MX2008004105A - Molecula de adhesion de celulas t y anticuerpo dirigido contra la molecula - Google Patents

Abstract

Se describe una molécula de adhesión de células T, la cual se expresa en una célula dendrítica. La molécula es una proteína que comprende una secuencia de aminoácidos representada en la SEQ ID NO:2, 4, 6, 8, 10ó12.

Description

MOLÉCULA DE ADHESIÓN DE CÉLULAS T Y ANTICUERPO DIRIGIDO CONTRA LA MOLÉCULA Campo Técnico La presente invención se relaciona a una molécula de adhesión de células T que se expresa en células dendriticas derivadas de médula ósea y un gen de las mismas, y un ligando para la molécula de adhesión (receptor) que se expresa en las células T y un gen de las mismas. La presente invención también se relaciona a un anticuerpo contra la molécula de adhesión o el ligando y un uso del mismo. Además, la presente invención también se relaciona a un método de selección utilizando la molécula de adhesión.

Antecedentes de la Invención En años recientes, se ha reportado que una molécula clonada como un activador de células dendriticas que se expresa en las células T es una citoquina principal para regular la diferenciación de osteoclastos (Yasuda, H., et al. (1998) Proc Nat Acad Sci USA 95: 3597-3602). De este modo, se ha aclaro que un sistema inmune se asocia estrechamente con el metabolismo de los huesos. Estudios en regulación de metabolismo de los huesos por moléculas que reglan el sistema inmune han avanzado rápidamente, y se ha aclarado también la transducción de señales asociada con la regulación de diferenciación de osteoclastos . Por ejemplo, se ha conocido Oscar (receptor asociado con osteoclastos), como una molécula implicada en diferenciación de osteoclastos. Se ha reportado a la fecha que Oscar es un receptor similar a inmunoglobulinas , el cual se asocia con la cadena FcRy y transmite una señal a la fosfolipasa Cy mediante un motivo ITAM de la cadena FcRy (Kim, . , et al. (2002) J Exp Med 195: 201-209). Además, varias interacciones tales como CD80-CD28, CD40-CD40L o ICAM1-LFA1 se han reportado para moléculas que se expresan en células dendriticas y se adhieren a una célula T de manera que están implicadas en una interacción con respecto a una respuesta inmune entre las células T y las células dendriticas.

Compendio de la Invención Los presentes inventores han identificado un gen que se expresa específicamente en células dendriticas derivadas de médula ósea por un método de sustracción. También, los inventores han encontrado que una proteina codificada por el gen antes mencionado se enlaza a la cadena FcRy que constituye el receptor IgE, para que la expresión de la proteina antes mencionada se mejore por el estimulo de LPS, para que las células dendriticas se activen por estimulo entrecruzado a la proteina antes mencionada, para que la proteína antes mencionada tenga una función para adherirse a una célula T, y para que un anticuerpo contra la proteína antes mencionada tenga un efecto terapéutico en un modelo de artritis inducido por colágeno que es un modelo de enfermedad de la artritis reumatoide. Los inventores han identificado además un gen de un ligando para la proteína antes mencionada, el cual se expresa en las células T. La presente invención se basa en estos hallazgos. La presente invención proporciona una membrana o proteína secretora que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2, la SEQ ID NO: 4, la SEQ ID NO: 6 o la SEQ ID NO: 8, o una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2, la SEQ ID NO: 4, la SEQ ID NO: 6 o la SEQ ID NO: 8 la cual contiene una o más sustituciones conservadoras (más adelante referidas como una proteína novedosa de una primera modalidad de acuerdo con la presente invención) . La presente invención proporciona una membrana o proteína secretora seleccionada de los siguientes (i), (ii), (iii) e (iv) (más adelante referido como una proteína novedosa de una segunda modalidad de acuerdo con la presente invención) : (i) una membrana o proteína secretora que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 10; (ii) una membrana o proteína secretora la cual comprende una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 10 en la cual uno o más aminoácidos se insertan, sustituyen o eliminan, o uno o más aminoácidos se agregan a uno o ambos extremos, y la cual es funcionalmente equivalente a una proteina que consiste de la secuencia de aminoácido de la SEQ ID NO: 10; (iii) una membrana o proteina secretora la cual se codifica por un polinucleotido el cual hibridiza bajo condiciones rigurosas a un polinucleotido el cual codifica la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 10, y el cual es funcionalmente equivalente a una proteina que consiste de la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 10; y (iv) una membrana o proteina secretora la cual comprende una secuencia de aminoácidos que tiene 90% o más identidad con la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 10, y la cual es funcionalmente equivalente a una proteina que consiste de la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 10. La presente invención proporciona un polinucleotido que codifica las proteínas novedosas de la primera y segunda modalidades de acuerdo con la presente invención. La presente invención también proporciona un polinucleotido seleccionado de los siguientes (v) , (vi), (vii) y (viii) : (v) un polinucleotido que comprende la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 9; (vi) un polinucleotido el cual comprende una secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 9, en la cual uno o más nucleótidos se insertan, sustituyen o eliminan, o uno o más nucleótidos se agregan a uno o ambos extremos, y el cual codifica una membrana o proteina secretora funcionalmente equivalente a una proteina que consiste de la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 10. (vii) un polinucleotido el cual hibridiza bajo condiciones rigurosas con un polinucleotido que comprende la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 9, y el cual codifica una membrana o proteína secretora funcionalmente equivalente a una proteína que consiste de la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 10; y (viii) un polinucleotido el cual tiene 90% o más de identidad con un polinucleotido que comprende la secuencia de nucleótido de la SEQ ID NO: 9, y el cual codifica una membrana o proteína secretora funcionalmente equivalente a una proteína que consiste de la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 10. La presente invención también proporciona un anticuerpo contra una membrana o proteína secretora seleccionada de los siguiente (ix), (x) , (xi) y (xii) (más adelante, referido ocasionalmente como una proteína TARM (Receptor de Activación que Interactúa con las Células T en células mieloides) , y un fragmento funcional de la misma (más adelante referido como un anticuerpo de una primera modalidad de acuerdo con la presente invención) : (ix) una membrana o proteina secretora que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2, la SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, la SEQ ID NO: 8, la SEQ ID NO: 10 o la SEQ ID NO: 12; (x) una membrana o proteina secretora la cual comprende una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2, la SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, la SEQ ID NO: 8, la SEQ ID NO: 10 o la SEQ ID NO: 12 en la cual uno o más aminoácidos se insertan, sustituyen o eliminan, o uno o más aminoácidos se agregan a uno o ambos extremos, y la cual es funcionalmente equivalente a una proteina que consiste de la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2, la SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, la SEQ ID NO: 8, la SEQ ID NO: 10 o la SEQ ID NO: 12; (xi) una membrana o proteina secretora la cual se codifica por un polinucleótido el cual hibridiza bajo condiciones rigurosas a un polinucleótido el cual codifica la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2, la SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, la SEQ ID NO: 8, la SEQ ID NO: 10 o la SEQ ID NO: 12, y la cual es funcionalmente equivalente a una proteina que consiste de la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2, la SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, la SEQ ID NO: 8, la SEQ ID NO: 10 o la SEQ ID NO: 12; y xii) una membrana o proteína secretora la cual comprende una secuencia de aminoácidos que tiene 70% o más de identidad con la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2, la SEQ ID NO: 4, la SEQ ID NO: 6, la SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10 o la SEQ ID NO: 12, y la cual es funcionalmente equivalente con una proteína que consiste de la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2, la SEQ ID NO: 4, la SEQ ID NO: 6, la SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10 o la SEQ ID NO: 12. La presente invención proporciona una proteína ligando novedosa que es un ligando para la proteína novedosa de acuerdo con la presente invención, la cual se selecciona de los siguientes (xiii), (xiv) , (xv) y (xvi) (más adelante, referida ocasionalmente como una proteína ligando novedosa de acuerdo con la presente invención o una proteína TARM-L (ligando TARM) ) : (xiii) una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 14 o la SEQ ID NO: 16; (xiv) una proteína la cual comprende una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 14 o la SEQ ID NO: 16, en la cual uno o más aminoácidos se insertan, sustituyen o eliminan, o uno o más aminoácidos se agregan a uno o ambos extremos, y la cual es funcionalmente equivalente a una proteína que consiste de la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 14 o la SEQ ID NO: 16; (xv) una proteína la cual se codifica por un polinucleótido el cual hibridiza bajo condiciones rigurosas a un polinucleótido el cual codifica la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 14 o la SEQ ID NO: 16, y el cual es funcionalmente equivalente a una proteina que consiste de la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 14 o la SEQ ID NO : 16; y (xvi) una proteina la cual comprende una secuencia de aminoácidos que tiene 70% o más de identidad con la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 14 o la SEQ ID NO: 16, y la cual es funcionalmente equivalente a una proteina que consiste de la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 14 o la SEQ ID NO: 16. La presente invención proporciona un polinucleótido que codifica la proteina ligando novedosa de acuerdo con la presente invención. La presente invención también proporciona un polinucleótido seleccionado de los siguientes (xvii) , (xviii), (xix) y (xx) : (xvii) un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 13 o la SEQ ID NO: ; (xviii) un polinucleótido el cual comprende una secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 13 o la SEQ ID NO: 15, en la cual uno o más nucleótidos se insertan, sustituyen o eliminan, o uno o más nucleótidos se agregan a uno o ambos extremos, y los cuales codifican una proteina funcionalmente equivalente a una proteina que consiste de la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 14 o la SEQ ID NO: 16; (xix) un polinucleótido el cual hibridiza bajo condiciones rigurosas con un polinucleótido que comprende la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 13 o la SEQ ID NO: 15; y el cual codifica una proteina funcionalmente equivalente a una proteina que consiste de la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 14 o la SEQ ID NO: 16; y (xx) un polinucleótido el cual tiene 70% o más de identidad con un polinucleótido que comprende la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 13 o la SEQ ID NO: 15, y el cual codifica una proteina funcionalmente equivalente a una proteina que consiste de la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 14 o la SEQ ID NO: 16. La presente invención proporciona un anticuerpo contra la proteina ligando novedosa de acuerdo con la presente invención, y un fragmento funcional del mismo (más adelante referido como un anticuerpo de una segunda modalidad de acuerdo con la presente invención) . La presente invención proporciona un agente terapéutico para enfermedades autoinmunes y un agente para inhibir adhesión de células T que comprende, como ingredientes activos, los anticuerpos de la primera y segunda modalidades de acuerdo con la presente invención (más adelante, arabos anticuerpos pueden referirse como "anticuerpos de acuerdo con la presente invención") , o fragmentos funcionales de los mismos. La presente invención proporciona los siguientes métodos de selección. De acuerdo con un método de selección de una primera modalidad de acuerdo con la presente invención, se proporciona un método para seleccionar una sustancia que inhibe la adhesión de una célula T a una proteina TARM o una sal de la misma, o un solvato de la misma, la cual comprende las etapas de: (a) poner en contacto una célula T con una proteina TARM en la presencia o la ausencia de una sustancia de prueba; y (b) medir la actividad de enlace de una célula T a la proteina TARM. De acuerdo con un método de selección de una segunda modalidad de acuerdo con la presente invención, se proporciona un método para seleccionar una sustancia que inhibe la activación de una célula dendritica o una sal del mismo, o un solvato del mismo, el cual comprende las etapas de: (d) poner en contacto un anticuerpo o un fragmento funcional del mismo de acuerdo con la presente invención con una célula dendritica en la presencia o la ausencia de una sustancia de prueba; y (e) medir el nivel de activación de la célula dendrítica . De acuerdo con un método de selección de una tercera modalidad de acuerdo con la presente invención, se proporciona un método para seleccionar una sustancia que inhibe una formación compleja entre una proteina TARM y la cadena FcRy o una sal de la misma, o un solvato de la misma, el cual comprende las etapas de: (g) poner en contacto un anticuerpo o un fragmento funcional del mismo de acuerdo con la presente invención con una célula dendrítica en la presencia o la ausencia de una sustancia de prueba; y (h) medir el nivel de expresión de la cadena FcRy en la célula dendrítica.

Breve Descripción de los Dibujos La Figura 1 muestra las secuencias de aminoácidos de los genes TARM de ratón (mi a 4 y si) , en donde el subrayado indica una región de estructura de bucle de inmunoglobulina (IG) y la letra negrita indica una región de transmembrana . La Figura 2 muestra los resultados obtenidos al analizar la expresión de ARNm de TARM en tejidos de ratón por PCR de tiempo real utilizando un conjunto 1 cebador.

La Figura 3A-B muestra los resultados obtenidos al analizar la expresión de ARNm de TARM en varios tipos de células por PCR de tiempo real utilizando un conjunto 1 cebado . La Figura 4A muestra la estructura y los números de aminoácidos de una región extracelular utilizada para producir anticuerpos anti-TARM. La Figura 4B muestra los resultados obtenidos al estudiar la especificidad del anticuerpo antes mencionado para la proteína TARM. La Figura 5A-D muestra los resultados obtenidos al analizar la expresión de proteínas de ratón de células dendríticas derivadas de médula ósea. La Figura 6A-H muestra los resultados obtenidos al analizar la expresión de proteínas de ratón en células derivadas de tejidos inmunes de ratón normales. La Figura 7 muestra los resultados obtenidos al analizar la expresión de la proteína de ratón en mastocitos peritoneales positivos de c-kit. La Figura 8A-F muestra los resultados obtenidos al analizar la expresión de la proteína TARM de ratón en células de nodulo linfático de ratón por estímulo inflamatorio de LPS, en donde las flechas indican la expresión de la proteína TARM de ratón. La Figura 9A muestra la inducción de producción de IL-6 a partir de células dendríticas de médula ósea madura por estímulo de anticuerpo anti-TARM. La Figura 9B muestra la inducción de producción de CP-1 a partir de células dendríticas de médula ósea inmaduras por estímulo de anticuerpo anti-TARM. La Figura 10A-D muestra incrementos en la cadena FcRy asociado con incrementos en la expresión de la proteína TARM de ratón en la superficie celular. La Figura 11A-B muestra los resultados obtenidos al analizar una formación compleja entre la proteína TARM de ratón y la cadena FcRy por un método de inmunoprecipitación . La Figura 12A-E muestra los resultados obtenidos al analizar la expresión de moléculas que se enlazan a la proteína TARM de ratón en células T activadas. La Figura 13A-B muestra la capacidad de las células T activadas para adherirse a la proteína TARM de ratón. La Figura 14 muestra la inhibición de adhesión de células Th2 a la proteína TARM de ratón por anticuerpos TARM anti-ratón. La Figura 15A-B muestra los hallazgos y cambios externos en los pesos corporales con el tiempo de un modelo de artritis inducida por colágeno, a la cual un anticuerpo TARM anti-ratón se ha administrado. La Figura 16 muestra el efecto de administrar el anticuerpo TARM anti-ratón al modelo de artritis inducida por colágeno en concentraciones del amiloideo A del suero en plasma del mismo. La Figura 17A-B muestra el efecto de administrar el anticuerpo TARM anti-ratón al modelo de artritis inducido por colágeno en títulos de anticuerpos anti-colágeno en plasma del mismo. La Figura 18 muestra los resultados obtenidos al analizar la expresión de ARNm de la proteína TARM en tejidos humanos por PCR de tiempo real. La Figura 19 muestra las secuencias de aminoácido de la proteína TARM humana, en donde el subrayado indica una región de estructura de bucle de inmunoglobulina (Ig) , la letra negrita indica una región de transmembrana, y la porción encerrada indica diferentes secuencias entre hTARM y LOC441864. La Figura 20 muestra la capacidad de células T activadas para adherirse a la proteína TARM humana, y la inhibición de adhesión de células T a la proteína TARM humana por anticuerpos TARM anti -humanos . La Figura 21A-B muestra los resultados obtenidos al analizar la expresión de moléculas que se enlazan a la proteína TARM de ratón en líneas celulares de ratón. La Figura 21B muestra los resultados obtenidos al analizar la expresión del ARNm de ENSMUSG00000035095 , una molécula candidata mTARM-L en líneas celulares de ratón por PCR de tiempo real .

La Figura 22A-B muestra el enlace específico de la proteína quimérica TARM-AP de ratón a células B300.19 que expresan mTARM-L. La Figura 22B muestra la adhesión celular específica de células B300.19 que expresan mTARM-L a la proteína quimérica TARM-AP de ratón. La Figura 23 muestra los resultados obtenidos al analizar la homología entre las proteínas TARM-L humanas y de ratón . La Figura 24 muestra los resultados obtenidos al analizar la homología entre la proteína TARM humana y la proteína TARM de ratón (m3) .

Descripción Detallada de la Invención La presente invención se describirá en detalle posteriormente. Las siguientes descripciones se dan sólo como ejemplos para explicar la presente invención, y de este modo tales ejemplos no se pretenden para limitar la presente invención únicamente a las modalidades de la presente invención. Todos los términos tecnológicos, términos científicos y términos técnicos utilizados en la presente especificación tienen el mismo significado como aquellos entendidos generalmente por las personas expertas en el campo técnico a la cual la presente invención pertenece. Tales términos se utilizan para el propósito de únicamente explicar las modalidades específicas, y de este modo no se pretenden que limitan la presente invención. La presente invención puede llevarse a cabo en varias modalidades, a menos que se desvie de la esencia de la misma. Todas las referencias de la técnica anterior y los documentos de la patente tales como solicitudes de patente o publicaciones de patente citados en la presente se incorporan en la presente para referencia en su totalidad, y pueden utilizarse para llevar a cabo la presente invención.

[Proteínas y polinucleótidos novedosos] Entre los genes que se expresan específicamente en las células dendríticas derivadas de la médula ósea, los cuales se identifican en la presente invención, un gen derivado de ratón tiene 5 tipos de isoformas. Tales isoformas de un gen derivado de ratón incluyen mi, m2 , m3 y m4 que son genes de proteína enlazados a una membrana (proteína de membrana) , y si que es un gen de proteína de tipo secretora (proteína secretora) . Las secuencias de nucleótidos y secuencias de aminoácidos de tales isoformas corresponden a los siguientes números de secuencias. mi SEQ ID NOS: 11 y 12 m2 SEQ ID NOS: 1 y 2 m3 SEQ ID NOS: 3 y 4 m4 SEQ ID NOS: 5 y 6 si SEQ ID NOS: 7 y 8 Entre los genes que se expresan específicamente en las células dendríticas derivadas de médula ósea, los cuales se identificaron en la presente invención, un tipo de gen de proteína de membrana puede mencionarse como un gen derivado de un ser humano. La secuencia de nucleótidos de este gen y la secuencia de aminoácidos de una proteína codificada por el gen son como se muestran en las SEQ ID NOS: 9 y 10, respectivamente . Ya que la secuencia de nucleótidos del gen identificado en la presente invención codifica un péptido de señal, una proteína codificada por el gen antes mencionado forma una proteína de membrana o una proteína secretora. La C-terminal de la proteína de membrana de acuerdo con la presente invención se modifica (por ejemplo, eliminando una porción de transmembrana) , de manera que se obtiene una proteína secretora. La C-terminal de la proteína secretora de acuerdo con la presente invención se modifica (por ejemplo, agregando una porción de transmembrana a la misma) , de manera que se obtiene una proteína de membrana. En la presente especificación, las expresiones "uno o más aminoácidos se insertan, sustituyen o eliminan, o se agregan a uno o ambos de los extremos" y "uno o más nucleótidos se insertan, sustituyen o eliminan, o uno o más nucleótidos se agregan a uno o ambos extremos", significa que la modificación se ha llevado a cabo de acuerdo con métodos técnicos bien conocidos tales como mutagénesis sitio-dirigida, o por sustitución de una pluralidad de números de aminoácidos o nucleótidos a un grado que se genera naturalmente. El número de aminoácidos o nucleótidos que se modifican, puede ser por ejemplo de 1 a 30, de preferencia 1 a 20, más preferiblemente 1 a 10, además más preferiblemente 1 a 5, y particularmente de preferencia 1 ó 2. La secuencia de aminoácidos modificada puede preferiblemente ser una secuencia de aminoácidos que tiene una o más (de preferencia, una o varias ó 1, 2, 3 ó 4) sustituciones conservadoras en la secuencia de aminoácidos. La secuencia de nucleótidos modificada puede preferiblemente ser una secuencia de nucleótidos que tiene una o más (por ejemplo, una a varias ó 1, 2, 3 ó 4) mutaciones las cuales no afectan las funciones de una proteina que consiste de la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 10. En la presente especificación, el término "sustitución conservadora" significa que uno o más residuos de aminoácidos se sustituyen con otros residuos de aminoácidos químicamente similares, de manera que las funciones de una proteína no se modifican sustancialmente . Ejemplos de tal sustitución conservadora incluyen un caso en donde un residuo hidrofóbico se sustituye con otro residuo hidrofóbico y un caso en donde un cierto residuo polar se sustituye con otro residuo polar que tiene la misma carga eléctrica. Para cada tipo de aminoácidos, los aminoácidos funcionalmente similares los cuales pueden sustituirse en tal manera se conocen en el presente campo técnico. Ejemplos de aminoácidos no polares (hidrofóbicos ) incluyen alanina, valina, isoleucina, leucina, prolina, triptofano, fenilalanina y metionina. Ejemplos de aminoácidos polares (neutros) incluyen glicina, serina, treonina, tirosina, glutamina, asparagina y cisteína. Ejemplos de aminoácidos positivamente cargados (básicos) incluyen arginina, histidina y lisina. Ejemplos de aminoácidos negativamente cargados (acídicos) incluyen ácido aspártico y ácido glutámico. En la presente especificación, el término "hibridiza" significa que hibridiza con un polinucleótido objetivo bajo condiciones rigurosas. Específicamente, puede haberse ejemplificado un polinucleótido que tiene al menos 70% o más, de preferencia 80$ o más, más preferiblemente 85% o más, además más preferiblemente 90% o más, incluso aún más preferiblemente 95% o más, particularmente de preferencia 98% o más, y más preferiblemente 99% o más de identidad con la secuencia de nucleótido objetivo, cuando tal identidad se calcula utilizando un parámetro predeterminado (inicialización) con un software de búsqueda de homología tal como FASTA, BLAST, o Smith- aterman [Meth. Enzym. , 164, 765 (1988)]. Además, el término "bajo condiciones rigurosas" significa condiciones en donde una reacción se lleva a cabo en un tampón de hibridización que puede utilizarse comúnmente por personas expertas en la técnica, a una temperatura de 40°C a 70°C, y de preferencia de 60°C a 65°C, y el producto de reacción se lava entonces con una solución de lavado que tiene una concentración salina de 15 a 300 mmoles/L, y de preferencia de 15 a 60 mmoles/L. Tal temperatura y concentración salina pueden ajustarse apropiadamente dependiendo de la longitud de la sonda utilizada. Además, las condiciones para lavar el producto obtenido por hibridización pueden ser 0.2 ó 2 x SSC, 0.1% de SDS, y una temperatura de 20°C a 68°C. Es posible determinar condiciones rigurosas (rigurosidad elevada) o condiciones moderadas (rigurosidad baja) haciendo una diferencia con una concentración salina o una temperatura aplicada durante el lavado. Cuando tal diferencia de hibridización se hace con una concentración salina, 0.2 x SSC, 0.1% de SDS pueden utilizarse como un tampón de lavado riguroso (tampón de lavado de alta rigurosidad), y 2 x SSC, 0.1% de SDS pueden utilizarse como un tampón de lavado moderado (tampón de lavado de baja rigurosidad) . Por otro lado, cuando tal diferencia se hace con una temperatura, una temperatura de 68 °C se aplica en el caso de alta rigurosidad, una temperatura de 42°C se aplica en el caso de rigurosidad moderada y una temperatura ambiente (20°C a 25°C) se aplica en el caso de baja rigurosidad. En todos los tres casos anteriores, la reacción puede llevarse a cabo en 0.2 x SSC, 0.1% de SDS. En general, la pre-hibridización se lleva a cabo bajo las mismas condiciones como aquellas para la hibridización . Sin embargo, la hibridización y el pre-lavado no siempre se llevan a cabo bajo las mismas condiciones. La hibridización puede llevarse a cabo de acuerdo con un método conocido. En el caso de utilizar una biblioteca comercialmente disponible, la hibridización puede llevarse a cabo de acuerdo con el método descrito en las instrucciones incluidas en el mismo. En la presente especificación, el término "identidad" (ocasionalmente referido como "homología") con respecto a las secuencias de aminoácidos y las secuencias de nucleótidos significa el grado de coincidencia entre las secuencias comparadas en términos de residuos de aminoácidos o residuos de nucleótidos que constituyen tales secuencias. En ese tiempo, la presencia de una abertura y la propiedad de los aminoácidos se toman en consideración (Wilbur, Nati. Acad. Sci. U.S. A. 80: 726-730 (1983)). Para el cálculo de homología, pueden utilizarse productos de software de búsqueda de homología comercialmente disponible tales como BLAST (Altschul: J. Mol. Biol. 215: 403-410 (1990)), FASTA (Peasron: Methods in Enzymology 183: 63-69 (1990)), o Smith-Waterman [Meth. Enzym. , 164, 765 (1988)].

El valor numérico de tal "identidad" puede calcularse utilizando un programa de búsqueda de homología conocido por las personas expertas en la técnica. Por ejemplo, tal valor numérico como identidad puede calcularse utilizando un parámetro predeterminado (inicialización) en el algoritmo de homología BLAST ( (herramienta de búsqueda de alineaciones locales básicas) http : //www . ncbi . nlm. nih . gov/BLAST/ ) del Centro Nacional para Información Biotecnologica (NCBI). En la proteína novedosa de la segunda modalidad de acuerdo con la presente invención, una secuencia de aminoácidos que tiene 90% o más de identidad con la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 10 puede ser una secuencia de aminoácidos que tiene de preferencia 95% o más, particularmente de preferencia 98% o más, y más preferiblemente 99% o más de identidad con la secuencia de aminoácidos antes mencionada. En el polinucleótido que codifica la proteína novedosa de la segunda modalidad de acuerdo con la presente invención, una secuencia de nucleótidos que tiene 90% o más de identidad con la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 9 puede ser una secuencia de nucleótidos que tiene de preferencia 95% o más, particularmente de preferencia 98% o más, y más preferiblemente 99% o más de identidad con la secuencia de nucleótidos antes mencionada.

En el anticuerpo de la primera modalidad de acuerdo con la presente invención, una secuencia de aminoácidos que tiene 70% o más de identidad con la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2, la SEQ ID NO: 4, la SEQ ID NO: 6, la SEQ ID NO: 8, la SEQ ID NO: 10 o la SEQ ID NO: 12, puede ser una secuencia de aminoácidos que tiene de preferencia 80% o más, más preferiblemente 85% o más, además más preferiblemente 90% o más, incluso además más preferiblemente 95% o más, particularmente de preferencia 98% o más, y con mayor preferencia 99% o más de identidad con la secuencia de aminoácidos antes mencionada. En la presente invención, si la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2, la SEQ ID NO: 4, la SEQ ID NO: 6, la SEQ ID NO: 8, la SEQ ID NO: 10 o la SEQ ID NO: 12 se da, una secuencia de nucleótidos que la codifica puede determinarse fácilmente. De este modo, pueden seleccionarse varias secuencias de nucleótidos que codifican la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2, la SEQ ID NO: 4, la SEQ ID NO: 6, la SEQ ID NO: 8, la SEQ ID NO: 10 o la SEQ ID NO: 12. Por consiguiente, un polinucleótido que codifica una proteina que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2, la SEQ ID NO: 4, la SEQ ID NO: 6, la SEQ ID NO: 8, la SEQ ID NO: 10 o la SEQ ID NO: 12 incluye no únicamente una parte de o la secuencia de ADN completa de la SEQ ID NO: 1, la SEQ ID NO: 3, la SEQ ID NO: 5, la SEQ ID NO: 7, la SEQ ID NO: 9 o la SEQ ID NO: 11, sino también una secuencia de ADN que codifica los mismos aminoácidos, la cual tiene un codón que tiene una relación de degeneración con la misma como una secuencia de ADN. La presente invención además incluye una secuencia de ARN que corresponde a tal secuencia de ADN. Un ejemplo preferido del polinucleótido que codifica una proteina que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2, la SEQ ID NO: 4, la SEQ ID NO: 6, la SEQ ID NO: 8, la SEQ ID NO: 10 o la SEQ ID NO: 12 es un polinucleótido que comprende la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 1, la SEQ ID NO: 3, la SEQ ID NO: 5, la SEQ ID NO: 7, la SEQ ID NO: 9 o la SEQ ID NO: 11. En la presente especificación, si o no una cierta proteina es funcionalmente equivalente a la proteina que consiste de la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2, la SEQ ID NO: 4, la SEQ ID NO: 6, la SEQ ID NO: 8, la SEQ ID NO: 10 o la SEQ ID NO: 12 puede determinarse al evaluar un fenómeno biológico o funciones asociadas con la expresión de la proteina que consiste de la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2, la SEQ ID NO: 4, la SEQ ID NO: 6, la SEQ ID NO: 8, la SEQ ID NO: 10 o la SEQ ID NO: 12. Por ejemplo, puede determinarse al permitir a cierta proteina expresarse por una técnica de recombinación genética y luego evaluando si o no la proteina antes mencionada funciona como un receptor de activación de células dendriticas. La proteina que consiste de la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2, la SEQ ID NO: 4, la SEQ ID NO: 6, la SEQ ID NO: 8, la SEQ ID NO: 10 o la SEQ ID NO: 12 interactúa con células T y tiene la función de activar células dendriticas. De este modo, para la evaluación antes mencionada, pueden utilizarse las siguientes funciones como índice: - Función para mediar la adhesión de las células T (Ejemplos 5, 6, 10 y 11); Función para activar células dendriticas por estímulo entrecruzado de anticuerpos (Ejemplo 3); - Función para formar un complejo con la cadena FcRy (Ejemplo 4); o - combinar el uso de varias o todas las funciones antes mencionadas.

[Proteína ligando y polinucleótido novedoso] Entre los genes que se expresan específicamente en las células T activadas como ligandos para las proteínas TARM, las cuales se identificaron en la presente invención, un tipo de gen de proteínas de membrana puede mencionarse como un gen derivado de ratón. La secuencia de nucleótidos de este gen y la secuencia de aminoácidos de una proteína codificada por el gen son como se muestran en las SEQ ID NOS 13 y 14, respectivamente. Además, entre los genes que se expresan específicamente en las células T activadas como ligandos para proteínas TARM, un tipo de gen de proteína de membrana puede mencionarse como un gen derivado de seres humanos. La secuencia de nucleótidos de este gen y la secuencia de aminoácidos de una proteína codificada por el gen son como se muestra en las SEQ ID NOS: 15 y 16, respectivamente . En la proteína ligando novedosa de acuerdo con la presente invención, una secuencia de aminoácidos que tiene 70% o más de identidad con la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 14 o la SEQ ID NO: 16 puede ser una secuencia de aminoácidos que tiene de preferencia 80% o más, más preferiblemente 85% o más, además, más preferiblemente 90% o más, incluso además más preferiblemente 95% o más, particularmente de preferencia 98% o más, y de mayor preferencia 99% o más de identidad con la secuencia de aminoácidos antes mencionada. En un polinucleótido que codifica la proteína ligando novedosa de acuerdo con la presente invención, una secuencia de nucleótidos que tiene 70% o más de identidad con la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 13 o la SEQ ID NO: 15 puede ser una secuencia de nucleótidos que tiene de preferencia 80% o más, más preferiblemente 85% o más, además más preferiblemente 90% o más, incluso además más preferiblemente 95% o más, particularmente de preferencia 98% o más, y de mayor preferencia 99% o más de identidad con la secuencia de nucleótidos antes mencionada. En la presente invención, si la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 14 o la SEQ ID NO: 16 se da, una secuencia de nucleótidos que la codifica puede determinarse fácilmente. De este modo, pueden seleccionarse varias secuencias de nucleótidos que codifican la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 14 o la SEQ ID NO: 16. Por consiguiente, un polinucleótido que codifica una proteina que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 14 o la SEQ ID NO: 16, incluye no únicamente una parte de la secuencia de ADN completa de la SEQ ID NO: 13 o la SEQ ID NO: 15, sino también una secuencia de ADN que codifica los mismos aminoácidos, la cual tiene un codón que tiene una relación de degeneración con la misma como una secuencia de ADN. La presente invención además incluye una secuencia de ARN que corresponde a tal secuencia de ADN. Un ejemplo preferido del polinucleótido que codifica una proteina que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 14 o la SEQ ID NO: 16 es un polinucleótido que comprende la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 13 o la SEQ ID NO: 15. En la presente especificación, si o no una cierta proteina es funcionalmente equivalente a la proteina que consiste de la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 14 o la SEQ ID NO: 16 puede determinarse al evaluar un fenómeno biológico o funciones asociadas con la expresión de la proteina que consiste de la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 14 o la SEQ ID NO: 16. Por ejemplo, puede determinarse al permitir a la cierta proteina expresarse por una técnica de recombinación genética y luego al evaluar si o no la proteina antes mencionada funciona como un ligando en una célula T para un receptor de activación de células dendriticas. La proteina que consiste de la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 14 o la SEQ ID NO: 16, se enlaza a una proteina TARM. De este modo, para la evaluación antes mencionada, la función de enlazar tal proteina TARM (Ejemplo 12) puede utilizarse como un índice: La proteína ligando novedosa de acuerdo con la presente invención tiene una región de transmembrana sencilla, y se expresa en la superficie celular en una dirección en donde el lado N-terminal de la misma puede ubicarse en el espacio extracelular . Por consiguiente, al utilizar la proteína antes mencionada, pueden producirse anticuerpos contra la proteína antes mencionada. La presente invención proporciona una proteína que comprende un polipéptido que consiste de al menos 6 residuos aminoácidos o toda la secuencia de aminoácidos de los aminoácidos 1 a 159 de la SEQ ID NO: 14 o los aminoácidos 1 a 158 de la SEQ ID NO: 16. La proteína antes mencionada contiene una porción que corresponde a la región extracelular de la secuencia de aminoácidos de una proteina TARM-L, y de este modo puede utilizarse como un antigeno para producir anticuerpos contra la proteina antes mencionada. La presente invención proporciona el uso de la proteina ligando novedosa de la presente invención para producir anticuerpos contra la proteina ligando novedosa antes mencionada de la presente invención.

[Anticuerpo] El anticuerpo de acuerdo con la presente invención puede reconocer específicamente una proteína TARM o una proteína TARM-L. Por consiguiente, es preferible que una proteína TARM o una proteína TARM-L utilizada para obtener el anticuerpo de acuerdo con la presente invención deban tener la antigenicidad de TARM o TARM-L. Una proteína TARM o una proteína TARM-L incluyen una proteína que tiene una secuencia de aminoácidos de una proteína TARM o una proteína TARM-L en la cual uno o más residuos aminoácidos se elimina, insertan, sustituyen o agregan. Se ha sabido que tal proteína mantiene la misma actividad biológica como aquella de la proteína original (Mark et al. (1984) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 81: 5662-6; Zoller y Smith (1982) Nucleic Acids Res. 10: 6487-500; Wang et al. (1984) Science 224: 1431-3; Dalbadie-McFarland et al. (1982) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 79: 6409- 13) . Se ha conocido un método para producir una cierta proteina al eliminar, insertar, sustituir o agregar uno o más aminoácidos con respecto a la proteina original, mientras se mantiene la antigenicidad de la proteina original. Por ejemplo, un polinucleótido que codifica una proteina mutante se prepara por mutagénesis sitio-dirigida, y una proteina se permite entonces expresar, cuando es apropiado (Molecular Cloning, A Laboratory Manual 2a edición, Cold Spring Harbor Press (1989) ; Current Protocols in Molecular Biology, John iley & Sons, (1987-1997), Sección 8.1-8.5; Hashimoto-Goto et al. (1995) Gene 152: 271-5; Kinkel (1985) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 82: 488-92; Kramer y Fritz (1987) Method, Enzymol 154: 350-67; Kunkel (1988) Method. Enzymol. 85: 2763-6). El anticuerpo de acuerdo con la presente invención también incluye anticuerpos específicos para una parte de la proteína TARM o la proteína TARM-L. Es decir, una proteína TARM o una proteína TARM-L utilizada para obtener el anticuerpo de acuerdo con la presente invención incluye no únicamente un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos de longitud total de la proteína TARM o de la proteína TARM-L, sino también un fragmento de polipéptido que tiene al menos 6 residuos aminoácidos (por ejemplo, 6, 8, 10, 12, 15 ó más residuos aminoácidos) de la proteína TARM o de la proteína TARM-L. En la presente especificación, el tipo del fragmento de polipéptido de la proteina TARM o de la proteina TARM-L no se limita particularmente, siempre y cuando tenga la antigenicidad de la proteina TARM o de la proteina TARM-L. Un fragmento de polipéptido preferido puede ser un fragmento de polipéptido tal como el amino terminal o el carboxi terminal de la proteina TARM o de la proteina TARM-L. El sitio determinante de antigeno de un polipéptido se estima por un método al analizar el carácter hidrofobicidad/hidrofilico en la secuencia de aminoácidos de una proteina (Kyte-Doolittle (1982) J. Mol. Biol. 157:105-22) o un método para analizar una estructura secundaria (Chou-Fasman (1978) Ann. Rev. Biochem. 47: 251-76). Más adelante, tal sitio determinante de antigeno puede confirmarse utilizando un programa de computadora (Anal. Biochem. 151: 540-6 (1985)) o al aplicar medios tales como un método PEPSCAN para sintetizar un péptido corto y para confirmar la antigenicidad del mismo (Publicación de Patente Japonesa Abierta al Público No. 500684/1985). El anticuerpo de acuerdo con la presente invención es de preferencia anticuerpos que tienen una influencia en las funciones de la proteina TARM o de la proteina TARM-L. Por ejemplo, los significados de la expresión "que tiene una influencia en las funciones de la proteina TARM", incluye: la activación de células dendriticas por el estimulo entrecruzado de la proteina TARM por el anticuerpo de acuerdo con la primera modalidad de la presente invención (Ejemplo 3) ; la inhibición de adhesión de las células T a la proteina TAR enlazando el anticuerpo antes mencionado a la proteina TARM (Ejemplos 6 y 11); y la inhibición de una formación compleja entre la proteina TARM y la cadena FcRy enlazando el anticuerpo antes mencionado a la proteina TARM (Ejemplo 4) . Por ejemplo, los significados de la expresión "que tiene una influencia en las funciones de la proteina TARM-L" incluyen la inhibición del enlace de la proteina TARM-L a la proteina TARM enlazando el anticuerpo de la segunda modalidad de acuerdo con la presente invención a la proteina TARM-L. El anticuerpo de acuerdo con la presente invención incluye: un anticuerpo monoclonal obtenido al utilizar la proteina TARM o la proteina TARM-L como un antigeno e inmunizando un mamífero tal como un ratón con el antígeno antes mencionado; un anticuerpo quimérico y un anticuerpo humanizado producido por una recombinación genética; y un anticuerpo humano producido utilizando un animal transgénico que produce anticuerpos humanos o similares. Cuando el anticuerpo de acuerdo con la presente invención se administra como un medicamento a un ser humano, un anticuerpo humano se utiliza de preferencia en términos de efectos secundarios. El "anticuerpo humano" significa un anticuerpo en donde todas las regiones se derivan de seres humanos. Tal anticuerpo humano puede producirse al introducir un gen de anticuerpo humano dentro de un ratón. Tal anticuerpo humano puede producirse con referencia a los métodos descritos, por ejemplo, en Nature Genetics, Vol. 7, pp. 13-21, 1994; Nature Genetics, Vol. 15, pp. 146-156, 1997; Publicación de Patente Japonesa Abierta al Público No. 504365/1992; Publicación de Patente Japonesa Abierta al Público No. 509137/1995; Publicación Internacional W094/25585; Nature, Vol. 368, pp. 856-859, 1994; y Publicación de Patente Japonesa Abierta al Público No. 500233/1994. Además, tal anticuerpo humano puede producirse también por un método de despliegue de fago. Puede producirse con referencia al método descrito, por ejemplo, en arks, J. d. et al.: J. Mol. Biol., Vol. 222, pp. 581-597, 1991. El "anticuerpo humanizado" es un anticuerpo producido al transplantar (injerto de CDR) únicamente la secuencia genética del sitio de enlace de antígeno (CDR; región que determina complementariedad) de un anticuerpo de ratón dentro de un gen de anticuerpo humano. Tal anticuerpo humanizado puede producirse con referencia a los métodos descritos, por ejemplo, en la Publicación de Patente Japonesa Abierta al Público No. 506458/1992 y la Patente Japonesa Abierta al Público No. 296890/1987. El "anticuerpo quimérico" es un anticuerpo producido al ligar la región variable de un anticuerpo de ratón a la región constante de un anticuerpo humano.

Específicamente, un ratón se inmuniza con un antígeno, y una región variable de anticuerpo (región V) que se enlaza al antígeno se corta del gen del anticuerpo monoclonal de ratón. La región V así obtenida se permite entonces ligar a un gen de la región constante de anticuerpo (región C) derivado de médula ósea humana, de manera que produce un anticuerpo quimérico. Tal anticuerpo quimérico puede producirse con referencia al método descrito, por ejemplo, en la Publicación de Patente Japonesa No. 73280/1991. El anticuerpo monoclonal de acuerdo con la presente invención puede obtenerse utilizando un método bien conocido por personas experimentadas en la técnica (por ejemplo, "Current Protocols in Molecular Biology" John iley & Sons (1987)), Antibodies: A Laboratory Manual, Ed. Harlow y David Lañe, Cold Spring Harbor Laboratory (1988)). Como un inmunógeno, un fragmento de la proteína TARM o la proteína TARM-L puede utilizarse. De otra manera, un antígeno sintetizado con base en la secuencia de aminoácidos antes mencionada puede también utilizarse. Tal antígeno puede utilizarse en la forma de un complejo con una proteína portadora. Con el fin de preparar un complejo de un antígeno con una proteína portadora, pueden utilizarse varios tipos de agentes de acoplamiento. Pueden utilizarse glutaraldehído, carbodiimida, un éster activo con maleimida y similares. La proteína portadora puede utilizar comúnmente productos tales como albúmina de suero bovino, tiroglobulina o hemocianina y se realiza en general acoplando en una relación de 1 a 5. Ejemplos de un animal que se inmuniza incluyen un ratón, una rata, un conejo, un cobayo y un hámster. Un método de inoculación incluye la administración subcutánea, la administración intramuscular y una administración intraperitoneal. Para administración, un antigeno puede mezclarse con adyuvante completo de Freund o adyuvante incompleto de Freund. La administración se lleva a cabo en general una vez cada 2 a 5 semanas. Las células que producen anticuerpos obtenidas del bazo o del nodulo linfático del animal inmunizado se someten a fusión celular con células de mieloma, y se aislan como hibridomas . Como tales células de mieloma, las células derivadas de un ratón, una rata, un ser humano o similares pueden utilizarse, y se derivan de preferencia de la misma especie como las células que producen anticuerpos. Sin embargo, existen también casos en donde tal fusión celular puede llevarse a cabo incluso entre las células de diferentes especies . La fusión celular puede llevarse a cabo por un método conocido tal como el método descrito en Nature, 256, 495, 1975. Ejemplos de un promotor de fusión incluyen polietilenglicol y virus Sendai. En general, la fusión celular puede llevarse a cabo al permitir a las células que producen anticuerpos hacerse reaccionar con células de mieloma utilizando polietilenglicol (peso molecular promedio: 1,000 a 4,000) que tiene una concentración de aproximadamente 20% a 50% a una temperatura entre 20°C y 40°C, y de preferencia entre 30°C y 37°C, en una relación del número de las células que producen anticuerpos al número de las células de mieloma que es en general aproximadamente 1 : 1 a 10 : 1, durante aproximadamente 1 a 10 minutos. Varios tipos de métodos inmunoquimicos pueden utilizarse para seleccionar hibridomas que producen anticuerpos. Ejemplos de tal método inmunoquimico incluyen: un método de ELISA que utiliza una microplaca recubierta con la proteina TARM o la proteina TARM-L; un método de EIA que utiliza una microplaca recubierta con un anticuerpo de anti-inmunoglobulina ; y un método de inmunotransferencia que implica aplicar electroforesis a una muestra que contiene la proteina TARM y luego utilizar una membrana de nitrocelulosa. Además, para seleccionar tales hibridomas que producen anticuerpos, puede aplicarse, un método para seleccionar los hibridomas basados en si o no el anticuerpo antes mencionado tiene una influencia en las funciones de la proteina TARM o la proteina TARM-L, en lugar del método inmunoquimico antes mencionado. Los hibridomas que producen anticuerpos pueden seleccionarse con base en la influencia del anticuerpo de la primera modalidad de acuerdo con la presente invención en las funciones de la proteina TARM, por ejemplo, con base en si o no las células dendriticas se activan por el estimulo entrecruzado de la proteina TARM por el anticuerpo de la primera modalidad de acuerdo con la presente invención (Ejemplo 3) , o si o no la función de la proteina TARM para mediar la adhesión de células T puede inhibirse enlazando el anticuerpo antes mencionado a la proteina TARM (Ejemplos 6 y 11), o si o no una formación compleja entre la proteina TARM y la cadena FcRy puede inhibirse enlazando el anticuerpo antes mencionado a la proteina TARM (Ejemplo 4). Los hibridomas que producen anticuerpos pueden también seleccionarse basados en la influencia del anticuerpo de la segunda modalidad de acuerdo con la presente invención en las funciones de la proteina TARM-L, por ejemplo, basados en si o no la función de la proteina TARM de enlace a la proteina TARM-L puede inhibirse enlazando el anticuerpo de la segunda modalidad de acuerdo con la presente invención a la proteina TARM-L. Por este método de selección, puede seleccionarse un anticuerpo que tiene una influencia de las funciones de la proteina TARM o la proteina TARM-L la cual es una modalidad preferida del anticuerpo de la presente invención. Además, este método de selección puede llevarse a cabo también como un método de selección secundario, el cual se realiza después del método de selección inmunoquimica antes mencionado en donde se selecciona un hibridoma que produce anticuerpos basados en si o no produce un anticuerpo que se enlaza a la proteina TARM o a la proteina TARM-L. Además, la clonación se lleva a cabo tan bien, por ejemplo, por un método de dilución limitante, de manera que se obtienen clones. La selección y cultivo de tales hibridomas se llevan a cabo en general en un medio para células animales (por ejemplo, RPMI1640) que contiene de 10% a 20% de suero de bovino fetal, al cual se agrega HAT (hipoxantina, aminopterina y timidita) . Los clones asi obtenidos se transplantan en la cavidad peritoneal de ratones SCID, a los cuales se ha administrado previamente pristano. Se recolecta de 10 a 14 días después, la ascitis que contiene una alta concentración de anticuerpos monoclonales , y puede utilizarse como una materia prima en la purificación de anticuerpos. De otro modo, los clones antes mencionados se cultivan, y el cultivo obtenido puede también utilizarse como una materia prima en purificación de anticuerpos. Un anticuerpo monoclonal puede purificarse por un método de purificación de inmunoglobulina conocido. Por ejemplo, tal purificación de un anticuerpo monoclonal puede lograrse fácilmente por medios tales como el método de fraccionamiento de sulfato de amonio, un método de fraccionamiento PEG, un método de fraccionamiento de etanol, el uso de un intercambiador de anión, o cromatografía de afinidad utilizando una columna de proteína A, una columna de proteína G y una proteína TARM. El "fragmento funcional" de la presente invención significa una parte de un anticuerpo (un fragmento parcial) , el cual reconoce específicamente la proteína de la presente invención. Ejemplos específicos de tal fragmento funcional incluyen Fab, Fab' , F(ab' ) 2, un fragmento de región variable (Fv), un Fv enlazado con disulfuro, un anticuerpo de cadena sencilla (scFv) y un polímero de los mismos. Ejemplos preferidos del anticuerpo de la primera modalidad de acuerdo con la presente invención incluyen un anticuerpo contra la proteína novedosa de la primera modalidad de acuerdo con la presente invención, y un fragmento funcional de los mismos. Tales ejemplos preferidos del anticuerpo de la primera modalidad de acuerdo con la presente invención también incluyen anticuerpos contra la proteína novedosa de la segunda modalidad de acuerdo con la presente invención, y un fragmento funcional de los mismos. Tales ejemplos preferidos del anticuerpo de la primera modalidad de acuerdo con la presente invención además incluyen anticuerpos contra las siguientes proteínas: (ix' ) una membrana o proteína secretora que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 12; (x' ) una membrana o proteina secretora la cual comprende una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 12 en la cual uno o más aminoácidos se inserta, sustituye o elimina, o uno o más aminoácidos se agregan a uno o ambos de los extremos, y la cual es funcionalmente equivalente a una proteina que consiste de la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 12. (xi' ) una membrana o proteina secretora la cual se codifica por un polinucleótido el cual hibridiza bajo condiciones rigurosas a un polinucleótido el cual codifica la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 12, y la cual es funcionalmente equivalente a una proteina que consiste de la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 12; y (xii' ) una membrana o proteina secretora la cual comprende una secuencia de aminoácidos que tiene 70% o más de identidad con la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 12, y la cual es funcionalmente equivalente a una proteina que consiste de la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 12. Un ejemplo más preferido del anticuerpo de la primera modalidad de acuerdo con la presente invención es anticuerpos contra una membrana o proteina secretora que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 12, o una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 12 la cual contiene una o más sustituciones conservadoras, o un fragmento funcional de las mismas. Un ejemplo especifico es un anticuerpo monoclonal producido por un hibridoma depositado bajo el No. de acceso FERM BP-10376. Por consiguiente, la presente invención proporciona un hibridoma (@TARM#6.11) depositado en el Instituto Nacional de Ciencia y Tecnología Industrial Avanzada, Depositario de Organismo de Patente Internacional (AIST Tsukuba Central 6, Higashi 1-1-1 Tsukuba, Ibaraki, 305-8566, Japón) , bajo el número de acceso FERM BP-10376 el 15 de julio del 2005. Otro ejemplo más preferido del anticuerpo de la primera modalidad de acuerdo con la presente invención es anticuerpos contra una membrana o proteína secretora que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 10 o una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 10, la cual contiene una o más sustituciones conservadoras, o un fragmento funcional de las mismas. Un ejemplo preferido del anticuerpo de la segunda modalidad de acuerdo con la presente invención es anticuerpos contra una membrana o una proteína secretora que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 14 o una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 14, la cual contiene una o más sustituciones conservadoras, o un fragmento funcional de las mismas.

Otro ejemplo preferido del anticuerpo de la segunda modalidad de acuerdo con la presente invención es anticuerpos contra una membrana o una proteina secretora que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 16 o una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 16, la cual contiene una o más sustituciones conservadoras, o un fragmento funcional de las mismas. Un ejemplo más preferido del anticuerpo de la segunda modalidad de acuerdo con la presente invención es anticuerpos que reconocen una región de polipéptidos que se expresa en el espacio extracelular de la proteina TARM-L o un fragmento funcional de los mismos. Un ejemplo de tal anticuerpo es anticuerpos contra una proteina que comprende un polipéptido que consiste de al menos 6 residuos aminoácidos o toda la secuencia de aminoácidos de los aminoácidos 1 a 159 de la SEQ ID NO: 14 o los aminoácidos 1 a 158 de la SEQ ID NO: 16, o un fragmento funcional de los mismos .

[Uso del anticuerpo y la composición farmacéutica] Enfermedades autoinmunes Ya que las células T, las cuales son linfocitos asociados con respuestas inmunes, actúan sinergisticamente con células dendriticas que tienen una función que presenta antígenos a tales células T, las células T juegan un papel en varias respuestas inmunes (Croczek, RA., et al. (2004) Current Opinión in Immunology 16: 321-327). Como se describe posteriormente en los ejemplos, se reveló que la expresión de una proteina TARM en células dendriticas se mejoró por estimulo inflamatorio (Ejemplo 2) y que las células dendriticas se adhieren a las células T a través de la proteina TARM (Ejemplos 5 y 10) . Además, se confirmó que las células dendriticas se activaron por la proteina TARM sometidas a estimulo de enlace, y que la producción de IL-6 se indujo (Ejemplo 3) . Se ha reportado que la producción excesiva de IL-6 se asocia con enfermedades autoinmunes (Ishihara, K. , et al. (2002) Citokine & Gro th Factor Reviews 13: 357-368). Además, la adhesión de las células T a las células dendriticas se suprimió notablemente por anticuerpos contra la proteina TARM (Ejemplos 6 y 11). Además, en los ejemplos antes mencionados, se confirmó que el anticuerpo de acuerdo con la presente invención tuvo realmente un efecto terapéutico en un modelo de artritis inducido por colágeno (Ejemplo 7). El modelo de artritis inducido por colágeno es un modelo de artritis reumatoide que es una enfermedad autoinmune. Por consiguiente, el anticuerpo de la primera modalidad de acuerdo con la presente invención es útil para el tratamiento de enfermedades autoinmunes.

Un ejemplo de tales enfermedades autoinmunes es artritis reumatoide. Asi mismo, se considera que la adhesión de las células T a las células dendriticas se suprime por anticuerpos contra una proteina TARM-L. Por consiguiente, el anticuerpo de la segunda modalidad de acuerdo con la presente invención es útil para el tratamiento de enfermedades autoinmunes . La presente invención proporciona el uso del anticuerpo de acuerdo con la presente invención para producir un agente terapéutico para tratar enfermedades autoinmunes. La presente invención proporciona un método para tratar enfermedades autoinmunes que comprenden la etapa de administrar una cantidad terapéuticamente efectiva del anticuerpo de acuerdo con la presente invención a mamíferos incluyendo un ser humano.

Agente para inhibir la adhesión de células T Como se describe posteriormente en los ejemplos, la adhesión de células T a células dendriticas se suprimió notablemente por anticuerpos contra una proteína TARM (Ejemplos 6 y 11) . Por consiguiente, el anticuerpo de la primera modalidad de acuerdo a la presente invención puede utilizarse como un agente para inhibir la adhesión de células Asi mismo, se considera que la adhesión de las células T a las células dendriticas se suprime por anticuerpos contra una proteina TARM-L. Por consiguiente, el anticuerpo de la segunda modalidad de acuerdo con la presente invención puede utilizarse como un agente para inhibir la adhesión de las células T. En la presente especificación, el término "adhesión de células T" significa la adhesión de las células T a las células dendriticas, particularmente, el enlace de una proteina TARM expresada en células dendriticas a una proteina TARM-L expresadas en células T. Al inhibir el enlace de una proteina TARM expresada en células dendriticas a una proteina TARM-L expresada en células T utilizando el agente para inhibir la adhesión de células T de acuerdo con la presente invención, una respuesta inmune generada como un resultado de la interacción entre las células dendriticas y las células T, tal activación, crecimiento y diferenciación de las células dendriticas y las células T, y la producción de citoquina/quimiocina puede suprimirse.

Composición farmacéutica La ruta de administración del anticuerpo de acuerdo con la presente invención no se limita particularmente. El anticuerpo antes mencionado puede administrarse a mamíferos que incluyen un ser humano por administración oral o por administración parenteral (por ejemplo, por inyección intravenosa, por inyección intramuscular, por administración subcutánea, por administración rectal, por administración percutánea y por administración local) . Entre estos, una administración parenteral, y en particular, una inyección intravenosa es preferible. La forma de dosis para administración oral y para administración parenteral y el método de producción de los mismos se conocen bien por las personas expertas en la técnica. La forma de dosis para administración oral y para administración parenteral puede producirse por un proceso convencional, por ejemplo, mezclando el anticuerpo de acuerdo con la presente invención, por ejemplo, con un portador farmacéuticamente aceptable. Como tal, se utiliza un portador farmacéuticamente aceptable, una sustancia, la cual se utiliza comúnmente en el campo de la formulación medicamentosa y no reacciona con el anticuerpo de acuerdo con la presente invención. Los portadores farmacéuticamente aceptables incluyen, por ejemplo, un excipiente, aglutinante, desintegrador, lubricante, agente colorante y agente saborizante comúnmente utilizado; y, cuando sea necesario, un estabilizador, un emulsionante, un promotor de absorción, un agente tensioactivo, un ajustador de pH, un antiséptico, un antioxidante, un diluyente, un agente humectante, un activador de superficie, un dispersante, un tampón, un conservador, un solubilizante y un calmante, y puede formularse de acuerdo con un método convencional al mezclar ingredientes comúnmente utilizados como materias primas para preparaciones farmacéuticas. Ejemplos de una forma de dosis para administración parenteral incluyen preparaciones inyectables (por ejemplo, un producto de inyección por goteo, un producto de inyección intravenosa, un producto de inyección intramuscular, un producto de inyección subcutánea y un producto de inyección percutánea) , preparaciones externas (por ejemplo, un ungüento, una cataplasma, una loción) , un supositorio, un inhalante, gotas para los ojos, un ungüento para los ojos, gotas nasales, gotas para los oídos y un agente liposomal. Una preparación inyectable se prepara, por ejemplo al disolver el anticuerpo de acuerdo con la presente invención dentro de agua destilada utilizada para inyecciones. Un solubilizador , un tampón, un ajustador de pH, un agente de isotonicidad, un calmante, un conservador, un estabilizador, etc., puede agregarse a tal preparación inyectable, cuando sea necesario. Además, tal preparación inyectable puede producirse en la forma de un producto liofilizado, el cual se preparará cuando se utilice. Ejemplos de una forma de dosis para administración oral incluyen formas de dosis sólidas y líquidas tales como una tableta, una tableta recubierta, una pildora, una pildora pequeña, un gránulo, un polvo, una cápsula, un jarabe, una emulsión, una suspensión, una inyección o una gragea. La composición farmacéutica de acuerdo con la presente invención puede además contener otros agentes terapéuticamente efectivos. Además, los componentes tales como un promotor de flujo sanguíneo, un germicida, un antiflogístico, un activador celular, vitaminas, un aminoácido, un humectante o un fármaco queratolítico pueden también agregarse, cuando sea necesario. Al mismo tiempo, la relación del ingrediente activo al portador puede cambiarse dentro de un intervalo de 1 a 90% en peso. Una dosis del anticuerpo de acuerdo con la presente invención puede determinarse por un médico basado en varios factores tales como una ruta de administración, el tipo de enfermedad, el grado de síntomas, la edad, el sexo y el peso corporal de un paciente, la severidad de la enfermedad, los hallazgos farmacéuticos tales como farmacocinética y características toxicológicas , la presencia o la ausencia de uso de un sistema de suministro de fármacos, y la posibilidad de ser administrado como una porción de la combinación con otros agentes, y puede ser en general de 1 a 5000 mg/día, de preferencia 10 a 2000 mg/día, y más preferiblemente de 50 a 2000 mg/día, para administración oral, y de 1 a 5000 mg/día, de preferencia 5 a 2000 mg/día, y más preferiblemente de 50 a 2000 mg/dia, para administración por inyección, cada una por adulto (60 kg de peso) las cuales se administran una vez o varias veces al día. Cuando se administra a un niño, la dosis puede ser más pequeña que aquella administrada a un adulto. Un método de administración, el cual se aplica realmente, puede cambiarse por decisión de un médico, y de este modo la dosis aplicada puede retirarse del intervalo antes mencionado .

[Método de Selección] Método para seleccionar una sustancia que inhibe la adhesión de una célula T a una proteina TARM De acuerdo con el método de selección de la primera modalidad de la presente invención, se proporciona un método de selección para seleccionar una sustancia que inhibe la adhesión de una célula T a una proteina TARM. La proteina TARM se expresa en células dendríticas y se asocia con una interacción que está implicada en la respuesta inmune entre las células dendríticas y las células T. Además, como un resultado de estímulo entrecruzado que se agrega a la proteína TARM, la producción de IL-6 que puede causar la enfermedad autoinmune puede inducirse. Por consiguiente, el método de selección de la primera modalidad de la presente invención puede utilizarse para seleccionar una sustancia que inhibe la adhesión de una célula T a la proteina TARM, y puede utilizarse de preferencia para seleccionar una sustancia útil para el tratamiento de la enfermedad autoinmune, y más preferiblemente artritis reumatoide. El método de selección de la primera modalidad de acuerdo con la presente invención puede además comprender la etapa de (c) comparar la actividad de enlace en la presencia de una sustancia de prueba con aquella en la ausencia de una sustancia de prueba, después de la etapa (b) . En la etapa (c) , cuando la actividad de enlace en la presencia de una sustancia de prueba es inferior que aquella en la ausencia de una sustancia de prueba, y de preferencia cuando es menor de 50%, puede determinarse que la sustancia de prueba inhibe el enlace de las células T a la proteina de acuerdo con la presente invención. El término "poner en contacto" en la etapa (a) no se limita particularmente, siempre y cuando se permita que una proteina TARM entre en contacto directamente con las células T. Por ejemplo, puede llevarse a cabo por un método de agregar las células T etiquetadas a una placa en la cual la proteina TARM se ha inmovilizado, o por un método de agregar la proteina TARM etiquetada a una placa que contiene las células T. Las células T son de preferencia células T activadas, y más preferiblemente células Th2 activadas. En la etapa (b) , la actividad de enlace puede medirse por un método conocido. Por ejemplo, se agregan las células T etiquetadas a una placa en la cual la proteina TARM se ha inmovilizado, y se cultivan entonces durante un cierto periodo de tiempo. Más adelante, las células no adheridas se eliminan por lavado o similares, y el nivel de las células adheridas se mide entonces, por lo que se mide la actividad de enlace. Para el etiquetado antes mencionado, puede utilizarse por ejemplo, un radioisótopo, una enzima, una sustancia fluorescente (incluyendo una proteina fluorescente), una sustancia luminiscente, etc. Ejemplos de un radioisótopo utilizado en la presente incluyen [3H] , [14C] , [125I] y [35S] . Ejemplos de una enzima utilizada en la presente incluyen ß-galactosidasa , fosfatasa alcalina, peroxidasa y luciferasa. Ejemplos de una sustancia fluorescente utilizada en la presente incluyen isotiocianato de fluoresceina, BODIPY y Calceina-AM (Dojindo Laboratories). También, una proteina fluorescente, GFP y similares pueden utilizarse. Con respecto a tales enzimas y proteínas fluorescentes, el gen de las mismas puede introducirse en una célula y puede expresarse entonces en la presente. Ejemplos de una sustancia luminiscente utilizada en la presente incluyen luciferina y lucigenina . En algunos casos, un sistema de biotina-avidina puede utilizarse para permitir al ligando antes mencionado unirse a una sustancia de etiquetado. Además, se agregan células T no etiquetadas, y las células T adheridas pueden detectarse entonces por un anticuerpo que es especifico para las células T, tales como un anticuerpo anti-CD3, o por un anticuerpo que es especifico para una célula T auxiliadora tal como un anticuerpo anti-CD4. Con respecto a la actividad de enlace, las células agregadas se han medido previamente, y puede expresarse en la forma de la relación de las células adheridas a las células agregadas .

Método para seleccionar una sustancia que inhibe la activación de una célula dendritica De acuerdo con un método de selección de la segunda modalidad de la presente invención, se proporciona un método de selección para seleccionar una sustancia que inhibe la activación de una célula dendritica. Las células dendriticas pueden activarse por una proteina TARM sometida a estimulo entrecruzado (Ejemplos 3 y 4). Por consiguiente, un sistema de células dendriticas que se ha sometido a estimulo entrecruzado con un anticuerpo TARM puede utilizarse para seleccionar una sustancia que inhibe la activación de las células dendriticas.

Como se establece anteriormente, se demostró que la enfermedad autoinmune es causada por la activación de células dendriticas. De este modo, puede utilizarse el método de acuerdo con la presente invención para seleccionar una sustancia que inhibe la activación de células dendriticas para seleccionar una sustancia útil para el tratamiento de, preferiblemente, de la enfermedad autoinmune, y más preferiblemente artritis reumatoide. Cuando se da el estimulo entrecruzado a una proteina TARM que se expresa en células dendriticas, las células dendriticas se llegan a activar. En ese momento, la proteina TARM forman un complejo con la cadena FcRy conocida como una molécula de transduccion de señal y la producción de IL-6 que causa enfermedades autoinmunes o MCP-1 que actúa como un factor quimiotáctico para monocitos se induce. Por consiguiente, en la etapa (e) del método de selección de la segunda modalidad de acuerdo con la presente invención, el nivel de activación de las células dendriticas puede medirse utilizando, como un índice, la cantidad de IL-6 y/o MPC-1 producido a partir de las células dendriticas. De otro modo, el nivel de activación de las células dendriticas puede medirse utilizando, como un índice, el nivel de expresión de la cadena FcRy en las células dendriticas. En el método de selección de la segunda modalidad de acuerdo con la presente invención, cuando el nivel de activación de las células dendriticas se mide utilizando, como un índice, la cantidad de IL-6 y/o MCP-1 producida a partir de las células dendriticas, el método de selección puede comprender además la etapa de (f-1) comparando la cantidad de IL-6 y/o MCP-1 producida en la presencia de una sustancia de prueba con aquella de IL-6 y/o MCP-1 producida en la ausencia de una sustancia de prueba, después de la etapa (e) . En la etapa (f-1), cuando la cantidad de IL-6 y/o MCP-1 producida en la presencia de una sustancia de prueba es más baja que aquella de IL-6 y/o MCP-1 producida en la ausencia de una sustancia de prueba, y de preferencia cuando es menor de 50%, puede determinarse que la sustancia de prueba que inhibe la activación de las células dendriticas. En el método de selección de la segunda modalidad de acuerdo con la presente invención, cuando el nivel de activación de células dendriticas se mide utilizando, como un índice, el nivel de expresión de la cadena FcRy en las células dendriticas, el método de selección puede comprender además la etapa de (f-2) comparando el nivel de expresión de la cadena FcRy en la presencia de una sustancia de prueba con aquella de la cadena FcRy en la ausencia de una sustancia de prueba, después de la etapa (e) . En la etapa (f-2), cuando el nivel de expresión de la cadena FcRy en la presencia de una sustancia de prueba es más baja que aquella de la cadena FcRy en la ausencia de una sustancia de prueba, y de preferencia cuando es menor de 50%, puede determinarse que la sustancia de prueba inhibe la activación de las células dendriticas. En la etapa (d) , el término "poner en contacto" no se limita particularmente, siempre y cuando una proteina TARM en las células dendriticas se someta a estimulo entrecruzado con el anticuerpo de acuerdo con la presente invención. Por ejemplo, puede llevarse a cabo cultivando las células dendriticas en un medio que contiene el anticuerpo de acuerdo con la presente invención. En la etapa (e) , la cantidad de una proteina producida o el nivel de expresión puede medirse de acuerdo con un método conocido. Puede utilizarse un equipo comercialmente disponible.

Método para seleccionar una sustancia que inhibe la formación compleja entre una proteina TARM y la cadena FcRy De acuerdo con el método de selección de la tercera modalidad de acuerdo con la presente invención, se proporciona un método para seleccionar una sustancia que inhibe una formación compleja entre una proteina TARM y la cadena FcRy. La proteina TARM se expresa en células dendriticas y forma un complejo con la cadena FcRy que se ha conocido bien como una molécula de transducción de señal. Además, se ha sugerido que la cadena FcRy forma un complejo con la proteína TARM, de manera que la expresión de la misma en la superficie celular se incrementa. Por consiguiente, el método de selección de acuerdo con la presente invención puede utilizarse para seleccionar una sustancia que inhibe una formación compleja entre la proteína TARM y la cadena FcRy, y puede utilizarse de preferencia para seleccionar una sustancia útil para el tratamiento de, preferiblemente de enfermedades autoinmunes, y más preferiblemente artritis reumatoide. El método de selección de acuerdo con la presente invención puede además comprender la etapa de (i) comparar el nivel de expresión de la cadena FcRy en la presencia de una sustancia de prueba con aquella de la cadena FcRy en la ausencia de una sustancia de prueba, después de la etapa (h) . En la etapa (i) , cuando el nivel de expresión de la cadena FcRy en la presencia de una sustancia de prueba es más bajo que aquel de la cadena FcRy en la ausencia de una sustancia de prueba, y de preferencia cuando es menor de 50%, puede determinarse que la sustancia de prueba inhibe una formación compleja entre la proteína de acuerdo con la presente invención y la cadena FcRy. En la etapa (g) , el término "poner en contacto" no se limita particularmente, mientras que las células dendríticas en las cuales se han expresado una proteína TARM y la cadena FcRy se permiten entrar en contacto directamente con el anticuerpo de acuerdo con la presente invención. Por ejemplo, puede llevarse a cabo cultivando las células dendriticas en un medio que contiene el anticuerpo de acuerdo con la presente invención. En la etapa (h) , el nivel de expresión puede medirse de acuerdo con un método conocido. Por ejemplo, el nivel de expresión puede medirse utilizando citometria de fluj o . En la presente especificación, ejemplos de la "sustancia de prueba" incluyen un compuesto de peso molecular bajo sintético, una proteina, un péptido sintético, un polipéptido purificado o parcialmente purificado, un anticuerpo, una sustancia de liberación de bacterias (incluyendo un metabolito bacterial) , y un ácido nucleico (antisentido, ribozima, ARNi, etc.). Los ejemplos preferidos incluyen un compuesto o una sal de los mismos, o un solvato de los mismos (por ejemplo, un hidrato), pero los ejemplos no se limitan a los mismos. La "sustancia de prueba" puede ser ya sea una sustancia novedosa o una sustancia conocida. La presente invención se describirá en detalle en los siguientes ejemplos. Sin embargo, los ejemplos descritos posteriormente no se pretenden para limitar el alcance de la presente invención. En los ejemplos, la "proteina TAR " y la "proteina TARM-L" pueden referirse simplemente como "TARM" y "TARM-L" a veces, respectivamente. Además, la proteina TARM derivada de ratón y la proteina TARM derivada de ser humano pueden referirse simplemente como "mTARM" y "hTARM" a veces, respectivamente .

[Ejemplo 1] Aislamiento de gen TARM de ratón y análisis de expresión (1) Aislamiento del gen mTARM Las células T CD4 separadas del bazo de ratón se diferenciaron de Thl o Th2 por cultivo ín Vitro. Un fragmento de ADNc que se utiliza como un conductor o un evaluador se preparó a partir de Thl o Th2. Más adelante, la búsqueda BLAST se llevó a cabo utilizando la secuencia de fragmentos de ADNc obtenida durante una etapa para conducir un método de sustracción de alta sensibilidad (N-RDA) . Como un resultado, se obtuvo un gen que codifica una proteina de membrana celular que tiene funciones desconocidas (No. de acceso GenBank™ NM_177363) . Los siguientes cebadores se diseñaron con base en la secuencia de GenBank™ (NM_177363) y la expresión del gen mTARM en varios órganos de un ratón se analizó. mTARM Fl : GTGACTTTGCAGTGCCAGAA (SEQ ID NO: 17) mTARM Rl : TGCACAGGAGTTGAGTGTCC (SEQ ID NO: 18) . Se sintetizó ADNc de hebra sencilla del ARN total de cada órgano (Promega) utilizando un kit de PCR de ARN (TAKARA) . Utilizar ADNc de hebra sencilla como una plantilla, una PCR de tiempo real se llevo a cabo utilizando ABI7700 (Applied Biosystems) . La PCR se llevó a cabo utilizando una solución de reacción con la siguiente composición (12.5 µ? de QuantiTect SYBR Green PCR Master ix (QIAGEN) , 0.25 µ? de ADN glicosilasa de uracilo ( Invitrogen) , 0.125 µ? de 100 µ? de cebador mTARM F, 0.125 µ? de 100 µ? del cebador mTARM R, 2.5 µ? de ADNc de plantilla (diluido 10 veces), y 7.25 µ? de agua destilada) . Para tal PCR, después del tratamiento a 94°C durante 10 minutos, un ciclo de reacción que consiste de 94°C-30 segundos y 60°C-1 minuto se repitió 35 veces. Como un resultado, se encontró que mTARM se expresó en el riñon. De este modo, al utilizar el ARN total del riñon, 5' -RACE (Rápida Amplificación de extremos de ADNc) y 3' -RACE se llevaron a cabo para intentar determinar la secuencia genética de longitud total en mTARM. Primero, se sintetizó el ADNc de doble hebra a partir del ARN total del riñon del ratón utilizando un kit de síntesis de ADNc (TAKARA) y el ADNc se purificó entonces utilizando un kit de purificación de PCR Qiaquick (QIAGEN) . Subsecuentemente, un adaptador ad29 (un producto obtenido al endurecer ad29S (acatcactccgt ; SEQ ID NO: 19) y ad29A (acggagtgatgtccgtcgacgtatctctgcgttgatacttcagcgtagct ; SEQ ID NO: 20)) se agregó al mismo, de manera que produce una plantilla de RACE.

Primero, se llevó a cabo la PCR utilizando una solución de reacción con la siguiente composición (5 µ? de tampón 10 x ExTaq, 4 µ? de 2.5 mM de dNTP, 0.25 µ? de ExTaq, 0.5 µ? de 100 µp? de cebador (5'PCR4), 0.5 µ? de 100 µ? del cebador especifico de Gen, 1 µ? de ADNc agregado al adaptador ad29 (diluido 29 veces) y 38.75 µ? de agua destilada). Se utilizaron las siguientes secuencias como cebadores . 5'PCR4 : AGCTACGCTGAAGTATCAACGCAGAG (SEQ ID NO. : 21) mTARM_RACE_5'_4: CTTCTGGCACTGCAGAGTCACCCT (SEQ ID NO. : 22), o mTARM_RACE_3'_4: GGAGAGTACACCTGTGAATACTAC (SEQ ID NO. : 23) Para tal PCR, después del tratamiento a 94 °C durante 5 minutos, un ciclo de reacción que consiste de 94 °C-30 segundos, 65°C-1 minuto, y 72°C-5 minutos se repitió 30 veces. Finalmente, una reacción se llevó a cabo a 72°C durante 5 minutos . Segundo, se llevó a cabo la PCR utilizando una solución de reacción con la siguiente composición (5 µ? de tampón 10 x ExTaq, 4 µ? de 2.5 mM de dNTP, 0.25 µ? de ExTaq, 0.5 µ? de 100 µ? del cebador (5'PCR1), 0.5 µ? de 100 µ? del cebador especifico del Gen, 1 µ? del primer producto de PCR (diluido 100 veces), y 38.75 µ? de agua destilada). Se utilizaron las siguientes secuencias como cebadores .

'PCRl : GTATCAACGCAGAGATACGTCGACGG (SEQ ID NO. : 24) mTARM_RACE_5'_3 : TCCACCTGCGGTCACTGTACCCCT (SEQ ID NO. : 25), o mTARM_RACE_3'_3 : CTACAGAAAAGCATCCCCCCACATCCTTTC (SEQ ID NO. : 26) Para tal PCR, después del tratamiento a 94 °C durante 5 minutos, un ciclo de reacción que consiste de 94 °C-30 segundos, 65°C-30 segundos, y 72°C-5 minutos se repitió 25 veces. Finalmente, una reacción se llevó a cabo a 72 °C durante 5 minutos. El fragmento de ADNc amplificado se clonó en pCR2.1 ( Invitrogen) , y la secuencia de nucleótido del mismo se determinó utilizando un Analizador de Secuencias ABI3100 (Applied Biosystems) . Como un resultado, 2 tipos de ADNc se obtuvieron en ' RACE, y 3 tipos de los ADNc se obtuvieron en 3' RACE, y de este modo la presencia de isoformas de empalme se aclaró. Al utilizar la información de secuencia de nucleótidos obtenida por RACE, se diseñaron los cebadores para amplificar isoformas de empalme. El ADNc de doble hebra se sintetizó del ARN total de médula ósea de ratón utilizando un kit de síntesis de ADNc (TAKARA) , y el ADNc se purificó entonces utilizando un kit de purificación de PCR Qiaquick (QIAGEN) . Se llevó a cabo la PCR utilizando una solución de reacción con la siguiente composición (5 µ? de tampón 10 x ExTaq, 4 µ? de 2.5 mM de dNTP, 0.25 µ? de ExTaq, 0.5 µ? de 100 µ? del cebador 5', 0.5 µ? de 100 µ? del cebador 3', 1 µ? de ADNc (diluido 25 veces), y 38.75 µ? de agua destilada). Se utilizaron las siguientes secuencias como cebadores. mTARM_5'UTR: GCTGATAGTAGACCTGCTGAAGAC (SEQ ID NO. : 27) mTARM_3'UTR-l : GTCCAGATATGTCCAGGCCTCTG (SEQ ID NO. : 28), o mTARM_3 ' UTR- 2 : TTCAGTTATTTTACC AG G GTTTA (SEQ ID NO. : 29) Para la PCR, después del tratamiento a 94 °C durante 5 minutos, un ciclo de reacción que consiste de 94°C-30 segundos, 65°C-30 segundos, y 72°C-5 minutos se repitió 35 veces. Finalmente, se llevó a cabo una reacción a 72°C durante 5 minutos. Con 2 tipos de cebadores, se confirmaron 6 tipos de isoformas de empalme. Como resultado se obtuvieron productos de amplificación en 5 tipos a raíz de 6 combinaciones de isoformas de empalme putativas. El fragmento de ADNc amplificado se clonó en pCR2.1 (Invitrogen) y la secuencia de nucleótido del mismo se determinó utilizando un Analizador de Secuencia ABI3100. Como un resultado, se reveló que las isoformas de empalme que codifican 4 tipos de genes TARM enlazados a la membrana (mi, m2 , m3 y m ) y un tipo de gen TARM de tipo secretor (si) se presentaron (Figura 1) . (2) Análisis de expresión de genes mTARM Se analizó la expresión de los genes mTARM en tejidos de ratón normal. Como se describe anteriormente, ya que las isoformas de empalme se presentaron, se diseñaron 3 tipos de conjuntos cebadores. Conjunto 1 (Se diseñaron los cebadores de manera que se pudieron amplificar específicamente las isoformas mi y m2) . MTARM_qF2: TCTGTGATAGACAACCATCT (SEQ ID NO: 30) MTARM_qR2: GTCATTGTACCCGGGGTCTT (SEQ ID NO: 31) Conjunto 2 (Se diseñaron los cebadores de manera que se pudieron amplificar específicamente las isoformas m3 y m4) . mTARM_qF4: ATGACAGAAGGCTACACTGTGGATAA (SEQ ID NO: 32) mTARM_qR3: TCATTTTTCTCCTGGGGCAC (SEQ ID NO: 33) Conjunto 3 (Se diseñaron cebadores de manera que se pudiera amplificar específicamente la isoforma si) . mTARM_qF3: GATCTCTGTGATAGATGCAAG ( SEQ ID NO: 34) mTARM_Qr2: GTCATTGTACCCGGGGTCTT (SEQ ID NO: 35) Al utilizar un kit de PCR ARN (TARARA) , el ADNc de hebra sencilla se sintetizó a partir del ARN total preparado de cada órgano de ratón utilizando un mini kit RNeasy (QIAGEN) o del ARN total adquirido de cada órgano (Promega).

Al utilizar el ADNc de hebra sencilla sintetizado como una plantilla, se llevó a cabo una PCR de tiempo real utilizando ABI7700. La PCR se llevó a cabo utilizando una solución de reacción con la siguiente composición (12.5 µ? de QuantiTect SYBR Green PCR Master Mix (QIAGEN) , 0.25 µ? de glicosilasa de ADN de uracilo ( Invitrogen) , 0.125 µ? de 100 µ? F de cebador, 0.125 µ? de 100 µ? R de cebador, 2.5 µ? de ADNc de plantilla (diluido 10 veces) y 7.25 µ? de agua destilada). Para tal PCR, después del tratamiento a 94 °C durante 10 minutos, un ciclo de reacción que consiste de 94°C-30 segundos y 60°C-1 minuto se repitió 35 veces. Como un resultado, se encontró que mTARM se expresó fuertemente en médula ósea (Figura 2). Subsecuentemente, se analizó la expresión de mTARM en varios tipos de células. Al utilizar un mini kit RNeasy (QIAGEN) , el ARN total se preparó a partir de cada una de las células separadas y purificadas de bazo de ratón, las células cultivadas in vitro, y varios tipos de lineas celulares. Más adelante, el ADNc de hebra sencilla se sintetizó del ARN total utilizando un kit de PCR de ARN (TAKARA) . Al utilizar el ADNc de hebra sencilla como una plantilla, la PCR de tiempo real se llevó a cabo utilizando ABI7700 en la misma manera como aquella para el análisis de expresión en tejidos de ratón normales.

Como un resultado, se encontró que mTARM se expresó fuertemente en células dendriticas derivadas de médula ósea (Figura 3) .

[Ejemplo 2] Preparación de un anticuerpo contra TARM de ratón y análisis de expresión (1) Preparación de células que expresan mTARM Se preparó un vector de expresión de gen mTARM como sigue. Se diseñaron cebadores basados en la secuencia de nucleótido de la isoforma mi. mTARM F2: cg cg tcg a cg cca cc ATG ATCTCTAG G CTCCTTTCCCTT (SEQ ID NO. : 36) mTARM R2: gcgggcggccgcTTACCAGGGTTTATTTGGAGACAG (SEQ ID NO. : 37) Al utilizar el kit de PCR de ARN (TARARA) , el ADNc de hebra sencilla se sintetizó del ARN total de médula ósea. El ADNc de hebra sencilla sintetizado asi se utilizó como una plantilla. Se llevó a cabo la PCR utilizando una solución de reacción con la siguiente composición (5 µ? de tampón 10 x, 4 µ? de 2.5 mM de dNTP, 0.5 µ? de polimerasa Pyrobest (TARARA), 0.5 µ? de cada uno de cebadores de 100 µ?, 1 µ? de ADNc, 2.5 µ? de DMSO, 36 µ? de agua destilada) . Para tal PCR, después del tratamiento a 9 °C durante 5 minutos, un ciclo de reacción que consiste de 94°C-30 segundos, 65°C-30 segundos, y 72°C-5 minutos se repitió 35 veces. Finalmente, se llevó a cabo una reacción a 72 °C durante 2 minutos. El ADNc amplificado se clonó en pBlueScriptII SK(+) (Stratagene) , y la secuencia de nucleótidos del mismo se confirmó entonces utilizando un Analizador de Secuencia ABI3100. El fragmento de ADNc obtenido se insertó en un vector de expresión pMXII IRES EGFP (Oncogene (2000) 19(27): 3050-3058), de manera que se prepara un vector de expresión de gen mTARM. Se preparó el retrovirus recombinante como sigue. Se suspendieron las células 3 x 106 293/EBNA-l (Invitrogen) en un medio (D-MEM/10% de FBS) , se colocaron en una cápsula de 10 cm, y luego se cultivaron en una incubadora de CO-2 durante 24 horas. Al día siguiente, el medio se cambió con uno reciente, y una solución de transfección preparada como se describe posteriormente se agregó entonces, de manera que se lleva a cabo la transfección. La solución de transfección se preparó agregando 600 µ? de OPTI-MEM (GIBCO BRL) y 24 µ? de TransIT LT1 (TaKaRa) en un tubo de 5 mi para mezclarlos, luego incubando la mezcla a temperatura ambiente durante 5 minutos, y luego agregando 9 \iq de un vector de expresión y 9 pg de pCL-Eco (Imgenex) utilizado como un vector de envasado a la mezcla de reacción, seguido al incubar la mezcla a temperatura ambiente durante 5 minutos. 48 horas después, se recuperó el sobrenadante de cultivo, y la filtración se llevó a cabo con un filtro de 0.45 pm, de manera que se obtiene una solución de virus recombinante . Las células B300.19 (EMBO J. (1984) 3: 1209-1219) se infectaron con este virus recombinante como se describe posteriormente, de manera que se preparan células que expresan mTARM. Se agregaron células 1 x 106 B300.19 a un tubo de 15 mi, y se centrifugaron entonces a 1200 rpm a 25°C durante 5 minutos. Más adelante, el sobrenadante de cultivo se eliminó por aspiración. Una solución obtenida al agregar la mezcla de 2 µ? de polibreno (10 mg/ml) y 2 µ? de 55 µ? de 2-mercaptoetanol a 2 mi de solución de virus recombinante se agregó a las células. La mezcla obtenida se centrifugó entonces a 2500 rpm a 30°C durante 2 horas, de manera que las células se infectaron con el virus recombinante. Tras la finalización de la infección, la solución de virus recombinante se eliminó, y se agregó un medio (RPMI-1640/10% de FBS/55 µ? de 2-mercaptoetanol) a la misma, seguido por el cultivo. Las células positivas de EGFP se separaron por clasificación celular, de manera que se obtienen células que expresan mTARM. (2) Preparación de la región extracelular de mTARM fusionada con la proteina quimérica a SEAP o Fe Primero, se preparó como sigue un vector pcDNA3.1 ( + ) -SEAP (His) io-Neo.

El sitio Salí endógeno de un vector pcDNA3.1 (+) -Neo (Invitrogen) se digirió con Salí, seguido por desafilado y re-ligación, de manera que se eliminó. El fragmento de ADNc de SEAP(His)io se amplificó por PCR utilizando pDREF-SEAP His6-Hyg (J. Biol . Chem. , 1995, 271, 21514-21521) como una plantilla y también utilizando un cebador 5' agregado a HindIII y un cebador 3' agregado a Xhol. El fragmento de ADNc obtenido se digirió con Hindi y Xhol, y se insertó entonces en el vector pcDNA3.1 ( + ) -Neo en el cual el sitio Salí se había eliminado. Subsecuentemente, la región extracelular de mTARM se amplificó por PCR utilizando un ADNc de longitud total de mTARM como una plantilla y también utilizando un cebador 5' agregado a Salí (mTARM_F2 : (SEQ ID NO: 36)) y un cebador 3' agregado a Notl (mTARM_R3: cgcggcggccgcattatccacagtgtagccttctgtcat (SEQ ID NO: 38)). La PCR se llevó a cabo en la solución de reacción con la siguiente composición (5 µ? del tampón 10 x, 4 µ? de 2.5 mM de dNTP, 0.5 µ? de polimerasa Pyrobest (TAKARA) , 0.5 µ? de cada uno de los cebadores de 100 µ?, 1 µ? de ADNc, 2.5 µ? de DMSO, y 36 µ? de agua destilada) . Para tal PCR, después del tratamiento a 9 °C durante 5 minutos, un ciclo de reacción que consiste de 94°C-30 segundos, 65°C-30 segundos, y 72°C-5 minutos se repitió 35 veces. Finalmente, se llevó a cabo una reacción a 72 °C durante 2 minutos. El ADNc amplificado se clonó en pBlueScriptII SK(+) (Stratagene) , y la secuencia de nucleótidos del mismo se determinó entonces utilizando un Analizador de Secuencia ABI3100. El fragmento de ADNc obtenido se digirió con Salí y Notl, y luego se insertó en el vector de expresión antes mencionado vector pcDNA3.1(+)-SEAP (His) io-Neo, de manera que se prepara un vector de expresión mTARM-AP. Por consiguiente, la región extracelular de mTARM se fusionó a través del enlazador de 3 aminoácidos (Ala-Ala-Ala) a la fosfatasa alcalina placentaria humana de tipo secretor que tiene una etiqueta 10-histidina (His)io en la C-terminal de la misma que se expresa como una proteína quimérica secretora (más adelante referida como una proteína quimérica AP) . El vector de expresión de proteína quimérica AP obtenido se introdujo en células 293/EBNA-l utilizando TransIT LT1 (TARARA) , y se cultivaron entonces durante 4 ó 5 días. Más adelante, el sobrenadante de cultivo se recuperó por centrifugación, y la proteína quimérica AP secretada en el sobrenadante se filtró entonces con un filtro de 0.22 µ??. Más adelante, se agregaron al mismo Hepes (pH 7.4) y azida de sodio a las concentraciones finales de 20 mM y 0.02%, respectivamente y el producto obtenido se almacenó a 4°C. La concentración de la proteína quimérica AP se calculó al medir la actividad de fosfatasa alcalina utilizando un ensayo del gen reportero quimioluminiscente AP Aurora (ICN). 3) Preparación de un anticuerpo monoclonal contra mTARM Para uso como un antigeno en inmunización, primero, se purificó la proteina quimérica mTARM-AP. Tal purificación se llevó a cabo utilizando la etiqueta de histidina existente en la C-terminal de la proteina quimérica AP y utilizando un Kit His Trap (Amersham Biosciences) . Un sobrenadante de cultivo que contiene la proteina quimérica mTARM-AP se agregó a una columna HP quelante HiTrap de 1 mi (Amersham Biosciences), seguida al lavar con una solución de imidazol de 10 mM. Más adelante, la proteina quimérica mTARM-AP se eluyó a partir de la columna utilizando una solución de imidazol de 500 mM. La concentración de la proteina quimérica mTARM-AP se calculó por la medición de actividad enzimática utilizando un ensayo del gen reportero quimioluminiscente AP Aurora (ICN) y por cuantificación de proteínas utilizando un kit II de Ensayo de Proteína (BIO-RAD) . La proteína quimérica mTARM-AP obtenida se mezcló con TiterMax, y se inmunizó entonces a ratas WKY (Japan, SLC, Inc.). Se aislaron linfocitos a partir de ratas inmunizadas. Se mezclaron linfocitos con células de mieloma P3 (ATCC) , de manera que la relación de las células de mieloma P3 a linfocitos se vuelve 1 : 5. Más adelante, la fusión celular se llevó a cabo utilizando una solución PEG1500 (Boehringer) .

Los hibridomas se seleccionaron en medio HAT ( Invitrogen) , y un sobrenadante de cultivo de los hibridomas obtenidos se sometió a selección por ELISA de fase doble utilizando una proteina quimérica mTARM-Fc. Se llevó a cabo la clonación y 3 tipos de clones (#6, #21 y #37) se obtuvieron de pozos positivos. Células B300.19, en las cuales se habían introducido mTARM-IRES-EGFP, se permitió reaccionar con los anticuerpos anti-mTARM, seguidos por análisis FACS . Como un resultado, los anticuerpos generados reaccionan únicamente con células B300.19 en las cuales se expresó EGFP (Figura 4B) y de este modo, se confirmó la especificidad de los anticuerpos anti-mTARM. Los hibridomas que producen los anticuerpos monoclonales anti-mTARM obtenidos #6, #21 y #37 se inocularon dentro de la cavidad peritoneal de ratones desnudos, y la ascitis se obtuvo entonces. Más adelante, los anticuerpos se purificaron utilizando una columna de Proteína G. El hibridoma que produce el anticuerpo #6 monoclonal anti-mTARM se depositó con el Instituto Nacional de Ciencia y Tecnología Industrial Avanzada, Depositario de Organismo de Patente Internacional, bajo el número de acceso FERM BP-10376. (4) Expresión de la proteína TARM en células dendríticas de médula ósea cultivada Al utilizar el anticuerpo monoclonal (mAb) obtenido, se analizó la expresión de una proteina TARM en las superficies celulares de las células dendriticas derivadas de médula ósea cultivadas. Tales células dendriticas derivadas de médula ósea cultivadas se prepararon por el siguiente método. Las células de médula ósea de ratones macho C57BL/6 (Japan SLC, Inc.) se suspendieron en un medio (RPMI1640/10% de FBS/1 mM de piruvato de sodio/55 µ? de 2-mercaptoetanol) que contiene GM-CSF de ratón (20 ng/ml) R & D system) en una concentración de 2 x 106 células/10 mi. Las células se colocaron en platos no recubiertos de 10 cm y se cultivaron entonces. 3 días después, 10 mi de medio que contenia GM-CSF de ratón (20 ng/ml) se agregó, y el cultivo se continuó además. Además, 3 días después, se recuperó 10 mi de la solución de cultivo y luego se centrifugó. Más adelante, los agregados celulares se suspendieron en 10 mi de medio fresco que contenia GM-CSF de ratón (20 ng/ml) y la suspensión obtenida se regresó entonces a los platos de 10 cm, no recubiertos originales, seguidos por un cultivo durante 2 días. Las células dendriticas inmaduras obtenidas asi se suspendieron en un medio que contenia LPS (100 ng/ml) (Sigma) en una concentración de 1 x 107 células/10 mi. Las células se colocaron en platos de 10 cm y se cultivaron entonces durante 1 dia, de manera que se obtuvieron células dendriticas maduras. Las células dendriticas inmaduras derivadas de médula ósea se suspendieron en tampón FACS (PBS/1% FBS/1 mM de EDTA) que contenia 5% de suero de ratón y se hicieron reaccionar con anticuerpo #6 o anticuerpo #21 (10 µ?/p??) . Más adelante, las células se incubaron con anticuerpo secundario IgG anti-rata de asno etiquetado con PE ( Jackson) , seguido por la medición con FACSCalibur (Becton Dickinson) . Como un resultado, tanto el anticuerpo #6 como el anticuerpo #21 mostraron reacciones positivas que fueron más fuertes que aquella obtenida con IgG de rata utilizadas como un control negativo. De este modo, con el fin de analizar en detalle las células que expresan mTARM, el anticuerpo #6 se etiquetó de forma fluorescente con un kit de etiquetado de anticuerpo monoclonal Alexa 647 (Molecular Probé) . Subsecuentemente, las células dendriticas inmaduras o las células dendriticas maduras obtenidas por estimulo de LPS se suspendieron en tampón FACS (PBS/1% FBS/1 mM de EDTA) que contenia 5% de suero de ratón y 5% de suero de rata. La solución de bloqueo FcR (BD Pharmingen) se agregó a la suspensión y se incubó en hielo durante 10 minutos. Más adelante, la mezcla de se hizo reaccionar en hielo durante 30 minutos con un anticuerpo anti-mTARM etiquetado en forma fluorescente, un anticuerpo marcador de células dendriticas anti-CDllc y un anticuerpo marcador de activación anti-CD40, y el nivel de expresión de la proteina mTARM se midió entonces utilizando FACSCalibur.

Como un resultado, se reveló que la proteína mTARM se expresó en células dendríticas tanto inmaduras como maduras, que la expresión de la proteina mTARM se mejoró en células dendríticas de médula ósea maduras en lugar que en las células dendríticas inmaduras, y que la proteína mTARM se expresó fuertemente en células en las cuales el marcador CD40 de activación se expresó (Figura 5) . (5) Expresión de la proteína TARM de ratón normal Ya que la expresión de mTARM se confirmó en células dendríticas derivadas de médula ósea, la expresión de la proteína mTARM en los tejidos inmunes del ratón normal se analizó entonces. Se prepararon células de la médula ósea, la sangre periférica, el bazo, el nodulo linfático mesentérico y el parche de Peyer del ratón macho C57BL/6. Las células así preparadas se suspendieron en un tampón FACS (PBS/1% FBS/1 mM de EDTA) que contenía 5% de suero de ratón y 5% de suero de rata. La solución de bloqueo FcR se agregó a la suspensión y se incubó en hielo durante 10 minutos. Más adelante, la mezcla de reacción se hizo reaccionar en hielo durante 30 minutos con un anticuerpo anti-mTARM etiquetado en forma fluorescente y varios tipos de los anticuerpos marcadores de linaje celular etiquetados en forma fluorescente, y el nivel de expresión de la proteína mTARM se midió entonces utilizando FACSCalibur. Como un resultado, en los tejidos inmunes del ratón normal, la expresión de la proteina mTAR no se observó en todas las células T CD3+, las células NK DX5+, las células mieloide CDllb+ y las células dendriticas CDllc+ en el bazo (SP) y las células B B220+, los monocitos/macrófagos F4/80+, los neutrófilos SSC altos/Grl+ y eosinófilos SSC altos/F4/80+ en sangre periférica (PBL) (Figura 6). De este modo, la expresión de la proteina mTARM en tejidos periféricos de ratón normal se analizó utilizando células preparadas a partir de la cavidad peritoneal del mismo . Como un resultado, la expresión de la proteina mTARM no se observó en células T CD3+ , células NK DX5+ , células dendriticas CDllc+, células B B220+, monocitos/macrófagos F4/80+ y neutrófilos SSC altos/Grl+ desde la cavidad peritoneal. Sin embargo, se observó tal expresión en una parte de las células mieloides CDllb+. De este modo, se llevó a cabo el análisis adicional. Como un resultado, se reveló que la proteina mTARM se expresó en mastocitos c-kit-+ (Figura 7). (6) Inducción de la expresión de la proteina TARM en células dendriticas por estimulo de inflamación de LPS Se expresó la proteina mTARM en las células dendriticas cultivadas, pero no se observó tal expresión de la proteina mTARM en las células dendriticas preparadas del sistema linfático de ratón y de los tejidos periféricos. De este modo, se consideró que la expresión de la proteina mTARM se indujo por estimulo inflamatorio in vivo. Por lo tanto, se administró intraperitonealmente 100 µg de LPS a un ratón macho C57BL/6. 14 a 18 horas después, se recuperaron las células del nodulo linfático mesentérico, y la expresión de la proteina mTARM se analizó entonces. Como un resultado, la expresión de la proteina mTARM se observó en células dendriticas mieloides CDllc+/CDllb+ que se había movido al nodulo linfático mesentérico por el estímulo inflamatorio LPS (Figura 8). Por consiguiente, se reveló que la proteína mTARM no se expresó en la superficie celular de las células dendriticas in vivo en condición normal, pero se expresó selectivamente en células dendriticas, y en particular, en células dendriticas mieloides durante la inflamación. De este modo, se sugirió que la proteína mTARM funcionó en las células dendriticas durante la inflamación.

[Ejemplo 3] Activación de células dendriticas cultivadas derivadas de médula ósea por anticuerpo anti-TARM El mTARM se expresó selectivamente en células dendriticas. De este modo, la activación de tales células dendríticas por el estimulo entrecruzado del mTARM se analizó. Las células dendriticas inmaduras o células dendriticas maduras derivadas de médula ósea se suspendieron en una concentración de 1 x 108 células en 350 µ? de tampón MACS (PBS/1% de FBS/2 mM de EDTA) . 50 µ? de solución de bloqueo FcR (Miltenyi) se agregó a la suspensión y se incubó a 4°C durante 10 minutos. Más adelante, 100 µ? de microperlas CDllc (Miltenyi) se agregaron a la mezcla de reacción y se incubaron a 4°C durante 30 minutos. Más adelante, se separaron las células CDllc+ y se purificaron utilizando Auto MACS (Miltenyi). Un anticuerpo IgG anti-rata F(ab)'2 (10 g/ml) (Jackson) se inmovilizó en una placa de 96 pozos a 37 °C durante 2 horas, y luego la placa se lavó con PBS. Más adelante, el anticuerpo #6, #21 anti-mTARM o IgG de rata (10 pg/ml) utilizado como un control negativo se inmovilizó en la placa a 37 °C durante 1 hora. La placa se lavó entonces con PBS, y las células dendriticas CDllc+ se cultivaron en un medio, o en un medio que contenia un anticuerpo anti-CD40 agonístico (BD Pharmingen) a una concentración final de 2 pg/ml. 24 ó 48 horas después, se recuperó el sobrenadante de cultivo, y las citoquinas se detectaron entonces utilizando un kit DouSet ELISA Development (R & D) . Como un resultado, se reveló que el anticuerpo anti-mTARM indujo la producción de IL-6 de células dendríticas maduras derivadas de médula ósea en el nivel similar con aquel del anticuerpo anti-CD40, y tuvo un efecto adictivo con el anticuerpo anti-CD40 (Figura 9A) . De forma similar, el anticuerpo antes mencionado tendía a inducir la producción de IL-6 también de células dendríticas inmaduras. Además, el anticuerpo anti-mTARM indujo la producción de MCP-1 a partir de células dendríticas de médula ósea inmaduras, pero el anticuerpo anti-CD40 no indujo tal producción de MCP-1 (Figura 9B) . La inducción de la producción de MCP-l por el anticuerpo anti-mTARM no se observó en las células dendríticas de médula ósea maduras. Además, la inducción de la producción de IL-12, TNFa, IL-?ß, IL-10 y KC se analizó también, pero el anticuerpo anti-mTARM no tuvo efectos significativos tanto en las células dendríticas inmaduras como en las células dendríticas maduras. A partir de los resultados anteriores, se confirmó que mTARM en las células dendríticas se asocia con la producción de citoquinas y quimiocinas específicas (por ejemplo, IL-6 y MCP-l) .

[Ejemplo 4] Formación compleja entre TARM y la cadena FcRy Se reveló que mTARM funciona como un receptor de activación de células dendríticas. Enseguida, se examinó una molécula de transducción de señal. El mTARM tiene una región de transmembrana similar a aquella de Oscar que está implicada en diferenciación de osteoclastos . Se ha conocido que Oscar forma un complejo con la cadena FcRy, una molécula de transducción de señal bien conocida como un componente del receptor IgE. Se ha considerado que la interacción entre un aminoácido básico en la región de transmembrana celular de Oscar y un aminoácido acidico de la cadena FcRy está implicada en la asociación antes mencionada. El mTARM también tiene un aminoácido básico en su región de transmembrana. Por otro lado, DAP10 y DAP12 se conocen como moléculas de transducción de señal de activación que tienen un aminoácido acidico en su región de transmembrana, como con la cadena FcRy. De este modo, la posibilidad de una formación compleja entre la cadena FcRy, DAP10 o DAP12, y el mTARM se analizó. Cada uno de los vectores de expresión de la cadena FcRy, DAP10 y DAP12 se produjo insertando un fragmento de ADNc amplificado utilizando los siguientes cebadores diseñados con base en las secuencias de nucleótidos como se muestra en NM_010185, AF072846 y NM_011662 de GenBank™ en un vector de expresión pMXII IRES-Puro diseñado de manera que una secuencia de etiqueta Flag unida a la N-terminal puede expresarse en una superficie celular.

FcRy F: cg cctcg a g CTG GGAGAGCCG C AG CTCTG CTAT (SEQ ID NO. : 39) FcRy R: gcgggcggccg cCTA CTG G G GTG GTTTCTC ATG CTT (SEQ ID NO. : 40) DAP10 F: cgcgtcgacCAGACATCGGCAGGTTCCTGCTCC (SEQ ID NO. : 41) DAPIO R: gcgggcggccgcTCAGCCTCTGCCAGGCATGTTGAT (SEQ ID NO. : 42) DAP12 F: cgcgtcgacTTAAGTCCCGTACAGGCCCAGAGT (SEQ ID NO. : 43) DAP12 R: g cg g g cg g ccg cTC ATCTGTAATATTG CCTCTGTGT (SEQ ID NO. : 44) Más adelante, se preparó el retrovirus recombinante por el método similar como aquel aplicado para preparar células que expresan mTARM y células B300.19 que expresan mTARM se infectaron entonces con el retrovirus recombinante. Más adelante, las células se cultivaron en la presencia de puromicina y las células infectadas se seleccionaron entonces. Los transíectantes B300.19 obtenidos se suspendieron en tampón FACS (PBS/1% FBS/1 mM de EDTA) y se hicieron reaccionar con un anticuerpo #6 y un anticuerpo anti-Flag de ratón (Sigma) en una concentración final de 10 µ?/p??. Más adelante, se hizo reaccionar con un anticuerpo secundario IgG anti-rata de asno etiquetado con PE (Jackson) y un anticuerpo secundario IgG anti-ratón de asno etiquetado con Cy5 (Jackson) , seguido por la medición del nivel de expresión utilizando FACSCalibur (Becton Dickinson) . Como un resultado, se reveló que cuando el mTARM y la cadena FcRy se expresaron simultáneamente, el nivel de expresión de la cadena FcRy en la superficie celular se incrementó, cuando el nivel de expresión del mTARM en la superficie celular se incrementó. Los niveles de expresión de DAP10 y DAP12 en la superficie celular no dependieron del nivel de expresión del mTARM. Por consiguiente, se sugirió que el nivel de expresión de la cadena FcRy en la superficie celular se incrementó por su formación de un complejo con el mTARM (Figura 10) . Subsecuentemente, las proteínas de enlace de mTARM se analizaron bioquímicamente. Se solubilizaron transfectantes B300.19 en un tampón de lisis celular que contiene 1% de digitonina (1% de digitonina/50 mM de Tris-HCl (pH 7.5) /150 mM de NaCl/5 mM de NaF/1 mM de ortovanadato/Complete™ (Roche) ) . Se llevó a cabo la inmunoprecipitación utilizando un anticuerpo anti-Flag, y se llevó a cabo entonces el análisis de inmunotransferencia utilizando un anticuerpo #6 anti-mTARM. Como un resultado, se encontró que el mTARM se inmunoprecipitó junto con la cadena FcRy, pero tanto DAP10 como DAP12 no se inmunoprecipitaron junto con el mTARM (Figura 11A) . La inmunoprecipitación de la cadena FcRy, DAP10 y DAP12 por el anticuerpo anti-Flag se confirmó por el análisis de inmunotransferencia con el anticuerpo anti-Flag. Además, la expresión de mTARM, una cadena FcRy etiquetada con Flag, DAP10 y DAP12 en transfectantes B300.19 se confirmó por análisis de inmunotransferencia de lisatos celulares utilizando un anticuerpo #6 anti-mTARM o el anticuerpo anti-Flag. Por consiguiente, se reveló que la cadena FcRy formó un complejo con el mTARM en los transfectantes B300.19. Además, las células dendríticas maduras derivadas de médula ósea se solubilizaron en un tampón de lisis celular que contiene 1% de digitonina. Se llevó a cabo la inmunoprecipitación utilizando IgG de ratas como un control negativo, un anticuerpo #21 anti-mTARM, un anticuerpo anti-CD54 y un anticuerpo de cadena anti-FcRy, y un análisis de inmunotransferencia se llevó a cabo utilizando un anticuerpo de cadena anti-FcRy. Como un resultado, se encontró que la cadena FcRy se inmunoprecipitó junto con el mTARM, y que otra proteina CD54 de membrana celular y la cadena FcRy no se co-inmunoprecipitaron (Figura 11B) . Por consiguiente, se reveló que la cadena FcRy y el mTARM formaron un complejo en células dendríticas maduras. A partir de estos resultados, se sugirió que la activación de las células dendríticas por el estímulo entrecruzado de mTARM se media mediante transducción de señal a partir de la cadena FcRy.

[Ejemplo 5] Adhesión de linfocitos activados a TARM inmovilizada (1) Expresión de moléculas de enlace de mTARM en célula T activada Se ha sabido que las células dendríticas actúan como células que presentan antigenos e interactúan con las células T. De este modo, se intenta especular que las moléculas que se enlazan a mTAR se expresan en las células T y que la activación de las células dendriticas se regula mediante tales moléculas. Por consiguiente, la presencia o la ausencia de las moléculas de enlace de mTARM en las células T se analizó. Se suspendieron células esplénicas de ratón macho 4 x 107 C57BL/6 en 70 µ? de un tampón MACS (PBS/1% de FBS/2 mM de EDTA) , y se agregó 10 µ? de una solución de bloqueo FcR (Miltenyi) a la suspensión. La mezcla se incubó entonces a 4°C durante 10 minutos. Se agregaron además 100 µ? de microperlas CD4 (Miltenyi) a la mezcla de reacción y se incubaron a 4°C durante 15 minutos. Más adelante, se utilizó Auto MACS para obtener células T CD4+ en reposo. Las células T CD4+, las cuales se habían purificado con MACS, se suspendieron en un medio (RPMI1640/10% FBS/1 mM de piruvato de sodio/55 µ? de 2-mercaptoetanol) en una concentración de 1 x 106 células/ml . Más adelante, la suspensión se agregó a una placa, en la cual un anticuerpo anti-CD3 (eBioscience) había sido inmovilizada con una solución de 1 yg/ml a 37 °C durante 2 horas, y se estimuló en la presencia de un anticuerpo anti-CD28 de 2 µg/ml (Pharmingen) . Cuando las células T CD4+ se diferenciaron en Thl, tal estímulo de anticuerpo anti-CD3 se llevó a cabo en la presencia de IL-12 de ratón (10 ng/ml) (Peprotech) y un anticuerpo IL-4 anti-ratón (10 pg/ml) (MP4-25D2; Pharmingen) . Cuando las células T CD4+ se diferenciaron en Th2, tal estimulo de anticuerpo anti-CD3 se llevó a cabo en la presencia de IL-4 de ratón (15 ng/ml) (Genzyme) y un anticuerpo IL-12 anti-ratón (15 g/ml) (24910.1; Pharmingen). Dos días después del estimulo, en el caso de Thl, el IL-2 de ratón (20 ng/ml) (Genzyme) y el IL-12 de ratón (10 ng/ml) se agregaron, seguidos por el cultivo. En el caso de Th2, IL-2 de ratón (20 ng/ml) e IL-4 de ratón (15 ng/ml) se agregaron, seguidos por el cultivo. La diferenciación en Thl y Th2 se confirmó por la producción de IFN-? e IL-4, respectivamente. Las células T CD4+ en reposo inmediatamente después de la purificación con MACS y las células T CD4+ activadas 2 y 8 días después del estimulo de CD3 se utilizaron para analizar la actividad de enlace de una proteina quimérica mTARM-AP sobre una superficie celular. Estas células se suspendieron en un tampón FACS (PBS/1% de FBS) y se hicieron reaccionar en hielo durante 30 minutos con una proteina quimérica mTARM-AP o una proteina AP utilizada como un control negativo en una concentración final de 30 pg/ml. Más adelante, un anticuerpo anti-PLAP de conejo (6000 veces de dilución) (COSMO BIO Co . , Ltd.) se agregó, y luego se hizo reaccionar en hielo durante 30 minutos. Además, el anticuerpo IgG anti-conejo (H + L) de asno etiquetado con PE (50 veces de dilución) (Jackson) se agregó y luego se hizo reaccionar con el mismo en hielo durante 30 minutos. La actividad de enlace de la proteina quimérica mTARM-AP se midió utilizando FACSCalibur . Como un resultado, se reveló que las moléculas de enlace de mTARM no se expresaron en una célula T CD4+ en reposo, sino que tal expresión se indujo en células T CD4+ activadas (Figura 12) . Las moléculas de enlace de mTARM ya se hablan expresado 2 dias después del estimulo y la expresión de las mismas se mantuvo también 8 dias después del estimulo. Tales moléculas de enlace de mTARM se expresaron bajo condiciones de diferenciación Thl y Th2. 8 dias después, la expresión de la molécula de enlace de mTARM en células Th2 tendió a ser más fuerte que aquellas en las células Thl (Figura 12) . (2) Adhesión de células T activadas a la proteina recombinante de mTARM Enseguida, se analizó la posibilidad de la función del mTARM como una molécula de adhesión a las células T activadas. Primero, se agregó 50 µ? de un anticuerpo de fosfatasa anti-alcalina (10 g/ml) (Seradyn) a cada pozo de una placa de ELISA de 96 pozos (Nunc) y se incubó a 37°C durante 30 minutos para inmovilización. Después de lavar con PBS, un sitio de enlace no especifico se bloqueo con Block Ace (Dainippon Pharma Co., Ltd. ) · Una proteína quimérica AP (10 n ) se agregó a cada pozo y se incubó a temperatura ambiente durante 30 minutos para inmovilización. 6 a 9 días después del estímulo, las células T activadas se suspendieron en un tampón de adhesión celular (RPMI1640/0.5% de BSA/20 mM de HEPES (pH 7.4)), seguido por etiquetado fluorescente con Calcein-AM (Dojindo Laboratories). Más adelante, se agregaron células 1 x 105 a cada pozo y se incubaron a 37°C durante 1 hora. Se eliminaron las células no adheridas por lavado, y se agregó a las mismas un tampón de lisis celular (10 mM de Tris-HCl (pH 8.0) /1% de TritonX-100 ) . Más adelante, se llevó a cabo la medición en una longitud de onda de excitación de 485 nm y una longitud de onda de detección de 535 nm utilizando Wallac ARVO SX 1420 MULTILABEL COUNTER (Perkin Elmer) , y las células adheridas se cuantificaron entonces. Con respecto al nivel de adhesión celular, la relación de las células adheridas a las células agregadas se expresó como un porcentaj e . Como un resultado, se reveló que el mTARM funcionaba como una molécula de adhesión a las células T activadas (Figura 13). Ambas células Thl y Th2 exhibieron actividad de adhesión al mTARM. La actividad de adhesión de las células Th2 al mTARM tendió a ser más elevada que aquella de las células Thl al mTARM.

[Ejemplo 6] Actividad para inhibir la adición celular del anticuerpo anti-TARM Se analizó el efecto de anticuerpos anti-TARM en la adhesión celular de células Th2 al mTARM. Se agregó 10 µ?/p?? de un anticuerpo anti-mTARM a las células Th2 y se pre-trató a temperatura ambiente durante 10 minutos. Más adelante, se agregaron las células resultantes a una placa en la cual se había inmovilizado una proteína quimérica mTARM-AP, y se analizó la actividad de adhesión celular en la presencia del anticuerpo. Como un resultado, la adhesión de las células Th2 a la proteína quimérica mTARM-AP se suprimió significativamente en todos los anticuerpos #6, #21 y #37 anti-mTARM (Figura 14) .

[Ejemplo 7] Efecto terapéutico del anticuerpo anti-TARM en modelo de artritis inducido por colágeno Un modelo de Artritis Inducida por Colágeno (CIA) es un modelo de enfermedad de artritis reumatoide autoinmune. Ya que la célula T CD4+ y los anticuerpos que reaccionan con el colágeno de tipo II se detectan, se considera que ambos cooperan para provocar artritis. Además, se reporta que la susceptibilidad al modelo CIA se une a moléculas MHC de clase II. El TARM es una molécula de activación que se expresa en células dendríticas, e induce la adhesión celular de células T activadas a través de moléculas de enlace de TARM. Por consiguiente, se ha considerado que la interacción entre tales células dendriticas y las células T activadas se inhibe por un anticuerpo anti-TARM, de manera que suprime posiblemente una respuesta inmune asociada con las células dendriticas o las células' T activadas. De este modo, se analizó el efecto terapéutico del anticuerpo anti-TARM en el modelo CIA. Una solución de 3% de colágeno de tipo II derivada de articulación de bovino (Collagen Gijutsu Kenshukai) y adyuvante completo de Freund (Difco) se mezcló en cantidades iguales para producir una emulsión. Más adelante, se administró subcutáneamente 100 µ? de la emulsión (150 g/ratón) en la base de la cola de un ratón DBA/1J de 5 semanas (Charles River Laboratories Japan, Inc.) de manera que el ratón se inmunizó el día 21 (inmunización inicial) y en el dia 0 (inyección de refuerzo) . A partir de la inyección de refuerzo, el anticuerpo #6 anti-mTARM se administró intravenosamente en una dosis de 500 µg dos veces a la semana. 3 días después de la inyección de refuerzo, la medición del peso corporal y la evaluación externa se llevaron a cabo. En el dia 13, el ratón se sacrificó. Se evaluaron los hallazgos externos utilizando la siguiente puntuación. Es decir, 0: normal, 1: eritema e hinchazón leve confinada al tobillo (tarso) o articulación del tobillo; 3: eritema e hinchazón moderada que se extiende desde el tobillo a la articulación del metatarso; 4: eritema e hinchazón severa en la porción completa que recorre desde el tobillo, el pie y los dedos. Consecuentemente, como un resultado de la administración del anticuerpo anti-mTARM, se observaron el claro alivio en los síntomas y la supresión de reducción de peso corporal (Figura 15). Además, se recolectó sangre heparinizada de la vena cava inferior del ratón sacrificado, y la concentración de suero amiloide A (SAA) en plasma y se midió el título de anticuerpo a colágeno. El SAA es una proteína de plasma producida en las células del hígado por la acción de citoquinas producidas por estímulo inflamatorio. La concentración de SAA en plasma se utiliza como un índice de inflamación. El título del anticuerpo al colágeno se utiliza como un índice de una respuesta inmune específica de antígenos . La concentración de SAA en plasma se midió por un kit ELISA (BioSource) utilizando el plasma diluido 8,000 veces . Además, el título de anticuerpo a colágeno en plasma se midió como sigue. Primero, se agregó 50 µ? de una solución 5 g/ml de colágeno de tipo II derivado de articulación de bovino a cada pozo de una placa ELISA de 96 pozos (Nunc) y se incubó a 4°C durante la noche para inmovilización. Más adelante, el pozo se lavó con T-PBS (0.02% de Tween20/PBS) , y se bloqueó entonces no específicamente un sitio de enlace con 1% de BSA/PBS. El pozo se lavó con T-PBS 3 veces y 50 µ? de plasma que se había diluido 100,000 veces con T-PBS, se agregó entonces a cada pozo, seguido por la incubación a temperatura ambiente durante 2 horas. Más adelante, el pozo se lavó con T-BS 3 veces y 50 µ? de cada IgGl anti-ratón biotinilado (BD) e IgG2a anti-ratón biotinilado (BD) que se habían diluido 1, 000 veces con T-BS se agregaron entonces a cada pozo, seguidos por la incubación a temperatura ambiente durante 2 horas. El pozo se lavó con T-PBS 3 veces, y 50 µ? de cada uno de estreptavidina etiquetada con HRP (Pierce) que se había diluido 5,000 veces con T-PBS se agregó entonces a cada pozo, seguida por temperatura ambiente durante 30 minutos. Más adelante, se agregó y desarrolló el sustrato cromogénico. Como un resultado, la concentración de SAA en plasma se redujo por la administración del anticuerpo anti-mTARM (Figura 16) . Sin embargo, el título de anticuerpo anticolágeno en plasma no se cambió por la administración del anticuerpo anti-mTARM (Figura 17).

[Ejemplo 8] Determinación de la secuencia genética de longitud total TARM humana Con el fin de identificar un gen TARM humano, se llevó a cabo la búsqueda BLAST utilizando la secuencia genética TARM de ratón. Como un resultado, una secuencia que muestra alta homología con la secuencia de ADNc TARM de ratón (No. de Acceso GenBank XM_497642) se descubrió. Sin embargo, no existen secuencias de señal en una secuencia de aminoácidos (LOC441864) codificada para tal XM_497642, y de este modo no se consideró que la secuencia antes mencionada funciona como una proteína de membrana celular. Se consideró que XM_497642 es una secuencia putativa y que la estimación de una secuencia de ADNc a partir de la secuencia del genoma es incorrecta. Por lo tanto, se intentó determinar la secuencia genética de longitud total del TARM humano. Los tejidos de expresión de TARM se identificaron, y la secuencia de longitud total de ADNc de TARM se estimó conduciendo 5' y 3' -RACE. Más adelante, con base en la secuencia de una región que codifica la proteína TARM, se diseñaron los cebadores, y el ADNc de longitud total se aisló entonces. (1) Análisis de expresión del gen TARM humano Primero, la expresión de hTARM en tejidos humanos se analizó. Basada en el Acceso GenBank XM_497642, se diseñaron los cebadores. hTARM Fl: TGTGAATACTACAGAAAAGCATCC (SEQ ID NO: 45) hTARM Rl: TCCACCTGCGGTCACTGTACCCCT (SEQ ID NO: 46) Se sintetizó el ADNc de hebra sencilla a partir del ARN total de cada órgano humano (Clontech) utilizando un kit de PCR de ARN (TARARA) . Al utilizar tal ADNc de hebra sencilla como una plantilla, se llevó a cabo la PCR de tiempo real utilizando ABI7700. La PCR se llevó a cabo utilizando una solución de reacción con la siguiente composición (12.5 µ? de QuantiTec SYBR Green PCR Master Mix (QIAGEN) , 0.25 µ? de Uracilo ADN Glicosilasa ( Invitrogen) , 0.125 µ? de 100 µ? del cebador F, 0.125 µ? de 100 µ? del cebador , 2.5 µ? del ADNc de plantilla (10 veces diluido) y 7.25 µ? de agua destilada). Para tal PCR, después del tratamiento a 94 °C durante 10 minutos, un ciclo de reacción que consiste de 94°C-30 segundos y 60°C-1 minuto se repitió 35 veces. Como un resultado, se encontró que el gen hTARM, como con el gen mTARM, se expresó fuertemente en médula ósea (Figura 18) . (2) Aislamiento del gen TARM humano Ya que el gen hTARM se expresó en médula ósea, el ARN total de la médula ósea se utilizó para llevar a cabo 5'-RACE y 3' -RACE de manera que se intenta determinar la secuencia de un gen de longitud total del hTARM. Primero, se sintetizó el ADNc de doble hebra a partir del ARN total de la médula ósea utilizando un kit de síntesis de ADNc (TAKARA) , y el ADNc se purificó entonces utilizando un kit de purificación de PCR Qiaquick (Qiagen) .

Subsecuentemente, se agregó al mismo un adaptador ad29 y se utilizó el producto asi obtenido como una plantilla en RACE. Primero, se llevó a cabo utilizando una solución de reacción con la siguiente composición (5 µ? de tampón 10 x ExTaq, 4 µ? de 2.5 mM de dNTP, 0.25 µ? de ExTaq, 0.5 µ? de 100 µ? del cebador (5'PCR4), 0.5 µ? de 100 µ? del cebador especifico de Gen, 1 µ? del ADNc agregado al adaptador ad29 (25 veces diluido), y 38.75 µ? de agua destilada). Se utilizaron las siguientes secuencias como cebadores. 5*PCR4: AGCTACGCTGAAGTATCAACGCAGAG (SEQ ID NO. : 21) hTARM_RACE_5'_4: CTTCTGGCACTGCAGAGTCACCCT (SEQ ID NO. : 47), O hTARM_RACE_3'_4: GGAGAGTACACCTGTGAATACTAC (SEQ ID NO. : 48) Para tal PCR, después del tratamiento a 94 °C durante 5 minutos, un ciclo de reacción que consiste de 94 °C-30 segundos, 65°C-1 minuto, y 72°C-5 minutos se repitió 30 veces. Finalmente, se llevó a cabo una reacción a 72 °C durante 5 minutos. Segundo, se llevó a cabo la PCR utilizando una solución de reacción con la siguiente composición (5 µ? de tampón de lOx ExTaq, 4 µ? de 2.5 mM de dNTP, 0.25 µ? de ExTaq, 0.5 µ? de 100 µ? del cebador (5'PCR1), 0.5 µ? de 100 µ? del cebador especifico de Gen, 1 µ? del primer producto de PCR (100 veces diluido) y 38.75 µ? de agua destilada). Se utilizaron las siguientes secuencias como cebadores . 5' PCR1: (SEQ ID NO: 24) , h29B1 0 Fl : TGTGAATACTACAGAAAAGCATCC (SEQ ID NO: 49) , o h29B140 Rl: TCCACCTGCGGTCACTGTACCCCT (SEQ ID NO: 50) Para tal PCR, después del tratamiento a 94 °C durante 5 minutos, un ciclo de reacción que consiste de 94 °C-30 segundos, 65°C-30 segundos y 72°C-5 minutos se repitió 25 veces. Finalmente, se llevó a cabo una reacción a 72 °C durante 5 minutos. El fragmento de ADNc amplificado se clonó en pCR2.1 (Invitrogen) y la secuencia de nucleótidos del mismo se determinó utilizando un Analizador de Secuencias ABI3100. Como un resultado, las secuencias de nucleótidos 5' y 3' , las cuales fueron completamente diferentes de la secuencia como se muestra en MX_497642, se obtuvieron (SEQ ID NO: 9) . Se diseñaron los siguientes cebadores utilizando la información de la secuencia de nucleótidos obtenida por RACE: h29B140_SaII-Kozac_F: cgcgtcgacGCCACCATGATCCCTAAGCTGCTTTCCCTC (SEQ ID NO: 51) h29B140_NotI-R: cgcgcggccgcCTAGCGCATGCTACCCTTGGCAGC (SEQ ID NO: 52) . Con estos cebadores, se llevó a cabo la PCR utilizando un ADNc de hebra sencilla sintetizado del ARN total de médula ósea utilizando un kit de PCR de ARN (TARARA) como una plantilla. La PCR se llevó a cabo en una solución de reacción con la siguiente composición (5 µ? de tampón 10 x, 4 µ? de 2.5 m de dNTP, 0.5 µ? de polimerasa Pyrobest (TARARA), 0.5 µ? de cada uno de los cebadores de 100 µ?, 1 µ? de ADNc, 2.5 µ? de DMSO, y 36 µ? de agua destilada). Para tal PCR, después del tratamiento a 94 °C durante 5 minutos, un ciclo de reacción que consiste de 94°C-30 segundos, 65°C-30 segundos y 72°C-5 minutos se repitió 35 veces. Finalmente, se llevó a cabo una reacción de 72 °C durante 2 minutos. El ADNc amplificado se clonó en pBlueScriptII SR(+) (Stratagene) , y la secuencia de nucleótidos del mismo se determinó entonces utilizando un Analizador de Secuencias ABI3100. La secuencia de nucleótidos obtenida del ADNc hTARM fue idéntica a la secuencia determinada por RACE (SEQ ID NO: 9) . La secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 10) codificada por el ADNc de hTARM tuvo una secuencia de señales necesaria para funcionar como una proteina de membrana celular en la N-terminal de la misma. La hTARC y la secuencia de aminoácidos codificada por XM_497642 (LOC441864), tuvo diferentes N-terminal y C- terminal. Por consiguiente, se reveló que tal secuencia de ADNc putativa, XM_497642, estimada a partir de la secuencia del genoma no existió realmente, y que el ADNc de hTARM fue un gen real que codifica la proteina hTARM de membrana celular (Figura 19) .

[Ejemplo 9] Preparación de un anticuerpo contra TARM humana (1) Preparación de células que expresan TARM humana Se preparó un vector de expresión genética TARM humano al insertar el ADNc de hTARM obtenido en el Ejemplo 8 en un vector de expresión pMXII IRES EGFP (Oncogene (2000) 19 (27) : 3050-3058) . Se preparó el retrovirus recombinante como sigue. Se suspendieron células 293/EBNA-l (Invitrogen) de 3 x 106 células en un medio (D-MEM/10% de FBS) y se colocaron en plato de cultivo, y se cultivaron en un incubador de C02 durante 24 horas. Al día siguiente, el medio se cambió con uno fresco, y una solución de transfección preparada como se describe posteriormente se agregó entonces al mismo, de manera que se llevó a cabo la transfección. Se preparó la solución de transfección agregando 600 µ? de OPTI-MEM (GIBCO BRL) y 24 µ? de TransIT LTl (TaKaRa) dentro de un tubo de 5ml para mezclarlos, incubando entonces la mezcla a temperatura ambiente durante 5 minutos, y agregando entonces 9 ug de un vector de expresión y 9 ug de pCL-Eco (Imgenex) utilizado como un vector de envasado a la mezcla de reacción, seguido al incubar la mezcla a temperatura ambiente durante 5 minutos. 48 horas después, se recuperó el sobrenadante del cultivo, y la filtración se llevó a cabo entonces en un filtro de 0.45 µ??, de manera que se obtiene una solución de virus recombinante . Se infectaron células B300.19 con este virus recombinante como se describe posteriormente, de manera que se preparan células que expresan hTARM. Se agregaron células 1 x 106 B300.19 a un tubo de 15 mi, y se centrifugaron entonces a 1200 rpm a 25°C durante 5 minutos. Más adelante, el sobrenadante de cultivo se desechó por aspiración. Una solución obtenida al agregar 2 µ? de polibreno (10 mg/ml) y 2 µ? de 55 µ? de 2-mercaptoetanol a 2 mi de la solución del virus recombinante se agregó a las células. La mezcla obtenida se centrifugó entonces a 2500 rpm a 30°C durante 2 horas, de manera que las células se infectaron con el virus recombinante. Después de terminar la infección, la solución de virus recombinante se desechó, y un medio (RPMI-1640/10% de FBS/55 µ? de 2-mercaptoetanol) se agregó a la misma, seguida por cultivo. Se separaron las células positivas EGFP por clasificación celular, de manera que se obtienen las células que expresan hTARM. (2) Preparación de la proteina quimérica fusionada a la región extracelular hTARM a SEAP o Fe La región extracelular de hTARM se amplificó por PCR utilizando ADNc de longitud total de hTARM como una plantilla y utilizando también un cebador 5' agregado a Salí (h29B140_SalI-Kozac_F: cgcgtcgacGCCACCATGATCCCTAAGCTGCTTTCCCTC (SEQ ID NO: 51)) y un cebador 3' agregado a Notl (h29B140_NotI_SEAP_R: gcgggcggccgcACCCAGGGAGTAGTTGCTCGATGT (SEQ ID NO: 53)). Se llevó a cabo la PCR en una solución de reacción con la siguiente composición (5 µ? de tampón 10 x, 4 µ? de 2.5 mM de dNTP, 0.5 µ? de polimerasa Pyrobest (TAKARA) , 0.5 µ? de cada uno de los cebadores de 100 µ?, 1 µ? de ADNc, 2.5 µ? de DMSO, y 36 µ? de agua destilada) . Para tal PCR, después del tratamiento a 94 °C durante 5 minutos, un ciclo de reacción que consiste de 94°C-30 segundos, 65°C-30 segundos y 72°C-5 minutos se repitió 35 veces. Finalmente, se llevó a cabo una reacción de 72 °C durante 2 minutos. El ADNc amplificado se clonó en pBlueScriptII SK(+) ( Stratagene ) , y la secuencia de nucleótidos del mismo se confirmó entonces utilizando un Analizador de Secuencias ABI3100. El fragmento de ADNc obtenido se digirió con Salí y Notl, y luego se insertó dentro del vector pcDNA3.1 ( + ) -SEAP (His ) i0-Neo descrito en el Ejemplo 2, de manera que se prepara un vector de expresión hTARM-AP. Por consiguiente, la región extracelular hTARM se fusionó a través del enlazador de tres aminoácidos (Ala-Ala-Ala) a una fosfatasa alcalina de placenta humana de tipo secretor que tiene una etiqueta de histidina 10 (His)io en la C-terminal de la misma que se expresa como una proteina quimérica secretora (más adelante referida como una proteina quimérica AP) . El vector de expresión de la proteina quimérica AP obtenido se introdujo en células 293/EBNA-l utilizando TransIT LTl (TAKARA) y se cultivaron entonces durante 4 ó 5 días. Más adelante, se recuperó el sobrenadante de cultivo por centrifugación, y la proteina quimérica AP secretada en el sobrenadante se filtró entonces con un filtro de 0.22 µp. Más adelante, se agregaron Hepes (pH 7.4) y azida de sodio al mismo a concentraciones finales de 20 mM y 0.02% respectivamente y el producto obtenido se almacenó a 4°C. La concentración de la proteina quimérica AP se calculó al medir la actividad de la fosfatasa alcalina utilizando un ensayo de gen reportero quimioluminiscente (ICN) Aurora AP . (3) Preparación de un anticuerpo monoclonal contra hTARM Para uso como un antigeno en inmunización, primero se purificó la proteina quimérica hTARM-AP. Se llevó a cabo tal purificación utilizando la etiqueta histidina existente en la C-terminal de la proteina quimérica AP y utilizando el kit His Trap (Amersham Biosciences) . Se agregó un sobrenadante del cultivo que contiene la proteina quimérica hTARM-AP a una columna HP HiTrap de 1 mi (Amersham Biosciences) , seguida por lavado con una solución de imidazol de 10 mM. Más adelante, la proteina hTARM-AP se eluyó desde la columna utilizando una solución de imidazol de 500 mM. La concentración de la proteina quimérica hTARM-AP se calculó por la medición de la actividad enzimática utilizando un ensayo de gen reportero quimioluminiscente (ICN) Aurora AP y por cuantificación de proteínas utilizando el kit II de Ensayo de Proteínas (BIO-RAD) . Subsecuentemente, se utilizó la proteína quimérica hTARM-AP obtenida como un antígeno, y se inmunizaron ratones Balb/c con la proteína antes mencionada por Kohjin Bio Co., Ltd. Los linfocitos se aislaron de los ratones inmunizados, y los linfocitos aislados se mezclaron entonces con células de mieloma P3U1. Más adelante, se llevó a cabo la fusión celular por un método de PEG. Al utilizar un sobrenadante de cultivo de los hibridomas obtenidos, se llevó a cabo la selección por ELISA con una proteína quimérica hTARM-Fc. Se llevó a cabo la clonación a partir de pozos positivos, y 6 tipos de clones se obtuvieron (#11, #18, #19, #22, #26 y #40) . Como un resultado de analizar la especificidad por FACS, se encontró que todos los clones reaccionaron sólo con las células B300.19 que expresan hTARM y que no reaccionaron con células B300.19 parentales. Los hibridomas que producen los anticuerpos #11, #18, #19, #22, #26 y #40 monoclonales anti-hTARM se inocularon dentro de la cavidad peritoneal de un ratón desnudo, y la ascitis se obtuvo de los mismos. Más adelante, se purificaron los anticuerpos utilizando una columna de Proteina A.

[Ejemplo 10] Adhesión de células T humanas activadas a la proteina recombinante hTARM Se recolectó sangre periférica humana utilizando heparina, y se agregó a la misma Ficoll-Paque PLUS (Amersham Biosciences) en una cantidad igual de la sangre periférica humana, y se aislaron las células monoclonales por centrifugación de gradiente de densidad a 400 x g durante 30 minutos. Las células aisladas se suspendieron en un tampón MACS (PBS/1% de FBS/2 mM de EDTA) , y la solución de bloqueo FcR (Miltenyi) se agregó a células 5 µ?/l x 107 a la suspensión. La mezcla obtenida se hizo reaccionar a 4°C durante 15 minutos. El kit de aislamiento CD25 + CD4+ Treg humano (Miltenyi) y un Auto MACS se utilizaron para obtener células T CD4+ en reposo. Se agregaron un anticuerpo CD25 anti-humano de ratón etiquetado con PE (Miltenyi) y un anticuerpo CD4 anti-humano de ratón etiquetado con FITC (Miltenyi) , cada uno en una cantidad de 1/11 de la solución, a las células CD4+ que se habían purificado con MACS. Se hicieron reaccionar entonces a 4°C durante 20 minutos. Más adelante, se utilizó FACS Aria (BD Biosciences) para obtener células T CD4+ CD25-. Se activaron las células T CD4+ CD25-utilizando el Kit de Activación/Expansión de células T humanas (Miltenyi) . 3 días después del estimulo, se agregó IL-2 humano (2 ng/ml) a las células. Al utilizar células positivas CD4 activadas obtenidas en el sexto y octavo días después del estimulo, se analizó la posibilidad de la función de la proteina quimérica hTARM-AP como una molécula de adhesión a las células T activadas. Primero, se agregó 50 µ? de un anticuerpo de fosfatasa anti-alcalina (10 pg/ml) (Seradyn) a cada pozo de una placa de ELISA de 96 pozos (Nunc) y se incubaron a 37°C durante 30 minutos para inmovilización. Después de lavar con PBS, un sitio de enlace no especifico se bloqueo con Block Ace (Dainippon Pharma Co., Ltd.) . Se agregó una proteina quimérico AP (1 nM) a cada pozo y se incubó a temperatura ambiente durante 30 minutos para inmovilización. Se suspendieron las células T activadas en un tampón de adhesión celular (RPMI1640/0.5% de BSA/20 mM de HEPES/55 nM de 2ME (pH 7.4)), seguido por el etiquetado de fluorescencia con Calcein-AM (Dojindo Laboratories). Más adelante, se agregaron células 5 x 104 a cada pozo y luego se incubaron a 37 °C durante 1 hora. Se eliminaron las células no adheridas al lavar, y un tampón de lisis celular (10 mM de Tris-HCl (pH 8.0) /1% de TritonX-100) se agregó entonces a las mismas. Más adelante, la medición se llevó a cabo en una longitud de onda de excitación de 485 nm y una longitud de onda de detección de 535 nm utilizando allac ARVO SX 1420 MULTILABEL COUNTER (Perkin Elmer) y las células adheridas se cuantificaron . Con respecto al nivel de adhesión celular, la relación de las células adheridas a las células agregadas se expresó como un porcentaj e . Como un resultado, se reveló que la hTARM funciona como una molécula de adhesión para las células T humanas activadas (Figura 20).

[Ejemplo 11] Actividad de adhesión-inhibición celular del anticuerpo anti-TARM Se analizó el efecto de los anticuerpos anti-TARM en la adhesión celular de las células T humanas activadas para la hTARM. Se agregó una proteina quimérica AP a cada pozo y luego se incubó a temperatura ambiente durante 30 minutos para inmovilización. Más adelante, cada uno de los anticuerpos de 10 µq/ml anti-hTARM (#11, #18, #19, #22, #26 y #40) se agregó a cada pozo y se pre-trató a temperatura ambiente durante 30 minutos./*/* Más adelante, se agregaron al mismo, células T activadas fluorescentemente etiquetadas, y se analizó la actividad de adhesión celular en la presencia de cada anticuerpo. Se observará que un anticuerpo anti-IgG2a se utilizó como un control para #11, #19, #26 y #40, y que un anticuerpo anti-IgG2b se utilizó como un control para #18 y #22. Como un resultado, se encontró que la adhesión de las células T activadas a la proteina quimérica hTARM-AP se suprimió notablemente en la presencia de anticuerpos #18, #19, #22 y #26 anti-hTAR , y que la supresión parcial de tal adhesión se observó en la presencia de anticuerpos #11 y #40 anti-hTARM (Figura 20) .

[Ejemplo 12] Identificación del ligando mTARM-L novedoso para mTARM (1) Selección de moléculas candidatas mTARM-L (Ligando mTARM) Se presentan moléculas de enlace mTARM en células T activadas (Ejemplo 5) . De este modo, la presencia o la ausencia de las moléculas de enlace mTARM en lineas celulares derivadas de células inmunes de ratón (L5178Y-R, BW5147 y Raw264.7) se analizó por el método descrito en el Ejemplo 5. Como un resultado, se reveló que las moléculas de enlace mTARM se expresaron fuertemente en las células L5178Y-R, pero se expresaron difícilmente en las células BW5147 y las células Raw264.7 (Figura 21A) . Subsecuentemente, suponiendo que un ligando desconocido para el mTARM que pertenece a la superfamilia de las inmunoglobulinas (IgSF), se buscó la base de datos de Mouse Ensemble. Poniendo atención a 47 candidatos IgSF, la expresión en células inmunes se examinó por PCR de tiempo real. El ARN total se aisló de las células L5168Y-R, las células BW5147, y las células RAw264.7 utilizando un mini kit RNeasy (Qiagen, Hilden, Alemania) . La PCR de tiempo real se llevó a cabo en la presencia de SYBR-green utilizando un Sistema de Detección de Secuencia ABI7700 (PE Applied-Biosystems ) . Como un resultado, la expresión de ARNm de ENSMUSG00000035095 (A530065I17Rik, N _176953) (utilizando el cebador #2558: CAGCTGGCAAGAGGAACAGT (SEQ ID NO: 54) y el cebador #2559: GAGCATCGGCACTTATCTCC (SEQ ID NO: 55)) mostró una correlación con la actividad de enlace de la proteina quimérica mTAR -AP a las células (Figura 22B) . Sin embargo, no existió una región de transmembrana en una secuencia codificada por ENSMUSG00000035095, y de este modo, no se consideró que funcionara como una proteina de membrana celular. Esta secuencia de aminoácido fue una secuencia putativa, y de este modo se consideró que la estimación de la secuencia de ADNc a partir de la secuencia genómica fue incorrecta. Por lo tanto, se intentó primero identificar un producto genético homólogo humano. Al utilizar una secuencia de aminoácidos codificada por ENSMUSG00000035095, se llevó a cabo la búsqueda de base de datos. Como un resultado, una secuencia de aminoácidos humano LOC196264 que muestra una homología elevada con la secuencia de aminoácido codificada por ENSMUSG00000035095 se descubrió. Esta secuencia de aminoácidos relacionada a una proteína de membrana celular contiene una región de estructura de bucle de inmunoglobulina . Por consiguiente, se consideró que LOC196264 fue la secuencia de aminoácido humana de longitud total de un candidato TARM-L. Subsecuentemente, al utilizar la secuencia de aminoácidos de LOC196264, la búsqueda de tblastn se llevó a cabo a través de la base de datos. Como un resultado, una región que codifica una secuencia que muestra homología con la secuencia de aminoácidos de LOC196264 se descubrió en la secuencia genómica de nucleótidos del clon BAC AC122305 de ratón. La secuencia de ADNc y la secuencia de aminoácidos de un candidato TARM-L de ratón se estimaron de esta secuencia, de manera que los siguientes cebadores se diseñaron y que el ADNc que codifica una proteína de longitud total se aisló. #2693: CGCGTCGACGCCACCATGCAGCTGGCAAGAGGAACAGTA (SEQ ID NO: 56) #2694: GCGGGCGGCCGCTCAGTACGCCTCTTCTTCGTAGTC (SEQ ID NO: 57) Se utilizó el ARN total de Thl el día 2 como una plantilla, y el ADNc se amplificó por el método descrito en el Ejemplo 1. El ADNc amplificado se insertó en un vector de expresión pMXII IRES EGFP (Oncogene (2000) 19(27): 3050-3058), y un vector de expresión de gen candidato mTARM-L se preparó también. El Analizador de Secuencias ABI3100 se utilizó para determinar la secuencia de nucleótidos del mismo (SEQ ID NO: 13) . (2) Identificación de mTARM-L Enseguida, con el fin de examinar si o no el candidato mTARM-L fue un ligando desconocido para células TARM, en las cuales esta molécula se expresó, se prepararon por el método descrito en el Ejemplo 2. La actividad de enlace de la proteina quimérica mTARM-AP sobre la superficie celular de las células que expresan el candidato mTARM-L y la actividad de adhesión de las células que expresan el candidato mTARM-L al mTARM inmovilizada se midió por el método descrito en el Ejemplo 5. Como un resultado, el mTARMAP se enlazó específicamente a las células B300.19 que expresan EGFP+mTARM-L, pero no se enlazó a las células B300.19, dentro de las cuales el vector control EGFP+ había sido introducido (Figura 22A) . La AP utilizada como un control negativo no se enlazó a las células B300.19 que expresan EGFP+ mTARM-L (Figura 22A) . Además, se examinó la actividad de adhesión de las células B300.19 que expresa mTARM-L a AP y la proteína quimérica mTARM-AP. Como un resultado, se encontró que la célula antes mencionada se adhirió únicamente a la proteína quimérica mTARM-AP (Figura 22B) . De este modo, los resultados anteriores demostraron que la molécula candidato mTAR -L fue realmente un ligando novedoso para TAR . Este ligando fue nombrado como mTARM-L (Ligando TARM) . Con respecto a hTARM-L, los siguientes cebadores se diseñaron con base en la secuencia de nucleótidos de NM_198275 que codifica la secuencia de aminoácidos de LOC196264, y se aisló el ADNc que codifica la proteina de longitud total. #2721: CGCGTCGACGCCACCATGCAGCAGAGAGGAGCAGCTGGA (SEQ ID NO: 58) #2722: GCGGGCGGCCGCTCAATATGTCTCTTCATAGTCTGA (SEQ ID NO: 59) Al utilizar el ARN total de médula ósea como una plantilla, el ADNc se amplificó por el método descrito en el Ejemplo 1. Se insertó el ADNc amplificado dentro de un vector de expresión pMXII IRES EGFP (Oncogene (2000) 19(27): 3050-3058) para preparar el vector de expresión genética TARM-L y la secuencia de nucleótidos del mismo (SEQ ID NO: 15) se determinó entonces utilizando un Analizador de Secuencias ABI3100. Se sometieron TARM-L de humanos y- de ratón a análisis de homología con ClustalW. Los resultados se muestran en la Figura 23. El hTARM-L consistió de 235 aminoácidos, y el mTARM-L consistió de 237 aminoácidos. Tienen 86% de homología. Por otro lado, mTARM m3 (293 aminoácidos) mostró la homología más elevada con el hTARM (271 aminoácidos) en un porcentaje de 50% (Figura 24).

Claims (31)

1. REIVINDICACIONES 1. Una membrana o proteína secretora, que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2, la SEQ ID NO: 4, la SEQ ID NO: 6 o la SEQ ID NO: 8, o una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2, la SEQ ID NO: 4, la SEQ ID NO: 6 o la SEQ ID NO: 8, la cual contiene una o más sustituciones conservadoras.
2. 2. Una membrana o proteína secretora seleccionada de los siguientes (i), (ii) , (iii) e (iv) : (i) una membrana o proteína secretora que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 10; (ii) una membrana o proteína secretora la cual comprende una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 10, en la cual uno o más aminoácidos se insertan, sustituye o elimina, o uno o más aminoácidos se agregan a uno o ambos extremos, y la cual es funcionalmente equivalente a una proteína que consiste de la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 10; (iii) una membrana o proteína secretora la cual se codifica por un polinucleótido el cual hibridiza bajo condiciones rigurosas a un polinucleótido el cual codifica la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 10, y el cual es funcionalmente equivalente a una proteína que consiste de la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 10; y (iv) una membrana o proteína secretora la cual comprende una secuencia de aminoácidos que tiene 90% o más identidad con la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 10, y la cual es funcionalmente equivalente a una proteina que consiste de la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 10.
3. 3. Un polinucleótido que codifica una membrana o proteina secretora de acuerdo con la reivindicación 1.
4. 4. Un polinucleótido de acuerdo con la reivindicación 3, que comprende la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 1, la SEQ ID NO: 3, la SEQ ID NO: 5 o la SEQ ID NO: 7.
5. 5. Un polinucleótido que codifica una membrana o proteina secretora de acuerdo con la reivindicación 2.
6. 6. Un polinucleótido seleccionado de los siguientes (v) , (vi), (vii) y (viii) : (v) un polinucleótido que comprende la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 9; (vi) un polinucleótido el cual comprende una secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 9, en la cual uno o más nucleótidos se insertan, sustituyen o eliminan, o uno o más nucleótidos se agregan a uno o ambos extremos, y el cual codifica una membrana o proteina secretora funcionalmente equivalente a una proteina que consiste de la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 10. (vii) un polinucleótido el cual hibridiza bajo condiciones rigurosas con un polinucleotido que comprende la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 9, y el cual codifica una membrana o proteina secretora funcionalmente equivalente a una proteina que consiste de la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 10; y (viii) un polinucleotido el cual tiene 90% o más de identidad con un polinucleotido que comprende la secuencia de nucleótido de la SEQ ID NO: 9, y el cual codifica una membrana o proteina secretora funcionalmente equivalente a una proteina que consiste de la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 10.
7. 7. Un anticuerpo contra una membrana o proteina secretora seleccionado de los siguientes (ix) , (x) , (xi) y (xii) , o un fragmento funcional del mismo: (ix) una membrana o proteina secretora que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2, la SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, la SEQ ID NO: 8, la SEQ ID NO: 10 o la SEQ ID NO: 12; (x) una membrana o proteina secretora la cual comprende una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2, la SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, la SEQ ID NO: 8, la SEQ ID NO: 10 o la SEQ ID NO: 12 en la cual uno o más aminoácidos se insertan, sustituyen o eliminan, o uno o más aminoácidos se agregan a uno o ambos extremos, y la cual es funcionalmente equivalente a una proteina que consiste de la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2, la SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, la SEQ ID NO: 8, la SEQ ID NO: 10 o la SEQ ID NO: 12; (xi) una membrana o proteina secretora la cual se codifica por un polinucleótido el cual hibridiza bajo condiciones rigurosas a un polinucleótido el cual codifica la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2, la SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, la SEQ ID NO: 8, la SEQ ID NO: 10 o la SEQ ID NO: 12, y la cual es funcionalmente equivalente a una proteina que consiste de la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2, la SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, la SEQ ID NO: 8, la SEQ ID NO: 10 o la SEQ ID NO: 12; y (xii) una membrana o proteina secretora la cual comprende una secuencia de aminoácidos que tiene 70% o más de identidad con la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2, la SEQ ID NO: 4, la SEQ ID NO: 6, la SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10 o la SEQ ID NO: 12, y la cual es funcionalmente equivalente con una proteina que consiste de la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2, la SEQ ID NO: 4, la SEQ ID NO: 6, la SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10 o la SEQ ID NO: 12.
8. 8. Un anticuerpo o un fragmento funcional del mismo de acuerdo con la reivindicación 7, el cual es un anticuerpo contra una proteina de membrana o una proteina secretora de acuerdo con la reivindicación 1 ó 2, o un fragmento funcional del mismo.
9. 9. Un anticuerpo o un fragmento funcional del mismo de acuerdo con la reivindicación 8, el cual es un anticuerpo contra una membrana o proteina secretora que comprende una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 10, o una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 10, la cual contiene una o más sustituciones conservadoras, o un fragmento funcional del mismo .
10. 10. Un anticuerpo o un fragmento funcional del mismo de acuerdo con la reivindicación 7, el cual es un anticuerpo contra una membrana o proteina secretora seleccionado de los siguientes (ix' ) , (x' ) , (xi' ) y (xii' ) o un fragmento funcional del mismo: (ix' ) una membrana o proteina secretora que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 12; (x' ) una membrana o proteina secretora la cual comprende una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 12 en la cual uno o más aminoácidos se inserta, sustituye o elimina, o uno o más aminoácidos se agregan a uno o ambos de los extremos, y la cual es funcionalmente equivalente a una proteina que consiste de la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 12. (xi' ) una membrana o proteina secretora la cual se codifica por un polinucleótido el cual hibridiza bajo condiciones rigurosas a un polinucleótido el cual codifica la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 12, y la cual es funcionalmente equivalente a una proteina que consiste de la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 12; y (xii' ) una membrana o proteina secretora la cual comprende una secuencia de aminoácidos que tiene 70% o más de identidad con la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 12, y la cual es funcionalmente equivalente a una proteina que consiste de la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 12.
11. 11. Un anticuerpo o un fragmento funcional del mismo de acuerdo con la reivindicación 10, el cual es un anticuerpo contra una membrana o proteina secretora que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 12, o una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 12, el cual contiene una o más sustituciones conservadoras, o un fragmento funcional del mismo.
12. 12. Un anticuerpo o un fragmento funcional del mismo de acuerdo con la reivindicación 11, el cual se produce por un hibridoma depositado bajo el No. de acceso FERM BP-10376.
13. 13. Un hibridoma depositado bajo el No. de acceso FERM BP-10376. 14. Una proteina selecciona de los siguientes (xiii) , (xiv) , (xv) y (xvi) : (xiii) una proteina que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 14 o la SEQ ID NO: 16; (xiv) una proteína la cual comprende una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 14 o la SEQ ID NO: 16, en la cual uno o más aminoácidos se insertan, sustituyen o eliminan, o uno o más aminoácidos se agregan a uno o ambos extremos, y la cual es funcionalmente equivalente a una proteina que consiste de la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 14 o la SEQ ID NO: 16; (xv) una proteina la cual se codifica por un polinucleotido el cual hibridiza bajo condiciones rigurosas a un polinucleotido el cual codifica la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 14 o la SEQ ID NO: 16, y el cual es funcionalmente equivalente a una proteina que consiste de la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 14 o la SEQ ID NO : 16; y (xvi) una proteina la cual comprende una secuencia de aminoácidos que tiene 70% o más de identidad con la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 14 o la SEQ ID NO: 16, y la cual es funcionalmente equivalente a una proteina que consiste de la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 14 o la SEQ ID NO: 16. 15. Un polinucleotido que codifica una proteina de acuerdo con la reivindicación
14. 14. 16. Un polinucleotido seleccionado de los siguientes (xvii) , (xviii) , (xix) y (xx) : (xvii) un polinucleotido que comprende una secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 13 o la SEQ ID NO:
15. 15; (xviii) un polinucleótido el cual comprende una secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 13 o la SEQ ID NO: 15, en la cual uno o más nucleótidos se insertan, sustituyen o eliminan, o uno o más nucleótidos se agregan a uno o ambos extremos, y los cuales codifican una proteina funcionalmente equivalente a una proteina que consiste de la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 14 o la SEQ ID NO: 16; (xix) un polinucleótido el cual hibridiza bajo condiciones rigurosas con un polinucleótido que comprende la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 13 o la SEQ ID NO: 15; y el cual codifica una proteina funcionalmente equivalente a una proteina que consiste de la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 14 o la SEQ ID NO: 16; y (xx) un polinucleótido el cual tiene 70% o más de identidad con un polinucleótido que comprende la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 13 o la SEQ ID NO: 15, y el cual codifica una proteina funcionalmente equivalente a una proteina que consiste de la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 14 o la SEQ ID NO:
16. 16.
17. 17. Un anticuerpo contra una proteina de acuerdo con la reivindicación 14, o un fragmento funcional del mismo.
18. 18. El uso de un anticuerpo o un fragmento funcional del mismo de acuerdo con cualquiera de una de las reivindicaciones 7 a 12 y 17 en la elaboración de un medicamento para tratar una enfermedad autoinmune.
19. 19. El uso de la reivindicación 18 para el tratamiento de artritis reumatoide.
20. 20. El uso de un anticuerpo o un fragmento funcional del mismo de acuerdo con cualquiera de una de las reivindicaciones 7 a 12 y 17 en la elaboración de un medicamento para inhibir la adhesión de células T.
21. 21. Un método para seleccionar una sustancia que inhibe la adhesión de una célula T a una proteina TARM o una sal del mismo, o un solvato del mismo, el cual comprende las etapas de: (a) poner en contacto una célula T con una proteina TARM en la presencia o la ausencia de una sustancia de prueba; y (b) medir la actividad de enlace de una célula T a la proteína TARM, en donde la proteína TARM es una membrana o una proteína secretora seleccionada de los siguientes (ix) , (x) , (xi) y (xii) : (ix) una membrana o proteína secretora que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2, la SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, la SEQ ID NO: 8, la SEQ ID NO: 10 o la SEQ ID NO: 12; (x) una membrana o proteína secretora la cual comprende una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2, la SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, la SEQ ID NO: 8, la SEQ ID NO: 10 o la SEQ ID NO: 12 en la cual uno o más aminoácidos se insertan, sustituyen o eliminan, o uno o más aminoácidos se agregan a uno o ambos extremos, y la cual es funcionalmente equivalente a una proteina que consiste de la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2, la SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, la SEQ ID NO: 8, la SEQ ID NO: 10 o la SEQ ID NO: 12; (xi) una membrana o proteina secretora la cual se codifica por un polinucleótido el cual hibridiza bajo condiciones rigurosas a un polinucleótido el cual codifica la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2, la SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, la SEQ ID NO: 8, la SEQ ID NO: 10 o la SEQ ID NO: 12, y la cual es funcionalmente equivalente a una proteina que consiste de la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2, la SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, la SEQ ID NO: 8, la SEQ ID NO: 10 o la SEQ ID NO: 12; y (xii) una membrana o proteina secretora la cual comprende una secuencia de aminoácidos que tiene 70% o más de identidad con la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2, la SEQ ID NO: 4, la SEQ ID NO: 6, la SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10 o la SEQ ID NO: 12, y la cual es funcionalmente equivalente con una proteina que consiste de la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2, la SEQ ID NO: 4, la SEQ ID NO: 6, la SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10 o la SEQ ID NO: 12.
22. 22. El método de selección de acuerdo con la reivindicación 21, el cual comprende además la etapa de (c) comparar la actividad de enlace en la presencia de una sustancia de prueba con la actividad de enlace en la ausencia de una sustancia de prueba, después de la etapa (b) .
23. 23. El método de selección de acuerdo con la reivindicación 21 ó 22, en donde la célula T es una célula T activada .
24. 24. El método de selección de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 21 a 23, en donde la célula T activada es una célula Th2 activada.
25. 25. Un método para seleccionar una sustancia que inhibe la activación de una célula dendritica o una sal del mismo, o un solvato del mismo, el cual comprende las etapas de : (d) poner en contacto un anticuerpo o un fragmento funcional del mismo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 7 a 12 con una célula dendritica en la presencia o la ausencia de una sustancia de prueba; y (e) medir el nivel de activación de la célula dendritica .
26. 26. El método de selección de acuerdo con la reivindicación 25, en donde, en la etapa (e) , el nivel de activación de la célula dendritica se mide utilizando la cantidad de IL-6 y/o MCP-1 producida de la célula dendritica como un índice.
27. 27. El método de selección de acuerdo con la reivindicación 26, el cual comprende además la etapa de (f-1) comparar la cantidad de IL-6 y/o MCP-1 producida en la presencia de una sustancia de prueba con la cantidad de IL-6 y/o MCP-1 producida en la ausencia de una sustancia de prueba, después de la etapa (e) .
28. 28. El método de selección de acuerdo con la reivindicación 25, en donde, en la etapa (e) , el nivel de activación de una célula dendrítica se mide utilizando el nivel de expresión de la cadena FcRy en la célula dendrítica como un índice.
29. 29. El método de selección de acuerdo con la reivindicación 28, el cual comprende además la etapa de (f-2) comparar el nivel de expresión de la cadena FcRy en la presencia de una sustancia de prueba con el nivel de expresión de la cadena FcRy en la ausencia de una sustancia de prueba, después de la etapa (e) .
30. 30. Un método para seleccionar una sustancia que inhibe una formación compleja entre una proteína TARM y la cadena FcRy o una sal del mismo, o un solvato del mismo, el cual comprende las etapas de: (g) poner en contacto un anticuerpo o un fragmento funcional del mismo de acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones 7 a 12, con una célula dendrítica en la presencia o la ausencia de al menos una sustancia de prueba; y (h) medir el nivel de expresión de la cadena FcRy en la célula dendritica, en donde la proteina TARM es una membrana o una proteina secretora seleccionada de los siguientes (ix), (x) , (xi) y (xii) : (ix) una membrana o proteina secretora que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2, la SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, la SEQ ID NO: 8, la SEQ ID NO: 10 o la SEQ ID NO: 12; (x) una membrana o proteina secretora la cual comprende una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2, la SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, la SEQ ID NO: 8, la SEQ ID NO: 10 o la SEQ ID NO: 12 en la cual uno o más aminoácidos se insertan, sustituyen o eliminan, o uno o más aminoácidos se agregan a uno o ambos extremos, y la cual es funcionalmente equivalente a una proteina que consiste de la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2, la SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, la SEQ ID NO: 8, la SEQ ID NO: 10 o la SEQ ID NO: 12; (xi) una membrana o proteina secretora la cual se codifica por un polinucleótido el cual hibridiza bajo condiciones rigurosas a un polinucleótido el cual codifica la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2, la SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, la SEQ ID NO: 8, la SEQ ID NO: 10 o la SEQ ID NO: 12, y la cual es funcionalmente equivalente a una proteina que consiste de la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2, la SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, la SEQ ID NO: 8, la SEQ ID NO: 10 o la SEQ ID NO: 12; y (xii) una membrana o proteina secretora la cual comprende una secuencia de aminoácidos que tiene 70% o más de identidad con la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2, la SEQ ID NO: 4, la SEQ ID NO: 6, la SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10 o la SEQ ID NO: 12, y la cual es funcionalmente equivalente con una proteina que consiste de la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2, la SEQ ID NO: 4, la SEQ ID NO:' 6, la SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10 o la SEQ ID NO: 12.
31. 31. El método de selección de acuerdo con la reivindicación 30, el cual comprende además la etapa de (i) comparar el nivel de expresión de la cadena FcRy en la presencia de una sustancia de prueba con el nivel de expresión de la cadena FcRy en la ausencia de una sustancia de prueba, después de la etapa (h) .