PT871474E - Produção de insulina humana - Google Patents

Description

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PRODUÇÃO DE INSULINA HUMANA

Antecedentes da Invenção

Ao longo da presente descrição, vão ser referenciadas várias publicações por meio de números números arábicos em parêntesis. As citações completas destas referências podem ser encontradas no fim da descrição, precedendo imedíatamente as reivindicações. A insulina é uma hormona constituída por um polipeptídeo essencial para o controlo do metabolismo da glicose e é administrada diariamente a pacientes que sofrem de diabetes mellitus, um distúrbio metabólico caracterizado por um fornecimento inadequado de insulina.

In vivo, a hormona é sintetizada em primeiro lugar como uma molécula percursora longa, processada subsequentemente para a sua forma activa sob o ponto de vista biológico, que consiste numa cadeia A e numa cadeia B. Com mais detalhe, o gene para a pré-pró-insulina está transcrito nas células beta do pâncreas endócrino num percursor de ARNm, que é então seccionado para produzir o ARNm maduro. Este ARNm é traduzido na pré-pró-insulina (NH2-pré-região-B cadeia C péptido-A cadeia-COOH) , que é tratado sequencialmente originando pró-insulina e finalmente originando a insulina. A primeira etapa no processamento e a eliminação proteolítica da pré-região; que serve como uma sequência de sinal hidrofóbica para a transferência da cadeia nascente através das membranas microsomais do retículo endoplasmático rugoso. Na pré-pró-insulina humana, o comprimento da pré-região é de 24 arriínoácidos. 1/50

Na pró-insulina, as duas regiões na cadeia do polipeptideo que se vão transformar na insulina madura, as cadeias B e A, estão ligadas uma à outra pelo péptido C (ou pela cadeia C), que compreende, nas terminações de N e C, dois pares de aminoácidos básicos. Na maior parte dos péptidos C, estes pares são Arg-Arg e Lys-Arg. 0 péptido C humano, incluindo os dois pares de aminoácidos básicos de flanqueio, contêm 35 aminoácidos. 0 péptido C liga as duas porções do polipeptideo de modo a ajudar na formação de uma ponte apropriada de disulfureto entre os segmentos B e A. Por isso, 0 papel do péptido C não depende em grande parte da sua estrutura. De facto, a sua substituição por uma ponte sintética mais curta, ainda permite uma dobragem apropriada da molécula de pró-insulina (1,2). A pró-insulina duplica com a concomitante oxidação de duas ligações de di-sulfureto inter-cadeias e uma ligação de disulfureto dentro da cadeia A. Na última etapa de maturação, as enzimas proteolíticas clivam nos aminoácidos básicos para libertar o péptido C e formar a insulina madura (3). Na insulina humana, a cadeia A tem 21 aminoácidos de comprimento, enquanto a cadeia B tem 30 aminoácidos de comprimento. A procura mundial de insulina excede várias toneladas anualmente e há uma falta severa de abastecimento. Normalmente, a insulina foi produzida a partir de fontes animais limitadas, principalmente a partir de preparações pancredticas de bovinos e de sumos, que diferem 0¾ insulina humana e podem provocar uma reacção imunitária adversa.

Estudos realizados durante os anos 60 demonstraram a produção in vitro de insulina. A síntese da insulina foi 2/50 conseguida por meio da combinação das cadeias A e B nas suas formas S-sulfonadas (4) ou por meio da re-oxidação espontânea de pró-insulina reduzida (5). Este último processo não era prático para a produção de insulina em grande escala, devido à concentração muito baixa de proteína na mistura de oxidação. A insulina pode subsequentemente ser recuperada no seguimento do tratamento com tripsina e carboxipeptidase B (6). A insulina humana semi-sintética e bio-sintética (recombinante), tornou-se disponível recentemente. A insulina humana semi-sintética é produzida a partir de insulina de suínos, por meio da troca catalisada por tripsina de alanina com treonina na posição 30 da cadeia B (a única diferença entre a insulina de suínos e humana). A insulina humana recombinante produzida quer em E. coli ou em levedura, irá eventualmente substituir outras vias de produção. A insulina humana recombinante bio-sintética, é actualmente fabricada por duas vias: quer produzindo as cadeias A e B separadamente em E. coli e combinando-as subsequentemente (7,8) ou por conversão enzimática da pró-insulina como polipeptídeos expressos quer em E. coli (1,8) ou em leveduras (2,9).

Na maior parte dos casos, a pró—insulina @ produzida como uma proteína híbrida que se acumula como uma proteína precipitada xntracelular. Este híbrido é normaImente purificado e criva-se por meio de CNBr de modo a libertar o poiípeptxdeu de pró—insulina. Este ultimo é ainda modi1içado por sulfitolise oxidativa pare originar o 8— sulfonato de pró-insulina. 0 S-sulfonato cie pró—insulina é então purificado e duplicado, em condições redutoras, para 3/50 originar a pró-insulina (8). A conversão da pró-insulina em insulina consegue-se por meio da acção combinada de tripsína e carboxipeptidase B (6). A publicação da patente de invenção europeia N°. EP 195691 Bl, atribuída a Novo Nordísk A/S, descreve uma pró-insulina de fórmula B-Lys-Arg-A e a sua utilização para a preparação de insulina em levedura. A publicação da patente de invenção europeia N°. EP 196056 Bl, atribuída a Chiron Corp., descreve uma proteína de hSGD-pró-insulina produzida por meio de levedura. A proteína hSOD-pró-insulina é submetida a uma clivagem por meio de brometo de cianogénio e sulfitólise antes da dobragem. A Hoechst descreve na publicação da EPO N°. 379162 que "recombínantes falsos de percursores de insulina" (isto é, produtos de insulina recombinante com pontes de di-sulfureto intermoleculares incorrectas ou parcialmente incorrectas), podem ser convertidos em produtos "correctos" de insulina sem sulfitólise, por meio da reacção de falsos recombínantes com um excesso de mercaptano num meio aquoso, na presença de um sistema orgânico de oxidação - redução. A etapa original de sulfitólise tem lugar após o aminoácido ou o radical de péptido ser clivado (quimicamente ou enzimaticamente) a partir do polipeptídeo de fusão (que tem lugar após a lise da célula hospedeira) dado que as seis cisteínas do percursor de insulina são convertidas nos seus S-sulfonatos. Numa etapa de renaturação subsequente, produz-se uma pró-insulina natural a partir deste S-sulfonato de pró-insulina, por meio da formação de três pontes de di-sulfureto correctas. Durante esta etapa de 4/50 renaturação, produzem-se os chamados "recombinantes falsos". A Hoechst ainda descreve na publicação da patente de invenção internacional PCT N°. WO 91/03550, um processo para a preparação de proteínas de fusão contendo uma proteína desejada (por exemplo, pró-insulina) e um "constituinte de lastro". A sulfitólise realiza-se antes da dobragem, enquanto que o "constituinte de lastro" é clivado concomitantemente com a cadeia C da pró-insulina, após a dobragem.

Além disso, a Hoechst descreve na patente de invenção europeia N°. EP 347781 Bl, uma "mini-pró-insulina" (B-Arg- A) e a sua utilização para a preparação da insulina de mono-Arg e da insulina. Eles descrevem ainda proteínas de fusãc que compreendem B-Arg-A e um "constituinte de lastro". 0 "constituinte de lastro" é clivado por meio de brometo de cianogénio e a sulfitólise é realizada antes da dobragem do polipeptídeo. A presente invenção descreve a produção de insulina humana recombinante através de um processo melhorado e eficaz. Os polipeptídeos híbridos de pró-insulina recombinante que compreendem uma sequência líder, são sintetizados em E. coli, Após a purificação parcial, eles são dobrados com o péptido líder ainda ligado em condições que permitem uma dobragem correcta. A insulina humana activa sob o ponto de vista biológico é então produzida por meio de um tratamento combinado com tripsina e carboxipeptidase B em que estas enzimas clivam o péptido líder e a cadeia C concomitantemente. A insulina humana purificada assim produzida é idêntica à insulina humana de ocorrência natural. 5/50

Os processos perigosos e morosos envolvidos na clivagem dos polipeptideos híbridos por CNBr e na sulfitólise, utilizados para proteger os grupos SH abundantes estão excluídos deste novo processo dado que todo o polipeptídeo híbrido de pró-insulina pode dobrar-se eficientemente de modo a produzir a sua estrutura original mesmo na presença do péptido líder e dos resíduos de cisteína não protegidos. A insulina humana recombinante, activa, é libertada por clivagem enzimática e é depois purificada.

Breve Descrição das Figuras

Os mapas de restrição para os três plasmidos mostrados nas figuras 3-5 não identificam todos os sítios de restrição presentes nestes plasmidos. Contudo, os sítios de restrição necessários para uma compreensão completa da presente invenção estão identificados.

Figura 1: Produção de insulina humana por clivagem enzimática do polipeptídeo híbrido de pró-insulina ligado a di-sulfureto e dobrado, produzido peia expressão do plasmido pBAST-R. Apenas se indica uma parte da sequência líder de SOD.

Figura 2: Produção de insulina humana por clivagem enzimática do polipeptídeo híbrido de pró-insulina iicrado a di-sulfureto e dobrado, produzido pela expressão dos plasmidos pDBAST-LAT ou pABAST-LAT. Apenas se indica uma parte da sequência líder de SOD.

Figura 3: Estrutura do plasmido pBAST-R, um plasmido de expressão que codifica um polipeptídeo híbrido de SOD-pró-insulina depositado na ATCC, com o número de acesso da áTCC 69362. 6/50

Fxgura 4: Estrutura do plasmido pDBAST-LAT, um plasmido de expressão que codifica um poiipeptideo híbrido de SOD-pró-insulma depositado na ATCC, com o número de acesso da ATCC 69361.

Figura 5: Estrutura do plasmido pABAST-LAT, um plasmido de expressão que codifica um poiipeptideo híbrido de SOD-pró-insulina depositado na ATCC, com o número de acesso da ATCC 69363.

Figura 6: Aminoácido e correspondente sequência de nucleótidos do ADN do poiipeptideo híbrido de SOD-pró-insulina expresso pelo plasmido pBAST-R.

Figura 7: Aminoácido e correspondente sequência de nucleótidos do ADN do poiipeptideo híbrido de SOD-pró-insulina expressa pelos plasmidos pDBAST-LAT e pABAST-LAT.

Figura 8: Produção de insulina humana, a partir do poiipeptideo híbrido de pró-insulina expresso pelo plasmido pBAST-R, como função do pH da mistura de dobragem A dobragem do poiipeptideo híbrido de pró-insulina (produzido tal como se descreve no exemplo 2), foi realizada a vários pH'S tal como indicado num tampão de glicina 100 mH, a 4°C, durante cerca de 16 horas, quer com 1 mg/mL ou 0,5 mg/mL do poiipeptideo híbrido. O material dobrado foi tratado com tripsina (1:500 p/p) (Sigma) e carboxipeptidase B (CPB, Sigma, 1:200 p/p) r durante 30 minutos, a b7 °çf a pH 9 e foi analisado quanto a insulina imunoreactiva (ir) pQr meio de um ensaio radio-imunitário, utilizando !-insulina (Amersham) e insulina humana recombinanle (Calbiochem) como padrão. 7/50

Figura 9: Produção de insulina humana a partir do polipeptídeo híbrido de pró-insulina, expresso pelo plasmido pBAST-LAT 0 polipeptídeo híbrido de pró-insulina (produzido como se descreveu no exemplo 2) foi dissolvido em ureia 8 M, HC1 5 mM, a uma concentração de cerca de 30 mg/ml e diluído para 1 mg/ml em glicina-NaOH 100 mM, a pH 11.0. A dobragem foi realizada a 22°C (temperatura ambiente), durante 20 horas. A solução foi então ajustada para pH 8,8 com HC|. Adicionou-se carboxipeptidase B (1:1.000 p/p, Sigma) e trípsina (1:2.000 p/p, Sigma) e incubou-se a mistura reaccional a 37°C, durante 60 minutos. Acidificaram-se as misturas de digestão para pH 3 antes de se diluírem com HC| 10 mM. Alí quotas de 150 μΐ foram analisadas por cromatografia líquida de alta pressão de fase reversa (RP-HPLC) numa coluna 100 RP-8 Lichrosphere de 5 μ, de 250x4 mm (Merck) que foi equilibrada com fosfato de tetraetilamónio 50 mM, NaCICh 162mM, pH 3, contendo 31,5% (v/v) de acetonitríla. Desenvolveu-se a coluna com um gradiente linear de acetonitrilo a 31,5-40,5% durante 75 minutos, a uma velocidade de fluxo de 1 ml/minuto. Monitorizou-se a absorvência a 220 nm. A: 5 pg de insulina padrão (Boehringer Mannheim); B: insulina humana recombinante produzida seguindo o tratamento enzimático; C: polipeptídeo híbrido de SOD-pró-insulina dobrado.

Figura 10: Produção de insulina humana a partir do polipeptídeo híbrido de pró-insulina, expresso pelo 8/50 plasmído pDBAST-LAT como uma função do pH na mistura de dobragem

Diluiu-se o polipeptídeo híbrido de pró-insulina (produzido como descrito no exemplo 2) com 1 mg/ml em tampão de glicina-NaOH 100 mM, com os valores de pH indicados e formatou-se a 22 °C, durante 16 horas. 0 tratamento enzimático e a análise por RP-HPLC, foi realizado como se descreveu na figura 9. A quantidade de insulina humana recombinante produzida a partir do polipeptídeo híbrido, foi calculada de acordo com a área do pico que tinha o mesmo tempo de retenção que a insulina padrão.

Figura 11: Produção de insulina humana a partir do polipeptídeo híbrido de pró-insulina, expresso pelo plasmido pDBAST-LAT como função da concentração de ácido ascórbico na mistura de dobragem

Realizou-se a dobragem do polipeptídeo híbrido de SOD-pró-insuiina (produzido como descrito no exemplo 2) com 1 mg/ml de glicina-NaOH 100 mM, a 22°C, a pH 11,2, na presença das concentrações de ácido ascórbico indicadas. Trataram-se as amostras com tripsina e carboxipeptidase B (como na figura 9) após períodos de dobragem de 5 e 25 horas. A produção de insulina humana recombinante foi analisada em RP-HPLC (tal como na figura 9).

Figura 12: Autenticidade da insulina humana produzida a partir do polipeptídeo híbrido de pró-insulina, expresso pelo plasmido pDBAST-LAT

Realizou-se a dobragem do polipeptídeo híbrido de SOD-pró-insulina (produzido como descrito no exemplo 2) com 1 mg/ml de glicina-NaOH 100 mM, a pH 11,2 e ácido ascórbico 1,2 mM, 9/50 a 22°C, durante 16 horas. No seguimento do tratamento enzimático (tal como na figura 9), fez-se a cromatografia da mistura numa coluna de DEAE-sefarose equilibrada em Tris-HCl 20 mM, a pH 8. Eluiu-se a insulina humana recombinante com um gradiente linear de NaCi 0-0,4 M, no seio de Tris-HCl 20 mM, a pH 8. Juntaram-se as fracções dos picos e acidificaram-se com HC1 até ao pH 3. A insulina humana recombinante foi depois purificada das moléculas semelhantes à insulina por meio de RP-HPLC, tal como descrito na figura 9. Recolheu-se o pico principal, dessalinizou-se numa coluna G-25 de Sephadex, no meio de ácido acético 0,25 M e iiofilizou-se. Prepararam-se amostras (5 pg de insulina humana recombinante), no meio HC1 10 mM e analisaram-se por RP-HPLC nas mesmas condições. A: insulina padrão; B: insulina humana recombinante purificada por HPLC; C: amostra combinada de insulina humana recombinante purificada por HPLC e insulina padrão.

Figura 13: Produção de insulina humana a partir do polipeptideo híbrido de pró-insulina expresso pelo plasmido pDBAST-LAT como função da concentração de proteína na mistura de dobragem

Duplicou-se o polipeptideo híbrido de SOD-pró-insulina (produzido como descrito no exemplo 2) no meio de glicina-

NaOH 100 mM, a pH 11,2, numa concentração final de proteína de 0,5 mg/ml até 10 mg/ml conforme indicado. Cada mistura de dobragem foi complementada com 2,5 moles de ácido ascórbico por mole do grupo SH. Realizou-se a dobragem a 24°C (temperatura ambiente), durante 16 horas. O tratamento 10/50 enzimático e a análise por RP-HPLC, foram realizados tal como se descreveu para a figura 9.

Figura 14: Produção de insulina humana a partir do polipeptídeo híbrido de pró-insulina, expresso pelo plasmido pDBAST-LAT a partir do precipitado intracelular impuro como função do tempo de dobragem

Dissolveu-se o precipitado intracelular no meio de glicina-NAOH 20 mM, EDTA 33 μΜ, a pH 11,2, a uma concentração de cerca de 2,6 A28o por ml. Ajustou-se o pH para 12 com hidróxido de sódio 10 N. Deixou-se a solução em agitação durante 10 minutos. Titulou-se o pH para 11,2 com ácido clorídrico concentrado. Adicionou-se carvão activado (lavado com ácido, Sigma) até a uma concentração final de 0,1% p/v e agitou-se a mistura durante 30 minutos. Centrifugou-se a suspensão (20 minutos, 12.000 rpm), a 20°C. 0 sobrenadante clarificado tinha um A2eo de cerca de 2,15. Complementou-se o ácido ascórbico até a uma concentração final de 3 mM. Realizou-se a dobragem do polipeptídeo híbrido de pró-insulina como se mostrou antes, com agitação vigorosa, à temperatura ambiente (22-23°C). Em vários momentos ao longo da experiência (começando com a dissolução) retiraram-se aliquotas de 10 ml, titularam-se para pH 8,8 e dissolveram-se em carboxípeptidase B (1:1000 p/p) e tripsina (1:2000 p/p), durante 1 hora, a 37°C, na presença de ZnCl2 50 μΜ. A digestão terminou por acidificação. O teor em insulina de cada amostra digerida foi determinado por análise de RP-HPLC, conforme descrito na figura 9. O progresso da reacção de dobragem manifesta-se pelo aumento da insulina (após digestão) e a diminuição do nível de grupos de tiol livres, sendo estes últimos analisados por meio da reacção de Ellman (16). 11/50

Sumário da Invenção A presente invenção tem por objecto um processo de produção de insulina humana, tal como descrito nas reivindicações, que compreende a dobragem de um polipeptídeo híbrido compreendendo pró-insulina, nas condições que permitem uma correcta formação da ligação de di-sulfureto, submetendo o polipeptídeo híbrido ligado por di-sulfureto e dobrado a uma clivagem enzimática para produzir insulina humana activa e purificando a insulina humana activa.

Também tem por objecto um polipeptídeo que compreende pró-insulina e um péptido líder ligado à terminação N da pró-insulina, em que o polipeptídeo é duplicado e contém as ligações de di-sulfureto correctas.

Descrição Detalhada da Invenção

Os plasmidos pBAST-R, pDBAST-LAT e pABAST-LAT foram depositados em E. coli em satisfação dos requisitos do Tratado de Budapeste no Reconhecimento Internacional do Depósito de Microrganismos, para os Propósitos de Processos de Patentes de Invenção na American Type Culture Collection (ATCC), 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852 com os números de acesso da ATCC 69362, 69361 e 69363, respectivamente, em 26 de Julho de 1993.

Tal como se utiliza aqui, um polipeptídeo híbrido compreende um péptido líder ligado covalentemente ao polipeptídeo desejado. O polipeptídeo híbrido da presente invenção compreende pró-insulina, e preferencialmente, compreende SOD como o péptido líder. 12/50 xai como se utiliza aqui, a dobragem compreende a dobragem de um polipeptídeo híbrido que compreende pró-insulina sem a clivagem de CNBr antes da dobragem e sem a sulfitólise antes da dooragem para proteger os grupos SH, em que a dobragem permite a formação correcta das fontes de ligação de di-sulfureto no polipeptídeo híbrido.

Tal como se utiliza aqui, a formação correcta da ligação de di-sulfureto do polipeptídeo híbrido compreende a formação de três ligações de di-sulfureto entre CiSB7 -CiSA7, CiSB19-CiS^20 e CiS^-Cis^1 de insulina (os resíduos de Cis estão numerados de acordo com a sua numeração na insulina madura).

Tal como se utiliza aqui, pró-insulina compreende um polipeptídeo, que compreende desde a ordem da terminação N até à terminação C, as cadeias B, C e A de insulina.

Tal como se utiliza aqui, o péptido de cadeia C de insulina compreende o péptido C de ocorrência natural e qualquer outro oligopéptido, dipéptido ou um simples aminoácido que possa ser clivado peia tripsina e pela carboxipeptidase B.

Tal como se utiliza aqui, um péptido líder compreende qualquer péptido ou polipeptídeo ligado covaientemente à cadeia B da insulina, que permite a dobragem e a formação da ligação de di-sulfureto e que pode ser clivado por meio de tripsina. 0 péptido líder é preferencialmente SOD.

Tal como se utiliza aqui, SOD compreende qualquer parte substancial da sequência de arciinoácídos de CuZnSOD ou MnSOD e a referida parte não tem necessariamente a actividade biológica de SOD nem tem necessariamente a sequência de aminoácidos idêntica dessa parte comparada com a sequência 13/50 de aminoácidos de SOD de ocorrência natural. O ADN que codifica SOD pode ser mutável por processos conhecidos pelos especialistas na matéria, por exemplo, Bauer et al. (1985), Gene 37:73-81. 0 péptido líder pode compreender, em vez de SOD, qualquer outro péptido, polipeptídeo ou proteína ou qualquer parte substancial da sequência de aminoácidos desse péptido, polipeptídeo ou proteína, em que a referida parte não tem necessariamente a actividade biológica do referido péptido, polipeptídeo ou proteína, nem tem necessariamente a sequência de aminoácidos idêntica dessa parte comparada com a sequência de aminoácidos do péptido, polipeptídeo ou proteína de ocorrência natural; contudo, o péptido líder deve permitir a dobragem e a formação correcta da ligação de dí-sulfureto do polipeptídeo híbrido.

Tal como se utiliza aqui, a insulina pode compreender um homólogo de insulina de ocorrência natural.

Tal como se utiliza aqui, a pró-insulina pode compreender um homólogo de insulina de ocorrência natural.

Tal como se utiliza aqui, o termo "homólogo" referido ao polipeptídeo de insulina produzido pelos processos da presente invenção, é um polipeptídeo que tem praticamente a mesma sequência de aminoácidos e praticamente a mesma actividade biológica que a insulina. Assim, um homólogo, pode diferir do polipeptídeo de insulina produzido pelos processos da presente invenção, por meio da adição, eliminação ou substituição de um ou mais dos resíduos de aminoácidos não essenciais, desde que o polipeptídeo resultante retenha a actividade biológica da insulina. Os especialistas na matéria podem facilmente determinar quais 14/50 os resíduos de aminoácidos que podem ser adicionados, eliminados ou substituídos (incluindo quais os aminoácidos a que se pode fazer essas substituições) utilizando processos conhecidos, bem estabelecidos, incluindo, por exemplo, processos convencionais para o desenho e produção de sequências de ADN que codificam para a expressão bacteriana de homólogos de péptidos do polipeptídeo em causa, a modificação do cADN e das sequências genómicas por meio de técnicas de mutagénese dirigidas ao sítio, a construção de proteínas recombinantes e vectores de expressão, a expressão bacteriana dos polipeptídeos e a medição da actividade bioquímica dos polipeptídeos utilizando ensaios bioquímicos convencionais. A definição anterior de homólogos de insulina aplica-se igualmente aos homólogos de pró-insulina.

Exemplos de homólogos de insulina produzidos pelos processos da presente invenção, são homólogos de eliminação contendo menos do que todos os resíduos de insulina de ocorrência natural, homólogos de substituição em que um ou mais resíduos especificados são substituídos por outros resíduos e homólogos de adição em que um ou mais resíduos de aminoácidos são adicionados a uma porção terminal ou média do polipeptídeo de insulina, sendo que todos eles partilham a actividade biológica da insulina.

Exemplos de homólogos são os análogos de insulina descritos no pedido de patente de invenção europeia N°. EP 384472 e também o análogo de insulina "Humalog" da Eli Lilly, tal como descrito em "Eli Lilly and Company Repor t to Shareholders 1992". 15/50

Praticamente a mesma sequência de aminoácidos é aqui definida como englobando as substituições e/ou as eliminações e/ou as adições de aminoácidos na sequência de aminoácidos e pode englobar até dez (10) resíduos de acordo com os grupos homólogos ou equivalentes, conforme descrito, por exemplo, por Albert L, Lehninger, Biochemistry, 2a edição, Worth Publishers Inc. (1975), Capítulo 4 ; Creighton, proteín Structure, a Practical Approach, IRL Press at Oxford University Press, Oxford, England (1989); e Margaret 0. Dayhoff, Atlas of Proteín Sequence and Structure, Volume 5, The National Biomedical Research Foundation (1972), Capítulo 9. Essas substituições são conhecidas pelos especialistas na matéria. 0 ADN que codifica o polipeptídeo de insulina pode ser mutável por processos conhecidos pelos especialistas na matéria, por exemplo, Bauer et al. (1985), Gene 37: 73-81. A sequência mutável pode ser inserida nos vectores de expressão apropriados, conforme descrito aqui, que são introduzidos em células, que são depois tratadas de tal maneira que o ADN mutável dirige a expressão do homólogo do polipeptídeo.

Os plasmidos da presente invenção compreendem uma sequência que codifica um polipeptídeo híbrido, que compreende a pró-insulina e podem ser adaptados para expressão em bactérias, leveduras, fungos ou células de mamíferos, tais como, OHC, embrião de galinha, fibroblastos ou outras linhas de células conhecidas que compreendem, adicionalmente, os elementos reguladores necessários para a expressão do gene clonado nas bactérias, leveduras, fungos ou células de mamíferos, assim localizados relativamente aos ácidos nucleicos que codificam o polipeptídeo híbrido, de modo a permitir a sua expressão. Os elementos reguladores 16/50 necessários para a expressão incluem sequências promotoras para ligar a ARN polimerase e um sítio de ligação ribossómico para a ligação do ribossoma.

Os plasmidos da presente invenção expressam um polipeptídeo híbrido que compreende pró-insulina.

Os especialistas na matéria compreenderão que os plasmidos depositados em relação com este pedido de patente de invenção, podem ser facilmente alterados por técnicas conhecidas (por exemplo, por mutagénese dirigida ao sítio ou por inserção de ligantes) para codificar a expressão de polipeptídeos homólogos. Essas técnicas estão descritas, por exemplo, em Sambrook, J., Fritsch, E.F. e Maniatis, T. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2a edição, Cold Spríng Harbor Laboratory Press.

Os elementos reguladores apropriados estão posicionados dentro do plasmido em relação ao ADN que codifica o polipeptídeo híbrido que compreende a pró-insulina, de tal modo que efectuem a expressão do polipeptídeo híbrido numa célula hospedeira apropriada. Nas realizações preferidas da presente invenção, os elementos reguladores estão posicionados próximo e a montante do ADN que codifica o polipeptídeo híbrido.

Também estão incluídos no âmbito da presente invenção, vários sítios de ligação de ribossomas (SLRs) para tornar o ARNm transcrito do ADN que codifica um polipeptídeo híbrido que compreende a pró-insulina, capaz de se ligar aos ribossomas dentro da célula hospedeira, tal como, o SLR deo. 17/50

Os piasmidos da presente invenção também contêm um codão de iniciação de ATG. 0 ADN que codifica o polipeptideo híbrido que compreende a pró-insulina está em fase com o codão de iniciação de ATG.

Os piasmidos da presente invenção também incluem uma sequência de ADN que compreende uma origem de replicação a partir de um plasmido bacteriano capaz de replicar de forma autónoma na célula hospedeira. As origens de replicação apropriadas podem ser obtidas de numerosas fontes, tais como, o plasmido pBR322 (número de acesso na ATCC 37017).

Os piasmidos da presente invenção também incluem uma sequência de ADN que contém um gene associado com um traço fenotípico seleccionável ou identificável, que se manifesta quando o plasmido está presente na célula hospedeira tal como um gene resistente a fármacos, por exemplo, resistente a ampicilina, cloranfenicol ou tetraciclina.

Exemplos de vectores que podem ser utilizados para expressar o ácido nucleico que codifica os polipeptídeos híbridos (que compreendem a pró-insulina) são vírus, tais como, vírus bacterianos, por exemplo, bacteriófagos (tal como, o fago lambda), cósmidos, piasmidos e outros vectores. Os genes que codificam os polipeptídeos híbridos que compreendem a pró-insulina, são inseridos em vectores apropriados por processos bem conhecidos na técnica. Por exemplo, utilizando sítios de restrição convencionais da enzima endonuclease, as inserções e o ADN do vector podem ambos ser clivados para criar extremidades complementares que emparelham as suas bases uma com a outra e são então ligadas em conjunto com uma lígase do ADN. Alternativamente, lígantes sintéticos comportando sequências de bases complementares a um sítio de restrição 18/50 no ADN do vector, podem ser ligados ao ADN de inserção que é então digerido com a enzima de restrição que corta nesse sítio. Estão disponíveis outros meios.

As células hospedeiras bacterianas preferidas são as células de E. coli. Exemplos de células de E. coli apropriadas são as estirpes S0733 (cytRstrA) ou 4300, mas outras estirpes de E. coli e outras bactérias podem também ser utilizadas como hospedeiros para os plasmidos.

As bactérias utilizadas como hospedeiros podem ser qualquer estirpe incluindo estirpes auxotróficas (tais como, A1645), prototróficas (tais como, A4255) e estirpes líticas; estirpes F+ e F~; estirpes que comportam a sequência repressora de c|857 do pró-fago λ (tal como, AI645 e A4255) e estirpes que derivam dos repressores de deo e/ou do gene de deo (ver pedido de patente de invenção europeia publicado N°. 0303972, publicado em 22 de Fevereiro de 1989) . A estirpe S0733 de E. coli e a estirpe 4300 de E. coli, foram depositadas na ATCC com os números de acesso 69361 e 69363, respectivamente.

Todas as estirpes hospedeiras de E. coli descritas antes podem ser "curadas" dos plasmidos que elas comportam por processos bem conhecidos na técnica, por exemplo, o processo de brometo de etidio descrito por R.P. Novick em Bacteriol. Keview 33, 210 (1969). A presente invenção tem por objecto um processo de produção de insulina que compreende (a) o tratamento de uma célula bacteriana contendo o ADN que codifica um polipeptídeo híbrido que compreende pró-insulina, de modo que o ADN dirija a sua expressão e a recuperação do polipeptídeo híbrido a partir da célula; (b) dobragem do referido 19/50 polipeptídeo híbrido compreendendo a pró-insulina sem submeter primeiro o polipeptídeo híbrido à sulfitólise em condições que permitam a correcta formação da ligação de di-sulfureto, em que as referidas condições compreendem um pH de cerca 8,5-12,0; (c) submetendo o polipeptídeo híbrido ligado por di-sulfureto, dobrado, resultante a clivagem enzimática para produzir insulina; (d) purificação da insulina assim produzida. A insulina tem a actividade e as propriedades da insulina humana disponível comercialmente.

Numa realização preferida, a dobragem compreende a incubação do polipeptídeo híbrido a cerca de 4-37 °'C, durante um período de cerca de 1-30 horas.

Numa outra realização preferida, a dobragem compreende a incubação do polipeptídeo híbrido a cerca de 4-37°C, durante um período de cerca de 1-30 horas, a um pH de cerca de 8,5-12,0, na presença de ácido ascórbico.

Numa realização especialmente preferida, o pH durante a dobragem é de 11,0-11,25.

Numa outra realização especialmente preferida, a concentração de ácido ascórbico é de cerca de 2 moles por mole de grupo SH presente na mistura de dobragem.

Ainda noutra realização, o período de incubação é de cerca de 5 horas.

Numa outra realização, o processo compreende o ajustamento do pH para cerca de 8,8-9,0 e a clivagem do polipeptídeo híbrido com tripsina e carboxipeptidase B a 16-37°C, durante cerca de 30 minutos a 16 horas. 20/50

Numa outra realização, a purificação compreende uma cromatografia com DEAE-sefarose e RP-HPLC.

Ainda noutra realização, a purificação compreende ainda a ultrafiltração e a cromatografía em CM-sefarose.

Numa realização especialmente preferida, a purificação compreende ainda a cromatografia em DEAE-sefarose e a cromatografia em fenil-sefarose.

Numa realização especialmente preferida, o polipeptídeo híbrido é expresso pelo plasmido pDBAST-LAT depositado sob o número de acesso da ATCCC 69361.

Numa realização especialmente preferida, o polipeptídeo híbrido é expresso pelo plasmido pABAST-LAT depositado sob o número de acesso da ATCCC 69363.

Numa realização especialmente preferida, o polipeptídeo híbrido é expresso pelo plasmido pBAST-R depositado sob o número de acesso da ATCCC 69362.

Numa realização preferida, o polipeptídeo híbrido obtém-se por tratamento de uma célula bacteriana contendo ADN que codifica o polipeptídeo híbrido, de modo que o ADN dirige a sua expressão e a recuperação do polipeptídeo híbrido a partir da célula.

Pretende-se que o tratamento compreenda a fermentação na presença de glicose, glicerol ou galactose.

Pretende-se ainda que a recuperação do polipeptídeo híbrido a partir da célula compreenda o rompimento da parede da célula bacteriana ou dos seus fragmentos, para produzir um 21/50 lisado, isolando o precipitado intracelular a partir do lisado por meio de centrifugação, solubilização do precipitado, eventualmente, purificação do polipeptídeo híbrido por cromatografia ou ultrafiltração.

Também se descreve aqui um polipeptídeo que compreende pró-insulina e um péptido líder ligado à terminação N da pró-insulina, em que o polipeptídeo é duplicado e contém as ligações de di-sulfureto correctas. 0 péptido líder pode derivar da terminação N de CuZnSOD. 0 péptido líder pode compreender 62 aminoácidos, sendo precedido do aminoácido Met e seguido de um resíduo de Arg. A pró-insulina pode compreender a cadeia B de insulina ligada à cadeia A de insulina por apenas um resíduo de Arg.

Alternativamente, a pró-insulina pode compreender a cadeia B da insulina ligada à cadeia A da insulina pelo dipéptido Lis-Arg.

As duas moléculas de pró-insulina anteriores, têm de ser produzidas como proteínas híbridas, caso contrário, os níveis de expressão são extremamente baixos e não têm significado comercial.

Os resíduos de cisteína do péptido líder podem ser substituídos por resíduos de serina.

Exemplos

Os exemplos que se seguem foram estabelecidos para ajudar na compreensão da presente invenção, mas não pretendem e 22/50 não foram construídos de modo a limitar, de alguma forma, o seu âmbito. Os exemplos não incluem descrições detalhadas para processos convencionais utilizados na construção de vectores, a inserção de genes que codificam polipeptideos nesses vectores ou a introdução dos piasmidos resultantes em hospedeiros. Os exemplos também não incluem a descrição detalhada de processos convencionais, utilizados para a avaliação dos polipeptideos produzidos por essos sistemas de vectores hospedeiros. Esses processos são bem conhecidos pelos especialistas na matéria e estão descritos em numerosas publicações incluindo, a título de exemplo, o seguinte:

Sambrook, J., Frítsch, E.F. e Maniatis, T. (1989) Molecular Cloning: A Laboratorv Manual, 2a edição, Cold Spríng Harbor Laboratory Press.

Exemplo 1

Construção da produção de piasmidos pBAST-R, pDBAST-LAT e plBAST-LAT expressando polipeptideos híbridos de pró-

insulina-SOD

Vectores de expressão bacteriana, que superproduzem proteínas híbridas em E. coli, sob o controlo tanto do promotor PiP2 deo como XPL, foram construídos. A pró- insulina foi produzida como uma proteína híbrida, uma vez que se verificou que a bactéria que abriga um vector de expressão que codifica a cadeia A de insulina Lis-Arg - cadeia B de insulina não produziu nenhum polipeptídeo detectável. As proteínas híbridas compreendem um péptido líder, 62 aminoãcidos longos, derivados da terminação N de CuZnSOD (11), precedidos na terminação N por um resíduo de Met e seguidos na terminação C por um resíduo de Arg 23/50 ligando o mesmo à cadeia B de insulina. A cadeia B de insulina é ligada à cadeia A de insulina por um péptido de cadeia C curto consistindo em Lis-Arg ou Arg. As duas cisteínas originalmente presentes na porção de SOD foram substituídas por resíduos de serina.

A. Plasmido pBAST-R

Uma série de plasmidos foi construída, culminando em pBAST-R, em que, no momento da transformação de células hospedeiras de E. coli apropriadas, foi capaz de conduzir a expressão eficaz de um polipeptídeo híbrido de pró-insulina, utilizável para a produção de insulina humana. A estrutura do plasmido pBAST-R, codificando um polipeptídeo híbrido da cadeia A de insulina Lis-Arg-cadeia B de insulína-SOD é mostrada na figura 3; a sequência de ADN e sequência de aminoácidos correspondente do polipeptídeo híbrido são mostradas na figura 6. 0 plasmido pBAST-R tem cerca de 4380 bp de comprimento e compreende os seguintes elementos (no sentido da direeção anti-horário): 1. Um fragmento de ADN, 1521 bp de comprimento, sítios Aat||-Msc| de transposição em pBR322, que inclui o gene de resistência à tetraciclina, 2. Um fragmento de ADN, 1497 bp de comprimento, sítios Sca|-Hae|1 de transposição em pBR322, que inclui um gene de resistência à ampicilina truncado e a origem de replicação de ADN. 24/50 sítios 3. Um fragmento de ADN, 930 bp de comprimento, Avafl-Ndef de transposição em ADN de E. coli, que inclui os promotores PXP2 deo e sítio de ligação ribossómica (RBS) (13) . 4. Um fragmento de ADN, 188 bp de comprimento, sítios Nde|-PpuM1 de transposição de cADN de CuZnSOD humano. As císteínas nas posições 6 e 57 de SOD maduro foram substituídas com resíduos de serina por mutagénese direccionada a sítios de oligonucleotídeos (12) . 5. Um fragmento de ADN sintético, 172 bp de comprimento, com terminações PpuM) e BamH). Esta região codifica a cadeia A de insulina Lis-Arg - cadeia B de insulina Arg. 6. Um poliligante de sítios de clonagem múltipla de 36 bp com terminações BamH| e Hindi||. 7. Um oligonucleotídeo de 44 bp, sintético, contendo o terminador de transcrição TrpA com terminações Hindi I I e AatII (10) . O plasmido pBAST-R, que dá resistência à tetraciclina e que codifica o polipeptídeo híbrido da cadeia A de insulina Lis-Arg - cadeia B de insuiina-SOD, foi introduzido na estirpe S0733 de E. coli (cytRstrA) e depositado em ATCC sob o número de acesso ATCC 69362, em 26 de Julho de 1993.

B. Plasmido pDBAST-LAT

Outra série de plasmídos foi construída, culminando no plasmido pDBAST-LAT, que, quando no momento da transformação de células hospedeiras de E. coli apropriadas, foi capaz de conduzir a expressão de alto 25/50 nível eficaz de um polipeptídeo híbrido de pró-insulina utilizável para produção de insulina humana, A estrutura do plasmido pDBAST-LAT, codificando o polipeptídeo híbrido da cadeia A de insulina Arg - cadeia B de insulina-SOD é mostrada na figura 4; a sequência de ADN e sequência de aminoácidos correspondente do polipeptídeo híbrido são mostradas na figura 7. 0 plasmido pDBAST-LAT tem cerca de 4377 bp de comprimento e compreende os seguintes elementos (numa direcção anti-sentido horário): 1. Um fragmento de ADN, 1521 bp de comprimento, sítios Aati I-Msc| de transposição em pBR322, que inclui o gene de resistência à tetraciclina. 2. Um fragmento de ADN, 14 97 bp de comprimento, sítios Sca1-Hae11 de transposição em pBR322, que inclui um gene de resistência a ampicilina truncado e a origem de replicação de ADN. 3. Um fragmento de ADN, 930 bp de comprimento, sítios Ava))-Nde( de transposição em ADN de E. coli, que inclui os promotores Ρι_Ρ2 deo e RBS (13). 4. Um fragmento de ADN, 188 bp de comprimento, sítios Nde|-PpuM| de transposição de cADN de CuZnSOD humano. As cisteinas nas posições 6 e 57 de SOD maduro foram substituídas com resíduos de serina e o teor de GC deste fragmento foi reduzido a 38% por mutagénese direccionada a sítios de oligonucleotídeos (12). 5. Um fragmento de ADN sintético, 169 bp de comprimento, com terminações PpuM| e BamH). Esta região codifica cadeia A de insulina Arg - cadeia B de insulina Arg. 26/50 6. Um poliligante de sítios de clonagem múltipla de 36 bp, sintético, com terminações BamH| e Hindi)). 7. Um oligonucleotídeo de 44 bp, sintético, contendo o terminador de transcrição TrpA com terminações Hindi I I e AatI! (10). O plasmido pDBAST-LAT, que dá resistência à tetraciclj-Πα. e que codifica o polipeptídeo híbrido da cadeia A de insulina Arg -cadeia B de insulina-SOD, foi introduzido na estirpe S0733 de E. coli (cytRstrA) e depositado em ATCC sob o número de acesso ATCC 69361, em 26 de Julho de 1993.

C. Plasmido pABAST-LAT

Outra série de plasmidos foi construída, culminando no plasmido pÃBAST-LAT, que, quando no momento da transformação de células hospedeiras de E. coli geneticamente elaboradas (abrigando o repressor c|857), foi capaz de conduzir a expressão eficaz de um polipeptídeo híbrido de pró-insulina utilizável para a produção de insulina humana. A estrutura do plasmido pXBAST-LAT, codifiçando o polipeptídeo híbrido da cadeia A de insulina Arg - cadeia B de insulina-SOD é mostrada na figura 5. A sequência de ADN e sequência de aminoácidos correspondente do polipeptídeo híbrido são mostradas na figura 7. O plasmido ρλΒΑβΤ-ΙΑΤ tem cerca de 3777 bp de comprimento e compreende os seguintes elementos (num sentido anti-horário): 27/50 1. Um fragmento de ADN, 1521 bp de comprimento, sítios

Aatfl-Msc! de transposição em pBR322, que incluí o gene de resistência à tetraciclina. 2. Um fragmento de ADN, 14 97 bp de comprimento, sítios

Sca|-Hae|| de transposição em pBR322, que inclui um gene de resistência à ampicilina truncado e à origem de replicação de ADN. 3. Um fragmento de ADN, 330 bp de comprimento, sítios

BamH|-EcoRi de transposição no plasmido pSODalS (14), que inclui o promotor XPL e um sítio de ligação ribossómico deo de par de base de 30 de comprimento Avr]I-Nde|. 4. Um fragmento de ADN, 188 bp de comprimento, sítios Nde | -

PpuM1 de transposição de cADN de CuZnSOD humano. As cisteinas nas posições 6 e 57 de SOD maduro foram substituídas com resíduos de serina e o teor de GC deste fragmento foi reduzido a 38% por mutagénese dirigida a sítios de oligonucieotídeo (12). 5. Um fragmento de ADN sintético, 169 bp de comprimento, com terminações PpuMí e BamH(. Esta região codifica cadeia A de insulina Arg - cadeia B de insulina Arg. 6. Um pollligante de sítios de clonagem múltipla de 36 bp, sintético, com terminações BamH( e Hindi 1 I· 7. Um oligonucieotídeo de 44 bp, sintético, contendo o terminador de transcrição TrpA com terminações Hindi (I e Aat|| (10) . 0 plasmido pXBAST-LAT, que dá resistência à tetraciclina e que codifica o polipeptídeo híbrido da cadeia A de insulina 28/50

Arg -cadeia B de insulina-SGD, sob o controlo do promotor XPl, foi introduzido na estirpe 4300 de e. coli (F- bio c|857 ) e depositado em ATCC sob o número de acesso ATCC 69363, em 26 de Julho de 1993.

As células bacterianas foram propagadas a 3o°C. A produção do polípeptídeo híbrido foi induzida no momento do deslocamento da temperatura para 42°C.

Exemplo 2

Fermentação, condições de crescimento e purificação de polipeptídeos híbridos de pró-insulina-SOD I. Culturas de Carga A cultura de carga da estirpe S0733 de E. coli abrigando o plasmido pDBAST-LAT (ou pBAST-R) foi cultivada em meio caseína (20 g/L hidrolisado de caseína, 10 g/1 extracto de levedura e 5 g/L NaCl) suplementando com tetraciclina (10 mg/L). As culturas foram então diluídas duas vezes com meio de congelamento e armazenadas a -80°C. Meio de congelamento: K2HP04 6,3 g KH2PO4 1,8 g Citrato de Na 0,45 g MgS04.7H20 0,09 g (NH4)2S04 0,9 g Glicerol 44 g Por 500 ml II. Inoculo 29/50 0 inoculo foi propagado no meio de produção (ver abaixo). Meio estéril num frasco de agitação foi inoculado da cultura de carga e incubado 15h num agitador a 37°C e aproximadamente 200 rpm. Se necessário, fases subsequentes na propagação do inoculo foram realizadas em fermentadores arejados agitados. O meio estéril foi inoculado com 2-10% de cultura do frasco e incubado 15h a 37°C, pH 7 í 0,5, com agitação e arejamento para manter o nivel de oxigénio dissolvido acima de 20% de saturação do ar. III. Produção

Meio de produção: k2hpo4 kh2po4 Citrato de Na NH4C1 K2S04 FeS04.7H20 MgS04.7H20 CaCl2.2H20 Solução de traços dos elementos Tetraciclina 8 g/1 2 g/1 2 g/1 3 g/1 0,6 g/1 0,04 g/1 0,4 g/1 0,02 g/1 3 ml/1 0,01 g/1

Glicose

Glicerol 2 g/1 1 ml/1

Solução de traços de elementos: MnS04.H20

ZnS04.7H20 CoCl2 · 7H20 1 g/1 2,78 g/1

Na2Mo04.2H20

CaCl2.2H20 CuS04.5H20 H3BO3 2 g/1 2 g/1 3 g/1 HC1 (32%) 1,85 g/1 0,5 g/1 100 mg/i 30/50 0 meio de produção foi inoculado com 0,5-10% de cultura de inoculo e incubado a 37°C. Taxas de agitação-arejamento foram fixadas para manter o nível de oxigénio dissolvido abaixo de 20% de saturação do ar. O pH foi mantido em 7 ± 0,2 com NH3.

Soluções estéreis de 501 glicose e 30% glicerol foram infundidas para fornecer energia e fontes de carbono. Uma vez a concentração de células tenha alcançado um OD660 de 25, as soluções estéreis de 10% glicose e 30% glicerol foram infundidas e a cultura continuou durante cerca de 5h até a concentração de células alcançar um OD660 aproximado de 60. A cultura foi então resfriada e as células recuperadas por centrifugação. Fermentação de E. colí, na presença de qualquer um de glicose, glicerol, galactose ou uma combinação dos mesmos como fonte de carbono, facilitou a expressão do polipeptídeo híbrido pró-insulina-SOD. IV. Purificação

Os polipeptídeos híbridos pró-insulina-SOD expressos pelos plasmidos pBAST-R e pDBAST-LAT acumularam no precipitado intracelular que foi isolado pelos seguintes procedimentos: 1 g (peso húmido) de torta bacteriana foi suspenso em tampão de 10 ml contendo Tris-PICl 50 mM, pH 8, EDTA lOmM e tratado com lisozima (Merck, 2500 u/ml) a 37°C, durante 2 h. A mistura foi então tratada com som e Nonidet-P-40 (Sigma) ou Triton X 100 foi adicionado a uma concentração final de 2% e agitado durante 2 h à temperatura ambiente. 0 precipitado foi pelotizado por centrifugação e lavado com água. O polipeptídeo híbrido foi purificado até próximo de homogeneidade por cromatografia de troca aniónica, como a 31/50 seguir. 0 precipitado foi dissolvido em ureia 8M, Trís-HCl 2QinM, β-mercaptoetanol 200mM, pH 8,2. A solução foi clarificada por centrifugação e cromatografada em coluna Fast-Flow Sepharose-DEAE (Pharmacia LKB), pré-equilibrada em ureia 8M, Tris-HCl 20mM, β-mercaptoetanol, pH 8,2. 0 material através do fluxo foi recolhido e a proteína híbrida foi tanto precipitada com (NH4) 2S04 a 40% de saturação como concentrada por ultrafiltragem em membrana de 10K seguido por diafiltragem contra glicina-HCl 100 mM, pH 3,1.

Alternativamente, o polipeptídeo híbrido de pró-insulina SOD expresso pelo plasmido pBAST-R foi purificado até quase à homogeneidade por dissolução em ureia 8M, ditiotreitol 20mM, acetato de Na 50mM, pH 5, e por ultraf iltração através de uma série de membranas de lOOkD e 50kD (Filtron). O polipeptídeo híbrido foi concentrado numa membrana de lOkD e precipitado com (NH4)2S04 a 40% de saturação.

Exemplo 3

Duplicação e clivagem enzimática de polipeptídeos híbridos pró-insulina-SOD

Polipeptídeos híbridos pró-insulina, obtidos por precipitação de (NH4)2S04 ou por ultrafiltragem (exemplo 2), foram dissolvidos em ureia 8M, HC1 5mM e diluídos num tampão de glicina lOOmM, pH 8,5-12,0 a uma concentração final de cerca de 1 mg/ml. A. A duplicação do polipeptídeo híbrido pró-insulina-SOD expresso pelo plasmido pBAST-R realizou-se a cerca de 4-32/50 37°C durante um período de cerca de 1-24 h, a fim de permitir a formação da ligação de dissulfeto correcta. 0 pH da solução contendo o polipeptídeo híbrido ligado a disulfeto duplicado foi ajustado a cerca de 8,8-9,0 com HC1 e a proteína tratada com trípsina e carboxipeptidase B a 16-37°C durante 30-120 minutos.

Após experimentação considerável, verificou-se que as condições óptimas foram como o seguinte: 0 polipeptídeo híbrido expresso pelo plasmido pBAST-R foi dissolvido em ureia 8M, HC1 5 mM e diluído em tampão de glicina lOOmM, pH 11/0 {figura 8) a uma concentração final de cerca de 1 mg/ml, após o que a duplicação do polipeptídeo híbrido se realizou durante 6-16 horas a 25°C, depois o polipeptídeo híbrido ligado ao dissulfeto, duplicado foi clivado com tripsina (1:500 p/p) e carboxipeptidase B (1:200 p/p) a 37°C, durante 30-60 minutos. A geração de insulina por clivagem enzimática do polipeptídeo híbrido pró-insulina ligado a dissulfeto, duplicado expresso pelo plasmido pBAST-R, é diagramaticamente mostrada na figura 1. B. A duplicação do polipeptídeo híbrido pró-insulina-SOD expresso pelo plasmido pDBAST-LAT realizou-se a cerca de 7-31°C, durante um período de cerca de 5-30 horas, a fim de permitir a formação da ligação de dissulfeto correcta. O pH da solução contendo o polipeptídeo híbrido ligado a dissulfeto, duplicado foi ajustado a cerca de 8,8-9,0 com HC1 e a proteína tratada com tripsina e carboxipeptidase B a 22-37°C, durante 30 minutos a 16 horas.

Após experimentação considerável, verificou-se que as condições óptimas foram as seguintes: 0 polipeptídeo híbrido expresso pelo plasmido pBAST-R foi dissolvido em 33/50 ureia 8M, HCi 5mM e diluído em tampão de glicina lOOmM, pH 11,0-11,25 (figura 8), a uma concentração final de cerca de 1 mg/ml, após o que a duplicação do polípeptídeo híbrido se realizou durante 5 horas a 25°C, depois o polípeptídeo híbrido ligado a díssulfeto, duplicado foi clivado com tripsina (1:15.000 p/p) e carboxipeptídase B (1:10.000 p/p) a 25°C, durante 16 horas. A geração de insulina por clivagem enzimática do polípeptídeo híbrido pró-insulina ligado a díssulfeto, duplicado, expresso pelo plasmido pDBAST-LAT, é diagramaticamente mostrada na figura 2.

Exemplos de condições específicas tanto para A como para B acima, são detalhados nas legendas para as figuras 8-14.

Exemplo 4

Análise de proteína e purificação de insulina humana do polípeptídeo híbrido pró-insulina-SOD expresso pelo

plasmido pBAST-R A geração de insulina humana do polípeptídeo híbrido pró-insulina-SOD expresso pelo plasmido pBAST-R foi determinada por radioimunoensaio e RP-HPLC, utilizando insulina humana comerciai como padrão (Calbiochem). O rendimento teórico de insulina humana recombinante, calculado de acordo com a sequência de aminoácidos do polípeptídeo híbrido pró-insulina, é de 45,6%. É evidente a partir da figura 8 que a duplicação óptima ocorre em pH 11. Neste valor de pH, a produção de insulina totaliza cerca de 80% do rendimento teórico (que corresponde a cerca de 40% do polípeptídeo híbrido aplicado). A insulina humana, produzida do polípeptídeo híbrido pró-insulina expresso pelo plasmido pBAST-R, foi detectada por RP-HPLC. Uma coluna de tamanho 34/50 de poro de 300 Á, 5 μιη, de 250 x 4, 6 mm I.D., Vydac 218TP54 (Grupo de Separação), foi usada na temperatura ambiente com uma taxa de fluxo de 1 ml/min. Ácido trifluoroacético a 0,1% (TFA) em H20 foi usado como eluente A e TFA a 0,08% em acetonitrila, como eluente B. A coluna foi lavada durante 5 minutos em tampão de equilíbrio (25% eluente B), seguido por um gradiente linear de 25-50% eluente B durante 37,5 minutos. A absorvência foi monitorizada a 220 nm ou a 280 nm. A análise da insulina humana após a digestão enzimática do polipeptídeo híbrido ligado a dissulfeto, duplicado, usando cromatografia líquida de alta pressão de fase reversa, revelou um pico principal com o mesmo tempo de retenção como insulina humana padrão.

Duas porções de pequena escala foram preparadas, dando 26 mg e 13 mg de insulina humana, respectivamente. A insulina humana foi purificada de solução tratada com enzima (pH 9) por ultrafiltragem tanto em membranas de 3K como de 5 K (Filtron) seguido por cromatografia de Sepharose-CM (tampão citrato, pH 3). Fracções de pico foram dessalinizadas, liofilizadas e submetidas a uma sequência N-terminação e análise de aminoácidos. A composição de arrdnoácidos de ambas as porções de insulina humana recombinante foi essencialmente idêntica à insulina humana de ocorrência natural (ver tabela 1, preparação 1) . A sequência de 5 aminoácidos na terminação amino das preparações de insulina foi determinada por degradação de Edman. Verificou-se que era idêntico à terminação NH2 de ambas as cadeias A e B de insulina humana, o que confirma a autenticidade do produto ín vitro.

No entanto, os resultados da sequência indicaram a presença de um resíduo de Arg extra na primeira posição, em cerca de 25% das moléculas. Este resultado corresponde à clivagem de 35/50 tripsxna entre Lis e Arg, no interior da sequência de ligante Lis-Arg, assim deixando um resíduo de Arg adicional na terminação artiino da cadeia A.

Verificou-se que a hidrólise específica na terminação C de Arg por tripsina pode ser obtida realizando a reacção em pH 11. Neste pH elevado, a maior parte dos grupos amino-ε de Lis não é carregada (pK=10,3) , assim possibilitando a clivagem seieetiva. Duas porções, dando 1 mg e 6,5 mg de insulina purificada, foram obtidas realizando a etapa de tripsina em pH 11 (ver tabela 1, preparação 2), seguido por digestão de carboxipeptidase B em pH 8,5. A sequência N-terminação revelou que a quantidade de insulina compreendendo Arg extra foi reduzida a cerca de 5%. TABELA 1

Composição de Aminoácidos de Insulina Humana Recombinante

Amino- Número de resíduos ácido Teórico Insulina padrão Preparação 1 Preparação 2 Asx 3 3,20 3,38 3,26 Thr 3 2, 98 2,83 2,68 Ser 3 2,84 2,53 2,77 Glx 7 7,15 7,73 7,23 Pro 1 1,28 1,13 1,09 Gly 4 4,24 4,39 4,25 Ala 1 1,00 1,28 1,04 Cys 6 5,88 5,11 5,79 Vai 4 3,82 4,58 3,88 Ile 2 2,04 1,96 1,96 Leu 6 5,87 6,10 5, 99 Tyr 4 3,80 3,80 3,87 Phe 3 3,15 3,56 3,03 His 2 2,04 2,05 2,08 Lys 1 1,01 1,05 1,02 Arg n 0,96 1,30 1,18 36/50

As preparações 1 e 2 mostram a composição de aminoácidos de insulina humana recombinante produzida do polipeptídeo híbrido pró-insuiina expresso pelo plasmido pBAST-R. A clivagem de tripsina foi realizada tanto em pH 9 (preparação 1) como em pH 11 (preparação 2). A análise de aminoácidos foi realizada após a oxidação de ácido perfórmico e hidrólise de fase de gás de preparações de insulina purificadas.

Exemplo 5

Análise de péptido de insulina humana purificada produzida do polipeptídeo híbrido pró-insulina-SOD expresso peio

plasmido pBAST-R

Insulina humana purificada, produzida como descrito nos exemplos acima, foi submetida a análise de péptido utilizando endoproteinase Glu-C (Sigma), que hidrolisa ligações de péptido no lado carboxila dos resíduos de giutamina.

Em maiores detalhes, as amostras de insulina (100 mg) , produzidas por clivagem do polipeptídeo híbrido pró-insulina ligado a dissulfeto, duplicado expresso pelo plasmido pBAST-R, foram digeridas com 5 μg Glu-C durante 6 horas a 37°C em 100 μΐ de Trls-HCl 0,1 M, pH 7,8. A análise HPLC foi realizada: amostras de insulina (controlo) disponível comercialmente e insulina produzida por clivagem do polipeptídeo híbrido pró-insulina ligado a dissulfeto, duplicado expresso pelo plasmido pBAST-R foram acidadas em um pH de cerca de 3 e separadas por RP-HPLC. Uma coluna de tamanho de poro de 300 Ã, 5 μιη, de 250 x 4, 6 mm I.D., Vydac 218TP54 foi usada. A coluna foi equilibrada com fosfato de 37/50 tetraetilamónio 50 mM, NaC104 162mM, pH 3, contendo 31,5% {v/v) de acetonitrila e revelada com um gradiente linear de 35-45% acetonitrila durante 75 minutos, a uma taxa de fluxo de 1 ml/min. A absorvência foi monitorizada a 220 nm.

Todos os péptidos esperados foram gerados em concordância com a reacção de controle ainda que um ressalto menor após o pico correspondente a um dos fragmentos esteja provavelmente relacionado à molécula semelhante à insulina des-Thr (B30) (15).

Os exemplos 4 e 5 indicam que o polipeptídeo recombinante expresso pelo plasmido pBAST-R compreende a sequência de insulina humana de ocorrência natural. Uma porção menor da proteína recombinante produzida compreendia formas como Arg(Ao), desamido- ou des-Thr (B30) .

Os subprodutos indesej ados podem ser eliminados por procedimentos cromatográficos como RP-HPLC, como descrito acima.

Exemplo 6

Análise de proteína e purificação de insulina humana produzida pelo polipeptídeo híbrido pró-insulina expresso peio plasmido pDBAST-LAT A fim de impedir a geração do subproduto de insulina Arg(Ao) (exemplos 4 e 5), o plasmido de expressão pBAST-R foi modificado para compreender ADN codificando somente um resíduo de Arg entre as cadeias A e B do polipeptídeo hxbrido pro-insulina como oposto a ADN codificando Lys-Arg entre as cadeias A e B do polipeptídeo híbrido pró-insulina expresso pelo plasmido pBAST-R. Isto resultou nos plasmidos 38/50 de expressão pDBAST-LAT (exemplo 1B) e pÀBAST-LAT (exemplo 1C) . A produção eficiente de insulina ocorreu após tratamento de duplicação e enzimático com tripsina e CPB do polipeptideo híbrido pró-insulina ligado a dissulfeto, duplicado expresso pelo novo plasmido de expressão pDBAST-LAT. A presença de contaxninantes semelhantes a insulina fo± baixa (figura 9). A duplicação foi óptima em pH 11,25 (figura 10) e foi significativamente melhorada na presença de cerca de 2 moles de ácido ascórbico por mole de grupo SH na mistura de reacção (figura 11). 0 efeito da concentração de proteína no rendimento de insulina produzida de polipeptideo híbrido pró-insulina foi determinado numa série de reacções em condições de duplicação óptimas de outro modo. Rendimentos óptimos foram obtidos quando a concentração de proteína não excedeu 1,5 mg/ml (figura 13). A insulina foi purificada por cromatografia em Sepharose-DEAE seguido por RP-HPLC (como descrito na figura 9). Como é evidente da figura 12, a insulina humana recombínante produzida teve o mesmo tempo de retenção como a insulina humana (disponível comercialmente) padrão. A composição de aminoácidos da preparação de insulina humana recombínante purificada é idêntica à da insulina padrão (ver tabela 2, insulina recombínante).

Notar que a tabela 2 indica que a insulina produzida do polipeptideo híbrido pró-insulina expresso pelo plasmido pDBAST-LAT não tinha resíduo de Arg extra fixado à cadeia A de insulina (insulina Arg(Ao)), como descrito no exemplo 4. Assim, o piasmido preferido para produção de insulina é o 39/50 plasmido pDBAST-LAT e a sequência preferida para o polipeptídeo híbrido pró-insulina é a mostrada na figura 7. TABELA 2

Composição de aminoácido de insulina humana recombínante

Amino Número de resíduos Ácido Teórico insulina padrão Insulina recombínante Asr 3 3,20 3, 32 Thr 3 2,98 2,73 Ser 3 2, 84 2,71 Glx 7 7,15 7,41 Pro 1 1,28 1,02 Gly 4 4,24 4,46 Ala 1 1,00 1,09 Cys 6 5,88 5,28 Vai 4 3, 82 O O Ile 2 2,04 1, 91 Leu 6 5,87 6, 34 Tyr 4 3,80 3, 64 Phe 3 3,15 3,06 Hí s 2 2,04 2, 18 Lys 1 1,01 1, 02 Arg 1 0, 96 1,07 A composição de aminoácido de insulina humana padrão e insulina humana recombínante produzidas a partir de polipeptídeo híbrido pró-insulina expressa pelo plasmido pDBAST-LAT são mostradas. A análise de aminoácidos foi realizada após oxidação de ácido perfórmico e hidrólise em fase gasosa de preparações de insulina purificada. 40/50

Exemplo 7

Produção de insulina humana a partir de polipeptídeo híbrido pró-insulina expresso pelo plasmido pDBAST-LAT a partir de precipitado intracelular bruto

Um processo melhorado para duplicação e conversão enzimática de polipeptídeo híbrido pró-insulina para insulina foi realizado por uso de precipitado intracelular bruto, omitindo a necessidade para a etapa de purificação inicial como descrito no exemplo 2, parte IV. A produção eficaz de insulina ocorreu após clivagem enzimática de polipeptídeo híbrido pró-insulina, ligado a dissulfeto, duplicado, com tripsina e carboxipeptidase B (figura 14, tabela 3). Os rendimentos de insulina foram calculados como a percentagem de concentração de proteína inicial (Α2βο) como determinado na etapa de dissolução do precipitado em pH 12 (figura 14). A duplicação de polipeptídeo híbrido pró-insulina-SOD de precipitado intracelular bruto foi mostrada como sendo óptima a cerca de 4,5 horas do início da experiência (figura 14). A tabela 3 resume a purificação parcial de insulina a partir de polipeptídeo híbrido pró-insulina expresso por plasmido pBAST-LAT a partir de precipitado intracelular bruto preparado a partir de uma cultura de fermentação de um litro a um 0. D. 660 de 45. A dissolução e duplicação são realizadas como descrito para figura 14. Em 4,5 horas da dissolução, a solução em bruto duplicada incluindo o polipeptídeo híbrido pró-insulina ligado a dissulfeto, duplicado, foi titulada a pH 8,8 com ácido clorídrico concentrado. ZnCl2 (a uma concentração final de 50 μΜ), carboxipeptidase B (1:4000 p/p) e tripsina (1:6000 p/p) foram adicionados. A digestão foi realizada durante 3 horas 41/50 a 37°C e foi terminada pela adição de fiuoreto de fenilmetíXsulfonila (PMSF) a 0,5inM concentração final. A análise por HPLC (como descrito na figura 9) indicou um rendimento de insulina de 169 mg. A insulina foi purificada por uma sequência de etapas cromatográficas nidrófobas e de troca aniónica. A mistura de duplicação digerida foi carregada em coluna Fast Flow Sepharose DEAE (Pharmacia) pré-equilibrada em 20 mM Tris-HCl, 10 mM NaCl pH 8, tampão, a cerca de 50 A2so unidades por ml resina. O material ligado foi lavado com 20 mM Tris-HCl, lOOmM NaCl, pH 8 tampão e insulina eluída com 250 mM NaCl no mesmo tampão. As fracções reunidas contendo insulina representaram 20% de proteína carregada e tinham uma pureza de 37,1%. O sulfato de amónio foi adicionado ao conjunto de eluição DEAE a uma concentração de 410 mM e foi carregado numa coluna Fast Flow Sepharose-Fenil pré-equilibrada em 20 mM Tris HC1, 540 mM sulfato de amónio a cerca de 12 A28o unidades por ml de resina. 0 material ligado foi lavado com tampão de equilíbrio e insulina eluída com 20 mM Tris HC1, 220 mM sulfato de amónio, pH 8 tampão. As fracções contendo insulina representaram 42,3% de proteína carregada e tinham uma pureza de 74,1%. Como resultado deste processo de purificação parcial, 120 mg de insulina, idêntica à insulina padrão foram produzidos que corresponde a um rendimento de insulina de 5,16%. Outra purificação da insulina pode ser realizada pelo uso de processos conhecidos na técnica, por exemplo filtragem por gel, RP-HPLC e cristalização (17). 42/50 TABELA 3

Purificação de insulina humana recombinante produzida a partir de polipeptídeo híbrido de pró-insulina expresso pelo plasmido pDBAST-LAT, após dissolução de precipitado intracelular bruto, duplicação e tratamento enzimátíco com tripsina e carboxipeptidase B.

Etapa de purificação A280 Quantidade mínima de insulina por HPLC - em mg % Pureza Dissolução precipitado 2326 Tratamento com carvão 1915 Duplicação e tratamento enzimático 1915 169 €0 CQ Pooi de DEAE-Sepharose 383 142 37,1 Pool de fenil-Sepharose 162 120 74,1 A28o representa a absorvência total a 280 nm em cada etapa de purificação. A presença de insulina foi determinada por análise de HPLC com relação à insulina padrão como descrito para a figura 9 e corresponde ao pico de insulina principal de insulina padrão.

Referências 1. Wetzel, R., Kleid, D.G., Crea, R., Heyneker, H.L., Yansura, D.G., Hirose., Kraszewskí, A., Riggs, A. D., Itakura, K. and Goeddel, D.V., Gene 16: 63-71, 1981. 2. Thim, L., Hansen, M.T., Morris, K., Hoegh, I., Boel, E., Forstrom, J., Ammerer, G. and Fiil, N.P., Proc. Natl. Acad. Sei., U.S.A., 83: 6766-6770, 1986. 43/50 3. Davidson, H.W., Rhodes, C.J. and Hutton, J.C., Nature 333: 93-96, 1988. 4. Panayotis, G., Katsoyannis, G. and Tometsko, A., Proc. Natl. Acad. Sei., U.S.A., 55: 1554-1561, 1966. 5. Steiner, D.F. and Clark, J.L., Poc. Natl. Acad. Sei., U.S.A., 60: 622-629, 1968. 6. Kemmler, W., Peterson, J.D. and Steiner, D.F., Bio. Chem. 246: 6786-6791, 1971. 7. Goeddel, D.V., Kleid, D.G., Bolívar, F., Heyneker, H.L., Yansura, D.G., Crea, R., Hirose, T., Kraszewski, A., Itakura, K. and Riggs, A.D., Proc. Natl. Acad. Sei., U.S.A., 76: 106-110, 1979. 8. Frank, B.H. and Chance, R.E. (1985), The preparation and characterization of human insulin of recombínant DNA origin, in Therepeutic agents produced by genetic engineering, Quo Vadís Symposíum, Sanofi Group, May 29-30, 1985, Toulouse-Labege, France, pp: 137-146. 9. Cousens, L.S., Shuster, J.R., Gallegos, C., Ku, L., Stempien, M.M., Urdea, M.S., Sanchez-Pescador, R., Taylor, A. and TeKamp-Olson, P., Gene 61: 265-275, 1987. 10. Yanofsky, C., Platt, T., Crawford, I.P., Nichols, B.P., Christie, G.E., Horowitz, H., Van Cleemput, M. and Wu, A.M., Nucleic Acids Res. 9: 6647-6668, 1981. 11. Sherman, L., Dafní, L., Liehman-Hurwítz, J. and Groner, Y., Proc., Natl. Acad. Sei., U.S.A., 80: 5465-5469, 1983. 12. Morinaga, Y., Franceschini, T., Inouye, S. and Inouye, M., Biotechnology 2: 636-639, 1984. 13. Fiscner, M., Fytlovitch, S., Amit, B., Wortzel, A. and Beck, Y., Appl. Microbiol. Biotechnol. 33: 424-428, 1990. 14. Hartman et al., U.S. Patent 5.143.836, September 1, 1992. 15. Grau, U., Diabetes 34: 1174-1180, 1985. 16. Ellman, G.L., Arch. Biochem. Biophys. 82: 70-77, 1959. 44/50 17. Schlichtkrull, J., Acta Chem. Scand. 10: 1459-1464, 1956

Listagem de sequências (1) Informação Geral (I) Requerentes: Hartman, Mendelovitz, Simona Gorecki, (II) (III) (IV) (A) (B) (C) (D) (E) (F) (V) (A) (B) (C) (D) (VI) (A) (B) (C) (VII) (A) (B) (C) (VIII)

Jacob R.

Marian

PRODUÇÃO DE INSULINA HUMANA

Titulo da Invenção: Número de sequências: 6 Endereço correspondente:

Destinatário: Cooper & Dunham LLP Rua: 1185 Avenue of the Américas C-idade: Nova Iorque Estado: Nova Iorque País: EUA Zip: 10036

Forma de leitura do computador:

Tipo médio: Disquete Computador: PC compatível IBM Sistema operativo: PC-DOS/MS-DOS Software: Patente em saída #1.0, Versão #1.30 Dados do pedido corrente: Número do Pedido: 95 90 7193,7 Data do Pedido:

Classificação:

Informação do advogado/agente:

Nome: White, John P. Número de Registo: 28,678

Número de Referência/Resumo: 41425-A-PCT-EPO

Informação de telecomunicações: 45/50 (A) Telefone: 212-278-0400 (B) Telefax: 212-391-0525 (2) Informação para a sequência ID n° 1 (i) Características da sequência: (A) Comprimento: 55 aminoácidos (B) Tipo: aminoácido (C) Parte Integrante: única (D) Topologia: linear (ii) Tipo de molécula: proteína (iii) Hipotético: Não (iv) Antí-sentido: Não

(v) Tipo de fragmento: Terminação-N (vi) Descrição da sequência: SEQ ID n°1:

Asn Cys Tyr Asn Glu Leu Gin Tyr Leu Ser Cys lie Ser Thr cys Cys 15 10 is

Gin Glu Vai Ile Gly Arg Lys Thr Lys Pro Thr Tyr Phe Phe Gly Arg 20 25 30

Glu Gly Cys Vai Leu Tyr Leu Ala Glu Vai Leu His Ser Gly Cys Leu 35 40 45

His Gin Asn Vai Phe Arg Pro 50 55 (2) Informação para a sequência ID n° 2 (i) Características da sequência: (A) Comprimento: 21 aminoácidos (B) Tipo: aminoácido (C) Parte integrante: única (D) Topologia: linear (ii) Tipo de molécula: proteína (iii) Hipotético: Não (iv) Antí-sentido: Não

(v) Tipo de fragmento: Terminação-N (xi) Descrição da sequência: SEQ ID n°2: 46/50

G1V Ile Vai Glu Gin cys Cys Thr Ser ile Cys Ser Leu Tyr Gin Leu 1 5 10 IS

Glu Asn Tyr Cys Asn 20 (2) Informação para a sequência ID n° 3 (i) Caracteristicas da sequência: (A) Comprimento: 30 aminoácidos (B) Tipo: aminoácido (C) Parte integrante: única (D) Topologia: linear (ií) Tipo de molécula: proteína (iii) Hipotético: Não (iv) Anti-sentido: Não (v) Tipo de fragmento: Terminação-N (xi) Descrição da sequência: SEQ ID n°3:

Thr Lys Pro Thr Tyr Phe Phe Gly Arg Glu Gly Cys Vai Leu Tyr Leu 15 10 IS

Ala Glu Vai Leu His Ser Gly Cys Leu His Gin Asn Vai Phe 20 25 30 (2) Informação para a sequência ID n° 4 (i) Caracteristicas da sequência: (A) Comprimento: 54 aminoácidos (B) Tipo: aminoácido (C) Parte integrante: única (D) Topologia: linear (ii) Tipo de molécula: proteína (iii) Hipotético: Não (iv) Anti-sentido: Não (v) Tipo de fragmento: Terminação-N (xi) Descrição da sequência: SEQ ID n°4: 47/50

Asn Cys Tyr Asn Glu Leu Gin Tyr Leu Ser Cys Ile Ser Thr Cys Cys 15 10 is

Gin Glu Vai lie Gly Arg Thr Lys Pro Thr Tyr Phe Phe Gly Arg Glu 20 25 30

Gly Cys Vai Leu Tyr Leu Ala Glu Vai Leu His Ser Gly Cys Leu Hls 35 40 45

Gin Asn vai Phe Arg Pro 50 (2) Informação para a sequência ID n° 5 (i) Características da sequência: (A) Comprimento: 354 pares base (B) Tipo: ácido nucleico (C) Parte integrante: única (D) Topologia: linear

(ii) Tipo de molécula: cADN (iii) Hipotético: Não (iv) Anti-sentido: Não

(v) Tipo de fragmento: Terminação-N (ix) Características

(A) Nome/chave: CDS (B) Localização: 1..354 (x) Descrição da sequência: SEQ ID n°5: 48/50 48

ATG GCT ACT AAA GCC GCT AGC GTG CTG AAG GGC GAC GGC CCA GTG CAG Met Ala Thr Lys Ala Ala Ser Val Leu Lys Gly Asp Gly Pro Val Gin 1 5 10 15 GGC ATC ATC AAT TTC GAG CAG AAG GAA AGT AAT GGA CCA GTG AAG GTG Gly Ile Ile Asn Phe Glu Gin Lys Glu Ser Asn Gly Pro Val Lys Val 20 25 30 TGG GGA AGC ATT AAA GGA CTG ACT GAA GGC CTG CAT GGA TTC CAT ATT Trp Gly Ser Ile Lys Gly Leu Thr Glu Gly Leu His Gly Phe His lie 35 40 45 CAT GAG TTT GGA GAT AAT ACA GCA GGC AGT ACT AGT GCA GGT CCT CGT His Glu Phe Gly Asp Asn Thr Ala Gly Ser Thr Ser Ala Gly Pro Arg 50 55 60 TTT GTC AAC CAG CAC CTG TGT GGT TCT CAC CTA ATT GAA GCA CTG TAC Phe Vai Asn Gin His Leu Cys Gly Ser His Leu Ile Glu Ala Leu Tyr 65 70 75 80 CTG GTA TGT GGC GAA CGT GGT TTC TTC TAC ACT .CCT AAA ACA AAG CGC Leu Vai Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr Lys Arg 85 90 95 GGC ATC GTT GAA CAG TGC TGT ACC TCT ATC TGT TCC CTG TAC CAA CTG Gly Ile val Glu Gin Cys Cys Thr ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gin Leu 100 105 110 GAG AAC TAC TGC AAT TAA 96 144 192 240 288 336 354

Glu Asn Tyr Cys Asn 115 (2) Informação para a sequência ID n° 6 (i) Características da sequência: (A) Comprimento: 352 pares base (B) Tipo: ácido nucleico (C) Parte integrante: única

(D) Topologia: linear (li) Tipo de molécula: cADN (iii) Hipotético: Não (iv) Anti-sentido: Não

(v) Tipo de fragmento: Terminação-N (ix) Características

(A) Nome/chave: CDS (B) Localização: 1..352 (xi) Descrição da sequência: SEQ ID n°6: 49/50 43 ATG GCT ACT aaa gct gtt tct gtt tta aaa ggt gat ggt cca gtt caa Met Ala Thr Lys Ala vai Ser Vai Leu Lys Gly Asp Gly Pro Vai Gin 1 S 10 15 GGA ATT ATT AAT TTT GAA CAA AAA GAA AGT AAT GGA CCA GTT AAA GTA Gly Ile Xle Asn Phe Glu Gin Lys Glu Ser Asn Gly Pro Vai Lys Vai 20 25 30 TGG GGA AGT ATT AAA GGA CTT ACT GAA GGC CTG CAT GGA TTC CAT GTT Trp Gly Ser lie Lys Gly Deu Thr Glu Gly Leu His Gly Phe His Vai 35 40 45 CAT GAG TTT GGA GAT AAT ACA GCA GGC AGT ACT AGT GCA GGT CCT CGT His Glu Phe Gly Asp Asn Thr Ala Gly Ser Thr Ser Ala Gly Pro Arg 50 55 60 TTT GTC AAC CAG CAC CTG TGT GGT TCT CAC CTG GTT GAA GCA CTG TAC Phe Vai Asn Gin His Leu Cys Gly Ser His Leu Vai Glu Ala Leu Tyr 65 70 75 80 CTG GTA TGT GGC GAA CGT GGT TTC TTC TAC ACT CCT AAA ACC CGC GGC Leu Vai Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr Arg Gly 85 90 95 ATC GTT GAA CAG TGC TGT ACC TCT ATC TGT TCC .CTG TAC CAA CTG GAG Xle Vai Glu Gin Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gin Leu Glu 100 105 110 AAC TAC TGC AAT TAA A Asn Tyr Cys Asn 115 96 144 192 240 288 336 352

Lisboa, 16 de Fevereiro de 2007 50/50

Claims (11)

1. REIVINDICAÇÕES 1. Processo para produzir insulina que compreende: (a) tratar uma célula bacteriana com ADN que codifica um polipeptídeo híbrido que compreende pró-insulina, para que o ADN dirija a expressão e recupere o polipeptídeo híbrido da célula; (b) duplicar um polipeptídeo híbrido compreendendo pró-insulina sem primeiro submeter o polipeptídeo híbrido à sulfitólise sob condições que permitam formação de ponte dissulfeto correcta, em que as ditas condições compreendem um pH de cerca de 8.5-12.0; (c) submeter o polipeptídeo híbrido, ligado a dissulfeto, duplicado, à clivagem enzimática para produzir insulina, (d) purificar a insulina assim produzida.
2. 2. Processo de acordo com a reivindicação 1, em que a etapa (b) ainda compreende incubar o polipeptídeo híbrido a cerca de 4-37°C durante um período de cerca de 1-30 horas.
3. 3. Processo de acordo com a reivindicação 2, em que a incubação ocorre na presença de ácido ascórbico.
4. 4. Processo de acordo com a reivindicação 2, em que o pH é 11,0 - li,25.
5. 5. Processo de acordo com a reivindicação 3, em que a concentração de ácido ascórbico é cerca de 2 moles por mole do grupo SH presente na mistura de duplicação. 1/3
6. 6. Processo de acordo com a reivindicação 2, em que o período de incubação é cerca de 5 horas.
7. 7. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6 em que o passo (c) compreende: (i) ajustar o pH a cerca de 8,8-9,0, e {ii) clivar o polipeptideo híbrido com tripsina e carboxipeptídase B a 16-37°C durante 30 minutos durante 16 horas
8. 8. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, em que a etapa (d) ainda compreende a purificação por meio de: (i) cromatografia DEAE-Sepharose e RP-HPLC. (ii) ultrafiltragem e cromatografia de CM-Sepharose; ou (iii) cromatografia DEAE-Sepharose e cromatografia Fenil-Sepharose
9. 9. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, em que o polipeptideo híbrido de pró-insulina é expresso por: (i) plasmido pDBAST-LAT depositado sob o número de acesso ATCC No. 69361; (ii) plasmido pXBAST-LAT depositado sob o número de acesso ATCC No. 69363; ou (iii) plasmido pBAST-R depositado sob o número de acesso ATCC No. 69362. 2/3
10. 10. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, em que o tratamento no passo (a) compreende a fermentação na presença de glicose, glícerol ou galactose.
11. 11. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, em que a dita recuperação compreende: (i) romper a parece celular da célula bacteriana ou fragmentos da mesma para produzir um iisado, (i i) isolar o precipitado intracelular do Iisado por centrifugação, e (iii) solubílizar o precipitado. Lisboa, 16 de Fevereiro de 2007 3/3