ES2266187T3 - Uso de la insulina para el tratamiento de trastornos del cartilago. - Google Patents

Abstract

El uso de la insulina o de una variante de la insulina en la fabricación de un medicamento para el tratamiento del cartílago lesionado procedente de un trastorno del cartílago, en donde el medicamento se formila para la inyección directa en la región afectada.

Description

Uso de la insulina para el tratamiento de trastornos del cartílago.

Campo de la invención

La presente invención se refiere de forma general a la reparación del cartílago y al uso en el tratamiento de los trastornos del cartílago.

Antecedentes de la invención

Los trastornos del cartílago describen ampliamente una colección de enfermedades caracterizadas por la degeneración o anormalidades metabólicas en los tejidos conectivos, las cuales se manifiestan por dolor, rigidez y limitación de la movilidad de las partes del cuerpo afectadas. El origen de estos trastornos puede ser patológico o a resultas de un trauma o lesión.

La osteoartritis (OA), también conocida como osteoartrosis o enfermedad degenerativa de las articulaciones, es el resultado de una serie de procesos degenerativos localizados que afectan la estructura articular y resultan en dolor y una función disminuida. La incidencia de la OA crece con la edad, y puede detectarse evidencia de OA en al menos una articulación en la mayoría de la población hacia los 65 años de edad. OA está acompañada a menudo por un componente inflamatorio local que podría acelerar la destrucción de la articulación.

La OA se caracteriza por la ruptura de la superficie lisa articulante del cartílago, con una pérdida temprana de proteoglicanos (PG) y colágenos, seguida por la formación de grietas y la fibrilación, y, en último lugar, por la pérdida total del grosor de cartílago. Coincidiendo con los cambios en el cartílago, hay alteraciones en el hueso periarticular. El hueso subcondral se espesa y lentamente queda expuesto. A menudo se forman nódulos óseos u osteofitos en la periferia de la superficie del cartílago, y ocasionalmente crecen por encima de las áreas erosionadas adyacentes. Los síntomas de la OA incluyen el dolor localizado en las articulaciones afectadas, especialmente después de su uso. Con la progresión de la enfermedad, los síntomas podrían progresar hasta una sensación de dolor continua, molestias locales, y alteraciones cosméticas tales como la deformación de la articulación afectada.

En contraste con la naturaleza localizada de la OA, la artritis reumatoide es una enfermedad inflamatoria sistémica, la cual probablemente se inicia en el sinovio, los tejidos que rodean el espacio articular. La prevalencia de la RA es aproximadamente 1/6 de la de la OA en la población general de los Estados Unidos. La RA es un trastorno autoinmune crónico caracterizado por la sinovitis simétrica de la articulación, y típicamente afecta las articulaciones diartrodiales pequeñas y grandes, lo que conduce a su progresiva destrucción. A medida que la enfermedad progresa, los síntomas de la RA también podrían incluir la fiebre, la pérdida de peso, el adelgazamiento de la piel, la implicación multiorgánica, la escleritis, la formación de nódulos subcutáneos o subperiósticos, y la muerte prematura. Mientras que las causas de la RA y de la OA son claramente distintas, las citocinas y los enzimas implicados en la destrucción del cartílago parecen ser similares.

Puesto que los condrocitos maduros tienen poco potencial para la replicación, y puesto que el reclutamiento de otros tipos celulares está limitado por la naturaleza avascular del cartílago, el cartílago maduro tiene una capacidad limitada para repararse a sí mismo. Por esta razón, se ha usado terapéuticamente el trasplante de tejido cartilaginoso o condrocitos aislados en las articulaciones defectuosas. Sin embargo, los trasplantes de tejidos procedentes de donantes corren el riesgo del rechazo del injerto, así como la posible transmisión de enfermedades infecciosas. Aunque estos riesgos pueden minimizarse usando el tejido o células del propio paciente, este procedimiento requiere cirugía adicional, la creación de una lesión nueva en el cartílago del paciente, y el cultivo y crecimiento caro de las células específicas del paciente. Se consigue una mejor curación si se penetra el hueso subcondral, bien a causa de la lesión/enfermedad o quirúrgicamente, puesto que la penetración en el vasculatura permite el reclutamiento y la proliferación de células no diferenciadas para efectuar la reparación. Desafortunadamente, las propiedades bioquímicas y mecánicas de este fibrocartílago recién formado difieren de las del cartílago hialino normal, lo que resulta en una función inapropiada o alterada. El fibrocartílago no tiene la misma durabilidad y podría no adherirse correctamente al cartílago hialino que lo rodea. Por esta razón, el fibrocartílago sintetizado de nuevo podría ser más proclive a la rotura y pérdida que el tejido cartilaginoso hialino articular original.

Los factores de crecimiento peptídicos son reguladores muy importantes del crecimiento del cartílago y del comportamiento (es decir, diferenciación, migración, división y síntesis o rotura de la matriz) de las células cartilaginosas (condrocitos). F. S. Chen et al., Am J. Orthop., 26:396-406 (1997). Los factores de crecimiento que se han propuesto previamente para estimular la reparación del cartílago incluyen el factor de crecimiento similar la insulina (IGF-1), Osborn, J. Orthop. Res., 7:35-42 (1989); Florini & Roberts, J. Gerontol.; 35:23-30 (1980); el factor de crecimiento básico de fibroblastos (bFGF), Toolan et al., J. Biomec. Mat. Res., 41:244-250 (1998); Sah et al., Arch. Biochem. Biophys.; 308:137-147 (1994); la proteína morfogenética del hueso (BMP), Sato & Urist, Clin. Orthop. Relat. Res., 183:180-187 (1984); Chin et al., Arthritis Rheum., 34:314-324 (1991) y el factor de crecimiento transformante beta (TGF-\beta), Hill & Logan, Prog. Growth Fac. Res., 4:45-68 (1992); Guerne et al., J. Cell Physiol., 158:476-84 (1994); Van der Kraan et al., Ann. Rheum. Dis., 51:643-647 (1992). El tratamiento con factores de crecimiento peptídicos solo, o como parte de un dispositivo diseñado para su implantación, podría, en teoría, usarse para promover la reparación in vivo del cartílago dañado, o para promover la expansión de las células ex vivo antes de su trasplante. Sin embargo, debido a su tamaño relativamente pequeño, los factores de crecimiento son absorbidos y/o degradados rápidamente, creando por tanto un gran desafío terapéutico al intentar hacerlos accesibles a las células in vivo en cantidad suficientes y con una duración suficiente.

La presente invención propone resolver esta limitación mediante el suministro de un factor de crecimiento con un vehículo, y/o como una formulación de liberación lenta. El vehículo de suministro ideal es biocompatible, se puede resorber, tiene las propiedades mecánicas apropiadas, y da como resultado productos de degradación no dañinos.

Otro procedimiento para estimular la reparación del cartílago es inhibir la actividad de las moléculas que inducen la destrucción del cartílago y/o inhiben la síntesis de la matriz. Una molécula de este tipo es la citocina IL-1\alpha, la cual tiene efectos perjudiciales sobre varios tejidos en la articulación, incluyendo la generación de inflamación sinovial y la regulación al alza de las metaloproteinasas de la matriz y la expresión de prostaglandinas. V. Baragi, et al., J. Clin. Invest., 96:2454-2460 (1995); V. M. Baragi et al., Osteoarthritis Cartilage, 5:275-282 (1997); C. H. Evans et al., J. Leukoc. Biol., 64:55-61 (1998); C. H. Evans y P. D. Robbins, J. Rheumatol., 24:2061-2063 (1997); R. Kang et al., Biochem. Soc. Trans., 25:533-537 (1997); R. Kang et al., Osteoarthritis Cartilage, 5:139-143 (1997). Una forma de antagonizar la IL-1\alpha es a través del tratamiento con el antagonista soluble del receptor de IL-1 (IL-1ra), una proteína que ocurre de forma natural y que impide que la IL-1 se una a su receptor, inhibiendo de ese modo, tanto los efectos directos como los indirectos de la IL-1 sobre el cartílago. Otras citocinas, tales como la IL-1\beta, el factor alfa de la necrosis del tumor (TNF-\alpha), el interferón gamma (IFN-\gamma), la IL-6 y la IL-8, se han relacionado con la activación incrementada de células similares a los fibroblastos sinoviales, a los condrocitos y/o a los macrófagos. La inhibición de estas citocinas podría proporcionar un beneficio terapéutico en la prevención de la inflamación y la destrucción del cartílago. De hecho, se ha mostrado que las moléculas que inhiben la actividad del TNF-\alpha tienen potentes efectos beneficiosos sobre las articulaciones de los pacientes con artritis reumatoide.

Probablemente, el óxido nítrico también juega un papel sustancial en la destrucción del cartílago. [Ashok et al., Curr. Opin. Rheum., 10:263-268 (1998)]. A diferencia del tejido articular normal, el cual no produce NO a menos que se estimule con citocinas tales como la IL-1, las membranas sinoviales o el cartílago obtenido de articulaciones artríticas produce espontáneamente grandes cantidades de óxido nítrico durante hasta 3 días después de retirarlo de la articulación. Además, se hallan concentraciones incrementadas de nitritos en el fluido sinovial de pacientes artríticos. Además de su estimulación directa del catabolismo del cartílago, el óxido nítrico presente en una articulación inflamada probablemente conducirá a una vasodilatación y permeabilidad incrementadas, la liberación adicional de citocinas tales como el TNF-\alpha y la IL-1 a partir de leucocitos, y la estimulación de la angiogénesis. La evidencia de un papel causante del NO en la artritis procede de modelos animales, en los que se ha observado que la inhibición del NO previene la destrucción del cartílago mediada por la IL-1 y la muerte de condrocitos, así como la progresión de la osteoartritis. Finalmente, se ha mostrado que varios agentes (tales como la auranofina, los glucocorticoides, las ciclosporinas, la tetraciclinas, y la menos ciertos fármacos antiinflamatorios no esteroideos, incluyendo la aspirina) usados actualmente para el tratamiento de enfermedades reumáticas humanas, reducen la producción y/o actividad del NO.

Estudios previos en animales diabéticos (con niveles de insulina en suero alterados) o anormales (hipofisectomizados) sugieren que la insulina es necesaria para la producción óptima de mucopolisacáridos sulfatados y colágeno, dos componentes principales del tejido conectido. Tan pronto como en 1957, se mostró que la insulina incrementaba la de otro modo, anormalmente baja captación de sulfato marcado en la piel de ratas diabéticas. Schiller y Dorfman, J. Biol. Chem., 227:625-632 (1957). e forma similar, la insulina incrementaba el de otro modo bajo nivel de captación de sulfato en la aorta de ratas diabéticas. Cohen, M. P. y Foglia, V. G. Proc. Soc. Exp. Biol. Med., 132:376-378 (1969); Proc. Soc. Exp. Biol. Med., 133:1275-1278 (1970); Proc. Soc. Exp. Biol. Med., 135:113-115 (1970). Subsiguientemente, se mostró que la insulina estimulaba la captación de sulfato en el cartílago, pero no se determinó la identidad de las moléculas en las que se incorporaba el sulfato. Además, no se verificó el efecto de la insulina sobre el recambio de la matriz endógena (es decir, la rotura de proteína o retención dentro de la matriz). Salmon, W. D., Jr., y Daughaday, W H. Endocrinol., 82:493-499 (1957); J. Posever et al., J. Orthopaedic Res., 13:832-827 (1995). Aunque la insulina podría tener efectos directos sobre los tejidos conectivos, al menos ciertos datos sugieren que los defectos en el metabolismo del tejido conectivo hallados en los animales diabéticos, los cuales pueden revertirse al menos parcialmente mediante la administración sistémica de insulina, podrían deberse a factor(es) circulante(s) inducidos por la insulina, y no deberse a efectos directos de la insulina sobre los tejidos conectivos (Spanheimer, R. G., Matrix, 12:101-107 (1992).

Se ha hallado también que la insulina estimula el crecimiento de los cultivos de fibroblastos de ratón, Paul y Pearson, J. Endocrinol., 21:287-294 (1960), de las células cartilaginosas procedentes de ratas hipofisectomizadas (Salmon, W. D., Jr., J. Lab. Clin. Med., 56:673-681 (1960), de las células en cultivos óseos (Prasad, G. C. y Rajan, K. T., Acta Orthop. Scand., 41:44-56 (1970), así como de las células en muchos otros sistemas (Gey, G. O. y Thalhimer, W., J. Amer. Med. Assoc., 82:1609 (1924); Lieberman, I., y Ove, P. O., J. Biol. Chem., 234:2754-2758 (1959); Younger, L. R., King, J. y Steiner, O. F., Cancer Res., 26:1408-1413 (1966); Schwartz, A. G. y Amos, H., Nature, 219:1366-1367 (1968). La mayoría de estos estudios muy tempranos se realizaron con animales, órganos o tejidos completos. Hajek y Solursh, Gene Comp. Endocrin., 25:432-446 (1975) fueron de los primeros en mostrar un efecto directo de la insulina sobre los condrocitos, derivados de cartílago esternal embrionario de pollo, en cultivos sin suero. La estimulación del crecimiento y de la síntesis de mucopolisacáridos por parte de la insulina en estos cultivos podría no ser sorprendentes, dado que la hormona insulina incrementa la captación de aminoácidos, promueve un equilibrio del nitrógeno positivo, y favorece la síntesis global de proteínas. De forma similar, el incremento en la síntesis de proteoglicano, estimulado por la insulina en células tumorales de rata derivadas de un condrosarcoma de rata Swarm, estuvo acompañado por un incremento en la incorporación de radioisótopo en la proteína total y, por tanto, podría reflejar un incremento general en la síntesis de proteínas (Stevens, R. L. y Hascall, V. C., J. Biol. Chem., 256:2053-2058 (1981). Finalmente, debería tenerse presente que en muchos de estos estudios se usaron niveles elevados de insulina (10 \mug/ml para los cultivos de pollo, Hajek y Solursh, ver más arriba) A tales concentraciones elevadas, la insulina se une, y activa, el receptor del factor de crecimiento similar a la insulina (IGF)-1, imitando por tanto los efectos del propio IGF-1. Por tanto, los efectos fisiológicos observados podrían ser el resultado de la señal de receptor del IGF-1, y meramente el resultado de la señal de insulina. Finalmente, la administración sistémica de insulina no ha tenido efecto alguno en un modelo poliartrítico inflamatorio en ratas, en las cuales sólo se monitorizó el número de articulaciones hinchadas. Roszkowski-Sliz, W., Acta Physiol. Pol., XXIV:371-376 (1973). Puesto que, en modelos animales, la inflamación puede ocurrir en ausencia de destrucción de cartílago y hueso, y viceversa, Joosten et al., J. Immunol., 163:5049-5055 (1999), no está claro cómo la insulina podría haber afectado los tejidos articulares subyacentes en este estudio.

Hace más de treinta años, se inyectaron dosis elevadas de insulina en 10 pacientes, 7 de los cuales tenían artritis reumatoide, con la finalidad de inducir una crisis hipoglucémica, incrementar los niveles de esteroides, y, de ese modo, alterar la actividad de la glándula adrenal (M. Ippolito et al., Reumatismo, 20(5):561-564 (1967). El tratamiento con insulina asociada con cortisona resultó en efectos globales beneficiosos para los pacientes, incluyendo la recuperación del apetito, un incremento en el peso corporal, y una mejorar del dolor. Estos efectos podrían deberse a actividades indirectas de la insulina, por ejemplo, la capacidad de la insulina de incrementar los niveles de corticosteroides en plasma. Puesto que los autores estaban más interesados en los efectos de la insulina sistémica sobre el "sistema diencefalohipofisario", no se examinaron o consideraron los efectos anabólicos de la insulina sobre el cartílago. Además, dada la naturaleza avascular del cartílago y la rápida eliminación de la insulina in vivo, es improbable que mucho, si acaso alguno, de la insulina administrada subcutáneamente, hubiera estado disponible para los condrocitos en las articulaciones de los individuos tratados con insulina.

A diferencia de la OA, la pérdida de hueso es una característica común de la RA. La solicitud de patente japonesa JO 59-234.826, depositada el 7 de noviembre de 1984 también especulaba sobre la aplicación potencial de la insulina para el tratamiento de la artritis reumatoide, en base a su inducción de un marcador óseo, a saber, la actividad de la fosfatasa alcalina, en el línea celular (ósea) osteoblástica MC3T3-E1. Sin embargo, los efectos de la insulina sobre el propio tejido cartilaginoso no se examinaron o consideraron.

A medida que la población envejece y que la incidencia de la artritis crece, se necesita con urgencia una terapia efectiva para inducir la reparación del cartílago, incluyendo el cartílago dañado a resultas de un lesión y/o enfermedad.

Resumen de la invención

La presente invención concierne al uso de la insulina o una variante de la insulina en la fabricación de un medicamento para el tratamiento, reparación y protección del cartílago dañado a resultas de un trastorno cartilaginoso, incluyendo aquél que resulta de enfermedad y/o lesión, en donde el medicamento se formula para su inyección directa en la región afectada. La insulina o variante de insulina podría estar en un forma de liberación sostenida o ampliada.

Opcionalmente, el cartílago es un cartílago articular, y está contenido en un mamífero, y la cantidad administrada es un cantidad terapéuticamente efectiva. Opcionalmente, el trastorno cartilaginosos es la osteoartritis, la artritis reumatoide, o una lesión.

En una realización adicional, la presente invención concierne al uso anterior para el tratamiento de cartílago dañado por lesión, o a la prevención del daño inicial o continuado, el cual comprende poner en contacto dicho cartílago con una cantidad efectiva de insulina o de variante de insulina. Más específicamente, la lesión tratada es una microlesión o un trauma romo, una fractura condral, una fractura osteocondral, o un daño en tendones, meniscos o ligamentos. Más específicamente, el cartílago está contenido en un mamífero, incluyendo los humanos, y la cantidad administrada es un cantidad terapéuticamente efectiva. En un aspecto específico, la lesión podría ser el resultado de un estrés mecánico excesivo u otra inestabilidad biomecánica que resulte de lesiones deportivas u obesidad. Alternativamente, la presente invención concierne al uso anterior para tratar o facilitar la reparación de fracturas óseas, el cual comprende poner en contacto la región de la lesión ósea con una cantidad efectiva de insulina o de variante de insulina.

En una realización adicional, la presente invención concierne al uso anterior para el tratamiento de cartílago lesionado o para la prevención del daño inicial o continuado por parte de un trastorno y/o lesión del cartílago, el cual comprende poner en contacto dicho cartílago con una cantidad efectiva una composición que comprende adicionalmente insulina o una variante de insulina. Alternativamente, la composición comprende además un portador, excipiente o estabilizante. Alternativamente, el cartílago está presente en un mamífero y la cantidad administrada es un cantidad terapéuticamente efectiva. La composición se inyecta directamente en la región cartilaginosa o articulación afectada.

En una realización adicional, la presente invención concierne al uso anterior para el tratamiento del cartílago dañado o para la prevención del daño inicial o continuado por parte de un trastorno y/o lesión del cartílago, el cual comprende administrar un cantidad cantidad terapéuticamente efectiva una composición de liberación sostenida o ampliada, la cual comprende adicionalmente insulina o una variante de insulina. Alternativamente, el cartílago está presente en un mamífero y la cantidad administrada es un cantidad terapéuticamente efectiva. Más específicamente, la composición de liberación sostenida o ampliada contiene insulina o una variante de insulina formulada en una microencapsulación, una membrana semipermeable de polímeros hidrofóbicos sólidos, un(os) polímero(s) biodegradable(s),
o una dispersión (por ejemplo, suspensión o emulsión). Más específicamente, la membrana semipermeable de polímero hidrofóbico sólido es de ácido poliláctico-coglicólico (PLGA), y el polímero biodegradable es ácido hialurónico (HA) entrecruzado. Alternativamente, la composición de liberación ampliada o continuada de insulina o variante de insulina comprende además una sal de metal polivalente soluble en agua. Más específicamente, la sal de metal polivalente incluye la sal formada por un catión metálico y un ácido inorgánico u orgánico.

En una realización adicional, la invención concierne al uso anterior para tratar cartílago dañado o prevenir el daño inicial o continuado a resultas de una lesión o trastorno del cartílago, el cual comprende poner en contacto el cartílago con una cantidad efectiva de insulina o de variante de insulina, en combinación con una cantidad efectiva de un agente de cartílago. Opcionalmente, el cartílago está presente dentro de en un mamífero, y la cantidad administrada es un cantidad terapéuticamente efectiva.

En otra realización, la invención concierne a un procedimiento para mantener, potenciar o promover el crecimiento de condrocitos en cultivo sin suero, mediante la puesta en contacto de los condrocitos con una cantidad efectiva de insulina o de variante de insulina. Alternativamente, el procedimiento concierne a la puesta en contacto de los condrocitos con una cantidad efectiva de insulina o de variante de insulina en una formulación de liberación sostenida o ampliada. Alternativamente, la presente invención concierne a un procedimiento para estimular la regeneración o para prevenir la degradación del cartílago, a resultas de una lesión o de un trastorno del cartílago, mediante el trasplante de una cantidad efectiva de condrocitos previamente tratados con una cantidad efectiva de insulina o variante de insulina.

[...] El presente medicamento podría administrarse antes, después y/o simultáneamente a un técnica quirúrgica de cartílago estándar. En un aspecto específico, la técnica quirúrgica estándar podría seleccionarse de entre los siguientes procedimientos: erosión del cartílago, condroplastia de abrasión, reparación con láser, desbridamiento, condroplastia, microfractura con o sin penetración del hueso subcondral, mosaicoplastia, aloinjerto de células del cartílago, autoinjerto de células madre, injertos de cartílago costal, estimulación química, estimulación eléctrica, autoinjertos pericondrales, autoinjertos perióstica, andamios de cartílago, autoinjertos o aloinjertos de cáscara (osteoarticular), u osteotomía.

En una realización adicional, la invención concierne a ácido nucleico que codifica la insulina y/o variantes de la insulina, y a vectores y células recombinantes que comprenden dicho ácido nucleico.

En otra realización, la presente invención concierne a un equipo terapéutico, el cual comprende insulina y/o una variante de la insulina, y un portador, excipiente y/o estabilizante (por ejemplo, un tampón) en un envase apropiado. El equipo preferiblemente contiene instrucciones para usar la insulina para tratar el cartílago dañado o para prevenir el daño inicial o continuado del cartílago a resultas de un trastorno del cartílago. Alternativamente, el equipo podría incluir instrucciones para usar la insulina para tratar un trastorno del cartílago.

En una realización adicional, la invención concierne a un artículo manufacturado que comprende:

un contenedor;

una instrucción sobre el contenedor;

y una composición que comprende un agente activo contenida dentro del contenedor;

en donde la composición es efectiva para tratar un trastorno del cartílago, la instrucción sobre el contenedor indica que la composición puede usarse para tratar un trastorno del cartílago, y el agente activo en la composición es un agente que estimula la reparación y/o previene la degradación del cartílago. En un aspecto preferido, el agente activo es la insulina o una variante de la insulina.

Descripción resumida de las figuras

La Figura 1 muestra el efecto que tiene la insulina sobre la síntesis de matriz en condrocitos articulares primarios (ACs). La insulina a diferentes concentraciones (0,1-100 nM) en medio sin suero indujo los condrocitos primarios, procedentes de cartílago articular porcino, a incrementar la síntesis de proteoglicano en relación a las muestras control no tratadas (-), y fue capaz de superar la inhibición de la síntesis inducida por la interleucina-1\alpha (IL-1\alpha). El contenido de proteoglicano en el medio se analizó usando el ensayo colorimétrico con DMMB. "*" indica una diferencia significativa (p < 0,05) respecto de la del control correspondiente (- ó +IL1\alpha).

La Figura 2 muestra que el tratamiento con insulina, a lo largo de un extenso período de tiempo (6 días), a varias concentraciones (1-100 nM) en medio sin suero, resultó en un metabolismo incrementado de los condrocitos articulares primarios, según se determinó mediante un ensayo colorimétrico que mide la actividad metabólica de las células cultivadas en base a la capacidad de las células viables para romper la sal de tretrazolio MTT amarilla para formar cristales de formazán púrpuras.

La Figura 3 muestra los efectos anabólicos de la insulina sobre los explantes de cartílago articular. El tratamiento con insulina de explantes de cartílago articular porcino cada día durante 3 días resultó en una disminución de la ruptura de la matriz inducida por la IL-1\alpha, según se determinó midiendo la cantidad de proteoglicanos en el medio usando el ensayo con DMMB (panel superior, Figura 3A). El tratamiento también incrementó significativamente la síntesis de matriz, y superó parcialmente la inhibición de la síntesis de la matriz inducida por la IL-1\alpha (panel inferior, Figura 3B).

La Figura 4 muestra los efectos de la insulina sobre la retención de proteínas de la matriz cartilaginosa. La inhibición de la ruptura de la matriz y la inducción de la síntesis de la matriz por parte de la insulina (tal como se mostró más arriba en la Figura 3) resultó en un incremento en la cantidad de matriz que permanecía en el tejido cartilaginoso al final del tratamiento de 3 días. La insulina también fue capaz de superar la disminución en el contenido de matriz inducida por la IL-1\alpha (+ vs. Ins+).

La Figura 5 muestra que la insulina y la IGF-1 disminuyen la liberación de óxido nítrico por parte de los explantes de AC Se recolectaron los medio procedentes de explantes de cartílago articular, los cuales se trataron con insulina (0,5-100 nM), IGF-1(1-100 ng/ml) o medio solo (-) en ausencia (panel superior, 5A (-)) o presencia (panel inferior, 5B (+)) de IL-1\alpha. La cantidad de nitrito en el medio se midió usando 2,3-diaminonaftaleno (DAN), el cual reacciona con el nitrito en condiciones ácidas para formar el 1-(H)-naftotriazol, un producto fluorescente.

La Figura 6 muestra un diagrama pictórico del ensayo en rótula. A continuación de la inyección intraarticular de una determinada "proteína" en las articulaciones de la rodilla de ratón, se recogieron las rótulas, se marcaron con ^{35}S-sulfato, se fijaron, descalcificaron, de diseccionaron aparte del hueso subyacente, y se contaron. La cantidad de radiactividad incorporada en el cartílago en una indicación del nivel de síntesis de matriz.

La Figura 7 muestra el efecto de la insulina sobre la rótula de ratón. La rótulas se recolectaron a partir de ratones y se incubaron con IL-1\alpha o con insulina (Ins) durante 24 horas. Durante las tres últimas horas, las rótulas se marcaron con ^{35} S-sulfato. A continuación se procesaron las rótulas como se describió en la Figura 6. En este modelo, la IL-1\alpha disminuyó y la insulina incrementó la síntesis de matriz este ensayo con cartílago articular intacto (panel superior, Figura 7A - tratamiento in vitro). Para los análisis in vivo, se inyectaron los ratones en una rodilla con insulina y en la otra rodilla con tampón solo (PBS+0,1% BSA) cada día durante tres días, y las rótulas se recolectaron y analizaron en el ensayo de rótula. Se muestran (panel inferior, Figura 7B) dos experimentos separados. En el primer experimento (lado izquierdo), los ratones se inyectaron diariamente con 6 \mul de una solución madre de insulina de 10 mg/ml, y las rótulas se recolectaron 3 horas después de la tercera inyección. En el segundo experimento (lado derecho), los ratones se inyectaron diariamente con 3 \mul de una solución madre de 10 mg/ml, y las rótulas se recolectaron 3 horas después de la tercera inyección. Los resultados se expresan como la cantidad de incorporación radiactiva respecto el control (rodilla contralateral), de forma que todo valor superior a 1,0 indica una inducción de la síntesis en la rodilla tratada con insulina.

La Figura 8 muestra la degeneración articular espontanea que ocurre en cobayas Hartley a medida que envejecen. La degeneración de la articulación femorotibial de los cobayas Hartley machos ocurre de forma dependiente de la edad, tal como se muestra mediante análisis histológico del cartílago articular a varias edades (6, 9 y 12 meses, lado izquierdo, Figura 8A). Los cambios histopatológicos se evaluaron como mínimos, moderados, o graves (lado derecho, Figura 8B). Los cambios mínimos incluyen la degradación focal de condrocitos, la ruptura de la capa superficial del cartílago, y una tinción disminuida de la matriz con azul de toluidina. Las lesiones leves fueron similares, pero abarcaban hasta un tercio de la superficie, y a menudo afectaban parte de la capa media. Los cambios moderados cubrían la mayoría de la superficie e incluían la mayoría de la capa media. Los cambios graves tenían una amplia degeneración de la capa profunda, osteofitos, clonación de condrocitos, espesamiento del hueso subcondral, hiperplasia sinovial y fibrosis. Cada asterisco (*) representa una unión articular. (Datos adaptados, procedentes de Wei, L. et al., Arthrits Rheum., 40:2075-2083 (1997) y Bendele, A., Lab. Anim. Sci., 39:115-121 (1989).

La Figura 9 muestra que la insulina tiene un efecto anabólico sobre el cartílago normal y enfermo. Se recolectó el cartílago articular procedente de cobayas Hartley machos, y se cultivaron como explantes en medio sin suero, sin (-) o con insulina (Insulina) a 100 nM. La incorporación de ^{35}S-sulfato se usó como una indicación de la síntesis de proteoglicanos. Hay que destacar que en todas las edades (por ejemplo, 1-2 meses - Figura 9A, 6 meses - Figura 9B, y 11 meses - Figura 9C) la insulina estimuló significativamente la síntesis de proteoglicanos.

La Figura 10 muestra que la insulina disminuyó el catabolismo del cartílago articular del cobaya. La insulina (Ins) disminuyó la cantidad de ruptura de la matriz, según se determinó midiendo la cantidad de proteoglicanos liberados a partir de explantes de cartílago articular procedentes de cobayas Hartley machos de 11 meses de edad. Después de tres días de tratamiento, los explantes de cartílago se digirieron durante la noche, y la cantidad de proteoglicanos que permanecían en el tejido se determinó usando el ensayo con DMMB (lado derecho, "tejido"). La disminución en ruptura de la matriz (medio), y el incremento en la síntesis de matriz (Figura 9) resultaron en un incremento en la cantidad de matriz que permanecía en el tejido al final del tratamiento de 3 días (tejido).

La Figura 11 muestra el efecto de la insulina sobre el cartílago de ratones diabéticos. Se recolectaron las rótulas procedentes de ratones diabéticos, hipoinsulinémicos (tratados con estreptozotocina), y se midió la síntesis de matriz después de cultivarlos (18 horas) en ausencia (-) o presencia (+Ins) de insulina 100 nM (Figura 6). La síntesis basal fue inferior en los ratones diabéticos (Diab-) que en los ratones control (Con-). Sin embargo, el tratamiento con insulina llevó los niveles de síntesis en el cartílago de los ratones diabéticos (Diab+Ins) hasta niveles comparables a los de los controles no tratados (Con-Ins) Además, el alcance de la inducción en los tejidos control y diabético fue similar.

La Figura 12 muestra la liberación acumulativa de HI a partir de microesferas de PLGA. La Formulación II (ver ejemplo 7) de microesferas encapsuladas con PLGA se colocó en histidina 10 mM, NaCl 10 mM, 0,02% de polisorbato 20, 0,02% de NaN_{3}, pH 7,2 y se incubó a 37ºC. La totalidad del medio de liberación se remplazó en cada intervalo de muestreo, y las muestras de liberación resultantes de analizaron con insulina bioactiva en un ensayo del receptor de quinasa de insulina (KIRA).

Las Figuras 13A-13B muestran la liberación de la insulina, a partir de la encapsulación en PLGA, en el fluido sinovial. La PLGA-Ins se incubó en fluido sinovial recolectado a partir de articulaciones de rodilla de rata, y se tomaron muestras diariamente para ensayar la actividad de la insulina en un ensayo del receptor de quinasa de insulina (KIRA). Como control, también se ensayó fluido sinovial enriquecido con insulina a 500 nM (SF+I-500) justo antes del KIRA. El propio fluido sinovial no tenía ninguna actividad de insulina detectable (no se muestran los datos). La Figura 13A muestra la liberación de los días 1-3, mientras que la Figura 13B es una gráfica expandida de los datos de A con la liberación de los días 2 y 3. Los resultados se expresan como concentración nM de insulina activa.

La Figura 14 muestra la actividad de la insulina (según KIRA) en muestras recolectadas diariamente a partir de muestras incubadas a 37ºC y en 5% de CO_{2} en varias condiciones de cultivo. Cada día se recolectó medio y se ensayó en busca de actividad de insulina en el ensayo del receptor de quinasa de insulina (KIRA). Los resultados se expresan como concentración nM de insulina activa. En la Figura 14A, las muestras procedían de insulina que se incubó en medio de explante sin suero a 37ºC y 5% de CO_{2}. En la Figura 14B, la misma solución de medio-insulina que en la Figura 14A se añadió a explantes de cartílago articular porcino. En la Figura 14C, la insulina microencapsulada en PLGA (PLGA-Ins) se añadió a los explantes, y en la Figura 14D, esta solución de PLGA-Ins se diluyó 1:10 y se añadió a los explantes.

Las Figuras 15A-F muestran el efecto de la PLGA-Ins sobre los explantes de cartílago. Las Figuras 15A-B examinan el efecto sobre la ruptura de la matriz. PLGA-Ins se añadió una vez (en el instante 0) a los explantes, en ausencia (Figura 15A -) o presencia (Figura 15B +) de IL-1\alpha (1 ng/ml), y la cantidad de proteoglicanos en el medio (es decir, liberados por los explantes) se midió usando el ensayo con DMMB. El medio se cambió a las 24 h y 48 h, sin añadir PLGA-Ins adicional. Por contra, las muestras tratadas con insulina (10 nM) (Ins10) recibieron insulina fresca con el cambio de medio en cada intervalo de tiempo (0, 24 h, 48 h). Los resultados se expresan como proteoglicano (\mug) liberados a lo largo de 24 horas. Un único tratamiento con PLGA-Ins fue capaz de disminuir tanto la ruptura de matriz basal como la inducida por IL-1\alpha. Las Figuras 15C-D examinan el efecto de la PLGA-Ins sobre la síntesis de matriz. Se añadió la PLGA-Ins a los explantes en ausencia (superior) o presencia (inferior, +) de IL-1\alpha (1 ng/ml) durante 3 días. La PLGA-Ins se añadió sólo en el instante 0, mientras que la insulina (10 nM) (Ins10) se añadió con el cambio de medio en cada intervalo de tiempo (0, 24 h, 48 h). Durante las últimas 15 horas de tratamiento, los explantes se marcaron con ^{35}S-sulfato, y las proteínas de la matriz marcadas se precipitaron y recontaron (c.p.m.). Tal como se muestra aquí, la PLGA-Ins indujo la síntesis de matriz, y superó la inhibición de la síntesis de proteoglicanos inducida por la IL-1\alpha. Las Figuras 15E-F examinan el efecto sobre la producción de óxido nítrico (NO). Se añadió PLGA-Ins a los explantes en ausencia (superior) o presencia (inferior, +) de IL-1\alpha (1 ng/ml), y se determinó la cantidad de nitrito (\muM) en el medio. La PLGA-Ins se añadió sólo en el instante 0, mientras que la insulina (10 nM) (Ins10) se añadió con el cambio de medio en cada intervalo de tiempo (0, 24 h, 48 h). Un único tratamiento con PLGA-Ins disminuyó la producción basal de óxido nítrico, e inhibió la inducción de la síntesis de óxido nítrico por parte de la IL-1\alpha.

La Figura 16 muestra el efecto in vivo de la PLGA-insulina. Se inyectó PLGA-Ins en el espacio articular las patas traseras de ratones. En la rodilla contralateral se inyectó tampón (PBS + 0,1% de BSA) como un control (-). Los resultados se expresan como la cantidad de radiactividad (c.p.m.)/rótula. Cada línea representa un único ratón.

Las Figuras 17A y 17B son diagramas que representan la estructura primaria de la insulina. Se muestra un diagrama comparativo de la estructura primaria de insulinas de vertebrados seleccionadas (Figura 17A), y la estructura primaria de la proinsulina porcina (Fig. 17B). Los datos de adaptaron a partir de Hadley, M. E., Endrocrinology, Prentice Hall Inc., 1988.

La Figura 18 muestra la secuencia nativa de la cadena A de la secuencia nativa de la cadena A (Figura 18A) (SEC. Nº ID.:1), de la cadena B (Figura 18B) (SEC. Nº ID.: 2), de la secuencia nativa de la proinsulina (Figura 18C) (SEC. Nº ID.: 3), y de la cadena C (Figura 18D) (SEC. Nº ID.: 4).

Las Figuras 19A y 19B muestra en el efecto sobre la síntesis de la matriz en cartílago articular humano del IGF, del IGF mutante que no se une al BP de IGF, y de la insulina. Se muestra que la insulina (Ins), pero no el IGF-1 (IGF) inducen la síntesis de matriz cartilaginosa en el cartílago articular. Los tejidos se trataron con los agentes indicados durante 24 horas, durante las cuales se midió la síntesis de proteoglicanos marcando el cartílago con ^{35}S-sulfato. La Figura 19A muestra los resultados sobre tejido extraído de un hombre blanco de 63 años de edad con enfermedad degenerativa articular (DJD), el cual se trató con IGF-1 (100 ng/ml), desIGF (100 ng/ml) o insulina (13,15 nM - concentración molar equivalente a 100 ng/ml de IGF-1). La Figura 19B muestra los resultados sobre tejido extraido de una mujer de 70 años de edad con osteoartritis (OA), el cual se trató con IGF-1 (80 ng/ml), desIGF (80 ng/ml) o insulina (10,54 nM - concentración molar equivalente a 80 ng/ml de IGF-1).

Descripción detallada de la invención La osteoartritis y la artritis reumatoide

La artritis reumatoide es una enfermedad sistémica, autoinmune, degenerativa que causa alteraciones simétricas en el sinovio de las articulaciones grandes y pequeñas por igual. A medida que la enfermedad progresa, los síntomas de la artritis reumatoide podrían incluir la fiebre, la pérdida de peso, el adelgazamiento de la piel, la implicación multiorgánica, la escleritis, la formación de nódulos subcutáneos o subperiósticos, y la muerte prematura. En contraste con la OA, los síntomas de la RA aparecen durante la juventud, las manifestaciones extraarticulares puede afectar cualquier sistema de órgano, y la destrucción de las articulaciones es simétrica y ocurren en las articulaciones grandes y pequeñas por igual. Los síntomas extraarticulares incluyen la vasculitis, la atrofia de la piel y del músculo, los nódulos subcutáneos, la linfadenopatía, la esplenomegalia, la leucopenia y la anemia crónica. Además, la RA es de naturaleza heterogénea, con una expresión de la enfermedad variable, y está asociada la formación del factor reumatoide del suero en el 90% de los pacientes el algún momento durante el curso de la enfermedad.

De forma interesante, los paciente con RA tienen también un sistema inmune hiperactivo. La gran mayoría de las personas con RA tienen una susceptibilidad genética asociada con la activación incrementada de las moléculas del complejo de histocompatibilidad principal de clase II sobre monocitos y macrófagos. Estas moléculas del complejo de histocompatibilidad están implicadas en la presentación del antígeno a células T activadas portadoras de receptores para estas moléculas de la clase II. La predisposición genética a la RA está apoyada por la prevalencia del antígeno DR contra leucocitos altamente conservado, subtipos Dw4, Dw14 y Dw15, en pacientes humanos con una enfermedad muy grave.

Los monocitos y macrófagos activados, al interaccionar con las células T apropiadas, estimulan una cascada de sucesos, incluyendo la activación extra de monocitos y macrófagos adicionales, células T, células B y células endoteliales. Con la regulación al alza de las moléculas de adhesión, células mononucleares y células polimorfonucleares adicionales son atraídas hacia la articulación inflamada. Este influjo estimula la secreción de citocinas quimiotácticas adicionales, potenciando de ese modo el influjo de células inflamatorias dentro del sinovio y del fluido sinovial.

La osteoartritis (OA) es un enfermedad degenerativa localizada que afecta el cartílago articular y el hueso y resulta en dolor y una función articular disminuida. La OA podría clasificarse en dos tipos: primaria y secundaria. La OA primaria se refiere al espectro de enfermedades articulares degenerativas para las cuales no se ha determinado un etiología subyacente. Típicamente, las articulaciones afectadas por la OA primaria son las articulaciones interfalángicas de las manos, las primeras uniones carpometacarpianas, la cadera, las rodillas, la columna vertebral, y algunas articulaciones en el mediopié. De forma interesante, parece que las articulaciones grandes, tales como el tobillo, los codos y los hombros tienden a ser respetadas en la OA primaria. Por contra, la OA secundaria ocurre a menudo a resultas de una lesión o trauma definido. La artritis secundaria puede hallarse también en individuos con enfermedades metabólicas tales como la hemocromatosis y la alcaptonuria, con anormalidades del desarrollo tales como la displasia del desarrollo de la cadera (dislocación congénita de la cadera) y discrepancias en la longitud de las extremidades, con obesidad, con artritis reumatoides tales como la artritis reumatoide o gota, la artritis sépticas, y la artritis neuropática.

La OA es un trastorno degenerativo, progresivo. La degradación asociada con la OA aparece inicialmente como deshilachamiento y fibrilación de la superficie del cartílago articular a medida que se pierden proteoglicanos de la matriz. Con el uso continuado de la articulación, la fibrilación de la superficie progresa, los defectos penetran más profundamente en el cartílago, y se pierden piezas del tejido cartilaginoso. Además, el hueso que subyace el cartílago (hueso subcondral) se espesa, y, a medida que se pierde el cartílago, el hueso que lentamente expuesto. Con la destrucción asimétrica del cartílago, puede ocurrir la desfiguración. Los nódulos óseos, denominados osteofitos, se forman a menudo en la periferia de la superficie del cartílago y ocasionalmente crecen por encima de las áreas erosionadas adyacentes. Si la superficie de estas excrecencias óseas se filtra, podría darse la hipertrofia vascular y causar la formación de tapones de tejido que contienen fibrocartílago.

Puesto que el cartílago es avascular, la lesión lesión que le sucede a la capa de cartílago pero que no penetra el hueso subcondral, deja el trabajo de la reparación a los condrocitos residentes, los cuales tienen poco potencial intrínseco para replicarse. Sin embargo, cuando se penetra el hueso subcondral, su aporte vascular permite que tenga lugar un proceso de reparación trifásico. El cartílago subóptimo que se sintetiza en respuesta a este tipo de lesión, denominado en la presente "fibrocartílago" a causa de su matriz fibrosa, tiene propiedades bioquímicas y mecánicas subóptimas, y, por tanto, está sometido a una desgaste y destrucción adicionales. En una articulación enferma o lesionada, la liberación incrementada de metaloproteinasas (MMP) tales como las colagenasas, las gelatinasas, la agrecanasas y otras proteasas, conduce a un adelgazamiento y pérdida adicionales del cartílago. Los estudios in vitro han mostrado que las citocinas tales como la IL-1\alpha, IL-1\beta, TNF-\alpha, PDGF, GM-CSF, IFN-\gamma, TGF-\beta, LIF, IL-2 e IL-6, IL-8 pueden alterar la actividad de las células similares a fibroblastos sinoviales, de los macrófagos, de las células T, y/o de los osteoclastos, sugiriendo que estas citocinas podrían regular in vivo el recambio de la matriz del cartílago. Como tales, cualquiera de estas citocinas podría amplificar y perpetuar in vivo el ciclo destructivo de la degeneración articular. De hecho, se ha mostrado que la inhibición de la actividad de la IL-1 o TNF-\alpha en animales y humanos artríticos es una forma efectiva en la cual al menos aminorar la progresión de la artritis. Mientras que los sucesos iniciadores en la RA y OA son claramente diferentes, la subsiguiente pérdida de cartílago y hueso en estos dos trastornos degenerativos parece implicar muchas de las mismas citocinas y proteinasas.

Las propiedades mecánicas del cartílago están determinadas por su composición bioquímica. Mientras que la arquitectura del colágeno contribuye a la resistencia a la tensión y rigidez del cartílago, la compresibilidad (o elasticidad) es debida a su componente de proteoglicano. En el cartílago articular sano, predomina el colágeno del tipo II (comprendiendo aproximadamente el 90-95%), sin embargo, también están presentes pequeñas cantidades de los tipos de colágeno V, VI, IX, y XI. Los proteoglicanos del cartílago (PG) incluyen los PG que se agregan, hidrodinámicamente grandes, con glicosaminoglicanos sulfatados unidos covalentemente, así como PG que no se agregan, hidrodinámicamente más pequeños, tales como la decorina, el biglicano y el lumicano.

Tipos de lesiones del cartílago

Las lesiones del cartílago se dividen en tres categorías: (1) microlesión o trauma romo, (2) fracturas condrales, y (3) fracturas osteocondrales.

La microlesión de los condrocitos y de la matriz cartilaginosa podría estar causada por un único impacto, a través de trauma romo repetitivo, o con el uso continuo de una articulación biomecánicamente inestable. De hecho, los cambios metabólicos y bioquímicos tales como los hallados en las primeras etapas de la artritis degenerativa pueden replicarse en modelos animales que implican la carga repetitiva del cartílago articular. Radin et al., Clin. Orthop. Relat. Res., 131:288-293 (1978). Tales experimentos, junto con el patrón característico de pérdida de cartílago hallado en las articulaciones artríticas, destacar el papel que la carga biomecánica juega en la pérdida de la homeostasis y de la integridad del cartílago en la enfermedad. Radin et al., J. Orthop. Res., 2:221-234 (1984); Radin et al., Semin. Arthritis Rheum., (supl. 2) 21:12-21 (1991); Wei et al., Acta Orthop. Scand., 69:351-357 (1998). Aunque los condrocitos podrían ser capaces inicialmente de rellenar la matriz de cartílago con proteoglicanos a una velocidad basal, la lesión concurrente de la red de colágeno podría incrementar la velocidad de pérdida y resultar en la degeneración irreversible. Buckwalter et al., J. Am. Acad. Orthop. Surg., 2:192-201 (1994).

Las fracturas condrales se caracterizan por la ruptura de la superficie articular sin violación de la placa subcondral. En el sitio de la lesión se presenta necrosis de condrocitos, seguida por una actividad mitótica y metabólica incrementada de los condrocitos supervivientes que bordean la lesión, lo que conduce al recubrimiento de las grietas de la superficie articular con tejido fibroso. El incremento en actividad de los condrocitos es transitorio, y la respuesta de reparación resulta en una cantidad y calidad insuficiente de los componentes de la nueva matriz.

Las fracturas osteocondrales, la más grave de los tres tipos de lesiones, son lesiones que cruzan la marca de agua hacia la placa subcondral subyacente. En este tipo de lesión, la presencia de vasculatura subcondral elicita la respuesta de tres fases que se encuentra típicamente en tejidos vasculares: (1) necrosis, (2) inflamación, y (3) reparación. Inicialmente, la lesión se llega con sangre y coágulos. El coágulo de fibrina resultante activa una respuesta inflamatoria y se convierte en tejido de reparación vascularizado, y los diferentes componentes celulares liberan factores de crecimiento y citocinas, incluyendo el factor de crecimiento transformante beta (TGF-\beta), el factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF), las proteínas morfogénicas del hueso, y los factores similares a la insulina I y II. Buckwalter et al., J. Am. Acad. Orthop. Surg., 2:191-201 (1994).

La respuesta de reparación inicial asociada con las fracturas osteocondrales está caracterizada por el reclutamiento, proliferación y diferenciación de los precursores en condrocitos. Las células madre mesenquimales se depositan en la red de fibrina, la cual eventualmente se convierte en una zona fibrocartilaginosa. F. Shapiro et al., J. Bone Joint Surg., 75:532-553 (1993); N. Mitchell y N. Shepard, J. Bone Joint Surg., 58:230-233 (1976). Estas células madre, las cuales se cree que proceden de la médula ósea subyacente en vez de la superficie articular adyacente, progresivamente se diferencian en condrocitos. A las seis a ocho semanas después de la lesión, el tejido de reparación contiene células similares a condrocitos en una matriz de proteoglicanos y, predominantemente, colágeno del tipo II, con algo de colágeno del tipo I. T. Furukawa et al., J. Bone Joint Surg., 62:79-89 (1980); J. Cheung et al., Arthritis Rheum., 23:211-219 (1980); S. O. Hjertquist y R. Lemperg, Calc. Tissue Res., 8:54-72 (1971). Sin embargo, esta matriz nuevamente depositada degenera, y el tejido condral es remplazada por más tejido fibroso y fibrocartílago, y por un cambio en la síntesis de colágeno, del tipo II al tipo I. H. F. S. Cheung et al., J. Bone Joint Surg., 60:1076-1081 (1978); D. Hamerman, "Prospects for medical intervention in cartilage repair", en Joint cartilage degradation: Basic and clinical aspects, editores Woessner J F et al., (1993); Shapiro et al., J. Bone Joint Surg., 75:532-553 (1993); N. Mitchell y N. Shepard, J. Bone Joint Surg., 58:230-233 (1976); S. O. Hjertquist y R. Lemperg, Calc. Tissue Res., 8:54-72 (1971). Los cambios degenerativos tempranos incluyen la fibrilación de la superficie, el agotamiento de los proteoglicanos, la clonación y muerte de condrocitos, y la formación de fisuras verticales desde la superficie hasta las capas profundas. Una año después de la lesión, el tejido de reparación es una mezcla de fibrocartílago y cartílago hialino, con una cantidad sustancial de colágeno del tipo I, el cual no se halla en cantidades apreciables en el cartílago articular normal. T. Furukawa, et al., J. Bone Joint Surg., 62:79-89 (1980).

Desde un cierto punto de vista clínico, el tejido de reparación fibrocartilaginoso podría funcionar satisfactoriamente durante un cierto tiempo. Sin embargo, el fibrocartílago tiene propiedades biomecánicas inferiores respecto a las del cartílago hialino normal. Las fibras de colágeno en el fibrocartílago están dispuestas en una orientación aleatoria con un módulo elástico inferior al del cartílago hialino normal. J. Colletti et al., J. Bone Joint Surg., 54:147-160 (1972). La permeabilidad del tejido de reparación es también más elevada, reduciendo por tanto la capacidad del tejido para soportar una carga de presión de fluido. H. Mankin et al., "Form and Function of Articular Cartilage", en Orthopaedic Basic Science, editor Simon & Schuster, American Academy of Orthopeadic Surgeons, Rosemont, Ill. (1994). Estos cambios resultan en una deformación viscoelástica incrementada, haciendo que el tejido de reparación sea menos capaz de sostener una carga repetitiva que el cartílago articular normal. Se ha descrito que los niveles de glicosaminoglicanos (GAG) en el cartílago adyacente a los defectos osteocondrales están reducidos en un 42% respecto los valores normales, indicando que la lesión conduce a la degeneración más allá del defecto inicial. Osteoarthritis Cartilage, 3:61-70 (1995).

Trasplante y supervivencia de condrocitos

El trasplante de condrocitos, las células responsables de secretar la matriz del cartílago, se ha sugerido también como un medio de efectuar la reparación del cartílago. Sin embargo, las desventajas de los aloinjertos, por ejemplo, la posibilidad de la respuesta inmunogénica del huésped, así como la transmisión de enfermedades virales y otras enfermedades infecciosas, ha limitado de forma efectiva el alcance de los trasplantes alogénicos de condrocitos. Aunque estos riesgos pueden minimizarse usando el tejido o células del propio paciente, este procedimiento requiere cirugía adicional, la creación de una lesión nueva en el cartílago del paciente, y el cultivo y crecimiento caro de las células específicas del paciente.

Cuando se cultivan como monocapas sobre placas de cultivo de tejidos, los condrocitos se desdiferenciarán, y con el tiempo en cultivo, pasan a parecerse a fibroblastos. Por ejemplo, la producción de colágeno cambiará desde predominantemente del tipo II al tipo I, y las células sintetizarán una proporción incrementada de ácido hialurónico en relación al contenido total de glicosaminoglicanos (GAG). W. Green, Clin. Orthop. Relat. Res., 124:237-250 (1977). Sin embargo, los condrocitos cultivados en geles de colágeno o como cultivos agregados mantendrán su morfología normal, también la síntesis de proteoglicanos y colágeno del tipo II, y mantendrán su capacidad para acumular matriz metacromática in vitro. Por tanto, en estas condiciones, los condrocitos permanecerán relativamente diferenciados y fenotípicamente estables in vitro durante hasta varias semanas. T. Kimura et al., Clin. Orthop. Relat. Res., 186:231-239 (1984).

Ingeniería del tejido

Las dificultades y el coste asociado con el cultivo de condrocitos ha conducido al diseño de implantes sembrados con condrocitos o libres de células para la reparación del cartílago articular usando una variedad de biomateriales, incluyendo: el hueso desmineralizado o tratado enzimáticamente, Dahlberg. et al., J. Orthop. Res., 9:11-19 (1991); B. C. Toolan et al., J. Biomed. Mat. Res., 41:244-250 (1998); ácido poliláctico, C. R., Chu et al., J. Biomed. Mat. Res., 29:1147-1154 (1995); ácido poliglicólico, C. A. Vacanti et al., Mat. Res. Soc. Symp. Proc., 252:367-274 (1992); compuestos de hidroxiapatito/Dracon, K. Messner y J. Gillquist, Biomaterials, 14:513-521 (1993); fibrina, D. A. Hendrickson et al., J. Orthop. Res., 12:485-497 (1994); geles de colágeno, D. Grande et al., J. Orthop. Res., 7:208-218 (1989), S. Wakitani et al., J. Bone Joint Surg., 71:74-80 (1989), S. Wakitani et al., J. Bone Joint Surg., 76:579-92 (1994); y fibra de colágeno, J. M. Pachence et al., "Development of a tissue analog for cartilage repair", en Tissue inducing biomaterials, editores L. Cima y E. Ron, Materials Research Soc. Press., Pittsburgh, Pa. (1992); B. C. Toolan et al., J. Biomed. Mat. Res., 31:273-280 (1996). Los tejidos alternativos emplearon tejido sinovial, A. G. Rothwell, Orthopedics, 13:433-442 (1990); o tejidos ricos en células madre mesenquimales (por ejemplo, médula ósea o tejido perióstico), K. Messner y J. Gillquist, Mat. Res. Soc. Symp. Proc., 252:367-374 (1992).

Técnicas quirúrgicas estándares del cartílago

La presente composición podría administrarse también en combinación con cualquier técnica quirúrgica de cartílago estándar. Las técnicas quirúrgicas estándares son procedimientos quirúrgicos empleados comúnmente para las manipulaciones del cartílago, incluyendo: la erosión del cartílago, la condroplastia de abrasión, la reparación con láser, el desbridamiento, la condroplastia, la microfractura con o sin penetración del hueso subcondral, la mosaicoplastia, el aloinjerto de células del cartílago, el autoinjerto de células madre, los injertos de cartílago costal, la estimulación química, la estimulación eléctrica, los autoinjertos pericondrales, los autoinjertos perióstica, los andamios de cartílago, los autoinjertos o aloinjertos de cáscara (osteoarticular), o la osteotomía. Estas técnicas se describen y discuten en mayor detalle en Frenkel et al., Front. Bioscience, 4:d671-685 (1999).

Agentes del cartílago

En combinación con, o en lugar de la manipulación del tejido, la administración de agentes del cartílago (por ejemplo, factores de crecimiento peptídicos) se ha considerado como una vía para aumentar la reparación del cartílago. Los agentes del cartílago son reguladores muy significativos de la diferenciación, migración, adhesión y metabolismo de las células del cartílago. F. F. S. Chen et al., Am J. Orthop., 26:396-406 (1997). Puesto que los agentes del cartílago son proteínas solubles de peso molecular relativamente pequeño y son rápidamente absorbidas y/o degradadas, es un gran desafío hacerlas disponibles para las células en cantidad suficiente y durante la duración suficiente. Por tanto, las proteínas secretadas deben incorporarse en dispositivos diseñados, implantables, para su máxima efectividad. El vehículo de suministro ideal es biocompatible, se puede resorber, tiene las propiedades mecánicas apropiadas, y se degrada en subproductos no tóxicos.

Varios péptidos secretados tienen el potencial de inducir la reparación del cartílago del huésped sin trasplante de células. El factor de crecimiento similar a la insulina (IGF-1) estimula la síntesis de matriz ósea y la proliferación de células en cultivo, K. Osborn, J. Orthop. Res. 7:35-42 (1989), y la insuficiencia de IGF-1 podría tener un papel etiológico en el desarrollo de la osteoartritis. R. D. Coutts, et al., Instructional Course Lect., 47:487-494, Amer. Acad. Orthop. Surg. Rosemont, Ill. (1997). Algunos estudios indican que las concentraciones de IGF-1 en suero son inferiores en pacientes osteoartríticos que en los grupos control, mientras que otros estudios no han hallado diferencias. Sin embargo, tanto los niveles de IGF-1 en suero como la respuesta de los condrocitos al IGF-1 disminuyen con la edad. J. R. Florini y S. B Roberts, J. Gerontol., 35:23-30 (1980). Por tanto, la disminuida disponibilidad del IGF-1, así como la respuesta disminuida de los condrocitos al IGF-1 podrían contribuir a la homeostasis del cartílago, y conducir a la degeneración a medida que avanza la edad.

El IGF-1 ha sido propuesto para el tratamiento o prevención de la osteoartritis. De hecho, la administración intraarticular de IGF-1 en combinación con polisulfato de pentosán sódico (un inhibidor de la actividad catabólica de los condrocitos) causó una apariencia histológica mejorada, y niveles prácticamente normales de enzimas catalíticos (metaloproteinasas neutrales y colagenasa), inhibidores del tejido de metaloproteinasas y matriz de colágeno. R. A. Rogachefsky, et al., Ann. NY Acad. Sci., 732:889-895 (1994). El uso del IGF-1, tanto solo como con un adyuvante o con otros factores de crecimiento, para estimular la regeneración del cartílago se ha descrito en WO 91/19510, WO 92/13565, patente estadounidense Pat. nº 5.444.047, y EP 434.652.

Las proteínas morfogenéticas del hueso (BMP) son miembros de la gran familia de factores de crecimiento del factor de crecimiento transformante beta (TGF-\beta). Los estudios in vitro e in vivo han mostrado que las BMP inducen la diferenciación de las células mesenquimales en condrocitos. K. Sato y M. Urist, Clin. Orthop. Relat. Res., 183:180-187 (1984). Además, el factor de crecimiento esquelético y los factores de crecimiento derivados del cartílago tienen efectos sinérgicos con las BMP, puesto que la combinación de estos factores de crecimiento con las BMP y la hormona del crecimiento inicia la diferenciación de las células mesenquimales. Las proliferación subsiguiente de las células diferenciadas está estimulada por otros factores. D. J. Hill y A Logan, Prog. Growth Fac. Res., 4:45-68 (1992).

El factor de crecimiento transformante beta (TGF-\beta) es producido por los osteoblastos, condrocitos, plaquetas, linfocitos activados, y otras células. R. D. Coutts et al., ver más arriba. El TGF-\beta puede tener propiedades tanto estimuladoras como inhibidoras sobre la síntesis de la matriz y la proliferación celular dependiendo de la célula diana, de la dosis, y de las condiciones de cultivo de la célula. P. Guerne et al., J. Cell Physiol., 158:476-484 (1994); H. Van Beuningen et al., Ann. Rheum. Dis., 52:185-191 (1993); P. Van der Kraan et al., Ann. Rheum. Dis., 51:643-647 (1992). Además, al igual que con el IGF-1, la respuesta al TGF-\beta disminuye con la edad. P. Gueme et al., J. Cell Physiol., 158:476-484 (1994). Sin embargo, el TGF-\beta es un estimulador más potente de la proliferación de condrocitos que otros factores de crecimiento, incluyendo el factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF), el bFGF, y el IGF-1 (Gueme et al., ver más arriba), y puede estimular la producción de proteoglicanos por los condrocitos. El TGF-\beta también regula a la baja los efectos de las citocinas que estimulan el catabolismo de los condrocitos, Van der Kraan et al., ver más arriba. in vivo, el TGF-\beta induce la proliferación y diferenciación de las células mesenquimales en condrocitos, y potencia la reparación de los defectos de grosor parcial en el cartílago articular del conejo. E. B Hunziker y L. Rosenberg, Trans. Orthopaed. Res. Soc., 19:236 (1994).

Antagonismo del catabolismo del cartílago

Se cree que la degradación de la matriz del cartílago se debe al rompimiento de las moléculas de la matriz (proteoglicanos y colagenos) por parte de proteasas (revisado en Woessner J. F. Jr., "Proteases of the extracellular matrix", en Structure and Function of Articular Cartilage, Mow, V., Ratcliffe, A. (editores), Boca Raton, Fla., CRC Press, 1994 y Smith R. L., Front. In Biosci., 4:d704-712. Mientras que los enzimas claves implicados en la ruptura no se han identificado claramente, la metaloproteinasas de la matriz (MMP) y las "agrecanasas" parecen desempeñar papeles claves en la destrucción de la articulación. Además, los miembros de la familia de proteinasas de la serina y cisteína (por ejemplo, las catepsinas y el activador del plasminógeno del tipo uroquinasa o tisular (uPA y tPA)) también podrían estar implicados. La plasmina, el activador del plasminógeno de la uroquinasa (uPA) y el activador del plasminógeno del tejido (tPA) podrían desempeñar un papel importante en la vía de activación de las metaloproteinasas. La evidencia conecta el grupo estrechamente relacionado de catepsinas B, L y S con la ruptura de la matriz, y estas catepsinas están algo incrementadas en la OA. Muchas citocinas, incluyendo el IL-1, el TNF-\alpha y el LIF inducen la expresión de MMP en condrocitos. La inducción de MMP puede ser antagonizada por el TGF-\beta y la IL-4, y potenciada, al menos en los conejos, por el FGF y el PDGF. Tal como se ha mostrado en estudios con animales, los inhibidores de estas proteasas (MMP y agrecanasas) podrían, al menos parcialmente, proteger in vivo el tejido articular del daño.

Otros procedimientos para estimular la reparación del cartílago incluyen bloquear los efectos de las moléculas que están asociadas con la destrucción del cartílago. Por ejemplo, tanto las IL-1 (\alpha y \beta) como el óxido nítrico son sustancias con conocidos efectos catabólicos sobre el cartílago. La citocina IL-1 causa la ruptura del cartílago, incluyendo la generación de inflamación sinovial y la regulación al alza de las metaloproteinasas de la matriz y de las agrecanasas. V. Baragi, et al., J. Clin. Invest., 96:2454-2460 (1995); V. M. Baragi et al., Osteoarthritis Cartilage, 5:275-282 (1997); C. H. Evans et al., J. Leukoc. Biol., 64:55-61 (1998); C. H. Evans y P. D. Robbins, J. Rheumatol., 24:2061-2063 (1997); R. Kang et al., Biochem. Soc. Trans., 25:533-537 (1997); R. Kang et al., Osteoarthritis Cartilage, 5:139-143 (1997). Puesto que en las articulaciones enfermas se hallan niveles elevados de IL-1, y se cree que la IL-1 desempeña un papel crucial en el inicio y desarrollo de la artritis, la inhibición de la actividad de la IL-1 podría resultar en una terapia exitosa. En los mamíferos, sólo una proteasa, denominada convertasa de la interleucina 1\beta (ICE) puede generar específicamente la IL-1\beta activa, madura. Se ha mostrado que la inhibición de la ICE bloquea la producción de IL-1\beta y podría retrasar la degeneración artrítica (revisado en Martel-Pelletier J. et al., Front. Biosci., 4:d694-703). También se ha mostrado que el antagonista soluble del receptor de la IL-1 (IL-1ra), una proteína que ocurre de forma natural, y que puede inhibir los efectos de la IL-1 impidiendo que la IL-1 interaccione con los condrocitos, es efectivo en modelos animales de la artritis, y actualmente se está ensayando en humanos su capacidad para prevenir la incidencia o la progresión de la artritis.

El óxido nítrico juega un papel sustancial en la destrucción del cartílago. Ashok et al., Curr. Opin. Rheum., 10:263-268 (1998). A diferencia del cartílago normal, el cual no produce NO, a menos que se estimule con citocinas tales como la IL-1\alpha, el cartílago obtenido de las articulaciones osteoartríticas produce grandes cantidades de óxido nítrico durante más de 3 días en cultivo a pesar de la ausencia de estímulo añadido. Además, se ha mostrado que la inhibición de la producción de NO previene la destrucción del cartílago y la muerte de condrocitos mediadas por la IL-1\alpha, así como la progresión de la osteoartritis en modelos animales. Por tanto, la inhibición del NO podría ser una forma de prevenir la destrucción del cartílago.

Al igual que las IL1\alpha y \beta, el TNF-\alpha es sintetizado por los condrocitos, induce la ruptura de la matriz, inhibe la síntesis de la matriz, y se halla en niveles elevados en las articulaciones artríticas. El TNF-\alpha presenta sinergias con la IL-1 en términos de destrucción del cartílago. Se ha visto que la inhibición de la actividad del TNF-\alpha en animales y humanos artríticos inhibe la progresión de la artritis.

El factor inhibidor de la leucemia (LIF), el cual es sintetizado por ambos, el cartílago y el sinovio, está presente en los fluidos sinoviales humanos. Puesto que el LIF induce la síntesis de metaloproteinasas de la matriz (MMP) por parte de los condrocitos, podría estar implicado en la ruptura de la matriz cartilaginosa.

El interferón-gamma (IFN-\gamma) inhibe la síntesis de proteoglicanos por parte de los condrocitos humanos sin potenciar su ruptura. Más aún, el IFN-\gamma podría suprimir la pérdida de proteoglicanos mediante la inhibición de la inducción de MMP.

La interleucina 8, una potente citocina quimiotáctica para los neutrófilo polimorfonucleares (PMN), es sintetizada por una variedades células, incluyendo los monocitos/macrófagos, los condrocitos y los fibroblastos, y es inducida por el TNF-\alpha. En paciente con OA, la IL-\beta, la IL-6, el TNF-\alpha y la IL-8 se hallan todas en el fluido sinovial. La IL-8 puede potenciar la liberación de citocinas inflamatorias en las células mononucleares humanas, incluyendo la de la IL-1\beta, la IL-6 y el TNF-\alpha, los cuales podrían modular aún más la reacción inflamatoria (revisado en Martel-Pelletier J. et al., Front. Biosci., 4:d694-703).

Se ha propuesto la IL-6 como una contribuidora al proceso patológico de la OA, mediante el incremento de las células inflamatorias en el tejido sinovial y la estimulación de la proliferación de condrocitos. Además, la IL-6 puede amplificar los efectos de la IL-1 sobre la síntesis de MMP y la inhibición de la producción de proteoglicanos (revisado en Martel-Pelletier J. et al., Front. Biosci., 4:d694-703).

La interleucina 17 regula al alza la producción de IL-1\beta, TNF-\alpha, IL-6 y MMP en macrófagos humanos. La IL-17 también induce la producción de NO en condrocitos, y se expresa en las articulaciones artríticas, pero no en las normales (revisado en Martel-Pelletier J. et al., Front. Biosci., 4:d694-703).

El factor de crecimiento de fibroblastos básico (bFGF), el cual es sintetizado por los condrocitos, puede inducir la replicación de condrocitos articulares. B C. Toolan et al., J. Biomed. Mat. Res., 41:244-250 (1998). En explantes obtenidos de animales jóvenes, el bFGF en pequeñas cantidades (por ejemplo, 3 ng/ml) estimula la síntesis e inhibe la ruptura de proteoglicanos, mientras que a niveles superiores (por ejemplo, 30-300 ng/ml) tiene exactamente el efecto opuesto (es decir, inhibición de la síntesis y ruptura potenciada). En tejidos adultos, las dosis más elevadas de FGF estimularon la síntesis de proteoglicano, proteína y colágeno, sin proliferación celular. R. L. Sah et al., Arch. Biochem. Biophys., 308:137-147 (1994). El bFGF también regula la homeostasis del cartílago induciendo la liberación autocrina, a partir de condrocitos, de interleucina 1 (IL-1), un potente estimulador del comportamiento catabólico en el cartílago. El bFGF potencia además la liberación de proteasa mediada por la IL-1, tal vez a través de su capacidad para regular al alza los receptores de la IL-1 en los condrocitos. J. E. Chin et al., Arthritis Rheum., 34:314-324 (1991)]. De forma similar, el factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF) puede potenciar los efectos catabólicos de la IL-1 y, presumiblemente, del TNF-\alpha. Sin embargo, cierta evidencia sugiere que en el cartílago humano el bFGF y el PDGF podrían tener un efecto anticatabólico; falta determinar si este fenómeno es específico de la especie o un efecto de la edad.

Aunque la inflamación no parece ser el suceso iniciador en la osteoartritis, la inflamación sí que está presente en las articulaciones osteoartríticas. Las células inflamatorias (es decir, los monocitos, macrófagos y neutrófilos) que invaden el recubrimiento sinovial después de la lesión y durante la inflamación producen metaloproteinasas así como citocinas catabólicas, las cuales pueden contribuir a la liberación adicional de enzimas degradantes. Aunque la inflamación y la destrucción de la articulación no muestran una correlación perfecta en todos los modelos animales de artritis, los agentes tales como la IL-4, IL-10 e IL-13, que inhiben la inflamación, también disminuyen la patología del cartílago y del hueso en los animales artríticos (revisado en Martel-Pelletier J. et al., Front. Biosci., 4:d694-703). La aplicación de agentes que inhiben las citocinas inflamatorias podría retrasar la progresión de la OA contrarrestando la sinovitis local que ocurre en los pacientes con OA.

Numerosos estudios muestran que los miembros de la familia tetraciclina de antibióticos son efectivos para inhibir la actividad colagenasa y gelatinas. La administración oral de uno de éstos, la doxicliclina, probó la disminución tanto de la actividad colagenasa como de la gelatinasa en cartílago procedente de la etapa final de la osteoartritis de la cadera. Estos datos sugieren que una dosis oral efectiva de doxiciclina podría retrasar la progresión de la osteoartritis. Smith R. L. Front. Biosci., 4:d704-712.

La OA implica no sólo la degeneración del cartílago articular, lo que conduce a la eburnación del hueso, sino también a un extenso remodelado del hueso subcondral, resultando en la denominada esclerosis de este tejido. Estos cambios óseos están acompañados a menudo por la formación de quistes subcondrales a resultas de la resorción focal. Los agentes que inhiben la resorción del hueso, por ejemplo, la osteoprotegerina o los bisfosfonatos, han mostrado resultados prometedores en modelos animales de la artritis. Kong et al., Nature, 402:304-308.

I. Definiciones

El término "trastorno cartilaginoso" se refiere a una colección de enfermedades, las cuales se manifiestan además por síntomas de dolor, rigidez y/o limitación de la movilidad de las partes del cuerpo afectadas, incluyendo aquéllas que resultan de enfermedad o lesión. Dentro del ámbito de "trastornos cartilaginosos" se incluyen los "trastornos cartilaginosos degenerativos" -una colección de trastornos caracterizados, al menos en parte, por la degeneración o la alteración metabólica de los tejidos conectivos del cuerpo, incluyendo no sólo las articulaciones o estructuras relacionadas, incluyendo los músculos, la bolsa (membrana sinovial), los tendones y el tejido fibroso, sino también el cartílago de crecimiento. En una realización, el término incluye los "trastornos del cartílago articular", los cuales se caracterizan por el rompimiento de la superficie lisa del cartílago articular y la degradación de la matriz del cartílago. Las patologías adicionales incluyen la producción de óxido nítrico, y la inhibición y reducción de la síntesis de la matriz.

Dentro del ámbito de los "trastornos del cartílago articular" se incluyen la osteoartritis (OA) y la artritis reumatoide (RA). La OA no define un único trastorno, sino la vía común final de la destrucción de la articulación que resulta de múltiples procesos. La OA se caracteriza por la destrucción asimétrica localizada del cartílago, que se corresponde con alargamientos óseos palpables en los márgenes de la articulación. La OA típicamente afecta las articulaciones interfalángicas de las manos, las primeras uniones carpometacarpianas, la cadera, las rodillas, la columna vertebral, y algunas articulaciones en el mediopié, mientras que las articulaciones grandes, tales como los tobillos, los codos y los hombros tienden a ser respetados. La OA puede asociarse con enfermedades metabólicas tales como la hemocromatosis y la alcaptonuria, con anormalidades del desarrollo tales como la displasia del desarrollo de la cadera (dislocación congénita de la cadera), discrepancias en la longitud de las extremidades, incluyendo el trauma y las artritis inflamatorias tales como la gota, la artritis séptica, y la artritis neuropática. La OA podría desarrollarse también después de una extensa inestabilidad biomecánica, tal como la que resulta de las lesiones deportivas o de la obesidad.

La artritis reumatoide (RA) es un trastorno autoinmune, crónico y sistémico, caracterizado por la sinovitos simétrica de la articulación, y afecta típicamente por igual las articulaciones diartroidales pequeñas y grandes. A medida que la RA progresa, los síntomas podrían incluir la fiebre, la pérdida de peso, el adelgazamiento de la piel, la implicación multiorgánica, la escleritis, las úlceras corneales, la formación de nódulos subcutáneos o de nódulos subperiósticos, e incluso la muerte prematura. Los síntomas de la RA a menudo aparecen durante la juventud, y pueden incluir la vasculitis, la atrofia de la piel y del músculo, los nódulos subcutáneos, la linfadenopatía, la esplenomegalia, la leucopenia y la anemia crónica.

Además, el término "trastorno cartilaginoso degenerativo" podría incluir el lupus eritematoso sistémico y la gota, la amiloidosis o el síntoma de Felty. Adicionalmente, el término abarca la degradación y destrucción del cartílago asociada con la artritis psoriática, la osteoartrosis, la inflamación aguda (por ejemplo, la artritis por yersinia, la artritis por pirofosfato, la artritis por gota (artritis úrica), la artritis séptica), la artritis asociada con trauma, la enfermedad inflamatoria del intestino (por ejemplo, la enfermedad de Crohn, la colitis ulcerante, la enteritis regional, la ileitis distal, la enteritis granulomatosa, la ileitis regional, la ileitis terminal), la esclerosis múltiple, la diabetes (por ejemplo, la dependiente de insulina y la no dependiente de insulina), la obesidad, la artritis de células gigantes, y el síndrome de Sjogren.

Los ejemplos de otras enfermedades inmunes o inflamatorias, al menos alguna de las cuales podría tratarse mediante los procedimientos de la invención, incluyen: la artritis crónica juvenil, la espóndiloartritis, la esclerosis sistémica (esclerodermia), las miopatías inflamatoria idiopáticas (dermatomiositis, polimiositis), la vasculitis sistémica, la sarcoidosis, la anemia autoimmune hemolítica (pancitopenia inmune, hemoglobinuria nocturna paroxismal), la trombocitopenia autoinmune (trombocitopenia idiopática púrpura, trombocitopenia inmune-mediada), tiroiditis (enfermedad de Grave, tiroiditis de Hashimoto, tiroiditis linfocítica juvenil, tiroiditis atrófica), las enfermedades inflamatorias autoinmunes (por ejemplo, la encefalimielitis alérgica, la esclerosis múltiple, la diabetes mellitus dependiente de insulina, la uveoretinitis autoinmune, la tirotoxicosis, la enfermedad de la tiroides auto, la anemia perniciosa) y el rechazo de injertos, la diabetes mellitus, la enfermedad renal inmunomediada (glomerulonefritis, nefritis tubulointersticial), las enfermedades desmielinizantes de los sistemas nerviosos central y periférico tales como la esclerosis múltiple, la polineuropatía desmielinizante idiopática o el síndrome de Guillain-Barre, y la polineuropatía desmielinizante inflamatoria crónica; las enfermedades hepatobiliares, tales como la hepatitis infecciosa (hepatitis A, B, C, D, E y otros virus no hepatotrópicos), la hepatitis activa crónica autoinmune, la cirrosis biliar primaria, la hepatitis granulomatosa, y la colangitis esclerosante, la enteropatía sensible al gluten, y la enfermedad de Whipple, las enfermedades de la piel autoinmunes o inmunomediadas, incluyendo las enfermedades ampollosas de la piel, el eritema multiforme y la dermatitis por contacto, la psoriasis, las enfermedades alérgicas tales como el asma, la rinitis alérgica, la dermatitis atópica, la hipersensibilidad a la comida y la urticaria, las enfermedades inmunológicas del pulmón, tales como las neumonías eosinofílicas, la fibrosis pulmonar idiopática y la neumonitis por hipersensibilidad; las enfermedades asociadas a trasplantes, incluyendo el rechazo del injerto y la enfermedad del injerto contra el huésped. Las enfermedades infecciosas, incluyendo las enfermedades víricas tales como el SIDA (infección por VIH), el herpes, etc., infecciones bacterianas, infecciones fúngicas, infecciones por protozoos, infecciones por parásitos, y virus sincitiales respiratorios, virus de la inmunodeficiencia humana, etc., y trastornos alérgicos, tales como la hipersensibilidad anafiláctica, el asma, la rinitis alérgica, la dermatitis atópica, la conjuntivitis vernal, el eccema, la urticaria y las alergias de los alimentos, etc.

"Tratamiento" es una intervención realizada con la intención de impedir el desarrollo o alterar la patología de un trastorno. En consecuencia, "trastorno" se refiere tanto al tratamiento terapéutico y profiláctico como a las medidas preventivas, en donde el objeto es prevenir o retrasar (aliviar) la condición o trastorno patológico específico. Aquéllos que precisan el tratamiento incluyen aquéllos que ya presentan el trastorno, así como aquéllos en los que debe prevenirse el trastorno. En el tratamiento del trastorno del cartílago, un agente terapéutico podría disminuir o incrementar directamente la magnitud de la respuesta de un componente patológico del trastorno, o hacer la enfermedad más susceptible al tratamiento mediante otros agentes terapéuticos, por ejemplo, antibióticos, antifúngicos, agentes antiinflamatorios, quimioterapéuticos, etc.

El término "cantidad efectiva" es la mínima concentración de insulina y/o de una variante de la misma que causa, induce o resulta en una mejora detectable o reparación del cartílago dañado, o en una protección medible frente a la destrucción inicial o continuada del cartílago en una muestra aislada de matriz cartilaginosa (por ejemplo, retención de proteoglicanos en la matriz, inhibición de la liberación de proteoglicanos a partir de la matriz, estimulación de la síntesis de proteoglicanos). Ademas, una "cantidad terapéuticamente efectiva" es la concentración (cantidad) mínima de insulina y/o de una variante de la misma administrada a un mamífero que sería efectiva para al menos atenuar un síntoma patológico (por ejemplo, causar, inducir o resultar en una mejora detectable o una reparación en el cartílago lesionado, o causar, inducir o resultar en una protección medible frente a la destrucción inicial o continuada del cartílago, una mejora en el alcance de la movilidad, una reducción en el dolor, etc.), el cual ocurre a resultas de una lesión o de un trastorno del cartílago.

El "agente del cartílago" podría ser un factor de crecimiento, citocina, molécula pequeña, anticuerpo, pieza de ARN o ADN, partícula vírica, péptido, o compuesto químico que tiene un efecto beneficioso sobre el cartílago, incluyendo los factores de crecimiento peptídicos, los antagonistas del catabolismo, y los factores óseos, sinoviales o antiinflamatorios. Alternativamente, el "agente de cartílago" podría ser un factor de crecimiento peptídico -tal como cualquiera de los factores de crecimiento de fibroblastos (por ejemplo, FGF-1, FGF-2, . . . FGF-21, etc.), IGF (I y II), TGF-\beta (1-3), BMP (1-7), o miembros de la familia de factores de crecimiento epidérmico tales como el EGF, HB-EGF, TGF-\alpha -los cuales podrían potenciar la respuesta de reparadora intrínseca del cartílago, por ejemplo, alterando la proliferación, diferenciación, migración, adhesión, o producción de matriz por los condrocitos. Alternativamente, un "agente de cartílago" podría ser un factor que antagoniza el catabolismo del cartílago (por ejemplo, el antagonista del receptor de la IL-1 (IL-1ra), los inhibidores del NO, los inhibidores de la convertasa de la IL1\beta (ICE), los factores que inhiben la actividad de la IL-6, la IL-8, el LIF, el IFN\gamma, la actividad del TNF-\alpha, las tetraciclinas y variantes de las mismas, los inhibidores de la apoptosis, los inhibidores de las MMP, los inhibidores de la agrecanasa, los inhibidores de las proteinasas de serina y cisteína tales como las catepsinas y el activador del plasminógeno del tipo uroquinasa o tisular (uPA y tPA). Aún de forma alternativa, los agentes del cartílago incluyen los factores que actúan indirectamente sobre el cartílago afectando el hueso subyacente (es decir, los osteofactores, por ejemplo, los bisfosfonatos o la osteoprotegerina) o el sinovio que lo rodea (es decir, factores sinoviales), o factores antiinflamatorios (por ejemplo, el anti-TNF-\alpha, el IL1ra, la IL-4, la IL-10, la IL-13 y los NSAID). Para una revisión de ejemplos de agentes del cartílago, consultar por favor Martel-Pelletier et al., Front. Biosci., 4:d694-703 (1999); Hering, T. M., Front. Biosci., 4:d743-761 (1999).

Las "técnicas quirúrgicas estándares" son procedimientos quirúrgicos empleados comúnmente para las manipulaciones terapéuticas del cartílago, incluyendo: la erosión del cartílago, la condroplastia de abrasión, la reparación con láser, el desbridamiento, la condroplastia, la microfractura con o sin penetración del hueso subcondral, la mosaicoplastia, los aloinjertos de células del cartílago, los autoinjertos de células madre, los injertos de cartílago costal, la estimulación química, la estimulación eléctrica, los autoinjertos pericondrales, los autoinjertos periósticos, los andamios de cartílago, los autoinjertos o aloinjertos de cáscara (osteoarticular), o la osteotomía. Estas técnicas se revisan y describen con mayor detalle en Frenkel et al., Front. Bioscience, 4:d671-685 (1999).

Una "IGFBP" o una "proteína unidora de IGF" se refiere a una proteína o polipéptido normalmente asociado con, o unido, o complejado con el IGF-1 o IGF-2, sea o no circulatorio (es decir, en suero o tejido). Tales proteínas unidoras no incluyen los receptores. Esta definición incluye los IGFBP-1, IGFBP-2, IGFBP-3, IGFBP-4, IGFBP-5, IGFBP-6, Mac 25 (IGFBP-7), y el factor estimulador de la prostaciclina (PSF) o la molécula especifica de células endoteliales (ESM-1), así como otras proteínas con homología por los IGFBP. Mac 25 se describe, por ejemplo, en Swisshelm et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92:4472-4476 (1995) y Oh et al., J. Biol. Chem., 271:30322-30325 (1996). El PSF se describe en Yamauchi et al., Biochem. J., 303:591-598 (1994). ESM-1 se describe en Lassalle et al., J. Biol. Chem., 271:20458-20464 (1996). Para las otras IGFBP identificadas, consultar, por ejemplo, la EP 375.438 publicada el 27 de junio de 1990; la EP 369.943 publicada el 23 de mayo de 1990; la WO 89/09268 publicada el 5 de octubre de 1989; Wood et al., Molec. Endocrin., 2:1176-1185 (1988); Brinkman et al., The EMBO J., 7:2417-2423 (1988); Lee et al., Mol. Endocrinol, 2:404-411 (1988); Brewer et al., BBRC, 152:1289-1297 (1988); la EP 294.021 publicada el 7 de diciembre de 1988; Baxter et al., BBRC, 147:408-415 (1987); Leung et al., Nature, 330:537-543 (1987); Martin et al., J. Biol. Chem., 261:8754-8760 (1986); Baxter et al., Comp. Biochem. Physiol, 91B:229-235 (1988); la WO 89/08667 publicada el 21 de septiembre de 1989; la WO 89/09792 publicada el 19 de octubre de 1989; y Binkert et al., EMBO J, 8:2497-2502 (1989).

La administración "crónica" se refiere a la administración del factor o factores de un modo continuo, en oposición a un modo agudo, con objeto de mantener el efecto (actividad) terapéutica inicial durante un extenso período de tiempo. La administración "intermitente" es el tratamiento que no se hace consecutivamente sin interrupción, sino que es cíclico por naturaleza.

La "patología" de un trastorno del cartílago incluye cualquier fenómeno fisiológico que comprometa el bienestar del paciente. Esto incluye, sin limitación, la destrucción del cartílago, la reparación del cartílago disminuida, el crecimiento o diferenciación celular anormal o incontrolable, la producción de anticuerpos, la autoproducción de anticuerpos, la producción y activación del complemento, la interferencia con el funcionamiento normal de las células vecinas, la producción de citocinas y otros productos secretores con niveles anormales, la supresión o agravación de cualquier respuesta inflamatoria o inmunológica, la infiltración de células inflamatorias (neutrofílicas, eosinofílicas, monocíticas, linfocíticas) en espacios del tejido, la inducción de dolor, o cualquier efecto del tejido que resulta en la alteración de la función o movilidad de la articulación, etc.

Mamífero, para los propósitos de tratamiento, se refiere a cualquier animal clasificado como un mamífero, incluyendo los humanos, los animales domésticos y de granja, de zoológicos y de deportes, o los animales de compañía, tales como los perros, los caballos, los gatos, las terneras, los cerdos, los hámsters, etc. Preferiblemente, el mamífero es un humano.

Administración "en combinación con" uno o más agentes terapéuticos incluye la administración simultanea (concurrente) y consecutiva en cualquier orden.

"Portadores", tal como se usa en la presente, incluye cualquier portadores, excipientes o estabilizantes fisiológicamente aceptables, los cuales no son tóxicos para la célula o mamífero que está siendo expuesto a los mismos en las dosis y concentraciones empleadas. A menudo, el portador fisiológicamente aceptable es una solución acuosa con pH tamponado. Los ejemplos de portadores fisiológicamente aceptables incluyen tampones tales como fosfato, citrato y otros ácidos orgánicos; antioxidante incluyendo el ácido ascórbico; polipéptido de bajo peso molecular (menos de aproximadamente 10 residuos); proteínas, tales como la albúmina del suero, la gelatina, o las inmunoglobulinas; polímeros hidrofílicos tales como la polivinilpirrolidona; aminoácidos tales como la glicina, la glutamina, la asparagina, la arginina o la lisina; monosacáridos, disacáridos, y otros carbohidratos, incluyendo la glucosa, la manosa, o las dextrinas; agentes quelantes tales como el EDTA; azúcares alcohol tales como el manitol o sorbitol; contraiones formadores de sales, tales como el sodio; y/o tensioactivos no iónicos tales como el TWEEN®, polietilenglicol (PEG), y PLURONICS®, ácido hialurónico (HA).

El término "insulina" y/o "variante de insulina" cuando se usa en la presente abarca ambas, (1) la insulina de secuencia nativa, y (2) las variantes de la insulina (las cuales se definen adicionalmente en la presente). La molécula de insulina podría aislarse a partir de una variedad de fuentes, tales como a partir de tipos de tejidos humanos o a partir de otra fuente, o prepararse mediante procedimientos recombinantes y/o sintéticos.

Una "insulina de secuencia nativa" comprende un polipéptido que tiene la misma secuencia de aminoácidos que la insulina derivada de la naturaleza. Tales polipéptidos de insulina de secuencia nativa pueden aislarse a partir de la naturaleza o pueden producirse mediante medio recombinantes y/o sintéticos. El término "insulina de secuencia nativa" abarca específicamente las formas truncadas o secretadas que ocurren de forma natural (por ejemplo, una secuencia del dominio extracelular), formas truncadas que ocurren de forma natural (por ejemplo, formas empalmadas de forma alternativa) y variantes alélicas de la insulina que ocurren de forma natural. En una realización de la invención, la insulina humana de secuencia nativa es una insulina de secuencia nativa madura o de longitud completa que comprende una cadena alfa (\alpha) o A de los aminoácidos 1 al 21 de la SEC. Nº ID.: 1 y una cadena beta (\beta) o B de los aminoácidos 1 a 30 de la SEC. Nº ID.:2.

"Polipéptido variante de la insulina" indica un polipéptido de insulina activo, tal como se define más abajo, que tiene al menos aproximadamente el 80% de identidad de secuencia de aminoácidos con la secuencia de aminoácidos de: (a) los residuos 1 a 21 de la cadena-A del polipéptido de la insulina humana mostrado en la Figura 18A (SEC. Nº ID.:1) en combinación con los residuos 1 a 30 de la cadena-B del polipéptido de la insulina humana mostrado en la Figura 18B (SEC. Nº ID.:2), o (b) otro fragmento específicamente derivado de las secuencias de aminoácidos mostradas en las Figuras 18A y 18B (SEC. Nº ID.:1-2), o tal como se describe en la presente. Además, se cree también que la estructura secundaria ilustrada en las Figuras 18A y 18B, a saber, los enlaces disulfuro entre los residuos de cisteína A6-A11, A7-B7 y A20-B19, es necesaria para la actividad, por tanto, el ámbito de las variantes incluidas en estas definiciones debería considerarse que preserva esta estructura secundaria tanto como sea posible.

Los polipéptidos variantes de la insulina incluyen, por ejemplo, los polipéptidos en donde uno o más residuos aminoácidos se añaden, o suprimen, en los extremos N- y/o C-terminales, así como dentro de uno o más de los dominios internos, de las secuencias mostradas en las Figuras 18A y 18B (SEC. Nº ID.:1-2). De forma ordinaria, un polipéptido variante de la insulina tendrá al menos aproximadamente un 80% de identidad de secuencia de aminoácidos, de forma alternativa al menos aproximadamente un 81% de identidad de secuencia de aminoácidos, de forma alternativa al menos aproximadamente un 82% de identidad de secuencia de aminoácidos, de forma alternativa al menos aproximadamente un 83% de identidad de secuencia de aminoácidos, de forma alternativa al menos aproximadamente un un 84% de identidad de secuencia de aminoácidos, de forma alternativa al menos aproximadamente un 85% de identidad de secuencia de aminoácidos, de forma alternativa al menos aproximadamente un 86% de identidad de secuencia de aminoácidos, de forma alternativa al menos aproximadamente un 87% de identidad de secuencia de aminoácidos, de forma alternativa al menos aproximadamente un 88% de identidad de secuencia de aminoácidos, de forma alternativa al menos aproximadamente un 89% de identidad de secuencia de aminoácidos, de forma alternativa al menos aproximadamente un 90% de identidad de secuencia de aminoácidos, de forma alternativa al menos aproximadamente un 91% de identidad de secuencia de aminoácidos, de forma alternativa al menos aproximadamente un 92% de identidad de secuencia de aminoácidos, de forma alternativa al menos aproximadamente un 93% de identidad de secuencia de aminoácidos, de forma alternativa al menos aproximadamente un 94% de identidad de secuencia de aminoácidos, de forma alternativa al menos aproximadamente un 95% de identidad de secuencia de aminoácidos, de forma alternativa al menos aproximadamente un 96% de identidad de secuencia de aminoácidos, de forma alternativa al menos aproximadamente un 97% de identidad de secuencia de aminoácidos, de forma alternativa al menos aproximadamente un 98% de identidad de secuencia de aminoácidos, de forma alternativa al menos aproximadamente un 99% de identidad de secuencia de aminoácidos con: (a) los residuos 1 a 21 de la cadena-A del polipéptido de la insulina humana mostrado en la Figura 18A (SEC. Nº ID.:1) en combinación con los residuos 1 a 30 de la cadena-B del polipéptido de la insulina humana mostrado en la Figura 18B (SEC. Nº ID.:2), o (b) otro fragmento específicamente derivado de las secuencias de aminoácidos mostradas en las Figuras 18A y 18B (SEC. Nº ID.:1-2), o tal como se describe en la presente.

Los polipéptidos variantes de la insulina tendrán una longitud de cadena A de al menos aproximadamente 15 residuos, de forma alternativa al menos aproximadamente 16 residuos, de forma alternativa al menos aproximadamente 17 residuos, de forma alternativa al menos aproximadamente 18 residuos, de forma alternativa al menos aproximadamente 19 residuos, de forma alternativa al menos aproximadamente 20 residuos, de forma alternativa al menos aproximadamente 21 residuos, de forma alternativa al menos aproximadamente 22 residuos, de forma alternativa al menos aproximadamente 23 residuos, de forma alternativa al menos aproximadamente 24 residuos, de forma alternativa al menos aproximadamente 25 residuos, de forma alternativa al menos aproximadamente 26 residuos, de forma alternativa al menos aproximadamente 27 residuos, de forma alternativa al menos aproximadamente 28 residuos, de forma alternativa al menos aproximadamente 29 residuos, de forma alternativa al menos aproximadamente 30 residuos, de forma alternativa al menos aproximadamente 35 residuos, o más. Los polipéptidos variantes de la insulina tendrán una longitud de cadena B de al menos aproximadamente 25 residuos, de forma alternativa al menos aproximadamente 26 residuos, de forma alternativa al menos aproximadamente 27 residuos, de forma alternativa al menos aproximadamente 28 residuos, de forma alternativa al menos aproximadamente 29 residuos, de forma alternativa al menos aproximadamente 29 residuos, de forma alternativa al menos aproximadamente 30 residuos, de forma alternativa al menos aproximadamente 31 residuos, de forma alternativa al menos aproximadamente 32 residuos, de forma alternativa al menos aproximadamente 33 residuos, de forma alternativa al menos aproximadamente 34 residuos, de forma alternativa al menos aproximadamente 35 residuos, de forma alternativa al menos aproximadamente 36 residuos, de forma alternativa al menos aproximadamente 37 residuos, de forma alternativa al menos aproximadamente 38 residuos, de forma alternativa al menos aproximadamente 39 residuos, de forma alternativa al menos aproximadamente 40 residuos, de forma alternativa al menos aproximadamente 41 residuos, de forma alternativa al menos aproximadamente 42 residuos, de forma alternativa al menos aproximadamente 42 residuos, de forma alternativa al menos aproximadamente 43 residuos, de forma alternativa al menos aproximadamente 44 residuos, de forma alternativa al menos aproximadamente 45 residuos, de forma alternativa al menos aproximadamente 50 residuos.

El término "proinsulina" y/o "variante de la proinsulina" cuando se usa en la presente abarca ambas, la secuencia nativa y las variantes de la proinsulina (las cuales se definen de forma adicional en la presente. La molécula de proinsulina podría aislarse a partir de una variedad de fuentes, tales como a partir de tipos de tejidos humanos o a partir de otra fuente, o prepararse mediante medios recombinantes y/o sintéticos.

Una "proinsulina de secuencia nativa" comprende un polipéptido que tiene la misma secuencia de aminoácidos que una proinsulina derivada de la naturaleza. Tales polipéptidos de insulina de secuencia nativa pueden aislarse a partir de la naturaleza o pueden producirse mediante medio recombinantes y/o sintéticos. El término "proinsulina de secuencia nativa" abarca específicamente las formas truncadas o secretadas que ocurren de forma natural (por ejemplo, una secuencia del dominio extracelular), las formas truncadas que ocurren de forma natural (por ejemplo, formas empalmadas de forma alternativa) y las variantes alélicas de la insulina que ocurren de forma natural. En una realización de la invención, la proinsulina humana de secuencia nativa es una insulina de secuencia nativa madura o de longitud completa que comprende los residuos 1 to a 84 de la Figura 18C (SEC. Nº ID.:3). La SEC. Nº ID.:3 contiene tres segmentos distintos: (1) una cadena-B de los residuos 1 a 30 (SEC. Nº ID.:2); (2) una cadena-C (conectando el péptido) de los residuos 31-63 (SEC. Nº ID.:4), y una cadena-A de los aminoácidos 64 a 84 (contando a partir del extremo N-terminal) (SEC. Nº ID.:1).

"Variante de la proinsulina" significa un polipéptido precursor de la insulina capaz de ser procesado en una insulina madura la cual es activa, tal como se define más abajo, que comprende al menos dos regiones distintas de residuos contiguos; en donde una región diferenciada tiene al menos un 80% de identidad de secuencia de aminoácidos con los residuos aminoácidos 1 a 21 de la cadena-A del polipéptido de la insulina humana tal como se muestra en la Figura 18A (SEC. Nº ID.:1), y la otra región diferenciada tiene al menos un 80% de identidad de secuencia de aminoácido con los aminoácido en combinación con los residuos aminoácidos 1 a 30 de la cadena-B del polipéptido de la insulina humana mostrado en la Figura 18B (SEC. Nº ID.:2), o (b) otro fragmento específicamente derivado de las secuencias de aminoácidos mostradas en las Figuras 18A y 18B (SEC. Nº ID.:1-2), o tal como se describe en la presente. Alternativamente, una variante de la proinsulina tendrá al menos un 80% de identidad de secuencia de aminoácidos, con los residuos 1 a 110 de la Figura 18C (SEC. Nº ID.:3), u otro fragmento específicamente derivado de las secuencias de aminoácidos mostradas en la Figura 18C (SEC. Nº ID.:3). Las regiones adicionales podrían incluir un péptido-c alargado o acortado, y/o secuencias 5' ó 3' adicionales respectivamente en los residuos N-terminal y C-terminal, las cuales proporcionan los medios para la transducción de señal y/o facilitan el plegamiento en la forma activa madura.

Además, se cree también que la estructura secundaria ilustrada en las Figuras 18A y 18B, a saber, los enlaces disulfuro entre los residuos de cisteína A6-A11, A7-B7 y A20-B19, es necesaria para la actividad, por tanto, el ámbito de las variantes incluidas en esta definición debería considerarse que preserva esta estructura secundaria tanto como sea posible.

La longitud de las variantes de la proinsulina está en función de la longitud de los tras partes componentes principales, a saber, los péptidos A, B y C. La longitud del péptido-C puede variar ampliamente, desde tan poco como ningún residuo (es decir, totalmente suprimido), hasta tanto como un péptido de 50 residuos. La longitud de los componentes de la cadena A y B de una variante de la proinsulina varían de forma similar a la descrita previamente para la molécula de longitud completa. Además, podría añadirse una secuencia N-terminal adicional con propósitos de señalización (por ejemplo, para dirigir el producto de la traducción hacia la vía secretora de la célula huésped) o para potenciar o controlar la expresión (por ejemplo, promotores, operones, etc.). La longitud de tales residuos N-terminales podría comprender desde 1 hasta 100 residuos, incluyendo cualquier número entero contenido en el rango (es decir, 1, 2, 3 . . . 97, 98, 99, etc.).

"Porcentaje de identidad de la secuencia de aminoácidos", en relación a las secuencias polipeptídicas identificadas en la presente, se define como el porcentaje de residuos aminoácidos en una secuencia candidata que son idénticos a los residuos aminoácidos en una secuencia del polipéptido de insulina, después de alinear las secuencias e introducir huecos, si es necesario, para conseguir el máxima porcentaje de identidad de la secuencia, y no considerando ninguna sustitución conservadora como parte de la identidad de la secuencia. Los alineamientos para los propósitos de determinar el porcentaje de identidad de secuencia de aminoácidos puede conseguirse de varias formas que se hallan dentro de los conocimientos del campo, por ejemplo, usando programas de ordenador disponibles públicamente, tales como los programas BLAST, BLAST-2, ALIGN, ALIGN-2 o Megalign (DNASTAR). Aquellos capacitados en la técnica pueden terminar los parámetros apropiados para medir el alineamiento, incluyendo cualquier algoritmos necesarios para conseguir el alineamiento máximo a lo largo de las secuencias de longitud completa que se están comparando. Sin embargo, para los propósitos en la presente, los valores de % de identidad de secuencia de aminoácidos se obtienen como se describe más abajo usando el programa de ordenador para comparación de secuencias ALIGN-2, en donde el código fuente completo para el programa ALIGN-2 se proporciona en la Tabla 1. El programa de ordenador de comparación de secuencias ALIGN-2 fue creado por Genentech, Inc. y el código fuente mostrado en la Tabla 1 se ha registrado con la documentación para el usuario en la U.S. Copyright Office, Washington D.C., 20559, en donde está registrado con el U.S. Copyright Registration No. TXU510087. El programa ALIGN-2 está disponible públicamente a través de Genentech, Inc., South San Francisco, Calif. o podría compilarse a partir del código fuente proporcionado en la Tabla 1. El programa ALIGN-2 debería compilarse para ser usado en un sistema operativo UNIX, preferiblemente el UNIX V4,0D de Digital. Todos los parámetros de comparación de secuencias son fijados por el programa ALIGN-2 y no varían.

Para los propósitos en la presente, el % de identidad de la secuencia de aminoácidos de una determinada secuencia de aminoácidos A respecto a, con, o contra una determinada secuencia de aminoácidos B (lo que puede redactarse alternativamente como una determinada secuencia de aminoácidos A que tiene o comprende un cierto % de identidad de aminoácidos respecto a, con o contra una determinada secuencia de aminoácidos B) se calcula como sigue:

100 veces la fracción X/Y

en donde X es el número de residuos aminoácidos anotados como emparejamientos idénticos por el programa de alineamiento de secuencias ALIGN-2 en el alineamiento del programa de A y B, y en donde Y es el número total de residuos aminoácidos en B. Se apreciará que, cuando la longitud de la secuencia de aminoácidos A no es igual a la longitud de aminoácidos de la secuencia B, el % de identidad de la secuencia de aminoácidos de A respecto B no será igual al % de identidad de la secuencia de aminoácidos de B respecto A. Como ejemplos de los cálculos del % de identidad de la secuencia de aminoácidos, la Tabla 2 y la Tabla 3 muestran cómo calcular el % de identidad de la secuencia de aminoácidos denominada "Proteína de Comparación" respecto la secuencia de aminoácidos denominada "PRO".

A menos que se indique lo contrario, todos los valores de % de identidad de la secuencia de aminoácidos usados en la presente se obtuvieron tal como se ha descrito más arriba usando el programa de ordenador para comparación de secuencias ALIGN-2. Sin embargo, el % de identidad de la secuencia de aminoácidos podría haberse determinado también usando el programa de comparación de secuencias NCBI-BLAST2 (Altschul et al., Nucleic Acids Res., 25:3389-3402 (1997)). El programa de comparación de secuencias NCBI-BLAST2 puede descargarse de "http://www.ncbi.nlm.nih.gov" u obtenerse de otro modo de los National Institutes of Health, Bethesda, Md., USA 20892. NCBI-BLAST2 usa varios parámetros de búsqueda, en donde todos esos parámetros de búsqueda se ajustan a valores por defecto, incluyendo, por ejemplo, desenmascarar = yes, hebra = all, acontecimientos esperados = 10, longitud mínima para la baja complejidad = 15/5, valor e para "multi-pass" = 0,01, constante para "multi-pass" = 25, disminución para el alineamiento final espaciado = 25, y matriz de puntuación = BLOSUM62.

En las situaciones en que se emplea NCBI-BLAST2 para las comparaciones de secuencias de aminoácidos, el % de identidad de la secuencia de aminoácidos de una determinada secuencia de aminoácidos A respecto a, con, o contra una determinada secuencia de aminoácidos B (lo que puede redactarse alternativamente como una determinada secuencia de aminoácidos A que tiene o comprende un cierto % de identidad de aminoácidos respecto a, con o contra una determinada secuencia de aminoácidos B) se calcula como sigue:

100 veces la fracción X/Y

en donde X es el número de residuos aminoácidos anotados como emparejamientos idénticos por el programa de alineamiento de secuencias NCBI-BLAST2 en el alineamiento del programa de A y B, y en donde Y es el número total de residuos aminoácidos en B. Se apreciará que, cuando la longitud de la secuencia de aminoácidos A no es igual a la longitud de aminoácidos de la secuencia B, el % de identidad de la secuencia de aminoácidos de A respecto B no será igual al % de identidad de la secuencia de aminoácidos de B respecto A.

En el término "variantes de la insulina" se incluyen también los polipéptidos que, en el contexto de las comparaciones de la identidad de la secuencia de aminoácidos realizadas tal como se ha descrito más arriba, incluyen residuos aminoácidos en las secuencias comparadas que no sólo son idénticos, sino también aquéllos que tienen propiedades similares. Estos polipéptidos se denominan "positivos". Los residuos aminoácidos que puntúan un valor positivos respecto un aminoácido de interés son aquéllos que, o son idénticos al residuo aminoácido de interés, o son una sustitución preferida (tal como se define en la Tabla 6 más abajo) del residuo aminoácido de interés. Para los propósitos en la presente, el valor del % de positivos de una determinada secuencia de aminoácidos A respecto a, con, o contra una determinada secuencia de aminoácidos B (lo que puede redactarse alternativamente como una determinada secuencia de aminoácidos A que tiene o comprende un cierto % de positivos respecto a, con o contra una determinada secuencia de aminoácidos B) se calcula como sigue:

100 veces la fracción X/Y

en donde X es el número de residuos aminoácidos que puntúan un valor positivo, tal como se ha anotado más arriba, según el programa de alineamiento de secuencias ALIGN-2 en ese alineamiento del programa de A y B, y en donde Y es el número total de residuos aminoácidos en B. Se apreciará que, cuando la longitud de la secuencia de aminoácidos A no es igual a la longitud de aminoácidos de la secuencia B, el % de positivos de A respecto B no será igual al % de positivos de B respecto A.

"Polinucleótido de variante de la insulina" o "secuencia de ácido nucleico de variante de la insulina" indica una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido de insulina activa tal como se definió más arriba, y que tiene al menos aproximadamente el 80% de identidad de secuencia de ácido nucleico con una secuencia de ácido nucleico que codifica: (a) los residuos 1 a 21 de la cadena-A del polipéptido de la insulina humana mostrado en la Figura 18A (SEC. Nº ID.:1) en combinación con los residuos 1 a 30 de la cadena-B del polipéptido de la insulina humana mostrado (con la sustitución del residuo humano B30Thr) en la Figura 18B (SEC. Nº ID.:2), o (b) otra secuencia de ácido nucleico que codifica otro fragmento específicamente derivado de las secuencias de aminoácidos mostradas en las Figuras 18A y B (SEC. Nº ID.:1-2). Ordinariamente, un polinucleótido de una variante de la insulina tendrá al menos aproximadamente un 80% de identidad de la secuencia de ácido nucleico, más preferiblemente al menos un 81% de identidad de la secuencia de ácido nucleico, más preferiblemente al menos un 82% de identidad de la secuencia de ácido nucleico, más preferiblemente al menos un 83% de identidad de la secuencia de ácido nucleico, más preferiblemente al menos un 84% de identidad de la secuencia de ácido nucleico, más preferiblemente al menos un 85% de identidad de la secuencia de ácido nucleico, más preferiblemente al menos un 86% de identidad de la secuencia de ácido nucleico, más preferiblemente al menos un 87% de identidad de la secuencia de ácido nucleico, más preferiblemente al menos un 88% de identidad de la secuencia de ácido nucleico, más preferiblemente al menos un 89% de identidad de la secuencia de ácido nucleico, más preferiblemente al menos un 90% de identidad de la secuencia de ácido nucleico, más preferiblemente al menos un 91% de identidad de la secuencia de ácido nucleico, más preferiblemente al menos un 92% de identidad de la secuencia de ácido nucleico, más preferiblemente al menos un 93% de identidad de la secuencia de ácido nucleico, más preferiblemente al menos un 94% de identidad de la secuencia de ácido nucleico, más preferiblemente al menos un 95% de identidad de la secuencia de ácido nucleico, más preferiblemente al menos un 96% de identidad de la secuencia de ácido nucleico, más preferiblemente al menos un 97% de identidad de la secuencia de ácido nucleico, más preferiblemente al menos un 98% de identidad de la secuencia de ácido nucleico y aún más preferiblemente al menos un 99% de identidad de la secuencia de ácido nucleico con una secuencia de ácido nucleico que codifica los residuos aminoácidos: (a) los residuos 1 a 21 de la cadena-A del polipéptido de la insulina humana mostrado en la Figura 18A (SEC. Nº ID.:1) en combinación con los residuos 1 a 30 de la cadena-B del polipéptido de la insulina humana mostrado (con la sustitución del residuo humano B30Thr) en la Figura 18B (SEC. Nº ID.:2), o (b) otra secuencia de ácido nucleico que codifica otro fragmento específicamente derivado de las secuencias de aminoácidos mostradas en las Figuras 18 y B (SEC. Nº ID.:1-2).

Ordinariamente, los polinucleótidos de la variante de la insulina contienen ácido nucleico que codifica una cadena A de insulina de al menos aproximadamente 45 nucleótidos, de forma alternativa al menos aproximadamente 48 nucleótidos, de forma alternativa al menos aproximadamente 51 nucleótidos, de forma alternativa al menos aproximadamente 54 nucleótidos, de forma alternativa al menos aproximadamente 57 nucleótidos, de forma alternativa al menos aproximadamente 60 nucleótidos, de forma alternativa al menos aproximadamente 63 nucleótidos, de forma alternativa al menos aproximadamente 66 nucleótidos, de forma alternativa al menos aproximadamente 69 nucleótidos, de forma alternativa al menos aproximadamente 72 nucleótidos, de forma alternativa al menos aproximadamente 75 nucleótidos, de forma alternativa al menos aproximadamente 78 nucleótidos, de forma alternativa al menos aproximadamente 81 nucleótidos, de forma alternativa al menos aproximadamente 84 nucleótidos, de forma alternativa al menos aproximadamente 87 nucleótidos, de forma alternativa al menos aproximadamente 90 nucleótidos, de forma alternativa al menos aproximadamente 105 nucleótidos. Los polinucleótidos de la variante de la insulina contienen ácido nucleico que codifica una cadena B de insulina de al menos aproximadamente 75 nucleótidos, de forma alternativa al menos aproximadamente 78 nucleótidos, de forma alternativa al menos aproximadamente 81 nucleótidos, de forma alternativa al menos aproximadamente 84 nucleótidos, de forma alternativa al menos aproximadamente 87 nucleótidos, de forma alternativa al menos aproximadamente 90 nucleótidos, de forma alternativa al menos aproximadamente 93 nucleótidos, de forma alternativa al menos aproximadamente 96 nucleótidos, de forma alternativa al menos aproximadamente 99 nucleótidos, de forma alternativa al menos aproximadamente 102 nucleótidos, de forma alternativa al menos aproximadamente 105 nucleótidos, de forma alternativa al menos aproximadamente 108 nucleótidos, de forma alternativa al menos aproximadamente 111 nucleótidos, de forma alternativa al menos aproximadamente 114 nucleótidos, de forma alternativa al menos aproximadamente 117 nucleótidos, de forma alternativa al menos aproximadamente 120 nucleótidos, de forma alternativa al menos aproximadamente 123 nucleótidos, de forma alternativa al menos aproximadamente 126 nucleótidos, de forma alternativa al menos aproximadamente 129 nucleótidos, de forma alternativa al menos aproximadamente 132 nucleótidos, de forma alternativa al menos aproximadamente 135 nucleótidos, de forma alternativa al menos aproximadamente 150 nucleótidos.

El "porcentaje (%) de identidad de la secuencia de ácido nucleico" con respecto a las secuencia de ácido nucleico que codifican el polipéptido de la insulina se define como el porcentaje de nucleótidos en una secuencia candidata que son idénticos a los nucleótidos en una secuencia que codifica un polipéptido de la invención de interés, después de alinear las secuencias e introducir espacios, si es necesario, para conseguir el máximo porcentaje de identidad de secuencia. Los alineamientos para los propósitos de determinar el porcentaje de identidad de secuencia de ácido nucleico pueden conseguirse de varias formas que se hallan dentro de los conocimientos del campo, por ejemplo, usando programas de ordenador disponibles públicamente, tales como los programas BLAST, BLAST-2, ALIGN, ALIGN-2 o Megalign (DNASTAR). Aquellos capacitados en la técnica pueden terminar los parámetros apropiados para medir el alineamiento, incluyendo cualquier algoritmos necesarios para conseguir el alineamiento máximo a lo largo de las secuencias de longitud completa que se están comparando. Sin embargo, para los propósitos en la presente, los valores de % de identidad de secuencia de ácido nucleico se obtienen como se describe más abajo usando el programa de ordenador para comparación de secuencias ALIGN-2, en donde el código fuente completo para el programa ALIGN-2 se proporciona en la Tabla 1. El programa de ordenador de comparación de secuencias ALIGN-2 fue creado por Genentech, Inc. y el código fuente mostrado en la Tabla 1 se ha registrado con la documentación para el usuario en la U.S. Copyright Office, Washington D.C., 20559, en donde está registrado con el U.S. Copyright Registration No. TXU510087. El programa ALIGN-2 está disponible públicamente a través de Genentech, Inc., South San Francisco, Calif. o podría compilarse a partir del código fuente proporcionado en la Tabla 1. El programa ALIGN-2 debería compilarse para ser usado en un sistema operativo UNIX, preferiblemente el UNIX V4,0D de Digital. Todos los parámetros de comparación de secuencias son fijados por el programa ALIGN-2 y no varían.

Para los propósitos en la presente, el % de identidad de la secuencia de ácido nucleico de una determinada secuencia de ácido nucleico C respecto a, con, o contra una determinada secuencia de ácido nucleico D (lo que puede redactarse alternativamente como una determinada secuencia de ácido nucleico C que tiene o comprende un cierto % de identidad de ácido nucleico respecto a, con o contra una determinada secuencia de ácido nucleico D) se calcula como sigue:

100 veces la fracción W/Z

en donde W es el número de nucleótidos anotados como emparejamientos idénticos por el programa de alineamiento de secuencias ALIGN-2 en el alineamiento del programa de C y D, y en donde Z es el número total de nucleótidos en D. Se apreciará que, cuando la longitud de la secuencia de ácido nucleico C no es igual a la longitud de ácido nucleico de la secuencia D, el % de identidad de la secuencia de ácido nucleico de C respecto D no será igual al % de identidad de la secuencia de ácido nucleico de D respecto C. Como ejemplos de los cálculos del % de identidad de la secuencia de ácido nucleico, las Tablas 4 y 5 muestran cómo calcular el % de identidad de la secuencia de ácido nucleico denominada "ADN de Comparación" respecto la secuencia de ácido nucleico denominada "PRO-ADN".

A menos que se indique lo contrario, todos los valores de % de identidad de la secuencia de ácido nucleico usados en la presente se obtuvieron tal como se ha descrito más arriba usando el programa de ordenador para comparación de secuencias ALIGN-2. Sin embargo, el % de identidad de la secuencia de ácido nucleico podría determinarse también usando el programa de comparación de secuencias NCBI-BLAST2 (Altschul et al., Nucleic Acids Res., 25:3389-3402 (1997)). El programa de comparación de secuencias NCBI-BLAST2 puede descargarse de "http://www.ncbi.nlm.nih.gov" u obtenerse de otro modo de los National Institutes of Health, Bethesda, Md., USA 20892. NCBI-BLAST2 usa varios parámetros de búsqueda, en donde todos esos parámetros de búsqueda se ajustan a valores por defecto, incluyendo, por ejemplo, desenmascarar = yes, hebra = all, acontecimientos esperados = 10, longitud mínima para la baja complejidad = 15/5, valor e para "multi-pass" = 0,01, constante para "multi-pass" = 25, disminución para el alineamiento final espaciado = 25, y matriz de puntuación = BLOSUM62.

En las situaciones en que se emplea el NCBI-BLAST2 para las comparaciones de secuencias, el % de identidad de la secuencia de ácido nucleico de una determinada secuencia de ácido nucleico C respecto a, con, o contra una determinada secuencia de ácido nucleico D (lo que puede redactarse alternativamente como una determinada secuencia de ácido nucleico C que tiene o comprende un cierto % de identidad de ácido nucleico respecto a, con o contra una determinada secuencia de ácido nucleico D) se calcula como sigue:

100 veces la fracción W/Z

en donde W es el número de nucleótidos anotados como emparejamientos idénticos por el programa de alineamiento de secuencias NCBI-BLAST2 en ese alineamiento del programa de C y D, y en donde Z es el número total de nucleótidos en D. Se apreciará que, cuando la longitud de la secuencia de ácido nucleico C no es igual a la longitud de ácido nucleico de la secuencia D, el % de identidad de la secuencia de ácido nucleico de C respecto D no será igual al % de identidad de la secuencia de ácido nucleico de D respecto C.

En otras realizaciones, los polinucleótidos de la variante de la invención son moléculas de ácido nucleico que codifican un polipéptido activo de la invención, y que son capaces de hibridarse, preferiblemente en condiciones rigurosas de hibridación y lavado, con secuencias nucleotídicas que codifican el polipéptido de longitud completa de la invención. Los polipéptidos de la variante de la invención incluyen aquéllos codificados por un polinucleótido de la variante de la invención.

El término "positivo", en el contexto de las comparaciones de la identidad de la secuencia de aminoácidos realizadas tal como se ha descrito más arriba, incluye los residuos aminoácidos en las secuencias comparadas que no sólo son idénticos, sino también aquéllos que tienen propiedades similares. Los residuos aminoácidos que puntúan un valor positivos respecto un aminoácido de interés son aquéllos que, o son idénticos al residuo aminoácido de interés, o son una sustitución preferida (tal como se define en la Tabla 6 más abajo) del residuo aminoácido de interés.

Para los propósitos en la presente, el valor del % de positivos de una determinada secuencia de aminoácidos A respecto a, con, o contra una determinada secuencia de aminoácidos B (lo que puede redactarse alternativamente como una determinada secuencia de aminoácidos A que tiene o comprende un cierto % de positivos respecto a, con o contra una determinada secuencia de aminoácidos B) se calcula como sigue:

100 veces la fracción X/Y

en donde X es el número de residuos aminoácidos que puntúan un valor positivo, tal como se ha definido más arriba, según el programa de alineamiento de secuencias ALIGN-2 en ese alineamiento del programa de A y B, y en donde Y es el número total de residuos aminoácidos en B. Se apreciará que, cuando la longitud de la secuencia de aminoácidos A no es igual a la longitud de aminoácidos de la secuencia B, el % de positivos de A respecto B no será igual al % de positivos de B respecto A.

Una molécula de ácido nucleico "aislada" que codifica un polipéptido de la insulina o variante de la insulina es una molécula de ácido nucleico que se identifica y separa de al menos una molécula de ácido nucleico contaminante con la cual está ordinariamente asociada en la fuente natural del ácido nucleico que codifica la insulina o variante de la insulina. Preferiblemente, el ácido nucleico aislado está libre de asociación con todos los componentes con los cuales está naturalmente asociado. Una molécula aislada de ácido nucleico que codifica la insulina o una variante de la insulina es distinta a la forma o entorno en el cual se halla en la naturaleza. Por tanto, tales moléculas de ácido nucleico aislada se distinguen de la molécula que codifica la insulina o la variante de la insulina tal como ésta existe en las células naturales. Sin embargo, la molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido de la insulina o de la variante de la insulina incluye respectivamente moléculas de ácido nucleico que codifican la insulina o variante de la insulina contenida en las células que ordinariamente expresan tales moléculas, en donde, por ejemplo, la molécula de ácido nucleico está en una ubicación cromosómica diferente de la de las células naturales.

El término "secuencias de control" se refiere a secuencias de ADN necesarias para la expresión de una secuencia codificante unida operativamente en un determinado organismo huésped. Las secuencias de control que son apropiadas para los procariotas incluyen, por ejemplo, un promotor, opcionalmente una secuencia de operador, y un sitio de unión de ribosomas. Se sabe que las células eucariotas utilizan promotores, señales de poliadenilación, y potenciadores.

Un ácido nucleico está unido operativamente cuando está colocado en una relación funcional con otra secuencia de ácido nucleico. Por ejemplo, el ADN para una presecuencia o líder secretor está unido operativamente al ADN para un polipéptido si se expresa como una preproteína que participa en la secreción del polipéptido; un promotor o potenciador está unido operativamente a una secuencia codificante si afecta la transcripción de la secuencia; o un sitio de unión de ribosomas está unido operativamente a una secuencia codificante si está ubicado de tal forma que facilita la traducción. Generalmente, "unido operativamente" significa que las secuencias de ADN que están uniéndose son contiguas, y, en el caso de un líder secretor, contiguas y en pauta de lectura. Sin embargo, los potenciadores no tienen porque ser contiguos. La unión se consigue mediante la ligación en los sitios de restricción apropiados. Si tales sitios no existen, se usan adaptadores o engarces de oligonucleótidos sintéticos de acuerdo con la práctica convencional.

La "rigurosidad" de las reacciones de hibridación es fácilmente determinable por alguien con la formación ordinaria en el campo, y generalmente es un cálculo empírico que depende de la longitud de la sonda, de la temperatura de lavado, y de la concentración de sal. En general, la sondas más largas requieren temperaturas más elevadas para un emparejamiento apropiado, mientras que las sondas más cortas necesitan temperaturas más bajas. La hibridación depende generalmente de la capacidad del ADN desnaturalizado para emparejarse de nuevo, cuando las hebras complementarias están presentes en un entorno, por debajo de su temperatura de fusión. Cuanto mayor es el grado de homología deseado entre la sonda y la secuencia que puede hibridarse, mayor es la temperatura relativa que puede usarse. Como resultado, se concluye que la temperaturas relativas más elevadas tenderán a hacer las condiciones de reacción más rigurosas, mientras que las temperaturas inferiores lo hacen menos. Para detalles adicionales y una explicación de la rigurosidad de las reacciones de hibridación, consultar Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Wiley Interscience Publishers, (1995).

Las "condiciones rigurosas" o las "condiciones de rigurosidad elevada", tal como se definen en la presente, podrían identificarse como aquéllas que: (1) emplean una fuerza iónica baja y una temperatura elevada para el lavado, por ejemplo cloruro sódico 0,015 M/citrato sódico 0,0015 M/0,1% de dodecilsulfato sódico a 50ºC; (2) durante la hibridación emplean un agente desnaturalizante, tal como la formamida, por ejemplo, 50% (v/v) de formamida con un 0,1% de albúmina de suero bovino/0,1% de Ficoll/0,1% de polivinilpirrolidona/tampón fosfato sódico 50 mM a pH 6,5 con cloruro sódico 750 mM, citrato sódico 75 mM a 42ºC; o (3) emplean 50% de formamida, 5\timesSSC (NaCl 0,75 M, citrato sódico 0,075 M), fosfato sódico 50 mM (pH 6,8), 0,1% de pirofosfato sódico, solución de Denhardt 5\times, ADN de esperma de salmón sonicado (50 \mug/ml), 0,1% de SDS, y 10% de dextrano sulfate a 42ºC, con lavados a 42ºC en 0,2\timesSSC (cloruro sódico/citrato sódico) y 50% formamida a 55ºC, seguidos por un lavado de elevada rigurosidad consistente en 0,1\timesSSC conteniendo EDTA a 55ºC.

Las "condiciones de rigurosidad moderadas" podrían identificarse tal como describieron Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, New York: Cold Spring Harbor Press, 1989, e incluyen el uso de solución de lavado y condiciones de hibridación (por ejemplo, temperatura, fuerza iónica y % de SDS) menos rigurosas que las descritas más arriba. Un ejemplo de condiciones de rigurosidad moderadas es la incubación durante la noche a 37ºC en una solución que comprende: 20% de formamida, 5\timesSSC (NaCl 150 mM, citrato trisódico 15 mM), fosfato sódico 50 mM (pH 7,6), 5\times solución de Denhardt, 10% de dextrano sulfato, y 20 \mug/ml de ADN de esperma de salmón cortado y desnaturalizado, seguido por un lavado con los filtros en 1\timesSSC a aproximadamente 37-50ºC. El especialista capacitado reconocerá como ajustar la temperatura, la fuerza iónica, etc., según sea necesario para acomodar los factores tales como la longitud de la sonda y similares.

El término "epítopo etiquetado" cuando se usa en ésta se refiere a un polipéptido quimérico que comprende un polipéptido de la invención fusionado a un "polipéptido etiquetado". El polipéptido etiquetado tiene bastantes residuos como para proporcionar un epítopo contra el que puede prepararse un anticuerpo, aunque lo bastante corto como para que no interfiera con la actividad del polipéptido al cual está fusionado. El polipéptido etiquetado preferiblemente es también bastante único, de forma que el anticuerpo no reaccione de forma cruzada sustancialmente con otros epítopos. Los polipéptidos etiquetados apropiados tienen generalmente al menos seis residuos aminoácidos, y usualmente entre 8 y 50 residuos aminoácidos (preferiblemente, entre aproximadamente 10 y 20 residuos aminoácidos).

"Activo" o "actividad" en el contexto de las variantes del polipéptido de la invención se refiere a la(s) forma(s) de las proteínas de la invención que retienen las actividades biológica y/o inmunológica de un polipéptido de insulina nativo o que ocurre de forma natural, en donde actividad "biológica" se refiere a una función biológica (inhibidora o estimuladora), causada por una insulina nativa o que ocurre de forma natural, distinta de la capacidad de servir como un antígeno en la producción de un anticuerpo contra un epítopo antigénico poseído por un polipéptido de la invención nativo o que ocurre de forma natural. De forma similar, actividad "inmunológica" se refiere a la capacidad de servir como un antígeno en la producción de un anticuerpo contra un epítopo antigénico poseído por un polipéptido de la invención nativo o que ocurre de forma natural.

"Actividad biológica" en el contexto de un anticuerpo y otra molecular que puede identificarse mediante los ensayos de búsqueda descrito en la presente (por ejemplo, una molécula orgánica o inorgánica pequeña, un péptido, etc.) se usa para referirse a la capacidad de tales moléculas para promover la regeneración y/o prevenir la destrucción del cartílago. Opcionalmente, el cartílago es cartílago articular y la regeneración y/o destrucción del cartílago está asociada con una lesión o un trastorno cartilaginoso. Por ejemplo, la actividad biológica podría cuantificarse mediante la inhibición de la liberación de proteoglicanos (PG) a partir del cartílago articular, el incremento en la síntesis de PG en el cartílago articular, la inhibición de la producción de NO, etc.

Una "molécula pequeña" se define en la presente que tiene un peso molecular inferior a 600 daltones, y generalmente es una molécula orgánica.

El término "aislado", cuando se usa para referirse a los diversos polipéptidos de la invención, indica un polipéptido que se ha identificado y separado y/o recuperado de un componente de su entorno natural. Los componentes contaminantes de su entorno natural son materiales que interferirían con los usos diagnósticos o terapéuticos del anticuerpo, y podrían incluir enzimas, hormonas, y otros solutos proteicos o no proteicos. En una realización preferida, el polipéptido de la invención se purificará (1) hasta más del 95% en peso del compuesto según se determina mediante el método de Lowry, y más preferiblemente más del 99% en peso, (2) hasta un grado suficiente para obtener al menos 15 residuos de la secuencia de aminoácidos N-terminal o interna mediante el uso de un secuenciador de copa rotatoria, o (3) hasta su homogeneidad según SDS-PAGE en condiciones reductoras o no reductoras, usando azul de Coomassie o, preferiblemente, tinción con plata. El compuesto aislado, por ejemplo, el anticuerpo o polipéptido, incluye el compuesto in situ dentro de células recombinantes, puesto que al menos uno de los compuestos del entorno natural no estará presente. Sin embargo, ordinariamente, el compuesto aislado se preparará mediante al menos un paso de purificación.

La palabra "marca" cuando se usa en la presente se refiere a un compuesto o composición detectable que está conjugado directa o indirectamente con el compuesto, por ejemplo, anticuerpo o polipéptido, con objeto de generar un compuesto "marcado". La marca podría ser detectable por sí misma (por ejemplo, marcas radiactivas o marcas fluorescentes) o, en el caso de una marca enzimática, podría catalizar la alteración química de un compuesto o composición sustrato, el cual es detectable. Por contra, la palabra "instrucción" tal como se usa en la presente se refiere al lenguaje fijado al embalaje de los contenedores que indica un uso conforme con los procedimientos reivindicados.

Por "fase sólida" se quiere significar una matriz no acuosa a la cual se adhiere el compuesto de la presente invención. Los ejemplos de fases sólidas abarcados en la presente, incluyen aquéllos formados parcial o totalmente por vidrio (por ejemplo, vidrio de poro controlado), polisacáridos (por ejemplo, agarosa), poliacrilamidas, poliestireno, alcohol polivinílico, y siliconas. En ciertas realizaciones, dependiendo del contexto, la fase sólida puede comprender el pocillo en una placa de ensayo; en otras es una columna de purificación (por ejemplo, una columna de cromatografía de afinidad). Este término también incluye una fase sólida discontinua de partículas discretas, tales como las descritas en la patente estadounidense nº 4,275,149.

Un "liposoma" es una vesícula pequeña compuesta por varios tipos de lípidos, fosfolípidos y/o tensioactivos, la cual es útil para suministrar un fármaco (tal como la insulina y variantes de la insulina descritas en la presente) a una mamífero. Los componentes del liposoma están comúnmente dispuestos en una formación de bicapa, similar a la disposición de los lípidos de membranas biológicas.

Tal como se usa en la presente, el término "inmunoadhesina" designa las moléculas parecidas a un anticuerpo que combinan la especificidad de unión de una proteína heteróloga (una "adhesina") con las funciones efectoras de los dominios constantes de inmunoglobulina. Estructuralmente, las inmunoadhesinas comprenden una fusión de una secuencia de aminoácidos con la especificidad de unión deseada, la cual es distinta del sitio de reconocimiento y unión del antígeno de un anticuerpo (es decir, es "heteróloga"), y una secuencia de un dominio constante de inmunoglobulina. La parte adhesina de una molécula de inmunoadhesina típicamente es una secuencia de aminoácidos contigua, que comprende al menos el sitio de unión de un receptor o de un ligando. La secuencia del dominio constante de inmunoglobulina podría obtenerse de cualquier inmunoglobulina, tal como los subtipos IgG-1, IgG-2, IgG-3, o IgG-4, la IgA (incluyendo la IgA-1 y la IgA-2), la IgE, la IgD o la IgM.

El término formulaciones de "liberación ampliada" o "liberación sostenida" en el sentido más amplio posible, significa una formulación de polipéptido de insulina o variante de la insulina activo que resulta en la liberación o activación del polipéptido activo durante un período de tiempo continuado o ampliado -o al menos durante un período de tiempo que es mayor que si el polipéptido se hiciera asequible in vivo en el estado nativo o sin formular. Opcionalmente, la formulación de liberación ampliada ocurre a una velocidad constante y/o resulta en la concentración sostenida y/o continua del polipéptido activo. Las formulación de liberación ampliada apropiadas comprenden la microencapsulación, las matrices semipermeables de polímeros hidrofóbicos sólidos, los polímeros biodegradables, los hidrogeles biodegradables, las suspensiones o emulsiones (por ejemplo, aceite-en-agua o agua-en-aceite). Opcionalmente, la formulación de liberación ampliada comprende el ácido poliláctico-coglicólico (PLGA) y puede prepararse tal como se describe en Lewis, "Controlled Release of Bioactive Agents form Lactide/Glycolide polymer," en Biodegradable Polymers as Drug Delivery Systems, editores M. Chasin & R. Langeer, (Marcel Dekker, New York), pp. 1-41. Opcionalmente, la formulación de liberación ampliada es estable y la actividad de la insulina o de la variante de la insulina no disminuye apreciablemente con el almacenamiento en el tiempo. Más específicamente, tal estabilidad puede potenciarse a través de la presencia de un agente estabilizante, tal como una sal metálica polivalente soluble en agua.

La Tabla 1 siguiente proporciona el código fuente completo del programa de ordenador de comparación de secuencias ALIGN-2. Este código fuente podría compilarse de forma rutinaria para su uso en un sistema operativo UNIX para proporcionar el programa de ordenador de comparación de secuencias ALIGN-2.

Las Tablas 2-5 de más abajo muestran ejemplos hipotéticos para usar del procedimiento descrito más abajo para determinar el % de identidad de la secuencia de aminoácidos (Tablas 2-3) el % de identidad de la secuencia de ácidos nucleicos (Tablas 4-5) usando el programa de ordenador de comparación de secuencias ALIGN-2, en donde "PRO" representa la secuencia de aminoácidos de un polipéptido hipotético de la invención de interés, "Proteína de comparación" representa la secuencia de aminoácidos del polipéptido con el cual se está comparando el polipéptido de interés "PRO", "PRO-ADN" representa la secuencia de ácido nucleico de una molécula de ácido nucleico con el cual se está comparando la molécula de ácido nucleico "PRO-ADN" de interés, cada una de "X", "Y" y "Z" representan diferentes residuos aminoácidos hipotéticos, y cada una de "N", "L" y "V" representa diferentes nucleótidos hipotéticos.

TABLA 1

1

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TABLA 2

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TABLA 3

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TABLA 4

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TABLA 5

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II. Modos para llevar a cabo la invención A. Ensayo del explante de cartílago articular

En este ensayo se describe el potencial sintético y profiláctico del compuesto de ensayo sobre el cartílago intacto. Con esta finalidad, se miden la síntesis y ruptura de proteoglicanos (PG), y la liberación de óxido nítrico en explantes de cartílago articular tratado. Los proteoglicanos son el segundo componente más abundante de material orgánico en el cartílago articular (Kuettner, K. E. et al., Articular Cartilage Biochemistry, Raven Press, New York, USA (1986), p.456; Muir, H., Biochem. Soc. Tran., 11:613-622 (1983); Hardingham, T. E., Biochem. Soc. Trans., 9:489-497 (1981). Puesto que los proteoglicanos ayudan a determinar las propiedades físicas y químicas del cartílago, la disminución en PG del cartílago que ocurre durante la degeneración articular conduce a una pérdida de rigidez compresiva y elasticidad, un incremento en la permeabilidad hidráulica, un contenido en agua incrementado (hinchazón), y cambios en la organización de otros componentes extracelulares tales como los colágenos. Por tanto, la pérdida de PG es un paso temprano en la progresión de los trastornos del cartílago, uno que además perturba la estabilidad biomecánica y bioquímica de la articulación. Los PG en el cartílago articular han sido ampliamente estudiados por su probable papel en el crecimiento esquelético y en la enfermedad. Mow, V. C. y Ratcliffe, A. Biomaterials, 13:67-97 (1992). La rotura de proteoglicanos, la cual está incrementada en las articulaciones enfermas, se mide en los ensayos descritos en la presente cuantificando la cantidad de PG liberados al medio por explantes de cartílago articular usando el ensayo colorimétrico de la DMMB. Farndale y Buttle, Biochem. Biophys. Acta, 883:173-177 (1985). La incorporación del ^{35}S-sulfato en los proteoglicanos se usa para medir la síntesis de proteoglicanos.

La evidencia que vincula la interleucina-1\alpha, IL-1\alpha, y los trastornos degenerativos del cartílago es sustancial. Por ejemplo, se han hallado niveles elevados de IL-1\alpha (Pelletier J P et al., "Cytokines and inflammation in cartilage degradation" in Osteoarthritic Edition of Rheumatic Disease Clinics of North America, editores R W Moskowitz, Philadelphia, W. D. Saunders Company, 1993, p. 545-568) y de receptores de la IL-1 (Martel-Pelletier et al., Arthritis Rheum., 35: 530-540 (1992) en articulaciones enfermas, y la IL-1\alpha induce la rotura de la matriz del cartílago e inhibe la síntesis de nuevas moléculas de la matriz. Baragi et al., J. Clin. Invest., 96:2454-2460 (1995); Baragi et al., Osteoarthritis Cartilage, 5:275-282 (1997); Evans et al., J. Leukoc. Biol., 64:55-61 (1998); Evans et al., J. Rheumatol., 24:2061-63 (1997); Kang et al., Biochem. Soc. Trans., 25:533-37 (1997); Kang et al., Osteoarthritis Cartilage, 5:139-43 (1997). Debido a la asociación de la IL-1\alpha con la enfermedad, el compuesto de ensayo también se ensaya en presencia de IL-1\alpha. La capacidad del compuesto de ensayo, no sólo de tener efectos positivos sobre el cartílago, sino también de contrarrestar los efectos catabólicos de la IL-1\alpha es una evidencia fuerte del efecto protector exhibido por el compuesto de ensayo. Además, una actividad tal sugiere que el compuesto de ensayo podría inhibir la degradación que ocurre en condiciones artríticas, porque los sucesos catabólicos iniciados por la IL-1\alpha son inducidos también por muchas otras citocinas, y porque se ha mostrado que el antagonismo de la actividad de la IL-1\alpha reduce la progresión de la osteoartritis. Arend, W. P. et al., Ann. Rev. Immunol., 16:27-55 (1998).

La producción de óxido nítrico (NO) puede inducirse en el cartílago mediante citocinas catabólicas tales como la IL-1. Palmer, R M J et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 193:398-405 (1993). El NO ha sido implicado en la destrucción de las articulaciones que ocurre en las condiciones artríticas. Ashok et al., Curr. Opin. Rheum., 10:263-268 (1998). A diferencia del cartílago normal (no enfermo ni lesionado), el cartílago osteoartrítico produjo cantidades significativas de óxido nítrico ex vivo, incluso en ausencia de estímulos añadidos tales como la interleucina-1 o los lipopolisacáridos (LPS). Los modelos animales in vivo sugieren que la inhibición de la producción de óxido nítrico reduce la progresión de la artritis. Pelletier, J P et al., Arthritis Rheum., 7:1275-1286 (1998); van de Loo et al., Arthritis Rheum., 41:634-646 (1998); Stichtenoth, D. O. y Frolich J. C., Br. J. Rheumatol., 37:246-257 (1998). in vitro, el óxido nítrico ejerce efectos perjudiciales sobre la función de los condrocitos, incluyendo la inhibición de la síntesis de colágeno y proteoglicanos, la inhibición de la adhesión a la matriz extracelular, y la potenciación de la muerte celular (apoptosis). Se hallan concentraciones más elevadas de nitrito en el fluido sinovial de pacientes osteoartríticos que en el fluido procedente de paciente con artritis reumatoide. Renoux et al., Osteoarthritis Cartilage, 4:175-179 (1996). Además, los modelos animales sugieren que la inhibición de la producción de óxido nítrico reduce la progresión de la artritis. Pelletier, J. P. et al., Arthritis Rheum., 7:1275-1286 (1998); van de Loo et al., Arthritis Rheum., 41:634-646 (1998); Stichtenoth, D. O. y Frolich, J. C., Br. J. Rheumatol., 37:246-257 (1998). Puesto que el NO tiene también un efecto sobre otras células, la presencia de NO dentro de la unión articular podría incrementar la vasodilatación y la permeabilidad, potenciando la liberación de citocinas por parte de los leucocitos, y estimulando la actividad angiogénica. Puesto que el NO probablemente desempeña un papel en ambos, los componentes erosivo e inflamatorio de las enfermedades articulares, un factor que disminuya la producción de óxido nítrico probablemente sería beneficioso para el tratamiento de los trastornos del cartílago.

El ensayo para medir la producción de óxido nítrico descrito en ésta se basa en el principio de que el 2,3-diaminonaftaleno (DAN) reacciona con el nitrito en condiciones ácidas para formar el 1-(H)-naftotriazol, un producto fluorescente. Puesto que el NO es metabolizado rápidamente en nitrito (NO_{2}^{-1}) y nitrato (NO_{3}^{-1}), la detección de nitrito es un medio para detectar (aunque contando de menos) el NO producido realmente por el cartílago.

Los procedimientos empleados se describen con mayor detalle en los ejemplos.

B. Mantenimiento de los condrocitos en cultivo sin suero

En este procedimiento, se examina la capacidad del compuesto de ensayo para potenciar, promover o mantener la viabilidad de los condrocitos en cultivo en ausencia de suero u otros factores de crecimiento. Los condrocitos articulares se preparan primero mediante la supresión de la matriz extracelular y se cultivan en una monocapa, lo que se cree se aproxima a las etapas tardías de los trastornos del cartílago, cuando la matriz se ha agotado.

El ensayo es un ensayo colorimétric que mide la actividad metabólica de las células cultivadas en base a la capacidad de las células viables para romper la sal de tretrazolio MTT amarilla para formar cristales de formazán púrpuras. Esta reducción celular implica los cofactores de nucleótido de piridina NADH y NADPH. Berridge, M. V. y Tan, A. S., Arch. Biochem. Biophys., 303:474 (1993). El producto solubilizado se cuantifica espectrofotométricamente en un lector de ELISA. Este procedimiento se describe con mayor detalle en los ejemplos.

C. Ensayo de la rótula de ratón

El experimento examina los efectos de los compuestos de ensayo sobre la síntesis de proteoglicanos en las patelas (rótulas) de ratones. Este ensayo usa el cartílago intacto (incluyendo el hueso subyacente) y por tanto ensaya los factores en condiciones que se aproximan al entorno in vivo del cartílago. Los compuestos se añaden a las rótulas in vitro, o se inyectan en las articulaciones de rodilla in vivo antes del análisis de la síntesis de proteoglicanos ex vivo. Se ha observado previamente que las rótulas tratadas in vivo muestran cambios distintos en la síntesis de PG ex vivo (Van den Berg et al., Rheum. Int., 1:165-169 (1982); Vershure, P. J. et al., Ann. Rheum. Dis., 53:455-460 (1994); y Van de Loo et al., Arthrit. Rheum., 38:164-172 (1995). En este modelo, la articulación contralateral de cada animal puede usarse como un control. Este procedimiento se describe mejor en los ejemplos.

D. Modelo del cobaya

Estos experimentos miden los efectos del compuesto de ensayo sobre la estimulación de la síntesis de PG y la inhibición de la liberación de PG en explantes de cartílago articular procedentes de una cepa de cobayas, Dunkin Hartley (DH), que espontáneamente desarrolla osteoartritis (OA) de rodilla. La mayoría de los otros modelos animales que causan la rotura de la articulación que progresa rápidamente, se parecen más a la OA secundaria que a la OA primaria humana que progresa lentamente. Por contra, los cobayas DH tienen cambios parecidos a la OA, no inflamatorios, que progresan lentamente y ocurren de forma natural. Puesto que el patrón altamente reproducible de la rotura del cartílago en estos cobayas es similar al observado en el trastorno humano, el cobaya DH es un modelo animal bien aceptado de la osteoartritis. Young et al., "Osteoarthrits", Spontaneous animal models of human disease, vol. 2, pp. 257-261, Acad. Press, New York. (1979); Bendele et al., Arthritis Rheum., 34:1180-1184; Bendele et al., Arthritis Rheum., 31:561-565 (1988); Jimenez et al., Laboratory Animal Sciences, 47 (6):598-601 (1997); Wei et al., Acta Orthop Scand, 69:351-357 (1998)). Inicialmente, estos animales desarrollan una OA moderada que es detectable por la presencia de cambios histológicos mínimos. Sin embargo, a medida que la enfermedad progresa, y hacia los 16-18 meses de edad, se observa un degeneración del cartílago, de moderada a grave, en las articulaciones (Figura 8).

Como resultado, el efecto del compuesto de ensayo sobre la matriz cartilaginosa de los cobayas DH a lo largo de la progresión de la enfermedad sería indicativo del efecto terapéutico del compuesto en el tratamiento de la OA en diferentes etapas de la destrucción de la articulación.

El procedimiento se describen con mayor detalle en los ejemplos.

E. Modelo del ratón diabético

Los cambios metabólicos asociados con la diabetes mellitus (diabetes) pueden afectar muchos otros órganos y sistemas musculoesqueléticos del organismo afectado. Por ejemplo, en los humanos, la incidencia de las lesiones y trastornos musculoesqueléticos se incrementa con la aparición de la diabetes, y la diabetes es considerada un factor de riesgo para el desarrollo de la artritis.

En los animales puede inducirse un síndrome similar a la diabetes mediante la administración de estreptozotocina (STZ). Portha B. et al., Diabete Metab., 15:61-75 (1989). Al matar las células pancreáticas que producen la insulina, la STZ disminuye la cantidad de insulina en suero en los animales tratados. La diabetes inducida por la STZ está asociada con la atrofia y el contenido disminuido de colágeno de los tejidos conectivos, incluyendo la piel, los huesos y el cartílago. Craig, R. G. et al., Biochim. Biophys. Acta, 1402:250-260 (1998).

En este procedimiento, las rótulas de ratones tratados con STZ y tratados se incuban en presencia del compuesto de ensayo, y se analiza la síntesis de la matriz resultante. La capacidad del compuesto de ensayo para incrementar o restaurar el nivel de síntesis de PG al de los controles no tratados es indicativo del potencial terapéutico. Este procedimiento se describe mejor en los ejemplos.

F. Formulación de liberación ampliada como microesferas poliméricas

Mientras que las inyecciones intermitentes son generalmente bien toleradas por los pacientes, y las inyecciones de agentes terapéuticos una vez por semana está siendo actualmente ensayada clínicamente, un fármaco ideal sería uno en el que se requiriera un número limitado de dosis. Sin embargo, cuando el componente activo es inestable o se degrada rápidamente en condiciones fisiológicas, es altamente deseable una formulación de liberación lenta, estabilizada.

Estos experimentos, descritos con mayor detalles como los Ejemplos 6-8, examinan la efectividad de una formulación de liberación lenta del compuesto ensayado según es indicada por (1) el tamaño, la carga de proteína y la integridad física; (2) el perfil de liberación del compuesto de ensayo a partir de la matriz de liberación lenta, y (3) la actividad biológica del compuesto de ensayo después de su liberación de la matriz de liberación lenta.

Estos procedimientos se describen mejor en los ejemplos siguientes.

1. Características físicas

En algunas circunstancias, podría ser necesario o deseable estabilizar el compuesto de ensayo con otros agentes complejantes o estabilizadores antes de su incorporación en la forma de liberación lenta. Por ejemplo, mientras que el compuesto concreto de la invención, la insulina humana (HI), parece ser muy efectivo para tratar trastornos del cartílago, no puede usarse cuando se almacena en condiciones neutras, a bajas concentraciones, durante extensos períodos de tiempo. J. Brenge y L. Langkjoer, Insulin Formulation and Delivery in Protein Delivery, Eds, L M. Sanders and W. Hendren, Plenum Press, 1997. Además, la HI se degrada rápidamente en el cuerpo, teniendo una vida media de tan sólo 5 minutos en el cuerpo humano. Hadley, M E, Endocrinology, Prentice-Hall, Inc. 1988.

Una solución potencial al problema de una vida corta e inestabilidad que se ha intentado con la HI es la formulación con zinc. En otro lugar se ha intentado una formulación de acetato de zinc:HI poco soluble, en base a la evidencia histoquímica que sugiere que la insulina se almacena en el páncreas como un complejo con zinc. Eli Lilly, Indianapolis, Ind.; J. Brenge y L. Langkjoer, ver más arriba.; Hadley, ver más arriba. Otra evidencia indica que la HI complejada con zinc es más resistente a la agregación y que tiene un arranque más lento y una mayor duración de su actividad respecto el material no complejado. J. Brenge & L. Langkjoer, ver más arriba.

La formulación de liberación lenta descrita en este procedimiento comprende la microencapsulación de un compuesto liofilizado por pulverización en una matriz de poli(ácido láctico/ácido glicólico) (PLGA) Gombotz et al., patente estadounidense nº 5,019,400 y Johnson et al., Nature Med., 2(7):795-799 (1996)

En este procedimiento, la cantidad de compuesto de ensayo en la composición de liberación lenta se determinó mediante análisis químico, mientras que la integridad física y biológica del material de ensayo recuperable de las composiciones se determinó mediante cromatografía de exclusión por tamaño (SEC) y fase inversa (RPC).

2. Perfiles de liberación

En este procedimiento, las microesferas de PLGA cargadas con insulina se incubaron en 3 condiciones diferentes y se analizó la actividad de la proteína recuperada en diferentes intervalos de tiempo. En este sistema de liberación lenta, el compuesto de ensayo se libera de la microesfera mediante tratamiento con hidróxido sódico y/o tampón de histidina. Con objeto de simular mejor las condiciones fisiológicas, las microesferas se incuban también en fluido sinovial o con explantes de cartílago articular.

La liberación del compuesto de ensayo de la microesfera puede determinarse mediante cualquier procedimiento que se use típicamente para ensayar la presencia y/o actividad del compuesto de ensayo. Por ejemplo, con la HI, una técnica apropiada es el uso de un ensayo de la quinasa del receptor de la insulina (por ejemplo, en células CHO).

3. Actividad biológica

En este procedimiento se determina la actividad biológica del compuesto de ensayo liberado desde la microencapsulación. Aunque el procedimiento de la última sección fue una medición de la actividad biológica del compuesto de ensayo en el sentido genérico, es importante confirmar que el compuesto de ensayo liberado todavía retiene una actividad biológica particularmente deseada sobre el cartílago articular (por ejemplo, la estimulación de la síntesis de la matriz y la inhibición de la rotura de la matriz).

G. Ensayo del explante de cartílago articular humano

De forma similar a la descrita más arriba en el ensayo del explante de cartílago articular, este procedimiento mide los efectos anabólicos de la molécula de ensayo, excepto que la fuente del tejido es humana. El procedimiento se describe con mayor detalle en el Ejemplo 9.

III. Composiciones y procedimientos de la invención A. Insulina de longitud completa y/o variantes de la misma

La presente invención proporciona en parte un procedimiento novedoso para usar polipéptidos de la insulina y de la variante de la insulina para tratar los trastornos del cartílago, incluyendo la regeneración y/o prevención de la degradación del cartílago. En concreto, se han identificado y aislado los cADN que codifican polipéptidos de la insulina y variante de la insulina, y en la presente se descubre su uso en el tratamiento de los trastornos del cartílago. La insulina es una molécula bien conocida, y la insulina humana recombinante es fácilmente disponible a partir de numerosos proveedores comerciales, incluyendo Lilly, Novo-Nordisk, y Sigma. Alternativamente, las moléculas de insulina y variante de la insulina para uso con la presente invención podrían obtenerse mediante cualquier técnica conocida a partir de las secuencias de polipéptidos identificadas como SEC. Nº ID.:1 y 2 (Figuras 18A y 18B).

La insulina humana nativa tiene dos cadenas peptídicas, una cadena A que contiene 21 aminoácidos (SEC. Nº ID.:1) y una cadena B que contiene 30 residuos aminoácidos (SEC. Nº ID.:2). Las dos cadenas contienen 3 enlaces disulfuro, formado cada uno por dos residuos cisteinilos. Dos de los puentes son puentes entre cadenas, entre los residuos A7-B7 y A-20-B-19, y el otro es un puente interno de la cadena entre los residuos A-6-A-11 (Figuras 17A-B).

La insulina podría producirse mediante la expresión separada de las cadenas A y B, seguida por una reacción de plegamiento para formar los enlaces disulfuro. Chance et al., Diabetes Care, 4:147-154 (1982). Estos cambios podrían expresarse en E. coli como proteínas de fusión con \beta-galactosidasa. Williams et al., Science, 215(5):687-689 (1982). Las cadenas separadas (formas S-sulfonatadas) pueden combinarse en presencia de mercaptano para obtener la molécula activa. Goeddel et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 76(1):106-110 (1979). Debido al gran tamaño de la proteína de fusión con \beta-gal (es decir, más de 1000 aminoácidos), a menudo ocurre el desprendimiento prematuro del ribosoma, lo que resulta en traducciones incompletas de la insulina. Burnett, Experimental Manipulation of Gene Expression, Inouye, Ed. Academic Press, Nueva York, pp. 259-277 (1983). Una mejora de este procedimiento es el uso del operón triptófano (Trp) en vez del operón lac en el sistema de expresión con \beta-gal. Hall, Invisible Frontiers-The Race to Synthesize a Human Gene, Atlantic Monthly Press, New York, 1987). El operón Trp es una serie de cinco genes bacterianos que secuencialmente sintetizan los enzimas responsables del anabolismo del triptófano. El operón Trp ofrece varias ventajas: (1) el Trp E sólo tiene aproximadamente 190 residuos aminoácidos en comparación con el enzima \beta-gal (1000), por tanto, reduce enormemente la probabilidad de una terminación prematura de la cadena; (2) el gen Trp E incrementa la expresión de la proteína de fusión, resultando en una expresión 10 veces mayor en comparación con el sistema lac (es decir, \beta-gal); (3) el operón Trp se activa cuando el medio de fermentación es deficiente en triptófano, por tanto, la expresión puede ponerse en marcha cuando la masa de células huésped está en un máximo, permitiendo que se agote el triptófano en el medio de fermentación. Cuando la fermentación se ha completado, la proteína se recupera mediante la rotura de las paredes celulares y la recuperación de los cuerpos de inclusión, seguida por el corte con CNBr para liberar las cadenas A o B, y se purifica, mediante cromatografía líquida de intercambio iónico, de exclusión por tamaño y de fase inversa con elevadas prestaciones, para obtener el producto recombinante purificado. Frank y Chase, Munch Med. Wschr., 125(Suppl. 1):514-520 (1983).

Otros procedimiento común para producir la insulina implica la producción de proinsulina. La proinsulina de secuencia nativa (SEC. Nº ID.:3) (Figura 18C) es un polipéptido de cadena simple en el cual el extremo N-terminal de la cadena-A de insulina está unido a través de un péptido conector con el extremo C-terminal de la cadena B de la insulina, y los residuos cisteinilos apropiados están unidos por enlaces disulfuro. La proinsulina de secuencia nativa humana tiene 86 residuos aminoácidos, 35 de los cuales constituyen el péptido conector, algunas veces conocido como péptido-C (SEC. Nº ID.:4) (Figura 18D). Yanaihara et al., Diabetes, 27 (Suppl. 1):149-160 (1978). La principal importancia del péptido-C es facilitar la formación de los puentes disulfuro apropiados y/o el procesamiento similar a tripsina en el sitio de dos aminoácidos básicos adyacentes. Bell et al., Nature, 284:26-32 (1980); Thim et al., PNAS, 83:6766-6770 (1986). Este péptido conector puede suprimirse mediante digestión enzimática. W. Kemmler et al., J. Biol. Chem., 246:6786 (1971).

La producción de proinsulina se describe en Kroeff et al., J. Chromatogr., 481:45-61 (1989). La expresión podrían llevarse a cabo en E. coli mediante la unión de un gen de metionina y el gen de la proinsulina en un gen bacteriano en un plásmido vector que se introduce. La proinsulina se libera a continuación de la proteína bacteriana mediante la destrucción del engarce de metionina, se pliega de nuevo, y el péptido-C se elimina para rendir insulina activa.

Se han intentado muchas variantes de la proinsulina con modificaciones en el péptido-C. Por ejemplo, EP 704,527 descubre el uso de cualquier péptido que contenga al menos un sitio de N-glicosilación, preferiblemente -Asn-X-Ser-. Hay variantes adicionales del péptido-C que contienen de 2 a 35 aminoácidos (DK-A-5284/87), o simplemente un dipéptido de -Lys-Arg- (EP-A-195-691). Se han descrito otras variantes del péptido-C que contiene solamente al menos un sitio de corte proteolítico, preferiblemente -KR-X-KR- (SEC. Nº ID.:5), -KR-X-M- (SEC. Nº ID.:6) o -N-X-KR- (SEC. Nº ID.:7), en donde X es cualquier cadena de residuos para facilitar el corte y procesamiento por parte de las células de levadura huéspedes. La ventaja del procesamiento por parte del huésped es que elimina o reduce la necesidad de procesar la proinsulina a través de la pasos de digestión y purificación con objeto de llegar a la forma madura. Otras modificaciones del péptido-C incluyen la supresión de los residuos Arg32 a Glu35, Arg32 a Asp36, Arg32 a Glu35 o Arg32 a Gly60 para hacer el precursor susceptible a una proteasa específica para un sitio generada a partir de un mutante de Pseudomonas fragi (WO 86/101540). Otra estrategia incluye la molécula conectora -X-Y-, en donde X es un grupo que une el grupo \alpha-amino de Al al grupo \varepsilon-amino de B-29 o al grupo carboxilo de B-30, la cual se puede cortar enzimática o químicamente sin alterar ninguna de las cadenas A o B de la insulina; e Y es Lys-B30, en donde B30 es Ala, Thr o Ser. (patente estadounidense nº 4,430,266).

Otras estrategias de expresión han suprimido el péptido-C completamente, y han expresado una "proinsulina" variante como un péptido que contiene una cadena-B acortada (B1-29 - residuo Ala carboxilo suprimido) conectado a través del extremo C-terminal con el extremo N-terminal de la cadena-A completa (A1-21). Alternativamente, el péptido-C podría ser los residuos 1-33 con tal que no halla dos aminoácidos básicos adyacentes, por ejemplo, -Ser-Lys- o -Ala-Ala-Lys (EP-A-427-296), alternativamente -Arg-Arg-Gly-Ser-Lys-Arg- (SEC. Nº ID.:8) o -Arg-Arg-(EP 055,945), alternativamente -Arg- o Lys-Arg- (WO 96/20724).

Se han empleado otras diversas estrategias para incrementar los niveles de expresión en huéspedes procariotas, incluyendo la inserción de residuos aminoácidos (por ejemplo, Ala, Arg, Gln, Gly, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Ser, Thr, Try o Val) entre la metionina y la secuencia codificante (EP 0 534 705). Un esquema de producción alternativo, que implica la producción de proteínas de fusión con GPI junto con la desactivación de gas-1 en levadura, se describe en WO 95/22614, EP 324,274, EP 557,976.

Finalmente, el campo está repleto con muchas variantes de la insulina madura que tienen actividad antidiabética. Por ejemplo, EP 0.544.466 describe variantes que tienen los residuos B3 y A21 seleccionados independientemente de entre Ala, Arg, Asn, Cys, Gly, Gln, Glu, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr y Val en combinación con B10 que es His, Asp o Glu. patente estadounidense nº 5,514,646 descubre variantes que se dimerizan menos fácilmente y son por tanto más rápidamente activas que la molécula madura no alterada. Por ejemplo, A21 se selecciona de entre Ala, Asn, Asp, Gln, Glu, Gly, Thr o Ser; B1 es Phe, Asp o está ausente; B2 es Val, o está ausente cuando B1 está ausente; B3 es Asn o Asp; B9 es Ser o Asp; B10 es His o Asn; B28 es cualquier aminoácido que ocurra naturalmente; B29 es Pro, hidroxipro; B30 es Ala, Thr o está ausente; y X-Y-Z son adiciones C-terminales al residuo B30, en donde Z es -OH, metoxi o etoxi, X es Arg, Arg-Arg, Lys, Lys-Lys, Arg-Lys, Lys-Arg o está ausente, e Y está presente sólo cuando X está presente y es Glu o cualquier fragmento de la secuencia -Glu-Ala-Glu-Asp-Leu-Gln-Val-Gly-Gln-Val-Glu-Leu-Gly-Gly-Gly-Pro-Gly-Ala-G ly-Ser-Leu-Gln-Pro-Leu-Ala-Leu-Gly-Gly-Ser-Leu-Gln-Lys-Arg (SEC. Nº ID.:9). WO 95/07931 descubre variantes en las cuales los residuos A21 y B3 son independientemente cualquier aminoácido natural distinto de Lys, Arg y Cys, B1 es Phe o está suprimido, B30 está suprimido o es cualquier aminoácido natural distinto de Lys, Arg o Cys que tenga un sustituyente lipofílico en el grupo \varepsilon-amino de B29. B30 también podría remplazarse con un aminoácido lipofílico no codificable que tenga de 10 a 24 átomos de carbono, que tenga un grupo acilo de hasta 5 átomos de carbono unido al grupo \varepsilon-amino de B29. EP 0 214 826 describe variantes de la insulina en las cuales de 1-7 de los siguientes son sustituidos con los mismos o diferentes residuos, para rendir de ese modo la molécula madura de la misma carga o una carga negativa mayor a pH neutro que la insulina humana: A9-10, A13, A21, B1-2, B5, B9-10, B12, B14, B28. RD 365030 (Research Disclosure, September 1994) descubre la sustitución de Asp por Pro en el residuo 28 y la supresión de B30 con objeto de permitir la conversión de la proinsulina en la forma activa mediante una endopeptidasa lisil-específica procedente de Achromobacter lyticus en vez del corte activado por tripsina. WO 89/10937 descubre variantes de la insulina en las cuales uno o más residuos Asp o Gln (por ejemplo, A5, A15, B4) han sido remplazados por otro aminoácido que ocurre de forma natural. EP 0 375 437 descubre variantes de insulina en las cuales un aminoácido cargado positivamente (es decir, Lys o Arg) se sustituye en la posición B28, o alternativamente la supresión de uno de los residuos B24, B25, B26, B27 o B28, resulta en una carga positiva en el nuevo residuo B28. patente estadounidense nº 5,656,722 descubre variantes de la insulina de acción prolongada en las cuales el residuo A21 es Gly, Ala, Ser, Thr, Val, Leu, Ile, Asp, Glu, Cys, Met, Arg, Lys, His, Tyr, Phe, Trp, Pro; B1 está ausente o es Phe, B10 es cualquier aminoácido que ocurre de forma natural (preferiblemente Asn o Gln); B30 es un aminoácido neutro (por ejemplo, Ala, Ser, Thr); B31 es un grupo orgánico básico que tiene hasta 50 átomos de carbono que comprende de 1-3 \alpha-aminoácidos básicos (por ejemplo, Arg, Lys, Hyl, Orn, Cit, His). Se cree que el inicio retrasado se debe a la poca solubilidad en el punto isoeléctrico causada por los grupos básicos. Estas moléculas pasan a ser activas a partir del corte enzimático de los grupos básicos (por ejemplo, tripsina, carboxipeptidasa B, esterasa). Una variación adicional de estas moléculas se describe en la patente estadounidense nº 5,506,302 en donde el residuo básico arginina está ubicado en el extremo N-terminal del residuo glicina A1. EP 0 519 750 descubre variantes de la insulina con sustituciones de Asp en el residuo B10, en combinación con la supresión de B27-30 o B28-30, incluyendo opcionalmente la sustitución del residuo A21 con Asn, Asp, Glu, Gln, Ala, Gly o Ser, del residuo B1 con Phe o Asp, o del residuo B3 con Asn o Asp.

Finalmente, se ha descrito que las siguientes moléculas tienen actividad antidiabética:

(1) GIVEQ(C)_{1} (C)_{2} TSI(C)_{1} SLYQLENY(C)_{3} N (SEC. Nº ID.:10) FVNQHL(C)_{2} GSHLVEALYLV(C)_{3} GERGFF
YTPKTRREAEDLQVGQVELGGGPGAGSLQPLX (SEC. Nº ID.:11), en donde los subíndices representan la ubicación de enlaces disulfuro y X está presente o ausente, y si está presente es ALEGSLQ (SEC. Nº ID.:12) o ALEGSLQKR (SEC. Nº ID.:13) (EP 0 171,886);

(2) EAEDLQVGQVELGGGPGAGSLQPLALEGSLQKR-GIVEQ(C)_{1} (C)_{2} TSICSLYQLENY(C)_{3} N (SEC. Nº ID.:14) FVNQHL(C)_{2} GSHLVEALYLV(C)_{3} GE-RGFFYTPKT-(RR)_{n}, en donde n es 1 (SEC. Nº ID.:15) o 0 (SEC. Nº ID.:16) (E.P 171,147), en donde los subíndices representan la ubicación de enlaces disulfuro; o

(3) ALEGSLQKRGIVEQ(C)_{1} (C)_{2} TSI(C)_{1} SLYQLENY(C)_{3} N (SEC. Nº ID.:17) FVNQHL(C)_{2} GSHLVEALYLV(C)_{3} GERGFFYTPKTX, en donde los subíndices representan la ubicación de enlaces disulfuro (EP 171,887), y X está presente o ausente (SEC. Nº ID.:18), y si está presente es -R-R o -RREAEDLQVGQVELGGGPGAGSLQPL (SEC. Nº ID.:19).

En presencia de zinc iónico (Zn^{2+}), la insulina humana natural se asocia con un hexámero, con 2 átomos de Zn coordinados de forma octaédrica al HB10 de cada monómero, y 3 moléculas de agua. Blundell et al., Adv. Protein Chem., 26:279-402 (1972), Baker et al., Philos. Trans. R. Soc. London B, 319:369-456 (1988). De ese modo, la unión al Zn^{2+} causa cambios conformacionales alostéricos.

Los ligandos fenólicos o ciertas sales son capaces de inducir una transición conformacional, resultando en la conversión de los 8 aminoácidos N-terminales de la cadena-B de una conformación extendida en una hélice \alpha. Este cambio conformacional permite que los dos átomos de Zn pasen a estar coordinados de forma tetrahédrica con el HB10 de cada monómero, y que un cuarto sitio accesible al solvente sea ocupado por ligandos aniónicos pequeños, es decir, el ion Cl^{1-}, Brader & Dunn, TIBS, 16:341-345 (1991). El estado conformacional inducido por los ligandos fenólicos se denomina estado R, mientras que la forma preconformacional es el estado T. Monod et al., J. Mol. Biol., 12:88-118 (1965). El estado R es más compacto, menos flexible, y el Zn está más fuertemente unido en comparación con el estado T. Derewenda et al., Nature, 338:594-596 (1989). La conversión de la insulina entre las conformaciones alostéricas T y R implica el movimiento del carbón \alpha de B(1) una distancia superior a los 30 Angstroms, una distancia muy considerable para una transformación alostérica.

El cambio conformacional instigado por la presencia de ligandos fenólicos tiene el efecto de incrementar la estabilidad durante el almacenamiento. Brange et al., Pharm. Res., 9:715-726 (1992); Brange et al., Pharm. Res., 9:727-734 (1992); Brange y Langkjaer, Acta Pharm. Nord., 4:149-158 (1992). Una teoría que explica porqué la vida en almacenamiento está incrementada es a través de un modelo termodinámico que describe la degradación de la insulina por la constante de equilibrio del desplegamiento, K_{eq}. Brems et al., Protein Engineering, 5:519-525 (1992). Esta constante de equilibrio de [U]/[N] se determina a partir de la reacción N \leftarrow \rightarrow U, en donde N es la conformación nativa y U es la insulina en conformación desplegada. Puesto que el estado R es la conformación más compacta y menos flexible, y el Zn está más fuertemente unido, se espera que también el estado R proporcione la mayor protección frente a la degradación.

La velocidad de absorción de la insulina está relacionada con la constate de disociación para la autoasociación. Brange et al., Diabetes Care, 13:923-954 (1990). Se cree que la forma de insulina que se absorbe realmente es un monómero, y la velocidad de disociación es el paso limitante de la velocidad. Binder, C., Artificial Systems for Insulin Delivery, Brunetti et al., editores, Raven Press, N.Y., 53-57 (1983). Además, los análogos monoméricos de la insulina se absorben rápidamente y resultan en un perfil rápido de acción con el tiempo. Brange et al., Curr. Opin. Struct. Biol, 1:934-940 (1991); DiMarchi et al., Peptides: Chemistry and Biology, Proceedings of the Twelfth American Peptide Symposium, ESCOM, Leiden, pp. 26-28 (1992). Por tanto, se ha intentado la presencia de Zn y/o de otros fenólicos para posponer la disociación de los hexámeros de Zn-insulina e incrementar la vida en almacenamiento. Sin embargo, la insulina puede ser inducida a forma un hexámero en ausencia sustituyendo GluB13 con GlnB13. Gentley, et al., J. Mol. Biol. 228:1163-1176. Además, el hexámero también podría inducirse en ausencia de insulina mediante la sustitución de un ácido aspártico en la posición 1 de la cadena B, y opcionalmente de glutamina en la posición B13 (WO 96/04307).

B. Variantes de la insulina

Además de los polipéptidos de insulina de secuencia nativa de longitud completa descritos en la presente, es posible crear variantes de la insulina. Mientras que los cambios en la formulación podrían hacerse para efectuar los cambios deseados en la actividad, el término "variantes de la insulina" se pretende explícitamente que abarque los cambios y/o modificaciones en la secuencia polipeptídica. La discusión de las modificaciones en la formulación aparece en la sección "E. Composiciones farmacéuticas y dosis". Otras formulaciones o cambios en la secuencia en la insulina podrían, en teoría, alterar el procesamiento y/o el trayecto intracelular de una variante de la insulina, mejorar la unión al receptor y/o la estabilidad de la proteína, etc. En último extremo, tales cambios podrían mejorar la bioactividad de una variante de la insulina respecto a la molécula nativa.

Las variaciones en la secuencia de aminoácidos de la insulina o en varios dominios del polipéptido de la insulina descritas en la presente, pueden hacerse, por ejemplo, usando cualquiera de las técnicas y guías para mutaciones conservadoras y no conservadores establecida, por ejemplo, en la patente estadounidense nº 5,364,934. Las variaciones podrían ser una sustitución, una supresión o inserción de uno o más nucleótidos que codifican el polipéptido de la insulina, lo que resulta en un cambio en la secuencia de aminoácidos del polipéptido cuando se compara con el polipéptido de la insulina de secuencia nativa. Opcionalmente, la variación resulta en la sustitución de al menos un aminoácido con cualquier otro aminoácido en uno o más de los dominios del polipéptido de la insulina. La guía para determinar qué residuo aminoácido podría insertarse, sustituirse o suprimirse sin afectar de forma adversa la actividad deseada, podría hallarse comparando la secuencia del polipéptido de la insulina con la de moléculas de proteína que se sabe son homólogas, y minimizando el número de cambios en la secuencia de aminoácidos hechos en regiones de elevada homología. Las sustituciones de aminoácidos pueden ser el resultado de sustituir una aminoácido con otro aminoácido que tiene propiedades estructurales y/o químicas similares, tal como en la sustitución de una leucina con una serina, es decir, sustituciones de aminoácido conservadoras. Las inserciones o supresiones podrían estar opcionalmente en el rango de aproximadamente de 1 a 5 aminoácidos. La variación permitida podría determinarse haciendo sistemáticamente inserciones, supresiones o sustituciones de aminoácidos en la secuencia y ensayando las variantes resultantes en busca de la actividad exhibida por la secuencia nativa madura o de longitud completa.

Los fragmentos del polipéptido de la insulina de los polipéptidos de la invención se hallan también dentro del ámbito de la invención. Tales fragmentos podrían estar truncados en los extremos N-terminal o C-terminal, o podrían carecer de residuos internos, por ejemplo, cuando se comparan con la proteína nativa de longitud completa. Ciertos fragmentos carecen de residuos aminoácidos que no son esenciales para una actividad biológica deseada de la insulina o del polipéptido variante de la insulina.

Los fragmentos de insulina podrían prepararse mediante cualquiera de un cierto número de técnicas convencionales. Los fragmentos peptídicos deseados podrían sintetizarse químicamente. Una estrategia alternativa implica generar fragmentos de la insulina mediante digestión enzimática, por ejemplo, tratando la proteína con un enzima que se sabe corta las proteínas en sitios definidos por determinados residuos aminoácidos, o mediante la digestión del ADN con enzimas de restricción apropiados y usando el fragmento deseado para generar la proteína recombinante. Aún otras técnicas apropiadas implican aislar y amplificar un fragmento de ADN, que codifica un fragmento polipeptídico deseado, mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Los oligonucleótidos que definen los extremos deseados del fragmento de ADN se emplean como cebadores 5' y 3' en la PCR. Preferiblemente, los fragmentos polipeptídicos comparten al menos una actividad biológica y/o inmunológica con los polipéptidos de la cadena-A y cadena-B mostrados en las Figuras 18A y 18B (SEC. Nº ID.:1-2).

En realizaciones particulares, las sustituciones conservadoras de interés se muestran en la Tabla 6 bajo el epígrafe de sustituciones preferidas. Si tales sustituciones resultan en un cambio en la actividad biológica, entonces se introducen cambios más sustanciales, denominados sustituciones ilustrativas en la Tabla 6, o como se describe adicionalmente más abajo en referencia a las clases de aminoácidos, antes de examinar los productos de proteína resultantes.

TABLA 6

Residuo original	Sustituciones ilustrativas	Sustituciones preferidas
Ala	(A)	val; leu; ile	val
Arg	(R)	lys; gln; asn	lys
Asn	(N)	gln; his; lys; arg	gln
Asp	(D)	glu	glu
Cys	(C)	ser	ser
Gln	(Q)	asn	asn
Glu	(E)	asp	asp
Gly	(G)	pro; ala	ala
His	(H)	asn; gln; lys; arg	arg
Ile	(I)	leu; val; met; ala; phe; leu norleucina	leu
Leu	(L)	norleucina; ile; val; ile met; ala; phe	ile
Lys	(K)	arg; gln; asn	arg
Met	(M)	leu; phe; ile	leu
Phe	(F)	leu; val; ile; ala; tyr	leu
Pro	(P)	ala	ala
Ser	(S)	thr	thr
Thr	(T)	ser	ser
Trp	(W)	tyr; phe	tyr
Tyr	(Y)	trp; phe; thr; ser	phe
Val	(V)	ile; leu; met; phe; ala; norleucina	leu

Las modificaciones sustanciales en función de la identidad inmunológica del polipéptido de la invención se consiguen seleccionando sustituciones que alteran (a) la estructura del esqueleto del péptido en el área de la sustitución, por ejemplo, como una conformación en hoja o hélice, (b) la carga o hidrofobicidad de la molécula en el sitio diana, o (c) el volumen de la cadena lateral. Los residuos que ocurren de forma natural se dividen en grupos en base a las propiedades comunes de la cadena lateral:

(1) hidrofóbicos: norleucina, met, ala, val, leu, ile;

(2) neutros hidrofílicos: cys, ser, thr;

(3) ácidos: asp, glu;

(4) básicos: asn, gln, his, lys, arg;

(5) residuos que influyen en la orientación de la cadena: gly, pro; y

(6) aromáticos: trp, tyr, phe.

Las sustituciones no conservadoras supondrán intercambiar miembros de una de estas clases por otra clase. Tales residuos sustituidos también podrían introducirse en los sitios de sustitución conservados o, más preferiblemente, en los sitios restantes (no conservados).

Las variaciones pueden hacerse usando procedimientos conocidos en el campos, tales como la mutagénesis mediada por oligonucleótidos (o dirigida contra un sitio), el barrido con alanina, y la mutagénesis con PCR. La mutagénesis dirigida contra un sitio, Carter et al., Nucl. Acids Res., 13:4331 (1986); Zoller et al., Nucl. Acids Res., 10:6487 (1987), la mutagénesis por casete, Wells et al., Gene, 34:315 (1985), la mutagénesis por selección de la restricción, Wells et al., Philos. Trans. R. Soc. London SerA, 317:415 (1986) u otras técnicas conocidas pueden realizarse sobre el ADN clonado para producir el ADN variante.

El análisis por aminoácidos de barrido puede emplearse también para identificar uno o más aminoácidos a lo largo de una secuencia contigua. Entre los aminoácidos de barrido preferidos se encuentran los aminoácidos neutrales, relativamente pequeños. Tales aminoácidos incluyen la alanina, la glicina, la serina y la cisteína. La alanina es típicamente un aminoácido de barrido preferido entre este grupo, por que elimina la cadena lateral más allá del carbono beta y es menos probable que altere la conformación de la cadena principal de la variante. Cunningham y Wells, Science, 244:1081-1085 (1989). La alanina también se prefiere típicamente porque es el aminoácido más común. Además, frecuentemente se halla tanto en posiciones enterradas como expuestas. Creighton, The Proteins, (W. H. Freeman & Co., N.Y.); Chothia, J. Mol. Biol., 150:1 (1976). Si la sustitución con alanina no rinde las cantidades adecuadas de variante, entonces podría usarse un aminoácido isostérico.

C. Modificaciones de la insulina y de las variantes de la insulina

Las modificaciones covalentes de la insulina y/o variantes de la insulina se incluyen dentro del ámbito de esta invención. Un tipo de modificación covalente incluye hacer reaccionar los residuos aminoácidos apuntados de un polipéptido de insulina o de variante de la insulina con un agente derivatizante orgánico que es capaz de reaccionar con cadenas laterales seleccionadas, o con los residuos N- o C-terminales de la molécula. La derivatización con agentes bifuncionales es útil, por ejemplo, para entrecruzar la molécula con una matriz o superficie de soporte insoluble en agua para su uso en el procedimiento para purificar anticuerpos anti-insulina o anti-variante de la insulina, y viceversa. Los agentes entrecruzadores comúnmente usados incluyen, por ejemplo, el 1,1-bis(diazoacetil)-2-feniletano, el glutaraldehído, los ésteres de N-hidroxisuccinimida, por ejemplo, los ésteres con el ácido 4-azidosalicílico, los imidoésteres bifuncionales, incluyendo los ésteres de disuccinimidilo tales como el 3,3'-ditiobis(succinimidilpropionato), la maleimida bifuncionales tales como el bis-N-maleimido-1,8-octano y agentes tales como el metil-3-[(p-azidofenil)ditio]propioimidato.

Otras modificaciones incluyen la desamidación de residuos glutaminilo o asparaginilo respectivamente a los correspondientes residuos glutamilo y asparagilo, la hidroxilación de la prolina y lisina, la fosforilación de los grupos hidroxilo de los residuos serilo y treonilo, la metilación de los grupos \alpha-amino de las cadenas laterales de la lisina, arginina e histidina, la acetilación de la amina N-terminal, y la amidación de cualquier grupo carboxilo C-terminal. T. E. Creighton, Proteins: Structure and Molecular Properties, W. H. Freeman & Co., San Francisco, pp. 79-86 (1983)].

Otro tipo de modificación covalente del polipéptido de la invención incluido dentro del ámbito de esta invención comprende alterar el patrón de glicosilación nativo del polipéptido. "Alterar el patrón de glicosilación nativo" se pretende que signifique, para los propósitos en la presente, suprimir uno o más grupos carbohidratos hallados en el polipéptido de secuencia nativa (bien suprimiendo el sitio de glicosilación subyacente, bien suprimiendo la glicosilación por medios químicos y/o enzimáticos), y/o añadir uno o más sitios de glicosilación que no están presentes en la secuencia nativa. Además, la frase incluye los cambios cualitativos en la glicosilación de las proteínas nativas, implicando un cambio en la naturaleza y proporciones de los diversos grupos carbohidrato presentes.

La adición de sitios de glicosilación al polipéptido podría conseguirse alterando la secuencia de aminoácidos. La alteración podría hacerse, por ejemplo, mediante la adición de, o la sustitución por, uno o más residuos serina o treonina en el polipéptido de secuencia nativa (para los sitios de glicosilación unidos a O). La secuencia de aminoácido podría alterarse opcionalmente a través de cambios a nivel de ADN, particularmente mutando el ADN que codifica el polipéptido en bases preseleccionadas de tal forma que se generen codones que se traducirán en los aminoácidos deseados.

Otro medio de incrementar el número de grupos carbohidratos sobre el polipéptido de la invención es mediante el acoplamiento químico o enzimático de glicósidos al polipéptido. Tales procedimientos se describen en el campo, por ejemplo, en WO 87/05330 publicada el 11 de septiembre de 1987, y en Aplin y Wriston, CRC Crit. Rev. Biochem., pp. 259-306 (1981).

La supresión de grupos carbohidratos presentes sobre el polipéptido de la invención podría conseguirse química o enzimáticamente, o mediante sustitución por mutación de codones que codifican residuos aminoácidos que sirven como dianas para la glicosilación. Las técnicas de desglicosilación química son conocidas en el campo, y son descritas, por ejemplo, por Hakimuddin, et al., Arch. Biochem. Biophys., 259:52 (1987) y by Edge et al., Anal. Biochem., 118:131 (1981). La ruptura enzimática de los grupos carbohidratos sobre los polipéptidos puede conseguir mediante el uso de una variedad de endo- y exoglucosidasas, tal como describen Thotakura et al., Meth. Enzymol., 138:350 (1987).

Otro tipo de modificación covalente comprende unir el polipéptido de la invención a uno de una variedad de polímeros no proteicos, por ejemplo, el polietilenglicol (PEG), el polipropilenglicol, o los polioxialquilenos, de la manera establecida en las patentes estadounidenses nº 4,640,835; 4,496,689; 4,301,144; 4,670,417; 4,791,192 ó 4,179,337.

Los polipéptidos de la insulina y/o variante de la insulina que pueden emplearse con la presente invención podrían modificarse también de manera que formen una molécula quimérica que comprende el polipéptido de la invención fusionado a otro polipéptido o secuencia de aminoácidos heterólogos.

En una realización, tal molécula quimérica comprende una fusión del polipéptido de la invención con un polipéptido etiqueta, el cual proporciona un epítopo al cual puede unirse selectivamente un anticuerpo anti-etiqueta. La etiqueta del epítopo se coloca generalmente en los extremos amino- o carboxi-terminales del polipéptido de la invención. La presencia de tales formas etiquetadas con epítopo del polipéptido de la invención puede detectarse usando un anticuerpo contra el polipéptido etiquetado. También, la provisión de la etiqueta del epítopo permite que el polipéptido de la invención sea fácilmente purificado mediante purificación por afinidad usando un anticuerpo anti-etiqueta u otro tipo de matriz de afinidad que se une a la etiqueta del epítopo. Varios polipéptidos etiqueta y sus respectivos anticuerpos son bien conocidos en el campo. Los ejemplos incluyen las etiquetas de poli-histidina (poly-his) o de poli-histidina-glicina (poly-his-gly); el polipéptido etiqueta HA de la gripe y su anticuerpo 12CA5, Field et al., Mol. Cell. Biol., 8:2159-2165 (1988); la etiqueta c-myc tag y los anticuerpos 8F9, 3C7, 6E10, G4, B7 y 9E10 contra la misma, Evan et al., Molecular and Cellular Biology, 5:3610-3616 (1985); y la etiqueta de la glicoproteína D (gD) del virus Herpes Simplex y su anticuerpo, Paborsky et al., Protein Engineering, 3 (6):547-553 (1990). Otros polipéptidos etiqueta incluyen el Flag-peptide, Hopp et al., BioTechnology, 6:1204-1210 (1988); el péptido del epítopo de KT3, Martin et al., Science, 255:192-194 (1992); un péptido del epítopo de la \alpha-tubulina, Skinner et al., J. Biol. Chem., 266:15163-15166 (1991); y el péptido etiqueta 10 de la proteína 10 del gen de T7, Lutz-Freyermuth et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 87:6393-6397 (1990).

En una realización alternativa, la molécula quimérica podría comprender una fusión del polipéptido de la invención con una inmunoglobulina o una región particular de una inmunoglobulina. Para una forma bivalente de la molécula quimérica (también denominada como una "inmunoadhesina"), tal fusión podría ser con la región Fc de una molécula de IgG. Las fusiones de Ig preferiblemente incluyen la sustitución de una forma soluble (con el dominio transmembrana suprimido o desactivado) de una polipéptido de la invención en lugar de la menos una región variable dentro de una molécula de Ig. En una realización particularmente preferida, la fusión con inmunoglobulina incluye el gozne, y las regiones CH2 y CH3, o el gozne, y las regiones CH1, CH2 y CH3 de una molécula de IgG1. Para la producción de fusiones con inmunoglobulina consultar también la patente estadounidense nº 5,428,130 concedida el 27 de junio de 1995.

D. Preparación de los polipéptidos de la insulina o de la variante de la insulina

La siguiente descripción se refiere principalmente a la producción del polipéptido de la insulina o de la variante de la insulina mediante el cultivo de células transformadas o transfectadas con un vector que contiene el ácido nucleico de la insulina o de la variante de la insulina. También podrían emplearse procedimientos alternativos, los cuales son bien conocidos en el campo, para preparar tales polipéptidos. Por ejemplo, la secuencia, o porciones de la misma, podrían producirse mediante la síntesis directa del péptido usando técnicas de fase sólida (consultar, por ejemplo, Stewart et al., Solid-Phase Peptide Synthesis, W. H. Freeman Co., San Francisco, Calif. (1969); Merrifield, J. Am. Chem. Soc., 85:2149-2154 (1963)). La síntesis proteica in vitro podría realizarse usando técnicas manuales o mediante automatización. La síntesis automatizada podría conseguirse usando, por ejemplo, un Sintetizador de Péptidos de Applied Biosystems (Foster City, Calif.) usando las instrucciones del fabricante. La síntesis automatizada podría conseguirse usando, por ejemplo, un Sintetizador de Péptidos de Applied Biosystems (Foster City, Calif.) usando las instrucciones del fabricante. Varias porciones del polipéptido podrían sintetizarse por separado y combinarse usando procedimientos químicos o enzimáticos para producir los polipéptidos de longitud completa de la insulina o de la variante de la insulina.

1. Aislamiento del ADN que codifica el polipéptido de la invención

El ADN que codifica la insulina o la variante de la insulina podría obtenerse a partir de una biblioteca de ADNc preparada a partir de tejido que se cree expresa el ARNm de la insulina o variante de la insulina, y que lo expresa en un nivel detectable. En consecuencia, el ADN de la insulina humana o una variante de la insulina puede obtenerse convenientemente a partir de una biblioteca preparada a partir de tejido humano. El gen que codifica la insulina o variante de la insulina podría obtenerse también a partir de una biblioteca genómica o mediante la síntesis del oligonucleótido.

Las bibliotecas pueden examinarse con sondas (tales como anticuerpos contra el polipéptido de la invención u oligonucleótidos de al menos aproximadamente 20-80 bases) diseñadas para identificar el gen de interés o la proteína codificada por éste. El examen de la biblioteca de ADNc o genómica con la sonda seleccionada podría llevarse a cabo usando procedimientos estándares, tales como los descritos en Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, (New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989). Un medio alternativo para aislar el gen que codifica los polipéptidos de la insulina y/o de la variante de la insulina es usar la metodología de la PCR. Sambrook et al., ver más arriba; Dieffenbach et al., PCR Primer: A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1995).

Los ejemplos siguientes describen las técnicas para examinar una biblioteca de ADNc. Las secuencias de oligonucleótidos seleccionadas como sondas deberían tener la longitud suficiente, y ser lo suficientemente no ambiguas como para que los falsos positivos estén minimizados. El oligonucleótido está preferiblemente marcado, de tal forma que pueda detectarse a partir de su hibridación con el ADN de la biblioteca que se está examinando. Los procedimientos de marcado son bien conocidos en el campo, e incluyen el uso de marcas radiactivas como el ATP marcado con ^{32}P, la biotinilación o el marcado con enzimas. Las condiciones de hibridación, incluyendo las de rigurosidad moderada y elevada rigurosidad, se proporcionan en Sambrook et al., ver más arriba.

Las secuencias identificadas en tales procedimientos de examen de bibliotecas pueden compararse y alinearse con otras secuencias conocidas depositadas y disponibles en bases de datos públicas, tales como el GenBank, u otras bases de datos de secuencias privadas. La identidad de la secuencia (a nivel de aminoácidos o de nucleótidos) dentro de regiones definidas de la molécula o a través de la secuencia de longitud completa pueden determinarse a través del alineamiento de la secuencia usando programas de ordenador tales como el ALIGN, el DNAstar, y el INHERIT, los cuales emplean varios algoritmos para medir la homología.

El ácido nucleico que tiene la secuencia que codifica la proteína podría obtenerse examinando bibliotecas de ADNc o genómicas usando la secuencia de aminoácidos deducida descrita en la presente por primera ver, y, si es necesario, usando procedimientos convencionales de extensión del cebador según se describen en Sambrook et al., ver más arriba, para detectar precursores y procesar los intermediarios del ARNm que podrían no haberse transcrito a la inversa en el ADNc.

2. Selección y transformación de células huéspedes

Las células huéspedes se transfectan o transforman con los vectores de expresión o clonación descritos en la presente para la producción de insulina o de la variante de la insulina, y se cultivan en medio nutritivo convencional según sea apropiado para inducir los promotores, seleccionar los transformantes, o amplificar los genes que codifican las secuencias deseadas. Los principios generales, protocolos y técnicas prácticas para maximizar la productividad de los cultivos celulares pueden hallarse en Mammalian Cell Biotechnology: A Practical Approach, editor M. Butler, (IRL Press, 1991) y Sambrook et al., ver más arriba.

Los procedimientos de transfección incluyen la transfección con CaCl_{2}, CaPO_{4}, mediada por liposomas y la electroporación. Dependiendo de la célula huésped usada, la transformación se realiza usando técnicas estándares apropiadas para tales células. El tratamiento con calcio empleando cloruro cálcico, tales como se describe en Sambrook et al., ver más arriba, o la electroporación, generalmente se usan para los procariotas u otras células que contienen barreras sustanciales de pared celular. La infección con Agrobacterium tumefaciens se usa para la transformación de ciertas células vegetales, tal como describen Shaw et al., Gene, 23:315 (1983) y WO 89/05859 publicada el 29 de junio de 1989. Para las células de mamífero son tales paredes celulares, puede emplearse el procedimiento de precipitación con fosfato cálcico de Graham and van der Eb, Virology, 52:456-457 (1978). Los aspectos generales de las transformaciones de sistemas huéspedes de células de mamífero se han descrito en la patente estadounidense nº 4,399,216. Las transformaciones en levaduras típicamente se llevan a cabo de acuerdo con el procedimiento de Van Solingen et al., J. Bact., 130: 946 (1977) y Hsiao et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 76:3829 (1979). Sin embargo, también podrían usarse otros procedimientos para introducir el ADN en las células, tales como mediante la microinyección nuclear, la electroporación, la fusión de protoplastos bacterianos con células intactas, los policationes, por ejemplo, el polibreno, la poliornitina, o el uso de vectores víricos recombinantes. Para información sobre varias técnicas para transformar células de mamífero, consultar Keown et al., Methods in Enzymology, 185:527-537 (1990) y Mansour et al., Nature, 336:348-352 (1988).

Las células huéspedes apropiadas para clonar o expresar el ADN en los vectores de la presente incluyen las células de procariota, de levadura o de eucariota superior. Los procariotas apropiados incluyen pero no se limitan a las eubacterias, tales como los organismos Gram-negativos o Gram-positivos, por ejemplo, las enterobacterias tales como E. coli. Hay varias cepas de E. coli disponibles públicamente, tales como la E. coli K12 de la cepa MM294 (ATCC 31,446); la E. coli X1776 (ATCC 31,537); la E. coli de las cepas W3110 (ATCC 27,325) y K5 772 (ATCC 53,635). Otras células huésped procariotas apropiadas incluyen enterobacterias tales como Escherichia, por ejemplo, la E. coli K12 de la cepa MM294 (ATCC 31,446); la E. coli X1776 (ATCC 31,537); la E. coli de las cepas W3110 (ATCC 27,325) y K5 772 (ATCC 53,635), Enterobacter, Erwinia, Klebsiella, Proteus, Salmonella, por ejemplo, Salmonella typhimurium, Serratia, por ejemplo, Serratia marcescans, y Shigella, así como Bacilli tales como B. subtilis y B. licheniformis (por ejemplo, B. licheniformis 41P descubierta en DD266,710 publicada el 12 de abril de 1989), pseudomonas tales como P. aeruginosa, y Streptomyces. Estos ejemplos son ilustrativos en vez de limitantes. La cepa W3110 es un huésped o progenitor de huésped particularmente preferido, porque es una cepa huésped común para las fermentaciones de productos de ADN recombinante. Preferiblemente, la célula huésped secreta cantidades mínimas de enzimas proteolíticos. Por ejemplo, la cepa W3110 podría modificarse fácilmente para desactivar sus genes endógenos para favorecer de la expresión de la secuencia heteróloga. Por ejemplo, la E. coli W3110 de la cepa 1 A2, la cual tiene el genotipo completo tonA; la E. coli W3110 de la cepa 9E4, la cual tiene el genotipo completo tonA ptr3; la E. coli W3110 de la cepa 27C7 (ATCC W3110 de la cepa 37D6) la cual tiene el genotipo completo tonA ptr3 phoA E15 (argF-lac)169 degP ompT rbs7 ilvG kan; la E. coli W3110 de la cepa 40B4, la cual es la cepa 37D6 con una mutación de supresión degP no resistente a la kanamicina; y una cepa de E. coli que tiene una proteasa periplásmica mutante, descubierta en la patente estadounidense nº 4,946,83 concedida el 8 de agosto de 1990.

Ademas de los procariotas, los microbios eucariotas, tales como los hongos filamentosos o las levaduras, son huéspedes de clonación o expresión apropiados para los vectores que codifican la insulina o la variante de la insulina. Saccharomyces cerevisiae es un microorganismo huésped eucariota inferior comúnmente usado. Otros incluyen Schizosaccharomyces pombe (Beach and Nurse, Nature, 290: 140 (1981); EP 139.383 publicada el 2 de mayo de 1985); los huéspedes Kluveromyces (patente estadounidense nº 4,943,529; Fleer et al., Bio/Technology, 9:968-975 (1991)) tales como, por ejemplo, K. lactis (MW98-8C, CBS683, CBS4574; Louvencourt et al., J. Bacteriol., 154(2):737 (1983); K. fragilis (ATCC 12,424), K. bulgaricus (ATCC 16,045), K. wicheramii (ATCC 24,178), K. waltii (ATCC 56,500), K. drosophilarum (ATCC 36,906); Van den Berg et al., Bio/Technology, 8:135 (1990)), K. thermotolerans, y K. marxianus; yarrowia (EP 402,226); Pichia pastoris (EP 183,070); Sreekrishna et al., J. Basic Microbiol., 28:265-278 (1988); Candida; Trichoderma reesia (EP 244,234); Neurospora crassa (Case et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76:5259-5263 (1979); schwaniomicetos tales como Schwanniomyces occidentalis (EP 394.538 publicada el 31 de octubre de 1990); y los hongos filamentosos tales como, por ejemplo, Neurospora, Penicillium, Tolypocladium (WO 91/00357 publicada el 10 de enero de 1991), y huéspedes Aspergillus tales como A. nidulans (Ballance et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 112:284-289 (1983); Tilburn al., Gene, 26:205-221 (1983); Yelton et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:1470-1474 (1984)) y A. niger (Kelly y Hynes, EMBO J., 4:475-479 (1985)). Las levaduras metilotróficas son apropiadas aquí, e incluyen, pero no se limitan a, Hansenula, Cadida, Kloeckera, Pichia, Saccharomyces, Torulopsis, y Rhodotorula. Una lista de especies específicas que son ilustrativas de esta clase de levaduras podría hallarse en C. Anthony, The Biochemistry of Methylotrophs, 269 (1982).

Las células huésped apropiadas para la expresión de polipéptidos glicosilados de la insulina o de la variante de la insulina pueden derivarse de organismos multicelulares. Los ejemplos de células de invertebrados incluyen células tales como la S2 de Drosophila y la Sf9 de Spodoptera y la "high five", así como las células de plantas. Los ejemplos de líneas celulares huéspedes de mamífero útiles incluyen la células ováricas de hámster chino (CHO) y las COS. Los ejemplos más específicos incluyen la línea CV1 renal de mono transformada por SV40 (COS-7, ATCC CRL 1651); la línea renal embrionaria humana (células 293 ó 293 subclonadas para su crecimiento en cultivo en suspensión, Graham et al., J. Gen Virol., 36:59 (1977)); las células ováricas de hámster chino/-DHFR (CHO, Urlaub y Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4216 (1980)); las células de Sertoli del ratón (TM4, Mather, Biol. Reprod., 23:243-251 (1980)); las células pulmonares humanas (W138, ATCC CCL 75); las células hepáticas humanas (Hep G2, HB 8065); y del tumor mamario del ratón (MMT 060562, ATCC CCL51). Las selección de la célula huésped apropiada se considera que se halla dentro del conocimiento del campo.

3. Selección y uso de un vector replicable

El ácido nucleico (por ejemplo, ADNc o ADN genómico) que codifica la insulina o las variantes de la insulina podría insertarse dentro de un vector replicable para su clonación (amplificación del ADN) o para su expresión. Hay varios vectores disponibles públicamente. El vector podría estar, por ejemplo, en forma de un plásmido, cósmido, partícula vírica, fagómido o fago. La secuencia de ácido nucleico apropiada podría insertarse en el vector mediante una variedad de procedimientos. En general, el ADN se inserta en el sitio o sitios de endonucleasas de restricción apropiados usando técnicas conocidas en el campo. Los componentes del vector generalmente incluyen, pero no están limitados a, una o más de una secuencia señal, un origen de replicación, uno o más genes marcadores, un elemento potenciador, un promotor, y una secuencia de terminación de la transcripción. La construcción de vectores apropiados que contienen uno o más de estos componentes emplea técnicas de ligación estándares, las cuales son conocidas por el especialista capacitado.

El polipéptido de la insulina o de la variante de la insulina podría producirse de forma recombinante, no sólo directamente, sino también como un polipéptido de fusión con un polipéptido heterólogo, el cual podría se r una secuencia de señal u otro polipéptido que tenga un sitio de corte específico en el extremo N-terminal de la proteína o polipéptido maduro. En general, la secuencia de señal podría ser un componente del vector, o podría ser una parte del ADN que codifica la insulina o la variante de la insulina que está insertado en el vector. La secuencia de señal podría ser una secuencia de señal procariota seleccionada, por ejemplo, del grupo formado por los líderes de la fosfatasa alcalina, la penicilinasa, 1 pp, o la enterotoxina II estable al calor. Para la secreción en levaduras, la secuencia de señal podría ser, por ejemplo, el líder de la invertasa de la levadura, el líder del factor alfa (incluyendo los líderes de los factores-\alpha de Saccharomyces y Kluyveromyces, éste último descrito en la patente estadounidense nº 5,010,182), o el líder de la fosfatasa ácida, el líder de la glucoamilasa de C. albicans (EP 362,179 publicada el 4 de abril de 1990), o la señal descrita en WO 90/13646, publicada el 15 de noviembre de 1990 En la expresión en células de mamífero, podrían usarse secuencias señal de mamífero para dirigir la secreción de la proteína, tales como las secuencias señal de polipéptidos secretados de la misma especie o de una especie relacionada, así como los líderes secretores víricos.

Ambos vectores, el de expresión y el de clonación, contienen una secuencia de ácido nucleico que permite al vector replicarse en una o más células huéspedes seleccionadas. Tales secuencias son bien conocidas para una variedad de bacterias, levaduras y virus. El origen de replicación del plásmido pBR322 es apropiado para la mayoría de las bacterias Gram-negativas, el origen del plásmido 2\mu es apropiado para levaduras, y varios orígenes víricos (SV40, polioma, adenovirus, VSV o BPV) son útiles para vectores de clonación en células de mamíferos.

Los vectores de expresión y clonación típicamente contendrán un gen de selección, también denominado marcador seleccionable. Los genes de selección típicos codifican proteínas que (a) confieren resistencia a los antibióticos u otras toxinas, por ejemplo, ampicilina, neomicina, metotrexato o tetraciclina, (b) complementan deficiencias auxotróficas, o (c) aportan nutrientes críticos no disponibles en el medio, por ejemplo, el gen que codifica la racemasa de D-alanina para Bacilli.

Un ejemplo de marcadores seleccionables apropiados para las células de mamífero son aquéllos que permiten la identificación de las células competentes para captar el ácido nucleico que codifica el polipéptido de la invención, tales como la DHFR o la quinasa de timidina. Una célula huésped apropiada cuando se emplea la DHFR del tipo salvaje es la línea CHO deficiente en actividad DHFR, preparada y propagada tal como describen Urlaub et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4216 (1980). Un gen de selección apropiado para su uso en levaduras es el gen trp1 presente en el plásmido YRp7 de levadura. Stinchcomb et al., Nature, 282:39 (1979); Kingsman et al., Gene, 7:141 (1979); Tschemper et al., Gene, 10:157 (1980). El gen trp1 proporciona un marcador seleccionable para una cepa mutante de levadura que carezca de la capacidad de crecer en triptófano, ATCC No. 44076 o PEP4-1. Jones, Genetics, 85:12 (1977).

Los vectores de clonación y expresión usualmente contienen un promotor unido operativamente a la secuencia de ácido nucleico que codifica la insulina para dirigir la síntesis de ARNm. Los promotores reconocidos por una variedad de células huéspedes potenciales son bien conocidos. Los promotores apropiados para uso con huéspedes procariotas incluyen los sistemas promotores de la \beta-lactamasa y de la lactosa; Chang et al., Nature, 275:615 (1978); Goeddel et al., Nature, 281:544 (1979); de la fosfatasa alcalina, un sistema promotor del triptófano (trp), Goeddel, Nucleic Acids Res., 8:4057 (1980); EP 36.776; y los promotores híbridos tal como el promotor tac, deBoer et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80:21-25 (1983). Los promotores para uso en sistemas bacterianos también contendrán una secuencia Shine-Dalgarno (S.D.) unida operativamente al ADN que codifica el polipéptido de la insulina o de la variante de la insulina.

Los ejemplos se secuencias promotoras apropiadas para uso con huéspedes de levadura incluyen los promotores para la quinasa del 3-fosfoglicerato, Hitzeman et al., J. Biol. Chem., 255:2073 (1980) u otros enzimas glicolíticos, Hess et al., J. Adv. Enzyme Reg., 7:149 (1968); Holland, Biochemistry, 17:4900 (1978), tales como la enolasa, la gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa, la hexoquinasa, la piruvato descarboxilasa, la fosfofructoquinasa, la isomerasa de la glucosa-6-fosfato, la mutasa del 3-fosfoglicerato, la piruvato quinasa, la triosafosfato isomerasa, la fosfoglucosa isomerasa y la glucoquinasa.

Otros promotores de levadura, los cuales son promotores inducibles que tienen las ventajas adicionales de la transcripción controlada por las condiciones de cultivo, son las regiones promotoras de la alcohol deshidrogenasa 2, el isocitocromo C, la fosfatasa ácida, los enzimas de degradación asociados con el metabolismo del nitrógeno, la metalotioneína, la gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa, y los enzimas responsables de la utilización de la maltosa y galactosa. Los vectores y promotores apropiados para uso en la expresión en levadura se describen adicionalmente en EP 73,657.

La expresión a partir de vectores en las células huéspedes de mamífero se controla, por ejemplo, mediante promotores obtenidos de genomas de virus tales como el virus del polioma, el virus de la viruela aviar (UK 2,211,504 publicada el 5 de julio de 1989), el adenovirus (tal como el Adenovirus 2), el virus del papiloma bovino, el virus del sarcoma de las aves, el citomegalovirus, un retrovirus, el virus de la hepatitis B y el virus 40 del mono (SV40), a partir de promotores heterólogos de mamífero, por ejemplo, el promotor de la actina o un promotor de inmunoglobulina, y a partir de promotores de choque térmico, a condición de que tales promotores sean compatibles con los sistemas de la célula huésped.

La transcripción de un ADN que codifica los polipéptidos que pueden emplearse con la invención por eucariotas superiores podrían incrementarse insertando una secuencia potenciadora en el vector. Los potenciadores son elementos del ADN que actúan en cis, de forma habitual aproximadamente de 10 a 300 p.b., que actúan sobre un promotor para incrementar su transcripción. Se conocen muchas secuencias potenciadores procedentes de genes de mamíferos (de globina, elastasa, albúmina, \alpha-fetoproteína, e insulina). Sin embargo, típicamente se usarán un potenciador procedente de un virus de célula eucariota. Los ejemplos incluyen el potenciador del SV40 en el lado tardío del origen de replicación (p.b. 100-270), el potenciador del promotor temprano del citomegalovirus, el potenciador del polioma en el lado tardío del origen de replicación, y los potenciadores de los adenovirus. El potenciador podría empalmarse dentro del vector en una posición 5' o 3' respecto la secuencia codificante de la insulina o de la variante de la insulina, pero preferiblemente se ubica en un sitio 5' respecto el promotor.

Los vectores de expresión usados el las células huésped eucariotas (levadura, hongos, insectos, plantas, animales, humanas, o células nucleadas procedentes de otros organismos multicelulares) también contendrán secuencias necesarias para la terminación de la transcripción y para estabilizar el ARNm. Tales secuencias están disponibles comúnmente de las regiones 5' y ocasionalmente 3', no traducidas, de los ADN o ADNc víricos eucariotas. Estas regiones contienen segmentos de nucleótidos que se transcriben como fragmentos poliadenilados en la porción no traducida del ARNm que codifica los polipéptidos de la invención.

Aún otros procedimientos, vectores y células huéspedes apropiadas para la adaptación de la síntesis de los polipéptidos de la invención, en el cultivo de célula vertebrada recombinante, se describen en Gething et al., Nature, 293:620-625 (1981); Mantei et al., Nature, 281:40-46 (1979); EP 117,060; y EP 117,058.

4. Detectando la amplificación/expresión del gen

La amplificación o la expresión del gen podría medirse directamente en una muestra mediante transferencia Southern o transferencia Northern convencional, o mediante RT-PCR (Taqman) para cuantificar la transcripción del ARNm, Thomas, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:5201-5205 (1980), la transferencia en punto (análisis del ADN o ARNr), o la hibridación in situ, usando una sonda marcada apropiada, basada en las secuencias proporcionadas en la presente.

Las expresión del gen, alternativamente, podría medirse mediante procedimientos inmunológicos, tales como la tinción inmunohistoquímica de las células o de las secciones de tejido, y el ensayo del cultivo de células o de los fluidos corporales, para cuantificar directamente la expresión del producto del gen. Los anticuerpos útiles para la tinción inmunohistoquímica y/o el ensayo de muestras fluidas podrían se tanto monoclonales como policlonales, y podrían prepararse en cualquier mamífero. De forma conveniente, los anticuerpos podrían prepararse contra un polipéptido de la insulina de secuencia nativa o de la variante de la insulina, o contra un péptido sintético basado en las secuencias de ADN proporcionadas en la presente, o contra una secuencia exógena fusionada al ADN de la insulina o de la variante de la insulina que codifica el polipéptido de la invención y que codifica un epítopo de anticuerpo específico.

5. Purificación de los polipéptidos

Las formas de los polipéptidos que pueden emplearse con la presente invención podrían recuperarse del medio de cultivo o de los lisados de las células huésped. Por ejemplo, si están unidos a la membrana, pueden liberarse de la membrana usando una solución detergente apropiada (por ejemplo Triton^{TM}-X 100) o mediante corte enzimático. Las células empleadas en la expresión del polipéptido que pueden emplearse con la invención pueden romperse mediante varios medios físicos o químicos, tales como un ciclo de congelación-descongelación, la sonicación, la rotura mecánica, o los agentes de lisado de células.

Podría ser deseable purificar la insulina o variante de la insulina. Los procedimientos siguientes son ilustrativos de los procedimientos de purificación apropiados: mediante fraccionamiento en una columna de intercambio iónico; la precipitación con etanol; la HPLC de fase inversa; la cromatografía en columnas de sílice o de una resina de intercambio catiónico tal como la DEAE; el cromatoenfoque; la SDS-PAGE; la precipitación con sulfato amónico; la filtración en gel usando, por ejemplo, Sephadex G-75; las columnas de proteína A-Sepharose para retirar contaminantes tales como la IgG; y columnas quelantes de metales para unir las formas etiquetadas con epítopo del polipéptido de la invención. Podrían emplearse varios procedimientos de purificación de proteínas, y tales procedimientos son conocidos en la técnica y se describen, por ejemplo, en Deutscher, Methods in Enzymology, 182 (1990); Scopes, Protein Purification: Principles and Practice, Springer-Verlag, New York (1982). El paso o pasos de purificación seleccionados dependerán, por ejemplo, de la naturaleza del proceso de producción usado y de la insulina o variante de la insulina concreta producida.

6. Distribución del tejido

La ubicación de los tejidos que expresan los polipéptidos que pueden emplearse con la invención puede identificarse determinando la expresión del ARNm en varios tejidos humanos. Tales datos podrían ayudar a determinar qué tejidos es más probable que se vean afectados por las actividades estimuladoras e inhibidoras de los polipéptidos de la invención. Los tejidos que expresan y responden a la insulina podrían, en teoría, usarse en los ensayos de bloqueo de la actividad descritos más adelante.

Tal como se ha mencionado previamente, la expresión del gen en varios tejidos podría mediarse mediante transferencia Northern convencional, o mediante RT-PCR (Taqman), Thomas, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:5201-5205 [1980], la transferencia en punto, o la hibridación in situ, usando una sonda marcada apropiadamente, basada en las secuencias proporcionadas en la presente. Alternativamente, la expresión del gen puede medirse mediante procedimientos inmunológicos, tales como la tinción inmunohistoquímica de las secciones de tejido, y el ensayo del cultivo de células o de los fluidos corporales, tal como se describió más arriba en 4. Detectando la amplificación/expresión del gen.

E. Composiciones farmacéuticas y dosificación

Los polipéptidos de la insulina y variante de la insulina que pueden emplearse con los procedimientos de la invención pueden administrarse para el tratamiento de los trastornos del cartílago en forma de composiciones farmacéuticas. Adicionalmente, las lipofecciones o liposomas también pueden usarse para suministrar la insulina o la variante de la insulina dentro de las células y en el área diana.

Las formulaciones terapéuticas de las moléculas activas que pueden emplearse con la invención se preparan para su almacenamiento mezclando la molécula activa, que tiene el grado de pureza deseado, con portadores, excipientes o estabilizantes farmacéuticamente aceptables (Remington's Pharmaceutical Sciences, 16ª edición, Osol, A. Ed. [1980]). Tales formulaciones terapéuticas pueden estar en forma de formulaciones liofilizadas o soluciones acuosas Los portadores, excipientes o estabilizantes no son tóxicos para los receptores en las dosis y concentraciones empleadas, e incluyen tampones tales como el fosfato, citrato y otros ácidos orgánicos; antioxidantes, incluyendo el ácido ascórbico y la metionina; conversantes (tales como el cloruro de octadecil-dimetil-bencilamonio; el cloruro de hexametonio; el cloruro de benzalcono, el cloruro de bencetonio; el fenol, el alcohol butílico o bencílico; los alquilparabenos tales como el metil o propilparaben; el catecol; el resorcinol; el ciclohexanol; el 3-pentanol; y el m-cresol); polipéptidos de bajo peso molecular (menos de aproximadamente 10 residuos); proteínas, tales como la albúmina del suero, la gelatina, o las inmunoglobulinas; polímeros hidrofílicos tales como la polivinilpirrolidona; aminoácidos tales como la glicina, la glutamina, la asparagina, la arginina o la lisina; monosacáridos, disacáridos, y otros carbohidratos, incluyendo la glucosa, la manosa, o las dextrinas, o el hialourano; agentes quelantes tales como el EDTA; azúcares tales como la sacarosa, el manitol, la trehalosa o el sorbitol; contraiones formadores de sales, tales como el sodio; complejos de metales (por ejemplo, complejos Zn-proteína); y/o tensioactivos no iónicos tales como el TWEEN®, el PLURONICS® o el polietilenglicol (PEG).

Con objeto de que las formulaciones puedan usarse para la administración in vivo, deben ser estériles. La formulación podría hacerse estéril fácilmente mediante la filtración a través de membranas de filtración estéril, antes de o a continuación de su liofilización y reconstitución. Las composiciones farmacéuticas en la presente generalmente se colocan en un contenedor que tiene un puerto de acceso estéril, por ejemplo, una bolsa de solución intravenosa o un vial que tiene un tapón perforable mediante una aguja de inyección hipodérmica.

Las formulaciones usadas en la presente también podrían contener más de un compuesto activo según sea necesario para la indicación concreta que se está tratando, preferiblemente aquéllas que complementan actividades que no se afectan desfavorablemente entre ellas. Alternativamente, o además, la composición podría comprender un agente citotóxico, citocina o agente inhibidor del crecimiento. Tales moléculas están presentes en combinaciones y cantidades que son efectivas para el propósito pretendido.

La ruta de administración está de acuerdo con los procedimientos conocidos, por ejemplo, inyección o infusión mediante rutas intravenosa, intraperitoneal, intramuscular, intraarterial, intralesional o intraarticular, administración tópica, mediante medios de liberación continua o de liberación ampliada. Opcionalmente, el compuesto activo o formulación se inyecta directamente en la región cartilaginosa o articulación afectada.

Las moléculas de insulina o de la variante de la insulina podrían prepararse también atrapándolas en microcápsulas preparadas, por ejemplo, mediante técnicas de coacervación o mediante polimerización interfacial, por ejemplo, respectivamente microcápsulas de nitrocelulosa o gelatina y microcápsulas de poly-(metilmetacrilato). Tales preparaciones pueden administrarse en sistemas de suministro de drogas coloidales (por ejemplo, liposomas, microesferas de albúmina, microemulsiones, nanopartículas y nanocápsulas) o microemulsiones. Tales técnicas se describen en Remington's Pharmaceutical Sciences, 16ª edición (o más reciente), Osol A. Ed. (1980).

Cuando se desea la liberación continuada o ampliada de polipéptidos de la insulina o de la variante de la insulina en una formulación con características de liberación apropiadas para el tratamiento de cualquier enfermedad o trastorno que requiera la administración de tales polipéptidos, se contempla la microencapsulación. La microencapsulación de proteínas recombinantes para su liberación continuada se ha realizado exitosamente con la hormona del crecimiento humana (rhGH), el interferón-\alpha, -\beta-\gamma (rhIFN-\alpha,-\beta,-\gamma), la interleucina-2, y la MN rgp120. Johnson et al., Nat. Med., 2: 795-799 (1996); Yasuda, Biomed. Ther., 27: 1221-1223 (1993); Hora et al., Bio/Technology, 8: 755-758 (1990); Cleland, "Design and Production of Single Immunization Vaccines Using Polylactide Polyglycolide Microsphere Systems" en Vaccine Design: The Subunit and Adjuvant Approach, editores Powell y Newman, (Plenum Press: New York, 1995), pp. 439-462; WO 97/03692, WO 96/40072, WO 96/07399 y en la patente estadounidense
nº 5,654,010.

Los ejemplos apropiados de preparaciones de liberación continuada incluyen las matrices semipermeables de polímeros hidrofóbicos sólidos que contienen la molécula activa, matrices que están en forma de artículos moldeados, por ejemplo, películas o microcápsulas. Los ejemplos de matrices de liberación continuada incluyen uno o más polianhídridos (por ejemplo, en la patente estadounidense nº 4,891,225; 4,767,628), poliésteres tales como los poliglicólidos, poliláctidos y poliláctidos-co-glicólidos (por ejemplo, en la patente estadounidense nº 3,773,919; la patente estadounidense nº 4,767,628; la patente estadounidense nº 4,530,840; Kulkarni et al., Arch. Surg., 93: 839 (1966)), ácidos poliamino tales como la polilisina, polímeros y copolímeros de óxido de polietileno, acrilatos de óxido de polietileno, poliacrilatos, etilenvinil acetatos, poliamidas, poliuretanos, poliortoésteres, poliacetilnitrilos, polifosfazenos, y hidrogeles de poliéster (por ejemplo, el poli(2-hidroxietil-metacrilato), o poli(vinilalcohol)), celulosa, acetatos de celulosa sustituidos con acilo, poliuretanos no degradables, poliestirenos, polivinilcloruro, polivinilfluoruro, poli(vinilimidazol), poliolefinas clorosulfonadas, óxido de polipetileno, copolímero de ácido L-glutámico y \gamma-etil-L-glutamato, etilenvinilacetato no degradable, copolímeros degradables de ácido láctico-ácido glicólico tales como el LUPRON DEPOT® (microesferas inyectables compuestas de copolímero de ácido láctico-ácido glicólico y acetato de leuprólido), y ácido poli-D-(-)-3-hidroxibutírico. Mientras que los polímeros tales como el etilenvinilacetato y el ácido láctico-ácido glicólico permiten la liberación de moléculas durante más de 100 días, ciertos hidrogeles liberan proteínas durante períodos de tiempo más cortos. Los polímeros no biodegradables adicionales que podrían emplearse son el polietileno, la polivinilpirrolidona, el etilenvinilacetato, el polietilenglicol, el acetato butirato de celulosa y el propionato acetato de celulosa.

Alternativamente, las formulaciones de liberación continuada podrían estar compuestas de material biológico degradable. Los polímeros biodegradables son formulaciones de fármacos atractivas a causa de su biocompatibilidad, y alta respuesta para la degradación específica, y la facilidad para incorporar el fármaco activo en la matriz biológica. Por ejemplo, el ácido hialurónico (HA) podría entrecruzarse y usarse como un vehículo de suministro polimérico hinchable. Patente estadounidense nº 4,957,744; Valle et al., Polym. Mater. Sci. Eng., 62:731-735 (1991). También se ha preparado el polímero de HA injertado con polietilenglicol como una matriz de suministro mejorada, la cual reduce tanto el efecto no deseado de las pérdida de fármaco como la desnaturalización asociada con el almacenamiento a largo plazo en condiciones fisiológicas. Kazuteru, M., J. Controlled Release, 59:77-86 (1999). Los polímeros biodegradables adicionales que podrían usarse son la poli(caprolactona), los polianhídridos, los ácidos poliamino, los poliortoésteres, los policianoacrilatos, los poli(fosfazinas), los poli(fosfodiésteres), las poliesteramidas, las polidioxanonas, los poliacetales, los poliquetales, los policarbonatos, los poliortocarbonatos, los poliuretanos degradables y no tóxicos, los polihidroxilbutiratos, los polihidroxivaleratos, los polialquilen-oxalatos, los polialquilen-succinatos, el poli(ácido málico), la quitina y el quitosano.

Alternativamente, podrían usarse hidrogeles biodegradables como vehículos de suministro de liberación controlada para materiales biológicos y drogas. A través de la elección apropiada de los macrómeros, pueden producirse membranas con un rango de permeabilidad, tamaños de poro, y velocidades de degradación apropiados para una amplia variedad de biomoléculas.

Alternativamente, los sistemas de liberación continuada para materiales biológicos y fármacos pueden componerse de dispersiones. Las dispersiones podrían clasificarse adicionalmente como suspensiones o emulsiones. En el contexto de los vehículos de suministro para materiales biológicos, las suspensiones son una mezcla de partículas sólidas muy pequeñas, las cuales se dispersan (más o menos uniformemente) en un medio líquido. Las partículas sólidas de una suspensión pueden oscilar en tamaño desde unos pocos nanómetros hasta cientos de micras, e incluyen las microesferas, microcápsulas y nanoesferas. Las emulsiones, por otra parte, son una mezcla de dos o o más líquidos inmiscibles mantenida en suspensión por pequeñas cantidades de emulgente. Los emulgentes forman una capa interfacial entre los líquidos inmiscibles y se conocen también como tensioactivos o detergentes. Las formulaciones de la emulsión pueden ser de aceite en agua (o/w), en donde el agua está en una fase continua mientras que el aceite o grasa está dispersado, así como de agua en aceite (w/o), en donde el aceite está en una fase continua mientras que el agua está dispersada. Un ejemplo de formulación de liberación continuada apropiado se describe en WO 97/25563. Adicionalmente, las emulsiones para uso con materiales biológicos incluyen las emulsiones múltiples, las microemulsiones, las microgotas y los liposomas. Las microgotas son vesículas de fosfolípidos unilamelares que consisten en una capa lipídica esférica con una fase de aceite en su interior. Por ejemplo, en la patente estadounidense nº 4,622,219 y en la patente estadounidense nº 4,725,442. Los liposomas son vesículas de fosfolípidos preparadas mezclando lípidos polares insolubles en agua con una solución acuosa.

Alternativamente, las formulaciones de liberación continuada de los polipéptidos de la insulina o de la variante de la insulina podrían desarrollarse usando ácido poliláctico-coglicólico (PLGA), un polímero que exhibe un elevado grado de biocompatibilidad con un amplio conjunto de propiedades biodegradables. Los productos de degradación del PLGA, los ácidos láctico y glicólico, se eliminan rápidamente del cuerpo humano. Además, la degradabilidad de este polímero puede ajustarse desde meses hasta años dependiendo de su peso molecular y composición. Para más información consultar Lewis, "Controlled Release of Bioactive Agents from Lactide/Glycolide polymer", en Biogradable Polymers as Drug Delivery Systems, editores M. Chasin y R. Langeer, (Marcel Dekker: Nueva York, 1990), pp. 1-41.

Cuando los polipéptidos encapsulados permanecen en el cuerpo durante un largo período, podrían desnaturalizarse o agregarse a resultas de la exposición a humedad a 37ºC, resultando en una pérdida de actividad biológica y en posibles cambios de su inmunogenicidad. Pueden idearse estrategias racionales para la estabilización dependiendo del mecanismo implicado. Por ejemplo, si se descubre que el mecanismo de agregación es la formación de enlaces S-S intermoleculares a través del intercambio tio-disulfuro, la estabilización podría conseguirse modificando los residuos sulfhidrilo, liofilizando a partir de soluciones ácidas, controlando el contenido en humedad, usando aditivos apropiados, y desarrollando composiciones de matriz polimérica específica.

Los polipéptidos encapsulados o los polipéptidos en formulación de liberación ampliada podrían transmitirse formulando el polipéptido con "sales de metal polivalentes solubles en agua", las cuales no son tóxicas en la concentración y temperatura de liberación. Los ejemplos de "metales polivalentes" incluyen los siguientes cationes: Ca^{2+}, Mg^{2+}, Zn^{2+}, Fe^{2+}, Fe^{3+}, Cu^{2+}, Sn^{2+}, Sn^{4+}, Al^{2+} y Al^{3+}. Los aniones ilustrativos que forman sales solubles en agua con los anteriores cationes metálicos polivalentes incluyen aquéllos formados por ácidos inorgánicos y/o ácidos orgánicos. Tales sales solubles en agua tienen una solubilidad en agua (a 20ºC) de al menos 20 mg/ml, alternativamente de 100 mg/ml, alternativamente de 200 mg/ml.

Los ácidos inorgánicos apropiados que pueden usarse para formar las "sales de metal polivalentes solubles en agua" incluyen el ácido clorhídrico, sulfúrico, nítrico, tiociánico y fosfórico. Los ácidos orgánicos apropiados que pueden usarse incluyen el ácido carboxílico y los ácidos aromáticos. Los ácidos alifáticos incluidos en esta definición podrían definirse como ácidos carboxílicos C_{2-9} saturados o insaturados (por ejemplo, ácidos mono-, di- y tri-carboxílicos alifáticos). Por ejemplo, los ácidos monocarboxílicos ilustrativos en esta definición incluyen los ácidos monocarboxílicos C_{2-9} saturados acético, propiónico, butírico, valérico, caproico, enántico, caprílico pelargónico y capriónico, y los ácidos monocarboxílicos C_{2-9} insaturados acrílico, propiólico metacrílico, crotónico e isocrotónico. Los ácidos dicarboxílicos ilustrativos incluyen los ácidos dicarboxílicos C_{2-9} saturados malónico, succínico, glutárico, adípico y pimélico, mientras que los ácidos dicarboxílicos C_{2-9} insaturados incluyen los ácidos maleico, fumárico, citracónico y mesacónico. Los ácidos tricarboxílicos ilustrativos incluyen los ácidos tricarboxílicos C_{2-9} saturados tricarbalílico y el ácido 1,2,3-butanetricarboxílico. Adicionalmente, los ácidos carboxílicos de esta definición también contienen uno o dos grupos hidroxilo para formas ácidos hidroxicarboxílicos. Los ácidos hidroxicarboxílicos ilustrativos incluyen el ácido glicólico, láctico, glicérico, tartrónico, málico, tartárico y cítrico. Los ácidos aromáticos dentro de esta definición incluyen el ácido benzoico y salicílico.

Las sales de metal polivalente solubles en agua comúnmente empleadas que podrían emplearse para ayudar a estabilizar los polipéptidos encapsulados de esta invención incluyen, por ejemplo: (1) las sales de metal con ácido inorgánico, de haluros (por ejemplo, cloruro de zinc, cloruro de calcio), sulfatos, nitratos, fosfatos y tiocianatos; (2) las sales de metal con ácido carboxílico alifático, el acetato de calcio, el acetato de zinc, el propionato de calcio, el glicolato de zinc, el lactacto de calcio, el lactato de zinc y el tartrato de zinc; y (3) las sales de metal con ácido carboxílico aromático, de benzoatos (por ejemplo, el benzoato de zinc) y salicilatos.

Las dosificaciones y concentraciones de fármaco deseadas de las composiciones farmacéuticas que pueden emplearse con la presente invención podrían variar dependiendo del uso concreto previsto. La determinación de la dosificación o ruta de administración apropiadas se halla claramente dentro de los conocimientos de un médico ordinario. Los experimentos con animales proporcionan una guía fiable para la determinación de las dosis efectivas para la terapia humana. El escalado interespecie de las dosis efectivas puede realizarse siguiendo los principios establecidos por Mordenti, J. y Chappell, W. "The use of interspecies scaling in toxicokinetics" en Toxicokinetics and New Drug Development, editores Yacobi et al., Pergamon Press, New York 1989, pp. 42-96.

Cuando se emplea la administración in vivo de polipéptidos de la insulina o de la variante de la insulina, las cantidades de dosificación normal podrían variar desde aproximadamente 10 ng/kg hasta aproximadamente 100 mg/kg de peso corporal del mamífero, o más por día, preferiblemente aproximadamente desde 1 \mug/kg/día hasta 10 mg/kg/día, dependiendo de la ruta de administración. La guía sobre dosificaciones y procedimientos de suministro concretos se proporciona en la literatura, consulta, por ejemplo, en la patente estadounidense nº 4,657,760; 5,206,344 o 5,225,212. Se anticipa que formulaciones diferentes serán efectivas para tratamientos diferentes y trastornos diferentes, y que la administración que se pretende trate un órgano o tejido específico podría necesitar ser suministrada de manera distinta a la de otro órgano o tejido.

F. Procedimientos de tratamiento

Se contempla que los polipéptidos, anticuerpos y otros compuestos activos de la presente invención podrían usarse para tratar varios trastornos del cartílago. Las condiciones o trastornos ilustrativos a ser tratados con los polipéptidos de la invención incluyen, pero no se limitan al lupus eritematoso, la artritis reumatoide, la artritis crónica juvenil, la osteoartritis, las espóndiloartropatías, la esclerosis sistémica (esclerodermia), las miopatías inflamatoria idiopaticas (dermatomiositis, polimiositis), el síndrome de Sjogren, la vasculitis sistémica, la sarcoidosis, la anemia autoimmune hemolítica (pancitopenia inmune, hemoglobinuria nocturna paroxismal), la trombocitopenia autoinmune (trombocitopenia idiopática púrpura, trombocitopenia inmune-mediada), tiroiditis (enfermedad de Grave, tiroiditis de Hashimoto, tiroiditis linfocítica juvenil, tiroiditis atrófica), la diabetes mellitus, la enfermedad renal inmunomediada (glomerulonefritis, nefritis tubulointersticial), las enfermedades desmielinizantes de los sistemas nerviosos central y periférico tales como la esclerosis múltiple, la polineuropatía desmielinizante idiopática o el síndrome de Guillain-Barre, y la polineuropatía desmielinizante inflamatoria crónica; las enfermedades hepatobiliares, tales como la hepatitis infecciosa (hepatitis A, B, C, D, E y otros virus no hepatotrópicos), la hepatitis activa crónica autoinmune, la cirrosis biliar primaria, la hepatitis granulomatosa, y la colangitis esclerosante, la enfermedad inflamatoria del intestino (colitis ulcerante: enfermedad de Crohn), la enteratía sensible al gluten, y la enfermedad de Whipple, las enfermedades de la piel autoinmunes o inmunomediadas, incluyendo las enfermedades ampollosas de la piel, el eritema multiforme y la dermatitis por contacto, la psoriasis, las enfermedades alérgicas tales como el asma, la rinitis alérgica, la dermatitis atópica, la hipersensibilidad a la comida y la urticaria, las enfermedades inmunológicas del pulmón, tales como las neumonías eosinofílicas, la fibrosis pulmonar idiopática y la neumonitis por hipersensibilidad; las enfermedades asociadas a trasplantes, incluyendo el rechazo del injerto y la enfermedad del injerto contra el huésped.

En el lupus eritematoso, el mediador central de la enfermedad es la producción de anticuerpos auto-reactivos contra proteínas/tejidos propios y la generación subsiguiente de inflamación inmunomediada. Estos anticuerpos median directa o indirectamente la lesión del tejido. Aunque no se ha mostrado que los linfocitos T estén implicados directamente en la lesión del tejido, los linfocitos T son necesarios para el desarrollo de anticuerpos auto-reactivos. Por tanto, la génesis de la enfermedad depende de los linfocitos T. Muchos órganos y sistemas están afectados clínicamente, incluyendo los riñones, pulmones, sistema musculoesquelético, mucocutáneo, ojo, sistema nervioso central, sistema cardiovascular, tracto gastrointestinal, médula ósea y sangre.

La artritis reumatoide (RA) es una enfermedad inflamatoria autoinmune, sistémica y crónica que afecta la membrana sinovial de múltiples articulaciones y que resulta en la lesión del cartílago articular. La patogénesis es dependiente del linfocito T y está asociada con la producción de factores reumatoides, auto-anticuerpos dirigidos contra proteínas endógenas, con la formación resultante de inmunocomplejos que alcanzan niveles elevados en el fluido articular y en la sangre. Estos complejos podrían inducir la infiltración de linfocitos, monocitos y neutrófilos en el compartimento sinovial. Los tejidos afectados son principalmente las articulaciones, a menudo en un patrón simétrico. Sin embargo, la enfermedad fuera de las articulaciones ocurren en dos formas principales. En una forma, las lesiones típicas son la fibrosis pulmonar, la vasculitis, y las úlceras cutáneas. La segunda forma es el denominado síndrome de Felty, el cual ocurre más tarde en el curso de la enfermedad RA, a veces después de que la enfermedad articular haya pasado a estar quiescente, e implica la presencia de neutropenia, trombocitopenia y esplenomegalia. Esto puede ir acompañado por vasculitis en múltiples órganos y el acontecimiento de infartos, úlceras de la piel y gangrena. Los pacientes desarrollan a menudo nódulos reumatoides en el tejido subcutis que recubre las articulaciones afectadas; en etapas más tardías, los nódulos tienen centros necróticos rodeados por un infiltrado celular inflamatorio mixto. Otras manifestaciones que pueden ocurrir en la RA incluyen: la pericarditis, la pleuritis, la arteritis crónica, la neumonitis intersticial con fibrosis pulmonar, la queratoconjuntivitis sicca, y los nódulos reumatoides.

La artritis crónica juvenil es una enfermedad inflamatoria idiopática crónica que empieza a menudo con menos de 16 años de edad, y que tiene ciertas similitudes con la RA. Algunos pacientes que son positivos para el factor reumatoide se clasifican como artritis reumatoide juvenil. La enfermedad se subclasifica en tres categorías principales: pauciarticular, poliarticular y sistémica. La artritis puede ser grave y conduce a la anquilosis articular y al crecimiento retardado. Otras manifestaciones incluyen la uveitis anterior crónica y la amiloidosis sistémica.

Las espondiloartropatías son un grupo de enfermedades con algunas características clínicas comunes, y la asociación común con la expresión del producto del gen HLA-B27. Los trastornos incluyen: la espondilitis anquilosante, el síndrome de Reiter (artritis reactiva), la artritis asociada con la enfermedad inflamatoria del intestino, la espondilitis asociada con la psoriasis, el inicio juvenil de la espondiloartropatía y la espondiloartropatía indiferenciada. Las características distintivas incluyen la sacroileitis con o sin espondilitis; la artritis inflamatoria asimétrica; la asociación con HLA-B27 (un alelo definido serológicamente del locus HLA-B del MCH de la clase I); la inflamación ocular, y la ausencia de anticuerpos asociados con otras enfermedades reumatoides. La célula más implicada como clave para la inducción de la enfermedad es el linfocito CD8+ T, una célula que apunta a antígenos presentados por moléculas del MHC de la clase I. Las células CD8+ T podrían reaccionar contra el alelo HLA-B27 del MHC de la clase I como si fuera un péptido extraño expresado por moléculas de la clase I del MHC. Se ha hipotetizado que un epítopo de HLA-B27 podría imitar un epítopo antigénico de bacteria u otro epítopo antigénico de microbio y, por tanto, inducir una respuesta de células CD8 +T.

La esclerosis sistémica (esclerodermia) tienen una etiología desconocida. Una marca característica de la enfermedad es la induración de la piel, la cual es inducida probablemente por un proceso inflamatorio activo. La esclerodermia puede ser localizada o sistémica. Las lesiones vasculares son comunes, y la lesión de las células endoteliales en la microvasculatura es un suceso temprano e importante en el desarrollo de la esclerosis sistémica. Está implicada una base inmunológica por la presencia de infiltrados de células mononucleares en las lesiones cutáneas y por la presencia de anticuerpos antinucleares en muchos pacientes. ICAM-1 está a menudo regulada al alza sobre la superficie celular de los fibroblastos en las lesiones de la piel, sugiriendo que la interacción de las células T con estas células podría tener un papel en la patogénesis de la enfermedad. Podrían estar implicados otros órganos. En el tracto gastrointestinal, la atrofia del músculo liso y la fibrosis pueden resultar en una peristalsis/movilidad anormal. En el riñón, la proliferación concéntrica de la intima subendotelial que afecta las pequeñas arterias arcuada e interlobulares puede resultar en un flujo de sangre cortical renal reducido y, por tanto, en proteinuria, aoztemia e hipertensión. En el músculo esquelético y cardíaco, puede presentarse atrofia, fibrosis/escarificación, y necrosis. Finalmente, el pulmón puede tener neumonitis intersticial y fibrosis intersticial.

Las miopatías inflamatorias idiopáticas, incluyendo la dermatomiositis, la polimiositis y otras, son enfermedades de inflamación crónica del músculo, de etiología desconocida, que resultan en debilidad muscular. La lesión/inflamación del músculo es a menudo simétrica y progresiva. Los autoanticuerpos están asociados con la mayoría de las formas. Estos autoanticuerpos específicos de la miositis están dirigidos contra e inhiben la función de los componentes implicados en la síntesis proteica.

El síndrome de Sjögren es el resultado de la inflamación inmunomediada, y de la subsiguiente destrucción, de las glándulas lacrimales y de las glándulas salivares. Esta enfermedad puede asociarse con o estar acompañada por enfermedades inflamatorias del tejido conectivo. La enfermedad está asociada con la producción de autoanticuerpos contra los antígenos Ro y La, los cuales son ambos complejos pequeños de ARN-proteína. Las lesiones resultan en queratoconjuntivitis sicca, xerostomia, y otras manifestaciones o asociaciones, incluyendo la cirrosis biliar, la neuropatía periférica o sensorial, y la púrpura palpable.

Las vasculitis sistémicas son enfermedades en las que la lesión primaria es la inflamación y subsiguiente lesión de los vasos sanguíneos, lo que resulta en la isquemia/necrosis/degeneración de los tejidos suministrados por los vasos afectados, y la eventual disfunción final del órgano en algunos casos. Las vasculitis pueden ocurrir también como una lesión secundaria o secuela de otros enfermedades inflamatorias inmunomediadas, tales como la artritis reumatoide, la esclerosis sistémica, etc., particularmente en enfermedades asociadas también con la formación de complejos inmunes. Las enfermedades en el grupo de la vasculitis sistémica primaria incluyen: la vasculitis sistémica necrotizante, la poliarteritis nudosa, la angitis alérgica y la granulomatosis, la poliangis, la granulomatosis de Wegener; la granulomatosis linfomatoide; y la arteritis de células gigantes. Las vasculitis varias incluyen: el síndrome del nodo linfático mucocutáneo (MLNS o enfermedad de Kawasaki), la vasculitis aislada del SNC, la enfermedad de Behet's, la tromboangitis obliterante (enfermedad de Buerger's) y la venulitis necrotizante cutánea. Se cree que el mecanismo patogénico de la mayoría de los tipos de vasculitis listados se debe principalmente a la deposición de complejos de inmunoglobulina en la pared del vaso y en la inducción subsiguiente de una respuesta inflamatoria a través de la ADCC, de la activación del complemento, o ambas.

La sarcoidosis es una condición de etiología desconocida que se caracteriza por la presencia de granulomas epitelioides en casi cualquier tejido en el cuerpo; la implicación del pulmón es lo más común. La patogénesis implica la persistencia de macrófagos activados y células linfoides en los sitios de la enfermedad, con la subsiguiente secuela crónica que resulta de la liberación de productos local y sistémicamente activos, liberados por estos tipos celulares.

La anemia hemolítica autoinmune, incluyendo la anemia hemolítica autoinmune, la pancitopenia inmune, y la hemoglobinuria paroxística nocturna, es un resultado de la producción de anticuerpos que reaccionan con antígenos expresados sobre la superficie de los glóbulos rojos (y en algunos casos otras células sanguíneas, incluyendo también las plaquetas) y es un reflejo de la supresión de estas células recubiertas por anticuerpos a través de la lisis mediada por el complemento y/o por los mecanismos mediados por ADCC/receptor Fc.

En la trombocitopenia autoinmune, incluyendo la púrpura trombocitopénica, y la trombocitopenia inmunomediada en otras situaciones clínicas, la destrucción/eliminación de las plaquetas ocurre a resultas de la unión del anticuerpo o complemento a las plaquetas, y la eliminación subsiguiente por mecanismos mediados por la lisis de complemento, por la ADCC o por el receptor-Fc.

La tiroiditis, incluyendo la enfermedad de Grave, la tiroiditis de Hashimoto, la tiroiditis juvenil linfocítica y la tiroiditis atrófica, son el resultado de una respuesta autoinmune contra antígenos de la tiroides con producción de anticuerpos que reaccionan con proteínas presentes en, y a menudo específicas de la glándula tiroides. Existen modelos experimentales, incluyendo modelos espontáneos: en ratas (ratas BUF y BB) y en pollos (cepa de pollos obesos); modelos inducibles: inmunización de los animales con tiroglobulina, antígeno microsomal tiroideo (peroxidasa tiroidea).

La diabetes mellitus es un trastorno genético del metabolismo de los carbohidratos, proteínas y grasas, asociado con una insuficiencia relativa o absoluta de secreción de insulina y con varios grados de resistencia a la insulina. En su versión clínica completamente desarrollada, se caracteriza por hiperglicemia en ayunas y, en la mayoría del los pacientes de larga duración, por enfermedad vascular ateroesclerótica y microangiopática y neuropatía. Las diferencias entre las varias formas de la enfermedad se expresan en términos de causa y patogénesis, historia natural y respuesta al tratamiento. Por tanto, la diabetes no es un única enfermedad, sino un síndrome.

La diabetes mellitus del tipo I o dependiente de la insulina (IDDM) ocurre en aproximadamente el 10 por ciento de todos los pacientes diabéticos en el mundo occidental. La diabetes mellitus del tipo I o diabetes dependiente de la insulina es la destrucción autoinmune de las células \beta de los islotes pancreáticos; esta destrucción está mediada por autoanticuerpos y células T autoreactivas. Los anticuerpos contra la insulina o el receptor de la insulina pueden producir también el fenotipo de no respuesta a la insulina.

Clásicamente, este tipo de enfermedad ocurre más comúnmente en la infancia y en la adolescencia; no obstante, puede reconocerse y pasar a ser sintomática a cualquier edad. En el tipo de IDDM más común (Tipo IA), se ha postulado que los factores del entorno (adquiridos), tales como ciertas infecciones víricas y, posiblemente, agentes químicos, superpuestos con factores genéticos, podrían conducir a la destrucción autoinmune mediada por células de las células \beta. Por tanto, se cree que las respuestas inmunes anormales determinadas genéticamente (ligadas a asociaciones HLA) caracterizadas por la autoinmunidad mediada por células y humoral juegan un papel patogenético después de su evocación por un factor del entorno. Un segundo tipo de IDDM (Tipo IB) se cree que se debe principalmente a la autoinmunidad. Estos pacientes tienen asociadas enfermedades endocrinas autoinmunes tales como la tiroiditis de Hashimoto, la enfermedad de Grave, la enfermedad de Addison, el fallo gonadal primario, y enfermedades autoinmunes no endocrinas tales como la anemia perniciosa, las enfermedad del tejido conectivo, la enfermedad celíaca y la miastenia gravis. La dependencia de la insulina implica que la administración de insulina es esencial para prevenir la cetosis espontánea, coma y muerte. Sin embargo, incluso con el tratamiento con insulina, los pacientes diabéticos pueden todavía tener muchos de los problemas adicionales asociados con la diabetes, a saber, trastornos del tejido conectivo, neuropatía, etc.

El segundo tipo de diabetes, del Tipo II o diabetes mellitus no dependiente de la insulina (NIDDM), presente en aproximadamente el 90% de los diabéticos, también tiene una base genética. Los pacientes con la diabetes del tipo II podrían tener un peso corporal que oscila de normal a excesivo. La obesidad y la resistencia patológica a la insulina no son esenciales en modo alguno en la evolución de la NIDDM. En la mayoría de los pacientes con NIDDM, se hace un diagnóstico en la edad madura. Los pacientes con NIDDM no son insulino-dependientes para la prevención de la cetosis, pero podrían requerir insulina para la corrección de la hiperglicemia persistente en ayunas sintomática o no sintomática si esto no se puede conseguir con el uso de una dieta o de agentes orales. Por tanto, la administración terapéutica de insulina no distingue entre la IDDM y la NIDDM. En algunas familias de NIDDM, las respuestas secretoras de insulina frente a la glucosa son tan bajas que podría parecer las de la diabetes del Tipo I en cualquier momento. De forma temprana en su historia natural, el defecto de secreción de insulina y la resistencia a la insulina podrían ser reversibles por tratamiento (es decir, reducción de peso) con normalización de la tolerancia a la glucosa. Las complicaciones crónicas típicas de la diabetes, a saber la macroangiopatía, la microangiopatía, la neuropatía y las cataratas observadas en la IDDM, se observan también en la NIDDM.

Otros tipos de diabetes incluyen entidades secundarias a, o asociadas con otras ciertas condiciones o síndromes. La diabetes podría ser secundaria respecto una enfermedad pancreática o la extracción de tejido pancreático; respecto enfermedades endocrinas tales como la acromegalia, el síndrome de Cushing, el feocitocroma, el glucagonoma, el somatostatinoma, o el aldosteronismo primario; respecto la administración de hormonas que causen hiperglicemia: y respecto la administración de ciertos fármacos (por ejemplo, fármacos antihipertensivos, diuréticos de tiazida, preparaciones conteniendo estrógeno, drogas psicoactivas, agentes simpatomiméticos). La diabetes podría estar asociada con un gran número de síndromes genéticos. Finalmente, la diabetes podría estar asociada con defectos genéticos del receptor de la insulina, o deberse a anticuerpos contra el receptor de la insulina, con o sin trastornos inmunes
asociados.

Las enfermedades renales inmunomediadas, incluyendo la glomerulonefritis y nefritis tubulointersticial, son el resultado de la lesión al tejido renal, mediada por anticuerpos o linfocitos T, bien directamente a resultas de la producción de anticuerpos autoreactivos o de células T contra antígenos renales, o indirectamente a resultas del deposito en el riñón de anticuerpos y/o complejos inmunes que reaccionan contra otros antígenos no renales. Por tanto, otras enfermedades inmunomediadas que resultan en la formación de inmunocomplejos pueden inducir también una enfermedad renal inmunomediada como secuela indirecta. Tanto los mecanismos inmunes directos como los indirectos resultan en una respuesta inflamatoria que produce/induce el desarrollo de una lesión en los tejidos renales, con el resultado del deterioro de la función del órgano y, en algunos casos, la progresión hacia el fallo renal. Ambos, mecanismos inmunes humorales y celulares pueden estar implicados en la patogénesis de las lesiones.

Se cree que las enfermedades desmielinizantes de los sistemas nerviosos central y periférico, incluyendo la esclerosis múltiple, la polineuropatía idiopática desmielinizante o síndrome de Guillain-Barre y la polineuropatía inflamatoria crónica desmielinizante, tienen una base autoinmune y resultan en la desmielinación del nervio a resultas del daño causado a los oligodendrocitos o directamente a la mielina. En la MS hay evidencia que sugiere que la inducción y progresión de la enfermedad depende de los linfocitos T. La esclerosis múltiple es una enfermedad desmielinizante que es dependiente de los linfocitos T, que tiene, o un curso recurrente-remitente o un curso progresivo crónico. La etiología es desconocida; sin embargo, todos contribuyen: las infecciones víricas, la predisposición genética, el entorno y la autoinmunidad. Las lesiones contienen infiltrados de, predominantemente, células microgliales y macrófagos infiltrantes mediados por linfocitos T; los linfocitos T CD4+ son el tipo celular predominante en las lesiones. El mecanismo de la muerte de las células oligodendrocitos y la desmielinación subsiguiente no se conoce, pero es probable que esté dirigido por los linfocitos T.

La enfermedad pulmonar inflamatoria y fibrótica, incluyendo las neumonías eosinofílicas, la fibrosis idiopática pulmonar, y la neumonitis por hipersensibilidad podrían implicar una respuesta inmuno-inflamatoria desregulada. La inhibición de esta respuesta tendría un beneficio terapéutico y se halla dentro del ámbito de la invención.

Las enfermedades de la piel autoinmunes o inmuno-mediadas, incluyendo las enfermedades de la piel ampollosa, el eritema multiforme, y la dermatitis por contacto, están mediadas por auto-anticuerpos, la génesis de los cuales depende de los linfocitos T.

La psoriasis es una enfermedad inflamatoria mediada por linfocitos T. Las lesiones contienen infiltrados de linfocitos T, macrófagos y células procesadores de antígeno, y algunos neutrófilos.

Las enfermedades asociadas con los trasplantes, incluyendo el rechazo del injerto y la enfermedad del injerto-contra-el huésped (GVHD) son linfocito-T dependientes; la inhibición de la función de los linfocitos T es aliviadora.

Otras enfermedades en las que la intervención de la respuesta inmune y/o inflamatoria podría proporcionar beneficio son las enfermedades infecciosas, incluyendo pero no limitándose a la infección vírica (incluyendo pero no limitándose al SIDA, hepatitis A, B, C, D, E y herpes), la infección bacteriana, las infecciones por hongos, y las infecciones por protozoos o parásitos (la molécula (o derivados/agonistas) que estimulan el MLR pueden utilizarse terapéuticamente para potenciar la respuesta inmune contra agentes infecciosos), las enfermedades de inmunodeficiencia (moléculas/derivados/agonistas) que estimulan el MLR pueden utilizarse terapéuticamente para potenciar la respuesta inmune en condiciones de inmunodeficiencia heredada, adquirida, inducida por infección (como en la infección por el VIH) o iatrogéncia (es decir, como procedente de la quimioterapia) y de neoplasia.

Adicionalmente, la inhibición de moléculas con propiedades proinflamatorias podría tener un beneficio terapéutico en la lesión por reperfusión; apoplejía; infarto de miocardio; ateroesclerosis; lesión pulmonar aguda; choque hemorrágico; quemadura; sepsis/choque séptico; necrosis tubular aguda; endometriosis; enfermedad articular generativas y pacreatitis.

Los compuestos de la presente invención, por ejemplo, los polipéptidos o anticuerpos, se administran a un mamífero, preferiblemente un humano, de acuerdo con procedimientos conocidos, tales como la administración intravenosa como un bolo o mediante infusión continuada a lo largo de un período de tiempo, por rutas intramuscular, intraperitoneal, intracerebrospinal, subcutánea, intra-articular, intrasinovial, intratecal, oral, tópica, o por inhalación (intranasal, intrapulmonar).

Podría ser deseable administrar también anticuerpos contra otros antígenos asociados con la enfermedad inmune o con el tumor, tales como anticuerpos que se unen a CD20, CD11a, CD40, CD18, ErbB2, EGFR, ErbB3, ErbB4, o al factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF). Alternativamente, o además, podrían coadministrarse al pacientes dos o más anticuerpos que se unen al mismo o a dos o más antígenos diferentes descritos en la presente. A veces, podría ser beneficioso administrar también una o más citocinas al paciente. En una realización, los polipéptidos de la invención se coadministran con un agente inhibidor del crecimiento. Por ejemplo, el agente inhibidor del crecimiento podría administrarse primero, seguido por un polipéptido de la invención. No obstante, también se contempla la administración simultánea o la administración primero. Las dosificaciones apropiadas para el agente inhibidor del crecimiento son aquéllas actualmente usadas, y podrían disminuirse debido a la acción combinada (sinergia) del agente inhibidor del crecimiento y del polipéptido de la invención.

Para el tratamiento o reducción de la gravedad de la enfermedad inmune relacionada, la dosificación apropiada de un compuesto de la invención dependerá del tipo de enfermedad a tratarse, según se ha definido más arriba, de la gravedad y el curso de la enfermedad, de si el agente se administra con propósitos preventivos o terapéuticos, de la terapia previa, de la historia clínica del paciente, y de la respuesta al compuesto, y del criterio del médico responsable. El compuesto se administra convenientemente al paciente de una vez o a lo largo de una serie de tratamientos.

Por ejemplo, dependiendo del tipo y gravedad de la enfermedad, una dosificación candidata inicial, para la administración al paciente, es aproximadamente de 1 \mug/kg a 15 mg/kg (por ejemplo 0,1-20 mg/kg) del polipéptido o anticuerpo, sea, por ejemplo, mediante una o más administraciones separadas o mediante infusión continuada. Una dosificación diaria típica podría oscilar desde aproximadamente 1 \mug/kg hasta 100 mg/kg o más, dependiendo de los factores antes mencionados. Para administraciones repetidas a lo largo de varios días o más, dependiendo de la condición, el tratamiento se mantiene hasta que ocurre una supresión deseada de los síntomas. Sin embargo, podrían ser útiles otros regímenes de dosificación. El progreso de esta terapia se sigue fácilmente mediante técnicas y ensayos convencionales.

G. Artículos manufacturados

En otra realización de la invención, se proporciona un artículo manufacturado que contiene materiales útiles para el diagnóstico o tratamiento de los trastornos descritos más arriba. El artículo manufacturado comprende un contenedor y unas instrucciones. Los contenedores apropiados incluyen, por ejemplo, las botellas, los viales, las jeringas y los tubos de ensayo. Los contenedores podrían estar formados por una variedad de materiales, tales como el vidrio o el plástico. El contenedor contiene una composición que es efectiva para diagnosticar o tratar el trastorno del cartílago, y podría tener un puerto de acceso estéril (por ejemplo, el contenedor podría ser una bolsa de solución intravenosa o un vial que tiene un tapón perforable mediante una aguja de inyección hipodérmica). El agente activo de la composición típicamente serán un polipéptido de la insulina o de una variante de la insulina. La composición podría comprender cualquiera o múltiples ingredientes descritos en la presente. Las instrucciones sobre, o asociadas al contenedor indican que la composición se usa para diagnosticar o tratar la condición escogida. Por ejemplo, la instrucción podría indicar que la composición es efectiva para el tratamiento de la osteoartritis, la artritis reumatoide o cualquier otro trastorno del cartílago. El artículo manufacturado podría comprender además un segundo contenedor que comprende un tampón farmacéuticamente aceptable, tal como una solución salina tamponada con fosfato, una solución de Ringer, y una solución de dextrosa. Alternativamente, la composición podría contener cualquiera de los portadores, excipientes y/o estabilizantes mencionados en la presente bajo al sección E. Composiciones farmacéuticas y dosificación Además, podría incluir otros materiales deseables desde un punto de vista comercial y del usuario, incluyendo otros tampones, diluyentes, filtros, agujas, jeringas, e insertos del paquete con instrucciones para su uso.

Los ejemplos siguientes se ofrecen sólo para propósitos ilustrativos, y no se pretende que limiten el ámbito de la presente invención en modo alguno.

Ejemplos

Los reactivos disponibles comercialmente citados en los ejemplos se usaron de acuerdo con las instrucciones del fabricante a menos que se indique lo contrario. La fuente de aquéllas células identificadas en los ejemplos siguientes, y a través de la memoria, mediante números de acceso ATCC es la American Type Culture Collection, Manassas, Va. A menos que se indique lo contrario, la presente invención usa procedimientos estándares de la tecnología del ADN recombinante, tales como aquéllos descritos más arriba en la presente y en los siguientes libros de texto: Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press N.Y., 1989; Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Green Publishing Associates and Wiley Interscience, N.Y., 1989; Innis et al., PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, Academic Press, Inc., N.Y., 1990; Harlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, 1988; Gait, M. J., Oligonucleotide Synthesis, IRL Press, Oxford, 1984; R. I. Freshney, Animal Cell Culture, 1987; Coligan et al., Current Protocols in Immunology, 1991.

Ejemplo 1 Efecto de la insulina sobre los condrocitos articulares primarios Introducción

Este experimento muestra el efecto de varias concentraciones (0,1-100 nM) de insulina sobre la síntesis de la matriz (proteoglicanos) y sobre la viabilidad de los condrocitos en medio de cultivo libre de suero. Para cultivar los condrocitos, el cartílago articular se digiere con enzimas para eliminar la matriz extracelular. De este modo, el entorno celular en este sistema de cultivo será similar al hallado en las etapas más tardías de los trastornos del cartílago, en los que la matriz de ha agotado. Puesto que esencialmente toda la matriz sintetizada por los condrocitos cultivados en monocapa se secreta al medio, la cantidad de proteoglicanos en el medio de tales células es indicativas de la síntesis de matriz. Los proteoglicanos se midieron en el medio usando el ensayo colorimétrico del azul de 1,9-dimetilmetileno (DMMB) de Farndale y Buttle, Biochim. Biophys. Acta, 883:173-177 (1986). En este ensayo, el cambio en el color del colorante DMMB que ocurre a partir de su unión a los proteoglicanos se cuantifica espectrofotométricamente. La viabilidad de los condrocitos se determinó usando un ensayo colorimétrico que mide la actividad metabólica de las células cultivadas en base a la capacidad de las células viables para romper la sal de tretrazolio MTT amarilla para formar cristales de formazán púrpuras, Berridge, M. V. y Tan, A. S., Arch. Biochem. Biophys., 303:474 (1993). Los cristales de formazán formados se solubilizan y se cuantifican espectrofotométricamente usando un lector de
ELISA.

Materiales y procedimientos Preparación de condrocitos

Las articulaciones metacarpofalángicas de cerdos hembra de 4-6 meses de edad se diseccionaron asépticamente, y el cartílago articular se retiró mediante corte en láminas a pulso, teniendo cuidado de evitar el hueso subyacente. Estos fragmentos de cartílago se digirieron en 0,05% tripsina en medio F12 de Ham libre de suero, durante 25 minutos a 37ºC. El medio se escurrió y descartó, y el cartílago se digirió en 0,3% de colagenasa B en medio F12 de Ham libre de suero, durante treinta minutos a 37ºC. El medio se escurrió y descartó, y el cartílago se digirió durante la noche en 0,06% de colagenasa B en medio F12 de Ham + 10% de suero bovino fetal. Las células se filtraron a continuación a través de un filtro de nilón de 70 micras y se sembraron en medio F12 de Ham sin suero.

Cultivo de los condrocitos

Los condrocitos (preparados tal como se ha descrito más arriba) se sembraron en placas de microtitulación (Falcon microtest 96, fondo plano) a una densidad de 80.000 células por pocillo en medio compuesto de F12 de Ham con antibióticos (10 \mug/ml gentamicina, 250 ng/ml amfotericina B, 100 \mug/ml penicilina/estreptomicina) en un volumen final de 250 \mul por pocillo, durante 6 días a 37ºC y 5% de CO_{2}. El medio se retiró y se usó para medir los proteoglicanos en los días 3 y 6.

Medición de los proteoglicanos

El DMMB es un colorante que experimenta metacromasia (un cambio en el color, en este caso de azul a púrpura) a partir de unir a glicosaminos (GAG) sulfatados, la cadena lateral de los proteoglicanos. La adición de proteoglicanos sulfatados al DMMB causa una disminución en el valor de pico a 590 y 660 nm con un incremento en la absorbancia a 530 nm. Por tanto, la cantidad de proteoglicanos en el medio se determinó añadiendo colorante DMMB en un formato de placa de 96 pocillos, y el cambio en el color se cuantificó usando un espectrofotómetro (Spectramax 250). El ensayo del DMMB es un procedimiento claramente aceptado para medir la cantidad de proteoglicanos en los cultivos de cartílago. Para este ensayo, se preparó una curva estándar usando condroitín sulfato oscilando desde 0,0 hasta 5,0 \mug.

Ensayo del MTT

Después de 6 días de tratamiento, se añadieron 10 \mul de la sal de tetrazolio, MTT (solución madre a 5 mg/ml), (Boehringer Mannheim, cat. nº 1465007) a los restantes 100 \mul de medio en cada pocillo. Después de otras 4 horas de incubación a 37ºC y 5% de CO_{2}, se añadieron 100 \mul de solución de solubilización (reactivo en el equipo de ensayo de Boehringer Mannheim) y se incubó la placa durante la noche a 37ºC y 5% de CO_{2}. A continuación se midió la absorbancia a 584 nm (y a 690 nm para determinar la absorbancia de fondo).

Resultados y discusión

Tal como se muestra en la Figura 1, la insulina incrementó la síntesis de proteoglicanos de una manera dependiente de la dosis. Además, la insulina (a concentraciones de tan bajas como 0,1 nM) inhibió la regulación a la baja de la síntesis de PG inducida por la IL-1\alpha (lado derecho de la gráfica en la Figura 1). Por tanto, la insulina (Intergen, Purchase, New York, cat. nº 450100) fue un estimulador muy potente de la síntesis de proteoglicanos, y fue capaz de superar los efectos inhibidores de la IL-1\alpha (R&D Systems, cat. nº 200LA002) sobre la síntesis de proteoglicanos.

A diferencia de la mayoría de las células primarias, los condrocitos son capaces de sobrevivir en medio sin suero en ausencia de cualquier factores de crecimiento adicionales durante al menos una semana. Sin embargo, la adición de la insulina (a 100 nM y 10 nM) incrementó la actividad metabólica de los condrocitos cultivados de esta forma durante 6 días (Figura 2). La insulina también bloqueó la capacidad de la interleucina-1\alpha para inhibir la actividad metabólica de los condrocitos (lado derecho de la gráfica). Tal actividad podría ser muy útil terapéuticamente, especialmente en condiciones tales como la artritis, el trauma articular, o el envejecimiento, en donde la actividad metabólica de los condrocitos está en peligro.

La capacidad de la insulina para contrarrestar los efectos perjudiciales de la IL1-\alpha hace de la insulina un candidato muy atractivo para el tratamiento de condiciones tales como la artritis, en las cuales los niveles elevados de IL-1 están implicados en la progresión de la enfermedad.

Ejemplo 2 Ensayo del explante de cartílago articular Introducción

Los experimentos de este ejemplo examinan tanto el potencial sintético como el profiláctico del compuesto de ensayo sobre el recambio de la matriz del cartílago. Este potencial se determina midiendo la síntesis y rotura de la matriz (es decir, proteoglicanos), así como la producción de óxido nítrico, en el cartílago articular. Estos parámetros se evalúan en presencia y ausencia de interleucina-1\alpha, IL-1\alpha. Los explantes del cartílago articular tienen varias ventajas sobre las células primarias en cultivo. En primer lugar, y quizá lo más importante, las células en los explantes permanecen incrustadas en la arquitectura del tejido producida in vivo. En segundo lugar, estos explantes son fenotípicamente estables durante varias semanas ex vivo, tiempo durante el cual son capaces de mantener la homeostasis del tejido. Finalmente, a diferencia de las células primarias, los explantes pueden usarse para medir la rotura de la matriz. Para preparar explantes de cartílago, el cartílago articular debe diseccionarse y trocearse, lo que resulta en la desorganización de la red de colágeno y la liberación de los proteoglicanos en el medio de cultivo. Por tanto, este sistema imita las condiciones de degeneración tales como la artritis, en la que la matriz se ve progresivamente reducida. Usando este sistema, hemos hallado que el compuesto de ensayo puede: (1) estimular la síntesis de proteoglicanos (PG); (2) inhibir la liberación de PG; (3) inhibir la rotura de PG inducida por la IL-1\alpha; (4) inhibir la reducción de la síntesis de PG inducida por la IL-1\alpha; y (5) disminuir tanto la producción de óxido nítrico basal como la inducida por IL-1\alpha.

La Il-1\alpha tiene efectos catabólicos sobre el cartílago, incluyendo la regulación al alza de enzimas que inducen la rotura de la matriz (metaloproteinasas y agrecanasas de la matriz), así como la inhibición de la síntesis de nuevas moléculas de la matriz (proteoglicanos y colágenos). Por tanto, la capacidad del compuesto de ensayo, no sólo para tener efectos positivos sobre el cartílago, sino también para contrarrestar los efectos perjudiciales de la IL-1\alpha, es una evidencia sólida del efecto protector exhibido por el compuesto de ensayo. Además, una actividad tal sugiere que el compuesto de ensayo podría inhibir la degradación que ocurre en condiciones artríticas, puesto que en las articulaciones artríticas se hallan niveles elevados de IL-1, y porque se ha mostrado que el antagonismo de la función de la IL-1 reduce la progresión de la osteoartritis. Arend W. P. et al., Ann. Rev. Immunol., 16:27-55 (1998).

El papel del óxido nítrico (NO) en la rotura del cartílago articular, especialmente la destrucción asociada con la osteoartritis, ha sido descrito (Ashok et al., Curr. Opin. Rheum., 10:263-268 (1998)). Los modelos animales in vivo sugieren que la inhibición de la producción de óxido nítrico reduce la progresión de la artritis (Pelletier, J P et al., Arthritis Rheum., 7:1275-1286 (1998); van de Loo et al., Arthritis Rheum., 41:634-46 (1998); Stichtenoth, DO y Frolich J. C., Br. J. Rheumatol., 37:246-257 (1998). En los humanos, muchos de los fármacos usados para tratar la artritis reumatoide pueden disminuir la producción o actividad del óxido nítrico. Puesto que el NO tiene también efectos sobre tipos celulares distintos de los condrocitos, la presencia de NO dentro de la articulación podría incrementar también la vasodilatación y la permeabilidad, potenciar la liberación de citocinas por parte de los leucocitos, y estimular la actividad angiogénica. Puesto que la producción de NO por parte del cartílago se correlaciona con el estado morboso, y puesto que el NO parece desempeñar un papel en ambos, los componentes erosivo e inflamatorio de las enfermedades articulares, un factor que disminuya la producción de óxido nítrico probablemente sería beneficioso para el tratamiento de los trastornos del cartílago.

El ensayo para el óxido nítrico descrito en la presente se basa en el principio de que el 2,3-diaminonaftaleno (DAN) reacciona con el nitrito en condiciones ácidas para formar el 1-(H)-naftotriazol, un producto fluorescente. Puesto que el NO es metabolizado rápidamente en nitrito (NO_{2}^{-1}) y nitrato (NO_{3}^{-1}), la detección de nitrito es un medio para detectar (aunque contando de menos) el NO producido realmente por el tejido cartilaginoso.

Materiales y procedimientos Explantes de cartílago articular

La articulación metacarpofalángica de cerdos hembra de 4-6 meses de edad se diseccionó asépticamente tal como se ha descrito más arriba. El cartílago se troceó, se lavó y cultivo en conjunto durante la menos 24 horas a 37ºC y 5% de CO_{2} en medio de explante, a saber, medio LG DMEM/F12 sin suero (SF) con 0,1% de BSA, 100 U/ml de penicilina/estreptomicina (Gibco), L-glutamina 2 mM, piruvato sódico 0,1 mM (Gibco), 20 \mug/ml de gentamicina (Gibco) y 1,25 mg/l de amfotericina B. El cartílago articular se repartió en alícuotas en tubos micrónicos (aproximadamente 55 mg por tubo) y se incubó durante al menos 24 horas en el medio anterior. El medio se recolectó y se añadió nuevo medio (solo o con insulina fresca) a diversos intervalos de tiempo (0, 24, 48 y 72 horas).

Liberación de proteoglicanos

El medio se recolectó a diversos intervalos de tiempo, y se ensayó su contenido en proteoglicanos usando el ensayo colorimétrico del azul de 1,9-dimetilmetileno (DMMB) de Farndale y Buttle, Biochim. Biophys. Acta, 883:173-177 (1985) tal como se ha descrito más arriba. La liberación de PG a la 0 hora se usó como una medida de referencia, y cualquier muestra con liberación especialmente elevada o baja de PG se descartó antes del tratamiento con insulina. En todos los tratamientos, los resultados representan el promedio de 5 muestras independientes.

Síntesis de proteoglicanos

48 horas después del primer tratamiento, se añadió ^{35} S-sulfate a los explantes de cartílago hasta una concentración final de 10 \muCi/ml junto con medio nuevo (con o sin el compuesto de ensayo). Después de 12-17 horas adicionales de incubación a 37ºC, se retiró el medio y se guardó para el análisis subsiguiente de PG y óxido nítrico (NO). Los explantes de cartílago se lavaron dos veces con medio para explantes y se digirió durante la noche a 50ºC en un volumen de reacción de 900 ml de EDTA 10 mM, fosfato sódico 0,1 M y 1 mg/ml de proteinasa K (Gibco BRL). La reacción de digestión se mezcló (2:1) con 10% w/v de cloruro de cetilpiridinio (Sigma) para precipitar los proteoglicanos y se centrifugó a 1000\timesg durante 15 minutos. Se retiró el sobrenadante y se añadió ácido fórmico (500 ml, Sigma) para disolver los precipitados. Las muestras se transfirieron a continuación a viales que contenían 10 ml de fluido de centelleo (ICN) y se leyeron en un contador de centelleo.

Proteoglicanos restantes en tejidos de cartílago

Transcurridas 72 hours, los explantes de cartílago articular restantes se digirieron tal como se describió más arriba en "Síntesis de proteoglicanos" y se ensayó su contenido en proteoglicanos usando el ensayo colorimétrico del DMMB (citado más arriba bajo "Liberación de proteoglicanos").

Ensayo del óxido nítrico

El medio del cartílago articular guardado de los explantes de cartílago en varios intervalos (24, 48, y 72 hours) se mezcló con 10 \mul de 0,05 mg/ml 2,3-diaminonaftaleno (DAN) en HCl 0,62 M, y se incubaron a temperatura ambiente durante 10-20 minutos a oscuras. La reacción se terminó con 5 \mul de NaOH 2,8N. La cantidad de fluorescencia del 2,3-diamionaftotriazol se midió con un lector de placas fluorescencte Cytoflor a 365 nm de excitación y 409 nm de emisión.

Resultados y discusión

De forma similar a sus efectos sobre los condrocitos articulares primarios (Figura 1), la insulina (Intergen, Purchase, Nueva York, cat. nº #450100) indujo la síntesis de proteoglicanos en los explantes de cartílago articular, y pudo, al menos parcialmente, bloquear los efectos inhibidores de la IL-1\alpha (R&D Systems, cat. nº 200LA002) (Figura 3B). Además, la insulina disminuyó la rotura de matriz que ocurre en ausencia o presencia de la IL-1\alpha (Figura 3A). Puesto que la rotura de la matriz es una de las características más tempranas y la más destructiva de la artritis, la inhibición de este proceso y la estimulación de nuevas moléculas de la matriz debería promover la reparación del tejido y de la articulación. Lo más importante, es que esta disminución en la rotura de la matriz e incremento en la síntesis inducidas por la insulina resultaron en un incremento en la cantidad total de proteoglicanos en los explantes de cartílago articular en relación a la de los tejidos no tratados (Figura 4). Incrementando la cantidad de matriz retenida en el cartílago, el tratamiento in vivo con insulina conduciría a la retención de la matriz del cartílago articular, y, por tanto, a la inhibición de la subsiguiente destrucción y deformidad de la articulación.

Además de su capacidad para disminuir la rotura de la matriz e incrementar la síntesis de matriz la insulina también inhibió la producción de óxido nítrico (NO) por parte tanto de los explantes de cartílago no tratados como de los tratados con IL-1\alpha (Figura 5). Este efecto se observó a concentraciones tan bajas como 1 nM y también se observó con explantes tratados con IGF. Tal como se ha descrito más arriba, el óxido nítrico tiene efectos perjudiciales sobre los condrocitos así como sobre otros tipos celulares en la articulación. Puesto que se ha observado que la inhibición del óxido nítrico inhibe la progresión de la artritis en los animales, el efecto de la insulina sobre el NO sugiere además que la insulina sería protectora para los tejidos articulares in vivo.

Ejemplo 3 Ensayo de la rótula de ratón Introducción

Este ensayo determina el efecto in vitro e in vivo del compuesto ensayado sobre la síntesis de proteglicanos en las rótulas de ratones. La rótula es un modelo muy útil para estudiar los efectos del compuesto de ensayo porque permite la evaluación sobre cartílago que no se ha retirado del hueso subyacente. Además, puesto que cada animal tiene una rótula en cada pata, los experimentos pueden realizarse usado la articulación contralateral como control. Este ensayo implica la inyección de una proteína en el espacio intraarticular de una articulación de rodilla (de ratón), y la recolección subsiguiente (transcurridos unos pocos días después de la inyección) de la rótula para medir la síntesis de matriz (Figura 6). El procedimiento realizado en la presente, y esquematizado en la Figura 6, se ha usado previamente para medir los efectos de las citocinas in vitro e in vivo (Van den Berg et al., Rheum. Int, 1:165-9 (1982); Vershure P. J. et al., Ann. Rheum. Dis., 53:455-460 (1994); y Van de Loo et al., Arthrit. Rheum., 38:164-172
(1995)).

Materiales y procedimientos Tratamiento in vitro de la rótula

Las rótulas de ratones C57B1-6J de 2 meses de edad (Jackson Laboratories) se diseccionaron aparte del tejido blando que las rodeaba y se incubaron durante la noche en medio de explante (ver más arriba, Ejemplo 2) sin factores adicionales o con 100 ng/ml de IL1\alpha o 100 nM de insulina. Las rótulas se marcaron con ^{35} S-sulfuro (30 \muCi/ml) durante al menos 3 horas de la incubación de 18 horas, y a continuación se lavaron tres veces con solución salina tamponada con fosfato (PBS). Las muestras se fijaron durante la noche en 10% de formalina, seguida por la descalcificación del hueso subyacente en ácido fórmico al 5%. Se diseccionó el cartílago aparte del hueso subyacente, se colocó en 500 \mul de un solubilizador de tejido y gel (Solvable, Packard Instrument Company) y se incubó a 60ºC durante 1,5 horas. Se añadió fluido de centelleo diseñado para soluciones salinas y alcalinas concentradas (HIONIC-fluor, Packard Instrument Company) (10 mL) a cada tubo y se mezcló a conciencia. A continuación se midió la captura de ^{35}S usando un contador de centelleo. Los niveles de síntesis de PG se dan como c.p.m. y muestra en promedio de rótulas procedentes de 4 ratones/grupo diferentes.

Tratamiento in vivo de la rótula

Los ratones se separaron en dos subgrupos y se inyectaron, y se inyectó una dosis elevada (6 \mul) o una dosis baja (3 \mul) del compuesto de ensayo (por ejemplo, insulina a 10 mg/ml) de forma intraarticular en la rodilla derecha diariamente durante tres días consecutivos. Las rótulas se recolectaron a continuación, se marcaron durante 3 horas en medio de explante sin ningún factor adicional, y se procesaron como se ha descrito más arriba. La Figura 7B muestra los datos como un cociente de la incorporación en la rodilla tratada en comparación con la no tratada. Los puntos que representan una proporción tratado/no tratado de más de 1 (por encima de la línea) indican que el compuesto ensayado resultó en una síntesis de proteoglicanos incrementada. La síntesis de PG a resultas de la aplicación de la dosis elevada (6 \mul) está indicada por los puntos de la izquierda, mientras que la dosis baja (3 \mul) está indicada por los puntos de la derecha. Cada punto representa los resultados de un ratón individual.

Resultados y discusión

De forma similar a su inducción de la síntesis de proteoglicanos (PG) in vitro en los explantes de cartílago diseccionados (Ejemplo 2), la insulina estimuló la síntesis de PG en el cartílago intacto, tanto in vitro (Figura 7A) como in vivo (Figura 7B). Más específicamente, la inyección de la insulina (Intergen, Purchase, Nueva York, cat. nº 450100) en las articulaciones de la rodilla de ratones normales resultó en un incremento aproximado del 25% en la síntesis de PG en 3 días (Figura 7B). Un incremento tal probablemente tendría un efecto beneficioso sobre los tejidos enfermos en los que la matriz del cartílago, perdida a través de la degradación, no puede ser remplazada. Además, este incremento en porcentaje podría infravalorar los efectos los efectos beneficiosos de la insulina sobre la matriz del cartílago in vivo, puesto que la capacidad de la insulina para disminuir la rotura del cartílago (ver el Ejemplo 2) no se habría detectado en este ensayo y, por tanto, no estaría incluida en este cálculo. La disminución en la rotura inducida por la insulina incrementaría adicionalmente la cantidad de matriz retenida en las articulaciones de la rodilla tratadas con insulina. Finalmente, estos experimentos representan intentos iniciales para determinar la seguridad en un modelo animal. De forma bastante sorprendente, no se observaron efectos adversos a partir de la inyección intraarticular de dosis muy elevadas (30 \mug) de insulina una vez/día durante 3 días.

Por tanto la insulina compuesto de ensayo tuvo efectos positivos sobre el cartílago dentro del espacio articular, y la inyección intraarticular de proteína de insulina purificada en las articulaciones de la rodilla parece ser una estrategia de tratamiento defendible.

Ejemplo 4 Modelo del cobaya Introducción

Estos experimentos miden el efecto del compuesto de ensayo sobre la síntesis y rotura de proteoglicanos (PG) en el cartílago de cobayas Dunkin Hartley (DH), un modelo animal aceptado para la osteoartritis (Young et al., "Osteoarthrits", Spontaneous animal models of human disease, Vol. 2, pp. 257-261, Acad. Press, New York. (1979); Bendele et al., Arthritis Rheum., 34:1180-1184; Bendele et al., Arthritis Rheum., 31:561-565 (1988); Jimenez et al., Laboratory Animal Sciences, vol 47(6):598-601 (1997). A diferencia de la mayoría de otros modelos animales que tienen una rotura de tejido en sus articulaciones que progresa rápidamente, los cobayas DH tienen en sus articulaciones cambios parecidos a la OA, no inflamatorios, que progresan lentamente y ocurren de forma natural.

El patrón altamente reproducible de la rotura del cartílago en estos cobayas es similar al observado en el trastorno humano (Figura 8). Mientras que las articulaciones parecen normales en cobayas DH de 2 meses de edad, a medida que el animal envejece, el curso y la gravedad de la enfermedad progresa de forma similar a la de la OA humana. Por tanto, el cambio histológico incluye la degeneración y muerte focal de condrocitos y la pérdida de matriz en la capa superficial del cartílago articular. Mientras que los condrocitos supervivientes adyacentes al área hipocelular fibrilada podrían sintetizar proteoglicanos, estas células no pueden mantener el contenido y la estructura normal de la matriz. Estos condrocitos no migran al interior y se distribuyen por sí mismos normalmente dentro del área hipocelular, en cambio, permanecen en agrupaciones rodeadas por proteoglicano. Como resultado, esta matriz de cartílago carente de condrocitos distribuidos normalmente experimenta una degradación adicional, que en último lugar resulta en la destrucción de la superficie articular (Bendele y Hulman, Arthritis Rheum., 31:561-565 (1988)). Por tanto, con el tiempo, la pérdida de condrocitos y de matriz pasa a ser más extensa. Un incremento transitorio en la proliferación de los condrocitos conduce a la formación de condrocitos periféricos, los cuales subsiguientemente experimental osificación endocondral para formar osteofitos. A continuación, ocurre la degeneración de moderada a grave del cartílago, con una degeneración extensa del cartílago profundo, formación de osteofitos, espesamiento del hueso subcondral, e hiperplasia sinovial y fibrosis. Por tanto, las articulaciones de los cobayas DH de más de 1 año de edad están gravemente afectadas, con osteofitos marginales de la tibia y fémur, esclerosis del hueso subcontral de la placa tibial, quistes en el condilo femoral, y calcificación de los ligamentos colaterales. (Jimenez et al., ver más arriba).

Materiales y procedimientos

Los cobayas Dunkin Hartley machos, obtenidos de los Charles River Laboratories (Wilmington, Mass.) se separaron en grupos de tratamiento para su sacrificio a los 1-2, 6 y 11 meses de edad. En el momento del sacrificio, las articulaciones metacarpofalángicas se diseccionaron asépticamente, y el cartílago articular se retiró mediante corte en láminas a pulso, teniendo cuidado de evitar el hueso subyacente. El cartílago se troceó, se lavó y cultivo en conjunto durante la menos 24 horas en una atmósfera humidificada a 37ºC y 5% de CO_{2} en medio LG DMEM/F12 sin suero (SF) con 0,1% de BSA, 100 U/ml de penicilina/estreptomicina (Gibco), L-glutamina 2 mM, piruvato sódico 0,1 mM (Gibco), 20 \mug/ml de gentamicina (Gibco) y 1,25 mg/l de amfotericina B. El cartílago articular se repartió en alícuotas en tubos micrónicos (aproximadamente 35 mg por tubo) y se incubó durante al menos 24 horas en el medio anterior. El me-
dio se recolectó y se añadió nuevo medio, solo o con insulina, a diversos intervalos de tiempo (0, 24, 48 y 72 horas).

Liberación de proteoglicanos

El medio se recolectó a diversos intervalos de tiempo, y se ensayó su contenido en proteoglicanos usando el ensayo colorimétrico del azul de 1,9-dimetilmetileno (DMMB) de Farndale y Buttle, Biochim. Bhiophys. Acta, 883:173-177 (1985) tal como se ha descrito más arriba (Ejemplo 2, "Ensayo del explante de cartílago articular"). La liberación de PG a la 0 hora se usó como una medida de referencia, y cualquier muestra con liberación especialmente elevada o baja de PG se descartó antes del tratamiento.

Síntesis de proteoglicanos

Después del cambio del medio a las 48 horas, se añadió ^{35} S-sulfato (concentración final de 10 \muCi/ml) a los cultivos de explantes de cartílago, y los tejidos se procesaron como más arriba en el Ejemplo 2, "Ensayo del explante de cartílago articular").

Proteoglicanos restantes en tejidos de cartílago

Transcurridas 72 horas, los explantes de cartílago articular restantes se digirieron tal como se describió más arriba en "Síntesis de proteoglicanos" y se ensayó su contenido en proteoglicanos usando el ensayo colorimétrico del DMMB (citado más arriba bajo "Liberación de proteoglicanos").

Resultados y discusión

Un factor que se sabe afecta al metabolismo de la matriz del cartílago es la edad. No solo la velocidad de la biosíntesis y la capacidad de reparación del tejido disminuyen con la edad, sino que también está comprometida la respuesta a un cierto número de factores de crecimiento, incluyendo el factor de crecimiento similar a la insulina (IGF-1) (Schafer et al., Arch. Biochem and Biophys., 302:431-438 (1993). La enfermedad está asociada también con una disminución en la sensibilidad al factor de crecimiento, tal como se evidencia por el hallazgo de que la respuesta del cartílago artrítico al IGF-1 es significativamente roma en relación a los controles de la misma edad (Chevalier y Tyler 1996, Br. J. Rheum, 35:515-522; J. Posever et al., J. Orthopaedic Res., 13:832-827 (1995)). Por esta razón, se ensayó el efecto de la insulina sobre el tejido procedente de cobayas de varias edades, y por tanto, en varias etapas de degeneración. Tal como se muestra en la Figura 9, la insulina incrementó la síntesis de proteoglicanos (PG) hasta aproximadamente el mismo nivel (dos veces) en el cartílago articular procedente de cobayas DH de 1-2, 6, u 11 meses de edad. Por tanto, el cartílago de los cobayas DH respondió a la insulina en varias edades y etapas de la enfermedad. Aparte de incrementar la síntesis de PG, la insulina también disminuyó la rotura de la matriz, tal como se muestra por una disminución en la cantidad de PG en los medios de explantes tratados con insulina (Figura 10, lado izquierdo, "Medios"). Lo más importante, esta disminución inducida por la insulina en la rotura e incremento en la síntesis resultaron en un ganancia neta significativa en la cantidad de proteoglicanos que permanecen el el cartílago tratado con insulina, incluso en tejido procedente de animales de 11 meses de edad tratados sólo durante 3 días (Figura 10, lado derecho "Tejido"). Estos datos, que muestran un incremento en la cantidad e PG mantenidos en la matriz del cartílago tratado con insulina, sugieren con fuerza que la insulina sería un estimulante muy efectivo y potente de la reparación del cartílago, puesto que la pérdida de matriz ocurre de forma temprana y continuada a lo largo del proceso de la enfermedad.

Ejemplo 5 Modelo del ratón diabético

Los cambios metabólicos en pacientes con diabetes mellitus (DM) afectan muchos sistemas de órganos. Por ejemplo, los pacientes con diabetes tienen un mayor número de lesiones y trastornos musculoesqueléticos en relación a pacientes sin diabetes. De hecho, la diabetes es uno de los factores de riesgo conocidos para desarrollar la artritis. Se han hallado cambios en los proteoglicanos en los discos intervertebrales de pacientes diabéticos, y las muestras de cartílago articular de pacientes con diabetes mellitus tienen una integridad estructural comprometida (Robinson et al., Spine, 23:849-855 (1998); Athanasiou et al., Clin Orthop, 368:182-189 (1999). El mecanismo que subyace estos cambios en el cartílago articular en los pacientes diabéticos no se conoce todavía.

Los síntomas que se parecen a la diabetes humana ocurren de forma natural en muchos animales o pueden inducirse quirúrgicamente mediante la extracción del páncreas, o mediante el tratamiento con fármacos, virus o una dieta específica. Entre estos modelos, la diabetes inducida por la administración de estreptozotocina (STZ) está acompañada por defectos en la secreción y acción de la insulina, lo que en muchos aspectos se parece a los hallados en la diabetes humana no dependiente de insulina (Portha, B. et al., Diabetes Metab., 15:61-75, 1989). La diabetes inducida por la estreptozotocina (STZ) en animales modelo está asociada con la atrofia y el contenido disminuido de colágeno de los tejidos conectivos, incluyendo la piel, los huesos y el cartílago (Craig, R. G. et al., Biochim. Biophys. Acta, 1402:250-260. 1998). De forma importante, se halló que el cartílago procedente de ratas inducidas con STZ era resistente a la acción anabólica del IGF-I, según se midió por la incorporación de ^{35}SO_{4} in vitro (Kelley, K. M. et al., 1993. Diabetes 42:463-469). Con objeto de comprender mejor los efectos de la diabetes sobre el metabolismo de la matriz del cartílago, y para ensayar los efectos de la insulina en otro modelo de cartílago enfermo, potencialmente resistente al factor de crecimiento, medimos la síntesis de matriz en el cartílago articular de ratones diabéticos inducidos con STZ, cultivados solos o en presencia de insulina.

Materiales y procedimientos Inducción de la diabetes

Se inyectaron ratones CD-1 hembra de 8 semanas de edad con 40 mg/kg STZ durante 5 días consecutivos. Las rótulas se recolectaron a los 2, 3 ó 5 meses después del tratamiento. También se recogió sangre de la cola en los mismos intervalos de tiempo, y se midieron los niveles de glucosa en sangre usando un medidor de glucosa (One-Touch, Lifescan).

Ensayo de la rótula

Las rótulas se incubaron en ausencia y presencia de la insulina (100 nM, Intergen, Purchase, Nueva York, cat. nº 450100) y ^{35}S-sulfato (concentración final de 15 \muCi/ml) durante 18 horas. Las rótulas se diseccionaron y procesaron como más arriba (Ejemplo 3).

Resultados y discusión

En todos los intervalos de tiempo ensayados (2, 3 y 5 meses), el cartílago articular de los ratones tratados con STZ tenía niveles basales inferiores de síntesis de proteoglicanos (Figura 11). Esta disminución en la síntesis podría deberse al hecho de que el tratamiento con la STZ resulta en niveles bajos de insulina en suero debido a la destrucción de las células pancreáticas que producen la insulina (Portha, B et al., Diabetes Metab., 15:61-75, 1989; Craig, R. G. et al., Biochim. Biophys. Acta, 1402:250-260. 1998; Kelley, K. M. et al., Diabetes, 42:463-469 (1993). Los más importante es que la insulina indujo la síntesis de matriz en el cartílago de ratones tratados con STZ hasta el mismo punto que en el cartílago de ratones normales. De hecho, la insulina fue capaz de restablecer la síntesis de matriz en el cartílago de ratones tratados con STZ hasta niveles comparables a los de los ratones normales, no tratados. Por contra, el IGF-1 no fue capaz de incrementar la síntesis en el cartílago de animales tratados con STZ (Kelley, K. M. et al., Diabetes, 42:463-469 (1993). Por tanto, el tejido enfermo no responde igualmente a los factores anabólicos, y la insulina podría probarse más efectiva que el IFG-1 en los animales diabéticos.

Nuestros datos apoyan la hipótesis de que la deficiencia de insulina en ratones tratados con STZ conduce a una síntesis disminuida de matriz en el cartílago. Además, a pesar del mecanismo por el cual la síntesis es inferior en los ratones tratados con STZ, el tratamiento fue capaz de restablecer la síntesis a niveles normales. Estos resultados sugieren que la insulina sería un tratamiento efectivo para los trastornos (distintos de la artritis primaria) en los cuales el tejido del cartílago tiene defectos en la síntesis y/o rotura de a matriz.

Ejemplo 6 Preparación y análisis de microesferas poliméricas que contienen insulina humana recombinante Introducción

Mientras que las inyecciones intraarticulares son generalmente bien toleradas por los pacientes, y las inyecciones de agentes terapéuticos una vez por semana está siendo actualmente ensayada clínicamente, un fármaco ideal sería uno en el que se requiriera un número limitado de dosis. Desafortunadamente, la insulina humana (HI) es inestable cuando se almacena en soluciones neutras, a baja concentración, durante períodos de tiempo extensos. J. Brenge y L. Langkjoer, Insulin Formulation and Delivery in Protein Delivery, editores L. M. Sanders y W. Hendren. Además, la insulina tiene una vida media de aproximadamente 5 minutos en el cuerpo humano. Hadley, M. E. Endocrinology, Prentice-Hall, Inc. 1988. Por tanto, es altamente deseable una formulación de HI liberación lenta. La insulina humana (Eli Lilly, Indianapolis, Ind.) se ha formulado también con acetato de zinc para producir un complejo Zn:H1 poco soluble. Se cree que el complejo Zn:H1 resulta en una formulación de insulina de acción prolongada. De hecho, la evidencia histoquímica indica que la HI se almacena en el páncreas como un complejo de zinc. J. Brenge y L. Langkjoer, Insulin Formulation and Delivery in Protein Delivery, editores L. M. Sanders y W. Hendren, Plenum Press, 1997; Hadley, M. E. Endocrinology, Prentice-Hall, Inc. 1988. Además, se sabe que la HI complejada con zinc es más resistente a la agregación que la HI sin complejar. J. Brenge y L. Langkjoer, ver más arriba. Finalmente, se ha mostrado que la insulina complejada con zinc tiene un inicio de la actividad más lento y una duración mayor (hasta 24 horas) en humanos en comparación con la insulina regular. J. Brenge y L. Langkjoer, ver más arriba.

Las formulaciones de microesferas se analizaron para determinar el tamaño, la carga de proteína, y la integridad biológica. La cantidad de insulina humana (HI) encapsulada (w/w) se determinó mediante análisis químico según Cleland, J. C. y Jones, A. J. S., Pharm. Res., 13(10):1464-1475 (1996)]. La integridad física y biológica de la HI recuperada de las microesferas se analizó mediante cromatografía de exclusión por tamaño (SEC) y de fase inversa (RPC). La SEC y RPC se usaron para detectar respectivamente la HO agregada y desamidada.

Material y procedimientos Formulación de microesferas

En las formulaciones de microesferas preparadas, tanto la proporción de hexámero de Zn:HI (por ejemplo, formulación I-2:1 y formulación II-4:1) como la carga de proteína (aproximadamente el 5,0%) permanecieron constantes. La proporción molar de láctico respecto glicólido en todos los polímeros se mantuvo constante a 50:50. Todas las formulaciones de microesferas se prepararon usando D,L-PLGA obtenido de Boehringer Ingelheim (Ingelheim, Alemania; RG502H; 0,2 dl/g, 8 kD). La insulina humana recombinante (HI) se encapsuló en microesferas de PLGA usando un proceso criogénico, no acuoso, descrito por Gombotz et al., patente estadounidense nº 5,019,400, concedida el 28 de mayo de 1991 y Johnson et. al. Nature Med, 2 (7):795-799 (1996).

Al prepararlas para la inserción dentro de las microesferas, las formulaciones de HI anteriores se liofilizaron primero por pulverización. Este proceso se consiguió atomizando las formulaciones anteriores a través de una boquilla ultrasónica (Sono-Tek, Milton N.Y.) dentro de nitrógeno líquido, seguido por la liofilización tal com se ha descrito previamente (Johnson et al., ver más arriba). Por ejemplo, el polvo de Zn-HI seco (100 mg) se añadió a 5,8 ml de una solución 0,17 mg/ml de D,L-PLGA, descrita más arriba, en solvente de etilacetato y se homogeneizó durante 2 minutos a 8000 r.p.m. con un homogeneizador de cizalla (Vitrius Inc. Giandiner, N.Y.) con objeto de formar una suspensión uniforme de Zn-HI y polímero. El polímero y la suspensión de Zn-HI se rociaron a través de una boquilla con sonicación (Sono-Tek, Milton N.Y.) hacia un recipiente que contenía 300 ml de etanol congelado. El recipiente se colocó a continuación en un congelador a -70ºC (para elevar la temperatura hasta -70ºC) con lo cual se fundió el etanol congelado y las microesferas se endurecieron lentamente a medida que el solvente etilacetato era extraído por el etanol. Transcurridos 3 días, las microesferas endurecidas se recolectaron mediante filtración a través de una pantalla de 20 \mum y se secaron bajo nitrógeno gas durante 4 días, y finalmente se cribaron a través de una pantalla de 60 \mum.

Cromatografía

Los procedimientos de cromatografía de exclusión por tamaño (SEC) y de fase inversa (RPC) se realizaron según procedimientos publicados (Pietta, P. G. et al., J. Chromatogr., 549:367:373 (1991); Klyushnichenko V. E. et al., J. Chromatogr., 661:83-92 (1994). De forma resumida, la SEC se realizó en una columna Zorbax® con tampón fosfato como fase móvil. La HI se detectó mediante la absorción UV a 214 nm. La cromatografía de fase inversa se llevó a cabo en una columna de fase inversa C-18 usando tampón sulfato con acetonitrilo como fase móvil, a 40ºC, la HI se detectó mediante absorción UV a 214 nm tal como se ha descrito previamente (Pietta, P. G. et al., J. Chromatogr., 549:367-373 (1991); Klyushnichenko, V. E. et al., J. Chromatogr., 661:83-92 (1994).

Análisis de proteínas

La HI encapsulada se recuperó de las microesferas disolviéndolas en hidróxido sódico (NaOH) 1,0 N, y la proteína soluble se recuperó y analizó mediante absorbancias UV usando la absorbancia A determinada experimentalmente (1 mg/mL, 291 nm, 1 cm) = 1,94.

Resultados y discusión

La distribución del diámetro promedio de las partículas se midió en un Malvern Masterisizer X, y se halló que era de aproximadamente 30 micras (Tabla I). La carga de proteína de la formulación I y formulación II se halló que era respectivamente del 5,56% y 5,59% (Tabla I). El análisis de la integridad de la HI indicó que no había diferencias significativas entre la proteína antes y después de la encapsulación, según se determinó mediante un ensayo de la quinasa del receptor de la insulina (KIRA) (ver Ejemplo 7 más abajo para el procedimiento).

TABLA I Propiedades físicas de las formulaciones en microesferas de PLGA-insulina

Formulación	Carga (% w/w)	Diámetro (nm)	Proporción^{a} Insulina:Zn
Formulación I	5,56	30,2 \pm 12	1:2
Formulación II	5,59	36,6 \pm 11	1:4
^{a} proporción definida como moles de hexámero de insulina/moles de zinc.

Ejemplo 7 Liberación de la insulina a partir de microesferas de HI Introducción

Con objeto de determinar la cantidad de insulina liberada, las microesferas cargadas con insulina se incubaron en 3 condiciones diferentes, y la actividad de la proteína recuperada se analizó a diferentes intervalos de tiempo. Inicialmente, las microesferas se incubaron en tampón histidina 10 mM a pH 7,4 a 37ºC. Con objeto de medir la liberación en condiciones similares a las de la articulación, las microesferas se incubaron también en fluido sinovial o con explantes de cartílago articular. En todos los casos, las muestras se tomaron a diferentes intervalos y se analizaron midiendo la inducción de la fosforilación del receptor de la insulina en células que expresaban el receptor de la insulina humana.

Materiales y procedimientos Liberación de la insulina al tampón

Para evaluar el perfil de liberación in vitro de las formulaciones de microesferas de HI, se colocaron 20 mg de cada formulación de microesferas de HI en 500 \mul de tampón de liberación (histidina 10 mM, NaCl 10 mM, 0,02% de polisorbato 20, 0,02% de NaN_{3}, pH 7,2) y se incubó a 37ºC. La totalidad del medio de liberación se remplazó en cada intervalo de muestreo, y las muestras de liberación resultantes se almacenaron a 5ºC antes de su análisis.

Liberación de la insulina al fluido sinovial

El fluido sinovial se recolectó de ratas Sprague-Dawley machos de 7-8 semanas de edad, y se diluyó 1:2 con solución salina tamponada con fosfato (PBS). La totalidad del medio de liberación se remplazó en cada intervalo de muestreo, y las muestras resultantes se almacenaron a 5ºC antes de su análisis.

Liberación de la insulina en cultivos de explantes

El medio procedente de explantes de cartílago articular, incubados con insulina (10 nM) o microesferas de PLGA-insulina, se recolectó a diferentes intervalos de tiempo y se ensayó su actividad en el ensayo del receptor de quinasa de insulina. Las cuentas de PLGA-In se resuspendieron en 500 \mul de medio de explante, y 3 \mul de esta mezcla se añadieron a cada muestra de explante en 260 \mul de medio de explante.

Ensayo del receptor de quinasa de insulina (KIRA)

Estimulación celular: Las células ováricas de hámster chino (CHO) transfectadas con el receptor de la insulina humana se sembraron (100 \mul de 5\times10^{5} células/ml) en placas de cultivo de tejidos estériles de 96 pocillos con fondo plano (Falcon 1270) en medio (PS/20 con 5% de FBS diafiltrado y antibióticos, 1\times glutamina, 1\times penicilina/estreptomicina, 10 \mug/ml puromicina), y se incubaron durante la noche en una atmósfera humidificada de 37ºC, 95% de aire y 5% de CO_{2}. Las células se trataron a continuación con 100 \mul de muestra en medio (PS/20 con 0,5% de BSA) y se incubó durante 15 minutos a 37ºC. Se añadieron 130 \mul de tampón de lisis (NaCl 150 mM con HEPES 50 mM y 0,5% de Triton-X 100) con proteasa (AEBSF, Aprotinina 1 mM, Leupeptina 0,05 mM) e inhibidores de la fosfatasa (ortovanidato sódico, 20 mM). Las muestras se usaron a continuación para el análisis de ELISA.

Ensayo inmunoespecífico unido a enzima (ELISA): Se recubrieron las placas (inmunoplaca Maxisorp 4-39454, Nunc) con 100 \mul de 1º anticuerpo monoclonal (concentración final de 2 \mug/ml en PBS, pH 7,0) a 4ºC durante la noche. Después de retirar esta solución, se incubaron las placas con 150 \mul de tampón de bloqueo (PBS con 0,5% de BSA) durante 1 hora. A continuación se lavaron las placas tres veces con tampón de lavado (PBS con 0,05% de tween 20, pH 7,4) (Skatron Scan Washer 300). Se añadieron 80 \mul de tampón de lisis (NaCl 150 mM con HEPES 50 mM y 0,5% de Triton-X 100) y 20 \mul de muestra (procedente de más arriba) a las placas de ELISA preparadas. Las placas se incubaron a temperatura ambiente durante 2 horas con agitación moderada. Después de lavar los pocillos seis veces con tampón de lavado, las muestras se incubaron con 100 \mul de anticuerpo 2º biotinilado (4G10, concentración final de 0,1 \mug/ml en tampón de ensayo, PBS con 0,5% de BSA, 0,05% de tween 20 y EDTA 5 mM, pH 7,4) (UBI) durante 2 horas con agitación moderada. A continuación se lavaron las placas seis veces con tampón de lavado, y las muestras se incubaron con 100 \mul de estreptoavidina/HRP (diluida 1:50.000 en tampón de ensayo) (Amdex) a temperatura ambiente durante 1 hora con agitación moderada. Las placas se lavaron a continuación con tampón de lavado seis veces y se incubaron con 100 \mul de solución de sustrato (1 volumen de sustrato TMB de K&P + 1 volumen de solución de peróxido TMB de K&P, en TMB, equipo de sustrato de Kirkegard Perry). Después del desarrollo del color (10-15 minutes), se detuvo la reacción con 100 \mul de H_{3}PO_{4} 1,0 N. La O.D. a 450 nm se midió a continuación.

Resultados y discusión

El ensayo del receptor de quinasa de insulina (KIRA) es un ensayo muy sensible que mide la insulina activa. Se observó un estallido inicial (en el día 1) de liberación de proteína tanto en el tampón (Figura 12) como en el fluido sinovial (Fig. 13A). Los perfiles de liberación de la HI a partir de la formulación II (PLGA-Zn) indicaron una liberación bifásica, en donde casi el 40% de la proteína total cargada se liberaba en las primeras 24 horas, seguida por una fase de latencia (<1% de liberación diaria) y una segunda fase de liberación (2-5% liberación diaria) a los largo de los 15 días siguientes, momento en el cual se había liberada el 89% de la proteína total cargada (Figura 12). Después de la incubación en fluido sinovial durante 3 días, las microesferas de la formulación II continuaron liberando insulina activa con una concentración aproximada de 5 \muM (1,67 mg/ml total). Por tanto, estos resultados indican que la insulina activa se liberó de las microesferas cargadas, y que el proceso de formulación no parece ser perjudicial para la calidad de la proteína.

La ventaja que tal sistema de liberación lenta podría tener in vivo se ilustra mediante experimentos que ensayan la insulina y las microesferas cargadas con insulina después de su incubación con explantes de cartílago articular. En este sistema, las muestras se trataron sólo una vez, el medio se recolectó en los días siguientes, y las células eran metabólicamente activas durante el curso del experimento. De esta forma, pudo determinarse la estabilidad de la insulina en un sistema biológico relevante. Mientras que la insulina permanecía bastante estable cuando se cultivaba en medio sin tejido (a 37ºC) (Figura 14A), en presencia de cartílago articular, la cantidad de insulina activa disminuía dramáticamente. De hecho, en las 24 horas posteriores a la incubación con cartílago, la cantidad de insulina activa había disminuido en tanto como un 70%, y hacia los 4 días de cultivo, se detectó poca insulina activa (Figura 14B). Por contra, se hallaron niveles significativos de insulina activa tan tarde como 3 días después del tratamiento con PLGA-Ins (14C). Además, incluso cuando la microesferas de PLGA-Ins diluidas se incubaron con tejidos, la cantidad de insulina activa en las muestras de PLGA-Ins a los 3 días era casi 14 veces superior a la de las muestras de insulina a los 3 días (Figura 14D).

En conclusión, se ha mostrado que las microesferas de PLGA-Ins continúan liberando insulina activa a lo largo del tiempo en presencia de cartílago articular. Por tanto, la insulina permanece activa y aparentemente inalterada después de la liberación desde microesferas incubadas en un sistema biológico relevante durante varios días. Tomados en conjunto, nuestros resultados sugieren que la PLGA-Ins sería útil para el suministro local, de liberación lenta, de insulina en la articulación.

Ejemplo 8 Actividad biológica del PLGA-Ins Introducción

Para verificar que la insulina liberada de las microesferas de PLGA-Nis era activa sobre el cartílago articular, se añadieron estas microesferas a explantes de cartílago articular y se recolectó y cambió el medio (sin añadir más PLGA-Ins) cada día durante tres días. La actividad se determinó midiendo la rotura y síntesis de proteoglicanos tal como se describió más arriba para los explantes de cartílago articular (Ejemplo 2). Como control, tratamos algunas muestras de explantes con insulina reciente (10 nM) en cada cambio de medio (es decir, en los intervalos de tiempo de 0, 24 y 48 horas).

Los datos procedentes de los cultivos de explantes pueden usarse para predecir el efecto de proteínas específicas sobre el cartílago articular in vivo. Sin embargo, dentro de la articulación hay presentes varios tipos de tejidos aparte del cartílago. Además, las proteínas pueden eliminarse rápidamente del fluido sinovial. Por tanto, para determinar si la insulina liberada de las microesferas de PLGA-Ins tenía un efecto sobre el cartílago in vivo, se inyectaron articulaciones de rodilla de ratón con microesferas de PLGA-In y se midió la síntesis de proteoglicanos.

Materiales y procedimientos Efecto de las microesferas de PLGA-In sobre la liberación y síntesis de proteoglicanos

Se trataron los explantes con microesferas de PLGA-Ins (se añadieron 3 \mul de una solución de microesferas resuspendidas en 0,5 ml de medio a explantes en 260 \mul de medio) el día 0, y el medio se recolectó y remplazó (sin microesferas) en los días subsiguientes. La rotura y síntesis de proteoglicanos se midió como se describió más arriba (Ejemplo 2, "Explantes de cartílago articular"). Algunas muestras de explantes se trataron con insulina reciente (10 nM) en cada cambio de medio (es decir, en los intervalos de tiempo de 0, 24 y 48 horas).

Inyecciones intraarticulares

Las microesferas de PLGA-Ins se resuspendieron en 500 \mul de tampón (0,1% de ácido hialurónico en solución salina tamponada con fosfato), y 3 \mul de esta solución se inyectaron intraarticularmente en las articulaciones de ratón. Como control, se inyectaron 3 \mul de tampón en la rodilla contralateral. Tres días más tarde, se recolectaron las rótulas y se determinó las síntesis de proteoglicanos como más arriba (Ejemplo 3, "Ensayo de la rótula").

Resultados y discusión

Los explantes tratados con microesferas de PLGA-Ins mostraron una rotura disminuida de matriz (Figura 15A) y una síntesis incrementada (Figura 15C). Además, la capacidad de la IL-1\alpha para inducir la rotura (Figura 15B) e inhibir la síntesis de matriz (Figura 15D) fue prevenida mediante el co-tratamiento con PLGA-In (Figuras 15A-B). Finalmente, la PLGA-Ins tanto la producción basal de óxido nítrico (Figura 15E) como la inducida por IL-1\alpha (Figura 15F). Estos resultados sugieren que la PLGA-Ins podría inhibir el catabolismo y pérdida del cartílago que ocurre en los trastornos del cartílago tales como la artritis.

Tres días después de la inyección de PLGA-Ins en las articulaciones de rodilla de ratón, la síntesis de matriz esta estimulada significativamente (p < 0,05) respecto a la rodilla contralateral inyectada con tampón (Figura 16). Por tanto, incluso en condiciones en las que la insulina podría eliminarse del fluido sinovial y/o ser capturada por los tejidos y células de los alrededores, el cartílago articular tiene una respuesta anabólica a la liberación de la insulina por parte de las microesferas de PLGA-Ins.

Tomados en conjunto, nuestros resultados demuestran que la insulina mitigaba la pérdida de moléculas de la matriz, tales como los proteoglicanos, así como estimulaba la síntesis de nuevas moléculas para remplazar las pérdidas. El efecto neto fue incrementar la cantidad total de proteoglicanos en una cantidad determinada de tejido de cartílago. Este efecto de la insulina se mostró in vitro e in vivo. Finalmente, se creo una formulación de insulina de liberación lenta usando el PLGA como portador. Estas microesferas de PLGA-Ins parecen tener una estabilidad y actividad relativa superior a las de la insulina sola.

Ejemplo 9 Explantes de cartílago humano

Está claramente establecido que el sistema GH/IGF/IGFBP está implicado en la regulación de los homeostasis anabólica y metabólica, y que los defectos en este sistema podrían afectar perjudicialmente el crecimiento, fisiología y control glicémico (Jones et al., Endocr. Rev., 16:3-34 (1995); Davidson, Endocr. Rev., 8:115-131 (1987); Moses, Curr. Opin. Endo. Diab., 4:16-25 (1997)).

El IGF-1 se ha propuesto para el tratamiento o prevención de la osteoartritis a causa de su capacidad para estimular tanto la síntesis de matriz como la proliferación celular en cultivo (Osborn, J. Orthop. Res., 7:35-42 (1989)). El IGF-1 se ha administrado con polisulfato de pentosán sódico (PPS) (un inhibidor de la actividad catabólica de los condrocitos) a perros gravemente osteoartríticos, con el efecto de reducir la gravedad de la enfermedad disminuyendo los niveles de metaloproteinasa neutra activa en el cartílago. En el modelo de perros moderadamente osteoatríticos, la intervención terapéutica con IGF-1 y PPS juntos parece que mantiene exitosamente la estructura y bioquímica del cartílago, mientras que el IGF sólo era inefectivo, tal como se describe en Rogachefsky, Osteoarthritis and Cartilage, 1:105-114 (1993); Rogachefsky et al., Ann. NY Acad. Sci., 732:889-895 (1994). El uso del IGF-1, tanto solo como con un adyuvante o con otros factores de crecimiento, para estimular la regeneración del cartílago se ha descrito en WO 91/19510, WO 92/13565, patente estadounidense Pat. nº 5.444.047, y EP 434.652.

El IGF-1 también se ha hallado que es útil en el tratamiento de la osteoporosis en mamíferos que exhiben una densidad mineral del hueso disminuida, y en aquéllos expuestos a drogas o condiciones del entorno que resultan en una reducción de la densidad ósea y potencialmente en osteoporosis, tales como se describe en EP 560.723 y EP 436.469.

La insuficiencia de IGF-1 podría tener un papel etiológico en el desarrollo de la osteoartritis (Coutts et al., "Effect of growth factors on cartilage repair," en Instructional Course Lect., 47:487-494 (Amer. Acad. Orthop. Surg.: Rosemont, Ill. 1997)). Algunos estudios indican que las concentraciones de IGF-1 en suero son inferiores en pacientes osteoartríticos que en los grupos control, mientras que otros estudios no han hallado diferencias. Sin embargo, se ha mostrado que tanto los niveles de IGF-1 en suero como la respuesta de los condrocitos al IGF-1 disminuyen con la edad, siendo esta última debida probablemente a los niveles elevador de IGF-BPs (Florini and Roberts, J. Gerontol., 35:23-30 (1980); Martin et al., J. Orthop. Res., 15:491-498 (1997); Femihough et al., Arthr. Rheum., 39:1556-1565 (1996)). Por tanto, la disminuida disponibilidad del IGF-1, así como la respuesta disminuida de los condrocitos y la desregulación de los IGFBP al mismo, podrían contribuir a la homeostasis del cartílago y a la degeneración del tejido a medida que ocurre que el avance de la edad y de la enfermedad.

No se conoce la función biológica de las proteínas unidora de IGF (IGFBP). De las IGFBP, la IGFBP-3 parece ser la IGFBP más responsable de la regulación de los niveles totales de IGF-1 e IGF-2 en el plasma. La IGFBP-3 es una proteína dependiente de la GH y está reducida en los casos de deficiencia o resistencia a la GH (Jones et al., ver más arriba; Rosenfield et al., "IGF-1 treatment of syndromes of growth hormone insensitivity", en The insulin-like growth factors and their regulatory proteins, editores Baxter R C, Gluckman P D, Rosenfield R G. Excerpta Medica, Amsterdam, 1994), pp 357-464; Scharf et al., J. Hepatology, 25:689-699 (1996)). Las IGFBP son capaces de potenciar o inhibir la actividad, dependiendo en gran parte de sus modificaciones posteriores a la traducción y de la localización en tejidos (revisado en Jones y Clemmons, Endocr. Rev., 16:3-34 (1995); Collet-Solberg y Cohen, Endocrinol. Metabol. Clin. North Am., 25:591-614 (1996)). Además, la desregulación en las IGFBP (3,4 y/o 5) podría jugar un papel clave en los trastornos artríticos (Chevalier y Tyler, Brit. J. Rheum., 35:515-522 (1996); Olney et al., J. Clin. Endocrinol. Metab., 81:1096-1103 (1996); Martel-Pelletier et al., Inflamm. Res., 47:90-100 (1998)). Se ha publicado que los análogos del IGF-1 con una muy baja afinidad de unión por las IGFBP son más efectivos que el IGF-1 para estimular la síntesis de proteoglicanos (Morales, Arch Biochem. Biophys., 324:173-188 (1997)). Sin embargo, datos más recientes sugieren que la IGFBP contribuyen a la unión y transporte del IGF a través del tejido del cartílago, y, por tanto, las IGFBP regulan la biodisponibilidad de IGF-1 dentro del articulación (Bhatka et al., J. Biol. Chem., 275:5860-5866 (2000)).

WO 94/04569 descubre una molécula unidora específica, distinta de una IGFBP natural, que es capaz de unir el IGF-1 y que puede potenciar la actividad biológica de la IGF-1. WO 98/45427 publicada el 15 de octubre 1998; Lowman et al., Biochemistry, 37:8870-8878 (1998); y Dubaquie y Lowman, Biochemistry, 38:6386 (1999) describen agonistas del IGF-1 identificados mediante la exhibición sobre fago. También, WO 97/39032 descubre inhibidores de ligando de las IGFBP y procedimientos para su uso. Además, la patente estadounidense nº 5,891,722 descubre anticuerpos que tienen afinidad de unión por la IGFB-1 libre, y dispositivos y procedimientos para detectar la IGFBP-1 y una ruptura en la membrana fetal en base a la presencia de fluido amniótico en una secreción vaginal, según está indicado por la presencia de IGFBP-1 libre en la secreción vaginal.

Resultados y discusión

El IGF-1 es un regulador clave de la homeostasis de la matriz en el cartílago articular. El desequilibrio metabólico en la osteoartritis que favorece la rotura de la matriz respecto a la síntesis de nueva matriz podría deberse, al menos en parte, a la insensibilidad de los condrocitos a la estimulación con IGF-1. Aunque no se conoce el mecanismo que subyace esta resistencia al IGF-1, sin querer estar limitados por cualquier teoría, se cree que las proteínas unidoras de IGF (IGFBP), las cuales están elevadas en muchos pacientes de OA, juegan un papel. En estos pacientes, las proteínas con actividad similar a la del IGF-1, las cuales no se unen a las IGFBP y, por tanto, no son inhibidas por éstas, probablemente estimularían la reparación del cartílago en tejidos que de otro modo son resistentes al IGF-1. Tal como se ilustra en la Figura 19, se halló que al menos el 20% de los pacientes que experimentaban la sustitución articular tienen un cartílago articular que no responde al IGF-I. Sin embargo, el cartílago de estos pacientes sí que responde a la insulina, la cual no se une a la IGFBP, induciendo la síntesis significativa de nuevas moléculas de matriz del cartílago (Figuras 19A,B). El hecho de que un mutante del IGF-1, el desIGF, que no se une a las IGFBP, induzca la síntesis de matriz del cartílago en estos tejidos resistentes al IGF-1 (Figuras 19A,B), sugiere que el mecanismo que subyace la resistencia al IGF-1 en este sistema es la producción incrementada de IGFBP inhibidoras. Por tanto, el cartílago humano enfermo permanece capaz de responder a los efectos anabólicos de la insulina, y como tal, es probable que la insulina tenga efectos beneficiosos sobre el cartílago de las articulaciones enfermas. Además, se cree que la insulina tiene efectos anabólicos sobre los tejidos, tales como el cartílago artrítico, que son por otra parte resistentes al IGF-1.

Ejemplo 10 Expresión de la insulina y variantes de la insulina en E. coli

Este ejemplo ilustra la preparación de una forma no glicosilada de la insulina o de variantes de la insulina en E. coli.

La secuencia de ADN que codifica la insulina o variante de la insulina se amplifica inicialmente usando cebadores de la PCR seleccionados. Los cebadores deberían contener sitios para enzimas de restricción que corresponden a los sitios de enzima de restricción en el vector de expresión seleccionado. Podrían emplearse una variedad de vectores de expresión. Un ejemplo de un vector apropiado es el pBR322 (derivado de E. coli; ver Bolivar et al., Gene, 2:95 (1977)) el cual contiene genes para la resistencia a la ampicilina y tetraciclina. El vector se digiere con el enzima de restricción y se desfosforila. Las secuencias amplificadas mediante la PCR se ligan a continuación en el vector. El vector preferiblemente contendrá secuencias que codifican un gen de la resistencia a antibiótico, un promotor trp, un líder poli-his (incluyendo los primeros seis codones STII, la secuencia poli-his, y el sitio de corte per enteroquinasa), la región codificante de NPOR, el terminado transcripcional lambda, y un gen argU.

La mezcla de ligación se usa entonces para transformar una cepa de E. coli usando los procedimientos descritos en Sambrook et al., ver más arriba. Los transformantes se identifican por su capacidad para crecer sobre placas LB y a continuación se seleccionan las colonias resistentes al antibiótico. El ADN plasmídico puede aislarse y confirmarse mediante análisis de restricción y secuenciación del ADN.

Los clones seleccionados pueden dejarse crecer en medio de cultivo líquido, tal como el caldo LB suplementado con antibióticos. El cultivo nocturno podría usarse subsiguientemente para inocular un cultivo a mayor escala. Las células se hacen crecer hasta una densidad óptica deseada, durante el crecimiento el promotor de la expresión está activado.

Después de cultivar las células durante varias horas más, las células pueden recolectarse mediante centrifugación. El precipitado de células obtenido mediante la centrifugación puede solubilizarse usando varios agentes conocidos en la técnica, y la proteína de insulina o variante de la insulina puede purificarse entonces usando una columna quelante de metales en condiciones que permiten la unión fuerte de la proteína.

La insulina o variantes de la insulina podrían expresarse también en E. coli en una forma etiquetada con poli-His usando el procedimiento siguiente. El ADN que codifica la insulina o variante de la insulina se amplifica inicialmente usando cebadores de la PCR seleccionados. Los cebadores contienen sitios para enzimas de restricción que corresponden a los sitios de enzima de restricción en el vector de expresión seleccionado, y otras secuencias útiles que proporcionan el inicio de la traducción eficiente y fiable, la purificación rápida en una columna de quelación de metal, y la eliminación proteolítica con enteroquinasa. Las secuencias etiquetadas con poli-His y amplificadas mediante la PCR se ligan a continuación en un vector de expresión, el cual se usa para transformar un huésped de E. coli basado en la cepa 52 (W3110 fuhA(tonA) lon galE rpoHts(htpRts) clpP(lacIq). Los transformantes se hacen crecer primero en LB que contiene 50 mg/ml de carbenicilina a 30ºC con agitación hasta que se alcanza una O.D.600 de 3-5. Los cultivos se diluyen a continuación 50-100 veces con medio CRAP (preparado mezclando 3,57 g de (NH_{4})_{2}SO_{4}, 0,71 g de citrato sódico 2H_{2}O, 1,07 g de KCl, 5,36 g de extracto de levadura de Difco, 5,36 g de hicasa SF de Sheffield en 500 ml de agua, así como MPOS 110 mM, pH 7,3, 0,55% (w/v) de glucosa y MgSO_{4} 7 mM), y se hacen crecer durante aproximadamente 20-30 horas a 30ºC con agitación. Se retiran muestras para verificar la expresión mediante análisis con SDS-PAGE, y el volumen del cultivo se centrifuga para precipitar las células. Los precipitados de células se congelan hasta su purificación y plegado.

La pasta de E. coli procedente de fermentaciones de 0,5 a 1 l (6-10 g de precipitado) se resuspendió en 10 volúmenes (p/v) en tampón guanidina 7 M, Tris 20 mM, pH 8. Se añaden sulfito sódico y tetrationato sódico sólidos hasta conseguir unas concentraciones finales respectivamente de 0,1 M y 0,02 M, y la solución se agita durante la noche a 4ºC. Este paso resulta en una proteína desnaturalizada con todos los residuos cisteína bloqueados por sulfitolización. La solución se centrifuga a 40.000 r.p.m. en una ultracentrífuga Beckman durante 30 minutos. El sobrenadante se diluye con 3-5 volúmenes de tampón de columna de quelato de metal (guanidina 6 M, Tris 20 mM, pH 7,4) y se filtra a través de filtros de 0,22 micras para clarificarlo. Dependiendo de la condición, el extracto clarificado se carga sobre una columna de 5 ml de quelato de metal Qiagen Ni-NTA equilibrada en el tampón de columna de quelato de metal. La columna se lava con tampón adicional que contiene imidazol 50 mM (Calbiochem, categoría Utrol), pH 7,4. La proteína se eluye con tampón que contiene imidazol 250 mM. Las fracciones que contenían la proteína deseada se juntaron y almacenaron a 4ºC. La concentración de proteína se estima por su absorbancia a 280 nm usando el coeficiente de extinción basado en su secuencia de aminoácidos.

Las proteínas de pliegan de nuevo diluyendo la muestra lentamente en tampón de replegado recién preparado, consistente en: Tris 20 mM, pH 8,6, NaCl 0,3 M, urea 2,5 M, cisteína 5 mM, glicina 20 mM y EDTA 1 mM. Los volúmenes de replegado se escogen de forma que la concentración final de proteína está entre 50 y 100 microgramos/ml. La solución de replegado se agita suavemente a 4ºC durante 12-36 horas. La reacción de replegado se detiene mediante la adición de TFA hasta una concentración final de 0,4% (pH de aproximadamente 3). Antes de la purificación adicional de la proteína, la solución se filtra a través de un filtro de 0,22 micras y se añade acetonitrilo hasta una concentración final de 2-10%. La proteína replegada se cromatografía sobre una columna de fase inversa Poros R1/H, usando un tampón de fase móvil con 0,1% de TFA, con elución con un gradiente del 10 al 80%. Las alícuotas de las fracciones con absorbancia A280 se analizaron en geles de SDS-poliacrilamida y se juntaron las fracciones que contenían proteína homogénea replegada. Generalmente, las especies correctamente replegadas de la mayoría de las proteínas se eluyen con las concentraciones más bajas de acetonitrilo, puesto que estas especies son las más compactas con sus interiores hidrofóbicos apantallados de las interacciones con la resina de fase inversa. Las especies agregadas se eluyen usualmente con concentraciones de acetonitrilo más elevadas. Además de resolver las formas plegadas incorrectamente de las proteínas respecto la forma deseada, el paso de fase inversa también elimina la endotoxina de las muestras.

Las fracciones que contienen respectivamente las proteínas de insulina o variante de la insulina plegadas deseadas se juntan y el acetonitrilo se elimina usando una corriente de nitrógeno delicada dirigida hacia la solución. Las proteínas se formulan en Hepes 20 mM, pH 6,8 con cloruro sódico 0,14 M y 4% de manitol mediante diálisis o mediante filtración en gel usando resinas G25 Superfine (Pharmacia) equilibradas en el tampón de formulación y esterilizadas mediante filtración.

Ejemplo 11 Expresión de la insulina y variantes de la insulina en células de mamífero

Este ejemplo ilustra la preparación de una forma potencialmente glicosilada de la insulina o de las variantes de la insulina mediante la expresión recombinante en células de mamífero.

El vector, pRK5 (consultar EP 307,247, publicada el 15 de marzo de 1989), se emplea como el vector de expresión. Opcionalmente, el ADN de la insulina o de la variante de la insulina se liga en pRK5 con enzimas de restricción seleccionados para permitir la inserción del ADN de la insulina o de la variante de la insulina usando procedimientos de ligación tales como los descritos en Sambrook et al., ver más arriba. El vector resultante se denomina, por ejemplo, pRK5-ins.

En una realización, las células huéspedes seleccionadas podrían ser células 293. Las células 293 humanas (ATCC CCL 1573) se hacen crecer hasta su confluencia en placas de cultivo de tejidos, en medios tales como el DMEM suplementado con suero fetal bovino y opcionalmente con componentes nutritivos y/o antibióticos. Aproximadamente 10 \mug de ADN de pRK5-ins se mezclan con aproximadamente 1 \mug de AND que codifica el gen VA RNA [Thimmappaya et al., Cell, 31:543 (1982)] y se disolvieron en 500 \mul de Tris-HCl 1 mM, EDTA 0,1 mM y CaCl_{2} 0,227 M. A esta mezcla se le añaden, gota a gota, 500 \mul de HEPES 50 mM (pH 7,35), NaCl 280 mM, NaPO_{4} 1,5 mM, y se deja formar un precipitado durante 10 minutos a 25ºC. El precipitado se resuspende y añade a las células 293 y se deja reposar durante aproximadamente cuatro horas a 37ºC. Se aspira el medio de cultivo, y se añaden 2 ml de glicerol al 20% en PBS durante 30 segundos. A continuación, se lavan las células 293 con medio sin suero, se añade medio reciente, y se incuban las células durante aproximadamente 5 días.

Aproximadamente 24 después de las transfecciones, el medio de cultivo se retira y se remplaza con medio de cultivo (solo) o medio de cultivo que contiene 200 \muCi/ml de ^{35}S-cisteína y 200 \muCi/ml de ^{35}S-metionina. Después de una incubación de 12 horas, el medio condicionado se recolecta, se concentra en un spin-filtro, y se carga sobre un gel de SDS al 15%. El gel procesado podría sercarse y exponerse a una película durante un período de tiempo seleccionado para revelar la presencia del polipéptido de la insulina o de la variante de la insulina. Los cultivos que contienen células transfectadas podrían experimentar una incubación adicional (en medio libre de suero) y el medio se ensaya en bioensayos seleccionados.

En una técnica alternativa, la insulina o variante de la insulina podría introducirse en células 293 transitoriamente usando el procedimiento del dextrano sulfato descrito por Somparyrac et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 12:7575 (1981). Las células 293 se hacen crecer hasta la densidad máxima en un frasco rotatorio y se añaden 700 \mug de ADN de pRK5-ins. Las células se concentraron primero a partir del frasco rotatorio mediante centrifugación y lavado con PBS. El precipitado de ADN-dextrano se incuba sobre el precipitado de células durante cuatro horas. Las células se trataron con 20% de glicerol durante 90 segundos, se lavaron con medio de cultivo de tejidos, y se reintrodujeron en el frasco rotatorio que contenía medio de cultivo de tejidos, 5 \mug/ml de insulina bovina y 0,1 \mug/ml de transferrina bovina. Después de aproximadamente cuatro días, el medio condicionado se centrifugó y filtró para retirar las células y los restos. La muestra que contenía la insulina o la variante de la insulina expresada puede concentrarse entonces y purificarse mediante cualquier procedimiento seleccionado, tales como la diálisis y/o la cromatografía en columna.

En otra realización, la insulina o la variante de la insulina puede expresarse en células CHO. El pRK5-ins puede transfectarse al interior de células CHO usando reactivos conocidos tales como el CaPO_{4} o el DEAE-dextrano. Tal como se ha descrito más arriba, los cultivos de células pueden incubarse, y el medio remplazarse con medio de cultivo (solo) o medio que contiene una marca radiactiva tal como la ^{35}S-metionina. Después de determinar la presencia de insulina o de la variante de la insulina, el medio de cultivo podría remplazarse con medio sin suero. Preferiblemente, los cultivos se incuban durante aproximadamente 6 días, y a continuación se recolecta el medio condicionado. El medio que contiene la insulina o la variante de la insulina expresada puede concentrarse entonces y purificarse mediante cualquier procedimiento seleccionado.

La insulina o la variante de la insulina etiquetada con un epítopo podría expresarse también en células CHO huéspedes. La insulina o la variante de la insulina podría subclonarse fuera del vector pRK5. El inserto del subclón puede experimentar la PCR para fusionarse en pauta con una etiqueta de epítopo seleccionada, tal como una etiqueta poli-His en un vector de expresión en Baculovirus. A continuación, la insulina o la variante de la insulina marcada con poli-His puede subclonarse en un vector dirigido por el SV40, que contiene un marcador de la selección´tal como la DHFR para la selección de clones estables. Finalmente, las células CHO pueden transfectarse (tal como se ha descrito más arriba) con el vector dirigido por el SV40. El marcado podría realizarse, tal como se ha descrito más arriba, para verificar la expresión. El medio de cultivo que contiene la insulina o la variante de la insulina etiquetada con poli-His expresada puede concentrarse a continuación y purificarse mediante cualquier procedimiento seleccionado, tal como la cromatografía de afinidad con Ni^{2+}-quelato.

La insulina o la variante de la insulina podría expresarse también en células CHO y/o en células COS mediante un procedimiento de expresión transitoria, o en células CHO mediante otro procedimiento de expresión estable.

La expresión estable en células CHO podría realizarse usando el procedimiento esquematizado más abajo. Las proteínas podrían expresarse, por ejemplo, bien (1) como una construcción con IgG (inmunoadhesión), en la cual las secuencias codificantes para las formas estables (por ejemplo, los dominios extracelulares) de las proteínas respectivas se fusionan a una secuencia de región constante de la IgG que contiene el dominio gozne CH2 y/o (2) una forma etiquetada con poli-His.

A continuación de la amplificación mediante la PCR, los ADN respectivos se subclonan en un vector de expresión en CHO usando técnicas estándares tales como las descritas en Ausubel et al., Current Protocols of Molecular Biology, unidad 3,16, John Wiley and Sons (1997). Los vectores de expresión en CHO están construidos para hacer compatible los sitios de restricción 5' y 3' del ADN de interés para permitir la transferencia apropiada de ADNc. Las vector de expresión usado en las células CHO es tal como se describe en Lucas et al., Nucl. Acids Res., 24:1774-1779 (1996), y usa el promotor temprano/potenciador del SV40 para dirigir la expresión del ADNc de interés y la dihidrofolato reductasa
(DHFR). La DHFR permite la selección para un mantenimiento estable del plásmido a continuación de la transfección.

Doce microgramos del ADN de plásmido deseado se introdujeron en aproximadamente 10 millones de células CHOP usando los reactivos de transfección disponibles comercialmente Superfect® (Quiagen), Dosper® o Fugene® (Boehringer Mannheim). Las células se hicieron crecer tal como se describe en Lucas et al., ver más arriba. Aproximadamente 3\times10^{-7} de células se congelaron en un ampolla para su ulterior crecimiento y producción tal como se describe más abajo.

Las ampollas que contenían el ADN plasmídico se descongelaron colocándolas en un baño de agua y se mezclaron mediante vórtice. El contenido se pipeteó en un tubo de centrífuga que contenía 10 ml de medio y se centrifugó a 1000 r.p.m. durante 5 minutos. Se aspiró el sobrenadante y las células se resuspendieron en 10 ml de medio selectivo (PS20 filtrado con 0,2 \mum, con 5% de suero fetal bovino diafiltrado con 0,2 \mum). A continuación se alicuotaron las células en un frasco rotatorio de 100 ml que contenía 90 ml de medio selectivo. Transcurridos 1-2 días, las células se transfirieron a un frasco rotatorio de 250 ml relleno con 150 ml de medio de cultivo selectivo, y se incubaron a 37ºC. Después de otros 2-3 días, se sembraron frascos rotatorios de 250 ml, 500 ml y 2000 ml con 3\times10^{5} células/ml. El medio de las células se remplazó con medio fresco mediante centrifugación y resuspensión en medio de producción. Aunque podría emplearse cualquier medio de CHO apropiado, en la realidad podría emplearse un medio de producción descrito en la patente estadounidense nº 5.122.469, concedida 16 de junio de 1992. Se siembra un frasco rotatorio de producción de 3 l a 1,2\times10^{6} células/ml. El día 0, se determina el número de células y el pH. El día 1, se muestrea el frasco rotatorio y se empieza la inyección de aire filtrado. El día 2, se muestrea el frasco rotatorio, se cambia la temperatura a 33ºC, y se toman 30 ml de 500 g/l de glucosa y 0,6 ml de antiespumante al 10% (por ejemplo, emulsión de polidimetilsiloxano al 35%, Dow Corning 365 Medical Grade Emulsion). A través de la producción, se ajusta el pH según sea necesario para mantenerlo alrededor de 7,2. Después de 10 días, o hasta que la viabilidad cae por debajo del 70%, el cultivo de células se recolecta mediante centrifugación y se filtra a través de un filtro de 0,22 \mum. El filtrado se almaceno a 4ºC o inmediatamente se cargó en columnas para su purificación.

Para las construcciones etiquetadas con poli-His, las proteínas se purifican usando una columna Ni-NTA (Qiagen). Antes de la purificación, se añade imizadol al medio condicionado hasta una concentración de 5 mM. El medio condicionado se bombea sobre una columan de 6 ml de Ni-NTA equilibrada en tampón HEPES 20 mM, pH 7,4, que contiene NaCl 0,3 M y imidazol 5 mM imidazole, a una velocidad de flujo de 4-5 ml/min, a 4ºC. Después de cargada, se lava la columan con tampón de equilibrado adicional y se eluye la proteína con tampón de equilibrio que contiene imidazol 0,25 M. La proteína altamente purificada se desala a continuación en un tampón de almacenamiento, que contiene HEPES 10 mM, NaCl 0,14 M y 4% de manitol, pH 6,8, con una columna de 25 ml de G25 Superfine (Pharmacia), y se almacena a -80ºC.

Las construcciones inmunoadhesinas (que contienen Fc) se purifican del medio condiciona como sigue. El medio condicionado se bombea sobre una columna de 5 ml de Proteína A (Pharmacia) la cual se ha equilibrado en tampón fosfato sódico 20 mM, pH 6,8. Después de cargada, se lava la columna se lava extensivamente con tampón de equilibrado con ácido cítrico 100 mM, pH 3,5. La proteína eluída se neutraliza inmediatamente recogiendo fracciones de 1 ml en tubos que contienen 275 \mul de tampón TRIS 1 M, pH 9. La proteína altamente purificada se desala a continuación en tampón de almacenamiento, tal como se ha descrito más arriba para las proteínas etiquetadas con poli-His. La homogeneidad se verifica mediante geles de SDS-poliacrilamida y mediante secuenciación N-terminal por la degradación de Edman.

Ejemplo 12 Expresión de la insulina y variantes de la insulina en levadura

El procedimiento siguiente describe la expresión recombinante de la insulina o de la variante de la insulina en levadura.

En primer lugar, los vectores de expresión se construyen para la producción intracelular o la secreción de la insulina o de la variante de la insulina a partir del promotor ADH2/GAPDH. El ADN que codifica la insulina o variante de la insulina y el promotor se insertan en los sitios de enzimas de restricción apropiados en el plásmido seleccionado para dirigir la expresión intracelular del inserto. Para la secreción, el ADN que codifica el inserto puede clonarse dentro del plásmido seleccionado para la expresión del inserto, junto con el ADN que codifica el promotor ADH2/GAPDH, un péptido señal nativo u otro péptido señal de mamífero heterólogo, o, por ejemplo, un factor-alfa o secuencia señal/líder secretora de levadura, y secuencias de engarce (si se necesitas).

Las células de levadura, tales como la cepa de levadura AB110, pueden transformarse a continuación con los plásmidos de expresión descritos más arriba y cultivarse en el medio de fermentación seleccionado. Los sobrenadantes de las levaduras transformadas pueden analizarse mediante precipitación con ácido tricloroacético al 10% y separación con SDS-PAGE, seguida por la tinción de los geles con colorante Coomassie Blue.

La insulina o la variante de la insulina recombinantes pueden aislarse y purificarse a continuación retirando las células de levadura del medio de centrifugación y concentrando a continuación el medio usando los filtros en cartucho seleccionados. El concentrado que contiene el polipéptido crudo podría purificarse adicionalmente usando resinas de cromatografía en columna seleccionadas.

Ejemplo 13 Expresión de la insulina o de la variante de la insulina en células de insecto infectadas con baculovirus

El procedimiento siguiente describe la expresión recombinante de la insulina o de la variante de la insulina en células de insecto infectadas con baculovirus.

La secuencia que codifica la insulina o la variante de la insulina se fusiona cadena arriba de una etiqueta de epítopo contenida dentro de un vector de expresión de baculovirus. Tales etiquetas de epítopo incluyen las etiquetas poli-His y las etiquetas de inmunoglobulina (como las regiones Fc de IgG). Podrían emplearse una variedad de plásmidos, incluyendo los plásmidos derivados de plásmidos disponibles comercialmente, tales como el pVL1393 (Novagen). De forma resumid, la secuencia que codifica la insulina o la variante de la insulina, o la porción deseada de la secuencia codificante de este polipéptido (tal como la secuencia que codifica el dominio extracelular de una proteína transmembrana, o la secuencia que codifica la proteína madura si la proteína es extracelular) se amplifica mediante la PCR con cebadores complementarios de las regiones 5' y 3'. El cebador en 5' podría incorporar sitios de enzimas de restricción (seleccionados) flanqueantes. El producto se digiere entonces con esos enzimas de restricción y se subclona en el vector de expresión.

El baculovirus recombinante se genera cotransfectando el plásmido anterior y el ADN del virus BaculoGold® (Pharmingen) en células de Spodoptera frugiperda ("Sf9") (ATCC CRL 1711) usando la lipofectina (disponible comercialmente de GIBCO-BRL). Después de 4-5 días de incubación a 28ºC, los virus liberados se recolectan y usan para amplificaciones adicionales. La infección viral y la expresión de proteínas se realiza tal como describieron O'Reilley et al., Baculovirus expression vectors: A Laboratory Manual, Oxford: Oxford University Press (1994).

La insulina o la variante de la insulina etiquetada con poli-His expresada pueden purificarse entonces, por ejemplo, mediante la cromatografía de afinidad con Ni^{2+}-quelato como sigue. Los extractos se prepararon a partir de células Sf0 infectadas con virus recombinantes tal como describieron Rupert et al., Nature, 362:175-179 (1993). De forma resumida, las células Sf9 se lavaron, resuspendieron en tampón de sonicación (25 ml Hepes, pH 7,9; MgCl_{2} 12,5 mM; EDTA 0,1 mM; 10% de glicerol; 0,1% de NP-40; KCl 0,4 M), y se sonicaron dos veces durante 20 segundos en hielo. Los sonicados se clarificaron mediante centrifugación, y el sobrenadante se diluyó 50 veces en tampón de carga (fosfato 50 mM, NaCl 300 mM, 10% de glicerol, pH 7,8) y se filtró a través de un filtro de 0,45 \mum. Se preparó una columna de Ni^{2+} -NTA agarosa (disponible comercialmente de Qiagen) con un volumen de lecho de 5 ml, se lavó con 25 ml de agua, y se equilibró con 25 ml de tampón de carga. El extracto de células filtrado se cargó sobre la columna a 0,5 ml por minuto. La columna se lavó con tampón de carga hasta obtener una línea base a A_{280}, momento en el que se inició la recolección de fracciones. A continuación, la columna se lavó con un tampón de lavado secundario (fosfato 50 mM; NaCl 300 mM, 10% de glicerol, pH 6,0), el cual eluye no específicamente la proteína unida. Después de alcanzar de nuevo la línea base a A_{280}, se reveló la columna con un gradiente de imidazol de 0 a 500 mM en el tampón de lavado secundario. Se recolectaron fracciones de un ml y se analizaron mediante SDS-PAGE y tinción con plata, o transferencia Western con Ni^{2+} -NTA-conjugado con la fosfatasa alcalina (Qiagen). Las fracciones que contienen la insulina o la variante de la insulina etiquetada con His_{10} se juntaron y dializaron de nuevo frente a tampón de
carga.

Alternativamente, la purificación de la insulina o de la variante de la insulina etiquetada con IgG (o etiquetada con Fc) puede realizarse usando técnicas de cromatografía conocidas, incluyendo por ejemlo la cromatografía con columna de Proteína A o de Proteína G.

Todavía de forma alternativa, las moléculas de insulina o de la variante de insulina de la invención podrían expresarse usando un procedimiento de baculovirus modificado que emplea células Hi-5. En este procedimiento, el ADN que codifica la secuencia deseada se amplificó con sistemas apropiados, tales como el Pfu (Stratagene), o se fusionó cadena arriba (5'-of) de una etiqueta de epítopo contenida dentro del vector de expresión baculovirus. Tales etiquetas de epítopo incluyen las etiquetas poli-His y las etiquetas de inmunoglobulina (como las regiones Fc de IgG). Podrían emplearse una variedad de plásmidos, incluyendo los plásmidos derivados de plásmidos disponibles comercialmente, tales como el pIE-1 (Novagen). Los vectores pIE11 y pIE1-2 están diseñados para la expresión constitutiva de proteínas recombinantes a partir del promotor ie1 de baculovirus en células de insectos transformadas de forma estable. Los plásmidos difieren solamente en la orientación de los múltiples sitios de clonación, y contienen todas las secuencias promotores que se sabe son importantes para la expresión de genes mediada por el ie1 en células de insecto no infectadas, así como el elemento potenciador hr5. pIE1-1 y pIE1-2 incluyen el sitio ie1 de inicio de la traducción y pueden usarse para producir proteínas de fusión. De forma resumida, la secuencia deseada, o la porción deseada de la secuencias (tal como la secuencia que codifica el dominio extracelular de la proteína transmembrana) se amplifica mediante la PCR con cebadores complementarios de las regiones 5' y 3'. El cebador en 5' podría incorporar sitios de enzimas de restricción (seleccionados) flanqueantes. El producto se digiere entonces con esos enzimas de restricción seleccionados y se subclona en el vector de expresión. Por ejemplo, los derivados de pIE1-1 pueden incluir la región Fc de la IgG humana (pb.PH.IgG) o una etiqueta de 8-histidina (pb.PH.His) cadena abajo (3'-of) de la secuencia deseada. Preferiblemente, la construcción del vector se secuencia para su confirmación.

Las células Hi5 se hacen crecer hasta un 50% de confluencia en las condiciones de 27ºC, sin CO_{2}, sin penicilina/estreptomicina. Para cada placa de 150 mm, se mezclaron 30 \mug de vector basado en pIE, que contenía la secuencia, con 1 ml de medio Ex-Cell (Medio: Ex-Cell 401 + 1/100 L-Glu JRH Biosciences #14401-78P (nota: este medio es sensible a la luz)). De forma separada, se mezclaron 100 \mul de Cell Fectin (CellFECTIN, Gibco BRL+10362-010, previamente agitada con vórtice) con 1 ml de medio Ex-Cell. Las dos soluciones se combinaron e incubaron a temperatura ambiente durante 15 minutos. Se añadieron 8 ml de medio Ex-Cell a los 2 ml de mezcla DNA/CellFECTIN, y ésta se depositó sobre células Hi5 que se habían lavado una vez con medio Ex-Cell. A continuación se incubó la placa a oscuras durante 1 hora a temperatura ambiente. La mezcla DNA/CellFECTIN se aspira entonces, y las células se lavan una vez con Ex-Cell para retirar el exceso de Cell FECTIN. Se añaden 30 ml de medio Ex-Cell nuevo y las células se incubaron durante 3 días a 28ºC. Se recolecta el sobrenadante y se determina la expresión de la secuencia en el vector de expresión en baculovirus mediante la unión por lotes de 1 ml de sobrendante a 25 ml de cuentas de Ni-NTA (QIAGEN) para las proteínas etiquetadas con histidina, y de cuentas de Proteína-A Sepharose CL-4B (Pharmacia) para las proteínas etiquetadas con IgG, seguido por análisis mediante SDS-PAGE, comparando con un estándar de concentración conocida de proteína mediante la tinción con azul de Coomassie.

El medio condicionado procedente de las células transfectadas (de 0,5 a 3 l) se recolectó mediante centrifugación para retirar las células y se filtró a través de filtros de 0,22 micras. Para las construcciones etiquetadas con poli-His, las proteínas que comprenden la secuencia se purifican usando una columna Ni-NTA (Qiagen). Antes de la purificación, imidazol a una velocidad de flujo de 4-5 ml/min a 48ºC. Después de cargada, se lava la columna con tampón de equilibrio adicional y se eluye la proteína con tampón de equilibrio que contiene imidazol 0,25 M. La proteína altamente purificada se desaló a continuación en un tampón de almacenamiento, que contenía HEPES 10 mM, NaCl 0,14 M y 4% de manitol, pH 6,8, con una columna de 25 ml de G25 Superfine (Pharmacia), y se almacenó a -80ºC.

Las construcciones de inmunoadhesión (que contienen Fc) también podrían purificarse del medio condicionado como sigue: el medio condicionado se bombea sobre una columna de 5 ml de Proteína A (Pharmacia) la cual se ha equilibrado en tampón fosfato sódico 20 mM, pH 6,8. Después de cargada, se lava la columna extensivamente con tampón de equilibrio con ácido cítrico 100 mM, pH 3,5. La proteína eluida se neutraliza inmediatamente recogiendo fracciones de 1 ml en tubos que contienen 275 \mul de tampón TRIS 1 M, pH 9. La proteína altamente purificada se desala a continuación en tampón de almacenamiento, tal como se ha descrito más arriba para las proteínas etiquetadas con poli-His. La homogeneidad se verifica mediante geles de SDS-poliacrilamida y mediante secuenciación N-terminal por la degradación de Edman.

Ejemplo 14 Preparación de anticuerpos unen la insulina o las variantes de la insulina

Este ejemplo ilustra la preparación de anticuerpos monoclonales que pueden unir específicamente la insulina o las variantes de la insulina

Las técnicas para producir los anticuerpos monoclonales son conocidas en la técnica y se describen, por ejemplo, en Goding, ver más arriba. Los inmunogenes que podrían emplearse incluyen la insulina o variantes de la insulina purificadas, las proteínas de fusión que contienen insulina o variantes de la insulina, y las células que expresan la insulina o variantes de la insulina recombinantes sobre la superficie de la célula. La selección del inmunogén puede realizarla el especialista capacitado sin experimentación indebida.

Los ratones, tales como los Balb/c, se inmunizan con el inmunogén de insulina o de la variante de la insulina emulsionado en adyuvante completo de Freund, y se inyecta subcutánea o intraperitonealmente en una cantidad de 1-100 microgramos. Alternativamente, el inmunogén se emulsiona en adyuvante MPL-TDM (Ribi Immunochemical Research, Hamilton, Mont.) y se inyecta en la planta de los pies de las patas traseras del animal. A continuación, los ratones inmunizados se refuerzan de 10 a 12 días más tarde con inmunogén adicional emulsionado en el adyuvante seleccionado. A partir de entonces, durante varias semanas, los ratones podrían reforzarse también con inyecciones de inmunización adicionales. Podrían obtenerse periódicamente muestras de suero de los ratones mediante sangrado retroorbital para ensayar en ensayos de ELISA para detectar los anticuerpos anti-insulina o anti-variante de la insulina.

Una vez se ha detectado un título de anticuerpo apropiado, los animales "positivos" para los anticuerpos pueden inyectarse con una inyección final intravenosa de insulina o de la variante de la insulina. Tres o cuatro días más tarde, se sacrifican los ratons y se recuperan las células del bazo. Las células del bazo se fusionan entonces (usando polietilenglicol al 35%) a una línea celular de mieloma múrido seleccionada, tal como P3\times63AgU.1, disponible de ATCC, No. CRL 1597.

Las fusiones generan células de hibridoma que pueden sembrarse en placas de cultivo de tejidos de 96 pocillos que contienen medio HAT (hipoxantina, aminopterina y timidina) para inhibir la proliferación de células no fusionadas, híbridos de mieloma, e híbridos de las células del bazo.

Las células de hibridoma se examinan en un ELISA por su reactividad contra la insulina o variante de la insulina. La determinación de células de hibridoma "positivas" que secretan los anticuerpos monoclonales deseados contra la insulina o la variante de la insulina se halla dentro de los conocimientos del campo.

Las células de hibridoma positivas pueden inyectarse intraperitonealmente en ratones singéneicos Balb/c para producir ascites que contienen anticuerpos monoclonales anti-insulina o anti-variante de la insulina. Alternativamente, las células de hibridoma pueden hacerse crecer en frascos de cultivo de tejidos o en botellas rodantes. La purificación de los anticuerpos monoclonales producidos en los ascites puede conseguirse usnado la precipitación con sulfato, seguida por la cromatografía de exclusión en gel. Alternativamente, puede emplearse la cromatografía de afinidad basada en la unión del anticuerpo a la Proteína A o a la Proteína G.

Ejemplo 15 Purificación de los polipéptidos de la insulina o de la variante de la insulina usando anticuerpos específicos

Los polipéptidos nativos o recombinantes de la insulina o de la variante de la insulina podrían purificarse mediante una variedad de técnicas estándares en el campo de la purificación de proteínas. Por ejemplo, el polipéptido de la pro-insulina o de la variante de la pro-insulina, el polipéptido de la insulina o de la variante de la insulina madura, o el polipéptido de la pre-insulina/variante de la pre-insulina, pueden purificarse por cromatografía de inmunoafinidad usando anticuerpos específicos para el polipéptido de interés. En general, la columna de inmunoafinidad se construye mediante el acoplamiento covalente del anticuerpo anti-insulina o anti-variante de la insulina a una resina cromatográfica activada.

Las inmunoglobulinas policlonales se preparan a partir de suero inmune mediante la precipitación con sulfato amónico o mediante la purificación sobre Proteína A inmovilizada (Pharmacia LKB Biotechnology, Piscataway, N.J.). De igual forma, los anticuerpos monoclonales se preparan a partir de fluido ascítico de ratón mediante precipitación con sulfato amónico o cromatografía con Proteína A inmovilizada. La inmunoglobulina parcialmente purificada se une covalentemente a una resina cromatográfica tal como la SEPHAROSE^{TM} activada con CnBr (Pharmacia LKB Biotechnology). El anticuerpo se une a la resina, se bloquea la resina, y la resina derivatizada se lava de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

Una columna de inmunoafinidad tal se utiliza en la purificación del polipéptido de la insulina o de la variante de la insulina preparando una fracción a partir de células que contienen el polipéptido de la insulina o de la variante de la insulina en una forma soluble. Esta preparación se deriva mediante solubilización de la célula completa o de una fracción subcelular obtenida a través de la centrifugación diferencial mediante la adición de detergente o mediante otros procedimientos conocidos en la técnica. Alternativamente, el polipéptido soluble de la insulina o de la variante de la insulina que contiene una secuencia de señal podría secretarse en una cantidad útil en el medio en el cual se hacen crecer las células.

Una preparación que contiene el polipéptido soluble de la insulina o de la variante de la insulina se pasa a través de la columna de inmunoafinidad, y la columna se lava en condiciones que permiten la absorbancia preferente del polipéptido de la insulina o de la variante de la insulina (por ejemplo, con tampones de fuerza iónica elevada en presencia de detergente). A continuación, la columna se eluye en condiciones que interrumpen la unión anticuerpo/antígeno (por ejemplo, un tampón a bajo pH, tal como aproximadamente a pH 2-3, o una concentración elevada de un caotropo, tal como la urea o el ión tiocianato), y se recolecta un polipéptido de la insulina o de la variante de la insulina

Ejemplo 16 Diseño racional de fármacos

La función del diseño racional de fármacos es producir análogos estructurales de los polipéptidos biológicamente activos de interés (es decir, un polipéptido de la insulina o de la variante de la insulina) o de pequeñas moléculas con las cuales interacciona, por ejemplo, agonistas, antagonistas o inhibidores. Cualquiera de estos ejemplos puede usarse para diseñar fármacos que son formas más activas o estables del polipéptido de la insulina o de la variante de la insulina, o que potencian o interfieren con la función de este polipéptido in vivo (Hodgson, Bio/Technology, 9:19-21 (1991)).

La insulina consiste en una cadena A (21 aminoácidos) y una cadena B (30 aminoácidos) que están unidas a través de un par de enlaces disulfuro. Entre especies de vertebrados diferentes existen pequeñas diferencias en la estructura primaria de la insulina (Ver el diagrama 1, reproducido del libro [Hadley, M. E. Endocrinology, Prentice-Hall, Inc., 1988]. En los mamíferos, estas diferencias están usualmente en las posiciones 8, 9 y 10 dentro del enlace disulfuro intracadena de la cadena A, y en la posición 30 de la cadena B. Aunque estas diferencias no parecen afectar la potencia biológica, pueden ser suficiente para hacer la insulina antigénica en algunos pacientes [Hadley, M. E., ver más arriba]. Pueden crearse variantes de la insulina que varían en su tiempo de acción. Por ejemplo, una forma de la insulina de acción rápida se crea invirtiendo los aminoácidos 28 y 29 en la cadena B de la insulina (Humalog, Insulin Lispro Injection, Eli Lilly). Alternativamente, cuando la insulina se formula como una suspensión amorfa y cristalina con zinc, resulta una insulina de acción intermedia, con un inicio lento y una larga duración de la actividad (hasta 24 horas). (humulin L, Lente, Eli Lilly). La cantidad de información sobre la secuencia primaria de aminoácido de la insulina, así como los datos clínicos sobre reacciones inmunes en humanos contra la insulina exógena, podrían ayudar en el diseño de las variantes de la insulina.

En una estrategia, se determina la estructura tridimensional del polipéptido de la insulina o de la variante de la insulina, o de este complejo polipéptido-inhibidor, mediante cristalografía de rayos-X, mediante modelado con ordenador, o más típicamente, mediante una combinación de estas estrategias. Deben averiguarse tanto la forma como las cargas del polipéptido de la insulina o de la variante de la insulina para elucidar la estructura y determinar el sitio o sitios activos de la molécula. Menos a menudo, podría obtenerse información útil en relación a la estructura del polipéptido de la insulina o de la variante de la insulina mediante el modelado en base a la estructura de proteínas homólogas. En ambos casos, la información estructural relevante se usa para diseñar moléculas análogas similares al polipéptido de la insulina o de la variante de la insulina, o para identificar inhibidores eficientes. Los ejemplos útiles de diseño racional de fármacos podrían incluir moléculas que tienen una actividad o estabilidad mejorada, tal como mostraron Braxton y Wells, Biochemistry, 31:7796-7801 (1992), o que actúan como inhibidores, agonistas o antagonistas de los péptidos nativos, tal como mostraron Athauda et al., J. Biochem., 113:742-746
(1993).

Es también posible aislar un anticuerpo específico para una diana, seleccionado mediante ensayo funcional, tal como se ha descrito más arriba, y a continuación resolver su estructura cristalina. Esta estrategia, en principio, proporciona un "pharmacore" a partir del cual puede basarse el subsiguiente diseño de fármacos. Es posible evitar la cristalografía de proteínas del todo generando anticuerpos antiidiopáticos (anti-ids) contra un anticuerpo farmacológicamente activo funcional. Al igual que la imagen especular de una imagen especular, se esperaría que el sitio de unión de los anti-ids fuera un análogo del receptor original. El anti-id podría usarse para identificar y aislar péptidos a partir de bancos de péptidos producidos química o biológicamente. Los péptidos aislados actuarían entonces como el pharmacore.

Gracias a la presente invención, podrían hacerse asequibles cantidades suficientes del polipéptido de la insulina o de la variante de la insulina para realizar tales estudios analíticos como la cristalografía de rayos-X. Además, el conocimiento de la secuencia de aminoácidos del polipéptido de la insulina o de la variante de la insulina proporcionada en la presente, proporcionará guía a aquéllos que emplean las técnicas de modelado en ordenador en lugar de o además de la cristalografía de rayos-X.

Referencias

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<120> USO DE LA INSULINA PARA EL TRATAMIENTO DE TRASTORNOS DEL CARTÍLAGO

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<130> P1786R1PCT

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<141> 2001-03-22

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\vskip0.400000\baselineskip

<150> US 60/192.103

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<151> 2000-03-24

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\vskip0.400000\baselineskip

<160> 17

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 1

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 1

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\sa{Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile}

\sac{Cys Ser Leu Tyr Gln Leu Glu Asn Tyr Cys}

\sac{Asn}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 2

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 30

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 2

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His}

\sac{Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly}

\sac{Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 3

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 110

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 3

\vskip1.000000\baselineskip

22

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 4

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<211> 35

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 4

24

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<210> 5

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<211> 5

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<212> PRT

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<213> Secuencia artificial

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<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> sitio de corte proteolítico

\vskip0.400000\baselineskip

<221> no está claro

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\vskip0.400000\baselineskip

<222> 3

\vskip0.400000\baselineskip

<223> aminoácido desconocido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 5

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Lys Arg Xaa Lys Arg}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 6

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 4

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

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<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> sitio de corte proteolítico

\vskip0.400000\baselineskip

<221> no está claro

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 3

\vskip0.400000\baselineskip

<223> aminoácido desconocido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 6

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\sa{Lys Arg Xaa Met}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 7

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 4

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<212> PRT

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<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> sitio de corte proteolítico

\vskip0.400000\baselineskip

<221> no está claro

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<222> 2

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<223> aminoácido desconocido

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 7

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\sa{Asn Xaa Lys Arg}

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 8

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<211> 6

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<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> C-péptido alternativo

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 8

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\sa{Arg Arg Gly Ser Lys Arg}

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 9

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<211> 33

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<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Adición C-terminal al beta-péptido descubierto en US 5.514.646

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<400> 9

25

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<210> 10

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<211> 56

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<212> PRT

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Porción de la variante de la insulina de EP 171.886.

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<400> 10

26

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<210> 11

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<211> 7

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<212> PRT

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Porción de la variante de la insulina de EP 171.886.

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 11

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\sa{Ala Leu Glu Gly Ser Leu Gln}

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<210> 12

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<211> 9

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<212> PRT

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Porción de la variante de la insulina de EP 171.886.

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<400> 12

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\sa{Ala Leu Glu Gly Ser Leu Gln Lys Arg}

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 13

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<211> 54

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<212> PRT

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Porción de la variante de la insulina de 171.147.

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<400> 13

27

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<210> 14

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<211> 32

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<212> PRT

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Porción de la variante de la insulina de EP 171.147.

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<400> 14

28

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<210> 15

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<211> 30

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<212> PRT

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Porción de la variante de la insulina de EP 171.147 y EP 171.887.

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 15

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\sa{Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His}

\sac{Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly}

\sac{Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr}

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<210> 16

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<211> 30

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<212> PRT

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Porción de la variante de la insulina de EP 171.887.

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 16

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\sa{Ala Leu Glu Gly Ser Leu Gln Lys Arg Gly}

\sac{Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys}

\sac{Ser Leu Tyr Gln Leu Glu Asn Tyr Cys Asn}

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<210> 17

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<211> 26

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<212> PRT

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Porción de la variante de la insulina de EP 171.887.

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<400> 17

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\sa{Arg Arg Glu Ala Glu Asp Leu Gln Val Gly}

\sac{Gln Val Glu Leu Gly Gly Gly Pro Gly Ala}

\sac{Gly Ser Leu Gln Pro Leu}

Claims (20)

1. El uso de la insulina o de una variante de la insulina en la fabricación de un medicamento para el tratamiento del cartílago lesionado procedente de un trastorno del cartílago, en donde el medicamento se formila para la inyección directa en la región afectada.

2. El uso de la reivindicación 1 para prevenir el daño inicial o continuado del cartílago por un trastorno del cartílago.

3. El uso de la reivindicación 1 ó 2 en donde el cartílago es cartílago articular.

4. El uso de la reivindicación 1 ó 2 en donde el trastorno del cartílago es un trastorno degenerativo del cartílago.

5. El uso de la reivindicación 4 en donde el trastorno degenerativo del cartílago es la artritis reumatoide.

6. El uso de la reivindicación 4 en donde el trastorno degenerativo del cartílago es la osteoartritis.

7. El uso de la reivindicación 1 ó 2 en donde el trastorno del cartílago resulta de una lesión.

8. El uso de la reivindicación 7 en donde el tipo de lesión es una microlesión o un trauma romo, una fractura condral, una fractura osteocondral, o un daño en el menisco, tendón o ligamentos.

9. El uso de la reivindicación 7 en donde el tipo de lesión es el resultado de un estrés mecánico excesivo u otra inestabilidad biomecánica que resulta de lesiones deportivas u obesidad.

10. El uso de la reivindicación 1 ó 2 en donde el medicamento comprende además un portador, excipiente o estabilizante.

11. El uso de la reivindicación 10 en donde el medicamento es una formulación de liberación continuada o ampliada.

12. El uso de la reivindicación 11 en donde el medicamento comprende además PLGA.

13. El uso de la reivindicación 11 en donde el medicamento comprende además una sal de metal polivante.

14. El uso de la reivindicación 14 en donde la sal de metal polivante es el acetato de zinc.

15. El uso de la reivindicación 1 ó 2 en donde el tratamiento comprende además poner en contacto el cartílago es con una cantidad efectiva de un agente de cartílago.

16. El uso de la reivindicación 15 en donde el agente de cartílago se selecciona de entre el grupo consistente en un factor de crecimiento peptídico, un antagonista del catabolismo, un osteo-factor, un factor sinovial, y un factor antiinflamatorio.

17. El uso de la reivindicación 16 en donde el factor de crecimiento peptídico de entre un miembro de la familia procedente del grupo consistente en: IGF (1,2), PDGF (AA, AB, BB), BMP, FGF (1-20), TGF-\beta (1-3) y EGF.

18. El uso de la reivindicación 16 en donde el antagonista del catabolismo se selecciona de entre el grupo consistente en: IL-1ra, inhibidores del NO, inhibidores del ICE, agentes que inhiben la actividad de la IL-6, IL-8, LIF, IFN-\gamma, TNF-\alpha, tetraciclinas y variantes de las mismas, inhibidores de la apoptosis, inhibidores de la MMP, inhibidores de la agrecanasa e inhibidores de las proteasas de serina y cisteína (tales como las catepsinas y el activador del plasminogeno del tipo uroquinasa o tisular (uPA y tPA)).

19. El uso de la reivindicación 16 en donde el osteo-factor se selecciona de entre el grupo consistente en bisfosfonatos y osteoprotegerina.

20. El uso de la reivindicación 16 en donde el factor antiinflamatorio se selecciona de entre el grupo consistente en anti-TNF\alpha, receptores solubles del TNF, IL-1ra, receptores solubles de la IL-1, IL-4, IL-10 e IL-13.