prawidłowego sfałdowania prekursora poprzez rozcieńczenie mieszaniny do uzyskania korzystnego stężenia cysteiny lub chlorowodorku cysteiny, poprzez wprowadzenie tej mieszaniny do odpowiedniej ilości wody.
Tak więc przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania prekursorów insuliny i pochodnych insuliny o prawidłowo związanych mostkach disiarczkowych, w obecności cysteiny lub chlorowodorku cysteiny i chaotropowej substancji pomocniczej, polegający na tym, że przeprowadza się kolejno następujące etapy:
(a) do wodnej zawiesiny prekursora insuliny lub pochodnej insuliny dodaje się taką ilość cysteiny lub chlorowodorku cysteiny, że 1-15 grup SH cysteiny lub chlorowodorku cysteiny przypada na jedną grupę cysteinową prekursora, (b) do 4-9 molowego roztworu chaotropowej substancji pomocniczej o pH 8-11,5 w temperaturze 15-55°C wprowadza się zawiesinę prekursora zawierającą cysteinę lub chlorowodorek cysteiny i utrzymuje się uzyskaną mieszaninę przez 10-60 minut w tej temperaturze, po czym (c) wprowadza się tę mieszaninę o pH 8-11,5 w temperaturze 5-30°C do takiej ilości wody, która powoduje rozcieńczenie cysteiny lub chlorowodorku cysteiny w mieszaninie do stężenia 1-5 mM i chaotropowej substancji pomocniczej do stężenia 0,2-1,0 M.
Korzystny jest sposób polegający na tym, że w etapie (a) stosuje się taką ilość cysteiny lub chlorowodorku cysteiny, że 1-6 grup SH cysteiny lub chlorowodorku cysteiny przypada na jedną grupę cysteinową prekursora, w etapie (b) do 4-9 molowego roztworu chaotropowej substancji pomocniczej o pH 8-11 w temperaturze 30-45°C wprowadza się zawiesinę prekursora zawierającą cysteinę lub chlorowodorek cysteiny i utrzymuje się uzyskaną mieszaninę przez 20-40 minut w tej temperaturze, a w etapie (c) wprowadza się tę mieszaninę o pH 8-11 w temperaturze 15-20°C do takiej ilości wody, która powoduje rozcieńczenie cysteiny lub chlorowodorku cysteiny w mieszaninie do stężenia 1-5 mM i chaotropowej substancji pomocniczej do stężenia 0,2-1,0 M.
Chaotropowe substancje pomocnicze są związkami rozrywającymi w roztworach wodnych wiązania wodorowe, takimi jak siarczan amonu, chlorowodorek guanidyny, węglan etylenu, tiocyjanian, dlmetylosulfotlenek i mocznik.
W sposobie według wynalazku jako chaotropową substancję pomocniczą korzystnie stosuje się guanidynę, chlorowodorek guanidyny lub szczególnie korzystnie mocznik.
Stężenie chaotropowej substancji pomocniczej w etapie (b) sposobu według wynalazku wynosi korzystnie 7,0-9 M, temperatura w etapie (b) korzystnie wynosi 40°C, a wartość pH w tym etapie korzystnie wynosi 10-11.
W etapie (c) według wynalazku wartość pH wynosi korzystnie 10-11, a ilość wody, do której wprowadza się mieszaninę jest korzystnie tak dobrana, że uzyskuje się rozcieńczenie cysteiny lub chlorowodorku cysteiny w mieszaninie do stężenia 2,5-3 mM i chaotropowej substancji pomocniczej do stężenia 0,5 M.
Szczególnie korzystny jest sposób według wynalazku, w którym stężenie chaotropowej substancji pomocniczej w etapie (b) wynosi 8 M, temperatura w etapie (b) wynosi 40°C, wartość pH w etapie (b) wynosi 10,6, wartość pH w etapie (c) wynosi 10,6, a ilość wody w etapie (c) jest taka, że uzyskuje się rozcieńczenie cysteiny lub chlorowodorku cysteiny w mieszaninie do stężenia 2,5-3 mM i chaotropowej substancji pomocniczej do stężenia 0,5 M.
Sposobem według wynalazku otrzymuje się prekursor insuliny lub pochodnych insuliny, a zwłaszcza proinsulinę o prawidłowo związanych mostkach disiarczkowych.
Pochodne insuliny są pochodnymi insulin występujących w naturze, a mianowicie insuliny ludzkiej (SEQ ID NO: 1 = łańcuch A insuliny ludzkiej; SEQ ID NO: 2 = łańcuch B insuliny ludzkiej, patrz zestawienie sekwencji) lub insuliny zwierzęcej, różniącymi się od takich samych pod innymi względami insulin występujących w naturze podstawieniem co najmniej jednej reszty występującego w naturze aminokwasu i/lub dodaniem co najmniej jednej reszty aminokwasu i/lub grupy organicznej odpowiadającej aminokwasom.
PL 191 901 B1
Z prekursora insuliny lub pochodnej insuliny o prawidłowo związanych mostkach disiarczkowych otrzymanego sposobem według wynalazku, można otrzymać insulinę lub pochodną insuliny o prawidłowo związanych mostkach disiarczkowych, sposobem opisanym w EP 0600 372 A1 (lub US 5 473 049) lub w EP 0 668 292 A2, polegającym na enzymatycznym rozszczepieniu z użyciem trypsyny lub enzymu podobnego do trypsyny i ewentualnie dodatkowo karboksypeptydazy B oraz końcowym oczyszczeniu na żywicy adsorbującej.
Insulinę lub pochodną insuliny wytwarzaną z prekursora korzystnie można przedstawić ogólnym wzorem 1, w którym Y oznacza genetycznie kodowalną resztę aminokwasu, Z oznacza resztę aminokwasu wybraną z grupy obejmującej His, Arg i Lys, ugrupowanie peptydu zawierające 2 lub 3 reszty aminokwasów, w tym resztę aminokwasu Arg lub Lys na karboksylowym końcu ugrupowania peptydu, ugrupowanie peptydu zawierające 2-35 genetycznie kodowalnych reszt aminokwasów, w tym 1-5 reszt histydyny albo hydroksyl, R1 oznacza resztę fenyloalaniny (Phe) lub wiązanie kowalencyjne, R3 oznacza genetycznie kodowalną resztę aminokwasu, przy czym reszty A2-A20, nie pokazane dla uproszczenia wzoru 1, odpowiadają sekwencji aminokwasów łańcucha A insuliny ludzkiej, insuliny zwierzęcej lub pochodnej insuliny, a reszty B2-B29, nie pokazane dla uproszczenia wzoru 1, odpowiadają sekwencji aminokwasów łańcucha B insuliny ludzkiej, insuliny zwierzęcej lub pochodnej insuliny.
Sekwencję aminokwasową peptydów i białek określa się od N-końca łańcucha aminokwasów. Symbole podane w nawiasach we wzorze 1, np. A6, A20, B1, B7 lub B19, odpowiadają pozycji reszt aminokwasów w łańcuchu A lub B insuliny.
Określenie „genetycznie kodowalna reszta aminokwasu” oznacza reszty aminokwasów Gly, Ala, Ser, Thr, Val, Leu, Ile, Asp, Asn, Glu, Gln, Cys, Met, Arg, Lys, His, Tyr, Phe, Trp, Pro i selenocysteiny.
Określenia „reszty A2-A20” i „reszty B2-B29” insuliny zwierzęcej oznaczają np. sekwencje aminokwasów insuliny bydlęcej, świńskiej lub kurzej.
Określenia „reszty A2-A20” i „B2-B29” pochodnej insuliny oznaczają odpowiednie sekwencje aminokwasów insuliny ludzkiej, utworzone poprzez wymianę aminokwasów na inne aminokwasy kodowalne genetycznie.
Łańcuch A insuliny ludzkiej ma np. następującą sekwencję (SEQ ID NO: 1):
Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln Leu Glu Asn Tyr Cys Asn
Łańcuch B insuliny ludzkiej ma następującą sekwencję (SEQ ID NO: 2):
Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr
Przy tym, we wzorze 1 R3 oznacza resztę asparginy (Asn), R1 oznacza resztę fenyloalaniny (Phe), Y oznacza resztę treoniny (Thr), a Z oznacza OH.
Sposób według wynalazku jest szczególnie przydatny do wytwarzania prekursora insuliny lub pochodnej insuliny o ogólnym wzorze 2, w którym mostki disiarczkowe (nie pokazane we wzorze 2) są prawidłowo usytuowane, przy czym we wzorze 2 R2 oznacza atom wodoru, resztę aminokwasu z grupy obejmującej lizynę (Lys) i argininę (Arg) albo ugrupowanie peptydu zawierające 2-45 reszt aminokwasów, w tym resztę aminokwasu lizyny (Lys) lub argininy (Arg) na karboksylowym końcu ugrupowania peptydu, R1 oznacza resztę fenyloalaniny (Phe) lub wiązanie kowalencyjne, (B2-B29) oznacza reszty aminokwasów w pozycjach B2-B29 łańcucha B insuliny ludzkiej, insuliny zwierzęcej lub pochodnej insuliny, ewentualnie zmienionej w jednej lub większej liczbie pozycji, Y oznacza genetycznie kodowalną resztę aminokwasu, X oznacza resztę aminokwasu z grupy obejmującej lizynę (Lys) i argininę (Arg), ugrupowanie peptydu zawierające 2-35 reszt aminokwasów, w tym resztę aminokwasu lizyny (Lys) lub argininy (Arg) na N-końcu i na C-końcu ugrupowania peptydu, albo ugrupowanie peptydu zawierające 2-35 genetycznie kodowalnych reszt aminokwasów, w tym 1-5 reszt histydyny, (A2-A20) oznacza reszty aminokwasów w pozycjach A2-A20 łańcucha A insuliny ludzkiej, insuliny zwierzęcej lub pochodnej insuliny, ewentualnie zmienionej w jednej lub większej liczbie pozycji, a R3 oznacza kodowalną genetycznie resztę aminokwasu.
2
Korzystnie otrzymuje się związki o wzorze 2, w którym R2 oznacza atom wodoru lub ugrupowanie peptydu zawierające 2-25 reszt aminokwasów, w tym resztę aminokwasu argininy (Arg) na karboksylowym końcu peptydu, R1 oznacza resztę fenyloalaniny (Phe), (B2-B29) oznacza reszty aminokwasów w pozycjach B2-B29 łańcucha B insuliny ludzkiej, Y oznacza resztę aminokwasu z grupy obejmującej alaninę (Ala), treoninę (Thr) i serynę (Ser), X oznacza resztę aminokwasu argininy (Arg) lub ugrupowanie peptydu o sekwencji aminokwasów łańcucha C insuliny ludzkiej, (A2-A20) oznacza reszty aminokwasów w pozycjach A2-A20 łańcucha A insuliny ludzkiej, a R3 oznacza resztę aminokwasu z grupy obejmującej asparaginę (Asn), serynę (Ser) i glicynę (Gly).
PL 191 901 B1
Łańcuch C insuliny ludzkiej ma następującą sekwencję (SEQ ID NO: 3):
Arg Arg Glu Ala Glu Asp Leu Gln Val Gly Gln Val Glu Leu Gly Gly Gly Pro Gly Ala Gly Ser Leu Gln Pro Leu Ala Leu Glu Gly Ser Leu Gln Lys Arg 2
Korzystnie otrzymuje się związki o wzorze 2, w którym R2 oznacza atom wodoru lub ugrupowanie peptydu o 2-15 resztach aminokwasów, na którego karboksylowym końcu znajduje się reszta argi1 niny (Arg), R1 oznacza resztę fenyloalaniny (Phe), (B2-B29) oznacza reszty aminokwasów w pozycjach B2-B29 łańcucha B insuliny ludzkiej, Y oznacza resztę treoniny (Thr), X oznacza resztę aminokwasu argininy (Arg) lub ugrupowanie peptydu o 2-35 resztach aminokwasów, przy czym na początku i na końcu peptydu znajdują się dwie zasadowe reszty aminokwasów, a zwłaszcza argininy (Arg) i/lub lizyny (Lys), (A2-A20) oznacza reszty aminokwasów w pozycjach A2-A20 łańcucha A insuliny ludzkiej, a R3 oznacza resztę aminokwasu asparaginy (Asn) lub glicyny (Gly).
Ugrupowanie Z insuliny lub pochodnej insuliny o wzorze 1 stanowi zazwyczaj część sekwencji aminokwasów X prekursora o wzorze 2 i powstaje w wyniku działania proteaz, takich jak trypsyna, enzym podobny do trypsyny lub karboksypeptydaza B. Grupa R3 jest resztą aminokwasu znajdującą się w pozycji A21 łańcucha A insuliny. Grupa Y jest resztą aminokwasu znajdującą się w pozycji B30 łańcucha B insuliny.
Trypsyna lub enzymy podobne do trypsyny są proteazami rozszczepiającymi łańcuchy aminokwasów przy argininie lub lizynie.
Karboksypeptydaza B jest egzoproteazą odszczepiającą zasadowe reszty aminokwasów, takie jak Arg lub Lys, znajdujące się na karboksylowym końcu łańcucha aminokwasów (Kemmler i inni,
J. Biol. Chem. 246, str. 6786-6791).
Z prekursorów wymienionych w pierwszej korzystnej grupie związków o wzorze 2 można otrzymać insulinę lub pochodną insuliny o wzorze 1 z prawidłowo połączonymi mostkami disiarczkowymi, przy czym Y, R1, R2, R3, A2-A20 i B2-B29 mają wyżej podane znaczenie, a Z oznacza resztę argininy (Arg), ugrupowanie peptydu Arg-Arg albo grupę OH.
Z prekursorów wymienionych w drugiej korzystnej grupie związków o wzorze 2 można otrzymać insulinę lub pochodną insuliny o wzorze 1 z prawidłowo połączonymi mostkami disiarczkowymi, przy czym Y, R1, R2, R3, A2-A20 i B2-B29 mają wyżej podane znaczenie, a Z oznacza ugrupowanie argininy (Arg), ugrupowanie peptydu Arg-Arg lub Lys-Lys, albo grupę OH.
Prekursor o wzorze 2 można wytworzyć w mikroorganizmach za pomocą licznych konstruktów genetycznych (EP 0 489 780, EP 0 347 781, EP 0 453969). Takie konstrukty podczas fermentacji są eksprymowane w mikroorganizmach, takich jak Escherichia coli lub Streptomycetes. Powstałe białka są magazynowane wewnątrz drobnoustrojów (EP 0 489 780) lub są wydzielane do roztworu fermentacyjnego.
W sposobie według wynalazku można stosować prekursor insuliny lub pochodnej insuliny o wzorze 2, pochodzący bezpośrednio z procesu roztwarzania komórek i zanieczyszczony dużą liczbą białek. Prekursor o wzorze 2 można stosować również w postaci uprzednio oczyszczonej, np. po wytrąceniu albo chromatograficznym oczyszczeniu.
Pr zy kł a d 1 (przykład porównawczy, stan techniki)
W wyniku fermentacji z użyciem genetycznie zmodyfikowanych komórek Escherichia coli (EP 0 489 780) wytworzono białko fuzyjne o następującej sekwencji aminokwasów.
Sekwencja proinsuliny 1(SEQ ID NO: 4):
Ala Thr Thr Ser Thr Gly Asn Ser Ala Arg Phe ValAsn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu
Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr Arg Arg Glu Ala Glu Asp Leu Gln Val Gly
Gln Val Glu Leu Gly Gly Gly Pro Gly Ala Gly Ser Leu Gln Pro Leu Ala Leu Glu Gly Ser Leu Gln Lys Arg
Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln Leu Glu Asn Tyr Cys Asn
Sekwencja proinsuliny 1 odpowiada wzorowi 2, w którym X oznacza ugrupowanie peptydu C in12 suliny ludzkiej (SEQ ID NO: 3), Y oznacza Thr (B30), R1 oznacza Phe (B1), R2 oznacza ugrupowanie peptydu o 10 resztach aminokwasów, R3 oznacza Asn (A21), A2-A20 to sekwencja aminokwasów łańcucha A insuliny ludzkiej (reszty aminokwasów 2-20), a B2-B29 to sekwencja aminokwasów łańcucha B insuliny ludzkiej (reszty aminokwasów 2-29). W komórkach E. coli zbiera się białko fuzyjne osekwencji proinsuliny 1 i tworzą się ciałka wtrętowe. Po zakończeniu fermentacji oddzielono komórki poprzez odwirowanie i roztworzono je drogą znanej homogenizacji wysokociśnieniowej. Uwolnione ciałka wtrętowe z białka fuzyjnego wyodrębniono poprzez odwirowanie. 20 kg wyodrębnionych ciałek wtrętowych z białka fuzyjnego (w przeliczeniu na suchą masę poliofilizacji; udział białek fuzyjnych zawierających insulinę oznaczony metodą HPLC wynosił 50%) osekwencji proinsuliny 1 rozpuszczo6
PL 191 901 B1 no w 550 litrach 8 M roztworu mocznika o pH 10,6. Ewentualnie po odwirowaniu niewielkiej ilości substancji tworzących zmętnienie, klarowny roztwór wprowadzono do 9000 litrów wodnego roztworu cysteiny (5 kg hydratu chlorowodorku cysteiny) o pH 10,6 i w temperaturze 4°C. Po zakończeniu reakcji fałdowania (po około 24 godzinach) oznaczono analitycznie metodą wyskosprawnej chromatografii cieczowej (HPLC) zawartość sekwencji proinsuliny 1 o prawidłowo związanych mostkach disiarczkowych. Wynosiła ona 3,0 kg, co odpowiadało przereagowaniu z wydajnością 30%. Za pomocą 1N HCl doprowadzono 9500 litrów roztworu do pH 5,0 i oddzielono osad. W wyniku dodania 1N ługu sodowego doprowadzono roztwór do pH 9 i dodano 3 g trypsyny. Zgodnie z pomiarami przeprowadzonymi metodą HPLC, powstało 1,25 kg insuliny o 2 resztach argininy na końcu karboksylowym. Po rozszczepieniu z użyciem karboksypeptydazy B powstała insulina ludzka, którą dodatkowo oczyszczono metodami chromatograficznymi. Insulina ludzka odpowiada wzorowi 1, w którym Y oznacza Thr (B30), Z oznacza OH, R1 oznacza Phe (B1), R3 oznacza Asn (A21), A2-A20 to sekwencja aminokwasów łańcucha A insuliny ludzkiej (reszty aminokwasów 2-20), a B2-B29 to sekwencja aminokwasów łańcucha B insuliny ludzkiej (reszty aminokwasów 2-29). Insulina ludzka 2 składa się z sekwencji o numerach identyfikacyjnych 1 i 2, które to sekwencje są związane ze sobą prawidłowo usytuowanymi mostkami disiarczkowymi. Roztwór zatężono i oczyszczono za pomocą żywicy adsorbującej, tak jak opisano w EP 0 668 292. Eluat zawierający insulinę 2, po rozcieńczeniu wodą i nastawieniu pH, można dodatkowo bezpośrednio oczyszczać w kolumnie chromatograficznej.
Analiza metodą HPLC
0,5 g białka rozpuszczono w ciągu 2 minut w temperaturze 95°C w 40 ml roztworu zawierającego 6 M chlorowodorek guanidyny, 50 mM Tris (pH 8,5), 5 mM etylenodiaminotetraoctan (EDTA), 1% 2-merkaptoetanolu i 10 mM ditiotreitol, a następnie mieszaninę poddawano wirowaniu przez 20 minut przy 14 000 g.
0,02 ml klarownej pozostałości wprowadzono do kolumny do wysokosprawnej chromatografii cieczowej.
®
Kolumna: ®Nucleogel RP 300-5/46 (Macherey & Nagel, Aachen, Niemcy)
Gradient: Bufor A: 0,1% kwas trifluorooctowy (TFA)
Bufor B: 0,09% TFA w acetonitrylu
Temperatura: 55°C
Czas całkowity: 40 minut
Gradient określono następującymi ilościami buforu B, po podanym czasie przebiegu procesu: 10 minut 25%, 12 minut 60%, 13 minut 90%, 15 minut 100%.
Przepływ: 1 ml/minutę
Wykrywanie: 215 nm
Czas retencji insuliny: około 19 minut
P r z y k ł a d 2 (sposób według wynalazku)
W wyniku fermentacji z użyciem genetycznie zmodyfikowanych komórek Escherichia coli (EP 0 489 780) wytworzono białko fuzyjne o sekwencji aminokwasów przedstawionej w przykładzie 1 (sekwencja proinsuliny 1, SEQ ID NO: 4). W komórkach E. coli zbiera się białko fuzyjne o sekwencji proinsuliny 1 i tworzą się ciałka wtrętowe. Po zakończeniu fermentacji oddzielono komórki poprzez odwirowanie i roztworzono drogą znanej homogenizacji wysokociśnieniowej. Uwolnione ciałka wtrętowe z białka fuzyjnego wyodrębniono poprzez odwirowanie. Do wodnej zawiesiny białka fuzyjnego, zawierającej 40 kg białka fuzyjnego (otrzymanego przez liofilizację podwielokrotnych próbek), dodano 5 kg hydratu chlorowodorku cysteiny. Zawiesinę (udział białka fuzyjnego zawierającego insulinę oznaczony metodą HPLC wynosił 50%) o sekwencji proinsuliny 1 rozpuszczono w 550 litrach 8 M roztworu mocznika o pH 10,2, w temperaturze 40°C. Klarowny roztwór wprowadzono do 9000 litrów wody o pH 10,6 i w temperaturze 15°C. Po zakończeniu reakcji fałdowania (po około 5 godzinach) oznaczono analitycznie metodą HPLC zawartość sekwencji proinsuliny 1 o prawidłowo związanych mostkach disiarczkowych. Wynosiła ona 10,0 kg, co odpowiadało przereagowaniu z wydajnością 50%.
Za pomocą 1N HCl doprowadzono 9500 litrów roztworu do pH 5,0 i oddzielono osad. W wyniku dodania 1N ługu sodowego doprowadzono roztwór do pH 9 i dodano 10 g trypsyny. Powstało 4 kg insuliny o 2 resztach argininy na końcu karboksylowym. Po rozszczepieniu z użyciem karboksypeptydazy B powstała insulina ludzka (SEQ ID NO: 1 i SEQ ID NO: 2, o prawidłowo związanych mostkach disiarczkowych). Roztwór zatężono i oczyszczono za pomocą żywicy adsorbującej. Eluat zawierający insulinę ludzką, po rozcieńczeniu wodą i nastawieniu pH, można dodatkowo bezpośrednio oczyszczać w kolumnie chromatograficznej.
PL 191 901 B1
Pr zy kł a d 3 (przykład porównawczy, stan techniki)
W wyniku fermentacji z użyciem genetycznie zmodyfikowanych komórek Escherichia coli (EP 0 489 780) wytworzono białko fuzyjne o następującej sekwencji aminokwasów.
Sekwencja proinsuliny 2 (SEQ ID NO: 5):
Ala Thr Thr Ser Thr Gly Asn Ser Ala Arg Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu
Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr Arg Arg Glu Ala Glu Asp Leu Gln Val Gly
Gln Val Glu Leu Gly Gly Gly Pro Gly Ala Gly Ser Leu Gln Pro Leu Ala Leu Glu Gly Ser Leu Gln Lys Arg
Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln Leu Glu Asn Tyr Cys Gly
Sekwencja proinsuliny 2 odpowiada wzorowi 2, w którym X oznacza ugrupowanie peptydu C in12 suliny ludzkiej (SEQ ID NO: 3), Y oznacza Thr (B30), R1 oznacza Phe (B1), R2 oznacza ugrupowanie peptydu o 10 resztach aminokwasów, R3 oznacza Gly (A21), A2-A20 to sekwencja aminokwasów łańcucha A insuliny ludzkiej (reszty aminokwasów 2-20), a B2-B29 to sekwencja aminokwasów łańcucha B insuliny ludzkiej (reszty aminokwasów 2-29). W komórkach E. coli zbiera się białko fuzyjne o sekwencji proinsuliny 2 i tworzą się ciałka wtrętowe. Po zakończeniu fermentacji oddzielono komórki poprzez odwirowanie i roztworzono je drogą znanej homogenizacji wysokociśnieniowej. Uwolnione ciałka wtrętowe z białka fuzyjnego wyodrębniono poprzez odwirowanie.
kg wyodrębnionych ciałek wtrętowych z białka fuzyjnego (w przeliczeniu na suchą masę po liofilizacji; udział białek fuzyjnych zawierających insulinę oznaczony metodą HPLC wynosił 50%) o sekwencji proinsuliny 2 rozpuszczono w temperaturze 20°C w 550 litrach 8 M roztworu mocznika o pH 10,6. Klarowny roztwór wprowadzono do 9000 litrów wodnego roztworu cysteiny (5 kg hydratu chlorowodorku cysteiny) o pH 10,6 i w temperaturze 4°C. Po zakończeniu reakcji fałdowania (po około 24 godzinach) oznaczono analitycznie metodą HPLC zawartość sekwencji proinsuliny 2 o prawidłowo związanych mostkach disiarczkowych. Wynosiła ona 3,0 kg, co odpowiadało przereagowaniu z wydajnością 30%.
Za pomocą 1N HCl doprowadzono 9500 litrów roztworu do pH 5,0 i oddzielono osad. W wyniku dodania 1N ługu sodowego doprowadzono roztwór do pH 9 i dodano 3 g trypsyny. Zgodnie z pomiarami przeprowadzonymi metodą HPLC, powstało 0,98 kg pochodnej insuliny o 2 resztach argininy na końcu karboksylowym. Ta pochodna insuliny odpowiada wzorowi 1, w którym Y oznacza Thr (B30), Z oznacza Arg-Arg, R1 oznacza Phe (B1), R3 oznacza Gly (A21), A2-A20 to sekwencja aminokwasów łańcucha A insuliny ludzkiej (reszty aminokwasów 2-20), a B2-B29 to sekwencja aminokwasów łańcucha B insuliny ludzkiej (reszty aminokwasów 2-29), przy czym składa się ona z SEQ ID NO: 6 i SEQ ID NO: 7, które to sekwencje są związane ze sobą prawidłowo usytuowanymi mostkami disiarczkowymi. Roztwór zatężono i oczyszczono za pomocą żywicy adsorbującej. Eluat zawierający pochodną insuliny, po rozcieńczeniu wodą i nastawieniu pH, można bezpośrednio dodatkowo oczyszczać w kolumnie chromatograficznej.
Przykład 4 (sposób według wynalazku)
W wyniku fermentacji z użyciem genetycznie zmodyfikowanych komórek Escherichia coli (EP 0 489 780) wytworzono białko fuzyjne o sekwencji proinsuliny 2 przedstawionej w przykładzie 3 (SEQ ID NO: 5). W komórkach E. coli zbiera się białko fuzyjne o sekwencji proinsuliny 2 i tworzą się ciałka wtrętowe. Po zakończeniu fermentacji oddzielono komórki poprzez odwirowanie i roztworzono je drogą znanej homogenizacji wysokociśnieniowej. Uwolnione ciałka wtrętowe z białka fuzyjnego wyodrębniono poprzez odwirowanie. Do wodnej zawiesiny białka fuzyjnego zawierającej 40 kg białka fuzyjnego (otrzymanego poprzez liofilizację podwielokrotnych próbek) dodano 5 kg hydratu chlorowodorku cysteiny. Zawiesinę (udział białek fuzyjnych zawierających insulinę oznaczony metodą HPLC wynosił 50%) o sekwencji proinsuliny 2 rozpuszczono w 550 litrach 8 M roztworu mocznika o pH 10,2, w temperaturze 40°C. Klarowny roztwór wprowadzono do 9000 litrów wody w pH 10,6 i w temperaturze 15°C. Po zakończeniu reakcji fałdowania (po około 5 godzinach) oznaczono analitycznie metodą HPLC zawartość sekwencji proinsuliny 1 o prawidłowo związanych mostkach disiarczkowych. Wynosiła ona 10,0 kg, co odpowiadało przereagowaniu z wydajnością 50%. Za pomocą 1N HCl doprowadzono 9500 litrów roztworu do pH 5,0 i oddzielono osad. W wyniku dodania 1N ługu sodowego doprowadzono roztwór do pH 9 i dodano 10 g trypsyny. Powstało 2,8 kg pochodnej insuliny (pomiary metodą HPLC), składającej się z SEQ ID NO: 6 i SEQ ID NO: 7, które to sekwencje były związane ze sobą prawidłowo usytuowanymi mostkami disiarczkowymi. Roztwór zatężono i oczyszczono za pomocą żywicy adsorbującej. Eluat zawierający pochodną insuliny, po rozcieńczeniu wodą i nastawieniu pH, można bezpośrednio dodatkowo oczyszczać w kolumnie chromatograficznej.
PL 191 901 B1
Zestawienie sekwencji (1) Informacja ogólna (i) Zgłaszający:
| (A) Nazwa: Sanofi-Aventis Deutschland GmbH | ||
| (B) | Ulica:- | |
| (C) | Miasto: Frankfurt nad | Menem |
| (E) | Państwo: Niemcy | |
| (F) | Kod pocztowy: 65926 | |
| (G) | Telefon: 069-305-5307 | |
| <H) | Telefaks: 069-35-7175 | |
| (I) | Teleks: 041234-700 |
(ii) Tytuł zgłoszenia: Sposób wytwarzania prekursorów insuliny (iii) Liczba sekwencji: 7 (iv) Sposób odczytu komputerowego:
(A) Typ nośnika: Dyskietka (B) Komputer: kompatybilny z IBM PC (C) System operacyjny:PC-DOS/MS-DOS (D) Oprogramowanie: Patentln Release #1.0, wersja #1.25 (EPA) (2) Informacja o SEQ ID NO: 1:
(i) Charakterystyka sekwencji:
(A) Długość: 21 aminokwasów (B) Typ: aminokwas (C) Niciowość: pojedyncza (D) Topologia: liniowa (ii) Typ cząsteczki: białko (vi) Pochodzenie pierwotne:
(A) Organizm: Escherichia coli (ix) Cechy:
PL 191 901 B1 (A) Nazwa/klucz: białko (B) Położenie: 1..21 (xi) Opis sekwencji: SEQ ID NO: 1:
Gly Ile Val Glu Gin Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gin Leu 1 5 10 15
Glu Asn Tyr Cys Asn 20 (2) Informacja o SEQ ID NO: 2:
(i) Charakterystyka sekwencji:
(A) Długość: 30 aminokwasów (B) Typ: aminokwas (C) Niciowość: pojedyncza (D) Topologia: liniowa (ii) Typ cząsteczki: białko (vi) Pochodzenie pierwotne:
(A) Organizm: Escherichia coli (ix) Cechy:
(A) Nazwa/klucz: białko (B) Położenie: 1..30 (xi) Opis sekwencji: SEQ ID NO: 2:
| Phe 1 | Val | Asn | Gin | His 5 | Leu | Cys | Gly Ser | His 10 | Leu | Val | Glu | Ala |
| Leu | Val | Cys | Gly 20 | Glu | Arg | Gly | Phe Phe 25 | Tyr | Thr | Pro | Lys | Thr 30 |
Leu Tyr 15 (2) Informacja o SEQ ID NO: 3:
(i) Charakterystyka sekwencji:
(A) Długość: 35 aminokwasów (B) Typ: aminokwas (C) Niciowość: pojedyncza (D) Topologia: liniowa (ii) Typ cząsteczki: białko (vi) Pochodzenie pierwotne:
PL 191 901 B1 (A) Organizm: Escherichia coli (ix) Cechy:
(A) Nazwa/klucz: białko (B) Położenie: 1..35 (xi) Opis sekwencji: SEQ ID NO: 3:
| Arg 1 | Arg | Glu | Ala | Glu 5 | Asp | Leu | Gin | Val | Gly 10 | Gin | Val | Glu | Leu | Gly 15 | Gly |
| Gly | Pro | Gly | Ala 20 | Gly | Ser | Leu | Gin | Pro 25 | Leu | Ala | Leu | Glu | Gly 30 | Ser | Leu |
Gin Lys Arg 35 (2) Informacja o SEQ ID NO: 4:
(i) Charakterystyka sekwencji:
(A) Długość: 96 aminokwasów (B) Typ: aminokwas (0) Niciowość: pojedyncza (D) Topologia: liniowa (ii) Typ cząsteczki: białko (vi) Pochodzenie pierwotne:
(A) Organizm: Escherichia coli (ix) Cechy:
(A) Nazwa/klucz: białko (B) Położenie: 1..96 (xi) Opis sekwencji: SEQ ID NO: 4:
| Ala 1 | Thr | Thr | Ser | Thr 5 | Gly | Asn | Ser | Ala | Arg 10 | Phe | Val | Asn | Gin | His 15 | Leu |
| Cys | Gly | Ser | His 20 | Leu | Val | Glu | Ala | Leu 25 | Tyr | Leu | Val | Cys | Gly 30 | Glu | Arg |
| Gly | Phe | Phe 35 | Tyr | Thr | Pro | Lys | Thr 40 | Arg | Arg | Glu | Ala | Glu 45 | Asp | Leu | Gin |
| Val | Gly 50 | Gin | Val | Glu | Leu | Gly 55 | Gly | Gly | Pro | Gly | Ala 60 | Gly | Ser | Leu | Gin |
| Pro 65 | Leu | Ala | Leu | Glu | Gly 70 | Ser | Leu | Gin | Lys | Arg 75 | Gly | Ile | Val | Glu | Gin 80 |
PL 191 901 B1
Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gin Leu Glu Asn 85 90 (2) Informacja o SEQ ID NO: 5:
(i) Charakterystyka sekwencji:
(A) Długość: 96 aminokwasów (B) Typ: aminokwas (C) Niciowość: pojedyncza (D) Topologia: liniowa (ii) Typ cząsteczki: białko (vi) Pochodzenie pierwotne:
(A) Organizm: Escherichia coli (ix) Cechy:
(A) Nazwa/klucz: białko (B) Położenie: 1..96 (xi) Opis sekwencji: SEQ ID NO: 5:
Tyr Cys Asn 95
| Ala 1 | Thr | Thr | Ser | Thr 5 | Gly | Asn | Ser | Ala | Arg 10 | Phe | Val | Asn | Gin | His 15 | Leu |
| Cys | Gly | Ser | His 20 | Leu | Val | Glu | Ala | Leu 25 | Tyr | Leu | Val | Cys | Gly 30 | Glu | Arg |
| Gly | Phe | Phe 35 | Tyr | Thr | Pro | Lys | Thr 40 | Arg | Arg | Glu | Ala | Glu 45 | Asp | Leu | Gin |
| Val | Gly 50 | Gin | Val | Glu | Leu | Gly 55 | Gly | Gly | Pro | Gly | Ala 60 | Gly | Ser | Leu | Gin |
| Pro 65 | Leu | Ala | Leu | Glu | Gly 70 | Ser | Leu | Gin | Lys | Arg 75 | Gly | Ile | Val | Glu | Gin 80 |
| cys (2) | Cys Thr Ser Informacja c | Ile 85 SEC | cys 1 ID | Ser NO: | Leu 6: | Tyr | Gin 90 | Leu | Glu | Asn | Tyr | Cys 95 | Gly |
(i) Charakterystyka sekwencji:
(A) Długość: 32 aminokwasy (B) Typ: aminokwas (C) Niciowość: pojedyncza (D) Topologia: liniowa
PL 191 901 B1 (ii) Typ cząsteczki: białko (vi) Pochodzenie pierwotne:
(A) Organizm: Escherichia coli (ix) Cechy:
(A) Nazwa/klucz: białko (B) Położenie: 1..32 (xi) Opis sekwencji: SEQ ID NO: 6:
| Phe 1 | Val | Asn | Gin | His 5 | Leu | Cys | Gly | Ser | His 10 | Leu | Val | Glu | Ala | Leu 15 | Tyr |
| Leu | Val | Cys | Gly 20 | Glu | Arg | Gly | Phe | Phe 25 | Tyr | Thr | Pro | Lys | Thr 30 | Arg | Arg |
(2) Informacja o SEQ ID NO: 7:
(i) Charakterystyka sekwencji:
(A) Długość: 21 aminokwasów (B) Typ: aminokwas (C) Niciowość: pojedyncza (D) Topologia: liniowa (ii) Typ cząsteczki: białko (vi) Pochodzenie pierwotne:
(A) Organizm: Escherichia coli (ix) Cechy:
(A) Nazwa/klucz: białko (B) Położenie: 1..21 (xi) Opis sekwencji: SEQ ID NO: 7:
Gly Ile Val Glu Gin Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gin Leu 1 5 10 15
Glu Asn Tyr Cys Gly
Claims (9)
1. Sposób wytwarzania prekursorów insuliny i pochodnych insuliny o prawidłowo związanych mostkach disiarczkowych, w obecności cysteiny lub chlorowodorku cysteiny i chaotropowej substancji pomocniczej, znamienny tym, że przeprowadza się kolejno następujące etapy:
(a)do wodnej zawiesiny prekursora insuliny lub pochodnej insuliny dodaje się taką ilość cysteiny lub chlorowodorku cysteiny, że 1-15 grup SH cysteiny lub chlorowodorku cysteiny przypada na jedną grupę cysteinową prekursora, (b)do 4-9 molowego roztworu chaotropowej substancji pomocniczej o pH 8-11,5 w temperaturze 15-55°C wprowadza się zawiesinę prekursora zawierającą cysteinę lub chlorowodorek cysteiny i utrzymuje się uzyskaną mieszaninę przez 10-60 minut w tej temperaturze, po czym (c) wprowadza się tę mieszaninę o pH 8-11,5 w temperaturze 5-30°C do takiej ilości wody, która powoduje rozcieńczenie cysteiny lub chlorowodorku cysteiny w mieszaninie do stężenia 1-5 mM i chaotropowej substancji pomocniczej do stężenia 0,2-1,0 M.
2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że w etapie (a) stosuje się taką ilość cysteiny lub chlorowodorku cysteiny, że 1-6 grup SH cysteiny lub chlorowodorku cysteiny przypada na jedną grupę cysteinową prekursora, w etapie (b) do 4-9 molowego roztworu chaotropowej substancji pomocniczej o pH 8-11 w temperaturze 30-45°C wprowadza się zawiesinę prekursora zawierającą cysteinę lub chlorowodorek cysteiny i utrzymuje się uzyskaną mieszaninę przez 20-40 minut w tej temperaturze, a w etapie (c) wprowadza się tę mieszaninę o pH 8-11 w temperaturze 15-20°C do takiej ilości wody, która powoduje rozcieńczenie cysteiny lub chlorowodorku cysteiny w mieszaninie do stężenia 1-5 mM i chaotropowej substancji pomocniczej do stężenia 0,2-1,0 M.
3. Sposób według zastrz. 1 albo 2, znamienny tym, że jako chaotropową substancję pomocniczą stosuje się guanidynę lub chlorowodorek guanidyny.
4. Sposób według zastrz. 1 albo 2, znamienny tym, że jako chaotropową substancję pomocniczą stosuje się mocznik.
5. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że w etapie (b) stosuje się chaotropową substancję pomocniczą w stężeniu 7,0-9 M.
Sposób według zastrz. Sposób według zastrz. Sposób według zastrz. Sposób według zastrz.
że w etapie (b) temperatura wynosi 40°C. że w etapie (b) wartość pH wynosi 10-11. że w etapie (c) wartość pH wynosi pH 10-11. że w etapie (c) stosuje się taką ilość wody,
1, znamienny tym,
1, znamienny tym,
1, znamienny tym,
1, znamienny tym, że uzyskuje się rozcieńczenie cysteiny lub chlorowodorku cysteiny w mieszaninie do stężenia 2,5-3 mM i chaotropowej substancji pomocniczej do stężenia 0,5 M.
10. Sposób według zastrz. 2, znamienny tym, że w etapie (b) stosuje się chaotropową substancję pomocniczą w stężeniu 8 M, w etapie (b) stosuje się temperaturę 40°C i wartość pH 10,6, a w etapie (c) stosuje się wartość pH 10,6 i taką ilość wody, że uzyskuje się rozcieńczenie cysteiny lub chlorowodorku cysteiny w mieszaninie do stężenia 2,5-3 mM i chaotropowej substancji pomocniczej do stężenia 0,5 M.
11. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że wytwarza się prekursor insuliny lub pochodnej insuliny mający sekwencję o ogólnym wzorze 2, w którym R2 oznacza atom wodoru, resztę aminokwasu z grupy obejmującej lizynę (Lys) i argininę (Arg), albo ugrupowanie peptydu zawierające 2-45 reszt aminokwasów, w tym resztę aminokwasu lizyny (Lys) lub argininy (Arg) na karboksylowym końcu ugrupowania peptydu, R1 oznacza resztę fenyloalaniny (Phe) lub wiązanie kowalencyjne, (B2-B29) oznacza reszty aminokwasów w pozycjach B2-B29 łańcucha B insuliny ludzkiej, insuliny zwierzęcej lub pochodnej insuliny, ewentualnie zmienionej w jednej lub większej liczbie pozycji, Y oznacza genetycznie kodowalną resztę aminokwasu, X oznacza resztę aminokwasu z grupy obejmującej lizynę (Lys) i argininę (Arg), ugrupowanie peptydu zawierające 2-35 reszt aminokwasów, w tym resztę aminokwasu lizyny (Lys) lub argininy (Arg) na N-końcu i na C-końcu ugrupowania peptydu, albo ugrupowanie peptydu zawierające 2-35 genetycznie kodowalnych reszt aminokwasów, w tym 1-5 reszt histydyny, (A2-A20) oznacza reszty aminokwasów w pozycjach A2-A20 łańcucha A insuliny ludzkiej, insuliny zwierzęcej lub pochodnej insuliny, ewentualnie zmienionej w jednej lub większej liczbie pozycji, a R3 oznacza kodowalną genetycznie resztę aminokwasu.
12. Sposób według zastrz. 11, znamienny tym, że wytwarza się związek o wzorze 2, w którym 2
R2 oznacza atom wodoru lub ugrupowanie peptydu zawierające 2-25 reszt aminokwasów, w tym resztę aminokwasu argininy (Arg) na karboksylowym końcu peptydu, R1 oznacza resztę fenyloalaniny (Phe),
PL 191 901 B1 (B2-B29) oznacza reszty aminokwasów w pozycjach B2-B29 łańcucha B insuliny ludzkiej, Y oznacza resztę aminokwasu z grupy obejmującej alaninę (Ala), treoninę (Thr) i serynę (Ser), X oznacza resztę aminokwasu argininy (Arg) lub ugrupowanie peptydu o sekwencji aminokwasów łańcucha C insuliny ludzkiej, (A2-A20) oznacza reszty aminokwasów w pozycjach A2-A20 łańcucha A insuliny ludzkiej, aR3 oznacza resztę aminokwasu z grupy obejmującej asparaginę (Asn), serynę (Ser) lub glicynę (Gly).
13. Sposób według zastrz. 11, znamienny tym, że wytwarza się związek o wzorze 2, w którym 2
R2 oznacza atom wodoru lub ugrupowanie peptydu o 2-15 resztach aminokwasów, na którego karboksylowym końcu znajduje się reszta argininy (Arg), R1 oznacza resztę fenyloalaniny (Phe), (B2-B29) oznacza reszty aminokwasów w pozycjach B2-B29 łańcucha B insuliny ludzkiej, Y oznacza resztę treoniny (Thr), X oznacza resztę aminokwasu argininy (Arg) lub ugrupowanie peptydu o 2-35 resztach aminokwasów, przy czym na początku i na końcu ugrupowania peptydu znajdują się dwie zasadowe reszty aminokwasów, a zwłaszcza argininy (Arg) i/lub lizyny (Lys), (A2-A20) oznacza reszty aminokwasów w pozycjach A2-A20 łańcucha A insuliny ludzkiej, a R3 oznacza resztę aminokwasu asparaginy (Asn) lub glicyny (Gly).
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE19735711A DE19735711C2 (de) | 1997-08-18 | 1997-08-18 | Verfahren zur Herstellung eines Vorläufers von Insulin oder Insulinderivaten mit korrekt verbundenen Cystinbrücken |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| PL328108A1 PL328108A1 (en) | 1999-03-01 |
| PL191901B1 true PL191901B1 (pl) | 2006-07-31 |
Family
ID=7839275
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| PL328108A PL191901B1 (pl) | 1997-08-18 | 1998-08-18 | Sposób wytwarzania prekursorów insuliny i pochodnych insuliny |
Country Status (21)
| Country | Link |
|---|---|
| US (3) | US5986048A (pl) |
| EP (2) | EP0980874B1 (pl) |
| JP (1) | JP4291900B2 (pl) |
| KR (2) | KR100537842B1 (pl) |
| CN (3) | CN1483831B (pl) |
| AR (1) | AR016821A1 (pl) |
| AT (2) | ATE217012T1 (pl) |
| AU (1) | AU744824B2 (pl) |
| BR (2) | BR9803755A (pl) |
| CA (1) | CA2245151C (pl) |
| CZ (1) | CZ295679B6 (pl) |
| DE (3) | DE19735711C2 (pl) |
| DK (2) | DK0906918T3 (pl) |
| ES (2) | ES2177178T3 (pl) |
| HK (3) | HK1018464A1 (pl) |
| HU (2) | HU228203B1 (pl) |
| ID (1) | ID20717A (pl) |
| PL (1) | PL191901B1 (pl) |
| PT (2) | PT906918E (pl) |
| RU (2) | RU2205836C2 (pl) |
| TR (1) | TR199801587A3 (pl) |
Families Citing this family (33)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE19735711C2 (de) | 1997-08-18 | 2001-04-26 | Aventis Pharma Gmbh | Verfahren zur Herstellung eines Vorläufers von Insulin oder Insulinderivaten mit korrekt verbundenen Cystinbrücken |
| DE19930676B4 (de) | 1999-07-02 | 2006-01-19 | Sanofi-Aventis Deutschland Gmbh | Verfahren zur Stabilisierung von Insulin, Insulinderivaten und/oder deren Vorläufer in komplexen Mischungen bei deren Lagerung in wäßrigen Lösungsmitteln |
| AU2151401A (en) * | 1999-12-22 | 2001-07-03 | Novo Nordisk A/S | Method for extractive refolding of scrambled single-chain polypeptides |
| WO2002004481A2 (en) * | 2000-07-12 | 2002-01-17 | Eli Lilly And Company | Process to increase protein stability |
| DE10235168A1 (de) * | 2002-08-01 | 2004-02-12 | Aventis Pharma Deutschland Gmbh | Verfahren zur Reinigung von Preproinsulin |
| DE102004015965A1 (de) * | 2004-04-01 | 2005-10-20 | Aventis Pharma Gmbh | Verfahren zur Gewinnung von Insulinen durch verbesserte Luftbegasung der Faltung |
| US20080032343A1 (en) | 2005-12-22 | 2008-02-07 | Genentech, Inc. | Recombinant Production of Heparin Binding Proteins |
| AU2007272412B2 (en) | 2006-07-14 | 2013-11-07 | Genentech, Inc. | Refolding of recombinant proteins |
| RU2468373C2 (ru) * | 2007-07-03 | 2012-11-27 | Эмджен Инк. | Количественное определение белков с использованием сухого веса внутриклеточных телец |
| RU2451750C2 (ru) * | 2007-09-24 | 2012-05-27 | Общество С Ограниченной Ответственностью "Герофарм" | Способ получения рекомбинантного с-пептида проинсулина человека |
| EP2229407B1 (de) | 2008-01-09 | 2016-11-16 | Sanofi-Aventis Deutschland GmbH | Neue insulinderivate mit extrem verzögertem zeit- / wirkungsprofil |
| WO2009133529A2 (en) * | 2008-04-30 | 2009-11-05 | Wockhardt Research Centre | Processes for refolding of insulin |
| HUE037449T2 (hu) | 2008-10-17 | 2018-08-28 | Sanofi Aventis Deutschland | Egy inzulin és egy GLP-1 agonista kombinációja |
| AR080669A1 (es) | 2009-11-13 | 2012-05-02 | Sanofi Aventis Deutschland | Composicion farmaceutica que comprende un agonista de glp-1, una insulina y metionina |
| WO2011058082A1 (de) | 2009-11-13 | 2011-05-19 | Sanofi-Aventis Deutschland Gmbh | Pharmazeutische zusammensetzung umfassend einen glp-1-agonisten und methionin |
| ES2606554T3 (es) | 2010-08-30 | 2017-03-24 | Sanofi-Aventis Deutschland Gmbh | Uso de AVE0010 para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de la diabetes mellitus de tipo 2 |
| US9821032B2 (en) | 2011-05-13 | 2017-11-21 | Sanofi-Aventis Deutschland Gmbh | Pharmaceutical combination for improving glycemic control as add-on therapy to basal insulin |
| TWI559929B (en) | 2011-09-01 | 2016-12-01 | Sanofi Aventis Deutschland | Pharmaceutical composition for use in the treatment of a neurodegenerative disease |
| US20180282405A1 (en) * | 2012-08-05 | 2018-10-04 | Absci, Llc | Cytoplasmic expression system |
| WO2014099577A1 (en) | 2012-12-17 | 2014-06-26 | Merck Sharp & Dohme Corp. | Process for purifying insulin and analogues thereof |
| WO2014133324A1 (ko) * | 2013-02-26 | 2014-09-04 | 한미약품 주식회사 | 신규한 인슐린 아날로그 및 이의 용도 |
| CN103694339B (zh) * | 2013-12-04 | 2017-10-13 | 珠海联邦制药股份有限公司 | 一种甘精胰岛素前体的复性方法 |
| WO2015138548A1 (en) | 2014-03-14 | 2015-09-17 | Merck Sharp & Dohme Corp. | Purifying insulin using cation exchange and reverse phase chromatography in the presence of an organic modifier and elevated temperature |
| PL3229828T3 (pl) | 2014-12-12 | 2023-07-31 | Sanofi-Aventis Deutschland Gmbh | Formulacja o ustalonym stosunku insuliny glargine/liksysenatydu |
| TWI748945B (zh) | 2015-03-13 | 2021-12-11 | 德商賽諾菲阿凡提斯德意志有限公司 | 第２型糖尿病病患治療 |
| TW201705975A (zh) | 2015-03-18 | 2017-02-16 | 賽諾菲阿凡提斯德意志有限公司 | 第２型糖尿病病患之治療 |
| CN104911203A (zh) * | 2015-06-30 | 2015-09-16 | 成都易胜科生物科技有限公司 | 一种重组人胰岛素的工业制备方法 |
| EP3344651B1 (en) | 2015-09-02 | 2022-03-02 | Merck Sharp & Dohme Corp. | A process for obtaining insulin with correctly formed disulfide bonds |
| US10689430B2 (en) | 2016-05-25 | 2020-06-23 | Merck Sharp & Dohme Corp. | Insulin receptor partial agonists |
| WO2018018613A1 (zh) | 2016-07-29 | 2018-02-01 | 广东东阳光药业有限公司 | 一种提高抗体纯度的细胞培养基和培养方法 |
| CN113773391B (zh) * | 2020-06-09 | 2023-10-20 | 宁波鲲鹏生物科技有限公司 | 一种门冬胰岛素的制备方法 |
| CN113773400B (zh) * | 2020-06-09 | 2023-08-18 | 宁波鲲鹏生物科技有限公司 | 一种门冬胰岛素衍生物及其应用 |
| CN113773396A (zh) * | 2020-06-10 | 2021-12-10 | 宁波鲲鹏生物科技有限公司 | 一种地特胰岛素衍生物及其应用 |
Family Cites Families (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| NZ199391A (en) * | 1981-01-02 | 1985-12-13 | Genentech Inc | Chimeric polypeptides comprising a proinsulin sequence,and preparation by recombinant dna technique;production of human insulin |
| DE3501641A1 (de) * | 1985-01-19 | 1986-07-24 | Hoechst Ag, 6230 Frankfurt | Verfahren zur gewinnung von insulin-vorlaeufern aus reaktionsgemischen, die bei der faltung von insulin-vorlaeufern aus den entsprechenden s-sulfonaten anfallen |
| IL95495A (en) * | 1989-08-29 | 1996-10-16 | Hoechst Ag | Fusion proteins their preparation and use |
| DK0600372T3 (da) * | 1992-12-02 | 1997-08-11 | Hoechst Ag | Fremgangsmåde til fremstilling af proinsulin med korrekt forbundne cystinbroer. |
| DE4405179A1 (de) * | 1994-02-18 | 1995-08-24 | Hoechst Ag | Verfahren zur Gewinnung von Insulin mit korrekt verbundenen Cystinbrücken |
| PT871474E (pt) * | 1994-12-29 | 2007-02-28 | Ferring Int Ct Sa | Produção de insulina humana |
| DE19735711C2 (de) * | 1997-08-18 | 2001-04-26 | Aventis Pharma Gmbh | Verfahren zur Herstellung eines Vorläufers von Insulin oder Insulinderivaten mit korrekt verbundenen Cystinbrücken |
-
1997
- 1997-08-18 DE DE19735711A patent/DE19735711C2/de not_active Expired - Lifetime
-
1998
- 1998-08-11 PT PT98115048T patent/PT906918E/pt unknown
- 1998-08-11 DE DE59804121T patent/DE59804121D1/de not_active Expired - Lifetime
- 1998-08-11 DK DK98115048T patent/DK0906918T3/da active
- 1998-08-11 DK DK99115386T patent/DK0980874T3/da active
- 1998-08-11 ES ES99115386T patent/ES2177178T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1998-08-11 DE DE59803985T patent/DE59803985D1/de not_active Expired - Lifetime
- 1998-08-11 AT AT99115386T patent/ATE217012T1/de active
- 1998-08-11 PT PT99115386T patent/PT980874E/pt unknown
- 1998-08-11 EP EP99115386A patent/EP0980874B1/de not_active Expired - Lifetime
- 1998-08-11 EP EP98115048A patent/EP0906918B1/de not_active Expired - Lifetime
- 1998-08-11 AT AT98115048T patent/ATE217636T1/de active
- 1998-08-11 ES ES98115048T patent/ES2176870T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1998-08-14 AR ARP980104052A patent/AR016821A1/es active IP Right Grant
- 1998-08-14 CA CA002245151A patent/CA2245151C/en not_active Expired - Lifetime
- 1998-08-14 ID IDP981136A patent/ID20717A/id unknown
- 1998-08-17 TR TR1998/01587A patent/TR199801587A3/tr unknown
- 1998-08-17 CN CN031523307A patent/CN1483831B/zh not_active Expired - Lifetime
- 1998-08-17 CN CN98117909A patent/CN1132845C/zh not_active Expired - Lifetime
- 1998-08-17 CZ CZ19982598A patent/CZ295679B6/cs not_active IP Right Cessation
- 1998-08-17 BR BR9803755-2A patent/BR9803755A/pt not_active Application Discontinuation
- 1998-08-17 JP JP23036898A patent/JP4291900B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1998-08-17 AU AU80763/98A patent/AU744824B2/en not_active Expired
- 1998-08-17 HU HU0600287A patent/HU228203B1/hu unknown
- 1998-08-17 US US09/134,836 patent/US5986048A/en not_active Expired - Lifetime
- 1998-08-17 HU HU9801886A patent/HU228161B1/hu unknown
- 1998-08-17 CN CN2006101000625A patent/CN101186940B/zh not_active Expired - Lifetime
- 1998-08-17 BR BRPI9816233A patent/BRPI9816233B8/pt not_active IP Right Cessation
- 1998-08-17 RU RU98116259/04A patent/RU2205836C2/ru active
- 1998-08-18 PL PL328108A patent/PL191901B1/pl unknown
- 1998-08-18 KR KR1019980033384A patent/KR100537842B1/ko not_active IP Right Cessation
-
1999
- 1999-08-06 HK HK99103399A patent/HK1018464A1/xx not_active IP Right Cessation
- 1999-08-31 US US09/386,303 patent/US6380355B1/en not_active Expired - Lifetime
-
2001
- 2001-09-07 US US09/947,563 patent/US6727346B2/en not_active Expired - Lifetime
-
2002
- 2002-10-07 RU RU2002126598/15A patent/RU2302882C2/ru active
-
2004
- 2004-07-06 HK HK04104835.7A patent/HK1061870A1/xx not_active IP Right Cessation
-
2005
- 2005-05-27 KR KR1020050044974A patent/KR100574580B1/ko not_active IP Right Cessation
-
2008
- 2008-07-18 HK HK08107963.0A patent/HK1119449A1/xx not_active IP Right Cessation
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| PL191901B1 (pl) | Sposób wytwarzania prekursorów insuliny i pochodnych insuliny | |
| US5352769A (en) | Enzymatic removal of a protein amino-terminal sequence | |
| US5698669A (en) | Tri-arginine insulins | |
| NO318424B1 (no) | Fremgangsmate for isolering av insulin med korrekt koblede cysteinbroer | |
| TW200817432A (en) | Amidated insulin glargine | |
| ZA200106971B (en) | Covalently bridged insulin dimers. | |
| JPH0691834B2 (ja) | インシュリン誘導体の製法 | |
| DK172242B1 (da) | Fremgangsmåde til fremstilling af insulinderivater | |
| IE903978A1 (en) | Novel insulin derivatives, process for their preparation,¹their use and a pharmaceutical preparation containing them | |
| HU205145B (en) | Process for producing new superactive insulin analogs and pharmaceutical compositions comprising same as active ingredient | |
| EP0017938A1 (en) | Process for preparing a B30-threonine insulin | |
| JP5743370B2 (ja) | 改善されたフォールディングの空気ガス処理によってインスリンを抽出する方法 | |
| HRP940766A2 (en) | Enzymatic process for conversion of preproinsulin to insulin | |
| MXPA98006666A (en) | Improved procedure for the obtaining of insulin precursors with cistina bridges correctly uni |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| RECP | Rectifications of patent specification |