KR101026016B1 - Ｔ 세포 접착 분자 및 이에 대한 항체 - Google Patents

Abstract

본 발명은 수상 세포 상에 발현되는 T 세포 접착 분자의 제공을 목적으로 한다. 본 발명에 따르면, 서열 2, 서열 4, 서열 6, 서열 8, 서열 10 또는 서열 12로 표시되는 아미노산 서열을 포함하여 이루어지는 단백질이 제공된다.

수상 세포, T 세포 접착 분자, 항체, 막 단백질, 분비 단백질, 폴리뉴클레오티드, 스크리닝

Description

Ｔ 세포 접착 분자 및 이에 대한 항체{T CELL ADHESION MOLECULE AND ANTIBODY THERETO}

본 발명은 골수 유래의 수상 세포 상에 발현되는 T 세포 접착 분자 및 그의 유전자, 및 T 세포 상에 발현되는, 상기 접착 분자(수용체)에 대한 리간드 및 그의 유전자에 관한 것이다. 본 발명은 또한, 상기 접착 분자 또는 상기 리간드에 대한 항체 및 그의 용도에 관한 것이다. 본 발명은 또한, 상기 접착 분자를 이용한 스크리닝 방법에 관한 것이다.

최근, T 세포 상에 발현되는 수상 세포 활성화 인자로서 클로닝되었던 분자가, 파골 세포의 분화를 제어하는 중심적인 사이토카인인 것으로 보고된 것을 비롯하여(Yasuda, H., et al.(1998) Proc Natl Acad Sci USA 95: 3597-3602), 면역계와 골대사가 밀접히 관계되어 있는 것이 밝혀지고 있다.

면역계 제어 분자에 의한 골대사의 제어에 관한 연구는 급속히 진행되었고, 파골 세포 분화의 제어에 관련된 시그널 전달에 대해서도 해명이 진행되어 오고 있다.

예를 들면, 파골 세포의 분화에 관여하는 분자로서, 오스카(Oscar(Osteoclast-associated receptor))가 알려져 있다. 오스카는 면역 글로 불린 유사 수용체로서, FcRγ쇄와 회합하고, FcRγ쇄의 ITAM 모티프를 통해 포스포리파아제 Cγ에 시그널을 전달하는 것으로 지금까지 보고되어 있다(Kim, N., et al.(2002) J Exp Med 195: 201-209).

또한, 수상 세포 상에 발현되고, T 세포와 접착하여 T 세포와 수상 세포 사이의 면역 응답에 관한 상호 작용에 관여하는 분자에 대해서는, CD80-CD28, CD40-CD40L, ICAM1-LFA1 등 다양한 상호 작용이 보고되어 있다.

<발명의 개요>

본 발명자들은 이번에, 서브트랙션법에 의해 골수 유래의 수상 세포 상에 특이적으로 발현되는 유전자를 동정하였다. 본 발명자들은 또한, 상기 유전자에 의해 코딩되는 단백질이 IgE 수용체를 구성하는 FcRγ쇄와 결합하는 점, LPS 자극에 의해 상기 단백질의 발현이 증강되는 점, 상기 단백질로의 항체 가교 자극에 의해 수상 세포가 활성화되는 점, 상기 단백질이 T 세포로의 접착 기능을 갖는 점, 상기 단백질에 대한 항체가 류마티스 관절염의 질환 모델인 콜라겐 유도 관절염 모델에 대하여 치료 효과를 갖는 점을 발견하였다. 본 발명자들은 또한, T 세포 상에 발현되는, 상기 단백질에 대한 리간드의 유전자를 동정하였다. 본 발명은 이들 지견에 기초한 것이다.

본 발명에 따르면, 서열 2, 서열 4, 서열 6 또는 서열 8로 표시되는 아미노산 서열, 또는 1개 또는 복수개의 보존적 치환을 갖는 서열 2, 서열 4, 서열 6 또는 서열 8로 표시되는 아미노산 서열을 포함하여 이루어지는 막 단백질 또는 분비 단백질(이하, 본 발명에 따른 제1 양태의 신규 단백질이라 함)이 제공된다.

본 발명에 따르면, 이하의 (i), (ii), (iii), 및 (iv)로부터 선택되는, 막 단백질 또는 분비 단백질(이하, 본 발명에 따른 제2 양태의 신규 단백질이라 함)이 제공된다.

(i) 서열 10으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하여 이루어지는 막 단백질 또는 분비 단백질;

(ii) 서열 10으로 표시되는 아미노산 서열에 있어서, 1개 또는 복수개의 아미노산의 삽입, 치환 또는 결실, 또는 그의 한쪽 또는 양쪽 말단으로의 1개 또는 복수개의 아미노산의 부가가 이루어진 아미노산 서열을 포함하여 이루어지고, 또한 서열 10으로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 단백질과 동등한 기능을 갖는 막 단백질 또는 분비 단백질;

(iii) 서열 10으로 표시되는 아미노산 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드와 가혹한 조건에서 하이브리다이제이션하는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되고, 또한 서열 10으로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 단백질과 동등한 기능을 갖는 막 단백질 또는 분비 단백질; 및

(iv) 서열 10으로 표시되는 아미노산 서열과 90％ 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하여 이루어지고, 또한 서열 10으로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 단백질과 동등한 기능을 갖는 막 단백질 또는 분비 단백질.

본 발명에 따르면, 본 발명에 따른 제1 양태 및 제2 양태의 신규 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 제공된다.

본 발명에 따르면 또한, 이하의 (v), (vi), (vii), 및 (viii)로부터 선택되는 폴리뉴클레오티드가 제공된다.

(v) 서열 9로 표시되는 뉴클레오티드 서열을 포함하여 이루어지는 폴리뉴클레오티드;

(vi) 서열 9로 표시되는 뉴클레오티드 서열을 포함하여 이루어지는 폴리뉴클레오티드에 있어서, 1개 또는 복수개의 뉴클레오티드의 삽입, 치환 또는 결실, 또는 그의 한쪽 또는 양쪽 말단으로의 1개 또는 복수개의 뉴클레오티드의 부가가 이루어지고, 또한 서열 10으로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 단백질과 동등한 기능을 갖는 막 단백질 또는 분비 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드;

(vii) 서열 9로 표시되는 뉴클레오티드 서열을 포함하여 이루어지는 폴리뉴클레오티드와 가혹한 조건에서 하이브리다이제이션하고, 또한 서열 10으로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 단백질과 동등한 기능을 갖는 막 단백질 또는 분비 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드; 및

(viii) 서열 9로 표시되는 뉴클레오티드 서열을 포함하여 이루어지는 폴리뉴클레오티드와 90％ 이상의 동일성을 갖고, 또한 서열 10으로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 단백질과 동등한 기능을 갖는 막 단백질 또는 분비 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드.

본 발명에 따르면, 이하의 (ix), (x), (xi), 및 (xii)로부터 선택되는 막 단백질 또는 분비 단백질(이하, TARM(T cell-interacting Activating Receptor on Myeloid cells) 단백질이라 부르는 경우가 있음)에 대한 항체 및 그의 기능적 단편(이하, 본 발명에 따른 제1 양태의 항체라 함)이 제공된다.

(ix) 서열 2, 서열 4, 서열 6, 서열 8, 서열 10 또는 서열 12로 표시되는 아미노산 서열을 포함하여 이루어지는 막 단백질 또는 분비 단백질;

(x) 서열 2, 서열 4, 서열 6, 서열 8, 서열 10 또는 서열 12로 표시되는 아미노산 서열에 있어서, 1개 또는 복수개의 아미노산의 삽입, 치환 또는 결실, 또는 그의 한쪽 또는 양쪽 말단으로의 1개 또는 복수개의 아미노산의 부가가 이루어진 아미노산 서열을 포함하여 이루어지고, 또한 서열 2, 서열 4, 서열 6, 서열 8, 서열 10 또는 서열 12로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 단백질과 동등한 기능을 갖는 막 단백질 또는 분비 단백질;

(xi) 서열 2, 서열 4, 서열 6, 서열 8, 서열 10 또는 서열 12로 표시되는 아미노산 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드와 가혹한 조건에서 하이브리다이제이션하는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되고, 또한 서열 2, 서열 4, 서열 6, 서열 8, 서열 10 또는 서열 12로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 단백질과 동등한 기능을 갖는 막 단백질 또는 분비 단백질; 및

(xii) 서열 2, 서열 4, 서열 6, 서열 8, 서열 10 또는 서열 12로 표시되는 아미노산 서열과 70％ 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하여 이루어지고, 또한 서열 2, 서열 4, 서열 6, 서열 8, 서열 10 또는 서열 12로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 단백질과 동등한 기능을 갖는 막 단백질 또는 분비 단백질.

본 발명에 따르면, 이하의 (xiii), (xiv), (xv), 및 (xvi)로부터 선택되는, 본 발명에 따른 신규 단백질의 리간드가 되는 신규 리간드 단백질(이하, 본 발명에 따른 신규 리간드 단백질 또는 TARM-L(TARM ligand) 단백질이라고 부르는 경우가 있음)이 제공된다.

(xiii) 서열 14 또는 서열 16으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하여 이루어지는 단백질;

(xiv) 서열 14 또는 서열 16으로 표시되는 아미노산 서열에 있어서, 1개 또는 복수개의 아미노산의 삽입, 치환 또는 결실, 또는 그의 한쪽 또는 양쪽 말단으로의 1개 또는 복수개의 아미노산의 부가가 이루어진 아미노산 서열을 포함하여 이루어지고, 또한 서열 14 또는 서열 16으로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 단백질과 동등한 기능을 갖는 단백질;

(xv) 서열 14 또는 서열 16으로 표시되는 아미노산 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드와 가혹한 조건에서 하이브리다이제이션하는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되고, 또한 서열 14 또는 서열 16으로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 단백질과 동등한 기능을 갖는 단백질; 및

(xvi) 서열 14 또는 서열 16으로 표시되는 아미노산 서열과 70％ 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하여 이루어지고, 또한 서열 14 또는 서열 16으로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 단백질과 동등한 기능을 갖는 단백질.

본 발명에 따르면, 본 발명에 따른 신규 리간드 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 제공된다.

본 발명에 따르면 또한, 이하의 (xvii), (xviii), (xix), 및 (xx)으로부터 선택되는 폴리뉴클레오티드가 제공된다:

(xvii) 서열 13 또는 서열 15로 표시되는 뉴클레오티드 서열을 포함하여 이루어지는 폴리뉴클레오티드;

(xviii) 서열 13 또는 서열 15로 표시되는 뉴클레오티드 서열을 포함하여 이루어지는 폴리뉴클레오티드에 있어서, 1개 또는 복수개의 뉴클레오티드의 삽입, 치환 또는 결실, 또는 그의 한쪽 또는 양쪽 말단으로의 1개 또는 복수개의 뉴클레오티드의 부가가 이루어지고, 또한 서열 14 또는 서열 16으로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 단백질과 동등한 기능을 갖는 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드;

(xix) 서열 13 또는 서열 15로 표시되는 뉴클레오티드 서열을 포함하여 이루어지는 폴리뉴클레오티드와 가혹한 조건에서 하이브리다이제이션하고, 또한 서열 14 또는 서열 16으로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 단백질과 동등한 기능을 갖는 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드; 및

(xx) 서열 13 또는 서열 15로 표시되는 뉴클레오티드 서열을 포함하여 이루어지는 폴리뉴클레오티드와 70％ 이상의 동일성을 갖고, 또한 서열 14 또는 서열 16으로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 단백질과 동등한 기능을 갖는 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드.

본 발명에 따르면, 본 발명에 따른 신규 리간드 단백질에 대한 항체 및 그의 기능적 단편(이하, 본 발명에 따른 제2 양태의 항체라 함)이 제공된다.

본 발명에 따르면, 본 발명에 따른 제1 양태 및 제2 양태의 항체(이하, 이들을 아울러 "본 발명에 따른 항체"라 부르는 경우가 있음) 또는 이들의 기능적 단편을 유효 성분으로서 포함하여 이루어지는, 자기 면역 질환 치료제 및 T 세포 접착 저해제가 제공된다.

본 발명에 따르면, 이하에 나타내는 스크리닝 방법이 제공된다.

본 발명에 따른 제1 양태의 스크리닝 방법에 따르면, 하기 공정을 포함하여 이루어지는, TARM 단백질과 T 세포와의 접착을 저해하는 물질 또는 그의 염 또는 이들의 용매화물의 스크리닝 방법이 제공된다.

(a) 피검 물질의 존재하 및 비존재하에서, TARM 단백질과 T 세포를 접촉시키는 공정; 및

(b) TARM 단백질과 T 세포와의 접착 활성을 측정하는 공정.

본 발명에 따른 제2 양태의 스크리닝 방법에 따르면 또한, 하기 공정을 포함하여 이루어지는, 수상 세포의 활성화를 저해하는 물질 또는 그의 염 또는 이들의 용매화물의 스크리닝 방법이 제공된다.

(d) 피검 물질의 존재하 및 비존재하에서, 본 발명에 따른 항체 또는 그의 기능적 단편과 수상 세포를 접촉시키는 공정; 및

(e) 상기 수상 세포의 활성화의 정도를 측정하는 공정.

본 발명에 따른 제3 양태의 스크리닝 방법에 따르면 또한, 하기 공정을 포함하여 이루어지는, TARM 단백질과 FcRγ쇄와의 복합체 형성을 저해하는 물질 또는 그의 염 또는 이들의 용매화물의 스크리닝 방법이 제공된다.

(g) 피검 물질의 존재하 및 비존재하에서, 본 발명에 따른 항체 또는 그의 기능적 단편과 수상 세포를 접촉시키는 공정; 및

(h) 상기 수상 세포에 있어서의 FcRγ쇄의 발현량을 측정하는 공정.

도 1은 마우스 TARM 유전자(m1 내지 4 및 s1)의 아미노산 서열을 나타낸 도면이다. 밑줄은 면역 글로불린(IG) 루프 구조 부분을 나타내고, 진한 글씨는 막 관통 부분을 나타낸다.

도 2는 마우스 조직에 있어서의 TARM의 mRNA 발현을, 프라이머 세트 1을 이용하여 실시간 PCR에 의해 해석한 결과를 나타낸 도면이다.

도 3은 각종 세포에 있어서의 TARM의 mRNA 발현을, 프라이머 세트 1을 이용하여 실시간 PCR에 의해 해석한 결과를 나타낸 도면이다.

도 4의 A는 항 TARM 단백질 항체의 제조에 이용되는 세포외 영역의 구조 및 아미노산 번호를 나타낸 도면이다. B는 상기 항체의 TARM 단백질에 대한 특이성에 대하여 검토한 결과를 나타낸 도면이다.

도 5는 골수 유래 수상 세포에 있어서의 마우스 단백질의 발현에 대하여 해석한 결과를 나타낸 도면이다.

도 6은 정상 마우스의 면역 조직 유래 세포에 있어서의 마우스 단백질의 발현에 대하여 해석한 결과를 나타낸 도면이다.

도 7은 c-kit 양성 복강 비만 세포에 있어서의 마우스 단백질의 발현에 대하여 해석한 결과를 나타낸 도면이다.

도 8은 LPS 염증 자극에 의한 마우스 림프절 유래 세포에 있어서의 마우스 TARM 단백질의 발현에 대하여 해석한 결과를 나타낸 도면이다. 화살표는 마우스 TARM 단백질의 발현을 나타낸다.

도 9의 A는 항 TARM 단백질 항체 자극에 의한, 성숙 골수 수상 세포로부터의 IL-6의 생산의 유도에 대하여 나타낸 도면이다. B는 항 TARM 단백질 항체 자극에 의한, 미숙 골수 수상 세포로부터의 MCP-1의 생산의 유도에 대하여 나타낸 도면이다.

도 10은 마우스 TARM 단백질의 세포 표면 상으로의 발현의 증가에 따른 FcRγ쇄의 증가에 대하여 나타낸 도면이다.

도 11은 마우스 TARM 단백질과 FcRγ쇄의 복합체 형성을 면역 침강법에 의해 해석한 결과를 나타낸 도면이다.

도 12는 활성화 T 세포에 있어서의 마우스 TARM 단백질에 결합하는 분자의 발현을 해석한 결과를 나타낸 도면이다.

도 13은 활성화 T 세포의 마우스 TARM 단백질에 대한 접착능에 대하여 나타낸 도면이다.

도 14는 항 마우스 TARM 단백질 항체에 의한 Th2 세포의 마우스 TARM 단백질로의 접착의 저해를 나타낸 도면이다.

도 15는 항 마우스 TARM 단백질 항체를 투여받은 콜라겐 유도 관절염 모델에 있어서의 외견적 소견 및 체중의 경시적 변화를 나타낸 도면이다.

도 16은 콜라겐 유도 관절염 모델의 혈장 중의 혈청 아밀로이드 A 농도에 대한 항 마우스 TARM 단백질 항체 투여의 효과를 나타낸 도면이다.

도 17은 콜라겐 유도 관절염 모델의 혈장 중의 항 콜라겐 항체가에 대한 항 마우스 TARM 단백질 항체의 투여의 효과를 나타낸 도면이다.

도 18은 인간 조직에 있어서의 TARM 단백질의 mRNA 발현을, 실시간 PCR에 의해 해석한 결과를 나타낸 도면이다.

도 19는 인간 유래의 TARM 단백질의 아미노산 서열을 나타낸 도면이다. 밑줄은 면역 글로불린(Ig) 루프 구조 부분을 나타내고, 진한 글씨는 막 관통 부분을 나타낸다. 또한, 포위 부분은 hTARM과 LOC441864 사이에서 상이한 서열을 나타낸다.

도 20은 활성화 T 세포의 인간 TARM 단백질에 대한 접착능, 및 항 인간 TARM 단백질 항체에 의한 T 세포의 인간 TARM 단백질로의 접착의 저해를 나타낸 도면이다.

도 21의 A는 마우스 세포주에 있어서의 마우스 TARM 단백질에 결합하는 분자의 발현을 해석한 결과를 나타낸 도면이다. B는 마우스 세포주에 있어서의 mTARM-L 후보 분자인 ENSMUSG00000035095의 mRNA 발현을, 실시간 PCR에 의해 해석한 결과를 나타낸 도면이다.

도 22의 A는 마우스 TARM-AP 키메라 단백질의, mTARM-L 발현 B300.19 세포로의 특이적인 결합을 나타낸 도면이다. B는 mTARM-L 발현 B300.19 세포의, 마우스 TARM-AP 키메라 단백질로의 특이적인 세포 접착을 나타낸 도면이다.

도 23은 인간 및 마우스 TARM-L 단백질의 상동성을 해석한 결과를 나타낸 도면이다.

도 24는 인간 TARM 단백질 및 마우스 TARM 단백질(m3)의 상동성을 해석한 결과를 나타낸 도면이다.

<발명의 구체적인 설명>

이하, 본 발명을 상세히 설명한다. 이하의 기술은 본 발명을 설명하기 위한 예시이며, 본 발명을 기술된 실시 형태에만 한정하는 취지는 아니다. 본 명세서 중에서 사용되는 모든 기술적 용어, 과학적 용어 및 전문 용어는 본 발명이 속하는 기술 분야의 통상의 당업자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖고, 단순히 특정 양태를 설명하는 것을 목적으로서 이용되고, 한정하는 것을 의도한 것은 아니다. 본 발명은 그 요지를 벗어나지 않는 한, 다양한 형태로 실시할 수 있다. 본 명세서에서 인용된 모든 선행 기술 문헌 및 공개 공보, 특허 공보, 그 밖의 특허 문헌은 참조로서 본 명세서에 포함되고, 본 발명의 실시를 위해 사용할 수 있다.

[신규 단백질 및 폴리뉴클레오티드]

본 발명에서 동정된 골수 유래의 수상 세포 상에 특이적으로 발현되는 유전자 중 마우스 유래의 유전자에는 5종의 이소폼이 존재한다. 마우스 유래의 유전자의 이소폼으로서는, 막 결합형 단백질(막 단백질)의 유전자로서 m1, m2, m3, 및 m4를, 분비형 단백질(분비 단백질)의 유전자로서 s1을 각각 들 수 있다. 각각의 이소폼의 뉴클레오티드 서열 및 아미노산 서열은 하기의 서열번호와 대응한다.

m1: 서열 11 및 12

m2: 서열 1 및 2

m3: 서열 3 및 4

m4: 서열 5 및 6

s1: 서열 7 및 8

본 발명에서 동정된 골수 유래의 수상 세포 상에 특이적으로 발현되는 유전자 중 인간 유래의 유전자로서는 1종의 막 단백질의 유전자를 들 수 있다. 이 유전자의 뉴클레오티드 서열 및 이에 의해 코딩되는 단백질의 아미노산 서열은 서열 9 및 10으로 기재된다.

본 발명에서 동정된 유전자의 뉴클레오티드 서열은 시그널 펩티드를 코딩하기 때문에, 상기 유전자에 의해 코딩되는 단백질은 막 단백질 또는 분비 단백질을 형성한다. 본 발명에 따른 막 단백질은 그의 C 말단을 개변함으로써(예를 들면, 막 관통 부분을 삭제함으로써), 분비 단백질로 할 수 있다. 본 발명에 따른 분비 단백질은 그의 C 말단을 개변함으로써(예를 들면, 막 관통 부분을 부가함으로써), 막 단백질로 할 수 있다.

본원 명세서에 있어서, "아미노산 서열에 있어서, 1개 또는 복수개의 아미노산의 삽입, 치환 또는 결실, 또는 그의 한쪽 또는 양쪽 말단으로의 부가가 이루어진" 및 "폴리뉴클레오티드에 있어서, 1개 또는 복수개의 뉴클레오티드의 삽입, 치환 또는 결실, 또는 그의 한쪽 또는 양쪽 말단으로의 1개 또는 복수개의 뉴클레오티드의 부가가 이루어진"이란, 부위 특이적 돌연 변이 유발법 등의 주지된 기술적 방법에 의해, 또는 천연에 생길 수 있는 정도의 복수개의 아미노산 또는 뉴클레오티드의 치환 등에 의해 개변이 이루어진 것을 의미한다. 아미노산 및 뉴클레오티드의 개변의 개수는, 예를 들면 1 내지 30개, 바람직하게는 1 내지 20개, 보다 바람직하게는 1 내지 10개, 더욱 바람직하게는 1 내지 5개, 특히 바람직하게는 1 내 지 2개일 수 있다.

개변 아미노산 서열은, 바람직하게는 그의 아미노산 서열이 1 또는 복수개(바람직하게는 1 또는 수개, 또는 1, 2, 3 또는 4개)의 보존적 치환을 갖는 아미노산 서열일 수 있다.

개변 뉴클레오티드 서열은, 바람직하게는 그의 뉴클레오티드 서열이 1개 또는 복수개(예를 들면, 1개 내지 수개, 또는 1, 2, 3 또는 4개)의, 서열 10으로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 단백질의 기능에 영향을 주지 않는 변이를 갖는 뉴클레오티드 서열일 수 있다.

본원 명세서에 있어서 "보존적 치환"이란, 단백질의 기능을 실질적으로 개변하지 않도록 1개 또는 복수개의 아미노산 잔기를 다른 화학적으로 유사한 아미노산 잔기로 치환하는 것을 의미한다. 예를 들면, 어느 소수성 잔기를 다른 소수성 잔기에 의해 치환하는 경우, 어느 극성 잔기를 동일한 전하를 갖는 다른 극성 잔기에 의해 치환하는 경우 등을 들 수 있다. 이러한 치환을 행할 수 있는 기능적으로 유사한 아미노산은 아미노산마다 해당 기술 분야에서 공지되어 있다. 구체예를 들면, 비극성(소수성) 아미노산으로서는, 알라닌, 발린, 이소류신, 류신, 프롤린, 트립토판, 페닐알라닌, 메티오닌 등을 들 수 있다. 극성(중성) 아미노산으로서는, 글리신, 세린, 트레오닌, 티로신, 글루타민, 아스파라긴, 시스테인 등을 들 수 있다. 양전하를 갖는 (염기성) 아미노산으로서는 아르기닌, 히스티딘, 리신 등을 들 수 있다. 또한, 음전하를 갖는 (산성) 아미노산으로서는 아스파르트산, 글루탐산 등을 들 수 있다.

본원 명세서에 있어서 "하이브리다이제이션한다"란, 가혹한 조건하에서 표적 폴리뉴클레오티드와 하이브리다이제이션하는 것을 의미한다. 구체적으로는, FASTA, BLAST, Smith-Waterman[Meth. Enzym., 164, 765(1988)] 등의 상동성 검색 소프트웨어에 의해 디폴트(초기 설정)의 파라미터를 이용하여 계산했을 때, 표적 뉴클레오티드 서열과 적어도 70％ 이상, 바람직하게는 80％ 이상, 보다 바람직하게는 85％ 이상, 더욱 바람직하게는 90％ 이상, 더더욱 바람직하게는 95％ 이상, 특히 바람직하게는 98％ 이상, 그리고 가장 바람직하게는 99％ 이상의 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드를 들 수 있다. 또한, "가혹한 조건하"란, 당업자가 통상 사용할 수 있는 하이브리다이제이션 완충액 중에서 온도 40℃ 내지 70℃, 바람직하게는 60℃ 내지 65℃ 등에서 반응을 행하고, 염 농도가 15 내지 300 mmol/L, 바람직하게는 15 내지 60 mmol/L 등의 세정액 중에서 세정하는 방법에 따라 행할 수 있다. 온도, 염 농도는 사용하는 프로브의 길이에 따라 적절히 조정하는 것이 가능하다. 또한, 하이브리다이제이션한 것을 세정할 때의 조건은 0.2 또는 2×SSC, 0.1％ SDS, 온도 20 내지 68℃에서 행할 수 있다. 가혹(high stringency)한 조건으로 할지 온화(low stringency)한 조건으로 할지는 세정시의 염 농도 또는 온도로 차이를 둘 수 있다. 염 농도로 하이브리다이제이션의 차이를 두는 경우에는 가혹한 세정 버퍼(high stringency wash buffer)로서 0.2×SSC, 0.1％ SDS, 온화한 세정 버퍼(low stringency wash buffer)로서 2×SSC, 0.1％ SDS로 행할 수 있다. 또한, 온도로 하이브리다이제이션의 차이를 두는 경우에는, 가혹한 경우에는 68℃, 중등도(moderate stringency)인 경우에는 42℃, 온화한 경우에는 실온(20 내지 25℃)에 서, 어느 경우든 0.2×SSC, 0.1％ SDS로 행하면 좋다.

통상, 프리 하이브리다이제이션을 실시하는 경우에는 하이브리다이제이션과 동일한 조건에서 실시하지만, 하이브리다이제이션과 프리(예비) 세정은 항상 동일한 조건에서 행하는 것은 아니다.

하이브리다이제이션은 공지된 방법에 따라 행할 수 있다. 또한, 시판되는 라이브러리를 사용하는 경우, 첨부된 사용 설명서에 기재된 방법에 따라 행할 수 있다.

본원 명세서에 있어서, 아미노산 서열 및 뉴클레오티드 서열에 대하여 "동일성"(상동성이라 하는 경우도 있음)이란, 비교되는 서열 간에 있어서, 각각의 서열을 구성하는 아미노산 잔기 또는 뉴클레오티드 잔기의 일치 정도의 의미로 이용된다. 이 때, 갭의 존재 및 아미노산의 성질이 고려된다(Wilbur, Natl. Acad. Sci. U.S.A. 80: 726-730(1983)). 상동성의 계산에는, 시판되는 소프트웨어인 BLAST(Altschul: J. Mol. Biol. 215: 403-410(1990)), FASTA(Peasron: Methods in Enzymology 183: 63-69(1990)), Smith-Waterman[Meth. Enzym., 164, 765(1988)] 등의 상동성 검색 소프트웨어를 이용할 수 있다.

"동일성"의 수치는 모두 당업자에게 공지된 상동성 검색 프로그램을 이용하여 산출되는 수치이면 좋고, 예를 들면 전미 바이오테크놀로지 정보 센터(NCBI)의 상동성 알고리즘 BLAST(Basic local alig㎚ent search tool; http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)에 있어서 디폴트(초기 설정)의 파라미터를 이용함으로써 산출할 수 있다.

본 발명에 따른 제2 양태의 신규 단백질에 있어서, 서열 10으로 표시되는 아미노산 서열과 90％ 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열은, 바람직하게는 95％ 이상, 특히 바람직하게는 98％ 이상, 그리고 가장 바람직하게는 99％ 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열일 수 있다.

본 발명에 따른 제2 양태의 신규 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드에 있어서, 서열 9로 표시되는 뉴클레오티드 서열과 90％ 이상의 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열은, 바람직하게는 95％ 이상, 특히 바람직하게는 98％ 이상, 그리고 가장 바람직하게는 99％ 이상의 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열일 수 있다.

본 발명에 따른 제1 양태의 항체에 있어서, 서열 2, 서열 4, 서열 6, 서열 8, 서열 10 또는 서열 12로 표시되는 아미노산 서열과 70％ 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열은, 바람직하게는 80％ 이상, 보다 바람직하게는 85％ 이상, 더욱 바람직하게는 90％ 이상, 더더욱 바람직하게는 95％ 이상, 특히 바람직하게는 98％ 이상, 그리고 가장 바람직하게는 99％ 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열일 수 있다.

본 발명에 있어서, 서열 2, 서열 4, 서열 6, 서열 8, 서열 10 또는 서열 12로 표시되는 아미노산 서열이 주어지면, 이를 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 용이하게 정해져, 서열 2, 서열 4, 서열 6, 서열 8, 서열 10 또는 서열 12로 표시되는 아미노산 서열을 코딩하는 다양한 뉴클레오티드 서열을 선택할 수 있다.

따라서, 서열 2, 서열 4, 서열 6, 서열 8, 서열 10 또는 서열 12로 표시되는 아미노산 서열을 포함하여 이루어지는 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드란, 서 열 1, 서열 3, 서열 5, 서열 7, 서열 9 또는 서열 11로 표시되는 DNA 서열의 일부 또는 전부에 더하여, 동일한 아미노산을 코딩하는 DNA 서열로서 축중 관계에 있는 코돈을 DNA 서열로서 갖는 서열도 의미하는 것으로 한다. 본 발명에서는 또한, 이들에 대응하는 RNA 서열도 포함된다.

서열 2, 서열 4, 서열 6, 서열 8, 서열 10 또는 서열 12로 표시되는 아미노산 서열을 포함하여 이루어지는 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 바람직한 예로서는, 서열 1, 서열 3, 서열 5, 서열 7, 서열 9 또는 서열 11로 표시되는 뉴클레오티드 서열을 포함하여 이루어지는 폴리뉴클레오티드를 들 수 있다.

본 명세서에 있어서, 서열 2, 서열 4, 서열 6, 서열 8, 서열 10 또는 서열 12로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 단백질과 동등한 기능을 갖는지의 여부는 서열 2, 서열 4, 서열 6, 서열 8, 서열 10 또는 서열 12로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 단백질의 발현과 관련된 생체 현상 또는 기능을 평가함으로써 결정할 수 있고, 예를 들면 그의 단백질을 유전자 재조합 기술에 의해 발현시켜, 수상 세포의 활성화 수용체로서 기능하는지의 여부를 평가함으로써 결정할 수 있다. 서열 2, 서열 4, 서열 6, 서열 8, 서열 10 또는 서열 12로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 단백질은 T 세포와 상호 작용하여 수상 세포를 활성화하는 기능을 갖기 때문에, 평가에 있어서는 하기 기능을 지표로 할 수 있다.

-T 세포에 대한 접착 기능(실시예 5, 6, 10 및 11),

-항체 가교 자극에 의한 수상 세포 활성화 기능(실시예 3),

-FcRγ쇄와의 복합체 형성 기능(실시예 4), 또는

-상기 기능의 일부 또는 모든 조합.

[신규 리간드 단백질 및 폴리뉴클레오티드]

본 발명에서 동정된, TARM 단백질의 리간드로서 활성화 T 세포 상에 특이적으로 발현되는 유전자 중 마우스 유래의 유전자로서는, 1 종류의 막 단백질의 유전자를 들 수 있다. 이 유전자의 뉴클레오티드 서열 및 이에 의해 코딩되는 단백질의 아미노산 서열은 서열 13 및 14로 기재된다. 또한, TARM 단백질의 리간드로서 활성화 T 세포 상에 특이적으로 발현되는 유전자 중 인간 유래의 유전자로서는, 1 종류의 막 단백질의 유전자를 들 수 있다. 이 유전자의 뉴클레오티드 서열 및 이에 의해 코딩되는 단백질의 아미노산 서열은 서열 15 및 16으로 기재된다.

본 발명에 따른 신규 리간드 단백질에 있어서, 서열 14 또는 서열 16으로 표시되는 아미노산 서열과 70％ 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열은, 바람직하게는 80％ 이상, 보다 바람직하게는 85％ 이상, 더욱 바람직하게는 90％ 이상, 더더욱 바람직하게는 95％ 이상, 특히 바람직하게는 98％ 이상, 그리고 가장 바람직하게는 99％ 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열일 수 있다.

본 발명에 따른 신규 리간드 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드에 있어서, 서열 13 또는 서열 15로 표시되는 뉴클레오티드 서열과 70％ 이상의 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열은, 바람직하게는 80％ 이상, 보다 바람직하게는 85％ 이상, 더욱 바람직하게는 90％ 이상, 더더욱 바람직하게는 95％ 이상, 특히 바람직하게는 98％ 이상, 그리고 가장 바람직하게는 99％ 이상의 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열일 수 있다.

본 발명에 있어서, 서열 14 또는 서열 16으로 표시되는 아미노산 서열이 주 어지면, 이를 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 용이하게 정해져, 서열 14 또는 서열 16으로 표시되는 아미노산 서열을 코딩하는 다양한 뉴클레오티드 서열을 선택할 수 있다.

따라서, 서열 14 또는 서열 16으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하여 이루어지는 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드란, 서열 13 또는 서열 15로 표시되는 DNA 서열의 일부 또는 전부에 더하여, 동일한 아미노산을 코딩하는 DNA 서열로서, 축중 관계에 있는 코돈을 DNA 서열로서 갖는 서열도 의미하는 것으로 한다. 본 발명에서는 또한, 이들에 대응하는 RNA 서열도 포함된다.

서열 14 또는 서열 16으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하여 이루어지는 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 바람직한 예로서는, 서열 13 또는 서열 15로 표시되는 뉴클레오티드 서열을 포함하여 이루어지는 폴리뉴클레오티드를 들 수 있다.

본원 명세서에 있어서, 서열 14 또는 서열 16으로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 단백질과 동등한 기능을 갖는지의 여부는 서열 14 또는 서열 16으로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 단백질의 발현과 관련된 생체 현상 또는 기능을 평가함으로써 결정할 수 있고, 예를 들면 그의 단백질을 유전자 재조합 기술에 의해 발현시켜, 수상 세포의 활성화 수용체의 T 세포 상의 리간드로서 기능하는지의 여부를 평가함으로써 결정할 수 있다. 서열 14 또는 서열 16으로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 단백질은 TARM 단백질과 결합하기 때문에, 평가에 있어서는, 예를 들면 TARM 단백질에 대한 결합 기능(실시예 12)을 지표로 할 수 있다.

본 발명에 따른 신규 리간드 단백질은 1회 막 관통 단백질로서, N 말단측을 세포외로 하는 방향으로 세포 표면에 발현되어 있다. 따라서, 상기 단백질을 이용하여 상기 단백질에 대한 항체를 제조할 수 있다.

본 발명에 따르면, 서열 14로 표시되는 아미노산 서열의 1번째 내지 159번째, 또는 서열 16으로 표시되는 아미노산 서열의 1번째 내지 158번째의 아미노산 서열의 적어도 6 아미노산 잔기 또는 전부로 이루어지는 폴리펩티드를 포함하여 이루어지는 단백질이 제공된다. 상기 단백질은 TARM-L 단백질의 아미노산 서열의 세포외 영역에 상당하는 부분을 포함하여 이루어지기 때문에, 상기 단백질에 대한 항체를 제조하기 위한 항원으로서 사용할 수 있다.

본 발명에 따르면, 본 발명에 따른 신규 리간드 단백질에 대한 항체를 제조하기 위한, 본 발명에 따른 신규 리간드 단백질의 용도가 제공된다.

[항체]

본 발명에 따른 항체는 TARM 단백질 또는 TARM-L 단백질을 특이적으로 인식할 수 있다. 따라서, 본 발명에 따른 항체를 얻기 위한 TARM 단백질 또는 TARM-L 단백질은 TARM 또는 TARM-L의 항원성을 갖고 있으면 좋고, TARM 단백질 또는 TARM-L 단백질의 아미노산 서열에 있어서 1개 또는 복수개의 아미노산 잔기가 결실, 삽입, 치환 또는 부가된 아미노산 서열을 갖는 단백질이 포함된다. 이러한 단백질이 원래의 단백질과 동일한 생물학적 활성이 유지되는 것은 공지되어 있다(Mark et al.(1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 5662-6; Zoller and Smith(1982) Nucleic Acids Res. 10: 6487-500; Wang et al.(1984) Science 224: 1431-3; Dalbadie-McFarland et al.(1982) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79: 6409-13). 어 느 단백질에 있어서, 원래의 단백질의 항원성을 유지한 상태에서 1개 또는 복수개의 아미노산을 결실, 삽입, 치환 또는 부가시키는 방법은 공지되어 있다. 예를 들면, 부위 특이적 변이 유발법에 의해 변이 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제조하여, 적절히 발현시켜 얻을 수 있다(Molecular Cloning, A Laboratory Manual 2^nd ed., Cold Spring Harbor Press(1989); Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, (1987-1997), Section 8.1-8.5; Hashimoto-Goto et al.(1995) Gene 152: 271-5; Kinkel(1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 488-92; Kramer and Fritz(1987) Method. Enzymol 154: 350-67; Kunkel(1988) Method. Enzymol. 85: 2763-6).

본 발명에 따른 항체에는 TARM 단백질 또는 TARM-L 단백질의 일부에 대하여 특이적인 항체도 포함된다.

즉, 본 발명의 항체를 얻기 위한 TARM 단백질 또는 TARM-L 단백질에는 TARM 단백질 또는 TARM-L 단백질의 전장 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드에 더하여, TARM 단백질 또는 TARM-L 단백질의 적어도 6 아미노산 잔기 이상(예를 들면, 6, 8, 10, 12 또는 15 아미노산 잔기 이상)과 동일한 서열을 갖는 폴리펩티드 단편도 포함된다. 본 명세서에서의 TARM 단백질 또는 TARM-L 단백질의 폴리펩티드 단편은 TARM 단백질 또는 TARM-L 단백질의 항원성만 가지면 어떠한 단편이어도 좋다.

바람직한 단편으로서는, TARM 단백질 또는 TARM-L 단백질의 아미노 말단, 카르복실 말단 등의 폴리펩티드 단편을 들 수 있다. 폴리펩티드의 항원 결정 부위는 단백질의 아미노산 서열 상의 소수성/친수성을 해석하는 방법(Kyte-Doolittle(1982) J. Mol. Biol. 157: 105-22), 이차 구조를 해석하는 방법(Chou-Fasman(1978) Ann. Rev. Biochem. 47: 251-76)에 의해 추정하고, 추가로 컴퓨터 프로그램(Anal. Biochem. 151: 540-6(1985)) 또는 짧은 펩티드를 합성하여 그의 항원성을 확인하는 PEPSCAN법(일본 특허 공표 (소)60-500684호 공보) 등의 수법에 의해 확인할 수 있다.

본 발명에 따른 항체는 바람직하게는 TARM 단백질 또는 TARM-L 단백질의 기능에 영향을 주는 항체이다. "TARM 단백질의 기능에 영향을 준다"란, 예를 들면 본 발명에 따른 제1 양태의 항체에 의한 TARM 단백질의 가교 자극에 의해 수상 세포를 활성화하는 것(실시예 3), 상기 항체가 TARM 단백질과 결합함으로써, TARM 단백질과 T 세포와의 접착을 저해하는 것(실시예 6 및 실시예 11), 및 상기 항체가 TARM 단백질과 결합함으로써, TARM 단백질과 FcRγ쇄와의 복합체 형성을 저해하는 것(실시예 4)이다. "TARM-L 단백질의 기능에 영향을 준다"란, 예를 들면 본 발명에 따른 제2 양태의 항체가 TARM-L 단백질과 결합함으로써, TARM-L 단백질과 TARM 단백질과의 결합을 저해하는 것이다.

본 발명에 따른 항체에는 TARM 단백질 또는 TARM-L 단백질을 항원으로 하여, 상기 항원을 마우스 등의 포유 동물에 면역하여 얻어지는 모노클로날 항체, 유전자 재조합 기술을 이용하여 제조되는 키메라 항체 및 인간형 항체, 및 인간 항체 생산 형질전환 동물 등을 이용하여 제조되는 인간 항체가 포함된다. 본 발명에 따른 항체를 의약으로서 인간에게 투여하는 경우에는 부작용 측면에서 인간 항체가 바람직 하다.

"인간 항체"란, 모든 영역이 인간 유래인 항체이다. 인간 항체는 인간 항체 유전자를 마우스에 도입하여 제조할 수 있다. 예를 들면, 문헌 [Nature Genetics, Vol.7, p.13-21, 1994]; [Nature Genetics, Vol.15, p.146-156, 1997]; 일본 특허 공표 (평)4-504365호 공보; 일본 특허 공표 (평)7-509137호 공보; WO94/25585호 공보; 문헌 [Nature, Vol.368, p.856-859, 1994]; 및 일본 특허 공표 (평)6-500233호 공보에 기재된 방법을 참조하여 제조할 수 있다. 또한, 파아지 디스플레이법을 이용하여 제조할 수도 있다. 예를 들면, 문헌 [Marks, J. D. et al.: J. mol. Biol., Vol.222, p.581-597, 1991]에 기재된 방법을 참조하여 제조할 수 있다.

"인간형 항체"는 마우스 항체의 항원 결합 부위(CDR; 상보성 결정 영역)의 유전자 서열만을 인간 항체 유전자에 이식(CDR 그라프팅)한 항체이다. 예를 들면, 일본 특허 공표 (평)4-506458호 공보 및 일본 특허 공개 (소)62-296890호 공보 등에 기재된 방법을 참조하여 제조할 수 있다.

"키메라 항체"는 마우스 항체의 가변 영역과 인간 항체의 정상 영역을 연결한 항체이다. 구체적으로는, 항원을 마우스에 면역하고, 그 마우스 모노클로날 항체의 유전자로부터 항원과 결합하는 항체 가변부(V 영역)를 잘라내어, 인간 골수 유래의 항체 정상부(C 영역) 유전자와 결합하여 제조할 수 있다. 예를 들면, 일본 특허 공고 (평)3-73280호 공보에 기재된 방법을 참조하여 제조할 수 있다.

본 발명에 따른 모노클로날 항체는 당업자에게 주지된 방법을 이용하여 얻을 수 있다(예를 들면, "Current Protocols in Molecular Biology", John Wiley & Sons(1987), Antibodies: A Laboratory Manual, Ed. Harlow and David Lane, Cold Spring Harbor Laboratory(1988)).

면역 항원으로서는, TARM 단백질 또는 TARM-L 단백질의 단편을 사용할 수 있다. 또는, 상기 아미노산 서열에 기초하여 합성한 것을 사용할 수 있다. 항원은 캐리어 단백질과의 복합체로서 이용할 수도 있다. 항원과 캐리어 단백질의 복합체의 제조에는 다양한 축합제를 사용할 수 있지만, 글루타르알데히드, 카르보디이미드, 말레이미드 활성 에스테르 등을 사용할 수 있다. 캐리어 단백질은 소 혈청 알부민, 티로글로불린, 헤모시아닌 등의 상용되고 있는 것일 수 있고, 통상 1 내지 5배량의 비율로 커플링시키는 방법이 이용된다.

면역되는 동물로서는 마우스, 래트, 토끼, 몰모트, 햄스터 등을 들 수 있고, 접종 방법으로서는 피하, 근육 또는 복강내 투여를 들 수 있다. 투여에 있어서는 완전 프로인트 보조제나 불완전 프로인트 보조제와 혼화하여 투여할 수 있고, 투여는 통상 2 내지 5주마다 1회씩 행해진다.

면역된 동물의 비장 또는 림프절로부터 얻어진 항체 생산 세포는 골수종 세포와 세포 융합시켜 하이브리도마로서 단리된다. 골수종 세포로서는 마우스, 래트, 인간 등에서 유래된 것이 사용되고, 항체 생산 세포와 동종 유래의 것인 것이 바람직하지만, 이종 간에도 가능한 경우도 있다.

세포 융합의 조작은 기지된 방법, 예를 들면 문헌 [Nature, 256, 495, 1975]에 따라 실시할 수 있다.

융합 촉진제로서는 폴리에틸렌글리콜이나 센다이 바이러스 등을 들 수 있고, 통상적으로는 20 내지 50％ 정도의 농도의 폴리에틸렌글리콜(평균 분자량 1000 내지 4000)을 이용하여 20 내지 40 ℃, 바람직하게는 30 내지 37 ℃의 온도하에, 항체 생산 세포수와 골수종 세포수의 비를 통상 1:1 내지 10:1 정도로 하여, 약 1 내지 10분간 정도 반응시킴으로써 세포 융합을 실시할 수 있다.

항체 생산 하이브리도마의 스크리닝에는 다양한 면역 화학적 방법을 사용할 수 있다. 예를 들면, TARM 단백질 또는 TARM-L 단백질을 코팅한 마이크로플레이트를 이용하는 ELISA법, 항 면역 글로불린 항체를 코팅한 마이크로플레이트를 이용하는 EIA법, TARM 단백질을 포함하는 샘플을 전기 영동한 후, 니트로셀룰로오스 전사막을 이용하는 면역 블로팅법 등을 들 수 있다.

항체 생산 하이브리도마의 스크리닝은 또한, 상기 면역 화학적 방법 대신에, 상기 항체가 TARM 단백질 또는 TARM-L 단백질의 기능에 영향을 주는지의 여부에 의해 스크리닝할 수 있다. 본 발명에 따른 제1 양태의 항체가 TARM 단백질의 기능에 미치는 영향, 예를 들면 본 발명에 따른 제1 양태의 항체에 의한 TARM 단백질의 가교 자극에 의해 수상 세포가 활성화되는지의 여부(실시예 3), 상기 항체와 TARM 단백질과의 결합에 의해 TARM 단백질과 T 세포와의 접착 기능을 저해할 수 있는지의 여부(실시예 6 및 실시예 11), 또는 상기 항체와 TARM 단백질과의 결합에 의해 TARM 단백질과 FcRγ쇄와의 복합체 형성을 저해할 수 있는지의 여부(실시예 4)에 의해 항체 생산 하이브리도마를 스크리닝할 수 있다. 본 발명에 따른 제2 양태의 항체가 TARM-L 단백질의 기능에 미치는 영향, 예를 들면 본 발명에 따른 항체의 제2 양태와 TARM-L 단백질과의 결합에 의해 TARM 단백질과 TARM-L 단백질과의 결합 기능을 저해할 수 있는지의 여부에 의해 항체 생산 하이브리도마를 스크리닝할 수 있다. 이 스크리닝 방법에 의해, 본 발명의 항체의 바람직한 형태인 TARM 단백질 또는 TARM-L 단백질의 기능에 영향을 주는 항체를 선택할 수 있다. 또한, 이 스크리닝은 TARM 단백질 또는 TARM-L 단백질과 결합하는 항체를 생산하는지의 여부에 따라 선택하는 상기 면역 화학적 방법 스크리닝에 이어서 행하는 2차 스크리닝으로서 행할 수 있다.

이러한 웰로부터 추가로, 예를 들면 한계 희석법에 의해 클로닝을 행하여 클론을 얻을 수 있다. 하이브리도마의 선별, 육종은 통상적으로 HAT(하이포크산틴, 아미노프테린, 티미딘)를 첨가한 10 내지 20％ 소 태아 혈청을 포함하는 동물 세포용 배지(예, RPMI1640)에서 행해진다. 이와 같이 하여 얻어진 클론을 미리 프리스탄을 투여한 SCID 마우스의 복강 내로 이식하고, 10 내지 14일 후에 모노클로날 항체를 고농도로 포함하는 복수를 채취하여 항체 정제의 원료로 할 수 있다. 또한, 상기 클론을 배양하여, 그 배양물을 항체 정제의 원료로 할 수도 있다.

모노클로날 항체의 정제는 면역 글로불린의 정제법으로서 기지된 방법을 이용하면 좋고, 예를 들면 황산암모늄 분획법, PEG 분획법, 에탄올 분획법, 음이온 교환체의 이용, 프로틴 A 컬럼, 프로틴 G 컬럼 및 TARM 단백질을 이용한 친화성 크로마토그래피 등의 수단에 의해 용이하게 달성할 수 있다.

본 발명에 따른 "기능적 단편"이란, 항체의 일부분(부분 단편)으로서, 본 발명의 단백질을 특이적으로 인식하는 것을 의미한다. 구체적으로는, Fab, Fab', F(ab')₂, 가변 영역 단편(Fv), 디술피드 결합 Fv, 1본쇄 항체(scFv), 및 이들의 중합체 등을 들 수 있다.

본 발명에 따른 제1 양태의 항체의 바람직한 예로서는, 본 발명에 따른 제1 양태의 신규 단백질에 대한 항체 및 그의 기능적 단편을 들 수 있다.

본 발명에 따른 제1 양태의 항체의 바람직한 예로서는 또한, 본 발명에 따른 제2 양태의 신규 단백질에 대한 항체 및 그의 기능적 단편을 들 수 있다.

본 발명에 따른 제1 양태의 항체의 바람직한 예로서는 또한, 하기 단백질에 대한 항체를 들 수 있다.

(ix') 서열 12로 표시되는 아미노산 서열을 포함하여 이루어지는 막 단백질 또는 분비 단백질;

(x') 서열 12로 표시되는 아미노산 서열에 있어서, 1개 또는 복수개의 아미노산의 삽입, 치환 또는 결실, 또는 그의 한쪽 또는 양쪽 말단으로의 1개 또는 복수개의 아미노산의 부가가 이루어진 아미노산 서열을 포함하여 이루어지고, 또한 서열 12로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 단백질과 동등한 기능을 갖는 막 단백질 또는 분비 단백질;

(xi') 서열 12로 표시되는 아미노산 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드와 가혹한 조건에서 하이브리다이제이션하는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되고, 또한 서열 12로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 단백질과 동등한 기능을 갖는 막 단백질 또는 분비 단백질; 및

(xii') 서열 12로 표시되는 아미노산 서열과 70％ 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하여 이루어지고, 또한 서열 12로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 단백질과 동등한 기능을 갖는 막 단백질 또는 분비 단백질.

본 발명에 따른 제1 양태의 항체의 보다 바람직한 예로서는, 서열 12로 표시되는 아미노산 서열 또는 1개 또는 복수개의 보존적 치환을 갖는 서열 12로 표시되는 아미노산 서열을 포함하여 이루어지는 막 단백질 또는 분비 단백질에 대한 항체 또는 그의 기능적 단편을 들 수 있다.

구체예로서는, FERM BP-10376 하에 수탁된 하이브리도마가 생산하는 모노클로날 항체를 들 수 있다.

따라서, 본 발명에 따르면, 2005년 7월 15일부로 독립행정법인 산업기술종합연구소 특허생물기탁센터(일본 305-8566 이바라끼껭 쯔꾸바시 히가시 1쪼메 1반찌 1 주오 다이 6)에 FERM BP-10376 하에 기탁된 하이브리도마(@TARM #6.11)가 제공된다.

본 발명에 따른 제1 양태의 항체의 보다 바람직한 예로서는 또한, 서열 10으로 표시되는 아미노산 서열 또는 1개 또는 복수개의 보존적 치환을 갖는 서열 10으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하여 이루어지는 막 단백질 또는 분비 단백질에 대한 항체 또는 그의 기능적 단편을 들 수 있다.

본 발명에 따른 제2 양태의 항체의 바람직한 예로서는, 서열 14로 표시되는 아미노산 서열 또는 1개 또는 복수개의 보존적 치환을 갖는 서열 14로 표시되는 아미노산 서열을 포함하여 이루어지는 막 단백질 또는 분비 단백질에 대한 항체 또는 그의 기능적 단편을 들 수 있다.

본 발명에 따른 제2 양태의 항체의 바람직한 예로서는 또한, 서열 16으로 표시되는 아미노산 서열 또는 1개 또는 복수개의 보존적 치환을 갖는 서열 16으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하여 이루어지는 막 단백질 또는 분비 단백질에 대한 항체 또는 그의 기능적 단편을 들 수 있다.

본 발명에 따른 제2 양태의 항체의 보다 바람직한 예로서는, TARM-L 단백질의 세포외에 발현되어 있는 폴리펩티드 부분을 인식하는 항체 또는 그의 기능적 단편을 들 수 있다. 이와 같은 항체로서는, 예를 들면 서열 14로 표시되는 아미노산 서열의 1번째 내지 159번째, 서열 16으로 표시되는 아미노산 서열의 1번째 내지 158번째의 아미노산 서열의 적어도 6 아미노산 잔기 또는 전부로 이루어지는 폴리펩티드를 포함하여 이루어지는 단백질에 대한 항체 또는 그의 기능적 단편을 들 수 있다.

[항체의 용도 및 의약 조성물]

자기 면역 질환

면역 응답에 관여하는 림프구인 T 세포는 T 세포에 대한 항원 제시 기능을 갖는 세포로서 알려져 있는 수상 세포와의 협동 작용에 의해 다양한 면역 응답을 담당하고 있다(Kroczek, RA., et al.(2004) Current Opinion in Immunology 16: 321-327). 후술하는 실시예에 의해 나타난 바와 같이, 염증 자극에 의해 수상 세포 상의 TARM 단백질의 발현이 증강되고(실시예 2), TARM 단백질을 통해 수상 세포와 T 세포가 접착되는 것으로 밝혀졌다(실시예 5 및 실시예 10). 또한, 가교 자극된 TARM 단백질에 의해 수상 세포가 활성화되어 IL-6의 생산이 유도되는 것으로 확인되었다(실시예 3). IL-6의 과잉 생산은 자기 면역 질환과 관련되어 있는 것이 보고되어 있다(Ishihara, K., et al.(2002) Cytokine & Growth Factor Reviews 13: 357-368). 또한, TARM 단백질에 대한 항체에 의해 T 세포와 수상 세포와의 접착이 현저히 억제되었다(실시예 6 및 실시예 11).

또한, 후술하는 실시예에서는, 콜라겐 유도 관절염 모델에 있어서, 본 발명에 따른 항체가 실제로 치료 효과를 갖는 것으로 확인되었다(실시예 7). 콜라겐 유도 관절염 모델은 자기 면역 질환의 하나인 류마티스 관절염의 모델이다.

따라서, 본 발명에 따른 제1 양태의 항체는 자기 면역 질환의 치료에 유용하다.

자기 면역 질환으로서는, 예를 들면 류마티스 관절염을 들 수 있다.

마찬가지로, TARM-L 단백질에 대한 항체에 의해 T 세포와 수상 세포와의 접착이 억제된다고 생각된다. 따라서, 본 발명에 따른 제2 양태의 항체는 자기 면역 질환의 치료에 유용하다.

본 발명에 따르면, 자기 면역 질환 치료제의 제조를 위한, 본 발명에 따른 항체의 용도가 제공된다.

본 발명에 따르면, 치료상의 유효량의 본 발명에 따른 항체를, 인간을 포함하는 포유류에 투여하는 공정을 포함하여 이루어지는, 자기 면역 질환의 치료 방법이 제공된다.

T 세포 접착 저해제

후술하는 실시예에서 나타난 바와 같이, TARM 단백질에 대한 항체에 의해 T 세포와 수상 세포와의 접착이 현저히 억제된다(실시예 6 및 실시예 11). 따라서, 본 발명에 따른 제1 양태의 항체는 T 세포 접착 저해제로서 사용할 수 있다.

마찬가지로, TARM-L 단백질에 대한 항체에 의해 T 세포와 수상 세포와의 접착이 억제된다고 생각된다. 따라서, 본 발명에 따른 제2 양태의 항체는 T 세포 접착 저해제로서 사용할 수 있다.

본원 명세서에 있어서, "T 세포 접착"이란 수상 세포와 T 세포와의 접착, 즉 수상 세포 상에 발현된 TARM 단백질과 T 세포 상에 발현된 TARM-L 단백질과의 결합을 의미한다. 본 발명의 T 세포 접착 저해제를 이용하여, 수상 세포 상에 발현된 TARM 단백질과 T 세포 상에 발현된 TARM-L 단백질과의 결합을 저해함으로써, 수상 세포와 T 세포의 상호 작용에 의해 생기는 면역 응답, 예를 들면 수상 세포 및 T 세포의 활성화, 증식, 분화, 사이토카인·케모카인 생산을 억제할 수 있다.

의약 조성물

본 발명에 따른 항체의 투여 형태는 특별히 제한되지 않고, 경구 투여, 비경구 투여(예를 들면, 정맥 주사, 근육 주사, 피하 투여, 직장 투여, 경피 투여, 국소 투여) 중 임의의 투여 경로로 인간을 포함하는 포유류에 투여할 수 있지만, 비경구 투여, 특히 정맥 주사가 바람직하다.

경구 투여 및 비경구 투여를 위한 제형 및 그의 제조 방법은 당업자에 주지되어 있고, 본 발명에 따른 항체를 약학적으로 허용되는 담체 등과 혼합 등을 함으로써, 통상법에 따라서 제조할 수 있다.

약학상 허용되는 담체로서는, 예를 들면 제제 분야에서 상용되면서, 본 발명에 따른 항체와 반응하지 않는 물질이 이용된다. 약학상 허용되는 담체로는, 예를 들면 통상 이용되는 부형제, 결합제, 붕해제, 활택제, 착색제, 교미교취제나, 필요에 따라 안정화제, 유화제, 흡수 촉진제, 계면 활성제, pH 조정제, 방부제, 항산화제, 증량제, 습윤화제, 표면 활성화제, 분산제, 완충제, 보존제, 용해 보조제, 무통화제 등을 사용할 수 있고, 일반적으로 의약품 제제의 원료로서 이용되는 성분을 배합하여 통상법에 따라 제제화하는 것이 가능하다.

비경구 투여를 위한 제형은 주사용 제제(예를 들면, 점적 주사제, 정맥 주사제, 근육 주사제, 피하 주사제, 피내 주사제), 외용제(예를 들면, 연고제, 습포제, 로션제), 좌제, 흡입제, 안제, 안연고제, 점비제, 점이제, 리포솜제 등을 들 수 있다.

예를 들면, 주사용 제제는 통상적으로 본 발명에 따른 항체를 주사용 증류수에 용해시켜 제조하지만, 필요에 따라 용해 보조제, 완충제, pH 조정제, 등장화제, 무통화제, 보존제, 안정화제 등을 첨가할 수 있다. 또한, 사용시 조제하는 동결 건조 제제로 할 수도 있다.

경구 투여를 위한 제형은 고체 또는 액체의 제형, 구체적으로는 정제, 피복 정제, 환제, 세립제, 과립제, 산제, 캡슐제, 시럽제, 유제, 현탁제, 주사제, 트로키제 등을 들 수 있다.

본 발명에 따른 의약 조성물은 치료상 유효한 다른 약제를 추가로 함유할 수 있고, 또한 필요에 따라 혈류 촉진제, 살균제, 소염제, 세포 부활제, 비타민류, 아 미노산, 보습제, 각질 용해제 등의 성분을 배합할 수도 있다. 이 때의 유효 성분의 담체에 대한 비율은 1 내지 90 중량％ 사이에서 변동될 수 있다.

본 발명에 따른 항체의 투여량은, 예를 들면 투여 경로, 질환의 종류, 증상의 정도, 환자의 연령, 성별, 체중, 질환의 위중도, 약물 동태 및 독물학적 특징 등의 약리학적 지견, 약품 송달계의 이용 유무, 및 다른 약품의 조합의 일부로서 투여되는지 등의 다양한 인자를 바탕으로 임상 의사에 의해 결정할 수 있지만, 통상 성인(체중 60 kg)당 경구 투여에서는 1 내지 5000 mg/일, 바람직하게는 10 내지 2000 mg/일, 더욱 바람직하게는 50 내지 2000 mg/일을, 주사 투여에서는 1 내지 5000 mg/일, 바람직하게는 5 내지 2000 mg/일, 더욱 바람직하게는 50 내지 2000 mg/일을 1회 또는 수회로 나누어 투여할 수 있다. 소아에게 투여되는 경우에는, 용량은 성인에게 투여되는 양보다 적을 가능성이 있다. 실제로 이용되는 투여법은 임상 의사의 판단에 따라 대폭 변동될 수도 있어, 상기 투여 범위에서 벗어날 수 있다.

[스크리닝 방법]

TARM 단백질과 T 세포와의 접착을 저해하는 물질의 스크리닝 방법

본 발명에 따른 제1 양태의 스크리닝 방법에 따르면, TARM 단백질과 T 세포와의 접착을 저해하는 물질의 스크리닝법이 제공된다.

TARM 단백질은 수상 세포 상에 발현되고, 수상 세포와 T 세포 간의 면역 응답에 관한 상호 작용에 관여하고 있다. 또한, TARM 단백질로 가교 자극이 가해짐으로써, 자기 면역 질환의 원인이 되기도 하는 IL-6의 생산이 유도된다. 따라서, 본 발명에 따른 제1 양태의 스크리닝 방법은 TARM 단백질과 T 세포와의 접착을 저해하는 물질의 스크리닝에 사용할 수 있고, 바람직하게는 자기 면역 질환, 보다 바람직하게는 류마티스 관절염의 치료에 유용한 물질의 스크리닝에 사용할 수 있다.

본 발명에 따른 제1 양태의 스크리닝법에 있어서는, 공정 (b) 후에 (c) 피검 물질의 존재하에서의 결합 활성과 피검 물질의 비존재하에서의 결합 활성을 비교하는 공정을 추가로 포함할 수 있다.

공정 (c)에 있어서는, 피검 물질의 존재하에서의 결합 활성이 피검 물질의 비존재하에서의 결합 활성을 하회하는 경우에, 바람직하게는 50％ 이하인 경우에, 상기 피검 물질이 본 발명에 따른 단백질과 T 세포와의 결합을 저해한다고 판정할 수 있다.

공정 (a)에 있어서, "접촉시킨다"란 TARM 단백질과 T 세포가 직접 접촉하는 양태이면 특별히 한정되는 것은 아니고, 예를 들면 TARM 단백질을 고상화한 플레이트에 표지한 T 세포를 첨가하는 방법, 또는 T 세포를 포함하는 플레이트에 표지한 TARM 단백질을 첨가하는 방법에 의해 실시할 수 있다.

T 세포는, 바람직하게는 활성화 T 세포, 보다 바람직하게는 활성화 Th2 세포이다.

공정 (b)에 있어서, 결합 활성의 측정은 공지된 방법에 따라 행할 수 있다. 예를 들면, TARM 단백질을 고상화한 플레이트에 표지한 T 세포를 첨가하여 일정 시간 배양한 후, 세정 등에 의해 접착되지 않은 세포를 제거하고, 접착된 세포에 대하여 측정함으로써 결합 활성을 측정할 수 있다.

상기 표지로서는, 예를 들면 방사성 동위 원소, 효소, 형광 물질(형광 단백질을 포함함), 발광 물질 등이 이용된다. 방사성 동위 원소로서는, 예를 들면 [³H], [¹⁴C], [¹²⁵I], [³⁵S] 등을 사용할 수 있다. 상기 효소로서는, 예를 들면 β-갈락토시다아제, 알칼리 포스파타아제, 페록시다아제, 루시페라아제 등을 사용할 수 있다. 형광 물질로서는, 예를 들면 플루오레세인 이소티오시아네이트, BODIPY, Calcein-AM(도진사 제조) 등을, 또한 형광 단백질로서는, 예를 들면 GFP 등을 사용할 수 있다. 이들 효소 및 형광 단백질은, 세포에 이들의 유전자를 도입하여 발현시키는 것도 가능하다. 발광 물질로서는, 예를 들면 루시페린, 루시게닌 등을 사용할 수 있다. 경우에 따라서는, 상기 리간드와 표지 물질을 결합시키기 위해 비오틴-아비딘계를 이용할 수도 있다.

또한, T 세포를 표지하지 않고 첨가하고, 접착된 T 세포를 T 세포에 특이적인 항체, 예를 들면 항 CD3 항체, 또는 핼퍼 T 세포에 특이적인 항체, 예를 들면 항 CD4 항체에 의해 검출할 수도 있다.

결합 활성은 첨가한 세포에 대하여 미리 측정해 두고, 첨가한 세포에 대한 접착된 세포의 비율로 표시할 수 있다.

수상 세포의 활성화를 저해하는 물질의 스크리닝 방법

본 발명에 따른 제2 양태의 스크리닝 방법에 따르면, 수상 세포의 활성화를 저해하는 물질의 스크리닝 방법이 제공된다.

가교 자극된 TARM 단백질에 의해 수상 세포를 활성화할 수 있다(실시예 3 및 4). 따라서, TARM 항체에 의해 가교 자극된 수상 세포계를 이용하여, 수상 세포의 활성화를 저해하는 물질을 스크리닝할 수 있다.

상술한 바와 같이, 수상 세포의 활성화에 의해 자기 면역 질환이 야기되는 것으로 나타났다. 따라서, 본 발명에 따른 수상 세포의 활성화를 저해하는 물질의 스크리닝법은, 바람직하게는 자기 면역 질환, 보다 바람직하게는 류마티스 관절염의 치료에 유용한 물질의 스크리닝에 사용할 수 있다.

수상 세포 상에 발현된 TARM 단백질에 가교 자극을 주면 수상 세포가 활성화되는데, 이 때, TARM 단백질은 시그널 전달 분자로서 알려져 있는 FcRγ쇄와 복합체를 형성하는 동시에, 자기 면역 질환의 원인이 되기도 하는 IL-6이나, 단구의 주화성 인자인 MCP-1의 생산이 유도된다. 따라서, 본 발명에 따른 제2 양태의 스크리닝 방법의 공정 (e)에 있어서는, 수상 세포의 활성화의 정도를 수상 세포에 있어서의 IL-6 및/또는 MCP-1의 생산량을 지표로 하여 측정할 수 있거나, 수상 세포의 활성화의 정도를 수상 세포에 있어서의 FcRγ쇄의 발현량을 지표로 하여 측정할 수 있다.

본 발명에 따른 제2 양태의 스크리닝법에 있어서, 수상 세포의 활성화의 정도를 수상 세포에 있어서의 IL-6 및/또는 MCP-1의 생산량을 지표로 하여 측정하는 경우에는, 공정 (e) 후에 (f-1) 피검 물질의 존재하에서의 IL-6 및/또는 MCP-1의 생산량과 피검 물질의 비존재하에서의 IL-6 및/또는 MCP-1의 생산량을 비교하는 공정을 추가로 포함할 수 있다. 공정 (f-1)에 있어서는, 피검 물질의 존재하에서의 IL-6 및/또는 MCP-1의 생산량이 피검 물질의 비존재하에서의 IL-6 및/또는 MCP-1의 생산량을 하회하는 경우에, 바람직하게는 50％ 이하인 경우에, 상기 피검 물질이 수상 세포의 활성화를 저해한다고 판정할 수 있다.

본 발명에 따른 제2 양태의 스크리닝법에 있어서는 또한, 수상 세포의 활성화 정도를 수상 세포에 있어서의 FcRγ쇄의 발현량을 지표로 하여 측정하는 경우에는, 공정 (e) 후에 (f-2) 피검 물질의 존재하에서의 FcRγ쇄의 발현량과 피검 물질의 비존재하에서의 FcRγ쇄의 발현량을 비교하는 공정을 추가로 포함할 수 있다.

공정 (f-2)에 있어서는, 피검 물질의 존재하에서의 FcRγ쇄의 발현량이 피검 물질의 비존재하에서의 FcRγ쇄의 발현량을 하회하는 경우에, 바람직하게는 50％ 이하인 경우에, 상기 피검 물질이 수상 세포의 활성화를 저해한다고 판정할 수 있다.

공정 (d)에 있어서, "접촉시킨다"란 수상 세포 상의 TARM 단백질이, 본 발명에 따른 항체에 의해 가교 자극되는 양태이면 특별히 한정되는 것은 아니고, 예를 들면 본 발명에 따른 항체를 포함하는 배지에서 수상 세포를 배양함으로써 행할 수 있다.

공정 (e)에 있어서, 단백질의 생산량이나 발현량의 측정은 공지된 방법에 따라 행할 수 있지만, 시판되는 키트를 사용할 수도 있다.

TARM 단백질과 FcR γ쇄와의 복합체 형성을 저해하는 물질의 스크리닝 방법

본 발명에 따른 제3 양태의 스크리닝 방법에 따르면, TARM 단백질과 FcRγ쇄와의 복합체 형성을 저해하는 물질의 스크리닝 방법이 제공된다.

TARM 단백질은 수상 세포 상에 발현되고, 시그널 전달 분자로서 잘 알려져 있는 FcRγ쇄와 복합체를 형성한다. 또한, FcRγ쇄는 TARM 단백질과 복합체를 형성함으로써 세포 표면으로의 발현이 증가하는 것이 시사되어 있다. 따라서, 본 발명에 따른 스크리닝 방법은 TARM 단백질과 FcRγ쇄와의 복합체 형성을 저해하는 물질의 스크리닝에 이용할 수 있고, 바람직하게는 자기 면역 질환, 보다 바람직하게는 류마티스 관절염의 치료에 유용한 물질의 스크리닝에 사용할 수 있다.

본 발명에 따른 스크리닝법에 있어서는, 공정 (h) 후에 (i) 피검 물질의 존재하에서의 FcRγ쇄의 발현량과 피검 물질의 비존재하에서의 FcRγ쇄의 발현량을 비교하는 공정을 추가로 포함할 수 있다.

공정 (i)에 있어서는, 피검 물질의 존재하에서의 FcRγ쇄의 발현량이 피검 물질의 비존재하에서의 FcRγ쇄의 발현량을 하회하는 경우에, 바람직하게는 50％ 이하인 경우에, 상기 피검 물질이 본 발명에 따른 단백질과 FcRγ쇄와의 복합체 형성을 저해한다고 판정할 수 있다.

공정 (g)에 있어서, "접촉시킨다"란 TARM 단백질과 FcRγ쇄를 발현시킨 수상 세포와 본 발명의 항체가 직접 접촉하는 양태이면 특별히 한정되는 것은 아니고, 예를 들면 본 발명에 따른 항체를 포함하는 배지에서 수상 세포를 배양함으로써 행할 수 있다.

공정 (h)에 있어서, 발현량의 측정은 공지된 방법에 따라 행할 수 있지만, 예를 들면 플로우 사이토메트리를 이용하여 측정할 수 있다.

본원 명세서에 있어서, "피검 물질"로서는, 합성 저분자 화합물, 단백질, 합성 펩티드, 정제 또는 부분 정제 폴리펩티드, 항체, 세균 방출 물질(세균 대사산물 을 포함), 핵산(안티센스, 리보자임, RNAi 등) 등을 들 수 있고, 바람직하게는 화합물 또는 그의 염 또는 이들의 용매화물(예를 들면, 수화물)이지만, 이들에 한정되는 것은 아니다. "피검 물질"은 신규한 물질일 수도 있고, 공지된 물질일 수도 있다.

이하, 실시예에 의해 본 발명을 상세히 설명하지만, 하기 실시예는 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다. 한편, 실시예에서는 "TARM 단백질"을 단순히 "TARM", "TARM-L 단백질"을 단순히 "TARM-L"이라 하는 경우가 있다. 또한, 마우스 유래의 TARM 단백질을 단순히 "mTARM", 인간 유래의 TARM 단백질을 단순히 "hTARM"이라 하는 경우가 있다.

[ 실시예 1] 마우스 TARM 유전자의 단리 및 발현 해석

(1) mTARM 유전자의 단리

마우스 비장으로부터 분리한 CD4 T 세포를 시험관내 배양에 의해 Th1 또는 Th2로 분화시키고, 각각으로부터 드라이버 또는 테스터로 이용하는 cDNA 단편을 제조하고, 고감도 서브트랙션(N-RDA)법을 행하는 과정에서 얻어진 cDNA 단편의 서열을 이용하여 Blast 검색을 행하였다. 그 결과, 기능 미지의 세포막 단백질을 코딩하는 유전자(Genbank^TM accession No. NM_177363)가 얻어졌다.

GenBank^TM의 서열(NM_177363)을 바탕으로 PCR용 프라이머를 하기와 같이 설계하고, 마우스의 각 장기에 있어서의 mTARM 유전자의 발현을 검토하였다.

각 장기의 전체 RNA(Promega사 제조)로부터 RNA PCR kit(TAKARA사 제조)를 이용하여 합성한 1본쇄 cDNA를 주형으로 하여, ABI7700(Applied Biosystems사 제조)으로 실시간 PCR을 행하였다. PCR은 이하의 반응액 조성(QuantiTect SYBR Green PCR Master Mix(QIAGEN사 제조) 12.5 μl, 우라실 DNA 글리코실라아제(Invitrogen사 제조) 0.25 μl, 100 μM mTARM F 프라이머 0.125 μl, 100 μM m TARM R 프라이머 0.125 μl, 주형 cDNA(10배 희석) 2.5 μl, 증류수 7.25 μl)으로 행하였다. PCR은 94℃에서 10분간 처리한 후, 94℃에서 30초, 60℃에서 1분의 반응을 35 사이클로 행하였다. 그 결과, mTARM은 신장에서 발현되었다.

따라서, 신장의 전체 RNA를 이용하여 5'-RACE(Rapid Amplification of cDNA Ends) 및 3'-RACE를 행하고, mTARM의 전장 유전자 서열의 결정을 시도하였다.

우선, 마우스 신장의 전체 RNA로부터 cDNA synthesis kit(TAKARA사 제조)를 이용하여 2본쇄 cDNA를 합성하고, Qiaquick PCR purification kit(QIAGEN사 제조)를 이용하여 cDNA를 정제하였다. 다음으로, ad29 어댑터(

와

를 어닐링시킨 것)을 부가하여 RACE의 주형으로 하였다.

1^st PCR은 이하의 반응액 조성(10×ExTaq 버퍼 5 μl, 2.5 mM dNTP 4 μl, ExTaq 0.25 μl, 100 μM 프라이머(5'PCR4) 0.5 μl, 100 μM Gene specific primer 0.5 μl, ad29 어댑터 부가 cDNA(25배 희석) 1 μl, 증류수 38.75 μl)으로 행하였다.

프라이머는 하기의 서열을 사용하였다.

, 또는

PCR은 94℃에서 5분간 처리한 후, 94℃에서 30초, 65℃에서 1분, 72℃에서 5분의 반응을 30 사이클 행하고, 마지막으로 72℃에서 5분간 반응시켰다.

2^nd PCR은 이하의 반응액 조성(10×ExTaq 버퍼 5 μl, 2.5 mM dNTP 4 μl, ExTaq 0.25 μl, 100 μM 프라이머(5'PCR1) 0.5 μl, 100 μM Gene specific primer 0.5 μl, 1^st PCR 산물(100배 희석) 1 μl, 증류수 38.75 μl)으로 행하였다.

프라이머는 하기의 서열을 사용하였다.

, 또는

PCR은 94℃에서 5분간 처리한 후, 94℃에서 30초, 65℃에서 30초, 72℃에서 5분의 반응을 25 사이클 행하고, 마지막으로 72℃에서 5분간 반응시켰다. 증폭된 cDNA 단편을 pCR2.1(Invitrogen사 제조)에 클로닝한 후, ABI3100 시퀀스 애널라이저(Applied Biosystems사 제조)를 이용하여 뉴클레오티드 서열을 결정하였다.

그 결과, 5'RACE에서는 2 종류, 3'RACE에서는 3 종류의 cDNA가 얻어졌고, 스플라이싱 이소폼의 존재가 분명해졌다.

RACE에서 얻어진 뉴클레오티드 서열 정보를 이용하여, 각 스플라이싱 이소폼을 증폭시키는 프라이머의 설계를 행하였다. 마우스 골수의 전체 RNA로부터 cDNA synthesis kit(TAKARA사 제조)를 이용하여 2본쇄 cDNA를 합성하고, Qiaquick PCR purification kit(QIAGEN사 제조)를 이용하여 cDNA를 정제하였다. PCR은 이하의 반응액 조성(10×ExTaq 버퍼 5 μl, 2.5 mM dNTP 4 μl, ExTaq 0.25 μl, 100 μM 5' 프라이머 0.5 μl, 100 μM 3' 프라이머 0.5 μl, cDNA(25배 희석) 1 μl, 증류수 38.75 μl)으로 행하였다.

프라이머는 하기의 서열을 사용하였다.

, 또는

PCR은 94℃에서 5분간 처리한 후, 94℃에서 30초, 65℃에서 30초, 72℃에서 5분의 반응을 35 사이클 행하고, 마지막으로 72℃에서 5분간 반응시켰다. 2종의 프라이머 세트에서 6 종류의 스플라이싱 이소폼을 확인할 수 있다. 그 결과, 스플라이싱 이소폼 6 종류의 조합 중 5 종류에서 증폭산물이 얻어졌기 때문에, 증폭된 cDNA 단편을 pCR2.1(Invitrogen사 제조)에 클로닝한 후, ABI3100 시퀀스 애널라이저를 이용하여 뉴클레오티드 서열을 결정하였다.

그 결과, 4 종류의 막 결합형 TARM 유전자(m1, m2, m3, m4)와 1 종류의 분비형 TARM 유전자(s1)를 코딩하는 스플라이싱 이소폼의 존재가 분명해졌다(도 1).

(2) mTARM 유전자의 발현 해석

mTARM 유전자의 마우스 정상 조직에서의 발현 해석을 행하였다. 상기와 같이 스플라이싱 이소폼이 존재하고 있기 때문에, 3개의 프라이머 세트를 설계하였다.

세트 1(m1, m2 이소폼을 특이적으로 증폭시키도록 설계)

세트 2(m3, m4 이소폼을 특이적으로 증폭시키도록 설계)

세트 3(s1 이소폼을 특이적으로 증폭시키도록 설계)

마우스 장기로부터 RNeasy mini kit(QIAGEN사 제조)를 이용하여 제조한 전체 RNA 또는 구입한 각 장기의 전체 RNA(Promega사 제조)로부터 RNA PCR kit(TAKARA사 제조)를 이용하여 합성한 1본쇄 cDNA를 주형으로 하여, ABI7700으로 실시간 PCR을 행하였다. PCR은 이하의 반응액 조성(QuantiTect SYBR Green PCR Master Mix(QIAGEN사 제조) 12.5 μl, 우라실 DNA 글리코실라아제(Invitrogen사 제조) 0.25 μl, 100 μM F 프라이머 0.125 μl, 100 μM R 프라이머 0.125 μl, 주형 cDNA(10배 희석) 2.5 μl, 증류수 7.25 μl)으로 행하였다.

PCR은 94℃에서 10분간 처리한 후, 94℃에서 30초, 60℃에서 1분의 반응을 35 사이클로 행하였다.

그 결과, mTARM은 골수에서 강하게 발현된 것으로 밝혀졌다(도 2).

이어서, mTARM의 각종 세포에 있어서의 발현 해석을 행하였다.

마우스 비장으로부터 분리 정제한 세포, 시험관 내에서 배양한 세포 및 각종 세포주로부터 RNeasy mini kit(QIAGEN사 제조)를 이용하여 전체 RNA를 제조하고, RNA PCR kit(TAKARA사 제조)를 이용하여 1본쇄 cDNA를 합성하여 주형으로 하고, ABI7700으로 실시간 PCR을 마우스 정상 조직에서의 발현 해석과 마찬가지로 행하였다.

그 결과, mTARM은 골수 유래 수상 세포에서 강하게 발현된 것으로 밝혀졌다(도 3).

[ 실시예 2] 마우스 TARM 에 대한 항체의 제조와 발현 해석

(1) mTARM 유전자 발현 세포의 제조

mTARM 유전자 발현 벡터의 제조는 이하와 같이 행하였다.

프라이머는 이소폼 m1의 뉴클레오티드 서열을 바탕으로 설계하였다.

골수의 전체 RNA로부터 RNA PCR kit(TAKARA사 제조)를 이용하여 1본쇄 cDNA를 합성하여 주형으로 이용하였다. PCR은 이하의 반응액 조성(10×버퍼 5 μl, 2.5 mM dNTP 4 μl, Pyrobest polymerase(TAKARA사 제조) 0.5 μl, 100 μM 프라이머 각 0.5 μl, cDNA 1 μl, DMSO 2.5 μl, 증류수 36 μl)으로 행하였다. PCR은 94℃에서 5분간 처리한 후, 94℃에서 30초, 65℃에서 30초, 72℃에서 5분의 반응을 35 사이클 행하고, 마지막으로 72℃에서 2분간 반응시켰다. 증폭된 cDNA를 pBlueScriptII SK(＋)(Stratagene사 제조)에 클로닝하여, ABI3100 시퀀스 애널라이저를 이용하여 뉴클레오티드 서열을 확인하였다. 얻어진 cDNA 단편을 발현 벡터 pMXII IRES EGFP(Oncogene(2000) 19(27): 3050-3058)에 삽입하여, mTARM 유전자 발현 벡터를 제조하였다.

재조합 레트로바이러스의 제조는 이하와 같이 행하였다.

293/EBNA-1 세포주(Invitrogen사 제조) 3×10⁶개를 배지(D-MEM/10％ FBS)에 현탁하여 10 cm 디쉬에 뿌리고, CO₂ 인큐베이터에서 24 시간 배양하였다. 다음날, 배지를 교환하고, 이하와 같이 제조한 형질감염 용액을 가하여 형질감염을 행하였다. 형질감염 용액은 5 ml 튜브에 OPTI-MEM(GIBCO BRL사 제조) 600 μl와 TransIT LT1(TaKaRa사 제조) 24 μl를 가하여 혼합하여 실온에서 5분간 정치한 후, 발현 벡터 9 μg과 패키징 벡터인 pCL-Eco(Imgenex사 제조) 9 μg을 가하여 실온에서 5분간 정치하여 제조하였다. 48 시간 후에, 배양 상청액을 회수하여 0.45 ㎛의 필터 여과를 행하여 재조합 바이러스액을 얻었다.

이 재조합 바이러스를 이하와 같이 B300.19 세포주(EMBO J.(1984) 3: 1209-1219)에 감염시켜, mTARM 유전자 발현 세포를 제조하였다. B300.19 세포 1×10⁶개를 15 ml 튜브에 가하고, 1200 rpm으로 25℃에서 5분간 원심한 후, 배양 상청액을 흡인 제거하였다. 세포에, 재조합 바이러스액 2 ml에 폴리브렌(10 mg/ml) 2 μl와 55 μM 2-머캅토에탄올 2 μl를 가하여 혼합한 용액을 가하고, 2500 rpm으로 30℃에서 2 시간 원심하여 감염을 행하였다. 감염 후에 재조합 바이러스액을 제거하고, 배지(RPMI-1640/10％ FBS/55 μM 2-머캅토에탄올)를 가하여 배양을 행하였다. EGFP 양성 세포를 셀 소팅에 의해 분리함으로써 mTARM 발현 세포를 얻었다.

(2) mTARM의 세포외 영역과 SEAP 및 Fc 키메라 단백질의 제조

우선, pcDNA3.1(+)-SEAP(His)₁₀-Neo 벡터를 이하와 같이 제조하였다.

pcDNA3.1(+)-Neo 벡터(Invitrogen사 제조)의 내재성의 SalI 사이트는 SalI으로 소화시킨 후, 평활화를 행함으로써 결손시켰다. SEAP(His)₁₀의 cDNA 단편은 pDREF-SEAP His₆-Hyg(J. Biol. Chem., 1996, 271, 21514-21521)을 주형으로 하여, HindIII를 부가한 5' 프라이머와 XhoI을 부가한 3' 프라이머를 이용하여 PCR로 증폭시켰다. 얻어진 cDNA 단편을 HindIII와 XhoI으로 소화시킨 후, SalI 사이트를 결손시킨 pcDNA3.1(+)-Neo 벡터에 삽입하였다.

다음으로, mTARM의 세포외 영역은 mTARM 전장 cDNA를 주형으로 하여, SalI을 부가한 5' 프라이머(mTARM_F2: (서열 36))와 NotI을 부가한 3' 프라이머

를 이용하여 PCR로 증폭시켰다. PCR은 이하의 반응액 조성(10×버퍼 5 μl, 2.5 mM dNTP 4 μl, Pyrobest polymerase(TAKARA사 제조) 0.5 μl, 100 μM 프라이머 각 0.5 μl, cDNA 1 μl, DMSO 2.5 μl, 증류수 36 μl)으로 행하였다. PCR은 94℃에서 5분간 처리한 후, 94℃에서 30초, 65℃에서 30초, 72℃에서 5분의 반응을 35 사이클 행하고, 마지막으로 72℃에서 2분간 반응시켰다. 증폭된 cDNA를 pBlueScriptII SK(＋)(Stratagene사 제조)에 클로닝하여, ABI3100 시퀀스 애널라이저를 이용하여 뉴클레오티드 서열을 확인하였다. 얻어진 cDNA 단편을 SalI과 NotI으로 소화시킨 후, 상기 pcDNA3.1(+)-SEAP(His)₁₀-Neo 벡터에 삽입하여 mTARM-AP 발현 벡터를 제조하였다.

이에 따라, mTARM의 세포외 영역과 분비형 인간 태반성 알칼리 포스파타아제가 3개의 아미노산 링커(Ala-Ala-Ala)로 결합되고, 또한 C 말단에 10개의 히스티딘 태그 (His)₁₀가 붙은 분비 키메라 단백질(이하 AP 키메라 단백질)의 발현이 가능해진다. 얻어진 AP 키메라 단백질 발현 벡터는 TransIT LT1(TAKARA사 제조)를 이용하여 293/EBNA-1 세포주에 도입하여 4 내지 5일간 배양을 행하였다. 배양 상청액 중에 분비된 AP 키메라 단백질은, 원심 분리에 의해 배양 상청액을 회수하고, 0.22 ㎛의 필터로 여과한 후, Hepes(pH 7.4)와 아지드화 나트륨을 각각 최종 농도가 20 mM, 0.02％가 되도록 가하여 4℃에서 보존하였다. AP 키메라 단백질의 농도는 알칼리 포스파타아제 활성을 Aurora AP chemiluminescent reporter gene assay(ICN사 제조)를 이용하여 측정하여 산출하였다.

(3) mTARM에 대한 모노클로날 항체의 제조

면역용 항원으로서 이용하기 위해, 우선 mTARM-AP 키메라 단백질의 정제를 행하였다.

정제는 AP 키메라 단백질의 C 말단에 존재하는 히스티딘 태그를 이용하여, His Trap Kit(Amersham Biosciences사 제조)를 이용하여 행하였다. mTARM-AP 키메라 단백질을 포함하는 배양 상청액을 1 ml의 HiTrap chelating HP 컬럼(Amersham Biosciences사 제조)에 첨가하고, 10 mM 이미다졸 용액으로 세정한 후, 500 mM 이미다졸 용액으로 mTARM-AP 키메라 단백질을 컬럼으로부터 용출하였다. mTARM-AP 키메라 단백질의 농도는 Aurora AP chemiluminescent reporter gene assay(ICN사 제조)를 이용한 효소 활성 측정과 Protein Assay kit II(BIO-RAD사 제조)를 이용한 단백질 정량에 의해 산출하였다.

얻어진 mTARM-AP 키메라 단백질은 TiterMax와 혼합하여 WKY 래트(닛본 SLC사로부터 입수)에 면역시켰다. 면역된 래트로부터 림프구를 단리하고, P3 골수종 세포(ATCC)와 림프구의 비율이 1:5가 되도록 혼합하고, PEG1500 용액(베링거사 제조)을 이용하여 세포 융합을 행하였다. HAT 배지(Invitrogen사 제조)에서 하이브리도마를 선택하고, 얻어진 하이브리도마의 배양 상청액은 mTARM-Fc 키메라 단백질을 이용한 샌드위치 ELISA에 의한 스크리닝을 행하였다. 양성 웰로부터 클로닝을 행하여 3 종류의 클론(#6, #21, #37)을 얻었다. mTARM-IRES-EGFP를 도입한 B300.19 세포에, 제조된 항 mTARM 항체를 반응시켜 FACS에 의해 해석한 결과, 제조한 항체는 EGFP를 발현하고 있는 B300.19 세포에만 반응하여(도 4B), 항 mTARM 항체의 특이성이 확인되었다.

얻어진 항 mTARM 모노클로날 항체 #6, #21, #37을 생산하는 하이브리도마를 누드 마우스의 복강에 접종하여 복수를 얻고, 프로틴 G 컬럼을 이용하여 항체를 정제하였다. 항 mTARM 모노클로날 항체 #6을 생산하는 하이브리도마는 FERM BP-10376 하에 독립행정법인 산업기술종합연구소 특허생물기탁센터에 기탁되었다.

(4) 골수 유래의 배양 수상 세포에 있어서의 TARM 단백질의 발현

얻어진 모노클로날 항체(mAb)를 이용하여 mTARM 단백질의 골수 유래의 배양 수상 세포 표면 상으로의 발현을 검토하였다.

골수 유래의 배양 수상 세포는 하기의 방법으로 제조하였다. C57BL/6 웅성 마우스(닛본 SLC사로부터 입수)의 골수 세포를 2×10⁶개/10 ml가 되도록 마우스 GM-CSF(20 ng/ml)(R & D system사 제조)를 포함하는 배지(RPMI1640/10％ FBS/1 mM 피루브산나트륨/55 μM 2-머캅토에탄올)에 현탁하고, 무처리 10 cm 디쉬에 뿌려서 배양하였다. 3일 후에, 마우스 GM-CSF(20 ng/ml)를 포함하는 배지 10 ml를 가하여 배양을 계속하였다. 추가로 3일 후, 배양액 10 ml를 회수하여 원심한 후, 세포 덩어리를 신선한 마우스 GM-CSF(20 ng/ml)를 포함하는 배지 10 ml에 현탁하고, 원래의 무처리 10 cm 디쉬에 되돌려 2일간 배양하였다. 이와 같이 하여 얻어진 미숙 수상 세포는 LPS(100 ng/ml)(Sigma사 제조)를 포함하는 배지에 1×10⁷개/10 ml가 되도록 현탁하고, 세포 배양 처리 종료 10 cm 디쉬에 뿌려 1일간 배양하여 성숙 수상 세포를 얻었다.

골수 유래의 미숙 수상 세포를 5％ 마우스 혈청을 포함하는 FACS 완충액(PBS/1％ FBS/1 mM EDTA)에 현탁하고, 항체 #6 또는 항체 #21(10 μg/ml)과 반응시킨 후, PE 표지 당나귀 항 래트 IgG 이차 항체(Jackson사 제조)와 반응시키고, FACSCalibur(Becton Dickinson사 제조)를 이용하여 측정하였다. 그 결과, 항체 #6, 항체 #21 모두 음성 대조구의 래트 IgG에 비하여 강한 양성 반응이 보였다.

이에, 상세히 mTARM 발현 세포를 해석하기 위해, 항체 #6을 Alexa 647 모노클로날 항체 표지 키트(Molecular Probe사 제조)를 이용하여 형광 표지를 행하였다. 다음으로, 미숙 수상 세포 또는 LPS 자극으로 얻은 성숙 수상 세포를 5％ 마 우스 혈청, 5％ 래트 혈청을 포함하는 FACS 완충액(PBS/1％ FBS/1 mM EDTA)에 현탁하고, FcR 블록킹 용액(BD Pharmingen사 제조)을 가하여 얼음 위에서 10분 반응시킨 후, 형광 표지 항 mTARM 항체와 항 CD11c 수상 세포 마커 항체 및 항 CD40 활성화 마커 항체와 얼음 위에서 30분 반응시키고, FACSCalibur를 이용하여 측정하였다.

그 결과, mTARM 단백질이 미숙 및 성숙 수상 세포에서 발현되어 있는 것, 성숙 골수 수상 세포에서는 미숙 수상 세포에 비하여 mTARM 단백질의 발현이 증강되는 것, 활성화 마커 CD40이 발현되는 세포에서 mTARM 단백질의 발현이 강한 것으로 밝혀졌다(도 5).

(5) 정상 마우스에 있어서의 TARM 단백질의 발현

골수 유래 수상 세포에 있어서의 mTARM의 발현이 보였기 때문에, 정상 마우스의 면역 조직에서의 mTARM 단백질의 발현을 해석하였다.

C57BL/6 웅성 마우스의 골수, 말초혈, 비장, 장관 림프절, 파이어반(Peyer's patch)으로부터 세포를 제조하고, 5％ 마우스 혈청, 5％ 래트 혈청을 포함하는 FACS 완충액(PBS/1％ FBS/1 mM EDTA)에 현탁하고, FcR 블록킹 용액을 가하여 얼음 위에서 10분 반응시켰다. 다음으로, 형광 표지 항 mTARM 항체와 다양한 형광 표지 세포 계열 마커 항체와 얼음 위에서 30분 반응시킨 후, FACSCalibur를 이용하여 측정하였다.

그 결과, 정상 마우스의 면역 조직에서는 비장(SP)에 있어서의 CD3 양성 T 세포, DX5 양성 NK 세포, CD11b 양성 골수계 세포, CD11c 양성 수상 세포, 또한 말 초혈(PBL)에 있어서의 B220 양성 B 세포, F4/80 양성 단구/마크로파아지, SSC high/Gr1 양성 호중구, SSC high/F4/80 양성 호산구 중 어디에 있어서도 mTARM 단백질의 발현은 보이지 않았다(도 6).

이에, 정상 마우스 말초 조직에서의 발현을, 복강으로부터 제조한 세포를 이용하여 해석하였다.

그 결과, mTARM 단백질은 복강의 CD3 양성 T 세포, DX5 양성 NK 세포, CD11c 양성 수상 세포, B220 양성 B 세포, F4/80 양성 단구/마크로파아지, SSC high/Gr1 양성 호중구에서는 발현이 보이지 않았지만, CD11b 양성 골수계 세포의 일부에서 발현이 보였기 때문에, 추가로 해석을 진행시킨 결과, c-kit 양성 비만 세포에서 mTARM 단백질이 발현된 것으로 밝혀졌다(도 7).

(6) LPS 염증 자극에 의한 수상 세포에 있어서의 TARM 단백질의 발현 유도

mTARM 단백질은 배양 수상 세포에서는 발현되었지만, 마우스 면역 및 말초 조직의 수상 세포에서는 발현이 보이지 않는 점에서, 생체 내에서는 염증 자극에 의해 발현이 유도되는 것으로 생각되었다. 따라서, C57BL/6 웅성 마우스에 100 μg의 LPS를 복강내 투여하고, 14 시간 내지 18 시간 후에 장간막 림프절로부터 세포를 회수하여 mTARM 단백질의 발현을 해석하였다.

그 결과, LPS 염증 자극에 의해 장간막 림프절로 이동한 CD11c 양성/CD11b＋양성의 골수계 수상 세포에서 mTARM 단백질의 발현이 보였다(도 8). 따라서, mTARM 단백질은 생체 내에서의 정상시의 수상 세포에서는 세포 표면 상에 발현되지 않았지만, 염증시에는 수상 세포, 특히 골수계 수상 세포에 선택적으로 발현된 것 으로 밝혀져, mTARM 단백질은 염증시에 수상 세포에서 기능하고 있는 것이 시사되었다.

[ 실시예 3] 항 TARM 항체에 의한 골수 유래의 배양 수상 세포의 활성화

mTARM은 수상 세포에서 선택적으로 발현된 점에서, mTARM의 가교 자극에 의한 수상 세포의 활성화에 대하여 검토하였다.

골수 유래의 미숙 수상 세포 또는 성숙 수상 세포는 1×10⁸개를 350 μl의 MACS 완충액(PBS/1％ FBS/2 mM EDTA)에 현탁하고, FcR 블록킹 용액(Miltenyi사 제조)을 50 μl 가하여 4℃에서 10분 반응시킨 후, CD11c 마이크로비드(Miltenyi사 제조)를 100 μl 가하여 4℃에서 30분 반응시킨 후, Auto MACS(Miltenyi사 제조)를 이용하여 CD11c 양성 세포를 분리 정제하여 제조하였다. 96 구멍 플레이트에 F(ab)'2 항 래트 IgG 항체(10 μg/ml)(Jackson사 제조)를 37℃에서 2 시간 고상화하고, PBS로 세정한 후에 항 mTARM 항체 #6, #21 또는 음성 대조구의 래트 IgG(10 μg/ml)를 37℃에서 1 시간 고상화시켰다. 플레이트를 PBS로 세정한 후, 정제한 CD11c 양성 수상 세포를 배지 또는 최종 농도 2 μg/ml의 항 CD40 활성화 항체(BD Pharmingen사 제조)를 포함하는 배지에서 배양하였다. 24 시간 또는 48 시간 후에 배양 상청액을 회수하고, DuoSet ELISA Development kit(R & D사 제조)를 이용하여 사이토카인의 검출을 행하였다.

그 결과, 항 mTARM 항체는 골수 유래의 성숙 수상 세포로부터의 IL-6의 생산을 항 CD40 항체와 동일 정도로 유도하고, 추가로 항 CD40 항체와의 상가 효과가 있음이 밝혀졌다(도 9A). 마찬가지로, 미숙 수상 세포에서도 IL-6의 생산을 유도하는 경향이 보였다. 또한, 미숙 골수 수상 세포로부터의 MCP-1의 생산을 항 mTARM 항체가 유도했지만, 항 CD40 항체에서는 유도가 보이지 않았다(도 9B). 항 mTARM 항체에 의한 MCP-1의 생산 유도는 성숙 골수 수상 세포에서는 보이지 않았다. 그 밖에, IL-12, TNFα, IL-1β, IL-10, KC의 생산 유도도 해석했지만, 항 mTARM 항체에서는 미숙 수상 세포와 성숙 수상 세포 중 어디에 있어서도 현저한 영향은 보이지 않았다.

이상의 결과로부터, 수상 세포 상의 mTARM은 특정한 사이토카인이나 케모카인(예를 들면, IL-6이나 MCP-1)의 생산에 관여하고 있는 것으로 밝혀졌다.

[ 실시예 4] TARM 과 FcR γ쇄와의 복합체 형성

mTARM이 수상 세포의 활성화 수용체로서 기능하는 것으로 밝혀졌기 때문에, 시그널 전달 분자의 해명을 시도하였다. mTARM은 파골 세포의 분화에 관여하는 오스카와 세포막 관통 부위가 유사하다. 오스카는 IgE 수용체로서 잘 알려져 있는 시그널 전달 분자 FcRγ쇄와 복합체를 형성한다고 알려져 있고, 이 회합에는 오스카의 세포막 관통 영역의 염기성 아미노산과 FcRγ쇄의 산성 아미노산의 상호 작용이 관여하는 것으로 생각되고 있다. mTARM도 세포막 관통 영역에 염기성 아미노산을 갖고 있다. 한편, FcRγ쇄와 마찬가지로 세포막 관통 영역에 산성 아미노산을 갖는 활성화 시그널 전달 분자로서 DAP10, DAP12가 알려져 있다. 이에, FcRγ쇄, DAP10 또는 DAP12가 mTARM과 복합체를 형성하는지의 여부를 검토하였다.

FcRγ쇄, DAP10, DAP12의 발현 벡터는 각각 GenBank^TM의 NM_010185, AF072846, NM_011662에 기재된 뉴클레오티드 서열을 바탕으로 설계한 하기의 프라이머

를 이용하여 증폭한 cDNA 단편을, Flag 태그 서열이 N 말단에 부가된 형태로 세포 표면 상에 발현되도록 설계된 발현 벡터 pMXII IRES-Puro에 삽입하여 제조하였다. 그리고, mTARM의 발현 세포의 제조와 동일한 방법으로 재조합 레트로바이러스를 제조하고, mTARM 발현 B300.19 세포에 감염시키고, 퓨로마이신 존재하에서 배양함으로써 감염 세포를 선택하였다. 얻어진 B300.19 강제 발현 세포를 FACS 완충액(PBS/1％ FBS/1 mM EDTA)에 현탁하고, 최종 농도 10 μg/ml의 항체 #6 및 마우스 항 Flag 항체(Sigma사 제조)와 반응시킨 후, PE 표지 당나귀 항 래트 IgG 이차 항체(Jackson사 제조) 및 Cy5 표지 당나귀 항 마우스 IgG 이차 항체(Jackson사 제조)와 반응시키고, FACSCalibur(Becton Dickinson사 제조)를 이용하여 측정하였다.

그 결과, mTARM과 FcRγ쇄를 동시에 발현시켰을 경우에, FcRγ쇄의 세포 표면 상으로의 발현이 mTARM의 세포 표면 상으로의 발현량에 따라서 증가하는 것으로 밝혀졌다. DAP10 및 DAP12의 세포 표면 상으로의 발현은 mTARM의 발현량에 의존하 지 않았다. 따라서, FcRγ쇄는 mTARM과 복합체를 형성함으로써 세포 표면으로의 발현이 증가하는 것이 시사되었다(도 10).

다음으로, 생화학적으로 mTARM의 결합 단백질을 해석하였다.

B300.19 강제 발현 세포를 1％ digtonin을 포함하는 세포 용해액(1％ digtonin/50 mM Tris-HCl(pH 7.5)/150 mM NaCl/5 mM NaF/1 mM orthovanadate/Complete^TM(Roche사 제조))으로 가용화하여, 항 Flag 항체로 면역 침강을 행하고, 항 mTARM 항체 #6으로 면역 블로팅을 행하였다.

그 결과, FcRγ쇄와 함께 mTARM이 면역 침강되었고, DAP10 및 DAP12와 mTARM은 함께 면역 침강되지 않았다(도 11A). 항 Flag 항체로 FcRγ쇄, DAP10, DAP12가 각각 면역 침강되어 있는 것은 항 Flag 항체에 의한 면역 블로팅으로 확인하였다. 또한, B300.19 강제 발현 세포에서의 mTARM과 Flag 태그를 부가한 FcRγ쇄, DAP10 및 DAP12의 발현은 세포 용해액의 항 mTARM 항체 #6 또는 항 Flag 항체에 의한 면역 블로팅으로 확인하였다. 따라서, B300.19 강제 발현 세포에 있어서, FcRγ쇄와 mTARM이 복합체를 형성하고 있는 것으로 밝혀졌다.

또한, 골수 유래의 성숙 수상 세포를 1％ digtonin을 포함하는 세포 용해액으로 가용화하여, 음성 대조구의 래트 IgG, 항 mTARM 항체 #21, 항 CD54 항체 및 항 FcRγ쇄 항체로 면역 침강을 행하고, 항 FcRγ쇄 항체로 면역 블로팅을 행하였다.

그 결과, mTARM과 함께 FcRγ쇄가 면역 침강되었고, 다른 세포막 단백질의 CD54와 FcRγ쇄는 함께 면역 침강되지 않았다(도 11B). 따라서, 성숙 수상 세포에 있어서도, FcRγ쇄와 mTARM이 복합체를 형성하고 있는 것으로 밝혀졌다.

이들 결과로부터, mTARM의 가교 자극에 의한 수상 세포의 활성화는 FcRγ쇄로부터의 시그널 전달을 매개하고 있는 것이 시사되었다.

[ 실시예 5] 고상화한 TARM 에 대한 활성화 림프구의 접착

(1) 활성화 T 세포 상에서의 mTARM 결합 분자의 발현

수상 세포는 항원 제시 세포로서 T 세포와 상호 작용하는 것으로 알려져 있다. 따라서, mTARM과 결합하는 분자가 T 세포 상에 발현되고, 이 분자를 통해 수상 세포의 활성화가 제어되고 있는 것으로 생각되었다. 따라서, T 세포 상에 mTARM 결합 분자가 존재하는지의 여부에 대하여 검토하였다.

C57BL/6 웅성 마우스의 비장 세포 4×10⁷개를 70 μl의 MACS 완충액(PBS/1％ FBS/2 mM EDTA)에 현탁하고, FcR 블록킹 용액(Miltenyi사 제조)을 10 μl 가하여 4℃에서 10분간 반응시키고, 추가로 CD4 마이크로비드(Miltenyi사 제조)를 100 μl 가하여 4℃에서 15분간 반응시킨 후, Auto MACS를 이용하여 휴지기 CD4 양성 T 세포를 얻었다. MACS로 정제한 CD4 양성 세포는 1×10⁶개/ml가 되도록 배지(RPMI1640/10％ FBS/1 mM 피루브산나트륨/55 μM 2-머캅토에탄올)에 현탁하고, 항 CD3 항체(eBioscience사 제조)를 1 μg/ml 용액에 의해 37℃에서 2 시간 고상화한 플레이트에 가하고, 항 CD28 항체(Pharmingen사 제조) 2 μg/ml 존재하에서 자극하였다. Th1로 분화시키는 경우에는 마우스 IL-12(10 ng/ml)(Peprotech사 제조) 와 항 마우스 IL-4 항체(10 μg/ml)(MP4-25D2; Pharmingen사 제조) 존재하에서, Th2로 분화시키는 경우에는 마우스 IL-4(15 ng/ml)(Genzyme사 제조)와 항 마우스 IL-12 항체(15 μg/ml)(24910.1; PharMingen사 제조) 존재하에서 항 CD3 항체 자극을 행하였다. 자극으로부터 2일 후, Th1 조건에서는 마우스 IL-2(20 ng/ml)(Genzyme사 제조)와 마우스 IL-12(10 ng/ml)를 가하고, Th2 조건에서는 마우스 IL-2(20 ng/ml)와 마우스 IL-4(15 ng/ml)를 가하여 배양을 행하였다. Th1 세포는 IFN-γ의 생산에 의해, Th2 세포는 IL-4의 생산에 의해 각각 분화되었음을 확인하였다.

MACS로 정제한 직후의 휴지기 CD4 양성 T 세포와 CD3 자극 후 2일 및 8일 후의 활성화 CD4 양성 T 세포를 이용하여, mTARM-AP 키메라 단백질의 세포 표면 상으로의 결합 활성을 검토하였다. 세포는 FACS 완충액(PBS/1％ FBS)에 현탁하고, 최종 농도 30 μg/ml의 mTARM-AP 키메라 단백질 또는 음성 대조구의 AP 단백질과 얼음 위에서 30분간 반응시키고, 토끼 항 PLAP 항체(6000배 희석)(코스모바이오사)를 가하여 얼음 위에서 30분간 반응시킨 후, 추가로 PE 표지 당나귀 항 토끼 IgG(H＋L)항체(50배 희석)(Jackson사 제조)를 가하여 얼음 위에서 30분간 반응시켰다. mTARM-AP 키메라 단백질의 결합은 FACSCalibur를 이용하여 측정하였다.

그 결과, mTARM 결합 분자가, 휴지기 CD4 양성 T 세포에서는 발현되지 않았지만, 활성화 CD4 양성 T 세포에서 발현이 유도되는 것으로 밝혀졌다(도 12). mTARM 결합 분자는 자극 2일 후에는 이미 발현되었고, 8일 후에도 발현이 유지되었다. Th1, Th2 어느 분화 조건에서도 mTARM 결합 분자는 발현되었지만, 8일 후에는 Th2 세포에서의 발현이 Th1 세포와 비교하여 강한 경향이 보였다(도 12).

(2) 활성화 T 세포의 mTARM 재조합 단백질로의 접착

다음으로 mTARM이 활성화 T 세포에 대한 접착 분자로서 기능하는지의 여부를 검토하였다.

우선, 96 구멍 ELISA 플레이트(Nunc사 제조)에 항 알칼리 포스파타아제 항체(10 μg/ml)(Seradyn사 제조)를 50 μl씩 가하고, 37℃에서 30분간 정치하여 고상화하였다. PBS로 세정한 후, 블록 에이스(다이니폰 세이야꾸사 제조)로 비특이적 결합 부위를 블록하였다. AP 키메라 단백질(10 nM)을 각 구멍에 가하고, 실온에서 30분간 정치하여 고상화하였다. 자극 후 6 내지 9일 후의 활성화 T 세포는 세포 접착 완충액(RPMI1640/0.5％ BSA/20 mM HEPES(pH 7.4))에 현탁하고, Calcein-AM(도진사 제조)으로 형광 표지한 후, 1 구멍당 1×10⁵개씩 가하여 37℃에서 1 시간 반응시켰다. 비접착 세포를 세정하여 제거하고, 세포 용해액(10 mM Tris-HCl(pH 8.0)/1％ TritonX-100)을 가한 후, Wallac ARVO SX 1420 MULTILABEL COUNTER(Perkin Elmer사 제조)를 이용하여, 여기 파장 485 ㎚, 검출 파장 535 ㎚에서 측정하고, 접착 세포를 정량하였다. 세포 접착의 정도는 첨가한 세포에 대한 접착된 세포의 비율을 퍼센트로 나타내었다.

그 결과, mTARM은 활성화 T 세포에 대한 접착 분자로서 기능하는 것으로 밝혀졌다(도 13). Th1 세포, Th2 세포 모두 mTARM에 대한 접착 활성을 나타내었지만, Th2 세포의 mTARM에 대한 접착 활성이 Th1 세포에 비교하여 높은 경향이 보였 다.

[ 실시예 6] 항 TARM 항체의 세포 접착 저해 활성

mTARM을 통한 Th2 세포의 세포 접착에 미치는 항 TARM 항체의 효과를 검토하였다.

Th2 세포에 항 mTARM 항체 10 μg/ml를 가하여 실온에서 10분간 전처리한 후, mTARM-AP 키메라 단백질을 고상화한 플레이트에 이것을 가하고, 항체 존재하에서의 세포 접착 활성을 검토하였다.

그 결과, Th2 세포의 mTARM-AP 키메라 단백질로의 접착은 항 mTARM 항체 #6, #21, #37의 모두에서 현저히 억제되었다(도 14).

[ 실시예 7] 콜라겐 유도 관절염 모델에 있어서의 항 TARM 항체의 치료 효과

콜라겐 유도 관절염(Collagen-Induced Arthritis: CIA) 모델은 자기 면역성의 류마티스 관절염의 질환 모델로서, II형 콜라겐에 반응하는 CD4 양성 T 세포 및 항체가 검출되는 점에서, 양자가 협동하여 관절염을 야기하는 것으로 생각되고 있다. 또한, CIA 모델에서는 MHC 클래스 II에 구속이 있다고 한다. TARM은 수상 세포에 발현되는 활성화 분자이고, 또한 TARM의 결합 분자를 통해 활성화 T 세포의 세포 접착을 유도한다. 따라서, 항 TARM 항체에 의해 수상 세포와 활성화 T 세포의 상호 작용을 저해함으로써, 수상 세포나 활성화 T 세포가 관여하는 면역 응답을 억제할 가능성을 생각할 수 있었다. 따라서, CIA 모델에 있어서의 항 TARM 항체의 치료 효과를 검토하였다.

소 관절 유래의 II형 콜라겐 3％ 용액(콜라겐 기쥬쯔 겐슈카이사 제조)과 완 전 프로인트 보조제(Difco사 제조)를 등량 혼합하여 에멀전을 제조하고, 5주령의 DBA/1J 마우스(챨스 리버사로부터 입수)에 1마리당 100 μl(150 μg/마리)를, -21일째(초회 면역)와 0일째(추가 면역)에 둔부 피내에 면역시켰다. 항 mTARM 항체 #6은 추가 면역시부터 500 μg/1회로 주 2회 꼬리 정맥에 투여하였다. 추가 면역으로부터 3일째부터 체중 측정과 외견적 평가를 행하고, 13일째에 도살하였다. 외견적 소견은 이하과 같이 스코어화하여 평가하였다. 0: 비발증, 1: 홍반과 발꿈치 또는 발목 관절에 가벼운 종창, 2: 홍반과 발목부터 발꿈치에 걸쳐 가벼운 종창, 3: 홍반과 발목부터 중족 관절에 걸친 중간 정도의 종창, 4: 홍반과 발목, 발, 발가락 전체에 중도의 종창.

그 결과, 항 mTARM 항체 투여에 의해, 육안적 소견에 있어서 분명한 증상의 경감과 체중 감소의 억제가 보였다(도 15).

또한, 도살한 마우스의 복부 대정맥으로부터 헤파린 채혈을 행하고, 혈장 중의 혈청 아밀로이드 A(Serum Amyloid A: SAA) 농도와 콜라겐에 대한 항체가를 측정하였다. SAA는 염증 자극에 의해 생산된 사이토카인의 작용에 의해 간세포에서 생산되는 혈장 단백질로서, 혈장 중의 SAA 농도는 염증의 지표가 된다. 콜라겐에 대한 항체가는 항원 특이적 면역 응답의 지표가 된다.

혈장 중의 SAA의 농도는 혈장을 8000배 희석하여, ELISA 키트(바이오소스사 제조)를 이용하여 측정하였다.

또한, 혈장 중의 콜라겐에 대한 항체가의 측정은 이하와 같이 행하였다.

우선, 96 구멍 ELISA 플레이트(Nunc사 제조)에 5 μg/ml의 소 관절 유래의 II형 콜라겐 용액을 50 μl씩 가하고, 4℃에서 밤새 정치하여 고상화하였다. T-PBS(0.02％ Tween20/PBS)로 세정한 후, 1％ BSA/PBS로 비특이적 결합 부위를 블로킹하였다. T-PBS로 3회 세정한 후, T-PBS로 10만배 희석한 혈장을 50 μl씩 각 구멍에 가하고, 실온에서 2 시간 정치하였다. T-PBS로 3회 세정한 후, 비오틴화 항 마우스 IgG1(BD사 제조), 비오틴화 항 마우스 IgG2a(BD사 제조)를 T-PBS로 1000배 희석하여 50 μl씩 각 구멍에 가하여, 실온에서 2 시간 정치하였다. T-PBS로 3회 세정한 후, HRP 표지 스트렙타비딘(Pierce사 제조)을 T-PBS로 5000배 희석하여 50 μl씩 각 구멍에 가하고 실온에서 30분간 정치하였다. 그 후, 발색 기질을 이용하여 발색시켰다.

그 결과, 혈장 중의 SAA의 농도가 항 mTARM 항체의 투여에 의해 감소되었다(도 16). 또한, 혈장 중의 항 콜라겐 항체가는 항 mTARM 항체의 투여에 의해 변화가 보이지 않았다(도 17).

[ 실시예 8] 인간 TARM 전장 유전자 서열의 결정

인간 TARM 유전자를 동정하기 위해, 마우스 TARM 유전자 서열을 이용하여 BLAST 검색을 행하였다. 그 결과, 마우스 TARM cDNA 서열과 상동성이 높은 서열 Genbank 수탁 번호: XM_497642를 발견하였다. 그러나, XM_497642가 코딩하는 아미노산 서열(LOC441864)에는 시그널 서열이 존재하지 않아, 세포막 단백질로서 기능한다고는 생각되지 않았다. XM_497642는 추정상의 서열로서, 게놈 서열로부터의 cDNA 서열 추정이 잘못된 것으로 생각되었다. 따라서, 인간 TARM의 전장 유전자 서열의 결정을 시도하였다. TARM의 발현 조직을 동정하고, 5'-, 3'-RACE를 행하여 TRAM cDNA의 전장 서열을 추정한 후, TARM 단백질을 코딩하는 영역의 서열을 바탕으로 프라이머를 설계하여 전장 cDNA의 단리를 행하였다.

(1) 인간 TARM 유전자의 발현 해석

우선, hTARM의 인간 조직에서의 발현 해석을 행하였다. GenBank 수탁 번호: XM_497642의 서열을 바탕으로 프라이머를 설계하였다.

인간 각 장기의 전체 RNA(Clontech사 제조)로부터 RNA PCR kit(TAKARA사 제조)를 이용하여 합성한 1본쇄 cDNA를 주형으로 하여, ABI7700으로 실시간 PCR을 행하였다. PCR은 이하의 반응액 조성(QuantiTect SYBR Green PCR Master Mix(QIAGEN사 제조) 12.5 μl, 우라실 DNA 글리코실라아제(Invitrogen사 제조) 0.25 μl, 100 μM F 프라이머 0.125 μl, 100 μM R 프라이머 0.125 μl, 주형 cDNA(10배 희석) 2.5 μl, 증류수 7.25 μl)로 행하였다. PCR은 94℃에서 10분간 처리한 후, 94℃에서 30초, 60℃에서 1분의 반응을 35 사이클로 행하였다.

그 결과, hTARM 유전자도 mTARM 유전자와 마찬가지로 골수에서 강하게 발현된 것으로 밝혀졌다(도 18).

(2) 인간 TARM 유전자의 단리

hTARM 유전자는 골수에 있어서 발현이 보였기 때문에, 골수의 전체 RNA를 이용하여 5'-RACE 및 3'-RACE에서 hTARM의 전장 유전자 서열의 결정을 시도하였다.

우선, 골수의 전체 RNA로부터 cDNA synthesis kit(TAKARAs사 제조)를 이용하 여 2본쇄 cDNA를 합성하고, Qiaquick PCR purification kit(Qiagen사 제조)를 이용하여 cDNA를 정제하였다. 다음으로 ad29 어댑터를 부가하여, RACE에서의 주형으로 하였다. 1^st PCR은 이하의 반응액 조성(10×ExTaq 버퍼 5 μl, 2.5 mM dNTP 4 μl, ExTaq 0.25 μl, 100 μM 프라이머(5'PCR4) 0.5 μl, 100 μM Gene specific primer 0.5 μl, ad29 어댑터 부가 cDNA(25배 희석) 1 μl, 증류수 38.75 μl)으로 행하였다.

프라이머는 이하의 서열을 이용하였다.

, 또는

PCR은 94℃에서 5분간 처리한 후, 94℃에서 30초, 65℃에서 1분, 72℃에서 5분의 반응을 30 사이클 행하고, 마지막으로 72℃에서 5분간 반응시켰다.

2^nd PCR은 이하의 반응액 조성(10×ExTaq 버퍼 5 μl, 2.5 mM dNTP 4 μl, ExTaq 0.25 μl, 100 μM 프라이머(5'PCR1) 0.5 μl, 100 μM Gene specific primer 0.5 μl, 1^st PCR 산물(100배 희석) 1 μl, 증류수 38.75 μl)으로 행하였다.

프라이머는 이하의 서열을 이용하였다.

5'PCR1(서열 24),

, 또는

PCR은 94℃에서 5분간 처리한 후, 94℃에서 30초, 65℃에서 30초, 72℃에서 5분의 반응을 25 사이클 행하고, 마지막으로 72℃에서 5분간 반응시켰다. 증폭된 cDNA 단편을 pCR2.1(Invitrogen사 제조)에 클로닝한 후, ABI3100 시퀀스 애널라이저를 이용하여 뉴클레오티드 서열을 결정하였다.

그 결과, XM_497642에 기재된 서열과 전혀 다른 5' 및 3'의 뉴클레오티드 서열이 얻어졌다(서열 9).

RACE에서 얻어진 뉴클레오티드 서열 정보를 이용하여 설계한 프라이머

와, 골수의 전체 RNA로부터 RNA PCR kit(TAKARA사 제조)를 이용하여 합성한 1본쇄 cDNA를 주형으로 하여 PCR을 행하였다. PCR은 이하의 반응액 조성(10×버퍼 5 μl, 2.5 mM dNTP 4 μl, Pyrobest polymerase(TAKARA사 제조) 0.5 μl, 100 μM 프라이머 각 0.5 μl, cDNA 1 μl, DMSO 2.5 μl, 증류수 36 μl)으로 행하였다. PCR은 94℃에서 5분간 처리한 후, 94℃에서 30초, 65℃에서 30초, 72℃에서 5분의 반응을 35 사이클 행하고, 마지막으로 72℃에서 2분간 반응시켰다. 증폭된 cDNA를 pBlueScriptII SK(＋)(Stratagene사 제조)에 클로닝하여, ABI3100 시퀀스 애널라이저를 이용하여 뉴클레오티드 서열을 결정하였다. 얻어진 hTARM cDNA의 뉴클레오티드 서열은 RACE에서 결정한 서열과 일치하였다(서열 9). hTARM cDNA가 코딩하는 아미노산 서열(서열 10)은 세포막 단백질로서 기능하기 위해 필요한 시그널 서열이 N 말단에 존재하였다. hTARC와 XM_497642가 코딩하는 아미노산 서열(LOC441864)에서는 N 말단과 C 말단이 달랐다. 따라서, 게놈 서열로부터의 추정 cDNA 서열 XM_497642는 실제로는 존재하지 않고, hTARM cDNA가 세포막 단백질 hTARM을 코딩하는 실재하는 유전자임이 밝혀졌다(도 19).

[ 실시예 9] 인간 TARM 에 대한 항체의 제조

(1) 인간 TARM 유전자 발현 세포의 제조

인간 TARM 유전자 발현 벡터는 실시예 8에서 얻어진 hTARM cDNA를 발현 벡터 pMXII IRES EGFP(Oncogene(2000) 19(27): 3050-3058)에 삽입하여 제조하였다.

재조합 레트로바이러스의 제조는 이하와 같이 행하였다.

293/EBNA-1 세포주(Invitrogen사 제조) 3×10⁶개를 배지(D-MEM/10％ FBS)에 현탁하여 10 cm 디쉬에 뿌리고, CO₂ 인큐베이터에서 24 시간 배양하였다. 다음날, 배지를 교환하고, 이하와 같이 제조한 형질감염 용액을 가하여 형질감염을 행하였다. 형질감염 용액은 5 ml 튜브에 OPTI-MEM(GIBCO BRL사 제조) 600 μl와 TransIT LT1(TaKaRa사 제조) 24 μl를 가하여 혼합하여 실온에서 5분간 정치한 후, 발현 벡터 9 μg과 패키징 벡터인 pCL-Eco(Imgenex사 제조) 9 μg을 가하여 실온에서 5분 간 정치하여 제조하였다. 48 시간 후에, 배양 상청액을 회수하여 0.45 ㎛의 필터 여과를 행하여 재조합 바이러스액을 얻었다.

이 재조합 바이러스를 이하와 같이 B300.19 세포주에 감염시켜 hTARM 유전자 발현 세포를 제조하였다. B300.19 세포 1×10⁶개를 15 ml 튜브에 가하고, 1200 rpm으로 25℃에서 5분간 원심한 후, 배양 상청액을 흡인 제거하였다. 세포에, 재조합 바이러스액 2 ml에 폴리브렌(10 mg/ml) 2 μl와 55 μM 2-머캅토에탄올 2 μl를 가하여 혼합한 용액을 가하고, 2500 rpm으로 30℃에서 2 시간 원심하여 감염을 행하였다. 감염 후에 재조합 바이러스액을 제거하고, 배지(RPMI-1640/10％ FBS/55 μM 2-머캅토에탄올)를 가하여 배양을 행하였다. EGFP 양성 세포를 셀 소팅에 의해 분리함으로써 hTARM 발현 세포를 얻었다.

(2) hTARM의 세포외 영역과 SEAP 및 Fc 키메라 단백질의 제조

hTARM의 세포외 영역은 hTARM 전장 cDNA를 주형으로 하여, SalI을 부가한 5' 프라이머(h29B140_SalI-Kozac_F:

)와 NotI을 부가한 3' 프라이머(h29B140_NotI_SEAP_R:

)를 이용하여 PCR로 증폭시켰다. PCR은 이하의 반응액 조성(10×버퍼 5 μl, 2.5 mM dNTP 4 μl, Pyrobest polymerase(TAKARA사 제조) 0.5 μl, 100 μM 프라이머 각 0.5 μl, cDNA 1 μl, DMSO 2.5 μl, 증류수 36 μl)로 행하였다. PCR은 94℃에서 5분간 처리한 후, 94℃에서 30초, 65℃에서 30초, 72℃에서 5분의 반응을 35 사이클 행하고, 마지막으로 72℃에서 2분간 반응시켰다. 증폭된 cDNA를 pBlueScriptII SK(＋)(Stratagene사 제조)에 클로닝하여, ABI3100 시퀀스 애널라이저를 이용하여 뉴클레오티드 서열을 확인하였다. 얻어진 cDNA 단편을 SalI과 NotI으로 소화시킨 후, 실시예 2에 기재된 pcDNA3.1(+)-SEAP(His)₁₀-Neo 벡터에 삽입하여 hTARM-AP 발현 벡터를 제조하였다.

이에 따라, hTARM의 세포외 영역과 분비형 인간 태반성 알칼리 포스파타아제가 3개의 아미노산 링커(Ala-Ala-Ala)로 결합되고, 또한 C 말단에 10개의 히스티딘 태그 (His)₁₀이 붙은 분비 키메라 단백질(이하, AP 키메라 단백질이라 함)의 발현이 가능해진다. 얻어진 AP 키메라 단백질 발현 벡터는 TransIT LT1(TAKARA사 제조)를 이용하여 293/EBNA-1 세포주로 도입하고, 4 내지 5일간 배양을 행하였다. 배양 상청액 중에 분비된 AP 키메라 단백질은, 원심 분리에 의해 배양 상청액을 회수하고, 0.22 ㎛의 필터로 여과한 후, Hepes(pH 7.4)와 아지드화 나트륨을 각각 최종 농도가 20 mM, 0.02％가 되도록 가하여 4℃에서 보존하였다. AP 키메라 단백질의 농도는 알칼리 포스파타아제 활성을 Aurora AP chemiluminescent reporter gene assay(ICN사 제조)를 이용하여 측정하여 산출하였다.

(3) hTARM에 대한 모노클로날 항체의 제조

면역용 항원으로서 이용하기 위해, 우선 hTARM-AP 키메라 단백질의 정제를 행하였다.

정제는 AP 키메라 단백질의 C 말단에 존재하는 히스티딘 태그를 이용하여, His Trap Kit(Amersham Biosciences사 제조)를 이용하여 행하였다. hTARM-AP 키메라 단백질을 포함하는 배양 상청액을 1 ml의 HiTrap chelating HP 컬럼(Amersham Biosciences사 제조)에 첨가하고, 10 mM 이미다졸 용액으로 세정한 후, 500 mM 이미다졸 용액으로 hTARM-AP 키메라 단백질을 컬럼으로부터 용출시켰다. hTARM-AP 키메라 단백질의 농도는 Aurora AP chemiluminescent reporter gene assay(ICN사 제조)를 이용한 효소 활성 측정과 Protein Assay kit II(BIO-RAD사 제조)를 이용한 단백질 정량에 의해 산출하였다.

다음으로, 코진 바이오 가부시끼가이샤에 위탁하여, 얻어진 hTARM-AP 키메라 단백질을 항원으로 하여 Balb/c 마우스에게 면역시켰다. 면역된 마우스로부터 림프구를 단리하여, P3U1 골수종 세포와 림프구를 혼합하고, PEG법으로 세포 융합을 행하였다. 얻어진 하이브리도마의 배양 상청액을 이용하여 hTARM-Fc 키메라 단백질을 이용한 ELISA에 의한 스크리닝을 행하였다. 양성 웰로부터 클로닝을 행하여 6 종류의 클론(#11, #18, #19, #22, #26, #40)을 얻었다. FACS에 의해 특이성을 검토한 결과, 각 클론 모두 hTARM 발현 B300.19 세포에만 반응하고, 친주인 B300.19 세포에는 반응하지 않았다. 얻어진 항 hTARM 모노클로날 항체 #11, #18, #19, #22, #26, #40을 생산하는 하이브리도마를 누드 마우스의 복강에 접종하여 복수를 얻고, 프로틴 A 컬럼을 이용하여 항체를 정제하였다.

[ 실시예 10] 활성화 인간 T 세포의 hTARM 재조합 단백질로의 접종

인간 말초혈을 헤파린 채혈하여, 등량의 Ficoll-Paque PLUS(Amersham Biosciences)를 가하고, 400× g 30분의 비중 원심 분리법에 의해 단핵구를 단리하였다. MACS 완충액(PBS/1％ FBS/2 mM EDTA)에 현탁하고, FcR 블록킹 용액(Miltenyi사 제조)을 5 μl/1×10⁷개로 가하고, 4℃에서 15분간 반응시켰다. 인간 CD25＋CD4＋ Treg isolation kit(Miltenyi사 제조)와 Auto MACS를 이용하여 휴지기 CD4 양성 T 세포를 얻었다. MACS로 정제한 CD4 양성 세포에 PE 표지 마우스 항 인간 CD25 항체(Miltenyi사 제조)와 FITC 표지 마우스 항 인간 CD4 항체(Miltenyi사 제조)를 각각 용액의 1/11 용량 가하여 4℃에서 20분간 반응시키고, FACS Aria(BD Biosciences)를 이용하여 CD4 양성 CD25 음성 T 세포를 얻었다. CD4 양성 CD25 음성 T 세포는 T Cell Activation/Expansion Kit human(Miltenyi사 제조)을 이용하여 활성화시켰다. 자극 후 3일째부터 인간 IL-2(2 ng/ml)를 가하고, 자극 후 6일째와 8일째의 활성화 CD4 양성 T 세포를 이용하여, hTARM-AP 키메라 단백질이 활성화 T 세포에 대한 접착 분자로서 기능하는지의 여부를 검토하였다.

우선, 96 구멍 ELISA 플레이트(Nunc사 제조)에 항 알칼리 포스파타아제 항체(10 μg/ml)(Seradyn사 제조)를 50 μl씩 가하고, 37℃에서 30분간 정치하여 고상화하였다. PBS로 세정한 후, 블록 에이스(다이니폰 세이야꾸사 제조)로 비특이적 결합 부위를 블로킹하였다. AP 키메라 단백질(1 nM)을 각 구멍에 가하고, 실온에서 30분간 정치하여 고상화하였다. 활성화 T 세포는 세포 접착 완충액(RPMI1640/0.5％ BSA/20 mM HEPES/55 nM 2ME(pH 7.4))에 현탁하여, Calcein-AM(도진사 제조)로 형광 표지한 후, 1 구멍당 5×10⁴개씩 가하여 37℃에서 1 시간 반응시켰다. 비접착 세포를 세정하여 제거하고, 세포 용해액(10 mM Tris-HCl(pH 8.0)/1％ TritonX-100)을 가한 후, Wallac ARVO SX 1420 MULTILABEL COUNTER(Perkin Elmer사 제조)를 이용하여, 여기 파장 485 ㎚, 검출 파장 535 ㎚로 측정하고, 접착 세포를 정량하였다. 세포 접착의 정도는 첨가한 세포에 대한 접착된 세포의 비율을 퍼센트로 나타내었다.

그 결과, hTARM은 활성화 인간 T 세포에 대한 접착 분자로서 기능하는 것으로 밝혀졌다(도 20).

[ 실시예 11] 항 TARM 항체의 세포 접착 저해 활성

hTARM을 통한 활성화 인간 T 세포의 세포 접착에 미치는 항 TARM 항체의 효과를 검토하였다.

AP 키메라 단백질을 각 구멍에 가하고, 실온에서 30분간 정치하여 고상화한 후, 각 구멍에 항 hTARM 항체(#11, #18, #19, #22, #26, #40) 10 μg/ml를 가하여 실온에서 30분간 전처리하였다. 그 후 형광 표지한 활성화 T 세포를 가하고, 각 항체 존재하에서의 세포 접착 활성을 검토하였다. 또한, #11, #19, #26, #40에 대해서는 항 IgG2a 항체를, #18, #22에 대해서는 항 IgG2b 항체를 대조구로서 이용하였다.

그 결과, 활성화 T 세포의 hTARM-AP 키메라 단백질로의 접착은 항 hTARM 항체 #18, #19, #22, #26에 있어서 현저히 억제되었고, #11, #40에 있어서 부분적인 억제가 보였다(도 20).

[ 실시예 12] mTARM 에 대한 신규 리간드 mTARM -L의 동정

(1) mTARM-L(mTARM Ligand) 후보 분자의 선택

활성화 T 세포 상에 mTARM 결합 분자가 존재하는 점에서(실시예 5), 마우스 면역 세포 유래의 세포주(L5178Y-R 세포주, BW5147 세포주, Raw264.7 세포주)에도 mTARM 결합 분자가 존재하는지의 여부에 대하여 실시예 5에 기재된 방법을 이용하여 검토하였다.

그 결과, mTARM 결합 분자가 L5178Y-R 세포주에서 강하게 발현되었지만, BW5147 세포주 및 Raw264.7 세포주에서는 발현되지 않은 것으로 밝혀졌다(도 21A).

다음으로, mTARM에 대한 미지의 리간드가 면역 글로불린 수퍼패밀리(IgSF)에 속하는 것으로 가정하여, Mouse Ensemble의 데이터 베이스를 검색하여 47개의 IgSF 후보에게 착안하여, 면역 세포에 있어서의 발현을 실시간 PCR로 조사하였다. 전체 RNA는 RNeasy mini kit(Qiagen, Hilden, Germany)를 이용하여, L5178Y-R 세포, BW5147 세포, Raw264.7 세포로부터 단리하였다. 실시간 PCR은 SYBR-green 존재하에서 ABI 7700 Sequence Detection System(PE Applied-Biosystems)을 이용하여 행하였다.

그 결과, ENSMUSG00000035095(A530065I17Rik, NM_176953)의 mRNA 발현(프라이머 #2558: CAGCTGGCAAGAGGAACAGT(서열 54), #2559: GAGCATCGGCACTTATCTCC(서열 55)를 사용)이 mTARM-AP 키메라 단백질의 세포로의 결합 활성과 상관되는 패턴을 나타내었다(도 22B). 그러나, ENSMUSG00000035095가 코딩하는 아미노산 서열에는 세포막 관통 영역이 존재하지 않아, 세포막 단백질로서 기능한다고는 생각되지 않았다. 이 아미노산 서열은 추정 상의 서열로서, 게놈 서열로부터의 cDNA 서열의 추정이 틀린 것으로 생각되었다. 따라서, 우선 인간 상동 유전자 산물의 동정을 시도하여, ENSMUSG00000035095가 코딩하는 아미노산 서열을 이용하여 데이터 베이스 검색을 행하였다. 그 결과, ENSMUSG00000035095가 코딩하는 아미노산 서열과 상동성이 높은 인간 아미노산 서열 LOC196264를 발견하였다. 이 아미노산 서열은 1개의 면역 글로불린 루프 구조 영역을 포함하는 세포막 단백질을 나타내고 있었다. 따라서, LOC196264가 TARM-L 후보의 전장 인간 아미노산 서열이라고 생각되었다. 다음으로, LOC196264의 아미노산 서열을 이용하여 데이터 베이스의 tblastn 검색을 행하였다. 그 결과, 마우스 BAC 클론 AC122305의 게놈 뉴클레오티드 서열에서, LOC196264의 아미노산 서열에 상동성이 있는 서열을 코딩하는 영역을 발견하였다. 이 서열로부터 마우스 TARM-L 후보의 cDNA 서열과 아미노산 서열을 추정하여 프라이머

를 설계하고, 전장 단백질을 코딩하는 cDNA의 단리를 행하였다. 주형으로는 Th1 day2의 전체 RNA를 이용하고, 실시예 1에 기재된 방법으로 cDNA를 증폭하였다. 증폭된 cDNA를 발현 벡터 pMXII IRES EGFP(Oncogene(2000) 19(27): 3050-3058)에 삽입하여, mTARM-L 후보 유전자 발현 벡터를 제조하고, ABI3100 시퀀스 애널라이저를 이용하여 뉴클레오티드 서열을 결정하였다(서열 13).

(2) mTARM-L의 동정

이어서, mTARM-L 후보가 TARM에 대한 미지의 리간드인지의 여부를 조사하기 위해, 이 분자의 발현 세포를 실시예 2에 기재된 방법으로 제조하였다. mTARM-AP 키메라 단백질의 mTARM-L 후보 발현 세포의 세포 표면 상으로의 결합 활성과 고상화한 mTARM에 대한 mTARM-L 후보 발현 세포의 접착 활성의 측정은 실시예 5에 기재된 방법으로 행하였다.

그 결과, mTARM-AP는 EGFP 양성의 mTARM-L 발현 B300.19 세포에 특이적으로 결합했지만, EGFP 양성의 대조구 벡터를 도입한 B300.19 세포에는 결합하지 않았다(도 22A). 음성 대조구의 AP는 EGFP 양성의 mTARM-L 발현 B300.19 세포에 결합하지 않았다(도 22A).

또한, AP 및 mTARM-AP 키메라 단백질에 대한 mTARM-L 발현 B300.19 세포와의 접착 활성을 조사한 결과, mTARM-AP 키메라 단백질에만 세포가 접착되었다(도 22B).

이상의 결과로부터, mTARM-L 후보 분자가 실제로 신규한 TARM에 대한 리간드인 것으로 밝혀졌고, 상기 리간드를 mTARM-L(TARM Ligand)이라 명명하였다.

hTARM-L은 LOC196264의 아미노산 서열을 코딩하는 NM_198275의 뉴클레오티드 서열을 바탕으로 하여 프라이머

를 설계하고, 전장 단백질을 코딩하는 cDNA의 단리를 행하였다. 주형으로는 골수의 전체 RNA를 이용하고, 실시예 1에 기재된 방법으로 cDNA를 증폭하였다. 증폭된 cDNA를 발현 벡터 pMXII IRES EGFP(Oncogene(2000) 19(27): 3050-3058)에 삽입하여, TARM-L 유전자 발현 벡터를 제조하고, ABI3100 시퀀스 애널라이저를 이용하여 뉴클레오티드 서열을 결정하였다(서열 15).

인간 및 마우스 TARM-L의 ClustalW에 의한 상동성 해석의 결과를 도 23에 나타내었다. hTARM-L은 235 아미노산, mTARM-L은 237 아미노산이고, 상동성은 86％였다. 한편, hTARM(271 아미노산)과 가장 상동성이 높은 mTARM m3(293 아미노산)의 상동성은 50％였다(도 24).

SEQUENCE LISTING <110> Eisai R&D Management Co., Ltd. <120> T cell adhesion molecules and antibodies thereto <130> 162119PX <160> 59 <170> PatentIn version 3.1 <210> 1 <211> 889 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> CDS <222> (49)..(879) <223> <400> 1 gctgatagta gacctgctga agacctttgg accagccgct gagccacc atg atc tct 57 Met Ile Ser 1 agg ctc ctt tcc ctt ctc tgc ctc cgg tct cct ccc aag ccc agc ctc 105 Arg Leu Leu Ser Leu Leu Cys Leu Arg Ser Pro Pro Lys Pro Ser Leu 5 10 15 agt gcc tgg ccc agc aca gtg ctt ccc acc aag agc cac gtg aca atg 153 Ser Ala Trp Pro Ser Thr Val Leu Pro Thr Lys Ser His Val Thr Met 20 25 30 35 caa tgt aag agc ccc acc ccg agt aaa tac ttc atc ctc aaa aag gaa 201 Gln Cys Lys Ser Pro Thr Pro Ser Lys Tyr Phe Ile Leu Lys Lys Glu 40 45 50 ggt ttc gct ttg aat tct gtg aag cca tat aat ttg aca gag gag acg 249 Gly Phe Ala Leu Asn Ser Val Lys Pro Tyr Asn Leu Thr Glu Glu Thr 55 60 65 gct gat ttt cat ttc acc gac cta cga cag aat gat ggc gga cac tac 297 Ala Asp Phe His Phe Thr Asp Leu Arg Gln Asn Asp Gly Gly His Tyr 70 75 80 acc tgt gaa tac tat agc aaa tgg ccc cat gac aca ccg tca cac ccc 345 Thr Cys Glu Tyr Tyr Ser Lys Trp Pro His Asp Thr Pro Ser His Pro 85 90 95 agc aat gcc ctt ttc ttg ttg gtc aca ggg tac tta cct cag ccc tcc 393 Ser Asn Ala Leu Phe Leu Leu Val Thr Gly Tyr Leu Pro Gln Pro Ser 100 105 110 115 ttt caa gcc cac cac cgg ggt aca gtg act gca gga agc aag gtg act 441 Phe Gln Ala His His Arg Gly Thr Val Thr Ala Gly Ser Lys Val Thr 120 125 130 ttg cag tgc cag aaa gca ggc agt gtc ctc gga ccc gta aag ttt gcg 489 Leu Gln Cys Gln Lys Ala Gly Ser Val Leu Gly Pro Val Lys Phe Ala 135 140 145 tta ctg aag gtg gga cac tca act cct gtg cag aca agg agc tca aca 537 Leu Leu Lys Val Gly His Ser Thr Pro Val Gln Thr Arg Ser Ser Thr 150 155 160 gga atg gta tca gac ttc tct ctt cag aat gtg aca gcc aga gac tcg 585 Gly Met Val Ser Asp Phe Ser Leu Gln Asn Val Thr Ala Arg Asp Ser 165 170 175 ggg gaa tac agc tgt gtt tac tat cag gca aag gct ccc tat cgg gcc 633 Gly Glu Tyr Ser Cys Val Tyr Tyr Gln Ala Lys Ala Pro Tyr Arg Ala 180 185 190 195 tca ggg ccc agc aat ctc ctt gag atc tct gtg ata gac aac cat ctg 681 Ser Gly Pro Ser Asn Leu Leu Glu Ile Ser Val Ile Asp Asn His Leu 200 205 210 cct caa gat ctt gct gcc tcg act ttc cca ccg caa ctg aca gca acc 729 Pro Gln Asp Leu Ala Ala Ser Thr Phe Pro Pro Gln Leu Thr Ala Thr 215 220 225 tca ccc aag acc ccg ggt aca atg aca gaa ggc tac act gtg gat aat 777 Ser Pro Lys Thr Pro Gly Thr Met Thr Glu Gly Tyr Thr Val Asp Asn 230 235 240 ctc atc cgg gtc ggt gtg gct gct gca atc ctg cta ata gtg gga ggc 825 Leu Ile Arg Val Gly Val Ala Ala Ala Ile Leu Leu Ile Val Gly Gly 245 250 255 ttc ctg gtt gaa gcc tgg cac agt gag cgg ctg tct cca aat aaa ccc 873 Phe Leu Val Glu Ala Trp His Ser Glu Arg Leu Ser Pro Asn Lys Pro 260 265 270 275 tgg taa aataactgaa 889 Trp <210> 2 <211> 276 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 2 Met Ile Ser Arg Leu Leu Ser Leu Leu Cys Leu Arg Ser Pro Pro Lys 1 5 10 15 Pro Ser Leu Ser Ala Trp Pro Ser Thr Val Leu Pro Thr Lys Ser His 20 25 30 Val Thr Met Gln Cys Lys Ser Pro Thr Pro Ser Lys Tyr Phe Ile Leu 35 40 45 Lys Lys Glu Gly Phe Ala Leu Asn Ser Val Lys Pro Tyr Asn Leu Thr 50 55 60 Glu Glu Thr Ala Asp Phe His Phe Thr Asp Leu Arg Gln Asn Asp Gly 65 70 75 80 Gly His Tyr Thr Cys Glu Tyr Tyr Ser Lys Trp Pro His Asp Thr Pro 85 90 95 Ser His Pro Ser Asn Ala Leu Phe Leu Leu Val Thr Gly Tyr Leu Pro 100 105 110 Gln Pro Ser Phe Gln Ala His His Arg Gly Thr Val Thr Ala Gly Ser 115 120 125 Lys Val Thr Leu Gln Cys Gln Lys Ala Gly Ser Val Leu Gly Pro Val 130 135 140 Lys Phe Ala Leu Leu Lys Val Gly His Ser Thr Pro Val Gln Thr Arg 145 150 155 160 Ser Ser Thr Gly Met Val Ser Asp Phe Ser Leu Gln Asn Val Thr Ala 165 170 175 Arg Asp Ser Gly Glu Tyr Ser Cys Val Tyr Tyr Gln Ala Lys Ala Pro 180 185 190 Tyr Arg Ala Ser Gly Pro Ser Asn Leu Leu Glu Ile Ser Val Ile Asp 195 200 205 Asn His Leu Pro Gln Asp Leu Ala Ala Ser Thr Phe Pro Pro Gln Leu 210 215 220 Thr Ala Thr Ser Pro Lys Thr Pro Gly Thr Met Thr Glu Gly Tyr Thr 225 230 235 240 Val Asp Asn Leu Ile Arg Val Gly Val Ala Ala Ala Ile Leu Leu Ile 245 250 255 Val Gly Gly Phe Leu Val Glu Ala Trp His Ser Glu Arg Leu Ser Pro 260 265 270 Asn Lys Pro Trp 275 <210> 3 <211> 1054 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> CDS <222> (49)..(930) <223> <400> 3 gctgatagta gacctgctga agacctttgg accagccgct gagccacc atg atc tct 57 Met Ile Ser 1 agg ctc ctt tcc ctt ctc tgc ctc cgg ctg tgt gtt ggg caa aca gac 105 Arg Leu Leu Ser Leu Leu Cys Leu Arg Leu Cys Val Gly Gln Thr Asp 5 10 15 att cct gaa aat ggg tct cct ccc aag ccc agc ctc agt gcc tgg ccc 153 Ile Pro Glu Asn Gly Ser Pro Pro Lys Pro Ser Leu Ser Ala Trp Pro 20 25 30 35 agc aca gtg ctt ccc acc aag agc cac gtg aca atg caa tgt aag agc 201 Ser Thr Val Leu Pro Thr Lys Ser His Val Thr Met Gln Cys Lys Ser 40 45 50 ccc acc ccg agt aaa tac ttc atc ctc aaa aag gaa ggt ttc gct ttg 249 Pro Thr Pro Ser Lys Tyr Phe Ile Leu Lys Lys Glu Gly Phe Ala Leu 55 60 65 aat tct gtg aag cca tat aat ttg aca gag gag acg gct gat ttt cat 297 Asn Ser Val Lys Pro Tyr Asn Leu Thr Glu Glu Thr Ala Asp Phe His 70 75 80 ttc acc gac cta cga cag aat gat ggc gga cac tac acc tgt gaa tac 345 Phe Thr Asp Leu Arg Gln Asn Asp Gly Gly His Tyr Thr Cys Glu Tyr 85 90 95 tat agc aaa tgg ccc cat gac aca ccg tca cac ccc agc aat gcc ctt 393 Tyr Ser Lys Trp Pro His Asp Thr Pro Ser His Pro Ser Asn Ala Leu 100 105 110 115 ttc ttg ttg gtc aca ggg tac tta cct cag ccc tcc ttt caa gcc cac 441 Phe Leu Leu Val Thr Gly Tyr Leu Pro Gln Pro Ser Phe Gln Ala His 120 125 130 cac cgg ggt aca gtg act gca gga agc aag gtg act ttg cag tgc cag 489 His Arg Gly Thr Val Thr Ala Gly Ser Lys Val Thr Leu Gln Cys Gln 135 140 145 aaa gca ggc agt gtc ctc gga ccc gta aag ttt gcg tta ctg aag gtg 537 Lys Ala Gly Ser Val Leu Gly Pro Val Lys Phe Ala Leu Leu Lys Val 150 155 160 gga cac tca act cct gtg cag aca agg agc tca aca gga atg gta tca 585 Gly His Ser Thr Pro Val Gln Thr Arg Ser Ser Thr Gly Met Val Ser 165 170 175 gac ttc tct ctt cag aat gtg aca gcc aga gac tcg ggg gaa tac agc 633 Asp Phe Ser Leu Gln Asn Val Thr Ala Arg Asp Ser Gly Glu Tyr Ser 180 185 190 195 tgt gtt tac tat cag gca aag gct ccc tat cgg gcc tca ggg ccc agc 681 Cys Val Tyr Tyr Gln Ala Lys Ala Pro Tyr Arg Ala Ser Gly Pro Ser 200 205 210 aat ctc ctt gag atc tct gtg ata gac aac cat ctg cct caa gat ctt 729 Asn Leu Leu Glu Ile Ser Val Ile Asp Asn His Leu Pro Gln Asp Leu 215 220 225 gct gcc tcg act ttc cca ccg caa ctg aca gca acc tca ccc aag acc 777 Ala Ala Ser Thr Phe Pro Pro Gln Leu Thr Ala Thr Ser Pro Lys Thr 230 235 240 ccg ggt aca atg aca gaa ggc tac act gtg gat aat ctc atc cgg gtc 825 Pro Gly Thr Met Thr Glu Gly Tyr Thr Val Asp Asn Leu Ile Arg Val 245 250 255 ggt gtg gct gct gca atc ctg cta ata gtg gga ggc ttc ctg gtt gaa 873 Gly Val Ala Ala Ala Ile Leu Leu Ile Val Gly Gly Phe Leu Val Glu 260 265 270 275 gcc tgg cac agt gag cgg ctg tct cca aat aaa ccc tgt gcc cca gga 921 Ala Trp His Ser Glu Arg Leu Ser Pro Asn Lys Pro Cys Ala Pro Gly 280 285 290 gaa aaa tga atcttcggac caaactatct ctgtgaattt atgtgaaatt 970 Glu Lys gatgcagcac tttgggaatc atccagagac aggctgcctc atcctgactc ttcacacaga 1030 acagaggcct ggacatatct ggac 1054 <210> 4 <211> 293 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 4 Met Ile Ser Arg Leu Leu Ser Leu Leu Cys Leu Arg Leu Cys Val Gly 1 5 10 15 Gln Thr Asp Ile Pro Glu Asn Gly Ser Pro Pro Lys Pro Ser Leu Ser 20 25 30 Ala Trp Pro Ser Thr Val Leu Pro Thr Lys Ser His Val Thr Met Gln 35 40 45 Cys Lys Ser Pro Thr Pro Ser Lys Tyr Phe Ile Leu Lys Lys Glu Gly 50 55 60 Phe Ala Leu Asn Ser Val Lys Pro Tyr Asn Leu Thr Glu Glu Thr Ala 65 70 75 80 Asp Phe His Phe Thr Asp Leu Arg Gln Asn Asp Gly Gly His Tyr Thr 85 90 95 Cys Glu Tyr Tyr Ser Lys Trp Pro His Asp Thr Pro Ser His Pro Ser 100 105 110 Asn Ala Leu Phe Leu Leu Val Thr Gly Tyr Leu Pro Gln Pro Ser Phe 115 120 125 Gln Ala His His Arg Gly Thr Val Thr Ala Gly Ser Lys Val Thr Leu 130 135 140 Gln Cys Gln Lys Ala Gly Ser Val Leu Gly Pro Val Lys Phe Ala Leu 145 150 155 160 Leu Lys Val Gly His Ser Thr Pro Val Gln Thr Arg Ser Ser Thr Gly 165 170 175 Met Val Ser Asp Phe Ser Leu Gln Asn Val Thr Ala Arg Asp Ser Gly 180 185 190 Glu Tyr Ser Cys Val Tyr Tyr Gln Ala Lys Ala Pro Tyr Arg Ala Ser 195 200 205 Gly Pro Ser Asn Leu Leu Glu Ile Ser Val Ile Asp Asn His Leu Pro 210 215 220 Gln Asp Leu Ala Ala Ser Thr Phe Pro Pro Gln Leu Thr Ala Thr Ser 225 230 235 240 Pro Lys Thr Pro Gly Thr Met Thr Glu Gly Tyr Thr Val Asp Asn Leu 245 250 255 Ile Arg Val Gly Val Ala Ala Ala Ile Leu Leu Ile Val Gly Gly Phe 260 265 270 Leu Val Glu Ala Trp His Ser Glu Arg Leu Ser Pro Asn Lys Pro Cys 275 280 285 Ala Pro Gly Glu Lys 290 <210> 5 <211> 1018 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> CDS <222> (49)..(894) <223> <400> 5 gctgatagta gacctgctga agacctttgg accagccgct gagccacc atg atc tct 57 Met Ile Ser 1 agg ctc ctt tcc ctt ctc tgc ctc cgg tct cct ccc aag ccc agc ctc 105 Arg Leu Leu Ser Leu Leu Cys Leu Arg Ser Pro Pro Lys Pro Ser Leu 5 10 15 agt gcc tgg ccc agc aca gtg ctt ccc acc aag agc cac gtg aca atg 153 Ser Ala Trp Pro Ser Thr Val Leu Pro Thr Lys Ser His Val Thr 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Ala 135 140 145 tta ctg aag gtg gga cac tca act cct gtg cag aca agg agc tca aca 537 Leu Leu Lys Val Gly His Ser Thr Pro Val Gln Thr Arg Ser Ser Thr 150 155 160 gga atg gta tca gac ttc tct ctt cag aat gtg aca gcc aga gac tcg 585 Gly Met Val Ser Asp Phe Ser Leu Gln Asn Val Thr Ala Arg Asp Ser 165 170 175 ggg gaa tac agc tgt gtt tac tat cag gca aag gct ccc tat cgg gcc 633 Gly Glu Tyr Ser Cys Val Tyr Tyr Gln Ala Lys Ala Pro Tyr Arg Ala 180 185 190 195 tca ggg ccc agc aat ctc ctt gag atc tct gtg ata gac aac cat ctg 681 Ser Gly Pro Ser Asn Leu Leu Glu Ile Ser Val Ile Asp Asn His Leu 200 205 210 cct caa gat ctt gct gcc tcg act ttc cca ccg caa ctg aca gca acc 729 Pro Gln Asp Leu Ala Ala Ser Thr Phe Pro Pro Gln Leu Thr Ala Thr 215 220 225 tca ccc aag acc ccg ggt aca atg aca gaa ggc tac act gtg gat aat 777 Ser Pro Lys Thr Pro Gly Thr Met Thr Glu Gly Tyr Thr Val Asp Asn 230 235 240 ctc atc cgg gtc ggt gtg gct gct gca atc ctg cta ata gtg gga ggc 825 Leu Ile Arg Val Gly Val Ala Ala Ala Ile Leu Leu Ile Val Gly Gly 245 250 255 ttc ctg gtt gaa gcc tgg cac agt gag cgg ctg tct cca aat aaa ccc 873 Phe Leu Val Glu Ala Trp His Ser Glu Arg Leu Ser Pro Asn Lys Pro 260 265 270 275 tgt gcc cca gga gaa aaa tga atcttcggac caaactatct ctgtgaattt 924 Cys Ala Pro Gly Glu Lys 280 atgtgaaatt gatgcagcac tttgggaatc atccagagac aggctgcctc atcctgactc 984 ttcacacaga acagaggcct ggacatatct ggac 1018 <210> 6 <211> 281 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 6 Met Ile Ser Arg Leu Leu Ser Leu Leu Cys Leu Arg Ser Pro Pro Lys 1 5 10 15 Pro Ser Leu Ser Ala Trp Pro Ser Thr Val Leu Pro Thr Lys Ser His 20 25 30 Val Thr Met Gln Cys Lys Ser Pro Thr Pro Ser Lys Tyr Phe Ile Leu 35 40 45 Lys Lys Glu Gly Phe Ala Leu Asn Ser Val Lys Pro Tyr Asn Leu Thr 50 55 60 Glu Glu Thr Ala Asp Phe His Phe Thr Asp Leu Arg Gln Asn Asp Gly 65 70 75 80 Gly His Tyr Thr Cys Glu Tyr Tyr Ser Lys Trp Pro His Asp Thr Pro 85 90 95 Ser His Pro Ser Asn Ala Leu Phe Leu Leu Val Thr Gly Tyr Leu Pro 100 105 110 Gln Pro Ser Phe Gln Ala His His Arg Gly Thr Val Thr Ala Gly Ser 115 120 125 Lys Val Thr Leu Gln Cys Gln Lys Ala Gly Ser Val Leu Gly Pro Val 130 135 140 Lys Phe Ala Leu Leu Lys Val Gly His Ser Thr Pro Val Gln Thr Arg 145 150 155 160 Ser Ser Thr Gly Met Val Ser Asp Phe Ser Leu Gln Asn Val Thr Ala 165 170 175 Arg Asp Ser Gly Glu Tyr Ser Cys Val Tyr Tyr Gln Ala Lys Ala Pro 180 185 190 Tyr Arg Ala Ser Gly Pro Ser Asn Leu Leu Glu Ile Ser Val Ile Asp 195 200 205 Asn His Leu Pro Gln Asp Leu Ala Ala Ser Thr Phe Pro Pro Gln Leu 210 215 220 Thr Ala Thr Ser Pro Lys Thr Pro Gly Thr Met Thr Glu Gly Tyr Thr 225 230 235 240 Val Asp Asn Leu Ile Arg Val Gly Val Ala Ala Ala Ile Leu Leu Ile 245 250 255 Val Gly Gly Phe Leu Val Glu Ala Trp His Ser Glu Arg Leu Ser Pro 260 265 270 Asn Lys Pro Cys Ala Pro Gly Glu Lys 275 280 <210> 7 <211> 932 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> CDS <222> (49)..(819) <223> <400> 7 gctgatagta gacctgctga agacctttgg accagccgct gagccacc atg atc tct 57 Met Ile Ser 1 agg ctc ctt tcc ctt ctc tgc ctc cgg ctg tgt gtt ggg caa 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125 Gln Ala His His Arg Gly Thr Val Thr Ala Gly Ser Lys Val Thr Leu 130 135 140 Gln Cys Gln Lys Ala Gly Ser Val Leu Gly Pro Val Lys Phe Ala Leu 145 150 155 160 Leu Lys Val Gly His Ser Thr Pro Val Gln Thr Arg Ser Ser Thr Gly 165 170 175 Met Val Ser Asp Phe Ser Leu Gln Asn Val Thr Ala Arg Asp Ser Gly 180 185 190 Glu Tyr Ser Cys Val Tyr Tyr Gln Ala Lys Ala Pro Tyr Arg Ala Ser 195 200 205 Gly Pro Ser Asn Leu Leu Glu Ile Ser Val Ile Asp Ala Arg Gln Pro 210 215 220 Ser Ala Ser Arg Ser Cys Cys Leu Asp Phe Pro Thr Ala Thr Asp Ser 225 230 235 240 Asn Leu Thr Gln Asp Pro Gly Tyr Asn Asp Arg Arg Leu His Cys Gly 245 250 255 <210> 9 <211> 816 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)..(816) <223> <400> 9 atg atc cct aag ctg ctt tcc ctc ctc tgt ttc aga ctg tgc gtg ggc 48 Met Ile Pro Lys Leu Leu Ser Leu Leu Cys Phe Arg Leu Cys Val Gly 1 5 10 15 caa gga gac aca agg gga gat ggg tca ctg ccc aag ccg tcc ctc agt 96 Gln Gly Asp Thr Arg Gly Asp Gly Ser Leu Pro Lys Pro Ser Leu Ser 20 25 30 gcc 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tgc cag aag cga gac caa ttg ttt gtg cct atc atg ttc gct cta 480 Gln Cys Gln Lys Arg Asp Gln Leu Phe Val Pro Ile Met Phe Ala Leu 145 150 155 160 ctg aag gca ggg acg cca tca ccc atc cag ctg cag agt cca gcg ggg 528 Leu Lys Ala Gly Thr Pro Ser Pro Ile Gln Leu Gln Ser Pro Ala Gly 165 170 175 aag gag ata gac ttc tct ctg gtg gac gtg aca gcc ggc gat gct ggg 576 Lys Glu Ile Asp Phe Ser Leu Val Asp Val Thr Ala Gly Asp Ala Gly 180 185 190 aac tac agc tgc atg tac tac cag aca aag tct ccc ttc tgg gcc tca 624 Asn Tyr Ser Cys Met Tyr Tyr Gln Thr Lys Ser Pro Phe Trp Ala Ser 195 200 205 gaa ccc agt gat cag ctt gag ata ttg gtg aca gtt ccc cca ggt acc 672 Glu Pro Ser Asp Gln Leu Glu Ile Leu Val Thr Val Pro Pro Gly Thr 210 215 220 aca tcg agc aac tac tcc ctg ggt aac ttc gta cga ctg ggt ctg gct 720 Thr Ser Ser Asn Tyr Ser Leu Gly Asn Phe Val Arg Leu Gly Leu Ala 225 230 235 240 gcc gta att gtg gtt atc atg gga gct ttc ctg gtg gag gcc tgg tac 768 Ala Val Ile Val Val Ile Met Gly Ala Phe Leu Val Glu Ala Trp Tyr 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Leu Gln Ser Pro Ala Gly 165 170 175 Lys Glu Ile Asp Phe Ser Leu Val Asp Val Thr Ala Gly Asp Ala Gly 180 185 190 Asn Tyr Ser Cys Met Tyr Tyr Gln Thr Lys Ser Pro Phe Trp Ala Ser 195 200 205 Glu Pro Ser Asp Gln Leu Glu Ile Leu Val Thr Val Pro Pro Gly Thr 210 215 220 Thr Ser Ser Asn Tyr Ser Leu Gly Asn Phe Val Arg Leu Gly Leu Ala 225 230 235 240 Ala Val Ile Val Val Ile Met Gly Ala Phe Leu Val Glu Ala Trp Tyr 245 250 255 Ser Arg Asn Val Ser Pro Gly Glu Ser Glu Ala Phe Lys Pro Glu 260 265 270 <210> 11 <211> 925 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> CDS <222> (49)..(915) <223> <400> 11 gctgatagta gacctgctga agacctttgg accagccgct gagccacc atg atc tct 57 Met Ile Ser 1 agg ctc ctt tcc ctt ctc tgc ctc cgg ctg tgt gtt ggg caa aca gac 105 Arg Leu Leu Ser Leu Leu Cys Leu Arg Leu Cys Val Gly Gln Thr Asp 5 10 15 att cct gaa aat ggg tct cct ccc aag ccc agc ctc agt gcc tgg ccc 153 Ile Pro Glu Asn Gly Ser Pro Pro Lys Pro Ser Leu Ser Ala Trp Pro 20 25 30 35 agc aca gtg ctt ccc acc aag agc cac gtg aca 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gcg tta ctg aag gtg 537 Lys Ala Gly Ser Val Leu Gly Pro Val Lys Phe Ala Leu Leu Lys Val 150 155 160 gga cac tca act cct gtg cag aca agg agc tca aca gga atg gta tca 585 Gly His Ser Thr Pro Val Gln Thr Arg Ser Ser Thr Gly Met Val Ser 165 170 175 gac ttc tct ctt cag aat gtg aca gcc aga gac tcg ggg gaa tac agc 633 Asp Phe Ser Leu Gln Asn Val Thr Ala Arg Asp Ser Gly Glu Tyr Ser 180 185 190 195 tgt gtt tac tat cag gca aag gct ccc tat cgg gcc tca ggg ccc agc 681 Cys Val Tyr Tyr Gln Ala Lys Ala Pro Tyr Arg Ala Ser Gly Pro Ser 200 205 210 aat ctc ctt gag atc tct gtg ata gac aac cat ctg cct caa gat ctt 729 Asn Leu Leu Glu Ile Ser Val Ile Asp Asn His Leu Pro Gln Asp Leu 215 220 225 gct gcc tcg act ttc cca ccg caa ctg aca gca acc tca ccc aag acc 777 Ala Ala Ser Thr Phe Pro Pro Gln Leu Thr Ala Thr Ser Pro Lys Thr 230 235 240 ccg ggt aca atg aca gaa ggc tac act gtg gat aat ctc atc cgg gtc 825 Pro Gly Thr Met Thr Glu Gly Tyr Thr Val Asp Asn Leu Ile Arg Val 245 250 255 ggt gtg gct gct gca atc ctg cta 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Gly Ser Val Leu Gly Pro Val Lys Phe Ala Leu 145 150 155 160 Leu Lys Val Gly His Ser Thr Pro Val Gln Thr Arg Ser Ser Thr Gly 165 170 175 Met Val Ser Asp Phe Ser Leu Gln Asn Val Thr Ala Arg Asp Ser Gly 180 185 190 Glu Tyr Ser Cys Val Tyr Tyr Gln Ala Lys Ala Pro Tyr Arg Ala Ser 195 200 205 Gly Pro Ser Asn Leu Leu Glu Ile Ser Val Ile Asp Asn His Leu Pro 210 215 220 Gln Asp Leu Ala Ala Ser Thr Phe Pro Pro Gln Leu Thr Ala Thr Ser 225 230 235 240 Pro Lys Thr Pro Gly Thr Met Thr Glu Gly Tyr Thr Val Asp Asn Leu 245 250 255 Ile Arg Val Gly Val Ala Ala Ala Ile Leu Leu Ile Val Gly Gly Phe 260 265 270 Leu Val Glu Ala Trp His Ser Glu Arg Leu Ser Pro Asn Lys Pro Trp 275 280 285 <210> 13 <211> 714 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 13 atgcagctgg caagaggaac agtaggaggc cgtggctgcg ctctctttcc actgctgagc 60 atcctagtcg tccagggtgc gcgtatcgtc ctctccttgg agataagtgc cgatgctcac 120 gtccgaggct atgtgggaga gaagatcaag ttgaaatgca ccttcaagtc atcttcagat 180 gtcactgaca agctgaccat agactggaca taccgccctc ccagcagcag 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ttcagatgtc 180 actgacaagc ttactataga ctggacatat cgccctccca gcagcagcca cacagtatca 240 atatttcatt atcagtcttt ccagtaccca accacagcag gcacatttcg ggatcggatt 300 tcctgggttg gaaatgtata caaaggggat gcatctataa gtataagcaa ccctaccata 360 aaggacaatg ggacattcag ctgtgctgtg aagaatcccc cagatgtgca ccataatatt 420 cccatgacag agctaacagt cacagaaagg ggttttggca ccatgctttc ctctgtggcc 480 cttctttcca tccttgtctt tgtgccctca gccgtggtgg ttgctctgct gctggtgaga 540 atggggagga aggctgctgg gctgaagaag aggagcaggt ctggctataa gaagtcatct 600 attgaggttt ccgatgacac tgatcaggag gaggaagagg cgtgtatggc gaggctttgt 660 gtccgttgcg ctgagtgcct ggattcagac tatgaagaga catattga 708 <210> 16 <211> 235 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 16 Met Gln Gln Arg Gly Ala Ala Gly Ser Arg Gly Cys Ala Leu Phe Pro 1 5 10 15 Leu Leu Gly Val Leu Phe Phe Gln Gly Val Tyr Ile Val Phe Ser Leu 20 25 30 Glu Ile Arg Ala Asp Ala His Val Arg Gly Tyr Val Gly Glu Lys Ile 35 40 45 Lys Leu Lys Cys Thr Phe Lys Ser Thr Ser Asp Val Thr Asp Lys Leu 50 55 60 Thr Ile Asp Trp Thr Tyr Arg Pro Pro Ser Ser Ser His Thr Val Ser 65 70 75 80 Ile Phe His Tyr Gln Ser Phe Gln Tyr Pro Thr Thr Ala Gly Thr Phe 85 90 95 Arg Asp Arg Ile Ser Trp Val Gly Asn Val Tyr Lys Gly Asp Ala Ser 100 105 110 Ile Ser Ile Ser Asn Pro Thr Ile Lys Asp Asn Gly Thr Phe Ser Cys 115 120 125 Ala Val Lys Asn Pro Pro Asp Val His His Asn Ile Pro Met Thr Glu 130 135 140 Leu Thr Val Thr Glu Arg Gly Phe Gly Thr Met Leu Ser Ser Val Ala 145 150 155 160 Leu Leu Ser Ile Leu Val Phe Val Pro Ser Ala Val Val Val Ala Leu 165 170 175 Leu Leu Val Arg Met Gly Arg Lys Ala Ala Gly Leu Lys Lys Arg Ser 180 185 190 Arg Ser Gly Tyr Lys Lys Ser Ser Ile Glu Val Ser Asp Asp Thr Asp 195 200 205 Gln Glu Glu Glu Glu Ala Cys Met Ala Arg Leu Cys Val Arg Cys Ala 210 215 220 Glu Cys Leu Asp Ser Asp Tyr Glu Glu Thr Tyr 225 230 235 <210> 17 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 17 gtgactttgc agtgccagaa 20 <210> 18 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 18 tgcacaggag ttgagtgtcc 20 <210> 19 <211> 12 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 19 acatcactcc gt 12 <210> 20 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 20 acggagtgat gtccgtcgac gtatctctgc gttgatactt cagcgtagct 50 <210> 21 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 21 agctacgctg aagtatcaac gcagag 26 <210> 22 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 22 cttctggcac tgcagagtca ccct 24 <210> 23 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 23 ggagagtaca cctgtgaata ctac 24 <210> 24 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 24 gtatcaacgc agagatacgt cgacgg 26 <210> 25 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 25 tccacctgcg gtcactgtac ccct 24 <210> 26 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 26 ctacagaaaa gcatcccccc acatcctttc 30 <210> 27 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 27 gctgatagta gacctgctga agac 24 <210> 28 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 28 gtccagatat gtccaggcct ctg 23 <210> 29 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 29 ttcagttatt ttaccagggt tta 23 <210> 30 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 30 tctgtgatag acaaccatct 20 <210> 31 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 31 gtcattgtac ccggggtctt 20 <210> 32 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 32 atgacagaag gctacactgt ggataa 26 <210> 33 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 33 tcatttttct cctggggcac 20 <210> 34 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 34 gatctctgtg atagatgcaa g 21 <210> 35 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 35 gtcattgtac ccggggtctt 20 <210> 36 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 36 cgcgtcgacg ccaccatgat ctctaggctc ctttccctt 39 <210> 37 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 37 gcgggcggcc gcttaccagg gtttatttgg agacag 36 <210> 38 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 38 cgcggcggcc gcattatcca cagtgtagcc ttctgtcat 39 <210> 39 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 39 cgcctcgagc tgggagagcc gcagctctgc tat 33 <210> 40 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 40 gcgggcggcc gcctactggg gtggtttctc atgctt 36 <210> 41 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 41 cgcgtcgacc agacatcggc aggttcctgc tcc 33 <210> 42 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 42 gcgggcggcc gctcagcctc tgccaggcat gttgat 36 <210> 43 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 43 cgcgtcgact taagtcccgt acaggcccag agt 33 <210> 44 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 44 gcgggcggcc gctcatctgt aatattgcct ctgtgt 36 <210> 45 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 45 tgtgaatact acagaaaagc atcc 24 <210> 46 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 46 tccacctgcg gtcactgtac ccct 24 <210> 47 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 47 cttctggcac tgcagagtca ccct 24 <210> 48 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 48 ggagagtaca cctgtgaata ctac 24 <210> 49 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 49 tgtgaatact acagaaaagc atcc 24 <210> 50 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 50 tccacctgcg gtcactgtac ccct 24 <210> 51 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 51 cgcgtcgacg ccaccatgat ccctaagctg ctttccctc 39 <210> 52 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 52 cgcgcggccg cctagcgcat gctacccttg gcagc 35 <210> 53 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 53 gcgggcggcc gcacccaggg agtagttgct cgatgt 36 <210> 54 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 54 cagctggcaa gaggaacagt 20 <210> 55 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 55 gagcatcggc acttatctcc 20 <210> 56 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 56 cgcgtcgacg ccaccatgca gctggcaaga ggaacagta 39 <210> 57 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 57 gcgggcggcc gctcagtacg cctcttcttc gtagtc 36 <210> 58 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 58 cgcgtcgacg ccaccatgca gcagagagga gcagctgga 39 <210> 59 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 59 gcgggcggcc gctcaatatg tctcttcata gtctga 36

Claims (31)

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18. (i) 서열 10으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하여 이루어지는 막 또는 분비 단백질;

    (ii) 서열 10으로 표시되는 아미노산 서열에 있어서, 1개 또는 복수개의 아미노산의 삽입, 치환 또는 결실, 또는 그의 한쪽 또는 양쪽 말단으로의 1개 또는 복수개의 아미노산의 부가가 이루어진 아미노산 서열을 포함하여 이루어지고, 또한 서열 10으로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 단백질과 동등한 기능을 갖는 막 또는 분비 단백질;

    (iii) 서열 10으로 표시되는 아미노산 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드와 가혹한 조건에서 하이브리다이제이션하는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되고, 또한 서열 10으로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 단백질과 동등한 기능을 갖는 막 또는 분비 단백질; 및

    (iv) 서열 10으로 표시되는 아미노산 서열과 70％ 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하여 이루어지고, 또한 서열 10으로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 단백질과 동등한 기능을 갖는 막 또는 분비 단백질

    로 이루어진 군으로부터 선택되는 막 또는 분비 단백질에 대한 항체 또는 그의 기능적 단편을 유효 성분으로서 포함하여 이루어지는 자기 면역 질환 치료제.
19. 제18항에 있어서, 류마티스 관절염의 치료에 이용되는 자기 면역 질환 치료제.
20. (i) 서열 10으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하여 이루어지는 막 또는 분비 단백질;

    (ii) 서열 10으로 표시되는 아미노산 서열에 있어서, 1개 또는 복수개의 아미노산의 삽입, 치환 또는 결실, 또는 그의 한쪽 또는 양쪽 말단으로의 1개 또는 복수개의 아미노산의 부가가 이루어진 아미노산 서열을 포함하여 이루어지고, 또한 서열 10으로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 단백질과 동등한 기능을 갖는 막 또는 분비 단백질;

    (iii) 서열 10으로 표시되는 아미노산 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드와 가혹한 조건에서 하이브리다이제이션하는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되고, 또한 서열 10으로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 단백질과 동등한 기능을 갖는 막 또는 분비 단백질; 및

    (iv) 서열 10으로 표시되는 아미노산 서열과 70％ 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하여 이루어지고, 또한 서열 10으로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 단백질과 동등한 기능을 갖는 막 또는 분비 단백질

    로 이루어진 군으로부터 선택되는 막 또는 분비 단백질에 대한 항체 또는 그의 기능적 단편을 유효 성분으로서 포함하여 이루어지는 T 세포 접착 저해제.
21. 하기 (i) 내지 (iv)로 이루어진 군으로부터 선택되는 막 또는 분비 단백질인 TARM 단백질과 T 세포와의 접착을 저해하는 물질 또는 그의 염 또는 이들의 용매화물의 스크리닝 방법이며,

    (a) 피검 물질의 존재하 및 비존재하에서, TARM 단백질과 T 세포를 접촉시키는 공정; 및

    (b) 상기 TARM 단백질과 T 세포와의 결합 활성을 측정하는 공정

    을 포함하는 스크리닝 방법.

    (i) 서열 10으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하여 이루어지는 막 또는 분비 단백질;

    (ii) 서열 10으로 표시되는 아미노산 서열에 있어서, 1개 또는 복수개의 아미노산의 삽입, 치환 또는 결실, 또는 그의 한쪽 또는 양쪽 말단으로의 1개 또는 복수개의 아미노산의 부가가 이루어진 아미노산 서열을 포함하여 이루어지고, 또한 서열 10으로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 단백질과 동등한 기능을 갖는 막 또는 분비 단백질;

    (iii) 서열 10으로 표시되는 아미노산 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드와 가혹한 조건에서 하이브리다이제이션하는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되고, 또한 서열 10으로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 단백질과 동등한 기능을 갖는 막 또는 분비 단백질; 및

    (iv) 서열 10으로 표시되는 아미노산 서열과 70％ 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하여 이루어지고, 또한 서열 10으로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 단백질과 동등한 기능을 갖는 막 또는 분비 단백질.
22. 제21항에 있어서, 공정 (b) 후에 (c) 피검 물질의 존재하에서의 결합 활성과 피검 물질의 비존재하에서의 결합 활성을 비교하는 공정을 추가로 포함하여 이루어지는 스크리닝 방법.
23. 제21항 또는 제22항에 있어서, T 세포가 활성화 T 세포인 스크리닝 방법.
24. 제23항에 있어서, 활성화 T 세포가 활성화 Th2 세포인 스크리닝 방법.
25. 수상 세포의 활성화를 저해하는 물질 또는 그의 염 또는 이들의 용매화물의 스크리닝 방법이며,

    (d) 피검 물질의 존재하 및 비존재하에서, 하기 (i) 내지 (iv)로 이루어진 군으로부터 선택되는 막 또는 분비 단백질에 대한 항체 또는 그의 기능적 단편과 수상 세포를 접촉시키는 공정; 및

    (e) 상기 수상 세포의 활성화 정도를 측정하는 공정

    을 포함하여 이루어지는 스크리닝 방법.

    (i) 서열 10으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하여 이루어지는 막 또는 분비 단백질;

    (ii) 서열 10으로 표시되는 아미노산 서열에 있어서, 1개 또는 복수개의 아미노산의 삽입, 치환 또는 결실, 또는 그의 한쪽 또는 양쪽 말단으로의 1개 또는 복수개의 아미노산의 부가가 이루어진 아미노산 서열을 포함하여 이루어지고, 또한 서열 10으로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 단백질과 동등한 기능을 갖는 막 또는 분비 단백질;

    (iii) 서열 10으로 표시되는 아미노산 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드와 가혹한 조건에서 하이브리다이제이션하는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되고, 또한 서열 10으로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 단백질과 동등한 기능을 갖는 막 또는 분비 단백질; 및

    (iv) 서열 10으로 표시되는 아미노산 서열과 70％ 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하여 이루어지고, 또한 서열 10으로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 단백질과 동등한 기능을 갖는 막 또는 분비 단백질.
26. 제25항에 있어서, 공정 (e)에 있어서, 수상 세포의 활성화 정도를 수상 세포에 있어서의 IL-6 및/또는 MCP-1 생산량을 지표로 하여 측정하는 스크리닝 방법.
27. 제26항에 있어서, 공정 (e) 후에 (f-1) 피검 물질의 존재하에서의 IL-6 및/또는 MCP-1 생산량과 피검 물질의 비존재하에서의 IL-6 및/또는 MCP-1 생산량을 비교하는 공정을 추가로 포함하여 이루어지는 스크리닝 방법.
28. 제25항에 있어서, 공정 (e)에 있어서, 수상 세포의 활성화 정도를 수상 세포에 있어서의 FcRγ쇄의 발현량을 지표로 하여 측정하는 스크리닝 방법.
29. 제28항에 있어서, 공정 (e) 후에 (f-2) 피검 물질의 존재하에서의 FcRγ쇄의 발현량과 피검 물질의 비존재하에서의 FcRγ쇄의 발현량을 비교하는 공정을 추가로 포함하여 이루어지는 스크리닝 방법.
30. 하기 (i) 내지 (iv)로 이루어진 군으로부터 선택되는 막 또는 분비 단백질인 TARM 단백질과 FcRγ쇄와의 복합체 형성을 저해하는 물질 또는 그의 염 또는 이들의 용매화물의 스크리닝 방법이며,

    (g) 피검 물질의 존재하 및 비존재하에서, 하기 (i) 내지 (iv)로 이루어진 군으로부터 선택되는 막 또는 분비 단백질에 대한 항체 또는 그의 기능적 단편과 수상 세포를 접촉시키는 공정; 및

    (h) 상기 수상 세포에 있어서의 FcRγ쇄의 발현량을 측정하는 공정

    을 포함하는 스크리닝 방법.

    (i) 서열 10으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하여 이루어지는 막 또는 분비 단백질;

    (ii) 서열 10으로 표시되는 아미노산 서열에 있어서, 1개 또는 복수개의 아미노산의 삽입, 치환 또는 결실, 또는 그의 한쪽 또는 양쪽 말단으로의 1개 또는 복수개의 아미노산의 부가가 이루어진 아미노산 서열을 포함하여 이루어지고, 또한 서열 10으로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 단백질과 동등한 기능을 갖는 막 또는 분비 단백질;

    (iii) 서열 10으로 표시되는 아미노산 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드와 가혹한 조건에서 하이브리다이제이션하는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되고, 또한 서열 10으로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 단백질과 동등한 기능을 갖는 막 또는 분비 단백질; 및

    (iv) 서열 10으로 표시되는 아미노산 서열과 70％ 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하여 이루어지고, 또한 서열 10으로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 단백질과 동등한 기능을 갖는 막 또는 분비 단백질.
31. 제30항에 있어서, 공정 (h) 후에 (i) 피검 물질의 존재하에서의 발현량과 피검 물질의 비존재하에서의 FcRγ쇄의 발현량을 비교하는 공정을 추가로 포함하여 이루어지는 스크리닝 방법.

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