PL206846B1 - Zastosowanie przeciwcia la agonistycznego anty-TCCR - Google Patents

Description

Opis wynalazku Przedmiotem wynalazku jest zastosowanie przeciwcia la agonistycznego anty-TCCR do wytwa- rzania leku do leczenia zaburzenia alergicznego u ssaka. Dziedzina wynalazku. Zgodnie z wynalazkiem opisano identyfikacj e i izolacj e nowego DNA, wytwarzanie nowych poli- peptydów poprzez rekombinowanie DNA oraz kompozycje i sposoby diagnozowania i leczenia chorób zwi azanych z odporno sci a, konkretnie sposoby modulowania ró znicowania komórek T i profili uwal- niania cytokin do podtypów Th1 i Th2, oraz gospodarzy dotkni etych chorobami, które s a zwi azane z profilami uwalniania cytokin. Tlo wynalazku. Choroby zwi azane z uk ladem immunologicznym i stanem zapalnym ujawniaj a si e lub s a konse- kwencj a dzia lania z lo zonych, cz esto w ró znorodny sposób wp lywaj acych na siebie szlaków biologicz- nych, które w normalnym stanie fizjologicznym s a krytyczne dla reakcji na obra zenie lub uraz, zapo- cz atkowanie gojenia obra zenia lub urazu i wzbudzenia wrodzonej i nabytej obrony przeciw obcym organizmom. Choroba lub patologia wyst epuje wówczas, gdy te normalne szlaki fizjologiczne powodu- ja dodatkowe obra zenie lub uraz, b ed ace bezpo sredni a konsekwencj a si ly odpowiedzi, konsekwencj a nieprawid lowej regulacji lub nadmiernego pobudzenia, reakcj a autologiczn a lub ich kombinacj a. Co za tym idzie geneza tych chorób cz esto obejmuje wieloetapowe szlaki i cz esto liczne, ró zne systemy/szlaki biologiczne, a wp lyw na krytyczne etapy jednego lub wielu tych szlaków mo ze mie c skutek lagodz acy lub terapeutyczny. Interwencja terapeutyczna mo ze nast api c zarówno przez anta- gonizowanie przynosz acego szkod e procesu/szlaku jak i pobudzenie po zadanego procesu/szlaku. Limfocyty T (komórki T) s a wa znym sk ladnikiem ssaczej odpowiedzi immunologicznej. Komórki T rozpoznaj a antygeny towarzysz ace w lasnej cz asteczce kodowanej przez geny g lównego kompleksu zgodno sci tkankowej (MHC). Antygen mo ze by c prezentowany wraz z cz asteczkami MHC na po- wierzchni komórek prezentuj acych antygen, komórek zaka zonych wirusem, komórek nowotworowych, przeszczepów, itp. System komórki T eliminuje takie zmienione komórki, które stanowi a zagro zenie zdrowia dla gospodarza ssaka jest zdrowy. Komórki T obejmuj a pomocnicze komórki T i cytotoksycz- ne komórki T. Pomocnicze komórki T namna zaj a si e intensywnie po rozpoznaniu kompleksu antygen- MHC na komórce prezentuj acej antygen. Pomocnicze komórki T wydzielaj a równie z rozmaite cytoki- ny, tj. limfokiny, które odgrywaj a centraln a rol e w aktywacji komórek B, cytotoksycznych komórek T i rozmaitych innych komórek, które uczestnicz a w odpowiedzi immunologicznej. Centralnym zdarze- niem zarówno w humoralnej jak i komórkowej odpowiedzi immunologicznej jest aktywacja i ekspansja klonalna pomocniczych komórek T. Aktywacja pomocniczych komórek T jest inicjowana przez oddzia- lywanie kompleksu receptor komórek T(TCR)-CD3 z antygenem MHC na powierzchni komórki prezen- tuj acej antygen. Oddzia lywanie to po sredniczy w kaskadzie zdarze n biochemicznych, które pobudzaj a spoczynkow a pomocnicz a komórk e T do wej scia w cykl komórkowy (przej scie z G0 do G1) i w konse- kwencji ekspresje receptora o wysokim powinowactwie dla IL-2 i czasem IL-4. Aktywowana komórka T przechodzi przez cykl namna zaj ac si e i ró znicuj ac w komórki pami eci lub komórki efektorowe. Uk lad immunologiczny ssaków obejmuje szereg unikalnych komórek funkcjonuj acych razem dla obrony gospodarza przed inwazj a bakterii, wirusów, toksyn i innych niepochodz acych od gospodarza substancji. Rodzaj komórki g lównie odpowiedzialny za swoistosc uk ladu immunologicznego jest na- zywany limfocytem, przy czym limfocytów s a dwa rodzaje, komórki B i T. Komórki T nazwane s a tak, poniewa z rozwijaj a si e w grasicy (ang. thymus), podczas gdy komórki B rozwijaj a si e w szpiku kost- nym (ang bone marrow). Populacja komórek T ma szereg podtypów, takich jak supresorowe komórki T, cytotoksyczne komórki T i pomocnicze komórki T. Pomocnicze komórki T definiuj a dwa szlaki im- munologiczne: Th1 i Th2. Komórki Th1, funkcjonalny podzbiór komórek CD4+, cechuje si e zdolno sci a do wspomagania komórkowej odpowiedzi immunologicznej. Komórka Th1 wytwarza cytokiny IL-2 i interferon- ? i jest identyfikowana przez brak IL-10, IL-4, IL-5 i IL-6. Komórka Th2 jest równie z komórk a CD4+, lecz jest odmienna od komórki Th1. Komórki Th2 s a odpowiedzialne za wytwarzanie przeciwcia l i wytwarzanie cytokin IL-4, IL-5, IL-10 i IL-13 (patrz fig. 1). Cytokiny te odgrywaj a wa zn a rol e w uczynieniu odpowiedzi Th1 i Th2 wzajemnie hamuj acymi si e. Interferon- ? jest wytwarzany przez komórki Th1, hamuj ac proliferacj e komórek Th2 (fig. 2), podczas gdy IL-10 wytwarzana przez komórki Th2 hamuje wytwarzanie interferonu- ? (fig. 2). Stwierdzono, ze przedstawiciele rodziny cytokiny z czterema helikalnymi domenami (Bazan, J. F., 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:6934-8) odgrywaj a kluczow a rol e w ekspansji i ko ncowym ró zni-PL 206 846 B1 3 cowaniu pomocniczych komórek T ze wspólnego prekursora w ró zne populacje komórek efektorowych Th1 i Th2. O'Garra, A., 1998, Immunity, 8:275-83. IL-4 wp lywa g lównie na rozwój komórek Th2, pod- czas gdy IL-12 jest g lównym czynnikiem uczestnicz acym w ró znicowaniu komórek Th1. Hsieh, C. S., i wsp., 1993, Science, 260:547-9; Seder, R. A., i wsp., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci USA, 90:10188-92; Le Gros, G., i wsp., 1990, J. Exp. Med., 172:921-9; Swain, S. L., 1991, Immunol. Rev., 123:115-44. Zgodnie z tym myszy z niedoborem IL-4 (Kuhn, R., i wsp., 1991, Science 254:707-10), lancucha re- ceptora IL-4 (Noben-Trauth, N., i wsp., 1997, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94:10838-43) lub specyficz- nego dla IL-4 czynnika transkrypcyjnego STAT6 (Shimoda, K., i wsp., 1996, Nature, 380:630-3) s a upo sledzone w odpowiedzi Th2, podczas gdy myszy z niedoborem IL-12 (Magram, J., i wsp., 1996, Immunity, 4:471-81), lancucha 1 receptora IL-12 (IL-) 12R) (Wu, C, i wsp., 1997, J. Immunol. 159:1658-65) lub specyficznego dla IL-12 czynnika transkrypcyjnego STAT4 (Kap lan, M. H. i wsp., 1996, Nature, 382:174-7) maj a zaburzone odpowiedzi Th1. Przypuszczalnie podtypy komórek Th-1 i Th-2 pochodz a od wspólnego prekursora nazwanego komórk a Th-0. W przeciwie nstwie do wybiórczo wytwarzaj acych cytokiny podtypów Th-1 i Th-2, ko- mórki Th-0 wytwarzaj a wi ekszo sc lub wszystkie te cytokiny. Profile uwalniania ró znych cytokin przez podtypy Th-1 i Th-2 odgrywaja aktywn a rol e w selekcji mechanizmów efektorowych i komórek cytotok- sycznych. IL-2 i interferon- ? wydzielane przez komórki Th-1 wykazuj a sk lonno sc do pobudzania ma- krofagów i komórek cytotoksycznych, podczas gdy IL-4, IL-5, IL-6 i IL-10 wydzielane przez komórki Th-2 wykazuj a sk lonno sc do 3 zwi ekszania wytwarzania eozynofili i komórek tucznych, jak równie z zwi ekszania wytwarzania przeciwcia l obejmuj acych IgE i zmniejszania funkcji komórek cytotoksycz- nych. Po ustaleniu wzoru odpowiedzi Th-1 lub Th-2, jest on utrzymywany przez wytwarzanie cytokin hamuj acych O wytwarzanie komórek drugiego podtypu. Interferon- ? wytwarzany przez komórki Th-1 hamuje produkcj e cytokin Th-2, takich jak IL-4 i 11-10, podczas gdy IL-10 wytwarzana przez komórki, Th-2 hamuje produkcj e cytokin Th-1, takich jak IL-2 i interferon- ?. Zaburzenie delikatnej równowagi pomi edzy wytwarzaniem cytokin przez podklasy Th1 i Th2 prowadzi do chorób gospodarza. Przyk ladowo, nadprodukcja cytokin Th1 mo ze prowadzi c do chorób z autoimmunologicznym stanem zapalnym, stwardnienia rozsianego i zapalenia jelita (np. choroba Crohna, miejscowe zapalenie jelita, zapalenie dystalnej cz esci kr etnicy, miejscowe zapalenie kr etnicy, zapalenie ko ncowej cz esci kr etnicy, ziarniniakowate zapalenie jelita). Podobnie, nadprodukcja cytokin Th2 prowadzi do chorób alergicznych obejmuj acych nadwra zliwo sc anafilaktyczn a, astm e, uczulenio- wy nie zyt nosa, atopowe zapalenie skóry, wiosenne zapalenie spojówek, egzem e, pokrzywk e i uczu- lenia pokarmowe. Umetsu i wsp., Soc. Exp. Biol. Med. 215:11-20 (1997). WO 97/44455 z lo zone 19 maja 1997 i Sprecher i wsp., Blochem. Biphys. Res. Commun. 264:82-90 (1998) opisuj a cz asteczki receptora cytokiny posiadaj ace sekwencj e identyczn a w pewnym stopniu z mysimi i ludzkimi cz asteczkami TCCR. Uwa za si e, ze znane wcze sniej mysie i ludzkie re- ceptory cytokiny s a wyra zane w tkance limfoidalnej w tym grasicy, sledzionie, w ez lach ch lonnych i leukocytach krwi obwodowej i jak pokazano ponadto wyst epuj a zarówno na komórkach B, jak i T, i posiadaj a funkcje zwi azan a z namna zaniem, ró znicowaniem i/lub aktywacj a komórek immunologicz- nych, przypuszczalnie podczas rozwoju i regulacji odpowiedzi immunologicznej. Jednak ze, WO 97/44455 i Sprecher i wsp., jak powy zej, nie identyfikuj a ani dok ladnej funkcji TCCR i jej homologów w po sredniczeniu w ró znicowaniu komórek T i profilach uwalniania cytokin przez podtyp Th1 i podtyp Th2, ani chorób zwi azanych z uwalnianiem cytokin przez podtypy komórki T. Streszczenie wynalazku Przedmiotem wynalazku jest zastosowanie terapeutycznie skutecznej ilo sci przeciwcia la agoni- stycznego przeciwko T-komórkowemu receptorowi cytokinowemu (anty-TCCR) do wytwarzania leku do leczenia zaburzenia alergicznego u ssaka, przy czym bia lko TCCR obejmuje sekwencj e amino- kwasow a wykazuj ac a co najmniej 90% identycznosc sekwencji aminokwasowej z sekwencj a ozna- czon a SEQ ID NO: 1 albo SEQ ID NO: 2. Korzystnie zaburzenie alergiczne wybrane jest z grupy sk ladaj acej si e z: nadwra zliwo sci anafi- laktycznej, astmy, alergicznego zapalenia sluzówki nosa, atopowego zapalenia skóry, egzemy, alergii pokarmowych, pokrzywki i wiosennego zapalenia spojówek. Korzystnie bia lko TCCR obejmuje sekwencj e aminokwasow a oznaczon a SEQ ID NO: 1 albo SEQ ID NO: 2. Korzystniej przeciwcia lo agonistyczne anty-TCCR stanowi przeciwcia lo agonistyczne anty- TCCR lub jego fragment wi azacy TCCR, biospecyficzne przeciwcia lo agonistyczne anty-TCCR, hete- rokoniugat przeciwcia la agonistycznego anty-TCCR albo diacia lo agonistyczne anty-TCCR, przy czymPL 206 846 B1 4 dowolne z tych przeciwcia l lub fragmentów przeciwcia l obejmuje dwa lub wi ecej miejsca wi azania antygenu TCCR. Jeszcze korzystniej przeciwcia lo monoklinalne lub jego fragment wiaz acy TCCR posiada reszty nie-ludzkiego regionu determinuj acego komplementarno sc (CDR) i reszty z ludzkiego regionu zr ebo- wego (FR). Korzystniej przeciwcia lo agonistyczne anty-TCCR stanowi liniowe przeciwcia lo agonistyczne anty-TCCR lub jedno lancuchowe przeciwcia lo agonistyczne anty-TCCR zawieraj ace dwa lub wi ecej miejsca wi azania antygenu TCCR. Korzystniej fragment przeciwcia la wiaz acy TCCR stanowi fragment F (ab') 2 . Korzystniej przeciwcia lo agonistyczne anty-TCCR lub jego fragment wi az acy TCCR s a poda- wane w kombinacji ze srodkiem cytotoksycznym, cytokin a, srodkiem przeciwnowotworowym, lub srodkiem hamuj acym wzrost. Korzystniej bispecyficzne przeciwcia lo agonistyczne anty-TCCR, heterokoniugat przeciwcia la agonistycznego anty-TCCR, lub diacia lo agonistyczne anty-TCCR wiaze dwa ró zne epitopy TCCR. Korzystniej przeciwcia lo agonistyczne anty-TCCR wi aze TCCR i indukuje wytwarzanie cytokin Th1. Zgodnie z wynalazkiem opisano sposoby diagnozowania i leczenia choroby zwi azanej z odpor- no scia u ssaków, w tym ludzi - dok ladnie fizjologii (np. profili uwalniania cytokin) i chorób wynikaj acych z odchyle n w szlaku ró znicowania komórek T w podtyp Th1 lub podtyp Th2. Niniejszy wynalazek opar- ty jest na identyfikacji genu koduj acego sekwencj e aminokwasow a TCCR (wcze sniej znany, jako NPOR), którego brak lub inaktywacja, która wp lywa na ró znicowanie u ssaków komórek, T w podtyp Th2. Okre slone choroby immunologiczne mog a by c leczone przez hamowanie lub wzmacnianie ró zni- cowania komórek T zarówno w podtyp Th1 jak i Th2. Ponadto, zgodnie z wynalazkiem opisano sposób wzmacniania, pobudzania lub zwi ekszania mo zliwo sci ró znicowania komórek T w podtyp Th2 zamiast w podtyp Th1, obejmuj acy podawanie skutecznej ilo sci antagonisty TCCR. Ewentualnie, sposób stosowany jest u ssaka i skuteczna ilo sc jest ilo sci a skuteczn a terapeutycznie. Ewentualnie ró znicowanie komórek T w komórki podtypu Th2 indukowane przez antagonist e TCCR prowadzi dalej do wzoru uwalniania cytokiny Th2 po pobudzeniu antygenem (np. IL-4, IL-5, IL-10 i IL-13). Choroby charakteryzuj ace si e nadprodukcj a cytokin Th1 i które s a wra zliwe na efekt równowagi pobudzenia ró znicowania podtypu Th2 i w efekcie okre slony profil uwalniania cytokin, obejmuj a choroby autoimmunologiczne ze stanem zapalnym (np. alergiczne zapalenie mózgu i rdzenia kr egowego, stwardnienie rozsiane, cukrzyca insulino zale zna, alergiczne zapalenie naczyniówki, zapalenie jelita (np. choroba Crohna, wrzodziej ace zapalenie okr eznicy), auto- immunologiczna choroba tarczycy) i odrzut alloprzeszczepu. Ponadto, zgodnie z wynalazkiem opisano sposób zapobiegania, hamowania lub os labiania ró z- nicowania komórek T do podtypu Th2 (np. powoduj acego ró znicowanie do podtypów Th1), obejmuj a- cy podanie skutecznej ilo sci TCCR lub agonisty. Ewentualnie sposób jest stosowany u ssaka i sku- teczna ilo sc jest terapeutycznie skuteczn a ilo scia. Ewentualnie, ten TCCR lub agonista indukuje ró zni- cowanie, co skutkuje profilem uwalniania cytokin Th1 po pobudzeniu antygenem (np. interferonem- ?). Mo zna si e spodziewa c, ze choroby charakteryzuj ace si e nadprodukcj a cytokin Th2 (lub niedosta- teczn a produkcj a cytokin Th1) i które by lyby odpowiedzialne za równowagowy efekt pobudzenia pod- typu Th1 lub ró znicowanie nadprodukcji cytokin Th2, b ed a skuteczne w leczeniu chorób zaka znych (np. Leishmania major, Mycobacterium leprae, Candida albicans, Toxoplasma gondi, syncytialne wiru- sy uk ladu oddechowego, ludzki wirus upo sledzenia odporno sci) i chorób alergicznych (np. astma, alergiczne zapalenie b lony sluzowej nosa, atopowe zapalenie skóry, wiosenne zapalenie spojówek). Zgodnie z wynalazkiem opisano wyizolowane przeciwcia lo wiaz ace polipeptyd TCCR (np. anty- TCCR). W pewnym aspekcie przeciwcia lo na sladuje aktywno sc polipeptydu TCCR (przeciwcia lo ago- nistyczne) lub odwrotnie, przeciwcia lo hamuje lub neutralizuje aktywno sc polipeptydu TCCR (przeciw- cia lo antagonistyczne). W innym aspekcie przeciwcialo jest przeciwcia lem monoklonalnym, które do- godnie posiada niepochodz acy od cz lowieka region determinuj acy komplementarno sc (CDR ang. complementarity determining region) i ludzki region zr ebowy (FR ang. frame work region). Przeciwcia- lo moze by c wyznakowane i mo ze by c unieruchomione na z lo zu sta lym. W dalszym aspekcie przeciw- cia lem jest fragment przeciwcia la, pojedynczy lancuch przeciwcia la lub przeciwcia lo anty-idiotypowe. Zgodnie z wynalazkiem opisano równie z zastosowania polipeptydów i przeciwcia l tu opisanych do wytwarzania opisanych tu kompozycji lub leków. Zgodnie z wynalazkiem opisano kwas nukleinowy kodujacy przeciwcia lo anty-TCCR i wektory, oraz rekombinowane komórki gospodarza zawieraj ace taki kwas nukleinowy. Zgodnie z wynalazkiemPL 206 846 B1 5 opisano równiez sposób wytwarzania takiego przeciwcia la przez hodowanie komórki gospodarza transformowanej kwasem nukleinowym koduj acym przeciwcia lo w takich warunkach, ze przeciwcia lo jest wyra zane, i odzyskiwanie przeciwcia la z hodowli komórek. Ponadto zgodnie z wynalazkiem opisano antagonistów polipeptydu TCCR hamuj acych jedn a lub wi ecej funkcji lub aktywno sci polipeptydu TCCR. Alternatywnie, zgodnie z wynalazkiem opisano antagonist e TCCR, który pobudza lub wzmaga jedn a lub wi ecej funkcji lub aktywno sci polipeptydu TCCR. Zalecani antagoni sci i/lub agoni sci to warianty, TCCR, fragmenty peptydowe, ma le cz asteczki, antysensowne oligonukleotydy DNA lub RNA, rybozymy lub przeciwcia la (monoklonlane, humanizo- wane, swoiste, jednoniciowe, heterokoniugaty lub fragmenty wy zej wspomnianych). Ponadto, agoni sci TCCR mog a obejmowa c potencjalne Ugandy, TCCR, podczas gdy potencjalni antagoni sci mog a obej- mowa c rozpuszczalne zewn atrzkomórkowe domeny TCCR (ECD ang. extracellular domains). Zgodnie z wynalazkiem opisano wyizolowane cz asteczki kwasu nukleinowego, które hybrydyzu- ja z cz asteczkami kwasu nukleinowego koduj acymi polipeptydy TCCR lub cz asteczki do nich komple- mentarne. Zalecanym kwasem nukleinowym jest DNA i hybrydyzacja dogodnie zachodzi w ostrych warunkach. Takie cz asteczki kwasu nukleinowego mog a dzia la c, jako cz asteczki antysensowne wzgl edem zidentyfikowanych tu zampolifikowanych genów, które z kolei mog a znale zc zastosowanie w modulowaniu odpowiednich zamplifikowanych genów lub jako antysensowne startery w reakcjach amplifikacji. Ponadto, takie sekwencje mog a by c u zyte, jako cz esc rybozymu i/lub sekwencja potrójnej helisy, która z kolei mo ze by c u zyta do regulowania zamplifikowanych genów. Zgodnie z wynalazkiem opisano sposób okre slenia obecno sci polipeptydu TCCR, obejmuj acy ekspozycj e komórki podejrzanej o zawieranie polipeptydu na przeciwcia lo anty-TCCR i okre slenie wi azania przeciwcia la do komórki. Zgodnie z wynalazkiem opisano równie z sposób diagnozowania choroby ssaka, w której po- sredniczy Th1 lub Th2, obejmujacy wykrywanie poziomu ekspresji genu koduj acego polipeptyd TCCR (a) w badanej próbce komórek tkanki otrzymanej od ssaka i (b) w próbce kontrolnej znanych komórek prawid lowej tkanki tego samego typu, gdzie ni zszy poziom ekspresji w próbce badanej w porównaniu z kontrol a dowodzi wyst epowania choroby, w której po sredniczy Th2, a wy zszy poziom ekspresji w próbce badanej w porównaniu z kontrol a wskazuje na wyst epowanie choroby, w której po sredniczy Th1 u ssaka, z którego pochodzi ly tkanki komórki badanej. Zgodnie z wynalazkiem opisano tak ze sposób diagnozowania choroby immunologicznej u ssa- ka, obejmuj acy (a) doprowadzenie do kontaktu przeciwcia la anty-TCCR z badan a próbk a komórek z tkanki otrzymanej od ssaka i (b) wykrywanie powstawania kompleksów pomi edzy przeciwcia lem i polipeptydem TCCR w badanej próbce. Wykrywanie mo ze by c jako sciowe lub ilo sciowe i mo ze by c dokonane równolegle ze sledzeniem kompleksu w próbce kontrolnej z komórek prawid lowej tkanki tego samego typu. Tworzenie wi ekszej ilo sci kompleksów w badanej próbce wskazuje na obecno sc, TCCR i choroby, w której po sredniczy Th1, podczas gdy mniejsza ilosc wskazuje na chorob e ssaka, w której po sredniczy Th2. Zalecane przeciwcia lo posiada wykrywalny znacznik. Tworzenie komplek- sów mo ze by c sledzone przyk ladowo przez mikroskopi e swietln a, cytometri e przep lywow a, fluoryme- tri e lub inne znane w tej dziedzinie sposoby. Próbka testowa jest zazwyczaj otrzymywana od jedno- stek podejrzanych o niedobór lub nieprawid lowo sc uk ladu immunologicznego. Zgodnie z wynalazkiem opisano równie z zestaw diagnostyczny zawieraj acy przeciwcia lo anty- TCCR i no snik (np. bufor) w dogodnym opakowaniu. Zalecany zestaw zawiera instrukcj e u zycia prze- ciwcia la do wykrywania polipeptydu TCCR. Zgodnie z wynalazkiem opisano ponadto artyku l przemys lowy obejmuj acy pojemnik; etykiet e na pojemniku; i kompozycj e zawieraj ac a czynnik aktywny zawarty w pojemniku; przy czym kompozycja jest skuteczna w pobudzaniu lub hamowaniu odpowiedzi immunologicznej u ssaka, etykieta na po- jemniku wskazuje, ze kompozycja mo ze by c u zyta do leczenia chorób zwi azanych z odporno scia a czynnik aktywny w kompozycji jest czynnikiem pobudzaj acym lub hamujacym ekspresj e i/lub aktyw- nosc polipeptydu TCCR. W zalecanym aspekcie aktywnym czynnikiem jest polipeptyd TCCR lub prze- ciwcia lo anty-TCCR). Zgodnie z wynalazkiem opisano te z sposób identyfikowania zwi azku zdolnego do modulowania ekspresji i/lub aktywno sci biologicznej polipeptydu TCCR poprzez doprowadzenie do kontaktu kandy- duj acego zwi azku z polipeptydem TCCR w warunkach i przez czas dostateczny dla umo zliwienia od- dzia lywania tych dwóch sk ladników. W konkretnym aspekcie zarówno kandyduj acy zwi azek jak i poli- peptyd TCCR jest unieruchomiony na sta lym pod lo zu. W kolejnym aspekcie nieunieruchomiony sk lad- nik niesie wykrywalny znacznik.PL 206 846 B1 6 Krótki opis rysunków Fig. 1 jest schematycznym przedstawieniem ró znicowania komórek T CD4+ w komórki Th1 i Th2, pierwotnych cytokin odpowiedzialnych za wywo lanie ró znicowania, pierwotnych cytokin uwal- nianych podczas ró znicowania odpowiednich podtypów po pobudzeniu antygenem i efektów fizjolo- gicznych zale znych od profilu uwalnianych cytokin. Fig. 2 jest schematycznym przedstawieniem ujemnego sprz ezenia zwrotnego opisuj acego wza- jemn a zale znosc pomi edzy cytokinami uwalnianymi przez podtypy Th1 i Th2 komórek T. Fig. 3 przedstawia sekwencj e aminokwasow a ludzkiego TCCR (hTCCR) (SEQ ID N0:1). Se- kwencj e opublikowano równie z w WO 97/44455 z lo zonym 23 maja 1996 i ponadto dost epn a z Gen- Bank pod numerem dost epu 4759327. Ponadto, sekwencj e opisano w Sprecher i wsp., Blochem. Biophys. Res. Commun. 246(1):82-90 (1998). W SEQ ID N0:1 peptyd sygnalowy zosta l zidentyfiko- wany, jako mieszcz acy si e pomi edzy aminokwasami 1 a oko lo 32, domena transb lonowa od amino- kwasu 517 do oko lo 538, miejsca N-glikozylacji w pozycjach reszt oko lo 51-54, 76-79, 302-305, 311- -314, 374-377, 382-385, 467-470, 563-566, miejsca N-mirystylacji w pozycjach reszt oko lo 107-112, 240-245, 244-249, 281-286, 292-297, 373-378, 400-405, 459-464, 470-475, 531-536 i 533-538, miej- sce przy laczenia lipidu prokariotycznej lipoproteiny b lonowej w pozycjach reszt oko lo 522-532 i sygna- tura 1 rodziny receptora dla czynnika wzrostowego i cytokiny, w pozycji reszt oko lo 41-54. Wyst epuje tu równie z obszar o znacz acej homologii z drug a podjednostk a dla ludzkiego czynnika stymuluj acego tworzenie kolonii granulocytów - makrofagów (GM-CSF) reszty 183-191. Fig. 4 przedstawia sekwencj e aminokwasow a mysiego TCCR (mTCCR) (SEQ ID N0:2). Se- kwencja by la równie z opublikowana w WO 97/44455 z lo zonym 23 maja 1996 i ponadto dost epn a z GenBank pod numerem dost epu 7710109. Sekwencja ta jest ponadto opisana w Sprecher i wsp., Blochem. Biophys. Res. Commun. 246(1):82-90 (1998). W SEQ ID N0:2 peptyd sygna lowy zosta l zidentyfikowany od aminokwasu 1 do oko lo 24, domena transb lonowa od aminokwasu oko lo 514 do oko lo 532, miejsca N-glikozylacji w pozycjach reszt oko lo 46-49, 296-299, 305-308, 360-361, 368-371 i 461-464, miejsca fosforylacji dla kinazy kazeinowej II w pozycjach reszt oko lo 10-13, 93-96, 130-133, 172-175, 184-187, 235-238, 271-274, 272-275, 323-326, 606-609 i 615-618, miejsce fosforylacji przez kinaz e tyrozynow a w pozycji reszt oko lo 202-209, miejsca N-mirystylacji w pozycjach reszt 43-48, 102- -107, 295-300, 321-326, 330-335, 367-342, 393-398, 525-530 i 527-532, miejsce amidacji w pozycji reszt 240-243, miejsce przy laczenia lipidu prokariotycznej lipoproteiny b lonowej w pozycji reszt oko lo 516-526 i sygnatura 1 rodziny receptora czynnika wzrostu i cytokiny, w pozycji reszt oko lo 36-49. Wy- st epuje obszar znacz acej homologii z: (1) ludzk a erytropoetyn a, w pozycji reszt oko lo 14-51 i (2) re- ceptorem mysiej interleukiny 5 w pozycji reszt oko lo 211-219. Fig. 5 jest porównaniem hTCCR (SEQ ID N0:1) i mTCCR (SEQ ID N0:2). Identyczne amino- kwasy zacieniowano a przerwy wprowadzone dla optymalnego przyrównania zaznaczono my slnikami. Wydedukowane miejsce ci ecia peptydu sygna lowego zaznaczono strza lk a. Potencjalne miejsca N-glikozylacji zaznaczono gwiazdkami. Motyw WSX domeny transb lonowej i motyw boxl uj eto w ramk e. Fig. 6 jest obrazem filtru z do swiadczenia typu Northern dla ludzkiego TCCR pokazuj acego pro- file ekspresji w tkankach doros lej i p lodowej. U doros lych hTCCR jest wyra zane w najwy zszym stopniu w grasicy, lecz wykryto równie z sygna l w leukocytach krwi obwodowej (PBL), sledzionie, jak równie z s lab a ekspresj e wykryto w p lucach. W tkankach plodowych TCCR ujawnia s lab a ekspresj e w p lucach i nerce. Charakterystyka ekspresji TCCR wskazuje, ze mo ze uczestniczy c w rozwoju i proliferacji ko- mórek krwi, szczególnie tymocytów. Fig. 7(A-B) bada liczb e i fenotyp komórek T w myszach TCCR -/-. Fig. 7A jest diagramem punk- towym z analizy FACS dla komórek T CD4+/CD8+ pobranych z myszy TCCR -/- i porównanych z typem dzikim. Fig. 7B jest diagramem punktowym analizy FACS CD4+/CD8+/TcR+. Brak jakiejkol- wiek znacz acej ró znicy pomiedzy liczbami komórek T u myszy TCCR -/- wskazuje, ze proliferacja komórki T nie jest os labiona. Fig. 8(A-B) sprawdza ekspresj e TCCR w ludzkich komórkach T. Fig. 8A jest diagramem punk- towym z analizy FACS dla ludzkiego TCCR i powierzchniowego znacznika komórek T, CD2 na ludz- kich komórkach T. Fig. 8B jest diagramem punktowym z analizy FACS dla ludzkiego TCCR i znaczni- ka CD20 komórek B na ludzkich komórkach B. Umieszczony najbardziej po lewej stronie diagram na obu fig. przedstawia odpowiednie skoniugowane z fluorochromem drugorz edowe przeciwcia lo. Lacz- nie, fig. 8A i 8B pokazuj a, ze TCCR znajduje si e na podtypie ludzkich komórek T i nie wyst epuje w zauwa zalnej ilo sci na komórkach B.PL 206 846 B1 7 Fig. 9(A-C) to diagram przedstawiaj acy metodologi e celowania genu TCCR poprzez homolo- giczn a rekombinacj e. Fig. 9A przedstawia allel typu dzikiego z eksonami TCCR oznaczonymi zaczer- nionymi blokami i intronami oznaczonymi liniami przerywanymi. „E” i „B” oznacza miejsca ci ecia dla endonukleaz, odpowiednio, EcoRI i BamHI. Fig. 9B przedstawia wektora docelowego, gdzie eksony 3-8 z TCCR zosta ly zast apione genem oporno sci na neomycyn e z wektora plazmidowego pGK-neo. Gen dla kinazy tymidynowej z wirusa opryszczki wbudowano po stronie 5' eksonu 1, gen, który do- starcza oporno sci na czynnik selekcyjny gancyklowir. Fig. 9C jest przedstawieniem allelu po ostatecz- nym nacelowaniu lub „znokautowanego” po zaj sciu rekombinacji homologicznej pomi edzy endogen- nym genem i wektorem docelowym. Fig. 10(A-C) to filtr z analizy, odpowiednio, Southern, obraz zelu po elektroforezie produktów reakcji PCR i filtr z analizy Northern, potwierdzajace transfekcj e wektorem docelowym z TCCR. Na fig. 10A genomowy DNA pobrano z komórek ES odpornych na selekcj e neomycyn a/gancyklowirem i hy- brydyzowano z radioaktywn a sond a specyficzn a dla TCCR. W drugiej scie zce od lewej wyst epowanie obu pasm zawieraj acych fragmenty o d lugo sci 10 Kb (ang. Kilobases, tysi ecy par zasad) i 12 Kb wskazuje, ze jeden z alleli TCCR zosta l usuni ety. Fig. 10B przedstawia produkt reakcji amplifikacji w reakcji PCR genomowego DNA z ogonów myszy TCCR -/-. Startery dla PCR zaprojektowano tak, aby rozró znia c allel TCCR typu dzikiego i docelowy („znokautowany”) allel uzyskany w wyniku rekombinacji. Scie zki 1 i 2 (licz ac od lewej) przedstawiaj a wzór pr azków wskazuj acych na TCCR typu dzikiego. Scie zka 3 przedstawia pr azek PCR dla myszy TCCR -/- a scie zki 5 i 6 odpowiadaj a TCCR myszy heterozygotycznej ( + /-). Fig 10 C to filtr z analizy Northern, który by l hybrydyzowany z sond a specy- ficzn a dla TCCR. W scie zce 1 rozdzielono material myszy TCCR -/- i w scie zce 2 myszy typu dzikiego. Brak jakiegokolwiek sygna lu dla myszy TCCR -/- wykazuje, ze nie zosta l wytworzony pe lnej d lugo sci funkcjonalny mRNA dla TCCR. Fig 11(A-B) przedstawia nasilenie u myszy TCCR -/-alergicznego stanu zapalnego dróg odde- chowcyh. Fig. 11A pokazuje, ze myszy TCCR -/- uczulone antygenem roztoczy kurzu (DMA od ang. Dust Mite Antigen) wytwarzaj a wieksz a 1 odpowied z Th2, czego miar a by la liczba limfocytów nacieka- jacych p luca. Fig. 12(A-B) jest graficznym przedstawieniem odpowiedzi Th1/Th2 u myszy TCCR -/-, co mie- rzono przez wytwarzanie IFN- ?. Na fig 12A, komórki T wyizolowane z D myszy TCCR -/- inkubowano z IL-12, co powodowa lo ró znicowanie zgodnie ze szlakiem Th1. Komórki te badano pod k atem wytwa- rzania IFN- ?, IL-4 i IL-5. IFN- ? jest wytwarzany w znacz aco mniejszej ilo sci przez myszy TCCR -/-, co przedstawiono, jako jasno cieniowane s lupki na fig. 12A. Wskazuje to na znaczne os labienie odpo- wiedzi Th1 u myszy TCCR -/-. Fig. 12B jest graficznym przedstawieniem wyników dla komórek T, które inkubowano z IL-4, co powodowa lo ró znicowanie zgodnie ze szlakiem Th2. Wskazuje to na brak ró znicy w wytwarzaniu cytokin pomi edzy komórkami T z myszy TCCR -/- i komórkami kontrolnymi typu dzikiego. Fig. 13 jest graficznym przedstawieniem poziomów wytwarzania Ig przez myszy TCCR -/-. Ba- dano poziomy Ig podtypów IgGl, IgG2b, IgG3, IgM i IgA. Jak przedstawiono, jako jasno cieniowane s lupki, myszy TCCR -/- wytwarza ly mniej IgG2a ni z myszy kontrolne typu dzikiego. Poziomy pozosta- lych IgG nie ró zni ly si e znacz aco. IgG2a jest wytwarzana przez komórki Th1 i wyra znie brak jej u my- szy TCCR -/-, co potwierdza zmniejszon a odpowied z Th1 obserwowan a w innych prezentowanych tu testach. Fig. 14 jest graficznym przedstawieniem poziomów wytwarzania IgG u myszy TCCR -/-, które wcze sniej immunizowano owoalbumin a. Myszom wstrzykiwano 10 µg OVA, dootrzewnowe w dniu 1 i 21, a nast epnie skrwawiono dnia 26. Poziomy IgGl i IgG2a mierzono u homozygotycznych myszy z nokautem i myszy typu dzikiego. Jak przedstawiono po lewej stronie wykresu, poziomy IgGl by ly równe u myszy typu dzikiego i myszy z nokautem, podczas gdy poziomy IgG2a by ly znacz aco ni zsze u myszy z nokautem TCCR -/- w porównaniu z myszami typu dzikiego, odzwierciedlaj ac os labion a odpowied z Th1 u myszy TCCR -/-. Fig. 15(A-B) jest graficznym przedstawieniem pokazuj acym, które typy komórek spo sród mysich splenocytów wyra zaj a TCCR. Fig. 15A przedstawia poziomy dla komórek CD4, CD8, CD19, NK1.1 i F4/80, gdzie ekspresja jest najwy zsza w komórkach, T CD4 i naturalnych zabójcach. Fig. 15B przed- stawia poziomy ekspresji w komórkach TH0, Th1 i Th2, przy czym ekspresja jest najwy zsza w komór- kach Th0 i jej poziom spada w czasie ró znicowania komórek CD4 zarówno w komórki Th1, jak i Th2. Ekspresj e TCCR wykryto poprzez PCR w czasie rzeczywistym i normalizowano wzgl edem rp119, genu rybosomalnego o sta lym poziomie ekspresji. Heid, CA. i wsp., 1996, Genomes Res., 6:986-94.PL 206 846 B1 8 Fig. 16(A-D) jest graficznym przedstawieniem indukowanego przez antygen wytwarzania cyto- kin i proliferacji za po srednictwem komórek w ez la limfatycznego z myszy z niedoborem TCCR. Myszy typu dzikiego i z niedoborem TCCR immunizowano KLH w pe lnym adiuwancie Freunda (CFA). W ez ly limfatyczne zbierano 9 dni pó zniej i hodowano w obecno sci KLH, jak wskazano, i badano pod k atem ich zdolno sci do wytwarzania (fig. 16A) IFN, (fig. 16B) IL-4, (fig. 16C) IL-5 lub (fig. 16D) ich zdolno sci do proliferacji. Wyniki s a przedstawione, jako warto sci srednie +/- SD uzyskane dla 5 zwierz at w ka z- dej grupie. P<0,004 dla niesparowanego testu T dla ró znic poziomów IFN pomi edzy WT (typu dzikie- go) i KO dla obu steze n KLH. Fig. 17(A-C) jest graficznym przedstawieniem efektu st eze n podklas IgG i wra zliwo sci na zaka- zenie L. monocytogenes. Surowic e zbierano od myszy typu dzikiego i z niedoborem TCCR i ca lkowite st ezenia podklasy IgG okre slano przez ELISA (fig. 17A). Swoiste wobec OVA IgGl i IgG2 od myszy uczulanych OVA/CFT. Surowic e zbierano od myszy typu dzikiego i z niedoborem TCCR, które immu- nizowano OVA w CFA i okre slano poziomy IgGl (rozcie nczenie 1:320000) i IgG2 (rozcie nczenie 1:5000) poprzez test ELISA swoisty dla OVA (fig. 17B). Piec myszy z niedoborem TCCR lub noworod- ków typu dzikiego zaka zano podskórnie 3x10 4 CFU L. monocytogenes. Trzy lub dziewiec dni pó zniej pobierano w atroby i okre slano miano bakterii (fig. 17C). Dane przedstawiono, jako warto sci srednie +/- SD dla 5 zwierz at w kazdej grupie. Uzyskano P<0,001 niesparowanym te scie T przy porównaniu dla WT i KO w obu punktach czasowych. Fig. 18(A-D) jest graficznym przedstawieniem indukcji in vitro ró znicowania i proliferacji komó- rek Th. Komórki T CD4+ oczyszczone ze sledzion myszy typu dzikiego lub z niedoborem TCCR ule- ga ly ró znicowaniu w komórki Th1 lub Th2 (fig. 18A, w obecno sci ConA i napromieniowanych lub APC typu dzikiego (fig. 18B) po pobudzeniu przeciwcia lem przeciw CD3 i przeciw CD28. Wytwarzanie IFN i IL-4 okre slono przez ELISA. Wynik podano, jako warto sc sredni a + /- SD dla pul po 5 myszy na gru- p e. ND oznacza, ze nie wykryto. Fig. 18C obrazuje indukowan a IL-2 proliferacj e splenocytów pocho- dz acych od myszy typu dzikiego i z niedoborem TCCR. Splenocyty aktywowane ConA inkubowano przez 24 godz. w obecno sci, jak to podano, rosn acych steze n IL-12. Proliferacj e komórek mierzono przez wbudowywanie [ 3 H] tymidyny w czasie ostatnich 6 godz. Fig. 18D przedstawia poziomy mRNA dla IL-12R w niepobudzonych (bia le s lupki) i pobudzonych ConA (czarne s lupki) splenocytach. Komór- ki T ze sledziony pobudzano ConA przez 72 godz. i oznaczono poziomy mRNA dla I1-12R 1 i IL-12R przy pomocy ilo sciowej reakcji PCR w czasie rzeczywistym (Taqman). Krotno sc wzrostu oznaczono wzgl e- dem poziomów RNA obecnych w niepobudzonych komórkach typu dzikiego. Fig. 19 przedstawia sekwencje SEQ ID NO: 5-16 przedstawiaj ace startery i sondy u zyte w ana- lizie Taqman. Szczegó lowy opis korzystnych wykona n. I. Definicje. Termin „choroba zwi azana z uk ladem immunologicznym” oznacza chorob e, w której sk ladnik uk ladu immunologicznego ssaka powoduje, po sredniczy lub w inny sposób uczestniczy w smiertelno- sci ssaka. Obejmuje on równie z choroby, w których pobudzenie lub interwencja odpowiedzi immuno- logicznej lagodzi skutek rozwoju choroby. Terminem tym s a obj ete choroby z udzia lem uk ladu immu- nologicznego ze stanem zapalnym, choroby ze stanem zapalnym bez udzia lu uk ladu immunologicz- nego, choroby zaka zne, choroby z niedoborem odporno sci, powstawanie nowotworów, itp. Termin „choroba z udzia lem TH1” oznacza chorob e charakteryzuj ac a si e nadprodukcj a cytokin Th1, wlacznie z tymi b ed acymi wynikiem nadprodukcji lub odchylenia w ró znicowaniu komórek T do podtypu Th1. Choroby takie obejmuj a, przyk ladowo, choroby autoimmunologiczne ze stanem zapal- nym (np. alegiczne zapalenie mózgu i rdzenia, stwardnienie rozsiane, cukrzyc e insulinozale zn a, stwardnienie rozsiane, alergiczne zapalenie naczyniówki, tyreotoksykoza, twardzina skóry, uk ladowy tocze n rumieniowaty, reumatoidalne zapalenie stawów, zapalenie jelita (np. choroba Crohna, wrzo- dziej ace zapalenie okreznicy, miejscowe zapalenie jelita, zapalenie dystalnej cz esci kr etnicy, miejsco- we zapalenie kr etnicy, ziarniniakowate zapalenie jelita), autoimmunologiczna choroba tarczycy, niedo- krwisto sc z lo sliwa i odrzut alloprzeszczepu. Termin „choroba z udzia lem Th2” oznacza chorob e charakteryzuj ac a si e nadprodukcj a cytokin Th2, w lacznie z tymi b ed acymi wynikiem nadprodukcji lub odchylenia w ró znicowaniu komórek T do podtypu Th2. Choroby takie obejmuj a przyk ladowo, zaostrzenie przebiegu chorób zaka znych (np. Le- ishmania major, Mycobacterium leprae, Candida albicans, ToKoplasma gondi, syncytialne wirusy uk ladu oddechowego, ludzki wirus upo sledzenia odporno sci) i choroby alergiczne, takie jak nadwra zliwo scPL 206 846 B1 9 anafilaktyczn a, astma, alergiczne zapalenie b lony sluzowej nosa, atopowe zapalenie skóry, wiosenne zapalenie spojówek, egzema, pokrzywka i alergie pokarmowe itp. Przyk ladami innych chorób immunologicznych, zwi azanych z uk ladem immunologicznym i cho- rób zapalnych, w których po srednicz a efekty (np. profile uwalniania cytokin) ró znicowania si e komórek T w podtypy Th1 i Th2 i które mog a by c leczone zgodnie z wynalazkiem obejmuj a, uk ladowy tocze n rumieniowaty, reumatoidalne zapalenie stawów, m lodzie ncze przewlek le zapalenie stawów, chorob e kr egów i stawów, stwardnienie ogólne (twardzina skóry), pierwotny zanik mi esni ze stanem zapalnym (zapalenie skórno-miesniowe, zapalenie wielomiesniowe), zespó l Sjogrena, ogólne sarkoidalne zapa- lenie naczy n, autoimmunologiczna anemi e hemolityczn a (immunologiczn a niedokrwisto sc aplastycz- n a, napadow a nocn a hemoglobinuri e), autoimmunologiczna D ma lop lytkowo sc (idiopatyczn a plamic e ma lop lytkow a, immuno-zale zn a ma lop lytkowo sc), zapalenie tarczycy (chorob e Gravesa, zapalenie tarczycy typu Hashimoto, m lodociane limfocytarne zapalenie tarczycy, zanikowe zapalenie tarczycy), autoimmunologiczne choroby zapalne (np. 5 alergiczne zapalenie mózgu i rdzenia, stwardnienie roz- siane, cukrzyc e insulinozale zn a, alergiczne zapalenie naczyniówki, nadczynno sc tarczycy, stwardnie- nie, uk ladowy tocze n rumieniowaty, reumatoidalne zapalenie stawów, zapalenie jelita (np. chorob e Crohna, wrzodziej ace zapalenie okr eznicy, miejscowe zapalenie jelita, zapalenie dystalnej cz esci kr etnicy, miejscowe zapalenie kr etnicy, zapalenie ko ncowej cz esci kr etnicy, ziarniniakowate zapalenie jelita), autoimmunologiczna chorob e tarczycy, niedokrwisto sc z lo sliw a i odrzucanie alloprzeszczepu, cukrzyc e, immunozale zn a chorob e nerek (zapalenie k lebuszków nerkowych, sródmi azszowe zapale- nie nerki), choroby z demielinizacj a w centralnym i obwodowym uk ladzie nerwowym, takie jak stward- nienie rozsiane, polineuropatia zapalna z idiopatyczn a demielinizacj a lub zespó l Guillain-Barre i prze- wlek la polineuropatia zapalna z idiopatyczn a demielinizacj a, choroby w atroby i woreczka zó lciowego, takie jak zaka zne zapalenie w atroby (A, B, C, D, E i inne powodowane przez inne wirusy nie hepato- tropowe), autoimmunologiczne przewlek le aktywne zapalenie w atroby, pierwotna zó lciowa marskosc w atroby, ziarniniakowate zapalenie w atroby i zapalenie stwardniaj ace dróg zó lciowych, chorob e za- paln a jelita (wrzodziej ace zapalenie okr eznicy, chorob e Crohna), enteropati e z wra zliwo sci a na gluten i chorob e Whipple'a, autoimmunologiczne lub zwi azane z odporno sci a choroby skóry, wlacznie z cho- robami skóry z p echerzami, rumieniem wielopostaciowym, luszczyc a, chorobami alergicznymi, takimi jak astma, alergiczne zapalenie b lony sluzowej nosa, atopowe zapalenie skóry, nadwra zliwo sc na pokarm i pokrzywka, choroby immunologiczne p luc, takie jak eozynofilne zapalenie p luc, idiopatyczne zw lóknienie p luc i zapalenie p luc z nadwra zliwo sci a, choroby zwi azane z przeszczepem, obejmuj ace odrzucenie przeszczepu i chorob e przeszczep przeciwko gospodarzowi. Choroby zaka zne obejmuj a- ce choroby wirusowe, takie jak AIDS (zaka zenie HIV), wirusowe zapalenie w atroby typu A, B, C, D i E, opryszczka itp., infekcje bakteryjne, infekcje grzybowe, infekcje pierwotniakami, infekcje paso zytnicze i syncytialny wirus uk ladu oddechowego, ludzki wirus upo sledzenia odporno sci itp.) oraz choroby aler- giczne, takie jak nadwra zliwo sc anafilaktyczn a, astma, alergiczne zapalenie b lony sluzowej nosa, atopowe zapalenie skóry, wiosenne zapalenie spojówki, egzema, pokrzywka i alergie pokarmowe itp. „Leczenie” jest dzia laniem prowadzonym celem zapobie zenia rozwojowi lub zmianie patologii choroby. Zgodnie z tym „leczenie” dotyczy zarówno post epowania terapeutycznego jak i profilaktycz- nego lub dzia lan zachowawczych, gdzie celem jest zapobieganie, spowolnienie lub z lagodzenie okre- slonego stanu patologicznego lub choroby. Wymagaj acy leczenia to ci, którzy ju z s a dotkni eci choro- b a, jak równie z ci, u których chorobie ma si e zapobiec. W leczeniu choroby zwi azanej z odporno sci a (np. choroby z udzia lem Th1 i Th2) czynnik terapeutyczny mo ze bezpo srednio zmniejsza c lub zwi ek- sza c zakres reakcji patologicznego sk ladnika choroby lub czyni c chorob e bardziej wra zliw a na lecze- nie innymi czynnikami terapeutycznymi np. antybiotykami, srodkami przeciwgrzybowymi i czynnikami przeciwzapalnymi, chemioterapeutykami itp. Termin „skuteczna ilo sc” to minimalne st ezenie polipeptydu TCCR, jego agonisty i/lub jego an- tagonisty powoduj acego, indukuj acego lub prowadz acego zarówno do wykrywalnego odchylenia w ró znicowaniu komórek T b ad z do podtypu Th1, b ad z podtypu Th2, jak i/lub zmiany profilu uwalnia- nia cytokin, które te podtypy komórek T wydzielaj a. Ponadto „terapeutycznie skuteczna ilosc” jest minimalnym st ezeniem (ilo sci a) polipeptydów TCCR, jego agonisty i/lub jego antagonisty, która b edzie skuteczna w leczeniu zarówno chorób z udzia lem od Th1, jak i z udzia lem Th2. „Przewlek le” podawanie dotyczy podawania czynnika(ów) w sposób ci ag ly, w odró znieniu od podania nag lego, tak aby podtrzyma c wyj sciowy skutek terapeutyczny (aktywno sc) przez d luzszyPL 206 846 B1 10 okres czasu. „Po srednie” podanie jest leczeniem, które nie jest prowadzone w sposób ci ag ly bez przerw, lecz raczej ma charakter cykliczny. „Patologia” w odniesieniu do choroby zwi azanej z uk ladem immunologicznym obejmuje wszyst- kie zjawiska, które upo sledzaj a dobre samopoczucie pacjenta. Obejmuje to bez ogranicze n, nieprawi- d lowy lub niekontrolowany wzrost komórek, wytwarzanie przeciwcia l, wytwarzanie autoprzeciwcia l, wytwarzanie i aktywacj e dope lniacza, zaburzenie prawid lowego dzia lania s asiaduj acych komórek, uwalnianie cytokin lub innych produktów wydzielniczych na nieprawid lowych poziomach, hamowanie lub pogorszenie jakiejkolwiek odpowiedzi zapalnej lub immunologicznej, naciekanie komórek zapal- nych (neutrofili, eozynofili, monocytów, limfocytów) do przestrzeni sródtkankowej, itp. „Ssak” dla celów leczenia dotyczy jakiegokolwiek zwierz ecia sklasyfikowanego, jako ssak, w lacznie z cz lowiekiem, zwierz etami hodowlanymi i gospodarskimi, z ogrodów zoologicznych, sporto- wymi lub domowymi, takimi jak psy, konie, koty, byd lo, owce, swinie, go lebie, kozy, króliki itp. Dogod- nie ssakiem jest cz lowiek. Podanie „w po laczeniu z” jednego lub wi ekszej liczby czynników terapeutycznych obejmuje podanie równoczesne (równoleg le) i kolejne w dowolnej kolejno sci. „No sniki” w u zytym tu znaczeniu obejmuj a farmaceutycznie akceptowalne no sniki, zarobki lub substancje stabilizuj ace, które s a nietoksyczne dla komórki lub ssaka wystawionego na ich dzia lanie, w stosowanych dawkach i st ezeniach. Cz esto akceptowalnym fizjologicznie no snikiem jest wodny roztwór o buforowanym pH. Przyk lady fizjologicznie akceptowalnych no sników obejmuj a bufory, takie jak bufor fosforanowy, cytrynianowy lub oparty na innym kwasie organicznym; przeciwutleniacze obejmuj ace kwas askorbinowy; polipeptydy o niskim ciezarze cz asteczkowym (mniej ni z 10 reszt); bia lka takie jak albumina surowicy, zelatyna lub immunoglobuliny; hydrofilowe polimery, takie jak poli- winylopirolidon; aminokwasy, takie jak glicyna, glutamina, asparagina, arginina lub lizyna, monosacha- rydy, disacharydy i inne w eglowodany obejmuj ace glukoz e, mannoz e lub dekstryny; czynniki chelatu- jace, takie jak EDTA; alkohole cukrów, takie jak mannitol lub sorbitol; tworz ace sole jony, takie jak sód; i/lub niejonowe substancje powierzchniowo czynne, takie jak TWEEN ™ , glikol polietylenowy (PEG) i PLURONICS ™ . Termin „czynnik cytotoksyczny” w u zytym tu znaczeniu dotyczy substancji hamuj acej lub zapo- biegaj acej dzia laniu komórek i/lub powoduj acej zniszczenie komórek. Termin ma obejmowa c izotopy promieniotwórcze (np. I 131 , I 125 , Y 125 , Y 90 i RE 186 ), czynniki chemioterapeutyczne i toksyny, takie jak enzymatycznie aktywne toksyny pochodzenia bakteryjnego, grzybowego, ro slinnego i zwierz ecego, lub ich fragmenty. „Czynnik hamuj acy wzrost” w u zytym tu znaczeniu dotyczy zwi azku lub kompozycji hamuj acej wzrost komórki, szczególnie komórki nowotworowej, w której nadmiernej ekspresji ulega jeden ze zidentyfikowanych tu genów i to zarówno in vitro jak i in vivo. Tak, wi ec czynnikiem hamuj acym wzrost jest taki, który znacz aco ogranicza procent komórek, w których takie geny ulegaj a nadmiernej ekspre- sji w fazie S. Przyk lady czynników hamuj acych wzrost obejmuj a czynniki blokuj ace post ep cyklu ko- mórkowego (w miejscu innym ni z faza S), takie jak czynniki, które indukuj a zatrzymanie komórki w fazie G1 i M. Klasyczne czynniki blokuj ace komórk e w fazie M obejmuj a alkaloidy z winobluszczu (winkrystyna i winblastyna), taksol i inhibitory topo II, takie jak doksorubicyna, epirubicyna, daunorubi- cyna, etopozyd i bleomycyna. Czynniki hamuj ace komórk e w fazie G1 obejmuj a równie z zatrzymanie komórki w fazie S i s a nimi przyk ladowo czynniki alkiluj ace DNA, takie jak tamoksyfen, prednizon, dakarbazyna, mechloretamina, cisplatyna, metotreksat, 5-fluorouracyl i ara-C. Dalsze informacje mo z- na znale zc w The Molecular Basis of Cancer, Mendelsohn i Israel, wyd., Rozdzia l I zatytu lowany „Celi cycle regulation, oncogens and antineoplastic & drugs” Murakami i wsp., (WB Saunders: Philadelphia, 1995), szczególnie na str. 13. Termin „cytokina” jest ogólnym terminem okre slaj acym bia lka uwalniane przez jedn a populacj e komórek, które dzia laj a jako mi edzykomórkowe przeka zniki na inn a komórk e. Przyk ladami takich cy- tokin s a limfokiny, monokiny i tradycyjne hormony polipeptydowe. Cytokiny obejmuj a hormon wzrostu, taki jak ludzki hormon wzrostu, N-metionylowy ludzki hormon wzrostu i bydl ecy hormon wzrostu; hor- mon przytarczyczny; tyroksyn e; insulin e; proinsulin e; relaksyn e; prorelaksyn e; hormony glikoproteino- we, takie jak hormon folikulotropowy (FSH), hormon pobudzaj acy tarczyc e (TSH) i hormon lutenizuj a- cy (LH); w atrobowy czynnik wzrostu; fibroblastowy czynnik wzrostu; prolaktyn e; lozyskowy laktogen; czynniki martwicy nowotworów a i ß; substancj e hamuj ac a muleryn e; mysi peptyd towarzysz acy go- nadotropinie; inhibin e; aktywin e; czynnik wzrostu sródb lonka naczy n, integryn e, trombopoetyn e (TPO); czynniki wzrostu nerwów, takie jak NGF- ß; czynnik wzrostu p lytek krwi; transformuj ace czynniki wzrostuPL 206 846 B1 11 (TGF), takie jak TGF- a i TGF- ß; insulinopodobne czynniki wzrostu I i II; erytropoetyn e (EPO); czynniki indukuj ace tworzenie ko sci; interferony, takie jak interferon a, ß i ?; czynniki stymuluj ace tworzenie kolonii komórek (CSF), takie jak makrofagowy-CSF (M-CSF), granulocytarno-makrofagowy-CSF (GM- CSF) i granulocytarny-CSF (G-CSF); interleukiny (IL), takie jak IL-1, IL-1 a, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-11, IL-12; czynniki martwicy nowotworu, takie jak TNF- a lub TNF- ß; i inne polipepty- dowe czynniki w tym LIF i ligand kit (KL). W u zytym tu znaczeniu termin cytokina obejmuje bia lka po- chodz ace z naturalnych zróde l lub z hodowli rekombinowanych komórek i biologicznie aktywnych równowa zników naturalnych sekwencji cytokin. Terminy „polipeptyd TCCR”, „bia lko TCCR” i „TCCR”, gdy s a tu u zywane, obejmuj a naturaln a sekwencj e TCCR i warianty polipeptydu TCCR (które b ed a tu dok ladniej zdefiniowane). Polipeptyd TCCR mo ze by c wyizolowany z ró znych zróde l, takich jak ró zne rodzaje ludzkich tkanek lub z innego zród la lub przygotowane poprzez rekombinowanie i/lub sposobami syntezy. „Natywna sekwencja TCCR” obejmuje polipeptyd maj acy tak a sam a sekwencj e aminokwasow a, co TCCR pochodz acy ze zród la naturalnego. Taka natywna sekwencja TCCR mo ze by c wyizolowana ze zród la naturalnego lub mo ze by c wytworzona przez rekombinowanie i/lub syntez e. Termin „natyw- na sekwencja TCCR” obejmuje konkretnie naturalnie wyst epuj ace postaci skrócone lub wydzielane (np. sekwencj e domeny zewn atrzkomórkowej), naturalnie wyst epuj ace postaci skrócone (np. postaci b ed ace wynikiem alternatywnego sk ladania) i naturalnie wyst epuj ace warianty alleliczne TCCR. W pewnym wykonaniu tu opisanym natywna sekwencj a TCCR jest dojrza la lub pe lnej d lugo sci sekwen- cja TCCR obejmuj aca aminokwasy od 1 do 636 z fig. 3 (SEQ ID N0:1). Podobnie, naturaln a sekwen- cja mysiego TCCR jest naturalna sekwencja TCCR pe lnej d lugo sci obejmuj aca aminokwasy 1 do 623 fig. 4 (SEQ ID N0:2). Równiez jakkolwiek polipeptydy TCCR ujawnione na Fig. 3 (SEQ ID N0:1) i fig. 4 (SEQ ID N0:2) s a przedstawione jako zaczynaj ace si e od reszty metioninowej oznaczonej tu jako pozycja aminokwasow a 1, mo zna sobie wyobrazi c i jest to mo zliwe, ze inna metionina po lo zona po- wy zej lub poni zej pozycji aminokwasowej 1 na fig. 3 (SEQ ID N0:2) mo ze by c wykorzystywana jako pierwsza reszta aminokwasow a w polipeptydzie TCCR. „Zewn atrzkomórkowa domena polipeptydu TCCR” lub „TCCR ECD” dotyczy postaci polipeptydu TCCR, która jest zasadniczo wolna od domen transb lonowej i cytoplazmatycznej. Zazwyczaj, polipep- tyd ECD z TCCR zawiera mniej ni z oko lo 1% takich domen transb lonowej i/lub cytoplazmatycznej i dogodnie zawiera mniej ni z oko lo 0,5% takich domen. B edzie zrozumia le, ze jakakolwiek domena(y) transb lonowa zidentyfikowana dla polipeptydów TCCR tu opisanych jest zidentyfikowana zgodnie z kryteriami rutynowo stosowanymi w tej dziedzinie dla identyfikacji tego typu hydrofobowej domeny. Dok ladne granice domeny transb lonowej mog a si e ró zni c, lecz najprawdopodobniej nie b ed a ró zni c sie wi ecej ni z oko lo 5 aminokwasów po ka zdej stronie domeny od zidentyfikowanych wyj sciowo. Tak wi ec, w jednym z wykona n tu opisanych domena zewn atrzkomórkowa polipeptydu TCCR zawiera aminokwasy od 1 lub od oko lo 33 do X 1 , gdzie X 1 jest dowoln a reszt a aminokwasow a pocz awszy od reszty 512 do reszty 522 z fig. 3 (SEQ ID N0:1). Podobnie zewn atrzkomórkowa domena mysiego poli- peptydu TCCR obejmuje aminokwasy od 1 lub do okolo 25 do X 2 , gdzie X 2 jest dowoln a reszt a amino- kwasow a od reszty 509 do reszty 519 z fig. 4 (SEQ ID N0:2). „Wariant polipeptydu TCCR” oznacza aktywny polipeptyd TCCR, jak zdefiniowano poni zej, maj a- cy co najmniej oko lo 80% sekwencji aminokwasowej identycznej z sekwencj a aminokwasow a: (a 1 ) ami- nokwas 1 lub oko lo 33 do 636 ludzkiego polipeptydu TCCR przedstawionego na fig. 3 (SEQ ID N0:1); (a 2 ) aminokwas 1 lub oko lo 25 do 623 mysiego polipeptydu TCCR przedstawionego na fig. 4 (SEQ ID N0:2); (b 1 ) X 3 do 636 ludzkiego polipeptydu TCCR przedstawionego na fig. 3 (SEQ ID N0:1), gdzie X 3 jest dowoln a reszt a aminokwasow a 27 do 37 z fig. 3 (SEQ IS N0:1); (b 2 ) X 4 do 623 mysiego polipeptydu TCCR przedstawionego na fig. 4 (SEQ ID N0:2), gdzie X 4 jest dowoln a reszt a aminokwasow a od 20 do 30 z fig. 4 (SEQ ID N0:2); (c 1 ) 1 lub oko lo 33 do X 1 , gdzie X 1 jest dowoln a reszt a aminokwasow a od 512 do 522 z fig. 3 (SEQ ID N0:1); (c 2 ) 1 lub oko lo 25 do X 2 , gdzie X 2 jest dowoln a reszt a aminokwasow a od 509 do 519 z fig. 4 (SEQ ID N0:2); (d 1 ) X 5 do 636, gdzie dowoln a reszt a aminokwasow a od 533 do 543 z fig. 3 (SEQ ID N0:1); (d 2 ) X 6 do 623, gdzie X 6 jest dowoln a reszt a aminokwasow a od 527 do 537 z fig. 4 (SEQ ID N0:2) lub (e) innym konkretnym fragmentem pochodz acym z sekwencji aminokwaso- wych przedstawionych na fig. 3 (SEQ ID N0:1) i fig. 4 (SEQ ID N0:2). Takie warianty polipeptydu TCCR obejmuj a przyk ladowo polipeptydy TCCR, gdzie dodano lub usuni eto jeden lub wi ecej aminokwasów na ko ncu N i/lub C, jak równie z jedn a lub wi ecej wewn etrz- nych domen z sekwencji z fig. 3 (SEQ ID N0:1) i fig. 4 (SEQ ID N0:2). Zazwyczaj, wariant polipeptydu b edzie mia l przynajmniej oko lo 80% identyczno sci sekwencji aminokwasowej, zw laszcza przynajmniejPL 206 846 B1 12 oko lo 81% identyczno sci sekwencji aminokwasowej, zw laszcza przynajmniej oko lo 82% identyczno sci sekwencji aminokwasowej, zw laszcza przynajmniej 83% identyczno sci sekwencji aminokwasowej, zw laszcza przynajmniej 84% identyczno sci sekwencji aminokwasowej, zw laszcza przynajmniej oko lo 85% identyczno sci sekwencji aminokwasowej, zw laszcza przynajmniej 86% identyczno sci sekwencji aminokwasowej, zw laszcza przynajmniej 87% identycznosci sekwencji aminokwasowej, zw laszcza przynajmniej 88% identyczno sci sekwencji aminokwasowej, zw laszcza przynajmniej 89% identyczno- sci sekwencji aminokwasowej, zw laszcza przynajmniej 90% identyczno sci sekwencji aminokwasowej, zw laszcza przynajmniej 91% identyczno sci sekwencji aminokwasowej, zw laszcza przynajmniej 92% identyczno sci sekwencji aminokwasowej, zw laszcza przynajmniej 93% identyczno sci sekwencji ami- nokwasowej, zw laszcza przynajmniej oko lo 94% identyczno sci sekwencji aminokwasowej, zw laszcza przynajmniej 95% identyczno sci sekwencji aminokwasowej, zw laszcza przynajmniej 96% identyczno- sci sekwencji aminokwasowej, zw laszcza przynajmniej 97% identyczno sci sekwencji aminokwasowej, zw laszcza przynajmniej 98% identyczno sci sekwencji aminokwasowej, zw laszcza przynajmniej 99% identyczno sci sekwencji aminokwasowej z: (a 1 ) aminokwas 1 lub oko lo 33 do 636 ludzkiego polipepty- du TCCR przedstawionego na fig. 3 (SEQ ID N0:1); (a 2 ) aminokwas 1 lub oko lo 25 do 623 mysiego polipeptydu TCCR przedstawionego na fig. 4 (SEQ ID N0:2); (b 1 ) X 3 do 636 ludzkiego polipeptydu TCCR przedstawionego na fig. 3 (SEQ ID N0:1), gdzie X 3 jest dowolnym aminokwasem od 27 do 37 z fig. 3 (SEQ ID N0:1); (b 2 ) X 4 do 623 mysiego polipeptydu TCCR przedstawionego na fig. 4 (SEQ ID N0:2), gdzie X 4 jest dowolnym aminokwasem od 20 do 30 z fig. 4 (SEQ ID N0:2); (c 1 ) od 1 lub oko lo 33 do X 1 , gdzie X 1 jest dowolnym aminokwasem od 512 do 522 z fig. 3 (SEQ ID N0:1); (c 2 ) od 1 lub oko lo 25 do X 2 , gdzie X 2 jest dowolnym aminokwasem od 509 do 519 z fig. 4 (SEQ ID N0:2); (d 1 ) X 5 do 636, gdzie X 5 jest dowolnym aminokwasem od 533 do 543 z fig. 3 (SEQ ID N0:1); (d 2 ) X 6 do 623, gdzie X 6 jest dowolnym aminokwasem od 527 do 537 z fig. 4 (SEQ ID N0:2) lub (e) innym konkretnym fragmentem pochodz acym z sekwencji aminokwasowej przedstawionej na fig. 3 (SEQ ID N0:1) i fig. 4 (SEQ ID N0:2). Warianty polipeptydów TCCR maj a d lugosc przynajmniej 10 aminokwasów, cz esto d lugo sc przynajmniej 20 aminokwasów, cz esciej d lugo sc oko lo 30 aminokwasów, cz esciej d lugo sc oko lo 40 aminokwasów, cz esciej d lugo sc oko lo 50 aminokwasów, cz esciej d lugosc oko lo 60 aminokwasów, cz esciej d lugosc oko lo 70 aminokwasów, cz esciej d lugo sc oko lo 80 aminokwasów, cz esciej d lugo sc oko lo 90 aminokwasów, cz esciej d lugo sc oko lo 100 aminokwasów, cz esciej d lugo sc oko lo 150 amino- kwasów, cz esciej d lugo sc oko lo 200 aminokwasów, cz esciej d lugosc oko lo 250 aminokwasów, cz e- sciej d lugo sc oko lo 300 aminokwasów, cz esciej d lugosc oko lo 400 aminokwasów, cz esciej d lugosc oko lo 500 aminokwasów, najcz esciej d lugosc oko lo 600 lub wi ecej aminokwasów. „Procent (%) identyczno sci sekwencji aminokwasowej” w odniesieniu do zidentyfikowanych tu sekwencji polipeptydowych jest zdefiniowany jako procent reszt aminokwasowych w kandyduj acej sekwencji, które s a identyczne z resztami aminokwasowymi w sekwencji polipeptydów TCCR, po przyrównaniu sekwencji i wprowadzeniu przerw, je sli jest to niezb edne dla uzyskania maksymalnej, wyra zonej w procentach, identyczno sci sekwencji, i nie bior ac pod uwag e jakichkolwiek konserwatyw- nych podstawie n jako sk ladnika identyczno sci sekwencji. Przyrównanie dla celów okre slenia procen- towej identyczno sci sekwencji aminokwasowej mo ze by c osi agni ete ró znymi sposobami, które miesz- cz a si e w zakresie umiej etno sci w tej dziedzinie, przyk ladowo u zywaj ac publicznie dost epnych pro- gramów komputerowych takich jak program BLAST, BLAST-2, ALIGN, ALIGN-2 lub Megalign (DNA- STAR). Specjali sci w tej dziedzinie mog a okre sli c odpowiednie parametry dla dokonania przyrówna- nia, w lacznie z dowolnymi algorytmami potrzebnymi dla uzyskania maksymalnego przyrównania na ca lej d lugo sci porównywanych sekwencji. Jednak, dla celów tego opisu warto sci % identyczno sci se- kwencji aminokwasowej s a uzyskiwane jak to opisano poni zej przy pomocy programu komputerowego do porównywania sekwencji ALIGN-2, gdzie pe lne dane dla programu ALIGN-2 s a podane w tabeli 3 (A-Q). Autorem programu ALIGN-2 dla porównywania sekwencji jest Genentech Inc., a zród lo kodu podane w tabeli 3 (A-Q) wype lniono zgodnie ze wskazówkami dla u zytkownika z U.S. Copyright Offi- ce, Washington D.C., 20559, gdzie jest on zarejestrowany jako U.S. Copyrighy Registration No. TXU510087. Program Align-2 jest dost epny publicznie z Genentech, Inc., South San Francisco, Kali- fornia lub mo ze by c uzyskany z innych zróde l podanych w Tabeli 3 (A-Q). Program ALIGN-2 mo ze by c kompilowany dla u zycia przy pomocy systemu operacyjnego UNIX, zw laszcza cyfrowego UNIX V4.0D. Wszystkie parametry porównania sekwencji s a ustawione przez program ALIGN-2 i nie podlegaj a zmianom.PL 206 846 B1 13 Dla celów tego opisu % identyczno sci sekwencji aminokwasowej danej sekwencji aminokwa- sowej A wzgl edem albo wobec danej sekwencji aminokwasowej B (co alternatywnie mo ze by c okre- slone jako dana sekwencja aminokwasow a A, która ma albo wykazuje okre slony % identyczno sci sekwencji aminokwasowej wzgl edem albo wobec danej sekwencji aminokwasowej B) oblicza si e jak nast epuje: 100 razy proporcja X/Y gdzie X jest liczb a reszt aminokwasowych okre slonych, jako identyczne na podstawie przyrów- nania sekwencji programem ALIGN-2, gdzie program porównuje A i B i gdzie, Y jest ca lkowit a liczb a aminokwasów w sekwencji B. Powinno by c dostrze zone, ze gdy d lugo sc sekwencji aminokwasowej A nie jest równa d lugo sci sekwencji aminokwasowej B, to % identyczno sci sekwencji aminokwasowej A wzgl edem B nie b edzie równy % identyczno sci sekwencji aminokwasowej B wzgl edem A. Przyk lado- we obliczenia % identyczno sci sekwencji aminokwasowej przedstawione w Tabeli 2 (A-B) pokazuj a jak obliczy c % identyczno sci sekwencji aminokwasowej dla sekwencji aminokwasowej oznaczonej jako „Porównywane Bia lko” wzgl edem sekwencji aminokwasowej oznaczonej jako „PRO”. Je sli nie b edzie podane inaczej, wszystkie u zywane tu warto sci % identyczno sci sekwencji ami- nokwasowej otrzymano jak to opisano powy zej przy pomocy programu komputerowego do porówny- wania sekwencji ALIGN-2. Jednak ze % identyczno sci sekwencji aminokwasowej mo ze równie z zosta c okre slony przy pomocy programu do porównywania sekwencji NCBI-Blast2 (Altschul i wsp., Nucleic Acids Res. 25:3389-3402 (1997)). Program do porównywania sekwencji NCBI-BLAST2 mo zna pobra c pod adresem sieciowym http: / /www.ncbi.nim.nih.gov albo uzyska c z National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA 20892. NCBI-BLAST2 wykorzystuje szereg takich parametrów, gdzie wszystkie te parametry do analizy s a ustawione jako warto sci domy slne, w tym przyk ladowo unmask=yes, strand=all, expected occurrences=10, minimum Iow complexity lenth=15/5, multi-pass e-value=0,01, constant for multi-pass=25, dropoff for final gapped alignment=25 i scoring matrix=BLOSUM62. W sytuacji, gdy do porównywania sekwencji aminokwasowych stosowany jest program NCBI- BLAST2, % identyczno sci danej sekwencji aminokwasowej A wzgl edem albo wobec danej sekwencji aminokwasowej B (co alternatywnie mo zna wyrazi c jako dana sekwencja aminokwasow a A, która ma lub wykazuje pewien % identyczno sci sekwencji aminokwasowej wzgl edem lub wobec sekwencji ami- nokwasowej B) oblicza si e jak nast epuje: 10 razy proporcja X/Y gdzie X jest liczb a reszt aminokwasowych okre slonych, jako identyczne na podstawie przyrów- nania sekwencji programem NCBI-BLAST2, gdzie program porównuje A i B i gdzie, Y jest ca lkowit a liczb a aminokwasów w sekwencji B. Powinno by c dostrze zone, ze gdy d lugo sc sekwencji aminokwa- sowej A nie jest równa d lugo sci sekwencji aminokwasowej B, to % identyczno sci sekwencji amino- kwasowej A wzgl edem B nie b edzie równy % identyczno sci sekwencji aminokwasowej B wzgl edem A. Terminem „polipeptydy tu opisane” s a równie z obj ete polipeptydy, które w kontek scie porówna n identyczno sci sekwencji aminokwasowych przeprowadzonych jak opisano powy zej zawieraj a w po- równanych sekwencjach aminokwasy, które nie tylko s a identyczne, lecz równie z takie, które maj a podobne w la sciwo sci. Peptydy takie s a okre slone, jako „dodatnie”. Reszty aminokwasowe, które li- czone s a, jako warto sc dodatnia dla reszty aminokwasowej b ed acej przedmiotem zainteresowania, to takie, które s a b ad z identyczne wzgl edem reszty aminokwasowej b ed acej przedmiotem zaintereso- wania b ad z s a odpowiednimi podstawieniami, (które zdefiniowano poni zej w tabeli 2) reszt aminokwa- sowych b ed acych przedmiotem zainteresowania. Dla celów niniejszego opisu % warto sci dodatnich dla danej sekwencji aminokwasowej A wzgl edem lub w porównaniu z dan a sekwencj a aminokwasow a B, (co alternatywnie mo zna wyrazi c jako dana sekwencja aminokwasow a A maj aca lub wykazuj aca okre slon a % warto sci dodatnich wzgl edem lub wobec danej sekwencji aminokwasowej B) oblicza si e jak nast epuje: 10 razy proporcja X/Y gdzie X jest liczb a reszt aminokwasów okre slonych, jako identyczne na podstawie przyrównania sekwencji programem Align-2, gdzie program porównuje A i B i gdzie Y jest ca lkowit a liczb a amino- kwasów w sekwencji B. Powinno by c dostrze zone, ze gdy dlugo sc sekwencji aminokwasowej A nie jest równa d lugo sci sekwencji aminokwasowej B to % warto sci dodatnich w A wzgl edem B nie b edzie równy % warto sci dodatnich B wzgl edem A. „Wariant polinukleotydu TCCR” lub „wariant sekwencji nukleotydowej TCCR” oznaczaj a cz astecz- k e kwasu nukleinowego koduj ac a aktywny polipeptyd TCCR, jak zdefiniowano poni zej i który posiada oko lo 80% identyczno sci sekwencji kwasu nukleinowego wzgl edem sekwencji kwasu nukleinowegoPL 206 846 B1 14 koduj acej: (a 1 ) reszty aminokwasowe od 1 lub oko lo 33 do 636 ludzkiego polipeptydu TCCR pokazane- go na fig. 3 (SEQ ID N0:1); (a 2 ) reszty aminokwasowe od 1 lub oko lo 25 do 623 mysiego polipeptydu TCCR przedstawionego na fig. 4 (SEQ ID N0:2); (b 1 ) aminokwasy od X 3 do 636 ludzkiego polipeptydu TCCR przedstawionego na fig. 3 (SEQ ID N0:1), gdzie X 3 jest dowolnym aminokwasem od 27 do 37 z fig. 3 (SEQ IS N0:1); (b 2 ) aminokwasy od X 4 do 623 mysiego polipeptydu TCCR przedstawionego na fig. 4 (SEQ ID N0:2), gdzie X 4 jest jakimkolwiek aminokwasem od 20 do 30 z fig. 4 (SEQ ID N0:2); (c 1 ) aminokwasy od 1 lub oko lo 33 do X 1 , gdzie X 1 jest dowoln a reszt a aminokwasow a od reszty 512 do reszty 522 z fig. 3 (SEQ ID N0:1); (c 2 ) aminokwasy od 1 lub oko lo 25 do X 2 , gdzie X 2 jest dowoln a reszt a aminokwasow a od reszty 509 do reszty 519 z fig. 4 (SEQ ID N0:2); (d 1 ) aminokwasy od X 5 do 636, gdzie X 5 jest dowolnym aminokwasem od reszty 533 do reszty 543 z fig. 3 (SEQ ID N0:1); (d 2 ) aminokwasy od X 6 do 623, gdzie X 6 jest dowolnym aminokwasem od reszty 527 do 537 z fig. 4 (SEQ ID N0:2); lub (e) sekwencj a kwasu nukleinowego, która koduje inny konkretny fragment pochodz acy z sekwencji aminokwasowej przedstawionej na fig. 3 (SEQ ID N0:1) i fig. 4 (SEQ ID N0:2). Zazwyczaj, wariant polipeptydu b edzie wykazywa l przynajmniej oko lo 80% identyczno sci sekwencji kwasu nukle- inowego, zw laszcza przynajmniej oko lo 81% identyczno sci sekwencji kwasu nukleinowego, zw laszcza przynajmniej oko lo 82% identyczno sci sekwencji kwasu nukleinowego, zw laszcza przynajmniej 83% identyczno sci sekwencji kwasu nukleinowego, zw laszcza przynajmniej 84% identyczno sci sekwencji kwasu nukleinowego, zw laszcza przynajmniej oko lo 85% identyczno sci sekwencji kwasu nukleinowe- go, zw laszcza przynajmniej 86% identyczno sci sekwencji kwasu nukleinowego, zw laszcza przynajm- niej 87% identyczno sci sekwencji kwasu nukleinowego, zw laszcza przynajmniej 88% identyczno sci sekwencji kwasu nukleinowego, zw laszcza przynajmniej 89% identyczno sci sekwencji kwasu nukle- inowego, zw laszcza przynajmniej 90% identyczno sci sekwencji kwasu nukleinowego, zw laszcza przy- najmniej 91% identyczno sci sekwencji kwasu nukleinowego, zw laszcza przynajmniej 92% identyczno- sci sekwencji kwasu nukleinowego, zw laszcza przynajmniej 93% identyczno sci sekwencji kwasu nu- kleinowego, zw laszcza przynajmniej oko lo 94% identyczno sci sekwencji kwasu nukleinowego, zw laszcza przynajmniej 95% identyczno sci sekwencji kwasu nukleinowego, zw laszcza przynajmniej 96% identyczno sci sekwencji kwasu nukleinowego, zw laszcza przynajmniej 97% identyczno sci se- kwencji kwasu nukleinowego, zw laszcza przynajmniej 98% identyczno sci sekwencji kwasu nukleino- wego, zw laszcza przynajmniej 99% identyczno sci sekwencji kwasu nukleinowego z sekwencj a kwasu nukleinowego koduj ac a reszty aminokwasowe: (a 1 ) od 1 lub oko lo 33 do 636 ludzkiego polipeptydu TCCR przedstawionego na fig. 3 (SEQ ID N0:1); (a 2 ) od 1 lub oko lo 25 do 623 mysiego polipeptydu TCCR przedstawionego na fig. 4 (SEQ ID N0:2); (b 1 ) od do 636 ludzkiego polipeptydu TCCR przed- stawionego na fig. 3 (SEQ ID N0:1), gdzie X 3 jest dowoln a reszt a aminokwasow a od 27 do 37 z fig. 3 (SEQ IS N0:1); (b 2 ) od X 4 do 623 mysiego polipeptydu TCCR przedstawionego na fig. 4 (SEQ ID N0:2), gdzie X 4 jest dowoln a reszt a aminokwasow a od 20 do 30 z fig. 4 (SEQ ID N0:2); (c 1 ) od 1 lub oko lo 33 do X 1 , gdzie X 1 jest dowoln a reszt a aminokwasow a od reszty 512 do reszty 522 z fig. 3 (SEQ ID N0:1); (c 2 ) od 1 lub oko lo 25 do X 2 , gdzie X 2 jest dowoln a reszt a aminokwasow a od reszty 509 do reszty 519 z fig. 4 (SEQ ID N0:2); (d 1 ) od X 5 do 636, gdzie X 5 jest dowoln a reszt a aminokwasow a od reszty 533 do 543 z fig. 3 (SEQ ID N0:1); (d 2 ) od X 6 do 623, gdzie X 6 jest dowoln a reszt a aminokwa- sow a od reszty 527 do 537 z fig. 4 (SEQ ID N0:2) lub (e) innym konkretnym fragmentem pochodz a- cym z sekwencji aminokwasowych przedstawionych na fig. 3 (SEQ ID N0:1) i fig. 4 (SEQ ID N0:2). Zazwyczaj warianty polinukleotydów TCCR maj a d lugosc przynajmniej 30 nukleotydów, cz esto d lugo sc przynajmniej 60 nukleotydów, cz esciej d lugosc przynajmniej oko lo 90 nukleotydów, cz esciej d lugo sc przynajmniej oko lo 120 nukleotydów, cz esciej d lugosc przynajmniej oko lo 150 nukleotydów, cz esciej d lugo sc przynajmniej oko lo 180 nukleotydów, cz esciej d lugo sc przynajmniej oko lo 210 nukle- otydów, cz esciej d lugo sc przynajmniej oko lo 240 nukleotydów, cz esciej d lugo sc przynajmniej oko lo 270 nukleotydów, cz esciej d lugo sc przynajmniej oko lo 300 nukleotydów, cz esciej d lugosc przynajm- niej oko lo 450 nukleotydów, cz esciej d lugo sc przynajmniej oko lo 600 nukleotydów, cz esciej d lugosc przynajmniej oko lo 900 nukleotydów. „Procent (%) identyczno sci sekwencji kwasu nukleinowego” w odniesieniu do zidentyfikowanej tu sekwencji kwasu nukleinowego koduj acej polipeptyd TCCR jest zdefiniowana jako procent nukleotydów w kandyduj acej sekwencji, które s a identyczne z nukleotydami w sekwencji b ed acej przedmiotem zain- teresowania koduj acej polipeptyd tu opisany po przyrównaniu sekwencji i wprowadzeniu przerw, je sli jest to niezb edne dla uzyskania maksymalnej wyra zonej w procentach identyczno sci sekwencji. Przy- równanie dla celów okre slenia procentowej identyczno sci sekwencji nukleotydowej mo ze by c osi agni ete ró znymi sposobami, które mieszcz a si e w zakresie umiej etno sci specjalisty w tej dziedzinie, przyk ladowoPL 206 846 B1 15 przy zastosowaniu publicznie dost epnych programów komputerowych, takich jak program BLAST, BLAST-2, ALIGN, ALIGN-2 lub Megalign (DNASTAR). Specjali sci w tej dziedzinie mog a okre sli c od- powiednie parametry dla dokonania przyrównania, w tym dowolne algorytmy potrzebne dla uzyskania maksymalnego przyrównania na ca lej d lugo sci porównywanych sekwencji. Jednak, dla celów tego opisu warto sc % identyczno sci sekwencji kwasów nukleinowych s a uzyskiwane jak to opisano poni zej przy pomocy programu komputerowego do porównywania sekwencji ALIGN-2, gdzie pe len kod zród lowy dla programu ALIGN-2 jest podany w tabeli 3 (A-Q). Autorem programu ALIGN-2 do porównywania sekwencji jest Genentech Inc., a kod zród lowy podany w tabeli 3 (A-Q) zosta l z lo zony z dokumentacj a u zytkownika w U.S. Copyright Office, Washington D.C., 20559, gdzie jest zarejestrowany jako U.S. Copyrighy Registration Nr TXU510087. Program Align-2 jest dost epny publicznie z Genentech, Inc., South San Francisco, Kalifornia lub mo ze by c skompilowany na podstawie kodu zród lowego podane- go w Tabeli 3 (A-Q). Program ALIGN-2 powinien by c kompilowany dla u zycia w systemie operacyj- nym UNIK, dogodnie cyfrowym UNIK V4.0D. Wszystkie parametry porównania sekwencji s a ustawio- ne przez program ALIGN-2 i s a niezmienne. Dla celów niniejszego wynalazku % identyczno sci danej sekwencji kwasu nukleinowego C z, wobec lub w porównaniu z dan a sekwencj a nukleotydow a D, (co alternatywnie mo zna wyrazi c, jako dana sekwencja nukleotydow a C, która ma albo wykazuje pewien % identyczno sci sekwencji kwasu nukleinowego z lub wzgl edem danej sekwencji kwasu nukleinowego D) oblicza si e jak nast epuje: 100 razy proporcja W/Z gdzie W jest liczb a nukleotydów okre slonych, jako identyczne na podstawie przyrównania se- kwencji programem ALIGN-2, gdzie program porównuje C i D i gdzie Z jest ca lkowit a liczb a nukleoty- dów w D. Powinno by c dostrze zone, ze gdy d lugosc sekwencji kwasu nukleinowego C nie jest równa d lugo sci sekwencji kwasu nukleinowego D, to % identyczno sci sekwencji kwasu nukleinowego C wzgl edem D nie b edzie równy % identyczno sci sekwencji kwasu nukleinowego D wzgl edem C. Przy- k ladowe obliczenia % identyczno sci sekwencji kwasu nukleinowego przedstawione w Tabeli 2 (C-D) pokazuj a jak obliczy c % identyczno sci sekwencji kwasu nukleinowego oznaczonej, jako „Porównywa- ny DNA” wzgl edem sekwencji kwasu nukleinowego oznaczonej, jako „PRO-DNA”. Je sli nie b edzie podane inaczej, wszystkie u zywane tu warto sci % identyczno sci sekwencji kwasu nukleinowego otrzymano jak to opisano powy zej przy pomocy programu komputerowego do porównywania sekwencji ALIGN-2. Jednak ze % identyczno sci sekwencji kwasu nukleinowego mo ze równie z zostac okre slony przy pomocy programu do porównywania sekwencji NCBI-Blast2 (Altschul i wsp., Nucleic Acids Res. 25:3389-3402 (1997)). Program do porównywania sekwencji NCBI-BLAST2 mo zna pobra c pod adresem sieciowym http://www.ncbi.nim.nih.gov lub uzyska c z National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA 20892. NCBI-BLAST2 wykorzystuje szereg takich parametrów, gdzie wszystkie te parametry do analizy s a ustawione jako warto sci domy slne, w tym przyk ladowo un- mask=yes, strand=all, expected occurrences=10, minimum Iow complexity lenth=15/5, multi-passe- value=0,01, constant for multi-pass=25, dropoff for fina l gapped alignment=25 i scoring ma- trix=BLOSUM62. W sytuacji, gdy do porównywania sekwencji stosowany jest program NCBI-BLAST2, % iden- tyczno sci danej sekwencji kwasu nukleinowego C wzgl edem danej sekwencji kwasu nukleinowego D, (co alternatywnie mozna wyrazi c, jako dana sekwencja kwasu nukleinowego C, która ma lub wykazuje pewien % identyczno sci sekwencji kwasu nukleinowego wzgl edem lub wobec sekwencji kwasu nukle- inowego D) oblicza si e jak nast epuje: 100 razy proporcja W/Z gdzie W jest liczb a nukleotydów okre slonych, jako identyczne na podstawie przyrównania se- kwencji programem NCBI-BLAST2, gdzie program porównuje C i D i gdzie Z jest ca lkowit a liczb a nu- kleotydów w sekwencji D. Powinno by c dostrze zone, ze gdy dlugo sc sekwencji kwasu nukleinowego C nie jest równa d lugo sci sekwencji kwasu nukleinowego D to % identyczno sci sekwencji kwasu nu- kleinowego C wzgl edem D nie b edzie równy % identyczno sci sekwencji aminokwasowej D wzgl edem C. W innych wykonaniach warianty polinukleotydów dla TCCR s a cz asteczkami kwasu nukleino- wego koduj acymi aktywny polipeptyd tu opisany, które s a zdolne do hybrydyzacji, zw laszcza w ostrych warunkach hybrydyzacji i p lukania, z sekwencjami nukleotydowymi koduj acymi pe lnej d lugo sci poli- peptyd tu opisany. Warianty polipeptydów tu opisanych obejmuj a te, które s a kodowane przez wariant polinukleotydu tu opisanego. Termin „pozytywny” w kontek scie porówna n identyczno sci sekwencji aminokwasowych prze- prowadzonych jak opisano powy zej, obejmuje reszty aminokwasowe w porównanych sekwencjach,PL 206 846 B1 16 które s a nie tylko identyczne, lecz równie z te posiadaj ace podobne w la sciwo sci. Reszty aminokwaso- we liczone, jako pozytywne to te, które s a b ad z identyczne z resztami aminokwasowymi b ed acymi przedmiotem zainteresowania b ad z s a odpowiednim podstawieniem (jak okre slono poni zej w tabeli 1) reszt aminokwasowych b ed acych przedmiotem zainteresowania. Dla obecnego celu, procent warto sci pozytywnych dla danej sekwencji aminokwasowej A, wo- bec albo wzgl edem danej sekwencji aminokwasowej B, (co alternatywnie mo zna wyrazi c, jako dana sekwencja aminokwasow a A, która ma lub zawiera pewien % pozytywnych aminokwasów wzgl edem lub w porównaniu z dan a sekwencj a aminokwasow a B) oblicza si e jak nast epuje: 100 razy proporcja X/Y gdzie X jest liczb a aminokwasów o warto sci pozytywnej jak to okre slono powy zej przy pomocy programu przyrównuj acego sekwencje ALIGN-2, gdzie program przyrównuje A do B i gdzie Y jest ca lkowit a liczb a aminokwasów w B. Powinno by c dostrze zone, ze gdy d lugo sc sekwencji aminokwa- sowej A nie jest równa d lugo sci sekwencji aminokwasowej B to % warto sci pozytywnych A wzgl edem B nie b edzie równy % warto sci pozytywnych B wzgl edem A. Termin „wyizolowany”, gdy u zyty jest dla opisania ró znych ujawnionych tu polipeptydów ozna- cza polipeptyd, który zidentyfikowano i oczyszczono i/lub odzyskano ze sk ladników jego naturalnego srodowiska. Zalecany wyizolowany polipeptyd jest wolny od wszystkich sk ladników, z którymi jest zwi azany w warunkach naturalnych. Zanieczyszczaj ace sk ladniki jego naturalnego srodowiska s a materia lami, które b ed a typowo zaburza ly diagnostyczne lub terapeutyczne zastosowania polipeptydu i mog a obejmowa c enzymy, hormony i inne bia lkowe lub niebia lkowe rozpuszczalne czynniki. W zale- canych wykonaniach polipeptyd b edzie oczyszczony (1) w stopniu dostatecznym dla uzyskania przy- najmniej 15 aminokwasów N-ko ncowej lub wewn etrznej sekwencji aminokwasowej przy pomocy wi- rówkowego urz adzenia do sekwencjonowania lub (2) do homogenno sci poprzez SDS-PAGE w wa- runkach nieredukuj acych lub redukuj acych stosuj ac barwienie blekitem Coomassie lub, dogodnie, barwienie srebrem. Wyizolowany polipeptyd obejmuje polipeptyd in situ w rekombinowanych komór- kach, bowiem przynajmniej jeden sk ladnik naturalnego srodowiska TCCR nie b edzie obecny. Jednak- ze, zazwyczaj wyizolowany polipeptyd b edzie wytworzony poprzez zastosowanie przynajmniej jedne- go etapu oczyszczania. „Wyizolowana” cz asteczka kwasu nukleinowego koduj ac a polipeptyd TCCR to cz asteczka kwa- su nukleinowego, która jest zidentyfikowana i oddzielona od przynajmniej jednej zanieczyszczaj acej cz asteczki kwasu nukleinowego, z któr a jest zazwyczaj zwi azana w naturalnym zródle kwasu nukle- inowego koduj acego TCCR. Zalecany wyizolowany kwas nukleinowy jest wolny od wszystkich zwi az- ków, z którymi zwi azany jest w warunkach naturalnych. Wyizolowana cz asteczka kwasu nukleinowego koduj aca TCCR jest inna ni z ta w postaci lub uk ladzie, w którym jest znajdowana w naturze. Wyizolo- wane cz asteczki kwasu nukleinowego odró zniaj a si e, zatem od cz asteczki kwasu nukleinowego kodu- jacej TCCR, która wyst epuje w komórkach naturalnych. Jednak ze, wyizolowana cz asteczka kwasu nukleinowego koduj aca polipeptyd TCCR obejmuje cz asteczki kwasu nukleinowego koduj ace, TCCR zawarte w komórkach, które zazwyczaj wyra zaj a TCCR, gdzie przyk ladowo, cz asteczka kwasu nukle- inowego znajduje si e w chromosomie w innym miejscu ni z w naturalnych komórkach. Termin „sekwencje kontroluj ace” dotyczy sekwencji DNA niezb ednych dla ekspresji w okre slo- nym organizmie gospodarza funkcjonalnie po laczonych z nimi sekwencji. Sekwencje kontroluj ace, które s a odpowiednie dla prokariotów przyk ladowo obejmuj a promotor, ewentualnie sekwencj e opera- tora i miejsce wi azania rybosomu. Komórki eukariotyczne s a znane, jako wykorzystuj ace przyk ladowo promotory, sygna ly poliadenylacji i wzmacniacze. Kwas nukleinowy jest „funkcjonalnie po laczony”, gdy znajduje si e w zwi azku funkcjonalnym z sekwencj a innego kwasu nukleinowego. Przyk ladowo, DNA dla presekwencji lub lidera dla sekrecji jest funkcjonalnie po laczony z DNA dla polipeptydu, je sli jest wyra zany, jako prebia lko uczestnicz ac w sekrecji polipeptydu; promotor lub wzmacniacz jest funkcjonalnie po laczony z sekwencj a koduj ac a, je sli wp lywa na transkrypcj e tej sekwencji; albo miejsce wi azania rybosomu jest funkcjonalnie po la- czone z sekwencj a koduj ac a, je sli jest ona zlokalizowana tak, ze u latwia translacj e. Ogólnie, „polaczo- ny funkcjonalnie” oznacza, ze sekwencje DNA s a polaczone w sposób ci ag ly i, w przypadku lidera dla sekrecji, ci ag ly i w tej samej ramce odczytu. Jednak ze, wzmacniacze nie musz a by c polaczone w sposób ci ag ly. Laczenie osi aga si e przez laczenie z wykorzystaniem dogodnych miejsc restrykcyj- nych. Je sli takie miejsca nie istniej a, to u zywa si e syntetycznych oligonukleotydowych adapterów zgodnie z tradycyjn a praktyk a.PL 206 846 B1 17 Termin „przeciwcia lo” jest u zyty w szerokim znaczeniu, a konkretnie obejmuje na przyk lad poje- dyncze przeciwcia la monoklonalne anty-TCCR (wlacznie z agonistami, antagonistami i przeciwcia lami neutralizuj acymi), kompozycje przeciwcia la anty-TCCR o poliepitopowej swoisto sci, jedno la ncuchowe przeciwcia la anty-TCCR i fragmenty przeciwcia l anty-TCCR (patrz poni zej). Termin „przeciwcia lo mo- noklonalne” w u zytym tu znaczeniu dotyczy przeciwcia la uzyskanego z populacji zasadniczo homo- gennych przeciwcia l, tj. pojedyncze przeciwcia la stanowi ace populacj e s a identyczne z wyj atkiem mo zliwych naturalnie wyst epuj acych mutacji, które mog a wyst epowa c niewielkiej liczbie. „Ostro sc” reakcji hybrydyzacji mo ze by c latwo okre slona przez specjalist e w tej dziedzinie i za- zwyczaj jest obliczona empirycznie zale znie od d lugo sci sondy, temperatury p lukania i st ezenia soli. Ogólnie, d luzsze sondy wymagaj a wy zszych temperatur dla odpowiedniego wi azania, podczas gdy krótsze sondy wymagaj a ni zszych temperatur. Hybrydyzacja ogólnie zale zy od zdolno sci zdenaturo- wanego DNA do ponownego polaczenia si e, gdy komplementarne nici wyst epuj a w srodowisku o temperaturze poni zej temperatury topnienia. Im wy zszy stopie n pozadanej homologii pomi edzy son- d a i hybrydyzuj ac a sekwencj a tym wzgl ednie wy zsza jest temperatura, któr a mo zna zastosowa c. W efekcie, wzgl ednie wy zsze temperatury czyni a warunki reakcji bardziej ostrymi, podczas gdy ni zsze temperatury mniej ostrymi. Dla dodatkowych szczegó lów i wyja snienia ostro sci reakcji hybrydyzacji patrz Ausubel i wsp. Current Protocols in Molecular Biology, Willey Interscience Publishers, (1995). „Ostre warunki” lub „warunki o wi ekszej ostro sci”, jak tu zdefiniowano, mog a by c zidentyfikowa- ne przez to, ze: (1) stosowana jest ni zsza si la jonowa i wy zsza temperatura plukania, przyk ladowo 0,015 M chlorek sodu/0,0015 M cytrynian sodu/0,1% sól sodowa siarczanu dodecylu w 50°C; (2) wy- korzystanie podczas hybrydyzacji czynnika denaturuj acego takiego jak przyk ladowo 50% formamid (obj./obj.) z 0,1% albumina z surowicy bydl ecej/0, 1% Ficoll/0,1% poliwinylopirolidon /50 mM sodowy bufor fosforanowy o pH 6,5 z 750 mM chlorkiem sodu, 75 mM cytrynian sodu w 42°C lub (3) zastoso- wanie 50% fomamidu, 5 x SSC (0,75 M NaCl, 0,075 M cytrynian sodu), 50 mM fosforan sodu (pH 6,8), 0,1% pirofosforan sodu, 5 x roztwór Denhardta, pofragmentowany ultrad zwi ekami DNA ze spermy lososia (50 µg/ml), 0,1% SDS i 10% siarczan dekstranu w 42°C z p lukaniem w 42°C w 0,2 SSC (chlo- rek sodu/cytrynian sodu) i 50% formamidzie w 55°C, a nast epnie p lukanie w ostrych warunkach w roztworze zawieraj acym 0,1 x SSC z EDTA w 55°C. „ Srednio ostre warunki” mog a by c zidentyfikowane jak to opisali Sambrook i wsp. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Nowy Jork: Cold Spring Harbor Press, 1989 i obejmuj a u zycie roztworu do p lukania i warunków hybrydyzacji (np. temperatura, si la jonowa i % SDS) o mniejszej ostro sci ni z te opisane powy zej. W pewnym wykonaniu, srednio ostre warunki obejmuj a ca lonocn a inkubacj e w 37°C w roztworze zawieraj acym 20% formamid, 5 x SSC (150 mM NaCl, 15 mM cytrynian trójso- dowy), 50 mM fosforan sodowy (pH 7,6), 5 x roztwór Denhardta, 10% siarczanu dekstranu i 20 mg/ml zdenaturowanego pofragmentowanego ultrad zwi ekami DNA ze spermy lososia, nast epnie przez p luka- nie filtrów w 1 x SSC w oko lo 37-50°C. Specjalista w tej dziedzinie b edzie wiedzia l jak dobra c temperatu- r e, si le jonow a itd. z uwagi na konieczno sc dostosowania si e do czynników, takich jak d lugo sc sondy i tym podobne. Termin „znakowany epitopem” w u zytym tu znaczeniu dotyczy chimerowego polipeptydu zawie- rajacego polipeptyd tu opisany po laczony z „polipeptydem znacznikowym”. Polipeptyd znacznikowy ma dostatecznie du zo reszt, aby dostarczy c epitopu, przeciw któremu mo ze by c przygotowane prze- ciwcia lo, ale dostatecznie krótki, aby nie przeszkadza l w aktywno sci polipeptydu, do którego jest przy- laczony. Zalecany polipeptyd znacznikowy jest dostatecznie unikalny, przez co przeciwcia lo zasadni- czo nie reaguje krzy zowo z innymi epitopami. U zyteczne polipeptydy znacznikowe ogólnie maj a przy- najmniej sze sc reszt aminokwasowych, zazwyczaj pomi edzy oko lo 8 i 50 reszt aminokwasowych (zw laszcza pomi edzy oko lo 10 i 20 reszt aminokwasowych). „Aktywny” lub „aktywno sc” dla celów tego wynalazku dotyczy postaci (jednej lub wielu) bia lek tu opisanych, które zachowa ly biologiczne i/lub immunologiczne aktywno sci natywnego lub naturalnie wyst epuj acego polipeptydu TCCR, gdzie aktywno sc „biologiczna” dotyczy funkcji biologicznej (b ad z hamuj acej b ad z pobudzaj acej) wywo lywanej przez natywny lub wyst epuj acy w naturze TCCR innej ni z zdolno sc do s lu zenia, jako antygen przy wytwarzaniu przeciwcia la przeciw antygenowemu epitopowi posiadanemu przez natywny lub wyst epuj acy w naturze polipeptyd tu opisany. Podobnie aktywno sc „immunologiczna” dotyczy zdolno sci do s lu zenia, jako antygen przy wytwarzaniu przeciwcia la prze- ciwko antygenowemu epitopowi posiadanemu przez natywny lub wyst epuj acy w naturze polipeptyd tu opisany.PL 206 846 B1 18 Termin „aktywno sc biologiczna” w kontek scie przeciwcia la lub innej cz asteczki, która mo ze by c zidentyfikowana w testach przesiewowych, które tu ujawniono (np. ma le cz asteczki organiczne lub nieorganiczne, peptydy itp.) jest u zyte dla okre slenia zdolno sci takich cz asteczek do indukowania lub hamowania naciekania komórek zapalnych do tkanki, do pobudzania lub hamowania proliferacji lub aktywacji komórek T oraz do pobudzania lub hamowania uwalniania przez komórki cytokin. Inn a, za- lecan a aktywno scia jest zwi ekszona przepuszczalno sc naczyniowa lub jej hamowanie. Najbardziej zalecan a aktywno sci a jest modulowanie odpowiedzi Th1/Th2 (np. zmniejszenie odpowiedzi Th1 i/lub zwi ekszenie odpowiedzi Th2, zmniejszenie odpowiedzi Th2 i/lub zwi ekszenie Th1). Termin „modulacja” lub „modulowanie” oznacza zwi ekszenie, zmniejszenie lub zmian e skutków fizjologicznych poprzez ró znicowanie komórek T w podgrupy Th1 i Th2 (np. profile uwalniania cytokin). Procesy komórkowe obj ete zakresem terminu mog a obejmowa c, lecz bez ograniczenia: transkrypcj e okre slonych genów; normalne funkcje komórkowe, takie jak metabolizm, proliferacja, ró znicowanie, adhezja, przekazywanie sygna lu, apoptoza i prze zycie, oraz nieprawid lowe procesy komórkowe, takie jak transformacja, blokowanie ró znicowania i przerzutowanie. Termin „antagonista” jest u zyty w najszerszym tego s lowa znaczeniu i obejmuje jak akolwiek cz asteczk e, która cz esciowo lub w pe lni blokuje, hamuje lub zoboj etnia aktywno sc biologiczn a natu- ralnej sekwencji polipeptydu TCCR tu opisanego, który tu ujawniono (np. zmniejszenie komórkowej funkcji Th1/Th2). W podobny sposób termin „agonista” jest u zyty w najszerszym znaczeniu i obejmuje jak akolwiek cz asteczk e na sladuj ac a, wzmacniaj ac a lub pobudzaj ac a aktywno sc biologiczn a polipep- tydu TCCR o natywnej sekwencji tu opisanej, któr a tu ujawniono. U zyteczne cz asteczki agonisty lub antagonisty obejmuj a konkretnie przeciwcia la agonistyczne lub antagonistyczne albo fragmenty prze- ciwcia la, fragmenty lub sekwencje aminokwasowe wariantów natywnych polipeptydów tu opisanych, peptydy, ma le cz asteczki organiczne itd. Sposoby identyfikacji agonistów lub antagonistów polipepty- du TCCR mog a obejmowa c doprowadzenie do kontaktu polipeptydu TCCR z kandydatem na cz a- steczk e agonisty lub antagonisty i pomiar wykrywalnej zmiany jednej lub wi ekszej liczby aktywno sci D biologicznych normalnie towarzysz acych polipeptydowi TCCR (np. zwi ekszenie/zmniejszenie funkcji komórkowych lub efektu Th1/Th2). „Ma la cz asteczka” jest tu zdefiniowana, jako posiadaj aca mas e cz asteczkow a mniejsz a ni z 500 daltonów i 5 ogólnie jest zwi azkiem organicznym. „Przeciwcia la” (Ab) i „immunoglobuliny” (Ig) s a glikoproteinami posiadaj acymi te same, ogólne cechy strukturalne. Podczas gdy przeciwcia la ujawniaj a swoisto sc wi azania wzgl edem specyficznego antygenu, immunoglobuliny obejmuj a zarówno przeciwcia la, jak i inne cz asteczki podobne do prze- ciwcia l, które utraci ly swoistosc antygenow a. Polipeptydy tego ostatniego rodzaju s a przyk ladowo wytwarzane na niskich poziomach przez system limfatyczny i na wy zszym poziomie przez szpiczaki. Termin „przeciwcia lo” jest u zyty w najszerszym znaczeniu i obejmuje konkretnie przyk ladowo poje- dyncze, monoklonalne przeciwcia la anty-TCCR (wlacznie z przeciwcia lami agonistycznymi, antagoni- stycznymi i zoboj etniaj acymi), kompozycje przeciwcia la anty-TCCR o poliepitopowej swoisto sci, prze- ciwcia la jedno lancuchowe anty-TCCR i fragmenty przeciwcia l anty-TCCR (patrz poni zej). Termin „przeciwcia lo monoklinalne” w u zytym tu znaczeniu dotyczy przeciwcia la uzyskanego z populacji za- sadniczo homogennych przeciwcia l, to jest pojedyncze przeciwcia la tworz ace populacj e s a identyczne z wyj atkiem mo zliwych naturalnie wyst epuj acych mutacji, które mog a by c obecne w niewielkiej liczbie. Przeciwcia lo moze wi aza c si e z dowoln a domen a polipeptydu tu opisanego, która mo ze mie c kontakt z przeciwcia lem. Przyk ladowo, przeciwcia lo mo ze wi aza c si e z 3 dowoln a zewn atrzkomórkowa dome- n a polipeptydu, a gdy ca ly polipeptyd jest wydzielany z dowoln a domen a polipeptydu dost epn a dla wi azania przeciwcia la. „Przeciwcia la natywne” i „immunoglobuliny natywne” s a zazwyczaj heterotetramerycznymi gli- koproteinami o masie cz asteczkowej oko lo 150 daltonów, zbudowanymi z dwóch identycznych la ncu- chów lekkich (L) i dwóch identycznych lancuchów ci ezkich (H). Ka zdy lancuch lekki jest po laczony z lancuchem ciezkim jednym, dwusiarczkowym wiazaniem kowalencyjnym, natomiast liczba wi aza n dwusiarczkowych ró zni si e pomi edzy la ncuchami ci ezkimi ró znych izotypów immunoglobulin. Ka zdy, ciezki i lekki la ncuch posiada równie z regularnie rozmieszczone mi edzy la ncuchowe mostki dwusiarcz- kowe. Ka zdy lancuch ciezki posiada na jednym ko ncu domen e zmienn a (V H ), po której nast epuje sze- reg domen sta lych. Ka zdy lancuch lekki posiada na jednym ko ncu domen e zmienn a (V L ) i domen e stala na drugim ko ncu; domena sta la la ncucha lekkiego jest po laczona z pierwsz a domen a sta la la n- cucha ciezkiego a domena zmienna la ncucha lekkiego jest polaczona z domen a zmienn a la ncuchaPL 206 846 B1 19 ciezkiego. Okre slone reszty aminokwasowe przypuszczalnie tworz a miejsca oddzia lywania pomi edzy domenami zmiennymi lancuchów lekkiego o ci ezkiego. Termin „zmienny” dotyczy faktu, ze okre slone cz esci domen zmiennych ró zni a si e znacz aco se- kwencjami pomi edzy przeciwcia lami i s a wykorzystywane w wi azaniu i swoisto sci ka zdego konkretne- go przeciwcia la wobec swojego okre slonego antygenu. Jednak ze zmienno sc nie jest równo roz lo zona na obszarze domen zmiennych przeciwcia l. Jest ona zgrupowana w trzech z czterech segmentów nazwanych „regionami okre slaj acymi dopasowanie” (CDR) lub „regionami hiperzmiennymi”, zarówno w domenach lancucha lekkiego, jak i la ncucha ciezkiego. Istniej a przynajmniej dwie (2) techniki dla okre slenia CDR: (1) podej scie oparte na mi edzygatunkowej zmienno sci sekwencji (np. Kabat i wsp. Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institute of Health, Bethesda, MD 1987) i (2) podej scie oparte na badaniach krystalograficznych kompleksów antygen-przeciwcia lo (Chothia, C i wsp. Nature 342:877 (1989)). Jednak ze w takim zakresie, ze dwie techniki opisuj a ró zne reszty, mo- g a by c one laczone dla zdefiniowania hybrydowego CDR. Bardziej konserwowane cz esci domen zmiennych s a nazywane zr ebem (FR). Domeny zmienne natywnych la ncuchów ci ezkich i lekkich zawieraj a cztery lub pi ec regionów FR, w du zym stopniu przyjmuj acych struktur e ß-kartki, polaczonych przez CDR, które tworz a p etle lacz ace i w pewnych przypadkach tworz ace cz es c struktury ß-kartki. CDR w ka zdym la ncuchu s a utrzymywane razem bli- sko siebie przez regiony FR i wraz z CDR z drugiego lancucha uczestnicz a w tworzeniu miejsca wi a- zania antygenu przeciwcia l (patrz Kabat i wsp., NIH Publ. Nr 91-3242, tom I, str. 647-669 (1991)). Domeny sta le nie uczestnicz a bezpo srednio w wi azaniu przeciwcia la z antygenem, lecz pe lni a ró zne funkcje efektorowe, takie jak uczestniczenie przeciwcia la w zale znej od przeciwcia la toksyczno sci komórkowej. „Fragmenty przeciwcia la” obejmuj a cz esc nienaruszonego przeciwcia la, zw laszcza obszar wi a- zacy antygen lub obszar zmienny nienaruszonego przeciwcia la. D Przyk lady fragmentów przeciwcia la obejmuj a Fab, Fab', F(ab') 2 i fragment Fv; diacia la; przeciwcia la liniowe (Zapata i wsp.. Protein Eng. 8 (10):1057-1062 [1995]), cz asteczki przeciwcia la jedo lancuchowego i przeciwcia la wieloswoiste utwo- rzone z fragmentów przeciwcia la. 5 Trawienie przeciwcia l papaina prowadzi do wytworzenia dwóch identycznych fragmentów wiaz acych antygen, nazywanych fragmentami „Fab”, ka zde z jednym miej- scem wi azania antygenu, i resztkowy fragment „Fc”, którego nazwa odzwierciedla zdolnosc do latwej krystalizacji. Dzia lanie 30 papaina daje fragment F(ab') 2 , który posiada dwa miejsca oddzia lywania z antygenem i nadal jest zdolny do krzy zowego wi azania antygenu. „Fv” jest minimalnym fragmentem przeciwciala zawieraj acym pe lne miejsce rozpoznawania i wi azania antygenu. Region ten sk lada si e z dimeru domeny zmiennej jednego ciezkiego i jednego lekkiego lancucha, w scis lym, niekowalencyjnym polaczeniu. Jest to taka konfiguracja, ze trzy CDR ka zdej domeny zmiennej oddzia luj a okre slaj ac miejsce wi azania antygenu na powierzchni dimeru V H -V L ,. Wspólnie, szesc CDR nadaje przeciwcialu swoisto sc wi azania antygenu. Jednak ze, nawet jedna do- mena zmienna (lub po lowa Fv zawieraj aca jedynie trzy CDR swoiste dla antygenu posiada zdolno sc rozpoznawania i wi azania antygenu, cho c z ni zszym powinowactwem ni z ca le miejsce wi azace. Fragment Fab zawiera równie z domen e sta la la ncucha lekkiego i pierwsz a domen e sta la (CH1) lancucha ciezkiego. Fragmenty Fab' ró zni a si e od fragmentów Fab kilkoma dodatkowymi aminokwa- sami na ko ncu karboksylowym domeny CH1 lancucha ciezkiego, w lacznie z jedn a lub wi eksz a liczb a) cystein z rejonu zawiasowego przeciwcia la. Fab'-SH oznacza tu dla Fab', w którym reszta(y) cysteiny z domen sta lych nios a wolne grupy tiolowe. Fragmenty przeciwcia la F(ab')2 oryginalnie zosta ly wytwo- rzone jako pary fragmentów Fab', które posiadaj a mi edzy sob a zawiasowe cysteiny. Znane s a równie z inne polaczenia chemiczne fragmentów przeciwcia l. „Lekkie lancuchy” przeciwcia l (immunoglobulin) z dowolnego gatunku kr egowca mog a by c za- kwalifikowane do jednego z dwóch jednoznacznie rozró znianych typów, nazywanych kappa ( ?) i lambda ( ?), w oparciu o sekwencje aminokwasowe ich domen sta lych. Zale znie od sekwencji aminokwasowej domeny sta lej ich lancuchów ciezkich, immunoglobuliny mog a by c zaklasyfikowane do ró znych klas. Istnieje piec g lównych klas immunoglobulin: IgA, IgD, IgE, IgG i IgM i szereg z nich mo zna z kolei podzieli c na podklasy (izotypy) np. IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA i IgA2. Domeny lancucha ci ezkiego odpowiadaj ace ró znym klasom immunoglobulin s a nazywane, odpowiednio, a, ß, e, ? i µ. Dobrze znane s a struktury podjednostek i trójwymiarowe konfiguracje ró z- nych klas immunoglobulin. Termin „przeciwcia lo monoklinalne” w u zytym tu znaczeniu dotyczy przeciwcia la uzyskanego z populacji zasadniczo homogennych przeciwcia l, to jest, poszczególne przeciwcia la tworz ace populacj ePL 206 846 B1 20 s a identyczne, z wyj atkiem mo zliwych naturalnie wyst epuj acych mutacji, które mog a wyst epowa c w niewielkiej liczbie. Przeciwcia la monoklonalne s a wysoce swoiste wzgl edem pojedynczego miejsca antygenowego. Ponadto, w przeciwie nstwie do tradycyjnych (poliklonalnych) preparatów przeciwcia l, które typowo zawieraj a ró zne przeciwcia la skierowane przeciw ró znym determinantom (epitopom), ka zde przeciwcia lo monoklonalne jest skierowane przeciw pojedynczej determinancie antygenu. Do- datkowo poza ich swoisto sci a, przeciwcia la monoklonalne s a zalecane z uwagi na to, ze s a syntety- zowane przez hodowle hybrydomy, niezanieczyszczone innymi immunoglobulinami. Przymiotnik „mo- noklonalny” oznacza w la sciwo sc przeciwcia la, jako uzyskanego z zasadniczo jednorodnej populacji przeciwcia l oraz, ze nie wymaga do wytwarzania przeciwcia la zadnych szczególnych sposobów. Przy- k ladowo, przeciwcia la monoklonalne do zastosowania zgodnie z wynalazkiem mog a by c przygotowa- ne przy zastosowaniu metody z u zyciem hybrydom, który to sposób opisa l jako pierwszy Kohler i wsp. Nature, 256:495 [1975], lub mog a by c przygotowane przy zastosowaniu metod rekombinowania DNA (patrz np. patent USA Nr 4,816,567). „Przeciwcia la monoklinalne” mog a równie z by c izolowane z fa- gowych bibliotek przeciwcia l przy zastosowaniu technik opisanych na przyk lad przez Clackson i wsp., w Nature 352:624-628 (1991) i Marks i wsp., J. Mol. Biol. 222:581-597 (1991). Patrz równie z patenty USA Nr 5,750,373, 5,571,698, 5,403,484 i 5,223,409 opisuj ace przygotowanie przeciwcia l przy pomo- cy wektorów fagemidowych i fagowych. Przeciwcia la monoklonalne obejmuj a tu konkretnie przeciwcia la „chimerowe” (immunoglobuli- ny), w których cz esc lancucha ciezkiego i/lub la ncucha lekkiego jest identyczna lub homologiczna z odpowiadaj ac a jej sekwencj a przeciwcia l pochodz acych od konkretnych gatunków lub nale zacych do okre slonej klasy lub podklasy przeciwcia la, podczas gdy pozosta la cz esc la ncucha(ów) jest iden- tyczna z, lub homologiczna do odpowiadaj acych jej sekwencji przeciwcia l pochodz acych z innych gatunków lub nale zacych do innej klasy lub podklasy przeciwcia la, jak równie z fragmentów takich przeciwcia l, tak d lugo jak d lugo ujawniaj a one po zadan a aktywno sc biologiczn a (patent USA Nr 4,816,567; Morrison i wsp., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6851-6855 [1984]). „Humanizowane” postaci innych ni z ludzkie (np. mysich) przeciwcia l, s a immunoglobulinami chimerowymi, ich la ncuchami immunoglobulinowymi lub ich fragmentami (takimi jak Fv, Fab, Fab', F(ab') 2 lub innymi podsekwencjami wiaz acymi antygen z przeciwcia l), które zawieraj a minimaln a se- kwencj e pochodz ac a z immunoglobuliny innej ni z ludzka. W wi ekszej cz esci, humanizowane przeciw- cia la s a immunoglobulinami ludzkimi (przeciwcia lo biorcy), w którym aminokwasy z regionów determi- nuj acych komplementarno sc (CDR) biorcy s a zast apione przez reszty z CDR gatunków nieb ed acych cz lowiekiem (przeciwcia lo dawcy), takich jak mysz, szczur lub królik, posiadaj acych po zadan a swo- isto sc, powinowactwo i pojemno sc. W niektórych przypadkach reszty regionu zr ebowego (FR) z Fv ludzkiej immunoglobuliny s a zast apione przez odpowiadaj ace im reszty inne ni z ludzkie, zw laszcza gdy te poszczególne reszty FR wp lywaj a na konformacj e miejsca wi azania i/lub trójwymiarowej struk- tury przeciwcia la. Ponadto, humanizowane przeciwcia la mog a zawiera c reszty, które nie wyst epuj a ani w przeciwciele biorcy, ani w importowanych sekwencjach CDR lub zr ebowych. Modyfikacje te s a do- konywane dla dalszego udoskonalenia w la sciwo sci przeciwcia la. Ogólnie, humanizowane przeciwcia- lo b edzie zawiera lo zasadniczo wszystkie spo sród przynajmniej jednej, a typowo dwóch domen zmiennych, w których wszystkie lub zasadniczo wszystkie regiony CDR odpowiadaj a tym z immuno- globulin innych ni z ludzkie a wszystkie lub zasadniczo wszystkie regiony FR s a tymi z ludzkiej sekwencji immunoglobuliny. Optymalnie, humanizowane przeciwcia lo b edzie równie z zawiera lo przynajmniej cz esc regionu sta lego immunoglobuliny (Fc), typowo z immunoglobuliny ludzkiej. Aby pozna c szczegó ly, patrz Jones i wsp.. Nature 321:522-525 (1986); Reichmann i wsp.. Nature 332:323-329 [1988] oraz Presta, Curr. Op. Struct. Biol., 2:593-596 (1992). Ewentualnie, przeciwcia lo humanizowane mo ze obejmowa c równie z przeciwcia lo upodobnione do naczelnych (ang. „primatized”), w którym obszar wiazacy antygen w przeciw- ciele pochodzi z przeciwcia la wytworzonego przez immunizacj e makaka antygenem b ed acym przedmio- tem zainteresowania. Przeciwcia la zawieraj ace reszty z ma lp starego swiata opisano, przyk ladowo, w pa- tentach USA nr 5,658,570; 5,693,780; 5,681,722; 5,750,105 i 5,756,096. Przeciwcia la i ich fragmenty tu opisane obejmuj a równie z przeciwcia la „dojrza le pod wzgl edem powinowactwa”, w których przeciwcia lo jest zmienione tak, ze zmieniono sekwencj e aminokwasow a jednego lub wi ekszej liczby regionów CDR i/lub regionów zr ebowych, zmieniaj ac powinowactwo prze- ciwcia la lub jego fragmentu wzgl edem wi azanego przez nie antygenu. Dojrzewanie pod wzgl edem powinowactwa mo ze prowadzi c do zwi ekszania lub zmniejszania powinowactwa dojrza lego przeciw- cia la wzgl edem antygenu w porównaniu z przeciwcia lem wyj sciowym. Typowo, wyj sciowe przeciwcia lo b edzie przeciwcia lem humanizowanym, ludzkim, chimerowym lub mysim, a powinowactwo dojrza legoPL 206 846 B1 21 przeciwcia la b edzie wy zsze ni z przeciwcia la wyj sciowego. Podczas procesu dojrzewania jedna lub wi ecej reszt aminokwasowych w CDR lub w regionach zr ebowych jest zmieniona na inn a reszt e przy zastosowaniu dowolnego typowego sposobu. Odpowiednie sposoby obejmuj a mutacje punktowe przy zastosowaniu dobrze znanych sposobów mutagenezy kasetkowej (Wells i wsp., 1985, Gene 34:315) lub sposobów mutagenezy przy pomocy oligonukleotydów (Zoller i wsp., 1987, Nucleic Acids Res., 10:6487-6504). Dojrzewanie powinowactwa mo zna równie z przeprowadzi c przy zastosowaniu zna- nych sposobów selekcji, w których wytwarza si e wiele mutacji i mutanty o po zadanym powinowactwie s a selekcjonowane z puli lub biblioteki mutacji na podstawie zwi ekszonego powinowactwa do antyge- nu lub ligandu. W podej sciu tym mo ze by c tradycyjnie u zyta znana technika prezentacji na fagach. Patrz przyk ladowo patenty USA 5,750,373; 5,223,409, itd. Ludzkie przeciwcia la mieszcz a si e równie z w zakresie przeciwcia l tu opisanych. Ludzkie prze- ciwcia la mog a by c wytworzone przy zastosowaniu ró znych, znanych w tej dziedzinie sposobów, w lacznie z bibliotekami z prezentacj a na fagach [Hoogenboom i Winter, J. Mol. Biol. 227:381 (1991); Marks i wsp., J. Mol. Biol. 222:581 (1991)]. Dla przygotowania ludzkich przeciwcia l monoklonalnych s a równie z dost epne techniki wed lug Cole i wsp. oraz Boerner i wsp. (Cole i wsp., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, str. 77 (1985); Boerner i wsp., J. Immunol., 147(1):86-95 (1991); US 5,750,373]. Podobnie, ludzkie przeciwcia la mog a by c przygotowane przez wprowadzenie loci ludzkiej immunoglobuliny do zwierz at transgenicznych, np. myszy, w których endogenne geny immu- noglobulin zosta ly cz esciowo lub ca lkowicie unieczynnione. Po prowokacji, obserwowane jest wytwa- rzanie ludzkiego przeciwcia la, które pod ka zdym wzgl edem przypomina obserwowane u ludzi, w lacz- nie z przebudow a genu, sk ladaniem i repertuarem przeciwcia l. To podej scie jest przyk ladowo opisane w patencie USA nr 5,545,807; 5,545,806; 5,569,825; 5,625,126; 5,633,425; 5,661,016 i w nast epuj a- cych publikacjach naukowych: Marks i wsp., Bio/Technology 10:779-783 (1992); Lonberg i wsp., Natu- re 368:856-859 (1994); Morrison, Nature 386:812-13 (1994); Fishwild i wsp., Nature Biotechnology 14:845-51 (1996); Neuberger, Nature Biotechnology 14:826 (1996); Lonberg i Huszar, Intern. Rev. Immunol. 13:65-93 (1995). Fragmenty przeciwcia la „jedno la ncuchowy Fv” lub „sFv” zawieraj a domeny V H i V L przeciwcia la, gdzie domeny te wyst epuj a w jednym lancuchu polipeptydowym. Zalecany polipeptyd Fv zawiera po- nadto lacznik polipeptydowy pomi edzy domenami V H i V L , który umo zliwia sFv tworzenie po zadanej struktury wiaz acej antygen. Dla przegl adu sFv patrz Pluckthun w The Pharmacology of Monoclonal Antibodies tom 113, Rosenburg i Moore wyd., Springer Yerlag, Nowy Jork str. 269-315 (1994). Termin „diacia la” (ang. diabodies) dotyczy ma lych fragmentów przeciwcia la z dwoma miejscami wi azacymi antygen, które to fragmenty zawieraj a domen e zmienn a la ncucha ci ezkiego (V H ) po laczon a z domen a zmienn a la ncucha lekkiego (V L ) w tym samym la ncuchu polipeptydowym (V H -V L ). Przez u zycie lacznika, który jest zbyt krótki, aby pozwala l na tworzenie par pomi edzy dwiema domenami w tym samym la ncuchu, domeny s a zmuszane do tworzenia par z komplementarnymi domenami innego la ncucha i wytwarzania dwóch miejsc wi azania antygenu. Pe lniej, diacia la s a przyk ladowo opisane w EP 404,097; WO 93/11161 oraz przez Hollinger oraz wsp., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448 (1993). Termin „wyizolowany” w odniesieniu do ró znych polipeptydów tu opisanych oznacza polipeptyd, który zosta l wyizolowany i oddzielony i/lub odzyskany ze sk ladników jego naturalnego srodowiska. Zanieczyszczaj acymi sk ladnikami jego naturalnego srodowiska s a materia ly, które bed a wp lywa ly na zastosowania diagnostyczne lub terapeutyczne przeciwcia la i mog a obejmowa c enzymy, hormony i inne bia lkowe lub niebia lkowe rozpuszczalne substancje. W zalecanych postaciach polipeptyd tu opisany b edzie oczyszczony (1) w wi ecej ni z 95% wagowych zwi azku, co okre sla si e metod a Lowry'e- go, a zw laszcza w wi ecej ni z 99% wagowych, (2) w stopniu wystarczaj acym dla uzyskania przynajm- niej 15 N-ko ncowych lub wewn etrznych reszt sekwencji aminokwasowej przy zastosowaniu urz adze- nia do sekwencjonowania z wirowaniem lub (3) do homogenno sci przez SDS-PAGE w redukuj acych lub nieredukuj acych warunkach stosuj ac barwienie b lekitem Coomassie lub, zw laszcza, barwienie srebrem. Wyizolowany zwi azek np. przeciwcia lo lub polipeptyd obejmuje zwi azek in situ w rekombi- nowanych komórkach, bowiem nie b edzie tam obecny przynajmniej jeden sk ladnik naturalnego sro- dowiska zwi azku. Jednak ze, zazwyczaj wyizolowany zwi azek b edzie przygotowany przez przynajm- niej jeden etap oczyszczania. S lowo „znacznik”, gdy jest tu u zyte, dotyczy wykrywalnego zwi azku lub kompozycji po laczonej bezpo srednio lub po srednio ze zwi azkiem, np. przeciwcia lem lub polipeptydem, tak, ze wytworzony jest „wyznakowany” zwi azek. Znacznik mo ze by c sam wykrywany (np. znaczniki b ed ace izotopamiPL 206 846 B1 22 promieniotwórczymi lub znaczniki fluorescencyjne) lub, w przypadku znaczników enzymatycznych, mog a katalizowa c chemiczn a zmian e substratu lub kompozycji, któr a mo zna wykry c. „Faza sta la” oznacza nie wodn a macierz, z któr a mo ze wi aza c si e zwi azek tu opisany. Przyk la- dy uwzgl ednionych tu faz sta lych obejmuj a te, które cz esciowo lub w ca lo sci s a utworzone ze szk la (np. szk lo o kontrolowanej porowato sci), polisacharydów (np. agaroza), poliakryloamidów, polistyrenu, alkoholu poliwinylowego i silikonów. W pewnych wykonaniach, zale znie od kontekstu faza sta la mo ze obejmowa c studzienk e p lytki do oznacze n; w innym przypadku jest to kolumna do oczyszczania (np. kolumna do chromatografii powinowactwa). Termin ten obejmuje równie z nieci ag la faz e stala zbudo- wan a z odr ebnych cz asteczek, tak a jak opisano w patencie USA nr 4,275,149. „Liposom” jest ma lym p echerzykiem z lo zonych z ró znych rodzajów lipidów, fosfolipidów i/lub sub- stancji powierzchniowo czynnej, który jest u zyteczny do dostarczenia leku (takiego jak ujawnione tu prze- ciwcia la anty-ErbB2 i, ewentualnie, czynnik chemoterapeutyczny) ssakowi. Sk ladniki liposomu s a zazwy- czaj zorganizowane w podwójn a warstw e, podobnie do organizacji lipidów w b lonach biologicznych. W u zytym tu znaczeniu termin „immunoadhezyna” oznacza cz asteczk e podobn a do przeciwcia- la, która laczy swoisto sc I wi azania heterologicznego bia lka („adhezyjna”) z funkcjami efektorowymi domen sta lych immunoglobuliny. Strukturalnie, immunoadhezyny zawieraj a fuzj e sekwencji amino- kwasowej o pozadanej swoisto sci wi azania z innym obszarem przeciwcia la ni z miejsce rozpoznawa- nia i wi azania antygenu (tj. „heterologicznej”) i sekwencj e domeny sta lej immunoglobuliny. Cz escia adhezynow a w cz asteczce immunoadhezyny typowo jest ci ag la sekwencja aminokwasow a zawieraj a- ca przynajmniej miejsce wi azania receptora lub ligandu. Sekwencj e domeny sta lej immunoglobuliny w immunoadhezynie mo zna otrzyma c z dowolnej immunoglobuliny, takiej jak podtypy IgG-1, IgG-2, IgG-3 lub IgG-4, IgA (w lacznie z IgA-1 i IgA-2), IgE, IgD lub IgM. II. Kompozycje i sposoby tu opisane A. Peptyd TCCR o pe lnej d lugo sci Zgodnie z wynalazkiem opisano cz esciowo nowy sposób zastosowania polipeptydów TCCR w leczeniu chorób zwi azanych z odporno sci a, obejmuj acy modulowanie ró znicowania komórek T do podtypów Th1 i Th2 i leczenie gospodarza dotkni etego takimi chorobami. Dok ladniej, zidentyfikowano cDNA koduj acy polipeptydy TCCR, wyizolowano je, a ich zastosowanie do leczenia zaburze n, w których po sredniczy Th1 i Th2, ujawniono szczegó lowo poni zej. Nale zy odnotowa c, ze TCCR oznacza zarówno cz asteczki o sekwencji natywnej, jak i warianty, jak dostarczono w rozdziale z definicjami, natomiast termin hTCCR i mTCCR oznacza pojedyncze polipeptydy o sekwencji natywnej przedstawione, odpo- wiednio, na fig. 3 (SEQ ID N0:1) i fig. 4 (SEQ ID N0:2). Jednak ze, dla uproszczenia, w niniejszym opisie bia lko kodowane przez DNA41419 (hTCCR) i/lub DNA120632 (mTCCR), jak równie z dalsze natywne homologi i warianty obj ete powy zsz a definicj a TCCR b ed a okre slane jako „TCCR” niezale znie od ich pochodzenia i sposobu przygotowania. Przewidywan a sekwencj e aminokwasow a bia lek kodowanych przez DNA41419 (hTCCR, SEQ ID N0:1) i DNA120632 (mTCCR, SEQ ID N0:2) mo zna okre sli c z sekwencji nukleotydowej wykorzystu- jac rutynowe umiej etno sci. Dla polipeptydu, TCCR i koduj acego kwasu nukleinowego, które tu opisa- no. Zg laszaj acy zidentyfikowali potencjaln a ramk e odczytu, najlepsz a, jak a mo zna by lo wówczas zi- dentyfikowa c na podstawie informacji o sekwencji. Stosuj ac opisany powy zej program komputerowy do przyrównywania sekwencji ALIGN-2 stwierdzono, ze pe lnej d lugo sci naturalna sekwencja hTCCR (fig. 3, SEQ ID N0:1) i mTCCR (fig. 4, SEQ ID N0:2) wykazuj a pewien stopie n identyczno sci sekwencji z sekwencjami Dayhoff (GenBank) o numerach dost epu 475327 i 7710109. B. Warianty TCCR. Poza polipeptydami TCCR pe lnej d lugo sci o sekwencji natywnej, które tu opisano, rozwa za si e mo zli- wo sc wytworzenia wariantów TCCR. Warianty TCCR mog a by c przygotowane przez wprowadzenie odpo- wiednich zmian nukleotydowych w DNA dla TCCR i/lub przez syntez e po zadanego polipeptydu TCCR. Spe- cjali sci w tej dziedzinie b ed a wiedzie c, ze zmiany aminokwasowe mog a zmieni c potranslacyjn a obróbk e TC- CR, np. zmieni c liczb e lub po lo zenie miejsc glikozylacji lub zmieni c charakterystyk e kotwiczenia w b lonie. Opisane tu warianty natywnego, pe lnej d lugo sci TCCR lub ró znych domen polipeptydu TCCR mo zna wytworzy c przyk ladowo przy zastosowaniu dowolnych technik i w oparciu o wskazówki dotycz ace wprowa- dzania konserwatywnych i nie konserwatywnych zmian podane przyk ladowo w Patencie USA nr. 5,364,934. Zmian a mo ze by c podstawienie, delecja lub insercja jednego lub wi ekszej liczby kodonów koduj acych TCCR, czego rezultatem jest zmiana w sekwencji aminokwasowej TCCR w porównaniu z naturaln a sekwencj a TCCR. Ewentualnie, zmian a jest podstawienie przynajmniej jednego aminokwasu innym aminokwasemPL 206 846 B1 23 w jednej lub wi ekszej liczbie domen TCCR. Wskazówka dla okre slenia, który aminokwas mo ze by c wstawio- ny, podstawiony lub usuni ety bez ujemnego efektu na po zadan a aktywno sc, mo zna znale zc przez porównanie sekwencji TCCR z sekwencjami znanych homologicznych cz asteczek bia lka i ogranicze- nia liczby zmienianych aminokwasów w obszarach o wysokiej homologii. Podstawienia aminokwasów mog a by c wynikiem zast apienia jednego aminokwasu innym aminokwasem o podobnej strukturze i/lub w la sciwo sciach chemicznych, tak jak zast apienie leucyny seryn a, tj. konserwatywna zamiana aminokwasów. Insercje lub delecje mog a mie c, ewentualnie, d lugosc w zakresie od oko lo 1 do 5 ami- nokwasów. Dopuszczalne zmiany mo zna okre sli c przez wprowadzenie kolejnych insercji, delecji lub podstawie n aminokwasów do sekwencji i badanie uzyskanych wariantów pod k atem aktywno sci wy- kazywanej przez pe lnej d lugo sci lub dojrza la natywna sekwencj e. Opisano tu równie z fragmenty polipeptydu TCCR. Fragmenty takie mog a by c skrócone na ko n- cu N lub koncu C lub mog a by c pozbawione wewn etrznych aminokwasów, przyk ladowo w porównaniu z natywnym bia lkiem pe lnej d lugo sci. W okre slonych fragmentach brak jest reszt aminokwasowych, które nie s a istotne dla po zadanej aktywno sci biologicznej polipeptydu TCCR. Fragmenty TCCR mog a by c przygotowane jakimkolwiek z licznych, tradycyjnych sposobów. Pozadane fragmenty peptydowe mog a by c syntetyzowane chemicznie. Alternatywne podej scie wy- maga wytworzenia fragmentów TCCR przez trawienie enzymatyczne np. przez dzia lanie na bia lko enzymem, o którym wiadomo, ze tnie bialka w miejscach okre slonych przez konkretne aminokwasy lub przez trawienie DNA odpowiednimi enzymami restrykcyjnymi i izolowanie pozadanego fragmentu. Kolejny u zyteczny sposób wymaga izolacji i oczyszczenia fragmentu DNA koduj acego po zadany fragment polipeptydu przez polimerazow a reakcj e lancuchow a (PCR). Oligonukleotydy okre slaj ace pozadany koniec fragmentu DNA s a u zyte, jako startery 5' i 3' w reakcji PCR. Zalecane fragmenty polipeptydowe posiadaj a wspóln a przynajmniej jedn a biologiczn a i/lub immunologiczn a aktywno sc z polipeptydami TCCR przedstawionymi na fig. 3 (SEQ ID N0:1) i fig. 4 (SEQ ID NO:2). W konkretnych wykonaniach, konserwatywne podstawienia b ed ace przedmiotem zaintereso- wania przedstawiono w tabeli I w kolumnie z nag lówkiem zalecane podstawienia. Je sli takie podsta- wienia prowadz a do zmiany aktywno sci biologicznej, to wprowadza si e bardziej istotne zmiany podane w tabeli I jako przyk ladowe podstawienia lub dodatkowo opisane poni zej w odniesieniu do klas amino- kwasów, a produkt jest poddawany analizie. T a b e l a I Wyj sciowa reszta Przyk ladowe podstawienia Zalecane podstawienia Ala (A) val; leu; ile val Arg (R) lys; gln; asn lys Asn (N) gln; his; lys; arg gln Asp (D) glu glu Cys (C) ser ser Gln (Q) asn asn Olu (E) asp asp Gly (G) pro; ala ala His (H) asn; gln; lys; arg arg Ile (I) Leu; val; met; Ala; phe; norleucyna leu Leu (L) norleucyna; ile, val; met; ala; phe ile Lys (K) arg; gln; asn arg Met (M) leu; phe; ile leu Phe (F) val ile Pro (P) ala ala Ser (S) thr thr Thr (T) ser ser Trp (W) tyr; phe tyr Tyr (Y) Trp; phe; thr; ser phe Val (V) Ile; leu; met; phe; ala; norleucyna leuPL 206 846 B1 24 Istotne modyfikacje funkcji lub to zsamo sci immunologicznej polipeptydu tu opisanego uzyskuje si e przez wybór podstawie n, które ró zni a si e znacz aco w swoim dzia laniu na utrzymanie (a) struktury szkie- letu polipeptydowego na obszarze podstawienia, przyk ladowo, jako konformacja kartki lub helisy, (b) ladunku lub hydrofobowo sci cz asteczki w docelowym miejscu lub (c) rozmiarów la ncucha bocznego. Naturalnie wyst epuj ace reszty podzielono na grupy zale znie od w la sciwo sci ich la ncuchów bocznych: (1) hydrofobowe: norleucyna, met, ala, val, leu, ile; (2) obojetne hydrofilowe: cys, ser, thr; (3) kwa sne: asp, glu; (4) zasadowe: asn, gln, his, lys, arg; (5) aminokwasy wp lywaj ace na orientacj e lancucha: gly, pro,; i (6) aromatyczne: trp, tyr, phe. Niekonserwatywne podstawienia b ed a obejmowa ly zmiany przedstawiciela jednej z tych klas na przedstawiciela innej klasy. Takie podstawione reszty aminokwasowe mog a by c równie z wprowadzo- ne w miejsca konserwatywnych podstawie n lub dogodniej w pozosta le (niekonserwatywne) miejsca. Warianty mo zna wytworzy c przy zastosowaniu znanych w tej dziedzinie sposobów, takich jak mutageneza za po srednictwem oligonukleotydów (miejscowo specyficzna), skanowanie alaninowe i mutageneza przez PCR. Mutageneza ukierunkowana [Carter i wsp.. Nucl. Acids Res., 13:4331 (1986); Zoller i wsp., Nucl. Acids Res. 10:6487 (1987)], mutageneza kasetkowa [Wells i wsp., Gene, 34:315 (1985)], mutageneza z selekcj a na enzym restrykcyjny [Wells i wsp., Philos. Trans. R. Soc. London SerA, 317:415 (1986)] lub innymi znanymi sposobami mog a by c przeprowadzone na sklono- wanym DNA dla wytworzenia wariantu DNA. Do identyfikacji jednego lub wi ekszej liczby aminokwasów wzd lu z ci ag lej sekwencji mo zna rów- nie z zastosowa c analiz e poprzez skanowanie aminokwasowe. W sród zalecanych aminokwasów do skanowania s a ma le, oboj etne aminokwasy. Takie aminokwasy obejmuj a alanin e, glicyn e, seryn e i cystein e. Alanina jest zazwyczaj zalecanym aminokwasem do skanowania, poniewa z wyklucza ona efekt w egla beta w lancuchu bocznym i jest mniej prawdopodobne, ze zmieni konformacj e g lównego lancucha wariantu [Cunningham i Wells, Science, 244:1081-1085 (1989)]. Alanina jest równie z za- zwyczaj zalecana, poniewa z jest najpowszechniejszym aminokwasem. Ponadto, jest cz esto znajdo- wana zarówno w ukrytych, jak i eksponowanych miejscach [Creighton, The Proteins (W.H. Freeman i Co., NY); Chothia, J. Mol. Biol. 150:1 (1976)]. Je sli podstawienie alanin a nie da odpowiedniej liczby wariantów u zyty mo ze by c aminokwas izoteryczny. C. Modyfikacje TCCR Zgodnie z wynalazkiem opisano równie z kowalencyjne modyfikacje TCCR. Jeden rodzaj kowa- lencyjnej modyfikacji obejmuje reakcj e docelowego aminokwasu w polipeptydzie TCCR z organicznym czynnikiem modyfikuj acym, który jest zdolny do reakcji z wybranymi lancuchami bocznymi albo N- lub C-ko ncowymi aminokwasami TCCR. Modyfikowanie bifunkcjonalnymi czynnikami jest u zyteczne przy- k ladowo dla wytworzenia wi aza n krzy zowych mi edzy TCCR a nierozpuszczalnym w wodzie z lo zem lub powierzchni a dla zastosowania w sposobie oczyszczania przeciwcia l anty-TCCR i vice-versa. Powszechnie stosowane czynniki do wytwarzania wi aza n krzy zowych obejmuj a np. 1,1-bis(diano- acetylo)-2-fenyloetan, aldehyd glutarowy, estry N-hydroksy sukcynimidowe, przyk ladowo estry z kwa- sem 4-azydosalicylowym, homobifunkcjonalne imido-estry obejmuj ace estry disukcynimidylowe, takie jak 3,3'-ditiobis(sukcynimidylopropionylo), bifunkcjonalne imidy maleinianowe, takie jak bis-N-male- imido-1,8-oktan i czynniki, takie jak metylo-3-[(p-azydofenylo)ditio]propioimid. Inne modyfikacje obejmuj a deamidacj e reszt glutaminylowej i asaraginylowej, odpowiednich reszt glutamylowych i aspartylowych, hydroksylacj e proliny i lizyny, fosforylacj e grup hydroksylowych seryny i treoniny, metylowanie grup a-aminowych lizyny, argininy i lancuchów bocznych histydyny [T.E. Creighton, Proteins Structure and Molecular Properties, W. H. Freeman i Co., San Francisco str. 79-86 (1983)], acetylacj e N-ko ncowej aminy i amidacj e jakiejkolwiek C-ko ncowej grupy karboksylowej. Inny rodzaj modyfikacji kowalencyjnej peptydu tu opisanego dotyczy zmiany naturalnego wzoru gli- kozylacji polipeptydu. „Zmiana naturalnej glikozylacji” ma tu oznacza c usuni ecie jednej lub wi ekszej liczby reszt w eglowodanowych wyst epuj acych w natywnej sekwencji polipeptydu (zarówno przez usuni ecie miejsca glikozylacji jak i usuni ecie glikozylacji chemicznie i/lub enzymatycznie) i/lub dodanie jednego lub wi ecej miejsc glikozylacji, które nie wyst epuj a w naturalnej sekwencji. Ponadto, wyra zenie obejmu- je jako sciowe zmiany w glikozylacji naturalnych bialek, w lacznie ze zmian a w naturze i proporcjach ró znych wyst epuj acych reszt w eglowodanowych.PL 206 846 B1 25 Dodanie miejsc glikozylacji do polipeptydu mo ze by c osi agni ete przez zmian e sekwencji amino- kwasowej. Zmiana mo ze by c dokonana przyk ladowo poprzez dodanie lub podstawienie jednej lub wi ekszej liczby seryn lub treonin w naturalnej sekwencji polipeptydowej (dla miejsc O-glikozylacji). Sekwencja aminokwasow a mo ze by c zmieniona w konsekwencji zmiany na poziomie DNA, szczegól- nie poprzez mutacje DNA koduj acego polipeptyd w wybranym nukleotydzie, tak, ze wytworzone s a kodony, które ulegaj a translacji do po zadanych aminokwasów. Inne sposoby zwi ekszania liczby reszt w eglowodanowych w peptydzie tu opisanym, to che- miczne lub enzymatyczne przy laczenie glikozydów do peptydu. Takie sposoby s a opisane w tej dzie- dzinie w WO 87/05330 opublikowanym 11 wrze snia 1987 oraz w Aplin i Wriston, CRC Crit. Rev. Blo- chem., str. 259-306 (1981). Usuni ecie reszt w eglowodanowych obecnych w peptydzie tu opisanym mo ze by c osi agni ete chemicznie lub enzymatycznie lub przez podstawienie w wyniku mutacji kodonów koduj acych amino- kwasy s lu zace, jako cele dla glikozylacji. Sposoby chemicznej deglikozylacji s a znane w tej dziedzinie i opisane przyk ladowo przez Hakimuddin i wsp., Arch. Blochem. Biophys., 259:52 (1987) oraz przez Edge i wsp., Anal. Blochem., 118:131 (1981). Enzymatyczne ci ecie reszt w eglowodanowych na poli- peptydach mo ze by c osiagni ete przy pomocy ró znych endo- i egzoglikozydaz, jak to opisali Thotakura i wsp., Meth. Enzymol. 138:350 (1987). Inny rodzaj modyfikacji kowalencyjnej obejmuje wi azanie polipeptydu tu opisanego z jednym z ró znorodnych, niebia lkowych polimerów np. glikolu polietylenowego (PEG), glikolu polipropylenowe- go lub polioksyalkilenów, w sposób podany w patentach US nr 4,640,835; 4,496,689; 4,301,144; 4,670,417; 4,791,192 lub 4,179,337. Polipeptydy TCCR tu opisane mog a równie z by c I modyfikowane tak, aby utworzy c chimerowe cz asteczki zawieraj ace polipeptyd tu opisany przy laczony do innego, heterologicznego polipeptydu lub sekwencji aminokwasowej. W pewnym wykonaniu taka chimerowa cz asteczka obejmuje fuzj e polipeptydu tu opisanego z polipeptydem znacznikowym D dostarczaj acym epitopu, z którym wybiórczo mo ze si e wi aza c prze- ciwcia lo przeciw znacznikowi. Epitop znacznikowy jest zazwyczaj umieszczany na ko ncu aminowym lub ko ncu karboksylowym polipeptydu tu opisanego. Obecno sc takiego epitopu-znacznika powoduje, ze polipeptyd tu opisany mo ze by c wykryty przy pomocy przeciwcia la przeciw polipeptydowemu znacznikowi. Równie z, dostarczenie epitopu znacznikowego czyni polipeptyd tu opisany latwym do oczyszczenia przez powinowactwo przy pomocy przeciwcia la przeciw znacznikowi lub innego rodzaju z lo za powinowactwa wi azacego epitop znacznikowy. Ró zne znaczniki polipeptydowe i odpowiadaj ace im przeciwcia la s a dobrze znane w tej dziedzinie. Przyk lady obejmuj a znaczniki polihistydynowe (poli- His) lub poli-histydynowo-glicynowe (poli-Gis-Gly), polipeptydowy znacznik HA grypy i przeciwcia lo przeciw niemu 12CA5 [Field i wsp.. Mol. Cell Biol., 8:2159-2165 (1988)]; znacznik c-myc i przeciwcia la przeciw niemu 8F9, 3C7, 6E10, G4, B7 i 9E10 [Evan i wsp., Molecular and Cellular Biology 5:3610- -3616 (1985)] oraz znacznik z glikoproteiny D wirusa opryszczki (gD) i przeciwcia lo I przeciw niemu [Paborsky i wsp.. Protein Egeneering 3(6):547-553 (1990)]. Inne znaczniki polipeptydowe obejmuj a polipeptyd Flag [Hopp i wsp., BioTechnology, 6:1204-1210 (1988)]; epitop peptydowy KT3 [Martin i wsp., Science 255:192-194 (1992)]; epitop peptydowy a-tubuliny [Skinner i wsp., J. Biol. Chem. 2 66:15163-15166 (1991)] i znacznik peptydowy z bia lka kodowanego przez gen 10 z bakteriofaga T7 [Lutz-Freyermuth i wsp., Proc. Natl. Acad. Sci USA 87:6393-6397 (1990)]. W alternatywnym wykonaniu chimerowa cz asteczka mo ze O obejmowa c fuzj e polipeptydu tu opisanego z immunoglobulin a lub konkretnym regionem immunoglobuliny. Dla postaci biwalentnej cz asteczki chimerowej (okre slanej równie z, jako „immunoadhezyna”) fuzj a tak a mo ze by c region Fc cz asteczki IgG. Fuzje Ig dogodnie obejmuj a podstawienie rozpuszczalnej (transb lonowa domena usu- ni eta lub inaktywowana) postaci polipeptydu tu opisanego w miejsce przynajmniej jednego regionu zmiennego w cz asteczce Ig. W szczególnie zalecanym wykonaniu fuzja immunoglobulinowa obejmuje zawias, CH2 i CH3 lub zawias i regiony CH1, CH2 i CHS cz asteczki IgGl. Dla informacji o wytwarzaniu fuzji immunoglobulin patrz równie z patent USA nr 5,428,130, nadany 27 czerwca 1995. D. Wytwarzanie TCCR Poni zszy opis dotyczy g lównie wytwarzania TCCR poprzez hodowanie komórek transformowa- nych lub transfekowanych wektorem zawieraj acym kwas nukleinowy dla TCCR. Oczywi scie rozwa za- ne s a sposoby alternatywne, które s a dobrze znane w tej dziedzinie i które mog a by c zastosowane do wytwarzania TCCR. Przyk ladowo sekwencja TCCR lub jej cz esci mog a by c wytworzone przez bezpo- sredni a syntez e peptydu na fazie sta lej (patrz np. Stewart i wsp., Solid-Phase Peptide Synthesis, W.H.PL 206 846 B1 26 Freeman Co., San Francisco CA (1969); Merryfield, J. Am. Chem. Soc. 85:2149-2154 (1963)). Synte- za bia lka in vitro mo ze by c przeprowadzona sposobem r ecznym lub automatycznie. Automatyczna synteza mo ze by c przyk ladowo wykonana przy pomocy Applied Biosysytems Peptide Synthesiser (Foster City, CA), zgodnie z instrukcjami producenta. Ró zne czesci TCCR mog a by c syntetyzowane chemicznie i po laczone sposobami chemicznymi lub enzymatycznymi, dajac TCCR pe lnej d lugo sci. 1. Izolacja DNA koduj acego polipeptyd tu opisany DNA koduj acy TCCR mo ze by c otrzymany z biblioteki cDNA przygotowanego z tkanki uwa zanej za zawieraj ac a mRNA dla TCCR i wyra zaj acej go w wykrywalnej ilo sci. Zgodnie z tym DNA ludzkiego TCCR mo ze by c dogodnie otrzymany z biblio- teki cDNA sporz adzonej dla ludzkiej tkanki, takiej jak opisano w przyk ladach. Gen koduj acy TCCR mo ze równie z by c uzyskany z biblioteki genomowej lub przez syntez e oligonukleotydu. Biblioteki mog a by c przeszukane sondami (takimi jak przeciwcia la przeciw peptydowi tu opisa- nemu lub oligonukleotydami o d lugo sci przynajmniej oko lo 20-80 zasad) zaprojektowanymi do identy- fikacji genu b edacego przedmiotem zainteresowania lub kodowanego przez niego bia lka. Przeszuki- wanie biblioteki cDNA lub genomowej wybran a sond a mo ze by c przeprowadzone przy pomocy typo- wych procedur, jakie opisano w Sambrook i wsp., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Nowy Jork: Cold Spring Harbor Laboratory Press 1989). Alternatywnym sposobem wyizolowania genu kodu- jacego polipeptyd tu opisany jest zastosowanie metodologii PCR [Sambrook i wsp., jak wy zej; Dieffenbach i wsp., PCR Primer: A Laboratory Manua l (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1995)]. Przyk lady poni zej opisuj a sposoby przeszukiwania biblioteki cDNA. Sekwencje oligonukleoty- dowe wybrane, jako sondy powinny mie c dostateczn a d lugo sc i by c dostatecznie urozmaicone, aby zminimalizowa c wyniki fa lszywie dodatnie. Zalecany oligonukleotyd jest wyznakowany tak, ze mo ze by c wykryty przez hybrydyzacj e z DNA w przeszukiwanej bibliotece. Sposoby znakowania s a dobrze znane w tej dziedzinie i obejmuj a zastosowanie radioaktywnych znaczników, jak ATP wyznakowany ^^P, biotynylowanie oraz znakowanie enzymem. Warunki hybrydyzacji obejmuj ace srednio ostre i ostre warunki hybrydyzacji s a podane przez Sambrook i wsp., jak wy zej. Sekwencje zidentyfikowane przy zastosowaniu takich sposobów przeszukiwania bibliotek mog a by c porównane i przyrównane z innymi znanymi sekwencjami zdeponowanymi i dost epnymi w pu- blicznych bazach danych, takich jak GenBank lub innych, prywatnych bazach danych sekwencji. Iden- tyczno sc sekwencji (zarówno na poziome aminokwasowym jak i nukleotydowym) w obr ebie okre slo- nych obszarów cz asteczki lub wzd lu z sekwencji o pe lnej d lugo sci mo ze by c mo ze by c okre slona spo- sobami znanymi w tej dziedzinie i tu opisanymi. Kwas nukleinowy posiadaj acy sekwencj e koduj ac a bia lko mo ze by c uzyskany przez przeszuki- wanie wybranych bibliotek cDNA lub genomowych przy pomocy ujawnionej tu po raz pierwszy wyde- dukowanej sekwencji aminokwasowej i je sli to niezb edne stosuj ac tradycyjn a technik e wyd luzania startera, jak opisano w Sambrook i wsp., jak wy zej, dla wykrycia prekursorów i produktów po srednich obróbki mRNA, które mog ly nie ulec odwrotnej transkrypcji do cDNA. 2. Wybór i transformacja komórek gospodarza W celu wytwarzania TCCR komórki gospodarza s a transfekowane lub transformowane wekto- rami ekspresyjnymi lub dla klonowania opisanymi tu i hodowane w tradycyjnych po zywkach zmodyfi- kowanych odpowiednio dla indukcji promotorów, selekcji transformantów lub amplifikacji genów kodu- jacych po zadane sekwencje. Warunki hodowli, takie jak pod lo ze, temperatura, pH i im podobne mog a by c wybrane przez specjalist e w tej dziedzinie bez potrzeby eksperymentowania. Ogólnie, podstawy, protoko ly i praktyczne techniki dla maksymalizacji produktywno sci hodowli komórkowych mo zna zna- lezc w Mammalian Celi Biotechnology: A Practical Approach, M. Butler wyd. (IRL Press, 1991) oraz Sambrook i wsp., jak wy zej. Sposoby transfekcji s a znane specjali scie w tej dziedzinie i przyk ladami ich s a metody z CaCl 2 , CaPO 4 , za po srednictwem liposomu i elektroporacja. Zale znie od u zytej komórki gospodarza, trans- formacja jest wykonana przy pomocy typowych technik odpowiednich dla takich komórek. Dzia lanie wapniem wykorzystuj ace chlorek wapniowy, jak to opisano w Sambrook i wsp., jak wy zej lub elektro- poracja, s a zazwyczaj stosowane dla komórek prokariotycznych lub innych komórek posiadaj acych istotne bariery w postaci sciany komórkowej. Zaka zenie Agrobacterium tumefaciens stosuje si e dla transformacji okre slonych komórek ro slinnych, jak to jest opisane w Shaw i wsp., Gene 23:315 (1983) i WO 89/05859, opublikowanym 29 czerwca 1989. Dla komórek ssaczych nieposiadaj acych takich scian komórkowych stosowany jest sposób wspó lstr acania z fosforanem wapnia, opisany przez Gra- ham i van der Eb, Virology:456-457 (1978). Podstawowe zasady transformacji ssaczych komórek opisano w patencie USA nr 4,399,216. Transformacje do dro zd zy s a typowo przeprowadzone zgodniePL 206 846 B1 27 ze sposobem Van Solingen i wsp., J. Bact. 130:976 (1977) i Hsiao i wsp., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 76:3829 (1979). Jednak ze do wprowadzenia DNA do komórek stosowane mog a by c inne spo- soby, takie jak np. mikrowstrzykni ecie do j adra komórkowego, elektroporacja, fuzja bakteryjnych pro- toplastów z nienaruszonymi komórkami lub polikationy np. polibren, poliornityna. Dla ró znych sposo- bów transformacji komórek ssaczych patrz Keown i wsp., Methods in Enzymology, 185:527-537 (1990) oraz Mansour i wsp.. Nature 336:348-352 (1988). U zytecznymi komórkami do klonowania lub ekspresji DNA w wektorach s a komórki prokario- tyczne, dro zd ze lub komórki wy zszych eukariotów. U zyteczne komórki prokariotyczne obejmuj a, bez ograniczenia, eubakterie, takie jak organizmy Gram-ujemne lub Gram-dodatnie, przyk ladowo Enterobacteriaceae takie jak E. coli. Ró zne szczepy E. coli s a dost epne publicznie, w tym szczep E. coli K12 MM294 (ATCC31, 446); E. coli X1776 (ATCC31,537) ; szczep E. coli W3110 (ATCC27,325) i K5 772 (ATCC53,635). Inne odpowiednie komórki gospodarza prokariotycznego obejmuj a Enterobacteriaceae takie jak Escherichia, np. E. coli K12 szczep MM294 (ATCC 31,446); E. coli X1776 (ATCC 31,537); E. coli szczep W3110 (ATCC 27,325) i K5 772 (ATCC 53,635), Enterobacter, Erwinia, Klebsiella, Proteus, Salmonella, np., Salmonella typhimurium, Serratia, np., Serratia marcescans i Shigella, jak równie z Bacilli, takie jak B. subtilis i B. licheniformis (np., B. licheniformis 41P ujawniony w DD 266,710 opubli- kowanym 12 kwietnia 1989), Pseudomonas, taki jak P. aeruginosa i Streptomyces. Przyk lady te sta- nowi a ilustracj e, a nie ograniczenie. Szczep E. coli W3110 jest szczególnie korzystnym gospodarzem lub gospodarzem rodzicielskim, poniewa z jest on powszechnie stosowanym szczepem gospodarza do fermentacji dla produktów rekombinowanego DNA. Zalecane komórki gospodarza wydzielaj a minimal- ne ilo sci enzymów mo zna proteolitycznych. Na przyk lad, szczep W3110 modyfikowa c w celu uzyska- nia mutacji genetycznej w genach koduj acych bia lka endogenne dla gospodarza, a przyk lady takich gospodarzy obejmuj a E. coli W3110 szczep 1A2, którego pe lny genotyp to tonA; E. coli W3110 szczep 9E4, którego pe lny genotyp to tonA ptr3; E coli W3110 szczep 27C7 (ATCC 55,244), którego pe lny genotyp to tonA ptr3 phoA E15 (argF-lac) 169 degP ompT kan r ; E. coli W3110 szczep 37D6, którego pe lny genotyp to tonA ptr3 phoA E15 (argF-lac)169 degP ompT rbs7 ilvG kan r ; E. coli W3110 szczep 40B4, który jest szczepem 37D6 z niekanamycynooporn a mutacj a delecyjn a degP; oraz szczep E. coli maj acy zmutowan a perypalazmatyczn a proteaz e, ujawniony w patencie USA nr 4,946,83 wydanym 7 sierpnia 1990. Alternatywnie, odpowiednie s a metody klonowania in vitro, np. PCR lub inne reakcje la ncuchowe polimerazy dla kwasów nukleinowch. Poza organizmami prokariotycznymi, mikroorganizmy eukariotyczne, takie jak grzyby nitkowate albo dro zd ze, s a przydatnymi gospodarzami do klonowania lub ekspresji dla wektorów koduj acych TCCR. Saccharomyces cerevisiae jest powszechnie stosowanym gospodarzem - mikroorganizmem b ed acym ni zszym eukariotem. Inne obejmuj a Schizosaccharomyces pombe (Beach i Nurse, Nature 290: 140 (1981); EP 139,383 opublikowany 2 maja 1985); gospodarze Kluveromyces (patent USA nr 4,943,529; Fleer i wsp., Bio/Technology 9: 968-975 (1991)), tacy jak, np., K. lactis (MW98-8C, CBS683, CBS4574; Louvencourt i wsp., J. Bacteriol. 154 (2): 737 (1983); K. fragilis (ATCC 12,424), K. bulgaricus (ATCC 16,045), K. wicheramii (ATCC 24,178), K. waltii (ATCC 56,500), K. drosophilarum (ATCC 36,906); Van den Berg i wsp., Bio/Technology 8:135 (1990)), K. thermotolerans i K. marxianus; Yarrowia (EP 402,226); Pichia pastoris (EP 183, 070); Sreekrishna i wsp., J. Basic Microbiol. 28: 265- -278 (1988); Candida; Trichoderma reesia (EP 244,234); Neurospora crassa (Case i wsp.. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76: 5259-5263 (1979); Schwanniomyces, taki jak Schwanniomyces occidentalis (EP 394,538 opublikowany 31 pa zdziernika 1990); oraz grzyby nitkowate, takie jak np., Neurospora, Peni- cillium, Tolypocladium (WO 91/00357 opublikowane 10 stycznia 1991) i gospodarze Aspergillus, tacy jak A. nidulans (Ballance i wsp., Blochem. Biophys. Res. Commun. 112: 284289 (1983); Tilburn i wsp., Gene 26: 205-221 (1983); Yelton i wsp.. Proc. Natl. Acad Sci. USA 81: 1470-1474 (1984)) i A. niger (Kelly and Hynes, EMBO J. 4 : 475-479 (1985)). Odpowiednie s a tu dro zd ze metylotropiczne i obejmuj a one, bez ograniczania, dro zd ze zdolne do wzrostu na metanolu wybrane z rodzajów sk la- daj acych si e z Hansenula, Cadida, Kloeckera, Pichia, Saccharomyces, Torulopsis i Rhodotorula. List e konkretnych gatunków, które stanowi a przyk lad dla tej klasy dro zd zy mo zna znale zc w C. Anthony, The Biochemistry of Methylotrophs 269 (1982). Odpowiednie komórki gospodarzy do ekspresji glikozylowanych polipeptydów TCCR pochodz a z organizmów wielokomórkowych. Przyk lady komórek bezkr egowców obejmuj a komórki owadów, takie jak S2 Drosophila oraz Sf9 i high five Spodoptera, jak równie z komórki ro slinne. Przyk lady przy- datnych linii komórek ssaków-gospodarzy obejmuj a komórki jajnika chomika chi nskiego (CHO) i ko-PL 206 846 B1 28 mórki COS. Bardziej konkretne przyk lady obejmuj a lini e komórek ma lpiej nerki CVI transformowan a SV40 (COS-7, ATCC CRL 1651); lini e ludzkiej embrionalnej nerki (293 lub komórki 293 subklonowane do wzrostu w hodowli zawiesinowej, Graham i wsp., J. Gen Virol. 36: 59 (1977)); komórki jajnika cho- mika chi nskiego/-DHFR (CHO, Urlaub i Chasin., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77: 4216 (1980)); mysie komórki Sertoliego (TM4, Mather, Biol. Reprod. 23: 243-251 (1980)); ludzkie komórki p luc (W138, ATCC CCL 75); ludzkie komórki w atroby (Hep G2, HB 8065); i mysiego raka gruczo lu mlecznego (MMT 060562, ATCC CCL51). Uwa za si e, ze wybór odpowiednich komórek gospodarza jest w zakre- sie umiej etno sci specjalisty w tej dziedzinie. 3. Wybór i stosowanie wektora podlegaj acego replikacji Kwas nukleinowy (np. cDNA lub DNA genomowy) koduj acy TCCR mo zna wstawi c do podlegaj acego replikacji wektora do klonowania (am- plifikacji DNA) lub do ekspresji. Rozmaite wektory s a publicznie dost epne. Wektory mog a by c na przy- k lad w postaci plazmidu, kosmidu, cz astki wirusowej, fagmidu lub faga. Odpowiedni a sekwencj e kwa- su nukleinowego mo zna wstawi c do wektora przy zastosowaniu rozmaitych procedur. Generalnie, DNA wstawia si e do odpowiedniego miejsca (miejsc) dla endonukleaz restrykcyjnych stosuj ac techniki znane w tej dziedzinie. Sk ladniki wektora generalnie obejmuj a, mi edzy innymi, jedn a albo wi ecej se- kwencji sygna lowych, pocz atek replikacji, jeden albo wi ecej genów markerowych, element wzmacnia- cza, promotor i sekwencj e terminacji transkrypcji. Przy konstrukcji odpowiednich wektorów zawieraj a- cych jeden albo wi eksz a liczb e tych sk ladników wykorzystuje si e standardowe techniki ligacji, które s a znane specjali scie w tej dziedzinie. TCCR mo zna wytwarza c poprzez rekombinowanie DNA nie tylko bezpo srednio, ale równie z, ja- ko fuzj e polipeptydow a z polipeptydem heterologicznym, którym mo ze by c sekwencja sygna lowa albo inny polipeptyd maj acy specyficzne miejsce ci ecia na ko ncu N dojrza lego bia lka albo polipeptydu. Generalnie, sekwencja sygna lowa mo ze by c sk ladnikiem wektora albo mo ze by c cz escia DNA kodu- jacego TCCR, który jest wstawiony do wektora. Sekwencj a sygna low a mo ze by c prokariotyczna se- kwencja sygna lowa wybrana na przyk lad z grupy z lo zonej z liderów alkalicznej fosfatazy, penicylinazy, Ipp, termostabilnej enterotoksyny II. Dla dro zd zy sekwencj a sygna low a mo ze by c, np., lider inwertazy dro zd zowej, lider czynnika alfa (w tym lidery czynnika a Saccharomyces i Kluyveromyces, ten ostatni opisany w patencie USA nr 5,010,182) albo lider alkalicznej fosfatazy, lider glukoamylazy C. albicans (EP 362,179 opublikowany 4 kwietnia 1990) lub sekwencja sygna lowa opisana w WO 90/13646 opu- blikowanym 15 listopada 1990. Przy ekspresji w komórkach ssaków, do kierowania sekrecj a bia lka mo zna zastosowa c ssacze sekwencje sygna lowe, takie jak sekwencje sygna lowe z wydzielanych polipeptydów tego samego albo spokrewnionego gatunku, jak równie z wirusowe lidery sekrecyjne. Zarówno ekspresyjne jak i wektory do klonowania zawieraj a sekwencj e kwasu nukleinowego, która umo zliwia wektorowi replikacj e w komórkach jednego albo wi ekszej liczby wybranych gospoda- rzy. Takie sekwencje s a dobrze znane dla wielu bakterii, dro zd zy i wirusów. Pocz atek replikacji z pla- zmidu pBR322 jest odpowiedni dla wi ekszo sci bakterii Gram-ujemnych, pocz atek replikacji plazmidu 2 µ jest odpowiedni dla dro zd zy, a ró zne pocz atki wirusowe (SV40, polyoma, adenowirusa, VSV lub BPV) s a przydatne dla wektorów do klonowania w komórkach ssaczych. Wektory ekspresyjne i wektory do klonowania typowo b ed a zawiera ly gen do selekcji, nazywany równie z markerem selekcyjnym. Typowe geny selekcyjne koduj a bia lka nadaj ace oporno sc na anty- biotyki lub inne toksyny np. amplicylin e, neomycyn e, metotreksat lub tetracyklin e, (b) komplementuj a auksotrofi e, lub (c) dostarczaj a krytycznych sk ladników pokarmowych niedost epnych w z lo zonej po- zywce, np. dla Bacilli, gen koduj acy racemaz e D-alaniny. Przyk ladem odpowiednich markerów selekcyjnych dla komórek ssaczych s a te, które pozwalaj a na identyfikacj e komórek zdolnych do pobrania kwasu nukleinowego koduj acego polipeptyd tu opisa- ny, taki jak DHFR lub kinaza tymidynowa. Odpowiednimi komórkami gospodarza, gdy stosowany jest DHFR typu dzikiego, jest linia komórkowa CHO pozbawiona aktywno sci DHFR, przygotowana i nam- na zana jak opisali Urlaub i wsp. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4216 (1980). U zytecznym genem se- lekcyjnym dla u zycia w dro zd zach jest gen trpl obecny na plazmidzie dro zd zowym YRp7 [Stinchcomb i wsp.. Nature 282:39 (1979); Kingsman i wsp., Gene 7:141 (1979); Tschemper i wsp., Gene 10:157 (1980)]. Gen trpl dostarcza markera selekcyjnego dla zmutowanego szczepu dro zd zy pozbawionego zdolno sci do wzrostu na tryptofanie, przyk ladowo, ATCC, nr 44076 lub PEP4-1 [Jones, Genetics, 85:12 (1977)]. Wektory ekspresyjne i do klonowania zazwyczaj zawieraj a promotor polaczony funkcjonalnie z sekwencj a kwasu nukleinowego koduj ac a TCCR dla kierowania syntez a mRNA. Promotory rozpo- znawane przez ró znorodne potencjalne komórki gospodarza s a dobrze znane. Promotory u zytecznePL 206 846 B1 29 w prokariotycznych gospodarzach obejmuj a systemy promotorowe ß-laktamazy i laktozy [Chang i wsp., Nature, 275:615 (1978); Goeddel i wsp., Nature 281:544 (1979)], alkalicznej fosfatazy, system promotora operonu tryptofanowego (trp) [Goeddel, Nucleic Acids Res., 8:40-57 (1980); EP 36,776] i hybrydowe promotory, takie jak promotor tac [deBoer i wsp., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:21-25 (1983)]. Promotory do zastosowania w systemach bakteryjnych powinny równie z zawiera c sekwencj e Shine-Dalgarno (S.D.) po laczon a funkcjonalnie z DNA koduj acym TCCR. Przyk lady u zytecznych sekwencji promotorowych do zastosowania w gospodarzach dro zd zo- wych obejmuj a promotory dla kinazy 3-fosfoglicerynianowej [Hitzeman i wsp., J. Biol. Chem. 255:2073 (1980)] lub innych enzymów glikolitycznych [Hess i wsp., J. Adv. Enzyme Reg. 7:149 (1968); Holland, Biochemistry, 17:4900 (1978)], takie jak enolaza, dehydrogenaza gliceraldehydo-3-fosforanowa, hek- sokinaza, dekarboksylaza pirogronianowa, fosfofruktokinaza, izomeraza glukozo-6-fosforanu, mutaza 3-fosfoglicerynianowa, kinaza pirogronianowa, izomeraza triozofosforanowa, izomeraza fosfoglukozy i glukokinaza. Innymi promotorami dro zd zowymi, które s a promotorami indukowalnymi posiadaj acymi dodat- kow a zalet e kontrolowania transkrypcji zale znie od warunków wzrostu, to regiony promotorowe genów dla dehydrogenazy alkoholowej 2, izocytochromu C, kwa snej fosfatazy, enzymów degraduj acych zwi azanych z metabolizmem azotu, metalotioneiny, dehydrogenazy gliceraldehydu-3-fosforanowej i enzymów odpowiedzialnych za wykorzystanie maltozy i galaktozy. U zyteczne wektory i promotory do ekspresji w dro zd zach s a ponadto opisane w EP 73,657. Transkrypcja genu dla polipeptydu TCCR tu opisanego z wektorów w komórkach ssaczych jest kontorlowana przyk ladowo przez promotory uzyskane z genomu wirusów, takich jak wirus polioma, wirus ospy drobiu (UK 2,211,504 opublikowane 5 lipca 1989), adenowirus (taki jak Adenowirus 2), bydl ecy wirus brodawczaka, ptasi wirus mi esaka, wirus cytomegalii, retrowirus, wirus zó ltaczki typu B i ma lpi wirus 40 (SV40), z heterologicznych ssaczych promotorów np. promotora aktyny lub promotora immunoglobuliny i z promotorów bia lek szoku cieplnego, przy za lo zeniu, ze takie promotory s a zgodne z systemami komórek gospodarza. Transkrypcja DNA koduj acego TCCR przez wy zsze eukarioty mo ze by c zwi ekszona przez wbudowanie do wektora sekwencji wzmacniacza. Wzmacniacze s a elementami DNA dzia laj acymi w uk ladzie cis, zazwyczaj o d lugo sci oko lo od 10 do 300 par zasad, które dzia laj a na promotor zwi ek- szaj ac jego transkrypcj e. Znanych jest obecnie wiele sekwencji wzmacniaczy z genów ssaczych (glo- bina, elastaza, albumina, a-fetoproteina i insulina). Jednak zazwyczaj b edzie stosowany wzmacniacz z wirusa komórki eukariotycznej. Przyk lady obejmuja wzmacniacz SV40, znajduj acy si e po stronie pó znej pocz atku replikacji (zasady 100-270), wzmacniacz wczesnego promotora wirusa cytomegalii, wzmacniacz polioma po pó znej stronie miejsca inicjacji replikacji i wzmacniacze adenowirusa. Wzmacniacz mo ze by c wstawiony do wektora po stronie 5' lub 3' wzgl edem sekwencji koduj acej poli- peptyd TCCR tu opisany, lecz jest dogodnie umiejscowiony po stronie 5' promotora. Wektory ekspresyjne u zywane w eukariotycznych komórkach gospodarza (dro zd zy, grzybów, owadów, ro slin, cz lowieka lub j adrowych komórkach z innych, wielokomórkowych organizmów) b ed a równie z zawiera ly sekwencje niezb edne dla terminacji transkrypcji i dla stabilizowania mRNA. Takie sekwencje s a powszechnie dost epne z 5', a czasami 3' nieulegaj acych translacji regionów eukario- tycznego lub wirusowego DNA lub cDNA. Regiony te zawieraj a odcinki nukleotydowe transkrybowane, jako poliadenylowane fragmenty w nieulegaj acych translacji cz esciach mRNA koduj acych TCCR. Dalsze sposoby, wektory i komórki gospodarza nadaj ace si e do syntezy TCCR w hodowlach rekombinowanych komórek kr egowca opisano w Gething i wsp.. Nature, 293:620-625 (1981); Mantei i wsp.,. Nature, 281:40-46 (1979); EP 117,060 i EP 117,058. 4. Wykrywanie amplifikacji/ekspresji genu Amplifikacja genu i/lub ekspresja mog a by c bezpo srednio zmierzone w próbce, przyk ladowo stosuj ac tradycyjn a metod e Southern b lot, Northern dla ilo sciowego okre slenia transkrypcji mRNA [Thomas, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:5201-5205 (1980)], analiz e kroplow a (analiza DNA) lub przez hybrydyzacj e in situ u zywaj ac odpowiedniej wyznakowanej sondy opieraj ac si e na dostarczonej tu sekwencji. Alternatywnie, przeciwcia la mog a by c zastosowane tak, ze mog a rozpoznawa c specyficzne dupleksy obejmuj ace dupleksy DNA, dupleksy RNA i hybrydowe dupleksy DNA-RNA lub dupleksy DNA-bia lko. Przeciwcia la mog a by c z kolei wyznakowane i oznaczenie mo ze by c przeprowadzone tak, ze dupleks wiaze si e z powierzchni a, tak, ze po utworzeniu dupleksu na powierzchni mo zna wy- kry c obecno sc przeciwcia la zwi azanego z dupleksem.PL 206 846 B1 30 Ekspresja genu mo ze by c, alternatywnie, zmierzona sposobami immunologicznymi, takimi jak immunohistochemiczne barwienie komórek lub skrawków tkanki i testy dla hodowli komórkowych lub p lynów cia la do bezpo sredniego, ilo sciowego oznaczenia produktu ekspresji genu. Przeciwcia la u zy- teczne dla barwienia immunohistochemicznego i/lub testu dla próbki p lynów mog a by c zarówno mo- noklonalne jak i poliklonalne i mog a by c wytworzone w ka zdym ssaku. Dogodnie, przeciwcia la mo zna wytworzy c anty-TCCR o sekwencji natywnej lub przeciw syntetycznemu peptydowi opartemu na do- starczonych tu sekwencjach DNA lub przeciw egzogennej sekwencji przy laczonej do DNA TCCR ko- duj acego polipeptyd tu opisany i koduj acego epitop dla swoistego przeciwcia la. 5. Oczyszczenie polipeptydu Postaci TCCR mog a by c odzyskane z po zywki hodowlanej lub z lizatów komórki gospodarza. Je sli jest on zwi azany z b lon a, to mo ze by c uwolniony z b lony przy pomocy dogodnego roztworu de- tergentu (np. Triton®-X 100) lub ci ecia enzymatycznego. Komórki zastosowane do ekspresji polipep- tydu TCCR mog a by c rozbite róznymi fizycznymi lub chemicznymi sposobami, takimi jak cykliczne zamra zanie-rozmra zanie, rozbijanie ultrad zwi ekami, rozbijanie mechaniczne lub czynnikami powodu- jacymi liz e komórki. Mo ze by c pozadanym oczyszczenie TCCR od rekombinowanych bia lek komór- kowych lub polipeptydów. Przyk ladowymi u zytecznymi procedurami do oczyszczania s a: frakcjonowa- nie na kolumnie jonowymiennej; wytr acanie etanolem; HPLC z odwróconymi fazami; chromatografia na krzemionce lub wymiana kationowa na zywicy takiej jak DEAE; ogniskowanie chromatograficzne; SDS-PAGE; wtr acanie siarczanem amonu; s aczenie molekularne przy pomocy przyk ladowo sefadek- su G-75; kolumny sefarozowe z bia lkiem A dla usuni ecia zanieczyszcze n, takich jak IgG i kolumny chelatuj ace metal dla zwi azania postaci polipeptydu tu opisanego z wyznakowanym epitopem. Mo zna zastosowa c ró zne sposoby oczyszczania bia lka i takie sposoby s a znane w tej dziedzinie i przyk lado- wo opisane przez Deutscher, Methods in Enzymology 182 (1990); Scopes, Protein Purification: Prin- ciples and Practice, Springer-Verlag, Nowy Jork (1982). Wybrane etap(y) oczyszczania b ed a przyk la- dowo zale za ly od charakteru procesu wytwarzania i konkretnego wytwarzanego TCCR. 6. Dystrybucja tkankowa. Lokalizacj e tkanek z ekspresj a polipeptydów tu opisanych mo zna uzyska c przez okre slenie ekspresji mRNA w ró znych ludzkich tkankach. Umiejscowienie takich genów dostarcza informacji o tym, które tkanki s a najprawdopodobniej dotkni ete pobudzaj ac a i hamuj ac a aktywno scia polipepty- dów tu opisanych. Umiejscowienie genu w specyficznej tkance dostarcza równie z próbki tkanki dla dyskutowanego poni zej oznaczenia blokowania aktywno sci. Jak wspomniano wcze sniej, ekspresja genu w ró znych tkankach mo ze by c zmierzona tradycyj- nymi sposobami Southern i Northern dla ilo sciowego oznaczenia syntezy mRNA (Thomas, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:5201-5205 [1980]), analizy kroplowej (analiza DNA) lub hybrydyzacji in situ przy pomocy odpowiednio wyznakowanej sondy opartej na dostarczonych tu sekwencjach. Alternatywnie, mog a by c zastosowane przeciwcia la rozpoznaj ace specyficzne dupleksy w lacznie z dupleksami DNA, dupleksami RNA i hybrydami dupleksami DNA-RNA lub dupleksami DNA-bia lko. Ekspresja genu w ró znych tkankach, alternatywnie, mo ze by c zmierzona sposobami immunolo- gicznymi, takimi jak immunohistochemiczne barwienie skrawków tkanki i testy dla hodowli komórko- wych lub p lynów cia la do ilo sciowej bezpo sredniej oceny produktu ekspresji genu. Przeciwcia la u zy- teczne dla immunohistochemicznego barwienia i/lub testów dla próbek p lynów mog a by c zarówno monoklonalne jak i poliklonalne i mog a by c wytworzone w jakimkolwiek ssaku. Dogodnie, przeciwcia la mog a by c przygotowane przeciw polipeptydowi tu opisanemu o sekwencji natywnej lub przeciw synte- tycznemu peptydowi opartemu na sekwencji DNA koduj acej polipeptyd tu opisany, lub przeciw egzo- gennej sekwencji przy laczonej do DNA koduj acego polipeptyd tu opisany i koduj acego epitop swoisty dla przeciwcia la. Ogólnie, techniki wytwarzania przeciwcia l i specjalne protoko ly dla analizy Northern i hybrydyzacji in situ s a dostarczone poni zej. E. Zastosowania TCCR. 1. Zastosowania ogólne. TCCR nale zy do receptorów cytokin klasy WS(G)XWS o homologii do receptora IL-12 ß-2, G-CSFR i receptora IL-6, przy czym najwi eksze podobie nstwo jest do receptora IL-12 ß-2 (26% identyczno sci). Receptory te przekazuj a sygna l kontroluj acy wzrost i ró znicowanie si e komórek, szczególnie komórek uczestnicz acych we wzro scie i ró znicowaniu komórek krwi. Przyk ladowo G-CSF znalaz l szerokie zastosowanie kliniczne dla namna zania neutrofili po chemioterapii. Te rodzaje recep- torów cytokin i ich agoni sci/antagoni sci prawdopodobnie b ed a mog ly odgrywa c wa zn a rol e w leczeniu chorób hematologicznych i nowotworowych. Stwierdzono, ze TCCR odgrywa rol e w odpowiedzi po-PL 206 846 B1 31 mocniczych komórek T - szczególnie w modulowaniu ró znicowania komórek T do podzbioru Th1 i Th2. W efekcie TCCR i jego agoni sci/antagoni sci mog a by c u zyteczni w sposobach terapeutycznych przechylania odpowiedzi immunologicznej ssaka b ad z w stron e odpowiedzi komórek pomocniczych T1 (Th1) b ad z w stron e odpowiedzi pomocniczych komórek T2 (Th2), zale znie od celu terapeutycznego. Komórki CD4+ T odgrywaj a krytyczn a rol e w alergicznych odpowiedziach zapalnych, wzmaga- jac rekrutacj e, wzrost i ró znicowanie wszystkich innych, uczestnicz acych w odpowiedzi typów komó- rek. Komórki CD4+ realizuj a t e funkcj e przez wydzielanie szeregu cytokin, w lacznie z interleukin a (IL-4) i IL-13, które wzmagaj a indukcj e syntezy IgE w komórkach B, wzrost komórek tucznych i rekru- tacj e limfocytów, komórek tucznych i zasadoch lonnych w miejscu stanu zapalnego. Ponadto komórki T CD4+ wytwarzaj a IL-5, która wzmaga wzrost i ró znicowanie eozynofili i komórek B, i IL-10, która wzmaga wzrost i ró znicowanie komórek tucznych i hamuje wytwarzanie interferonu ?. Kombinacja IL-4, IL-5, IL-10 i IL-13 jest wytwarzana przez podklas e komórek T CD4+ nazywan a Th2, któr a wykry- wa si e z wi eksz a cz estosci a u osób z alergi a. Komórki Th1 wydzielaj a cytokiny wa zne w aktywacji makrofagów (IFN- ?, IL-2, czynnik ß martwi- cy nowotworu [TNF- ß]) iw indukcji odporno sci z udzia lem komórek. Komórki Th2 wydzielaj a cytokiny wa zne w odporno sci humoralnej i chorobach alergicznych (IL-4, IL-5 i IL-10). Podczas gdy cytokiny Th1 hamuj a wytwarzanie cytokin Th2, cytokiny Th2 hamuj a wytwarzanie cytokin Th1. Ta p etla ujem- nego sprz ezenia zwrotnego warunkuje wytworzenie spolaryzowanego wzoru wytwarzania cytokin podczas odpowiedzi immunologicznych. Utrzymanie delikatnej równowagi pomi edzy produkcj a tych „przeciwstawnych” cytokin jest krytyczne, bowiem nadprodukcja cytokin Th1 przypuszczalnie prowadzi do chorób z autoimmunologicznym stanem zapalnym i odrzutu alloprzeszczepu. Równocze snie nad- produkcja cytokin Th2 prowadzi do chorób z uczuleniowym stanem zapalnym, takich jak astma i aler- giczne zapalenie b lony sluzowej nosa lub nieskutecznej odporno sci przeciw wewn atrzkomórkowym patogenom. Umetsu i DeKruyff, Proc. Soc. Exp. Bio. Med. 215(1):ll-20 (1997) zaproponowali model, w któ- rym wra zliwo sc na infekcj e jest wyt lumaczona nie jako brak odporno sci, lecz raczej jako rozwój komó- rek T o odpowiednim profilu wydzielania cytokin. Choroba alergiczna jest powodowana przez komórki T CD4+ nieodpowiednio wydzielaj ace cytokiny Th2, podczas gdy osoby bez alergii pozostaj a bez- objawowe, poniewa z wykszta lcaj a komórki T wydzielaj ace cytokiny Th1, które hamuj a syntez e IgE i ró znicowanie komórek tucznych i eozynofili. Innymi s lowy alergiczne zapalenie b lony sluzowej nosa i astma mog a by c zaburzeniami patologicznymi lub tolerancj a jamy ustnej/ sluzówki, w której komórki T, które normalnie rozwin elyby si e w regulatorowe/supresorowe komórki „Th2” zamiast tego rozwijaj a sie w komórki „Th2”, które zapocz atkowuj a i nasilaj a uczuleniowy stan zapalny. Receptory cytokinowe ogólnie cechuj a si e wielodomenow a struktur a obejmuj ac a domen e ze- wn atrzkomórkowa, domen e transb lonowa i domen e wewn atrzkomórkow a. Domena zewn atrzkomór- kowa zazwyczaj dzia la wiaz ac ligand, domena transb lonowa kotwiczy receptor w b lonie komórkowej, a domena wewn atrzkomórkowa jest zazwyczaj efektorem uczestnicz acym w przekazywaniu sygna lu w komórce. Jednak ze, wi azanie ligandu i funkcje efektorowe mog a by c zwi azane z oddzielnymi pod- jednostkami multimerycznego receptora. Sama domena wi azaca ligand mo ze by c domen a wielopod- jednostkow a. Multimeryczne receptory to szeroki termin, który ogólnie obejmuje: (1) homodimery; (2) heterodimery posiadaj ace podjednostki, które posiadaj a zarówno domeny wiazace ligand jak i efekto- rowe i (3) multimery sk ladaj ace si e z podjednostek o oddzielnych funkcjach. Receptory cytokiny s a dok ladniej opisane i sklasyfikowane w Urdahl, Ann. Reports Med. Chem. 26:221-228 (1991) i Cos- man, Cytokine 5:95-106 (1993). Poza konkretnymi zastosowaniami zwi azanymi z odporno scia (np. fizjologi a z udzia lem komó- rek Th1 i Th2) sekwencje nukleotydowe (lub komplementarne do nich) koduj ace TCCR znajduj a ró zne zastosowania w biologii molekularnej, w lacznie z u zyciem jako sondy do hybrydyzacji, w mapowaniu chromosomów i genów oraz wytwarzania antysensownego DNA i RNA. Kwas nukleinowy dla TCCR b edzie równie z u zyteczny do wytwarzania polipeptydów TCCR przy zastosowaniu opisanych tu spo- sobów rekombinowania. Gen TCCR o natywnej sekwencji pe lnej d lugo sci opisany na fig. 3 (SEQ ID N0:1) i fig. 4 (SEQ ID N0:2), lub jego cz esci mog a by c zastosowane jako sondy do hybrydyzacji dla biblioteki cDNA ce- lem izolacji cDNA dla TCCR pe lnej d lugo sci lub izolacji jeszcze innych cDNA (przyk ladowo tych, kodu- jacych naturalnie wyst epuj ace warianty TCCR lub TCCR z innych gatunków) o po zadanej identyczno- sci sekwencji wzgl edem sekwencji TCCR ujawnionej na fig. 3 14 (odpowiednio SEQ ID N0:1 i 2). Ewentualnie, d lugo sc sond b edzie wynosi la od oko lo 20 do 50 zasad. Sondy do hybrydyzacji mog aPL 206 846 B1 32 pochodzi c z obszarów o sekwencji nukleotydowej SEQ ID N0:1 i 2, gdzie obszary te mog a by c okre- slone bez niepotrzebnych do swiadcze n lub z sekwencji genomowych zawieraj acych promotory, ele- menty wzmacniaczy i introny z natywnej sekwencji TCCR. Dla przyk ladu sposoby wyszukiwania b ed a obejmowa ly izolowanie obszarów koduj acych genu TCCR stosuj ac znan a sekwencj e DNA do zsynte- tyzowania wybranej sondy o d lugo sci oko lo 40 zasad. Sondy do hybrydyzacji mog a by c wyznakowane ró znymi znacznikami obejmuj acymi znaczniki radioaktywne, takie jak 32 P lub 35 S lub znaczniki enzy- matyczne, takie jak fosfataza alkaliczna przy laczona do sondy za pomoc a systemu przy laczania awi- dyna/biotyna. Wyznakowane sondy posiadaj ace sekwencj e komplementarn a do genu TCCR tu opisa- nego mog a by c u zyte do przeszukania bibliotek ludzkiego cDNA, genomowego DNA lub mRNA dla okre slenia, z którym reprezentantem takich bibliotek sonda b edzie hybrydyzowa la. Techniki hybrydy- zacji s a opisane bardziej szczegó lowo w przyk ladach poni zej. Dowolna sekwencja EST lub inne fragmenty sekwencji, które tu ujawniono mo zna podobnie u zy c, jako sondy, stosuj ac opisane tu sposoby. Inne u zyteczne fragmenty kwasów nukleinowych dla TCCR obejmuj a antysensowne lub sen- sowne oligonukleotydy zawieraj ace, jednoniciow a sekwencj e kwasu nukleinowego (zarówno RNA jak i DNA) zdoln a do wi azania si e z docelowym mRNA dla TCCR (sensowny) lub sekwencjami DNA TC- CR (antysensowny). Antysensowne lub sensowne oligonukleotydy tu opisane obejmuj a fragment ob- szaru koduj acego DNA dla TCCR. Taki fragment ogólnie zawiera przynajmniej 14 nukleotydów, zw laszcza oko lo 14 do 30 nukleotydów. Mo zliwo sc otrzymania antysensownego lub sensownego oli- gonukleotydu na podstawie sekwencji cDNA koduj acej dane bia lko opisano na przyk lad, w Stein i Kohen, Cancer Res. 48:2659 (1988) i van der Kroi i wsp., BioTechniques 6:958 (1988). Wi azanie antysensownych lub sensownych oligonukleotydów do docelowych sekwencji kwasów nukleinowych prowadzi do utworzenia dupleksów blokuj acych transkrypcj e lub translacj e sekwencji docelowej na jeden z szeregu sposobów, obejmuj acych zwi ekszenie degradacji dupleksów, przed- wczesn a terminacj e transkrypcji lub translacji, lub innymi sposobami. Dlatego antysensowne oligonu- kleotydy mog a by c u zyte dla blokowania ekspresji bia lek TCCR. Antysensowne lub sensowne oligo- nukleotydy obejmuj a ponadto oligonukleotydy o zmodyfikowanych wi azaniach fosfodiestrowych (lub inne wi azania cukrowe, takie jak to opisano w WO 91/06629) i gdzie takie wi azania cukrowe s a od- porne na endogenne nukleazy. Takie oligonukleotydy z odpornymi wi azaniami cukrowymi s a stabilne in vitro (tj. odporne na trawienie enzymatyczne), lecz zachowuj a specyficzno sc sekwencji pozwalaj a- cej na wi azanie si e z docelowymi sekwencjami nukleotydowymi. Inne przyk lady sensownych lub antysensownych oligonukleotydów obejmuj a te oligonukleotydy, które s a kowalencyjnie zwi azane z cz asteczkami organicznymi, takimi jak opisane w WO 90/10048 i innymi cz asteczkami zwi ekszaj acymi powinowactwo do docelowej sekwencji aminokwasowej, takie jak poli-(L-lizyna). Ponadto, czynniki interkaluj ace, takie jak eliptycyna, i czynniki alkiluj ace lub kom- pleksy metalu mog a by c przy laczone do sensownych lub antysensownych oligonukleotydów, modyfi- kuj ac specyficzno sc wi azania antysensownych lub sensownych oligonukleotydów z docelow a se- kwencj a nukleotydow a. Antysensowny lub sensowne oligonukleotydy mog a by c wprowadzone do komórki zawieraj acej docelow a sekwencj e kwasu nukleinowego jakimkolwiek sposobem wprowadzania, obejmuj acym przy- k ladowo transfekcj e DNA za po srednictwem CaPO 4 , elektroporacj e lub przy u zyciu wektorów do prze- noszenia genów, takich jak wirus Epsteina-Barra. W zalecanej procedurze antysensowny lub sensow- ny oligonukleotyd jest wbudowany do dogodnego wektora retrowirusowego. Doprowadza si e do kon- taktu komórki zawieraj acej docelow a sekwencj e kwasu nukleinowego z rekombinowanym wektorem wirusowym b ad z in vivo b ad z ex vivo. U zyteczne wektory retrowirusowe obejmuj a, bez ograniczenia, te pochodz ace z mysiego retrowirusa M-MuLV, N2 (retrowirus pochodz acy od M-MuLY) lub dwuko- piowe wektory oznaczone, jako DCT5A, DCT5B i DCT5C (patrz WO 90/13641). Sensowne lub antysensowne oligonukleotydy mog a by c równie z wprowadzone do komórki za- wierajacej docelow a sekwencj e nukleotydow a przez utworzenie koniugatu z cz asteczk a wiazac a li- gand, jak to opisano w WO 91/04733. U zyteczne cz asteczki wi azace ligand obejmuj a, bez ograniczenia, receptory powierzchniowe komórki, czynników wzrostu, inne cytokiny lub inne Ugandy wiaz ace si e z receptorami powierzchniowymi komórki. Dogodnie przy laczenie cz asteczki wi azacej ligand zasadni- czo nie wp lywa na zdolnosc cz asteczki wiaz acej ligand do zwi azania si e z odpowiadaj ac a jej cz a- steczk a lub receptorem lub blokowania wej scia sensownego lub antysensownego oligonukleotydu lub ich skoniugowanej wersji do komórki.PL 206 846 B1 33 Alternatywnie, sensowny lub antysensowny oligonukleotyd mo ze by c wprowadzony do komórki zawieraj acej docelow a sekwencj e kwasu nukleinowego przez utworzenie kompleksu oligonukleotyd- lipid, jak to opisano w WO 90/10448. Kompleks sensownego lub antysensownego oligonukleotydu z lipidem dogodnie ulega w komórce dysocjacji przez endogenn a lipaz e. Sondy mog a równie z by c zastosowane w technikach PCR do wytwarzania puli sekwencji dla identyfikacji scisle spokrewnionych sekwencji koduj acych TCCR. Sekwencja nukleotydow a koduj aca TCCR mo ze równie z by c zastosowana do konstrukcji sond hybrydyzacyjnych dla mapowania genu koduj acego TCCR i analizy genetycznej osobników z choro- bami genetycznymi. Dostarczone tu sekwencje nukleotydowe mog a by c zmapowane w specyficznych obszarach chromosomu przy pomocy znanych technik, takich jak hybrydyzacja in situ, analiza sprz e- zenia wzgl edem znanych znaczników chromosomowych i hybrydyzacyjne przeszukiwanie bibliotek. Poniewa z TCCR jest receptorem, to sekwencja koduj aca TCCR koduje bia lko wi azace inne bia lko. W efekcie bia lka TCCR tu opisane mog a by c u zyte w oznaczeniach dla identyfikacji innych bia lek lub cz asteczek uczestnicz acych w oddzia lywaniu podczas wi azania. Takimi sposobami zidenty- fikowane mog a by c inhibitory oddzia lywania receptor/ligand. Bia lka uczestnicz ace w takim wi azaniu mog a by c równie z stosowane do wyszukiwania peptydu lub ma lych cz asteczek inhibitorów lub agoni- stów wi azania. Równie z receptor TCCR mo ze by c u zyty do izolacji pokrewnego ligandu(ów). Testy wyszukuj ace mog a by c stosowane do wyszukiwania zwi azków na sladuj acych aktywnosc biologiczn a naturalnego TCCR lub ligandu TCCR. Takie testy wyszukuj ace b ed a obejmowaly wysoko wydajne analizy przesiewowe bibliotek chemicznych, czyniac je szczególnie u zytecznymi dla identyfikacji ma- lych cz asteczek b ed acych kandydatami na lek. Rozwa zane ma le cz asteczki obejmuj a syntetyczne zwi azki organiczne lub nieorganiczne. Testy mog a by c przeprowadzane w ró znych postaciach obej- mujacych oznaczenia bia lko-bia lko, biochemiczne testy przesiewowe, testy immunologiczne i testy oparte na komórkach, które s a dobrze scharakteryzowane w tej dziedzinie. Opisane tu polipeptydy TCCR mog a równie z by c zastosowane, jako znaczniki masy cz astecz- kowej w elektroforezie bia lka. Cz asteczki kwasu nukleinowego koduj ace polipeptydy TCCR lub jego fragmenty, które tu opi- sano, s a u zyteczne dla identyfikacji chromosomu. Zgodnie z tym istnieje potrzeba identyfikacji nowych znaczników chromosomowych, bowiem obecnie w oparciu o dost epne dane o sekwencji dost epnych jest wzgl ednie niewiele odczynników znakuj acych chromosom. Ka zda cz asteczka kwasu nukleinowe- go dla TCCR tu opisanego mo ze by c stosowana, jako znacznik chromosomowy. Polipeptydy TCCR i cz asteczki kwasu nukleinowego tu opisane mog a równie z by c stosowane do typowania tkanek, bowiem polipeptydy TCCR tu opisane mog a ulega c ró znicowej ekspresji w jed- nej tkance w porównaniu z inn a. Cz asteczki kwasu nukleinowego dla TCCR znajd a zastosowanie przy wytwarzaniu sond do PCR, w analizie typu Northern, Southern i Western. 2. Badania wi azania przeciwcia la Aktywno sc polipeptydów TCCR tu opisanych mo ze by c ponadto zweryfikowana przez badania wi azania przeciwcia l, w których sprawdzana jest zdolno sc przeciwcia l anty-TCCR do hamowania wp lywu polipeptydów TCCR na komórki tkanek. Przyk lady przeciwcia l obejmuj a przeciwcia la poliklo- nalne, monoklonalne, humanizowane, bispecyficzne i heterokoniugaty, których przygotowanie b edzie opisane poni zej. Badanie wi azania przeciwcia l mo ze by c przeprowadzone dowolnym znanym sposo- bem, takim jak badanie wi azania ze wspó lzawodnictwem, bezpo srednie i po srednie testy kanapkowe i testy immunoprecypitacji. Zola, Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques str. 147-158 (CRC Press Inc., 1987). Testy wiazania ze wspó lzawodnictwem zale za od zdolno sci wyznakowanego standardu do kompetycji z badan a próbk a testow a o wi azanie z ograniczon a ilo scia przeciwcia la. Ilo sc docelowego bia lka w badanej próbce jest odwrotnie proporcjonalna do ilo sci standardu wiaz acego si e z przeciw- cia lami. Dla u latwienia okre slenia ilo sci zwi azanego standardu, zalecane jest wyodr ebnienie przeciw- cia l z roztworu przed lub po kompetycji, tak, aby standard i analizowan a próbk e, które zwi aza ly si e z przeciwcia lem, mo zna by lo dogodnie oddzieli c od standardu i badanej próbki, które pozosta ly nie- zwi azane. Testy kanapkowe wymagaj a u zycia dwóch przeciwcia l, z których ka zde jest zdolne do zwi aza- nia innej immunogennej cz esci, lub epitopu, wykrywanego bia lka. W te scie kanapkowym badana próbka jest wi azana przez pierwsze przeciwcia lo unieruchomione na z lo zu sta lym, a nast epnie drugie przeciwcia lo wiaze si e z badan a substancj a tworz ac w ten sposób nierozpuszczalny, trój elementowy kompleks. Patrz np. patent USA nr 4,376,110. Drugie przeciwcia lo mo ze samo by c wyznakowanePL 206 846 B1 34 wykrywaln a cz asteczk a (bezpo srednie oznaczenia kanapkowe) lub mo ze by c zmierzone przy pomocy przeciwcia la przeciw immunoglobulinie wyznakowanego wykrywaln a cz asteczk a (po sredni test kanap- kowy). Przyk ladowo, jednym z rodzajów testu kanapkowego jest oznaczenie ELISA, w którym to przy- padku wykrywalna cz asteczka jest enzymem. Dla celów immunohistochemicznych próbka tkanki mo ze by c swie za lub zamro zona, lub mo ze by c zatopiona w parafinie i utrwalona przyk ladowo srodkiem konserwuj acym, takim jak formalina. 3. Testy oparte na komórkach. Dla dalszego zrozumienia zale zno sci pomi edzy zidentyfikowanymi tu genami i polipeptydami a rozwojem stanu patologicznego w chorobie zwi azanej z odporno scia u zyte mog a by c testy oparte na komórkach i modele zwierz ece dla chorób zwi azanych z odporno scia. W ró znych podej sciach komórki znanego typu, o których wiadomo, ze uczestnicz a w konkret- nych chorobach zwi azanych z odporno scia, s a transfekowane opisanym tu cDNA i badana jest zdol- nosc tych cDNA do pobudzania lub hamowania funkcji odporno sciowych. Dogodne komórki mog a by c transfekowane po zadanym genem i sledzone pod k atem aktywno sci funkcji odporno sciowej. Takie transfekowane linie komórkowe mog a by c nast epnie stosowane do badania zdolno sci przeciwcia l poli- lub monoklonalnych lub kompozycji przeciwcia l do hamowania lub pobudzania funkcji odporno sciowej, przyk ladowo do modulowania proliferacji komórek T lub naciekania komórek zapalnych. Komórki transfekowane sekwencjami koduj acymi zidentyfikowanych tu genów moga ponadto by c stosowane do identyfikacji kandydatów na leki do leczenia chorób zale znych od odporno sci. Ponadto, pierwotne hodowle pochodz ace od transgenicznych zwierz at (jak to opisano poni zej) mog a by c stosowane w testach opartych na komórkach cho c preferowane s a stabilne linie komórko- we. Dobrze znane s a w tej dziedzinie sposoby wyprowadzania ci ag lych linii komórkowych z transge- nicznych zwierz at (patrz np. Smali i wsp.. Mol. Cell Biol. 5, 642-648 [1985]). Jeden z dogodnych testów opartych na komórkach to reakcja mieszana limfocytów (MLR ang. mixed lymphocyte reaction). Current Protocols in Immunology, cz esc 3.12; wydane przez J. E. Coli- gan, A. M. Kruisbeek, D. H. Marglies, E. M. Shevach, W. Strober, National Institute of Health, opub- likowana przez John Willey & Sons Inc. W tym te scie okre slana jest zdolno sc badanego zwi azku do pobudzania lub hamowania proliferacji aktywowanych komórek T. Zawiesin e odpowiadaj acych komó- rek T hoduje si e z allogenicznymi komórkami pobudzaj acymi i proliferacj e komórek T mierzy si e po- przez pobieranie trytowanej tyminy. Test ten jest ogólnie miar a reaktywno sci komórek T. Poniewa z wi ekszo sc komórek T reaguje i wytwarza IL-2 po aktywacji, to ró znice w zdolno sci do odpowiedzi w tym te scie cz esciowo odzwierciedlaj a ró znice w wytwarzaniu IL-2 przez odpowiadaj ace komórki. Wyniki MLR mog a by c zweryfikowane typowym testem wykrywaj acym limfokin e (IL-2). Current Proto- cols in Immunology, jak wy zej, 3.15, 6.3. Proliferacja komórek T w te scie MLR mo ze by c spowodowana bezpo srednimi mitogennymi w la- sciwo sciami badanej cz asteczki lub aktywacji indukowanej zewn etrznym antygenem. Dodatkowa we- ryfikacja aktywno sci pobudzaj acej komórki T polipeptydu tu opisanego mo ze by c uzyskana przy za- stosowaniu testu wspó lpobudzania. Aktywacja komórek T wymaga specyficznego dla antygenu sy- gna lu przekazywanego poprzez receptor komórek T (TCR) i sygna lu wspó lpobudzaj acego, w którym po sredniczy oddzia lywanie przy wi azaniu drugiego ligandu, przyk ladowo wi azaniu B7 (CD80, CD86)/CD28. Wi azanie krzy zowe z CD28 zwi eksza wydzielanie limfokiny przez aktywowane komórki T. Aktywowanie komórek T pe lni zarówno kontrol e negatywn a, jak i pozytywn a, za po srednictwem wi azania ligandów maj acych negatywny lub pozytywny wp lyw. CD28 i CTLA-4 s a pokrewnymi gliko- proteinami z nadrodziny Ig, które wi aza B7. CD28 wi azac B7 ma pozytywny wspó lpobudzaj acy wp lyw na aktywacj e komórek T; przeciwnie, wi azanie si e CTLA-4 z B7 ma ujemny deaktywuj acy wp lyw na komórki T. Chambers, C. A. i Allison, J.P., Curr. Opin. Immunol. (1997) 9:396. Schwartz, R. H., Cell (1992) 71:1065; Linsey, P. S. i Ledbetter J. A., Annu. Rev. Immunol. (1993) 11:191; June, CH. i wsp., Immunol. Today (1994) 15:321; Jenkins, M. K., Immunity (1994) 1:405. W te scie wspó lpobudzania polipeptydy tu opisane bada si e pod k atem aktywno sci wspó lpobudzaj acej lub hamuj acej komórki T. Polipeptydy tu opisane, jak równie z inne zwi azki tu opisane, które s a stymulatorami (wspó lsty- mulatorami) proliferacji komórek T i agonistami, np. przeciwcia lami agonistycznymi, co okre sla si e przyk ladowo przez testy MRL i wspólpobudzenia, s a u zyteczne w leczeniu chorób zwi azanych z od- porno sci a cechuj acych si e ubog a, suboptymaln a lub niedostateczn a funkcja immunologiczn a. Choro- by te leczy si e przez pobudzenie proliferacji i aktywacji komórek T (np. odporno sci z udzia lem komó- rek T, wytwarzania cytokin Th1 i/lub Th2) i wzmacnianie odpowiedzi immunologicznej u ssaka poprzez podawanie zwi azku pobudzaj acego, takiego jak pobudzaj ace polipeptydy tu opisane. Peptydem po-PL 206 846 B1 35 budzaj acym mo ze przyk ladowo by c polipeptyd ligandu TCCR lub agonistyczne wzgl edem niego prze- ciwcia lo. Bezpo srednie zastosowanie zwi azku pobudzaj acego tak jak tu opisano oceniono w do swiad- czeniach z glikoprotein a 4-1BB, przedstawicielem rodziny receptora czynnika martwicy martwicy no- wotworu, który wiaze si e z ligandem (4-1BBL) prezentowanym na pobudzonych komórkach T i sygna- lizuj acym aktywacj e i wzrost komórek T. Alderson, M. E. i wsp., J. Immunol. (1994) 24:2219. Zastosowanie zwi azku pobudzaj acego agonist e równie z oceniono do swiadczalnie. Aktywacja 4-1BB przez traktowanie agonistycznym przeciwcia lem przeciw 4-1BB zwi eksza zanikanie guzów. Hellstrom, I. i Hellstrom K. E., Crit. Rev. Immunol. (1998) 18:1. Terapia iramunoadiuwantowa do le- czenia guzów nowotworowych opisana bardziej szczegó lowo poni zej, jest innym przyk ladem zasto- sowania pobudzaj acych zwi azków tu opisanych. Efekt pobudzaj acy lub wzmagaj acy odporno sc mo ze równie z by c osi agni ety przez antagonizo- wanie lub blokowanie aktywno sci bia lka, dla którego w te scie MLR stwierdzono, ze dzia la hamuj aco. Znosz ac aktywno sc hamuj ac a zwiazku uzyskuje si e lacznie efekt pobudzaj acy. U zytecznymi zwi az- kami antagonistycznymi/blokuj acymi s a przeciwcia la lub ich fragmenty, które rozpoznaj a i wiaz a si e do bia lka hamuj acego, co za tym idzie blokuj a skuteczne oddzia lywanie bia lka z jego receptorem i hamu- ja przekazywanie sygna lów za po srednictwem receptora. Efekt ten oceniano w do swiadczeniach wy- korzystuj acych przeciwcia la przeciw CTLA-4, które zwi ekszaj a proliferacj e komórek T, przypuszczal- nie przez usuni ecie sygna lu hamuj acego wywo lywanego przez wi azanie CTLA-4. Walunas, T. L. i wsp., Immunity (1994) 1:405. Z drugiej strony peptydy tu opisane, jak równie z inne zwi azki tu opisane, które s a bezpo sredni- mi inhibitorami proliferacji/aktywacji komórek T i/lub wydzielania limfokin mog a by c bezpo srednio sto- sowane do hamowania odpowiedzi immunologicznej. Zwi azki te s a u zyteczne do zmniejszania stopnia odpowiedzi immunologicznej i leczenia chorób zwi azanych z odporno sci a, ocechuj acych si e odpowie- dzi a nadmiern a, ponad optymaln a lub autoimmunologiczna. To zastosowanie zwi azków tu opisanych mo ze by c ocenione przez opisane powy zej do swiadczenia, w których CTLA-4 wi aze si e z receptorem B7 z deaktywowanych komórek T. Bezpo srednio hamuj ace zwi azki tu opisane dzia laj a w analogiczny sposób. Alternatywnie, zwi azki np. przeciwcia la, które wi aza si e z pobudzaj acymi polipeptydami tu opi- sanymi i blokuj a efekt pobudzaj acy tych cz asteczek daj a ogólny efekt hamuj acy i mog a by c stosowa- ne do t lumienia odpowiedzi immunologicznej z udzia lem komórek T poprzez hamowanie prolifera- cji/aktywacji i/lub sekrecji limfokin przez komórki T. Blokowanie pobudzaj acego efektu polipeptydów t lumi odpowied z immunologiczn a ssaka. To zastosowanie by lo ocenione w do swiadczeniach z zasto- sowaniem przeciwcia la przeciw IL2. W tych do swiadczeniach przeciwcia lo wi aze si e z IL2 i blokuje wi azanie IL2 do jego receptora, co za tym idzie uzyskuje si e efekt hamowania komórek. 4. Modele zwierz ece. Wyniki uzyskane w testach in vitro opartych na komórkach mog a by c dalej weryfikowane in vivo na modelach zwierz ecych i testach dla funkcji komórek T. Dla dalszego zrozumienia roli zidentyfiko- wanych tu genów w rozwoju i patogenezie choroby zwi azanej z odporno sci a i badania skuteczno sci kandydatów na czynniki terapeutyczne, w lacznie z przeciwcia lami i innymi antagonistami natywnych polipeptydów, obejmuj acymi niskocz asteczkowych antagonistów, u zyte mog a by c ró zne dobrze znane modele zwierz ece. Fakt, ze s a to modele in vivo, czyni je prognostycznymi dla odpowiedzi u ludzi. Modele zwierz ece chorób zwi azanych z odporno sci a obejmuj a zarówno zwierz eta nierekombinowane, jak i rekombinowane (transgeniczne). Modele zwierz at nierekombinowanych obejmuj a przyk ladowo gryzonie, np. modele mysie. Takie modele mog a by c wytworzone przez wprowadzenie komórek do syngenicznych myszy przy zastosowaniu typowych sposobów, np. wstrzykni ecia podskórnego, wstrzykniecia do zy ly ogonowej, przeszczepu sledziony, wszczepu dootrzewnowego, wszczepu pod torebk e nerkow a itp. Choroba zwi azana z chorob a przeszczep przeciwko gospodarzowi wyst epuje wtedy, gdy immu- nokompetentne komórki przeszczepia si e pacjentom poddanym immunosupresji lub wykazuj acym tole- rancj e. Komórki dawcy rozpoznaj a i reaguj a na antygeny gospodarza. Reakcja mo ze by c zró znicowana, pocz awszy od zagra zaj acego zyciu ostrego stanu zapalnego po lagodne przypadki biegunki i utraty wagi. Modele choroby zwi azanej z chorob a przeszczep przeciwko gospodarzowi dostarczaj a mo zliwo sci oceny reaktywno sci komórek T wzgl edem antygenów MHC i drugorz edowych antygenów przeszcze- pu. U zyteczna procedura jest opisana szczegó lowo w Current Protocols in Immunology, powy zej, cz esc 4.3.PL 206 846 B1 36 Zwierz ecy model odrzutu alloprzeszczepu skóry jest sposobem badania zdolno sci komórek T do udzia lu in vivo w niszczeniu tkanki i oceny ich roli w odrzucaniu przeszczepu. Najpowszechniejsze akceptowane modele wykorzystuj a mysie przeszczepy skóry ogona. Powtarzane do swiadczenia po- kaza ly, ze w odrzucaniu alloprzeszczepu skóry posrednicz a komórki T, pomocnicze komórki T i efek- torowe komórki T zabójcy, a nie przeciwcia la. Auchincloss, H. Jr. i Sachs, D. H., Fundamental Immu- nology, 2 wyd., W.E. Paul wyd., Raven Press NY. 1989, 889-992. U zyteczna procedura jest opisana szczegó lowo w Current Protocols in Immunology, jak wy zej, cz esc 4.4. Inne modele odrzucania przeszczepu, które mog a by c stosowane do testowania zwi azków tu opisanych s a modelami alloprzeszczepu serca opisanymi przez Tanabe, M. i wsp., Transplantation (1994) 58:23 i Tinubu, S. A. i wsp., J. Immunol. (1994) 4320-4338. Zwierz ece modele nadwra zliwo sci typu opó znionego dostarczaj a równie z testu do badania funkcji odporno sciowej z udzia lem komórek. Reakcje nadwra zliwo sci typu opó znionego s a odpowie- dzi a immunologiczn a z udzia lem komórki T in vivo, cechuj ac a si e tym, ze stan zapalny osi aga swoje maksimum dopiero po jakim s czasie po podaniu antygenu. Reakcje te wyst epuj a równie z w tkankowo specyficznych chorobach autoimmunologicznych, takich jak stwardnienie rozsiane (MS) i do swiad- czalne autoimmunologiczne zapalenie mózgu i rdzenia (EAE, model dla MS). U zyteczna procedura jest opisana w szczegó lach w Current Protocols in Immunology, powy zej, cz esc 4.5. EAE jest chorob a autoimmunologiczna z udzia lem komórek T cechuj ac a si e zapaleniem z udzia lem komórek T i komórek jednoj adrzastych i w konsekwencji dochodzi do demielinizacji akso- nów w centralnym uk ladzie nerwowym. EAE jest ogólnie rozwa zany, jako odpowiedni model zwierz ecy dla MS u ludzi. Bolton, C, Multiple Sclerosis (1995) 1:143. Opracowano zarówno ostre, jak i nawroto- we modele. Zwi azki tu opisane mog a by c testowane pod k atem aktywno sci pobudzaj acej komórki T lub hamuj acej chorob e z demielinizacj a z udzia lem odporno sci, zgodnie z protoko lem opisanym w Current Protocols in Immunology, powy zej, cz esci 15.1 i 15.2. Patrz równie z modele dla choroby z udzia lem mieliny, w której oligodendrocyty lub komórki Shwanna s a wszczepiane do centralnego uk ladu nerwowego, jak to opisano w Duncan I. D. i wsp., Molec. Med. Today (1997) 554-561. Nadwra zliwo sc kontaktowa jest prostym testem dla nadwra zliwo sci typu opó znionego in vivo w oparciu o funkcj e immunologiczn a z udzia lem komórek. W procedurze tej skór e eksponuje si e na egzogenne hapteny, powoduj ace rozwój reakcji nadwra zliwo sci typu opó znionego, która jest zmierzo- na i okre slana ilo sciowo. Wra zliwo sc kontaktowa wymaga pocz atkowej fazy uczulenia, po której na- st epuje faza ujawnienia. Faza ujawnienia wyst epuje wówczas, gdy limfocyty T napotykaj a antygen, z którym kontaktowa ly si e uprzednio. Wyst epuje obrz ek i stan zapalny, co jest doskona lym modelem ludzkiego alergicznego, kontaktowego zapalenia skóry. U zyteczne procedury opisano w szczegó lach w Current Protocols in Immunology wyd. J. E. Cologan, A. M. Kruisbeek, D. H. Margulies, E. M. She- wach i W. Strober, John Willey & Sons, Inc., 1994 cz esc 4.2. Patrz równie z Grabbe, S. i Schwarz, T., Immun. Today 19(l):37-44 (1998). Modelem zwierz ecym dla zapalenia stawów jest zapalenie stawów indukowane kolagenem. Model ten dzieli kliniczne, histologiczne i immunologiczne cechy z ludzkim autoimmunologicznym, reumatoidalnym zapaleniem stawów i jest akceptowalnym modelem dla ludzkiego autoimmunologicz- nego zapalenia stawów. Mysie i szczurze modele cechuj a si e zapaleniem maziówki, degradacj a chrz astki i przychrz estnej cz esci ko sci. Zwi azki tu opisane mog a by c testowane pod k atem ich aktyw- no sci wzgl edem autoimmunologicznego zapalenia stawów zgodnie z protoko lem podanym w Current Protocols in Immunology, powy zej, cz es c 15.5. Patrz równie z model wykorzystuj acy przeciwcia lo mo- noklonalne przeciw C18 i integrynom VLA-4 opisany przez Issekutz, A. C. i wsp., Immunology (1996) 88:569. Opisano model astmy, w którym indukowana przez antygen hiperreaktywno sc dróg oddecho- wych, p lucna eozynofilia i stan zapalny s a indukowane przez uczulenie zwierz ecia owoalbumin a, a nast epnie podanie zwierz eciu tego samego bia lka w postaci aerozolu. Szereg modeli zwierz ecych ( swinka morska, szczur, naczelne inne ni z cz lowiek) ujawnia lo objawy podobne do atopowej astmy u cz lowieka po podaniu antygenów w aerozolu. Mysie modele maj a wiele cech ludzkiej astmy. U zy- teczne procedury dla badania zwi azków tu opisanych pod k atem aktywno sci i skuteczno sci w leczeniu astmy zosta ly opisane przez Wolyniec, W. W. i wsp., Am. J. Respir. Celi Mol. Biol. (1998) 18:777 i w cyto- wanych tam odno snikach. Ponadto, zwi azki tu opisane mog a by c testowane na modelach zwierz ecych chorób typu lusz- czycy. Dane wskazuj a na udzia l komórek T w patogenezie luszczycy. Zwi azki tu opisane mog a by c testowane w modelu myszy scid/scid opisanym przez Schon, M. P. i wsp., Nat. Med. (1997) 3:183,PL 206 846 B1 37 w którym mysz wykazuje histopatologiczne zmiany skórne przypominaj ace luszczyc e. Innym, u zy- tecznym modelem jest chimera ludzka skóra/mysz scid, wytworzona jak to opisali Nickoloff, B. J. i wsp., Am. J. Pathol. (1995) 146:580. Modele z zastosowaniem rekombinowanych (transgenicznych) zwierz at mo zna skonstruowa c poprzez wprowadzenie kodujacej cz esci zidentyfikowanych tu genów do genomu zwierz ecia b ed ace- go przedmiotem zainteresowania, u zywaj ac typowych technik do wytwarzania transgenicznych zwie- rz at. Zwierz eta, które mog a s lu zy c, jako cel dla transgenicznych manipulacji, obejmuj a bez ograni- cze n, myszy, szczury, króliki, swinki morskie, owce, swinie, kozy i naczelne inne ni z cz lowiek, np. pawiany, szympansy i ma lpy. Do wprowadzania transgenu do takich zwierz at stosowane s a techniki znane w tej dziedzinie obejmuj ace mikrowstrzykni ecie do przedj adrzy (Hoppe i Wanger, patent USA nr 4,873,191); wprowadzenie genu do linii komórek zarodkowych przy pomocy retrowirusa (np. Van der Putten i wsp.. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82 : 6148, 615 [1985]); celowanie genowe w zarodkowych komórkach macierzystych (Thompson i wsp., Cell 56: 313-321 [1989]); elektroporacja zarodków (Lo, Mol. Cel. Biol. 3, 1803-1814 [1983]); przenoszenie genu za po srednictwem plemników (Lavitrano i wsp.. Cell 57, 717-73 [1989]). Dla przegl adu patrz przyk ladowo patent US nr 4,736,866. Dla celów niniejszego wynalazku transgeniczne zwierz eta obejmuj a te, które nios a transgen je- dynie w 3 cz esci swoich komórek („zwierz eta mozaikowe”). Transgen mo ze by c wbudowany zarówno, jako pojedynczy transgen jak i jako konkatamery, np. tandemy g lowa do g lowy lub g lowa do ogona. Wybiórcze wprowadzenie transgenu do konkretnego rodzaju komórki jest równie z mo zliwe poprzez zastosowanie, 5 przyk ladowo, techniki Lasko i wsp.. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 6232-636 (1992). Ekspresja transgenu w zwierz etach transgenicznych mo ze by c sledzona typowymi sposobami. Przyk ladowo, przez analiz e Southern lub amplifikacj e PCR, która mo ze by c 30 stosowana do potwier- dzenia wbudowania transgenu. Poziom ekspresji mRNA mo ze by c nast epnie badany przy pomocy sposobów takich jak hybrydyzacja in situ, analiza Northern, PCR lub immunocytochemia. Nast epnie zwierz eta mog a by c badane pod k atem objawów patologii choroby immunologicznej, przyk ladowo poprzez badania histologiczne dla okre slenia naciekania komórek odporno sciowych do konkretnych tkanek. Przeprowadzone mog a by c równie z do swiadczenia z blokowaniem, w których transgeniczne zwierz eta s a poddane dzia laniu zwi azków tu opisanych dla okre slenia zakresu pobu- dzenia lub zahamowania proliferacji komórek T przez zwi azki. W do swiadczeniach tych blokuj ace przeciwcia la, które wi aza si e z polipeptydem tu opisanym przygotowane tak, jak to opisano powy zej, s a podawane zwierz eciu i okre sla si e efekt na funkcj e odporno sciow a. Kwasy nukleinowe koduj ace TCCR lub ich zmodyfikowane postaci mog a by c równie z stosowa- ne do wytwarzania zarówno zwierz at transgenicznych jak i zwierz at z „nokautem”, które z kolei s a u zy- teczne do opracowania i wyszukiwania 3 terapeutycznie u zytecznych odczynników. Termin „nokaut” jest u zywany w tej dziedzinie dla opisania transgenicznego zwierz ecia, w którym endogenny gen zosta l „znokautowany” lub usuni ety, tak jak osi aga si e to poprzez zastosowanie homologicznej rekombinacji. Homologiczna rekombinacja jest terminem stosowanym w tej dziedzinie dla opisania regionów wektora docelowego, które s a homologiczne do endogennego genu. Te obszary homologii b ed a hybrydyzowa ly ze sob a i rekombinacja z genomem gospodarza spowoduje zast apienie endogennej sekwencji gospoda- rza sekwencj a wbudowan a do wektora w miejscu i w orientacji okre slonej przez obszary homologii. Ge- notyp zwierz ecia z nokautem jest opisany nazw a genu, po której nast epuje „-/-”. Odró znia go to od zwie- rz ecia, u którego tylko jeden allel zosta l „znokautowany” (heterozygota), które oznacza si e „-/+”. Endo- genny gen, który zosta l „znokautowany” nie ulega ju z ekspresji w komórkach zwierz ecia. Szczegó lowe badania konkretnych komórek mog a zidentyfikowa c funkcj e usuni etego genu. Transgeniczne zwierz e, (np. mysz lub szczur) jest zwierz eciem majacym komórki zawieraj ace transgen, gdzie, transgen zosta l wprowadzony do zwierz ecia lub przodka zwierz ecia w okresie prena- talnym, np. w stadium zarodkowym. Transgen to DNA, który jest wbudowany do genomu komórki, z której rozwija si e transgeniczne zwierz e. W jednym z wykona n cDNA koduj acy TCCR mo ze by c u zyty do klonowania genomowego DNA kodujacego TCCR zgodnie z ustalonymi sposobami i wyko- rzystuj ac sekwencje genomowe dla wytworzenia transgenicznych zwierz at zawieraj acych komórki z ekspresj a DNA koduj acego TCCR. Sposoby wytwarzania ) transgenicznych zwierz at, szczególnie zwierz at, takich jak myszy lub szczury sta ly si e powszechnie stosowane w tej dziedzinie i przyk ladowo s a opisane w patencie USA nr 4,736,866 i 4,870,009. Typowo, okre slone komórki b ed a wybrane, jako cel dla wbudowania transgenu TCCR ze 5 specyficznymi tkankowo wzmoacniaczami. Transgeniczne zwierz eta, które zawieraj a kopi e, transgenu koduj acego TCCR wprowadzon a do linii zarodkowej zwie- rz ecia w stadium zarodkowym mog a by c stosowane do sprawdzania efektu zwi ekszonej ekspresjiPL 206 846 B1 38 DNA koduj acego TCCR. Takie zwierz eta mog a by c stosowane jako zwierz eta testowe dla odczynni- ków poprzez uzyskanie ochrony przed, przyk ladowo, stanami patologicznymi zwi azanymi z jego na- dekspresj a. Zgodnie z tym aspektem zwierz e jest poddawane dzia laniu odczynnika i zmniejszenie wyst epowania stanu patologicznego w porównaniu ze zwierz etami nieleczonymi nios acymi transgen b edzie wskazywa lo na potencjalnie terapeutyczne dzia lanie na stan patologiczny. Alternatywnie, mo zna skonstruowa c zwierz eta z „nokautem”, posiadaj ace uszkodzony lub zmieniony gen koduj acy zidentyfikowany tu polipeptyd, w wyniku homologicznej rekombinacji pomi e- dzy endogennym genem koduj acym polipeptyd i zmienionym genomowym DNA koduj acym ten sam polipeptyd wprowadzonym do komórek zarodkowych zwierz ecia. Przyk ladowo, cDNA koduj acy kon- kretny polipeptyd mo ze by c stosowany do klonowania genomowego DNA koduj acego ten polipeptyd zgodnie z ustalonymi sposobami. Cz es c genomowego DNA koduj acego konkretny polipeptyd mo ze by c usuni eta lub zast apiona innym genem, takim jak gen koduj acy marker selekcyjny, który mo ze by c stosowany do sledzenia integracji. Typowo, wektor zawiera kilka tysi ecy par zasad niezmienionego flankuj acego DNA (zarówno po stronie 5' jak i 3' [patrz np., Thomas i Capecchi, Celi, 51:503 (1987) dla opisu wektorów do rekombinacji homologicznej]. Wektor wprowadza si e do linii macierzystych komórek zarodkowych (np. poprzez elektroporacj e) i komórki, w których wprowadzony DNA uleg l ho- mologicznej rekombinacji z endogennym DNA s a selekcjonowane [patrz np.. Li i wsp.. Celi, 69:915 (1992)]. Wybrane komórki s a nast epnie wstrzykiwane do blastocysty zwierz ecia (np. myszy lub szczu- ra), aby wytworzy c chimerowe agregaty [patrz np. Bradley, w Teratocarcinomas and Embryonic Stern Cells: A Practical Approach, E. J. Robertson, wyd. (IRL, Oxford, 1987), str. 113-152]. Nast epnie chi- merowy zarodek mo ze by c wszczepiony do odpowiedniej samicy w ciazy rzekomej i zarodek dono- szony do urodzenia zwierz ecia z „nokautem”. Potomstwo nios ace DNA po homologicznej rekombinacji w swoich komórkach linii p lciowej mo zna zidentyfikowa c typowymi sposobami i u zy c do hodowania zwierz at, u których wszystkie komórki zawieraj a DNA po homologicznej rekombinacji. Zwierz eta z nokautem mog a by c oceniane przyk ladowo pod k atem zdolno sci do obrony przed okre slonymi sta- nami patologicznymi i rozwoju stanów patologicznych w nieobecno sci polipeptydu. Dla niniejszego wynalazku myszy z nokautem wytworzono w celu zbadania efektu agoniza- cji/antagonizacji TCCR odpowiedzi immunologicznej Th1 i/lub Th2 i chorób z ich udzia lem. 5. Receptory chimerowe. Dodatkowo mog a by c ponownie wytworzone receptory chimerowe dla okre slenia efektu prze- kazywania sygna lów przez receptor posiadaj acy nieznany ligand. Receptory chimerowe s a sprawdzo- nym sposobem badania funkcji receptorowych bez izolowania ligandu. Chang i wsp.. Mol. Celi Biol. 18(2): 896-905 (1998). 6. Terapia immunoadiuwantowa. W jednym z wykona n immunopobudzaj ace tu opisane mog a by c stosowane w terapii immuno- adiuwantowej nowotworów (raka). Obecnie dobrze wiadomo, ze komórki T rozpoznaj a ludzkie anty- geny specyficzne dla guza nowotworowego. Jedna grupa antygenów nowotworowych kodowanych przez rodziny genów MAGE, BAGE i GAGE jest milcz aca we wszystkich prawid lowych tkankach u doros lych, lecz s a one wyra zane w znacz acych ilo sciach w nowotworach, takich jak czerniaki, nowo- twory p luc, nowotwory g lowy i szyi i raki p echerza. DeSmet C., i wsp., (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:7149. Pokazano, ze wspó lpobudzenie komórek T indukuje zanik guza i odpowied z przeciw- nowotworow a zarówno in vitro, jak i in vivo. Melero, I. i wsp.. Nature Medicine (1997) 3:682; Kwon, E. D. i wsp.. Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1997) 94:80-99; Lynch, D. H. i wsp.. Nature Medicine (1997) 3:682; Kwon, E. D. i WSP., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1997) 94:80-99; Lynch, D. H. i WSP., Nature Medicine (1997) 3:625; Finn, O. J. i Lotze, M. T., J. Immunol. (1998) 21:114. Pobudzaj ace zwi azki tu opisane mog a by c podane, jako adiuwanty, same lub wraz z czynnikiem reguluj acym wzrost, czynni- kiem cytotoksycznym lub czynnikiem chemioterapeutycznym dla pobudzenia proliferacji/aktywacji komórek T i odpowiedzi przeciw guzowi na antygeny nowotworów. Czynniki reguluj ace wzrost, cyto- toksyczne lub chemioterapeutyczne mog a by c podane w tradycyjnych ilo sciach, stosuj ac znane re zi- my podawania. Aktywnosc immunopobudzaj aca zwi azków tu opisanych pozwala na zmniejszenie ilo sci czynników reguluj acych wzrost, cytotoksycznych lub chemioterapeutycznych, co za tym idzie potencjalnie obni za ich toksyczno sc dla pacjenta. 7. Testy przesiewowe dla kandydatów na lek. Testy przesiewowe dla kandydatów na lek zaprojektowano do identyfikacji zwi azków wi azacych sie lub kompleksuj acych z polipeptydami kodowanymi przez zidentyfikowane tu kwasy nukleinowe dla TCCR lub ich biologicznie aktywnym wariantem, lub inaczej wp lywaj ace na oddzia lywanie kodowa-PL 206 846 B1 39 nych polipeptydów z innymi bia lkami komórkowymi. Takie testy przesiewowe b ed a obejmowa ly testy umo zliwiaj ace wysokowydajne przeszukiwanie bibliotek chemicznych, co czyni je szczególnie u zy- tecznymi dla identyfikacji niskocz asteczkowych kandydatów na lek. Rozwa zane niskocz asteczkowe zwi azki obejmuj a syntetyczne zwi azki organiczne lub nieorganiczne, w tym polipeptydy, dogodnie rozpuszczalne polipeptydy, fuzje (poli)peptyd-immunoglobulina, a szczególnie przeciwcia la w tym i bez ogranicze n przeciwcia la poli- i monoklonalne i fragmenty przeciwcia l, przeciwcia la jedno lancu- chowe, przeciwcia la anty-idiotypowe oraz warianty chimerowe lub humanizowane takich przeciwcia l lub fragmentów, jak równie z ludzkie przeciwcia la i fragmenty przeciwcia l. Testy mog a by c wykonane ró znymi sposobami obejmuj acymi testy wi azania bia lko-bia lko, bio- chemiczne testy przesiewowe, testy immunologiczne i testy oparte na komórkach, które s a dobrze scharakteryzowane w tej dziedzinie. Wszystkie testy wyszukuj ace kandydata na lek, które tu przed- stawiono posiadaj a wspóln a w lasciwo sc tak a, ze wymagaj a doprowadzenia do kontaktu kandydata na lek z polipeptydem TCCR w warunkach i przez czas dostateczny dla umo zliwienia oddzia lywania tych cz asteczek. W testach wi azania, oddzia lywaniem jest wi azanie, a tworz acy si e kompleks mo ze by c wyizolo- wany lub wykryty w mieszaninie reakcyjnej. Poniewa z polipeptydy TCCR tu opisane s a receptorami, to fragment ECD TCCR mo ze równie z by c dogodnie zastosowany celem identyfikacji kandydatów na lek w lacznie z wariantami TCCR, ich antagonistami i/lub agonistami. W konkretnym wykonaniu polipeptyd kodowany przez zidentyfikowany tu gen lub kandydat na lek jest unieruchomiany na fazie sta lej np. na p lytce do mikromiareczkowania przez przy laczenie kowalencyjne lub niekowalencyjne. Przylaczenie niekowalencyjne generalnie osi aga si e przez op laszczenie sta lej powierzchni roztworem polipeptydu i wysuszenie. Alternatywnie, unieruchomione przeciwcia lo np. przeciwcia lo monoklonalne swoiste dla unieruchomionego polipeptydu mo ze by c u zyte dla zakotwiczenia go na fazie sta lej. Test przeprowa- dza si e przez dodanie nieunieruchomionego sk ladnika, który mo ze by c wyznakowany wykrywalnym znacznikiem, do unieruchomionego sk ladnika np. op laszczonej powierzchni zawieraj acej zakotwiczo- ny sk ladnik. Po przeprowadzeniu reakcji zwi azki, które jej nie uleg ly, usuwa si e np. przez p lukanie i wykrywa si e kompleksy zakotwiczone na fazie sta lej. Gdy wyj sciowo nieunieruchomiony sk ladnik niesie wykrywalny znacznik, to wykrycie znacznika unieruchomionego na powierzchni wykazuje, ze nast api lo powstanie kompleksu. Gdy wyj sciowo nieunieruchomiony sk ladnik nie niesie znacznika, powstawanie kompleksów mo ze by c wykryte przyk ladowo przy pomocy wyznakowanego przeciwcia la specyficznie wiaz acego unieruchomiony kompleks. Je sli kandyduj acy zwi azek oddzia luje, z, lecz nie wi aze si e z konkretnym, zidentyfikowanym tu bia lkiem TCCR, to jego oddzia lywanie z bia lkiem mo ze by c badane sposobami dobrze znanymi dla wykrywania oddzia lywa n bia lko-bia lko. Takie testy obejmuj a tradycyjne podej scia takie jak tworzenie wi aza n krzy zowych, koimmunoprecypitacja i wspó loczyszczanie przez gradienty lub kolumny chroma- tograficzne. Ponadto, oddzia lywania bia lko-bia lko mo zna sledzi c przy pomocy opartego na dro zd zach systemu genetycznego opisanego przez Fields i wspó lpracowników [Fields i Song, Nature (Londyn) 340, 245-246 (1989); Chien i wsp., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:9578-9582 (1991)] jak to opisali Chevray i Nathans [Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:5789-5793 (1991)]. Wiele aktywatorów transkrypcji, takie): jak GAL4, sk lada si e z dwóch fizycznie niezale znych modularnych domen, jednej dzia laj acej jako domena wi azaca DNA, natomiast drugiej funkcjonuj acej jako domena aktywuj aca transkrypcj e. Dro zd zowy system ekspresyjny opisany w powy zszych publikacjach (ogólnie nazywany „systemem dwuhybrydowym”) wykorzystuje te w la sciwo sci i stosuje dwa hybrydowe bia lka, jedno, w którym doce- lowe bia lko jest po laczone z domen a wi azac a DNA GAL4 i drugie, w której kandydat na bia lko aktywu- jace jest przy laczony do domeny aktywuj acej. Ekspresja genu reporterowego GALl-lacZ pod kontrol a promotora aktywowanego przez GAL4 zale zy od rekonstrukcji aktywno sci GAL4 przez oddzia lywanie bia lko-bia lko. Kolonie zawieraj ace oddzia luj ace polipeptydy s a wykrywane przy zastosowaniu chro- mogennego substratu dla p-galaktozydazy. Pe len zestaw (MATCHMAKER™) do identyfikacji oddzia- lywa n bia lko-bia lko pomi edzy dwoma specyficznymi bia lkami wykorzystuj acy technik e dwuhybrydow a jest komercyjnie dost epny z Clontech. System ten mo ze by c równie z zastosowany do mapowania domen bia lka uczestnicz acych w specyficznych oddzia lywaniach z bia lkiem, jak równie z zidentyfiko- wania aminokwasów, które s a krytyczne dla tych oddzia lywa n. Dla znalezienia zwi azków przeszkadzaj acych w oddzia lywaniu zidentyfikowanego tu polipeptydu TCCR i innych wewn atrz- lub zewn atrzkomórkowych sk ladników do testowania, zazwyczaj przygotowuje si e mieszanin e zawieraj ac a produkt genu i wewn atrz- lub zewn atrzkomórkowy sk ladnik w warunkach i przez czas pozwalaj acy na oddzia lywanie i wi azanie sk ladników. Dla sprawdzenia zdolno sci badanegoPL 206 846 B1 40 zwi azku do hamowania powy zszych oddzia lywa n reakcja jest prowadzone przy braku i w obecno sci testowanego zwi azku. Ponadto, do trzeciej mieszaniny reakcyjnej, s lu zacej, jako kontrola pozytywna, dodane mo ze by c placebo. Wi azanie (tworzenie kompleksu) pomi edzy badanym zwi azkiem i wewn atrz - lub zewn atrzkomórkowym sk ladnikiem obecnym w mieszaninie sledzi si e jak opisano powy zej. Tworze- nie kompleksu w reakcji(ach) kontrolnych, ale nie w mieszaninie reakcyjnej zawieraj acej badany zwi azek wskazuje, ze badany zwi azek wp lywa na oddzia lywanie testowanego zwi azku z jego partnerem w reakcji. 8. Kompozycje i sposoby leczenia chorób zwi azanych z odporno sci a. Kompozycje u zyteczne w leczeniu chorób zwi azanych z uk ladem immunologicznym (np. chorób z udzia lem Th1 i/lub Th2) obejmuj a, bez ograniczania, bia lka, przeciwcia la, niskocz asteczkowe zwi az- ki organiczne, peptydy, fosfopeptydy, cz asteczki antysensowne i rybozymy, cz asteczki o potrójnej helisie itp., które hamuj a lub pobudzaj a funkcj e odporno sciow a, przyk ladowo proliferacj e/aktywacj e komórek T, uwalnianie limfokin lub naciekanie komórek odporno sciowych. Przyk ladowo, antysensowne cz asteczki RNA i cz asteczki RNA dzia laj a bezpo srednio, blokuj ac translacj e mRNA przez hybrydyzacj e z docelowym mRNA i zapobieganie syntezie bia lka. Gdy stosuje sie antysensowny DNA, zalecane s a oligodeoksyrybonukleotydy pochodz ace z miejsca inicjacji trans- lacji np. pomi edzy pozycjami -10 i +10 sekwencji nukleotydowej docelowego genu. Rybozymy s a enzymatycznymi cz asteczkami RNA zdolnymi do specyficznego ci ecia RNA. Ry- bozymy dzia laj a przez specyficzn a wzgl edem sekwencji hybrydyzacj e z komplementarnym, docelo- wym RNA, a nast epnie endonukleolityczne ci ecie. Specyficzny rybozym tn acy miejsce w obr ebie RNA b ed acego potencjalnym celem mo ze by c zidentyfikowany znanymi sposobami. Dla dalszych szczegó- lów patrz np. Rossi, Current Biology 4:469-471 (1994) i publikacja PCT nr WO 97/33551 (opublikowa- na 18 wrze snia 1997). Cz asteczki kwasu nukleinowego tworz ace potrójn a helis e stosowane do hamowania transkryp- cji powinny by c jednoniciowe i sk lada c si e z deoksynukleotydów. Sk lad zasad tych oligonukleotydów projektuje si e tak, ze promuj a one tworzenie trójniciowej helisy zgodnie z zasadami parowania Hoog- steena, co ogólnie wymaga odpowiednio d lugich ci agów puryn lub pirymidyn w jednej nici dupleksu. Dla dalszych szczegó lów patrz np. publikacja PCT nr WO 97/33551, jak wy zej. Cz asteczki te mog a by c zidentyfikowane przy zastosowaniu jakiejkolwiek kombinacji dyskuto- wanych powy zej testów przesiewowych i/lub innej techniki wyszukiwania dobrze znanej specjalistom w tej dziedzinie. Polipeptydy TCCR, agonistów i antagonistów (cz asteczki TCCR) tu opisane mo zna równie z za- stosowa c, jako czynniki terapeutyczne. Cz asteczki TCCR tu opisane mog a by c wytwarzane zgodnie ze znanymi sposobami wytwarzania farmaceutycznie u zytecznych kompozycji, gdzie cz asteczk e TC- CR laczy si e w kombinacji z farmaceutycznie dopuszczalnym no snikiem. Terapeutyczne postaci s a przygotowywane do przechowania poprzez mieszanie cz asteczek TCCR maj acych pozadany stopie n czystosci, ewentualnie z fizjologicznie dopuszczalnymi no snikami, zarobkami lub substancjami stabili- zuj acymi. Remington's Pharmaceutical Sciences wydanie 16 Osol. A. wyd. (1980)) w postaciach liofili- zowanych lub roztworach wodnych. Akceptowalne no sniki, zarobki lub substancje stabilizuj ace s a nietoksyczne dla biorców w stosowanych dawkach i st ezeniach i obejmuj a bufory, takie jak fosforano- wy, cytrynianowy i oparte na innych kwasach organicznych, przeciwutleniacze obejmuj ace kwas askorbinowy; niskocz asteczkowe polipeptydy (mniej ni z oko lo 10 reszt aminokwasowych); bia lka, takie jak albumina surowicy, zelatyna lub immunoglobuliny; hydrofilowe polimery, takie jak poliwinylopiroli- don, aminokwasy, takie jak glicyna, glutamina, asparagina, arginina lub lizyna; monosacharydy, disa- charydy i inne w eglowodany w lacznie z glukoz a, mannoz a lub dekstrynami; czynniki chelatuj ace takie jak EDTA; alkohole cukrowe, takie jak mannitol lub sorbitol, tworz ace sole jony, takie jak jon sodowy; i/lub niejonowe substancje powierzchniowo czynne, takie jak TWEEN®, PLURONICS® lub PEG. Kompozycje do zastosowania in vivo musz a by c sterylne. Jest to latwo osi agalne przez filtro- wanie przez b lony przed dalsz a liofilizacj a i rekonstytucj a. Kompozycje terapeutyczne tutaj zazwyczaj s a umieszczane w pojemniku zawieraj acym sterylne uj scie, przyk ladowo woreczek do wlewu do zylnego lub fiolka posiadaj acy zamkni ecie, które mo ze by c przebite ig la do zastrzyków podskórnych. Droga podania jest zgodna ze znanymi sposobami, np. wstrzykni ecie lub wlew do zylny, do- otrzewnowy, domi esniowy, do ga lki ocznej, donaczyniowy, lub do miejsca uszkodzenia, jako podanie domiejscowe lub przy pomocy systemów o przed lu zonym uwalnianiu.PL 206 846 B1 41 Dawkowanie i pozadane st ezenie kompozycji farmakologicznych tu opisanych mo ze ró zni c si e zale znie od planowanego konkretnego zastosowania. Okre slenie odpowiedniej dawki i drogi podania jest mo zliwe dla przeci etnego lekarza. Do swiadczenia na zwierz etach dostarczaj a wiarygodnych wskazówek dla okre slania skutecznej dawki dla leczenia cz lowieka. Mi edzygatunkowe przeliczenie skutecznej dawki mo ze zosta c wykonane zgodnie z zasadami podanymi przez Mordenti, J. i Chappell, W. „The use of interspecies scaling in toxicokinetics” Toxicokinetics and New Drug Development, Yacobi i wsp., wyd., Pergamon Press, Nowy Jork 1989, str. 42-96. Gdy cz asteczki TCCR s a podawane in vitro, to wielkosc prawid lowej dawki mo ze by c zró znico- wana od oko lo 10 ng/kg do 100 mg/kg masy cia la ssaka lub wi ecej na dzie n, dogodnie oko lo 1 µg/kg/dzie n do 10 mg/kg/dzie n, zale znie od drogi podania. Wskazówki dotycz ace konkretnych dawek i sposobu podania s a dostarczone w pi smiennictwie; patrz przyk ladowo patenty USA nr 4,657,760; 5,206,344 lub 5,225,212. Przewiduje si e, ze ró zne kompozycje b ed a skuteczne dla ró znego leczenia i ró znych chorób i podanie zamierzone do leczenia konkretnego organu mo ze by c dokonane inaczej ni z w przypadku innego organu lub tkanki. Gdy po zadane jest podawanie cz asteczek TCCR w kompozycji o przed lu zonym uwalnianiu od- powiedniej do leczenia dowolnej choroby lub zaburzenia wymagaj acego podania cz asteczek TCCR, rozwa zane jest zamkni ecie cz asteczek TCCR w kapsu lkach. Zamkni ecie rekombinowanych bia lek w mikrokapsu lkach do przed lu zonego uwalniania zosta lo z sukcesem przeprowadzone w przypadku ludzkiego hormonu wzrostu (rhGH), interferonu- a, - ß, - ? (rhIFN- a, - ß, - ?), interleukiny-2 i MNrgp120. Johnson i wsp., Nat. Med. 2:795-799 (1996); Yasuda, Biomed. Ther. 27: 1221-1223 (1993); Hora i wsp., Bio/Technology 8:755-758 (1990); Cleland, „Design and Production of Single Immunization Yaccines Using Polylactide Polyglycolide Microsphere Systems” w Yaccine Designe: The Subunit and Adjuvant Approach, Powell i Newman, wyd., (Plenum Press, Nowy Jork, 1995), str. 439-462; WO 97/03692, WO 96/40072, WO 96/07399 i patent US nr 5,654,010. Kompozycje cz asteczek TCCR o przed luzonym uwalnianiu mog a by c opracowane z wykorzy- staniem kopolimeru kwasu mlekowego i glikolowego (PLGA), polimeru wykazuj acego wysoki stopie n zgodno sci biologicznej i szeroki zakres mo zliwo sci biologicznej degradacji. Produkty degradacji PLGA, mleczan i kwasy glikolowe s a szybko usuwane z cia la cz lowieka. Ponadto, szybko sc degradacji tego polimeru mo zna ustali c na miesi ace do lat, zale znie od jego masy cz asteczkowej i kompozycji. Dla dalszych informacji patrz Lewis „Controlled Release of Bioactive Agents from Lactide/Glycolide Poly- mer” The Biodegradable Polymers as Drug Delivery Systems M. Chasin i R. Langeer, wyd. (Marcel Dekker: Nowy Jork, 1990) str. 1-41. 9. Identyfikacja agonistów i antagonistów TCCR. Zgodnie z wynalazkiem opisano równie z sposoby przeszukiwania zwi azków do identyfikacji tych, które na sladuj a lub wzmagaj a efekt (agonista) polipeptydu TCCR, lub zapobiegaj a albo hamuj a jedn a lub wi ecej funkcji lub aktywno sci polipeptydu TCCR. Dogodnie, tacy antagoni sci i agoni sci s a wariantami TCCR, fragmentami peptydowymi, ma lymi cz asteczkami, antysensownymi oligonukleoty- dami (DNA lub RNA) lub przeciwcialami (monoklonalnymi, humanizowanymi, swoistymi, jedno la ncu- chowymi, heterokoniugatami lub fragmentami wy zej wspomnianych). Ponadto, antagoni sci TCCR mog a obejmowa c potencjalne Ugandy TCCR, natomiast potencjalni agoni sci TCCR mog a obejmowa c rozpuszczalne zewn atrzkomórkowe domeny TCCR (ECD). Testy przesiewowe dla kandydatów na leki b ed acych antagonistami i/lub agonistami s a zapro- jektowane dla identyfikacji zwi azków wi azacych lub tworz acych z polipeptydami TCCR, kodowanymi przez zidentyfikowane tu geny, lub inaczej wp lywaj ace na oddzia lywanie zkodowanych polipeptydów z innymi bia lkami komórkowymi. Takie testy przesiewowe b ed a obejmowa ly wysokowydajne testy przesiewowe bibliotek chemicznych, co czyni je szczególnie u zytecznymi dla identyfikacji niskocz a- steczkowych kandydatów na lek. Testy mo zna przeprowadza c na ró zne sposoby obejmuj ace testy wi azania bia lko-bia lko, bio- chemiczne testy przesiewowe, testy immunologiczne i testy oparte na komórkach, które s a dobrze scharakteryzowane w tej dziedzinie. Rozwa zane tu testy przesiewowe dla antagonisty maj a wspóln a cech e, któr a jest proces do- prowadzania do kontaktu kandydata na lek z polipeptydem TCCR w warunkach i przez czas dosta- teczny dla umo zliwienia oddzia lywania tym dwóm sk ladnikom. Przyk lady dogodnych testów u zytecznych dla identyfikacji antagonistów i agonistów TCCR zo- staly wcze sniej przedstawione w punkcie 7. Testy przesiewowe dla kandydatów na lek.PL 206 846 B1 42 Jako dodatkowy przyk lad testu dla antagonistów, polipeptyd TCCR mo zna dodawa c do komó- rek wraz ze zwi azkiem, który ma by c badany pod k atem konkretnej aktywno sci, przy czym zdolno sc do hamowania aktywno sci b ed acej przedmiotem zainteresowania w obecno sci polipeptydu TCCR, wskazuje, ze zwi azek ten jest antagonist a polipeptydu TCCR. Alternatywnie, antagonistów mo zna wykry c przez laczenie polipeptydu TCCR i potencjalnego antagonisty ze zwi azanymi z b lon a recepto- rami polipeptydu TCCR lub rekombinowanymi receptorami, w warunkach odpowiednich dla oznacze- nia hamowania kompetycyjnego. Polipeptyd TCCR mo ze by c wyznakowany np. radioaktywnie tak, ze mo ze by c okre slona liczba cz asteczek polipeptydu TCCR zwi azanych z receptorem, co okre sli sku- teczno sc potencjalnego antagonisty. Gen koduj acy receptor mo zna zidentyfikowa c ró znymi sposoba- mi znanymi w tej dziedzinie, na przyk lad poprzez wyszukiwanie ligandem i sortowanie FACS. Coligan i wsp., Current Protocols in Immunol. 1(2): rozdzia l 5 (1991). Zalecane jest stosowanie klonowania na ekspresj e, gdzie poliadenylowany RNA jest przygotowywany z komórek reaguj acych na polipeptyd TCCR i tworzy si e bibliotek e cDNA z tego RNA, któr a dzieli si e na pule i u zywa do transfekcji komórek COS lub innych komórek, które nie reaguj a na polipeptyd TCCR. Transfekowane komórki, które hodu- je si e na szkie lkach, s a wystawione na dzia lanie wyznakowanych polipeptydów TCCR. Polipeptyd TCCR mo ze by c wyznakowany ró znorodnymi sposobami obejmuj acymi jodowanie lub wstawienie miejsca rozpoznawanego przez specyficzn a kinaz e bia lkow a. Po utrwaleniu i inkubacji szkie lka s a poddawane analizie autoradiograficznej. Identyfikowane s a pozytywne pule i przygotowywane podpu- le, które ponownie transfekuje si e, stosuj ac proces dzielenia na pule i przeszukiwania pod k atem od- dzia lywania, co ostatecznie daje pojedynczy klon koduj acy potencjalny receptor. W kolejnym te scie dla antagonistów komórki ssaka lub preparat b lonowy zawieraj acy receptor b ed a inkubowane z wyznakowanym polipeptydem TCCR w obecno sci kandyduj acego zwi azku. Mie- rzona b edzie zdolnosc zwi azku do wzmacniania lub blokowania tego oddzia lywania. Bardziej konkretne przyk lady potencjalnych antagonistów obejmuj a oligonukleotyd wiazacy si e z fuzjami immunoglobuliny z polipeptydem TCCR i szczególnie przeciwcia la obejmuj ace, bez ograni- czania, przeciwcia la poli- i monoklonalne i fragmenty przeciwcia l, przeciwcia la jedno la ncuchowe, przeciwcia la antyidiotypowe i chimerowe lub humanizowane wersje takich przeciwcia l lub fragmentów, jak równie z ludzkie przeciwcia la i fragmenty przeciwcia l. Alternatywnie, potencjalny antagonista mo ze by c blisko spokrewnionym bia lkiem, przyk ladowo polipeptydem TCCR zmienionym w wyniku mutacji, który rozpoznaje ligand, lecz nie powoduje to zadnego skutku, co za tym idzie konkurencyjnie hamuje dzia lanie polipeptydu TCCR. Ostatecznie, kolejnym, potencjalnym antagonist a TCCR jest ECD TCCR, która mo ze konkurowa c o dost epny ligand, efektywnie pozostawiaj ac wolnym sygna l naturalnego re- ceptora TCCR. Kolejnym, potencjalnym antagonist a TCCR jest konstrukt antysensownego RNA lub DNA przy- gotowany przy zastosowaniu technologii antysensownych cz asteczek, gdzie np. cz asteczka antysen- sownego RNA lub DNA dzia la blokuj ac bezpo srednio translacj e mRNA przez hybrydyzacj e z docelowym mRNA i zapobieganie powstawaniu bia lka w wyniku translacji. Technologia antysensownej cz asteczki mo ze by c stosowano do kontrolowania ekspresji genu przez tworzenie potrójnej helisy lub antysensow- nego DNA lub RNA, gdzie oba sposoby s a oparte na wi azaniu polinukleotydu z DNA lub RNA. Przyk ladowo, cz es c 5' koduj aca sekwencji polinukleotydowej, która koduje opisane tu dojrza le polipeptydy TCCR, stosuje si e do projektowania antysensownego oligonukleotydu RNA o d lugo sci oko lo 10 do 40 zasad. Oligonukleotyd DNA projektuje si e tak, aby by l komplementarny do obszaru genu uczestnicz acego w transkrypcji (trójniciowa helisa - patrz Lee i wsp.. Nuci. Acids Res. 6: 3073 (1979); Cooney i wsp.. Science 241: 456 (1988); Dervan i wsp.. Science, 251: 1360 (1991)) co za tym idzie zapobiegaj ac transkrypcji i wytwarzaniu polipeptydu TCCR. Antysensowny oligonukleotyd RNA hybrydyzuje in vitro z mRNA, blokujac translacj e cz asteczki mRNA do polipeptydu TCCR (antysens - Okano, Neurochem. 56: 560 (1991); Oligodeoxynucleotides as Antisense Inhibitors of Gene Expres- sion (CRC Press: Boca Raton, FL, 1988). Opisane powy zej oligonukleotydy mog a by c równie z dostar- czone do komórek tak, ze antysensowny RNA lub DNA mo ze podlega c ekspresji in vivo hamuj ac wy- twarzanie polipeptydu TCCR. Gdy stosowany jest antysensowny DNA, oligodeoksyrybonukleotydy pochodz ace z miejsca inicjacji translacji np. pomi edzy oko lo -10 i +10 sekwencji nukleotydowej doce- lowego genu s a zalecane, jako antysensowne cz asteczki. Potencjalni antagoni sci obejmuj a ma le cz asteczki wi azace si e z aktywnym miejscem, miejscem wi azania receptora lub czynnika wzrostu, lub innym odpowiednim miejscem wi azania polipeptydu TCCR, co za tym idzie blokuj a normaln a aktywnosc biologiczn a polipeptydu TCCR. Przyk lady ma lychPL 206 846 B1 43 cz asteczek obejmuj a ma le peptydy lub cz asteczki podobne do peptydu, zw laszcza rozpuszczalne peptydy i syntetyczne niepeptydowe zwi azki organiczne lub nieorganiczne. Rybozymy s a enzymatycznymi cz asteczkami RNA zdolnymi do katalizowania specyficznego ciecia RNA. Rybozymy dzia laj a poprzez specyficzn a wzgl edem sekwencji hybrydyzacj e z komplemen- tarnym, docelowym RNA, a nast epnie ci ecie endonukleolityczne. Specyficzne miejsca ci ecia dla rybo- zymu w potencjalnym, docelowym RNA, mo zna zidentyfikowa c znanymi sposobami. Dla dalszych szczegó lów patrz np. Rossi, Current Biology, 4: 469-471 (1994) i PCR publikacja nr WO 97/33551 (opublikowana 18 wrze snia 1997). Cz asteczki kwasu nukleinowego do tworzenia trójniciowej helisy stosowane do hamowania transkrypcji powinny by c jednoniciowe i z lo zone z deoksynukleotydów. Sk lad zasad tych oligonukleotydów projektuje si e tak, aby promowa l tworzenie trójniciowej heli- sy, zgodnie z zasadami parowania Hoogsteena, które ogólnie wymagaj a odpowiedniej d lugo sci ci agu puryn lub pirymidyn w jednej nici dupleksu. Dla szczegó lów patrz np publikacja PCT nr WO 97/33551, jak wy zej. Cz asteczki te mog a by c identyfikowane przy zastosowaniu jednego lub wi ekszej liczby testów przesiewowych u zywanych powy zej i/lub przy zastosowaniu dowolnego spo sród sposobów wyszuki- wania, dobrze znanych specjalistom w tej dziedzinie. 10. TCCR i terapia genowa Kwas nukleinowy koduj acy polipeptydy TCCR mo ze by c równie z u zyty w terapii genowej. W za- stosowaniach terapii genowej, geny s a wprowadzane do komórek celem uzyskania in vivo syntezy terapeutycznie skutecznego produktu genetycznego, przyk ladowo do zast apienia uszkodzonego ge- nu. „Terapia genowa” obejmuje zarówno klasyczn a terapi e genow a, gdzie trwa ly efekt jest osi agni ety przez jednokrotne dzia lanie i podanie czynników terapii genowej, które obejmuje jednokrotne lub po- wtarzalne podawanie terapeutycznie skutecznej ilo sci DNA lub mRNA. Jako czynniki terapeutyczne mog a by c u zyte antysensowne RNA i DNA do blokowania okre slonych genów in vivo. Pokazano, ze krótkie antysensowne oligonukleotydy mog a by c importowane do komórek, gdzie dzia laj a, jako inhibi- tory pomimo ich niskiego, wewn atrzkomórkowego st ezenia spowodowanego ograniczonym pobiera- niem przez b lon e komórkow a (Zamecnik i wsp.. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83: 4143-4146 (1986)). Oligonukleotydy mog a by c zmodyfikowane celem zwi ekszenia ich pobierania np. przez podstawienie ich ujemnie na ladowanych grup fosfodiestrowych grupami bez ladunku. Istnieje wiele sposobów wprowadzania kwasów nukleinowych do zywych komórek. Sposoby te ró zni a si e w zale zno sci od tego, czy kwas nukleinowy jest wprowadzany do komórek hodowanych in vitro czy komórek zamierzonego gospodarza in vivo. Sposoby u zyteczne dla wprowadzania kwasu nukleinowego do komórek ssaka in vitro obejmuj a zastosowanie liposomów, elektroporacji, mikroin- iekcji, fuzji komórek, DEAE-dekstranu, sposoby wytr acania fosforanem wapniowym itp. Obecnie prefe- rowane sposoby przenoszenia genu in vivo obejmuj a transfekcj e wektorem wirusowym (typowo retro- wirusowym) i transfekcj e za po srednictwem wirusowej otoczki bia lkowo-liposomowej (Dzau i wsp., Trends in Biotechnology 11: 205-210 (1993)). W pewnych sytuacjach po zadanym jest dostarczenie zród la kwasu nukleinowego z czynnikiem adresuj acym do docelowych komórek, takim jak przeciwcia- lo swoiste dla bia lka b lony powierzchniowej lub docelowej komórki, ligand dla receptora na okre slonej komórce docelowej, itp. Gdy stosowane s a liposomy to do adresowania i/lub u latwiania pobierania bia lka u zy c mo zna bia lek, które wiaza si e z bia lkami powierzchni b lony komórkowej zwi azanymi z endocytoz a, np. bia lka kapsydu lub ich fragmenty wykazuj ace tropizm wzgl edem konkretnego rodza- ju komórki, przeciwcia la dla bia lek ulegaj acych cyklicznej internalizacji, bia lka kieruj ace do wn etrza komórki i zwi ekszaj ace okres pó ltrwania w komórce. Technika endocytozy za po srednictwem recepto- ra jest przyk ladowo opisana przez Wu i wsp., J. Bio. Chem. 262: 4429-4432 (1980) oraz Wagner i wsp., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:3410-3414 (1990). Dla przegl adu protoko lów znakowania geno- wego i terapii genowej patrz Anderson i wsp., Science 256: 808-813 (1992). 11. Przeciwcia la. Zgodnie z wynalazkiem opisano ponadto przeciwcia la anty-TCCR. Przyk lady przeciwcia l obej- muj a przeciwcia la poliklonalne, monoklonalne, humanizowane, bispecyficzne i heterokoniugaty w lacznie z fragmentami przeciwcia l, które mog a hamowa c (by c antagonistami) lub pobudza c (agoni sci) prolife- racj e komórek T, naciekami eozynofili, itp. i. Przeciwcia la poliklonalne Przeciwcia la anty-TCCR mog a obejmowa c przeciwcia la poliklonalne. Sposoby otrzymywania przeciwcia l poliklonalnych s a dobrze znane specjalistom w tej dziedzinie. Przeciwcia la poliklonalnePL 206 846 B1 44 mo zna uzyska c w ssaku, na przyk lad poprzez jedno lub wi ecej wstrzykni ec czynnika immunizujacego i, je sli to po zadane, adiuwanta. Typowo, czynnik immunizuj acy i/lub adiuwant b edzie wstrzykni ety ssakowi, jako wiele wstrzykniec podskórnych lub dootrzewnowych. Czynnik immunizuj acy moze za- wiera c polipeptyd TCCR lub jego bia lko fuzyjne. Mo ze by c u zyteczne skoniugowanie czynnika immu- nizuj acego z bia lkiem, o którym wiadomo, ze jest immunogenne dla immunizowanego ssaka. Przyk la- dy takich immunogennych bia lek obejmuj a, bez ograniczenia, hemocyjanin e ze, ska loczepa (ang. keyhole limpet), albuminy z surowicy, tyroglobuliny bydl ecej i inhibitora trypsyny z soi. Przyk lady adiu- wantów, które mog a by c zastosowane obejmuj a kompletny adiuwant Freunda i adiuwant MPL-TDM (monofosforylowy Lipid A, syntetyczny dikorynomykolan trehalozy). Protokó l immunizacji mo ze by c dobrany przez specjalist e w tej dziedzinie bez niepotrzebnego eksperymentowania. ii. Przeciwcia la monoklonalne Przeciwcia la anty-TCCR mog a alternatywnie by c przeciwcia lami monoklonalnymi. Przeciwcia la monoklonalne mog a by c otrzymane przy zastosowaniu metod z u zyciem hybrydom, tak jak opisali to Kohler i Milstein, Nature 256: 495 (1975). W sposobie z hybrydom a mysz, chomik lub inne odpowiednie zwierz e b ed ace gospodarzem jest typowo immunizowane czynnikiem immunizuj acym dla wywo lania powstawania limfocytów, wytwarzaj acych lub zdolnych do wytwarzania przeciwcia l, które b ed a wi aza ly si e swoi scie z czynnikiem immunizuj acym. Alternatywnie, limfocyty mog a by c immunizowane in vitro. Czynnik immunizuj acy b edzie typowo zawiera l polipeptyd TCCR lub jego bia lko fuzyjne. Ogól- nie, u zywa si e zarówno limfocytów krwi obwodowej („PBL”), je sli pozadane s a komórki pochodzace od cz lowieka, jak i komórek sledziony, lub komórek w ez la ch lonnego, je sli po zadane s a zród la ssaczych komórek innych ni z ludzkie. Limfocyty poddaje sie nast epnie fuzji z unie smiertelnion a lini a komórkow a przy pomocy dogodnych czynników powoduj acych fuzj e, takich jak glikol polietylenowy, tworz ac ko- mórk e hybrydomy [Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, Academic Press, (1986) str. 59-103]. Unie smiertelnione linie komórkowe s a zazwyczaj transformowanymi komórkami ssaka, szczególnie komórkami szpiczaka pochodz acymi od gryzoni, byd la i cz lowieka. Zazwyczaj wykorzy- stywane s a linie komórkowe szpiczaka pochodz ace od szczura lub myszy. Komórki hybrydomy mog a by c hodowane w dogodnej po zywce hodowlanej, która dogodnie zawiera jedn a lub wi ecej substancji hamuj acych wzrost lub prze zycie unie smiertelnionych komórek, które nie uleg ly fuzji. Przyk ladowo, je sli komórki rodzicielskie utraci ly enzym fosforybozylo transferaz e hipoksantyny guaniny (HGPRT lub HPRT) to po zywka hodowlana dla hybrydom typowo zawiera hipoksantyn e, aminopteryn e i tymidyn e („po zywka HAT”), które to substancje zapobiegaj a wzrostowi komórek pozbawionych HGPRT. Zalecanymi unie smiertelnionymi liniami komórkowymi s a te, które wydajnie ulegaj a fuzji, za- pewniaj a stabilny, wysoki poziom ekspresji przeciwcia la w wybranych komórkach wytwarzaj acyh prze- ciwcia lo i s a wra zliwe na po zywk e, tak a jak po zywka HAT. Bardziej zalecanymi unie smiertelnionymi liniami komórkowymi s a linie mysiego szpiczaka, które mo zna otrzyma c przyk ladowo z Salk Institute Celi Distribution Center, San Diego, Kalifornia i z 7\merican Type Culture Collection Rockville, Mary- land. Ludzkie komórki szpiczaka i mysio-ludzkie linie komórkowe heteroszpiczaka równie z opisano, jako wytwarzaj ace ludzkie przeciwcia la monoklonalne [Kozbor, J. Immunol., 133:3001 (1984); Brodeur i wsp., Monoclonal Antibody Production Techni aues and Applications, Marcel Dekker, Inc., Nowy Jork (1987) str. 51-63]. Po zywk e hodowlan a, w której hoduje si e komórki hybrydomy mo zna nast epnie bada c pod k a- tem obecno sci przeciwcia l monoklonalnych skierowanych anty-TCCR. Dogodnie, swoisto sc wi azania przeciwcia l monoklonalnych wytwarzanych przez komórki hybrydomy okre sla si e przez immunoprecy- pitacj e lub przez test wi azania in vitro, taki jak test radioimmunologiczny (RIA) lub enzymatyczny test immunosorpcyjny (ELISA). Takie techniki i testy s a znane w tej dziedzinie. Powinowactwo wi azania przeciwcia la monoklonalnego mo ze by c przyk ladowo okre slone przez analiz e Scatchard wed lug Munson i Pollard, Anal. Blochem. 107:220 (1980). Po zidentyfikowaniu po zadanych komórek hybrydomy klony mog a by c subklonowane przy za- stosowaniu procedur ograniczaj acych rozcie ncze n i hodowane typowymi sposobami [Goding, jak wy zej]. U zyteczne dla tych celów po zywki hodowlane obejmuj a przyk ladowo po zywk e Dulbecco's Modified Eagle's Medium i po zywk e RPMI-1640. Alternatywnie, komórki hybrydomy mog a by c hodowane in vivo w postaci p lynu puchlinowego ssaka. Przeciwcia la monoklonalne wydzielane przez subklony mo zna izolowa c i oczyszcza c z po zywki hodowlanej lub p lynu puchlinowego przy pomocy tradycyjnych sposobów oczyszczania immunoglobu- lin, takich jak, przyk ladowo, chromatografia na sefarozie ze zwi azanym bia lkiem A, chromatografia na hydroksyapatycie, elektroforeza w zelu, dializa lub chromatografia powinowactwa.PL 206 846 B1 45 Przeciwcia la monoklonalne mog a równie z by c wytworzone sposobami rekombinowania DNA, takimi jak opisane w patencie USA nr 4,816,567. DNA koduj acy przeciwcia la monoklonalne tu opisane mo ze by c, przy zastosowaniu tradycyjnych sposobów (np. przy pomocy sond oligonukleotydowych zdolnych do specyficznego wi azania si e z genem koduj acym lancuchy lekki i ciezki mysich przeciw- cia l), latwo wyizolowany i mo ze by c ustalona jego sekwencja nukleotydow a. Komórki hybrydomy tu opisane s lu za, jako zalecane zród lo takiego DNA. Po wyizolowaniu, DNA mo ze by c umieszczony w wektorach ekspresyjnych, które s a nast epnie wprowadzane do komórek gospodarza, takich jak ma lpie komórki COS, komórki jajnika chomika chi nskiego (CHO) lub komórki szpiczaka, które inaczej nie wytwarzaj a bia lka immunoglobuliny, dla uzyskania syntezy przeciwcia l monoklonalnych w rekom- binowanych komórkach gospodarza. DNA mo ze by c równie z zmodyfikowany, przyk ladowo przez pod- stawienie sekwencji koduj acej ludzkie domeny sta le la ncucha ci ezkiego i lekkiego w miejsce homolo- gicznych sekwencji mysich [patent USA nr 4, 816, 567; Morrison i wsp., jak wy zej] lub przez kowalen- cyjne po laczenie sekwencji koduj acej immunoglobulin e z ca la lub czescia sekwencji koduj acej poli- peptyd nieb ed acy immunoglobulin a. Takie nieb ed ace immunoglobulin a polipeptydy mog a zast api c domeny sta le przeciwcia la tu opisanego lub mog a zast api c domeny zmienne miejsca oddzialywania z antygenem przeciwcia la tu opisanego, tworz ac dwuwarto sciowe przeciwcia lo chimerowe. Przeciwcia la mog a by c przeciwcia lami jednowarto sciowymi. Sposoby przygotowania przeciwcia l jednowarto sciowych s a dobrze znane w tej dziedzinie. Przyk ladowo, jeden sposób obejmuje ekspresj e poprzez rekombinowanie DNA lekkiego lancucha immunoglobuliny i zmodyfikowanego lancucha ciez- kiego. La ncuch ci ezki jest zazwyczaj skrócony w jakimkolwiek miejscu regionu Fc, tak, aby zapobiec wi azaniu poprzecznym la ncucha ci ezkiego. Alternatywnie, odpowiednie reszty cysteiny zast epuje si e innym aminokwasem lub s a usuwane tak, aby zapobiec wi azaniu poprzecznemu. Dla przygotowania jednowarto sciowych przeciwcia l u zyteczne s a równie z sposoby in vitro. Tra- wienie przeciwcia l dla wytworzenia ich fragmentów, szczególnie fragmentów Fab mo ze by c osiagni ete przy pomocy rutynowych sposobów, znanych w tej dziedzinie. iii. Przeciwcia la ludzkie i humanizowane. Przeciwcia la anty-TCCR tu opisane mog a ponadto obejmowa c przeciwcia la humanizowane lub ludzkie. Humanizowane postaci przeciwcia l innych ni z ludzkie (np. mysich) to immunoglobuliny chime- rowe, lancuchy immunoglobulin lub ich fragmenty (takie jak Fv, Fab, Fab', F(ab') 2 lub inne wiazace antygen sekwencje przeciwcia l) zawieraj ace minimaln a sekwencj e immunoglobuliny innej ni z ludzka. Humanizowane przeciwcia la obejmuj a ludzkie immunoglobuliny (przeciwcia lo biorcy), w których reszty aminokwasowe z regionu determinuj acego komplementarnosc (CDR) biorcy s a zast apione amino- kwasami z CDR gatunków innych ni z cz lowiek (przeciwcia lo dawcy), takich jak mysz, szczur lub królik, o po zadanej swoisto sci, powinowactwie i pojemno sci. W pewnych warunkach aminokwasy regionu zr ebowego Fv ludzkiej immunoglobuliny s a zast apione odpowiednimi aminokwasami niepochodz acy- mi od cz lowieka. Humanizowane przeciwcia la mog a równie z zawiera c aminokwasy, które nie wyst e- puj a ani w przeciwciele biorcy, ani w importowanym CDR lub sekwencjach zr ebowych. Ogólnie, hu- manizowane przeciwcia lo b edzie zawiera lo zasadniczo wszystkie lub przynajmniej jedn a, typowo dwie domeny zmienne, w których wszystkie lub zasadniczo wszystkie regiony CDR odpowiadaj a tym z immunoglobulin innych ni z ludzkie i wszystkie lub zasadniczo wszystkie regiony FR s a odpowiadaj a- cymi im regionami z ludzkich sekwencji najwy zszej zgodno sci dla immunoglobuliny. Optymalnie, je zeli przeciwcia lo b edzie zawiera lo równie z przynajmniej cz esc regionu sta lego immunoglobuliny (Fc), ty- powo z ludzkiej immunoglobuliny [Jones i wsp., Nature 321: 522-525 (1986); Riechmann i wsp.. Natu- r e, 332:323-329 (1988) i Presta, Curr. Op. Struct. Biol., 2: 593-596 (1992)]. Sposoby humanizowania przeciwcia l innych ni z ludzkie s a dobrze w tej dziedzinie. Ogólnie, humanizowane przeciwcia lo ma wprowadzon a jedn a lub wi ecej reszt aminokwasowych pochodz acych ze zród la innego ni z cz lowiek. Te aminokwasy, które nie pochodz a od cz lowieka s a cz esto okre slane, jako aminokwasy „importowane”, które s a typowo pobierane z „importowanej” domeny mo ze by c za- sadniczo przeprowadzona wed lug Winter i wsp. [Jones i wsp. (1986); Riechmann i wsp., Nature, Verhoeyen i wsp., Science, 239:1534-1536 (1988)], przez zast apienie jednym lub wi eksz a liczb a CDR gryzonia odpowiednich sekwencji ludzkiego przeciwcia la. Zgodnie z tym, takie „humanizowane” prze- ciwcia la s a przeciwcia lami chimerowymi (patent USA nr 4,816,567), gdzie zasadniczo mniej ni z pe lna ludzka domena zmienna zosta la zast apiona przez odpowiadaj ac a jej sekwencj e pochodz ac a z gatun- ków innych ni z cz lowiek. W praktyce, humanizowane przeciwcia la s a typowo ludzkimi przeciwcia lami, w których pewne reszty aminokwasowe w CDR a mo zliwe, ze tak ze pewne reszty aminokwasowe z FR s a zast apione aminokwasami z analogicznych miejsc przeciwcia l gryzonia.PL 206 846 B1 46 Ludzkie przeciwcia la mo zna równie z wytworzy c przy zastosowaniu ró znych, znanych w tej dziedzinie sposobów, obejmuj acych biblioteki z prezentacj a na fagach [Hoogenboom zmiennej. Hu- manizacja zgodnie ze sposobem, Nature, 321:522-525 332:323-327 (1988); i Winter, J. Mol. Biol., 227:381 (1991); Marks i wsp., J. Mol. Biol., 222:581 (1991)]. Dost epne s a równie z techniki wed lug Cole i wsp. oraz Boerner i wsp. dla sporz adzania ludzkich przeciwcia l monoklonalnych (Cole i wsp., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss str. 77 (1985); Borener i wsp., J. Immunol., 147(1): 86-95 (1991); patent USA 5,750,373]. Podobnie ludzkie przeciwcia la mo zna wytwarza c po- przez wprowadzenie loci ludzkich immunoglobulin do zwierz at transgenicznych np. myszy, w której endogenne geny immunoglobuliny b ed a cz esciowo lub ca lkowicie inaktywowane. Po podaniu obser- wowane jest wytwarzanie ludzkiego przeciwcia la, które bardzo przypomina pod ka zdym wzgl edem, w lacznie z przebudow a genu, sk ladaniem i repertuarem przeciwcia l, te obserwowane u ludzi. To po- dej scie jest przyk ladowo opisane w patentach USA nr 5,545,807; 5,545,806; 5,569,825; 5,625,126; 5,633,425; 5,661,016 i nast epuj acych publikacjach naukowych: Marks i wsp., Bio/Technology 10, 779- -783 (1992); Lonberg i wsp.. Nature 368: 856-859 (1994); Morrison, Nature 368: 812-13 (1994); Fish- wild i wsp.. Nature Biotechnology 14: 845-51 (1996); Neuberger, Nature Biotechnology 14: 826 (1996); Lonberg i Huszar, Intern. Rev. Immunol. 13: 65-93 (1995). Przeciwcia la mog a równie z by c doprowadzone do dojrza lo sci pod wzgl edem powinowactwa przy pomocy znanych sposobów selekcji i/lub mutagenezy, jak to opisano powy zej. Zalecane, dojrza le pod wzgl edem powinowactwa przeciwcia la maj a powinowactwo pi eciokrotnie, zw laszcza dziesi ecio- krotnie, w szczególno sci 20 lub 30 razy wy zsze ni z wyj sciowe przeciwcia lo (zazwyczaj mysie, humani- zowane lub ludzkie), z którego dojrza le przeciwcia lo jest wytworzone. iv. Przeciwcia la biswoiste. Przeciwcia la biswoiste s a monoklonalnymi, zw laszcza ludzkimi lub humanizowanymi przeciw- cia lami o swoisto sci wi azania wzgl edem przynajmniej dwóch ró znych antygenów. W obecnym przy- padku jedna swoisto sc wi azania mo ze by c wzgl edem polipeptydu tu opisanego, a druga wzgl edem jakiegokolwiek innego antygenu, a zw laszcza bia lka powierzchniowego komórki albo receptora lub podjednostki receptora. Sposoby wytwarzania przeciwcia l biswoistych s a dobrze znane w tej dziedzinie. Tradycyjnie, wytwarzanie przeciwcia l biswoistych poprzez rekombinowanie jest oparte na wspó lekspresji dwóch par la ncuch ciezki/ la ncuch lekki immunoglobuliny, gdzie dwa la ncuchy ciezkie posiadaj a ró zn a swo- isto sc (Milstein i Cuello, Nature, 305: 537-539 [1983]). Z uwagi na losowy dobór ciezkich i lekkich lan- cuchów immunoglobuliny hybrydomy te (kwadromy) wytwarzaj a potencjalnie mieszanin e dziesi eciu ró znych cz asteczek przeciwcia l, z których jedynie jedna posiada prawid low a, biswoist a struktur e. Oczyszczanie prawid lowej cz asteczki jest osi agane zazwyczaj przez etapy chromatografii powinowac- twa. Podobne procedury s a ujawnione w WO 93/08829, opublikowanym 13 maja 1993 oraz w Trau- necker i wsp., EMBO J., 10: 3655-3659 (1991). Domeny zmienne przeciwcia l o pozadanych swoisto sciach wi azania (miejsca laczenia przeciw- cia lo-antygen) mog a by c laczone z sekwencjami domeny sta lej immunoglobuliny. Zalecana fuzja uzy- skana jest z domen a sta la ciezkiego la ncucha immunoglobuliny, zawieraj ac a przynajmniej cz esc re- gionów zawiasowego CH2 i CH3. Zalecane jest, aby przynajmniej w jednej fuzji obecny by l pierwszy region sta ly la ncucha ciezkiego (CH1) zawieraj acy miejsce niezb edne dla wi azania la ncucha lekkiego. DNA koduj ace fuzje lancucha ciezkiego immunoglobuliny i, je sli to po zadane, lancucha lekkiego im- munoglobuliny, wstawia si e do oddzielnych wektorów ekspresyjnych i wspó ltransfekuje si e do dogod- nego organizmu gospodarza. Dla dalszych szczegó lów wytwarzania przeciwcia l biswoistych patrz przyk ladowo Suresh i wsp., Methods in Enzymology, 121: 210 (1986). Zgodnie z kolejnym podej sciem opisanym w WO 96/27011 styk pomi edzy par a cz asteczek przeciwcia la mo ze by c przebudowany dla zmaksymalizowania procentu heterodimerów odzyskiwa- nych z hodowli rekombinowanych komórek. Zalecany styk zawiera przynajmniej cz esc regionu CH3 domeny sta lej przeciwcia la. W sposobie tym jeden lub wi ecej ma lych la ncuchów bocznych aminokwa- sów tworz acych styk z pierwszej cz asteczki przeciwcia la jest zast apionych wi ekszymi la ncuchami bocznymi (np. tyrozyn a lub tryptofanem). Na styku, w cz asteczce drugiego przeciwcia la tworz a si e kompensuj ace „zag lebienia" o identycznej lub podobnej wielko sci, co du zy(e) la ncuch(y) boczne przez zast apienie du zych lancuchów bocznych aminokwasów, ma lymi (np. alanin a lub treonin a). Dostarcza to mechanizmu zwi ekszania wydajno sci tworzenia heterodimerów wzgl edem innych niepo zadanych produktów ko ncowych, takich jak homodimery.PL 206 846 B1 47 Przeciwcia la biswoiste mo zna wytworzy c, jako pe lnej d lugo sci przeciwcia la lub fragmenty prze- ciwcia la (np. biswoiste przeciwcia la F(ab') 2 ). Techniki wytwarzania biswoistych przeciwcia l z fragmen- tów przeciwcia l zosta ly opisane w pi smiennictwie. Przyk ladowo, biswoiste przeciwcia la mog a by c przygotowane przez wi azanie chemiczne. Brennah i wsp., Science 229: 81 (1985) opisuje procedur e, w której nienaruszone przeciwcia la s a ci ete proteolitycznie w celu wytworzenia fragmentów F(ab') 2 . Fragmenty te poddaje si e redukcji w obecno sci arsenianu sodu b ed acego czynnikiem kompleksuj a- cym ditiol dla stabilizowania s asiednich ditioli i zapobiegania tworzeniu mi edzycz asteczkowych most- ków dwusiarczkowych. Wytworzone fragmenty Fab' s a nast epnie przekszta lcane do pochodnych tioni- trobenzoesanu (TNB). Jeden z wytworzonych fragmentów Fab' jest nast epnie przekszta lcany do po- chodnych tionitrobenzoesanu (TNB). Jedna z pochodnych Fab'-TNB jest nast epnie ponownie prze- kszta lcana do Fab'-tiol przez redukcj e merkaptoetyloamin a i jest mieszana w równomolarnych ilo- sciach z inn a pochodn a Fab'-TNB, tworz ac przeciwcia lo biswoiste. Wytworzone biswoiste przeciwcia la mog a by c u zyte, jako czynniki do wybiórczego unieruchamiania enzymów. Fragmenty Fab' mog a by c bezpo srednio odzyskane z E. coli i zwi azane chemicznie tworz ac przeciwcia la biswoiste. Shalaby i wsp., J. Exp. Med. 175: 217-225 (1992) opisa l wytwarzanie cz a- steczki w pe lni humanizowanego biswoistego przeciwcia la F(ab') 2 . Ka zdy fragment Fab' by l oddzielnie wydzielany z E. coli i poddany bezpo sredniemu chemicznemu wi azaniu in vitro, tworz ac przeciwcia lo biswoiste. Tak utworzone przeciwcia lo biswoiste by lo zdolne do wi azania si e z komórkami z nadeks- presj a receptora ErbB2 i prawid lowymi ludzkimi komórkami T, jak równie z wyzwala c aktywno sc litycz- n a ludzkich limfocytów cytotoksycznych przeciw celom w ludzkim nowotworze sutka. Znane s a ró zne techniki wytwarzania i izolacji fragmentów biswoistego przeciwcia la bezpo sred- nio z hodowli rekombinowanych komórek. Przyk ladowo, biswoiste przeciwcia la s a wytwarzane z za- stosowaniem suwaków leucynowych. Kostelny i wsp., J. Immunol. 148(5): 1547-1553 (1992). Peptydy suwaka leucynowego z bia lek Fos i Jun s a przy laczane do cz esci Fab' dwóch ró znych przeciwcia l przez fuzj e genow a. Homodimery przeciwcia l redukuje si e w regionie zawiasu tworz ac monomery, a nast epnie ponownie utlenia tworz ac heterodimery przeciwcia la. Sposób ten mo ze równie z by c wyko- rzystany do wytwarzania homodimerów przeciwcia l. Technologia „diacia la” opisana przez Hollinger i wsp., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448 (1993) dostarcza alternatywnego mechanizmu spo- rz adzania biswoistych fragmentów przeciwcia l. Fragmenty te zawieraj a domen e zmienn a lancucha ciezkiego (VH) polaczon a z domen a zmienn a la ncucha lekkiego (VL) przez lacznik, który jest 3 zbyt krótki, aby umo zliwia l parowanie dwóch domen tego samego la ncucha. Zgodnie z tym, domeny VH i VL jednego fragmentu s a zmuszone do parowania z domenami VL i VH innego fragmentu, co za tym idzie tworz a dwa miejsca wi azania antygenu. Doniesiono równie z o innej strategii wytwarzania biswo- istych fragmentów przeciwcia l poprzez zastosowanie dimerów pojedynczego lancucha Fv (sFv). Patrz, Gruger i wsp., J. Immunol. 152: 5368 (1994). Rozwa zane s a przeciwcia la o wi ecej ni z dwóch warto- sciowo sciach. Przyk ladowo, przygotowane mog a by c przeciwcia la SO trójswoiste. Tutt i wsp., J. Im- munol. 147: 60 (1991). Przyk ladowe przeciwcia la biswoiste mog a wi aza c si e do dwóch ró znych epitopów na danym po- lipeptydzie TCCR. Alternatywnie, rami e przeciwko polipeptydowi TCCR mo ze by c polaczone z ramie- niem wiaz acym cz asteczk e wyzwalaj ac a na leukocycie, tak a jak cz asteczka receptora komórki T (np. CD2, CD3, Cd28 lub B7) lub receptory Fc z IgG (Fc ?R), takie jak Fc ?RI (CD64), Fc ?RII (CD32) i Fc ?RIII (CD16) , tak aby ogniskowa c komórkowe mechanizmy obronne na komórce wyra zaj acej ko- kretny polipeptyd TCCR. Przeciwcia la biswoiste mog a by c równie z stosowane do lokalizacji czynników cytotoksycznych w komórkach wyra zaj acych konkretny polipeptyd TCCR. Przeciwcia la te posiadaj a rami e wiaz ace TCCR i rami e wiaz ace czynnik cytotoksyczny lub chelatuj acy radioaktywny nukleotyd, taki jak EOTUBE, DPTA, DOTA lub TETA. Inne biswoiste przeciwcia lo b ed ace przedmiotem zaintere- sowania wiaze polipeptyd TCCR i ponadto wiaze czynnik tkankowy (TF). v. Heterokoniugaty przeciwcia l. Heterokoniugaty przeciwcia l s a zbudowane z dwóch, kowalencyjnie zbudowanych przeciwcia l. Takie przeciwcia la przyk ladowo zaproponowano dla adresowania komórek uk ladu immunologicznego do niepo zadanych komórek [patent USA nr 4,676,980] i dla leczenia infekcji HIV [WO 91/00360; WO 92/200373; EP 03089]. Jest rozwa zane, aby przeciwcia la mog ly by c przygotowane in vitro przy zasto- sowaniu znanych sposobów chemicznej syntezy bia lka, w lacznie z tymi wymagaj acymi czynników sieciuj acych. Przyk ladowo, immunotoksyny mog a by c skonstruowane przy pomocy reakcji wymiany dwusiarczków lub przez utworzenie wi azania tioeterowego. Przyk lady u zytecznych dla tych celówPL 206 846 B1 48 odczynników obejmuj a iminotiolany i imidy metylo-4-merkaptobutymidanowe i te, które ujawniono przyk ladowo w patencie US nr 4,676,980. vi. Przebudowa funkcji efektorowej. Mo ze by c po zadanym zmodyfikowanie przeciwcia la tu opisanego pod wzgl edem funkcji efekto- rowej tak, aby zwi ekszy c skuteczno sc przeciwcia la, przyk ladowo, w leczeniu choroby zwi azanej z odporno sci a. Przyk ladowo mo zna wprowadzi c do obszaru Fc reszt e(y) cysteinow a pozwalaj ac na utworzenie w tym rejonie wi azania dwusiarczkowego pomiedzy la ncuchami. Tak wytworzone homo- dimery przeciwcia l mog a mie c zwi ekszon a zdolno sc do internalizacji i/lub wykazywa c zwi ekszone zabijanie komórek za po srednictwem dope lniacza i cytotoksycznosc komórkow a zale zn a od przeciw- cia la (ADCC). Patrz Caron i wsp., J. Exp. Med. 176: 1191-1195 (1992) i Shopes B. J. Immunol. 148:2918-2922 (1992). Homodimery przeciwcia la o zwi ekszonej aktywno sci przeciwnowotworowej mog a równie z by c wytworzone przy pomocy heterobifunkcjonalnych laczników sieciuj acych, jakie opisano w Wolff i wsp., Cancer Research 53: 2560-2565 (1993). Alternatywnie, przeciwcia lo mo ze by c tak przebudowane, ze posiada dwa rejony Fc i co za tym idzie wykazuje zwi ekszone zdolno sci do lizy zale znej od dope lniacza i ADCC. Patrz Stevenson i wsp., Anti-cancer Drug Design 3: 219-230 (1989). vii. Immunokoniugaty. Zgodnie z wynalazkiem opisano równie z immunokoniugaty obejmuj ace przeciwcia la skoniugo- wane z czynnikiem cytotoksycznym, takim jak czynnik chemioterapeutyczny, O toksyna (np. enzyma- tycznie aktywna toksyna pochodz aca z bakterii, grzyba, ro sliny lub zwierz ecia lub jej fragment) lub radioaktywny izotop (tj. radiokoniugat). Czynniki chemioterapeutyczne u zyteczne do wytworzenia takich immunokoniugatów opisano powy zej. Enzymatycznie aktywne toksyny i ich fragmenty, które mog a by c u zyte obejmuj a lancuch A b lonicy, niewi azace aktywne fragmenty toksyny b lonicy, lancuch A egzotoksyny (z Pseudomonas ae- ruginosa), la ncuch A rycyny, lancuch A abryny, lancuch A modekiny, alfa-sarcyn e, bia lka Aleurites fordii, bia lka diantyny, bia lka Phylolaca americana (PAPI, PAPU i PAP-S), inhibitor z Momordica cha- rantia, kurcyn e, krotyn e, inhibitor z Sapaonaria officinalis, zelonin e, mito zelin e, restryktocyn e, fenomy- cyn e, enomycyn e i trikotekeny. Do wytwarzania przeciwcia l z przy laczonym izotopem promieniotwór- czym dost epne s a ró zne radionuklidy. Przyk ladami s a 212 Bl, 131 l, 131 In, i 186 Re. Koniugaty przeciwcia la i czynnika cytotoksycznego wytwarza si e z wykorzystaniem ró znych bi- funkcjonalnych czynników lacz acych bialka, takich jak N-sukcynylimidylo-3-(2-pirydyditiolo)propionian (SPDP), iminotiolan (IT), bifunkcjonalnych pochodnych imidoestrów (takich jak imid dimetyloadypino- wy HCl), aktywnych estrów (takich jak suberynian disukcynyloimidylowy), aldehydów (takich jak alde- hyd glutarowy), zwi azków bis-azydowych (takich jak bis (p-azydobenzylo)heksanodiamina), pochod- nych bis-diazoniowych (takich jak bis-(p-diazoniobenzylo)etylenodiamina), diizocyjanianów (takich jak tolueno2,6-diizocyjanian), zwi azków bisaktywnego fluoru (takich jak 1,5-difluoro-2,4-dinitrobenzen). Przyk ladowo, immunotoksyczna rycyna mo ze by c przygotowana jak to opisano w Vitetta i wsp., Science 238: 1098 (1987). Wyznakowany 14 C kwas 1-izotiocyjanobenzylo-3-metylodietylenotriamino- pentaoctowy (MX-DTPA) jest przyk ladem czynnika chelatuj acego dla koniugacji radioaktywnego nu- kleotydu z przeciwcia lem. Patrz WO 94/11026. W innym wykonaniu przeciwcia lo mo ze by c skoniugowane z „receptorem” (takim jak streptawi- dyna) w celu wykorzystania do wst epnego kierowania do tkanki, gdzie koniugat przeciwcia lo-receptor podaje si e pacjentowi, nast epnie z kr azenia usuwa si e niezwi azany koniugat przy pomocy czynnika usuwaj acego, a nast epnie podaje si e „ligand” (np. awidyn e), który jest skoniugowany z czynnikiem cytotoksycznym (np. radioaktywnym nukleotydem). viii. Immunoliposomy. Bia lka, przeciwcia la, itp., które tu ujawniono mog a by c sporz adzone, jako immunoliposomy. Li- posomy zawieraj ace przeciwcia lo s a przygotowane sposobami znanymi w tej dziedzinie tak, jak to opisano w Epstein i wsp.. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 3688 (1985); Hwang i wsp.. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77: 4030 (1980) i patentach USA nr 4,485,045 i 4,544,545. Liposomy o wyd lu zonym czasie krazenia s a ujawnione w patencie USA nr 5,013,556. Szczególnie u zyteczne liposomy mog a by c wytworzone sposobem odparowania na odwróconej fazie przy zastosowaniu kompozycji lipidowej zawieraj acej fosfatydylocholin e, cholesterol i pochodne fosfatydyloetanolaminowe PEG (PEG-PE). Liposomy przepuszcza si e przez filtry o okre slonej wielko- sci porów, co daje liposomy o po zadanej srednicy. Fragmenty Fab' przeciwcia la tu opisane moga by c skoniugowane z liposomami jak to opisano w Martin i wsp., J. Biol. Chem. 257: 286-288 (1982) po-PL 206 846 B1 49 przez reakcj e wymiany dwusiarczku. W liposomie mo ze by c warunkowo zawarty czynnik chemiotera- peutyczny (taki jak doksorubicyna). Patrz Gabizon i wsp., J. National Cancer Inst. 81(19):1484 (1989). ix. Zastosowania przeciwcia l anty-TCCR. Przeciwcia la anty-TCCR tu opisane maj a ró zne zastosowania. Przyk ladowo, przeciwcia la anty- TCCR mog a by c stosowane w testach diagnostycznych dla TCCR, np. wykrywaniu jego ekspresji w konkretnych komórkach, tkankach lub surowicy. Mo zna zastosowa c ró zne, znane w tej dziedzinie techniki testów diagnostycznych, takie jak testy kompetycyjnego wi azania, bezpo srednie lub po sred- nie testy kanapkowe i testy immunoprecypitacji przeprowadzane zarówno w fazach heterogennych jak i homogennych [Zola, Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques, CRC Press, Inc. (1987) str. 147-158]. Przeciwcia la stosowane w testach diagnostycznych mog a by c wyznakowane wykrywaln a cz asteczk a. Wykrywalna cz asteczka powinna by c zdolna do wytworzenia zarówno bezpo srednio, jak i po srednio, wykrywalnego sygna lu. Przyk ladowo, wykrywalna cz asteczka mo ze by c izotopem pro- mieniotwórczym takim jak 3 H, 14 C, 32 P, 35 S lub 125 I, zwi azkiem fluorescencyjnym lub chemilumine- scencyjnym, takim jak izocyjanian fluoresceiny, rodamina lub lucyferyna lub enzymem, takim jak fosfataza alkaliczna, beta-galaktozydaza lub peroksydaza z chrzanu. Mo zna zastosowa c jakikolwiek znany w tej dziedzinie sposób koniugowania przeciwcia la z mo zliw a do wykrycia cz asteczk a, w lacz- nie ze sposobami opisanymi przez Hunter i wsp., Nature 144:945 (1962); David i wsp. Biochemistry 13: 1014 (1974); Pain i wsp., J. Immunol. Meth. 40: 219 (1981) i Nygren, J. Histochem. Cytochem. 30: 407 (1982). Przeciwcia la anty-TCCR s a równie z u zyteczne do oczyszczania przez powinowactwo TCCR z hodowli rekombinowanej komórki lub zróde l naturalnych. W procesie tym przeciwcia la anty-TCCR s a unieruchamiane na odpowiednich z lo zach, takich jak zywica Sephadex lub bibula filtracyjna, sposo- bami dobrze znanymi w tej dziedzinie. Nast epnie doprowadza si e do kontaktu unieruchomionego przeciwcia la z próbk a zawieraj ac a TCCR, który ma by c oczyszczany, a nast epnie z lo ze jest p lukane odpowiednim rozpuszczalnikiem usuwaj acym zasadniczo ca ly materia l próbki, z wyj atkiem TCCR, który jest zwi azany z unieruchomionym przeciwcia lem. Ostatecznie z lo ze jest p lukane kolejnym od- powiednim rozpuszczalnikiem uwalniaj acym TCCR od przeciwcia la. 10. Kompozycje farmaceutyczne. Aktywne cz asteczki tu opisane, polipeptydy i przeciwcia la, jak równie z inne cz asteczki zidentyfi- kowane ujawnionymi powyzej testami przesiewowymi, mog a by c podawane w celu leczenia chorób zwi azanych z odporno sci a w postaci kompozycji farmaceutycznych. Do nacelowania wewn atrzkomórkowej cz esci TCCR lub do nacelowania TCCR, gdy ju z wyst e- puje on w komórce, u zyte mog a by c przeciwcia la internalizuj ace. Ponadto mo zna równie z zastosowa c lipofekcj e lub liposomy do dostarczania przeciwcia la lub fragmentu przeciwcia la do komórek. Gdy u zywa si e fragmentów przeciwcia l, to zalecane jest zastosowanie najmniejszego inhibitorowego frag- mentu, który swoi scie wiaze si e z domen a wiaz ac a docelowego bia lka. Przyk ladowo, opieraj ac si e na sekwencji regionu zmiennego przeciwcia la mo zna zaprojektowa c cz asteczki peptydu, które zachowa ly zdolno sc do wi azania sekwencji docelowego bia lka. Takie pep- tydy mog a by c zsyntetyzowane chemicznie i/lub wytworzone sposobami rekombinowania DNA. Patrz np. Marasco i wsp. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 7889-7893 (1993). Terapeutyczne kompozycje aktywnej cz asteczki, w szczególno sci polipeptyd lub przeciwcia lo tu opisane, przygotowuje si e do przechowywania przez mieszanie aktywnej cz asteczki o po zadanym stopniu czysto sci z ewentualnymi, farmaceutycznie dopuszczalnymi nosnikami, zarobkami lub sub- stancjami stabilizuj acymi (Remington's Pharmaceutical Sciences wyd. 16 Osol., A. wyd. [1980]), w postaci zliofilizowanej lub w roztworach wodnych. Dopuszczalne no sniki, zarobki lub substancje stabilizujace s a nietoksyczne dla biorcy w stosowanych dawkach i st ezeniach i zawieraj a bufory, takie jak fosforanowy, cytrynianowy i oparty na innych kwasach organicznych; przeciwutleniacze, w lacznie z kwasem askorbinowym i metionina; srodki konserwuj ace (takie jak chlorek amonowy oktadecylodi- metylobezylu; chlorek heksametoniowy, chlorek benzalkoniowy, chlorek benzetonu; fenol, butyl lub alkohol benzylowy; alkilowe parabeny, takie jak paraben metylowy lub propylowy, katechol; rezorcy- nol; cykloheksanol; 3-pantanol i m-krezol); niskocz asteczkowe (mniej ni z oko lo 10 aminokwasów) polipeptydy; bia lka, takie jak albumina surowicy, zelatyna lub immunoglobuliny; hydrofilowe polimery, takie jak poliwinylopirolidon; aminokwasy, takie jak glicyna, glutamina, asparagina, histydyna, arginina lub lizyna; monosacharydy, disacharydy i inne w eglowodany w lacznie z glukoz a, mannoz a lub dek- strynami; czynniki chelatuj ace, takie jak EDTA; cukry, takie jak sacharoza, mannitol, treheloza lub sorbitol; sole tworz ace przeciwjony dodatnie, takie jak sód; kompleksy metalu (np. kompleksy Zn-PL 206 846 B1 50 bia lko); i/lub niejonowe substancje powierzchniowo czynne, takie jak TWEEN™, PLURONICS™ lub glikol polietylenowy (PEG). Zwi azki zidentyfikowane poprzez testy przesiewowe tu opisane mog a by c przygotowane w ana- logiczny sposób przy zastosowaniu typowych technik, dobrze znanych w tej dziedzinie. Przedstawione tu preparaty postaci mog a równie z zawiera c wi ecej ni z jeden zwi azek aktywny, je sli jest to konieczne przy konkretnych wskazaniach przy leczeniu, zw laszcza takie, które posiadaj a dope lniaj ace aktywno sci i nie wp lywaj a na siebie negatywnie. Alternatywnie lub dodatkowo kompozy- cja mo ze zawiera c czynnik cytotoksyczny, cytokin e lub czynnik hamuj acy wzrost. Takie cz asteczki powinny by c obecne w kompozycji w ilo sciach skutecznych dla za lozonego celu. Aktywne cz asteczki mog a by c równie z zamkni ete w mikrokapsu lkach przygotowanych przyk la- dowo technikami koacerwacji lub mi edzyfazowej polimeryzacji, na przyk lad odpowiednio, mikrokap- su lki hydroksymetylocelulozowe lub zelatynowe i mikrokapsu lki z poli-(metylometakrylanu), w syste- mach dostarczania leku w postaci koloidalnej (przyk ladowo liposomy, mikrokulki albuminowe, mikro- emulsje, nanocz asteczki i nanokapsu lki) lub jako makroemulsje. Takie techniki s a ujawnione w Re- mington's Pharmaceutical Sciences wyd. 16, Osol. A. wyd. (1980). Kompozycje do zastosowania do podawania in vivo musz a by c ja lowe. Jest to latwe do osi a- gni ecia przez filtrowanie przez ja lowe bibu ly filtracyjne. Mo zna wytworzy c kompozycje o przed lu zonym uwalnianiu. Odpowiednie przyk lady podlozy do przed lu zonego uwalniania obejmuj a pó lprzepuszczalne z lo za ze sta lych hydrofobowych polimerów zawieraj acych przeciwcia lo, gdzie z lo za s a w postaci ukszta ltowanych artyku lów np. b lon lub mikro- kapsu lek. Przyk lady z ló z do przed lu zonego uwalniania obejmuj a poliestry, hydro zele (przyk ladowo poli(2-hydroksyetylometakrylan) lub alkohol poliwinylowy), polimleczany (patent USA nr 3,773,919), kopolimery kwasu L-glutaminowego, ? etylo-L-glutamin e, nieulegaj acy degradacji octan etyleno- winylowy, ulegaj acy degradacji kopolimer kwasu mlekowego i kwasu glikolowego, taki jak LUPRON DEPOT™ (nadaj ace si e do wstrzykni ecia mikrokulek zbudowanych z kopolimeru kwas mlekowy-kwas winylowy i octanu leuprolidowego) oraz kwas poli-D-(-)-3-hydroksymas lowy. Podczas gdy polimery, takie jak octan etyleno-winylu i kwas mlekowy-kwas glikolowy zapewniaj a uwalnianie cz asteczki przez ponad 100 dni, okre slone hydro zele uwalniaj a bia lka przez krótsze okresy czasu. Gdy zamkni ete w kapsu lki przeciwcia la pozostaj a w ciele przez czas d lu zszy, to mog a denaturowa c lub agregowa c w wyniku ekspozycji na wilgo c w 37°C, co prowadzi do utraty aktywno sci biologicznej i mo zliwych zmian immunogenno sci. Mo zna opracowa c racjonalne strategie dla stabilizacji zale znie od mechani- zmu w to zaanga zowanego. Przyk ladowo, je zeli odkryto, ze mechanizm agregowania jest zwi azany z tworzeniem mi edzycz asteczkowego wi azania S-S za po srednictwem wewn etrznej wymiany tio- dwusiarczkowej, stabilizacja mo ze by c osi agni eta przez modyfikowanie reszt sulfhydrylowych, liofiliza- cje z kwa snych roztworów, kontrolowanie zawartej wilgoci, stosowanie odpowiednich dodatków i opracowanie specyficznych kompozycji pod lo za polimerowego. 11. Sposoby leczenia. Rozwa zane jest, ze polipeptydy, przeciwcia la i inne aktywne zwi azki tu opisane mo zna stoso- wa c do leczenia ró znych chorób i stanów zwi azanych z oporno scia, takich jak choroby z udzia lem komórek T, obejmuj ace te, które cechuj a si e naciekaniem komórek zapalnych do tkanki, pobudzeniem proliferacji komórek T, hamowaniem proliferacji komórek T, zwi ekszeniem lub zmniejszeniem prze- puszczalno sci naczy n lub jego zahamowaniem. Przyk ladowe stany lub choroby, które mo zna b edzie leczy c polipeptydami, antybiotykami lub in- nymi zwi azkami tu opisanymi obejmuj a, lecz bez ograniczenia, uk ladowy tocze n rumieniowaty, reuma- toidalne zapalenie stawów, m lodzie ncze przewlek le zapalenie stawów, choroby kr egów i stawów, stwardnienie uk ladowe (twardzina skóry), pierwotn a miopati e ze stanem zapalnym (zapalenie skórno- mi esniowe, zapalenie wielomi esniowe), zespó l Sjögrena, uk ladowe sarkoidalne zapalenie naczy n, autoimmunologiczna anemi e hemolityczn a (immunologiczna niedokrwistosc aplastyczn a, napadowa nocna hemoglobinuria), autoimmunologiczna ma lop lytkowo sc (idiopatyczn a plamica ma lop lytkowa, immuno-zale zna ma lop lytkowo sc), zapalenie tarczycy (choroba Gravesa, zapalenie tarczycy typu Hashimoto, m lodociane limfocytarne zapalenie tarczycy, zanikowe zapalenie tarczycy), cukrzyc e, immunozale zn a chorob e nerek (zapalenie k lebuszków nerkowych, sródmiazszowe zapalenie nerki), choroby z demielinizacj a nerwów centralnego i obwodowego uk ladu nerwowego, takie jak stwardnienie rozsiane, polineuropati e z idiopatyczn a demielinizacj a lub zespó l Guillain-Barre i przewlek la polineu- ropatia z idiopatyczn a demielinizacj a, choroby w atroby i woreczka zó lciowego, takie jak zaka zne za- palenie w atroby (zapalenie w atroby A, B, C, D, E i powodowane przez nie hepatotropowe wirusy),PL 206 846 B1 51 autoimmunologiczne przewlek le aktywne zapalenie watroby, pierwotn a marsko sc w atroby, ziarninia- kowate zapalenie w atroby i stwardniaj ace zapalenie dróg zó lciowych, choroby z zapaleniem jelita (wrzodziej ace zapalenie okr eznicy: choroba Crohna), enteropati e z wra zliwo sci a na gluten i chorob e Whipple'a, autoimmunologiczne lub immunozale zne choroby skóry, w lacznie z chorobami skóry z p echerzami, rumieniem wielopostaciowym, luszczyc a, choroby alergiczne, takie jak astma, alergicz- ne zapalenie b lony sluzowej nosa, atopowe zapalenie skóry, nadwra zliwo sc na pokarm i pokrzywk e, choroby immunologiczne p luc, takie jak eozynofilne zapalenie p luc, idiopatyczne zw lóknienie p luc i zapalenie p luc z nadwra zliwo sci a, choroby zwi azane z przeszczepem obejmuj ace odrzucenie prze- szczepu i chorob e przeszczep przeciwko gospodarzowi. W uk ladowym toczniu rumieniowatym g lów- nym po srednikiem choroby jest wytwarzanie autoreaktywnych przeciwcia l przeciw w lasnym bia l- kom/tkankom, a nast epnie wytworzenie immunozale znego stanu zapalnego. Przeciwcia la b ad z bez- po srednio b ad z po srednio uczestnicz a w uszkodzeniu tkanki. Cho c nie wykazano, aby limfocyty T uczestniczy ly bezpo srednio w zniszczeniu tkanki, to limfocyty T s a wymagane dla wykszta lcenia auto- reaktywnych przeciwcia l. Pochodzenie tej choroby jest, wi ec zale zne od limfocytów T. Wiele organów i uk ladów jest dotkni etych objawami klinicznymi, w lacznie z nerkami, p lucami, uk ladem miesniowo- szkieletowym, sluzówk a i skór a, oczami, centralnym uk ladem nerwowym, systemem naczyniowo- krwiono snym, uk ladem pokarmowym, szpikiem kostnym i krwi a. Reumatoidalne zapalenie stawów (RA) jest przewlekla, uk ladow a autoimmunologiczna chorob a zapaln a, która g lównie dotyka b lony maziowej wielu stawów, co powoduje uszkodzenie chrz astki sta- wowej. Patogeneza zale zy od limfocytów T i jest zwi azana z wytwarzaniem czynników reumatoidal- nych, autoprzeciwcia l skierowanych przeciw w lasnym IgG i w rezultacie utworzeniu kompleksów im- munologicznych wyst epuj acych w du zych ilo sciach w p lynie stawowym i we krwi. Kompleksy te w stawie mog a indukowa c znacz ace naciekanie limfocytów i monocytów do b lony maziówkowej i w konsekwencji jej istotne zmiany; przestrze n/p lyn stawowy jest naciekany przez podobne komórki, z dodatkiem licznych komórek oboj etnoch lonnych. Zaburzonymi tkankami s a g lównie stawy, cz esto w sposób symetryczny. Jednak, czesto wyst epuje równie z w dwóch postaciach choroba dotycz aca elementów poza chrzestnych. Jedn a postaci a jest powstawanie poza stawowych ubytków z post epu- jac a chorob a stawów i typowymi uszkodzeniami ze zw lóknieniem p luc, zapaleniem naczy n i owrzo- dzeniem skóry. Druga posta c choroby poza stawowej to tzw. zespó l Felty'ego wyst epuj acy pó zno w rozwoju RA, czasem po wyciszeniu choroby stawów, i objawia si e wyst epowaniem neutropenii, ma lop lytkowo sci i powi ekszeniem sledziony. Mo ze temu towarzyszy c zapalenie naczy n w wielu orga- nach z powstaniem martwicy niedokrwiennej, owrzodzenia skóry i gangreny. U pacjentów równie z cz esto pojawiaj a si e guzki reumatoidalne w tkance podskórnej otaczaj acej dotkni ete stawy; w pó znym stadium guzki posiadaja centra martwicze otoczone przez naciek mieszaniny komórek zapalnych. Inne objawy, które mog a wyst epowa c w RA obejmuj a: zapalenie osierdzia, zapalenie op lucnej, zapa- lenie naczy n wie ncowych, zapalenie p luc ze zw lóknieniem p luc, suche zapalenie rogówki i spojówki oraz guzki reumatoidalne. M lodociane, przewlek le zapalenie stawów jest przewlek la, idiopatyczn a chorob a zapaln a, poja- wiaj ac a si e cz esto przed 16 rokiem zycia. Objawy s a podobne jak w RA; niektórzy pacjenci o dodat- nim czynniku reumatoidalnym s a klasyfikowani, jako chorzy na m lodociane, reumatoidalne zapalenie stawów. Choroba ta jest podzielona na trzy g lówne kategorie: dotycz ace niektórych stawów, wielu stawów i uk ladowa. Zapalenie stawów mo ze by c ostre i typowo jest niszcz ace i prowadzi do usztyw- nienia stawów i zahamowania wzrostu. Inne objawy obejmuj a przewlek le zapalenie b lony naczyniowej przedniego odcinka oka i ogóln a amyloidoz e. Choroby stawów kr egos lupa to grupa chorób o pewnych wspólnych cechach klinicznych i po- wi azaniu z ekspresj a produktu genu HLA-B27. Choroby obejmuj a: zesztywniaj ace zapalenie stawów kr egos lupa, zespó l Reitera (reaktywne zapalenie stawów), zapalenie stawów zwi azane z chorob a zapaln a jelita, zapalenie kr egos lupa stowarzyszone z luszczyc a, m lodociany zespó l zapalenia stawów kr egos lupa i D niezró znicowane zapalenie stawów kr egos lupa. Wyró zniaj ace cechy obejmuj a zapale- nie stawów krzy zowo-biodrowych z lub bez zapalenia kr egos lupa; niesymetryczne zapalenie stawów; zwi azek z HLA-B27 (serologicznie okre slony allel locus HLA-B klasy I MHC); zapalenie oka i brak autoprzeciwcia l zwi azanych z inna chorob a reumatoidaln a. Komórka najbardziej zaanga zowana, jako kluczowa w indukcji choroby to limfocyt T CD8+, komórka, której celem jest antygen prezentowany przez cz asteczki MHC klasy I. Komórki T CD8+ mog a reagowa c przeciw allelowi HLA-B27 MHC klasy I tak, jakby by l to obcy peptyd prezentowany przez cz asteczki MHC klasy I. Postawiono hipotez e, zePL 206 846 B1 52 epitop HLA-B27 mo ze na sladowa c bakteryjny lub z innego mikroorganizmu antygenowy epitop i tak indukowa c odpowied z komórek T CD8+. Stwardnienie uk ladowe (twardzina skóry) ma nieznan a etiologi e. Cech a charakterystyczn a tej choroby jest stwardnienie skóry; prawdopodobnie jest ono indukowane przez aktywny proces zapalny. Twardzina skóry mo ze by c umiejscowiona lub uk ladowa; powszechne s a zaniki naczy n, a uszkodze- nie komórek sródb lonka w naczyniach w losowatych jest wczesnym i wa znym zdarzeniem w rozwoju stwardnienia uk ladowego; w uszkodzeniu naczy n mo ze uczestniczy c uk lad immunologiczny. Podsta- w e immunologiczn a postuluje si e w zwi azku z obecno scia nacieków jednoj adrzastych komórek ku uszkodzeniach w skórze i wyst epowaniem u wielu pacjentów przeciwcia l anty-j adrowych. Poziom ICAM-1 zwi ekszony na powierzchni komórek fibroblastów wyst epuje cz esto w uszkodzeniach skór- nych, co sugeruje, ze oddzia lywanie komórek T z tymi komórkami mo ze odgrywa c rol e w patogenezie choroby. Inne, dotkni ete chorob a organy obejmuj a uk lad pokarmowy: zanik mi esni g ladkich i zw lók- nienie powoduj ace nieprawid low a perystaltyk e/ruchliwo sc; nerki: koncentryczna sródb lonkowa ukryta proliferacja dotykaj aca ma lych lukowych i wewn atrzzrazikowych naczy n, powoduj aca ograniczenie przep lywu krwi w korze nerki, prowadzi do bia lkomoczu, azotemii i nadci snienia; mi esnie szkieletowe: zanik, zw lóknienie sródmiazszowe, stan zapalny; p luca: sródmiazszowe zapalenie p luc i zw lóknienie sródmiazszowe; i serce: martwica w lókienek kurczliwych, bliznowacenie/zw lóknienie. Idiopatyczne miopatie zapalne obejmuj ace zapalenie skórno-miesniowe, zapalenie wielomi e- sniowe i inne s a przewlek lymi stanami zapalnymi mi esni o nieznanej etiologii prowadz acymi do s labo- sci miesni. Uszkodzenie mi esnia/stan zapalny jest cz esto symetryczne i post epuj ace. Autoprzeciwcia- la s a zwi azane z wi ekszo scia postaci. Te specyficzne dla zapalenia mi esni przeciwcia la s a skierowane przeciw i hamuj a funkcj e sk ladników syntezy bia lek i RNA uczestnicz acych w syntezie bia lka. Zespó l Sjögrena jest zwi azany ze stanem zapalnym z udzia lem uk ladu immunologicznego i pó zniejszym funkcjonalnym zniszczeniem gruczo lów lzowych i slinianek. Choroba mo ze by c zwi aza- na chorobami zapalnymi tkanki lacznej, lub im towarzyszy c. Choroba jest zwi azana z wytwarzaniem autoprzeciwcia l przeciw antygenom Ro i La, które oba s a kompleksami ma lymi RNA-bia lko. Uszkodze- nia powoduj a suche zapalenie rogówki i spojówki, sucho sc ust z innymi objawami towarzysz acymi, obejmuj acymi zó lciow a marsko sc w atroby, neuropati e obwodow a lub sensoryczn a i plamic e dotykow a. Uk ladowe zapalenie naczy n to choroby, w których pierwotne uszkodzenie jest stanem zapal- nym, a nast epuj ace potem uszkodzenie naczy n krwiono snych prowadzi do niedokrwienia/martwi- cy/degeneracji tkanek zaopatrywanych przez uszkodzone naczynia i ostatecznie w niektórych przy- padkach do niewydolno sci organu. Zapalenie naczy n mo ze równie z wyst epowa c, jako wtórne uszko- dzenie lub element innej choroby zale znej od stanu zapalnego z udzia lem uk ladu immunologicznego, takiej jak reumatoidalne zapalenie stawów, stwardnienie uk ladowe itp., szczególnie w chorobach zwi azanych równie z z powstawaniem kompleksów immunologicznych. Choroby w grupie pierwotnych, uk ladowych zapale n naczy n obejmuj a: uk ladowe martwicze zapalenie naczy n: zapalenie guzkowate t etnic, alergiczne zapalenie naczy n i ziarnic e, zapalenie wielonaczyniowe; ziarnic e Wagenera; ziarnic e limfoidaln a; i zapalenie naczy n z udzia lem komórek olbrzymich. Ró znorodne zapalenia naczy n obej- muja skórno- sluzówkowy zespó l w ez la ch lonnego (MLNS lub choroba Kawasaki), ograniczone zapa- lenie naczy n CNS, chorob e Beheta, zakrzepowo-zwyrodnieniowe zapalenie naczy n (choroba Buerge- ra) i skórne martwicze zapalenie naczy n. Mechanizm patogenezy wi ekszo sci zapale n naczy n typów podanych powy zej jest prawdopodobnie zwi azany przede wszystkim z odk ladaniem si e kompleksów immunoglobulinowych w scianach naczy n, a nast epnie indukcj e odpowiedzi zapalnej b ad z poprzez ADCC, aktywacj e dope lniacza b ad z obydwa. Sarkoidoza jest stanem o nieznanej etiologii, który cechuje si e wyst epowaniem ziarniaka na- b lonkowego prawie wszystkich tkanek cia la; najcz esciej w p lucach. Patogeneza obejmuje utrzymywa- nie si e aktywowanych makrofagów i komórek limfoidalnych w miejscach choroby z dalszymi przewle- k lymi konsekwencjami b ed acymi efektem miejscowego lub ogólnoustrojowego uwalniania aktywnych produktów uwalnianych przez te typy komórek. Autoimmunologiczna anemia hemolityczn a obejmuj aca autoimmunologiczna anemi e hemolitycz- n a, immunologiczn a niedokrwisto sc aplastyczn a i napadow a nocn a hemoglobinuri e jest wynikiem wy- twarzania przeciwcia l reaguj acych z antygenami prezentowanymi na powierzchni krwinek czerwonych (i w niektórych przypadkach innych komórek krwi, wlacznie z p lytkami krwi) i jest odbiciem usuwania komórek op laszczonych tymi przeciwcia lami poprzez liz e zale zn a od dope lniacza i/lub mechanizmy z udzia lem ADCC/Fc-receptor.PL 206 846 B1 53 W autoimmunologicznej ma lop lytkowo sci obejmuj acej plamic e ma lop lytkowa i ma lop lytkowo sc zale zn a od uk ladu immunologicznego w innych przypadkach klinicznych, nast epuje niszcze- nie/usuwanie p lytek krwi b ed ace wynikiem atakowania p lytek zarówno przez dope lniacz jak i przeciw- cia lo, a nast epnie usuwanie przez liz e z udzia lem dope lniacza, mechanizmy z udzia lem ADCC lub receptora Fc. Zapalenie tarczycy obejmuj ace chorob e Gravesa, zapalenie tarczycy Hashimoto, m lodociane lim- focytarne zapalenie tarczycy i zanikowe zapalenie tarczycy s a wynikiem autoimmunologicznej odpowie- dzi przeciw antygenom tarczycy z wytworzeniem przeciwcia l reaguj acych z bia lkami wyst epuj acymi i cz esto specyficznymi dla gruczo lu tarczycy. Istniej a modele do swiadczalne obejmuj ace modele spon- taniczne: szczurzy (szczury BUF i BB) i kury (szczep kur oty lych); modele indukowalne: immunizacja zwierz at b ad z tyroglobulin a, b ad z mikrosomalnym antygenem tarczycy (peroksydaza tarczycowa). Cukrzyca typu I lub cukrzyca insulinozale zn a jest autoimmunologicznym niszczeniem komórek P wysepek trzustkowych; w zniszczeniu tym uczestnicz a autoprzeciwcia la i autoreaktywne komórki T. Przeciwcia la przeciw insulinie lub receptorowi insuliny mog a równie z wytworzy c fenotyp niewra zliwo- sci na insulin e. Choroby nerek z udzia lem uk ladu immunologicznego obejmuj ace zapalenie k lebuszków nerko- wych i sródmi azszowe zapalenie nerek s a wynikiem uszkodzenia tkanki nerkowej z udzia lem przeciw- cia la lub limfocytów T b ad z bezpo sredniego, b ed acego wynikiem wytwarzania autoreaktywnych prze- ciwcia l lub komórek T przeciw antygenom nerki, b ad z po sredniego, jako wynik odk ladania si e w ner- kach przeciwcia l i/lub kompleksów immunologicznych, b ed acych wynikiem reakcji z innymi ni z nerko- we antygenami. Co za tym idzie inne choroby z udzia lem uk ladu immunologicznego b ed ace wynikiem tworzenia si e kompleksów odporno sciowych mog a równie z indukowa c chorob e nerek z udzia lem uk ladu immunologicznego, jako po srednie nast epstwo. Zarówno bezpo srednie jak i po srednie mecha- nizmy odporno sciowe wywo luj a odpowied z zapaln a, która wytwarza/indukuje powstawanie uszkodze n tkanek nerkowych powoduj ac niewydolnosc funkcjonaln a organu i w niektórych przypadkach prowadzi do niewydolno sci nerki. Zarówno humoralne, jak komórkowe mechanizmy odporno sciowe mog a uczestniczy c w patogenezie uszkodze n. Uwa za si e, ze choroby z demielinizacj a neuronów centralnego i obwodowego uk ladu nerwowe- go obejmuj ace stwardnienie rozsiane; idiopatyczna demielinizacj e polineuropatyczn a lub zespó l Guil- lain-Barre; oraz przewlek la polineuropati e z demielinizacj a i stanem zapalnym, posiadaj a podstaw e autoimmunologiczna i powoduj a demielinizacj e nerwu jako wynik uszkodzenia oligodendrocytów lub bezpo srednio mieliny. W przypadku MS istniej a dane sugeruj ace, ze indukcja choroby i jej post ep zale zy od limfocytów T. Stwardnienie rozsiane jest chorob a z demielinizacj a zale zn a od limfocytów T i posiadaj ac a zarówno przebieg z nawrotami jak i przewlek ly, post epuj acy. Etiologia jest nieznana, jednak bior a w niej udzia l takie czynniki jak infekcje wirusowe, predyspozycja genetyczna, srodowisko i czynnik autoimmunologiczny. Zmiany patologiczne obejmuj a nacieki g lównie z udzia lem limfocytów T, komórek mikrogleju i naciekaj acych makrofagów; limfocyty CD4+ T s a g lównymi komórkami w miej- scach uszkodzenia. Mechanizm smierci oligodendrocytów, a nast epnie demielinizacji nie jest znany, lecz przypuszczalnie jest kierowany przez limfocyty T. Zapalenie i zw lóknieniowa choroba p luc, obejmuj aca eozynofilne zapalenie p luc, idiopatyczne zw lóknienie p luc i zapalenie p luc z nadwra zliwo sci a, mog a by c zwi azane z rozregulowaniem immuno- logicznej odpowiedzi zapalnej. Hamowanie tej odpowiedzi mog loby by c terapeutycznie wskazane. Autoimmunologiczna lub zale zna od uk ladu immunologicznego choroba skóry, obejmuj aca p e- cherzow a chorob e skóry, rumie n wielopostaciowy i kontaktowe zapalenie skóry, jest zale zne od auto- przeciwcia l, których wytwarzanie jest zale zne od limfocytów T. Luszczyca jest chorob a zapaln a z udzia lem limfocytów T. Zmiany chorobowe zawieraj a nacieki z limfocytów T, makrofagów i komórek dokonuj acych obróbki antygenu oraz troch e komórek oboj etno- ch lonnych. Choroby alergiczne obejmuj ace astm e, alergiczne zapalenie b lony sluzowej nosa; atopowe za- palenie skóry, nadwra zliwo sc na pokarm i pokrzywk e zale za od limfocytów T. W chorobach tych uczestniczy g lównie stan zapalny indukowany przez limfocyty T, stan zapalny z udzia lem IgE lub kombinacja obu. Choroby zwi azane z przeszczepem, w lacznie z odrzuceniem przeszczepu i chorob e przeszczep przeciwko gospodarzowi (GVHD) zale za od limfocytów T. Zahamowanie funkcji limfocytów T dzia la lagodz aco.PL 206 846 B1 54 Inne choroby, w których interwencja odpowiedzi immunologicznej i/lub zapalnej jest wskazane obejmuj a, choroby zaka zne, w tym choroby wirusowe (obejmuj ace, lecz nieograniczone do takich jak AIDS, wirusowe zapalenia w atroby typu A, B, C, D i E, opryszczka itp.), infekcje bakteryjne, infekcje grzybowe oraz infekcje pierwotniacze i paso zytnicze (cz asteczki (lub pochodne/agoni sci) pobudzaj ace MLR mog a by c wykorzystane terapeutycznie w celu zwi ekszenia odpowiedzi immunologicznej przeciw czynnikom zaka znym), choroby zwi azane z niedoborem odporno sci (cz asteczki/pochodne, agoni sci) pobudzaj ace MLR mog a by c wykorzystane terapeutycznie w celu zwi ekszenia odpowiedzi immunolo- gicznej w przypadkach wrodzonego, nabytego, wywo lanego zara zeniem (takim jak infekcja HIV) lub jatrogennego (np. wynikaj acego z chemoterapii) niedoboru odporno sci) oraz nowotwory. Pokazano, ze u niektórych pacjentów z nowotworem rozwija si e odpowied z przeciwcia lowa i/lub z udzia lem limfocytów T przeciw antygenom na komórkach nowotworowych. W zwierz ecych modelach nowotworzenia pokazano równie z, ze wzmocnienie odpowiedzi immunologicznej mo ze powodowa c odrzucenie lub cofni ecie tego konkretnego nowotworu. Cz asteczki wzmacniaj ace odpowied z limfocy- tów T w MLR maj a zastosowanie in vivo dla wzmacniania odpowiedzi immunologicznej przeciw proce- som nowotworowym. Cz asteczki zwi ekszaj ace odpowied z proliferacyjn a limfocytów T w MLR (albo drobncz asteczkowi agoni sci lub przeciwcia la wp lywaj ace na ten sam receptor w sposób agonistyczny) mog a by c u zyte terapeutycznie dla leczenia nowotworu. Cz asteczki hamuj ace odpowied z limfocytów w MLR dzia laj a równie z in vivo w MLR w czasie nowotworzenia, hamuj ac odpowied z immunologiczn a na nowotwór; takie cz asteczki mog a by c b ad z wyra zane przez same komórki nowotworowe b ad z ich ekspresja mo ze by c indukowana przez komórki nowotworowe w innych komórkach. Antagonizm ta- kich cz asteczek inhibitorowych (zarówno z przeciwcia lem, ma la cz asteczk a antagonisty lub w inny sposób) wspomaga zale zne od uk ladu immunologicznego odrzucenie nowotworu. Ponadto hamowanie cz asteczek o prozapalnych w la sciwo sciach mo ze by c terapeutycznie wskazane w reperfuzji urazu; udarze; zawale mi esnia sercowego; stwardnieniu t etnic; ostrym uszko- dzeniu p luc; wstrz asie krwotocznym; oparzeniu; posocznicy/wstrz asie septycznym; ostrej martwicy; chorobie degeneracyjnej stawów i zapaleniu trzustki. Zwi azki tu opisane, np. polipeptydy lub przeciwcia la s a podawane ssakowi, zw laszcza cz lowie- kowi zgodnie ze znanymi sposobami, takimi jak podanie w postaci jednej du zej dawki lub przez ci ag la wlewk e, przez pewien czas domiesniowo, dootrzewnowe, domózgowo-rdzeniowo, podskórnie, dosta- wowo, domaziówkowo, dooponowo, doustnie, miejscowo lub w postaci inhalacji (donosowej lub do- p lucnej). Zalecane jest podanie polipeptydów i przeciwcia l do zylnie lub w postaci inhalacji. W terapii immunoadiuwantowej inne re zimy terapeutyczne, takie jak podanie czynnika przeciw- nowotworowego mog a by c polaczone z podaniem bia lek, przeciwcia l lub zwi azków tu opisanych. Przyk ladowo, pacjent, który ma by c leczony immunoadiuwantem tu opisanym mo ze równie z otrzyma c czynnik przeciwnowotworowy (czynnik chemioterapeutyczny) lub radioterapi e. Przygotowanie i sposób dawkowania takich czynników chemioterapeutycznych mo ze by c zastosowany zgodnie z zaleceniami producenta lub okre slony empirycznie przez bieg lego praktyka. Przygotowanie i dawkowanie w przy- padku takiej chemioterapii opisano równie z w Chemotherapy Service wyd. M.C. Perry, Williams and Wilkins, Baltimore, MD (1992). Podanie czynnika chemioterapeutycznego mo ze poprzedza c lub na- st api c po podaniu immunoadiuwanta lub mo ze by c on podany równocze snie z nim. Dodatkowo, mo ze by c podany zwi azek przeciwestrogenowy, taki jak tamoksyfen lub przeciwprogesteronowy, taki jak onapriston (patrz, EP 616812), w dawkach znanych dla takich cz asteczek. Mo ze by c równie z po zadane podawanie przeciwcia l przeciw innym antygenom, towarzysz acym chorobom immunologicznym lub towarzysz acym nowotworowi, takich jak przeciwcia la wiaz ace CD20, CD11a, CD18, ErbB2, EGFR, ErbB3, ErbB4 lub naczyniowy czynnik sródb lonkowy (VEGF). Alterna- tywnie lub dodatkowo pacjentowi mo zna poda c jednocze snie dwa lub wi ecej przeciwcia l wiazacych ten sam lub dwa lub wi ecej ró zne ujawnione tu antygeny. Czasem mo ze by c wskazane podanie pa- cjentowi równie z jednej lub wi ekszej liczby cytokin. W jednym z wykona n polipeptydy tu opisane poda- je si e jednocze snie z czynnikiem hamuj acym wzrost. Przyk ladowo, czynnik hamuj acy wzrost mo ze by c podany przed polipeptydem tu opisanym. Jednak, równoczesne podanie lub podanie najpierw równie z jest rozwa zane. Odpowiednie dawkowania dla czynnika hamuj acego wzrost s a tymi, które obecnie si e stosuje i mog a by c obni zone na skutek wspólnego dzia lania (synergii) czynnika hamuj a- cego wzrost i polipeptydu tu opisanego. Do leczenia lub lagodzenia ostro sci przebiegu choroby zwi azanej z uk ladem immunologicznym odpowiednia dawka zwi azku tu opisanego b edzie zale za la od rodzaju leczonej choroby, któr a okre- slono powy zej, ostro sci i przebiegu choroby, tego czy czynnik jest podawany dla celów profilaktycz-PL 206 846 B1 55 nych czy terapeutycznych, wcze sniej stosowanego leczenia, klinicznej historii pacjenta i odpowiedzi na zwi azek i rozwagi prowadz acego lekarza. Zwi azek jest dogodnie podany pacjentowi jednorazowo lub jako seria. Przyk ladowo, zale znie od rodzaju i ostro sci choroby, oko lo 1 µq/kg do 15 mg/kg (np. 0,1-20 mg/kg) polipeptydu lub przeciwcia la jest wyj sciow a dawk a, któr a mo zna poda c pacjentowi, przyk ladowo, jako jedna lub wi ecej niezale znych dawek, lub przez ci ag la wlewk e. Typowa, dzienna dawka mo ze miescic si e w zakresie od 1 µg/kg do 100 mg/kg lub wi ecej, zale znie od wspomnianych wy zej czynników. Dla wielokrotnego podawania przez kilka dni lub d luzej, zale znie od warunków, le- czenie jest kontynuowane a z do uzyskania po zadanego zniesienia objawów choroby. Jednak u zy- teczne mog a by c inne re zimy dawkowania. Post ep tej terapii jest latwo sledzi c przy zastosowaniu konwencjonalnych sposobów i testów. 12. Artyku ly przemys lowe. Zgodnie z wynalazkiem opisano równie z artyku l przemys lowy zawieraj acy materia ly u zyteczne do diagnozowania lub leczenia opisanych powy zej chorób. Artyku l przemys lowy zawiera pojemnik i etykiety. Odpowiednie pojemniki obejmuj a na przyk lad butelki, fiolki, strzykawki i probówki testowe. Pojemniki mog a by c utworzone z ró znych materia lów, takich jak szk lo lub plastyk. Pojemnik zawiera kompozycj e, która jest skuteczna do diagnozowania lub leczenia stanu i mo ze posiada c ja lowe uj scie (przyk ladowo pojemnik mo ze by c woreczkiem z p lynem do zylnym lub fiolk a z zamkni eciem, które mo zna przebi c ig la do zastrzyku podskórnego). Sk ladnik aktywny w kompozycji jest zazwyczaj poli- peptydem lub przeciwcia lem tu opisanym. Etykietka na pojemniku lub do laczona do pojemnika wska- zuje, ze kompozycj e stosuje si e do diagnozowania lub leczenia wybranego stanu. Artyku l przemys lo- wy mo ze ponadto zawiera c drugi pojemnik zawieraj acy farmaceutycznie dopuszczalny bufor, taki jak sól fizjologiczna buforowana fosforanem, p lyn Ringera i roztwór dekstrozy. Mo ze ponadto zawiera c inne materia ly pozadane z punktu widzenia komercyjnego i u zytkownika, obejmuj ace inne bufory, rozcie nczalniki, filtry, ig ly, strzykawki i ulotk e z instrukcjami do u zycia. 13. Diagnozowanie i prognozowanie choroby zwi azanej z uk ladem immunologicznym. Bia lka powierzchniowe komórki, takie jak bia lka ulegaj ace nadekspresji w okre slonych choro- bach zwi azanych z uk ladem immunologicznym s a doskona lymi celami dla kandydatów na lek lub le- czenia choroby. Te same bia lka wraz z wydzielanymi bia lkami kodowanymi przez geny amplifikowane w wymienionych stanach chorobowych zwi azanych z odporno sci a znajduj a dodatkowe zastosowanie w diagnostyce i prognozowaniu tych chorób. Przyk ladowo, przeciwcia la skierowane przeciw produk- tom bia lkowym genów amplifikowanych w stwardnieniu rozsianym, reumatoidalnym zapaleniu stawów lub innej chorobie zwi azanej z uk ladem immunologicznym mog a by c stosowane w diagnozowaniu lub prognozowaniu. Przyk ladowo, przeciwcia la, w lacznie z fragmentami przeciwcia l mog a by c stosowane dla jako- sciowego lub ilo sciowego wykrywania ekspresji bia lek kodowanych przez amplifikowane lub ulegaj ace nadmiernej ekspresji geny („produkty genów markerowych”). Przeciwcia lo dogodnie jest wyposa zone w wykrywalny np. fluorescencyjny znacznik i wi azanie mo ze by c sledzone przy pomocy mikroskopu swietlnego, cytometrii przep lywowej, fluorymetrii lub innych technik znanych nauce. Techniki te s a szczególnie odpowiednie, je sli ulegaj acy nadmiernej ekspresji gen koduje bia lko powierzchniowe ko- mórki. Takie testy wi azania przeprowadza si e zasadniczo tak, jak opisano powy zej. Wykrywanie in situ wi azania przeciwcia la do produktów genów markerowych mo ze by c prze- prowadzone przyk ladowo przez immunofluorescencj e lub immunologiczn a mikroskopi e elektronow a. Dla tych celów pobiera si e od pacjenta próbk e histologiczn a i wyznakowane przeciwcia lo dodaje si e dogodnie przez na lo zenie przeciwcia la na próbk e biologiczn a. Procedura ta pozwala równiez na wy- krycie rozmieszczenia produktu genu markerowego w badanej tkance. Dla specjalisty w tej dziedzinie b edzie jasne, ze ró znorodne metody histologiczne s a latwo dost epne dla wykrywania in situ. P r z y k l a d y Komercyjnie dost epne odczynniki omawiane w przyk ladach by ly u zyte zgodnie z zaleceniami producentów, chyba, ze podano inaczej. Zród lem komórek identyfikowanych w poni zszych przyk la- dach i w opisie poprzez numery dost epu ATCC jest American Type Culture Collection, Manassas, VA. Je sli inaczej nie zaznaczono to niniejszy wynalazek, wykorzystuje typowe procedury technologii re- kombinowania DNA, takie jak opisane powy zej i w nast epuj acych podr ecznikach: Sambrook i wsp., Molecular Cloning: A Laboratory Manua l, Cold Spring Harbor Press NY., 1989; Ausubel i wsp., Cur- rent Protocols in Molecular Biology, Green Publishing Associates and Willey Interscience, N.Y. 1989; Innis i wsp., PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, Academic Press Inc., N.Y. 1990;PL 206 846 B1 56 Harlow i wsp., Antibodies: A Laboratory Manua l, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, 1988; Gait, M.J. Oligonukleotide Synthesis IRL, Press, Oxford, 1984; R.I. Freshney, Animal Celi Culture, 1987; Coligan i wsp., Current Protocols in Immunology, 1991. P r z y k l a d 1 Izolacja i klonowanie TCCR Receptory cytokinowe i/lub receptory charakteryzuj ace si e domen a WS(G)XWS u zyto do prze- szukiwania publicznych baz danych EST, w wyniku czego wyizolowano hTCCR (SEQ ID N0:1) i mTCCR (mTCCR). Alternatywnie, mysi TCCR przedstawiony na fig. 4 (SEQ ID N0:2) zosta l opubli- kowany w WO 97/44455 z lo zonym 23 maja 1996, jak równie z w GenBank pod numerem dost epu 7710109. Wcze sniej znana cz asteczka jest równie z opisana przez Sprecher i wsp. Blochem. Biophys. Res. Commun. 24 6 (1): 82-90 (1998 ). Na fig. 4 (SEQ ID N0:2) zosta l pokazany sygna lowy peptyd od aminokwasu 1 do oko lo 24, domena transb lonowa od aminokwasu oko lo 514 do oko lo 532, miejsca N-glikozylacji w pozycji reszt oko lo 46-49, 296-299, 305-308, 360-361, 368-371 i 461-464, miejsca fosforylacji przez kinaz e kazeinow a II w pozycji reszt aminokwasowych oko lo 10-13, 93-96, 130-133, 172-175, 184-187, 235-238, 271-274, 272-275, 323-326, 606-609 i 615-618, miejsca fosforylacji dla kinazy tyrozynowej w pozycji reszt aminokwasowych oko lo 202-209, miejsca N-mirystylacji w pozycji reszt aminokwasowych oko lo 43-48, 102-107, 295-300, 321-326, 330-335, 367-342, 393-398, 525- 530 i 527-532, miejsce amidacji w pozycji reszt aminokwasowych oko lo 240-243, miejsce przy laczenia lipidu z lipoproteiny z b lony prokariotycznej w pozycji reszt aminokwasowych oko lo 516-526 i receptor czynnika wzrostu i cytokiny z rodziny w pozycji reszt aminokwasowych 36-49. Wyst epuje region zna- cz acej homologi z: (1) ludzk a erytropoetyn a w pozycjach aminokwasowych oko lo 14-15 i (2) recepto- rem mysiej interleukiny 5 w pozycjach aminokwasowych oko lo 211-219. Polipeptyd wykazuj acy wysok a homologi e z ludzkim TCCR, co przedstawiono na fig. 3 (SEQ ID N0:1), opublikowano w WO 97/44455 z lozonym 23 maja 1996, i jest równie z dost epny z GenBank pod numerem dost epu 4759327. Wcze sniej znana w tej dziedzinie cz asteczka jest równie z opisana przez Sprecher i wsp., Blochem. Biophys. Res. Comun. 246(1): 82-90 (1998). Na fig. 3 (SEQ ID N0:1) sy- gna lowy peptyd zosta l pokazany od aminokwasu 1 do oko lo 32, domena transb lonowa od aminokwa- su 517 do oko lo 538, miejsca N-glikozylacji w pozycjach reszt aminokwasowych oko lo 51-54, 76-79, 302-305, 311-314, 374-377, 382-385, 467-470, 563-566, miejsca N-mirystylacji w pozycjach amino- kwasowych oko lo 107-112, 240-245, 244-249, 281-286, 292-297, 373-378, 400-405, 459-464, 470- -475, 531-536 i 533-538, miejsce przylaczenia lipidu z lipoproteiny b lony prokariotycznej w pozycjach aminokwasowych 522-532 i receptor czynnika wzrostu i cytokiny rodziny o oznaczeniu 1 w pozycjach aminokwasowych oko lo 41-54. Wyst epuje równie z region o znacz acej homologii z drug a podjednostk a receptora ludzkiego czynnika pobudzaj acego tworzenie kolonii granulocytarno-makrofagowych (GM- -CSF) w pozycjach aminokwasowych 183-191. Porównanie sekwencji ludzkiego TCCR (SEQ ID N0:1) i mysiego TCCR (SEQ ID N0:2) przed- stawiono na fig. 5. Porównanie ujawnilo oko lo 62% identyczno sci sekwencji pomi edzy sekwencjami ludzk a i mysi a. P r z y k l a d 2 Myszy z „nokautem” TCCR 1. Przygotowanie wektora docelowego. Termin „wektor docelowy” (ang. targeting vector), jest terminem stosowanym w tej dziedzinie okre slaj acym sekwencj e kwasu nukleinowego skonstruowan a w celu usuwania genu. Fig. 9A opisuje wektor docelowy stosowany dla cz asteczki TCCR wyizolowanej w tym przyk ladzie. Dok ladniej wektor docelowy zosta l skonstruowany przy zastosowaniu fragmentu XhoI-HindIII o wielko sci 2,4 kb zawiera- jacego pierwsze dwa eksony i fragmentu EcoRI-BamHI o wielko sci 6,0 kb zawieraj acego eksony od 9 do 14. Konkretny wyizolowany gen TCCR zawiera 14 eksonów i 13 intronów. W tym wektorze docelo- wym gen pGK-neo nadaj acy oporno sc na gentamycyn e zast api l eksony 3-8, pozostawiaj ac eksony 112 nienaruszone. Region koduj acy kinaz e tymidynowa z wirusa opryszczki (HSV-TK) zosta l umiesz- czony po stronie 5' eksonu pierwszego, umo zliwiaj ac selekcj e gancyklowirem. Takie markery selek- cyjne warunkuj ace oporno sc na lek, na przyk lad gancyklowir umo zliwiaj a selekcj e stabilnie transfor- mowanych linii komórkowych zawieraj acych wektor docelowy i ponadto umo zliwia przygotowanie starte- rów dla reakcji la ncuchowej polimerazy (PCR), które b ed a amplifikowa ly fragment kwasu nukleinowego unikalny dla konstruktu docelowego, który pozwoli na odró znienie go od endogennego genu. Ten kon- strukt zosta l wbudowany do wektora pBluescript (Stratagene, La Jolla, CA), który wprowadzono przezPL 206 846 B1 57 transformacj e do bakterii DH10B. Pojedyncze kolonie zebrano i u zyto dla przygotowania du zych ilo sci wektora docelowego. 2. Przygotowanie komórek macierzystych TCCR -/- Wektor docelowy zlinearyzowano przez trawienie endonukleaz a Notl i wprowadzono przez transfekcj e do zarodkowych komórek macierzystych (ES). Komórki ES wybrano z uwagi na ich zdol- nosc w laczania si e do linii p lciowej rozwijaj acych si e zarodków, co za tym idzie przenosz a one wektor docelowy do potomstwa. Jako preferowan a lini e ES wybrano lini e ESGS, lecz linia D3(ATCC CRL- -1934) równie z mo ze by c u zyta. Elektroporacj e wykonano na 2-5 milionach komórek ES zawieszo- nych w 0,8 ml PBS. Zlinearyzowany wektor docelowy (20 µg) dodano do komórek i umieszczono w ja lowej kuwecie do elektroporacji (0,4 cm Bio-Rad, Hercules, CA). Elektroporacj e przeprowadzono sto- suj ac aparat do elektroporacji Bio-Rad ustawiony na 500 µF, 240 V. Zawarto sc kuwety przeniesiono do 410 ml po zywki ES. Po zywka ES sk lada si e z DMEM z wysokim stezeniem glukozy (Gibco 10960- 010), 10% FBS (testowana na komórkach ES Gibco 16141-061) i 1000 jednostek/ml ESGRO mysiej LIF (Gibco 13275-0290). Komórki te s a nast epnie rozporojowane na 20 96-studzienkowych p lytek. Po transfekcji wektorem docelowym komórki ES selekcjonowano stosuj ac letalne st ezenia wcze sniej wspomnianych zwi azków. W przypadku G418 u zyto 400 µg/ml. Jedynie te komórki ES, które nios ly wektor docelowy zawiera ly markery oporno sci na antybiotyk niezb edne dla prze zycia. Wybrane kolo- nie komórek ES by ly nast epnie sprawdzane poprzez analiz e Southern pod k atem poprawno sci inte- gracji wektora (fig. 10A), PCR (fig. 10B), brak ekspresji mRNA docelowego endogennego genu (fig. 10C). Klony ES, które spe lni ly powy zsze kryteria u zyto nast epnie do mikrowstrzykni ecia do za- rodków. 3. Wstrzykni ecie i wyszukiwanie myszy TCCR -/- Wyselekcjonowane i sprawdzone komórki ES z poprzedniego etapu przenosi si e do rozwijaj a- cego si e zarodka przy zastosowaniu jakiejkolwiek u zytecznej techniki znanej w tej dziedzinie, dogod- nie przez mikrowstrzykni ecie. U zyteczne techniki mikrowstrzykiwania s a opisane w Hogan i wsp., Manipulating the mouse embryo: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor N.Y. 1986. Jakkolwiek dowolny zarodek mo ze by c u zyty, pod warunkiem, ze mo ze on by c pó zniej zidentyfikowany, zalecane jest, aby zarodek wybrany do mikrowstrzykni ecia by l samcem i posiada l barw e sier sci, która jest inna ni z barwa sier sci kodowana przez geny komórki ES nios acej wektor docelowy. Przyk ladowo komórki ES od zwierz ecia o bia lej sier sci b ed a wstrzykiwane do zarod- ka, który rozwinie si e w zwierz e o sier sci br azowej/czarnej. W ten sposób pomy slnie nastrzykni ete zarodki mog a by c wybrane, jako doros le osobniki na podstawie mozaikowego ubarwienia. Tak uzy- skane mozaikowe zwierz eta (za lo zycielskie) s a TCCR -/+ i s a nast epnie krzy zowane wstecznie (krzy- zowane z innym potomstwem TCCR -/+ w celu uzyskania myszy TCCR -/-. Dla potwierdzenia genoty- pu TCCR -/- DNA jest ekstrahowany z koniuszka ogona i wyizolowany przez inkubowanie tkanki ogo- na w 60°C przez noc w 0,5 ml buforu dla lizy. Bufor do lizy zawiera 0,5% SDS, 100 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl (pH 8,0), 7,5 mM EDTA (pH 8,0) i 1 mg/ml proteinazy K (Boehringer Mannheim). Po ca lonoc- nej inkubacji dodaje si e próbki 75 µl 8 M octanu potasu, 600 ml CHCI 3 i ca la mieszanina reakcyjna jest wirowana przez 10 min w temperaturze pokojowej. Warstwa wodna jest pobierana i umieszczana w oddzielnej probówce typu Eppendorf, do której dodaje si e 600 ml 100% etanolu i DNA wytr aca si e przez wirowanie przez 5 minut. Osad DNA jest p lukany 70% etanolem i pozostawiony na powietrzu do wyschni ecia. Po usuni eciu resztek etanolu osad DNA jest zawieszany w 150-200 µl wody. Ten DNA mo ze by c nast epnie u zyty dla analizy Southern i dla PCR. W przypadku analizy Southern gen neo mo ze by c stosowany, jako sonda; dla PCR zastosowane mog a by c startery u zyte dla sprawdzania komórek ES. Wyniki przedstawiono na fig. 10A, 10B i 10C wykazuj a sukces w usuwaniu genu TCCR. Myszy pozbawione TCCR by ly zywotne, p lodne i nie ujawnia ly zadnych widocznych nieprawid lowo sci. Szczegó lowe badanie histologiczne nie ujawni lo zadnych oczywistych wad. Analiza przez cytometri e przep lywow a komórek otrzymanych z grasicy, sledziony, w ez lów ch lonnych i wycinków peyera od wielu zwierz at typu dzikiego i zwierz at z nokautem, barwionych przeciwcia lami przeciw CD3, CD4, CD8, CD25, CD19, B220, CD40, NK1.1, DX5, F4/80 CD14, CD16 MHC II i CD45 nie ujawni ly zadnych powa zniejszych ró znic mi edzy dwoma genotypami. P r z y k l a d 3 Wzmocnienie alergicznego stanu zapalnego dróg oddechowych u myszy TCCR -/-. Astma jest z lo zon a chorob a wynikaj ac a z oddzia lywania wielu uczulaj acych i nieuczulaj acych czynników powoduj acych obrz ek oskrzeli i stan zapalny. Jednym z kluczowych aspektów stanu zapal-PL 206 846 B1 58 nego dróg oddechowych jest naciek sciany dróg oddechowych przez komórki Th2. Poniewa z wytwo- rzone tu myszy TCCR -/- posiadaj a wi eksz a odpowied z Th2, to s a one u zytecznym modelem dla ba- dania alergicznego stanu zapalnego uk ladu oddechowego. Zwierz eta: 12 myszy TCCR -/- i 11 m lodych typu dzikiego (WT) podzielono losowo na nast epu- jace cztery grupy: grupa 1 - nieuczulane TCCR -/-; grupa 2 nieuczulane TCCR WT (n=4); grupa 3 - uczulane TCCR -/-(n=8); i grupa 4 - uczulane TCCR WT (n=7). Uczulanie: 15 myszy (samce i samice) uczulano 300 jednostkami/ml antygenu roztoczy kurzu (Bayer Pharmaceutical) zaadsorbowanego do 1 mg/ml a lunu podanymi IP w dniu 0 w obj eto sci 0,1 ml. Nieuczulane myszy kontrolne (n=8) otrzyma ly 0,1 ml 0,9% NaCl i 1 mg/ml a lunu IP. Obie grupy myszy doszczepiano dawk a przypominaj ac a w dniu 7 przez wstrzykniecie IP antygenu (grupa uczulana) lub NaCl (grupa nieuczulana), jak to opisano powy zej. Prowokacj e przez inhalacj e: Po uczuleniu i doszczepieniu dawk a przypominaj ac a podano 4 in- halacje z DMA (od ang. dust mite antigen) pocz awszy od dnia 16. Dla rozpylania ostateczny roztwór roztoczy kurzu w nebulizatorze zawiera l 6000 jednostek/ml po rozcie nczeniu w PBS Dulbecco z 0,1% Tween®-20. Wszystkie inhalacje wykonano w komorze Plexiglass®. DMA rozpylano przez 20 minut stosuj ac pocz atkowo nebulizator PARI IS-2 wyj sciowo i ponownie wype lniany 1,5 ml, stosuj ac ekspo- zycje przez 10 minut. Laczna dawka na pluca wynosi la ~6,5 AU DMA. AHR (parali zowane): W dniu 24 oko lo 18 godzin po ostatnim podaniu DMA w aerozolu myszy u spiono mieszanin a pentabarbital (25 mg/kg) i uretan (1,8 g/kg) i za lozono kateter przez 1 cm naci ecie na prawej zyle szyjnej. Zy la szyjna zosta la wypreparowana i kateter (PE-10 polaczony z PE-50) zosta l ciasno umiejscowiony. Ponadto, mysz tracheotomizowano (1 cm naci ecie szyi, tchawica wypreparo- wana i kaniula ciasno umiejscowiona). Myszy nast epnie umieszczano w pletysmografie przep lywo- wym Plexiglass® dla pomiaru pojemno sci i ci snienia w drogach oddechowych. Myszy wentylowano stosuj ac 100% tlen przy cz esto sci 170 bpm i Vt wynosz acej 9 µl/q. Mechanik e oddechu sledzono w sposób ci ag ly stosuj ac skomputeryzowany program zbierania danych (Buxco Electronics). Po wy- konaniu pomiarów podstawowych myszy otrzymywa ly, co 10 sek. dawki metacholiny (dawka MCH 500 µg/kg) stosuj ac MCH w st ezeniu 200 µg/ml, jako roztwór podstawowy. U smiercanie: Po zako nczeniu pomiarów reaktywno sci dróg oddechowych probówki z EDTA zo- staly u zyte do zebrania krwi z tylnej zy ly ocznej w celu otrzymania surowicy. Jama brzuszna zosta l otwarta, aorta zst epuj aca wypreparowana i przepona przeci eta. Po up lywie czasu skrwawianie zwie- rz ecia, przeprowadzono p lukanie oskrzelikowo-p echerzykowe (BAL ang. bronchioalveolar lavage). P luca przep lukiwano trzykrotnie t a sam a dawk a sterylnej soli fizjologicznej (30 µg/g ci ezaru cia la my- szy) poprzez uprzednio umieszczon a w tchawicy kaniul e. Podana dawka wype lnia la w oko lo 70% pe lnej pojemno sci p luc. Próbki BAL (odzysk srednio 80%) wirowano przy 1000 x g w 4°C przez 10 minut. Nads acza zosta ly zebrane i natychmiast zamro zone w -80°C. Osady komórkowe ponownie zawieszano w 250 ml PBS z 2% BSA (Sigma, St. Louis, MO), a nast epnie zliczane przy u zyciu auto- matycznego licznika (Baker Instruments, Allentown, PA) i zanotowywano jako ca lkowit a liczb e komó- rek/µl dla BAL. Zawiesin e komórek doprowadzano nast epnie do stanu 200 komórek/µl i 100 ml by lo wirowanych na powlekanych szkie lkach mikroskopowych Superfrost Plus (Baxter Diagnostics, Deer- field, IL) przy 800 x g przez 10 minut u zywaj ac cytospin (Shandon, Inc., Pittsburgh, PA). Nast epnie szkie lka by ly suszone, utrwalane przez 1 minut e w 100% metanolu i barwione Diff-Qiuck™ (Baxter Health Care, Miami, FL). Przynajmniej 200 komórek na szkie lko oceniano, aby uzyska c ró znicuj ace zliczenie leukocytów. Po BAL, pobrano prawe p luco, sledzion e i tchawiczo-oskrzelowe w ez ly limfatyczne i zamro zono w p lynnym azocie do analizy RNA (a nast epnie umieszczono w suchym lodzie). Pobrano próbki ko- niuszków ogona i zamro zono w suchym lodzie dla pó zniejszego genotypowania. Pozosta le lewe p luco myszy pobrano dla oceny i porównania ostro sci i charakteru zmian patologicznych w p lucach pomi e- dzy grupami do swiadczalnymi. Wykonano to poprzez wst epne utrwalenie tkanki p luc w 10% oboj etnej zbuforowanej formalinie, zatopienie w parafinie, a nast epnie barwienie 3 µm skrawków hematoksylin a i eozyn a. Skrawki p luc pobrano poprzez pierwotne oskrzeliki i ca ly skrawek by l oceniany na slepo i oceniany pod wzgl edem ostro sci stanu zapalnego wokó l dróg oddechowych i naczy n krwiono snych. Rozleg losc rozrostu komórek nab lonkowych dróg oddechowych oceniano w skali od 0 (brak stanu zapalnego i zmian w drogach oddechowych) do 4 (zaznaczony stan zapalny i zmiany w drogach od- dechowych). ELISA dla IgE: W celu przeprowadzenia kanapkowego testu ELISA dla ca lkowitego IgE, u zyto p lynu BAL lub próbek surowicy nie rozcie nczonych lub rozcie nczonych 1:2 do 1:20 (BAL) i 1:25 doPL 206 846 B1 59 1:200 (surowica) w buforze dla ELISA. Jako przeciwcia lo wychwytuj ace u zyto przeciwcia la królicze anty-mysie IgE (2 µg/ml w PBS) i p lytki powlekano przez 24-48 godzin w 4°C. Wzorcem by la mysia IgE (PharMlngen, San Diego, CA), któr a rozcie nczono seryjnie 1:2, pocz awszy od st ezenia 100 ng/ml. Wykrywaj ace przeciwcia lo, biotynylowane FcsRI-IgG by lo stosowane w rozcie nczeniu 1:2000 przez 1-1,5 godziny. HRP-SA i etapy wywo lywania reakcji enzymatycznej by ly identyczne ze stosowanymi w testach cytokin. Wyniki wykaza ly znacz acy wzrost naciekania limfocytów do p luc myszy TCCR -/- w porównaniu z typem dzikim (fig. 11). P r z y k l a d 4 Ekspresja TCCR w E. coli. Ten przyk lad ilustruje przygotowanie nieglikozylowanej formy TCCR przez ekspresj e poprzez rekombinowanie w E. coli. Sekwencj e DNA koduj ac a TCCR pocz atkowo amplifikowano z u zyciem wybranych starterów dla PCR. Startery powinny zawiera c miejsca dla enzymów restrykcyjnych, które odpowiadaj a miejscom dla enzymów restrykcyjnych na wybranym wektorze ekspresyjnym. Mo zliwe jest zastosowanie ró znorodnych wektorów ekspresyjnych. Przyk ladem u zytecznego wektora jest pBR322 (pochodz acy od E. coli; patrz Bolivar i wsp., Gene, 2:95 (1977)) zawieraj acy geny odporno sci na amplicylin e i tetracyklin e. Wektor jest trawiony enzymem restrykcyjnym i zdefosforylowany. Na- st epnie sekwencje powielone w reakcji PCR s a wstawiane poprzez ligacj e do wektora. Wektor b edzie dogodnie zawiera l sekwencje koduj ace gen oporno sci na antybiotyk, promotor trp, lider poli-his (obej- mujacy pierwsze sze sc kodonów STU, sekwencj e poli-His i miejsce ci ecia dla enterokinazy), region koduj acy TCCR, terminator transkrypcji z bakteriofaga lambda i gen arg U. Mieszanin e ligacyjn a u zyto nastepnie do transformacji wybranego szczepu E. coli stosuj ac spo- soby opisane w Sambrook i wsp., jak wy zej. Transformaty identyfikowano pod k atem ich zdolno sci do wzrostu na szalkach LB, a nast epnie selekcjonowano kolonie oporne na antybiotyk. Plazmidowy DNA mo zna wyizolowa c i potwierdzi c przez analiz e restrykcyjn a i ustalenie sekwencji nukleotydowej DNA. Wybrane klony mo zna hodowa c przez noc w p lynnej po zywce hodowlanej, takiej jak po zywka LB uzupe lniona antybiotykami. Ca lonocna hodowla mo ze by c nast epnie u zyta do zaszczepienia ho- dowli na wi eksz a skal e. Komórki s a nast epnie hodowane do po zadanej g esto sci optycznej, a nastep- nie uruchomiona jest ekspresja z promotora ekspresyjnego. Po hodowaniu komórek przez kilka kolejnych godzin, komórki mog ly by c zebrane przez wirowa- nie. Otrzymany po wirowaniu osad komórek mo ze by c rozpuszczony w ró znych znanych w tej dzie- dzinie odczynnikach, a nast epnie oczyszczone bia lko TCCR mo ze by c oczyszczone na kolumnie ze z lo zem chelatuj acym metal w warunkach pozwalaj acych na silne wi azanie bia lka. TCCR mo ze rów- nie z by c wyra zony w E. coli w postaci ze znacznikiem poli-His, przy zastosowaniu poni zszej procedu- ry. DNA koduj acy TCCR jest wyj sciowo amplifikowany przy pomocy wybranych starterów dla PCR. Startery zawieraj a miejsca dla enzymów restrykcyjnych, odpowiadaj ace miejscom dla enzymów re- strykcyjnych na wybranym wektorze ekspresyjnym i inne u zyteczne sekwencje dostarczone dla wy- dajnej i wiarygodnej inicjacji translacji, szybkiego oczyszczenia na kolumnie chelatuj acej metal i prote- olitycznego usuwania przy zastosowaniu enterokinazy. Nast epnie amplifikowane poprzez reakcj e PCR wyznakowane poli-His sekwencje s a przy laczone poprzez ligaz e do wektora ekspresyjnego, który jest u zyty do transformacji gospodarza E. coli opartego na szczepie 52 (W3110 fuhA(tonA) lon gal rpoHts (htpRts) clpP (lad a). Transformaty sa najpierw hodowane na po zywce LB zawieraj acej 50 mg/ml karbenicyliny w 30°C z wytrz asaniem a z do osi agni ecia OD 600 3-5. Hodowle s a nast epnie rozcie nczane 50-100 razy w po zywce CRAP (przygotowanej przez zmieszanie 3,57 g (NH 4 ) 2 SO 4 , 0,71 g cytrynianu sodu x 2H 2 O, 1,07 g KCl, 5,36 g ekstraktu chidiowego Disco, 5,36 g Sheffield hikazy SF w 500 ml wody, jak równie z 110 mM MPOS, pH 7,3, 0,55% (wag/obj.) glukozy i 7 mM MgSO 4 ) i hodo- wanie przez oko lo 20-30 godzin w 30°C z wytrz asaniem. Próbki pobierano i ekspresj e potwierdzano przez analiz e SDS-PAGE i du za hodowl e wirowano celem osadzenia komórek. Osad komórkowy zamro zono a z do czasu oczyszczania i refa ldowania bia lka. Past e E. coli uzyskan a z bakterii z 0,5 do 1,0 1 (osady 6-10 g) hodowli zawieszano w 10 obj eto- sciach (wag./obj.) 7 M guanidyny, 20 mM buforze Tris, pH 8. Dodawano sta ly siarczek sodowy i tetrationian sodowy do ko ncowego st ezenia, odpowiednio, 0,1 i 0,02 M, a otrzymany roztwór mieszano przez noc w 4°C. W wyniku przeprowadzenia tego etapu otrzymano zdenaturowane bia lko z wszystkimi resztami cysteinowymi zablokowanymi przez powstanie siarczków. Roztwór wirowano przy 40 000 obr. na min. w ultrawirówce Beckman, przez 30 min. Nas acz rozcie nczano w 3-5 obj eto sciach buforu do kolumny chelatuj acej metal (6 M guanidyna, 20 mM Tris pH 7,4) i dla wyklarowania filtrowano przez filtr o 0,22-PL 206 846 B1 60 -mikronowych porach. Zale znie od warunków sklarowany ekstrakt nanoszono na 5 ml kolumn e Qiagen Ni-NTA chelatuj acej metal, w buforze do kolumny chelatuj acej metal. Kolumn e p lukano dodatkowym buforem zawieraj acym 50 mM imidazol (Calbiochem, stopie n czysto sci Utrol), pH 7,4. Bia lko wymy- wano buforem zawieraj acym 250 mM imidazol. Frakcje zawieraj ace po zadane bia lko laczono w pule i przechowywano w 4°C. St ezenie bia lka szacowano przez pomiar absorbancji przy 280 nm stosuj ac wspó lczynnik ekstynkcji oparty na sekwencji aminokwasowej. Bia lka ponownie fa ldowano poprzez powolne rozcie nczanie próbki w swie zo przygotowanym buforze do refa ldowania sk ladaj acym si e z: 20 mM Tris pH 8,6, 0,3 M NaCl, 2,5 M mocznika, 5 mM cysteiny, 20 mM glicyny i 1 mM EDTA. Obj eto sci buforu do refa ldowania wybrano tak, aby ko ncowe st ezenie bia lka wynosi lo od 50 do 100 mikrogramów/ml. Roztwór do refa ldowania mieszano dok ladnie w 4°C przez 12-36 godz. Reakcj e refa ldowania wygaszano przez dodanie TFA do ko ncowego st eze- nia 0,4% (pH oko lo 3). Przed dalszym oczyszczaniem bia lka roztwór filtrowano przez filtr o porach 0,22 mikrona i dodano acetonitryl do ko ncowego st ezenia 2-10%. Refa ldowane bia lko poddano chro- matografii na kolumnie z odwróconymi fazami Poros R1/H, stosuj ac jako mobilny bufor 0,1% TFA z elucj a gradientem acetonitrylu od 10 do 80%. Próbki frakcji o absorbancji przy A280 badano poprzez elektroforez e w zelach poliakryloamidowych z SDS i laczono frakcje zawieraj ace homogenne refa ldo- wane bia lko. Ogólnie wi ekszo sc rodzajów bia lek w la sciwie refa ldowanych jest wymywana ni zszymi st ezeniami acetonitrylu, bowiem s a one bardziej zwarte ze swoim hydrofobowym wn etrzem chronio- nym przed oddzia lywaniem ze z lo zem odwróconej fazy. Agregaty s a zazwyczaj wymywane przy wy z- szych st ezeniach acetonitrylu. Poza oddzieleniem nieprawid lowo sfa ldowanych postaci bia lek od po- zadanych postaci, etap odwróconej fazy usuwa równie z z próbek endotoksyn e. Frakcje zawieraj ace bia lka TCCR sfa ldowane w po zadany sposób, s a laczone w pule, a aceto- nitryl jest usuwany z roztworu przy pomocy delikatnego strumienia azotu. Bia lka s a przygotowane w 20 mM Hepes, pH 6,8 z 0,14 M chlorkiem sodu i 4% mannitolem, poprzez dializ e lub s aczenie mo- lekularne przy zastosowaniu z loza G25 Superfine (Pharmacia) zrównowa zonego odpowiednim bufo- rem dla preparatu i ja lowiono przez filtrowanie. P r z y k l a d 5 Ekspresja TCCR w komórkach ssaczych Ten przyk lad ilustruje przygotowanie potencjalnie glikozylowanej postaci TCCR poprzez eks- presj e poprzez rekombinowanie DNA w komórkach ssaczych. Wektor pRK5 (patrz EP 307,247 opublikowany 15 marca 1989) jest u zyty jako wektor ekspre- syjny. Ewentualnie, DNA TCCR jest przy laczany do pRK5 poprzez ligacj e z zastosowaniem wybra- nych enzymów restrykcyjnych pozwalaj acych na wbudowanie DNA dla TCCR metodami ligacji opisa- nymi, w Sambrook i wsp., jak wy zej. Uzyskany wektor jest nazwany, przyk ladowo, pRK5-TCCR. W jednym z wykona n wybranymi komórkami gospodarza mog a by c komórki 293. Ludzkie ko- mórki 293 (ATCC CCL 1573) s a hodowane do konfluencji na p lytkach do hodowli tkankowych w pod- lozu, takim jak DMEM uzupe lnionym p lodow a surowic a ciel ec a i ewentualnie sk ladnikami od zywczymi i/lub antybiotykami. Oko lo 10 µg DNA pRK5-TCCR zmieszano z 1 µg DNA genu koduj acego VA RNA [Thimmappaya i wsp.. Cell, 31:543 (1982)] i rozpuszczono w 500 µl 1 mM Tris-HCl, 0,1 mM EDTA, 0,227 M CaCl 2 . Do mieszaniny tej dodawano kroplami 500 µl 50 mM HEPES (pH 7,35), 280 mM NaCl, 1,5 mM NaPO 4 i pozwolono osadowi formowa c si e przez 10 minut w 25°C. Osad zawieszono i dodano do komórek 293 pozwalaj ac na ustabilizowanie si e przez oko lo cztery godziny w 37°C. Po zywk e ho- dowlan a usuni eto i na 30 sekund dodano 2 ml 20% glicerolu w PBS. Nast epnie komórki 293 p lukano po zywk a woln a od surowicy, dodano swie za po zywk e i komórki inkubowano przez 5 dni. Oko lo 24 godziny po transfekcji usuwano po zywk e hodowlan a i zast apiono j a po zywk a hodow- lan a (sam a) lub po zywk a hodowlan a zawieraj ac a 200 µCi/ml 35 S-cysteiny i 200 µCi/ml 35 S-metioniny. Po 12 godzinach inkubacji, zbierano kondycjonowan a po zywk e, zat ezano na filtrach przez wirowanie i nanoszono na 15% zel z SDS. Poddany obróbce zel, ze by c wysuszony i eksponowany wobec b lony przez kre slony czas dla ujawnienia wyst epowania polipeptydu TCCR. Hodowle zawieraj ace transfe- kowane komórki mog a by c poddane dalszej inkubacji (w po zywce wolnej od surowicy) i po zywka jest sprawdzana wybranym testem biologicznym. W alternatywnym sposobie TCCR mo ze by c wprowadzony do komórek 293 przej sciowo przy zastosowaniu metody z siarczanem dekstranu opisanej przez Somparyrac i wsp., 5 Proc. Natl. Acad. Sci., 12:7575 (1981). Komórki 293 s a hodowane do maksymalnej g esto sci w kolbach z mieszad lem (ang. Spinner Plash) i dodawane jest 700 µg DNA pRK5-TCCR. Komórki s a najpierw zatezane z kolbPL 206 846 B1 61 z mieszad lem przez wirowanie i p lukanie w PBS. Wytr acony dekstranem DNA jest inkubowany z osa- dem komórkowym przez cztery godziny. Komórki przez 90 sekund s a poddawane dzia laniu 20% glicerolu, przep lukiwane po zywk a do hodowli tkankowej i ponownie umieszczane w kolbach z mieszad lem zawieraj acych po zywk e do ho- dowli tkankowej, 5 µg/ml bydl ecej insuliny i 0,1 µg/ml bydl ecej transferyny. Po czterech dniach kondy- cjonowana po zywka jest wirowana i filtrowana celem usuni ecia komórek i resztek. Próbka zawieraj aca wyra zony TCCR mo ze nast epnie by c zat ezona i oczyszczona jakimkolwiek wybranym sposobem, takim jak dializa i/lub chromatografia na kolumnie. W innym wykonaniu TCCR mo ze by c wyra zony w komórkach CHO. Plazmid pRK5-TCCR mo ze by c wprowadzony przez transfekcj e do komórek CHO, przy pomocy znanych odczynników, takich jak CaPO 4 lub DEAE-dekstran. Jak opisano powy zej, hodowle komórkowe mog a by c inkubowane i po- zywka zast apiona po zywk a do hodowli (sam a) lub zawieraj ac a znacznik radioaktywny, taki jak 35 S- -metionina. Po ustaleniu obecno sci TCCR, po zywka hodowlana mo ze by c zast apiona po zywk a bez surowicy. Dogodnie hodowle s a inkubowane przez oko lo 6 dni, a nast epnie po zywka jest zbierana. Po zywka zawieraj aca wyra zony TCCR mo ze by c nast epnie zat ezona i oczyszczona jakimkolwiek wybranym sposobem. TCCR ze znacznikiem - epitopem mo ze równie z by c wyra zony w komórkach gospodarza CHO. TCCR mo ze by c subklonowany w wektorze pRK5. Subklonowana wstawka mo ze by c poddana reakcji PCR celem po laczenia w fazie wybranego znacznikowego epitopu, takiego jak znacznik poli-his z bakulowirusowym wektorem ekspresyjnym. Wstawka TCCR ze znacznikiem poli-his TCCR mo ze by c nast epnie subklonowana do wektora b ed acego pochodn a SV40, zawieraj acego marker selekcyj- ny, taki jak DHFR, dla selekcji stabilnych klonów. Ostatecznie komórki CHO mog a by c transfekowane (jak opisano powy zej) wektorem b ed acym pochodn a SV40. Dla potwierdzenia ekspresji znakowanie mo ze by c wykonane jak to opisano powy zej. Po zywka hodowlana zawieraj aca wyra zony TCCR ze znacznikiem poli-His mo ze by c zatezona i oczyszczona jakimkolwiek wybranym sposobem, takim jak chromatografia powinowactwa ze schelatowanym Ni 2+ . TCCR mo ze równie z by c wyra zony w komórkach CHO i/lub COS poprzez przej sciow a ekspre- sje lub w komórkach CHO przy zastosowaniu innego sposobu do stabilnej ekspresji. Stabilna ekspresja w komórkach CHO mo ze by c uzyskana przy zastosowaniu poni zej podanej procedury. Bia lka mog a by c wyra zone przyk ladowo zarówno, (1) jako konstrukt z IgG (immunoadhe- zja), gdzie sekwencje koduj ace rozpuszczalne postaci (np. domeny zewn atrzkomórkowe) odpowied- nich bia lek s a po laczone z sekwencj a regionu sta lego IgG zawieraj acego domen e zawiasow a CH2 i/lub (2) jako posta c ze znacznikiem poli-His. Po amplifikacji PCR odpowiednie DNA s a, subklonowane w wektorze ekspresyjnym, przy za- stosowaniu typowych sposobów opisanych w Ausubel i wsp., Current Protocols of Molecular Biology, sekcja 3.16, Jon Wiley and Sons (1997). Wektory do ekspresji w CHO s a skonstruowane tak, aby posiada ly miejsca dla odpowiednich enzymów restrykcyjnych po stronie 5' i 3' DNA b ed acego przed- miotem zainteresowania umo zliwiaj ac wygodne podmienianie cDNA. Wektor u zyty do ekspresji w komórkach CHO opisany przez Lucas i wsp.. Nucl. Acids Res. 24:9, 1774-1779 (1996) wykorzystuje do wywo lania ekspresji b ed acego przedmiotem zainteresowania cDNA wczesny promo- tor/wzmacniacz SV 40 i reduktaz e dihydrofolianow a (DHFR). Ekspresja DHFR umo zliwia selekcj e dla stabilnego utrzymywania plazmidu po transformacji. Dwana scie mikrogramów DNA po zadanego plazmidu jest wprowadzone do oko lo 10 milionów komórek CHO przy pomocy komercyjnie dost epnych odczynników do transfekcji Superfect® (Qiagen), Dosper® lub Fugene® (Boehringer Mannheim). Komórki hodowano jak to opisali Lucas i wsp., jak wy zej. Oko lo 3 x 10 7 komórek zamro zono w ampu lce dla dalszej hodowli i produkcji jak to opisano poni zej. Ampu lki zawieraj ace plazmidowy DNA rozmro zono przez umieszczenie ich w la zni wodnej i zmieszano na worteksie. Zawartosc pipetowano do probówki wirówkowej zawieraj acej 10 ml po zywki i wirowano przy 10 tys. obrotów przez 5 min. Nads acz odsysano i komórki zawieszano w 10 ml swie- zej po zywki selekcyjnej (PS20 filtrowana przez filtr o srednicy porów 0,2 µm z 5% p lodow a surowic a bydl ec a diafiltrowan a przez filtr o srednicy porów 0,2 µm). Komórki umieszczono nast epnie w 100 ml kolbach z mieszad lem zawieraj acych 90 ml po zywki selekcyjnej. Po 1-2 dniach komórki przenoszono do 250 ml kolb z mieszad lem wype lnionych 150 ml po zywki selekcyjnej i inkubowano w 37°C. Po ko- lejnych 2-3 dniach 250 ml, 500 ml i 2000 ml kolb z mieszad lem zaszczepiano 3 x 10 5 komórek/ml. Po zywk e do hodowli komórkowej zmieniano na swie za przez wirowanie i zawieszano ponowniePL 206 846 B1 62 w po zywce produkcyjnej. Cho c jakiekolwiek u zyteczne pod lo ze dla CHO mo ze by c u zyte, to obecnie mo zna zastosowa c pod lo ze opisane w patencie US nr 5,122,469 z lo zonym 16 czerwca 1992. Produk- cyjn a kolb e z mieszad lem o obj eto sci 3 l zaszczepiono 1,2 x 10 6 komórek/ml. W dniu 0 okre slono licz- b e komórek i pH. W dniu 1 pobrano próbk e z kolby z mieszad lem i rozpocz eto wt laczanie przefiltro- wanego powietrza. W dniu 2 pobrano próbk e z kolby z mieszad lem, temperatur e zmieniono na 33°C i dodano 30 ml glukozy o st ezeniu 500 g/l i 0,6 ml 10% czynnika przeciw pianie (np. 35% emulsja polidimetylosiloksanu, Dow Corning 365 Medical Grade Emulsion). Podczas wytwarzania, gdy by lo to konieczne ustawiano pH na oko lo 7,2. Po 10 dniach lub w momencie gdy liczba zywych komórek spa- d la poni zej 70% hodowl e komórkow a zbierano przez wirowanie i filtrowano przez filtr o srednicy porów 0,22 µm. Filtrat przechowywano w 4°C lub niezw locznie nanoszono na kolumn e do oczyszczania. W przypadku konstruktów ze znacznikiem poli-His bia lka oczyszczano przy pomocy kolumny Ni-NTA (Quiagen). Przed oczyszczaniem do kondycjonowanego pod lo za dodano imidazol do st ezenia 5 mM. Kondycjonowane pod lo ze pompowano na 6 ml Ni-NTA kolumn e zrównowa zon a 20 mM HE- PES, pH 7,4 zawieraj acym 0,3 M NaCl i 5 mM imidazol przy szybko sci przep lywu 4-5 ml/min. w 4°C. Po naniesieniu kolumn e p lukano dodatkowym buforem równowa zacym i bia lko wymywano buforem równowa zacym zawieraj acym 0,25 M imidazol. Wysoce oczyszczone bia lko nast epnie odsalano do buforu do przechowywania zawieraj acego 10 mM Hepes, 0,14 M NaCl i 4% mannitol pH 6,8 na 25 ml kolumnie z G25 Superfine (Pharmacia) i przechowywano w -80°C. Konstrukty z immunoadhezyna (zawieraj ace Fc) oczyszczano z kondycjonowanej po zywki jak nast epuje. Kondycjonowan a po zywk e wpompowywano do 5 ml kolumny z bia lkiem A (Pharmacia), któr a zrównowa zono 20 mM sodowym buforem fosforanowym 6,8. Po naniesieniu kolumn e starannie wyp lukano buforem równowa zacym przed wymyciem 100 mM kwasem cytrynowym pH 3,5. Wymyte bia lko niezw locznie zoboj etniano przez zbieranie 1 ml frakcji do probówek zawieraj acych 275 µl 1 M buforu Tris pH 9. Wysoce oczyszczone bia lko nast epnie odsalano w buforze do przechowywania, jak to opisano powy zej dla bia lek wyznakowanych poli-His. Homogennosc oceniono przez elektroforez e w zelach poliakryloamidowych z SDS i N-ko ncow a sekwencj e aminokwasow a okre slono przez degra- dacj e Edmana. P r z y k l a d 6 Ekspresja TCCR w dro zd zach Poni zszy sposób opisuje ekspresj e TCCR poprzez rekombinowanie DNA w dro zd zach. Najpierw skonstruowano wektory ekspresyjne dla wewn atrzkomórkowego wytwarzania lub se- krecji TCCR z promotora ADH2/GAPDH. DNA koduj acy TCCR i promotor jest wstawiony w dogodne miejsca restrykcyjne wybranego plazmidu dla wewn atrzkomórkowej ekspresji TCCR. Dla wydzielania, DNA koduj acy TCCR mo ze by c sklonowany w wybranym plazmidzie wraz z DNA koduj acym promotor ADH2/GAPDH, naturalny polipeptyd sygna lowy TCCR lub inny sygna lowy polipeptyd ssaczy lub przy- k ladowo sygnal sekrecyjny dro zd zowego czynnika alfa lub inwertazy i sekwencje lacznikowe (je sli potrzeba) dla ekspresji TCCR. Komórki dro zd zowe, takie jak szczep dro zd zowy szczepu AB110 mog a nast epnie by c transfor- mowane opisanymi powy zej plazmidami ekspresyjnymi i hodowane w wybranym pod lozu fermenta- cyjnym. Nads acza z hodowli transformowanych dro zd zy O mog a by c analizowane przez wytr acenie 10% kwasem trichlorooctowym i rozdzia l przez SDS-PAGE, a nast epnie barwienie zeli b lekitem Co- omasie. Rekombinowany TCCR mo ze nast epnie by c wyizolowany i oczyszczony przez usuni ecie komó- rek dro zd zowych z po zywki fermentacyjnej przez wirowanie, a nast epnie zatezenie po zywki przy po- mocy wybranych zestawów filtrów. Koncentrat zawieraj acy TCCR mo ze by c dalej oczyszczony przez chromatografi e na kolumnie z wybranymi z lozami. P r z y k l a d 7 Ekspresja TCCR w komórkach owadzich zaka zonych bakulowirusem. Poni zszy sposób opisuje ekspresj e TCCR poprzez rekombinowanie DNA w komórkach owa- dzich zaka zonych bakulowirusem. Sekwencja koduj aca TCCR jest przy laczona powy zej epitopu znacznikowego zawartego w wek- torze ekspresyjnym dla bakulowirusa. Takie epitopy znacznikowe obejmuj a znaczniki poli-His i znacz- niki immunoglobulinowe (takie jak region Fc IgG). Zastosowane mog a by c ró zne plazmidy, w lacznie z plazmidami pochodz acymi z komercyjnie dost epnych plazmidów, takich jak pVL1393 (Novagen). Krót- ko, sekwencja koduj aca TCCR lub po zadana cz esc sekwencji koduj acej TCCR [taka jak sekwencja koduj aca zewn atrzkomórkowa domen e lub bia lko transb lonowe lub sekwencja koduj aca dojrza le bia l-PL 206 846 B1 63 ko, je sli bia lko jest zewn atrzkomórkowe] jest amplifikowana przez PCR ze starterami komplementar- nymi do regionów 5' i 3'. Starter 5' mo ze zawiera c flankuj ace (wybrane) miejsca restrykcyjne. Produkt jest nast epnie trawiony tymi wybranymi enzymami restrykcyjnymi i subklonowany do wektora ekspre- syjnego. Rekombinowany bakulowirus jest wytwarzany przez kotransfekcj e powy zszym plazmidem i Ba- culoGold™ wirusowym DNA (Pharmingen) komórek Spodoptera frugiperda („Sf9”) (ATCC CRL 1711) przy pomocy lipofektyny (komercyjnie dost epnej z GIBCO-BRL). Po 4-5 dniach inkubacji w 28°C uwolnione wirusy s a zbierane i stosowane do dalszego namna zania. Infekcja wirusowa i ekspresja bia lka s a przeprowadzone jak to opisali O'Reilley i wsp., Baculovirus Expression Vectors: A Laborato- ry Manua l, Oxford: Oxford University Press (1994). Wyra zony TCCR ze znacznikiem poli-His mo ze by c nast epnie oczyszczony przyk ladowo przez chromatografi e powinowactwa z chelatem Ni 2+ jak nast epuje. Ekstrakty s a przygotowane ze rekombi- nowanych, zaka zonych wirusem komórek Sf9, jak to opisali Rupert i wsp., Nature, 362: 175-179 (1993). Krótko, komórki Sf9 s a p lukane, zawieszane w buforze do rozbijania ultrad zwi ekami (25 ml Hepes pH 7,9; 12,5 mM MgCl 2 ; 0,1 mM EDTA; 10% glicerol; 0,1% NP40; 0,4 M KCl) i dwukrotnie roz- bijane ultrad zwi ekami przez 20 sek. w lodzie. Roztwory po rozbijaniu ultrad zwi ekami oczyszczane s a przez wirowanie i nads acza rozcie nczane 50-krotnie w buforze do nanoszenia (50 mM bufor fosfora- nowy, 300 mM NaCl, 10% glicerol, pH 7,8) i filtrowano przez filtry o porach 0,45 µm. Agarozowa ko- lumna Ni 2+ -NTA (komercyjnie dost epna z Qiagen) jest przygotowana tak, ze jej obj eto sc wynosi 5 ml, p lukana jest 25 ml wody i równowa zona 25 ml buforu do nanoszenia. Przefiltrowany ekstrakt komór- kowy jest naniesiony na kolumn e z szybko scia 0,5 ml na minut e. Kolumna jest p lukana do warto sci podstawowej A 280 buforem do nanoszenia i od tego momentu rozpoczyna si e zbieranie frakcji. Na- st epnie kolumna jest p lukana drugim buforem do p lukania (50 mM fosforanu; 300 mM NaCl, 10% gli- cerol, pH 6,0) wymywaj acym niespecyficznie zwi azane bia lko. Po uzyskaniu ponownie warto sci pod- stawowej A 280 kolumna jest rozwijana 0 do 500 mM gradientem imidazolu w drugim buforze do p luka- nia. Zebrane s a 1 ml frakcje, które analizowane s a przez SDS-PAGE i barwienie srebrem lub technik a Western z Ni 2+ -NTA skoniugowanym z alkaliczn a fosfataz a (Quiagen). Frakcje zawieraj ace wymyte TCCR ze znacznikiem Hisio s a zbierane i dializowane wobec buforu do nanoszenia. Alternatywnie, oczyszczanie TCCR ze znacznikiem IgG (lub znacznikiem Fc) mo ze by c prze- prowadzone przy pomocy znanych technik chromatografii, obejmuj acych przyk ladowo kolumn e chro- matograficzn a z bia lkiem A lub bia lkiem G. Alternatywnie, cz asteczki TCCR tu opisane mog a by c wyra zone przy pomocy zmodyfikowanej procedury dla bakulowirusa wykorzystuj acej komórki Hi5. W tej procedurze DNA koduj acy pozadan a sekwencj e jest amplifikowany przy zastosowaniu odpowiednich systemów, takich jak Pfu (Startagene) lub przy laczony powy zej po stronie (5') epitopu znacznikowego zawartego w wektorze ekspresyjnym dla bakulowirusa. Takie epitopy znacznikowe obejmuj a znaczniki poli-His i znaczniki immunoglobuli- nowe (takie regiony Fc z IgG). Ró znorodne plazmidy mog a by c u zyte, w lacznie z plazmidami pocho- dz acymi z komercyjnie dost epnych plazmidów, takich jak pIE-1 (Novagen). Wektory pIE1-1 i pIE1-2 s a zaprojektowane dla konstytutywnej ekspresji rekombinowanych bia lek z bakulowirusowego promotora ie 1 w stabilnie transformowanych komórkach owadzich. Plazmidy ró zni a si e jedynie orientacj a zgru- powania miejsc do klonowania i wszystkie zawieraj a sekwencje promotorowe, o których wiadomo, ze s a wa zne dla ekspresji genu zale znej od ie 1 w niezaka zonych komórkach owadzich, jak równie z ele- mentu wzmacniacza hr5. pIE1-1 i pIE1-2 zawieraj a miejsce inicjacji translacji ie 1 i mog a by c u zyte do wytwarzania bia lek fuzyjnych. Krótko, pozadane sekwencje lub pozadana cz es c sekwencji (taka jak sekwencja koduj aca zewn atrzkomórkowa domen e bia lka transb lonowego jest amplifikowana poprzez PCR ze starterami komplementarnymi do regionów 5' i 3'. Starter 5' mo ze zawiera c flankuj ace (wybra- ne) miejsca dla enzymów restrykcyjnych. Produkt jest nast epnie trawiony wybranymi enzymami re- strykcyjnymi i subklonowany do wektora ekspresyjnego. Przyk ladowo, pochodne pIE1-1 mog a zawie- ra c region Fc ludzkiej IgG (pb.PH.IgG) lub o smio-histydynowy znacznik (pb.PH.His) poni zej (po stronie 3') pozadanej sekwencji. Dogodnie, dla potwierdzenia ustalana jest sekwencja nukleotydow a kon- struktu wektora. Komórki Hi5 s a hodowane do 50% konfluencji w warunkach 27°C bez CO 2 , bez pen/strep. Dla ka zdej szalki o srednicy 150 mm 30 µg wektora opartego na pIE zawieraj acego sekwencj e mieszano z 1 ml po zywki Ex-Cell (po zywka: Ex-Cell 401 + 1/100 L-Glu JRH Bioscience #14401-78P (uwaga: po zywka ta jest wra zliwa na swiat lo)). Niezale znie zmieszano 100 µl Celi Fectin (CellFECTIN, Gibco BRL # 10362-010, wst epnie zamieszanej na worteksie) z 1 ml po zywki Ex-Cell. Dwa roztwory po la-PL 206 846 B1 64 czono i inkubowano w temperaturze pokojowej przez 15 minut. 8 ml po zywki Ex-Cell dodano do 2 ml mieszaniny DNA/CellFECTIN i nak ladano to na komórki Hi5, które by ly raz przemyte po zywk a Ex-Cell. P lytk e nast epnie inkubowano w ciemno sci przez 1 godzin e w temperaturze pokojowej. Mieszanina DNA/CellFECTIN jest nast epnie odsysana i komórki s a raz przemywane Ex-Cell w celu usuni ecia nadmiaru CellFECTIN. Dodaje si e 30 ml swie zej po zywki Ex-Cell i komórki inkubuje 3 dni w 28°C. Nads acz zbiera si e i ekspresj e sekwencji z bakulowirusowego wektora ekspresyjnego okre sla przez wi azanie 1 ml nads aczu z 25 ml z lo za Ni-NTA (QIAGEN) dla bia lek ze znacznikiem histydynowym lub kulkami bia lko-A Sepharose CL-4B (Pharmacia) dla bia lek ze znacznikiem IgG, a nast epnie analizuje przez SDS-PAGE porównuj ac ze znanym standardem bia lkowym poprzez barwienie b lekitem Co- omassie. Kondycjonowane pod lo ze ze transfekowanych komórek (od 0,5 do 3 1) zbierane jest przez wi- rowanie celem usuni ecia komórek i filtrowanie przez filtry o wielko sci porów 0,22 µ. Dla konstruktów ze znacznikiem poli-His, bia lko zawieraj ace sekwencj e jest oczyszczane przy pomocy kolumny Ni- NTA (Qiagen). Przed oczyszczeniem, przez kolumn e przepuszczany jest imidazol przy szybko sci przep lywu 4-5 ml/min. w 48°C. Po za ladowaniu, kolumna jest p lukana przez dodanie buforu równowa- zacego i bia lko jest wymywane buforem równowazacym zawieraj acym 0,25 M imidazol. Wysoce oczyszczone bia lko jest nast epnie odsalane do buforu do przechowywania zawieraj acego 10 mM Hepes, 0,14 M NaCl i 4% mannitol pH 6,8 na 25 ml kolumnie G25 Superfine (Pharmacia) i przecho- wywane w -80°C. Konstrukty do immunoadhezji (zawieraj ace Fc) mo zna równie z oczyszcza c z kondycjonowane- go pod lo za jak nast epuje: Kondycjonowane pod lo ze jest pompowane na 5 ml kolumn e z bia lkiem A (Pharmacia), któr a wcze sniej zrównowa zono 20 mM sodowym buforem fosforanowym pH 6,8. Po za ladowaniu kolumn e intensywnie p lucze sie buforem do równowa zenia przed wymywaniem 100 mM kwasem cytrynowym o pH 3,5. Wymyte bia lko jest niezw locznie zoboj etniane przez zbieranie 1 ml frakcji w probówkach zawieraj acych 275 µl 1 M buforu Tris pH 9. Wysoce oczyszczone bia lko jest nast epnie odsalane w buforze do przechowywania, jak to opisano powy zej dla bia lek ze znacznikiem poli-His. Homogennosc jest oceniona przez elektroforez e w zelach poliakryloamidowych z SDS i przez okre slenie sekwencji N-ko ncowych aminokwasów przez degradacj e Edmana. P r z y k l a d 8 Przygotowanie przeciwcia l wiaz acych TCCR. Przyk lad ilustruje przygotowanie przeciwcia l monoklonalnych swoi scie wiaz acych TCCR. Sposoby wytwarzania przeciwcia l monoklonalnych s a znane w tej dziedzinie i s a opisane przy- k ladowo przez Goding, jak wy zej. Immunogeny, które mog a by c u zyte obejmuj a oczyszczony TCCR, bia lka fuzyjne zawieraj ace TCCR i komórki wyra zaj ace rekombinowany TCCR na powierzchni komór- ki. Selekcja immunogenu mo ze by c dokonana przez bieg lego w tej dziedzinie bez zb ednego ekspe- rymentowania. Myszy, takie jak Balb/c s a immunizowane immunogenem TCCR zemulgowanym w pe lnym ad- iuwancie Freunda i wstrzykni ete podskórnie lub dootrzewnowe w ilo sci 1-100 µg. Alternatywnie, im- munogen jest emulgowany w adiuwancie MPL-TDM (Ribi, Immunochemical Reasearch, Hamilton, MT) i wstrzykiwany do poduszeczki tylnej lapy. Immunizowane myszy s a nast epnie doszczepiane dawk a przypominaj ac a 10 do 12 dni pó zniej dodatkowym immunogenem zemulgowanym w wybranym adiuwancie. Nast epnie po kilku tygodniach myszy moga równie z by c doszczepiane dawk a przypomi- naj ac a dodatkowym zastrzykiem immunizuj acym. Okresowo mog a by c otrzymywane próbki surowicy od myszy przez skrwawianie z tylnej zy ly ocznej, w celu badania w oznaczeniach ELISA dla wykrycia przeciwcia l anty-TCCR. Po wykryciu odpowiedniego miana przeciwcia l zwierz eta „dodatnie” pod wzgl edem przeciwcia la mog a by c nastrzykni ete ostatnim, do zylnym zastrzykiem TCCR. 3 do 4 dni pó zniej myszy s a zabijane i zbierane s a komórki sledziony. Komórki sledziony s a nast epnie poddawane fuzji (przy pomocy 35% glikolu polietylenowego) z komórkami wybranej linii komórkowej szpiczaka, takiej jak P3X63AgU.l, dost epnej z ATCC, nr CRL.1597. W wyniku fuzji uzyskuje si e komórki hybrydomy, które nast epnie mog a by c umieszczone w 96- -studzienkowej p lytce do hodowli tkankowej zawieraj acej po zywk e HAT (hipoksantyna, aminopteryna i tymidyna) dla zahamowania proliferacji komórek, które nie uleg ly fuzji, hybryd szpiczaka i hybryd komórek sledziony.PL 206 846 B1 65 Komórki hybrydomy s a sprawdzane w te scie ELISA pod k atem reaktywno sci anty-TCCR. Iden- tyfikacja „dodatnich” komórek hybrydomy wydzielaj acych po zadane przeciwciala monoklonalne anty- TCCR mie sci si e w zakresie umiej etno sci specjalisty w tej dziedzinie. Dodatnie komórki hybrydomy mog a by c wstrzykiwane dootrzewnowe syngenicznymj myszom Balb/c dla wytworzenia p lynu puchlinowego zawieraj acego przeciwcia la monoklonalne anty-TCCR. Alternatywnie, komórki hybrydomy mog a by c hodowane w kolbach do hodowli tkankowej lub w obra- canych butlach. Oczyszczanie wytworzonych monoklinalnych przeciwcia l w p lynie wysi ekowym mo ze by c osi agni ete przy pomocy wytr acania siarczanem amonu, a nast epnie przez s aczenie molekularne. Alternatywnie, zastosowana mo ze by c chromatografia powinowactwa oparta na wi azaniu przeciwcia la z bia lkiem A lub bia lkiem G. P r z y k l a d 9 Oczyszczanie polipeptydów TCCR przy pomocy swoistych przeciwcia l. Naturalne lub rekombinowane polipeptydy TCCR mog a by c oczyszczone ró znymi, typowymi sposobami oczyszczania bia lek, które s a znane w tej dziedzinie. Przyk ladowo, polipeptyd pro-TCCR, dojrza ly polipeptyd TCCR lub polipetyd pre-TCCR mo ze by c oczyszczony przez chromatografi e im- munopowinowactwa przy pomocy przeciwcia l swoistych dla polipeptydu TCCR b ed acego przedmio- tem zainteresowania. Ogólnie, kolumna immunopowinowactwa jest konstruowana przez kowalencyjne wi azanie przeciwcia la anty-polipeptyd TCCR z aktywowanym z lo zem chromatograficznym. Poliklonalne immunoglobuliny s a przygotowane z surowicy odporno sciowej b ad z przez wytr a- cenie siarczanem amonu b ad z przez oczyszczenie na unieruchomionym bia lku A (Pharmacia LKB Biotechnology, Piscataway, N.J.). Podobnie przeciwcia la monoklonalne s a przygotowywane z p lynu puchlinowego myszy przez wytr acenie siarczanem amonu lub chromatografi e na unieruchomionym bia lku A. Cz esciowo oczyszczona immunoglobulin a jest wi azana kowalencyjnie ze z lo zem chromato- graficznym, takim jak SEPHAROSE™ aktywowana CnBr (Pharmacia LKB Biotechnology). Przeciwcia- lo jest wi azane ze z lo zem, z lo ze jest blokowane i zmodyfikowane z lo ze jest p lukane zgodnie z zalece- niami producentów. Taka kolumna immunopowinowactwa jest wykorzystywana w oczyszczaniu polipeptydu TCCR przez przygotowanie frakcji z komórek zawieraj acych polipeptyd TCCR w rozpuszczalnej postaci. Preparat taki jest modyfikowany przez up lynnienie ca lej komórki lub frakcji wewn atrzkomórkowej otrzymanej przez wirowanie ró znicowe, przez dodanie detergentu lub innymi sposobami dobrze zna- nymi w tej dziedzinie. Alternatywnie, rozpuszczalny polipeptyd TCCR zawieraj acy sekwencj e sygna- low a mo ze by c wydzielony w u zytecznych ilo sciach do po zywki, w której s a hodowane komórki. Preparat zawieraj acy rozpuszczalny polipeptyd TCCR jest przepuszczany przez kolumn e im- munopowinowactwa i kolumna jest p lukana w warunkach umo zliwiaj acych preferencyjne wi azanie polipeptydu TCCR (np. wysoka si la jonowa buforów w obecno sci detergentu). Nast epnie kolumna jest wymywana w warunkach rozrywaj acych wi azanie polipeptydu TCCR/przeciwcia lo (niskie pH buforu, tak jak np. pH 2-3 lub wysokie st ezenie substancji chaotropowej, takiej jak mocznik lub jony rodanko- we) i zbierany jest polipeptyd TCCR. P r z y k l a d 10 Wyszukiwanie leku Zastosowane mog a by c sposoby, które s a szczególnie u zyteczne do wyszukiwania zwi azków przez u zycie polipeptydów TCCR lub zwi azanie jego fragmentów w jakiejkolwiek odmianie sposobu wyszukiwania leku. Polipeptyd TCCR lub jego fragment stosowany w takim te scie mo ze by c wolny w roztworze, unieruchomiony na z lo zu sta lym, prezentowany na powierzchni komórki lub umiejsco- wiony wewn atrz komórki. Jeden sposób wyszukiwania leku wykorzystuje eukariotyczne lub prokario- tyczne komórki gospodarza stabilnie transformowane rekombinowanymi kwasami nukleinowymi i wy- ra zaj ace polipeptyd TCCR lub jego fragment. Leki s a sprawdzane wobec takich transformowanych komórek w kompetycyjnych testach wi azania. Takie komórki, zarówno zywe, jak i w utrwalonej posta- ci, mog a by c stosowane w typowych testach wi azania. Przyk ladowo mo zna mierzy c tworzenie kom- pleksu pomi edzy polipeptydem TCCR lub jego fragmentem i testowanym czynnikiem. Alternatywnie, mo zna bada c zmniejszenie tworzenia kompleksu pomi edzy polipeptydem TCCR i komórk a dla niego docelow a lub docelowymi receptorami, spowodowan a przez badany czynnik. A zatem, zgodnie z wynalazkiem opisano sposoby wyszukiwania leków lub jakichkolwiek innych czynników, które mog a wp lywa c na chorob e lub zaburzenie zwi azane z polipeptydem TCCR. Sposoby te obejmuj a doprowadzenie do kontaktu takiego czynnika z polipeptydem TCCR lub jego fragmentem i badania (i) obecno sci kompleksów pomi edzy czynnikiem i polipeptydem TCCR lub fragmentem, alboPL 206 846 B1 66 (ii) obecno sci kompleksu pomi edzy polipeptydem TCCR lub fragmentem i komórk a, sposobami zna- nymi w tej dziedzinie. W takich testach kompetycyjnych polipeptyd TCCR lub jego fragment jest za- zwyczaj wyznakowany. Po odpowiedniej inkubacji wolny polipeptyd TCCR lub jego fragment jest od- dzielany od wyst epuj acego w postaci wolnej i ilo sc wolnego lub nie skompleksowanego znacznika jest miar a zdolno sci danego czynnika do wi azania polipeptydu TCCR lub przeszkadzania w tworzeniu si e kompleksu polipeptyd TCCR/komórka. Inna technika wyszukiwania leków dostarcza wysokowydajnego wyszukiwania zwi azków maj a- cych odpowiednie powinowactwo wi azania z polipeptydem, co szczegó lowo opisano w WO 84/03564 opublikowanym 13 wrze snia 1984. Krótko, du za liczba ró znych, ma lych testowanych zwi azków pepty- dowych jest syntetyzowana na fazie sta lej, takiej jak plastyk lub inna powierzchnia. W odniesieniu do polipeptydu TCCR testowane zwi azki peptydowe s a poddawane reakcji z polipeptydem TCCR i p lu- kane. Zwi azany polipeptyd TCCR wykrywa si e sposobami dobrze znanymi w tej dziedzinie. Oczysz- czony polipeptyd TCCR mo ze równie z by c op laszczony bezpo srednio na p lytkach do zastosowania w wy zej wspomnianych sposobach wyszukiwania leków. Ponadto, nie-neutralizuj ace przeciwcia la mog a by c zastosowane do wychwycenia peptydu i unieruchomienia go na pod lo zu sta lym. Zgodnie z wynalazkiem rozwa zane jest równie z zastosowanie kompetycyjnych testów wyszuki- wania leków, w których neutralizuj ace przeciwcia la zdolne do wi azania polipeptydu TCCR specyficznie konkuruj a z badanym zwi azkiem o wi azanie z polipeptydem TCCR lub jego fragmentami. W ten spo- sób przeciwcia la mog a by c zastosowane do wykrywania obecno sci jakiegokolwiek peptydu posiadaj a- cego wspóln a jedn a lub wi ecej antygenowych determinant z polipeptydem TCCR. P r z y k l a d 11 Racjonalne projektowanie leku Celem racjonalnego projektowania leku jest wytworzenie strukturalnych analogów biologicznie aktywnego polipeptydu b ed acego przedmiotem zainteresowania (tj. polipeptydu TCCR) lub ma lych cz asteczek, z którymi oddzia luj a, np. agonistów, antagonistów lub inhibitorów. Którykolwiek z tych przyk ladów mo ze by c zastosowany do projektowania leków, które s a bardziej aktywnymi lub bardziej stabilnymi postaciami polipeptydu TCCR, lub które zwiekszaj a lub przeszkadzaj a w funkcji in vivo polipeptydu TCCR (Hodgson, Bio/Technology 9: 19-21 (1991)). W jednym z podej sc, okre sla si e trójwymiarow a struktur e polipeptydu TCCR lub kompleksu po- lipeptyd TCCR-inhibitor, krystalografi a rentgenowsk a, przez modelowanie komputerowe lub najcz e- sciej przez kombinacj e tych podejsc. Zarówno kszta lt, jak i ladunki polipeptydu TCCR musz a zosta c potwierdzone dla uzyskania struktury i okre slenia aktywnego(ych) miejsca(miejsc) cz asteczki. Rza- dziej, u zyteczna informacja dotycz aca struktury polipeptydu TCCR mo ze by c uzyskana przez mode- lowanie oparte na strukturze homologicznych bia lek. W obu przypadkach, odpowiednia informacja strukturalna jest stosowana do zaprojektowania analogicznej cz asteczki typu polipeptyd TCCR lub do zidentyfikowania skutecznych inhibitorów. U zyteczne przyk lady racjonalnego projektowania leku mog a obejmowa c cz asteczki o udoskonalonej aktywno sci lub stabilno sci, jak to pokazali Braxton i Wells, Biochemistry 31: 7796-7801 (1992) lub które dzia laj a, jako inhibitory, agoni sci lub antagoni sci natyw- nych peptydów, jak to pokazali Athauda i wsp., J. Blochem. 113: 742-746 (1993). Mo zliwym jest równie z wyizolowanie swoistego dla celu przeciwcia la wyselekcjonowanego po- przez test funkcjonalny, taki jak opisano powy zej i nast epnie rozwiazanie struktury jego kryszta lu. Podej scie to zasadniczo daje podstaw e, na której mo ze si e opiera c dalsze projektowanie leku. Mo zli- wym jest omini ecie krystalografii przez wytworzenie przeciwcia l anty-idiotypowych (anty-id) dla funk- cjonalnego, farmakologicznie aktywnego przeciwcia la. Jako lustrzane odbicie lustrzanego odbicia oczekuje si e, ze miejsce wi azania anty-id b edzie analogiem oryginalnego receptora. Tak wi ec, anty-id mo ze by c zastosowany do identyfikacji polipeptydów z banków peptydów wytworzonych chemicznie lub biologicznie. Wyizolowane peptydy b ed a, zatem dzia laly, jako wzorce farmakologiczne. Dzi eki niniejszemu wynalazkowi dostateczne ilo sci polipeptydu TCCR mog a by c dost epne dla przeprowadzenia takich analitycznych bada n, jak krystalografia rentgenowska. Ponadto, wiedza o se- kwencji aminokwasowej polipeptydu TCCR, któr a tu dostarczono, dostarcza wskazówki przy stosowaniu technik modelowania komputerowego zamiast lub dodatkowo do krystalografii rentgenowskiej. Tabela 2(A-D) przedstawia hipotetyczne przyk lady zastosowania ni zej opisanego sposobu okre slenia procentu identyczno sci sekwencji aminokwasowej (tabela 2(A-B)) i procentu identyczno sci sekwencji nukleotydowej (tabela 2(C-D)) przy pomocy programu komputerowego porównuj acego se- kwencje ALIGN-2, gdzie „PRO” przedstawia sekwencj e aminokwasow a hipotetycznego polipeptydu tu opisanego b ed acego przedmiotem zainteresowania, „porównanie bia lka” przedstawia sekwencj ePL 206 846 B1 67 aminokwasow a polipeptydu wzgl edem którego polipeptyd „PRO” b ed acy przedmiotem zainteresowa- nia jest porównany, „PRO-DNA” przedstawia sekwencj e kwasu nukleinowego b ed acego przedmiotem zainteresowania koduj aca hipotetyczn a „PRO”, „porównanie DNA” przedstawia sekwencj e nukleoty- dow a cz asteczki kwasu nukleinowego, wzgl edem której cz asteczka kwasu nukleinowego b ed aca przedmiotem zainteresowania „PRO-DNA” jest porównana, „X”, „Y” i „Z”, ka zda przedstawia inny hipo- tetyczny aminokwas, a „N”, „L”, i „V”, ka zda przedstawia inny z hipotetycznych nukleotydów. P r z y k l a d 12 Rola TCCR w wytwarzaniu odpowiedzi immunologicznej. Odpowiedzi komórek T: Dla odpowiedzi anty-KLH myszy immunizowano 100 µg KLH w soli fi- zjologicznej w emulsji 1:1 z CFA, zawieraj acej 1 mg/ml Mycobacterium tuberculosis szczep H37Ra (Difco Laboratories, Detroit, MI) podan a w poduszki lap. Po 9 dniach usuni eto podkolanowe w ez ly limfatyczne i przygotowano zawiesin e komórek. Komórki w ez la limfatycznego hodowano (5 x 10 5 na studzienk e) w ró znych st ezeniach KLH w po zywce DMEM uzupe lnionej 5% FCS. Proliferacj e mierzo- no przez dodanie 1 µCi. [ 3 H]-tymidyny (ICN, Irvine, CA] na ostatnie 18 godzin 5-dniowej hodowli i wbu- dowanie radioaktywno sci zmierzono przez zliczenie scyntylacji w p lynie. Testy wytwarzania cytokin przez komórki T przeprowadzono poprzez hodowanie 5 x 10 5 komórek w ez la limfatycznego zarówno z myszy uczulonych KLH dzikiego typu jak i myszy z brakiem TCCR w obecno sci wskazanych ilo sci KLH w 96-studzienkowych p lytkach w ko ncowej obj eto sci 200 ml. Po 96 godzinach hodowli, 150 µl nads aczu hodowlanego usuni eto z ka zdej studzienki i poziomy cytokin okre slono przez ELISA stosu- jac przeciwcia la z Pharmingen (San Diego, CA) w zalecanych warunkach. Indukcja in vitro ró znicowania komórek T: Komórki T CD4 + ze sledziony i w ez lów limfatycznych z noworodków typu dzikiego lub z brakiem TCCR oczyszczano przy pomocy ziaren magnetycznych z przeciwcia lami anty-CD4 (MACS). Oczyszczone komórki T 10 6 komórek/ml aktywowano w obecno- sci napromieniowanych (3000 radów) syngenicznych komórek typu dzikiego lub z nokautem APC (10Vml) i ConA (2,5 µg/ml, Boehringer Mannheim, Niemcy) lub przez wysianie na p lytki op laszczone 5 µg/ml przeciwcia la przeciw CD3 i 1 µg/ml przeciwcia la przeciw CD28. Po zywk e hodowlan a uzupe lnia- no IL-2 (20 jedn./ml), IL-12 (3,5 ng/ml, R&D Systems) i 500 ng/ml przeciwcia la anty IL-4 (Pharmingen) dla ró znicowania TH1 i z IL-2 (20 jedn./ml), IL-4 (10 3 jedn./ml, R&D Systems) i 500 ng/ml przeciwcia la przeciw IFN (Pharmingen) dla ró znicowania Th2. Po trzech dniach komórki lizowano dla ekstrakcji RNA lub intensywnie p lukano, obliczano i ponownie pobudzano w stezeniu 10 6 komórek/ml, zarówno w obecno sci ConA (2,5 µg/ml) jak i na p lytkach op laszczonych 5 µg/ml przeciwcia la anty-CD3. Po 24 godzinach nads acza zbierano i badano pod k atem wyst epowania cytokin. Ca lkowite i OVA-swoiste poziomy immunoglobulin: Nieimmunizowane myszy w wieku 12 tygo- dni i starsze skrwawiano i surowic e badano pod k atem wyst epowania ró znych izotypów immunoglobu- lin poprzez ELISA. Dla przeciwcia l swoistych wobec OVA sze sciotygodniowe myszy typu dzikiego lub z brakiem TCCR immunizowano 100 µg OVA w pe lnym adiuwancie Freunda dootrzewnowe (i.p.) i 21 dni pó zniej podawano im 100 µg OVA w niepe lnym adiuwancie Freunda (i.p.). Siedem dni po podaniu myszy skrwawiano i surowic e badano pod k atem obecno sci przeciwcia l swoistych wzgl edem OVA. Analiza PCR w czasie rzeczywistym: Mysie splenocyty podzielono na pomocnicze komórki T (CD4 dodatnie, F4/80 ujemne, 97% czysto sci), komórki B (CD19 dodatnie, 97% czystosci), komórki naturalnych zabójców (NK1.1 dodatnie, 99% czysto sci) i makrofagi (F4/80 dodatnie, wi ecej ni z 95% czystosci) poprzez FACS i na cytotoksyczne komórki T (CD8 dodatnie, 85% czysto sci) poprzez MACS. Ca lkowity RNA wyekstrahowano przy pomocy kolumienek Qiagen RNeasy i strawiono DNAz a I dla usuni ecia zanieczyszczenia DNA. RNA sondowano pod k atem TCCR stosuj ac Taqman 18. Wszystkie reakcje przeprowadzono w dwóch powtórzeniach i normalizowano wobec rp119, rybosomal- nego genu o sta lej ekspresji. Uwzgl edniono kontroln a reakcj e bez RT, która pokaza la, ze wszystkie próbki by ly wolne od zanieczyszcze n DNA. Sekwencje wszystkich starterów i sond opisano na fg. 19. Myszy typu dzikiego i z brakiem TCCR immunizowano hemocyjanin a ze ska loczepa (KLH) i w ez ly ch lonne zebrane 9 dni pó zniej oceniano pod wzgl edem produkcji cytokiny po pobudzeniu in vitro KLH (fig. 16A i B). Zdolno sc komórek z brakiem TCCR do wytwarzania IFN by la znacz aco zabu- rzona przy pobudzaniu KLH, podczas gdy wytwarzanie IL-4 by lo znacz aco zwi ekszone. Wytwarzanie IL-5 i indukowana antygenem proliferacja w komórkach w ez lów limfatycznych z brakiem TCCR uczu- lanych in vivo by la normalna (fig. 16C i D). Prawid lowe poziomy wytwarzania IFN mierzono po pobu- dzeniu LPS myszy z brakiem TCCR, co wykazuje, ze przypuszczalnie nie mia ly wrodzonego zaburze- nia produkcji IFN. Wyniki te wykazuj a, ze myszy z brakiem TCCR maja zaburzon a zdolno sc do uzy- skiwania odpowiedzi Th1. Utrata odpowiedzi Th1 jest kojarzona ze zwi ekszon a odpowiedzi a Th2,PL 206 846 B1 68 podobn a do obserwowanej u myszy z brakiem cytokin Th1, takich jak IL-12 (Magram, J. i wsp., 1996, Immunity, 4: 471-81; Wu, C. i wsp., 1997, J. Immunol. 159: 1658-65). Dodatkowo do roli w regulowaniu komórkowej odpowiedzi immunologicznej, IFN uczestniczy równie z w regulacji izotypu immunoglobulin (Ig). W szczególno sci o IFN wiadomo, ze zwi eksza wytwa- rzanie przeciwcia l IgG2a i w mniejszym zakresie przeciwcia l IgG3 (Snapper, C. M. & Paul, W. E. 1987, Science, 236: 944-7; Huang, S., i wsp., 1993, Science 259: 1742-5). Zgodnie ze zmniejszonym wy- twarzaniem IFN przez komórki Th1 myszy z brakiem TCCR maj a zmniejszone ca lkowite stezenia IgG2a w surowicy, podczas gdy poziom wszystkich innych izotypów immunoglobulin by l normalny (fig. 17A). Ponadto, po pobudzeniu in vivo owoalbumin a (OVA), myszy z brakiem TCCR posiada ly owa znie zmniejszone miana IgG2a swoistych wobec OVA (~20% kontroli; fig. 17B). Odpowied z Th1 jest kluczowa dla obrony przeciw wewn atrzkomórkowym patogenom, takim jak Listeria monocytogenes [L. monocytogenes). Dla dalszego okre slenia roli TCCR in vivo w kontrolowaniu odpowiedzi Th1, myszy z brakiem TCCR i noworodki kontrolne zaka zano subletaln a dawk a L. monocy- togenes (3 x 10 4 jednostek tworz acych kolonii (CFU)). Miana bakterii okre slano 3 dni lub 9 dni po zaka- zeniu i stwierdzono, ze s a one do 10 6 razy wy zsze w w atrobach myszy z brakiem TCCR (fig. 17C). Nast epnie badano rol e TCCR w po sredniczeniu w ró znicowaniu odpowiedzi Th1 in vitro. Ko- mórki T CD4+ z myszy typu dzikiego i z brakiem TCCR ró znicowano in vitro w obecno sci napromie- niowanych APC w warunkach, które preferowa ly b ad z rozwój Th1 b ad z Th2. Po 3-4 dniach w hodowli komórki p lukano i ponownie pobudzano ConA i, 24 godziny pó zniej, nads acza badano pod k atem obecno sci cytokin. Gdy ró znicowa ly si e w komórki Th1 limfocyty z brakiem TCCR wytwarza ly 80% mniej IFN ni z w przypadku noworodków typu dzikiego (fig. 18A). Przeciwnie, limfocyty z brakiem TC- CR hodowane w obecno sci IL-4 i przeciwcia l anty-IFN produkowa ly nieznacznie wi ecej IL-4. Podobne wyniki otrzymano dla naiwnych komórek T CD4 + CD45Rb high . Efekt ten jest przypisany do komórkom T z dwóch powodów: po pierwsze podobne wyniki uzyskano, gdy komórki T ró znicowa ly si e w obecno- sci APC pochodz acych od myszy typu dzikiego lub z brakiem TCCR. Po drugie efekt powtarza l si e w systemie bez APC, gdzie ró znicowanie komórek T przeprowadzano przy zastosowaniu unierucho- mionych na p lytce przeciwcia l anty-CD3/CD28 (fig. 18B). Zmniejszenie wytwarzania IFN korelowa lo równie z ze zmniejszeniem liczby komórek wytwarzaj acych IFN co zmierzono przez wewn atrzkomór- kowe barwienie FACS. Obserwowany brak Th1 nie wydaje si e by c wynikiem defektu w receptorze IL-12 bowiem obie podjednostki receptora ulegaly prawid lowej ekspresji w aktywowanych komórkach T. Poniewa z IL-12 nadal mo ze zapocz atkowywa c proliferacj e pobudzonych ConA komórek T z myszy typu dzikiego i z brakiem TCCR, to wydaje si e, ze nie ma defektu, u tych myszy, w szlaku przekazy- wania sygna lów przez IL-12 (fig. 18C i D). Tabela 3 (A-Q) dostarcza pe lnego zród lowego kodu dla komputerowego programu porównuj a- cego sekwencje ALIGN-2. Ten kod zród lowy mo ze by c rutynowo skompilowany dla zastosowania w systemie operacyjnym UNIX dostarczaj ac programu komputerowego dla porównywania sekwencji ALIGN-2.PL 206 846 B1 69PL 206 846 B1 70PL 206 846 B1 71PL 206 846 B1 72PL 206 846 B1 73PL 206 846 B1 74PL 206 846 B1 75PL 206 846 B1 76PL 206 846 B1 77PL 206 846 B1 78PL 206 846 B1 79PL 206 846 B1 80PL 206 846 B1 81PL 206 846 B1 82PL 206 846 B1 83PL 206 846 B1 84PL 206 846 B1 85PL 206 846 B1 86PL 206 846 B1 87PL 206 846 B1 88PL 206 846 B1 89PL 206 846 B1 90PL 206 846 B1 91PL 206 846 B1 92PL 206 846 B1 93PL 206 846 B1 94PL 206 846 B1 95PL 206 846 B1 96 PL PL

Claims (11)

1. Zastrze zenia patentowe 1. Zastosowanie terapeutycznie skutecznej ilo sci przeciwcia la agonistycznego przeciwko T-komórkowemu receptorowi cytokinowemu (anty-TCCR) do wytwarzania leku do leczenia zaburzenia alergicznego u ssaka, przy czym bia lko TCCR obejmuje sekwencj e aminokwasow a wykazuj ac a, co najmniej 90% identycznosc sekwencji aminokwasowej z sekwencj a oznaczon a SEQ ID NO: 1 albo SEQ ID NO: 2.

2. Zastosowanie wed lug zastrz. 1, znamienne tym, ze zaburzenie alergiczne wybrane jest z grupy sk ladaj acej si e z: nadwra zliwo sci anafilaktycznej, astmy, alergicznego zapalenia sluzówki nosa, atopowego zapalenia skóry, egzemy, alergii pokarmowych, pokrzywki i wiosennego zapalenia spojówek.

3. Zastosowanie wed lug zastrz. 1 albo 2, znamienne tym, ze bia lko TCCR obejmuje sekwen- cje aminokwasow a oznaczon a SEQ ID NO: 1 albo SEQ ID NO: 2.

4. Zastosowanie wed lug zastrz. 3, znamienne tym, ze przeciwcia lo agonistyczne anty-TCCR stanowi przeciwcia lo agonistyczne anty-TCCR lub jego fragment wiaz acy TCCR, bispecyficzne prze- ciwcia lo agonistyczne anty-TCCR, heterokoniugat przeciwcia la agonistycznego anty-TCCR albo dia- cia lo agonistyczne anty-TCCR, przy czym dowolne z tych przeciwcia l lub fragmentów przeciwcia l obejmuje dwa lub wi ecej miejsca wi azania antygenu TCCR.

5. Zastosowanie wed lug zastrz. 3, znamienne tym, ze przeciwcia lo agonistyczne anty-TCCR stanowi przeciwcia lo monoklonalne anty-TCCR lub jego fragment wiazacy TCCR zawieraj acy dwa lub wi ecej miejsca wi azania antygenu TCCR.

6. Zastosowanie wed lug zastrz. 5, znamienne tym, ze przeciwcia lo monoklonalne lub jego fragment wiaz acy TCCR posiada reszty nie-ludzkiego regionu determinuj acego komplementarno sc (CDR) i reszty z ludzkiego regionu zr ebowego (FR).

7. Zastosowanie wed lug zastrz. 3, znamienne tym, ze przeciwcia lo agonistyczne anty-TCCR stanowi liniowe przeciwcia lo agonistyczne anty-TCCR lub jedno la ncuchowe przeciwcia lo agonistyczne anty-TCCR zawieraj ace dwa lub wi ecej miejsca wi azania antygenu TCCR.

8. Zastosowanie wed lug jednego z zastrz. 4 do 7, znamienne tym, ze fragment przeciwcia la wiaz acy TCCR stanowi fragment F(ab') 2 .

9. Zastosowanie wed lug jednego z zastrz. 4 do 7, znamienne tym, ze przeciwcia lo agoni- styczne anty-TCCR lub jego fragment wi az acy TCCR s a podawane w kombinacji ze srodkiem cyto- toksycznym, cytokin a, srodkiem przeciwnowotworowym, lub srodkiem hamuj acym wzrost.

10. Zastosowanie wed lug jednego z zastrz. 4 do 7, znamienne tym, ze bispecyficzne przeciw- cia lo agonistyczne anty-TCCR, heterokoniugat przeciwcia la agonistycznego anty-TCCR, lub diacialo agonistyczne anty-TCCR wi aze dwa ró zne epitopy TCCR.

11. Zastosowanie wed lug zastrz. 4, znamienne tym, ze przeciwcia lo agonistyczne anty-TCCR wiaze TCCR i indukuje wytwarzanie cytokin Th1.PL 206 846 B1 97 RysunkiPL 206 846 B1 98PL 206 846 B1 99PL 206 846 B1 100PL 206 846 B1 101PL 206 846 B1 102PL 206 846 B1 103PL 206 846 B1 104PL 206 846 B1 105PL 206 846 B1 106PL 206 846 B1 107PL 206 846 B1 108PL 206 846 B1 109PL 206 846 B1 110 Departament Wydawnictw UP RP Cena 6,00 z l. PL PL