ES2317847T3

ES2317847T3 - Composiciones y procedimientos para el tratamiento de enfermedades de tipo inmunologico.

Info

Publication number: ES2317847T3
Application number: ES00959474T
Authority: ES
Inventors: Audrey Goddard; Paul J. Godowski; Austin L. Gurney; Kenneth J. Hillan; Daniel Tumas; Colin K. Watanabe; William I. Wood
Original assignee: Genentech Inc
Current assignee: Genentech Inc
Priority date: 1999-08-31
Filing date: 2000-08-23
Publication date: 2009-05-01
Anticipated expiration: 2020-08-23
Also published as: EP1208201B9; JP2003534769A; WO2001016319A3; CA2384055A1; EP1208201B1; AU7079300A; ATE419348T1; JP2007037552A; EP1208201A2; WO2001016319A2; DE60041266D1; JP3988821B2

Abstract

Anticuerpo que se une específicamente a un polipéptido PRO7425 aislado que presenta una identidad de secuencia de aminoácidos de por lo menos 80% respecto a: (a) la secuencia de aminoácidos del polipéptido mostrado en la figura 2 (SEC ID nº 12), (b) la secuencia de aminoácidos del polipéptido mostrado en la figura 2 (SEC ID nº 12), sin el péptido de señal asociado, (c) la secuencia de aminoácidos de un dominio extracelular del polipéptido mostrado en la figura 2 (SEC ID nº 12), con su péptido de señal asociado, o (d) la secuencia de aminoácidos de un dominio extracelular del polipéptido mostrado en la figura 2 (SEC ID nº 12), sin su péptido de señal asociado, o (e) una secuencia de aminoácidos codificada por la secuencia codificante de longitud completa del ADN depositado bajo el número de acceso de la ATCC nº PTA-6147, en el que el anticuerpo bloquea, inhibe o neutraliza parcial o totalmente la actividad estimuladora de la proliferación de los linfocitos T de dicho polipéptido.

Description

Composiciones y procedimientos para el tratamiento de enfermedades de tipo inmunológico.

Campo de la invención

La presente invención se refiere a composiciones y procedimientos útiles para el diagnóstico y el tratamiento de enfermedades de tipo inmunológico.

Antecedentes de la invención

Las enfermedades de tipo inmunológico e inflamatorias son la manifestación o la consecuencia de múltiples rutas biológicas bastante complejas, con frecuencia interconectadas, que en la fisiología normal resultan críticas para la respuesta frente al insulto o la lesión, que inician la reparación tras el insulto o la lesión, y que montan la defensa innata y adquirida contra los organismos foráneos. La enfermedad o patología se produce cuando estas rutas fisiológicas normales causan un insulto o lesión adicionales de manera directamente relacionada con la intensidad de la respuesta, como consecuencia de la regulación anormal o la estimulación excesiva, como una autorreacción o como combinación de los mismos.

Aunque la génesis de dichas enfermedades con frecuencia implica rutas multietapa y con frecuencia múltiples rutas/sistemas biológicos diferentes, la intervención en puntos críticos en una o más de dichas rutas puede presentar un efecto de mejora o terapéutico. La intervención terapéutica puede producirse mediante antagonismo de un proceso/ruta perjudicial o mediante la estimulación de un proceso/ruta beneficioso.

Muchas enfermedades de tipo inmunológico son conocidas y han sido estudiadas extensivamente. Entre estas enfermedades se incluyen las enfermedades inflamatorias de tipo inmunológico, las enfermedades inflamatorias no mediadas inmunológicamente, las enfermedades infecciosas, las enfermedades por inmunodeficiencia, neoplasias, etc.

Los linfocitos T (células T) son un componente importante de una respuesta inmunológica en el mamífero. Las células T reconocen los antígenos que se asocian a una automolécula codificada por genes dentro del complejo de histocompatibilidad mayor (MHC). El antígeno puede expresar conjuntamente con moléculas del MHC sobre la superficie de las células presentadoras de antígeno, de células infectadas por virus, de células de cáncer, de injertos, etc. El sistema de células T elimina estas células alteradas que plantean un reto de salud para el mamífero huésped. Entre las células T se incluyen las células T ayudante y las células T citotóxicas. Las células T ayudantes proliferan extensivamente tras el reconocimiento de un complejo de antígeno-MHC sobre una célula presentadora de antígeno. Las células T ayudante también segregan una diversidad de citoquinas, es decir linfoquinas, que desempeñan un papel central en la activación de las células B, de las células T citotóxicas y de una diversidad de otras células que participan en la respuesta inmunológica.

Un suceso central en las respuestas inmunológicas humorales y mediadas por células es la activación y expansión clonal de las células T ayudante. La activación de las células T ayudante es iniciada por la interacción entre el complejo de receptor de células T-CD3 con un antígeno-MHC sobre la superficie de una célula presentadora de antígeno. Esta interacción media una cascada de sucesos bioquímicos que inducen que la célula T adyuvante en reposo para que entre en un ciclo celular (la transición G0 a G1) y resulta en la expresión de un receptor de afinidad elevada para IL-2 y en ocasiones IL-4. La célula T activada progresa a través del ciclo, proliferando y diferenciándose en células de memoria o en células efectoras.

Además de las señales mediadas a través del TCR, la activación de las células T implica coestimulación adicional inducida por citoquinas liberadas por la célula presentadora de antígeno o a través de interacciones con moléculas unidas a membrana sobre la célula presentadora de antígeno y la célula T. Las citoquinas IL-1 e IL-6 se ha demostrado que proporcionan una señal coestimuladora. Además, la interacción entre la molécula B7 expresada sobre la superficie de una célula presentadora de antígeno y las moléculas CD28 y CTLA-4 expresadas sobre la superficie de las células T inducen la activación de las células T. Las células T activadas expresan un número incrementado de moléculas de adhesión celular, tales como ICAM-1, integrinas, VLA-4, LFA-1, CD56, etc.

La proliferación de las células T en un cultivo mixto de linfocitos o una reacción de linfocitos mixtos (MLR) es una indicación aceptada de la capacidad de un compuesto de estimular el sistema inmunológico. En muchas respuestas inmunológicas, las células inflamatorias se infiltran en el sitio de lesión o de infección. Las células migradoras pueden ser neutrofílicas, eosinofílicas, monocíticas o linfocíticas, según se determine mediante examen histológico de los tejidos afectados (Current Protocols in Immunology, editor John E. coligan, 1994, John Wiley & Sons, Inc.).

Las enfermedades de tipo inmunológico podrían tratarse mediante la supresión de la respuesta inmunológica. La utilización de anticuerpos neutralizadores que inhiben las moléculas que presentan actividad estimuladora inmunológica resultarían beneficiosas en el tratamiento de las enfermedades mediadas inmunológicamente e inflamatorias. Las moléculas que inhiben la respuesta inmunológica puede utilizarse (las proteínas directamente o mediante la utilización de agonistas de anticuerpo) para inhibir la respuesta inmunológica y de esta manera aliviar la enfermedad de tipo inmunológico.

Descripción resumida de la invención A. Realizaciones

La presente invención se refiere a composiciones y procedimientos útiles en el tratamiento de enfermedades de tipo inmunológico en mamíferos, incluyendo seres humanos. La presente invención se basa en la identificación de proteínas (incluyendo anticuerpos antagonistas) que estimulan o inhiben la respuesta inmunológica en mamíferos. Las enfermedades de tipo inmunológico pueden tratarse mediante la supresión o la intensificación de la respuesta inmunológica. Las moléculas que incrementan la respuesta inmunológica estimulan o potencian la respuesta inmunológica frente a un antígeno. Las moléculas que estimulan la respuesta inmunológica pueden utilizarse terapéuticamente en los casos en que el incremento de la respuesta inmunológica resultaría beneficioso. Alternativamente, las moléculas que suprimen las respuestas inmunológicas, que atenúan o que reducen la respuesta inmunológica frente a un antígeno (por ejemplo anticuerpos neutralizadores) pueden utilizarse terapéuticamente en el caso de que la atenuación de la respuesta inmunológica resulte beneficiosa (por ejemplo en la inflamación). Por consiguiente, un polipéptido PRO7425 también resulta útil para preparar medicinas y medicamentos para el tratamiento de enfermedades de tipo inmunológico e inflamatorias. En un aspecto específico, dichas medicinas y medicamentos comprenden una cantidad terapéuticamente eficaz de un polipéptido PRO7425 con un portador farmacéuticamente aceptable. Preferentemente la mezcla es estéril. La paten-
te WO nº 00/78953 describe una proteína transportadora humana, TP PT-41, que es idéntica al polipéptido PRO7425.

En una realización adicional, la invención se refiere a un procedimiento para identificar agonistas o antagonistas de un polipéptido PRO7425 que comprende poner en contacto el polipéptido PRO con una molécula candidata y realizar el seguimiento de la actividad biológica mediada por dicho polipéptido PRO7425. Preferentemente el polipéptido PRO es un polipéptido PRO de secuencia nativa. En una realización específica, el agonista o antagonista de PRO es un anticuerpo anti-PRO.

En otra realización, la invención se refiere a una composición de materia que comprende un polipéptido PRO7425 o un anticuerpo antagonista que se une al polipéptido en mezcla con un portador o excipiente. En un aspecto, la composición comprende una cantidad terapéuticamente eficaz del anticuerpo. En otro aspecto, en el caso de que la composición comprenda una molécula estimuladora inmunológica, la composición resulta útil para: (a) incrementar la infiltración de células inflamatorias en un tejido de un mamífero que necesita la misma, b) estimular o incrementar una respuesta inmunológica en un mamífero que necesita la misma, (c) incrementar la proliferación de los linfocitos T en un mamífero que necesita la misma en respuesta a un antígeno, (d) estimular la actividad de los linfocitos T, o (e) incrementar la permeabilidad vascular. En otro aspecto, la composición comprende un ingrediente activo adicional que puede ser, por ejemplo, un anticuerpo adicional o un citotóxico de un agente quimioterapéutico. Preferentemente la composición es estéril.

En otra realización, la invención se refiere a la utilización de un polipéptido PRO7425 en la preparación de un medicamento para la utilización en un procedimiento para tratar un trastorno de tipo inmunológico en un mamífero. En un aspecto preferente, el trastorno de tipo inmunológico se selecciona de entre el grupo según se define en las reivindicaciones.

En otra realización, la invención proporciona un anticuerpo que se une específicamente a cualquiera de entre los polipéptidos anteriormente o posteriormente indicados. Opcionalmente el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal, un anticuerpo humanizado, un fragmento de anticuerpo o un anticuerpo de una cadena. En un aspecto, la presente invención se refiere a un anticuerpo aislado que se une a un polipéptido PRO7425. El anticuerpo inhibe o neutraliza la actividad de un polipéptido PRO7425 (un anticuerpo antagonista). En otro aspecto, el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal que preferentemente presenta residuos de región determinante de complementariedad (CDR) y residuos de región marco (FR) humana. El anticuerpo puede estar marcado y puede inmovilizarse sobre un soporte sólido. En un aspecto adicional, el anticuerpo es un fragmento de anticuerpo, un anticuerpo monoclonal, un anticuerpo de una cadena o un anticuerpo antiidiotípico.

En todavía otra realización, la presente invención proporciona una composición que comprende un anticuerpo anti-PRO7425 mezclado con un portador farmacéuticamente aceptable. En un aspecto la composición comprende una cantidad terapéuticamente eficaz del anticuerpo. Preferentemente la composición es estéril. La composición puede administrarse en forma de una formulación farmacéutica líquida, que puede conservarse para conseguir una estabilidad de almacenamiento prolongada. Alternativamente, el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal, un fragmento de anticuerpo, un anticuerpo humanizado o un anticuerpo de una cadena.

También se describe en la presente invención un producto de fabricación, que comprende:

(a): una composición de materia que comprende un polipéptido PRO7425 o un anticuerpo antagonista,

(b): un recipiente que contiene dicha composición, y

(c): una etiqueta fijada a dicho recipiente, o un impreso insertado en un paquete incluido en dicho recipiente, que hace referencia a la utilización de dicho polipéptido PRO o anticuerpo antagonista en el tratamiento de una enfermedad de tipo inmunológico. La composición puede comprender una cantidad terapéuticamente eficaz del polipéptido PRO o del antagonista del mismo.

Se describe un procedimiento para determinar la presencia de un polipéptido PRO en una muestra, que comprende exponer una muestra de ensayo de células que se sospecha que contiene el polipéptido PRO, a un anticuerpo anti-PRO, y determinar la unión de dicho anticuerpo a dicha muestra de células. En un aspecto específico, la muestra comprende una célula que se sospecha que contiene el polipéptido PRO y el anticuerpo que se une a la célula. El anticuerpo preferentemente se encuentra detectablemente marcado y/o unido a un soporte sólido.

También se describe un kit, que comprende un anticuerpo anti-PRO7425 y un portador en un empaquetamiento adecuado. El kit preferentemente contiene instrucciones para utilizar el anticuerpo para detectar la presencia del polipéptido PRO. Preferentemente el portador es farmacéuticamente aceptable.

También se describe un kit, que contiene un anticuerpo anti-PRO7425 en un empaquetamiento adecuado. El kit preferentemente contiene instrucciones para utilizar el anticuerpo para detectar el polipéptido PRO.

En otra realización, la presente invención se refiere a un procedimiento para identificar un agonista de un polipéptido PRO7425, que comprende:

(a): puesta en contacto de las células y un compuesto de ensayo que debe cribarse bajo condiciones adecuadas para la inducción de una respuesta celular normalmente inducida por un polipéptido PRO7425, y

(b): determinar la inducción de dicha respuesta celular para determinar si el compuesto de ensayo es un agonista efectivo, en la que la inducción de dicha respuesta celular es indicativa de que dicho compuesto de ensayo es un agonista efectivo. En otra realización la invención se refiere a un procedimiento para identificar un compuesto capaz de inhibir la actividad de un polipéptido PRO7425, que comprende poner en contacto un compuesto candidato con un polipéptido PRO7425 bajo condiciones y durante un tiempo suficiente para permitir que estos dos componentes interaccionen, y determinar si la actividad del polipéptido PRO7425 resulta inhibida, en el que la actividad es de estimulación de la proliferación de los linfocitos T. En un aspecto específico, el compuesto candidato o el polipéptido PRO se inmovilizan sobre un soporte sólido. En otro aspecto, el componente no inmovilizado porta un marcaje detectable. En un aspecto preferente, este procedimiento comprende las etapas siguientes:

(a): poner en contacto las células y un compuesto de ensayo que debe cribarse en presencia de un polipéptido PRO7425 bajo condiciones adecuadas para la inducción de una respuesta celular normalmente inducida por un polipéptido PRO7425, y

(b): determinar la inducción de dicha respuesta celular para determinar si el compuesto de ensayo es un antagonista eficaz.

Se describe un procedimiento para identificar un compuesto que inhibe la expresión de un polipéptido PRO en células que normalmente expresan el polipéptido, en el que el procedimiento comprende poner en contacto las células con un compuesto de ensayo y determinar si la expresión del polipéptido PRO resulta inhibida. En un aspecto preferente este procedimiento comprende las etapas siguientes:

(a): poner en contacto células y un compuesto de ensayo que debe cribarse bajo condiciones adecuadas para permitir la expresión del polipéptido PRO, y

(b): determinar la inhibición de la expresión de dicho polipéptido.

En todavía otra realización, la presente invención se refiere a la utilización de una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido PRO, en la preparación de un medicamento para la utilización en un procedimiento para tratar un trastorno de tipo inmunológico en un mamífero que sufre del mismo. En una realización preferente, el mamífero es el ser humano. En otra realización preferente, el ácido nucleico se administra mediante terapia génica ex vivo. En una realización preferente adicional, el ácido nucleico se encuentra comprendido dentro de un vector, más preferentemente un vector adenovírico, vírico adenoasociado, lentivírico o retrovírico.

Se describe un procedimiento para incrementar la infiltración de células inflamatorias de la vasculatura en un tejido de un mamífero que comprende administrar en dicho mamífero: (a) un polipéptido PRO, (b) un agonista de un polipéptido PRO, o (c) un antagonista de un polipéptido PRO, de manera que la infiltración de células inflamatorias de la vasculatura en el mamífero se incrementa.

Se describe un procedimiento para reducir la infiltración de células inflamatorias de la vasculatura en un tejido de un mamífero, que comprende administrar en dicho mamífero: (a) un polipéptido PRO, (b) un agonista de un polipéptido PRO, o (c) un antagonista de un polipéptido PRO, de manera que la infiltración de células inflamatorias de la vasculatura en el mamífero se reduce.

Se describe un procedimiento para incrementar la actividad de los linfocitos T en un mamífero, que comprende administrar en dicho mamífero: (a) un polipéptido PRO, (b) un agonista de un polipéptido PRO, o (c) un antagonista de un polipéptido PRO, de manera que la actividad de los linfocitos T en el mamífero se incrementa.

Se describe un procedimiento para reducir la actividad de los linfocitos T en un mamífero que comprende administrar en dicho mamífero: (a) un polipéptido PRO, (b) un agonista de un polipéptido PRO, o (c) un antagonista de un polipéptido PRO, de manera que la actividad de los linfocitos T en el mamífero se reduce.

En todavía otra realización, la invención proporciona un procedimiento in vitro para incrementar la proliferación de los linfocitos T, que comprende administrar: (a) un polipéptido PRO7425, de manera que la proliferación de los linfocitos T se incrementa.

En todavía otra realización, la invención proporciona un procedimiento in vitro para reducir la proliferación inducida por PRO7425 de los linfocitos T, que comprende administrar un anticuerpo antagonista de un polipéptido PRO7425, de manera que la proliferación de los linfocitos T se reduce.

En todavía otra realización, la invención proporciona un procedimiento in vitro para estimular la proliferación de las células T, que comprende poner en contacto dichas células T con un polipéptido PRO7425, de manera que se estimula dicha proliferación de las células T.

En todavía otra realización, la invención proporciona un procedimiento in vitro para reducir la proliferación inducida por PRO7425 de los linfocitos T, que comprende poner en contacto dichos linfocitos T con un antagonista de un polipéptido PRO7425, de manera que la proliferación de los linfocitos T se reduce.

B. Realizaciones adicionales

También se describen en la presente invención: vectores que comprenden ADN codificante de cualquiera de los polipéptidos indicados en la presente invención. También se proporciona una célula huésped que comprende cualquiera de dichos vectores. A título de ejemplo, las células huésped puede ser células CHO, E. coli o levaduras. Un procedimiento para producir cualquiera de los polipéptidos indicados en la presente invención también se proporciona y comprende cultivar células huésped bajo condiciones adecuadas para la expresión del polipéptido deseado y recuperar el polipéptido deseado a partir del cultivo celular;

moléculas quiméricas que comprenden cualquiera de los polipéptidos indicados en la presente invención fusionados con un polipéptido heterólogo o con una secuencia de aminoácidos. Entre los ejemplos de dichas moléculas quiméricas se incluyen cualquiera de los polipéptidos anteriormente indicados en la presente memoria fusionados con una secuencia de etiqueta epítopo o con una región Fc de una inmunoglobulina;

un anticuerpo que se une específicamente a cualquiera de los polipéptidos anteriormente o posteriormente indicados. Opcionalmente el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal, un anticuerpo humanizado, un fragmento de anticuerpo o un anticuerpo de una cadena;

las sondas oligonucleótidas útiles para aislar las secuencias genómicas o de nucleótidos de ADNc o como sondas antisentido, en el que dichas sondas pueden derivarse a partir de cualquiera de las secuencias de nucleótidos anteriormente o posteriormente indicadas;

una molécula aislada de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido PRO.

En un aspecto, la molécula aislada de ácido nucleico comprende una secuencia de nucleótidos que presenta una identidad de secuencia de ácidos nucleicos de aproximadamente 80%, alternativamente de por lo menos aproximadamente 81%, alternativamente de por lo menos aproximadamente 82%, alternativamente de por lo menos aproximadamente 83%, alternativamente de por lo menos aproximadamente 84%, alternativamente de por lo menos aproximadamente 85%, alternativamente de por lo menos aproximadamente 86%, alternativamente de por lo menos aproximadamente 87%, alternativamente de por lo menos aproximadamente 88%, alternativamente de por lo menos aproximadamente 89%, alternativamente de por lo menos aproximadamente 90%, alternativamente de por lo menos aproximadamente 91%, alternativamente de por lo menos aproximadamente 92%, alternativamente de por lo menos aproximadamente 93%, alternativamente de por lo menos aproximadamente 94%, alternativamente de por lo menos aproximadamente 95%, alternativamente de por lo menos aproximadamente 96%, alternativamente de por lo menos aproximadamente 97%, alternativamente de por lo menos aproximadamente 98%, alternativamente de por lo menos aproximadamente 99% respecto a: (a) una molécula de ADN codificante de un polipéptido PRO que presenta una secuencia de aminoácidos de longitud completa tal como se da a conocer en la presente invención respecto a: (a) una molécula de ADN codificante de un polipéptido PRO que presenta una secuencia de aminoácidos de longitud completa tal como se da a conocer en la presente invención, una secuencia de aminoácidos sin el péptido de señal tal como se da a conocer en la presente invención, un dominio extracelular de una proteína transmembranal, con o sin el péptido de señal, tal como se da a conocer en la presente invención, o cualquier fragmento específicamente definido de la secuencia de aminoácidos de longitud completa, tal como se da a conocer en la presente invención, o (b) el complemento de la molécula de ADN de (a).

En otros aspectos, la molécula aislada de ácido nucleico comprende una secuencia de nucleótidos que presenta una identidad de secuencia de ácidos nucleicos de aproximadamente 80%, alternativamente de por lo menos aproximadamente 81%, alternativamente de por lo menos aproximadamente 82%, alternativamente de por lo menos aproximadamente 83%, alternativamente de por lo menos aproximadamente 84%, alternativamente de por lo menos aproximadamente 85%, alternativamente de por lo menos aproximadamente 86%, alternativamente de por lo menos aproximadamente 87%, alternativamente de por lo menos aproximadamente 88%, alternativamente de por lo menos aproximadamente 89%, alternativamente de por lo menos aproximadamente 90%, alternativamente de por lo menos aproximadamente 91%, alternativamente de por lo menos aproximadamente 92%, alternativamente de por lo menos aproximadamente 93%, alternativamente de por lo menos aproximadamente 94%, alternativamente de por lo menos aproximadamente 95%, alternativamente de por lo menos aproximadamente 96%, alternativamente de por lo menos aproximadamente 97%, alternativamente de por lo menos aproximadamente 98%, alternativamente de por lo menos aproximadamente 99%, respecto a: (a) una molécula de ADN que comprende la secuencia codificante de un ADNc de polipéptido PRO de longitud completa tal como se da a conocer en la presente invención, careciendo la secuencia codificante de un polipéptido PRO del péptido de señal tal como se da a conocer en la presente invención, la secuencia codificante de un dominio extracelular de un polipéptido PRO transmembranal, con o sin el péptido de señal, tal como se da a conocer en la presente invención o la secuencia codificante de cualquier otro fragmento específicamente definido de la secuencia de aminoácidos de longitud completa tal como se da a conocer en la presente invención, o (b) el complemento de la molécula de ADN de (a).

En un aspecto adicional, una molécula aislada de ácidos nucleicos comprende una secuencia de nucleótidos que presenta una identidad de secuencia de ácidos nucleicos de por lo menos aproximadamente 80%, alternativamente de por lo menos aproximadamente 81%, alternativamente de por lo menos aproximadamente 82%, alternativamente de por lo menos aproximadamente 83%, alternativamente de por lo menos aproximadamente 84%, alternativamente de por lo menos aproximadamente 85%, alternativamente de por lo menos aproximadamente 86%, alternativamente de por lo menos aproximadamente 87%, alternativamente de por lo menos aproximadamente 88%, alternativamente de por lo menos aproximadamente 89%, alternativamente de por lo menos aproximadamente 90%, alternativamente de por lo menos aproximadamente 91%, alternativamente de por lo menos aproximadamente 92%, alternativamente de por lo menos aproximadamente 93%, alternativamente de por lo menos aproximadamente 94%, alternativamente de por lo menos aproximadamente 95%, alternativamente de por lo menos aproximadamente 96%, alternativamente de por lo menos aproximadamente 97%, alternativamente de por lo menos aproximadamente 98%, alternativamente de por lo menos aproximadamente 99% respecto a: (a) una molécula de ADN que codifica el mismo polipéptido maduro codificado por cualquier de los ADNc de proteína humana depositados en la ATCC tal como se da a conocer en la presente invención, o (b) el complemento de la molécula de ADN de (a).

En otro aspecto, una molécula aislada de ácidos nucleicos comprende una secuencia de nucleótidos codificante de un polipéptido PRO con deleción o con inactivación de dominio transmembranal, o que es complementario a dicha secuencia de nucleótidos codificante, en la que el dominio o dominios transmembranales de dicho polipéptido se dan a conocer en la presente invención. Por lo tanto, se encuentran contemplados dominios extracelulares solubles de los polipéptidos PRO indicados en la presente invención.

Además se describen: fragmentos de una secuencia codificante de polipéptido PRO, o el complemento de la misma, que pueden encontrar utilidad en, por ejemplo, sondas de hibridación, para codificar fragmentos de un polipéptido PRO que opcionalmente puede codificar un polipéptido que comprende un sitio de unión para un anticuerpo anti-PRO o como sondas oligonucleótidas antisentido. Dichos fragmentos de ácidos nucleicos habitualmente presentan una longitud de por lo menos aproximadamente 20 nucleótidos, alternativamente de por lo menos aproximadamente 30 nucleótidos, alternativamente de por lo menos aproximadamente 40 nucleótidos, alternativamente de por lo menos aproximadamente 50 nucleótidos, alternativamente de por lo menos aproximadamente 60 nucleótidos, alternativamente de por lo menos aproximadamente 70 nucleótidos, alternativamente de por lo menos aproximadamente 80 nucleótidos, alternativamente de por lo menos aproximadamente 90 nucleótidos, alternativamente de por lo menos aproximadamente 100 nucleótidos, alternativamente de por lo menos aproximadamente 110 nucleótidos, alternativamente de por lo menos aproximadamente 120 nucleótidos, alternativamente de por lo menos aproximadamente 130 nucleótidos, alternativamente de por lo menos aproximadamente 140 nucleótidos, alternativamente de por lo menos aproximadamente 150 nucleótidos, alternativamente de por lo menos aproximadamente 160 nucleótidos, alternativamente de por lo menos aproximadamente 170 nucleótidos, alternativamente de por lo menos aproximadamente 180 nucleótidos, alternativamente de por lo menos aproximadamente 190 nucleótidos, alternativamente de por lo menos aproximadamente 200 nucleótidos, alternativamente de por lo menos aproximadamente 250 nucleótidos, alternativamente de por lo menos aproximadamente 300 nucleótidos, alternativamente de por lo menos aproximadamente 350 nucleótidos, alternativamente de por lo menos aproximadamente 400 nucleótidos, alternativamente de por lo menos aproximadamente 450 nucleótidos, alternativamente de por lo menos aproximadamente 500 nucleótidos, alternativamente de por lo menos aproximadamente 600 nucleótidos, alternativamente de por lo menos aproximadamente 700 nucleótidos, alternativamente de por lo menos aproximadamente 800 nucleótidos, alternativamente de por lo menos aproximadamente 900 nucleótidos, alternativamente de por lo menos aproximadamente 1.000 nucleótidos, en los que en el presente contexto el término "aproximadamente" se refiere a la longitud de la secuencia de nucleótidos referenciada más o menos 10% de dicha longitud referenciada. Se indica que pueden determinarse nuevos fragmentos de una secuencia de nucleótidos codificante de polipéptido PRO de manera rutinaria mediante la alineación de las secuencias de nucleótidos codificantes del polipéptido PRO con otras secuencias de nucleótidos conocidas utilizando cualquiera de entre varios programas de alineación de secuencias bien conocidos, y determinar qué fragmento o fragmentos de secuencia de nucleótidos codificantes de polipéptido PRO son nuevos. La totalidad de dichas secuencias de nucleótidos codificantes del dicho polipéptido PRO se encuentran contempladas en la presente invención. También se encuentran contempladas los fragmentos de polipéptido PRO codificados por estos fragmentos de molécula de nucleótido, preferentemente
aquellos fragmentos de polipéptido PRO que comprenden un sitio de unión para un anticuerpo anti-PRO;

un polipéptido PRO aislado codificado por cualquiera de las secuencias asiladas de ácido nucleico de la presente invención anteriormente identificadas;

un polipéptido PRO aislado, que comprende una secuencia de aminoácidos que presenta una identidad de secuencia de aminoácidos de por lo menos aproximadamente 80%, alternativamente de por lo menos aproximadamente 81%, alternativamente de por lo menos aproximadamente 82%, alternativamente de por lo menos aproximadamente 83%, alternativamente de por lo menos aproximadamente 84%, alternativamente de por lo menos aproximadamente 85%, alternativamente de por lo menos aproximadamente 86%, alternativamente de por lo menos aproximadamente 87%, alternativamente de por lo menos aproximadamente 88%, alternativamente de por lo menos aproximadamente 89%, alternativamente de por lo menos aproximadamente 90%, alternativamente de por lo menos aproximadamente 91%, alternativamente de por lo menos aproximadamente 92%, alternativamente de por lo menos aproximadamente 93%, alternativamente de por lo menos aproximadamente 94%, alternativamente de por lo menos aproximadamente 95%, alternativamente de por lo menos aproximadamente 96%, alternativamente de por lo menos aproximadamente 97%, alternativamente de por lo menos aproximadamente 98%, alternativamente de por lo menos aproximadamente 99% respecto a un polipéptido PRO que presenta una secuencia de aminoácidos de longitud completa tal como se da a conocer en la presente invención, una secuencia de aminoácidos sin el péptido de señal tal como se da a conocer en la presente invención, un dominio extracelular de una proteína transmembranal, con o sin el péptido de señal, tal como se da a conocer en la presente invención o cualquier otro fragmento específicamente diseñado de la secuencia de aminoácidos de longitud completa tal como se da a conocer en la presente invención;

un polipéptido PRO aislado que comprende una secuencia de aminoácidos que presenta una identidad de secuencia de aminoácidos de por lo menos aproximadamente 80%, alternativamente de por lo menos aproximadamente 81%, alternativamente de por lo menos aproximadamente 82%, alternativamente de por lo menos aproximadamente 83%, alternativamente de por lo menos aproximadamente 84%, alternativamente de por lo menos aproximadamente 85%, alternativamente de por lo menos aproximadamente 86%, alternativamente de por lo menos aproximadamente 87%, alternativamente de por lo menos aproximadamente 88%, alternativamente de por lo menos aproximadamente 89%, alternativamente de por lo menos aproximadamente 90%, alternativamente de por lo menos aproximadamente 91%, alternativamente de por lo menos aproximadamente 92%, alternativamente de por lo menos aproximadamente 93%, alternativamente de por lo menos aproximadamente 94%, alternativamente de por lo menos aproximadamente 95%, alternativamente de por lo menos aproximadamente 96%, alternativamente de por lo menos aproximadamente 97%, alternativamente de por lo menos aproximadamente 98%, alternativamente de por lo menos aproximadamente 99% respecto a una secuencia de aminoácidos codificada por cualquiera de los ADNc de proteína humana depositados en la ATCC tal como se da a conocer en la presente invención;

un polipéptido PRO aislado sin la secuencia de señal N-terminal y/o la metionina de inicio y se encuentra codificada por una secuencia de nucleótidos que codifica una secuencia de aminoácidos tal como se ha descrito anteriormente en la presente memoria. Los procedimientos para producir los mismos también se describen en la presente invención, donde aquellos procedimientos comprenden cultivar una célula huésped que comprende un vector que comprende la molécula de ácidos nucleicos codificante apropiada bajo condiciones adecuadas para la expresión del polipéptido PRO y recuperar el polipéptido PRO a partir del cultivo celular;

un polipéptido PRO aislado con deleción del dominio transmembranal o con inactivación del dominio transmembranal. Los procedimientos para producir los mismos también se describen en la presente invención, donde aquellos procedimientos comprenden cultivar una célula huésped que comprende un vector que comprende la molécula de ácidos nucleicos codificante apropiada bajo condiciones adecuadas para la expresión del polipéptido PRO y recuperar el polipéptido PRO a partir del cultivo celular.

En todavía otra realización, la invención se refiere a antagonistas de un polipéptido PRO7425 nativo tal como se define en la presente invención, en la que el antagonista es un anticuerpo anti-PRO7425.

En una realización adicional, la invención se refiere a un procedimiento para identificar agonistas o antagonistas de un polipéptido PRO7425 que comprende poner en contacto el polipéptido PRO7425 con una molécula candidata y realizar el seguimiento de la actividad biológica mediada por dicho polipéptido PRO7425 que es estimulación de la proliferación de los linfocitos T. Preferentemente el polipéptido PRO7425 es un polipéptido PRO7425 nativo.

En todavía otra realización, la invención se refiere a una composición de materia que comprende un antagonista de un polipéptido PRO7425 tal como se describe en la presente invención, un anticuerpo anti-PRO, en combinación con un portador. Opcionalmente el portador es un portador farmacéuticamente aceptable.

Otra realización de la presente invención se refiere a la utilización de un polipéptido PRO7425 tal como se ha descrito anteriormente en la presente invención, para la preparación de un medicamento útil en el tratamiento de una condición que es sensible al polipéptido PRO7425.

Breve descripción de los dibujos

La figura 1 muestra una secuencia de nucleótidos (SEC ID nº 11) de un ADNc de PRO7425 de secuencia nativa, en la que SEC ID nº 11 es un clon denominado en la presente invención "DNA108792-2753".

La figura 2 muestra la secuencia de aminoácidos (SEC ID nº 12) derivada de la secuencia codificante de la SEC ID nº 11 mostrada en la figura 1.

Descripción detallada de las realizaciones preferentes I. Definiciones

Las expresiones "polipéptido PRO" y "PRO" tal como se utilizan en la presente invención y en el caso de que siga inmediatamente un número, se refieren a diversos polipéptidos, en las que la denominación completa (es decir, PRO/número) se refiere a secuencias polipeptídicas específicas tal como se describen en la presente invención. Los términos "polipéptidos PRO/número" y "PRO/número" en los que el término "número" se proporciona como denominación numérica real tal como se utilizan en la presente invención comprenden polipéptidos de secuencia nativa y variantes de polipéptido (que se definen adicionalmente en la presente invención). Los polipéptidos PRO descritos en la presente invención pueden aislarse a partir de una diversidad de fuentes, tales como tipos de tejido humano o de otra fuente, o pueden prepararse mediante un procedimiento recombinante o sintético. La expresión "polipéptido PRO" se refiere a cada polipéptido PRO/número individual dado a conocer en la presente invención. Todas las descripciones en la presente memoria referidas al "polipéptido PRO" se refieren a cada uno de los polipéptidos individualmente, así como colectivamente. Por ejemplo, las descripciones de la preparación, purificación, derivación, formación de anticuerpos, administración de composiciones que contienen un tratamiento de una enfermedad, etc., se refieren a cada polipéptido de la invención individualmente. La expresión "polipéptido PRO" también incluye variantes de los polipéptidos PRO/número dados a conocer en la presente invención.

Un "polipéptido PRO de secuencia nativa" comprende un polipéptido que presenta la misma secuencia de aminoácidos que el polipéptido PRO correspondiente derivado naturalmente. Estos polipéptidos PRO de secuencia nativa pueden aislarse de la Naturaleza o pueden producirse por medios recombinantes o sintéticos. La expresión "polipéptido PRO de secuencia nativa" específicamente comprende formas truncadas o secretadas naturales del polipéptido PRO específico (por ejemplo una secuencia de dominio extracelular), formas variantes naturales (por ejemplo formas alternativamente procesadas) y variantes alélicas naturales del polipéptido. En diversas realizaciones de la invención, los polipéptidos PRO de secuencia nativa dados a conocer en la presente invención son polipéptidos de secuencia nativa maduros o de longitud completa que comprenden las secuencias de aminoácidos de longitud completa mostradas en las figuras adjuntas. Los codones de inicio y de parada se muestran en negrita y subrayados en las figuras. Sin embargo, aunque los polipéptidos PRO dados a conocer en las figuras adjuntas se muestra que se inician con residuos de metionina designados en la presente invención como posición aminoácida 1 en las figuras, resulta concebible que puedan utilizarse otros residuos de metionina situados cadena arriba o cadena abajo de la posición aminoácida 1 en las figuras como el residuo aminoácido de partida para los polipéptidos PRO.

El "dominio extracelular" del polipéptido PRO o "ECD" se refiere a una forma del polipéptido PRO que se encuentra esencialmente libre de dominios transmembranales y citoplasmáticos. Habitualmente un ECD de polipéptido PRO presente menos de 1% de dichos dominios transmembranales y/o citoplasmáticos y preferentemente presenta menos de 0,5% de dichos dominios. Se entiende que cualquier dominio transmembranal identificado para los polipéptidos PRO de la presente invención se identifica siguiendo los criterios utilizados rutinariamente en la técnica para identificar ese tipo de dominio hidrofóbico. Los límites exactos de un dominio transmembranal pueden variar pero muy probablemente en no más de aproximadamente 5 aminoácidos en cualquiera de los extremos del dominio según se ha identificado inicialmente en la presente invención. Por lo tanto, opcionalmente un dominio extracelular de un polipéptido PRO puede contener entre aproximadamente 5 o menos aminoácidos en cada lado del límite dominio transmembranal/dominio extracelular tal como se identifica en los Ejemplos o la memoria, y dichos polipéptidos, con o sin el péptido de señal asociado, y los ácidos nucleicos codificantes de los mismos, se encuentran contemplados por la presente invención.

La localización aproximada de los "péptidos de señal" de los diversos polipéptidos PRO dados a conocer en la presente invención se muestran en la presente memoria y/o en las figuras adjuntas. Sin embargo, se indica que el límite C-terminal de un péptido de señal puede variar, aunque muy probablemente en no más de aproximadamente 5 aminoácidos en cada lado del límite C-terminal del péptido de señal según se ha identificado inicialmente en la presente invención, en el que el límite C-terminal del péptido de señal puede identificarse siguiendo criterios utilizados rutinariamente en la técnica para identificar el tipo de elemento secuencia de aminoácidos (por ejemplo Nielsen et al., Prot. Eng. 10:1-6, 1997, y von Heinje et al., Nucl. Acids. Res. 14:4683-4690, 1986). Además, también se reconoce que, en algunos casos, el corte de una secuencia de señal de un polipéptido secretado no es completamente uniforme, resultando en más de una especie secretada. Estos polipéptidos maduros, en los que el péptido de señal se corta dentro de máximo aproximadamente 5 aminoácidos en cada lado del límite C-terminal del péptido señal según se identifica en la presente invención, y los polinucleótidos codificantes de los mismos, se encuentran contemplados por la presente invención.

La expresión "variante de polipéptido PRO" se refiere a un polipéptido PRO activo tal como se ha definido anteriormente o posteriormente, que presenta una identidad de secuencia de aminoácidos de por lo menos aproximadamente 80% con una secuencia de polipéptido PRO de secuencia nativa de longitud completa de un polipéptido PRO, con o sin el péptido de señal, tal como se da a conocer en la presente invención, o cualquier otro fragmento de una secuencia de polipéptido PRO de longitud completa tal como se da a conocer en la presente invención. Entre dichas variantes de polipéptido PRO se incluyen, por ejemplo, polipéptidos PRO en los que se añaden o delecionan uno o más residuos aminoácidos en los extremo N-terminal o C-terminal de la secuencia de aminoácidos nativa de longitud completa. Habitualmente una variante de polipéptido PRO presentará un identidad de secuencia de aminoácidos de por lo menos aproximadamente 80%, alternativamente de por lo menos aproximadamente 81%, alternativamente de por lo menos aproximadamente 82%, alternativamente de por lo menos aproximadamente 83%, alternativamente de por lo menos aproximadamente 84%, alternativamente de por lo menos aproximadamente 85%, alternativamente de por lo menos aproximadamente 86%, alternativamente de por lo menos aproximadamente 87%, alternativamente de por lo menos aproximadamente 88%, alternativamente de por lo menos aproximadamente 89%, alternativamente de por lo menos aproximadamente 90%, alternativamente de por lo menos aproximadamente 91%, alternativamente de por lo menos aproximadamente 92%, alternativamente de por lo menos aproximadamente 93%, alternativamente de por lo menos aproximadamente 94%, alternativamente de por lo menos aproximadamente 95%, alternativamente de por lo menos aproximadamente 96%, alternativamente de por lo menos aproximadamente 97%, alternativamente de por lo menos aproximadamente 98%, alternativamente de por lo menos aproximadamente 99%, con una secuencia de polipéptido PRO de secuencia nativa de longitud completa tal como se da a conocer en la presente invención, una secuencia de polipéptido PRO sin el péptido de señal tal como se da a conocer en la presente invención, un dominio extracelular de un polipéptido PRO, con o sin el péptido de señal, tal como se da a conocer en la presente invención, o cualquier otro fragmento definido específicamente de una secuencia de polipéptido PRO de longitud completa tal como se da a conocer en la presente invención. Habitualmente los polipéptidos de variante de PRO presentan una longitud de por lo menos aproximadamente 10 aminoácidos, alternativamente de por lo menos aproximadamente 20 aminoácidos, alternativamente de por lo menos aproximadamente 30 aminoácidos, alternativamente de por lo menos aproximadamente 40 aminoácidos, alternativamente de por lo menos aproximadamente 50 aminoácidos, alternativamente de por lo menos aproximadamente 60 aminoácidos, alternativamente de por lo menos aproximadamente 70 aminoácidos, alternativamente de por lo menos aproximadamente 80 aminoácidos, alternativamente de por lo menos aproximadamente 90 aminoácidos, alternativamente de por lo menos aproximadamente 100 aminoácidos, alternativamente de por lo menos aproximadamente 150 aminoácidos, alternativamente de por lo menos aproximadamente 200 aminoácidos, alternativamente de por lo menos aproximadamente 300 aminoácidos, o más.

La expresión "porcentaje (%) de identidad de secuencia de aminoácidos" con respecto a las secuencias de polipéptido PRO identificadas en la presente invención se define como el porcentaje de residuos aminoácidos en una secuencia candidata que son idénticos a los residuos aminoácidos en la secuencia de polipéptido PRO específica, tras alinear las secuencias e introducir los huecos, en caso necesario, para conseguir el máximo porcentaje de identidad de secuencia, y sin considerar ninguna sustitución conservativa como parte de la identidad de secuencia. La alineación a fin de determinar el porcentaje de identidad de secuencia de aminoácidos puede conseguirse de diversas maneras que se encuentran comprendidas dentro de los conocimientos de la técnica, por ejemplo utilizando software informático disponible públicamente, tal como BLAST, BLAST-2, ALIGN o Megalign (DNASTAR). Los expertos en la materia pueden determinar parámetros apropiados para medir la alineación, incluyendo cualquier algoritmo necesario para conseguir la alineación máxima a lo largo de la longitud completa de las secuencias que se compara. Para los fines de la presente invención, sin embargo, se generaron valores de % de identidad de secuencia de aminoácidos utilizando el programa informático de comparación de secuencias ALIGN-2, en el que se proporciona en la Tabla 1 posteriormente el código fuente completo para el programa ALING-2. El autor del programa informático de comparación de secuencias ALIGN-2 es Genentech, Inc. y el código fuente mostrado en la Tabla 1 posteriormente ha sido presentado con documentación de usuario en la U.S. Copyright Office, Washington D.C., 20559, en la que se encuentra registrado bajo el nº de registro U.S. Copyright TXU510087. El programa ALIGN-2 se encuentra disponible públicamente a través de Genentech, Inc., South San Francisco, California, o puede compilarse a partir del código fuente proporcionado en la Tabla 1, posteriormente. El programa ALIGN-2 debe compilarse para la utilización en un sistema operativo UNIX, preferentemente UNIX V4.0D digital. Todos los parámetros de comparación de secuencias son fijados por el programa ALIGN-2 y no varían.

En las situaciones en las que se utiliza ALIGN-2 para las comparaciones de secuencias de aminoácidos, el % de identidad de secuencia de aminoácidos de una secuencia de aminoácidos dada A respecto a, o frente a, una secuencia de aminoácidos dada B (que alternativamente puede expresarse que una secuencia de aminoácidos dada A que presenta o comprende un % determinado de identidad de secuencia de aminoácidos respecto a, o frente a, una secuencia de aminoácidos dada B) se calcula de la manera siguiente:

100 veces la fracción X/Y

donde X es el número de residuos aminoácidos puntuado como correspondencias idénticas por el programa de alineación de secuencias ALIGN-2 en la alineación de este programa de A y B, y en el que Y es el número total de residuos aminoácidos en B. Se apreciará que en el caso de que la longitud de la secuencia de aminoácidos A no s igual a la longitud de la secuencia de aminoácidos B, el % d identidad de secuencia de aminoácidos de A a B no será igual al % de identidad de secuencia de aminoácidos de B respecto a A. A título de ejemplos de los cálculos de % de identidad de secuencia de aminoácidos utilizando dicho procedimiento, las Tablas 2 y 3 demuestran cómo calcular el % de identidad de secuencia de aminoácidos de la secuencia de aminoácidos denominada "proteína de comparación" respecto a la secuencia de aminoácidos denominada "PRO", n la que "PRO" representa la secuencia de aminoácidos de un polipéptido PRO hipotético de interés. La "proteína de comparación" representa la secuencia de aminoácidos de un polipéptido frente a la que se compara el polipéptido "PRO" de interés, y "X", "Y" y "Z" representan, cada uno, diferentes residuos aminoácidos hipotéticos.

A menos que se indique específicamente lo contrario, todos los valores de % de identidad de secuencia de aminoácidos utilizados en la presente invención se obtienen tal como se ha descrito en el párrafo inmediatamente anterior utilizando el programa informático ALIGN-2. Sin embargo, también pueden obtenerse valores de % de identidad de secuencia de aminoácidos tal como se describe posteriormente, utilizando el programa informático WU-BLAST-2 (Altschul et al., Methods in Enzymology 266:460-480, 1996). La mayoría de los parámetros de búsqueda de WU-BLAST-2 s fijan en los valores por defecto. Aquellos no fijados en los valores por defecto, es decir, los parámetros ajustables, se fijan en los valores siguientes: overlap scan=1, overlap fraction=0,125, word threshold(T)=11 y scoring matrix=BLOSUM62. Al utilizar WUB-LAST-2, se determina un valor de % de identidad de secuencia de aminoácidos mediante la división de: (a) el número de residuos aminoácidos idénticos correspondientes entre la secuencia de aminoácidos del polipéptido PRO de interés que presenta una secuencia derivada del polipéptido PRO nativo y la secuencia de aminoácidos de comparación de interés (es decir, la secuencia con la que el polipéptido PRO de interés se está comparando, que puede ser un polipéptido PRO variante) según determina WU-BLAST-2 y (b) el número total de residuos aminoácidos del polipéptido PRO de interés. Por ejemplo, en la expresión "un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos A que presenta una identidad de secuencia de aminoácidos de por lo menos 80% respecto a la secuencia de aminoácidos B", la secuencia de aminoácidos A es la secuencia de aminoácidos de comparación de interés y la secuencia de aminoácidos B es la secuencia de aminoácidos del polipéptido PRO de interés.

También puede determinarse el porcentaje d identidad de secuencia de aminoácidos utilizando el programa de comparación de secuencias NCBI-BLAST2 (Altschul et al., Nucleic Acids Res. 25:3389-3402, 1997). El programa de comparación de secuencias NCBI-BLAST2 pude descargarse de http://www.ncbi.nlm.nih.gov o si no obtenerse del National Institute of Health, Bethesda, MD. NCBI-BLAST-2 utiliza varios parámetros de búsqueda, en el que todos estos parámetros de búsqueda se fijan n los valores por defecto, incluyendo, por ejemplo, unmask=sí, strand=all, expected occurrences=10, minimum low complexity length=15/5, multi-pass e-value=0,01, constant for multi-pass=25, dropoff for final gapped alignment=25 y scoring matriz=BLOSUM62.

En las situaciones en las se utiliza NCBI-BLAST2 para las comparaciones entre secuencias de aminoácidos, el % de identidad de secuencia de aminoácidos de una secuencia de aminoácidos dada A respecto o frente a, una secuencia de aminoácidos dada B (que alternativamente puede expresarse como una secuencia de aminoácidos dada A que presenta o comprende un % de identidad de secuencia de aminoácidos respecto a, o frente a una secuencia de aminoácidos dada B) se calcula de la manera siguiente:

100 veces la fracción X/Y

en la que X es el número de residuos aminoácidos puntuado como correspondencias idénticas por el programa de alineación de secuencias NCBI-BLAST2 en la alineación de este programa de A y B, y n la que Y s el número total de residuos aminoácidos en B. Se apreciará que, en el caso de que la longitud de la secuencia de aminoácidos A no sea igual a la longitud de la secuencia de aminoácidos B, el % de identidad de secuencia de aminoácidos de A respecto a B no será igual al % de identidad de secuencia de aminoácidos de B respecto a A.

La expresión "polinucleótido de variante de PRO" o "secuencia d ácidos nucleicos de variante de PRO" se refiere a una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido PRO activo tal como se define posteriormente y que presenta una identidad de secuencia de ácidos nucleicos de por lo menos aproximadamente 80% con una secuencia de nucleótidos codificante de una secuencia de polipéptido PRO nativo de longitud completa tal como se da a conocer en la presente invención, una secuencia de polipéptido PRO d secuencia nativa de longitud completa sin el péptido de señal tal como s da a conocer en la presente invención, un dominio extracelular de un polipéptido PRO, con o sin el péptido de señal, tal como se da a conocer en la presente invención o cualquier otro fragmento de una secuencia de polipéptido PRO de longitud completa tal como se da a conocer en la presente invención. Habitualmente, un polinucleótido de variante de PRO presenta una identidad de secuencia de ácidos nucleicos de por lo menos aproximadamente 80%, alternativamente de por lo menos aproximadamente 81%, alternativamente de por lo menos aproximadamente 82%, alternativamente de por lo menos aproximadamente 83%, alternativamente de por lo menos aproximadamente 84%, alternativamente de por lo menos aproximadamente 85%, alternativamente de por lo menos aproximadamente 86%, alternativamente de por lo menos aproximadamente 87%, alternativamente de por lo menos aproximadamente 88%, alternativamente de por lo menos aproximadamente 89%, alternativamente de por lo menos aproximadamente 90%, alternativamente de por lo menos aproximadamente 91%, alternativamente de por lo menos aproximadamente 92%, alternativamente de por lo menos aproximadamente 93%, alternativamente de por lo menos aproximadamente 94%, alternativamente de por lo menos aproximadamente 95%, alternativamente de por lo menos aproximadamente 96%, alternativamente de por lo menos aproximadamente 97%, alternativamente de por lo menos aproximadamente 98%, alternativamente de por lo menos aproximadamente 99% con una secuencia de ácidos nucleicos codificante de una secuencia de polipéptido PRO de secuencia nativa de longitud completa tal como se da a conocer en la presente invención, una secuencia de polipéptido PRO de secuencia nativa de longitud completa sin el péptido de señal tal como se da a conocer en la presente invención, un dominio extracelular de un polipéptido PRO, con o sin la secuencia de señal, tal como se da a conocer en la presente invención, o cualquier otro fragmento de una secuencia de polipéptido PRO de longitud completa tal como se da a conocer en la presente invención. Las variantes no comprenden la secuencia de nucleótidos nativa.

Habitualmente, los polinucleótidos de variante de PRO presentan una longitud de por lo menos aproximadamente 30 nucleótidos, alternativamente de por lo menos aproximadamente 60 nucleótidos, alternativamente de por lo menos aproximadamente 90 nucleótidos, alternativamente de por lo menos aproximadamente 120 nucleótidos, alternativamente de por lo menos aproximadamente 150 nucleótidos, alternativamente de por lo menos aproximadamente 180 nucleótidos, alternativamente de por lo menos aproximadamente 210 nucleótidos, alternativamente de por lo menos aproximadamente 240 nucleótidos, alternativamente de por lo menos aproximadamente 270 nucleótidos, alternativamente de por lo menos aproximadamente 300 nucleótidos, alternativamente de por lo menos aproximadamente 450 nucleótidos, alternativamente de por lo menos aproximadamente 600 nucleótidos, alternativamente de por lo menos aproximadamente 900 nucleótidos, o más.

La expresión "porcentaje (%) de identidad de secuencia de ácidos nucleicos" con respecto a las secuencias de ácidos nucleicos codificantes de PRO identificadas en la presente invención se define como el porcentajes de nucleótidos en una secuencia candidata que es idéntico a los nucleótidos en la secuencia de ácidos nucleicos de PRO de interés tras alinear las secuencias e introducir los huecos, en caso necesario, para conseguir el porcentaje máximo de identidad de secuencias. La alineación para los fines de determinar el porcentaje de identidad de secuencia de ácidos nucleicos puede obtenerse de diversas maneras que se encuentran comprendidas dentro de los conocimientos de la técnica, por ejemplo utilizando software informático disponible públicamente, tal como BLAST, BLAST-2, ALIGN o Megalign (DNASTAR). Sin embargo, para los fines de la presente invención, los valores de % de identidad de secuencia de ácidos nucleicos se generan utilizando el programa informático de comparación de secuencias ALIGN-2, del que se proporciona el código fuente completo en la Tabla 1, posteriormente. El programa informático de comparación de secuencias ALIGN-2, cuyo autor es Genentech, Inc., y el código fuente mostrado en la Tabla 1, posteriormente, han sido presentados junto con la documentación de usuario en la U.S. Copyright Office, Washington D.C., 20559, en la que se encuentra registrado bajo el nº de registro U.S. Copyright TXU510087. El programa ALIGN-2 se encuentra disponible públicamente a través de Genentech, Inc., South San Francisco, California, o puede compilarse a partir del código fuente proporcionado en la Tabla 1, posteriormente. El programa ALIGN-2 debe compilarse para su utilización en un sistema operativo UNIX, preferentemente UNIX V4.0D digital. Todos los parámetros de comparación de secuencias son fijados por el programa ALIGN-2 y no varían.

En las situaciones en las que se utiliza ALIGN-2 para comparaciones de secuencias de ácidos nucleicos, el % de identidad de secuencia de ácidos nucleicos de una secuencia de ácidos nucleicos dada C respecto a, o frente a, una secuencia de ácidos nucleicos dada D (que alternativamente puede denominarse secuencia de ácidos nucleicos dada C que presenta o que comprende un % determinado de identidad de secuencia de ácidos nucleicos con, o respecto a una secuencia de ácidos nucleicos dada D), se calcula de la manera siguiente:

100 veces la fracción W/Z

donde W es el número de nucleótidos puntuados como correspondencias idénticas por el programa de alineación de secuencias ALIGN-2 en la alineación de este programa de C y D, y en la que Z es el número total de nucleótidos en D. Se apreciará que, en el caso de que la longitud de la secuencia de ácidos nucleicos C no sea igual a la longitud de la secuencia de ácidos nucleicos D, el % de identidad de secuencia de ácidos nucleicos de C respecto a D no será igual al % de identidad de secuencia de ácidos nucleicos de D respecto a C. A modo de ejemplos de los cálculos de % de identidad de secuenciad e ácidos nucleicos, las Tablas 4 y 5 muestran cómo calcular el % de identidad de secuencia de ácidos nucleicos de la secuencia de ácidos nucleicos denominada "ADN de comparación" respecto a la secuencia de ácidos nucleicos denominada "PRO-DNA", n la que "PRO-DNA" representa una secuencia de ácidos nucleicos codificante de PRO hipotética de interés, el "ADN de comparación" representa la secuencia de nucleótidos de una molécula de ácidos nucleicos con la que la molécula de ácidos nucleicos "PRO-DNA" de interés se está comparando, y "N", "L" y "V" representan, cada uno, diferentes nucleótidos hipotéticos.

A menos que se indique específicamente lo contrario, todos los valores de % de identidad de secuencia de ácidos nucleicos se obtiene tal como se ha descrito en el párrafo inmediatamente anterior utilizando el programa informático ALIGN-2. sin embargo, los valores de % de identidad d secuencia de ácidos nucleicos también pueden obtenerse tal como se describe posteriormente, mediante la utilización del programa informático WU-BLAST-2 (Altschul et al., Methods in Enzymology 266:460-480, 1996). La mayoría de los parámetros de búsqueda de WU-BLAST-2 se fijan en los valores por defecto. Aquellos no fijados en los valores por defecto, es decir, los parámetros ajustables, se fijan en los valores siguientes: overlap span=1, overlap fraction=0,125, word threshold(T)=11, y scoring matrix=BLOSUM62. Al utilizar WU-BLAST-2, se determina un valor de % de identidad de secuencia de ácidos nucleicos mediante la división de: (a) el número de nucleótidos idénticos correspondientes en la secuencia de ácidos nucleicos de la molécula de ácidos nucleicos de interés codificante del polipéptido PRO que presenta una secuencia derivada del ácido nucleico codificante del polipéptido PRO de secuencia nativa y la molécula de ácidos nucleico de comparación de interés (es decir, la secuencia frente a la que se está comparando la molécula de ácido nucleico de interés codificante del polipéptido PRO que se está comparando, que puede ser una variante de polinucleótido PRO) según determine WU-BLAST-2, por (b) el número total de nucleótidos de la molécula de ácido nucleico codificante del polipéptido PRO de interés. Por ejemplo, en la expresión "una molécula de ácido nucleico aislada que comprende una secuencia de ácidos nucleicos A que presenta una identidad de secuencia de ácidos nucleicos de por lo menos 80% respecto a la secuencia de ácidos nucleicos B", la secuencia de ácidos nucleicos A es la molécula de ácidos nucleicos de comparación de interés y la secuencia de ácidos nucleicos B es la secuencia de ácidos nucleicos de la molécula de ácidos nucleicos de interés codificante del polipéptido PRO.

\newpage

El porcentaje de identidad de secuencia de ácidos nucleicos también puede determinarse utilizando el programa de comparación de secuencias NCBI-BLAST2 (Altschul et al., Nucleic Acids Res. 25:3389-3401, 1997). El programa de comparación de secuencias NCBI-BLAST2 puede descargarse de http://www.ncbi.nim.nih.gov u obtenerse de otra manera del National Institute of Health, Bethesda, MD. NCBI-BLAST2 utiliza varios parámetros de búsqueda, en el que la totalidad de estos parámetros se fija en valores por defecto, incluyendo, por ejemplo, unmask=yes, strand=all, expected occurrences=10, minimum low complexity length=15/5, multi-pass e-value=0,01, constant for multi-pass=25, dropoff for final gapped alignment=25 y scoring matrix=BLOSUM62.

En las situaciones en las que se utiliza NCBI-BLAST2 para las comparaciones de secuencias, el % de identidad de secuencia de ácidos nucleicos de una secuencia de ácidos nucleicos C con o respecto a una secuencia de ácidos nucleicos dada D (que alternativamente puede denominarse secuencia de ácidos nucleicos dada C que presenta o que comprende un determinado % de identidad de secuencia de ácidos nucleicos con, o respecto a, una secuencia de ácidos nucleicos dada D) se calcula de la manera siguiente:

100 veces la fracción W/Z

donde W es el número de nucleótidos puntuado como correspondencias idénticas por el programa de alineación de secuencias NCBI-BLAST2 en la alineación de este programa de C y D, y donde Z es el número total de nucleótidos en D. Se apreciará que, en el caso de que la longitud de la secuencia de ácidos nucleicos C no sea igual a la longitud de la secuencia de ácidos nucleicos D, el % de identidad de secuencia de ácidos nucleicos de C respecto a D no será igual al % de identidad de secuencia de ácidos nucleicos de D respecto a C.

En otras realizaciones, los polinucleótidos de variantes de PRO son moléculas de ácidos nucleicos que codifican un polipéptido PRO activo y que son capaces de hibridación, preferentemente bajo condiciones restrictivas de hibridación y de lavado, a secuencias de nucleótidos codificantes de un polipéptido PRO de longitud completa tal como se da a conocer en la presente invención. Los polipéptidos variantes de PRO pueden ser aquellos codificados por un polinucleótido de variante de PRO.

El término "aislado" tal como se utiliza para describir los diversos polipéptidos dados a conocer en la presente invención, se refiere a un polipéptido que ha sido identificado y separado y/o recuperado a partir de un componente de su ambiente natural. Los componentes contaminantes de su ambiente natural son materiales que típicamente interferirían con usos diagnósticos o terapéuticos para el polipéptido, y pueden incluir enzimas, hormas y otros solutos proteicos o no proteicos. En realizaciones preferentes, el polipéptido puede purificarse (1) en un grado suficiente para obtener por lo menos 15 residuos de secuencia de aminoácidos N-terminal o interna mediante la utilización de un secuenciador de taza giratoria, o (2) hasta la homogeneidad mediante SDS-PAGE bajo condiciones no reductoras o reductoras utilizando azul de Coomassie o, preferentemente, tinción de plata. El polipéptido aislado incluye un polipéptido in situ dentro de células recombinante, debido a que por lo menos un componente del ambiente natural del polipéptido PRO no se encontrará presente. Sin embargo, habitualmente el polipéptido aislado se prepara mediante por lo menos una etapa de purificación.

Un ácido nucleico codificante de polipéptido PRO "aislado" u otro ácido nucleico codificante de polipéptido es una molécula de ácido nucleico que se ha identificado y separado de por lo menos una molécula contaminante de ácido nucleico con la que se encuentra habitualmente asociado en la fuente natural del ácido nucleico codificante del polipéptido. Una molécula aislada de ácido nucleico codificante de polipéptido es diferente de la forma o contexto n la que se halla en la naturaleza. Por lo tanto, las moléculas de ácidos nucleicos aisladas codificantes de polipéptido son diferentes de la molécula específica de ácido nucleico codificante de polipéptido tal como existe en las células naturales. Sin embargo, una molécula de ácido nucleico aislada codificante de polipéptido incluye moléculas de ácido nucleico codificante de polipéptido contenidas en células, que habitualmente expresan el polipéptido en las que, por ejemplo, la molécula de ácido nucleico se encuentra en una localización cromosómica diferente de la de las células naturales.

La expresión "secuencias de control" se refiere a secuencias de ADN necesarias para la expresión de una secuencia codificante operablemente ligada en un organismo huésped particular. Las secuencias de control que resultan adecuadas para los procariotas, por ejemplo, incluyen un promotor, opcionalmente una secuencia de operador, y un sitio de unión ribosómica. Es conocido que las células eucarióticas utilizan promotores, señales de poliadenilación e intensificadores.

Un ácido nucleico se encuentra "operablemente ligado" cuando se encuentra situado en una relación funcional con otra secuencia de ácido nucleico. Por ejemplo, el ADN para una presecuencia o líder secretorio se encuentra operablemente ligado a ADN de un polipéptido si se expresa en forma de una preproteína que participa en la secreción del polipéptido; un promotor o intensificador se encuentra operablemente ligado a una secuencia codificante si afecta a la transcripción de la secuencia; o un sitio de unión ribosómica se encuentra operablemente ligado a una secuencia codificante si se encuentra situado de manera que facilite la traducción. Generalmente la expresión "operablemente ligado" se refiere a que las secuencias de ADN que se unen son contiguas y, en el caso de un líder secretorio, contiguas y en la misma fase de lectura. Sin embargo, no es necesario que los intensificadores sean contiguos. La unión se consigue mediante ligación en sitios de restricción convenientes. Si estos sitios no existen, los adaptadores o línkers oligonucleótidos sintéticos se utilizan de acuerdo con la práctica convencional.

El término "anticuerpo" se utiliza en el sentido más amplio y específicamente cubre, por ejemplo, anticuerpos monoclonales anti-PRO individuales (incluyendo anticuerpo agonistas, antagonistas y neutralizadores), composiciones de anticuerpo anti-PRO con especificidad poliepitópica, anticuerpos anti-PRO de una cadena y fragmentos de anticuerpos anti-PRO (ver posteriormente). La expresión "anticuerpo monoclonal" tal como se utiliza en la presente invención se refiere a un anticuerpo obtenido a partir de una población de anticuerpos sustancialmente homogénea, es decir, los anticuerpos individuales que comprende la población son idénticos excepto por posibles mutaciones naturales que pueden encontrarse presentes en cantidades menores.

La "astringencia" de las reacciones de hibridación puede ser fácilmente determinada por un experto ordinario en la materia y generalmente es un cálculo empírico dependiente de la longitud de la sonda, la temperatura de lavado y la concentración de sales. En general, las sondas más largas requieren temperaturas más altas para una hibridación correcta, mientras que sondas más cortas requieren temperaturas más cortas. La hibridación generalmente depende de la capacidad del ADN desnaturalizado de rehibridarse en el caso de que las cadenas complementarias se encuentran presentes en un ambiente por debajo de la temperatura de fusión de las mismas. Cuanto más elevada sea el grado de homología deseada entre la sonda y la secuencia hibridable, más alta será la temperatura relativa que puede utilizarse. En consecuencia, se infiere que las temperaturas relativas más altas tienden a provocar que las condiciones de reacción sean más restrictivas, y a la inversa las temperaturas más bajas. Para más detalles y una explicación de la astringencias de las reacciones de hibridación, ver Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Wiley Interscience Publishers, 1995.

Las "condiciones astringentes" o las "condiciones de elevada astringencia", tal como se definen en la presente invención, pueden identificarse como aquéllas en las que: (1) se utiliza una fuerza iónica reducida y una temperatura elevada para el lavado, por ejemplo cloruro sódico 0,015 M/citrato sódico 0,0015 M/dodecil sulfato sódico al 0,1% a 50ºC, (2) se utiliza durante la hibridación un agente desnaturalizante, tal como formamida, por ejemplo formamida al 50% (v/v) con albúmina de suero bovino al 0,1%/Ficoll al 0,1%/polivinilpirrolidona al 0,1%/tampón de fosfato sódico 50 mM a pH 6,5 con cloruro sódico 750 mM, citrato sódico 75 mM a 42ºC, o (3) se utiliza formamida al 50%, 5 x SSC (NaCl 0,75 M, citrato sódico 0,075 M), fosfato sódico 50 mM (pH 6,8), pirofosfato sódico al 0,1%, 5 x solución de Denhardt, ADN de esperma de salmón sonicado (50 \mug/ml), SDS al 0,1% y dextrán sulfato al 10% a 42ºC, con lavados a 42ºC en 0,2 x SSC (cloruro sódico/citrato sódico) y formamida al 50% a 55ºC, seguido de un lavado de alta astringencia consistente de 0,1 x SSC que contenía EDTA a 55ºC.

La expresión "condiciones moderadamente astringentes" puede identificarse tal como describen Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, New York: Cold Spring Harbor Press, 1989, e incluye la utilización de solución de lavado y condiciones de hibridación (por ejemplo temperatura, fuerza iónica y % de SDS) menos restrictivas que aquéllas indicadas anteriormente. Un ejemplo de condiciones moderadamente restrictivas es la incubación durante la noche a 37ºC en una solución que comprende: formamida al 20%, 5 x SSC (NaCl 150 mM, citrato trisódico 15 mM), fosfato sódico 50 mM (pH 7,6), 5 x solución de Denhardt, dextrán sulfato al 10% y 20 mg/ml de ADN de esperma de salmón sonicado y desnaturalizado, seguido de lavado de los filtros en 1 x SSC a una temperatura de entre 37ºC y 50ºC. El experto en la materia conocerá cómo ajustar la temperatura, la fuerza iónica, etc., según resulte necesario para ajustarse a factores tales como la longitud de la sonda y similares.

La expresión "etiquetado con epítopo" tal como se utiliza en la presente invención se refiere a un polipéptido quimérico que comprende un polipéptido PRO fusionado con un "polipéptido etiqueta". El polipéptido etiqueta presenta suficientes residuos para proporcionar un epítopo contra el que puede prepararse un anticuerpo, aunque es suficientemente corto para no interferir con la actividad del polipéptido con el que se encuentra fusionado. El polipéptido etiqueta preferentemente también es único de manera que el anticuerpo no reaccione cruzadamente de manera sustancial con otros epítopos. Los polipéptidos etiqueta adecuados generalmente presentan por lo menos seis residuos aminoácidos y habitualmente entre aproximadamente 8 y 50 residuos aminoácidos (preferentemente entre aproximadamente 10 y 20 residuos aminoácidos).

Tal como se utiliza en la presente invención, el término "inmunoadhesina" designa moléculas de tipo anticuerpo que combinan la especificidad de unión de una proteína heteróloga (una "adhesina") con las funciones efectoras de los dominios constantes de inmunoglobulina. Estructuralmente las inmunoadhesinas comprenden una fusión de una secuencia de aminoácidos con la especificidad de unión deseada, que es diferente de las de los sitios de reconocimiento de antígeno y de unión de un anticuerpo (es decir, es "heteróloga"), y una secuencia de dominio constante de inmunoglobulina. La parte adhesina de una molécula de inmunoadhesina típicamente es una secuencia de aminoácidos contigua que comprende por lo menos el sitio de unión de un receptor o de un ligando. La secuencia de dominio constante de inmunoglobulina en la inmunoadhesina puede obtenerse a partir de cualquier inmunoglobulina, por ejemplo de los subtipos IgG-1, IgG-2, IgG-3 o IgG4, IgA (incluyendo IgA-1 e IgA-2), IgE, IgD o IgM.

Los términos "activo" o "actividad" para los fines de la presente invención se refieren a una o más formas de un polipéptido PRO que conservan una actividad biológica y/o inmunológica de PRO nativo o natural, en las que actividad "biológica" se refiere a una función biológica (inhibidora o estimuladora) causada por un PRO nativo o natural que no es la capacidad de inducir la producción de un anticuerpo contra un epítopo antigénico que posea el PRO nativo o natural y una actividad "inmunológica" se refiere a la capacidad de inducir la producción de un anticuerpo contra un epítopo antigénico que presente un PRO nativo o natural.

\newpage

El término "antagonista" se utiliza en el sentido más amplio, e incluye cualquier molécula que bloquea, inhibe o neutraliza parcial o totalmente una actividad biológica de un polipéptido PRO nativo dado a conocer en la presente invención. De manera similar, el término "agonista" se utiliza en el sentido más amplio e incluye cualquier molécula que imita una actividad biológica de un polipéptido PRO nativo dado a conocer en la presente invención. Entre las moléculas agonistas o antagonistas adecuadas específicamente se incluyen anticuerpos agonistas o antagonistas o fragmentos de anticuerpo, fragmentos o variantes de secuencia de aminoácidos de polipéptidos PRO nativos, péptidos, oligonucleótidos antisentido, moléculas orgánicas pequeñas, etc. Los procedimientos para identificar los agonistas o antagonistas de un polipéptido PRO pueden comprender poner en contacto un polipéptido PRO con una molécula agonista o antagonista candidata y medir un cambio detectable en una o más actividades biológicas normalmente asociadas con el polipéptido PRO.

El término "tratamiento" se refiere tanto al tratamiento terapéutico como a medidas profilácticas o preventivas, en el que el objetivo es prevenir o enlentecer (reducir) la condición o trastorno patológico diana. Entre aquellos que necesitan tratamiento se incluyen aquellos que ya presentan el trastorno, así como aquellos con tendencia a presentar el trastorno o aquellos en los que debe prevenirse el trastorno.

La administración "crónica" se refiere a la administración del agente o agentes de un modo continuo, es decir no de un modo agudo, de manera que se mantenga el efecto (actividad) terapéutico inicial durante un periodo de tiempo prolongado. La administración "intermitente" es el trastorno que no se realiza consecutivamente sin interrupción, sino que es de naturaleza cíclica.

El término "mamífero" para los fines del tratamiento se refiere a cualquier animal clasificado como mamífero, incluyendo seres humanos, animales domésticos y de granja, y animales de zoológico o animales de compañía, tales como perros, gatos, vacas, caballos, ovejas, cerdos, cabras, conejos, etc. Preferentemente el mamífero es el ser
humano.

La administración "en combinación" con uno o más agentes terapéuticos adicionales incluye la administración simultánea (concurrente) y la administración consecutiva en cualquier orden.

El término "portadores" tal como se utiliza en la presente invención incluye portadores, excipientes o estabilizadores farmacéuticamente aceptables que resultan no tóxicos para la célula o mamífero expuestos a los mismos a las dosis y concentraciones utilizadas. Con frecuencia el portador fisiológicamente aceptable es una solución acuosa de pH tamponado. Entre los ejemplos de portadores fisiológicamente aceptables se incluyen tampones, tales como fosfato, citrato y otros ácidos orgánicos; antioxidantes, incluyendo ácido ascórbico; polipéptidos de bajo peso molecular (menos de aproximadamente 10 residuos); proteínas, tales como albúmina sérica, gelatina o inmunoglobulinas; polímeros hidrofílicos, tales como polivinilpirrolidona; aminoácidos, tales como glicina, glutamina, asparagina, arginina o lisina; monosacáridos, disacáridos y otros carbohidratos, incluyendo glucosa, manosa o dextrinas; agentes quelantes, tales como EDTA; alcoholes de azúcar, tales como manitol o sorbitol; contraiones formadores de sal, tales como sodio, y/o surfactantes no iónicos, tales como TWEEN^{TM}, polietilenglicol (PEG) y PLURONICS^{TM}.

Los "fragmentos de anticuerpo" comprenden una parte de un anticuerpo intacto, preferentemente la región de unión a antígeno o la región variable del anticuerpo intacto. Entre los ejemplos de fragmentos de anticuerpo se incluyen los fragmentos Fab, Fab', F(ab')_{2} y Fv; los diacuerpos; los anticuerpos lineales (Zapata et al., Protein Eng. 8(10):1057-1062, 1995]; las moléculas de anticuerpo de una cadena, y los anticuerpos multiespecíficos formados a partir de fragmentos de anticuerpo.

La digestión con papaína de los anticuerpos produce dos fragmentos idénticos de unión a antígeno, denominados fragmentos "Fab", cada uno de los cuales presenta un único sitio de unión a antígeno, y un fragmento "Fc" residual, una denominación que refleja la capacidad de cristalizar fácilmente. El tratamiento con pepsina produce un fragmento F(ab')_{2} que presenta dos sitios de unión a antígeno y que todavía es capaz de unirse cruzadamente a antígenos.

"Fv" es el fragmento mínimo de anticuerpo que contiene un sitio completo de reconocimiento y de unión a antígeno. Esta región consiste de un dímero de un dominio variable de cadena pesada y de uno de cadena ligera en íntima asociación no covalente. Es en esta configuración que las tres CDR de cada dominio variable interaccionan, definiendo un sitio de unión a antígeno sobre la superficie del dímero V_{H}-V_{L}. Colectivamente las seis CDR proporcionan especificidad de unión a antígeno al anticuerpo. Sin embargo, incluso un solo dominio variable (o la mitad de un Fv que comprenda únicamente tres CDR específicas para un antígeno) presenta la capacidad de reconocer y unirse a antígeno, aunque a una afinidad menor que el sitio de unión completo.

El fragmento Fab también contiene el dominio constante de la cadena ligera y el primer dominio constante (CH1) de la cadena pesada. Los fragmentos Fab difieren de los fragmentos Fab' por la adición de unos cuantos residuos en el extremo carboxi-terminal del dominio CH1 de cadena pesada, incluyendo una o más cisteínas de la región bisagra del anticuerpo. Fab'-SH es la denominación en la presente invención para Fab' en el que el residuo o residuos de cisteína de los dominios constantes portan un grupo tiol libre. Los fragmentos de anticuerpo F(ab')_{2} originalmente se produjeron como pares de fragmentos Fab' que presentaban cisteínas de bisagra entre ellos. También son conocidos otros enlaces químicos de fragmentos de anticuerpo.

\newpage

Las "cadenas ligeras" de anticuerpos (inmunoglobulinas) procedentes de cualquier especie de vertebrado pueden asignarse a dos tipos claramente diferenciados, denominados kappa y lambda, basándose en las secuencias de aminoácidos de sus dominios constantes.

Dependiendo de la secuencia de aminoácidos del dominio constante de sus cadenas pesadas, las inmunoglobulinas pueden asignarse a diferentes clases. Existen cinco clases principales de inmunoglobulinas: IgA, IgD, IgE, IgG e IgM, y varias de éstas pueden dividirse adicionalmente en subclases (isotipos), por ejemplo IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA e IgA2.

Los fragmentos de anticuerpo "Fv de una cadena" o "sFv" comprenden los dominios V_{H} y V_{L} de anticuerpos, en los que estos dominios se encuentran presentes en una sola cadena polipeptídica. Preferentemente el polipéptido Fv comprende además un línker polipeptídico entre los dominios V_{H} y V_{L} que permite que sFv formen la estructura deseada para la unión de antígeno. Para una revisión de sFv, ver Pluckthun, en: The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg y Moore, editores, Springer-Verlag, New York, páginas 269 a 315, 1994.

El término "diacuerpos" se refiere a fragmentos de anticuerpo pequeños con dos sitios de unión a antígeno, comprendiendo los fragmentos un dominio variable de cadena pesada (V_{H}) conectado a un dominio variable de cadena ligera (V_{L}) en la misma cadena polipeptídica (VH-VL). Mediante la utilización de un línker que es excesivamente corto para permitir el apareamiento entre los dos dominios en la misma cadena, se fuerza el apareamiento de los dominios con los dominios complementarios de otra cadena y se crean dos sitios de unión a antígeno. Los diacuerpos se describen más detalladamente, por ejemplo, en las patentes EP nº 404.097, WO nº 93/11161, y en Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448, 1993.

Un anticuerpo "aislado" es uno que ha sido identificado y separado y/o recuperado a partir de un componente de su ambiente natural. Los componentes contaminantes de su ambiente natural son materiales que interferirían con los usos diagnósticos o terapéuticos del anticuerpo, y pueden incluir enzimas, hormonas y otros solutos proteicos o no proteicos. En las realizaciones preferentes, el anticuerpo se purifica: (1) a más de 95% en peso de anticuerpo según se determina mediante el procedimiento de Lowry, y más preferentemente a más de 99% en peso, (2) en un grado suficiente para obtener por lo menos 15 residuos de secuencia N-terminal o interna de aminoácidos mediante la utilización de un secuenciador de taza giratoria, o (3) hasta la homogeneidad mediante SDS-PAGE bajo condiciones reductoras o no reductoras utilizando azul de Coomassie o, preferentemente, tinción de plata. El anticuerpo aislado incluye el anticuerpo in situ dentro de células recombinantes debido a que por lo menos un componente del ambiente natural del anticuerpo no se encontrará presente. Sin embargo, habitualmente el anticuerpo aislado se prepara mediante por lo menos una etapa de purificación.

Un anticuerpo que "se une específicamente" o que es "específico de" un polipéptido particular o de un epítopo sobre un polipéptido particular es un anticuerpo que se une a ese polipéptido particular o epítopo sobre un polipéptido particular sin unirse sustancialmente a ningún otro polipéptido o epítopo de polipéptido.

El término "marcaje" tal como se utiliza en la presente invención se refiere a un compuesto o composición detectable que se conjuga directa o indirectamente al anticuerpo de manera que genera un anticuerpo "marcado". El marcaje puede ser detectable por sí mismo (por ejemplo marcajes de isótopos radioactivos o marcajes fluorescentes) o, en el caso de un marcaje enzimático, puede catalizar la alteración química de un compuesto o composición sustrato que es detectable.

La expresión "fase sólida" se refiere a una matriz no acuosa a la que el anticuerpo de la presente invención puede adherirse. Entre los ejemplos de fases sólidas comprendidas en la presente invención se incluyen aquéllas formadas parcial o enteramente de vidrio (por ejemplo vidrio de poro controlado), polisacáridos (por ejemplo agarosa), poliacrilamidas, poliestireno, alcohol polivinílico y siliconas. En determinadas realizaciones, dependiendo del contexto, la fase sólida puede comprender el pocillo de una placa de ensayo; en otras, es una columna de purificación (por ejemplo una columna de cromatografía de afinidad). Este término también incluye una fase sólida discontinua de partículas discretas, tales como aquéllas descritas en la patente US nº 4.275.149.

Un "liposoma" es una vesícula pequeña compuesta de diversos tipos de lípidos, fosfolípidos y/o surfactante que resulta útil para la administración de un fármaco (tal como un polipéptido PRO o anticuerpo del mismo) en un mamífero. Los componentes del liposoma comúnmente se organizan en una formación de bicapa, similar a la disposición de los lípidos de las membranas biológicas.

Una "molécula pequeña" se define en la presente invención que presenta un peso molecular inferior a aproximadamente 500 daltons.

La expresión "enfermedad de tipo inmunológico" se refiere a una enfermedad en la que un componente del sistema inmunológico de un mamífero causa, media o de otra manera contribuye a una morbilidad en el mamífero. También se encuentran incluidas las enfermedades en las que la estimulación o la intervención de la respuesta inmunológica presenta un efecto de mejora sobre la progresión de la enfermedad. Se encuentran incluidas dentro de dicho término las enfermedades inflamatorias mediadas inmunológicamente, las enfermedades inflamatorias no mediadas inmunológicamente, las enfermedades infecciosas, las enfermedades de inmunodeficiencia, la neoplasia, etc.

La expresión "enfermedad mediada por células T" se refiere a una enfermedad en la que las células T directa o indirectamente median o de otra manera contribuye a una morbilidad en un mamífero. La enfermedad mediada por células T puede encontrarse asociada a efectos mediados por células, efectos mediados por linfoquinas, etc., e incluso a efectos asociados a células B si las células B resultan estimuladas, por ejemplo por las linfoquinas secretadas por las células T.

Entre los ejemplos de enfermedades de tipo inmunológico e inflamatorias, algunas de las cuales se encuentran mediadas inmunológicamente o por células T, que pueden tratarse según la invención, se incluyen: lupus eritematoso sistémico, artritis reumatoide, artritis crónica juvenil, espondiloartropatías, esclerosis sistémica (escleroderma), miopatías inflamatorias idiopáticas (dermatomiositis, polimiositis), síndrome de Sjögren, vasculitis sistémica, sarcoidosis, anemia hemolítica autoinmunológica (pancitopenia inmunológica, hemoglobinuria nocturna paroxística), trombocitopenia autoinmunológica (púrpura trombocitopénica idiopática, trombocitopenia mediada inmunológicamente), tiroiditis (enfermedad de Grave, tiroiditis de Hashimoto, tiroiditis linfocítica juvenil, tiroiditis atrófica), diabetes mellitus, enfermedad renal mediada inmunológicamente (glomerulonefritis, nefritis tubulointersticial), enfermedades desmielinizantes de los sistemas nerviosos central y periférico, tales como esclerosis múltiple, polineuropatía desmielinizante idiopática o síndrome de Guillain-Barré y polineuropatía desmielinizante inflamatoria crónica, enfermedades hepatobiliares, tales como hepatitis infecciosa (hepatitis A, B, C, D, E y otros virus no hepatotrópicos), hepatitis activa crónica autoinmunológica, cirrosis biliar primaria, hepatitis granulomatosa y colangitis esclerosante, enfermedad intestinal inflamatoria (colitis ulcerosa: enfermedad de Crohn), enteropatía sensible al gluten y enfermedad de Whipple, enfermedades de la piel autoinmunológicas o mediadas inmunológicamente, incluyendo las enfermedades bullosas de la piel, eritema multiforme y dermatitis por contacto, soriasis, enfermedades alérgicas tales como asma, rinitis alérgica, dermatitis atópica, hipersensibilidad alimentaria y urticaria, enfermedades inmunológicas de los pulmones, tales como neumonías eosinofílicas, fibrosis pulmonar idiopática y neumonitis por hipersensibilidad, enfermedades asociadas a trasplantes, incluyendo el rechazo del injerto y la enfermedad de injerto contra huésped, enfermedades infecciosas, incluyendo enfermedades víricas tales como el SIDA (infección por VIH), hepatitis, A, B, C, D y E, etc., infecciones bacterianas, infecciones fúngicas, infecciones protozoáricas e infecciones parasitarias.

La expresión "cantidad eficaz" es una concentración o cantidad de un polipéptido PRO y/o agonista/antagonista que resulta en que se consigue un fin particular indicado. Puede determinarse empíricamente una "cantidad eficaz" de un polipéptido PRO o agonista o antagonista del mismo. Además, una "cantidad terapéuticamente eficaz" es una concentración o cantidad de un polipéptido PRO y/o agonista/antagonista que resulta eficaz para conseguir un efecto terapéutico indicado. Esta cantidad también puede determinarse empíricamente.

La expresión "agente citotóxico" tal como se utiliza en la presente invención se refiere a una sustancia que inhibe o evita la función de las células y/o causa la destrucción de las mismas. La expresión pretende incluir isótopos radioactivos (por ejemplo I^{131}, I^{125}, Y^{90} y Re^{186}), agentes quimioterapéuticos y toxinas, tales como toxinas enzimáticamente activas de origen bacteriano, fúngico, vegetal o animal, o fragmentos de las mismas.

Un "agente quimioterapéutico" es un compuesto químico útil en el tratamiento del cáncer. Entre los ejemplos de agentes quimioterapéuticos se incluyen adriamicina, doxorubicina, epirubicina, 5-fluorouracilo, citosina arabinósido ("Ara-C"), ciclofosfamida, tiotepa, busulfán, citoxina, taxoides, por ejemplo paclitaxel (Taxol, Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, NJ), y doxetaxel (Taxotere, Rhône-Poulenc Rorer, Antony, Francia), toxotere, metotrexato, cisplatino, melfalán, vinblastina, bleomicina, etopósido, ifosfamida, mitomicina C, mitoxantrona, vincristina, vinorelbina, carboplatino, tenipósido, daunomicina, carminomicina, aminopterina, dactinomicina, mitomicinas, esperamicinas (ver la patente US nº 4.675.187), melfalán y otras mostazas nitrogenadas relacionadas. También se encuentran incluidas en esta definición los agentes hormonales que actúan regulando o inhibiendo la acción hormonal sobre tumores, tales como el tamoxifeno y la onapristona.

Un "agente inhibidor del crecimiento" tal como se utiliza en la presente invención se refiere a un compuesto o composición que inhibe el crecimiento de una célula, especialmente una célula de cáncer que sobreexpresa cualquiera de los genes identificados en la presente invención, in vitro o in vivo. De esta manera, el agente inhibidor del crecimiento es uno que reduce significativamente el porcentaje de células que sobreexpresan dichos genes en fase S. Entre los ejemplos de agentes inhibidores del crecimiento se incluyen agentes que bloquean la progresión del ciclo celular (en un momento que no es la fase S), tal como agentes que inducen la detención de las fases G1 y M. Entre los bloqueantes clásicos de la fase M se incluyen las vincas (vincristina y vinblastina), taxol e inhibidores topo II, tales como doxorubicina, epirubicina, daunorubicina, etopósido y bleomicina. Aquellos agentes que detienen la fase G1 también se desbordan deteniendo la fase S, por ejemplo agentes alquilantes del ADN, tales como tamoxifeno, prednisona, dacarbazina, mecloretamina, cisplatino, metotrexato, 5-fluorouracilo y ara-C. Puede encontrarse información adicional en: The Molecular Basis of Cancer, Mendelsohn e Israel, editores, capítulo 1, titulado: "Cell cycle regulation, oncogenes and antineoplastic drugs", por Murakami et al. (WB Saunders: Philadelphia, 1995), especialmente la página 13.

El término "citoquina" es un término genérico para las proteínas liberadas por una población celular que actúa sobre otra célula como mediadores intercelulares. Son ejemplos de estas citoquinas: linfoquinas, monoquinas y hormonas polipeptídicas tradicionales. Entre las citoquinas se encuentran las hormonas del crecimiento, tales como la hormona del crecimiento humana, la N-metionil-hormona del crecimiento humana y la hormona del crecimiento bovina, la hormona paratiroidea, la tirosina, la insulina, la proinsulina, la relaxina, la prorelaxina, las hormonas glucoproteínas, tales como la hormona folículo-estimulante (FSH), la hormona estimuladora del tiroides (TSH) y la hormona luteinizante (LH), el factor de crecimiento hepático, el factor de crecimiento fibroblástico, la prolactina, el lactógeno placentario, los factores \alpha y \beta de necrosis tumoral, la sustancia inhibidora mulleriana, el péptido asociado a la gonadotropina de ratón, la inhibina, la activina, el factor de crecimiento endotelial vascular, la integrina, la trombopoyetina (TPO), los factores de crecimiento nervioso, tales como NGF-\beta, el factor de crecimiento plaquetario, los factores de crecimiento transformante (TGFs), tales como TGF-\alpha y TGF-\beta, los factores I e II de crecimiento similares a la insulina, la eritropoyetina (EPO), los factores osteoconductores, los interferones, tales como el interferón \alpha, el interferón \beta y el interferón \gamma, los factores estimuladores de colonias (CSFs), tales como CSF de macrófago (M-CSF), el CSF de granulocito-macrófago (GM-CSF) y el CSF-granulocito (G-CSF), las interleuquina (ILs), tales como IL-1, IL-1\alpha, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-11, IL-12, un factor de necrosis tumoral, tal como TNF-\alpha o TNF-\beta, y otros factores polipeptídicos, incluyendo LIF y el ligando kit (KL). Tal como se utiliza en la presente invención, el termino citoquina incluye proteínas de fuentes naturales o de cultivo celular recombinante y equivalentes biológicamente activos de las citoquinas de secuencia nativa.

Tal como se utiliza en la presente invención, el término "inmunoadhesina" designa moléculas de tipo anticuerpo que combinan la especificidad de unión de una proteína heteróloga (una "adhesina") con las funciones efectoras de los dominios constantes de inmunoglobulina. Estructuralmente las inmunoadhesinas comprenden una fusión de una secuencia de aminoácidos con la especificidad de unión deseada que es diferente de la del sitio de reconocimiento y unión de antígeno de un anticuerpo (es decir, es "heteróloga") y una secuencia de dominio constante de inmunoglobulina. La parte adhesina de una molécula de inmunoadhesina típicamente es una secuencia de aminoácidos contigua que comprende por lo menos el sitio de unión de un receptor o de un ligando. La secuencia de dominio constante de inmunoglobulina en la inmunoadhesina puede obtenerse a partir de cualquier inmunoglobulina, tal como los subtipos IgG-1, IgG-2, IgG-3 o IgG-4, IgA (incluyendo IgA-1 e IgA-2), IgE, IgD o IgM.

\vskip1.000000\baselineskip

TABLA 1

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12

13

14

15

16

TABLA 2

17

\vskip1.000000\baselineskip

TABLA 3

18

\vskip1.000000\baselineskip

TABLA 4

19

\vskip1.000000\baselineskip

TABLA 5

20

II. Composiciones y procedimientos de la invención A. Polipéptidos PRO de longitud completa

La presente invención proporciona secuencias de nucleótidas nuevamente identificadas y aisladas codificantes de polipéptidos a los que se hace referencia en la presente solicitud como polipéptidos PRO. En particular, se han identificado y aislado los ADNc codificantes de diversos polipéptidos PRO, tal como se da a conocer en más detalle en los Ejemplos, posteriormente. Se indica que las proteínas producidas en rondas de expresión separadas pueden recibir diferentes números de PRO aunque el número UNQ es único para cualquier ADN dado y proteína codificada, y no se modifica. Sin embargo, por simplicidad, en la presente memoria la proteína codificada por las moléculas de ácido nucleico nativas de longitud completa dadas a conocer en la presente invención, así como todos los homólogos y variantes nativos adicionales incluidos en la definición anterior de PRO, recibirán como referencia "PRO/número", con independencia del origen o modo de preparación.

Tal como se da a conocer en los Ejemplos posteriormente, se han depositado diversos clones de ADNc en la ATCC. Las secuencias de nucleótidos reales de dichos clones puede ser fácilmente determinadas por el experto en la materia mediante la secuenciación del clon depositado utilizando procedimientos rutinarios de la técnica. La secuencia de aminoácidos predicha puede determinarse a partir de la secuencia de nucleótidos utilizando conocimientos rutinarios de la técnica. Para los polipéptidos PRO y ácidos nucleicos codificantes descritos en la presente invención, los solicitantes han identificado lo que se considera es el marco de lectura que mejor se identifica con la información de secuencia disponible hasta el momento.

B. Variantes de polipéptido PRO

Además de los polipéptidos PRO de secuencia nativa de longitud completa descritos en la presente invención, se contempla que puedan prepararse variantes de PRO. Las variantes de PRO pueden prepararse mediante la introducción de modificaciones apropiadas de nucleótidos en el ADN y/o mediante síntesis del polipéptido PRO deseado. Los expertos en la materia apreciarán que las modificaciones de aminoácidos pueden alterar los procesos post-traduccionales de PRO, por ejemplo la modificación del número o posición de los sitios de glucosilación o la alteración de las características de anclaje a membrana.

Pueden realizarse variaciones en el PRO de secuencia nativa de longitud completa o en diversos dominios del PRO descrito en la presente invención, por ejemplo utilizando cualquiera de las técnicas y directrices para mutaciones conservativas y no conservativas fijadas, por ejemplo, en la patente US nº 5.364.934. Las variaciones pueden ser una sustitución, deleción o inserción de uno o más codones codificantes del PRO que resultan en una modificación de la secuencia de aminoácidos del PRO comparado con el PRO de secuencia nativa. Opcionalmente la variación es mediante sustitución de por lo menos un aminoácido por cualquier otro aminoácido en uno o más de los dominios del PRO. Puede encontrarse guías para determinar qué residuos aminoácido puede insertarse, sustituirse o delecionarse sin afectar adversamente la actividad deseada mediante la comparación de la secuencia del PRO con la de las moléculas de proteína homólogas conocidas y la minimización del número de modificaciones de la secuencia de aminoácidos realizadas en las regiones de homología elevada. Las sustituciones de aminoácidos pueden ser el resultado de sustituir un aminoácido por otro aminoácido que presente propiedades estructurales y/o químicas similares, tal como la sustitución de una leucina por una serina, es decir sustituciones de aminoácidos conservativas. Las inserciones o deleciones opcionalmente pueden encontrarse comprendidas en el intervalo de entre aproximadamente 1 y 5 aminoácidos. La variación permitida puede determinarse realizando sistemáticamente inserciones, deleciones o sustituciones de aminoácidos en la secuencia y sometiendo a ensayo las variantes resultantes para actividad mostrada por la secuencia nativa de longitud completa o madura.

En la presente invención se proporcionan fragmentos de polipéptido PRO. Estos fragmentos pueden truncarse en el extremo N-terminal o C-terminal o pueden carecer de residuos internos, por ejemplo en comparación con una proteína nativa de longitud completa. Determinados fragmentos no presentan residuos aminoácidos que no resultan esenciales para una actividad biológica deseada del polipéptido PRO.

Pueden prepararse fragmentos de PRO mediante cualquiera de entre varias técnicas convencionales. Los fragmentos peptídicos deseados pueden sintetizarse químicamente. Un enfoque alternativo implica generar fragmentos de PRO mediante digestión enzimática, por ejemplo tratando la proteína con un enzima que es conocido que corta proteínas en sitios definidos por residuos aminoácidos particulares, o mediante la digestión del ADN con enzimas de restricción adecuados y aislando el fragmento deseado. Todavía otra técnica adecuada implica aislar y amplificar un fragmento de ADN codificante de un fragmento polipeptídico deseado, mediante reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Se utilizan oligonucleótidos que definen los extremos deseados del fragmento de ADN en los cebadores 5' y 3' en la PCR. Preferentemente los fragmentos del polipéptido PRO comparten por lo menos una actividad biológica y/o inmunológica con el polipéptido PRO nativo dado a conocer en la presente invención.

En realizaciones particulares, se muestran sustituciones conservativas de interés en la Tabla 6 bajo el título de sustituciones preferentes. Si estas sustituciones resultan en una modificación de la actividad biológica, se introducen más modificaciones sustanciales, denominadas sustituciones ejemplares en la Tabla 6 o tal como se describe adicionalmente después en referencia a las clases de aminoácido, y se criban los productos.

TABLA 6

21

Se consiguen modificaciones sustanciales de la función o de la identidad inmunológico del polipéptido PRO mediante la selección de sustituciones que difieren significativamente en su efecto sobre el mantenimiento de: (a) la estructura del esqueleto del polipéptido en el área de la sustitución, por ejemplo en conformación de hoja o de hélice, (b) la carga o hidrofobicidad de la molécula en el sitio diana, (c) el volumen de la cadena lateral. Los residuos naturales se dividen en grupos basándose en las propiedades comunes de las cadenas laterales:

(1): hidrofóbicos: norleucina, met, ala, val, leu, ile;

(2): hidrofílicos neutros: cys, ser, thr;

(3): ácidos: asp, glu;

(4): básicos: asn, gln, his, lys, arg;

(5): residuos que influyen sobre la orientación de la cadena: gly, pro, y

(6): aromáticos: trp, tyr, phe.

Las sustituciones no conservativas implican intercambiar un miembro de una de estas clases por un miembro de otra clase. Estos residuos sustituidos también pueden introducirse en los sitios de sustitución conservativa o, más preferentemente, en los sitios (no conservados) restantes.

Las variaciones pueden realizarse utilizando procedimientos conocidos de la técnica, tales como la mutagénesis mediada por oligonucleótidos (sitio-dirigida), el escaneo de alaninas y la mutagénesis por PCR. La mutagénesis sitio-dirigida [Carter et al., Nucl. Acids Res. 13:4331, 1986; Zoller et al., Nucl. Acids Res. 10:6487, 1987], la mutagénesis por inserción de casete [Wells et al., Gene 34:315, 1985], la mutagénesis por restricción de selección [Wells et al., Philos. Trans. R. Soc. London SerA 317:415, 1986] u otras técnicas conocidas pueden llevarse a cabo sobre el ADN clonado para producir el ADN de variante de PRO.

El análisis de escaneo de aminoácidos también puede utilizarse para identificar uno o más aminoácidos a lo largo de una secuencia contigua. Entre los aminoácidos de escaneo preferentes se encuentran los aminoácidos neutros relativamente pequeños. Entre estos aminoácidos se incluyen alanina, glicina, serina y cisteína. La alanina es típicamente un aminoácido de escaneo preferente de entre este grupo debido a que elimina la cadena lateral más allá del carbono beta y es menos probable que altere la conformación de la cadena principal de la variante [Cunningham y Wells, Science 244:1081-1085, 1989]. La alanina también resulta típicamente preferente debido a que es el aminoácido más común. Además, se encuentra frecuentemente en posiciones tanto enterradas como expuestas [Creighton, The Proteins, W.H. Freeman & Co., N.Y.); Chothia, J. Mol. Biol. 150:1, 1976]. Si la sustitución de alaninas no proporciona cantidades adecuadas de variante, puede utilizarse un aminoácido isotérico.

\vskip1.000000\baselineskip

C. Modificaciones de PRO

Las modificaciones covalentes de PRO se encuentran comprendidas dentro del alcance de la presente invención. Un tipo de modificación covalente incluye reaccionar residuos aminoácidos diana de un polipéptido PRO con un agente derivatizante orgánico que es capaz de reaccionar con cadenas laterales seleccionadas de los residuos N-terminales o C-terminales del PRO. La derivatización con agentes bifuncionales resulta útil, por ejemplo, para reticular PRO con una matriz de soporte o superficie insoluble en agua para la utilización en el procedimiento para purificar anticuerpos anti-PRO, y viceversa. Entre los agentes reticulantes utilizados comúnmente se incluyen, por ejemplo, 1,1-bis(diazoacetil)-2-feniletano, glutaraldehído, ésteres de N-hidroxisuccinimida, por ejemplo ésteres con ácido 4-azidosalicílico, imidoésteres homobifuncionales, incluyendo ésteres disuccinimidilo, tales como 3,3'-ditiobis(succinimidilpropionato), maleimidas bifuncionales, tales como bis-N-maleimido-1,8-octano y agentes tales como metil-3-[(p-azidofenil)ditio]propioimidato.

Entre otras modificaciones se incluyen la desamidación de los residuos glutaminilo y asparaginilo en los residuos glutamilo y aspartilo correspondientes, respectivamente, la hidroxilación de prolina y lisina, la fosforilación de grupos hidroxilo de residuos serilo o treonilo, la metilación de los grupos \alpha-amino de cadenas laterales de lisina, arginina e histidina [T.E. Creighton, Proteins: Structure and Molecular Properties, W.H. Freeman & Co., San Francisco, páginas 79 a 86, 1983], la acetilación de la amina N-terminal y la amidación de cualquier grupo carboxilo C-terminal.

Otro tipo de modificación covalente del polipéptido PRO comprendido dentro del alcance de la presente invención comprende alterar el patrón de glucosilación nativo del polipéptido. La expresión "alterar el patrón de glucosilación nativo" pretende, para los fines de la presente invención, referirse a la deleción de uno o más grupos carbohidrato que se encuentran en el PRO de secuencia nativa (eliminando el sitio de glucosilación subyacente o delecionando la glucosilación por medios químicos y/o enzimáticos) y/o la adición de uno o más sitios de glucosilación que no se encuentran presentes en el PRO de secuencia nativa. Además, la expresión incluye modificaciones cualitativas en la glucosilación de las proteínas nativas, implicando una modificación de la naturaleza y proporciones de los diversos grupos carbohidrato presentes.

La adición de sitios de glucosilación en el polipéptido PRO puede conseguirse mediante la alteración de la secuencia de aminoácidos. La alteración puede realizarse, por ejemplo, mediante la adición de uno o más residuos serina o treonina o la sustitución de los mismos en la el PRO de secuencia nativa (para los sitios de glucosilación O-ligados). La secuencia de aminoácidos de PRO opcionalmente puede alterarse mediante cambios a nivel del ADN, particularmente mutando el ADN codificante del polipéptido PRO en bases preseleccionadas de manera que se generan codones que se traducirán en los aminoácidos deseados.

Otro medio para incrementar el número de grupos carbohidrato en el polipéptido PRO es mediante el acoplamiento químico o enzimático de glucósidos al polipéptido. Estos procedimientos se describen en la técnica, por ejemplo en la patente WO nº 87/05330, publicada el 11 de septiembre de 1987, y en Aplin y Wriston, CRC Crit. Rev. Biochem., páginas 259 a 306, 1981.

La eliminación de los grupos carbohidrato presentes en el polipéptido PRO puede conseguirse química o enzimáticamente o mediante la sustitución mutacional de codones codificantes de residuos aminoácidos que sirven como dianas para la glucosilación. Las técnicas de desglucosilación química son conocidas de la técnica y se describen, por ejemplo, en Hakimuddin et al., Arch. Biochem. Biophys. 259:52, 1987, y en Edge et al., Anal. Biochem. 118:131, 1981. El corte enzimático de los grupos carbohidrato en los polipéptidos puede conseguirse mediante la utilización de una diversidad de endoglucosidasas y exoglucosidasas tal como describen Thotakura et al., Meth. Enzymol. 138:350, 1987.

Otro tipo de modificación covalente de PRO comprende unir el polipéptido PRO a uno de entre una diversidad de polímeros no proteicos, por ejemplo polietilenglicol (PEG), polipropilenglicol o polioxialquilenos, de la manera indicada en las patentes US nº 4.640.835, nº 4.496.689, nº 4.301.144, nº 4.670.417, nº 4.791.192 o nº 4.179.337.

El PRO de la presente invención también puede modificación de manera que forme una molécula quimérica que comprende PRO fusionado con otro polipéptido o secuencia de aminoácidos heteróloga.

En una realización, dicha molécula quimérica comprende una fusión de PRO con un polipéptido etiqueta que proporciona un epítopo al que puede unirse selectivamente un anticuerpo anti-etiqueta. La etiqueta epítopo generalmente se sitúa en el extremo aminoterminal o carboxilo-terminal del PRO. La presencia de estas formas etiquetadas con epítopo del PRO puede detectarse utilizando un anticuerpo contra el polipéptido etiqueta. Además, la provisión de la etiqueta epítopo permite que PRO se pueda purificar con facilidad mediante purificación por afinidad utilizando un anticuerpo anti-etiqueta u otro tipo de matriz de afinidad que se una al epítopo etiqueta. Son bien conocidos de la técnica diversos polipéptidos etiqueta y sus anticuerpos respectivos. Entre los ejemplos se incluyen etiquetas polihistidina (poli-his) o polihistidina-glicina (poli-his-gly); el polipéptido etiqueta HA de la gripe y su anticuerpo 12CA5 [Field et al., Mol. Cell. Biol. 8:2159-2165, 1988], la etiqueta c-myc y los anticuerpos 8F9, 3C7, 6E10, G4, B7 y 9E10 del mismo [Evan et al., Molecular and Cellular Biology 5:3610-3616, 1985] y la etiqueta glucoproteína D (gD) del virus del herpes simplex y su anticuerpos [Paborsky et al., Protein Engineering 3(6):547-553, 1990]. Entre otros polipéptidos etiqueta se incluyen el péptido Flag [Hopp et al., BioTechnology 6:1204-1210, 1988], el péptido epítopo KT3 [Martin et al., Science 255:192-194, 1992], un péptido epítopo alfa-tubulina [Skinner et al., J. Biol. Chem. 266:15163-15166, 1991] y el péptido etiqueta de la proteína del gen 10 de T7 [Lutz-Freyermuth et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:6393-6397, 1990].

En una realización alternativa, la molécula quimérica puede comprender una fusión de PRO con una inmunoglobulina o con una región particular de una inmunoglobulina. Para una forma bivalente de la molécula quimérica (también denominada "inmunoadhesina"), dicha fusión podría ser con la región Fc de una molécula de IgG. Las fusiones de Ig preferentemente incluyen la sustitución de una forma soluble (con deleción o inactivación del dominio transmembranal) de un polipéptido PRO en lugar de por lo menos una región variable dentro de una molécula de Ig. En una realización particularmente preferente, la fusión de inmunoglobulina incluye la bisagra de regiones CH2 y CH3, o la bisagra de regiones CH1, CH2 y CH3 d una molécula de IgG1. Para la producción de fusiones de inmunoglobulina ver también la patente US nº 5.428.130, publicada el 27 de junio de 1995.

\vskip1.000000\baselineskip

D. Preparación de PRO

La descripción posterior se refiere principalmente a la producción de PRO mediante el cultivo de células transformadas o transfectadas con un vector que contiene ácido nucleico de PRO. Evidentemente se contempla que puedan utilizarse procedimientos alternativos, que son bien conocidos de la técnica, para preparar PRO. Por ejemplo, la secuencia de PRO, o partes de la misma, pueden producirse mediante síntesis directa del péptido utilizando técnicas de fase sólida [ver, por ejemplo, Stewart et al., Solid-Phase Peptide Synthesis, W.H. Freeman Co., San Francisco, CA, 1969; Merrifield, J. Am. Chem. Soc. 85:2149-2154, 1963]. La síntesis de proteínas in vitro puede llevarse a cabo utilizando técnicas manuales o mediante automatización. La síntesis automatizada puede conseguirse, por ejemplo, utilizando un sintetizador de péptidos de Applied Biosystems (Foster City, CA) siguiendo las instrucciones del fabricante. Pueden sintetizarse químicamente diversas partes de PRO separadamente y combinarse utilizando procedimientos químicos o enzimáticos para producir el PRO de longitud completa.

\vskip1.000000\baselineskip

1. Aislamiento de ADN codificante de PRO

Puede obtenerse ADN codificante de PRO a partir de una biblioteca de ADNc preparada a partir de tejido que se cree que presenta el ARNm de PRO y expresarlo a un nivel detectable. Por consiguiente, el ADN humano de PRO puede obtenerse convenientemente a partir de una biblioteca de ADNc preparada a partir de tejido humano, tal como se describe en los Ejemplos. El gen codificante de PRO también puede obtenerse a partir de una biblioteca genómica o mediante procedimientos sintéticos conocidos (por ejemplo síntesis automatizada de ácidos nucleicos).

Puede cribarse bibliotecas con sondas (tal como anticuerpos contra PRO u oligonucleótidos de por lo menos aproximadamente 20 a 80 bases) diseñados para identificar el gen de interés o la proteína codificada por el mismo. El cribado de ADNc o de la biblioteca genómica con la sonda seleccionada puede llevarse a cabo utilizando procedimientos estándares, tal como se describen en Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989). Un medio alternativo para aislar el gen codificante de PRO es utilizar metodología de PCR [Sambrook et al., supra; Dieffenbach et al., PCR Primer: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1995)].

Los Ejemplos posteriormente describen técnicas para cribar una biblioteca de ADNc. Las secuencias oligonucleótidas seleccionadas como sondas deben ser de suficiente longitud y suficientemente poco ambiguas para minimizar los falsos positivos. El oligonucleótido preferentemente se marca de manera que pueda detectarse tras la hibridación con ADN en la biblioteca que se está cribando. Los procedimientos de marcaje son bien conocidos de la técnica, e incluyen la utilización de marcajes radioactivos tales como ATP marcado con ^{32}P, la biotinilación o el marcaje enzimático. Las condiciones de hibridación, incluyendo la astringencia moderada y la astringencia elevada, se proporcionan en Sambrook et al., supra.

\newpage

Las secuencias identificadas en dichos procedimientos de cribado de biblioteca pueden compararse y alinearse con otras secuencias conocidas depositadas y disponibles en bases de datos públicas, tales como GenBank o en otras bases de datos de secuencias privadas. La identidad de secuencia (a nivel de aminoácidos o de nucleótidos) con regiones definidas de la molécula o a lo largo de la secuencia de longitud completa pueden determinarse utilizando procedimientos conocidos de la técnica y tal como se describe en la presente invención.

Pueden obtenerse ácidos nucleicos que presenta la secuencia codificante de la proteína mediante el cribado de bibliotecas seleccionadas de ADNc o genómicas utilizando la secuencia de aminoácidos deducida dada a conocer en la presente invención por primera vez y, en caso necesario, utilizando procedimientos de extensión de cebador convencionales, tal como se describe en Sambrook et al., supra, para detectar precursores y procesar intermediarios de ARNm que pueden no haber sido transcritos inversamente para formar ADNc.

\vskip1.000000\baselineskip

2. Selección y transformación de células huésped

Las células huésped se transfectan o se transforman con los vectores de expresión o de clonación descritos en la presente invención para la producción de PRO, y se cultivan en medios nutritivos convencionales modificados según resulte apropiado para inducir promotores, seleccionar transformantes o amplificar los genes codificantes de las secuencias deseadas. Las condiciones de cultivo, tales como el medio, la temperatura, el pH y similares, pueden ser seleccionadas por el experto en la materia sin experimentación indebida. En general, los principios, protocolos y técnicas prácticas para maximizar la productividad de los cultivos celulares pueden encontrarse en: Mammalian Cell Biotechnology: a Practical Approach, M. Butler, editor (IRL Press, 1991) y en Sambrook et al., supra.

Los procedimientos para la transfección de células eucarióticas y para la transformación de células procarióticas son conocidos por el experto ordinario en la materia, por ejemplo CaCl_{2}, CaPO_{4}, mediada por liposomas y la electroporación. Dependiendo de la célula huésped utilizada, la transformación se lleva a cabo utilizando técnicas estándares apropiadas para dichas células. El tratamiento de calcio utilizando cloruro de calcio, tal como se describe en Sambrook et al., supra, o la electroporación, generalmente se utilizan para procariotas. La infección con Agrobacterium tumefaciens se utiliza para la transformación de determinadas células vegetales, tal como describen Shaw et al., Gene 23:315, 1983, y en la patente WO nº 89/05859, publicada el 29 de junio de 1989. Para las células de mamífero, sin paredes celulares, puede utilizarse el procedimiento de precipitación con fosfato de calcio de Graham y van der Eb, Virology 52:456-457, 1978. Se han descrito aspectos generales de las transfecciones de sistemas de células huésped de mamífero en la patente US nº 4.399.216. Las transformaciones en levaduras típicamente se llevan a cabo según los procedimientos de Van Solingen et al., J. Bact. 130:946, 1977, y de Hsiao et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 76:3829, 1979. Sin embargo, también pueden utilizarse otros procedimientos para introducir ADN en las células, tales como la microinyección nuclear, la electroporación, la fusión de protoplastos bacterianos con células intactas, o los policationes, por ejemplo polibreno y poliornitina. Para diversas técnicas de transformación de células de mamífero, ver Keown et al., Methods in Enzymology 185:527-537, 1990, y Mansour et al., Nature 336:348-352, 1988.

Entre las células huésped adecuadas para clonar o expresar el ADN en los vectores se incluyen células procarióticas, de levadura o de eucariotas superiores. Entre los procariotas adecuados se incluyen, aunque sin limitarse a ellos, eubacterias, tales como organismos Gram-negativos o Gram-positivos, por ejemplo enterobacteriáceas, tales como E. coli. Diversas cepas de E. coli se encuentran disponibles públicamente, tales E. coli K12 cepa MM294 (ATCC nº 31.446), E. coli X1776 (ATCC nº 31.537), E. coli cepa W3110 (ATCC nº 27.325) y K5 772 (ATCC nº 53.635). Entre otras células huésped procarióticas adecuadas se incluyen enterobacteriáceas tales como Escherichia, por ejemplo E. coli, Enterobacter, Erwinia, Klebsiella, Proteus, Salmonella, por ejemplo Salmonella typhimurium, Serratia, por ejemplo Serratia marcescans y Shigella, así como Bacilli, tales como B. subtilis y B. licheniformis (por ejemplo B. licheniformis 41P, dado a conocer en la patente DD nº 266.710, publicada el 12 de abril de 1989), Pseudomonas, tal como P. aeruginosa, y Streptomyces. Estos ejemplos son ilustrativos y no limitativos. La cepa W3110 es un huésped o huésped parental particularmente preferente debido a que es una cepa huésped común para fermentaciones de productos de ADN recombinante. Preferentemente la célula huésped segrega cantidades mínimas de enzimas proteolíticos. Por ejemplo, la cepa W3110 puede modificarse para llevar a cabo una mutación genética en los genes codificantes de proteína endógenas del huésped, incluyendo los ejemplos de estos huéspedes E. coli W3110 cepa 1A2, que presenta el genotipo tonA completo, E. coli W3110 cepa 9E4, que presenta el genotipo tonAptr3 completo, E. coli W3110 cepa 27C7 (ATCC nº 55.244), que presenta el genotipo tonA ptr3 phoA E15 (argF-lac) 169 degP ompT rbs7 ilvG kan' completo, E. coli W3110 cepa 40B4, que es la cepa 37D6 con una mutación por deleción de degP no resistente a la canamicina, y una cepa de E. coli que presenta una proteasa periplásmica mutante dado a conocer en la patente US nº 4.946.783, publicada el 7 de agosto de 1990. Alternativamente, resultan adecuados procedimientos de clonación in vitro, por ejemplo PCR u otras reacciones de polimerasa de ácidos nucleicos.

Además de los procariotas, los microbios eucarióticos, tales como hongos filamentosos o levaduras, resultan huéspedes de clonación o de expresión adecuados para vectores codificantes de PRO. Saccharomyces cerevisiae es un microorganismo huésped eucariótico inferior utilizado comúnmente. Entre otros se incluyen Schizosaccharomyces pombe [Beach y Nurse, Nature 290:140, 1981; patente EP nº 139.383, publicada el 2 de mayo de 1985), huéspedes Kluyveromyces (patente US nº 4.943.529, Fleer et al., Bio/Technology 9:968-975, 1991, tal como, por ejemplo, K. lactis (MW98-8C, CBS683, CBS4574, Louvencourt et al., J. Bacteriol. 154(2):737-742, 1983), K. fragilis (ATCC nº 12.424), K. bulgaricus (ATCC nº 16.045), K. wicheramii (ATCC nº 24.178), K. waltii (ATCC nº 56.500), K. drosophilarum (ATCC nº 36.906, van den Berg et al., Bio/Technology 8:135, 1990), K. thermotolerans y K. marxianus; Yarrowia (patente EP nº 402.226); Pichia pastoris (patente EP nº 183.070, Sreekrishna et al., J. Basic Microbiol. 28:265-278), Candida, Trichoderma reesia (patente EP nº 244.234), Neurospora crassa (Case et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76:5259-5263, 1979), Schwanniomyces, tal como Schwanniomyces occidentalis (patente EP nº 394.538, publicada el 31 de octubre de 1990) y hongos filamentosos, tales como, por ejemplo, Neurospora, Penicillium, Tolypocladium (patente WO nº 91/00357, publicada el 10 de enero de 1991), y huéspedes Aspergillus, tales como A. nidulans [Ballance et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 112:284-289, 1983; Tilburn et al., Gene 26:205-221, 1983; Yelton et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:1470-1474, 1984) y A. niger (Kelly e Hynes, EMBO J. 4:475-479, 1985). Las levaduras metilotróficas resultan adecuadas para la presente invención y entre ellas se incluyen, aunque sin limitarse a ellas, levaduras capaces de crecer en metanol, seleccionados de entre los géneros que consisten de Hansenula, Candida, Kloeckera, Pichia, Saccharomyces, Torulopsis y Rhodotorula. Puede encontrarse una lista de las especies específicas
que son ejemplares de esta clase de levaduras en C. Anthony, The Biochemistry of Methylotrophs, 269, 1982).

Las células huésped adecuadas para la expresión de PRO glucosilado se derivan a partir de organismos multicelulares. Entre los ejemplos de células de invertebrado se incluyen células de insecto, tales como Drosophila S2 y Spodoptera Sf9, así como células vegetales. Entre los ejemplos de líneas celulares de huéspedes mamíferos que resultan útiles se incluyen las células de ovario de hámster chino (CHO) y las células COS. Entre los ejemplos más específicos se incluyen la línea CV1 de riñón de mono transformada por SV40 (COS-7, ATCC nº CRL 1651), la línea renal embrionaria humana (células 293 ó 293 subclonadas para el crecimiento en cultivo en suspensión, Graham et al., J. Gen. Virol. 36:59, 1977), las células de ovario de hámster chino/-DHFR (CHO, Urlaub y Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216, 1980), las células de sertoli de ratón (TM4, Mather, Biol. Reprod. 23:243-251, 1980, las células pulmonares humanas (W138, ATCC nº CCL 75), las células hepáticas humanas (Hep G2, HB 8065) y el tumor mamario de ratón (MMT 060562, ATCC nº CCL51). La selección de la célula huésped apropiada se considera que se encuentra comprendida dentro de los conocimientos del experto en la materia.

\vskip1.000000\baselineskip

3. Selección y utilización de un vector replicable

El ácido nucleico (por ejemplo ADNc o ADN genómico) codificante de PRO puede insertarse en un vector replicable para la clonación (amplificación del ADN) o para la expresión. Se encuentran disponibles públicamente diversos vectores. El vector puede encontrarse, por ejemplo, en la forma de un plásmido, cósmido, partícula vírica o fago. La secuencia de ácidos nucleicos apropiado puede insertarse en el vector mediante una diversidad de procedimientos. En general, el ADN se inserta en uno o más sitios de restricción de endonucleasa apropiados utilizando procedimientos conocidos de la técnica. Entre los componentes de vector se incluyen de manera general, aunque sin limitarse a ellos, uno o más de entre: una secuencia de señal, un origen de replicación, uno o más genes marcadores, un elementos intensificador, un promotor, y una secuencia de terminación de transcripción. La construcción de vectores adecuados que contienen uno o más de estos componentes utiliza técnicas estándares de ligación que son conocidas por el experto en la materia.

El PRO puede producirse recombinantemente no sólo de manera directa, sino también en forma de un polipéptido de fusión con un polipéptido heterólogo, que puede ser una secuencia de señal u otro polipéptido que presente un sitio de corte específico en el extremo N-terminal de la proteína madura o del polipéptido. En general, la secuencia de señal puede ser un componente del vector, o puede ser una parte del ADN codificante de PRO que se inserta en el vector. La secuencia de señal puede ser una secuencia de señal procariótica seleccionada, por ejemplo, de entre el grupo que la fosfatasa alcalina, penicilinasa, lpp o líderes de enterotoxina II termoestable. Para la secreción en levaduras, la secuencia de señal puede ser, por ejemplo, el líder invertasa de levadura, el líder de factor alfa (incluyendo los líderes de factor \alpha de Saccharomyces y de Kluyveromyces, éste último descrito en la patente US nº 5.010.182) o el líder de la fosfatasa ácida, el líder de la glucoamilasa de C. albicans (patente EP nº 362.179, publicada el 4 de abril de 1990) o la señal descrita en la patente WO nº 90/13646, publicada el 15 de noviembre de 1990. En la expresión en células de mamífero, pueden utilizarse secuencias de señal de mamífero para dirigir la secreción de la proteína, tales como secuencias de señal de polipéptidos secretados de la misma especie o de una especie relacionada, así como líderes secretorios víricos.

Los vectores tanto de expresión como de clonación contienen una secuencia de ácidos nucleicos que permite que el vector se replique en una o más células huésped seleccionadas. Estas secuencias son bien conocidas para una diversidad de bacterias, levaduras y virus. El origen de replicación del plásmido pBR322 resulta adecuado para la mayoría de las bacterias Gram-negativas, el origen del plásmido 2 \mu resulta adecuado para las levaduras y los diversos orígenes víricos (SV40, polioma, adenovirus, VSV o BPV) resultan útiles para vectores de clonación en células de mamífero.

Los vectores de expresión y de clonación típicamente contienen un gen de selección, también denominado marcador seleccionable. Los genes de selección típicos codifican proteínas que: (a) proporcionan resistencia frente a antibióticos o a otras toxinas, por ejemplo ampicilina, neomicina, metotrexato o tetraciclina, (b) complementan deficiencias auxotróficas, o (c) suministran nutrientes críticos no disponibles de medios complejos, por ejemplo el gen codificante de la D-alanina racemasa para los Bacilli.

Son ejemplos de marcadores seleccionables adecuados para las células de mamífero aquellos que permiten la identificación de las células competentes para la incorporación del ácido nucleico codificante de PRO, tales como DHFR o timidina quinasa. Una célula huésped apropiado en el caso de que se utilice DHFR de tipo salvaje es la línea celular CHO deficiente en actividad de DHFR, preparada y propagada tal como describen Urlaub et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216, 1980. Un gen de selección adecuado para la utilización en levaduras es el gen trp1 presentes en el plásmido levadura YRp7 [Stinchcomb et al., Nature 282:39, 1979; Kingsman et al., Gene 7:141, 1979; Tschemper et al., Gene 10:157, 1980]. El gen trp1 proporciona un marcador de selección para una cepa mutante de levadura
sin la capacidad de crecer en triptófano, por ejemplo la ATCC nº 44076 o PEP4-1 [Jones, Genetics 85:12, 1977].

Los vectores de expresión o de clonación habitualmente contienen un promotor operablemente ligado a la secuencia de ácidos nucleicos codificante de PRO para dirigir la síntesis de ARNm. Los promotores reconocidos por una diversidad de células huésped potenciales son bien conocidos. Entre los promotores adecuados para la utilización con huéspedes procarióticos se incluyen los sistemas de promotor \beta-lactamasa y lactosa [Chang et al., Nature 275:615, 1978; Goeddel et al., Nature 281:544, 1979), fosfatasa alcalina, un sistema promotor triptófano (trp), Goeddel, Nucleic Acids Res. 8:4057, 1980; patente EP nº 36.776] y promotores híbridos, tales como el promotor tac [deBoer et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:21-25, 1983]. Los promotores para la utilización en sistemas bacterianos también contienen una secuencia de Shine-Dalgarno (S.D.) operablemente ligada al ADN codificante de PRO.

Entre los ejemplos de secuencias promotoras adecuadas para la utilización con huéspedes levaduras se incluyen los promotores para la 3-fosfoglicerato quinasa [Hitzeman et al., J. Biol. Chem. 255:2073, 1980] u otros enzimas glucolíticos [Hess et al., J. Adv. Enzyme Reg. 7:149, 1968; Holland, Biochemistry 17:4900, 1978], tales como enolasa, gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa, hexoquinasa, piruvato descarboxilasa, fosfofructoquinasa, glucosa-6-fosfato isomerasa, 3-fosfoglicerato mutasa, piruvato quinasa, tiosafosfato isomerasa, fosfoglucosa isomerasa y glucoquinasa.

Otros promotores de levaduras, que son promotores inducibles que presentan la ventaja adicional de que la transcripción está controlada por las condiciones de cultivo, son las regiones promotoras para la alcohol deshidrogenasa 2, el isocitocromo C, la fosfatasa ácida, los enzimas degradativos asociados con el metabolismo del nitrógeno, la metalotioneína, la gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa y los enzimas responsables de la utilización de la maltosa y de la galactosa. Los vectores y promotores adecuados para la utilización en la expresión en levaduras se describen adicionalmente en la patente EP nº 73.657.

La transcripción de PRO a partir de vectores en células huésped de mamífero está controlada, por ejemplo, por promotores obtenidos de los genomas de virus tales como el virus del polioma, el virus de la viruela aviar (patente UK nº 2.211.054, publicada el 5 de julio de 1989), adenovirus (tal como el adenovirus 2), el virus del papiloma bovino, el virus del sarcoma aviar, citomegalovirus, retrovirus, el virus de la hepatitis B y el virus 40 del simio (SV40), de promotores de mamífero heterólogos, por ejemplo el promotor actina o un promotor de inmunoglobulina, y de promotores de choque térmico, con la condición de que estos promotores resulten compatibles con los sistemas de células huésped.

La transcripción de un ADN codificante de PRO por eucariotas superiores puede incrementarse mediante la inserción de una secuencia intensificadora en el vector. Los intensificadores son elementos de ADN que actúan en cis, habitualmente de entre 10 y 300 pb, que actúan sobre un promotor incrementando la transcripción del mismo. Ahora se conocen muchas secuencias intensificadoras de genes de mamífero (globina, elastasa, albúmina, \alpha-fetoproteína e insulina). Sin embargo, típicamente se utiliza un intensificador procedente de un virus de célula eucariótica. Entre los ejemplos se incluyen el intensificador de SV40 en el lado tardío del origen de replicación (pb 100 a 270), el intensificador del promotor temprano de citomegalovirus, el intensificador del polioma en el lado tardío del origen de replicación e intensificadores de adenovirus. El intensificador puede introducirse en el vector en una posición 5' o 3' respecto a la secuencia codificante de PRO, aunque preferentemente se sitúa en un sitio 5' respecto al promotor.

Los vectores de expresión utilizados en las células huésped procarióticas (levaduras, hongos, células de insecto, vegetales, animales, humanas o nucleadas de otros organismos multicelulares) también contienen secuencias necesarias para la terminación de la transcripción y para estabilizar el ARNm. Estas secuencias se encuentran comúnmente disponibles en las regiones 5', y ocasionalmente 3', no traducidas procedentes de ADNs o ADNcs eucarióticos o víricos. Estas regiones contienen segmentos de nucleótidos transcritos como fragmentos poliadenilados en la parte no traducida del ARNm codificante de PRO.

Todavía otros procedimientos, vectores y células huésped adecuadas para la adaptación a la síntesis de PRO en cultivo celular recombinante de vertebrado se describen en Gething et al., Nature 293:620-625, 1981; Mantei et al., Nature 281:40-46, 1979; patentes EP nº 117.060 y nº 117.058.

\vskip1.000000\baselineskip

4. Detección de la amplificación/expresión génicas

La amplificación y/o expresión génicas pueden medirse en una muestra directamente, por ejemplo mediante transferencia southern, transferencia northern convencional para cuantificar la transcripción del ARNm [Thomas, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:5201-5205, 1980], transferencia por puntos (análisis de ADN) o hibridación in situ, utilizando una sonda apropiadamente marcada basándose en las secuencias proporcionadas en la presente invención. Alternativamente, pueden utilizarse anticuerpos que pueden reconocer dúplex específicos, incluyendo dúplex de ADN, dúplex de ARN y dúplex híbridos ADN-ARN o dúplex ADN-proteína. Los anticuerpos a su vez pueden marcarse y el ensayo llevarse a cabo donde el dúplex se encuentra unido a una superficie, de manera que tras la formación del dúplex sobre la superficie, pueda detectarse la presencia de anticuerpo unido al dúplex.

La expresión génica alternativamente puede medirse mediante procedimientos inmunológicos, tales como la tinción inmunohistoquímica de células o de secciones de tejido y el ensayo de cultivo celular o de líquidos corporales, para cuantificar directamente la expresión del producto génico. Los anticuerpos útiles para la tinción inmunohistoquímica y/o el ensayo de líquidos de muestra puede ser monoclonal o policlonal, y pueden prepararse en cualquier mamífero. Convenientemente los anticuerpos pueden prepararse contra un polipéptido PRO de secuencia nativa o contra un péptido sintético basándose en las secuencias de ADN proporcionadas en la presente invención o contra una secuencia exógena fusionada con ADN de PRO y codificante de un epítopo de anticuerpo específico.

\vskip1.000000\baselineskip

5. Purificación de polipéptido

Pueden recuperarse formas de PRO a partir de medio de cultivo o de lisados de células huésped. Si se encuentran unidas a membrana, pueden liberarse de la membrana utilizando una solución detergente adecuada (por ejemplo Triton-X 100) o mediante corte enzimático. Las células utilizadas en la expresión de PRO pueden romperse mediante diversos medios físicos o químicos, tales como el ciclado de congelación-descongelación, la sonicación, la rotura mecánica o agentes de lisado celular.

Puede desearse purificar PRO a partir de proteínas o polipéptidos de células recombinantes. Los procedimientos siguientes son ejemplares de procedimientos de purificación adecuados: mediante fraccionamiento en una columna de intercambio iónico; la precipitación con etanol; la HPLC de fase reversa; la cromatografía en sílice o en una resina de intercambio catiónico tal como DEAE; el cromatoenfoque; SDS-PAGE; la precipitación con sulfato amónico; la filtración en gel utilizando, por ejemplo, Sephadex G-75; columnas de proteína A-sefarosa para eliminar contaminantes tales como IgG; y columnas quelantes de metales para ligar formas de PRO etiquetadas con epítopo. Pueden utilizarse diversos procedimientos de purificación de proteínas y estos procedimientos son conocidos de la técnica y se describen, por ejemplo, en Deutscher, Methods in Enzymology 182, 1990; Scopes, Protein Purification: Principles and Practice, Springer-Verlag, New York, 1982. La etapa o etapas de purificación seleccionadas dependerán, por ejemplo, de la naturaleza del proceso de producción utilizado y del PRO particular producido.

\vskip1.000000\baselineskip

E. Distribución en los tejidos

La localización de los tejidos que expresan PRO puede identificarse determinando la expresión de ARNm en diversos tejidos humanos. La localización de estos genes proporciona información acerca de qué tejidos es más probable que resulten afectados por las actividades de estimulación y de inhibición de los polipéptidos PRO. La localización de un gen en un tejido específico también proporciona tejido e muestra para los ensayos de bloqueo de actividad comentados posteriormente.

Tal como se ha indicado anteriormente, la expresión génica en diversos tejidos puede medirse mediante transferencia southern, transferencia northern convencional para cuantificar la transcripción del ARNm (Thomas, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:5201-5205, 1980), la transferencia por puntos (análisis del ADN), o la hibridación in situ, utilizando una sonda apropiadamente marcada, basándose en las secuencias proporcionadas en la presente invención. Alternativamente, pueden utilizarse anticuerpos que pueden reconocer dúplex específicos, incluyendo dúplex de ADN, dúplex de ARN, y dúplex híbridos ADN-ADRN o dúplex ADN-proteína.

Alternativamente, puede medirse la expresión génica en diversos tejidos mediante procedimientos inmunológicos, tales como la tinción inmunohistoquímica de secciones de tejido y el ensayo de cultivo celular o de líquidos corporales, para cuantificar directamente la expresión del producto génico. Los anticuerpos útiles para la tinción inmunohistoquímica y/o el ensayo de líquidos de muestra puede ser monoclonales o policlonales, y pueden prepararse en cualquier mamífero. Convenientemente los anticuerpos pueden prepararse contra una secuencia nativa de un polipéptido PRO o contra un péptido sintético basado en las secuencias de ADN codificante del polipéptido PRO o contra una secuencia exógena fusionada con un ADN codificante de un polipéptido PRO y codificante de un epítopo específico de anticuerpo. Se proporcionan posteriormente técnicas generales para generar anticuerpos, y protocolos especiales para la transferencia northern y la hibridación in situ.

\vskip1.000000\baselineskip

F. Estudios de unión de anticuerpos

La actividad de los polipéptidos PRO puede verificarse adicionalmente mediante estudios de unión de anticuerpo, en los que se somete a ensayo la capacidad de los anticuerpos anti-PRO de inhibir el efecto de los polipéptidos PRO, respectivamente en células de tejido. Entre los anticuerpos ejemplares se incluyen anticuerpos policlonales, monoclonales, humanizados, biespecíficos y heteroconjugados, la preparación de los cuales se describe a continuación en la presente memoria.

Pueden llevarse a cabo ensayos de unión de anticuerpos de cualquier procedimiento de ensayo conocido, tal como los ensayos de unión competitiva, ensayos sándwich directos e indirectos, y ensayos de inmunoprecipitación (Zola, Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques, páginas 147 a 158 (CRC Press, Inc., 1987)).

\newpage

Los ensayos de unión competitiva se basan en la capacidad de un estándar marcado de competir con el analito de la muestra de ensayo para la unión con una cantidad limitada de anticuerpo. La cantidad de proteína diana en la muestra de ensayo es inversamente proporcional a la cantidad de estándar que se une a los anticuerpos. Para facilitar la determinación de la cantidad de estándar que se une, los anticuerpos preferentemente se insolubilizan antes o después de la competición, de manera que el estándar y el analito que se encuentran unidos a los anticuerpos pueden separarse convenientemente del estándar y del analito que quedan no unidos.

Los ensayos sándwich implican la utilización de dos anticuerpos, cada uno de ellos capaz de unirse a una parte inmunogénica diferente, o epítopo de la proteína que debe detectarse. En un ensayo sándwich, el analito de la muestra de ensayo se une a un primer anticuerpo que se inmoviliza en un soporte sólido, y después un segundo anticuerpo se une al analito, formando de esta manera un complejo insoluble de tres partes (ver, por ejemplo, patente US nº 4.376.110). El segundo anticuerpo mismo puede marcarse con un grupo detectable (ensayo sándwich directo) o puede medirse utilizando un anticuerpo anti-inmunoglobulina que se marca con un grupo detectable (ensayo sándwich indirecto). Por ejemplo, un tipo de ensayo sándwich es un ensayo ELISA, en cuyo caso el grupo detectable es un enzima.

Para la inmunohistoquímica, la muestra de tejido puede ser fresca o congelada o puede incluirse en parafina y fijarse con un conservante, tal como formalina, por ejemplo.

\vskip1.000000\baselineskip

G. Ensayos basados en células

Los ensayos basados en células y los modelos animales para las enfermedades de tipo inmunológico pueden utilizarse para comprender mejor la relación entre los genes y los polipéptidos identificados en la presente invención y el desarrollo y la patogénesis de la enfermedad de tipo inmunológico.

En un enfoque diferente, las células de un tipo celular que es conocido que se encuentran implicadas en una enfermedad de tipo inmunológico particular se transfectan con los ADNcs indicados en la presente invención, y se analiza la capacidad de estos ADNcs de estimular o de inhibir la función inmunológica. Pueden transfectarse células adecuadas con el gen deseado, y se realizó el seguimiento de la actividad de función inmunológica. Estas líneas celulares transfectadas seguidamente pueden utilizarse para someter a ensayo la capacidad de los anticuerpos policlonales o monoclonales o de las composiciones de anticuerpo de inhibir o de estimular la función inmunológico, por ejemplo de modular la proliferación de las células T o la infiltración de células inflamatorias. Las células transfectadas con las secuencias codificantes de los genes identificados en la presente invención además pueden utilizarse para identificar los fármacos candidatos para el tratamiento de enfermedades de tipo inmunológico.

Además, los cultivos primarios derivados de animales transgénicos (tal como se describe posteriormente) pueden utilizarse en los ensayos basados en células de la presente invención, aunque resultan preferentes las líneas celulares estables. Las técnicas para derivar líneas celulares continuas a partir de animales transgénicos son bien conocidas de la técnica (ver, por ejemplo, Small et al., Mol. Cell. Biol. 5:642-648, 1985).

Un ensayo basado en células adecuado es la reacción de linfocitos mixtos (MLR), Current Protocols in Immunology, unidad 3.12, editado por J. E. coligan, A. M. Kruisbeek, D.H. Marglies, E.M. Shevach, W. Strober, National Institutes of Health, publicado por John Wiley & Sons, Inc. En este ensayo, se prueba la capacidad de un compuesto de ensayo de estimular o de inhibir la proliferación de las células T activadas. Se cultiva una suspensión de células T respondedoras con células estimuladoras alogénicas y se mide la proliferación de las células T mediante la incorporación de la timidina tritiada. Este ensayo es una medida general de la reactividad de las células T. Debido a que la mayoría de las células T responden y producen IL-2 tras la activación, las diferencias de sensibilidad en esta ensayo en parte reflejan las diferencias en la producción de IL-2 por parte de las células respondedoras. Los resultados del MLR pueden verificarse con un ensayo de detección estándar de linfoquinas (IL-2) (Current Protocols in Immunology, anteriormente, 3.15, 6.3).

Una respuesta proliferativa de las células T en un ensayo MLR puede deberse a propiedades mitogénicas directas de una molécula sometida a ensayo o a la activación externa inducida por antígeno. La verificación adicional de la actividad estimuladora de las células T por parte de los polipéptidos PRO puede llevarse a cabo utilizando un ensayo de coestimulación. La activación de las células T requiere una señal específica de antígeno mediada a través de receptores del receptor de las células T (TCR) y una señal coestimuladora mediada a través de una segunda interacción de unión a ligando, por ejemplo la interacción de unión B7 (CD80, CD86)/CD28. La reticulación de CD28 incrementa la secreción de las linfoquinas por parte de las células T activadas. La activación de las células T presenta controles tanto negativos como positivos a través de la unión de ligandos que presentan un efecto negativo o positivo. CD28 y CTLA-4 son glucoproteínas relacionadas en la superfamilia de Ig que se unen a B7. La unión de CD28 a B7 presenta un efecto de coestimulación positivo sobre la activación de las células T; a la inversa, la unión de CTLA-4 a B7 presenta un efecto negativo, de desactivación de las células T (Chambers, C.A. y Allison, J.P., Curr. Opin. Immunol. 9:396, 1997; Schwartz, R.H., Cell 71:1065, 1992; Linsey, P.S. y Ledbetter, J.A., Annu. Rev. Immunol. 11:191, 1993; June, C.H. et al., Immunol. Today 15:321, 1994; Jenkins, M.K., Immunity 1:405, 1994. En un ensayo de coestimulación, se someten a ensayo los polipéptidos PRO para la actividad coestimuladora o inhibidora de las células T.

Los polipéptidos PRO, así como otros compuestos de la invención, que son estimuladores (coestimuladores) de la proliferación de las células T y agonistas, por ejemplo anticuerpos agonistas, de los mismos según se determina mediante MLR y ensayos de coestimulación, por ejemplo, resultan útiles en el tratamiento de enfermedades de tipo inmunológico caracterizadas por una función inmunológica pobre, subóptima o inadecuada. Estas enfermedades se tratan estimulando la proliferación y la activación de las células T (y la inmunidad mediada por las células T) e intensificando la respuesta inmunológica en un mamífero mediante la administración de un compuesto estimulador, tal como los polipéptidos PRO estimuladores. El polipéptido estimulador puede ser, por ejemplo, un polipéptido PRO o un anticuerpo agonista del mismo.

La utilización directa de un compuesto estimulador según la invención ha sido validada en experimentos con glucoproteína 4-1BB, un miembro de la familia del receptor del factor de necrosis tumoral, que se une a un ligando (4-1BBL) expresado en células T cebadas y señaliza la activación y crecimiento de las células T (Alderson, M.E. et al., J. Immunol. 24:2219, 1994).

La utilización de un compuesto estimulador agonista también ha sido validada experimentalmente. La activación de 4-1BB mediante el tratamiento con un anticuerpo agonista anti-4-1BB incrementa la erradicación de los tumores (Hellstrom, I. y Hellstrom, K.E., Crit. Rev. Immunol. 18:1, 1998). La terapia inmunoadyuvante para el tratamiento de tumores, descrita en más detalle posteriormente, es otro ejemplo de la utilización de los compuestos estimuladores de la invención.

También puede conseguirse un efecto estimulador o intensificador inmunológico mediante la antagonización o bloqueo de la actividad de un PRO que se ha encontrado que es inhibidor en el ensayo MLR. La negación de la actividad inhibidora del compuesto produce un efecto estimulador neto. Son compuestos antagonistas/bloqueantes adecuados los anticuerpos o fragmentos de los mismos que reconocen y se unen a la proteína inhibidora, bloqueando de esta manera la interacción eficaz de la proteína con su receptor, e inhibiendo la señalización a través del receptor. Este efecto ha sido validado en experimentos utilizando anticuerpos anti-CTLA-4 que incrementan la proliferación de las células T, presumiblemente mediante eliminación de la señal inhibidora causada por la unión de CTLA-4 (Walunas, T.L. et al., Immunity 1:405, 1994).

Alternativamente, también puede conseguirse un efecto estimulador o intensificador inmunológico mediante la administración de un PRO que presente propiedades incrementadoras de la permeabilidad vascular. La permeabilidad vacuolar incrementada resultaría beneficiosa para trastornos que pueden atenuarse mediante la infiltración local de células inmunológicas (por ejemplo monocitos, eosinófilos, PMNs) y la inflamación.

Por otra parte, los polipéptidos PRO, así como otros compuestos de la invención, que son inhibidores directos de la proliferación/activación de las células T, la secreción de linfoquinas y/o la permeabilidad vascular pueden utilizarse directamente para suprimir la respuesta inmunológica. Estos compuestos resultan útiles para reducir el grado de la respuesta inmunológica y para tratar las enfermedades de tipo inmunológico caracterizadas por una respuesta hiperactiva, superóptima o autoinmune. Esta utilización de los compuestos de la invención ha sido validad mediante los experimentos descritos anteriormente, en los que la unión de CTLA-4 al receptor B7 desactiva las células T. Los compuestos inhibidores directos de la invención funcionan de una manera análoga. La utilización de un compuesto que suprime la permeabilidad vascular se esperaría que redujese la inflamación. Este tipo de usos resultaría beneficioso en el tratamiento de condiciones asociadas a la inflamación excesiva.

Alternativamente, los compuestos, por ejemplo anticuerpos, que se unen a polipéptidos PRO estimuladores y que bloquean el efecto estimulador de estas moléculas, producen un efecto inhibidor neto y puede utilizarse para suprimir la respuesta inmunológica mediada por las células T, mediante la inhibición de la proliferación/activación de las células T y/o la secreción de linfoquinas. El bloqueo del efecto estimulador de los polipéptidos suprime la respuesta inmunológico del mamífero. Esta utilización ha sido validad en experimentos utilizando un anticuerpo anti-IL2. En estos experimentos, el anticuerpo se une a IL2 y bloquea la unión de IL2 a su receptor, consiguiendo de esta manera un efecto inhibidor de las células T.

\vskip1.000000\baselineskip

H. Modelos animales

Los resultados de los ensayos in vitro basados en células pueden verificarse adicionalmente utilizando modelos animales y ensayos in vivo para la función de las células T. Puede utilizarse una diversidad de modelos animales bien conocidos para comprender mejor el papel de los genes identificados en la presente invención en el desarrollo y la patogénesis de la enfermedad de tipo inmunológico, y para someter a ensayo la eficacia de agentes terapéuticos candidatos, incluyendo anticuerpos, y otros antagonistas de los polipéptidos nativos, incluyendo antagonistas de molécula pequeña. La naturaleza in vivo de dichos modelos los convierte en predictivos de respuestas en pacientes humanos. Entre los modelos animales de enfermedades de tipo inmunológico se incluyen animales tanto no recombinantes como recombinantes (transgénicos). Entre los modelos animales no recombinantes se incluyen, por ejemplo, los modelos de roedor, por ejemplo murinos. Estos modelos pueden generarse mediante la introducción de células en ratones singénicos utilizando técnicas estándares, por ejemplo la inyección subcutánea, la inyección en la vena de la cola, el implante de bazo, el implante intraperitoneal, el implante bajo la cápsula renal, etc.

La enfermedad del injerto contra el huésped se produce cuando se trasplantan células inmunocompetentes en pacientes inmunosuprimidos o tolerantes. Las células donantes reconocen y responden a los antígenos del huésped. La respuesta puede variar entre inflamación severa potencialmente letal y casos leves de diarrea y pérdida de peso. Los modelos de enfermedad de injerto contra el huésped proporcionan un medio para evaluar la reactividad de las células T contra los antígenos del MHC y antígenos del trasplante menores. Se describe un procedimiento adecuado en detalle en Current Protocols in Immunology, anteriormente, unidad 4.3.

Un modelo animal de rechazo del aloinjerto de la piel es un medio para someter a ensayo la capacidad de las células T de mediar en la destrucción in vivo de tejido y una medida de su papel en el rechazo del trasplante. Los modelos más comunes y aceptados utilizando injertos de piel de cola murina. Algunos experimentos repetidos han demostrado que el rechazo del aloinjerto de la piel se encuentra mediado por células T, células T ayudantes y células T asesinas efectoras y no anticuerpos (Auchincloss, H. Jr. y Sachs, D.H., Fundamental Immunology, 2a edición, W. E. Paul, editor, Raven Press, NY, 1989, 889 a 992). Se describe en detalle un procedimiento adecuado en Current Protocols in Immunology, anteriormente, unidad 4.4. Otros modelos de rechazo del trasplante que pueden utilizarse para someter a ensayo los compuestos de la invención son los modelos de trasplante alogénico de corazón descritos por Tanabe, M. et al., Transplantation 58:23, 1994, y Tinubu, S.A. et al., J. Immunol. 4330-4338, 1994.

Los modelos animales para la hipersensibilidad de tipo retardado también proporcionan un ensayo de la función inmunológica mediada por células. Las reacciones de hipersensibilidad de tipo retardado son una respuesta inmunológica in vivo mediada por células T caracterizadas por inflamación que no alcanza un pico hasta que ha transcurrido un periodo de tiempo tras el reto con un antígeno. Estas reacciones también se producen en enfermedades autoinmunológicas específicas de tejido, tales como la esclerosis múltiple (MS) y la encefalomielitis autoinmunológica experimental (EAE, un modelo para la MS). Se describe en detalle un procedimiento adecuado en Current Protocols in Immunology, anteriormente, unidad 4.5.

La EAE es una enfermedad autoinmunológica mediada por células T caracterizada por inflamación de células T y de células mononucleares y la desmielinización posterior de los axones en el sistema nervioso central. La EAE se considera generalmente un modelo animal relevante para la MS en el ser humano (Bolton, C., Multiple Sclerosis 1:143, 1995). Se han desarrollado modelos tanto agudos como de recaída-remisión. Los compuestos de la invención pueden someterse a ensayo para actividad estimuladora o inhibidora de las células T contra una enfermedad desmielinizante mediada inmunológicamente utilizando el protocolo descrito en Current Protocols in Immunology, anteriormente, unidades 15.1 y 15.2. Ver también los modelos de enfermedad de la mielina en los que se injertan oligodendrocitos o células de Schwann en el sistema nervioso central tal como se describe en Duncan, I.D. et al., Molec. Med. Today 554-561, 1997.

La hipersensibilidad por contacto es un ensayo in vivo simple de hipersensibilidad de tipo retardado de función inmunológica mediada por células. En este procedimiento, se mide y se cuantifica la exposición cutánea a haptenos exógenos que dan lugar a una reacción de hipersensibilidad de tipo retardado. La sensibilidad por contacto implica una etapa inicial de sensibilización seguida de una etapa de inducción. La fase de inducción se produce cuando los linfocitos T se encuentran con un antígeno con el que han tenido contacto anteriormente. Se produce hinchazón e inflamación, convirtiéndolo en un modelo excelente de dermatitis alérgica por contacto humana. Se describe en detalle un procedimiento adecuado en Current Protocols in Immunology, editores J.E. Cologan, A.M. Kruisbeek, D.H. Margulies, E.M. Shevach y W. Strober, John Wiley & Sons, Inc., 1994, unidad 4.2. Ver también Grabbe, S. y Schwarz, T., Immun. Today 19(1):37-44, 1998.

Un modelo animal de artritis es la artritis inducida por colágeno. Este modelo comparte características clínicas, histológicas e inmunológicas con la artritis reumatoide autoinmunológica humana y es un modelo aceptable de artritis autoinmunológica humana. Los modelos de ratón y de rata se caracterizan por sinovitis, erosión del cartílago y del hueso subcondral. Los compuestos de la invención pueden someterse a ensayo para actividad contra la artritis autoinmunológica utilizando los protocolos descritos en Current Protocols in Immunology, anteriormente, unidades 15.5. Ver también el modelo que utiliza un anticuerpo monoclonal contra las integrinas CD18 y VLA-4 descritas en Issekutz, A.C. et al., Immunology 88:569, 1996.

Se ha descrito un modelo de asma en el que se provoca hiperreactividad de las vías respiratorias inducida por antígeno, eosinofilia e inflamación pulmonares sensibilizando un animal con ovoalbúmina y después retando el animal con la misma proteína administrada mediante aerosol. Varios modelos animales (cobaya, rata, primate no humano) muestran síntomas similares al asma atópica en el ser humano tras el reto con antígenos en aerosol. Los modelos murinos presentan muchas de las características del asma humana. Se describen procedimientos adecuados para someter a ensayo los compuestos de la invención para actividad y eficacia en el tratamiento del asma en Wolyniec, W.W. et al., Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 18:777, 1998, y en las referencias citadas en el mismo.

Además, los compuestos de la invención pueden someterse a ensayo en modelos animales de enfermedades similares a la soriasis. La evidencia sugiere una patogénesis de células T para la soriasis. Los compuestos de la invención pueden someterse a ensayo en el modelo de ratón scid/scid descrito por Schon, M.P. et al., Nat. Med. 3:183, 1997, en el que los ratones muestran lesiones histopatológicas de la piel similares a la soriasis. Otro modelo adecuado es la quimera piel humana/ratón scid preparada tal como describen Nickoloff, B.J. et al., Am. J. Path. 146:580, 1995.

Pueden construirse modelos animales recombinantes (transgénicos) mediante la introducción de la parte codificante de los genes identificados en la presente invención en el genoma de los animales de interés utilizando técnicas estándar para la producción de animales transgénicos. Entre los animales que pueden servir como diana para la manipulación transgénica se incluyen, aunque sin limitación, ratones, ratas, conejos, cobayas, ovejas, cabras, cerdos y primates no humanos, por ejemplo babuinos, chimpancés y monos. Entre las técnicas conocidas de la técnica para introducir un transgén en dichos animales se incluyen la microinyección pronucleica (Hoppe y Wanger, patente US nº 4.873.191), la transferencia génica mediada por retrovirus en líneas germinales (por ejemplo Van der Putten et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:6148-615, 1985), el "gen targeting" en células madre embrionarias (Thompson et al., Cell 56:313-321, 1989), la electroporación de embriones (Lo, Mol. Cell Biol. 3:1803-1814, 1983) y la transferencia génica mediada por esperma (Lavitrano et al., Cell 57:717-73, 1989). Para una revisión ver, por ejemplo, la patente US nº 4.736.866.

Para los fines de la presente invención, los animales transgénicos incluyen aquellos que portan únicamente el transgén en parte de las células de los mismos ("animales mosaico"). El transgén puede integrarse en forma de un único transgén, o en concatámeros, por ejemplo tándems de cabeza con cabeza o de cabeza con cola. La introducción selectiva de un transgén en un tipo celular particular también resulta posible siguiendo, por ejemplo, la técnica de Lasko et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:6232-636, 1992.

La expresión del transgén en animales transgénico puede monitorizarse mediante técnicas estándar. Por ejemplo, el análisis de transferencia southern o la amplificación por PCR pueden utilizarse para verificar la integración del transgén. A continuación puede analizarse el nivel de expresión de ARNm utilizando técnicas tales como la hibridación in situ, el análisis de transferencia northern, la PCR o la inmunocitoquímica.

Los animales pueden examinarse adicionalmente para indicios de patología de enfermedad inmunológica, por ejemplo mediante examen histológico, para determinar la infiltración de las células inmunológicas en tejidos específicos. También pueden llevarse a cabo experimentos de bloqueo, en los que los animales transgénicos se tratan con los compuestos de la invención para determinar el grado de estimulación o inhibición de la proliferación de las células T provocado por los compuestos. En estos experimentos, se administran anticuerpos bloqueantes que se unen al polipéptido PRO, preparados tal como se ha descrito anteriormente, en el animal y se determina el efecto sobre la función inmunológica.

Alternativamente, pueden construirse animales "knock out", que presentan un gen defectuoso o alterado codificante de un polipéptido identificado en la presente invención, como resultado de la recombinación homóloga entre el gen endógeno codificante del polipéptido y ADN genómico alterado codificante del mismo polipéptido introducido en una célula embrionaria del animal. Por ejemplo, puede utilizarse ADNc codificante de un polipéptido particular para clonar ADN genómico codificante de ese polipéptido según técnicas establecidas. Puede delecionarse una parte del ADN genómico codificante de un polipéptido particular o sustituirse por otro gen, tal como un gen codificante de un marcador seleccionable que puede utilizarse para realizar el seguimiento de la integración. Típicamente se incluyen en el vector varias kilobases de ADN flanqueante no alterado (tanto en el extremo 5' como en el extremo 3') [ver, por ejemplo, Thomas y Capecchi, Cell 51:503, 1987, para una descripción de los vectores de recombinación homóloga]. El vector se introduce en una línea celular madre embrionaria (por ejemplo mediante electroporación) y se seleccionan células en las que el ADN introducido se ha recombinado homólogamente con el ADN endógeno [ver, por ejemplo, Li et al., Cell 69:915, 1992]. Las células seleccionadas seguidamente se inyectan en un blastocito de un animal (por ejemplo un ratón o una rata) para formar quimeras de agregación [ver, por ejemplo, Bradley, en: Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cells: A Practical Approach, E.J. Robertson, editor (IRL, Oxford, 1987), páginas 113 a 152]. A continuación, puede implantarse un embrión quimérico en una hembra nodriza pseudoembarazada adecuada y llevar el embrión a término, creando un animal "knock out". La progenie que porta el ADN homólogamente recombinado en sus células germinales puede identificarse mediante técnicas estándares y utilizarse para criar animales en los que todas las células del animal contienen el ADN homólogamente recombinado. Los animales knockout pueden caracterizarse, por ejemplo, por su capacidad de defenderse frente a determinadas condiciones patológicos y por su desarrollo de condiciones patológicos debido a la ausencia del polipéptido.

\vskip1.000000\baselineskip

I. Terapia de inmunoadyuvante

En una realización, los compuestos inmunoestimuladores de la invención pueden utilizarse en terapia de inmunoadyuvante para el tratamiento de tumores (cáncer). En la actualidad está bien establecido que las células T reconocen antígenos específicos de tumor humano. Un grupo de antígenos tumorales, codificado por las familias de genes MAGE, BAGE y GAGE, son silenciosos en todos los tejidos adultos normales, pero se expresan en cantidades significativas en los tumores, tales como los melanomas, los tumores pulmonares, los tumores de cabeza y cuello y los carcinomas de vejiga (DeSmet, C. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:7149, 1996). Se ha demostrado que la coestimulación de las células T induce la regresión de los tumores y una respuesta antitumoral tanto in vitro como in vivo (Melero, I. et al., Nature Medicine 3:682, 1997; Kwon, E.D. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:8099, 1997; Lynch, D.H. et al., Nature Medicine 2:625, 1997; Finn, O.J. y Lotze, M.T., J. Immunol. 21:114, 1998). Los compuestos estimuladores de la invención pueden administrarse en forma de adyuvantes, solos o conjuntamente con un agente regulador del crecimiento, agente citotóxico o agente quimioterapéutico, con el fin de estimular la proliferación/activación de las células T y una respuesta antitumoral frente a los antígenos tumorales. El agente regulador del crecimiento, citotóxico o quimioterapéutico puede administrarse en cantidades convencionales en regímenes de administración conocidos. La actividad inmunoestimuladora de los compuestos de la invención permite utilizar cantidades reducidas de los agentes reguladores del crecimiento, citotóxicos o quimioterapéuticos, potencialmente rebajando de esta manera la toxicidad para el paciente.

\vskip1.000000\baselineskip

J. Ensayos de cribado para fármacos candidatos

Los ensayos de cribado para fármacos candidatos se diseñan para identificar compuestos que se unen o se acomplejan con los polipéptidos codificados por los genes identificados en la presente invención o a un fragmento biológicamente activo de los mismos, o de otra manera interfieren con la interacción entre los polipéptidos codificados y otras proteínas celulares. Este tipo de ensayos de cribado incluye ensayos en los que puede aplicarse el cribado de alto rendimiento de bibliotecas químicas, haciendo que resulten particularmente adecuados para identificar fármacos candidatos de molécula pequeña. Entre las moléculas pequeñas contempladas se incluyen compuestos sintéticos orgánicos o inorgánicos, incluyendo péptidos, preferentemente péptidos solubles, fusiones de (poli)péptido-inmunoglobulina y, en particular, anticuerpos, incluyendo, aunque sin limitarse a ellos, anticuerpos policlonales y monoclonales y fragmentos de anticuerpos, anticuerpos de una sola cadena, anticuerpos antiidiotípicos y versiones quiméricas o humanizados de dichos anticuerpos o fragmentos, así como anticuerpos y fragmentos de anticuerpo humanos. Los ensayos pueden llevarse a cabo en una diversidad de formatos, incluyendo ensayos de unión proteína-proteína, ensayos de cribado bioquímico, inmunoensayos y ensayos basados en células, que se encuentran bien caracterizados en la técnica. Todos los ensayos son comunes en el aspecto de que demandan la puesta en contacto del fármaco candidato y el polipéptido codificado por un ácido nucleico identificado en la presente invención bajo condiciones y durante un tiempo suficiente para permitir que estos dos componentes interaccionen.

En los ensayos de unión, la interacción es la unión y el complejo formado puede aislarse o detectarse en la mezcla de reacción. En una realización particular, el polipéptido codificado por el gen identificado en la presente invención o el fármaco candidato se inmoviliza sobre una fase sólida, por ejemplo sobre una placa de microtitulación, mediante uniones covalentes o no covalentes. La unión no covalente generalmente se consigue mediante recubrimiento de la superficie sólida con una solución del polipéptido y secando. Alternativamente, puede utilizarse un anticuerpo inmovilizado, por ejemplo un anticuerpo monoclonal, específico para el polipéptido que debe inmovilizarse para anclarlo a una superficie sólida. El ensayo se lleva a cabo mediante la adición del componente no inmovilizado, que puede marcarse con un marcaje detectable, al componente inmovilizado, por ejemplo la superficie recubierta que contiene el componente anclado. Tras completarse la reacción, se eliminan los componentes no reaccionados, por ejemplo mediante lavado, y los complejos anclados sobre la superficie sólida se detectan. En el caso de que el componente originalmente no inmovilizado porte un marcaje detectable, la detección del marcaje inmovilizado sobre la superficie indica que se ha producido acomplejamiento. En el caso de que el componente originalmente no inmovilizado no porte un marcaje, puede detectarse el acomplejamiento, por ejemplo mediante la utilización de un anticuerpo marcado que se una específicamente al complejo inmovilizado.

Si el compuesto candidato interacciona, aunque sin unirse, a una proteína particular codificada por un gen identificado en la presente invención, la interacción del mismo con dicha proteína puede someterse a ensayo mediante procedimientos bien conocidos para la detección de las interacciones proteína-proteína. Entre este tipo de ensayos se incluyen los enfoques tradicionales, tales como la reticulación, la coinmunoprecipitación y la copurificación mediante gradientes o columnas cromatográficas. Además, puede realizarse el seguimiento de las interacciones proteína-proteína mediante la utilización de un sistema genético basado en levaduras descrito por Fields y colaboradores [Fields y Song, Nature (London) 340:245-246, 1989; Chien et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:9578-7582, 1991], tal como dan a conocer Chevray y Nathans, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:5789-5793, 1991. Muchos activadores transcripcionales, tales como GAL4 de levadura, consisten de dos dominios modulares físicamente discretos, actuando uno como el dominio de unión al ADN, mientras el otro funciona como el dominio de activación de la transcripción. El sistema de expresión levadura descrito en las publicaciones anteriormente indicadas (generalmente denominado "sistema de dos híbridos") se beneficia de esta propiedad, y utiliza proteínas de dos híbridos, una en la que la proteína diana se fusiona con el ADN-dominio de unión de GLA4, y el otro, en el que las proteínas activadoras candidatas se fusionan con el dominio de activación. La expresión de un gen informador GAL1-lacZ bajo el control de un promotor activado por GAL4 depende de la reconstitución de la actividad de GAL4 mediante la interacción proteína-proteína. Las colonias que contienen polipéptido interaccionantes se detectan con un sustrato cromogénico para la \beta-galactosidasa. Se encuentra disponible comercialmente de Clontech un kit completo (MATCHMAKER^{TM}) para identificar interacciones proteína-proteína entre dos proteínas específicas utilizando la técnica de dos híbridos. Este sistema también puede extenderse al mapado de dominios de proteína implicados en interacciones específicas de proteínas, así como para identificar residuos aminoácidos que resulten cruciales para estas interacciones.

Con el fin de encontrar compuestos que interfieran con la interacción de un gen identificado en la presente invención y otros componentes intracelulares o extracelulares , habitualmente se prepara una mezcla de reacción que contiene el producto del gen y el componente intracelular o extracelular bajo condiciones y durante un tiempo que permite la interacción y la unión de los dos productos. Para someter a ensayo la capacidad de un compuesto de ensayo de inhibir la unión, se corre la reacción en ausencia y en presencia del compuesto de ensayo. Además, puede añadirse un placebo a una tercera mezcla de reacción, que sirva como control positivo. La unión (formación de complejo) entre el compuesto de ensayo y el componente intracelular o extracelular presente en la mezcla se monitoriza tal como se ha descrito anteriormente. La formación de un complejo en la reacción o reacciones de control pero no en la mezcla de reacción que contiene el compuesto de ensayo indica que éste interfiere con la interacción del compuesto de ensayo y la pareja de reacción del mismo.

\vskip1.000000\baselineskip

K. Composiciones y procedimientos para el tratamiento de las enfermedades de tipo inmunológico

Entre las composiciones útiles en el tratamiento de las enfermedades de tipo inmunológico se incluyen, aunque sin limitarse a ellos, proteínas, anticuerpos, moléculas orgánicas pequeñas, péptidos, fosfopéptidos, moléculas antisentido y ribozimas, moléculas de triple hélice, etc., que inhiben o estimulan la función inmunológica, por ejemplo la proliferación/activación de las células T, la liberación de linfoquinas o la infiltración de células inmunológicas.

Por ejemplo, las moléculas de ARN antisentido y de ARN actúan bloqueando directamente la traducción del ARNm mediante hibridación al ARNm diana y evitando la traducción en proteínas. En el caso de que se utilice ADN antisentido, resultan preferentes oligodesoxirribonucleótidos derivados del sitio de inicio de traducción, por ejemplo entre las posiciones -10 y +10 de la secuencia de nucleótidos del gen diana.

Los ribozimas son moléculas de ARN enzimático capaces de catalizar el corte específico del ARN. Los ribozimas actúan mediante hibridación específica de secuencia con el ARN diana complementario, seguido del corte endonucleolítico. Pueden identificarse mediante técnicas conocidas sitios específicos de corte de ribozima dentro de un ARN diana potencial. Para más detalles ver, por ejemplo, Rossi, Current Biology 4:469-471, 1994, y la publicación de patente PCT nº WO 97/33551 (publicada el 18 de septiembre de 1997).

Las moléculas de ácidos nucleicos en formación de triple hélice utilizadas para inhibir la transcripción deben ser de una sola cadena y estar compuestas de desoxinucleótidos. La composición de bases de estos oligonucleótidos se diseña de manera que estimule la formación de triple hélice siguiendo reglas de Hoogsteen de apareamiento de bases, que generalmente requiere tramos bastante grandes de purinas o de pirimidinas en una cadena de un dúplex. Para más detalles ver, por ejemplo, la publicación de patente PCT nº WO 97/33551, supra.

Dichas moléculas pueden identificarse mediante cualquier combinación de los ensayos de cribado comentados anteriormente y/o mediante cualquier otra técnica de cribado bien conocida por los expertos en la materia.

\vskip1.000000\baselineskip

L. Anticuerpos anti-PRO

Asimismo, la presente invención proporciona anticuerpos anti-PRO. Entre los anticuerpos ejemplares se incluyen los anticuerpos policlonales, monoclonales, humanizados, biespecíficos y heteroconjugados.

\vskip1.000000\baselineskip

1. Anticuerpos policlonales

Los anticuerpos anti-PRO pueden comprender anticuerpos policlonales. Los procedimientos de preparación de anticuerpos policlonales son conocidos para el experto en la materia. Los anticuerpos policlonales pueden prepararse en un mamífero, por ejemplo mediante una o más inyecciones de un agente inmunizador y, si se desea, un adyuvante. Típicamente el agente inmunizador y/o adyuvante se inyecta en el mamífero mediante múltiples inyecciones subcutáneas o intraperitoneales. El agente inmunizador puede incluir el polipéptido PRO o una proteína de fusión del mismo. Puede resultar útil conjugar el agente inmunizador con una proteína que es conocido que es inmunogénica en el mamífero que se inmuniza. Entre los ejemplos de estas proteínas inmunogénicas se incluyen, aunque sin limitarse a ellas, hemocianina de lapa americana, albúmina sérica, tiroglobulina bovina e inhibidor de tripsina de soja. Entre los ejemplos de adyuvantes que pueden utilizarse se incluyen adyuvante completo de Freund y adyuvante MPL-TDM (monofosforil-lípido A, dicorinomicolato de trehalosa sintética). El protocolo de inmunización puede ser seleccionado por un experto en la materia sin experimentación indebida.

\vskip1.000000\baselineskip

2. Anticuerpos monoclonales

Los anticuerpos anti-PRO alternativamente pueden ser anticuerpos monoclonales. Los anticuerpos monoclonales pueden prepararse utilizando procedimientos de hibridoma, tales como aquellos descritos por Kohler y Milstein, Nature 256:495, 1975. En un procedimiento de hibridoma, típicamente se inmuniza un ratón, hámster u otro animal huésped apropiado, con un agente inmunizador para inducir linfocitos que producen, o que son capaces de producir anticuerpos que se unirán específicamente al agente inmunizador. Alternativamente, los linfocitos pueden inmunizarse in vitro.

El agente inmunizador típicamente incluye el polipéptido PRO o una proteína de fusión del mismo. Generalmente se utilizan linfocitos de sangre periférica ("PBLs") si se desean células de origen humana, o células de bazo o células de nódulo linfático si se desean fuentes de mamífero no humano. A continuación, los linfocitos se fusionan con una línea celular inmortalizada utilizando un agente de fusión adecuado, tal como polietilenglicol, para formar una célula de hibridoma [Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, Academic Press, páginas 59 a 103, 1986]. Las líneas celulares inmortalizadas habitualmente son células de mamífero transformadas, particularmente células de mieloma de origen roedor, bovino y humano. Habitualmente, se utilizan líneas celulares de mieloma de rata o de ratón. Las células de hibridoma pueden cultivarse en un medio de cultivo adecuado que preferentemente contiene una o más sustancias que inhiben el crecimiento o la supervivencia de las células inmortalizadas no fusionadas. Por ejemplo, si las células parentales no presentan el enzima hipoxantina guanina fosforibosiltransferasa (HGPRT o HPRT), el medio de cultivo para los hibridomas típicamente incluirá hipoxantina, aminopterina y timidina ("medio HAT"), evitando estas sustancias el crecimiento de las células deficientes en HGPRT.

Las líneas celulares inmortalizadas preferentes son aquéllas que se fusionan eficientemente, que soportan un nivel de expresión elevado estable de anticuerpos por las células productoras de anticuerpo seleccionadas, y que son sensibles a un medio tal como el medio HAT. Son líneas celulares inmortalizadas más preferentes las líneas de mieloma murino, que pueden obtenerse, por ejemplo, del Salk Institute Cell Distribution Center, San Diego, California y de la American Type Culture Collection, Manassas, Virginia. También han sido descritas líneas celulares de mieloma humano y de heteromieloma de ratón-humano para la producción de anticuerpos monoclonales humanas [Kozbor, J. Immunol. 133:3001, 1984; Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, Marcel Dekker, Inc., New York, páginas 51 a 63, 1987].

El medio de cultivo en el que se cultivan las células de hibridoma seguidamente puede someterse a ensayo para la presencia de anticuerpos monoclonales dirigidos contra PRO. Preferentemente la especificidad de unión de los anticuerpos monoclonales producidos por las células de hibridoma se determina mediante inmunoprecipitación o mediante un ensayo de unión in vitro, tal como el radioinmunoensayo (RIA) o el ensayo de inmunosorción ligado a enzima (ELISA). Estas técnicas y ensayos son conocidos de la técnica. La afinidad de unión del anticuerpo monoclonal puede determinarse, por ejemplo, mediante el análisis de Scatchard de Munson y Pollard, Anal. Biochem. 107:220, 1980.

Tras la identificación de las células de hibridoma deseadas, los clones pueden subclonarse mediante procedimientos de dilución limitante y cultivarse mediante procedimientos estándares [Goding, supra]. Entre los medios de cultivo adecuados para este fin se incluyen, por ejemplo, el medio de Eagle modificado por Dulbecco y el medio RPMI-1640. Alternativamente, las células de hibridoma pueden cultivarse in vivo en forma de ascites en un mamífero.

Los anticuerpos monoclonales secretados por los subclones pueden aislarse o purificarse del medio de cultivo o del líquido ascites mediante procedimientos de purificación de inmunoglobulina convencionales tales como, por ejemplo, proteína A-sefarosa, cromatografía en hidroxilapatito, electroforesis en gel, diálisis o cromatografía de afinidad.

Los anticuerpos monoclonales también pueden prepararse mediante procedimientos de ADN recombinante, tales como los descritos en la patente US nº 4.816.567. El ADN codificante de los anticuerpos monoclonales de la invención puede aislarse y secuenciarse fácilmente utilizando procedimientos convencionales (por ejemplo mediante la utilización de sondas oligonucleótidas que son capaces de unirse específicamente a genes codificantes de las cadenas pesada y ligera de los anticuerpos murinos). Las células de hibridoma de la invención sirven como fuente preferente de dicho ADN. Tras su asilamiento, el ADN puede introducirse en vectores de expresión, que seguidamente se transfectan en células huésped tales como células COS de simio, células de ovario de hámster chino (CHO) o células de mieloma que de otra manera no producirían proteína inmunoglobulina, con el fin de obtener la síntesis de los anticuerpos monoclonales en las células huésped recombinantes. El ADN también puede modificarse, por ejemplo mediante la sustitución de la secuencia codificante de los dominios constantes de cadena pesada y ligera humanas por las secuencias murinas homólogas [patente US nº 4.816.567; Morrison et al., supra] o mediante unión covalente a la secuencia codificante de inmunoglobulina de la totalidad o de parte de la secuencia codificante de un polipéptido no inmunoglobulina. Este polipéptido no inmunoglobulina puede sustituir los dominios constantes de un anticuerpo de la invención o puede sustituir los dominios variables de un sitio de unión a antígeno de un anticuerpo de la invención para crear un anticuerpo bivalente quimérico.

Los anticuerpos pueden ser anticuerpos monovalentes. Los procedimientos para preparar anticuerpos monovalentes son bien conocidos de la técnica. Por ejemplo, un procedimiento implica la expresión recombinante de cadenas ligeras y de cadenas pesadas modificadas de inmunoglobulina. La cadena pesada generalmente se encuentra truncada en cualquier punto en la región Fc de manera que se impida el entrecruzamiento de la cadena pesada. Alternativamente, se sustituyen residuos de cisteína relevantes por otro residuo aminoácido o se delecionan de manera que se impida el entrecruzamiento.

Los procedimientos in vitro también resultan adecuados para preparar anticuerpos monovalentes. La digestión de los anticuerpos para producir fragmentos de los mismos, fragmentos Fab, puede conseguirse aplicando técnicas rutinarias conocidas de la técnica.

\vskip1.000000\baselineskip

3. Anticuerpos humanos y humanizados

Los anticuerpos anti-PRO de la invención pueden comprender además anticuerpos humanizados o anticuerpos humanos. Las formas humanizadas de los anticuerpos no humanos (por ejemplo murinos) son inmunoglobulinas quiméricas, cadenas de inmunoglobulina o fragmentos de las mismas (tales como Fv, Fab, Fab', F(ab')_{2} u otras subsecuencias ligantes de antígeno de los anticuerpos) que contienen una secuencia mínima derivada de una inmunoglobulina no humana. Los anticuerpos humanizados incluyen inmunoglobulinas humanas (anticuerpo receptor) en las que se sustituyen residuos de una región determinante de complementariedad (CDR) del receptor por residuos de una CDR de una especie no humana (anticuerpo donante), tal como ratón, rata o conejo, que presenta la especificidad, afinidad y capacidad deseadas. En algunos casos, se sustituyen los residuos de marco de Fv de la inmunoglobulina humana por residuos no humanos correspondientes. Los anticuerpos humanizados también pueden comprender residuos que no se encuentran en el anticuerpo receptor ni en la CDR importada ni en las secuencias esqueléticas. En general, el anticuerpo humanizado comprende sustancialmente la totalidad de por lo menos un dominio variable, y típicamente dos, en los que la totalidad, o sustancialmente la totalidad, de las regiones CDR corresponden a las de una inmunoglobulina no humana, y la totalidad, o sustancialmente la totalidad, de las regiones FR son aquéllas de una secuencia de consenso de inmunoglobulina humana. El anticuerpo humanizado óptimamente también comprende por lo menos una parte de una región constante de inmunoglobulina (Fc), típicamente de una inmunoglobulina humana [Jones et al., Nature 321:522-525, 1986; Riechmann et al., Nature 332:323-329, 1988; y Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596, 1992].

Los procedimientos para humanizar anticuerpos no humanos son bien conocidos de la técnica. Generalmente en un anticuerpo humanizado se han introducido uno o más residuos aminoácidos procedentes de una fuente que es no humana. Estos residuos aminoácidos no humanos con frecuencia se denominan residuos "importados", que típicamente se obtienen de un dominio variable "importado". La humanización puede llevarse a cabo esencialmente siguiendo el procedimiento de Winter y colaboradores [Jones et al., Nature 321:522-525, 1986; Riechmann et al., Nature 332:323-327, 1988; Verhoeyen et al., Science 239:1534-1536, 1988], mediante la sustitución de CDRs de roedor o secuencias de CDR por las secuencias correspondientes de un anticuerpo humano. Por consiguiente, estos anticuerpos "humanizados" son anticuerpos quiméricos (patente US nº 4.816.567), en los que se ha sustituido sustancialmente menos de un dominio variable humano intacto por la secuencia correspondiente de una especie no humana. En la práctica, los anticuerpos humanizados típicamente son anticuerpos humanos en los que se han sustituido algunos residuos de CDR y posiblemente algunos residuos de FR por residuos procedentes de sitios análogos en anticuerpos de roedor.

También pueden producirse anticuerpos humanos utilizando diversas técnicas conocidas de la técnica, incluyendo las bibliotecas de expresión fágica [Hoogenboom y Winter, J. Mol. Biol. 227:381, 1991; Marks et al., J. Mol. Biol. 222:581, 1991]. Las técnicas de Cole et al. y de Boerner et al. también se encuentran disponibles para la preparación de anticuerpos monoclonales humanos (Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, página 77, 1985, y Boerner et al., J. Immunol. 147(1):86-95, 1991]. De manera similar, pueden prepararse anticuerpos humanos mediante la introducción de loci de inmunoglobulina humana en animales transgénicos, por ejemplo ratones en los que se han inactivado parcial o completamente genes endógenos de inmunoglobulina. Tras el reto, se observó producción de anticuerpos humanos, que resulta estrechamente similar a la observada en el ser humano en todos los aspectos, incluyendo la reorganización génica, el ensamblaje y el repertorio de anticuerpos. Este enfoque se describe, por ejemplo, en las patentes US nº 5.545.807, nº 5.545.806, nº 5.569.825, nº 5.625.126, nº 5.633.425 y nº 5.661.016, y en las publicaciones científicas siguientes: Marks et al., Bio/Technology 10:779-783, 1992; Lonberg et al., Nature 368:856-859, 1994; Morrison, Nature 368:812-13, 1994; Fishwild et al., Nature Biotechnology 14:845-51, 1996; Neuberger, Nature Biotechnology 14:826, 1996; Lonberg y Huszar, Intern. Rev. Immunol. 13:65-93, 1995.

Los anticuerpos también pueden madurarse por afinidad mediante procedimientos conocidos de selección y/o de mutagénesis, tal como se ha descrito anteriormente. Los anticuerpos madurados por afinidad preferentes presentan una afinidad que es cinco veces, más preferentemente 10 veces, incluso preferentemente 20 ó 30 veces mayor que el anticuerpo de partida (generalmente murinos, humanizados o humanos), a partir del cual se prepara el anticuerpo maduro.

\vskip1.000000\baselineskip

4. Anticuerpos biespecíficos

Los anticuerpos biespecíficos son anticuerpos monoclonales, preferentemente humanos o humanizados, que presentan especificidades de unión para por lo menos dos antígenos diferentes. En el presente caso, una de las especificidades de unión es para PRO, siendo la otra es para cualquier otro antígeno, y preferentemente para una proteína o receptor o subunidad de receptor de superficie celular.

Los procedimientos para preparar anticuerpos biespecíficos son conocidos de la técnica. Tradicionalmente la producción recombinante de los anticuerpos biespecíficos se basan en la coexpresión de dos parejas de cadena pesada/cadena ligera de inmunoglobulina, en las que las dos cadenas pesadas presentan especificidades diferentes [Milstein y Cuello, Nature 305:537-539, 1983]. Debido a la organización aleatoria de las cadenas pesada y ligera de inmunoglobulina, estos hibridomas (cuadromas) producen una mezcla potencial de diez moléculas de anticuerpo diferentes, de las que únicamente una presenta la estructura biespecífica correcta. La purificación de la molécula correcta habitualmente se consigue mediante etapas de cromatografía por afinidad. Se dan a conocer procedimientos similares en la patente WO nº 93/08829, publicada el 13 de mayo de 1993, y en Traunecker et al., EMBO J. 10:3655-3659,
1991.

Pueden fusionarse dominios variables de anticuerpo con las especificidades de unión deseadas (sitios de unión anticuerpo-antígeno) con las secuencias de dominio constante de inmunoglobulina. La fusión preferentemente es con un dominio constante de pesada cadena de inmunoglobulina, que comprende por lo menos parte de las regiones bisagra CH2 y CH3. Resulta preferente que la primera región constante de cadena pesada (CH1) que contiene el sitio necesario para la unión de la cadena ligera se encuentre presente en por lo menos una de las fusiones. Los ADNs codificantes de las fusiones de cadena pesada de inmunoglobulina y, si se desea, la cadena ligera de inmunoglobulina, se insertan en vectores de expresión separados y se cotransfectan en un organismo huésped adecuado. Para más detalles sobre la generación de anticuerpos biespecíficos ver, por ejemplo, Suresh et al., Methods in Enzymology 121:210:1986.

Según otro enfoque descrito en la patente WO nº 96/27011, puede manipularse el interfaz entre un par de moléculas de anticuerpo para maximizar el porcentaje de heterodímeros que se recuperan del cultivo celular recombinante. La interfaz preferente comprende por lo menos una parte de la región CH3 de un dominio constante de anticuerpo. En este procedimiento, se sustituye una o más cadenas laterales pequeñas de aminoácidos de la interfaz de la primera molécula de anticuerpo por cadenas laterales más grandes (por ejemplo de tirosina o de triptófano). Se crean "cavidades" compensatorias de tamaño idéntico o similar a la cadena o cadenas laterales grandes en la interfaz de la segunda molécula de anticuerpo mediante la sustitución de las cadenas laterales grandes de aminoácidos por más pequeñas (por ejemplo de alanina o de treonina). Esto proporciona un mecanismo para incrementar el rendimiento del heterodímero respecto a otros productos finales no deseados, tales como homodímeros.

Pueden prepararse anticuerpos biespecíficos en forma de anticuerpos de longitud completa o de fragmentos de anticuerpo (por ejemplo anticuerpos biespecíficos F(ab')_{2}). Se han descrito en la literatura técnicas para generar anticuerpos biespecíficos a partir de fragmentos de anticuerpo. Por ejemplo, pueden prepararse anticuerpos biespecíficos mediante enlace químico. Brennan et al., Science 229:81, 1985, describen un procedimiento en el que se cortan proteolíticamente anticuerpos intactos para generar fragmentos F(ab')_{2}. Estos fragmentos se reducen en presencia del agente acomplejante de ditiol llamado arsenito sódico para estabilizar los ditioles vecinales y evitar la formación de disulfuros intermoleculares. Los fragmentos Fab' generados seguidamente se convierten en derivados tionitrobenzoato (TNB). A continuación, uno de los derivados Fab'-TNB se reconvierte en el Fab'-tiol mediante reducción con mercaptoetilamina y se mezcla con una cantidad equimolar de los demás derivados Fab'-TNB para formar el anticuerpo biespecífico. Los anticuerpos biespecíficos producidos pueden utilizarse como agentes para la inmovilización selectiva de enzimas.

Pueden recuperarse directamente fragmentos Fab' de E. coli y acoplarse químicamente para formar anticuerpos biespecíficos. Shalaby et al., J. Exp. Med. 175:217-225, 1992, describen la producción de una molécula de anticuerpo biespecífico F(ab')2 completamente humanizado. Cada fragmento Fab' se secretó separadamente de E. coli y se sometió a acoplamiento químico dirigido in vitro para formar el anticuerpo biespecífico. El anticuerpo biespecífico formado de esta manera era capaz de unirse a células que sobreexpresaban el receptor ErbB2 y células T humanas normales, así como desencadenar actividad lítica de linfocitos citotóxicos humanos contra dianas de tumor mamario humano.

También se han descrito diversas técnicas para preparar y aislar fragmentos de anticuerpo biespecífico directamente a partir de un cultivo celular recombinante. Por ejemplo, se han producido anticuerpos biespecíficos utilizando cremalleras de leucina (Kostelny et al., J. Immunol. 148(5):1547-1553, 1992). Los péptidos de cremallera de leucina de las proteínas Fos y Jun se unieron a las partes Fab' de dos anticuerpos diferentes mediante fusión génica. Los homodímeros de anticuerpo se redujeron en la región de bisagra para formar monómeros y después se reoxidaron para formar los heterodímeros de anticuerpo. Este procedimiento también puede utilizarse para la producción de homodímeros de anticuerpo. La tecnología de "diacuerpos" descrita por Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448, 1993, ha proporcionado un mecanismo alternativo para preparar fragmentos de anticuerpo biespecífico. Los fragmentos comprenden un dominio variable de cadena pesada (VH) conectado a un dominio variable de cadena ligera (VL) mediante un línker que es excesivamente corto para permitir el apareamiento entre los dos dominios en la misma cadena. Por consiguiente, los dominios VH y VL de un fragmento se fuerza a que se apareen con los dominios VL y VH complementarios de otro fragmento, formando de esta manera dos sitios de unión a antígeno. Se ha informado de otra estrategia para preparar fragmentos de anticuerpo biespecífico mediante la utilización de dímeros de Fv monocatenario (sFv) (ver Gruber et al., J. Immunol. 152:5368, 1994). Se encuentran contemplados anticuerpos con más de dos valencias. Por ejemplo pueden prepararse anticuerpos triespecíficos (Tutt et al., J. Immunol. 147:60, 1991).

Los anticuerpos biespecíficos ejemplares pueden unirse a dos epítopos diferentes en un polipéptido PRO dado de la presente invención. Alternativamente, puede combinarse un brazo anti-polipéptido PRO con un brazo que se una a una molécula inductora en un leucocito tal como una molécula de receptor de célula T (por ejemplo CD2, CD3, CD28 o B7) o receptores Fc de IgG (Fc\gammaR), tal como Fc\gammaRI (CD64), Fc\gammaRII (CD32) y Fc\gammaRIII (CD16) de manera que se focalicen los mecanismos de defensa celular en la célula que expresa el polipéptido PRO particular. También pueden utilizarse anticuerpos biespecíficos para localizar agentes citotóxicos en células que expresan un polipéptido PRO particular. Estos anticuerpos presentan un brazo de unión a PRO y un brazo que se une a un agente citotóxico o a un quelante radionucleido, tal como EOTUBE, DPTA, DOTA o TETA. Otro anticuerpo biespecífico de interés se une al polipéptido PRO y se une además al factor tisular (TF).

\vskip1.000000\baselineskip

5. Anticuerpos heteroconjugados

Los anticuerpos heteroconjugados también se encuentran comprendidos dentro del alcance de la presente invención. Los anticuerpos heteroconjugados están compuestos de dos anticuerpos unidos covalentemente. Estos anticuerpos se ha propuesto, por ejemplo, que dirigen las células del sistema inmunológico a las células no deseadas [patente US nº 4.676.980] y para el tratamiento de la infección por VIH [patente WO nº 91/00360, patente WO nº 92/200373, patente EP nº 03089]. Se encuentra contemplado que los anticuerpos puedan prepararse in vitro utilizando procedimientos conocidos de la química sintética de proteínas, incluyendo aquellos que implican agentes reticulantes. Por ejemplo, pueden construirse inmunotoxinas utilizando una reacción de intercambio de disulfuros o mediante la formación de un enlace tioéter. Entre los ejemplos de reactivos adecuados para este fin se incluyen iminotiolato y metil-4-mercaptobutirimidato y aquellos dados a conocer, por ejemplo, en la patente US nº 4.676.980.

\vskip1.000000\baselineskip

\global\parskip0.900000\baselineskip

6. Manipulación de la función efectora

Puede resultar deseable modificar el anticuerpo del a invención con respecto a la función efectora, de manera que se incremente, por ejemplo, la efectividad del anticuerpo en el tratamiento del cáncer. Por ejemplo, puede introducirse uno o más residuos de cisteína en la región Fc, permitiendo de esta manera la formación de disulfuros entre cadenas en esta región. El anticuerpo homodimérico generado de esta manera puede presentar una capacidad de internacionalización mejorada y/o eliminación celular mediada por el complemento y citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC) incrementadas (ver Caron et al., J. Exp. Med. 176:1191-1195, 1992, y Shopes, J. Immunol. 148:2918-2922, 1992). Los anticuerpos homodiméricos con actividad antitumoral incrementada también pueden prepararse utilizando reticulantes heterobifuncionales, tal como se describe en Wolff et al., Cancer Research 53:2560-2565, 1993. Alternativamente, puede manipularse un anticuerpo que presente regiones Fc dobles y puede presentar de esta manera capacidades incrementadas de lisis por el complemento y ADCC (ver Stevenson et al., Anti-Cancer Drug Design 3:219-230, 1989.

\vskip1.000000\baselineskip

7. Inmunoconjugados

La invención también se refiere a inmunoconjugados que comprenden un anticuerpo conjugado con un agente citotóxico, tal como un agente quimioterapéutico, toxina (por ejemplo una toxina enzimáticamente activo de origen bac-
teriano, fúngico, vegetal o animal, o fragmentos de la misma) o un isótopo radioactivo (es decir, un radioconjugado).

Se han descrito anteriormente agentes quimioterapéuticos útiles en la generación de dichos inmunoconjugados. Entre las toxinas enzimáticamente activas y fragmentos de las mismas que pueden utilizarse se incluyen la cadena A diftérica, los fragmentos activos no ligantes de la toxina diftérica, la cadena A de exotoxina (de Pseudomonas aeruginosa), la cadena A de la ricina, la cadena A de la abrina, la cadena A de la modeccina, alfa-sarcina, proteínas de Aleurites fordii, proteínas diantina, proteínas de Phytolaca americana (PAPI, PAPII y PAP-S), inhibidor de Momordica charantia, curcina, crotina, inhibidor de Saponaria officinalis, gelonina, mitogelina, restrictocina, fenomicina, enomicina y los tricotecenos. Se encuentra disponible una diversidad de radionucleidos para la producción de anticuerpos radioconjugados. Entre los ejemplos se incluyen ^{212}Bi, ^{131}I, ^{131}In, ^{90}Y y ^{186}Re.

Se prepararon conjugados del anticuerpo y del agente citotóxico utilizando una diversidad de agentes acoplantes de proteína bifuncional, tales como propionato de N-succinimidil-3-(2-piridilditiol) (SPDP), iminotiolano (IT), derivados bifuncionales de imidoésteres (tales como HCl de adipimidato de dimetilo), ésteres activos (tales como suberato de disuccinimidilo), aldehídos (tales como glutaraldehído), compuestos bis-azido (tales como bis(p-azidobenzoilo) hexandiamina), derivados bis-diazonio (tales como bis-(p-diazol-niumbenzoil)-etilendiamina), diisocianatos (tales como 2,6-diisocianato de tolueno) y compuestos de flúor bis-activos (tales como 1,5-difluoro-2,4-dinitrobenceno). Por ejemplo, puede prepararse una inmunotoxina ricina tal como se describe en Vitetta et al., Science 238:1098, 1987. El ácido 1-isotiocianatobencil-3-metildietilén triaminopentaacético marcado con carbono 14 (MX-DTPA) es un agente quelante ejemplar para la conjugación de radionucleótidos a anticuerpos (ver la patente WO nº 94/11026).

En otra realización, el anticuerpo puede conjugarse con un "receptor" (tal como estreptavidina) para la utilización en la prerreconocimiento tumoral, en la que el conjugado de anticuerpo-receptor se administra en el paciente, seguido de la eliminación de conjugado no unido de la circulación utilizando un agente eliminador y después la administración de un "ligando" (por ejeplo avidina) que está conjugado con un agente citotóxico (por ejemplo un radionucleótido).

\vskip1.000000\baselineskip

8. Inmunoliposomas

Los anticuerpos dados a conocer en la presente invención también pueden formularse como inmunoliposomas. Los liposomas que contienen el anticuerpo se preparan mediante procedimientos conocidos de la técnica, tales como los descritos en Epstein et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:3688, 1985; Hwang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4030, 1980; y en las patentes US nº 4.485.045 y nº 4.544.545. Se dan a conocer liposomas con tiempo de circulación incrementado en la patente US nº 5.013.556.

Pueden generarse liposomas particularmente útiles mediante el procedimiento de evaporación en fase reversa con una composición de lípidos que comprende fosfatidilcolina, colesterol y fosfatidiletanolamina derivatizada con PEG (PEG-PE). Los liposomas se extrusionan a través de filtros de tamaño de poro definido, rindiendo liposomas con el diámetro definido. Pueden conjugarse fragmentos Fab' del anticuerpo de la presente invención con los liposomas, tal como se describe en Martin et al., J. Biol. Chem. 257:286-288, 1982, mediante una reacción de intercambio de disulfuros. Un agente quimioterapéutico (tal como doxorubicina) se encuentra opcionalmente contenido dentro del liposoma (ver Gabizon et al., J. National Cancer Inst. 81(19):1484, 1989).

\vskip1.000000\baselineskip

M. Composiciones farmacéuticas

Las moléculas de PRO activas de la invención (por ejemplo polipéptidos PRO, anticuerpos anti-PRO y/o variantes de cada uno de los mismos), así como otras moléculas identificadas en los ensayos de cribado dados a conocer anteriormente, pueden administrarse para el tratamiento de enfermedades de tipo inmunológico, en la forma de composiciones farmacéuticas.

\global\parskip1.000000\baselineskip

Se preparan formulaciones terapéuticas de la molécula de PRO activa, preferentemente un polipéptido o un anticuerpo de la invención, para el almacenamiento mediante la mezcla de la molécula activa que presenta el grado deseado de pureza con portadores, excipientes o estabilizadores opcionales farmacéuticamente aceptables (Remington's Pharmaceutical Sciences, 16a edición, Osol, A., editor, 1980), en la forma de formulaciones liofilizadas o de soluciones acuosas. Los portadores, excipientes o estabilizadores aceptables resultan no tóxicos para los receptores a las dosis y concentraciones utilizadas, e incluyen tampones, tales como fosfato, citrato y otros ácidos orgánicos; antioxidantes, incluyendo ácido ascórbico y metionina; conservantes (tales como cloruro de octadecildimetilbencil-amonio; cloruro de hexametonio; cloruro de benzalconio; cloruro de bencetonio; fenol; alcohol butílico o bencílico; alquilparabenes, tales como metilparabén o propilparabén; catecol; resorcinol; ciclohexanol; 3-pentanol y m-cresol); polipéptidos de bajo peso molecular (menos de aproximadamente 10 residuos); proteínas, tales como albúmina sérica, gelatina o inmunoglobulinas; polímeros hidrofílicos, tales como polivinilpirrolidona; aminoácidos, tales como glicina, glutamina, asparagina, histidina, arginina o lisina; monosacáridos, disacáridos, y otros carbohidratos, incluyendo glucosa, manosa, histidina, arginina o lisina; monosacáridos, disacáridos y otros carbohidratos, incluyendo glucosa, manosa o dextrinas; agentes quelantes, tales como EDTA; azúcares, tales como sacarosa, manitol, trehalosa o sorbitol; contraiones formadores de sal, tales como sodio; complejos metálicos (por ejemplo complejos de Zn-proteína) y/o surfactantes no iónicos, tales como TWEEN^{TM}, PLURONICS^{TM} o polietilenglicol (PEG)).

Los compuestos identificados por los ensayos de cribado dados a conocer en la presente invención pueden formularse de una manera análoga, utilizando técnicas estándares bien conocidas de la técnica.

También pueden utilizarse lipofecciones o liposomas para administrar la molécula PRO en las células. En el caso de que se utilicen fragmentos de anticuerpo, resulta preferente el fragmento inhibidor más pequeño que se una específicamente al dominio de unión de la proteína diana. Por ejemplo, basándose en las secuencias de la región variable de un anticuerpo, pueden diseñarse moléculas peptídicas que conserven la capacidad de unirse a la secuencia de la proteína diana. Estos péptidos pueden sintetizarse químicamente y/o producirse mediante tecnología de ADN recombinante (ver, por ejemplo, Marasco et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:7889-7893, 1993).

La formulación de la presente invención también puede contener más de un compuesto activo según resulte necesario para la indicación particular bajo tratamiento, preferentemente aquellos con actividades complementarias que no interfieran negativamente entre sí. Alternativamente, o adicionalmente, la composición puede comprender un agente citotóxico, citoquina o agente inhibidor del crecimiento. Estas moléculas se encuentran convenientemente presentes en combinación en cantidades que resultan eficaces para el fin pretendido.

Las moléculas de PRO activas también pueden atraparse en microcápsulas preparadas, pro ejemplo, mediante técnicas de coacervado o mediante polimerización interfacial, por ejemplo microcápsulas de hidroximetilcelulosa o de gelatina y microcápsulas de poli-(metilmetacrilato), respectivamente, en sistemas de administración de fármaco coloidal (por ejemplo liposomas, microsferas de albúmina, microemulsiones, nanopartículas y nanocápsulas) o en macroemulsiones. Estas técnicas se dan a conocer en Remington's Pharmaceutical Sciences, 16a edición, Osol, A., editor, 1980.

Las formulaciones destinadas a la administración in vivo deben ser estériles. Esto se consigue fácilmente mediante filtración a través de membranas de filtración estéril.

Pueden prepararse preparaciones de liberación sostenida para las moléculas de PRO. Entre los ejemplos adecuados de preparaciones de liberación sostenida se incluyen matrices semipermeables de polímeros hidrofóbicos sólidos que contienen el anticuerpo, encontrándose las matrices en la forma de productos conformados, por ejemplo películas o microcápsulas. Entre los ejemplos de matrices de liberación sostenida se incluyen poliésteres, hidrogeles (por ejemplo poli(2-hidroxietilmetacrilato) o poli(alcohol vinílico), poliláctidos (patente US nº 3.773.919), copolímeros de ácido L-glutámico y \gamma-etil-L-glutamato, copolímeros no degradables de etileno-acetatno de vinilo, copolimeros degradables de ácido láctico-ácido glicólico, tales como LUPRON DEPOT^{TM} (microesferas inyectables compuestas de copolímero de ácido láctico-ácido glicólico y acetato de leuprólido) y ácido poli-D-(-)-3-hidroxibutírico. Aunque polímeros tales como etileno-acetato de vinilo y ácido láctico-ácido glicólico permiten la liberación de moléculas durante más de 100 días, determinados hidrogeles liberan proteínas durante periodos de tiempo más cortos. En el caso de que los anticuerpos encapsulados permanezcan en el cuerpo durante un tiempo prolongado, pueden desnaturalizarse o agregarse como resultado de la exposición a humedad a 37ºC, resultando en una pérdida de actividad biológico y en posibles cambios de inmunogenicidad. Pueden diseñarse estrategias racionales para la estabilización dependiendo del mecanismo implicado. Por ejemplo, si se descubre que el mecanismo de agregación es la formación de enlaces S-S intermoleculares a través del intercambio de tio-disulfuros, puede conseguirse la estabilización modificando los residuos sulfhidrilo, lofilizando a partir de soluciones ácidas, controlando el contenido de humedad, utilizando aditivos apropiados y desarrollando composiciones específicas de matriz de polímero.

N. Procedimientos de tratamiento

Se contempla que los polipéptidos, anticuerpos y otros compuestos activos de la presente invención puedan utilizarse para tratar diversas enfermedades y condiciones de tipo inmunológico, tales como enfermedades mediadas por células T, incluyendo aquéllas caracterizadas por la infiltración de células inflamatorias en un tejido, la estimulación de la proliferación de las células T, la inhibición de la proliferación de las células T, la permeabilidad vascular incrementada o reducida o la inhibición de las mismas.

Entre las condiciones o trastornos ejemplares que deben tratarse con los polipéptidos, anticuerpos y otros compuestos de la invención se incluyen, aunque sin limitarse a ellos, el lupus eritematoso sistémico, la artritis reumatoide, la artritis crónica juvenil, la osteoartritis, las espondiloartorpatías, la esclerosis sistémica (escleroderma), las miopatías inflamatorias idiopáticas (dermatomiositis, polimiositis), el síndrome de Sjögren, la vasculitis sistémica, la sarcoidosis, la anemia hemolítica autoinmunológica (pancitopenia inmunológica, hemoglobinuria nocturna paroxística), la trombocitopenia autoinmunológica (púrpura trombocitopénica idiopática, trombocitopenia mediada inmunológicamente), la tiroiditis (enfermedad de Grave, tiroiditis de Hashimoto, tiroiditis linfocítica juvenil, tiroiditis atrófica), la diabetes mellitus, la enfermedad renal mediada inmunológicamente (glomerulonefritis, nefritis tubulointersticial), las enfermedades desmielinizantes de los sistemas nerviosos central y periférico, tales como la esclerosis múltiple, la polineuropatía desmielinizante idiopática o síndrome de Guillain-Barré y la polineuropatía desmielinizante inflamatoria crónica, enfermedades hepatobiliares tales como la hepatitis infecciosa (hepatitis A, B, C, D, E y otros virus no hepatotrópicos), la hepatitis activa crónica autoinmunológica, la cirrosis biliar primaria, la hepatitis granulomatosa y la colangitis esclerosante, la enfermedad intestinal inflamatoria (colitis ulcerosa, enfermedad de Crohn), la enteropatía sensible al gluten y la enfermedad de Whipple, las enfermedades de la piel autoinmunológicas o mediadas inunológicamente, incluyendo las enfermedades bullosas de la piel, el eritema multiforme y la dermatitis por contacto, la soriasis, las enfermedades alérgicas tales como el asma, la rinitis alérgica, la dermatitis atópica, la hipersensibilidad alimentaria y la urticaria, las enfermedades inmunológicas de los pulmones, tales como las neumonías eosinofílicas, la fibrosis pulmonar idiopática y la neumonitis de hipersensibilidad, las enfermedades asociadas al trasplante, incluyendo el rechazo del injerto y la enfermedad del injerto contra el huésped.

En el lupus eritematoso sistémico, el mediador central de la enfermedad es la producción de anticuerpos autorreactivos contra autoproteínas/tejidos y la generación posterior de inflamación mediada inmunológicamente. Los anticuerpos median directa o indirectamente en la lesión de los tejidos. Aunque no se ha demostrado que los linfocitos T se encuentren directamente implicados en el daño de los tejidos, los linfocitos T resultan necesarios para el desarrollo de los anticuerpos autorreactivos. La génesis de la enfermedad, de esta manera, depende de los linfocitos T. Resultan afectados clínicamente múltiples órganos y sistemas, incluyendo riñón, pulmón, sistema musculoesquelético, mucocutáneo, ojo, sistema nervioso central, sistema cardiovascular, tracto gastrointestinal, médula
ósea y sangre.

La artritis reumatoide (RA) es una enfermedad inflamatoria autoinmunológica sistémica crónica que principalmente implica la membrana sinovial de múltiples articulaciones, con daños resultantes en el cartílago articular. La patogénesis depende de los linfocitos T y se asocia a la producción de factores reumatoides, autoanticuerpos dirigidos contra auto-IgG, con la formación resultante de complejos inmunológicos que alcanzan niveles elevados en el líquido articular y en la sangre. Estos complejos en la articulación pueden inducir la infiltración marcada de linfocitos y monocitos en el sinovio y cambios sinoviales marcados posteriores; el espacio/líquido articular se infiltra con células similares, con la adición de numerosos neutrófilos. Los tejidos afectados principalmente son las articulaciones, con frecuencia en un patrón simétrico. Sin embargo, también se produce enfermedad extraarticular en dos formas principales. Una forma es el desarrollo de lesiones extraarticulares con enfermedad articular progresiva continua y lesiones típicas de fibrosis pulmonar, vasculitis y úlceras cutáneas. La segunda forma de enfermedad extraarticular es el denominado síndrome de Felty, que se produce tarde durante el curso de la enfermedad de la RA, en ocasiones tras convertirse la enfermedad articular en quiescente, e implica la presencia de neutropenia, trombocitopenia y esplenomegalia. Esto puede verse acompañado por vasculitis en múltiples órganos, con formación de infartos, úlceras de la piel y gangrena. Los pacientes con frecuencia también desarrollan nódulos reumatoides en el tejido subcutáneo que recubre las articulaciones afectadas; los nódulos en estadio tardío presentan centros necróticos circundados por un infiltrado celular inflamatorio mixto. Entre otras manifestaciones que pueden producirse en la RA se incluyen: pericarditis, pleuritis, arteritis coronaria, neumonitis intestinal con fibrosis pulmonar, queratoconjuntivitis seca y nódulos reumatoides.

La artritis crónica juvenil es una enfermedad inflamatoria idiopática crónica que se inicia con frecuencia a edades inferiores a 16 años. El fenotipo de la misma presenta algunas similitudes con la RA; algunos pacientes positivos para el factor reumatoide se clasifican como artritis reumatoide juvenil. La enfermedad se subclasifica en tres categorías principales: pauciarticular, poliarticular y sistémica. La artritis puede ser severa y típicamente es destructiva y conduce a la anquilosis articular y a retraso en el crecimiento. Entre otras investigaciones pueden incluirse uveitis anterior crónica y amiloidosis sistémica.

Las espondiloartropatías son un grupo de trastornos con algunas características clínicas comunes y la asociación común con la expresión del producto génico HLA-B27. Entre los trastornos se incluyen: espondilitis anquilosante, síndrome de Reiter (artritis reactiva), artritis asociada a enfermedad intestinal inflamatoria, espondilitis asociada a soriasis, espondiloartropatía de aparición juvenil y espondiloartropatía no diferenciada. Entre las características distintivas se incluyen sacroileitis con o sin espondilitis, artritis asimétrica inflamatoria, asociación con HLA-B27 (un alelo definido serológicamente del locus HLA-B del MHC de clase I), inflamación ocular y ausencia de autoanticuerpos asociados a otra enfermedad reumatoide. Las células que se han implicado más como clave para la inducción de la enfermedad son los linfocitos T CD8+, células con diana en los antígenos presentados por las moléculas del MHC de clase I. Las células T CD8+ pueden reaccionar contra el alelo HLA-B27 del MHC de clase I como si fuese un péptido foráneo expresado por las moléculas del MHC de clase I. Se ha planteado la hipótesis de que un epítopo de HLA-B27 podría imitar un epítopo antigénico bacteriano u otro epítopo antigénico microbiano y de esta manera inducir la respuesta de las células T CD8+.

\newpage

La esclerosis sistémica (escleroderma) presenta una etiología desconocida. Una característica distintiva de la enfermedad es la induración de la piel; probablemente inducida por un proceso inflamatorio activo. El escleroderma puede estar localizado o ser sistémico; las lesiones vasculares son comunes y las lesiones de las células endoteliales en la microvasculatura son un suceso temprano e importante en el desarrollo de la esclerosis sistémica; la lesión vascular puede encontrarse mediada inmunológicamente. Se infiere una base inmunológica por la presencia de infiltrados de células mononucleares en las lesiones cutáneas y por la presencia de anticuerpos antinucleares en muchos pacientes. ICAM-1 con frecuencia se encuentra regulada positivamente sobre la superficie de los fibroblastos en lesiones de la piel, sugiriendo que la interacción de las células T con estas células podría presentar un papel en la patogénesis de la enfermedad. Entre otros órganos implicados se incluyen: el tracto gastrointestinal, resultando la atrofia del músculo liso y la fibrosis en peristalsis/motilidad anormales; riñón: proliferación íntima subedontelial concéntrica que afecta a arterias arqueadas e interlobulares menores, resultando en una reducción del flujo sanguíneo renal cortical y en proteinuria, azotemia e hipertensión; músculo esquelético: atrofia, fibrosis intersticial, inflamación; pulmón: neumonitis intersticial y fibrosis intersticial; y corazón: necrosis de la banda de contracción, cicatrización/fibrosis.

Las miopatías inflamatorias idiopáticas, incluyendo la dermatomiositis, la polimiositis y otras, son trastornos de inflamación muscular crónica de etiología desconocida que resultan en debilidad muscular. El daño/inflamación muscular con frecuencia es simétrico y progresivo. Se asocian autoanticuerpos a la mayoría de formas. Estos autoanticuerpos específicos de la miositis se dirigen contra, e inhiben, la función de componentes, proteínas y ARNs implicados en la síntesis de las proteínas.

El síndrome de Sjögren se debe a inflamación mediada inmunológicamente y la posterior destrucción funcional de las glándulas lacrimales y salivares. La enfermedad puede encontrarse asociada, o verse acompañada, de enfermedades inflamatorias del tejido conectivo. La enfermedad se asocia a la producción de autoanticuerpos contra los antígenos Ro y La, ambos complejos pequeños de ARN-proteína. Las lesiones resultan en queratoconjuntivitis seca, xerostomia, incluyendo otras manifestaciones o asociaciones la cirrosis biliar, la neuropatía periférica o sensorial y la púrpura palpable.

Las vasculitis sistémicas son enfermedades en las que la lesión primaria es la inflamación y el posterior daño a los vasos sanguíneos que resulta en isquemia/necrosis/degeneración de los tejidos alimentados por los vasos afectados y finalmente la disfunción del órgano final en algunos casos. La vasculitides también puede producirse como lesión secundaria o secuela en otras enfermedades mediadas por el sistema inmunológico y la inflamación, tales como la artritis reumatoide, la esclerosis sistémica, etc., particularmente en enfermedades que también se asocian a la formación de complejos inmunológicos. Entre las enfermedades en el grupo de las vasculitis sistémicas primarias se incluyen: vasculitis necrotizante sistémica, poliarteritis nodosa, angiitis alérgica y granulomatosis, poliangitis, granulomatosis de Wegener, granulomatosis linfomatoide y arteritis de las células gigantes. Entre las vasculitides misceláneas se incluyen: síndrome del nódulo linfático mucocutáneo (MLNS o enfermedad de Kawasaki), vasculitis aislada del SNC, enfermedad de Behet, tromboangiitis obliterans (enfermedad de Buerger) y venulitis necrotizante cutánea. El mecanismo patogénico de la mayoría de los tipos de vasculitis listados se cree que se be principalmente a la deposición de complejos de inmunoglobulina en la pared del vaso y la posterior inducción de una respuesta inflamatoria a través de ADCC, la activación del complemento, o ambos.

La sarcoidosis es una condición de etiología desconocida que se caracteriza por la presencia de granulomas epitelioides en prácticamente cualquier tejido del cuerpo; la implicación de los pulmones es la más común. La patogénesis implica la persistencia de macrófagos y células linfoides activados en sitios de la enfermedad, con secuelas crónicas posteriores resultantes de la liberación de productos activos local y sistémicamente por parte de estos tipos celulares.

La anemia hemolítica autoinmunológica, incluyendo la anemia hemolítica autoinmunológica, la pancitopenia inmunológica y la hemoglobinuria nocturna paroxística, es el resultado de la producción de anticuerpos que reaccionan con antígenos expresados sobre la superficie de los glóbulos rojos (y en algunos casos otras células sanguíneas, incluyendo también las plaquetas) y es un reflejo de la eliminación de aquellas células recubiertas de anticuerpo a través de la lisis mediada por el complemento y/o mecanismos mediados por ADCC/receptor Fc.

En la trombocitopenia autoinmunológica, incluyendo la púrpura trombocitopénica, y en la trombocitopenia mediada inmunológicamente en otros contextos clínicos, la destrucción/eliminación de las plaquetas se produce como resultado de la unión de anticuerpo o complemento a las plaquetas y la posterior eliminación mediante mecanismos mediados por lisis del complemento, ADCC o receptor FC.

La tiroiditis, incluyendo la enfermedad de Grave, la tiroiditis de Hashimoto, la tiroiditis linfocítica juvenil y la tiroiditis atrófica, son el resultado de una respuesta autoinmunológica contra los antígenos del tiroides con producción de anticuerpos que reaccionan con proteínas presentes, y con frecuencia específicas de la glándula tiroides. Existen modelos experimentales, incluyendo modelos espontáneos: ratas (ratas BUF y BB) y pollos (cepa de pollos obesos); modelos inducibles: inmunización de animales con tiroglobulina o con antígeno microsómico tiroideo (peroxidasa del tiroides).

La diabetes mellitus de tipo I o diabetes insulino-dependiente es la destrucción autoinmunológica de las células de los islotes \beta pancreáticos: esta destrucción se encuentra mediada por autoanticuerpos y células T autorreactivas. Los anticuerpos de la insulina o del receptor de la insulina también pueden producir el fenotipo de falta de respuesta a la insulina.

Las enfermedades renales mediadas inmunológicamente, incluyendo la glomerulonefritis y la nefritis tubulointersticial, son el resultado de daños mediados por anticuerpos o linfocitos T del tejido renal, sea directamente como resultado de la producción de anticuerpos autorreactivos o células T contra antígenos renales, o indirectamente como resultado de la deposición de anticuerpos y/o complejos inmunológicos en el riñón que son reactivos contra otros antígenos no renales. De esta manera, otras enfermedades mediadas inmunológicamente que resultan en la formación de complejos inmunológicos también pueden inducir una enfermedad renal mediada inmunológicamente como secuela indirecta. Los mecanismos inmunológicos tanto directos como indirectos resultan en una respuesta inflamatoria que produce/induce el desarrollo de lesiones en los tejidos renales, con la resultante alteración de la función del órgano y en algunos casos la progresión hasta la insuficiencia renal. Pueden encontrarse implicados mecanismos inmunológicos tanto humorales como celulares en la patogénesis de las lesiones.

Se cree que las enfermedades desmielinizantes de los sistemas nerviosos central y periférico, incluyendo la esclerosis múltiple, la polineuropatía desmielinizante idiopática o síndrome de Guillain-Barré, y la polineuropatía desmielinizante inflamatoria crónica, presentan una base autoinmunológica y resultan en la desmielinización de los nervios como resultado de los daños causados en oligodendrocitos o directamente en la mielina. En la MS existe evidencia que sugiere que la inducción y progresión de la enfermedad depende de los linfocitos T. La esclerosis múltiple es una enfermedad desmielinizante que depende de los linfocitos T y que presenta un curso de recaída-remisión o un curso progresivo crónico. Sin embargo, la etiología es desconocida: contribuyen las infecciones víricas, la predisposición genética, el ambiente y la autoinmunidad. Las lesiones contienen infiltrados de células microgliales mediadas predominantemente por linfocitos T y macrófagos infiltrantes; los linfocitos T CD4+ son el tipo celular predominante en las lesiones. El mecanismo de la muerte de los oligodendrocitos y la desmielinización posterior no es conocido pero es probable que esté controlado por los linfocitos T.

La enfermedad pulmonar inflamatoria y fibrótica, incluyendo las neumonías eosinofílicas, la fibrosis pulmonar idiopática y la neumonitis por hipersensibilidad pueden implicar una respuesta inmunológica-inflamatoria desregulada. La inhibición de esa respuesta resultaría beneficiosa terapéuticamente.

Las enfermedades de la piel autoinmunológicas o mediadas inmunológicamente, incluyendo las enfermedades bullosas de la piel, el eritema multiforme y la dermatitis por contacto, se encuentran medidas por autoanticuerpos, la génesis de las cuales depende de los linfocitos T.

La soriasis es una enfermedad inflamatoria mediada por linfocitos T. Las lesiones contienen infiltrados de linfocitos T, macrófagos y células procesadoras de antígenos, y algunos neutrófilos.

Las enfermedades alérgicas, incluyendo el asma, la rinitis alérgica, la dermatitis atópica, la hipersensibilidad alimentaria y la urticaria dependen de los linfocitos T. Estas enfermedades se encuentran predominantemente medidas por inflamación inducida por linfocitos T, inflamación mediada por IgE o una combinación de ambos.

Las enfermedades asociadas al trasplante, incluyendo el rechazo del injerto y la enfermedad del injerto contra el huésped (GVHD) dependen de los linfocitos T; la inhibición de la función de los linfocitos T resulta beneficiosa.

Otras enfermedades en las que la intervención de la respuesta inmunológica y/o inflamatoria resulta beneficiosa son las enfermedades infecciosas, incluyendo aunque sin limitación, la infección vírica (incluyendo, aunque sin limitación, SIDA, hepatitis A, B, C, D, E y herpes), la infección bacteriana, las infecciones fúngicas y las infecciones protozoáricas y parasitarias (las moléculas (o derivados/agonistas) que estimulan la MLR pueden utilizarse terapéuticamente para incrementar la respuesta inmunológica frente a agentes infecciosos), enfermedades de inmunodeficiencia (moléculas/derivados/agonistas) que estimulan el MLR pueden utilizarse terapéuticamente para incrementar la respuesta inmunológica para condiciones de inmunodeficiencia heredada, adquirida, infecciosa inducida (tal como en la infección por VIH) o yatrogénica (es decir, derivada de la quimioterapia), y la neoplasia.

Se ha demostrado que algunos pacientes humanos de cáncer desarrollan una respuesta de anticuerpos y/o de linfocitos T frente a los antígenos en las células neoplásicas. También se ha demostrado en modelos animales de neoplasia que la intensificación de la respuesta inmunológica puede resultar en el rechazo o la regresión de ese neoplasma particular. Las moléculas que incrementan la respuesta de linfocitos T en la MLR presentan utilidad en vivo en el incremento de la respuesta inmunológica frente a la neoplasia. Las moléculas que incrementan la respuesta proliferativa de los linfocitos T en la MLR (o agonistas o anticuerpos de molécula pequeña que afectaban al mismo receptor de manera agonista) pueden utilizarse terapéuticamente para tratar el cáncer. Las moléculas que inhiben la respuesta de linfocitos en la MLR también funcionan in vivo durante la neoplasia para suprimir la respuesta inmunológica frente a un neoplasma; dichas moléculas pueden ser expresadas por las células neoplásicas mismas o la expresión de las moléculas puede ser inducida por el neoplasma en otras células. El antagonismo de dichas moléculas inhibidoras (con anticuerpos, con antagonistas de molécula pequeña o con otros medios) incrementa el rechazo del tumor mediado inmunológicamente.

Además, la inhibición de moléculas con propiedades proinflamatorias podría resultar terapéuticamente beneficioso en el daño por reperfusión, el ictus, el infarto de miocardio, la aterosclerosis, el daño pulmonar agudo, el choque hemorrágico, las quemaduras, la sepsis/choque séptico, la necrosis tubular aguda, la endometriosis, la enfermedad articular degenerativa y la pancreatitis.

Los compuestos de la presente invención, por ejemplo polipéptidos o anticuerpos, se administran en un mamífero, preferentemente un ser humano, según procedimientos conocidos, tales como la administración intravenosa en forma de un bolo o mediante infusión continua a lo largo de un periodo de tiempo, por vía intramuscular, intraperitoneal, intracerebroespinal, subcutánea, intraarticular, intrasinovial, intratecal, oral, tópica o mediante inhalación (intranasal, intrapulmonar). Resulta preferente la administración intravenosa o inhalada de polipéptidos y anticuerpos.

En la terapia de inmunoadyuvante, pueden combinarse otros regímenes terapéuticos, tales como la administración de un agente anticáncer, con la administración de las proteínas, anticuerpos o compuestos de la invención. Por ejemplo, el paciente que debe tratarse con el inmunodyuvante de la invención también puede recibir un agente anticáncer (agente quimioterapéutico) o terapia de radiación. La preparación y programas de dosificación para estos agentes quimioterapéuticos puede realizarse siguiendo las instrucciones del fabricante o según determine empíricamente el experto en la materia. La preparación y programas de dosificación de dicha quimioterapia también se describen en: Chemotherapy Service Ed., M.C. Perry, Williams & Wilkins, Baltimore, MD, 1992. El agente quimioterapéutico puede anteceder o seguir a la administración del inmunoadyuvante o puede proporcionarse simultáneamente al mismo. Además, puede proporcionarse un compuesto antiestrógeno, tal como tamoxifeno, o una antiprogesterona, tal como onapristona, (ver la patente EP nº 616812) en las dosis conocidas de dichas moléculas.

Puede resultar deseable administrar también anticuerpos contra otros antígenos asociados a enfermedad inmunológica o a tumor, tales como anticuerpos que se unen a CD20, CD11a, CD18, ErbB2, EGFR, ErbB3, ErbB4 o factor vascular endotelial (VEGF). Alternativamente, o adicionalmente, pueden coadministrarse en el paciente dos o más anticuerpos que se unen a los mismos antígenos o a dos o más antígenos diferentes dados a conocer en la presente invención. En ocasiones puede resultar beneficioso administrar también una o más citoquinas en el paciente. En una realización, los polipéptidos PRO se coadministran con n agente inhibidor del crecimiento. Por ejemplo, el agente inhibidor del crecimiento puede administrarse en primer lugar, seguido de un polipéptido PRO. Sin embargo, la administración simultánea o la administración en primer lugar también se encuentra contemplada. Las dosis adecuadas del agente inhibidor del crecimiento son aquéllas utilizadas en la actualidad y pueden reducirse debido a la acción combinada (sinergia) del agente inhibidor del crecimiento y el polipéptido PRO.

Para el tratamiento o la reducción en la severidad de la enfermedad de tipo inmunológico, la dosis apropiada de un compuesto de la invención dependerá del tipo de enfermedad que deba tratarse, tal como se ha definido anteriormente, de la severidad y del curso de la enfermedad, si el agente se administra con fines preventivos o terapéuticos, la terapia anterior, el historial clínico del paciente y la respuesta al compuesto, y la discreción del médico responsable. El compuesto se administra convenientemente en el paciente en un tiempo o a lo largo de una serie de tratamientos.

Por ejemplo, dependiendo del tipo y severidad de la enfermedad, una dosis candidata inicial para administrar en el paciente es aproximadamente 1 \mug/kg a 15 mg/kg (por ejemplo 0,1 a 20 mg/kg) de polipéptido o anticuerpo, mediante una o más administraciones separadas o mediante infusión continua. Una dosis diaria típica se encuentra comprendida entre aproximadamente 1 \mug/kg y 100 mg/kg o más, dependiendo de los factores indicados anteriormente. Para las administraciones repetidas a lo largo de varios días o más tiempo, dependiendo de la condición, el tratamiento se prolonga hasta que se produje una supresión deseada de los síntomas de la enfermedad. Sin embargo, también pueden resultar útiles otros regímenes de dosis. El progreso de esta terapia de sigue con facilidad mediante técnicas y ensayos convencionales.

\vskip1.000000\baselineskip

O. Productos de fabricación

En otra realización de la invención, se proporciona un producto de fabricación que contiene materiales (por ejemplo que comprende una molécula de PRO) útiles para el diagnóstico o el tratamiento de los trastornos descritos anteriormente. El producto de fabricación comprende un recipiente y unas instrucciones. Entre los recipientes adecuados se incluyen, botellas, viales, jeringas y probetas. Los recipientes pueden formarse a partir de una diversidad de materiales, tales como el vidrio o el plástico. El recipiente contiene una composiciones que resulta eficaz para diagnosticar o tratar la condición y puede presentar una abertura de acceso estéril (por ejemplo el recipiente puede ser una bolsa de solución intravenosa o un vial que presenta un tapón perforable con una aguja de inyección hipodérmica). El agente activo en la composición habitualmente es un polipéptido o un anticuerpo de la invención. Unas instrucciones o etiquetas sobre el recipiente o asociado al mismo indican que la composición se utiliza para diagnosticar o tratar la condición seleccionada. El producto de fabricación puede comprender además un segundo recipiente que comprende un tampón farmacéuticamente aceptable, tal como solución salina tamponada con fosfato, solución de Ringer y solución de dextrosa. Puede incluir adicionalmente otros materiales deseables desde un punto de vista comercial y del usuario, incluyendo otros tampones, diluyentes, filtros, agujas, jeringas e impresos insertos en el paquete con las instrucciones de utilización.

\vskip1.000000\baselineskip

P. Diagnóstico y prognóstico de la enfermedad de tipo inmunológico

Las proteínas de superficie celular, tales como las proteínas que se sobreexpresan en determinadas enfermedades de tipo inmunológico, son dianas excelentes para fármacos candidatos o para el tratamiento de enfermedades. Las mismas proteínas conjuntamente con proteínas secretadas codificadas por los genes amplificados en los estados de enfermedad de tipo inmunológico encuentran un uso adicional en el diagnóstico y prognóstico de estas enfermedades. Por ejemplo, los anticuerpos dirigidos contra los productos proteína de genes amplificados en la esclerosis múltiple, la artritis reumatoide u otra enfermedad de tipo inmunológico, pueden utilizarse como diagnósticos o prognósticos.

Por ejemplo, los anticuerpos, incluyendo los fragmentos de anticuerpo, pueden utilizarse para detectar cualitativa o cuantitativamente la expresión de proteínas codificadas por genes amplificados o sobreexpresados ("productos génicos marcadores"). El anticuerpo preferentemente está dotado de un marcaje detectable, por ejemplo fluorescente, y la unión puede seguirse mediante microscopía óptica, citometría de flujo, fluorimetría u otras técnicas conocidas de la técnica. Estas técnicas resultan particularmente adecuadas si el gen sobreexpresado codifica una proteína de superficie celular. Estos ensayos de unión se llevan a cabo esencialmente tal como se ha descrito anteriormente.

La detección in situ de la unión de anticuerpos a los productos génicos marcadores puede llevarse a cabo, por ejemplo, mediante inmunofluorescencia o mediante microscopía inmunoelectrónica. Para este fin, se extrae un espécimen histológico del paciente y se aplica al mismo un anticuerpo marcado, preferentemente recubriendo con el anticuerpo una muestra biológica. Este procedimiento también permite determinar la distribución del producto génico marcador en el tejido examinado. Resultará evidente para los expertos en la materia que se encuentran fácilmente disponibles una amplia diversidad de procedimientos histológicos para la detección in situ.

Los ejemplos siguientes se ofrecen únicamente a título ilustrativo, y no pretenden limitar el alcance de la presente invención en modo alguno.

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplos

Los reactivos disponibles comercialmente a los que se hace referencia en los ejemplos se utilizaron siguiendo las instrucciones del fabricante, a menos que se indique lo contrario. La fuente de las células identificadas en los ejemplos siguientes, y en toda la memoria, por los números de acceso de la ATCC es la American Type Culture Collection, Manassas, VA.

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplo 1 Cribado por homología de dominio extracelular para identificar nuevos polipéptidos y ADNc codificante de los mismos

Se utilizaron para la búsqueda en las bases de datos EST las secuencias de dominio extracelular (ECD) (incluyendo la secuencia de señal de secreción, en caso de estar presente) de entre aproximadamente 950 proteínas secretadas conocidas de la base de datos pública Swiss-Prot. Las bases de datos EST incluían bases de datos públicas (por ejemplo Dayhoff, GenBank) y bases de datos propietarias (por ejemplo LIFESEQ^{TM}, Incyte Pharmaceuticals, Palo Alto, CA). La búsqueda se llevó cabo utilizando el programa informático BLAST o BLAST-2 (Altschul et al., Methods in Enzymology 266:460-480, 1996) como comparación de las secuencias proteicas de ECD con una traducción de 6 marcos de las secuencias de EST. Aquellas comparaciones con una puntuación BLAST de 70 (o en algunos casos 90) o superior que no codificaban ninguna proteína conocida se agruparon y se ensamblaron en secuencias de ADN de consenso con el programa "phrap" (Phil Green, University of Washington, Seattle, WA).

Utilizando este cribado de homología de dominio extracelular, se ensamblaron secuencias de ADN de consenso respecto a las demás secuencias de EST identificadas utilizando phrap. Además, las secuencias de ADN de consenso obtenidas con frecuencia (aunque no en todo caso) se extendieron utilizando ciclos repetidos de BLAST o de BLAST-2 y de phrap para extender la secuencia de consenso lo máximo posible utilizando las fuentes de secuencias de EST comentadas anteriormente.

Basándose en las secuencias de consenso obtenidas tal como se ha descrito anteriormente, seguidamente se sintetizaron oligonucleótidos y se utilizaron para identificar mediante PCR una biblioteca de ADNc que contenía la secuencia de interés y para la utilización como sondas para aislar un clon de la secuencia codificante de longitud completa de un polipéptido PRO. Los cebadores de PCR directos e inversos generalmente presentan entre 20 y 30 nucleótidos y con frecuencia se diseñan para proporcionar un producto PCR de una longitud aproximada de entre 100 y 1.000 pb. Las secuencias de sonda típicamente presentan una longitud de entre 40 y 55 pb. En algunos casos, se sintetizan oligonculeótidos adicionales en el caso de que la secuencia de consenso sea mayor de aproximadamente 1 a 1,5 kpb. Con el fin de cribar varias bibliotecas para un clon de longitud completa, se cribó el ADN de las bibliotecas mediante amplificación por PCR, tal como en Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, con el par de cebadores de PCR. A continuación, se utilizó una biblioteca positiva para aislar clones codificantes del gen de interés utilizando el oligonucleótido sonda y una de las parejas de cebadores.

Se construyeron las bibliotecas de ADNc para aislar los clones de ADNc mediante procedimientos estándares utilizando reactivos disponibles comercialmente, tales como los de Invitrogen, San Diego, CA. El ADNc se cebó con oligo-dT que contenía un sitio NotI, se unió con un extremo romo a adaptadores Sail semiquinasados, se cortó con NotI, se determinó su tamaño apropiadamente mediante electroforesis en gel, y se clonó en una orientación definida en un vector de clonación adecuado (tal como pRKB o pRKD; pRK5B es un precursor de pRK5D que no contiene el sitio Sfil; ver Holmes et al., Science 253:1278-1280, 1991) en los sitios únicos XhoI y NotI.

Ejemplo 2 Aislamiento de clones de ADNc utilizando una búsqueda específica de la base de datos

Se identificaron las secuencias de ácidos nucleicos codificantes de polipéptido mediante la utilización del programa informático BLAST o BLAST2 (Altschul et al., Methods in Enzymology 266:460-480, 1996) para buscar los homólogos de genes específicos en bases de datos públicas (por ejemplo GenBank) y/o privadas (LIFESEQ®, Incyte Pharmaceuticals, Inc., Palo Alto, CA). En este caso, los investigadores utilizaron un único gen identificado anteriormente como secuencia de búsqueda para buscar los homólogos relacionados. La significancia de la homología se determinó caso por caso para cada gen. Cada vez que se encontraba una homología significativa, resultaba la identificación de secuencias de EST adicionales que correspondían a clones de longitud completa, que se examinaron y se secuenciaron o que sirvieron de molde para la creación de oligonucleótidos de clonación que seguidamente se utilizaron para cribar diversas bibliotecas de tejidos, resultando en el aislamiento del ADN codificante de un polipéptido PRO de secuencia nativa.

Ejemplo 3 Aislamiento de clones de ADNc utilizando análisis de algoritmo de señales

Se identificaron diversas secuencias de ácidos nucleico mediante la aplicación de un algoritmo propietario de búsqueda de secuencias de señal desarrollado por Genentech, Inc. (South San Francisco, CA) en ESTs, así como en fragmentos de EST agrupados y ensamblados procedentes de bases de datos públicas (por ejemplo GenBank) y/o privadas (LIFESEQ®, Incyte Pharmaceuticals, Inc., Palo Alto, CA). El algoritmo de secuencia de señal computa una puntuación de señal de secreción basada en el carácter de los nucleótidos de ADN circundantes al primer y opcionalmente el segundo codón o codones de metionina (ATG) en el extremo 5' de la secuencia o fragmento de secuencia en consideración. Los nucleótidos después del primer ATG deben codificar por lo menos 35 aminoácidos no ambiguos sin ningún codón de parada. Si el primer ATG presenta los aminoácidos requeridos, el segundo no se examine. Si ninguno de ellos cumple el requisito, la secuencia candidata no se puntúa. Con el fin de determinar si la secuencia de EST contiene una secuencia de señal auténtica, el ADN y las secuencias de aminoácidos correspondientes circundantes al codón ATG se puntúan utilizando un conjunto de siete sensores (parámetros de evaluación) que es conocido que se encuentra asociado a señales de secreción. La utilización de este algoritmo resultó en la identificación de numerosas secuencias de ácidos nucleicos codificantes de polipéptidos.

Ejemplo 4 Aislamiento de clones de ADNc codificante de polipéptidos PRO humanos

Utilizando las técnicas descritas en los Ejemplos 1 a 3 anteriormente, se identificaron numerosos clones de ADNc de longitud completa como codificantes de polipéptidos PRO tal como se da a conocer en la presente invención. A continuación, se depositaron estos ADNc bajo los términos del Tratado de Budapest en la American Type Culture Collection, 10801 University Blvd., Manassas, VA 20110-2209, USA (ATCC) tal como se muestra en la Tabla 7, a continuación.

TABLA 7

22

Ejemplo 5 Actividad estimuladora en el ensayo de reacción de linfocitos mixtos (MLR) (nº 24)

El presente ejemplo muestra que los polipéptidos de la invención son activos como estimuladores de la proliferación de los linfocitos T. Los compuestos que estimulan la proliferación de los linfocitos resultan útiles terapéuticamente en el caso de resulte beneficiosa una intensificación de la respuesta inmunológica. Un agente terapéutico también puede adoptar la forma de antagonistas de los polipéptidos PRO de la invención, por ejemplo anticuerpos humanos o humanizados quiméricos murino-humanos contra el polipéptido, que se esperaría que inhibiesen la proliferación de los linfocitos T.

El protocolo básico de este ensayo se describe en Current Protocols in Immunology, unidad 3.12, editado por J.B. Coligan, A.M. Kruisbeek, D.H. Marglies, E.M. Shevach, W. Strober, National Institutes of Health, publicado por John Wiley & Sons, Inc.

Más específicamente, en una variante de ensayo, se aislaron células mononucleares de sangre periférica (PBMC) procedente de individuos mamíferos, por ejemplo de un voluntario humano, mediante leucoféresis (un donante proporciona PBMCs estimuladoras, el otro donante proporciona PBMCs respondedoras). Si se desea, las células se congelan en suero de feto bovino y DMSO tras el aislamiento. Las células congeladas pueden descongelarse durante la noche en medio de ensayo (37ºC, 5% de CO_{2}) y después se lavan y se resuspenden hasta 3 x 10^{6} células/ml de medio de ensayo (RPMI: suero de feto bovino al 10%, penicilina/estreptomicina al 1%, glutamina al 1%, HEPES al 1%, aminoácidos no esenciales al 1%, piruvato al 1%).

Se prepararon las PBMCs estimuladoras mediante irradiación de las células (aproximadamente 3.000 Rads). El ensayo se preparó mediante siembra en placa en pocillos por triplicado de una mezcla de: 100 \mul de muestra de ensayo diluida hasta el 1% o hasta el 0,1%; 50 \mul de células estimuladoras irradiadas y 50 \mul de células PBMC respondedoras. Se utilizó como control 100 microlitros de medio de cultivo celular o 100 microlitros de CD4-IgG. A continuación, los pocillos se incubaron a 37ºC, 5% de CO_{2}, durante 4 días. El día 5 cada pocillo se pulsó con timidina "inflada" (1,0 mCi/pocillo; Amersham). Tras 6 horas, las células se lavaron 3 veces y después se evaluó la incorporación del marcaje.

En otra variante del presente ensayo, se aislaron PBMCs de bazos de ratones Balb/c y ratones C57B6. Las células se separaron de bazos recién recolectados en medio de ensayo (RPMI; suero de feto bovino al 10%, penicilina/estreptomicina al 1%, glutamina al 1%, HEPES al 1%, aminoácidos no esenciales al 1%, piruvato al 1%) y las PBMCs se aislaron recubriendo estas células sobre Lympholyte M (Organon Teknika), se centrifugaron a 2.000 rpm durante 20 minutos, recogiendo y lavando la capa celular mononuclear en medio de ensayo y resuspendiendo las células hasta una densidad de 1 x 10^{7} células/ml de medio de ensayo. A continuación, el ensayo se llevó a cabo tal como se ha descrito anteriormente. Los resultados de este ensayo para compuestos de la invención se muestran posteriormente, en la Tabla 8. Los incrementos positivos respecto al control se consideran positivos, resultando preferentes los incrementos superiores o iguales al 180%. Sin embargo, cualquier valor superior al control indica un efecto estimulador para la proteína de ensayo.

TABLA 8

23

Ejemplo 7 Hibridación in situ

La hibridación in situ es una técnica potente y versátil para la detección y localización de las secuencias de ácidos nucleicos en preparaciones de células o de tejidos. Puede resultar útil, por ejemplo, identificar los sitios de expresión génica, analizar la distribución en tejidos de la transcripción, identificar y localizar la infección vírica, seguir los cambios en la síntesis de ARNm específico y ayudar en el mapado de cromosomas.

La hibridación in situ se llevó a cabo siguiendo una versión optimizada del protocolo de Lu y Gillett, Cell Vision 1:169-176, 1994, utilizando ribosondas marcadas con ^{33}P generadas por PCR. Brevemente, se seccionaron, desparafinaron, desproteinizaron en proteinasa K (20 mg/ml) durante 15 minutos a 37ºC tejidos fijados con formalina e incluidos en parafina, y se procesaron adicionalmente para la hibridación in situ tal como describen Lu y Gillett, supra. Se generó una ribosonda antisentido marcada con [^{33}P]UTP a partir de un producto de PCR y se hibridó a 55ºC durante la noche. Los portaobjetos se sumergieron en emulsión de trazas nucleares NTB2 Kodak y se expusieron durante 4 semanas.

\vskip1.000000\baselineskip

Síntesis de ^{33}P-ribosonda

Se sometieron a secado rápido al vacío 6,0 \mul (125 mCi) de ^{33}P-UTP (Amersham BF 1002, SA < 2.000 Ci/mmoles). A cada tubo que contenía ^{33}P-UTP seco, se añadieron los ingredientes siguientes: 2,0 \mul de 5x tampón de transcripción, 1,0 \mul de DTT (100 mM), 2,0 \mul de mezcla de NTP (2,5 mM: 10 \mul; cada uno de entre GTP, CTP y ATP 10 mM + 10 \mul de H_{2}O), 1,0 \mul de UTP (50 \muM), 1,0 \mul de Rnasin, 1,0 \mul de molde de ADN (1 \mug), 1,0 \mul de H_{2}O.

Los tubos se incubaron a 37ºC durante una hora. Se añadió 1,0 \mul de ADNasa RQ1, seguido de incubación a 37ºC durante 15 minutos. Se añadieron 90 \mul de TE (Tris 10 mM, pH 7,6/EDTA 1 mM, pH 8,0) y la mezcla se pipeteó sobre papel DE81. La solución restante se cargó en una unidad de ultrafiltración Microcon-50 y se centrifugó utilizando el programa 10 (6 minutos). La unidad de filtración se invirtió sobre un segundo tubo y se centrifugó utilizando el programa 2 (3 minutos). Tras la centrifugación final de recuperación, se añadieron 100 \mul de TE. Se pipeteó 1 \mul del producto final sobre papel DE81 y se contó en 6 ml de Biofluor II.

La sonda se corrió en un gel de TBE/urea. Se añadieron 1 a 3 \mul de la sonda o 5 \mul de ARN Mrk III a 3 \mul de tampón de carga. Tras calentar en un bloque calefactor de 95ºC durante tres minutos, el gel se introdujo inmediatamente en hielo. Los pocillos de gel se enjuagaron, se cargó la muestra y se corrió a 180 a 250 voltios durante 45 minutos. El gel se envolvió en envoltorio Saran y se expuso a película XAR con una pantalla intensificadora en un congelador de -70ºC durante un periodo de entre una hora y toda la noche.

\vskip1.000000\baselineskip

Hibridación de ^{33}P

Pretratamiento de secciones congeladas. Los portaobjetos se extrajeron del congelador, se colocaron sobre bandejas de aluminio y se descongelaron a temperatura ambiente durante 5 minutos. Las bandejas se introdujeron en un incubador a 55ºC durante cinco minutos para reducir la condensación. Los portaobjetos se fijaron durante 10 minutos en paraformaldehído al 4% sobre hielo en la campana de humos, y se lavaron en 0,5 x SSC durante 5 minutos, a temperatura ambiente (25 ml 20 x SSC + 975 ml de H_{2}O SQ). Tras la desproteinización en proteinasa K 0,5 \mug/ml durante 10 minutos a 37ºC (12,5 \mul de solución madre 10 mg/ml en 250 ml de tampón ARNasa libre de ARNasa precalentado), las secciones se lavaron en 0,5 x SSC durante 10 minutos a temperatura ambiente. Las secciones se deshidrataron 2 minutos cada vez en etanol al 70%, al 95% y al 100%.

Pretratamiento de secciones incluidas en parafina. Los portaobjetos se desparafinaron, se introdujeron en SQ H_{2}O y se enjuagaron dos veces en 2 x SSC a temperatura ambiente, durante 5 minutos cada vez. Las secciones se desproteinizaron en 20 \mug/ml de proteinasa K (500 \mul de 10 mg/ml en 250 ml de tampón ARNasa libre de ARNasa, 37ºC, 15 minutos) - embrión humano, o en 8 x proteinasa K (100 \mul en 250 ml de tampón ARNasa, 37ºC, 30 minutos) - tejidos en formalina. El enjuague posterior en 0,5 x SSC y la deshidratación se llevaron a cabo tal como se ha descrito anteriormente.

Prehibridación. Los portaobjetos se colocaron en una caja de plástico revestida de papel de filtro saturado de tampón Box (4 x SSC, formamida al 50%). El tejido se recubrió con 50 \mul de tampón de hibridación (3,75 g de dextrán sulfato + 6 ml de H_{2}O SQ), se centrifugó con vórtex y se calentó en el microondas durante 2 minutos con la tapa aflojada. Tras enfriar sobre hielo, se añadieron 18,75 ml de formamida, 3,75 ml de 20 x SSC y 9 ml de SQ H_{2}O, el tejido se centrifugó bien con vórtex y se incubó a 42ºC durante 1 a 4 horas.

Hibridación. Se calentaron 1,0 x 10^{6} cp. de sonda y 1,0 \mul de ARN (50 mg/ml de solución madre) por cada portaobjetos a 95ºC durante 3 minutos. Los portaobjetos se enfriaron sobre hielo y se añadieron 48 \mul de tampón de hibridación a cada portaobjetos. Tras centrifugaron con vórtex, se añadieron 50 \mul de mezcla de ^{33}P a 50 \mul de prehibridación en el portaobjetos. Los portaobjetos se incubaron durante la noche a 55ºC.

Lavados. El lavado se realizó 2x10 minutos con 2xSSC, EDTA a temperatura ambiente (400 ml de 20 x SSC + 16 ml de EDTA 0,25 M, V_{f}=4L), seguido del tratamiento con ARNasa A a 37ºC durante 30 minutos (500 \mul de 10 mg/ml en 250 ml de tampón ARNasa - 20 \mug/ml). Los portaobjetos se lavaron 2x10 minutos con 2 x SSC, EDTA a temperatura ambiente. Las condiciones de lavado de astringencia era el siguiente: 2 horas a 55ºC, 0,1 x SSC, EDTA (20 ml de 20 x SSC + 16 ml de EDTA, V_{f}=4L).

Alternativamente, se adquirieron de Clontech (Palo Alto, CA) filtros multi-tejido que contenían poliA + ARN (2 \mug por carril) procedentes de diversos tejidos humanos. Se marcaron sondas de ADN con [\alpha-^{32}P]dCTP mediante cebado aleatorio de perlas de marcaje de ADN (Pharmacia Biotech). La hibridación se llevó a cabo con Expresshyb (Clontech) a 68ºC durante 1 hora. Los filtros seguidamente se lavaron con 2X SSC/solución de SDS al 0,05% a temperatura ambiente durante 40 minutos, seguido de lavados en 0,1X SSC/solución de SDS al 0,1% a 55ºC durante 40 minutos con un cambio de solución fresca. Los filtros se expusieron en un PhosphorImager.

Este procedimiento se utilizó para determinar la expresión génica, analizar la distribución en tejidos de la transcripción y para realizar el seguimiento de los cambios en la síntesis de ARNm específico para los genes/ADNs y las proteínas de la invención en tejidos enfermos aislados de individuos humanos que sufren de una enfermedad específica. Estos resultados muestran más específicamente dónde en los tejidos enfermos se expresan los genes de la invención y dónde son más predictivos de la localización particular del efecto terapéutico de los compuestos inhibidores o estimuladores de la invención (y agonistas o antagonistas de los mismos) en una enfermedad. La hibridación se llevó a cabo según el procedimiento descrito anteriormente utilizando uno o más de las muestras de tejidos y de células siguientes:

(a): linfocitos y células presentadoras de antígeno (células dendríticas, células de Langherhans, macrófagos y monocitos, células NK),

(b): tejidos linfoides: nódulo linfático normal y reactivo, timo, tejidos linfoides asociados a bronquios (BALT), tejidos linfoides asociados a mucosas (MALT),

(c): tejidos enfermos humanos:

\bullet: sinovio y articulación de pacientes con artritis y enfermedad articular degenerativa,

\bullet: colon, de pacientes con enfermedad intestinal inflamatoria, incluyendo la colitis ulcerosa y la enfermedad de Crohn,

\bullet: lesiones de la piel, de soriasis y de otras formas de dermatitis,

\bullet: tejido pulmonar, incluyendo BALT y tejido de nódulos linfáticos de bronquitis crónica y aguda, neumonía, neumonitis, pleuritis,

\bullet: tejido pulmonar, incluyendo BALT, y tejido de nódulo linfático de asma,

\bullet: tejido nasal y de seno, de pacientes con rinitis o sinusitis,

\bullet: cerebro y médula espinal, de esclerosis múltiple, enfermedad de Alzheimer e ictus,

\bullet: riñón, de nefritis, glomerulonefritis y lupus eritematoso sistémico,

\bullet: hígado, de hepatitis infecciosa y no infecciosa y de cirrosis hepática inducida por acetaminofeno,

\bullet: tejidos de neoplasmas/cáncer.

\vskip1.000000\baselineskip

Se observó la expresión en una o más muestras de células o de tejidos que indican la localización del efecto terapéutico de los compuestos de la invención (y agonistas o antagonistas de los mismos) en la enfermedad asociada a la muestra de células o de tejidos.

\vskip1.000000\baselineskip

Expresión de DNA60764-1533 en tumores

Se examinaron quince tumores pulmonares (8 adenocarcinomas y 7 carcinomas escamosos). La mayoría de los tumores mostraba algún nivel de expresión de DNA60764-1533. La expresión se encontraba en gran parte restringida a las células mononucleares contiguas al tumor infiltrante. En un tumor específico (26A3), un carcinoma escamoso, aparentemente existía expresión en epitelio maligno. En otro caso existía expresión de DNA60764-1533 sobre células mononucleares en intersticio renal dañado y en células intersticiales en un carcinoma de células renales. Existía expresión de DNA60764-1533 sobre células en la médula tímica fetal. La expresión se encontraba sobre células en un centro germinal, consistente con el hecho de que la mayoría de las células positivas de Fig-1 probablemente presentaban un origen inflamatorio. Se utilizaron las sondas siguientes para el estudio in situ:

5'-GGATTCTAATACGACTCACTATAGGGCCGCGCTGTCCTGCTGTCACCA-3'

\hskip0.3cm

(60764.p1 SEC ID nº 15)

5'-CTATGAAATTAACCCTCACTAAAGGGAGTTCCCCTCCCCGAGAAGATA-3'

\hskip0.3cm

(60764.p2 SEC ID nº 16)

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplo 8 Utilización de PRO como sonda de hibridación

El procedimiento siguiente describe la utilización de una secuencia de nucleótidos codificante de PRO como sonda de hibridación.

Se utilizó el ADN que comprendía la secuencia codificante de PRO de longitud completa o maduro como sonda para cribar los ADNs homólogos (tales como aquellos codificantes de variantes naturales de PRO) en bibliotecas de ADNc de tejido humano o en bibliotecas genómicas de tejido humano.

La hibridación y el lavado de filtros que contenían cualquiera de los ADN de biblioteca se llevó a cabo bajo las condiciones de elevada astringencia indicadas a continuación. La hibridación de sonda derivada de PRO marcada radioactivamente con los filtros se llevó a cabo en una solución de formamida al 50%, 5x SSC, SDS al 0,1%, pirofosfato sódico al 0,1%, fosfato sódico 50 mM, pH 6,8, 2x solución de Denhardt y dextrán sulfato al 10%, a 42ºC durante 20 horas. El lavado de los filtros se llevó a cabo en una solución acuosa de 0,1x SSC y SDS al 0,1% a 42ºC.

Los ADNs que presentaban una identidad de secuencia deseada con el ADN codificante del PRO de secuencia nativa de longitud completa seguidamente pudieron identificarse utilizando técnicas estándares conocidas de la técnica.

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplo 9 Expresión de PRO en E. coli

El presente ejemplo ilustra la preparación de una forma no glucosilada de PRO mediante expresión recombinante en E. coli.

La secuencia de ADN codificante de PRO se amplificó inicialmente utilizando cebadores de PCR seleccionados. Los cebadores debían contener sitios de enzimas de restricción correspondientes a los sitios de enzima de restricción en el vector de expresión seleccionado. Puede utilizarse una diversidad de vectores de expresión. Un ejemplo de un vector adecuado es pBR322 (derivado de E. coli; ver Bolivar et al., Gene 2:95, 1977), que contiene genes para resistencia a la ampicilina y a la tetraciclina. El vector se digiere con enzima de restricción y se desfosforila. Las secuencias amplificadas por PCR seguidamente se ligan en el vector. El vector preferentemente incluye secuencias que codifican un gen de resistencia a antibiótico, un promotor trp, un líder polihis (incluyendo los primeros seis codones STII, la secuencia polihis y el sitio de corte de enteroquinasa), la región codificante de PRO, el terminador transcripcional lambda y un gen argU.

A continuación se utilizó la mezcla de ligación para transformar una cepa de E. coli seleccionada utilizando los procedimientos descritos en Sambrook et al., supra. Se identificaron los transformante por su capacidad de crecer en placas de LB y seguidamente se seleccionaron las colonias resistentes a antibiótico. El plásmido de ADN puede aislarse y confirmarse mediante análisis de restricción y secuenciación de ADN.

Los clones seleccionados pueden cultivarse durante la noche en medio de cultivo líquido, tal como caldo LB suplementado con antibióticos. El cultivo de durante la noche posteriormente puede utilizarse para inocular un cultivo a mayor escala. A continuación, se cultivan las células hasta una densidad óptica deseada, periodo durante el que se activa el promotor de expresión.

Tras cultivar las células durante varias horas más, las células pueden recolectarse mediante centrifugación. El pellet celular obtenida mediante la centrifugación puede solubilizarse utilizando diversos agentes conocidos de la técnica, y la proteína PRO solubilizada seguidamente puede purificarse utilizando una columna quelante de metales bajo condiciones que permitan la unión fuerte de la proteína.

PRO puede expresarse en E. coli en una forma etiquetada con poli-His utilizando el procedimiento siguiente. El ADN codificante de PRO se amplifica inicialmente utilizando cebadores de PCR seleccionados. Los cebadores contendrán sitios de enzima de restricción que corresponden a los sitios de enzima de restricción en el vector de expresión seleccionado y otras secuencias útiles que proporcionan un inicio de traducción eficiente y fiable, la rápida purificación en una columna quelante de metales y la eliminación proteolítica con enteroquinasa. Las secuencias etiquetadas con poli-His amplificadas por PCR seguidamente se ligan en un vector de expresión, que se utiliza para transformar un huésped E. coli basado en la cepa 52 (W3110 fuhA(tonA)lon galE rpoHts(htpRts)clpP(laclq). Los trnsformantes en primer lugar se cultivan en LB que contiene 50 mg/ml de carbenicilina a 30ºC bajo agitación hasta alcanzar una D.O.600 de 3 a 5. A continuación, los cultivos se diluyen 50 a 100 veces en medio CRAP (preparado mediante la mezcla de 3,57 g de (NH_{4})_{2}SO_{4}, 0,71 g de citrato sódico\cdot2H_{2}O, 1,07 g de KCl, 5,36 g de extracto de levadura Difco, 5,36 g de hicasa SF de Sheffield en 500 ml de agua, así como MPOS 110 mM, pH 7,3, glucosa al 0,55% (p/v) y MgSO_{4} 7 mM) y se cultivan durante aproximadamente 20 a 30 horas a 30ºC bajo agitación. Las muestras se extraen para verificar la expresión mediante análisis de SDS-PAGE, y el cultivo base se centrifuga para peletizar las células. Los pellets celulares se congelan hasta el momento de la purificación y replegamiento.

Se resuspende pasta de E. coli procedente de fermentaciones de 0,5 1 litro (pellets de 6 a 10 g) en 10 volúmenes (p/v) en tampón de guanidina 7 M, Tris 20 mM, pH 8. Se añaden sulfito sódico sólido y tetrationato sódico para alcanzar concentraciones finales de 0,1 M y 0,02 M, respectivamente, y la solución se agita durante la noche a 4ºC. Esta etapa resulta en una proteína desnaturalizada con todos los residuos de cisteína bloqueados mediante sulfitolización. La solución se centrifuga a 40.000 rpm en una ultracentrífuga Beckman durante 30 minutos. El sobrenadante se diluye con 3 a 5 volúmenes de tampón de columna de quelato metálico (guanidina 6 M, Tris 20 mM, pH 7,4) y se filtra a través de filtros de 0,22 micrómetros para clarificar. El extracto clarificado se carga en una columna de quelato metálico Ni-NTA Qiagen de 5 ml (Calbiochem, grado Utrol), pH 7,4. La proteína se eluye con tampón que contiene imidazol 250 mM. Las fracciones que contienen la proteína deseada se agrupan y se almacenan a 4ºC. La concentración de proteína se estima a partir de su absorbancia a 280 nm utilizando el coeficiente de extinción calculado basado en su secuencia de aminoácidos.

Las proteínas se replegaron mediante dilución de la muestra lentamente en tampón de replegamiento recién preparada consistente de: Tris 20 mM, pH 8,6, NaCl 0,3 M, urea 2,5 M, cisteína 5 mM, glicina 20 mM y EDTA 1 mM. Se seleccionaron los volúmenes de replegamiento de manera que la concentración final de proteína se encontrase entre 50 y 100 microgramos/ml. La solución de replegamiento se agitó suavemente a 4ºC durante 12 a 36 horas. La reacción de replegamiento se refrescó mediante la adición de TFA hasta una concentración final de 0,4% (pH de aproximadamente 3). Antes de la purificación adicional de la proteína, la solución se filtró a través de un filtro de 0,22 micrómetros y se añadió acetonitrilo hasta una concentración final de 2 a 10%. La proteína replegada se cromatografió en una columna de fase reversa Poros R1/H utilizando un tampón móvil de TFA al 0,1% con elución con un gradiente de acetontrilo de entre 10% y 80%. Se analizaron alícuotas de fracciones con absorbancia A_{280} en geles de SDS-poliacrilamida y las fracciones que contenían proteína replegada homogénea se agruparon. Generalmente, las especies replegadas correctamente de la mayoría de proteínas se eluyeron a las concentraciones más bajas de acetonitrilo debido a que estas especies son las más compactas, con sus interiores hidrofóbicos resguardados de la interacción con la resina de fase reversa. Las especies agregadas habitualmente se eluyen a concentraciones de acetonitrilo más altas. Además de resolver las formas mal plegadas de las proteínas respecto a la forma deseada, la etapa de fase inversa también elimina la endotoxina de las muestras.

Las fracciones que contenían el polipéptido PRO plegado deseado se agrupan y el acetonitrilo se elimina utilizando un flujo suave de nitrógeno dirigido a la solución. Las proteínas se formulan en Hepes 20 mM, pH 6,8 con cloruro sódico 0,14 M y manitol al 4% mediante diálisis o mediante filtración en gel utilizando resinas G25 Superfine (Pharmacia) equilibradas en el tampón de formulación y se filtran a esterilidad.

Muchos de los polipéptidos PRO dados a conocer en la presente invención se expresaron con éxito tal como se ha descrito anteriormente.

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplo 10 Expresión de PRO en células de mamífero

El presente ejemplo ilustra la preparación de una forma potencialmente glucosilada de PRO mediante expresión recombinante en células de mamífero.

El vector, pRK5 (ver la patente EP nº 307.247, publicada el 15 de marzo de 1989) se utilizó como vector de expresión. Opcionalmente el ADN de PRO se liga en pRK5 con enzimas de restricción seleccionados para permitir la inserción del ADN de PRO utilizando procedimientos de ligación tales como los descritos en Sambrook et al., supra. El vector resultante se denomina pRK5-PRO.

En una realización, las células huésped seleccionadas pueden ser células 293. Las células 293 humanas (ATCC nº CCL 1573) se cultivan hasta la confluencia en placas de cultivo de tejido en medio tal como DMEM suplementado con suero de feto bovino y opcionalmente con componentes nutritivos y/o antibióticos. Se mezclaron aproximadamente 10 \mug de ADN de pRKS-PRO con aproximadamente 1 \mug de ADN codificante del gen VA de ARN [Thimmappaya et al., Cell 31:543, 1982] y se disolvieron en 500 \mul de Tris-HCl 1 mM, EDTA 0,1 mM, CaCl_{2} 0,227 M. A esta mezcla se añadieron, gota a gota, 500 \mul de HEPES 50 mM (pH 7,35), NaCl 280 mM, NaPO_{4} 1,5 mM y se dejó que se formase un precipitado durante 10 minutos a 25ºC. El precipitado se suspendió y se añadió a las células 293 y se dejó sedimentar durante aproximadamente cuatro horas a 37ºC. El medio de cultivo se eliminó mediante aspiración y se añadieron a lo largo de 30 segundos 2 ml de glicerol al 20% en PBS. A continuación, se lavaron las células 293 con medio libre de suero, se añadió medio fresco y las células se incubaron durante aproximadamente 5 días.

Aproximadamente 24 horas después de las transfecciones se eliminó el medio de cultivo y se sustituyó por medio de cultivo (solo) o medio de cultivo que contenía 200 \muCi/ml de ^{35}S-cisteína y 200 \muCi/ml de ^{35}S-metionina. Tras una incubación de 12 horas, se recogió el medio condicionado, se concentró en un filtro de centrífuga y se cargó en un gel de SDS al 15%. El gel procesado puede secarse y exponerse a película durante un periodo de tiempo seleccionado para revelar la presencia de polipéptido PRO. Los cultivos que contenían células transfectadas puede someterse a incubación adicional (en medio libre de suero) y el medio someterse a ensayo en bioensayos seleccionados.

En una técnica alternativa, puede introducirse PRO en células 293 transitoriamente utilizando el procedimiento del dextrán sulfato, descrito por Somparyrac et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 12:7575, 1981. Las células 293 se cultivan hasta la densidad máxima en un matraz de agitación y se añadieron 700 \mug de ADN de pRK5-PRO. En primer lugar las células se concentran a partir del matraz de agitación mediante centrifugación y se lavan con PBS. El precipitado de ADN-dextrano se incuba en el pellet celular durante cuatro horas. Las células se tratan con glicerol al 20% durante 90 segundos, se lavan con medio de cultivo de tejidos y se reintroducen en el matraz de agitación que contiene medio de cultivo de tejidos, 5 \mug/ml de insulina bovina y 0,1 \mug/ml de transferrina bovina. Tras aproximadamente cuatro días, el medio condicionado se centrifuga y se filtra para eliminar las células y residuos. La muestra que contiene PRO expresado seguidamente puede concentrarse y purificarse mediante cualquier procedimiento seleccionado, tal como diálisis y/o cromatografía de columna.

En otra realización, PRO puede expresarse en células CHO. El plásmido pRK5-PRO puede transfectarse en células CHO utilizando reactivos conocidos, tales como CaPO_{4} o DEAE-dextrano. Tal como se ha descrito anteriormente, los cultivos celulares pueden incubarse y el medio sustituirse por medio de cultivo (solo) o medio que contiene un marcaje radioactivo tal como 35S-metionina. Tras determinar la presencia de polipéptido PRO, el medio de cultivo puede sustituirse por medio libre de suero. Preferentemente los cultivos se incubar durante aproximadamente 6 días y después se recolecta el medio condicionado. El medio que contiene PRO expresado seguidamente puede concentrarse y purificarse mediante cualquier procedimiento seleccionado.

También puede expresarse PRO etiquetado con epítopo en células CHO huésped. PRO puede subclonarse sacándolo del vector pRK5. La inserción de subclón puede someterse a PCR para fusionarlo en el mismo marco de lectura de una etiqueta epítopo seleccionada, tal como una etiqueta poli-his, en un vector de expresión baculovirus. La inserción de PRO etiquetado con poli-his seguidamente puede subclonarse en un vector que contiene promotor de SV40/intensificador, que contiene un marcador de selección tal como DHFR para la selección de los clones estables. Finalmente, las células CHO pueden transfectarse (tal como se ha descrito anteriormente) con el vector que contiene promotor de SV40/intensificador. El marcaje puede llevarse a cabo, tal como se ha descrito anteriormente, para verificar la expresión. El medio de cultivo que contiene PRO etiquetado con pol-his expresado seguidamente puede concentrarse y purificarse mediante cualquier procedimiento seleccionado, tal como cromatografía de afinidad de Ni^{2+}-quelato.

PRO también puede expresarse en células CHO y/o COS mediante un procedimiento de expresión transitoria o en células CHO mediante otro procedimiento de expresión estable.

La expresión estable en células CHO se lleva a cabo utilizando el procedimiento siguiente. Las proteínas se expresan en forma de un constructo de IgG (inmunoadhesina), en el que las secuencias codificantes para las formas solubles (por ejemplo los dominios extracelulares) de las proteínas respectivas se fusionan con una secuencia de región constante de IgG1 que contiene los dominios de bisagra CH2 y CH3 y/o una forma etiquetada con poli-His.

Tras la amplificación por PCR, los ADNs respectivos se subclonan en un vector de expresión CHO utilizando técnicas estándares, tal como se describe en Ausubel et al., Current Protocols of Molecular Biology, unidad 3.16, John Wiley and Sons, 1997. Los vectores de expresión CHO se construyen de manera que presenten sitios de restricción compatibles 5' y 3' del ADN de interés para permitir el transporte lanzadera de los ADNc. El vector utilizado para la expresión en células CHO es tal como se describe en Lucas et al., Nucl. Acids Res. 24:9 (1774-1779), 1996, y utiliza el promotor temprano/intensificador de SV40 para controlar la expresión del ADNc de interés y de la dihidrofolato reductasa (DHFR). La expresión de DHFR permite la selección para el mantenimiento estable del plásmido tras la transfección.

Se introdujeron doce microgramos del plásmido ADN deseado en aproximadamente 10 millones de células CHO utilizando los reactivos de transfección disponibles comercialmente Superfect® (Qiagen), Dosper® o Fugene® (Boehringer Mannheim). Las células se cultivaron tal como se describe en Lucas et al., supra. Se congelaron aproximadamente 3 x 10^{7} células en una ampolla para el crecimiento y producción posteriores, tal como se describe posteriormente.

Las ampollas que contenía el plásmido de ADN se descongelaron mediante introducción en un baño de agua y se mezclaron mediante centrifugación con vórtex. El contenido se pipeteó a un tubo de centrífuga que contenía 10 ml de medio y se centrifugó a 1.000 rpm durante 5 minutos. El sobrenadante se aspiró y las células se suspendieron en 10 ml de medio selectivo (0,2 \mum de PS20 filtrado con suero de feto bovino diafiltrado por 0,2 \mum al 5%). A continuación, se prepararon alícuotas de las células en una centrífuga de 100 ml que contenía 90 ml de medio selectivo. Tras 1 a 2 días, las células se transfirieron a una centrífuga de 250 ml llena de 150 ml de medio de crecimiento selectivo y se incubaron a 37ºC. Tras 2-3 días adicionales, se sembraron centrífugas de 250 ml, de 500 ml y de 2.000 ml con 3 x 10^{5} células/ml. Se intercambiaron los medios celulares por medios frescos mediante centrifugación y resuspensión en medio de producción. Aunque puede utilizarse cualquier medio adecuado de CHO, en efecto puede utilizarse un medio de producción descrito en la patente US nº 5.122.469, publicada el 16 de junio de 1992. Se sembró un matraz de agitación para producción de 3 litros a una densidad de 1,2 x 10^{6} células/ml. El día 0, se determinó el pH. El día 1, se muestreó el matraz y se inició la inyección de aire filtrado. El día 2, se muestreó el matraz, se elevó la temperatura hasta 33ºC, y se recolectaron 30 ml de glucosa 500 g/l y 0,6 ml de antiespumante al 10% (por ejemplo emulsión al 35% de polidimetilsiloxano, Dow Corning 365 emulsión de grado médico). Durante la producción se ajustó el pH según resultase necesario para mantenerlo a aproximadamente 7,2. Tras 10 días, o hasta que la viabilidad había caído por debajo de 70%, se recolectó el cultivo celular mediante centrifugación y filtración a través de un filtro de 0,22 \mum. El filtrado se almacenó a 4ºC o se cargó inmediatamente en columnas para la purificación.

Para los constructos etiquetados con poli-His, las proteínas se purificaron utilizando una columna Ni-NTA (Qiagen). Antes de la purificación se añadió imidazol al medio condicionado hasta una concentración de 5 mM. El medio condicionado se bombeó a una columna Ni-NTA de 6 ml equilibrada en Hepes 20 mM, pH 7,4; tampón que contenía NaCl 0,3 M e imidazol 5 mM a un caudal de 4-5 ml/minuto a 4ºC. Tras la carga, la columna se lavó con tampón de equilibración adicional y la proteína se eluyó con tampón de equilibración que contenía imidazol 0,25 M. La proteína altamente purificada posteriormente se desaló en un tampón de almacenamiento que contenía Hepes 10 mM, NaCl 0,14 M y manitol al 4%, pH 6,8, con una columna G25 Superfine de 25 ml (Pharmacia) y se almacenó a -80ºC.

Se purificaron constructos de inmunoadhesina (que contenían Fc) a partir del medio condicionado, de la manera siguiente. El medio condicionado se bombeó por una columna de proteína A de 5 ml (Pharmacia) que había sido equilibrada en tampón de fosfato sódico 20 mM, pH 6,8. Tras la carga, la columna se lavó extensivamente con tampón de equilibración previamente a la elución con ácido cítrico 100 mM, pH 3,5. La proteína eluida se neutralizó inmediatamente mediante la recolección de fracciones de 1 ml en tubos que contenían 275 \mul de tampón Tris 1 M, pH 9. Después, la proteína altamente purificada se desaló en tampón de almacenamiento, tal como se ha descrito anteriormente para las proteínas etiquetadas con poli-His. Se evaluó la homogeneidad con geles de SDS-poliacrilamida y mediante secuenciación de aminoácidos N-terminales a través de degradación Edman.

Muchos de los polipéptidos PRO dados a conocer en la presente invención se expresaron con éxito de la manera descrita anteriormente.

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplo 11 Expresión de PRO en levaduras

El procedimiento siguiente describe la expresión recombinante de PRO en levaduras.

En primer lugar se construyeron vectores de expresión levaduras para la producción intracelular o la secreción de PRO a partir del promotor ADH2/GAPDH. Se insertó ADN codificante de PRO y el promotor en sitios de enzima de restricción adecuados en el plásmido seleccionado para dirigir la expresión intracelular de PRO. Para la expresión, puede clonarse ADN codificante de PRO en el plásmido seleccionado, conjuntamente con ADN codificante del promotor ADH2/GAPDH, un péptido de señal nativo de PRO u otro péptido de señal de mamífero o, por ejemplo, un factor alfa de levadura o secuencia de señal secretoria de invertasa/secuencia líder y secuencias línker (en caso necesario) para la expresión de PRO.

Las células de levadura, tales como la cepa de levadura AB110, seguidamente pueden transformarse con los plásmidos de expresión indicados anteriormente y cultivarse en medios de fermentación seleccionados. Los sobrenadantes de las levaduras transformadas pueden analizarse mediante precipitación con ácido tricloroacético al 10% y separación mediante SDS-PAGE, seguido de tinción de los geles con tinción de azul de Coomassie.

Posteriormente puede aislarse y purificarse PRO recombinante mediante eliminación de las células de levadura del medio de fermentación mediante centrifugación y después concentrando el medio utilizando filtros de cartucho seleccionados. El concentrado que contenía PRO además puede purificarse utilizando resinas de cromatografía de columna seleccionadas.

Ejemplo 12 Expresión de PRO en las células de insecto infectadas por baculovirus

El procedimiento siguiente describe la expresión recombinante de PRO en células de insecto infectadas por baculovirus.

La secuencia codificante de PRO se fusiona corriente arriba de una etiqueta epítopo contenida dentro de un vector de expresión baculovirus. Entre estas etiquetas epítopo se incluyen etiquetas poli-his y etiquetas de inmunoglobulina (como regiones Fc de IgG). Puede utilizarse una diversidad de plásmidos, incluyendo plásmidos derivados de plásmidos disponibles comercialmente, tales como pVL1393 (Novagen). Brevemente, la secuencia codificante de PRO o la parte deseada de la secuencia codificante de PRO, tal como la secuencia codificante del dominio extracelular de una proteína transmembranal o la secuencia codificante e la proteína madura si la proteína es extracelular, se amplifican por PCR con cebadores complementarios a las regiones 5' y 3'. El cebador 5' puede incorporar sitios de enzima de restricción flanqueantes (seleccionados). A continuación, el producto se digiere con dichos enzimas de restricción seleccionados y se subclona en el vector de expresión.

Se generaron baculovirus recombinantes mediante cotransfección del plásmido anteriormente indicado y ADN de virus BaculoGold^{TM} (Pharmingen) en células de Spodoptera frugiperda ("Sf9") (ATCC nº CRL 1711) utilizando lipofectina (disponible comercialmente de GIBCO-BRL). Tras 4 a 5 días de incubación a 28ºC, los virus liberados se recolectaron y se utilizaron para amplificaciones adicionales. La infección vírica y la expresión de proteínas se llevaron a cabo tal como describe O'Reilley et al., Baculovirus expression vectores: A Laboratory Manual, Oxford, Oxford University Press, 1994.

A continuación, pueden purificarse PRO etiquetado con poli-his expresado, por ejemplo mediante cromatografía de afinidad de Ni^{2+}-quelato de la manera siguiente. Se prepararon extractos a partir de células Sf9 infectadas por virus recombinante tal como describen Rupert et al., Nature 362:175-179, 1993. Brevemente, se lavaron células Sf9, se resuspendieron en tampón de sonicación (25 ml de Hepes, pH 7,9; MgCl_{2} 12,5 mM, EDTA 0,1 mM, glicerol al 10%, NP-40 al 0,1%, KCl 0,4 M) y se sonicaron dos veces durante 20 segundos sobre hielo. Los sonicados se clarificaron mediante centrifugación y el sobrenadante se diluyó 50 veces en tampón de carga (fosfato 50 mM, NaCl 300 mM, glicerol al 10%, pH 7,8) y se filtró a través a través de un filtro de 0,45 \mum. Se preparó una columna de agarosa Ni^{2+}-NTA (disponible comercialmente de Qiagen) con un volumen de lecho de 5 ml, se lavó con 25 ml de agua y se equilibró con 25 ml de tampón de carga. El extracto celular filtrado se cargó en una columna a un caudal de 0,5 ml por minuto. La columna se lavó hasta la línea base de A_{280} con tampón de carga, momento en el que se inició la recolección de fracciones. A continuación, la columna se lavó con un tampón de lavado secundario (fosfato 50 mM, NaCl 300 mM, glicerol al 10%, pH 6,0) que eluye no específicamente proteína unida. Tras alcanzar nuevamente la línea base de A_{280}, la columna se reveló con un gradiente de imidazol de 0 a 500 mM en el tampón de lavado secundario. Se recogieron fracciones de un ml y se analizaron mediante SDS-PAGE y tinción de plata o transferencia western con Ni^{2+}-NTA conjugado con fosfatasa alcalina (Qiagen). Las fracciones que contenían PRO etiquetado con His_{10} eluido se agruparon y se dializaron frente al tampón de carga.

Alternativamente, puede llevarse a cabo la purificación de PRO etiquetado con IgG (o etiquetado con Fc) utilizando técnicas conocidas de cromatografía, incluyendo, por ejemplo, cromatografía de columna de proteína A o de proteína G.

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplo 13 Preparación de anticuerpos que se unen a PRO

El presente ejemplo ilustra la preparación de anticuerpos monoclonales que pueden unirse específicamente a PRO.

Las técnicas para producir los anticuerpos monoclonales son conocidas de la técnica y se describen, por ejemplo, en Goding, supra. Entre los inmunógenos que pueden utilizarse se incluyen PRO purificado, proteínas de fusión que contienen PRO, y células que expresan PRO recombinante sobre la superficie celular. La selección del inmunógeno puede ser llevada a cabo por el experto en la materia sin experimentación indebida.

Se inmunizan ratones, tales como Balb/c, con el inmunógeno PRO emulsionado en adyuvante de Freund completo y reciben inyecciones subcutáneas o intraperitoneales en una cantidad de entre 1 y 100 microgramos. Alternativamente, el inmunógeno se emulsiona en adyuvante MPL-TDM (Ribi Immunochemical Research, Hamilton, MT) y se inyecta en las almohadillas plantares traseras del animal. A continuación, los ratones inmunizados reciben un refuerzo 10 a 12 días después de inmunógeno adicional emulsionado en el adyuvante seleccionado. Después, durante varias semanas, los ratones también pueden recibir un refuerzo con inyecciones de inmunización adicionales. Pueden obtenerse periódicamente muestras de suero de los ratones mediante sangrado retroorbital para el análisis en ensayos ELISA para la detección de anticuerpos anti-PRO.

Tras detectar un título de anticuerpos adecuado, los animales "positivos" para los anticuerpos pueden recibir una inyección intravenosa final de PRO. Tres a cuatro días después, los ratones se sacrifican y se recolectan las células de bazo. A continuación, las células de bazo se fusionan (utilizando polietilenglicol al 35%) con una línea celular de mieloma murino seleccionado, tal como P3X63AgU.1, disponible de ATCC nº CRL 1597. Las fusiones generan células de hibridoma que después pueden sembrarse en placas de cultivo de tejido de 96 pocillos que contienen medio HAT (hipoxantina, aminopterina y timidina) para inhibir la proliferación de las células no fusionadas, híbridos de mieloma e híbridos de células de bazo.

Las células de hibridoma se criban en una ELISA para la reactividad contra PRO. La determinación de las células de hibridoma "positivas" que secretan los anticuerpos monoclonales deseados contra PRO se encuentra dentro de los conocimientos disponibles de la técnica.

Las células de hibridoma positivos pueden inyectarse intraperitonealmente en los ratones Balb/c singénicos para producir ascites que contiene los anticuerpos monoclonales anti-PRO. Alternativamente, las células de hibridoma pueden cultivarse en matraces de cultivo de tejido o matraces giratorios. La purificación de los anticuerpos monoclonales producidos en el ascites puede conseguirse utilizando la precipitación con sulfato amónico, seguido de cromatografía de exclusión en gel. Alternativamente, puede utilizarse la cromatografía de afinidad basada en la unión de anticuerpos a la proteína A o a la proteína G.

Ejemplo 14 Purificación de polipéptidos PRO utilizando anticuerpos específicos

Pueden purificarse polipéptidos PRO nativos recombinantes mediante una diversidad de técnicas estándares de la técnica de la purificación de proteínas. Por ejemplo, se purifican pro-polipéptido PRO, polipéptido PRO maduro o pre-polipéptido PRO mediante cromatografía de inmunoafinidad utilizando anticuerpos específicos para el polipéptido PRO de interés. En general, se construye una columna de inmunoafinidad mediante acoplamiento covalente del anticuerpo anti-polipéptido PRO a una resina cromatográfica activada.

Se preparan inmunoglobulinas policlonales a partir de sueros inmunológicos mediante precipitación con sulfato amónico o mediante purificación en proteína A (Pharmacia LKB Biotechnology, Piscataway, N.J.). De manera similar, se preparan anticuerpos monoclonales a partir de líquido ascites de ratón mediante precipitación con sulfato amónico o cromatografía en proteína A inmovilizada. Se une covalentemente inmunoglobulina parcialmente purificada a una resina cromatográfica tal como SEPHAROSE TM activada con CnBr (Pharmacia LKB Biotechnology). El anticuerpo se acopló a la resina, la resina se bloqueó y la resina derivada se lavó siguiendo las instrucciones del fabricante.

Dicha columna de inmunoafinidad se utilizó en la purificación de polipéptido PRO mediante la preparación de una fracción a partir de células que contenían polipéptido PRO en una forma soluble. Esta preparación se derivó mediante solubilización de células completas o de una fracción subcelular obtenida mediante centrifugación diferencial mediante la adición de detergente o mediante otros procedimientos bien conocidos de la técnica. Alternativamente, puede secretarse en cantidad útil hacia el medio en que se cultivan las células polipéptido PRO soluble que contiene una secuencia de señal.

Se pasó una preparación que contenía polipéptido PRO soluble sobre la columna de inmunoafinidad, y la columna se lavó bajo condiciones que permitían la absorbancia preferente del polipéptido PRO (por ejemplo tampones de elevada fuerza iónica en presencia de detergente). A continuación, la columna se eluyó bajo condiciones que rompen la unión de anticuerpo/polipéptido PRO (por ejemplo un tampón de pH reducido, tal como aproximadamente 2-3, o una concentración elevada de un caótropo, tal como urea o ión tiocianato) y se recolectó polipéptido PRO.

Ejemplo 15 Cribado de fármacos

La presente invención resulta particularmente útil para cribar compuestos mediante la utilización de polipéptidos PRO o fragmento ligante del mismo en cualquiera de entre una diversidad de técnicas de cribado de fármacos. El polipéptido PRO o fragmento utilizado en dicho ensayo puede encontrarse libre en solución, fijo a un soporte sólido, sobre una superficie celular o ser intracelular. Un procedimiento de cribado de fármacos utiliza células huésped eucarióticas o procarióticas que se transforman establemente con ácidos nucleicos recombinantes que expresan el polipéptido PRO o fragmento. Los fármacos se criban frente a dichas células transformadas en ensayos de unión competitiva. Dichas células, en forma viable o fija, pueden utilizarse para ensayos de unión estándares. Se puede medir, por ejemplo, la formación de complejos entre el polipéptido PRO o un fragmento y el agente bajo ensayo. Alternativamente, puede examinarse la disminución en formación de complejo entre el polipéptido PRO y su célula diana o receptores diana causados por el agente bajo ensayo.

De esta manera, la presente invención proporciona procedimientos de cribado de fármacos o de cualquier otro agente que puede afectar a la enfermedad o trastorno asociado al polipéptido PRO. Estos procedimientos comprenden poner en contacto dicho agente con un polipéptido PRO o fragmento del mismo y someter a ensayo (i) para la presencia de un complejo entre el agente y el polipéptido PRO o fragmento, o (ii) para la presencia de un complejo entre el polipéptido PRO o fragmento y la célula, mediante procedimientos bien conocidos de la técnica. En estos ensayos de unión competitiva, el polipéptido PRO o fragmento típicamente se marca. Tras una incubación adecuada, el polipéptido PRO libre o fragmento se separa del presente en forma ligada, y la cantidad de marcaje libre o no acomplejado es una medida de la capacidad del agente particular de unirse a polipéptido PRO o de interferir con el polipéptido PRO/complejo celular.

Otra técnica de cribado de fármacos proporciona el cribado de alto rendimiento para compuestos que presentan una afinidad de unión adecuada con un polipéptido, y se describe en detalle en la patente WO nº 84/03564, publicada el 13 de septiembre de 1984. Brevemente, se sintetiza un gran número de diferentes compuestos de ensayo péptidos pequeños sobre un sustrato sólido, tal como clavos de plástico o alguna otra superficie. Tal como se aplican en un polipéptido PRO, los compuestos de ensayo péptidos se hacen reaccionar con polipéptido PRO y se lavan. El polipéptido PRO unido se detecta mediante procedimientos bien conocidos de la técnica. El polipéptido PRO purificado también puede recubrirse directamente sobre placas para la utilización en las técnicas de cribado de fármacos anteriormente indicadas. Además, pueden utilizarse anticuerpos no neutralizantes para capturar el péptido e inmovilizarlo sobre el soporte sólido.

La presente invención también contempla la utilización de ensayos de cribado competitivo de fármacos en los que anticuerpos neutralizadores capaces de unirse a polipéptido PRO compiten específicamente con un compuesto de ensayo para la unión al polipéptido PRO o a fragmentos del mismo. De esta manera, los anticuerpos pueden utilizarse para detectar la presencia de cualquier péptido que compara uno o más determinantes antigénicos con el polipéptido PRO.

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplo 16 Diseño racional de fármacos

El objetivo del diseño racional de fármacos es producir análogos estructurales del polipéptido biológicamente activo de interés (es decir de un polipéptido PRO) o de moléculas pequeñas con las que interaccionan, por ejemplo agonistas, antagonistas o inhibidores. Cualquiera de estos ejemplos puede utilizarse para diseñar fármacos que resultan más activos, o formas estables del polipéptido PRO o que intensifican o interfieren con la función del polipéptido PRO in vivo (c.f. Hodgson, Bio/Technology 9:19-21, 1991).

En un enfoque, se determina la estructura tridimensional del polipéptido PRO, o de un complejo inhibidor del polipéptido PRO, mediante cristalografía de rayos X, mediante modelado informático, o más típicamente, mediante una combinación de los dos enfoques. Debe determinarse tanto la forma como las cargas del polipéptido PRO para elucidar la estructura y para determinar el sitio o sitios activos de la molécula. Con menos frecuencia puede obtenerse información útil sobre la estructura del polipéptido PRO mediante modelado basado en la estructura de las proteínas homólogas. En ambos casos, se utiliza información estructural relevante para diseñar moléculas análogas de tipo polipéptido PRO o para identificar inhibidores eficientes. Entre los ejemplos útiles de diseño racional de fármacos pueden incluirse moléculas que presentan una actividad o estabilidad mejoradas tal como muestran Braxton y Wells, Biochemistry 31:7796-7801, 1992, o que actúan como inhibidores, agonistas o antagonistas de péptidos nativos, tal como muestran Athauda et al., J. Biochem. 113:742-746, 1993.

También resulta posible aislar un anticuerpo específico de diana, seleccionado mediante ensayo funcional, tal como se ha descrito anteriormente, y después resolver su estructura cristalina. Este enfoque, en principio, proporciona un farmacoro en el que puede basarse el diseño de fármaco posterior. Resulta posible evitar la cristalografía de proteínas por complejo mediante la generación de anticuerpos antiidiotípicos (anti-ids) contra un anticuerpo farmacológicamente activo funcional. A modo de imagen especular de una imagen especular, el sitio de unión de los anti-ids se esperaría que fuese un análogo del receptor original. El anti-id podría utilizarse entonces para identificar y aislar péptidos de bancos de péptidos producidos química o biológicamente. Los péptidos aislados actuarían entonces como el farmacoro.

En virtud de la presente invención, pueden proporcionarse cantidades suficientes del polipéptido PRO para llevar a cabo estudios analíticos tales como cristalografía de rayos X. Además, el conocimiento proporcionado por la presente invención de la secuencia de aminoácidos del polipéptido PRO proporcionará una guía para aquellos que utilizan técnicas de modelado informático en lugar de la cristalografía de rayos X o además de la misma.

La memoria escrita anterior se considera suficiente para permitir que un experto en la materia ponga en práctica la invención. La presente invención no debe considerarse limitada en su alcance a los constructos depositados, debido a que la realización depositada pretende ser una única ilustración de determinados aspectos de la invención y cualquier constructo funcionalmente equivalente se encuentra comprendido dentro del alcance de la presente invención. El depósito del material de la presente invención no constituye una admisión de que la descripción escrita contenida en la presente memoria resulta inadecuada para permitir la práctica de cualquier aspecto de la invención, incluyendo el mejor modo de la misma, ni debe interpretarse como limitativa del alcance de las reivindicaciones a las ilustraciones específicas que representa. En efecto, diversas modificaciones de la invención, además de aquéllas mostradas y descritas en la presente memoria, se pondrán de manifiesto a los expertos en la materia a partir de la descripción anterior y se encuentran comprendidas dentro del alcance según las reivindicaciones adjuntas.

\vskip1.000000\baselineskip

Referencias citadas en la descripción

Esta lista de referencias citadas por el solicitante está prevista únicamente para ayudar al lector y no forma parte del documento de patente europea. Aunque se ha puesto el máximo cuidado en su realización, no se pueden excluir errores u omisiones y la OEP declina cualquier responsabilidad en este respecto.

Documentos de patente citados en la descripción

\bullet WO 0078953 A [0010]

\bullet EP 404097 A [0084]

\bullet WO 9311161 A [0084]

\bullet US 4275149 A [0088]

\bullet US 4675187 A [0096]

\bullet US 5364934 A [0103]

\bullet WO 8705330 A [0115]

\bullet US 4640835 A [0117]

\bullet US 4496689 A [0117]

\bullet US 4301144 A [0117]

\bullet US 4670417 A [0117]

\bullet US 4791192 A [0117]

\bullet US 4179337 A [0117]

\bullet US 5428130 A [0120]

\bullet WO 8905859 A [0128]

\bullet US 4399216 A [0128]

\bullet DD 266710 [0129]

\bullet US 4946783 A [0129]

\bullet EP 139383 A [0130]

\bullet US 4943529 A [0130]

\bullet EP 402226 A [0130]

\bullet EP 183070 A [0130]

\bullet EP 244234 A [0130]

\bullet EP 394538 A [0130]

\bullet WO 9100357 A [0130]

\bullet US 5010182 A [0133]

\bullet EP 362179 A [0133]

\bullet WO 9013646 A [0133]

\bullet EP 36776 A [0137]

\bullet EP 73657 A [0139]

\bullet GB 2211504 A [0140]

\bullet EP 117060 A [0143]

\bullet EP 117058 A [0143]

\bullet US 4376110 A [0154]

\bullet US 4873191 A [0177]

\bullet US 4736866 A [0177]

\bullet WO 9733551 A [0189] [0190]

\bullet US 4816567 A [0200] [0200] [0204]

\bullet US 5545807 A [0205]

\bullet US 5545806 A [0205]

\bullet US 5569825 A [0205]

\bullet US 5625126 A [0205]

\bullet US 5633425 A [0205]

\bullet US 5661016 A [0205]

\bullet WO 9308829 A [0208]

\bullet WO 9627011 A [0210]

\bullet US 4676980 A [0215] [0215]

\bullet WO 9100360 A [0215]

\bullet WO 92200373 A [0215]

\bullet EP 03089 A [0215]

\bullet WO 9411026 A [0219]

\bullet US 4485045 A [0221]

\bullet US 4544545 A [0221]

\bullet US 5013556 A [0221]

\bullet US 3773919 A [0230]

\bullet EP 616812 A [0256]

\bullet EP 307247 A [0307]

\bullet US 5122469 A [0317]

\bullet WO 8403564 A [0344]

Documentos que no son patentes citados en la descripción

\bullet Current Protocols in immunology. John Wiley & Sons, Inc, 1994 [0008]

\bulletNIELSEN et al. Prot. Eng., 1997, vol. 10, 1-6 [0045]

\bullet VON HEINJE et al. Nucl. Acids. Res., 1986, vol. 14, 4683-4690 [0045]

\bulletALTSCHUL et al. Methods in Enzymology, 1996, vol. 266, 460-480 [0049] [0056] [0266] [0270]

\bulletALTSCHUL et al. Nucleic Acids Res, 1997, vol. 25, 3389-3402 [0050]

\bulletALTSCHUL et al. Nucleic Acids Res., 1997, vol. 25, 3389-3402 [0057]

\bulletSAMBROOK et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Press, 1989 [0067]

\bulletZAPATA et al. Protein Eng., 1995, vol. 8 (10), 1057-1062 [0077]

\bulletPLUCKTHUN. The Pharmacology of Monoclonal Antibodies. Springer-Verlag, 1994, vol. 113, 269-315 [0083]

\bulletHOLLINGER et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1993, vol. 90, 6444-6448 [0084] [0213]

\bullet Cell cycle regulation, oncogens, and antineoplastic drugs. MURAKAMI et al. The Molecular Basis of Cancer. WB Saunders, 1995, 13 [0097]

\bulletCARTER et al. Nucl. Acids Res., 1986, vol. 13, 4331 [0109]

\bulletZOLLER et al. Nucl. Acids Res., 1987, vol. 10, 6487 [0109]

\bulletWELLS et al. Gene, 1985, vol. 34, 315 [0109]

\bulletWELLS et al. Philos. Trans. R. Soc. London SerA, 1986, vol. 317, 415 [0109]

\bulletCUNNINGHAM; WELLS. Science, 1989, vol. 244, 1081-1085 [0110]

\bulletCREIGHTON. The Proteins [0110]

\bulletCHOTHIA. J. Mol. Biol., 1976, vol. 150, 1 [0110]

\bullet T.E. CREIGHTON. Proteins: Structure and Molecular Properties. W.H. Freeman & Co, 1983, 79-86 [0112]

\bulletAPLIN; WRISTON. CRC Crit. Rev. Biochem., 1981, 259-306 [0115]

\bulletHAKIMUDDIN et al. Arch. Biochem. Biophys., 1987, vol. 259, 52 [0116]

\bulletEDGE et al. Anal. Biochem., 1981, vol. 118, 131 [0116]

\bulletTHOTAKURA et al. Meth. Enzymol., 1987, vol. 138, 350 [0116]

\bulletFIELD et al. Mol. Cell. Biol., 1988, vol. 8, 2159-2165 [0119]

\bulletEVAN et al. Molecular and Cellular Biology, 1985, vol. 5, 3610-3616 [0119]

\bulletPABORSKY et al. Protein Engineering, 1990, vol. 3 (6), 547-553 [0119]

\bulletHOPP et al. BioTechnology, 1988, vol. 6, 1204-1210 [0119]

\bulletMARTIN et al. Science, 1992, vol. 255, 192-194 [0119]

\bulletSKINNER et al. J. Biol. Chem., 1991, vol. 266, 15163-15166 [0119]

\bulletLUTZ-FREYERMUTH et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1990, vol. 87, 6393-6397 [0119]

\bulletSTEWART et al. Solid-Phase Peptide Synthesis. W.H. Freeman Co, 1969 [0121]

\bulletMERRIFIELD. J. Am. Chem. Soc., 1963, vol. 85, 2149-2154 [0121]

\bulletSAMBROOK et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989 [0123]

\bulletDIEFFENBACH et al. PCR Primer: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1995 [0123]

\bullet Mammalian Cell Biotechnology: a Practical Approach. IRL Press, 1991 [0127]

\bulletSHAW et al. Gene, 1983, vol. 23, 315 [0128]

\bulletGRAHAM; VAN DER EB. Virology, 1978, vol. 52, 456-457 [0128]

\bullet VAN SOLINGEN et al. J. Bact., 1977, vol. 130, 946 [0128]

\bulletHSIAO et al. Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 1979, vol. 76, 3829 [0128]

\bulletKEOWN et al. Methods in Enzymology, 1990, vol. 185, 527-537 [0128]

\bulletMANSOUR et al. Nature, 1988, vol. 336, 348-352 [0128]

\bulletBEACH; NURSE. Nature, 1981, vol. 290, 140 [0130]

\bulletFLEER et al. Bio/Technology, 1991, vol. 9, 968-975 [0130]

\bulletLOUVENCOURT et al. J. Bacteriol., 1983, vol. 154 (2), 737-742 [0130]

\bullet VAN DEN BERG et al. Bio/Technology, 1990, vol. 8, 135 [0130]

\bulletSREEKRISHNA et al. J. Basic Microbiol., 1988, vol. 28, 265-278 [0130]

\bulletCASE et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1979, vol. 76, 5259-5263 [0130]

\bulletBALLANCE et al. Biochem. Biophys. Res. Commun., 1983, vol. 112, 284-289 [0130]

\bulletTILBURN et al. Gene, 1983, vol. 26, 205-221 [0130]

\bulletYELTON et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1984, vol. 81, 1470-1474 [0130]

\bulletKELLY; HYNES. EMBO J., 1985, vol. 4, 475-479 [0130]

\bullet C. ANTHONY. The Biochemistry of Methylotrophs, 1982, vol. 269 [0130]

\bulletGRAHAM et al. J.GenVirol., 1977, vol. 36, 59 [0131]

\bulletCHO; URLAUB; CHASIN. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1980, vol. 77, 4216 [0131]

\bullet TM4, MATHER. Biol. Reprod., 1980, vol. 23, 243-251 [0131]

\bulletURLAUB et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1980, vol. 77, 4216 [0136]

\bulletSTINCHCOMB et al. Nature, 1979, vol. 282, 39 [0136]

\bulletKINGSMAN et al. Gene, 1979, vol. 7, 141 [0136]

\bulletTSCHEMPER et al. Gene, 1980, vol. 10, 157 [0136]

\bulletJONES. Genetics, 1977, vol. 85, 12 [0136]

\bulletCHANG et al. Nature, 1978, vol. 275, 615 [0137]

\bulletGOEDDEL et al. Nature, 1979, vol. 281, 544 [0137]

\bulletGOEDDEL. Nucleic Acids Res., 1980, vol. 8, 4057 [0137]

\bulletDEBOER et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1983, vol. 80, 21-25 [0137]

\bulletHITZEMAN et al. J. Biol. Chem., 1980, vol. 255, 2073 [0138]

\bulletHESS et al. J. Adv. Enzyme Reg., 1968, vol. 7, 149 [0138]

\bulletHOLLAND. Biochemistry, 1978, vol. 17, 4900 [0138]

\bulletGETHING et al. Nature, 1981, vol. 293, 620-625 [0143]

\bulletMANTEI et al. Nature, 1979, vol. 281, 40-46 [0143]

\bulletTHOMAS. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1980, vol. 77, 5201-5205 [0144] [0149]

\bulletDEUTSCHER. Methods in Enzymology, 1990, vol. 182 [0147]

\bulletSCOPES. Protein Purification: Principles and Practice. Springer-Verlag, 1982 [0147]

\bulletZOLA. Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques. CRC Press, Inc, 1987, 147-158 [0152]

\bulletSMALL et al. Mol. Cell. Biol., 1985, vol. 5, 642-648 [0158]

\bullet Current Protocols in Immunology. John Wiley & Sons, Inc, [0159]

\bulletCHAMBERS, C. A.; ALLISON, J. P. Curr. Opin. Immunol., 1997, vol. 9, 396 [0160]

\bulletSCHWARTZ, R. H. Cell, 1992, vol. 71, 1065 [0160]

\bulletLINSEY, P. S.; LEDBETTER, J. A. Annu. Rev. Immunol., 1993, vol. 11, 191 [0160]

\bulletJUNE, C. H. et al. Immunol. Today, 1994, vol. 15, 321 [0160]

\bulletJENKINS, M. K. Immunity, 1994, vol. 1, 405 [0160]

\bulletALDERSON, M. E. et al. J. Immunol., 1994, vol. 24, 2219 [0162]

\bulletHELLSTROM, I.; HELLSTROM, K. E. Crit. Rev. Immunol., 1998, vol. 18, 1 [0163]

\bulletWALUNAS, T. L. et al. Immunity, 1994, vol. 1, 405 [0164]

\bulletAUCHINCLOSS, H. JR.; SACHS, D. H. Fundamental Immunology. Raven Press, 1989, 889-992 [0170]

\bulletTANABE, M. et al. Transplantation, 1994, vol. 58, 23 [0170]

\bulletTINUBU, S. A. et al. J. Immunol., 1994, 4330-4338 [0170]

\bulletBOLTON, C. Multiple Sclerosis, 1995, vol. 1, 143 [0172]

\bulletDUNCAN, I. D. et al. Molec. Med. Today, 1997, 554-561 [0172]

\bullet Current Protocols in Immunology. John Wiley & Sons, Inc, 1994 [0173]

\bulletGRABBE, S.; SCHWARZ, T. Immun. Today, 1998, vol. 19 (1), 37-44 [0173]

\bulletISSEKUTZ, A.C. et al. Immunology, 1996, vol. 88, 569 [0174]

\bulletWOLYNIEC, W. W. et al. Am. J. Respir. Cell Mol. Biol., 1998, vol. 18, 777 [0175]

\bulletSCHON, M. P. et al. Nat. Med., 1997, vol. 3, 183 [0176]

\bulletNICKOLOFF, B. J. et al. Am. J. Path., 1995, vol. 146, 580 [0176]

\bulletVANDERPUTTEN et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1985, vol. 82, 6148-615 [0177]

\bulletTHOMPSON et al. Cell, 1989, vol. 56, 313-321 [0177]

\bulletLO. Mol. Cel. Biol., 1983, vol. 3, 1803-1814 [0177]

\bulletLAVITRANO et al. Cell, 1989, vol. 57, 717-73 [0177]

\bulletLASKO et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1992, vol. 89, 6232-636 [0178]

\bulletTHOMAS; CAPECCHI. Cell, 1987, vol. 51, 503 [0181]

\bulletLI et al. Cell, 1992, vol. 69, 915 [0181]

\bulletBRADLEY. Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cells: A Practical Approach. IRL, 1987, 113-152 [0181]

\bulletDESMET, C. et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1996, vol. 93, 7149 [0182]

\bulletMELERO, I. et al. Nature Medicine, 1997, vol. 3, 682 [0182]

\bulletKWON, E. D. et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1997, vol. 94, 8099 [0182]

\bulletLYNCH, D. H. et al. Nature Medicine, 1997, vol. 2, 625 [0182]

\bulletFINN, O. J.; LOTZE, M. T. J. Immunol., 1998, vol. 21, 114 [0182]

\bulletFIELDS; SONG. Nature (London), 1989, vol. 340, 245-246 [0185]

\bulletCHIEN et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1991, vol. 88, 9578-9582 [0185]

\bulletCHEVRAY; NATHANS. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1991, vol. 89, 5789-5793 [0185]

\bulletROSSI. Current Biology, 1994, vol. 4, 469-471 [0189]

\bulletKOHLER; MILSTEIN. Nature, 1975, vol. 256, 495 [0194]

\bulletGODING. Monoclonal Antibodies: Principles and Practice. Academic Press, 1986, 59-103 [0195]

\bulletKOZBOR. J. Immunol., 1984, vol. 133, 3001 [0196]

\bulletBRODEUR et al. Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, 1987, 51-63 [0196]

\bulletMUNSON; POLLARD. Anal. Biochem., 1980, vol. 107, 220 [0197]

\bulletJONES et al. Nature, 1986, vol. 321, 522-525 [0203]

\bulletRIECHMANN et al. Nature, 1988, vol. 332, 323-329 [0203]

\bulletPRESTA. Curr. Op. Struct. Biol., 1992, vol. 2, 593-596 [0203]

\bulletRIECHMANN et al. Nature, 1988, vol. 332, 323-327 [0204]

\bulletVERHOEYEN et al. Science, 1988, vol. 239, 1534-1536 [0204]

\bulletHOOGENBOOM; WINTER. J. Mol. Biol., 1991, vol. 227, 381 [0205]

\bulletMARKS et al. J. Mol. Biol., 1991, vol. 222, 581 [0205]

\bulletCOLE et al. Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy. Alan R. Liss, 1985, 77 [0205]

\bulletBOERNER et al. J. Immunol., 1991, vol. 147 (1), 86-95 [0205]

\bulletMARKS et al. Bio/Technology, 1992, vol. 10, 779-783 [0205]

\bulletLONBERG et al. Nature, 1994, vol. 368, 856-859 [0205]

\bulletMORRISON. Nature, 1994, vol. 368, 812-13 [0205]

\bulletFISHWILD et al. Nature Biotechnology, 1996, vol. 14, 845-51 [0205]

\bulletNEUBERGER. Nature Biotechnology, 1996, vol. 14, 826 [0205]

\bulletLONBERG; HUSZAR. Intern. Rev. Immunol., 1995, vol. 13, 65-93 [0205]

\bulletMILSTEIN; CUELLO. Nature, 1983, vol. 305, 537-539 [0208]

\bulletTRAUNECKER et al. EMBO J., 1991, vol. 10, 3655-3659 [0208]

\bulletSURESH et al. Methods in Enzymology, 1986, vol. 121, 210 [0209]

\bulletBRENNAN et al. Science, 1985, vol. 229, 81 [0211]

\bulletSHALABY et al. J. Exp. Med., 1992, vol. 175, 217-225 [0212]

\bulletKOSTELNY et al. J. Immunol, 1992, vol. 148 (5), 1547-1553 [0213]

\bulletGRUBER et al. J. Immunol., 1994, vol. 152, 5368 [0213]

\bulletTUTT et al. J. Immunol., 1991, vol. 147, 60 [0213]

\bulletCARON et al. J. Exp Med., 1992, vol. 176, 1191-1195 [0216]

\bulletSHOPES. J. Immunol., 1992, vol. 148, 2918-2922 [0216]

\bulletWOLFF et al. Cancer Research, 1993, vol. 53, 2560-2565 [0216]

\bulletSTEVENSON et al. Anti-Cancer Drug Design, 1989, vol. 3, 219-230 [0216]

\bulletVITETTA et al. Science, 1987, vol. 238, 1098 [0219]

\bulletEPSTEIN et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1985, vol. 82, 3688 [0221]

\bulletHWANG et al. Proc. Natl Acad. Sci. USA, 1980, vol. 77, 4030 [0221]

\bulletMARTIN et al. J. Biol. Chem., 1982, vol. 257, 286-288 [0222]

\bulletGABIZON et al. J. National Cancer Inst., 1989, vol. 81 (19), 1484 [0222]

\bulletRemington's Pharmaceutical Sciences. 1980 [0224] [0228]

\bulletMARASCO et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1993, vol. 90, 7889-7893 [0226]

\bullet Chemotherapy Service. Williams & Wilkins, 1992 [0256]

\bulletHOLMES et al. Science, 1991, vol. 253, 1278-1280 [0269]

\bullet Current Prorocols in Immunology. John Wiley & Sons, Inc, [0274]

\bulletLU; GILLETT. Cell Vision, 1994, vol. 1, 169-176 [0279]

\bulletBOLIVAR et al. Gene, 1977, vol. 2, 95 [0297]

\bulletTHIMMAPPAYA et al. Cell, 1982, vol. 31, 543 [0308]

\bulletSOMPARYRAC et al. Proc. Natl. Acad. Sci., 1981, vol. 12, 7575 [0310]

\bulletAUSUBEL et al. Current Protocols of Molecular Biology. John Wiley and Sons, 1997 [0315]

\bulletLUCAS et al. Nucl. Acids Res., 1996, vol. 24 (9), 1774-1779 [0315]

\bulletO'REILLEY et al. Baculovirus expression vectors: A Laboratory Manual. Oxford University Press, 1994 [0328]

\bulletRUPERT et al. Nature, 1993, vol. 362, 175-179 [0329]

\bulletHODGSON. Bio/Technology, 1991, vol. 9, 19-21

\bulletBRAXTON; WELLS. Biochemistry, 1992, vol. 31, 7796-7801 [0347]

\bulletATHAUDA et al. J. Biochem., 1993, vol. 113, 742-746 [0347]

Claims

1. Anticuerpo que se une específicamente a un polipéptido PRO7425 aislado que presenta una identidad de secuencia de aminoácidos de por lo menos 80% respecto a:

(a): la secuencia de aminoácidos del polipéptido mostrado en la figura 2 (SEC ID nº 12),

(b): la secuencia de aminoácidos del polipéptido mostrado en la figura 2 (SEC ID nº 12), sin el péptido de señal asociado,

(c): la secuencia de aminoácidos de un dominio extracelular del polipéptido mostrado en la figura 2 (SEC ID nº 12), con su péptido de señal asociado, o

(d): la secuencia de aminoácidos de un dominio extracelular del polipéptido mostrado en la figura 2 (SEC ID nº 12), sin su péptido de señal asociado, o

(e): una secuencia de aminoácidos codificada por la secuencia codificante de longitud completa del ADN depositado bajo el número de acceso de la ATCC nº PTA-6147,

en el que el anticuerpo bloquea, inhibe o neutraliza parcial o totalmente la actividad estimuladora de la proliferación de los linfocitos T de dicho polipéptido.

2. Anticuerpo según la reivindicación 1, en el que dicho anticuerpo es un anticuerpo monoclonal, un anticuerpo humanizado o un anticuerpo monocatenario.

3. Composición de materia que comprende un anticuerpo antagonista de un polipéptido PRO7425 según la reivindicación 1, en combinación con un portador.

4. Composición de materia según la reivindicación 3, en la que dicho portador es un portador farmacéuticamente aceptable.

5. Anticuerpo según la reivindicación 1 ó 2, o la composición según la reivindicación 3 ó 4, para bloquear, inhibir o neutralizar parcial o totalmente la actividad estimuladora de la proliferación de los linfocitos T de dicho polipéptido PRO7425.

6. Polipéptido PRO7425 según la reivindicación 1, para estimular o incrementar la proliferación de los linfocitos T para el tratamiento de un trastorno de tipo inmunológico en un mamífero que necesita del mismo.

7. Utilización de un polipéptido PRO7425 según la reivindicación 1, en la preparación de un medicamento para estimular o incrementar la proliferación de los linfocitos T para el tratamiento de un trastorno de tipo inmunológico en un mamífero que necesita del mismo.

8. Utilización según la reivindicación 7, en la que el trastorno de tipo inmunológico es una enfermedad infecciosa, incluyendo enfermedades víricas, infecciones bacterianas, infecciones fúngicas, infecciones protozoáricas e infecciones parasitarias, una enfermedad de inmunodeficiencia o neoplasia.

9. Utilización según la reivindicación 8, en la que la enfermedad vírica es el SIDA (infección por VIH), hepatitis A, B, C, D o E, o herpes.

10. Utilización según la reivindicación 8, en la que la enfermedad de inmunodeficiencia es heredada, adquirida, infecciosa inducida o iatrogénica.

11. Procedimiento para identificar un compuesto que inhibe la actividad de un polipéptido PRO7425 según la reivindicación 1, en el que la actividad es la estimulación de la proliferación de los linfocitos T, comprendiendo dicho procedimiento poner en contacto células que normalmente responden a dicho polipéptido con: (a) dicho polipéptido, y (b) un compuesto candidato, y determinar la falta de respuesta de dicha célula frente a (a).

12. Procedimiento para identificar un agonista o antagonista de un polipéptido PRO7425 según la reivindicación 1, comprendiendo dicho procedimiento poner en contacto dicho polipéptido con un compuesto candidato, y realizar el seguimiento de al estimulación de la proliferación de los linfocitos T por dicho polipéptido.

13. Procedimiento para identificar un compuesto que imita la actividad de un polipéptido PRO7425 según la reivindicación 1, en el que la actividad es la estimulación de la proliferación de los linfocitos T, comprendiendo dicho procedimiento la puesta en contacto de células que normalmente responden a dicho polipéptido con un compuesto candidato, y determinar la respuesta de dicha célula a dicho compuesto candidato.

\newpage

14. Procedimiento in vitro para estimular la proliferación de los linfocitos T, comprendiendo dicho procedimiento poner en contacto linfocitos T con una cantidad eficaz de un polipéptido PRO7425 según la reivindicación 1.

15. Procedimiento in vitro para inhibir la proliferación inducida por PRO7425 de los linfocitos T, comprendiendo dicho procedimiento poner en contacto linfocitos T con una cantidad eficaz de un anticuerpo antagonista de un polipéptido PRO7425 según la reivindicación 1.