JPWO2006054748A1 - 腎炎の治療剤 - Google Patents
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Abstract
Description
薬物治療の他に、自己抗体などの自己免疫症状の原因物質を除去する治療法も知られている。1つは「血漿交換」という方法で、透析と同じように血液を体外へ導き出して原因物質を除いてから体内に戻す。所要時間は3〜4時間で週に1回程度行う。もう1つは「血液吸着」といい、血液を体外へ導き出し原因物質をトリプトファンを固定化した膜に吸着させて除去するという方法である。しかし薬物療法と同様に治療効果には個人差がある。
〔1〕インターフェロン産生細胞の活性抑制物質を有効成分として含有する腎炎の治療剤。
〔2〕インターフェロン産生細胞の活性抑制物質が、インターフェロン産生細胞のインターフェロン産生および細胞の生存のいずれか、または両方を抑制する作用を有する物質である〔1〕に記載の治療剤。
〔3〕インターフェロン産生細胞の活性抑制物質が、インターフェロン産生細胞のインターフェロン産生および細胞の生存のいずれか、または両方を抑制する作用を有する抗体である〔2〕に記載の治療剤。
〔4〕抗体が、BST2およびそのホモログのいずれか、または両方を認識する抗体、またはその少なくとも抗原結合領域を含む抗体断片である〔3〕に記載の治療剤。
〔5〕抗体が、FERM BP-10339として寄託されたハイブリドーマ3D3#7、またはFERM BP-10340として寄託されたハイブリドーマ3G7#6が産生するモノクローナル抗体の、少なくとも抗原結合領域を含む抗体である〔4〕に記載の治療剤。
〔6〕インターフェロン産生細胞の活性を抑制する工程を含む、腎炎の治療方法。
〔7〕抑制すべきインターフェロン産生細胞の活性が、インターフェロン産生細胞のインターフェロン産生および細胞の生存のいずれか、または両方である〔6〕に記載の治療方法。
〔8〕インターフェロン産生細胞の活性を抑制する工程が、インターフェロン産生細胞のインターフェロン産生および細胞の生存のいずれか、または両方を抑制する作用を有する抗体を投与する工程を含む、〔7〕に記載の治療方法。
〔9〕抗体が、BST2およびそのホモログのいずれか、または両方を認識する抗体、またはその少なくとも抗原結合領域を含む抗体断片である、〔8〕に記載の治療方法。
〔10〕抗体が、FERM BP-10339として寄託されたハイブリドーマ3D3#7、またはFERM BP-10340として寄託されたハイブリドーマ3G7#6が産生するモノクローナル抗体の、少なくとも抗原結合領域を含む抗体である〔9〕に記載の治療方法。
〔11〕次の工程を含む、被験化合物の腎炎の治療効果の検出方法。
(1) インターフェロン産生細胞とインターフェロン産生細胞のインターフェロン産生誘導物質を、以下のi)-iii)のいずれかの順序で接触させる工程、
i) 被験化合物とインターフェロン産生細胞を接触後に、インターフェロン産生を誘導する細胞刺激剤をインターフェロン産生細胞に接触させる、
ii)被験化合物とインターフェロン産生を誘導する細胞刺激剤を同時にインターフェロン産生細胞に接触させる、または
iii)インターフェロン産生を誘導する細胞刺激剤をインターフェロン産生細胞に接触させた後に、被験化合物とインターフェロン産生細胞を接触させる
(2) インターフェロン産生細胞の活性を測定する工程、および
(3) 対照と比較して、インターフェロン産生細胞の活性が抑制されたとき、被験化合物の腎炎の治療効果が検出される工程
〔12〕細胞刺激剤がウイルス、ウイルスの構成要素、およびバクテリアのDNAからなる群から選択される少なくとも1つの細胞刺激剤である〔11〕に記載の方法。
〔13〕被験化合物が、インターフェロン産生細胞を認識する抗体またはその少なくとも抗原結合領域を含む抗体断片である〔11〕に記載の方法。
〔14〕〔11〕に記載の方法によって腎炎の治療効果が検出された被験化合物を選択する工程を含む、腎炎の治療効果を有する化合物のスクリーニング方法。
〔15〕〔14〕に記載のスクリーニング方法によって選択された化合物を有効成分として含有する腎炎の治療剤。
〔16〕インターフェロン産生細胞の活性抑制物質の、腎炎の治療剤の製造における使用。
ところで、IPCを認識する既知のモノクローナル抗体である抗BDCA-2モノクローナル抗体(Dzionek, A. et al. J.Immunol. 165: 6037-6046, 2000.)は、ヒトIPCのIFN産生を抑制する作用を有することが明らかにされている。その他にもマウスのインターフェロン産生細胞を認識するモノクローナル抗体が、インターフェロンの産生を抑制することも報告されている(Blood 2004 Jun 1;103/11:4201-4206. Epub 2003 Dec)。マウスのプラズマ細胞様樹状細胞(Plasmacytoid Dendritic Cell)に対するモノクローナル抗体による樹状細胞数の減少が報告された(J. Immunol. 2003, 171:6466-6477)。しかしこれらの抗体の腎炎に対する治療効果は未知である。
一方、本発明においては、IPCの活性を抑制することから、長期間にわたるIFN産生抑制効果が期待できる。特に、本発明の望ましい態様によれば、BST2あるいはそのホモログを認識する抗体は、IPCのIFN産生のみならず、細胞数をも抑制する。つまり、新たなIPCが供給されるまでは、IFN産生の抑制効果が持続する。またIPCが産生し得る他の炎症性サイトカインの産生も直接的あるいは間接的に抑制されることになる。これらの効果が相乗的に作用し、IFNの産生は効果的に抑制される。その結果、腎炎の高度な治療効果が達成される。特に腎炎のような慢性の疾患の治療方法においては、治療効果の持続性が大きな利点となる。
本発明において、腎炎とは腎臓による尿のろ過機能の阻害によってもたらされる疾患をいい、その原因は限定されない。腎臓のろ過機能の低下は、蛋白質や血液の尿への漏出を指標として診断される。
−蛋白尿、
−血尿、
−血液のろ過機能低下に伴う窒素化合物の血中濃度の上昇
−糸球体における免疫複合体の沈着、あるいは
−腎臓組織に対する自己抗体の沈着等
したがって、本発明は、腎炎の予防を含む。すなわち本発明は、IPCの活性抑制物質を有効成分として含む、腎炎の治療剤および予防剤の、いずれかまたは両方を提供する。あるいは本発明は、IPCの機能を抑制する工程を含む、腎炎の治療方法および予防方法の、いずれかまたは両方を提供する。
[ヒトIPCの細胞表面抗原のプロファイル]
CD4陽性、CD123陽性、
Lineage(CD3、CD14、CD16、CD19、CD20、CD56)陰性、CD11c陰性
[マウスIPCの細胞表面抗原のプロファイル]
−CD11c、B220、Ly6C、およびCD45RBが陽性
−CD11b、CD3、CD19が陰性
更に、ヒトあるいはマウスのIPCに共通して見られる特徴として、以下のような特徴を示すことができる。
[細胞の形態上の特徴]
−プラズマ細胞に似ている
−細胞表面が平滑な丸い細胞
−核が比較的大きい
[細胞の機能的な特徴]
−ウイルス感染時に、短期間に大量のType-1 interferonを産生する
−ウイルス感染後、樹状細胞に分化する
すなわち本発明は、BST2およびそのホモログのいずれかまたは両方を認識する抗体、またはその少なくとも抗原結合領域を含む抗体断片を有効成分として含有する腎炎の治療剤に関する。また本発明は、BST2およびそのホモログのいずれかまたは両方を認識する抗体、またはその少なくとも抗原結合領域を含む抗体断片を投与する工程を含む、腎炎の治療方法に関する。あるいは本発明は、BST2およびそのホモログのいずれかまたは両方を認識する抗体、またはその少なくとも抗原結合領域を含む抗体断片の、腎炎の治療剤の製造における使用に関する。
本発明において明らかにされたヒトとマウスのBST2とそのホモログの塩基配列情報、およびアミノ酸配列情報を以下にまとめた。
塩基配列 アミノ酸配列 アミノ酸配列の長さ
ヒトBST2D 配列番号:1 配列番号:2 (180)
ヒトBST2H 配列番号:3 配列番号:4 (158)
ヒトBST2HS 配列番号:5 配列番号:6 (100)
マウスBST2H 配列番号:7 配列番号:8 (178)
マウスBST2D 配列番号:9 配列番号:10 (172)
マウスBST2HS 配列番号:18 配列番号:19 (105)
トキシン類:緑膿菌毒素(Pseudomonas Endotoxin; PE)、ジフテリアトキシン、リシン
放射性同位元素:Tc99m、Sr89、I131、Y90
抗癌剤:カリキアマイシン、マイトマイシン、パクリタキセル
蛋白質からなるトキシン類は、2官能性試薬によって抗体あるいはその断片などに結合することができる。あるいは、抗体をコードする遺伝子にトキシン類をコードする遺伝子を接合し、両者の融合蛋白質を得ることもできる。放射性同位元素を抗体に結合する方法も公知である。たとえば、キレート剤を利用して、抗体を放射性同位元素で標識する方法が公知である。更に抗癌剤は、糖鎖あるいは2官能性試薬などの利用により、抗体に結合することができる。
(1)BST2またはそのホモログを免疫原として免疫動物に投与する工程
(2)(1)の免疫動物の抗体産生細胞から、BST2を認識する抗体を産生する抗体産生細胞を選択する工程、
(3)(2)で選択された抗体産生細胞を培養するか、または当該抗体産生細胞が産生する抗体をコードする遺伝子を単離し、この遺伝子を発現可能に保持する細胞を培養する工程、および
(4)(3)の培養物からインターフェロン産生細胞の活性を抑制する抗体を回収する工程。
−生体から採取されたIPC
−造血幹細胞などから分化誘導されたIPC
−外来性のBST2またはそのホモログ遺伝子を発現可能に保持する細胞
生体からIPCを採取するためには、たとえば先に述べたような細胞表面マーカーの発現プロファイルに基づいて、目的とする細胞を採取すればよい。複数の細胞表面マーカーを指標として特定の細胞を集めるための方法は公知である。たとえば免疫染色とセルソーターを利用することによって、目的とする発現プロファイルに適合する細胞を容易に分取することができる。たとえばヒトのIPCは、BDCA-2陽性細胞を選択することにより、IPCが濃縮される。ヒトから採取されたIPCは、必要に応じて活性化された後に免疫原として利用される。
IPCは、生体の末梢血あるいは造血組織以外に、培養細胞として得ることもできる。たとえばヒトおよびマウスの造血幹細胞を培養し、IPCに分化させることによって大量に得ることができる。ヒトおよびマウス造血幹細胞をin vitroでIPCに分化させるための条件は公知である。
あるいは、既にIPC特異的であることが明らかな抗体を利用して、当該抗体陽性の細胞をIPCとして分取することもできる。本発明者らが樹立した、マウスIPC特異抗原を認識するモノクローナル抗体産生細胞2E6(WO 2004/013325, FERM-BP-8445)が産生するモノクローナル抗体を、マウスIPCの分取に利用することができる。
次に、融合細胞が有する選択マーカーに基づいて、細胞融合に成功した細胞が選択される。たとえばHAT感受性の細胞株を細胞融合に用いた場合には、HAT培地において成育する細胞を選択することによって、細胞融合に成功した細胞が選択される。更に選択された細胞が産生する抗体が、目的とする反応性を有していることを確認する。
本発明に利用することができるモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマとして、たとえば、ハイブリドーマ3D3#7あるいは3G7#6を示すことができる。ハイブリドーマ3D3#7およびハイブリドーマ3G7#6は、2005年5月27日付けで独立行政法人産業技術総合研究所内特許生物寄託センターに対して、受託番号FERM BP-10339および受託番号FERM BP-10340として寄託されている。以下に、寄託を特定する内容を記載する。
(a)寄託機関の名称・あて名
名称:独立行政法人 産業技術総合研究所 特許生物寄託センター
あて名:日本国茨城県つくば市東1丁目1番1号中央第6(郵便番号305-8566)
(b)寄託日:2005年5月27日
(c)受託番号:BP-10339 (ハイブリドーマ3D3#7)
(c)受託番号:BP-10340 (ハイブリドーマ3G7#6)
(a)BST2およびそのホモログのいずれかまたは両方に結合する抗体、またはその抗原結合領域を含む断片
(b)(a)の抗体の相補性決定領域を移植したイムノグロブリン、またはその抗原結合領域を含む断片、および
(c)(a)または(b)に記載の成分をコードするポリヌクレオチド
本発明において、IPCの活性を抑制するモノクローナル抗体としては、配列番号:2、配列番号:4、および配列番号:6からなる群から選択されるいずれかの配列番号に記載のアミノ酸配列を有する蛋白質を認識するモノクローナル抗体を利用することができる。
−定常領域を欠失した抗原結合領域を含む断片(Monoclonal Antibodies : Principles and Practice, third edition, Academic Press Limited. 1995; Antibody Engineering, A Practical Approach, IRL PRESS, 1996)
−モノクローナル抗体の抗原結合領域と宿主のイムノグロブリンの定常領域とで構成されるキメラ抗体(遺伝子発現実験マニュアル 講談社 1994年 (石田 功、安東 民衛 編))
−宿主のイムノグロブリンにおける相補性決定領域(CDR)をモノクローナル抗体のCDRに置換したCDR置換抗体(遺伝子発現実験マニュアル 講談社 1994年 (石田 功、安東 民衛 編))
イムノグロブリンを発現することができるベクターは、細胞に導入することにより投与することができる。生体への投与にあたっては、生体への投与によって細胞に感染させることができるものはそのまま投与することができる。あるいは、いったん生体から分離したリンパ球にベクターを導入して再び生体に戻すこともできる(ex vivo)。
(1) インターフェロン産生細胞とインターフェロン産生細胞のインターフェロン産生誘導物質を、以下のi)-iii)のいずれかの順序で接触させる工程、
i) 被験化合物とインターフェロン産生細胞を接触後に、インターフェロン産生を誘導する細胞刺激剤をインターフェロン産生細胞に接触させる、
ii)被験化合物とインターフェロン産生を誘導する細胞刺激剤を同時にインターフェロン産生細胞に接触させる、または
iii)インターフェロン産生を誘導する細胞刺激剤をインターフェロン産生細胞に接触させた後に、被験化合物とインターフェロン産生細胞を接触させる
(2) インターフェロン産生細胞の活性を測定する工程、および
(3) 対照と比較して、インターフェロン産生細胞の活性が抑制されたとき、被験化合物の腎炎の治療効果が検出される工程
更にex vivoでの評価においては、生体外で調製されたIPCに対して、細胞刺激剤または被験化合物を接触させる。接触後のIPCを生体に投与し、更に被験化合物または細胞刺激剤を投与する。生体内におけるIPCの活性化のレベルを評価し、被験化合物の作用が評価される。IPCの活性化のレベルは、たとえば血中のIFNのレベルを指標として評価することができる。なお生体外におけるIPCの調製とは、生体からIPCを採取すること、あるいはIPCの前駆細胞の分化誘導によって人工的にIPCを調製することを言う。
(1)本発明の腎炎の治療効果を測定する方法によって、被験化合物が有している腎炎の治療効果を測定する工程、および
(2)対照と比較して前記効果が大きい被験化合物を選択する工程
本発明のスクリーニング方法に用いる被験化合物としては、IPCの細胞表面抗原を認識する抗体、その少なくとも抗原結合領域を含む抗体断片、あるいはその可変領域を含む断片を用いることができる。抗体として、可変領域を発現させたファージライブラリーを用いることもできる。あるいは、コンビナトリアルケミストリーにより合成された化合物標品のほか、動・植物組織の抽出物もしくは微生物培養物等の複数の化合物を含む混合物、またそれらから精製された標品などを候補化合物として用いることもできる。
(1) インターフェロン産生細胞とインターフェロン産生細胞のインターフェロン産生誘導物質を、以下のi)-iii)のいずれかの順序で接触させる工程、
i) 抗体とIPCを接触後に、IFN産生を誘導する細胞刺激剤をIPCに接触させる、
ii)抗体とIFN産生を誘導する細胞刺激剤を同時にIPCに接触させる、または
iii)IFN産生を誘導する細胞刺激剤をIPCに接触させた後に、抗体とIPCを接触させる
(2) IPCの活性を測定する工程、および
(3) 対照と比較して、IPCの活性が抑制されたとき、抗体の腎炎の治療効果が検出される工程
本発明に基づく、抗体の腎炎の治療効果の検出方法は、更に当該活性を有する抗体のスクリーニング方法を可能とする。すなわち本発明は、以下の工程を含む、腎炎の治療効果を有する抗体のスクリーニング方法に関する。
(1)本発明の腎炎の治療効果を測定する方法によって、抗体が有している腎炎の治療効果を測定する工程、および
(2)対照と比較して前記効果が大きい抗体を選択する工程
本発明の検出方法並びにスクリーニング方法において、抗体とは、天然のイムノグロブリン分子、その抗原結合領域を含む断片、アミノ酸配列や糖鎖が修飾された変異体、および化学的な修飾を施した誘導体が含まれる。抗体の抗原結合領域を含む断片は、イムノグロブリンを酵素的に消化することによって得ることができる。あるいは、当該領域をコードする遺伝子を単離し、適当な発現系において発現させることにより、遺伝子工学的に得ることもできる。このようなイムノグロブリンの組み換え体として、たとえばファージ抗体ライブラリーを示すことができる。一方、IPCおよび細胞刺激剤は、先に示したようなものを利用することができる。
なお、本明細書において引用された全ての先行技術文献は、参照として本明細書に組み入れられる。
以下、実施例に基づいて本発明を更に詳細に説明する。
免疫原とする細胞は以下のようにして調製した。Balb/cマウス雌(4〜6週令)の骨髄細胞を、10ng/mlのFLT-3リガンド(R&D Systems社製)を添加した10%FCS-RPMI1640培地〔10%牛胎児血清(FCS)、およびペニシリン、ストレプトマイシンを含むRPMI1640培地〕にて10日間培養した。10日後、IPC(Interferon producing cell)を、CD11c陽性、CD11b陰性、B220陽性分画としてセルソーター(FACSVantage, Becton Dickinson社製)で分離した。抗体はBecton Dickinson社製のものを用いた。
上記の分離した細胞を、0、4、11日目に、片足あたり1x106個ずつ、完全フロインドアジュバント(CFA:ヤトロン社製)と共にラットのフットパッド(foot pad)へ注入した。12日目に免疫ラットのリンパ節を分離し、リンパ球を採取した。マウスのミエローマ細胞P3x63Ag8.653とラットのリンパ球を4:5の割合で混合し、ポリエチレングリコール(PEG)を加えて細胞を融合した。融合後の細胞を十分に洗浄してHAT培地に分散させ、1ウェルあたり5x104個の細胞を含むように96 well plateにまいた。
Balb/cマウス雌(4〜6週令)の骨髄細胞を、10ng/mlのFLT-3リガンドを添加した10%FCS-RPMI1640培地にて10日間培養した。10日目には約40%の細胞がIPCになった。この細胞を用い、ハイブリドーマ培養上清を1次抗体とし、2次抗体にFITC標識抗ラットIg抗体(BD Pharmingen社製)を用いて染色した。その後、各種抗体(CD11b、CD11c、CD3、CD19、CD45RB、B220、Ly6C;いずれもBecton Dickinson社製)により二重染色し、フローサイトメトリー法により解析(FACS解析)した。
実施例2と同様に培養した骨髄細胞を、培養上清を1次抗体とし、2次抗体にFITC標識抗ラットIg抗体を用いて染色した。その後、セルソーター(FACSVantage, Becton Dickinson社製)を用いて陽性細胞を分離した。サイトスピン後、ギムザ染色し、顕微鏡下にて観察したところ、IPCに特異的な形態を示した(図2a)。すなわち、この細胞の形は丸く、大きな核を有していた。
実施例2と同様に培養した骨髄細胞をSNK01、SNK03培養上清および2次抗体で染色後、セルソーターにて陽性、陰性細胞を分離した。各々の分画の細胞、1x105個ずつを96 well 丸底プレートに分注し(100μl/well)、インフルエンザウイルスPR8を感染させ、24時間後の培養上清中のIFNαの濃度を以下のようなELISA法にて測定した。
抗体陽性細胞では、陰性細胞に比べて、高いインターフェロンの産生が認められた。すなわち、モノクローナル抗体SNK01、SNK03が認識する抗原はIPCに特異的な表面抗原であることが確認できた(図3)。
実施例2と同様に培養したマウス骨髄細胞を1x105個ずつ、96 well丸底プレートに分注した。これに抗体、またはコントロール抗体であるラットIgGを添加し、37℃にて30分間培養後、インフルエンザウイルスPR8を添加し、37℃にて24時間培養し、培養上清中のIFNαを上記実施例4に示したELISAにより測定した(図4)。その結果、SNK01は濃度依存的にIFNαの産生を抑制した。また、SNK03抗体も同様に濃度依存的にIFNαの産生を抑制した(図5)。
1) IPC-cDNAライブラリーの作製
実施例2と同様にFLT-3リガンドで骨髄細胞から誘導したIPCより全RNAをフェノール-グアニジン法により抽出し、oligo-dTカラムによりmRNAを精製した。精製したmRNAからGubler-Hoffman法によりcDNAを合成し、両端にEcoRI-NotIアダプター(インビトロジェン社製)を結合後、スパンカラム(クロマスピン400、クロンテック社製)により未反応のEcoRIアダプターおよび500塩基以下の短いcDNAを除去した。得られた両端にEcoRIサイトを有するcDNAを動物細胞用発現用ベクターpME18s (XhoI断片を除いたもの)のEcoRIサイトにT4リガーゼにより結合し、大腸菌DH10(インビトロジェン社製)にエレクトロポーレーション法により形質転換した。これを100μg/mlのカルベニシリンを含むLB培地(LB・カルベニシリン)500mlで30℃で一晩培養し、QIA filter plasmid maxi kit (Qiagen社製)により 同キットのプロトコールに従ってplasmidを抽出、精製し、IPC-cDNAライブラリーを得た。
COS7細胞を6cmディシュに5x105個ずつ10枚まき、37℃、5%CO2存在下で20時間培養後、Effectene trasfection Reagent(Qiagen社製)により同製品のプロトコールに従い、上記1)で取得したIPC cDNAライブラリーをtransfectionした。48時間、37℃、5%CO2下で培養後、PBS(Phosphate Buffered Saline)で洗浄、PBS/5mM EDTAで細胞をディシュから剥離し、さらにPBSで洗浄後、セルストレナー(70μm, ファルコン社製)を通した。遠心後(1300rpm, 5分)上清を除去し、PBS/ 0.5%BSA/2mM EDTAを1ml添加して懸濁し、Fc block (ファーミンジェン社製) 40μlを加え4℃で20分間置いた。これにビオチン化したSNK01抗体30〜50μgを加え、氷上で30分間保持した。PBSで洗浄後、100μlのPBSに懸濁し、ストレプトアビジンマイクロビーズ(Miltenyi Biotec社製)10-20μlを加え10℃で15分静置した。PBS/ 0.5%BSA/2mM EDTAで洗浄することにより過剰なストレプトアビジンマイクロビーズを除去し、1mlのPBS/ 0.5%BSA/2mM EDTAに懸濁した。AutoMACS(Miltenyi Biotec社製)でposseldsの条件で細胞を分取した。改良Hirt法(BioTechniques Vol.24,760-762,1998)によりplasmidを抽出、精製した。得られたplasmidを大腸菌DH10にエレクトロポーレーション法により形質転換し、LB・カルベニシリン100mlで30℃で一晩培養し、QIA filter plasmid midi kit (Qiagen社製)により 同キットのプロトコールに従ってplasmidを抽出、精製した。
その結果モノクローナル抗体SNK01が結合したクローンは、配列番号:7および、配列番号:9に記載の塩基配列を有していた。これらの塩基配列によってコードされるアミノ酸配列を、配列番号:8および配列番号:10に示した。
上記発現クローニング法により得られたプラスミドをQIA filter plasmid midi kit (Qiagen社製)により再度大腸菌より高度に精製し、もう一度COS7細胞にtransfectionした。48時間後、定法に従って、SNK01抗体およびFITC標識抗ラットIg抗体で反応させ、FACS解析を行うことで、plasmid上にクローン化されているcDNAが、抗原をコードしているかどうかを確認した。
その結果、上記モノクローナル抗体SNK01は、プラスミドを導入したCOS7細胞に対する結合が観察された。したがって、プラスミド上にクローン化されているcDNAは、いずれもこのモノクローナル抗体によって認識された抗原をコードしていることが確認された。
前記モノクローナル抗体が、配列番号:8または配列番号:10に記載のアミノ酸配列を有する蛋白質を認識し結合することを、ウエスタンブロッティング法によって確認した。配列番号:8または配列番号:10に記載のアミノ酸配列を遺伝子組み換え体として発現させ、本発明のモノクローナル抗体との反応性を確認した。具体的な操作は次のとおりである。
クローニングしたmBST2DおよびmBST2Hをコードするplasmid(1μg)を鋳型として、PCRにより配列番号:7または配列番号:9に記載の塩基配列を有するDNAを増幅した。PCRに用いたプライマーの塩基配列は次のとおりである。
forward primer(配列番号:11):
5'-tttttgctagcgacggatcacatggcgccctctttctatcactatctgcccgtgcccatggatgagatgggggggaagcaagga-3'
reverse primer(配列番号:12)
5'-tttttttctcgagtcctcaaaagagcaggaacagtgac-3'
また反応液の組成は以下のとおりである。
1XGC bufferI,
dNTP mix (0.25 mM ),
LA Taq DNA polymerase 5U(以上タカラバイオ製)/100μL
forward primer (1 pmol):
reverse primer (1 pmol)
pcDNA3.1-mBST2D(pcDNA3.1-mBST2D-His構築の場合)あるいはpcDNA3.1-mBST2H(pcDNA3.1-mBST2H-His構築の場合)1μgを鋳型として、PCRによりHisタグをコードする塩基配列を付加した。PCRに用いたプライマーの塩基配列は次のとおりである。なおforward primer(配列番号:13)は、pcDNA3.1-mBST2D-HisとpcDNA3.1-mBST2H-Hisに同じものを用いた。反応液の組成と温度サイクルの条件は1)と同様とした。
forward primer(配列番号:13):
5'-ccagctcacccgcacccaggacagtc-3'
reverse primer(pcDNA3.1-mBST2D-His用、配列番号:14):
5' -tttttttctcgagtcaatgatgatgatgatgatgaaagagcagaaacagtgacactttga-3'
reverse primer(pcDNA3.1-mBST2H-His用、配列番号:15):
5'-tttttttctcgagtcaatgatgatgatgatgatggaagtctccttttggatcctgagctg-3'
6cmディシュにCOS7細胞を5x105で10枚まき、37℃、5%CO2下で20時間培養した。培養後のCOS7細胞に、Effectene trasfection Reagent(Qiagen社製)により、pcDNA3.1-mBST2D-HisあるいはpcDNA3.1-mBST2H-Hisを形質転換した。操作は、同製品のプロトコールに従った。37℃・5%CO2下で48時間の培養後、PBSで洗浄、PBS/5mM EDTAで細胞をディシュから剥離し回収した。回収した細胞は、さらにPBSで洗浄後、1xHalt Protease Inhibitor Coctail (PIERCE 社製)を含む2mlのRIPA bufferを加えて氷上で1時間溶解した。RIPA bufferの組成を以下に示す。
50 mM Tris-HCl(pH7.4),
150 mM NaCl,
1% Triton x-100,
0.5% sodium deoxycholate,
0.1% SDS
沈殿には200μLの1x変性bufferを、濃縮した上清には等量の2x変性bufferを加え100℃にて10分間煮沸した後、それぞれ5μLをNuPAGE4-12% Bis-Tris Gel (インビトロジェン社製)にて電気泳動した。泳動後のゲルから試料をセミドライ方式のブロッティング装置(BIO CRAFT社製、MODEL BE-330)にて、PVDF膜(MILLIPORE社製)にトランスファーした。
セルソーター(FACSVantage, Becton Dickinson社製)により高度に分離したマウスIPCから抽出したRNAより合成したcDNAを鋳型として、定法に従ってPCRを行い、抗原遺伝子がIPCに特異的に発現していることを確認した。PCRに用いたプライマーの塩基配列は次の通りである。
配列番号:7用forward(配列番号:16):
5'-acatggcgccctctttctatcac-3'
reverse(配列番号:17):
5'-gagcccaggttttgaaggaagtg-3'
その結果、cDNAに該当する増幅断片の他に、短い増幅断片が観察された。本増幅断片を定法によりクローニングして塩基配列を確認したところ、配列番号:7に示したmBST2Hの第2エクソン部分が欠失した塩基配列を有していた。すなわち、配列番号:18に示した塩基配列を有する、マウスBST2の新規のスプライシングバリアントであると考えられた。この遺伝子がコードするアミノ酸配列を配列番号:19に示した。この配列番号:18記載の遺伝子を、以下mBST2HSとも称する。
mBST2D、mBST2H、mBST2HSのアミノ酸配列のアライメントを図7(a)に、それぞれのゲノム構造を図7(b)に示す。
実施例6により得られたmBST2DおよびmBST2HのcDNAを鋳型とし、以下の塩基配列からなるプライマーを使って以下の条件でPCRを行った。
forward primer ;
tttttgctagcgacggatcacatggcgccctctttctatcactatctgcccgtgcccatggatgagatgggggggaagcaagga(配列番号:11)および
reverse primer; tttttttctcgagtcctcaaaagagcaggaacagtgac(配列番号:12)
DNAポリメラーゼ:LA Taq(タカラバイオ社)
[95℃を30秒、55℃を30秒、72℃を2分]を25サイクル
本発明において同定されたマウスIPC特異抗原BST2のヒトオーソログを検索したところ、ヒトBST2として報告された既知の遺伝子であった(Ishikawa,J. et al. Genomics, 1995; 26, 527-;GenBank Acc#. D28137)。更にマウスで見出された新規スプライシングバリアントのヒトオーソログも含めて以下のようにしてPCR法によりクローニングし、3種類の発現ベクターを作製した。
mBST2Hオーソログ用のプライマー
hBST2 primer F(配列番号:20)および
primerhBHR;ttttttctcgagctagggatgtgggggtgagaggaatgtggcaggtggagggtagcgggggaaggctatctctgacctcagtcgctccacctctgcagac(配列番号:22)
mBST2HSオーソログ用のプライマー
hBST2 primer F(配列番号:20)および
primerhBST2HSR1; aaaaaaactcgagcttatggtttaatgtagtgatctctccacagtgtggttgcaggtggcggcct(配列番号:23)
hBST2D、hBST2H、hBST2HSのアミノ酸配列のアライメントを図8(a)に、それぞれのゲノム構造を図8(b)に示した。hBST2HおよびhBST2HSは新規スプライシングバリアントであることが示唆された。
1)抗マウスBST2抗体の作製
マウスBST2の3種類のサブタイプD、H、HSのいずれか、あるいは複数を認識する抗体を以下のように作製した。
6cmディッシュ5枚に、1枚あたり4x105個のCOS7細胞を播種し、20時間培養後にEffectene trasfection Reagent(Qiagen社製)を用いて同製品のプロトコールに従い、上記実施例10で作製したそれぞれのタイプのcDNAがクローニングされた3種類の発現ベクターを同量(ディッシュ1枚あたり1μg)ずつ混合してトランスフェクションした。24時間後、新鮮な培地に交換し、更に24時間後、PBS/5mM EDTAで細胞を回収し、PBSで洗浄した後に、Wister rat(5〜6週令)の両足のfoot padにアジュバンドCFAとともに注入した。
得られたクローンの培養上清を用いて、実施例5に示した方法に従って、IFN産生に与える影響を検討したところ、いずれもコントロール抗体と比較してIPCのIFN産生を抑制する活性があった。更に、0.1μMのCpG ODN 1668(MWG Biotech社)を用いて刺激した際にも、IFN産生抑制活性を示した(図9)。このことから、SNK01以外のmBST2に対する抗体もIPCからのIFN産生を抑制する活性を示すことが確認された。
1) ヒトBST2抗体の作製
ヒトBST2の3種類のサブタイプD、H、HSのいずれか、あるいは複数を認識する抗体を実施例11と同様の方法に従って作製した。実施例10で作製したそれぞれのタイプのヒトcDNAがクローニングされた3種類の発現ベクターを用い、培養上清をFACS解析することによってハイブリドーマをスクリーニングした。3D3#7、3E2#8、5C11#7、3G7#6など、複数のクローンが得られた。得られた複数のクローンの精製抗体を取得し、更に解析を行った。
健常人より末梢血を採取し、PBL(末梢血リンパ球)を分離した。Lineage抗体(CD3、CD14、CD16、CD19、CD20、CD56抗体)にてMACSで種々の細胞を除去した後、CD4陽性、CD123陽性、Lineage陰性細胞群をIPCとしてセルソーターで分離した。このように取得したヒトIPCを2x104cells/wellで96 wellプレートに播種し、それぞれ3、10、30μg/mLの濃度で抗BST2抗体を添加して37℃で1時間培養した。1時間培養後にHerpes Simplex virus(20 pfu/cell)を添加し、37℃で24時間培養し、培養上清中のIFNαをELISA kit(Bender Med System社)により、測定した。その結果、抗ヒトBST2抗体は、既に報告のあるBDCA2抗体(Miltenyi社)と同様に、ヒトIFN産生抑制活性を示すことが明らかとなった(図10)。すなわち、ヒトBST2を認識する抗体は、その分子を発現する細胞のIFN産生活性に影響を与えることが明らかとなった。
1) 抗体投与マウスより採取した細胞の解析
Balb/cマウスの腹腔内にSNK01、SNK03、およびコントロールのラットIgGを1匹あたり300μgずつ、一日おきに3回投与し(0.9mg/マウス)、6日目に脾臓、骨髄を採取した。更に、骨髄細胞を1x106/wellにて96wellプレートに播種し、CpG(0.5μM)あるいはインフルエンザウイルスPR8によって刺激し、24時間後の培養上清のサイトカイン値をELISAにより測定した(図11)。
その結果、SNK01、SNK03投与群において、IPCの各種刺激に対するIFNの産生能が低いことが明らかになった。すなわち、抗体の投与により、IPCの機能に変化を生じ、in vitroでの刺激によるIFN産生能が抑制されたことが示された。
抗体を前投与(1.5日前と0.5日前にそれぞれ一匹あたり500μg)したマウス(n=3)に5x104pfu/mouseのMCMV(マウスサイトメガロウイルス)を腹腔内に投与し、感染を起した。この感染後、1.5日後のマウスの血清中のIFNαをELISAにより測定した。また、脾臓でのIPCの細胞数(cell population)をB220、CD11c、CD11bの染色によって解析した(図12)。
その結果、SNK01投与群において、血清中のIFN産生量は抑制されていた。すなわち、本抗体投与により、分子が発現している細胞の機能に変化を生じ、in vivoにおけるIFN産生能が抑制されたことが示された。
自己免疫性溶血性貧血を自然発症するNZB(New Zealand Black)マウスと、一見正常に見えるNZW(New Zealand White)マウスのF1マウスは、ループス腎炎を自然発症する。(Helyer BJ et al. Nature 197;197,1963) これらのマウス(日本SLC)を用いて、解析を行った。まず、骨髄、脾臓、末梢血中のIPCの細胞数(cell population)をFACS解析によって測定した。その結果、コントロールとして用いた129マウスと比較して、自己免疫疾患を発症するNZB、NZB/W F1マウスでは、IPCの数が特に骨髄で増加していることが示された(図13)。
NZB/W F1マウス(日本SLC)を、SPF環境下で飼育し、2ヶ月齢から7ヶ月齢までの5ヶ月間、次のように抗体投与を行った。各群10匹のマウスに、SNK01、SNK03、およびコントロールのラットIgG (ICN Pharmaceuticals,Inc.)を1匹あたり250μgずつ、週2回腹腔内に投与した。
5ヶ月齢の各マウスより血清を採取し、血清中のIFNα濃度を実施例4に示した方法で、また、TNFα濃度をELISA Development kit(Genzyme-Techne社製)により測定した。その結果、SNK01、SNK03抗体投与群では、それぞれのサイトカイン産生量が抑制されていた(図16)。
NZB/W F1マウスを飼育し、腎炎が発症する5ヶ月齢より8ヶ月齢まで抗体を投与し、その効果を比較検討した。各群を6匹とし、以下に示す物質を週2回腹腔内に投与した。各群の尿中の蛋白質量を実施例15と同様に測定し、比較検討した。プレドニンは自己免疫疾患の治療に利用されるステロイドである。塩野義製薬社製のコハク酸プレドニゾロンナトリウムをプレドニン(以下プレドニンあるいはPDと称する)として用いた。
1)SNK01抗体250μg+プレドニン 0.5mg、
2)コントロールのラットIgG(ICN Pharmaceuticals, Inc. )250μg +プレドニン0.5mg、
3)プレドニン0.5mgのみ
治療後8ヶ月齢のマウスでは、SNK01抗体とプレドニンを併用した群において、プレドニン単独もしくは、プレドニン+コントロール抗体の投与群に比較し、蛋白尿の程度の抑制が見られ、腎炎発症において治療効果があることが示唆された(図17)。なお図において、黒丸は死亡マウスで、死亡直前の蛋白尿の程度を示す。
Claims (16)
- インターフェロン産生細胞の活性抑制物質を有効成分として含有する腎炎の治療剤。
- インターフェロン産生細胞の活性抑制物質が、インターフェロン産生細胞のインターフェロン産生および細胞の生存のいずれか、または両方を抑制する作用を有する物質である請求項1に記載の治療剤。
- インターフェロン産生細胞の活性抑制物質が、インターフェロン産生細胞のインターフェロン産生および細胞の生存のいずれか、または両方を抑制する作用を有する抗体である請求項2に記載の治療剤。
- 抗体が、BST2およびそのホモログのいずれか、または両方を認識する抗体、またはその少なくとも抗原結合領域を含む抗体断片である請求項3に記載の治療剤。
- 抗体が、FERM BP-10339として寄託されたハイブリドーマ3D3#7、またはFERM BP-10340として寄託されたハイブリドーマ3G7#6が産生するモノクローナル抗体の、少なくとも抗原結合領域を含む抗体である請求項4に記載の治療剤。
- インターフェロン産生細胞の活性を抑制する工程を含む、腎炎の治療方法。
- 抑制すべきインターフェロン産生細胞の活性が、インターフェロン産生細胞のインターフェロン産生および細胞の生存のいずれか、または両方である請求項6に記載の治療方法。
- インターフェロン産生細胞の活性を抑制する工程が、インターフェロン産生細胞のインターフェロン産生および細胞の生存のいずれか、または両方を抑制する作用を有する抗体を投与する工程を含む、請求項7に記載の治療方法。
- 抗体が、BST2およびそのホモログのいずれか、または両方を認識する抗体、またはその少なくとも抗原結合領域を含む抗体断片である、請求項8に記載の治療方法。
- 抗体が、FERM BP-10339として寄託されたハイブリドーマ3D3#7、またはFERM BP-10340として寄託されたハイブリドーマ3G7#6が産生するモノクローナル抗体の、少なくとも抗原結合領域を含む抗体である請求項9に記載の治療方法。
- 次の工程を含む、被験化合物の腎炎の治療効果の検出方法。
(1) インターフェロン産生細胞とインターフェロン産生細胞のインターフェロン産生誘導物質を、以下のi)-iii)のいずれかの順序で接触させる工程、
i) 被験化合物とインターフェロン産生細胞を接触後に、インターフェロン産生を誘導する細胞刺激剤をインターフェロン産生細胞に接触させる、
ii)被験化合物とインターフェロン産生を誘導する細胞刺激剤を同時にインターフェロン産生細胞に接触させる、または
iii)インターフェロン産生を誘導する細胞刺激剤をインターフェロン産生細胞に接触させた後に、被験化合物とインターフェロン産生細胞を接触させる
(2) インターフェロン産生細胞の活性を測定する工程、および
(3) 対照と比較して、インターフェロン産生細胞の活性が抑制されたとき、被験化合物の腎炎の治療効果が検出される工程 - 細胞刺激剤がウイルス、ウイルスの構成要素、およびバクテリアのDNAからなる群から選択される少なくとも1つの細胞刺激剤である請求項11に記載の方法。
- 被験化合物が、インターフェロン産生細胞を認識する抗体またはその少なくとも抗原結合領域を含む抗体断片である請求項11に記載の方法。
- 請求項11に記載の方法によって腎炎の治療効果が検出された被験化合物を選択する工程を含む、腎炎の治療効果を有する化合物のスクリーニング方法。
- 請求項14に記載のスクリーニング方法によって選択された化合物を有効成分として含有する腎炎の治療剤。
- インターフェロン産生細胞の活性抑制物質の、腎炎の治療剤の製造における使用。
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