WO2021029318A1 - 免疫チェックポイント阻害剤、免疫チェックポイント関連疾患の治療剤、免疫抑制剤、抗フィブロネクチン抗体又はその誘導体、フィブロネクチンアナログ、フィブロネクチンまたはその部分タンパク質を検出するためのキット、及びフィブロネクチンまたはその部分タンパク質を検出する方法 - Google Patents

免疫チェックポイント阻害剤、免疫チェックポイント関連疾患の治療剤、免疫抑制剤、抗フィブロネクチン抗体又はその誘導体、フィブロネクチンアナログ、フィブロネクチンまたはその部分タンパク質を検出するためのキット、及びフィブロネクチンまたはその部分タンパク質を検出する方法 Download PDF

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高井　俊行
匡範 乾
ミジ ソ
章太 遠藤
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Definitions

  • the present invention relates to immune checkpoint inhibitors, therapeutic agents for immune checkpoint-related diseases, immunosuppressants, anti-fibronectin antibodies or derivatives thereof, fibronectin analogs, kits for detecting fibronectin or partial proteins thereof, and fibronectin or parts thereof. It relates to a method for detecting a protein.
  • the present application claims priority based on Japanese Patent Application No. 2019-148423 filed in Japan on August 13, 2019, the contents of which are incorporated herein by reference.
  • An immune checkpoint inhibitor is an immune checkpoint molecule that suppresses the immune response to itself and binds to an immune checkpoint molecule or its ligand that suppresses an excessive immune response, thereby inhibiting the transmission of immunosuppressive signals. It is a drug that releases the suppression of T cell activation by checkpoint molecules.
  • LILRB4 Leukocyte Ig-like receptor B4, hereinafter also referred to as B4
  • B4 an immunosuppressive receptor for an unknown ligand. It has been found that an inflammatory disease can be determined (Patent Document 1).
  • Non-Patent Documents 1 to 3 Recently, CD166, ApoE, Angptls and the like have been reported as ligands for LILRB4 (Non-Patent Documents 1 to 3). However, the proof that these are physiological ligands is not sufficient.
  • Fibronectin (hereinafter, also referred to as FN) is an extracellular matrix (hereinafter, also referred to as ECM), a glycoprotein of about 259 kDa present on the cell surface and in body fluids. Fibronectin is divided into 6 regions (domains) by treatment with the proteolytic enzyme thermolysin. These are based on their specific molecular binding ability. Fibrin / heparin binding region (Fibrin / Heparin binding-FN), 2. Collagen binding-FN, 3. Heparin binding region (Heparin binding-FN), 4. 4. Cell / integrin binding region (cell / integrin-binding-domine (CBD) -FN), 5. Second heparin binding region (second Heparin binding-FN), 6.
  • ECM extracellular matrix
  • thermolysin a glycoprotein of about 259 kDa present on the cell surface and in body fluids. Fibronectin is divided into 6 regions (domains) by treatment with the proteolytic enzyme thermolysin. These
  • FN is composed of a plurality of domains having different binding abilities to physiological molecules. So far, in some autoimmune diseases such as systemic lupus erythematosus (SLE) and rheumatoid arthritis (RA), fluctuations in FN concentration in plasma and body fluid (for example, joint fluid) have been observed. , Domain analysis for evaluating FN fragmentation using a monoclonal antibody has been reported to be useful for disease diagnosis or severity evaluation (Non-Patent Documents 4 to 6).
  • the Fibrin / Heparin binding-FN concentration was 24 ⁇ 12 ⁇ g / ml (p ⁇ 0.003) for SLE and 36 ⁇ 22 ⁇ g / ml (p ⁇ 0) for RA in comparison with healthy subjects (61 ⁇ 18 ⁇ g / ml). It is 0.0002) and is expected to be used for diagnosis.
  • FN promotes the metastatic ability and infiltration ability of lung cancer cell lines (Non-Patent Document 7).
  • Non-Patent Document 7 Non-Patent Document 7
  • the present invention relates to immune checkpoint inhibitors, therapeutic agents for immune checkpoint-related diseases, immunosuppressants, anti-fibronectin antibodies or derivatives thereof, fibronectin analogs, kits for detecting fibronectin or partial proteins thereof, and fibronectin or parts thereof. It is an object of the present invention to provide a method for detecting a protein.
  • the present inventors have found that the physiological ligand of LILRB4 is fibronectin, which is one of the major constituent proteins of ECM, identifies the target sequence of LILRB4 in fibronectin, and inhibits the binding between this target sequence and fibronectin.
  • the present invention has been completed by finding that the substance is useful as an immune checkpoint inhibitor, a therapeutic agent for immune checkpoint-related diseases, and an immunosuppressive agent.
  • the present invention includes the following aspects. [1] An immune checkpoint inhibitor containing a substance that inhibits the binding of fibronectin to the immunosuppressive receptor LILRB4 as an active ingredient.
  • the substance that inhibits the binding of fibronectin to the immunosuppressive receptor LILRB4 is an anti-fibronectin antibody or a derivative thereof, an anti-immunosuppressive receptor LILRB4 antibody or a derivative thereof, or a fibronectin analog, [1] or The immune checkpoint inhibitor according to [2].
  • fibronectin analog is a peptide according to any one of the following (a) to (c).
  • A A peptide containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1.
  • B In the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, one to several amino acids contain an amino acid sequence deleted, inserted, substituted or added, and with respect to the fibronectin binding site of the immunosuppressive receptor LILRB4.
  • fibronectin A therapeutic agent for an immune checkpoint-related disease containing a substance that inhibits the binding of the immunosuppressive receptor LILRB4 as an active ingredient. [7] The therapeutic agent according to [6], wherein the fibronectin binds to the immunosuppressive receptor LILRB4 via the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 in the fibronectin.
  • the substance that inhibits the binding between fibronectin and the immunosuppressive receptor LILRB4 is an anti-fibronectin antibody or a derivative thereof, an anti-immunosuppressive receptor LILRB4 antibody or a derivative thereof, or a fibronectin analog, [6] or The therapeutic agent according to [7].
  • the therapeutic agent according to [8], wherein the anti-fibronectin antibody or a derivative thereof binds to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 in fibronectin.
  • the therapeutic agent according to [8], wherein the fibronectin analog is a peptide according to any one of the following (a) to (c). (A) A peptide containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1.
  • the therapeutic agent according to any one of [6] to [10], wherein the immune checkpoint-related disease is selected from the group consisting of autoimmune diseases, cancers, inflammatory diseases, and allergic diseases.
  • a therapeutic agent for an immune checkpoint-related disease containing a substance that activates the immunosuppressive receptor LILRB4 as an active ingredient.
  • the substance that activates the immunosuppressive receptor LILRB4 is an anti-fibronectin antibody or a derivative thereof, an anti-immunosuppressive receptor LILRB4 antibody or a derivative thereof, or a fibronectin or a fibronectin analog, according to [13].
  • Therapeutic agent. [15] The therapeutic agent according to [14], wherein the fibronectin analog is a peptide according to any one of the following (a) to (c).
  • A A peptide containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1.
  • B In the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, one to several amino acids contain an amino acid sequence deleted, inserted, substituted or added, and with respect to the fibronectin binding site of the immunosuppressive receptor LILRB4. Peptides with binding ability,
  • C A peptide containing an amino acid sequence having 80% or more identity in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 and having a binding ability to the fibronectin binding site of the immunosuppressive receptor LILRB4 [16].
  • the therapeutic agent according to any one of [13] to [15], wherein the immune checkpoint-related disease is a bone disease.
  • the substance that activates the immunosuppressive receptor LILRB4 is an anti-fibronectin antibody or a derivative thereof, an anti-immunosuppressive receptor LILRB4 antibody or a derivative thereof, or a fibronectin or a fibronectin analog, according to [17].
  • Immunosuppressant. [19] The immunosuppressant according to [18], wherein the fibronectin analog is a peptide according to any one of the following (a) to (c). (A) A peptide containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1.
  • a fibronectin analog in which any one of the following peptides (a) to (c) and the Fc region of immunoglobulin G are fused.
  • A A peptide containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1.
  • B In the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, one to several amino acids contain an amino acid sequence deleted, inserted, substituted or added, and with respect to the fibronectin binding site of the immunosuppressive receptor LILRB4.
  • Peptides with binding ability (C) In the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, a peptide containing an amino acid sequence having 80% or more identity and having a binding ability to the fibronectin binding site of the immunosuppressive receptor LILRB4 [22] [ 20] A kit for detecting fibronectin or a partial protein thereof, which comprises the anti-fibronectin antibody or derivative thereof and contains the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 contained in a biological sample. [23] A method for detecting fibronectin or a partial protein thereof in a biological sample using the kit according to [22].
  • immune checkpoint inhibitors therapeutic agents for immune checkpoint-related diseases, immunosuppressants, anti-fibronectin antibodies or derivatives thereof, fibronectin analogs, kits for detecting fibronectin or partial proteins thereof, and fibronectin or A method for detecting the partial protein can be provided.
  • B4 left, PD-1 (center), Tim-3 (right) in activation stimulation of mouse wild-type CD8-positive T cells (upper) and B4-deficient CD8-positive T cells (lower) with anti-CD3 antibody / anti-CD28 antibody ) Is analyzed over time (day 0-3) by flow cytometry.
  • the vertical axis shows the proportion of cells when the peak value of the histogram is 100%, and the horizontal axis shows the histogram of each measurement day shown by the fluorescence intensity (protein expression intensity).
  • the solid line shows the result of staining with each antigen-specific antibody, and the gray without solid line shows the result of staining with the isotype control antibody.
  • B4 left), PD-1 (center), Tim-3 (right) in activation stimulation of mouse wild-type CD4-positive T cells (upper) and B4-deficient CD4-positive T cells (lower) with anti-CD3 antibody / anti-CD28 antibody ) Is analyzed over time (day 0-3) by flow cytometry.
  • the vertical axis shows the proportion of cells when the peak value of the histogram is 100%, and the horizontal axis shows the histogram of each measurement day shown by the fluorescence intensity (protein expression intensity).
  • the solid line shows the result of staining with each antigen-specific antibody, and the gray without solid line shows the result of staining with the isotype control antibody.
  • the results of the analysis are shown in (eyes).
  • the vertical axis represents the expression intensity of PD-1
  • the horizontal axis represents the expression intensity of B4
  • the lower left area separated by a cross is PD-1 negative B4 negative
  • the upper left area is PD-1 alone positive
  • the upper right area is PD.
  • the -1 positive B4 positive and the lower right area represent PD-1 negative B4 positive, respectively.
  • the results of evaluating the FN-B4 binding inhibitory effect of an anti-FN30 monoclonal antibody by the proportion of GFP-expressing cells of B4-GFP reporter cells in co-culture of human MSC and B4-GFP reporter cells are shown.
  • the vertical axis of the plot shows the cell size
  • the horizontal axis shows the fluorescence intensity of GFP
  • the numerical values in the plot show the percentage (%) of GFP-positive cells (in the frame).
  • the bar graph shows the percentage of GFP-positive cells when treated with each antibody.
  • the results of staining mouse bone marrow-derived mesenchymal stem cells and human bone marrow-derived mesenchymal stem cells with an anti-FN30 monoclonal antibody and analyzing them with a flow cytometer are shown.
  • the solid line shows the result of staining with the anti-FN30 monoclonal antibody, and the gray without the solid line shows the result of staining with the isotype control antibody.
  • Anti-FN30 monoclonal antibody No. 5 is used to stain a mouse cancer cell line (upper row) and a human cancer cell line (lower row), and the results of analysis with a flow cytometer are shown.
  • the solid line shows the result of staining with the anti-FN30 monoclonal antibody, and the gray without the solid line shows the result of staining with the isotype control antibody.
  • the result of analyzing the expression of is with a flow cytometer is shown.
  • the vertical axis represents the expression intensity of PD-1
  • the horizontal axis represents the expression intensity of B4
  • the lower left area separated by a cross is PD-1 negative B4 negative
  • the upper left area is PD-1 alone positive
  • the upper right area is PD.
  • the -1 positive B4 positive and the lower right area represent PD-1 negative B4 positive, respectively.
  • B4 and PD-1 for CD4-positive T cells infiltrating into tumors formed by ingesting B16F10 cell lines (upper two) and 3LL cell lines (lower, three) into wild-type mice The result of analyzing the expression of is with a flow cytometer is shown.
  • the vertical axis represents the expression intensity of PD-1
  • the horizontal axis represents the expression intensity of B4
  • the lower left area separated by a cross is PD-1 negative B4 negative
  • the upper left area is PD-1 alone positive
  • the upper right area is PD.
  • the -1 positive B4 positive and the lower right area represent PD-1 negative B4 positive, respectively.
  • the results of protein detection by Western blotting using an anti-fibronectin antibody in a human plasma sample are shown.
  • the upper row shows the fibronectin concentration [A ( ⁇ g / ml)] detected by the anti-FN30 monoclonal antibody, and the lower row shows the fibronectin concentration [B ( ⁇ g / ml)] detected by the anti-FN44 antibody.
  • a boxplot showing the first, second, and third quartiles and the maximum and minimum values of the full-length fibronectin molecule and the concentration of the fibronectin 24 kDa fragment in healthy human plasma using an anti-FN monoclonal antibody is shown. .. The left shows the full-length molecular concentration of fibronectin, and the right shows the concentration of the fibronectin 24 kDa fragment.
  • mice The results of intraperitoneal administration of control IgG or FN30-Fc to BXSB / Yaa mice and measurement of anti-dsDNA IgG level in serum are shown.
  • results of intraperitoneal administration of control IgG or anti-gp49B monoclonal antibody H1.1 to BXSB / Yaa mice and measurement of anti-dsDNA IgG level in serum are shown.
  • results of H & E staining of the lung surface 30 days after injecting Lewis lung carcinoma cells (LLC) into wild-type (WT) B6 mice and gp49B-deficient mice through the tail vein are shown.
  • WT indicates the result of wild-type mouse
  • gp49B ⁇ / ⁇ indicates the result of gp49B deficient mouse.
  • Lewis lungg carcinoma cells are injected from the tail vein into wild-type (WT) B6 mice and gp49B-deficient mice, and the quantitative results of the number of metastatic lesions in the lung after 30 days are shown.
  • the results of H & E staining of the liver 30 days after injection of Lewis lung carcinoma cells (LLC) into wild-type (WT) B6 mice and gp49B-deficient mice from the tail vein are shown.
  • WT indicates the result of wild-type mouse
  • gp49B ⁇ / ⁇ indicates the result of gp49B deficient mouse.
  • Lewis lungg carcinoma cells are injected from the tail vein into wild-type (WT) B6 mice and gp49B-deficient mice, and the quantification results of the number of metastatic lesions in the liver after 30 days are shown.
  • the results of H & E staining of the lung surface after 20 days by injecting mouse melanoma cells B16F10 from the tail vein into wild-type (WT) B6 mice and gp49B-deficient mice are shown.
  • WT indicates a wild-type mouse
  • gp49B ⁇ / ⁇ indicates a gp49B-deficient mouse.
  • the results of H & E staining of the liver after 20 days by injecting mouse melanoma cells B16F10 into wild-type (WT) B6 mice and gp49B-deficient mice through the tail vein are shown.
  • WT indicates a wild-type mouse
  • gp49B ⁇ / ⁇ indicates a gp49B-deficient mouse.
  • the results of adoption of wild-type mouse bone marrow cells or gp49B-deficient mouse bone marrow cells are shown.
  • the left shows the results of H & E staining of the lung (upper) and liver (lower), and the right shows the number of metastases in the lung (upper) and liver (lower).
  • WT-R indicates a wild-type mouse
  • gp49B ⁇ / ⁇ ⁇ R indicates a gp49B-deficient mouse.
  • control isotype IgG antibody, anti-PD-1 monoclonal antibody, anti-gp49B monoclonal antibody, or combination of anti-PD-1 monoclonal antibody and anti-gp49B monoclonal antibody It is a figure which showed the metastatic state of the lung and the liver of the mouse which developed the B16F10 tumor by administration.
  • the upper row shows tumor nodules in the lung, and the lower row shows H & E stained images of the liver.
  • control isotype IgG antibody, anti-PD-1 monoclonal antibody, anti-gp49B monoclonal antibody, or combination of anti-PD-1 monoclonal antibody and anti-gp49B monoclonal antibody It is a graph comparing the number of tumor nodules in the lungs in each antibody-treated group.
  • control isotype IgG antibody, anti-PD-1 monoclonal antibody, anti-gp49B monoclonal antibody, or combination of anti-PD-1 monoclonal antibody and anti-gp49B monoclonal antibody It is a graph which compared the number of B16F10 metastasis to the liver in each antibody treatment group.
  • the results of induction of differentiation of bone marrow cells into osteoclasts by addition of 6 are shown.
  • the photograph shows a TRAP-stained image of osteoclasts, and the graph shows the differentiation induction rate by each antibody addition.
  • Mock shows the case where no antibody is added.
  • the TRAP stained image of osteoclasts when the anti-LILRB4 monoclonal antibody ZM4.1 (right figure) or mouse IgG1 ⁇ (left figure) is added is shown.
  • the results of inducing osteoclast differentiation from bone marrow cells of wild-type B6 mice or gp49B-deficient mice are shown.
  • the left photo shows osteoclasts differentiated from bone marrow cells of wild-type B6 mice, and the right photo shows TRAP-stained images of osteoclasts differentiated from bone marrow cells of gp49B-deficient mice.
  • the graph shows the differentiation induction rate when osteoclasts are induced to differentiate from bone marrow cells of wild-type B6 mice and bone marrow cells of gp49B-deficient mice, respectively.
  • WT indicates wild-type B6 mice
  • gp49B ⁇ / ⁇ and KO indicate gp49B deficient mice.
  • a TRAP-stained image of osteoclasts in the femur of wild-type B6 mice and gp49B-deficient mice is shown.
  • the left figure shows a TRAP-stained image of osteoclasts of a wild-type B6 mouse and the right figure shows a gp49B-deficient mouse.
  • the immune checkpoint inhibitor of the present invention contains a substance that inhibits the binding of fibronectin to the immunosuppressive receptor LILRB4 as an active ingredient.
  • Fibronectin can bind to LILRB4 via the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 in the fibronectin. That is, the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 is the target sequence in fibronectin of LILRB4.
  • the substance that inhibits the binding between fibronectin and LILRB4 is not particularly limited as long as it is a substance having an activity that inhibits the binding between fibronectin and LILRB4, but is an anti-fibronectin antibody or its derivative, an anti-LIRB4 antibody or its derivative, and fibronectin. Examples include analog.
  • the anti-fibronectin antibody may be either a monoclonal antibody or a polyclonal antibody as long as it is an antibody that reacts with fibronectin, but a monoclonal antibody is preferably used.
  • the antibody can be prepared by a well-known method. For example, mice, rats, hamsters, rabbits, goats, sheep, chickens and the like are used as immunized animals for the production of polyclonal antibodies.
  • Antiserum can be obtained from serum after the antigen is administered subcutaneously, intradermally, peritoneally or the like in an animal once or multiple times. When a protein or peptide is used as an antigen, immunization of a mixture with a replacement fluid having an immunostimulatory effect is more preferable.
  • monoclonal antibodies for the production of monoclonal antibodies, known methods for producing monoclonal antibodies, such as Kamei Nagamune and Hiroshi Terada, “Monclonal Antibody” Hirokawa Shoten (1990), and Jame W. It can be produced according to Golding, "Monoclonal Antibody", 3rd edition, Academic Press, 1996. Monoclonal antibodies can also be prepared by the DNA immunization method, such as Nature 1992 Mar12; 356 152-154 and J. Mol. It can be produced with reference to Immunol Methods Mar 1; 249 147-154.
  • fibronectin or a partial fragment (peptide) thereof, or a vector incorporating a cDNA encoding fibronectin or a partial fragment thereof can be used.
  • a peptide containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 which is the target sequence of LILRB4 in fibronectin.
  • a fibronectin vector which is a construct containing a gene encoding a peptide containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, can be used as an optimal immune antigen gene.
  • the DNA immunization method uses any of a variety of gene transfer methods (eg, intramuscular injection, electroporation, gene gun, etc.) into an immunized animal, either alone or in combination with the above gene constructs. It can be carried out by injecting it subcutaneously into a rat or the like and incorporating it into cells.
  • gene transfer methods eg, intramuscular injection, electroporation, gene gun, etc.
  • the anti-fibronectin monoclonal antibody can be produced by a method of culturing a hybridoma prepared according to a conventional method and separating it from the culture supernatant, or a method of administering the hybridoma to a mammal compatible with the hybridoma and collecting it as ascites.
  • the anti-fibronectin monoclonal antibody can also be produced by using a known gene recombination technique. Specifically, the monoclonal antibody produced by the hybridoma produced above and the gene encoding the antibody are cloned, a vector containing the gene is prepared, and this is introduced into a host cell to transform it.
  • It can be prepared by obtaining a cell expressing a fibronectin antibody and culturing the cell.
  • the cells, vector type, cell type, culture conditions, etc. used for this preparation are within the technical scope of those skilled in the art, and appropriate conditions can be set as appropriate.
  • the antibody can be used after purifying it as needed.
  • Examples of the method for purifying and isolating the antibody include conventionally known methods such as salting out such as ammonium sulfate precipitation method, gel filtration method such as Sephadex, ion exchange chromatography method, and affinity purification method using a protein A column. Be done.
  • the derivative of the anti-fibronectin antibody examples include a fusion protein or fusion containing the anti-fibronectin antibody F (ab') 2 , F (ab) 2 , Fab', Fab, Fv, scFv, variants thereof, and an antibody moiety thereof. Peptides and the like can be mentioned.
  • the derivative of the anti-fibronectin antibody can be produced according to a known method for producing an antibody derivative.
  • the anti-fibronectin antibody or its derivative binds to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 in fibronectin or a partial sequence thereof.
  • the anti-fibronectin antibody or a derivative thereof inhibits the binding between fibronectin and LILRB4 by binding to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 in fibronectin or a partial sequence thereof. Can be done.
  • the anti-LILRB4 antibody either a monoclonal antibody or a polyclonal antibody may be used as long as it is an antibody that binds to LILRB4, but a monoclonal antibody is preferably used.
  • the anti-LIRB4 antibody can be prepared by the same method as the anti-fibronectin antibody.
  • the antigen used for producing the anti-LILRB4 antibody a vector incorporating a LILRB4 protein, a partial fragment (peptide) thereof, or a cDNA encoding the LILRB4 protein can be used.
  • the full-length LILRB4 vector which is a structure containing the human LILRB4 full-length gene, is the optimal immune antigen gene, but in addition, a part of the LILRB4 sequence is inserted.
  • the construct can also be used as an immune antigen gene.
  • the region of LILRB4 (fibronectin binding site) in which the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, which is the target sequence of LILRB4 in fibronectin, binds to LILRB4 is preferable.
  • the DNA immunization method uses any of a variety of gene transfer methods (eg, intramuscular injection, electroporation, gene gun, etc.) into an immunized animal, either alone or in combination with the above gene constructs. It can be carried out by injecting it subcutaneously into a rat or the like and incorporating it into cells.
  • Purification of the anti-LIRB4 antibody can be performed by the same method as that of the anti-fibronectin antibody.
  • the derivative of the anti-LILRB4 antibody include a fusion protein containing F (ab') 2 , F (ab) 2 , Fab', Fab, Fv, scFv, variants thereof, and an antibody portion of the anti-LILRB4 antibody. Examples include fusion peptides.
  • the anti-LILRB4 antibody or a derivative thereof can inhibit fibronectin from binding to LILRB4 via the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 in fibronectin.
  • Inhibition of the binding of fibronectin to LILRB4 can be performed by evaluating the inhibition of the binding of fibronectin to cells expressing LILRB4.
  • the cells expressing LILRB4 are not particularly limited as long as they are cells expressing LILRB4, but for example, spleen cells, peripheral blood leukocytes, bone mast cells, or B cells isolated from them, traits. Examples thereof include cells, monocytes / macrophages, dendritic cells, eosinophils, eosinophils, neutrophils, mast cells, activated T cells and the like.
  • LILRB4 The nucleotide sequence and amino acid sequence of LILRB4 can be known from the database provided by the National Center for Biotechnology Information (NCBI).
  • NCBI National Center for Biotechnology Information
  • LILRB4 for example, Entrez GeneID is 11006 (as of June 17, 2019)
  • RefSeq ProteinID is NP_001265355.2, NP_0012653556.2, NP_001265357.2, NP_001265358. (Equivalent to ⁇ 5).
  • Examples of the mouse (Mus musculus) LILRB4 include GeneID 14728 (as of June 24, 2016) and NP_030560.1.
  • LILRB4 As the rat (Rattus norvegicus) LILRB4, the GeneID is 292594 (as of April 18, 2019). , RefSeq ProteinID is NP_001013916, and it is known that other animals also have LILRB4. Not limited to the above LILRB4, other LILRB4s are also included in the LILRB4 in the present invention.
  • the nucleotide sequence and amino acid sequence of fibronectin can be obtained from the database provided by the National Center for Biotechnology Information (NCBI).
  • NCBI National Center for Biotechnology Information
  • Entrez GeneID is 2335
  • RefSeq ProteinID is NP_997647, NP_001352447, XP_005246463 and the like.
  • GeneID is 14268
  • rat Rostus norvegicus
  • GeneID is 25661
  • RefSeq ProteinID is NP_062016
  • other animals are also known to have fibronectin. .. Not limited to the above fibronectin, other fibronectins are also included in the fibronectin in the present invention.
  • Fibronectin binds to LILRB4 present on the cell surface of plasma cells, T cells, macrophages, etc. via the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 in the fibronectin, and activates an immune checkpoint molecule.
  • LILRB4 expresses an immunosuppressive function by binding to fibronectin via the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 in fibronectin.
  • the fibronectin analog includes any fibronectin analog as long as it has an action of inhibiting the binding between fibronectin and LILRB4, and for example, any one of the following (a) to (c).
  • the identity of the amino acid sequence is 80% or more, preferably 85% or more, more preferably 90% or more, further preferably 95% or more, still more preferably 98% or more.
  • the number of deletions, substitutions or additions of the above amino acid sequence is preferably 1 to 5, more preferably 1 to 4, further preferably 1 to 3, and even more preferably 1 to 2.
  • Amino acid sequence identity can be determined by BLAST search provided on the GenBank database.
  • the fibronectin analog may be a fibronectin analog in which any one of the peptides (a) to (c) and the Fc region of immunoglobulin G are fused.
  • the fibronectin analog can be produced by a known method, for example, a gene recombination technique.
  • the immune checkpoint inhibitor of the present invention contains a substance that inhibits the binding between fibronectin and LILRB4 as an active ingredient, and may further contain a pharmaceutically acceptable carrier or additive.
  • carriers and additives include pharmaceutically acceptable organic solvents such as water, saline, phosphate buffer, dextrose, glycerol, ethanol, collagen, polyvinyl alcohol, polyvinylpyrrolidone, carboxyvinyl polymer, sodium carboxymethyl cellulose, etc.
  • pharmaceutically acceptable organic solvents such as water, saline, phosphate buffer, dextrose, glycerol, ethanol, collagen, polyvinyl alcohol, polyvinylpyrrolidone, carboxyvinyl polymer, sodium carboxymethyl cellulose, etc.
  • Sodium polyacrylate sodium alginate, water-soluble dextran, sodium carboxymethyl starch, pectin, methyl cellulose, ethyl cellulose, xanthan gum, gum arabic, casein, agar, polyethylene glycol, diglycerin, glycerin, propylene glycol, vaseline, paraffin, stearyl alcohol , Steeric acid, human serum albumin, mannitol, sorbitol, lactose, surfactants and the like, but are not limited thereto.
  • the immune checkpoint inhibitor of the present invention can be in various forms, such as liquids (eg, injections), dispersants, suspensions, tablets, pills, powders, suppositories and the like.
  • a preferred embodiment is an injection, which is preferably administered parenterally (eg, intravenously, transdermally, intraperitoneally, intramuscularly).
  • the immune checkpoint inhibitor of the present invention can be used as a therapeutic agent for immune checkpoint-related diseases.
  • the dose of the immune checkpoint inhibitor of the present invention is, for example, 0.025 to 50 mg / kg, preferably 0.1 to 50 mg / kg, more preferably 0.1 to 25 mg / kg, still more preferably 0. It can be 1-10 mg / kg or 0.1-3 mg / kg, but is not limited to this.
  • the therapeutic agent for immune checkpoint-related diseases of the present invention contains a substance that inhibits the binding between fibronectin and LILRB4 as an active ingredient.
  • the substance that inhibits the binding between fibronectin and LILRB4 is not particularly limited as long as it is a substance having an activity that inhibits the binding between fibronectin and LILRB4, but is an anti-fibronectin antibody or its derivative, an anti-LIRB4 antibody or its derivative, and fibronectin. Examples include analog. Examples of the anti-fibronectin antibody or its derivative, the anti-LILRB4 antibody or its derivative, and the fibronectin analog include those described above.
  • the immune checkpoint-related disease is not particularly limited as long as it is a disease in which the immune checkpoint molecule LILRB4 is involved, but for example, autoimmune disease, cancer, inflammatory disease, allergic disease and the like. Can be mentioned.
  • Autoimmune diseases include, for example, Graves' disease, rheumatoid arthritis, Hashimoto thyroiditis, type 1 diabetes, systemic lupus erythematosus, vasculitis, Addison's disease, polymyositis, dermatomyositis, psoriasis, Sjogren's syndrome, systemic lupus, Examples include glomerulonephritis.
  • cancer include lung cancer, colon cancer, renal cancer, malignant melanoma, Hodgkin lymphoma, head and neck cancer, pancreatic cancer, liver cancer, prostate cancer, osteosarcoma, leukemia and the like.
  • the cancer may be primary or metastatic, but is preferably used for metastatic cancer.
  • Inflammatory diseases include, for example, systemic erythematosus, dermatomyositis, Kawasaki disease, psoriasis, herpes zoster, chronic obstructive pulmonary disease (COPD), bronchial asthma, atopic dermatitis, rheumatoid arthritis, antiphospholipid antibody syndrome, and multiple occurrences.
  • COPD chronic obstructive pulmonary disease
  • Dermatomyositis vasculitis syndrome, Schegren's syndrome, Bechet's disease, Basedou's disease, Hashimoto's disease, myocarditis, aortitis syndrome, ulcerative colitis, Crohn's disease, primary biliary cirrhosis, autoimmune hepatitis, autoimmune pancreatitis, Examples thereof include polysclerosis, severe myasthenia, Gillan Valley syndrome, glomerulonephritis, ANCA-related nephritis, amyloidosis, TINU syndrome, irritable pneumonia, eosinophilia pneumonia, and sarcoidosis.
  • Allergic diseases include allergic rhinitis, bronchial asthma, urticaria / atopic dermatitis, herpes zoster, chronic obstructive pulmonary disease (COPD), allergic conjunctivitis, food allergy, anaphylaxis, autoimmune hematopoietic anemia, and thrombocytopenia.
  • COPD chronic obstructive pulmonary disease
  • Granulocytopenia a progressive hemorrhagic jaundice
  • serum disease irritable pneumonia
  • lupus nephritis chronic glomerulonephritis
  • systemic lupus erythematosus contact dermatitis
  • Hashimoto disease Hashimoto disease
  • Bechet's disease rejection after organ transplantation and grafts Anti-host disease (GVHD) and the like
  • GVHD Anti-host disease
  • the therapeutic agent for immune checkpoint-related diseases of the present invention may contain a substance that activates LILRB4 as an active ingredient.
  • the substance that activates LILRB4 is not particularly limited as long as it is a substance that activates LILRB4 by binding to LILRB4, but for example, an anti-fibronectin antibody or a derivative thereof, an anti-fibronectin antibody or a derivative thereof, fibronectin or Examples thereof include fibronectin analogs.
  • Examples of the anti-fibronectin antibody or derivative thereof, anti-LILRB4 antibody or derivative thereof, fibronectin or fibronectin analog include those described above, and the immune checkpoint-related diseases containing a substance that activates LILRB4 of the present invention as an active ingredient.
  • the anti-fibronectin antibody or derivative thereof, the anti-LILRB4 antibody or derivative thereof, fibronectin or fibronectin analog activates LILRB4 by binding to LILRB4 and expresses the immunosuppressive function of LILRB4.
  • the immune checkpoint-related disease is a disease that has a therapeutic effect by suppressing immune function by activating LILRB4. If this is the case, there is no particular limitation, and examples thereof include bone diseases such as rheumatoid arthritis, marble bone disease, and osteoporosis.
  • the substance that activates LILRB4 of the present invention can treat bone diseases, for example, by suppressing the proliferation of osteoclasts.
  • the therapeutic agent for immune checkpoint-related diseases of the present invention may further contain a pharmaceutically acceptable carrier or additive.
  • Pharmaceutically acceptable carriers and additives include those described above.
  • the therapeutic agent for immune checkpoint-related diseases of the present invention can be in various forms such as liquid (for example, injection), dispersant, suspension, tablet, pill, powder, suppository and the like.
  • a preferred embodiment is an injection, which is preferably administered parenterally (eg, intravenously, transdermally, intraperitoneally, intramuscularly).
  • the dose of the therapeutic agent for immune checkpoint-related diseases of the present invention is, for example, 0.025 to 50 mg / kg, preferably 0.1 to 50 mg / kg, more preferably 0.1 to 25 mg / kg, and further. It can preferably be 0.1 to 10 mg / kg or 0.1 to 3 mg / kg, but is not limited to this.
  • the immunosuppressant of the present invention contains a substance that activates LILRB4 as an active ingredient.
  • the substance that activates LILRB4 include those mentioned in the therapeutic agents for immune checkpoint-related diseases.
  • an anti-fibronectin antibody or a derivative thereof, an anti-fibronectin antibody or a derivative thereof, fibronectin or a fibronectin analog binds to LILRB4 to obtain LILRB4. It activates and expresses the immunosuppressive function of LILRB4.
  • the immunosuppressant of the present invention can be applied to transplantation medicine.
  • the immunosuppressive agent of the present invention may further contain a pharmaceutically acceptable carrier or additive.
  • Pharmaceutically acceptable carriers and additives include those described above.
  • the immunosuppressive agent of the present invention can be in various forms, for example, a liquid (for example, an injection), a dispersant, a suspension, a tablet, a pill, a powder, a suppository, or the like.
  • a preferred embodiment is an injection, which is preferably administered parenterally (eg, intravenously, transdermally, intraperitoneally, intramuscularly).
  • the dose of the immunosuppressive agent of the present invention is, for example, 0.025 to 50 mg / kg, preferably 0.1 to 50 mg / kg, more preferably 0.1 to 25 mg / kg, still more preferably 0.1. It can be up to 10 mg / kg or 0.1 to 3 mg / kg, but is not limited to this.
  • the kit for detecting fibronectin or a partial peptide thereof of the present invention contains an anti-fibronectin antibody or a derivative thereof that binds to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 and detects the fibronectin or a partial peptide thereof in a biological sample.
  • the biological sample is not particularly limited, and examples thereof include blood, saliva, urine, cerebrospinal fluid, bone marrow fluid, pleural effusion, ascites, joint fluid, tear fluid, aqueous humor, vitreous fluid, and lymph fluid.
  • the partial peptide of fibronectin is not particularly limited as long as it binds to an anti-fibronectin antibody or a derivative thereof, but is a partial peptide having a molecular weight of 24 kDa including the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1. Is preferable.
  • the kit of the present invention contains other components necessary for the detection of fibronectin, such as a reaction buffer and a reaction vessel. be able to.
  • fibronectin or a partial peptide thereof in a biological sample can be detected.
  • an anti-fibronectin antibody or a derivative thereof that binds to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 is included, and fibronectin or a partial peptide thereof is detected in the biological sample. If possible, there is no particular limitation, but it is preferable to measure by an immunological method using the anti-fibronectin antibody or a derivative thereof.
  • Immunological methods include, for example, immunostaining (Western blot), enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), sandwich ELISA, immunoprecipitation, immunoturbidimetric method (TIA or LTIA), enzyme immunoassay, chemoluminescence immunoassay, fluorescence. It can be carried out by subjecting it to an immunoassay, a flow cytometry method, or the like and detecting a band or spot or peak that matches the molecular weight of fibronectin or a partial peptide thereof, but is not limited thereto.
  • Example 1 Expression of LILRB4 in mouse T cells
  • Anti-mouse CD3 antibody (manufactured by BD Bioscience, Clone: 145-2C11, # 553058) and anti-mouse CD28 antibody (BD) on a 48-well plate (manufactured by Thermo, # 150687).
  • gp49B is a molecule homologous to human LILRB4 in mice.
  • Suspended spleen cells were seeded in antibody-coated wells at a concentration of 1 ⁇ 10 6 cells / 200 ⁇ L / well and cultured at 37 ° C. under 5% carbon dioxide conditions for 0 to 3 days.
  • Cells are harvested from wells, suspended in PBS (-) buffer containing 2% bovine fetal serum and 0.05% sodium azide (# S8032, manufactured by Sigma) and labeled with FITC under ice temperature conditions.
  • Anti-mouse CD4 antibody (BioLegend, Clone: GK1.5, # 100406), Alexa647-labeled anti-mouse CD8a antibody (BD Biosciences, Clone: 53-6.7, # 557882), PE-labeled anti-mouse gp49A / B Antibodies (BioLegend, Clone: H1.1, # 144904), BV421-labeled anti-mouse PD-1 antibody (BioLegend, Clone: 29F.1A12, # 135218), PerCP-Cy5.5-labeled anti-mouse Tim-3 (BioLegend, Clone: B8.2C12, # 134012), PE-labeled Armenian hamster IgG (BioLegend, Clone: HTK888, # 400908) as an isotype control antibody, BV421-labeled rat IgG2a (BioLegend, Clone: RT) , # 400549), PerCP-Cy5.5 label
  • FIG. 1 shows the expression of B4, PD-1, and Tim-3 in mouse naive CD8-positive T cells.
  • FIG. 1 shows the expression of B4, PD-1, and Tim-3 in mouse naive CD8-positive T cells.
  • PD-1 expression was slightly observed, but B4 and Tim-3 expression were not observed.
  • deficiency of B4 did not affect the expression of PD-1 and Tim-3.
  • FIG. 2 shows the expression of B4, PD-1, and Tim-3 after stimulation with anti-CD3 antibody / anti-CD28 antibody in mouse CD8-positive T cells.
  • the expression of PD-1 on mouse CD8-positive T cells was almost maximized on the first day by activation stimulation with anti-CD3 antibody / anti-CD28 antibody, but B4 and Tim-3.
  • the expression increased slightly on the first day and reached a maximum after the second day, suggesting that the expression was regulated differently from that of PD-1.
  • activation stimulation with anti-CD3 antibody / anti-CD28 antibody did not affect PD-1 expression, but Tim-3 expression was attenuated.
  • FIG. 3 shows the expression of B4, PD-1, and Tim-3 in mouse naive CD4 positive T cells.
  • FIG. 3 shows the expression of B4, PD-1, and Tim-3 in mouse naive CD4 positive T cells.
  • FIG. 4 shows the expression of B4, PD-1, and Tim-3 after stimulation with anti-CD3 antibody / anti-CD28 antibody in mouse CD4-positive T cells.
  • the expression of PD-1 on mouse CD4-positive T cells was almost maximized on the first day by activation stimulation with anti-CD3 antibody / anti-CD28 antibody, but B4 and Tim-3.
  • the expression increased slightly on the first day and reached its maximum after the second day, suggesting that the expression was regulated differently from that of PD-1.
  • activation stimulation with anti-CD3 antibody / anti-CD28 antibody did not affect the expression of PD-1, but attenuated the expression of Tim-3.
  • FIG. 5 shows the expression of B4 and PD-1 in mouse CD8-positive T cells and CD4-positive T cells after stimulation with anti-CD3 antibody / anti-CD28 antibody.
  • FIG. 5 shows the expression of B4 and PD-1 in mouse CD8-positive T cells and CD4-positive T cells after stimulation with anti-CD3 antibody / anti-CD28 antibody.
  • PD-1 expression increased first, then B4 expression increased later, and PD-1 and B4 2 It was confirmed that the cells became heavily positive cells.
  • B4 is an immune checkpoint molecule expressed in mouse T cells and different from PD-1 and Tim-3.
  • Example 2 Expression of LILRB4 in human T cells
  • Anti-human CD3 antibody (BD Bioscience, Clone: UCHT1, # 555329) and anti-human CD28 antibody (BD Bioscience) on a 48-well plate (Thermo, # 150687). , Clone: CD28.2, # 555725), each containing 100 ⁇ L of PBS (-) buffer at a concentration of 10 ⁇ g / mL, coating the wells for 30 minutes at room temperature, and then 3 times with 500 ⁇ L PBS (-) buffer. The wells were washed.
  • Frozen human peripheral blood mononuclear cells (manufactured by CTL) are rapidly thawed in a warm bath at 37 ° C., 10% bovine fetal serum, 50 ⁇ M 2-mercaptoethanol, 1% penicillin (5000 U / ml) / streptomycin ( After suspending in RPMI-1640 medium (Sigma, # R8755) containing a solution of 5000 ⁇ g / mL and 20 U / ml DNase I (Sigma, # D5025) and culturing overnight, the cells were collected and Naive Pan.
  • T cells were purified using T cell Isolation Kit, human (manufactured by Miltenyi, # 130-097-095) and suspended in a DNase I-free medium having the above composition. Suspended T cells were seeded in antibody-coated wells at a concentration of 1 ⁇ 10 6 cells / 200 ⁇ L / well and cultured at 37 ° C. under 5% carbon dioxide conditions for 0 to 3 days. The cells were harvested from the wells, suspended in PBS (-) buffer containing 2% bovine fetal serum and 0.05% sodium azide, and under ice temperature conditions, FITC-labeled anti-human CD4 antibody (BioLegend).
  • FIG. 6 shows the expression of B4, PD-1, and Tim-3 after stimulation with anti-CD3 antibody / anti-CD28 antibody in human CD8-positive T cells and CD4-positive T cells.
  • FIG. 6 shows that in human CD8-positive T cells and CD4-positive T cells, no expression of B4, PD-1, or Tim-3 was observed without stimulation (day 0). However, an increase in B4 expression was observed as in PD-1 and Tim-3 by activation stimulation with anti-CD3 antibody / anti-CD28 antibody. From the above results, it was clarified that B4 is an immune checkpoint molecule expressed in human T cells and different from PD-1 and Tim-3.
  • Example 3 Analysis of binding site of fibronectin to LILRB4 Human fibronectin is translated from various mRNA isoforms transcribed from a single gene located at 2q35, and generally contains a signal peptide of 26 residues. It consists of 2240 to 2843 amino acid residues. Fibronectin exists as a soluble dimer in plasma and as a dimer or multimer on the cell surface and extracellular matrix (ECM).
  • ECM extracellular matrix
  • Dimeric fibronectin is a structure in which two nearly identical 210 kDa to 250 kDa polypeptides are disulfide-bonded near the C-terminus, and each polypeptide is composed of a large number of functional modules, which are composed of fibrin, It has the property of binding to other proteins including collagen, integrins, heparins, syndecans, and fibronectin.
  • BLI Bio-layer interferometry
  • the reporter cell assay uses mouse T cells expressing the NFAT-GFP reporter gene and DAP12 using a chimeric receptor whose extracellular domain is human LILRB4 and whose transmembrane and intracellular domains are activated pairedo immunoglobulin-like receptor beta.
  • the hybridoma cell line was transfected with a retrovirus vector, and the obtained 5 ⁇ 10 4 reporter cells were cultured with a test protein, and the expression of GFP was analyzed by flow cytometry.
  • the N-terminal cathepsin D digested fragment 70 kDa of human fibronectin and its trypsin digested fragment, the N-terminal 30 kDa fragment, are binding, and the C-terminal 45 kDa fragment is subjected to reporter cell assay and BLI analysis. There was no binding. The more C-terminal portion of fibronectin, amino acid residues 607 to 1265, 1266 to 1908, 1277 to 2477, did not induce a signal in either the reporter cell assay or the BLI analysis. From this result, it was shown that the B4 binding site in fibronectin is in the N-terminal 30 kDa fragment (FN30).
  • Example 4 Preparation of recombinant fibronectin target sequence-Fc fusion protein N-terminal 30 kDa of human fibronectin (corresponding to the 40th glutamine residue to the 282nd glycine residue, manufactured by Sigma, # 9911, hereinafter also referred to as FN30) A recombinant protein (hereinafter, also referred to as FN30-Fc) fused with Fc of mouse IgG2a was prepared by the following procedure.
  • FN30 A DNA fragment encoding FN30 was amplified from human mesenchymal stem cell-derived mRNA with the following primers.
  • FN30 Forward Primer 5'-ATAGAATTCGCAGTCCCCCGGTGGCTGTCAGT-3'(SEQ ID NO: 2)
  • FN30 Reverse Primer 5'-TTAAGTCTTCCGCTCGATGTGGTGTCTGCAC-3'(SEQ ID NO: 3)
  • the amplified FN30 DNA fragment was digested with Eco RI and Bgl II and inserted into the respective sites of the pFUSE-mIgG2Ae1-Fc2 vector.
  • This vector introduced mutations of L235E, E318A, K320A, and K322A into the Fc moiety to reduce the antibody-dependent cellular cytotoxicity (ADCC) and complement-dependent cellular cytotoxicity (CDC) inherent in the Fc of IgG2a. It is a thing.
  • the obtained plasmid pFUSE-mIgG2Ae1-Fc2 / FN30 was sequenced and confirmed, and then subjected to protein expression.
  • FN30-Fc For expression of FN30-Fc, this plasmid was transfected into CHO-K1 cells with Lipofectamine 2000 and stable transfection cell clones were selected with Zeocin (0.8 mg / ml) and then obtained by ultra-dilution method. It was. Recombinant FN30-Fc was purified from cell culture supernatant on a HiTrap Protein G HP column and then dialyzed against PBS (-).
  • Example 5 Preparation of anti-fibronectin antibody An N-terminal 30 kDa fragment (FN30; manufactured by Sigma) of fibronectin obtained by treating human plasma-derived fibronectin with cathepsin D and purifying it using heparin binding after trypsin treatment. , # 9911) was used as an antigen to immunize WKY rats, and iliac lymph node cells were fused with myeloma cells in the presence of 50% polyethylene glycol to obtain hybridomas.
  • FN30 N-terminal 30 kDa fragment (FN30; manufactured by Sigma) of fibronectin obtained by treating human plasma-derived fibronectin with cathepsin D and purifying it using heparin binding after trypsin treatment. , # 9911) was used as an antigen to immunize WKY rats, and iliac lymph node cells were fused with myeloma cells in the presence of 50% polyethylene glycol to obtain hybridomas.
  • FN30 monoclonal antibody Anti-fibronectin monoclonal antibody (hereinafter referred to as FN30 monoclonal antibody) by selection by ELISA using human FN30, FN30-Fc obtained in Example 4, mouse FN (manufactured by Abcam, # ab92784), and synthetic peptide fragment of FN30. 9 clones of hybridomas producing (also referred to as) were obtained. Table 1 shows the clone names, isotypes, binding properties of mouse MSCs, and binding properties of human MSCs of the established 9 types of anti-FN30 monoclonal antibodies. In the table, (-) indicates no binding, (+) indicates weak binding, and (++) indicates strong binding.
  • Example 6 Blocking effect of anti-fibronectin antibody Human bone marrow-derived mesenchymal stem cells (PromoCell, # C-12974) are suspended in a mesenchymal stem cell proliferation medium (PromoCell, C-28009) and 1 ⁇ 10 5 cells / 300 [mu] L / well were seeded in 48-well plates, 37 ° C., were cultured under conditions of 5% carbon dioxide. With the mesenchymal stem cells sufficiently attached to the plate after 24 hours of culturing, the medium was aspirated and removed, and the anti-FN30 monoclonal antibody (No. 1 to No. 9) obtained in Example 5 was 20 ⁇ g / mL.
  • a mesenchymal stem cell proliferation medium PromoCell, C-28009
  • reporter cells (2B4 cells) were seeded at 1 ⁇ 10 5 cells / 200 ⁇ L / well, 37 °C, were cultured for 18 hours under the conditions of 5% carbon dioxide. After collecting the cells from the wells, the cells were suspended in PBS (-) buffer containing 2% fetal bovine serum and 0.05% sodium azide, measured by BD FACSCalibur flow cytometer (manufactured by BD Biosciences), and measured by FlowJo. The data was analyzed by software. The result is shown in FIG.
  • the anti-FN30 monoclonal antibody No. When treated with 1 to 5 and 7 to 9, the GFP expression was equivalent to that of the positive control without antibody, whereas the anti-FN30 monoclonal antibody No. When treated with No. 6, the expression of GFP was equivalent to that of the negative control of reporter cells only. It can be said that the 6 antibody is an antibody that inhibits the binding between FN30 and B4.
  • the anti-FN30 monoclonal antibody No. 4, No. 5 and No. No. 6 was strongly stained with both mouse MSC and human MSC.
  • the 7 antibodies weakly stained mouse MSCs and human MSCs.
  • No. The 9 antibodies only weakly stained human MSCs. No. 1, No. 2. No. 3 and No. Eight antibodies did not stain any MSCs.
  • Human cancer cell line Daudi (Berkit lymphoma), HL60 (premyelocytic leukemia), HeLa (cervical epithelioma), HepG2 (hepatocellular carcinoma), Saos-2 (osteosarcoma) 2 Suspended in PBS (-) buffer containing% bovine fetal serum and 0.05% sodium azide, anti-FN30 monoclonal antibody (No.
  • fibronectin (FN30) on the cell surface in mouse cancer cell lines was found to be weak at B16F10 and strong at 3LL.
  • Daudi, HL60, and HeLa had no cell surface expression
  • HepG2 and Saos-2 had strong cell surface expression.
  • Example 9 Expression of B4 and PD-1 of intratumorally infiltrating lymphocytes
  • the left thigh of a wild-type mouse was subcutaneously inoculated with 5 ⁇ 10 5 cells / 100 ⁇ L / animal of B16F10 cells or 3LL cells, and then. When the diameter grows to about 1.5 cm, the mice are euthanized by excessive inhalation of carbon dioxide gas, and the tumor is taken out to remove the tumor and remove the tumor from Tumor Discovery Kit, mouse (Miltenyi, # 130-096-730) and gentleMACS Dissociator (Miltenyi).
  • a single cell suspension was prepared using # 130-093-235), and lymphocytes were collected by specific gravity separation by Percoll (manufactured by GE Healthcare, # 17089102).
  • the recovered cells were suspended in PBS (-) buffer containing 2% fetal bovine serum and 0.05% sodium azide, and under ice temperature conditions, FITC-labeled anti-mouse CD4 antibody, Alexa647-labeled anti-mouse CD8a antibody, Stained with PE-labeled anti-mouse gp49A / B antibody, BV421-labeled anti-mouse PD-1 antibody, PE-labeled Armenian hamster IgG as isotype control antibody, and BV421-labeled rat IgG2a, measured by BD FACSAria III cell sorter, and data by FlowJo software. Was analyzed. The results are shown in FIGS. 10 and 11.
  • FIG. 10 shows the expression of B4 and PD-1 of intratumoral infiltrating lymphocytes (mouse CD8-positive T cells).
  • B4 and PD-1 expression was observed in some of the CD8-positive T cells infiltrating the tumor of B16F10, and most of them were B4 and PD-1 double-positive cells. And B4 alone positive cells were also observed. Most of the CD8-positive T cells infiltrating the 3LL tumor were B4 positive, and more than 80% of them were also PD-1 positive.
  • FIG. 11 shows the expression of B4 and PD-1 of intratumoral infiltrating lymphocytes (mouse CD4 positive T cells).
  • B4 and PD-1 intratumoral infiltrating lymphocytes (mouse CD4 positive T cells).
  • FIG. 11 shows the expression of B4 and PD-1 was observed in some of the CD4-positive T cells infiltrating the tumor of B16F10, and B4 and PD-1 double-positive cells and B4 single-positive cells were observed.
  • Most of the CD4-positive T cells infiltrating the 3LL tumor were B4 and PD-1 double-positive cells.
  • Example 10 Protein detection by anti-fibronectin polyclonal antibody and anti-fibronectin monoclonal antibody of plasma sample (Western blotting) Using healthy male (age: 25-31 years old) blood as a plasma sample, 10.5 ml / person of blood was collected in a Venoject II vacuum blood collection tube (registered trademark), and 2500 rpm ⁇ with a universal cooling centrifuge (KUBOTA S911). Centrifuge for 3 minutes to separate and collect plasma.
  • a Venoject II vacuum blood collection tube registered trademark
  • KUBOTA S911 universal cooling centrifuge
  • the plasma sample is diluted 15-fold with ultrapure water, a reducing agent (1M ⁇ -ME) and a surfactant (4% SDS) are added, and the mixture is heated at 95 ° C. for 5 minutes and then heated to 7.5%. It was run on an acrylamide gel. After electrophoresis, the separated protein was transferred to a polyvinylidene fluoride (PVDF) membrane.
  • PVDF polyvinylidene fluoride
  • thermoFisher Dyeing was performed using Pierce ECL Western Blotting Substrate manufactured by the same company. ImageQuant LAS 4000mini manufactured by GE Healthcare Japan was used for image analysis. The results are shown in FIG.
  • the anti-FN30 monoclonal antibody No. 4, No. A band of 250 kDa was confirmed at 5.
  • a band having a molecular weight of about 24 kDa was observed in both the anti-FN polyclonal antibody and the anti-FN30 monoclonal antibody, confirming the presence of a 24 kDa FN fragment in healthy human plasma.
  • Example 11 Quantification of fibronectin full-length molecule and fibronectin 24 kDa fragment in healthy human plasma using anti-fibronectin antibody (ELISA method)
  • Anti-FN44 kDa antibody manufactured by Origine, Clone: OTI3F9, hereinafter also referred to as anti-FN44 antibody
  • 6 and Collagen binding-FN as an antigen
  • polyclonal antibody Anti-Fibronectin antibody, product # Albiti Using F3648 hereinafter, also referred to as anti-FN polyclonal antibody
  • carbonate buffer NaHCO 3
  • the amount of fibronectin bound to the monoclonal antibody was detected using an anti-FN polyclonal antibody (13500-fold dilution) and an anti-rabbit IgG-HRP antibody (250-fold dilution). TBS 0.1% Tween 20 was used for plate cleaning between each operation. After adding the substrate, the absorbance was measured at a wavelength of 450 nm with a microplate reader (BioRad, Model 680) and quantified. Non-linear approximation was performed by 4-parameter logistic regression based on the absorbance of the standard protein, and the concentration was calculated from the absorbance value of the sample. The result is shown in FIG.
  • the fibronectin concentration [A ( ⁇ g / ml)] detected by the anti-FN30 monoclonal antibody and the fibronectin concentration [B ( ⁇ g / ml)] detected by the anti-FN44 antibody are considered to be the concentrations shown in FIG.
  • both the 24 kDa-deficient fibronectin and the 24 kDa fibronectin are degradation products, and the polyclonal antibody to which the secondary antibody binds has a molecular weight. Considering that it is roughly proportional, the relationship is as follows.
  • the results are shown as a boxplot display showing the first, second and third quartiles and the maximum and minimum values (Fig. 14).
  • the full-length molecular concentration of fibronectin was 279 ⁇ 131 ⁇ g / ml, which was in agreement with the known FN concentration (300 ⁇ g / ml).
  • Anti-FN30 monoclonal antibody No. Using the difference in each concentration using 6 and anti-FN44 antibody, the FN24 kDa concentration in plasma was calculated to be 6.49 ⁇ 7.44 ⁇ g / ml.
  • Example 12 Therapeutic effect of FN30 on autoantibody diseases Whether or not inhibition of FN30 inhibits the binding of gp49B to fibronectin and exhibits a therapeutic effect on autoantibody production by pathogenic plasma cells is as follows. I verified it in this way. Intraperitoneal administration of control IgG or FN30-Fc obtained in Example 4 to BXSB / Ya mice was repeated twice at 2-week intervals. The result is shown in FIG.
  • the anti-dsDNA IgG serum antibody titer gradually increased in the group of mice administered with control IgG, but the IgG autoantibody level was relatively constant during the observed period in the FN30-Fc administration group. Was kept in. This inhibitory effect was also observed by intraperitoneally administering the anti-gp49B monoclonal antibody H1.1 to BXSB / Ya mice on the same schedule as FN30-Fc administration (FIG. 16).
  • Example 13 Involvement of LILRB4 in cancer metastasis
  • Lewis lung carcinoma cells LLC
  • WT wild-type B6 mice
  • gp49B-deficient mice mice
  • mouse melanoma cells B16F10 were injected from the tail vein, and after 30 days and 20 days, respectively, the lungs and liver were excised, and H & E staining or the number of tumor nodules on the surface was counted and evaluated.
  • the results of LLC injection are shown in FIGS. 17A to 17D, and the results of B16F10 injection are shown in FIGS. 18A, 18B and 19. As shown in FIGS.
  • the metastasis of LLC to the lung was reduced in gp49B-deficient mice compared to WT.
  • the site of tumor metastasis was found only in the liver of LLC-injected WT mice, and was not observed in the liver of gp49B-deficient mice.
  • FIGS. 18A and 18B the number of tumor nodules on the total surface of the lung was significantly reduced in gp49B-deficient mice (Fig. 18A), and metastasis to the liver was also reduced (Fig. 18B).
  • mice were transferred injected at 5 ⁇ 10 6 cells / mouse wild-type and gp49B deficient mice bone marrow cells from the tail vein after 1 day.
  • the mice were treated with gentamicin for 1 month, and at 4 weeks after transfer, the total blood image was confirmed by a flow cytometer to confirm the replacement state of donor cells.
  • FIG. 19 metastasis to lung and liver was lower in mice adopting gp49B-deficient bone marrow cells than in wild-type mice adopted control mice. From these results, it was shown that gp49B is involved in the metastasis of tumor cells.
  • Example 14 Cancer metastasis inhibitory effect by LILRB4 inhibition As shown in Example 12, tumor metastasis decreases when gp49B is deficient. Therefore, inhibition of gp49B using the anti-gp49B monoclonal antibody H1.1. We investigated how tumor metastasis is affected by the following.
  • B6 mice injected with B16F10 were injected intraperitoneally 6 times with a control isotype IgG antibody, anti-PD-1 monoclonal antibody, anti-gp49B monoclonal antibody, or a combination of anti-PD-1 monoclonal antibody and anti-gp49B monoclonal antibody.
  • a control isotype IgG antibody anti-PD-1 monoclonal antibody
  • anti-gp49B monoclonal antibody anti-gp49B monoclonal antibody
  • a combination of anti-PD-1 monoclonal antibody and anti-gp49B monoclonal antibody were evaluated. The results are shown in FIGS. 20A to 20D. As shown in FIGS.
  • the anti-gp49B monoclonal antibody-treated group was equivalent to the anti-PD-1 monoclonal antibody-treated group or the group treated with the combination of the anti-gp49B monoclonal antibody and the anti-PD-1 monoclonal antibody.
  • the number of metastatic lesions of B16F10 tumor decreased in both lung and liver.
  • B6 mice are injected with LLC (LLC-Luc2) expressing luciferase to control isotype IgG antibody, anti-PD-1 monoclonal antibody, anti-gp49B monoclonal antibody, or a combination of anti-PD-1 monoclonal antibody and anti-gp49B monoclonal antibody.
  • the number of metastatic lesions of LLC-Luc2 tumor decreased in both the lung and liver in the anti-gp49B monoclonal antibody-treated group and the anti-PD-1 monoclonal antibody and anti-gp49B monoclonal antibody combined treatment group. 20E to 20G).
  • Example 15 Verification of osteoclast differentiation promoting effect by inhibition of LILRB4 1 Bone marrow cells were harvested from wild B6 mice and F (ab') 2 fragments of 10% FCS and 10 ⁇ g / ml control isotype IgG antibody, anti-gp49B monoclonal antibody H1.1, anti-gp49B monoclonal antibody H1.1 or anti. FN30 monoclonal antibody No. Using ⁇ -MEM medium containing 6, the cells were cultured in 48-well plates at 5.0 ⁇ 10 5 cells / well. After 2 hours of culturing, 20 ng / well of M-CSF was added and the cells were further cultured for 48 hours.
  • the differentiation induction into osteoclasts was carried out by adding the F (ab') 2 fragment of the anti-gp49B monoclonal antibody H1.1 or the anti-gp49B monoclonal antibody H1.1, respectively.
  • F (ab') 2 fragment of the anti-gp49B monoclonal antibody H1.1 or the anti-gp49B monoclonal antibody H1.1 respectively.
  • Osteoclast count / total cell count x 100 was 3.5% and 3.4%, which tended to increase slightly as compared with the case of the control isotype IgG antibody (2.7%).
  • anti-FN-30 monoclonal antibody No With the addition of 6, the differentiation induction rate became 7.9%, and a remarkable increase was observed.
  • the differentiation induction rate from PBMC to osteoclasts was 13.7%, which was disrupted by the addition of anti-LILRB4 antibody as compared with the case of the control isotype antibody (7.6%). Induction of differentiation into osteoclasts was enhanced about 2-fold.
  • Example 17 Verification of osteoclast differentiation promoting effect by inhibition of LILRB4 3 Bone marrow cells were collected from wild-type B6 mice and gp49B-deficient mice and cultured in 24-well plates for 2 days using 10% FCS, 20 ng / ml M-CSF, 1.0 ⁇ 10 6 cells / ml ⁇ -MEM medium. did. Then, in order to induce differentiation into osteoclasts, 10% FCS-added ⁇ -MEM containing 20 ng / well and 100 ng / ml RANKL of M-CSF was added, and TRAP staining was performed 5 days later. The result is shown in FIG.
  • the rate of induction of differentiation into osteoclasts was increased approximately 3-fold in bone marrow cells derived from gp49B-deficient mice as compared with bone marrow cells derived from wild-type mice.
  • Example 18 Verification of osteoclast differentiation promoting effect by LILRB4 inhibition 4 Femurs were isolated from 18-week-old wild-type B6 mice (female) and 18-week-old gp49B-deficient mice (female), and the Kawamoto method (“Non-osteoclast frozen section preparation technique (Kawamoto method 2008) and its). Application ”Tadafumi Kawamoto“ Pathological Technology Vol. 72, No. 2, p.76-83, 2009 ”), frozen sections were prepared, and TRAP staining was performed to detect osteoclasts. The result is shown in FIG.
  • immune checkpoint inhibitors therapeutic agents for immune checkpoint-related diseases, immunosuppressants, anti-fibronectin antibodies or derivatives thereof, fibronectin analogs, kits for detecting fibronectin or partial proteins thereof, and fibronectin or A method for detecting the partial protein can be provided.

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Abstract

フィブロネクチンと免疫抑制性受容体ＬＩＬＲＢ４との結合を阻害する物質を有効成分として含有する免疫チェックポイント阻害剤、免疫チェックポイント関連疾患の治療剤、免疫抑制性受容体ＬＩＬＲＢ４を活性化する物質を有効成分として含有する免疫抑制剤、抗フィブロネクチン抗体又はその誘導体、フィブロネクチンアナログ、フィブロネクチンまたはその部分タンパク質を検出するためのキット、及び前記キットを用いる生体試料中のフィブロネクチン又はその部分タンパク質を検出する方法。

Description

免疫チェックポイント阻害剤、免疫チェックポイント関連疾患の治療剤、免疫抑制剤、抗フィブロネクチン抗体又はその誘導体、フィブロネクチンアナログ、フィブロネクチンまたはその部分タンパク質を検出するためのキット、及びフィブロネクチンまたはその部分タンパク質を検出する方法
　本発明は、免疫チェックポイント阻害剤、免疫チェックポイント関連疾患の治療剤、免疫抑制剤、抗フィブロネクチン抗体又はその誘導体、フィブロネクチンアナログ、フィブロネクチンまたはその部分タンパク質を検出するためのキット、及びフィブロネクチンまたはその部分タンパク質を検出する方法に関する。
　本願は、２０１９年８月１３日に、日本に出願された特願２０１９－１４８４２３号に基づき優先権を主張し、その内容をここに援用する。
　近年、免疫チェックポイント阻害剤を用いる癌免疫療法が注目されている。免疫チェックポイント阻害薬とは、自己に対する免疫応答を抑制し、過剰な免疫反応を抑制する作用を有する免疫チェックポイント分子もしくはそのリガンドに結合して、免疫抑制シグナルの伝達を阻害することで、免疫チェックポイント分子によるＴ細胞の活性化抑制を解除する薬剤である。
　本願発明者らは未知のリガンドに対する免疫抑制性受容体であるＬＩＬＲＢ４（白血球Ｉｇ様受容体（Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ　Ｉｇ－ｌｉｋｅ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ）Ｂ４、以下、Ｂ４とも称する）を用いることにより、感染又は自己免疫に由来する炎症性疾患を判定できることを見出した（特許文献１）。
　ＬＩＬＲＢ４のリガンドとしては、最近、ＣＤ１６６、ＡｐｏＥ、Ａｎｇｐｔｌｓ等が報告されている（非特許文献１～３）。しかしながら、これらが生理的リガンドであることの証明は十分とは言えない。
　フィブロネクチン（Ｆｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎ；以下、ＦＮとも称する）は細胞外マトリックス（Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ　Ｍａｔｒｉｘ；以下、ＥＣＭとも称する）、細胞表面上および体液中に存在する約２５９ｋＤａの糖蛋白である。フィブロネクチンはタンパク分解酵素であるサーモリシン（ｔｈｅｒｍｏｌｙｓｉｎ）処理により６つの領域（ドメイン）に分割される。これらはそれぞれの特異的な分子結合能をもとに１．フィブリン・ヘパリン結合領域（Ｆｉｂｒｉｎ／Ｈｅｐａｒｉｎ　ｂｉｎｄｉｎｇ－ＦＮ）、２．コラーゲン結合領域（Ｃｏｌｌａｇｅｎ　ｂｉｎｄｉｎｇ－ＦＮ）、３．ヘパリン結合領域（Ｈｅｐａｒｉｎ　ｂｉｎｄｉｎｇ－ＦＮ）、４．細胞／インテグリン結合領域（ｃｅｌｌ／ｉｎｔｅｇｒｉｎ－ｂｉｎｄｉｎｇ－ｄｏｍａｉｎ（ＣＢＤ）－ＦＮ）、５．第二ヘパリン結合領域（ｓｅｃｏｎｄ　Ｈｅｐａｒｉｎ　ｂｉｎｄｉｎｇ－ＦＮ）、６．第二フィブリン結合領域（ｓｅｃｏｎｄ　Ｆｉｂｒｉｎ　ｂｉｎｄｉｎｇ－ＦＮ）と呼称されている。このように、ＦＮは生理的分子への結合能を異にする複数のドメインから構成される。これまで、全身性エリテマトーデス（Ｓｙｓｔｅｍｉｃ　Ｌｕｐｕｓ　Ｅｒｙｔｈｅｍａｔｏｓｕｓ；ＳＬＥ）やリウマチ関節炎（Ｒｈｅｕｍａｔｏｉｄ　Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ；ＲＡ）といった一部の自己免疫疾患では血漿中や体液（例えば、関節液）中のＦＮ濃度の変動がみられるほか、モノクローナル抗体を用いてＦＮの断片化（ｆｒａｇｍｅｎｔａｔｉｏｎ）を評価するドメイン解析が、疾患の診断ないし重症度評価に有用であると報告されている（非特許文献４～６）。特に、Ｆｉｂｒｉｎ／Ｈｅｐａｒｉｎ　ｂｉｎｄｉｎｇ－ＦＮ濃度は健常人（６１±１８μｇ／ｍｌ）との比較で、ＳＬＥは２４±１２μｇ／ｍｌ（ｐ＜０．００３）、ＲＡは３６±２２μｇ／ｍｌ（ｐ＜０．００００２）であり、診断への活用が見込まれる。また、ＦＮが肺癌細胞株の転移能と浸潤能を促進することが報告されている（非特許文献７）。しかしながら、上記の何れの文献にも、ＦＮがＬＩＬＲＢ４のリガンドであることは報告されていない。
特開２０１８－２５５５４号公報
J Immunol. 2018 Feb 1;200(3):1207-1219. Blood. 2014 Aug 7;124(6):924-935. Nature. 2018 Oct;562(7728):605-609. Rheumatology (Oxford). 2007 Jul;46(7):1071-1075. J Rheumatol. 1987 Oct;14(5):1052-1054. Rheumatol Int. 2013 Jan;33(1):37-43. Br J Cancer 2009 Jul 21;101(2):327-334.
　本発明は、免疫チェックポイント阻害剤、免疫チェックポイント関連疾患の治療剤、免疫抑制剤、抗フィブロネクチン抗体又はその誘導体、フィブロネクチンアナログ、フィブロネクチンまたはその部分タンパク質を検出するためのキット、及びフィブロネクチンまたはその部分タンパク質を検出する方法を提供することを目的とする。
　本発明者らは、ＬＩＬＲＢ４の生理的リガンドがＥＣＭの主要構成タンパク質の一つであるフィブロネクチンであることを見出し、フィブロネクチン中のＬＩＬＲＢ４の標的配列を特定し、この標的配列とフィブロネクチンの結合を阻害する物質が、免疫チェックポイント阻害剤、免疫チェックポイント関連疾患の治療剤、及び免疫抑制剤として有用であることを見出し、本発明を完成させた。
　本発明は以下の態様を含む。
［１］　フィブロネクチンと免疫抑制性受容体ＬＩＬＲＢ４との結合を阻害する物質を有効成分として含有する免疫チェックポイント阻害剤。
［２］　前記フィブロネクチンが、前記フィブロネクチン中の配列番号１で表されるアミノ酸配列を介して、免疫抑制性受容体ＬＩＬＲＢ４と結合する、［１］に記載の免疫チェックポイント阻害剤。
［３］　前記フィブロネクチンと免疫抑制性受容体ＬＩＬＲＢ４との結合を阻害する物質が、抗フィブロネクチン抗体又はその誘導体、抗免疫抑制性受容体ＬＩＬＲＢ４抗体又はその誘導体、若しくはフィブロネクチンアナログである、［１］又は［２］に記載の免疫チェックポイント阻害剤。
［４］　前記抗フィブロネクチン抗体又はその誘導体が、フィブロネクチン中の配列番号１で表されるアミノ酸配列と結合する、［３］に記載の免疫チェックポイント阻害剤。
［５］　前記フィブロネクチンアナログが、以下の（ａ）～（ｃ）のいずれか一つのペプチドである、［３］に記載の免疫チェックポイント阻害剤。
（ａ）配列番号１で表されるアミノ酸配列を含むペプチド、
（ｂ）配列番号１で表されるアミノ酸配列において、１～数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、且つ、免疫抑制性受容体ＬＩＬＲＢ４のフィブロネクチン結合部位に対し結合能を有するペプチド、
（ｃ）配列番号１で表されるアミノ酸配列において、８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、且つ、免疫抑制性受容体ＬＩＬＲＢ４のフィブロネクチン結合部位に対し結合能を有するペプチド
［６］　フィブロネクチンと免疫抑制性受容体ＬＩＬＲＢ４との結合を阻害する物質を有効成分として含有する免疫チェックポイント関連疾患の治療剤。
［７］　前記フィブロネクチンが、前記フィブロネクチン中の配列番号１で表されるアミノ酸配列を介して、免疫抑制性受容体ＬＩＬＲＢ４と結合する、［６］に記載の治療剤。
［８］　前記フィブロネクチンと免疫抑制性受容体ＬＩＬＲＢ４との結合を阻害する物質が、抗フィブロネクチン抗体又はその誘導体、抗免疫抑制性受容体ＬＩＬＲＢ４抗体又はその誘導体、若しくはフィブロネクチンアナログである、［６］又は［７］に記載の治療剤。
［９］　前記抗フィブロネクチン抗体又はその誘導体が、フィブロネクチン中の配列番号１で表されるアミノ酸配列と結合する、［８］に記載の治療剤。
［１０］　前記フィブロネクチンアナログが、以下の（ａ）～（ｃ）のいずれか一つのペプチドである、［８］に記載の治療剤。
（ａ）配列番号１で表されるアミノ酸配列を含むペプチド、
（ｂ）配列番号１で表されるアミノ酸配列において、１～数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、且つ、免疫抑制性受容体ＬＩＬＲＢ４のフィブロネクチン結合部位に対し結合能を有するペプチド、
（ｃ）配列番号１で表されるアミノ酸配列において、８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、且つ、免疫抑制性受容体ＬＩＬＲＢ４のフィブロネクチン結合部位に対し結合能を有するペプチド
［１１］　前記免疫チェックポイント関連疾患が、自己免疫疾患、がん、炎症性疾患、及びアレルギー性疾患からなる群から選択される、［６］～［１０］のいずれか一項に記載の治療剤。
［１２］　前記がんが、がん転移によるものである、［１１］に記載の治療剤。
［１３］　免疫抑制性受容体ＬＩＬＲＢ４を活性化する物質を有効成分として含有する免疫チェックポイント関連疾患の治療剤。
［１４］　前記免疫抑制性受容体ＬＩＬＲＢ４を活性化する物質が、抗フィブロネクチン抗体又はその誘導体、抗免疫抑制性受容体ＬＩＬＲＢ４抗体又はその誘導体、若しくはフィブロネクチン又はフィブロネクチンアナログである、［１３］に記載の治療剤。
［１５］　前記フィブロネクチンアナログが、以下の（ａ）～（ｃ）のいずれか一つのペプチドである、［１４］に記載の治療剤。
（ａ）配列番号１で表されるアミノ酸配列を含むペプチド、
（ｂ）配列番号１で表されるアミノ酸配列において、１～数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、且つ、免疫抑制性受容体ＬＩＬＲＢ４のフィブロネクチン結合部位に対し結合能を有するペプチド、
（ｃ）配列番号１で表されるアミノ酸配列において、８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、且つ、免疫抑制性受容体ＬＩＬＲＢ４のフィブロネクチン結合部位に対し結合能を有するペプチド
［１６］　前記免疫チェックポイント関連疾患が、骨疾患である、［１３］～［１５］のいずれか一項に記載の治療剤。
［１７］　免疫抑制性受容体ＬＩＬＲＢ４を活性化する物質を有効成分として含有する免疫抑制剤。
［１８］　前記免疫抑制性受容体ＬＩＬＲＢ４を活性化する物質が、抗フィブロネクチン抗体又はその誘導体、抗免疫抑制性受容体ＬＩＬＲＢ４抗体又はその誘導体、若しくはフィブロネクチン又はフィブロネクチンアナログである、［１７］に記載の免疫抑制剤。
［１９］　前記フィブロネクチンアナログが、以下の（ａ）～（ｃ）のいずれか一つのペプチドである、［１８］に記載の免疫抑制剤。
（ａ）配列番号１で表されるアミノ酸配列を含むペプチド、
（ｂ）配列番号１で表されるアミノ酸配列において、１～数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、且つ、免疫抑制性受容体ＬＩＬＲＢ４のフィブロネクチン結合部位に対し結合能を有するペプチド、
（ｃ）配列番号１で表されるアミノ酸配列において、８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、且つ、免疫抑制性受容体ＬＩＬＲＢ４のフィブロネクチン結合部位に対し結合能を有するペプチド
［２０］　配列番号１で表されるアミノ酸配列に結合する抗フィブロネクチン抗体又はその誘導体。
［２１］　以下の（ａ）～（ｃ）のいずれか一つのペプチドと免疫グロブリンＧのＦｃ領域とが融合したフィブロネクチンアナログ。
（ａ）配列番号１で表されるアミノ酸配列を含むペプチド、
（ｂ）配列番号１で表されるアミノ酸配列において、１～数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、且つ、免疫抑制性受容体ＬＩＬＲＢ４のフィブロネクチン結合部位に対し結合能を有するペプチド、
（ｃ）配列番号１で表されるアミノ酸配列において、８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、且つ、免疫抑制性受容体ＬＩＬＲＢ４のフィブロネクチン結合部位に対し結合能を有するペプチド
［２２］　［２０］に記載の抗フィブロネクチン抗体又はその誘導体を含み、生体試料中に含まれる配列番号１で表されるアミノ酸配列を含むフィブロネクチンまたはその部分タンパク質を検出するためのキット。
［２３］　［２２］に記載のキットを用いる、生体試料中のフィブロネクチン又はその部分タンパク質を検出する方法。
　本発明によれば、免疫チェックポイント阻害剤、免疫チェックポイント関連疾患の治療剤、免疫抑制剤、抗フィブロネクチン抗体又はその誘導体、フィブロネクチンアナログ、フィブロネクチンまたはその部分タンパク質を検出するためのキット、及びフィブロネクチンまたはその部分タンパク質を検出する方法を提供することができる。
マウス野生型ナイーブＣＤ８陽性Ｔ細胞（上段）およびＢ４欠損ナイーブＣＤ８陽性Ｔ細胞（下段）におけるＢ４（左）、ＰＤ－１（中央）、Ｔｉｍ－３（右）の発現をフローサイトメトリーにより解析した結果を示す。縦軸はヒストグラムのピーク値を１００％としたときの細胞の割合、横軸は蛍光強度（タンパク質の発現強度）を示している。実線は、各抗原特異的抗体による染色、実線無しグレーは、アイソタイプコントロール抗体による染色の結果をそれぞれ示す。 マウス野生型ＣＤ８陽性Ｔ細胞（上段）およびＢ４欠損ＣＤ８陽性Ｔ細胞（下段）の抗ＣＤ３抗体／抗ＣＤ２８抗体による活性化刺激におけるＢ４（左）、ＰＤ－１（中央）、Ｔｉｍ－３（右）の発現をフローサイトメトリーにより継時的（０－３日目）に解析した結果を示す。縦軸にヒストグラムのピーク値を１００％としたときの細胞の割合および横軸に蛍光強度（タンパク質の発現強度）で示した各測定日のヒストグラムを重ね合わせた図として示している。実線は、各抗原特異的抗体による染色、実線無しグレーは、アイソタイプコントロール抗体による染色の結果を示す。 マウス野生型ナイーブＣＤ４陽性Ｔ細胞（上段）およびＢ４欠損ナイーブＣＤ４陽性Ｔ細胞（下段）におけるＢ４（左）、ＰＤ－１（中央）、Ｔｉｍ－３（右）の発現をフローサイトメトリーにより解析した結果を示す。縦軸はヒストグラムのピーク値を１００％としたときの細胞の割合、横軸は蛍光強度（タンパク質の発現強度）を示している。実線は、各抗原特異的抗体による染色、実線無しグレーは、アイソタイプコントロール抗体による染色の結果をそれぞれ示す。 マウス野生型ＣＤ４陽性Ｔ細胞（上段）およびＢ４欠損ＣＤ４陽性Ｔ細胞（下段）の抗ＣＤ３抗体／抗ＣＤ２８抗体による活性化刺激におけるＢ４（左）、ＰＤ－１（中央）、Ｔｉｍ－３（右）の発現をフローサイトメトリーにより継時的（０－３日目）に解析した結果を示す。縦軸にヒストグラムのピーク値を１００％としたときの細胞の割合および横軸に蛍光強度（タンパク質の発現強度）で示した各測定日のヒストグラムを重ね合わせた図として示している。実線は、各抗原特異的抗体による染色、実線無しグレーは、アイソタイプコントロール抗体による染色の結果を示す。 マウスＣＤ８陽性Ｔ細胞（上段）およびＣＤ４陽性Ｔ細胞（下段）の抗ＣＤ３抗体／抗ＣＤ２８抗体による活性化刺激におけるＢ４とＰＤ－１の共発現についてフローサイトメトリーにより継時的（０－３日目）に解析した結果を示す。縦軸はＰＤ－１の発現強度、横軸はＢ４の発現強度を表し、十字で区切った左下のエリアはＰＤ－１陰性Ｂ４陰性、左上のエリアはＰＤ－１単独陽性、右上のエリアはＰＤ－１陽性Ｂ４陽性、右下のエリアはＰＤ－１陰性Ｂ４陽性をそれぞれ表す。 ヒトＣＤ８陽性Ｔ細胞（上段）およびＣＤ４陽性Ｔ細胞（下段）の抗ＣＤ３抗体／抗ＣＤ２８抗体による活性化刺激におけるＢ４（左）、ＰＤ－１（中央）、Ｔｉｍ－３（右）の発現をフローサイトメトリーにより継時的（０－３日目）に解析した結果を示す。縦軸にヒストグラムのピーク値を１００％としたときの細胞の割合および横軸に蛍光強度（タンパク質の発現強度）で示した各測定日のヒストグラムを重ね合わせた図として示している。実線は、各抗原特異的抗体による染色、薄いグレーは、アイソタイプコントロール抗体による染色の結果を示す。 ヒトＭＳＣとＢ４－ＧＦＰレポーター細胞との共培養において、抗ＦＮ３０モノクローナル抗体によるＦＮ－Ｂ４結合阻害効果をＢ４－ＧＦＰレポーター細胞のＧＦＰ発現細胞の割合により評価した結果を示す。プロット図の縦軸は細胞の大きさ、横軸はＧＦＰの蛍光強度を表し、プロット図中の数値は、ＧＦＰ陽性細胞（枠内）の割合（％）を示している。棒グラフは、各抗体で処理した際のＧＦＰ陽性細胞の割合（％）を示している。 マウス骨髄由来間葉系幹細胞およびヒト骨髄由来間葉系幹細胞を抗ＦＮ３０モノクローナル抗体で染色し、フローサイトメーターで解析した結果を示す。実線は、抗ＦＮ３０モノクローナル抗体による染色、実線無しグレーは、アイソタイプコントロール抗体による染色の結果をそれぞれ示す。 抗ＦＮ３０モノクローナル抗体Ｎｏ．５を用いて、マウスがん細胞株（上段）およびヒトがん細胞株（下段）を染色し、フローサイトメーターで解析した結果を示す。実線は抗ＦＮ３０モノクローナル抗体による染色、実線無しグレーは、アイソタイプコントロール抗体による染色の結果をそれぞれ示す。 野生型マウスにＢ１６Ｆ１０細胞株（上段、２匹分）および３ＬＬ細胞株（下段、３匹分）を摂取して形成された腫瘍内に浸潤しているＣＤ８陽性Ｔ細胞について、Ｂ４およびＰＤ－１の発現をフローサイトメーターで解析した結果を示す。縦軸はＰＤ－１の発現強度、横軸はＢ４の発現強度を表し、十字で区切った左下のエリアはＰＤ－１陰性Ｂ４陰性、左上のエリアはＰＤ－１単独陽性、右上のエリアはＰＤ－１陽性Ｂ４陽性、右下のエリアはＰＤ－１陰性Ｂ４陽性をそれぞれ表す。 野生型マウスにＢ１６Ｆ１０細胞株（上段、２匹分）および３ＬＬ細胞株（下段、３匹分）を摂取して形成された腫瘍内に浸潤しているＣＤ４陽性Ｔ細胞について、Ｂ４およびＰＤ－１の発現をフローサイトメーターで解析した結果を示す。縦軸はＰＤ－１の発現強度、横軸はＢ４の発現強度を表し、十字で区切った左下のエリアはＰＤ－１陰性Ｂ４陰性、左上のエリアはＰＤ－１単独陽性、右上のエリアはＰＤ－１陽性Ｂ４陽性、右下のエリアはＰＤ－１陰性Ｂ４陽性をそれぞれ表す。 ヒト血漿サンプル中の抗フィブロネクチン抗体を用いたウエスタンブロット法によるタンパク質の検出結果を示す。左に、抗フィブロネクチンポリクローナル抗体を用いた染色、右に、抗ＦＮ３０モノクローナル抗体Ｎｏ．４及びＮｏ．５で染色した結果をそれぞれ示す。 抗フィブロネクチン抗体を用いた健常ヒト血漿中フィブロネクチン全長分子、及びフィブロネクチン２４ｋＤａ断片の定量結果を示す。スタンダードタンパクの吸光度をもとに４パラメーターロジスティック回帰にて非線形近似を行い、サンプルの吸光度値より濃度を算出した。上段は、抗ＦＮ３０モノクローナル抗体で検出されるフィブロネクチン濃度［Ａ（μｇ／ｍｌ）］、下段は、抗ＦＮ４４抗体で検出されるフィブロネクチン濃度［Ｂ（μｇ／ｍｌ）］を示す。 抗ＦＮモノクローナル抗体を用いた健常ヒト血漿中のフィブロネクチン全長分子、及びフィブロネクチン２４ｋＤａ断片の濃度の、第一、第二、第三四分位点および最大値、最小値を表した箱ひげ図を示す。左が、フィブロネクチン全長分子濃度、右がフィブロネクチン２４ｋＤａ断片の濃度を示す。 ＢＸＳＢ／ＹａａマウスにコントロールＩｇＧまたはＦＮ３０－Ｆｃを腹腔内投与し、血清中の抗ｄｓＤＮＡ　ＩｇＧレベルを測定した結果を示す。 ＢＸＳＢ／ＹａａマウスにコントロールＩｇＧまたは抗ｇｐ４９Ｂモノクローナル抗体Ｈ１．１を腹腔内投与し、血清中の抗ｄｓＤＮＡ　ＩｇＧレベルを測定した結果を示す。 野生型（ＷＴ）Ｂ６マウスおよびｇｐ４９Ｂ欠損マウスにＬｅｗｉｓ　ｌｕｎｇ　ｃａｒｃｉｎｏｍａ細胞（ＬＬＣ）を尾静脈から注入し、３０日経過後に、肺表面をＨ＆Ｅ染色した結果を示す。ＷＴは野生型マウス、ｇｐ４９Ｂ－／－は、ｇｐ４９Ｂ欠損マウスの結果を示す。 野生型（ＷＴ）Ｂ６マウスおよびｇｐ４９Ｂ欠損マウスにＬｅｗｉｓ　ｌｕｎｇ　ｃａｒｃｉｎｏｍａ細胞（ＬＬＣ）を尾静脈から注入し、３０日経過後の、肺の転移巣数の定量結果を示す。 野生型（ＷＴ）Ｂ６マウスおよびｇｐ４９Ｂ欠損マウスにＬｅｗｉｓ　ｌｕｎｇ　ｃａｒｃｉｎｏｍａ細胞（ＬＬＣ）を尾静脈から注入し、３０日経過後に、肝臓をＨ＆Ｅ染色した結果を示す。ＷＴは野生型マウス、ｇｐ４９Ｂ－／－は、ｇｐ４９Ｂ欠損マウスの結果を示す。 野生型（ＷＴ）Ｂ６マウスおよびｇｐ４９Ｂ欠損マウスにＬｅｗｉｓ　ｌｕｎｇ　ｃａｒｃｉｎｏｍａ細胞（ＬＬＣ）を尾静脈から注入し、３０日経過後の、肝臓の転移巣数の定量結果を示す。 野生型（ＷＴ）Ｂ６マウスおよびｇｐ４９Ｂ欠損マウスにマウスメラノーマ細胞Ｂ１６Ｆ１０を尾静脈から注入し、２０日経過後の肺表面をＨ＆Ｅ染色した結果を示す。ＷＴは野生型マウス、ｇｐ４９Ｂ－／－は、ｇｐ４９Ｂ欠損マウスを示す。 野生型（ＷＴ）Ｂ６マウスおよびｇｐ４９Ｂ欠損マウスにマウスメラノーマ細胞Ｂ１６Ｆ１０を尾静脈から注入し、２０日経過後の肝臓をＨ＆Ｅ染色した結果を示す。ＷＴは野生型マウス、ｇｐ４９Ｂ－／－は、ｇｐ４９Ｂ欠損マウスを示す。 野生型マウスの骨髄細胞又はｇｐ４９Ｂ欠損マウスの骨髄細胞を養子移入した結果を示す。左が肺（上段）、肝臓（下段）のＨ＆Ｅ染色の結果、右が肺（上段）、肝臓（下段）の転移巣数を示す。ＷＴ－Ｒは野生型マウス、ｇｐ４９Ｂ－／―－Ｒは、ｇｐ４９Ｂ欠損マウスを示す。 野生型（ＷＴ）Ｂ６マウスに、マウスメラノーマ細胞Ｂ１６Ｆ１０を注入した後、対照アイソタイプＩｇＧ抗体、抗ＰＤ－１モノクローナル抗体、抗ｇｐ４９Ｂモノクローナル抗体、又は抗ＰＤ－１モノクローナル抗体と抗ｇｐ４９Ｂモノクローナル抗体との組み合わせを投与するスケジュールを示す。 野生型（ＷＴ）Ｂ６マウスに、マウスメラノーマ細胞Ｂ１６Ｆ１０を注入した後、対照アイソタイプＩｇＧ抗体、抗ＰＤ－１モノクローナル抗体、抗ｇｐ４９Ｂモノクローナル抗体、又は抗ＰＤ－１モノクローナル抗体と抗ｇｐ４９Ｂモノクローナル抗体との組み合わせを投与し、Ｂ１６Ｆ１０腫瘍を生じているマウスの肺及び肝臓の転移状態を示した図である。上段は、肺の腫瘍結節、下段は、肝臓のＨ＆Ｅ染色像を示す。 野生型（ＷＴ）Ｂ６マウスに、マウスメラノーマ細胞Ｂ１６Ｆ１０を注入した後、対照アイソタイプＩｇＧ抗体、抗ＰＤ－１モノクローナル抗体、抗ｇｐ４９Ｂモノクローナル抗体、又は抗ＰＤ－１モノクローナル抗体と抗ｇｐ４９Ｂモノクローナル抗体との組み合わせを投与し、肺の腫瘍結節数を各抗体処置群で比較したグラフである。 野生型（ＷＴ）Ｂ６マウスに、マウスメラノーマ細胞Ｂ１６Ｆ１０を注入した後、対照アイソタイプＩｇＧ抗体、抗ＰＤ－１モノクローナル抗体、抗ｇｐ４９Ｂモノクローナル抗体、又は抗ＰＤ－１モノクローナル抗体と抗ｇｐ４９Ｂモノクローナル抗体との組み合わせを投与し、肝臓へのＢ１６Ｆ１０転移巣数を各抗体処置群で比較したグラフである。 野生型（ＷＴ）Ｂ６マウスに、Ｌｅｗｉｓ　ｌｕｎｇ　ｃａｒｃｉｎｏｍａ細胞（ＬＬＣ）を注入した後、対照アイソタイプＩｇＧ抗体、抗ＰＤ－１モノクローナル抗体、抗ｇｐ４９Ｂモノクローナル抗体、又は抗ＰＤ－１モノクローナル抗体と抗ｇｐ４９Ｂモノクローナル抗体との組み合わせを投与するスケジュールを示す。 野生型（ＷＴ）Ｂ６マウスに、Ｌｅｗｉｓ　ｌｕｎｇ　ｃａｒｃｉｎｏｍａ細胞（ＬＬＣ）を注入した後、対照アイソタイプＩｇＧ抗体、抗ＰＤ－１モノクローナル抗体、抗ｇｐ４９Ｂモノクローナル抗体、又は抗ＰＤ－１モノクローナル抗体と抗ｇｐ４９Ｂモノクローナル抗体との組み合わせを投与し、ＬＬＣ細胞を注入されたマウスの２１日後のＩｎ　ｖｉｖｏ　ｂｉｏｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ　ｉｍａｇｉｎｇの結果を示す。 野生型（ＷＴ）Ｂ６マウスに、Ｌｅｗｉｓ　ｌｕｎｇ　ｃａｒｃｉｎｏｍａ細胞（ＬＬＣ）を注入した後、対照アイソタイプＩｇＧ抗体、抗ＰＤ－１モノクローナル抗体、抗ｇｐ４９Ｂモノクローナル抗体、又は抗ＰＤ－１モノクローナル抗体と抗ｇｐ４９Ｂモノクローナル抗体との組み合わせを投与し、ＬＬＣ細胞を注入されたマウスの２１日後のＩｎ　ｖｉｖｏ　ｂｉｏｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ　ｉｍａｇｉｎｇの像をもとに、平均径（ｐｈｏｔｏｎｓ／ｓ／ｃｍ２／ｓｔｅｒａｄｉａｎ）でＢｉｏｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ解析し、各抗体処置群で比較した結果を示す。 野生型（ＷＴ）Ｂ６マウスに、Ｌｅｗｉｓ　ｌｕｎｇ　ｃａｒｃｉｎｏｍａ細胞（ＬＬＣ）を注入した後、対照アイソタイプＩｇＧ抗体、抗ＰＤ－１モノクローナル抗体、抗ｇｐ４９Ｂモノクローナル抗体、又は抗ＰＤ－１モノクローナル抗体と抗ｇｐ４９Ｂモノクローナル抗体との組み合わせを投与したマウスの肺と肝臓の病理切片の解析結果を示す。上段が肺表面、下段が肝臓のＨ＆Ｅ染色を示す。矢印は、がん転移巣の位置を示す。 対照アイソタイプＩｇＧ抗体、抗ｇｐ４９Ｂモノクローナル抗体Ｈ１．１、抗ｇｐ４９Ｂモノクローナル抗体Ｈ１．１のＦ（ａｂ’）２フラグメント又は抗ＦＮ３０モノクローナル抗体Ｎｏ．６添加による骨髄細胞からの破骨細胞への分化誘導の結果を示す。写真が破骨細胞のＴＲＡＰ染色像を示し、グラフは、各抗体添加による分化誘導率を示す。写真及びグラフにおいて、Ｍｏｃｋは抗体非添加の場合を示す。 抗ＬＩＬＲＢ４モノクローナル抗体ＺＭ４．１（右図）又はマウスＩｇＧ１κ（左図）を添加した場合の破骨細胞のＴＲＡＰ染色像を示す。 野生型Ｂ６マウス又はｇｐ４９Ｂ欠損マウスの骨髄細胞から破骨細胞を分化誘導した結果を示す。写真左が野生型Ｂ６マウスの骨髄細胞から分化した破骨細胞、写真右がｇｐ４９Ｂ欠損マウスの骨髄細胞から分化した破骨細胞のＴＲＡＰ染色像を示す。グラフは、野生型Ｂ６マウスの骨髄細胞、ｇｐ４９Ｂ欠損マウスの骨髄細胞からそれぞれ破骨細胞を分化誘導させた場合の分化誘導率を示す。ＷＴは野生型Ｂ６マウス、ｇｐ４９Ｂ－／－及びＫＯは、ｇｐ４９Ｂ欠損マウスを示す。 野生型Ｂ６マウスおよびｇｐ４９Ｂ欠損マウスの大腿骨中の破骨細胞のＴＲＡＰ染色像を示す。左図が野生型Ｂ６マウス、右図がｇｐ４９Ｂ欠損マウスの破骨細胞のＴＲＡＰ染色像を示す。
［免疫チェックポイント阻害剤］
　本発明の免疫チェックポイント阻害剤は、フィブロネクチンと免疫抑制性受容体ＬＩＬＲＢ４との結合を阻害する物質を有効成分として含有する。フィブロネクチンは、前記フィブロネクチン中の配列番号１で表されるアミノ酸配列を介して、ＬＩＬＲＢ４と結合することができる。すなわち、配列番号１で表されるアミノ酸配列は、ＬＩＬＲＢ４のフィブロネクチン中の標的配列である。
　フィブロネクチンとＬＩＬＲＢ４との結合を阻害する物質としては、フィブロネクチンとＬＩＬＲＢ４との結合を阻害する活性を有する物質であれば特に制限はないが、抗フィブロネクチン抗体又はその誘導体、抗ＬＩＬＲＢ４抗体又はその誘導体、フィブロネクチンアナログ等が挙げられる。
　抗フィブロネクチン抗体としては、フィブロネクチンと反応する抗体であれば、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体のいずれでも良いが、モノクローナル抗体が好ましく用いられる。当該抗体の作製は周知の方法にて作製することができる。例えば、ポリクローナル抗体の作製には、免疫する動物としてマウス、ラット、ハムスター、ウサギ、ヤギ、ヒツジ、ニワトリなどが用いられる。抗血清は、抗原を動物の皮下、皮内、腹腔などに一回又は複数回投与した後、血清から得ることができる。タンパク質、ペプチドを抗原として用いる時は、免疫賦活効果を有する補液との混合物の免疫がより好ましい。
　また、モノクローナル抗体の作製には、公知のモノクローナル抗体作製方法、例えば、長宗香明、寺田弘共著、「モノクローナル抗体」廣川書店（１９９０年）や、Ｊａｍｅ　Ｗ．Ｇｏｌｄｉｎｇ，“Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　Ａｎｔｉｂｏｄｙ”，３ｒｄ　ｅｄｉｔｉｏｎ，Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ，１９９６年に従い作製することができる。また、ＤＮＡ免疫法によりモノクローナル抗体を作製することもでき、Ｎａｔｕｒｅ　１９９２　Ｍａｒ１２；３５６　１５２－１５４やＪ．Ｉｍｍｕｎｏｌ　Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｍａｒ　１；２４９　１４７－１５４を参考に作製することができる。
　抗体作製に用いられる抗原としては、フィブロネクチン、又はその一部断片（ペプチド）、或いはフィブロネクチンまたはその一部断片をコードするｃＤＮＡを組み込んだベクターを用いることができる。フィブロネクチンとＬＩＬＲＢ４との結合を阻害するモノクローナル抗体を得るためには、フィブロネクチン中のＬＩＬＲＢ４の標的配列である配列番号１で表されるアミノ酸配列を含むペプチドを用いることが好ましい。配列番号１で表されるアミノ酸配列を含むペプチドをコードする遺伝子が入った構築物であるフィブロネクチンベクターが最適な免疫用抗原遺伝子として使用できる。ＤＮＡ免疫法は、上記遺伝子構築物を単独又は混合して、免疫動物に対して様々な遺伝子導入法（例えば筋肉注射、エレクトロポレーション、遺伝子銃など）のいずれかを用いて、動物（マウス、又はラット等）の皮下に注入し、細胞内に取り込ませることにより実施できる。
　前記抗フィブロネクチンモノクローナル抗体は、常法に従い作成したハイブリドーマを培養し、培養上清から分離する方法、該ハイブリドーマをこれと適合性のある哺乳類動物に投与し、腹水として回収する方法により製造できる。また、前記抗フィブロネクチンモノクローナル抗体は、公知の遺伝子組換え技術を用いて作製することもできる。具体的には、前記で作製したハイブリドーマが生産するモノクローナル抗体、前記抗体をコードする遺伝子をクローニングし、前記遺伝子を含むベクターを作製し、これを宿主細胞に導入して形質転換させることによって、抗フィブロネクチン抗体を発現する細胞を取得し、これを細胞培養することにより作製することができる。この調製に使用される細胞、ベクターの種類、細胞の種類、培養条件等は、当業者の技術的範囲内であり、適宜適切な条件を設定することができる。
　抗体は、必要に応じてそれをより精製して使用することができる。抗体を精製・単離する手法としては、従来公知の方法、例えば、硫酸アンモニウム沈殿法などの塩析、セファデックスなどによるゲルろ過法、イオン交換クロマトグラフィ法、プロテインＡカラムなどによるアフィニティ精製法等が挙げられる。
　抗フィブロネクチン抗体の誘導体としては、例えば、前記抗フィブロネクチン抗体のＦ(ａｂ’)２、Ｆ(ａｂ)２、Ｆａｂ’、Ｆａｂ、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、それらの変異体、抗体部分を含む融合タンパク質又は融合ペプチド等が挙げられる。抗フィブロネクチン抗体の誘導体は、公知の抗体の誘導体の製造方法に従って製造することができる。
　抗フィブロネクチン抗体又はその誘導体は、フィブロネクチン中の配列番号１で表されるアミノ酸配列またはその部分配列に結合する。本発明の免疫チェックポイント阻害剤において、抗フィブロネクチン抗体又はその誘導体は、フィブロネクチン中の配列番号１で表されるアミノ酸配列またはその部分配列に結合することにより、フィブロネクチンとＬＩＬＲＢ４との結合を阻害することができる。
　抗ＬＩＬＲＢ４抗体としては、ＬＩＬＲＢ４と結合する抗体であれば、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体のいずれでも良いが、モノクローナル抗体が好ましく用いられる。前記抗ＬＩＬＲＢ４抗体は前記抗フィブロネクチン抗体と同様の方法により作製することができる。
　抗ＬＩＬＲＢ４抗体作製に用いられる抗原としては、ＬＩＬＲＢ４タンパク質、又はその一部断片（ペプチド）、或いはＬＩＬＲＢ４タンパクをコードするｃＤＮＡを組み込んだベクターを用いることができる。ＬＩＬＲＢ４の高次構造を認識するモノクローナル抗体を得るために、ヒトＬＩＬＲＢ４全長遺伝子が入った構築物である全長ＬＩＬＲＢ４ベクターが最適な免疫用抗原遺伝子となるが、そのほか、ＬＩＬＲＢ４配列の一部領域が挿入された構築物も、免疫用抗原遺伝子として使用できる。ＬＩＬＲＢ４配列の一部領域としては、フィブロネクチン中のＬＩＬＲＢ４の標的配列である、配列番号１で表されるアミノ酸配列が、ＬＩＬＲＢ４に結合するＬＩＬＲＢ４の領域（フィブロネクチン結合部位）が好ましい。ＤＮＡ免疫法は、上記遺伝子構築物を単独又は混合して、免疫動物に対して様々な遺伝子導入法（例えば筋肉注射、エレクトロポレーション、遺伝子銃など）のいずれかを用いて、動物（マウス、又はラット等）の皮下に注入し、細胞内に取り込ませることにより実施できる。
　前記抗ＬＩＬＲＢ４抗体の精製は、前記抗フィブロネクチン抗体と同様の方法により行うことができる。前記抗ＬＩＬＲＢ４抗体の誘導体としては、例えば、前記抗ＬＩＬＲＢ４抗体のＦ(ａｂ’)２、Ｆ(ａｂ)２、Ｆａｂ’、Ｆａｂ、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、それらの変異体、抗体部分を含む融合タンパク質又は融合ペプチド等が挙げられる。
　本発明の免疫チェックポイント阻害剤において、抗ＬＩＬＲＢ４抗体又はその誘導体は、フィブロネクチンが、フィブロネクチン中の配列番号１で表されるアミノ酸配列を介してＬＩＬＲＢ４に結合することを阻害することができる。
　フィブロネクチンとＬＩＬＲＢ４の結合の阻害は、ＬＩＬＲＢ４を発現している細胞へのフィブロネクチンの結合を阻害することを評価することにより行うことができる。ＬＩＬＲＢ４を発現している細胞としては、ＬＩＬＲＢ４を発現している細胞であれば、特に制限はないが、例えば、脾臓細胞、末梢血白血球、骨髄細胞、もしくはそれらから単離されたＢ細胞、形質細胞、単球・マクロファージ、樹状細胞、好酸球、好塩基球、好中球、マスト細胞、活性化Ｔ細胞等が挙げられる。
　ＬＩＬＲＢ４の塩基配列及びアミノ酸配列は、米国生物工学情報センター（ＮＣＢＩ）により提供されているデータベースから知ることができる。ヒト（Ｈｏｍｏ　ｓａｐｉｅｎｓ）ＬＩＬＲＢ４の場合、例えばＥｎｔｒｅｚ　ＧｅｎｅＩＤは１１００６（２０１９年６月１７日時点）、ＲｅｆＳｅｑ　ＰｒｏｔｅｉｎＩＤはＮＰ＿００１２６５３５５．２、ＮＰ＿００１２６５３５６．２、ＮＰ＿００１２６５３５７．２、ＮＰ＿００１２６５３５８．２、ＮＰ＿００１２６５３５９．２（アイソフォーム１～５に相当）が挙げられる。マウス（Ｍｕｓ　ｍｕｓｃｕｌｕｓ）ＬＩＬＲＢ４としては、ＧｅｎｅＩＤは１４７２８（２０１６年６月２４日時点）、ＮＰ＿０３８５６０．１が挙げられ、ラット（Ｒａｔｔｕｓ　ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ）ＬＩＬＲＢ４としては、ＧｅｎｅＩＤは２９２５９４（２０１９年４月１８日時点）、ＲｅｆＳｅｑ　ＰｒｏｔｅｉｎＩＤはＮＰ＿００１０１３９１６が挙げられ、他の動物もＬＩＬＲＢ４を有することが知られている。上記のＬＩＬＲＢ４には限定されず、他のＬＩＬＲＢ４も本発明におけるＬＩＬＲＢ４に含まれる。
　フィブロネクチンの塩基配列及びアミノ酸配列は、米国生物工学情報センター（ＮＣＢＩ）により提供されているデータベースから知ることができる。ヒト（Ｈｏｍｏ　ｓａｐｉｅｎｓ）フィブロネクチンの場合、例えばＥｎｔｒｅｚ　ＧｅｎｅＩＤは２３３５、ＲｅｆＳｅｑ　ＰｒｏｔｅｉｎＩＤはＮＰ＿９９７６４７、ＮＰ＿００１３５２４４７、ＸＰ＿００５２４６４６３などが挙げられる。マウス（Ｍｕｓ　ｍｕｓｃｕｌｕｓ）フィブロネクチンとしては、ＧｅｎｅＩＤは１４２６８が挙げられ、ラット（Ｒａｔｔｕｓ　ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ）フィブロネクチンとしては、ＧｅｎｅＩＤは２５６６１、ＲｅｆＳｅｑ　ＰｒｏｔｅｉｎＩＤはＮＰ＿０６２０１６が挙げられ、他の動物もフィブロネクチンを有することが知られている。上記のフィブロネクチンには限定されず、他のフィブロネクチンも本発明におけるフィブロネクチンに含まれる。
　フィブロネクチンは、前記フィブロネクチン中の配列番号１で表されるアミノ酸配列を介して、形質細胞、Ｔ細胞、マクロファージ等の細胞表面に存在するＬＩＬＲＢ４と結合し、免疫チェックポイント分子を活性化する。言い換えれば、ＬＩＬＲＢ４は、フィブロネクチン中の配列番号１で表されるアミノ酸配列を介してフィブロネクチンと結合することにより、免疫抑制機能を発現する。
　本発明において、フィブロネクチンアナログとしては、フィブロネクチンとＬＩＬＲＢ４との結合を阻害する作用を有していれば、いかなるフィブロネクチンのアナログも包含するが、例えば、以下の（ａ）～（ｃ）のいずれか一つのペプチドが挙げられる。
（ａ）配列番号１で表されるアミノ酸配列を含むペプチド、
（ｂ）配列番号１で表されるアミノ酸配列において、１～数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、且つ、免疫抑制性受容体ＬＩＬＲＢ４のフィブロネクチン結合部位に対し結合能を有するペプチド、
（ｃ）配列番号１で表されるアミノ酸配列において、８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、且つ、免疫抑制性受容体ＬＩＬＲＢ４のフィブロネクチン結合部位に対し結合能を有するペプチド
　上記アミノ酸配列の同一性は、８０％以上であるが、８５％以上が好ましく、９０％以上がより好ましく、９５％以上がさらに好ましく、９８％以上がさらに好ましい。また、上記のアミノ酸配列の欠失、置換若しくは付加の数は、１～５個が好ましく、１～４個がより好ましく、１～３個がさらに好ましく、１～２個がさらに好ましい。アミノ酸配列の同一性は、ＧｅｎＢａｎｋデータベース上で提供されるＢＬＡＳＴ検索により求めることができる。
　前記フィブロネクチンアナログとしては、前記（ａ）～（ｃ）のいずれか一つのペプチドと免疫グロブリンＧのＦｃ領域とが融合したフィブロネクチンアナログであってもよい。
　前記フィブロネクチンアナログは、公知の方法、例えば、遺伝子組換え技術によって作製することができる。
　本発明の免疫チェックポイント阻害剤は、フィブロネクチンとＬＩＬＲＢ４との結合を阻害する物質を有効成分として含み、さらに薬学的に許容できる担体や添加物を含んでいてもよい。
　担体及び添加物の例としては、水、食塩水、リン酸緩衝液、デキストロース、グリセロール、エタノール等薬学的に許容される有機溶剤、コラーゲン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、カルボキシビニルポリマー、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ポリアクリル酸ナトリウム、アルギン酸ナトリウム、水溶性デキストラン、カルボキシメチルスターチナトリウム、ぺクチン、メチルセルロース、エチルセルロース、キサンタンガム、アラビアゴム、カゼイン、寒天、ポリエチレングリコール、ジグリセリン、グリセリン、プロピレングリコール、ワセリン、パラフィン、ステアリルアルコール、ステアリン酸、ヒト血清アルブミン、マンニトール、ソルビトール、ラクトース、界面活性剤等が挙げられるがこれらに限定されない。
　本発明の免疫チェックポイント阻害剤は、様々な形態、例えば、液剤（例えば注射剤）、分散剤、懸濁剤、錠剤、丸剤、粉末剤、坐剤等とすることができる。好ましい態様は、注射剤であり、非経口（例えば、静脈内、経皮、腹腔内、筋内）で投与することが好ましい。
　本発明の免疫チェックポイント阻害剤は、免疫チェックポイント関連疾患の治療剤として用いることができる。
　本発明の免疫チェックポイント阻害剤の投与量は、例えば、０．０２５～５０ｍｇ／ｋｇ、好ましくは０．１～５０ｍｇ／ｋｇであり、より好ましくは０．１～２５ｍｇ／ｋｇ、さらに好ましくは０．１～１０ｍｇ／ｋｇ又は０．１～３ｍｇ／ｋｇとすることができるが、これに限定されない。
［免疫チェックポイント関連疾患の治療剤］
　本発明の免疫チェックポイント関連疾患の治療剤は、フィブロネクチンとＬＩＬＲＢ４との結合を阻害する物質を有効成分として含有する。
　フィブロネクチンとＬＩＬＲＢ４との結合を阻害する物質としては、フィブロネクチンとＬＩＬＲＢ４との結合を阻害する活性を有する物質であれば特に制限はないが、抗フィブロネクチン抗体又はその誘導体、抗ＬＩＬＲＢ４抗体又はその誘導体、フィブロネクチンアナログ等が挙げられる。抗フィブロネクチン抗体又はその誘導体、抗ＬＩＬＲＢ４抗体又はその誘導体、及びフィブロネクチンアナログとしては、前記したものが挙げられる。
　本発明において、免疫チェックポイント関連疾患としては、免疫チェックポイント分子であるＬＩＬＲＢ４が関与する疾患であれば、特に制限はないが、例えば、自己免疫疾患、がん、炎症性疾患、アレルギー性疾患等が挙げられる。
　自己免疫疾患としては、例えば、バセドウ病、リウマチ関節炎、橋本甲状腺炎、１型糖尿病、全身性エリテマトーデス、血管炎、アジソン病、多発性筋炎、皮膚筋炎、乾癬、シェーグレン症候群、全身性強皮症、糸球体腎炎等が挙げられる。
　がんとしては、例えば、肺がん、大腸がん、腎がん、悪性黒色腫、ホジキンリンパ腫、頭頸部がん、膵がん、肝がん、前立腺がん、骨肉腫、白血病等が挙げられる。がんは、原発性であっても、転移性であってもよいが、転移性のがんに対して、好ましく用いられる。
　炎症性疾患としては、例えば、全身性エリテマトーデス、皮膚筋炎、川崎病、乾癬、帯状疱疹、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、気管支喘息、アトピー性皮膚炎、リウマチ関節炎、抗リン脂質抗体症候群、多発性筋炎、血管炎症候群、シェーグレン症候群、ベーチェット病、バセドウ病、橋本病、心筋炎、大動脈炎症候群、潰瘍性大腸炎、クローン病、原発性胆汁性肝硬変、自己免疫性肝炎、自己免疫性膵炎、多発性硬化症、重症筋無力症、ギラン・バレー症候群、糸球体腎炎、ＡＮＣＡ関連腎炎、アミロイドーシス、ＴＩＮＵ症候群、過敏性肺炎、好酸球性肺炎、サルコイドーシス等が挙げられる。
　アレルギー疾患としては、アレルギー性鼻炎、気管支喘息、じんましん・アトピー性皮膚炎、帯状疱疹、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、アレルギー性結膜炎、食物アレルギー、アナフィラキシー、自己免疫性容血性貧血、血小板減少症、顆粒球減少症、新生児容血性黄疸、血清病、過敏性肺炎、ループス腎炎（慢性糸球体腎炎）、全身性エリテマトーデス、接触皮膚炎、橋本病、ベーチェット病、臓器移植後の拒絶反応や移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）等が挙げられる。
　本発明の免疫チェックポイント関連疾患の治療剤は、ＬＩＬＲＢ４を活性化する物質を有効成分として含有してもよい。ＬＩＬＲＢ４を活性化する物質としては、ＬＩＬＲＢ４と結合することにより、ＬＩＬＲＢ４を活性化する物質であれば、特に制限はないが、例えば、抗フィブロネクチン抗体又はその誘導体、抗ＬＩＬＲＢ４抗体又はその誘導体、フィブロネクチン又はフィブロネクチンアナログ等が挙げられる。抗フィブロネクチン抗体又はその誘導体、抗ＬＩＬＲＢ４抗体又はその誘導体、フィブロネクチン又はフィブロネクチンアナログとしては、前記したものが挙げられるが、本発明のＬＩＬＲＢ４を活性化する物質を有効成分として含有する免疫チェックポイント関連疾患の治療剤においては、抗フィブロネクチン抗体又はその誘導体、抗ＬＩＬＲＢ４抗体又はその誘導体、フィブロネクチン又はフィブロネクチンアナログは、ＬＩＬＲＢ４と結合することにより、ＬＩＬＲＢ４を活性化し、ＬＩＬＲＢ４の免疫抑制機能を発現させる。
　本発明のＬＩＬＲＢ４を活性化する物質を有効成分として含有する免疫チェックポイント関連疾患の治療剤において、前記免疫チェックポイント関連疾患としては、ＬＩＬＲＢ４を活性化することによる免疫機能抑制により治療効果を有する疾患であれば特に制限はないが、例えば、リウマチ性関節炎、大理石骨病、骨粗鬆症等の骨疾患等が挙げられる。本発明のＬＩＬＲＢ４を活性化する物質は、例えば、破骨細胞の増殖を抑制することにより、骨疾患を治療することができる。
　本発明の免疫チェックポイント関連疾患の治療剤は、さらに薬学的に許容できる担体や添加物を含んでいてもよい。薬学的に許容できる担体及び添加物は、前記したものが挙げられる。
　本発明の免疫チェックポイント関連疾患の治療剤は、様々な形態、例えば、液剤（例えば注射剤）、分散剤、懸濁剤、錠剤、丸剤、粉末剤、坐剤等とすることができる。好ましい態様は、注射剤であり、非経口（例えば、静脈内、経皮、腹腔内、筋内）で投与することが好ましい。
　本発明の免疫チェックポイント関連疾患の治療剤の投与量は、例えば、０．０２５～５０ｍｇ／ｋｇ、好ましくは０．１～５０ｍｇ／ｋｇであり、より好ましくは０．１～２５ｍｇ／ｋｇ、さらに好ましくは０．１～１０ｍｇ／ｋｇ又は０．１～３ｍｇ／ｋｇとすることができるが、これに限定されない。
［免疫抑制剤］
　本発明の免疫抑制剤は、ＬＩＬＲＢ４を活性化する物質を有効成分として含有する。ＬＩＬＲＢ４を活性化する物質としては、前記免疫チェックポイント関連疾患の治療剤で挙げられたものが挙げられる。本発明のＬＩＬＲＢ４を活性化する物質を有効成分として含有する免疫抑制剤においては、抗フィブロネクチン抗体又はその誘導体、抗ＬＩＬＲＢ４抗体又はその誘導体、フィブロネクチン又はフィブロネクチンアナログは、ＬＩＬＲＢ４と結合することにより、ＬＩＬＲＢ４を活性化し、ＬＩＬＲＢ４の免疫抑制機能を発現させる。本発明の免疫抑制剤は、移植医療への応用が可能である。
　本発明の免疫抑制剤は、さらに薬学的に許容できる担体や添加物を含んでいてもよい。薬学的に許容できる担体及び添加物は、前記したものが挙げられる。
　本発明の免疫抑制剤は、様々な形態、例えば、液剤（例えば注射剤）、分散剤、懸濁剤、錠剤、丸剤、粉末剤、坐剤等とすることができる。好ましい態様は、注射剤であり、非経口（例えば、静脈内、経皮、腹腔内、筋内）で投与することが好ましい。
　本発明の免疫抑制剤の投与量は、例えば、０．０２５～５０ｍｇ／ｋｇ、好ましくは０．１～５０ｍｇ／ｋｇであり、より好ましくは０．１～２５ｍｇ／ｋｇ、さらに好ましくは０．１～１０ｍｇ／ｋｇ又は０．１～３ｍｇ／ｋｇとすることができるが、これに限定されない。
［フィブロネクチン検出キット及びフィブロネクチン検出方法］
　本発明のフィブロネクチンまたはその部分ペプチドを検出するためのキットは、配列番号１で表されるアミノ酸配列に結合する抗フィブロネクチン抗体又はその誘導体を含み、生体試料中の前記フィブロネクチンまたはその部分ペプチドを検出することができる。
　生体試料としては、特に制限はなく、例えば血液、唾液、尿、髄液、骨髄液、胸水、腹水、関節液、涙液、眼房水、硝子体液、リンパ液等が挙げられる。
　本発明のキットにおいて、フィブロネクチンの部分ペプチドとしては、抗フィブロネクチン抗体又はその誘導体が結合するものであれば特に制限はないが、配列番号１で表されるアミノ酸配列を含む分子量２４ｋＤａの部分ペプチドであることが好ましい。
　本発明のキットには、配列番号１で表されるアミノ酸配列に結合する抗フィブロネクチン抗体又はその誘導体の他に、フィブロネクチンの検出に必要な他の構成要素、例えば、反応緩衝液や反応容器を含むことができる。
　本発明のフィブロネクチンまたはその部分ペプチドを検出するためのキットを用いることにより、生体試料中のフィブロネクチンまたはその部分ペプチドを検出することができる。
　生体試料中のフィブロネクチンまたはその部分ペプチドを検出する方法としては、配列番号１で表されるアミノ酸配列に結合する抗フィブロネクチン抗体又はその誘導体を含み、生体試料中のフィブロネクチンまたはその部分ペプチドを検出することができれば特に制限はないが、前記抗フィブロネクチン抗体又はその誘導体を用いた免疫学的方法により測定することが好ましい。免疫学的方法としては、例えば免疫染色（ウエスタンブロット）、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）、サンドイッチＥＬＩＳＡ、免疫沈降法、免疫比濁法（ＴＩＡやＬＴＩＡ）、エンザイムイムノアッセイ、化学発光イムノアッセイ、蛍光イムノアッセイ、フローサイトメトリー法等に供し、フィブロネクチンまたはその部分ペプチドの分子量と一致するバンド若しくはスポット、又はピークを検出することにより行うことができるが、これらに限定されない。
　次に実施例を示して本発明を更に詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
［実施例１］マウスＴ細胞におけるＬＩＬＲＢ４の発現
　４８ウェルプレート（Ｔｈｅｒｍｏ社製、＃１５０６８７）に抗マウスＣＤ３抗体（ＢＤ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製、Ｃｌｏｎｅ：１４５－２Ｃ１１、＃５５３０５８）および抗マウスＣＤ２８抗体（ＢＤ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製、Ｃｌｏｎｅ：３７．５１、＃５５３２９８）を各々１０μｇ／ｍＬ濃度で含むＰＢＳ（－）緩衝液を１００μＬ加え室温で３０分間、ウェルをコーティングし、その後５００μＬのＰＢＳ（－）緩衝液で３回ウェルを洗浄した。１０週齢のメスのｇｐ４９Ｂ欠損マウスまたは野生型マウスの脾臓から採取した脾臓細胞を溶血処理後に１０％ウシ胎仔血清（ＢｉｏＷｅｓｔ社製、＃Ｓ１５３０）、５０μＭ　２－メルカプトエタノール（富士フィルム和光社製、＃１３９－０６８６１）、１％ペニシリン（５０００Ｕ／ｍｌ）／ストレプトマイシン（５０００μｇ／ｍＬ）溶液（Ｓｉｇｍａ社製、＃Ｐ４４５８）を含むＲＰＭＩ－１６４０培地（Ｓｉｇｍａ社製、＃Ｒ８７５８）に懸濁した。なお、ｇｐ４９Ｂは、マウスにおける、ヒトＬＩＬＲＢ４と相同な分子である。
　抗体をコーティングしたウェルに、懸濁した脾臓細胞を１×１０６細胞／２００μＬ／ウェルの濃度で播種し、３７℃、５％二酸化炭素の条件下で０～３日間培養した。細胞は、ウェルから回収した後、２％ウシ胎仔血清と０．０５％アジ化ナトリウム（Ｓｉｇｍａ社製、＃Ｓ８０３２）を含むＰＢＳ（－）緩衝液に懸濁し、氷温条件下で、ＦＩＴＣ標識抗マウスＣＤ４抗体（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ社製、Ｃｌｏｎｅ：ＧＫ１．５、＃１００４０６）、Ａｌｅｘａ６４７標識抗マウスＣＤ８ａ抗体（ＢＤ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製、Ｃｌｏｎｅ：５３－６．７、＃５５７８８２）、ＰＥ標識抗マウスｇｐ４９Ａ／Ｂ抗体（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ社製、Ｃｌｏｎｅ：Ｈ１．１、＃１４４９０４）、ＢＶ４２１標識抗マウスＰＤ－１抗体（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ社製、Ｃｌｏｎｅ：２９Ｆ．１Ａ１２、＃１３５２１８）、ＰｅｒＣＰ－Ｃｙ５．５標識抗マウスＴｉｍ－３（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ社製、Ｃｌｏｎｅ：Ｂ８．２Ｃ１２、＃１３４０１２）、アイソタイプコントロール抗体としてＰＥ標識アルメニアンハムスターＩｇＧ（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ社製、Ｃｌｏｎｅ：ＨＴＫ８８８、＃４００９０８）、ＢＶ４２１標識ラットＩｇＧ２ａ（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ社製、Ｃｌｏｎｅ：ＲＴＫ２７５８、＃４００５４９）、ＰｅｒＣＰ－Ｃｙ５．５標識ラットＩｇＧ１（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ社製、Ｃｌｏｎｅ：ＲＴＫ２０７１、＃４００４２６）を用いて染色し、ＢＤ　ＦＡＣＳＡｒｉａＩＩＩセルソーター（ＢＤ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）により測定し、ＦｌｏｗＪｏソフトウェア（ＢＤ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）によりデータを解析した。その結果を図１～５に示す。
　図１にマウスナイーブＣＤ８陽性Ｔ細胞におけるＢ４、ＰＤ－１、Ｔｉｍ－３の発現を示す。図１に示したように、マウスナイーブＣＤ８陽性Ｔ細胞では、わずかにＰＤ－１の発現が認められたが、Ｂ４およびＴｉｍ－３の発現は認められなかった。また、Ｂ４を欠損することでＰＤ－１やＴｉｍ－３の発現に影響は見られなかった。
　図２に、マウスＣＤ８陽性Ｔ細胞における抗ＣＤ３抗体／抗ＣＤ２８抗体刺激後のＢ４、ＰＤ－１、Ｔｉｍ－３の発現を示す。図２に示したように、抗ＣＤ３抗体／抗ＣＤ２８抗体による活性化刺激により、マウスＣＤ８陽性Ｔ細胞上のＰＤ－１の発現は１日目でほぼ極大となるが、Ｂ４とＴｉｍ－３の発現は１日目でわずかに発現が上昇し２日目以降で極大となり、ＰＤ－１の発現とは異なる調節を受けていることが示唆された。Ｂ４欠損ＣＤ８陽性Ｔ細胞では、抗ＣＤ３抗体／抗ＣＤ２８抗体による活性化刺激によりＰＤ－１の発現に影響は認めなかったが、Ｔｉｍ－３の発現に減弱が認められた。
　図３に、マウスナイーブＣＤ４陽性Ｔ細胞におけるＢ４、ＰＤ－１、Ｔｉｍ－３の発現を示す。図３に示したように、マウスナイーブＣＤ４陽性Ｔ細胞では、ＰＤ－１の弱いながらも明らかな発現が認められたが、Ｂ４およびＴｉｍ－３の発現は認められなかった。また、Ｂ４を欠損することでＰＤ－１やＴｉｍ－３の発現に影響は見られなかった。
　図４に、マウスＣＤ４陽性Ｔ細胞における抗ＣＤ３抗体／抗ＣＤ２８抗体刺激後のＢ４、ＰＤ－１、Ｔｉｍ－３の発現を示す。図４に示したように、抗ＣＤ３抗体／抗ＣＤ２８抗体による活性化刺激により、マウスＣＤ４陽性Ｔ細胞上のＰＤ－１の発現は１日目でほぼ極大となるが、Ｂ４とＴｉｍ－３の発現は１日目でわずかに発現が上昇し２日目以降で極大となり、ＰＤ－１の発現とは異なる調節を受けていることが示唆された。Ｂ４欠損ＣＤ４陽性Ｔ細胞では、抗ＣＤ３抗体／抗ＣＤ２８抗体による活性化刺激によりＰＤ－１の発現に影響は認めなかったがＴｉｍ－３の発現に減弱が認められた。
　図５に、マウスＣＤ８陽性Ｔ細胞およびＣＤ４陽性Ｔ細胞における抗ＣＤ３抗体／抗ＣＤ２８抗体刺激後のＢ４およびＰＤ－１の発現を示す。図５に示したように、マウスＣＤ８陽性Ｔ細胞およびＣＤ４陽性Ｔ細胞は、いずれもＰＤ－１の発現が先に上昇し、その後Ｂ４の発現が遅れて上昇し、ＰＤ－１とＢ４の二重陽性細胞となることが認められた。
　以上の結果から、Ｂ４は、マウスＴ細胞に発現し、ＰＤ－１やＴｉｍ－３とは異なる免疫チェックポイント分子であることが明らかとなった。
［実施例２］ヒトＴ細胞におけるＬＩＬＲＢ４の発現
　４８ウェルプレート（Ｔｈｅｒｍｏ社製、＃１５０６８７）に抗ヒトＣＤ３抗体（ＢＤ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製、Ｃｌｏｎｅ：ＵＣＨＴ１、＃５５５３２９）および抗ヒトＣＤ２８抗体（ＢＤ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製、Ｃｌｏｎｅ：ＣＤ２８．２、＃５５５７２５）を各々１０μｇ／ｍＬ濃度で含むＰＢＳ（－）緩衝液を１００μＬ加え室温で３０分間、ウェルをコーティングし、その後５００μＬのＰＢＳ（－）緩衝液で３回ウェルを洗浄した。凍結ヒト末梢血単核球（Ｃ．Ｔ．Ｌ．社製）を３７℃の温浴で急速解凍し、１０％ウシ胎仔血清、５０μＭ　２－メルカプトエタノール、１％ペニシリン（５０００Ｕ／ｍｌ）／ストレプトマイシン（５０００μｇ／ｍＬ）溶液、２０Ｕ／ｍｌ　ＤＮａｓｅ　Ｉ（Ｓｉｇｍａ社製、＃Ｄ５０２５）を含むＲＰＭＩ－１６４０培地（Ｓｉｇｍａ社製、＃Ｒ８７５８）に懸濁して一晩培養した後、細胞を回収してＮａｉｖｅ　Ｐａｎ　Ｔ　ｃｅｌｌ　Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ　Ｋｉｔ，ｈｕｍａｎ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ社製、＃１３０－０９７－０９５）を用いてＴ細胞を精製し、上記組成のＤＮａｓｅ　Ｉ不含の培地に懸濁した。抗体をコーティングしたウェルに、懸濁したＴ細胞を１×１０６細胞／２００μＬ／ウェルの濃度で播種し、３７℃、５％二酸化炭素の条件下で０～３日間培養した。細胞は、ウェルから回収した後、２％ウシ胎仔血清と０．０５％アジ化ナトリウムを含むＰＢＳ（－）緩衝液に懸濁し、氷温条件下で、ＦＩＴＣ標識抗ヒトＣＤ４抗体（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ社製、Ｃｌｏｎｅ：ＲＰＡ－Ｔ４、＃３００５０６）、Ａｌｅｘａ６４７標識抗ヒトＣＤ８ａ抗体（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ社製、Ｃｌｏｎｅ：ＲＰＡ－Ｔ８、＃３０１０２２）、ＰＥ標識抗ヒトＣＤ８５ｋ（ＬＩＬＲＢ４）抗体（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製、Ｃｌｏｎｅ：ＺＭ４．１、＃１２－５１３９－４２）、ＢＶ４２１標識抗ヒトＰＤ－１抗体（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ社製、Ｃｌｏｎｅ：ＥＨ１２．２Ｈ７、＃３２９９２０）、ＰｅｒＣＰ－Ｃｙ５．５標識抗ヒトＴｉｍ－３（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ社製、Ｃｌｏｎｅ：Ｆ３８－２Ｅ２、＃３４５０１６）、アイソタイプコントロール抗体としてＰＥ標識マウスＩｇＧ１，ｋ（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製、Ｃｌｏｎｅ：Ｐ３．６．２．８．１、＃１２－４７１４－４２）、ＢＶ４２１標識マウスＩｇＧ１（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ社製、Ｃｌｏｎｅ：ＭＯＰＣ－２１、＃４００１５８）、ＰｅｒＣＰ－Ｃｙ５．５標識マウスＩｇＧ１（ＢＤ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製、Ｃｌｏｎｅ：ＭＯＰＣ－２１、＃５５２８３４）を用いて染色し、ＢＤ　ＦＡＣＳＡｒｉａＩＩＩセルソーター（ＢＤ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）により測定し、ＦｌｏｗＪｏソフトウェア（ＢＤ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）によりデータを解析した。
　図６に、ヒトＣＤ８陽性Ｔ細胞およびＣＤ４陽性Ｔ細胞における抗ＣＤ３抗体／抗ＣＤ２８抗体刺激後のＢ４、ＰＤ－１、Ｔｉｍ－３の発現を示す。図６に示したように、ヒトＣＤ８陽性Ｔ細胞およびＣＤ４陽性Ｔ細胞は、無刺激（０日目）ではＢ４、ＰＤ－１、Ｔｉｍ－３のいずれも発現が認められなかった。しかし、抗ＣＤ３抗体／抗ＣＤ２８抗体による活性化刺激により、ＰＤ－１とＴｉｍ－３と同様にＢ４の発現上昇が認められた。
　以上の結果から、Ｂ４は、ヒトＴ細胞に発現し、ＰＤ－１やＴｉｍ－３とは異なる免疫チェックポイント分子であることが明らかとなった。
［実施例３］フィブロネクチンのＬＩＬＲＢ４への結合部位の解析
　ヒトフィブロネクチンは２ｑ３５に位置する単一の遺伝子から転写される多種のｍＲＮＡアイソフォームから翻訳され、一般的には２６残基のシグナルペプチドを含めて２２４０～２４８３個のアミノ酸残基からなる。フィブロネクチンは血漿中では可溶性の二量体として存在し、細胞表面や細胞外マトリックス（ＥＣＭ）では二量体あるいは多量体として存在している。二量体のフィブロネクチンは二本のほぼ同一の２１０ｋＤａ～２５０ｋＤａのポリペプチドがＣ末端近くで２つのジスルフィド結合した構造であり、各ポリペプチドは多数の機能的モデュールから構成され、これらモデュールはフィブリン、コラーゲン、インテグリン、ヘパリン、シンデカン、およびフィブロネクチンを含む他のタンパク質と結合する性質を有している。
　フィブロネクチン中のＢ４結合サイトを同定するためにそれらモデュールを含む個別のドメインをレポーター細胞アッセイおよびＢＬＩ（Ｂｉｏ－ｌａｙｅｒ　ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｍｅｔｒｙ）解析でＢ４結合性を解析した。
　ＢＬＩ解析はＢＬＩｔｚを用いて次のようにして行った。ヒトＨｉｓタグ付きヒトＬＩＬＲＢ４をＮｉ－ＮＴＡセンサーに固相化し、結合しなかったタンパク質はリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で洗い落とした。このセンサーを被験タンパク質に浸した後、ＰＢＳに浸して解離させた。曲線回帰とデータ処理はＢＬＩｔｚ　Ｐｒｏソフトで行った。
　レポーター細胞アッセイは、細胞外ドメインがヒトＬＩＬＲＢ４で、膜貫通ドメインと細胞内ドメインが活性化型ｐａｉｒｅｄ　ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ－ｌｉｋｅ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ　ｂｅｔａであるキメラレセプターを用い、ＮＦＡＴ－ＧＦＰレポーター遺伝子およびＤＡＰ１２を発現するマウスＴ細胞ハイブリドーマ細胞株にレトロウィルスベクターを用いてトランスフェクトし、得られた５×１０４個のレポーター細胞を被験タンパク質と培養し、ＧＦＰの発現をフローサイトメトリーで解析することにより行った。
　その結果、ヒトフィブロネクチンのＮ末端のカテプシンＤ消化断片７０ｋＤａポリペプチドとそのトリプシン消化断片であるＮ末端側の３０ｋＤａフラグメントに結合性があり、Ｃ末端側の４５ｋＤａ断片にはレポーター細胞アッセイおよびＢＬＩ解析で結合性が無かった。フィブロネクチンのよりＣ末端側の部分、すなわちアミノ酸残基６０７～１２６５、１２６６～１９０８、１２７７～２４７７はレポーター細胞アッセイでも、ＢＬＩ解析でもシグナルを誘導しなかった。この結果から、フィブロネクチン中のＢ４結合サイトはＮ末端の３０ｋＤａフラグメント（ＦＮ３０）中にあることが示された。
　さらに、ペプチドマッピングをＦＮ３０の２０アミノ酸残基ごとにそれぞれ８残基ずつオーバーラップさせて行ったところ、Ｃｙｓ１２３～Ｈｉｓ１４２のアミノ酸配列（ＣｙｓＴｈｒＣｙｓＩｌｅＧｌｙＡｌａＧｌｙＡｒｇＧｌｙＡｒｇＩｌｅＳｅｒＣｙｓＴｈｒＩｌｅＡｌａＡｓｎＡｒｇＣｙｓＨｉｓ）だけがレポーター細胞で顕著なシグナルを誘導した。フィブロネクチンのＣｙｓ１２３～Ｈｉｓ１４２のアミノ酸配列を配列番号１に示す。この結果から、フィブロネクチンは、配列番号１で表されるアミノ酸配列を介してＢ４に結合することが明らかとなった。
［実施例４］組換えフィブロネクチン標的配列－Ｆｃ融合タンパク質の調製
　ヒトフィブロネクチンのＮ末端３０ｋＤａ（４０番グルタミン残基～２８２番グリシン残基に相当、Ｓｉｇｍａ社製、＃９９１１、以下、ＦＮ３０とも称する）をマウスＩｇＧ２ａのＦｃと融合させた組換えタンパク質（以下、ＦＮ３０－Ｆｃとも称する）を以下の手順で調製した。
　ＦＮ３０をコードするＤＮＡフラグメントをヒト間葉系幹細胞由来のｍＲＮＡから以下のプライマーで増幅した。
　ＦＮ３０　フォワードプライマー：５’－ＡＴＡＧＡＡＴＴＣＧＣＡＧＴＣＣＣＣＧＧＴＧＧＣＴＧＴＣＡＧＴ－３’（配列番号２）
　ＦＮ３０　リバースプライマー：５’－ＴＴＡＡＧＡＴＣＴＴＣＣＧＣＴＣＧＡＴＧＴＧＧＴＣＴＧＣＡＣ－３’（配列番号３）
　増幅されたＦＮ３０　ＤＮＡフラグメントをＥｃｏ　ＲＩとＢｇｌ　ＩＩで消化し、ｐＦＵＳＥ－ｍＩｇＧ２Ａｅ１－Ｆｃ２ベクターのそれぞれのサイトに挿入した。本ベクターはＦｃ部分に、ＩｇＧ２ａのＦｃが本来有する抗体依存性細胞障害活性（ＡＤＣＣ）と補体依存性細胞障害活性（ＣＤＣ）を低減させるためにＬ２３５Ｅ、Ｅ３１８Ａ、Ｋ３２０Ａ、Ｋ３２２Ａの変異を導入したものである。
　得られたプラスミドｐＦＵＳＥ－ｍＩｇＧ２Ａｅ１－Ｆｃ２／ＦＮ３０を配列解析して確認した後、タンパク質発現に供した。ＦＮ３０－Ｆｃの発現のため、本プラスミドをＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ　２０００を用いてＣＨＯ－Ｋ１細胞にトランスフェクトし、安定導入細胞クローンを、Ｚｅｏｃｉｎ（０．８ｍｇ／ｍｌ）で選択した後、限外希釈法で得た。組換えＦＮ３０－Ｆｃは細胞培養上清からＨｉＴｒａｐ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｇ　ＨＰカラムで精製した後、ＰＢＳ（－）に対して透析した。
［実施例５］抗フィブロネクチン抗体の調製
　ヒト血漿由来フィブロネクチンをカテプシンＤ処理して得られる７０ｋＤａ断片をトリプシン処理後にヘパリン結合性を利用して精製したフィブロネクチンのＮ末端側３０ｋＤａ断片（ＦＮ３０；Ｓｉｇｍａ社製、＃９９１１）を抗原としてＷＫＹラットに免疫し、腸骨リンパ節細胞を５０％ポリエチレングリコール存在下でミエローマ細胞と融合させハイブリドーマを得た。ヒトＦＮ３０、実施例４で得られたＦＮ３０－Ｆｃ、マウスＦＮ（Ａｂｃａｍ社製、＃ａｂ９２７８４）、ＦＮ３０の合成ペプチド断片を用いたＥＬＩＳＡで選択することで、抗フィブロネクチンモノクローナル抗体（以下、ＦＮ３０モノクローナル抗体とも称する）を産生するハイブリドーマを９クローン得た。樹立した９種類の抗ＦＮ３０モノクローナル抗体のクローン名、アイソタイプ、マウスＭＳＣとの結合性、ヒトＭＳＣとの結合性を表１に示す。表中、（－）は結合性なし、（＋）は弱結合性、（＋＋）は強結合性をそれぞれ表す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
［実施例６］抗フィブロネクチン抗体のブロッキング効果
　ヒト骨髄由来間葉系幹細胞（ＰｒｏｍｏＣｅｌｌ社製、＃Ｃ－１２９７４）を間葉系幹細胞増殖培地（ＰｒｏｍｏＣｅｌｌ社製、Ｃ－２８００９）に懸濁して１×１０５細胞／３００μＬ／ウェルで４８ウェルプレートに播種し、３７℃、５％二酸化炭素の条件下で培養した。培養２４時間後の間葉系幹細胞がプレートに十分に張り付いた状態において、培地を吸引して取り除き、実施例５で得られた抗ＦＮ３０モノクローナル抗体（Ｎｏ．１～Ｎｏ．９）２０μｇ／ｍＬを含むＰＢＳ（－）緩衝液３００μＬを添加して３７℃で１時間反応させた。その後、抗ＦＮ３０モノクローナル抗体を含むＰＢＳ（－）緩衝液を吸引して取り除き、０．５％ウシ胎仔血清、５０μＭ　２－メルカプトエタノール、１％ペニシリン（５０００Ｕ／ｍｌ）／ストレプトマイシン（５０００μｇ／ｍＬ）溶液を含むＲＰＭＩ－１６４０培地５００μＬで２回ウェルを洗浄し、同じ組成のＲＰＭＩ－１６４０培地に懸濁したＢ４キメラ受容体ＧＦＰレポーター細胞（Ｂ４－２Ｂ４細胞）またはキメラ受容体を発現していないコントロールＧＦＰレポーター細胞（２Ｂ４細胞）を１×１０５細胞／２００μＬ／ｗｅｌｌで播種し、３７℃、５％二酸化炭素の条件下で１８時間培養した。細胞は、ウェルから回収した後、２％ウシ胎仔血清と０．０５％アジ化ナトリウムを含むＰＢＳ（－）緩衝液に懸濁し、ＢＤ　ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒフローサイトメーター（ＢＤ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）により測定し、ＦｌｏｗＪｏソフトウェアによりデータを解析した。その結果を図７に示す。
　図７に示したように、抗ＦＮ３０モノクローナル抗体Ｎｏ．１～５、７～９で処理した場合は、抗体なしの陽性コントロールと同等のＧＦＰ発現を示しているのに対し、抗ＦＮ３０モノクローナル抗体Ｎｏ．６で処理した場合は、レポーター細胞のみの陰性コントロールと同等のＧＦＰ発現であることから、Ｎｏ．６抗体はＦＮ３０とＢ４との結合を阻害する抗体であると言える。
［実施例７］各抗ヒトＦＮ３０モノクローナル抗体の交差性（マウス骨髄由来間葉系幹細胞（ＭＳＣ）およびヒト骨髄由来間葉系幹細胞の染色）
　酵素処理等をせずにシャーレからピペッティングにより回収したマウス骨髄由来間葉系幹細胞（Ｃｙａｇｅｎ社製、＃ＭＵＢＭＸ－０１００１）およびヒト骨髄由来間葉系幹細胞を２％ウシ胎仔血清と０．０５％アジ化ナトリウムを含むＰＢＳ（－）緩衝液に懸濁し、氷温条件下で、実施例５で得られた抗ＦＮ３０モノクローナル抗体またはＰＥ標識ラットＩｇＧ１，ｋ（ＢＤ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製、Ｃｌｏｎｅ：Ｒ３－３４、＃５５３９２５）で処理し、洗浄後にＰＥ標識ヤギ抗ラットＩｇＧポリクローナル抗体（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ社製、＃４０５４０６）で染色し、ＢＤ　ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒフローサイトメーターにより測定し、ＦｌｏｗＪｏソフトウェアによりデータを解析した。その結果を図８に示す。
　図８に示したように、抗ＦＮ３０モノクローナル抗体Ｎｏ．４、Ｎｏ．５、及びＮｏ．６は、マウスＭＳＣおよびヒトＭＳＣのいずれも強く染色し、Ｎｏ．７抗体は、マウスＭＳＣおよびヒトＭＳＣを弱く染色した。Ｎｏ．９抗体は、ヒトＭＳＣのみを弱く染色した。Ｎｏ．１、Ｎｏ．２、Ｎｏ．３、及びＮｏ．８抗体は、いずれのＭＳＣも染色しなかった。
［実施例８］ヒトおよびマウスがん細胞株におけるフィブロネクチン（ＦＮ３０）細胞表面発現
　酵素処理等をせずにシャーレからピペッティングにより回収したマウスがん細胞株のＢ１６Ｆ１０（メラノーマ）、３ＬＬ（ルイス肺がん）、ヒトがん細胞株のＤａｕｄｉ（バーキットリンパ腫）、ＨＬ６０（前骨髄球性白血病）、ＨｅＬａ（子宮頸部類上皮腫）、ＨｅｐＧ２（肝細胞がん）、Ｓａｏｓ－２（骨肉腫）を２％ウシ胎仔血清と０．０５％アジ化ナトリウムを含むＰＢＳ（－）緩衝液に懸濁し、氷温条件下で抗ＦＮ３０モノクローナル抗体（Ｎｏ．５）またはＰＥ標識ラットＩｇＧ２ａ，ｋ（ＢＤ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製、Ｃｌｏｎｅ：Ｒ３５－９５、＃５５４６８９）で処理し、洗浄後にＡｌｅｘａ４８８標識ヤギ抗ラットＩｇＧポリクローナル抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製、＃Ａ－１１００６）で染色し、ＢＤ　ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒフローサイトメーターにより測定し、ＦｌｏｗＪｏソフトウェアによりデータを解析した。その結果を図９に示す。
　図９に示したように、マウスがん細胞株におけるフィブロネクチン（ＦＮ３０）の細胞表面での発現は、Ｂ１６Ｆ１０で弱く、３ＬＬで強いことが認められた。ヒトがん細胞株においては、Ｄａｕｄｉ、ＨＬ６０、ＨｅＬａで細胞表面発現が無く、ＨｅｐＧ２およびＳａｏｓ－２で強い細胞表面での発現が認められた。
［実施例９］腫瘍内浸潤リンパ球のＢ４およびＰＤ－１の発現
　野生型マウスの左足大腿部に、５×１０５細胞／１００μＬ／匹のＢ１６Ｆ１０細胞または３ＬＬ細胞を皮下接種し、その後、直径が１．５ｃｍ程度に成長した段階でマウスを炭酸ガスの過剰吸引により安楽死させ、腫瘍を取り出してＴｕｍｏｒ　Ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ　Ｋｉｔ，ｍｏｕｓｅ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ社製、＃１３０－０９６－７３０）とｇｅｎｔｌｅＭＡＣＳ　Ｄｉｓｓｏｃｉａｔｏｒ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ社製、＃１３０－０９３－２３５）を用いて単細胞懸濁液を調製し、Ｐｅｒｃｏｌｌ（ＧＥ　Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製、＃１７０８９１０２）による比重分離によりリンパ球を回収した。回収した細胞は、２％ウシ胎仔血清と０．０５％アジ化ナトリウムを含むＰＢＳ（－）緩衝液に懸濁し、氷温条件下で、ＦＩＴＣ標識抗マウスＣＤ４抗体、Ａｌｅｘａ６４７標識抗マウスＣＤ８ａ抗体、ＰＥ標識抗マウスｇｐ４９Ａ／Ｂ抗体、ＢＶ４２１標識抗マウスＰＤ－１抗体、アイソタイプコントロール抗体としてＰＥ標識アルメニアンハムスターＩｇＧ、ＢＶ４２１標識ラットＩｇＧ２ａを用いて染色し、ＢＤ　ＦＡＣＳＡｒｉａＩＩＩセルソーターにより測定し、ＦｌｏｗＪｏソフトウェアによりデータを解析した。その結果を図１０及び図１１に示す。
　図１０に、腫瘍内浸潤リンパ球（マウスＣＤ８陽性Ｔ細胞）のＢ４およびＰＤ－１の発現を示す。図１０に示したように、Ｂ１６Ｆ１０の腫瘍内に浸潤しているＣＤ８陽性Ｔ細胞の一部にＢ４およびＰＤ－１の発現が認められ、そのうちの大部分がＢ４とＰＤ－１二重陽性細胞であり、Ｂ４単独陽性細胞も認められた。３ＬＬの腫瘍内に浸潤しているＣＤ８陽性Ｔ細胞は、ほとんどがＢ４陽性であり、そのうちの８０％以上がＰＤ－１も陽性であった。
　図１１に腫瘍内浸潤リンパ球（マウスＣＤ４陽性Ｔ細胞）のＢ４およびＰＤ－１の発現を示す。図１１に示したように、Ｂ１６Ｆ１０の腫瘍内に浸潤しているＣＤ４陽性Ｔ細胞の一部にＢ４およびＰＤ－１の発現が認められ、Ｂ４とＰＤ－１二重陽性細胞とＢ４単独陽性細胞も認められた。３ＬＬの腫瘍内に浸潤しているＣＤ４陽性Ｔ細胞は、ほとんどがＢ４とＰＤ－１二重陽性細胞であった。
［実施例１０］血漿サンプルの抗フィブロネクチンポリクローナル抗体、抗フィブロネクチンモノクローナル抗体によるタンパク検出（ウェスタンブロット法）
　血漿サンプルとして、健常男性（年齢：２５～３１歳）血液を用い、血液１０．５ｍｌ／人をベノジェクトII真空採血管（登録商標）に採取し，ユニバーサル冷却遠心機（ＫＵＢＯＴＡ　Ｓ９１１）にて２５００ｒｐｍ×３分間遠心分離し、血漿を分離・回収した。
　血漿サンプルを超純水にて１５倍希釈し，還元剤（１Ｍ　β－ＭＥ）および界面活性剤（４％ＳＤＳ）を添加し９５℃×５分間加熱後の還元条件下で、７．５％アクリルアミドゲルで泳動した。泳動後、分離したタンパクをポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）膜に転写した。得られたブロットは一次抗体として、抗ＦＮポリクローナル抗体、及び実施例５で得られた抗ＦＮ３０モノクローナル抗体Ｎｏ．４及びＮｏ．５、二次抗体として、それぞれ抗ｒａｂｂｉｔ　ＩｇＧ－ＨＲＰ抗体（ｃｅｌｌ　ｓｉｇｎａｌｉｎｇ社製、＃７０７４）、抗ｒａｔ　ＩｇＧ－ＨＲＰ抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社製、Ｃｌｏｎｅ：Ｐｏｌｙ４０５４、＃４０５４０５）を添加した後、基質にＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ社製Ｐｉｅｒｃｅ　ＥＣＬ　Ｗｅｓｔｅｒｎ　Ｂｌｏｔｔｉｎｇ　Ｓｕｂｓｔｒａｔｅを用いて、染色を行った。画像解析にはＧＥヘルスケア社製ＩｍａｇｅＱｕａｎｔ　ＬＡＳ　４０００ｍｉｎｉを用いた。結果を図１２に示す。
　図１２に示したように、抗ＦＮ３０モノクローナル抗体Ｎｏ．４、Ｎｏ．５で２５０ｋＤａのバンドを確認した。抗ＦＮポリクローナル抗体および抗ＦＮ３０モノクローナル抗体のいずれにおいても分子量約２４ｋＤａのバンドがみられ、健常ヒト血漿中の２４ｋＤａのＦＮ断片の存在を確認した。
［実施例１１］抗フィブロネクチン抗体を用いた健常ヒト血漿中フィブロネクチン全長分子、及びフィブロネクチン２４ｋＤａ断片の定量（ＥＬＩＳＡ法）
　実施例５で得られた抗ＦＮ３０モノクローナル抗体Ｎｏ．６およびＣｏｌｌａｇｅｎ　ｂｉｎｄｉｎｇ－ＦＮを抗原とする抗ＦＮ４４ｋＤａ抗体（Ｏｒｉｇｅｎｅ社製、Ｃｌｏｎｅ：ＯＴＩ３Ｆ９、以下、抗ＦＮ４４抗体とも称する）及びポリクローナル抗体であるＡｎｔｉ－Ｆｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎ　ａｎｔｉｂｏｄｙ　ｐｒｏｄｕｃｅｄ　ｉｎ　ｒａｂｂｉｔ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社製、＃Ｆ３６４８、以下、抗ＦＮポリクローナル抗体とも称する）を使用し、９６ウェルプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ　Ｂｉｏ－ｏｎｅ社製、ＭＩＣＲＯＬＯＮ（登録商標））に各モノクローナル抗体を終濃度４μｇ／ｍｌとなるよう炭酸バッファー（ＮａＨＣＯ３　０．０１Ｍ）にて希釈し、４℃、１２時間静置にてプレートをコーティングした。１％ＢＳＡ含有ＰＢＳにてブロッキング後、スタンダードＦＮタンパク（Ｒ＆Ｄ社製、Ｆｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎ　ＥＬＩＳＡ　ＤｕｏＳｅｔ）および健常ヒト血漿を加えた。
　モノクローナル抗体に結合したフィブロネクチン量は抗ＦＮポリクローナル抗体（１３５００倍希釈）および抗ｒａｂｂｉｔ　ＩｇＧ－ＨＲＰ抗体（２５０倍希釈）を用いて検出した。各操作間のプレート洗浄にはＴＢＳ　０．１％Ｔｗｅｅｎ２０を使用した。基質を加えたのち，マイクロプレートリーダー（ＢｉｏＲａｄ社製、Ｍｏｄｅｌ　６８０）にて波長４５０ｎｍの吸光度測定し数値化した。
　スタンダードタンパクの吸光度をもとに４パラメーターロジスティック回帰にて非線形近似を行い、サンプルの吸光度値より濃度を算出した。その結果を図１３に示す。抗ＦＮ３０モノクローナル抗体で検出されるフィブロネクチン濃度［Ａ（μｇ／ｍｌ）］と抗ＦＮ４４抗体で検出されるフィブロネクチン濃度［Ｂ（μｇ／ｍｌ）］は図１３に示した濃度と考えられる。
　フィブロネクチン全長分子をｘμｇ／ｍｌ、２４ｋＤａ欠損フィブロネクチンをｙμｇ／ｍｌ、２４ｋＤａフィブロネクチンをｚμｇ／ｍｌとすると、２４ｋＤａ欠損フィブロネクチンと２４ｋＤａフィブロネクチンがいずれも分解産物であること、二次抗体の結合するポリクローナル抗体は分子量におおむね比例することを考慮すると下記式の関係になる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000002
 　この式から、ｘ、ｙ及びｚは下記の式で算出される。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000003
　結果を、第一、第二、第三四分位点および最大値、最小値を表した箱ひげ図表示として示した（図１４）。この結果、フィブロネクチン全長分子濃度は２７９±１３１μｇ／ｍｌであり、公知のＦＮ濃度（３００μｇ／ｍｌ）に合致した。抗ＦＮ３０モノクローナル抗体Ｎｏ．６及び抗ＦＮ４４抗体を用いて各濃度の差分を利用し、血漿中のＦＮ２４ｋＤａ濃度は６．４９±７．４４μｇ／ｍｌと算出された。
［実施例１２］ＦＮ３０の自己抗体疾患に対する治療効果
　ＦＮ３０の阻害がｇｐ４９Ｂとフィブロネクチンとの結合を阻害して病原性のプラズマセルによる自己抗体産生に対して治療的な効果を示すかどうかを以下のようにして検証した。
　ＢＸＳＢ／ＹａａマウスにコントロールＩｇＧまたは実施例４で得られたＦＮ３０－Ｆｃを腹腔内投与することを２週間の間隔で２回繰り返した。その結果を図１５に示す。
　図１５に示したように、コントロールＩｇＧを投与されたマウスの群は抗ｄｓＤＮＡ　ＩｇＧ血清抗体価が徐々に上昇したが、ＦＮ３０－Ｆｃ投与群では観察した期間中、ＩｇＧ自己抗体レベルは比較的一定に保たれた。
　この抑制効果はＢＸＳＢ／Ｙａａマウスに、ＦＮ３０－Ｆｃ投与と同様のスケジュールで抗ｇｐ４９Ｂモノクローナル抗体Ｈ１．１を腹腔内に投与することでも同様に観察された（図１６）。自己抗体価の上昇抑制は脾臓重量、総脾臓細胞数、総骨髄細胞数、脾臓と骨髄中のプラズマセルの割合、脾臓中のｄｓＤＮＡ自己抗体産生細胞の頻度などに特段の影響を与えていなかった。
　これらの結果はＦＮ３０－Ｆｃあるいは抗ｇｐ４９Ｂモノクローナル抗体Ｈ１．１をＢＸＳＢ／Ｙａａマウスに投与することで、抗体産生細胞を特に消去させることなく、抗ｄｓＤＮＡ　ＩｇＧの更なる上昇を抑制したと示唆された。これらの結果から、ＦＮ－３０及び抗Ｂ４抗体は、Ｂ４とＦＮとの結合をブロックすることにより、自己免疫疾患を緩和させる効果があると考えられる。
［実施例１３］がん転移におけるＬＩＬＲＢ４の関与
　ＬＩＬＲＢ４（マウスではｇｐ４９Ｂ）が腫瘍の転移に関与するかどうかを評価するため、野生型（ＷＴ）Ｂ６マウスおよびｇｐ４９Ｂ欠損マウスにＬｅｗｉｓ　ｌｕｎｇ　ｃａｒｃｉｎｏｍａ細胞（ＬＬＣ）又はマウスメラノーマ細胞Ｂ１６Ｆ１０を尾静脈から注入し、それぞれ３０日、２０日経過後、肺と肝臓を摘出し、Ｈ＆Ｅ染色または表面の腫瘍結節数をカウントして評価した。ＬＬＣ注入の結果を図１７Ａ～図１７Ｄに、Ｂ１６Ｆ１０注入の結果を図１８Ａ、図１８Ｂ及び図１９示す。
　図１７Ａ及び図１７Ｂに示したように、ＬＬＣの肺への転移はＷＴに比べ、ｇｐ４９Ｂ欠損マウスで低下した。また、図１７Ｃ及び図１７Ｄに示したように、腫瘍が転移した部位はＬＬＣを注入されたＷＴマウスの肝臓のみに見られ、ｇｐ４９Ｂ欠損マウスの肝臓では観察されなかった。
　Ｂ１６Ｆ１０については、図１８Ａ及び図１８Ｂに示したように、ｇｐ４９Ｂ欠損マウスでは肺の総表面の腫瘍結節数が優位に低下（図１８Ａ）し、肝臓への転移も低下した（図１８Ｂ）。
　次に、Ｃ５７ＢＬ／６ＮＪｃｌマウスを８．５Ｇｙで全身放射線照射を行い、１日後に野生型およびｇｐ４９Ｂ欠損マウス由来の骨髄細胞を尾静脈から５×１０６細胞／匹で注射して移入した。養子移入後、マウスを１ヶ月間、ｇｅｎｔａｍｙｃｉｎで処置し、移入後４週間の時点で総血液像をフローサイトメーターでドナー細胞の置換状態を確認した。その結果を図１９に示す。図１９に示したように、肺と肝臓への転移はｇｐ４９Ｂ欠損の骨髄細胞を養子移入されたマウスでは野生型マウスの骨髄細胞を養子移入されたコントロールマウスよりも低下していた。これらの結果から、ｇｐ４９Ｂは腫瘍細胞の転移に関与することが示された。
［実施例１４］ＬＩＬＲＢ４阻害によるがん転移抑制効果
　実施例１２で示したように、ｇｐ４９Ｂを欠損すると腫瘍の転移が減少することから、抗ｇｐ４９Ｂモノクローナル抗体Ｈ１．１を使ってｇｐ４９Ｂを阻害することで腫瘍の転移がどのように影響を受けるかを以下のようにして調べた。
　Ｂ１６Ｆ１０を注入されたＢ６マウスに対照アイソタイプＩｇＧ抗体、抗ＰＤ－１モノクローナル抗体、抗ｇｐ４９Ｂモノクローナル抗体、あるいは抗ＰＤ－１モノクローナル抗体と抗ｇｐ４９Ｂモノクローナル抗体の組み合わせで、６回腹腔内注射し、抗体の投与後、肺の腫瘍結節数、肝臓の転移巣数を評価した。その結果を図２０Ａ～図２０Ｄに示す。
　図２０Ａ～図２０Ｄに示したように、抗ｇｐ４９Ｂモノクローナル抗体処理群は、抗ＰＤ－１モノクローナル抗体処理群、あるいは抗ｇｐ４９Ｂモノクローナル抗体と抗ＰＤ－１モノクローナル抗体の組み合わせで処理した群と同等に、肺、肝臓ともＢ１６Ｆ１０腫瘍の転移巣数が低下した。さらに、Ｂ６マウスにルシフェラーゼ発現するＬＬＣ（ＬＬＣ－Ｌｕｃ２）を注射して、対照アイソタイプＩｇＧ抗体、抗ＰＤ－１モノクローナル抗体、抗ｇｐ４９Ｂモノクローナル抗体、あるいは抗ＰＤ－１モノクローナル抗体と抗ｇｐ４９Ｂモノクローナル抗体の組み合わせの効果を調べたところ、抗ｇｐ４９Ｂモノクローナル抗体処理群、及び抗ＰＤ－１モノクローナル抗体と抗ｇｐ４９Ｂモノクローナル抗体の組み合わせ処理群において、肺、肝臓ともＬＬＣ－Ｌｕｃ２腫瘍の転移巣数が減少していた（図２０Ｅ～図２０Ｇ）。
　さらに、ＬＬＣ－Ｌｕｃ２腫瘍を有するマウスで抗ＰＤ－１モノクローナル抗体と抗ｇｐ４９Ｂモノクローナル抗体を併用したところ、統計的に有意に転移巣数を減少させた（図２０Ｇ）。ｇｐ４９Ｂ阻害はＰＤ－１とｇｐ４９Ｂの同時阻害と同様、病理切片の解析でも肺と肝臓のＬＬＣ－Ｌｕｃ２の転移を抑制していた（図２１）。これらの結果から、ＬＩＬＲＢ４を阻害することにより、がんの転移が抑制されることが明らかとなった。
［実施例１５］ＬＩＬＲＢ４阻害による破骨細胞分化促進効果の検証１
　野生型Ｂ６マウスから骨髄細胞を採取し、１０％ＦＣＳ及び１０μｇ／ｍｌの、対照アイソタイプＩｇＧ抗体、抗ｇｐ４９Ｂモノクローナル抗体Ｈ１．１、抗ｇｐ４９Ｂモノクローナル抗体Ｈ１．１のＦ（ａｂ’）２フラグメント又は抗ＦＮ３０モノクローナル抗体Ｎｏ．６を含むα－ＭＥＭ培地を用い、４８ウェルプレートで５．０×１０５ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌで培養した。培養２時間後にＭ－ＣＳＦを２０ｎｇ／ｗｅｌｌ添加してさらに４８時間培養した。この時点からさらに、破骨細胞への分化誘導のために２０ｎｇ／ｍｌ　Ｍ－ＣＳＦ及び１００ｎｇ／ｍｌ　ＲＡＮＫＬを含む１０％ＦＣＳ添加α－ＭＥＭを添加し、６日後にＴＲＡＰ染色を行なった。その結果を、図２２に示す。
　図２２に示したように、破骨細胞への分化誘導は、抗ｇｐ４９Ｂモノクローナル抗体Ｈ１．１又は抗ｇｐ４９Ｂモノクローナル抗体Ｈ１．１のＦ（ａｂ’）２フラグメントの添加で、それぞれ分化誘導率（％）（破骨細胞数／全細胞数×１００）が、３．５％、３．４％となり、対照アイソタイプＩｇＧ抗体の場合（２．７％）と比較してやや上昇する傾向がみられた。また、抗ＦＮ－３０モノクローナル抗体Ｎｏ．６の添加で分化誘導率が、７．９％となり、顕著な上昇がみられた。
［実施例１６］ＬＩＬＲＢ４阻害による破骨細胞分化促進効果の検証２
　健常人から採取した血液サンプルから調製した末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）からマグネティックセルソーターＭＡＣＳ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ　Ｂｉｏｔｅｃ社製）を用いてＣＤ１１ｂ陽性の単球を得た。これを１００ｎｇ／ｍｌ　ＲＡＮＫＬ、２５ｎｇ／ｍｌ　Ｍ－ＣＳＦを含む１０％ＦＣＳ添加α－ＭＥＤ培地中で抗ＬＩＬＲＢ４モノクローナル抗体ＺＭ４．１（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）１．０　μｇ／ｍｌ又は対照アイソタイプ抗体としてマウスＩｇＧ１κ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社製）１．０μｇ／ｍｌを添加して７日間培養し、ＴＲＡＰ染色した。その結果を図２３に示す。
　図２３に示したように、ＰＢＭＣからの破骨細胞への分化誘導率は、１３．７％となり、対照アイソタイプ抗体の場合（７．６％）と比較して、抗ＬＩＬＲＢ４抗体の添加で破骨細胞への分化誘導は約２倍亢進した。
［実施例１７］ＬＩＬＲＢ４阻害による破骨細胞分化促進効果の検証３
　野生型Ｂ６マウス及びｇｐ４９Ｂ欠損マウスから骨髄細胞を採取し、１０％ＦＣＳ、２０ｎｇ／ｍｌ　Ｍ－ＣＳＦ、１．０×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍｌのα－ＭＥＭ培地を用い、２４ウェルプレートで２日間培養した。その後、破骨細胞への分化誘導のため、Ｍ－ＣＳＦを２０ｎｇ／ｗｅｌｌ及び１００ｎｇ／ｍｌ　ＲＡＮＫＬを含む１０％ＦＣＳ添加α－ＭＥＭを添加し、５日後にＴＲＡＰ染色を行なった。その結果を図２４に示す。
　図２４に示したように、破骨細胞への分化誘導率は、野生型マウス由来の骨髄細胞と比較して、ｇｐ４９Ｂ欠損マウス由来の骨髄細胞でおよそ３倍上昇した。
［実施例１８］ＬＩＬＲＢ４阻害による破骨細胞分化促進効果の検証４
　１８週齢の野生型Ｂ６マウス（雌）および１８週齢のｇｐ４９Ｂ欠損マウス（雌）から大腿骨を単離し、川本法（「非脱灰硬組織凍結切片標本作成技術（川本法２００８）とその応用」川本忠文「病理技術　７２巻２号ｐ．７６－８３，２００９年」）で包埋したのち凍結切片を作成し、ＴＲＡＰ染色して破骨細胞を検出した。その結果を図２５に示す。
　図２５に示したように、破骨細胞は、野生型Ｂ６マウスと比較して、ｇｐ４９Ｂ欠損マウスの方が多数検出された。
　本発明によれば、免疫チェックポイント阻害剤、免疫チェックポイント関連疾患の治療剤、免疫抑制剤、抗フィブロネクチン抗体又はその誘導体、フィブロネクチンアナログ、フィブロネクチンまたはその部分タンパク質を検出するためのキット、及びフィブロネクチンまたはその部分タンパク質を検出する方法を提供することができる。

Claims (23)

  1. 　フィブロネクチンと免疫抑制性受容体ＬＩＬＲＢ４との結合を阻害する物質を有効成分として含有する免疫チェックポイント阻害剤。
  2. 　前記フィブロネクチンが、前記フィブロネクチン中の配列番号１で表されるアミノ酸配列を介して、免疫抑制性受容体ＬＩＬＲＢ４と結合する、請求項１に記載の免疫チェックポイント阻害剤。
  3. 　前記フィブロネクチンと免疫抑制性受容体ＬＩＬＲＢ４との結合を阻害する物質が、抗フィブロネクチン抗体又はその誘導体、抗免疫抑制性受容体ＬＩＬＲＢ４抗体又はその誘導体、若しくはフィブロネクチンアナログである、請求項１又は２に記載の免疫チェックポイント阻害剤。
  4. 　前記抗フィブロネクチン抗体又はその誘導体が、フィブロネクチン中の配列番号１で表されるアミノ酸配列と結合する、請求項３に記載の免疫チェックポイント阻害剤。
  5. 　前記フィブロネクチンアナログが、以下の（ａ）～（ｃ）のいずれか一つのペプチドである、請求項３に記載の免疫チェックポイント阻害剤。
    （ａ）配列番号１で表されるアミノ酸配列を含むペプチド、
    （ｂ）配列番号１で表されるアミノ酸配列において、１～数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、且つ、免疫抑制性受容体ＬＩＬＲＢ４のフィブロネクチン結合部位に対し結合能を有するペプチド、
    （ｃ）配列番号１で表されるアミノ酸配列において、８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、且つ、免疫抑制性受容体ＬＩＬＲＢ４のフィブロネクチン結合部位に対し結合能を有するペプチド
  6. 　フィブロネクチンと免疫抑制性受容体ＬＩＬＲＢ４との結合を阻害する物質を有効成分として含有する免疫チェックポイント関連疾患の治療剤。
  7. 　前記フィブロネクチンが、前記フィブロネクチン中の配列番号１で表されるアミノ酸配列を介して、免疫抑制性受容体ＬＩＬＲＢ４と結合する、請求項６に記載の治療剤。
  8. 　前記フィブロネクチンと免疫抑制性受容体ＬＩＬＲＢ４との結合を阻害する物質が、抗フィブロネクチン抗体又はその誘導体、抗免疫抑制性受容体ＬＩＬＲＢ４抗体又はその誘導体、若しくはフィブロネクチンアナログである、請求項６又は７に記載の治療剤。
  9. 　前記抗フィブロネクチン抗体又はその誘導体が、フィブロネクチン中の配列番号１で表されるアミノ酸配列と結合する、請求項８に記載の治療剤。
  10. 　前記フィブロネクチンアナログが、以下の（ａ）～（ｃ）のいずれか一つのペプチドである、請求項８に記載の治療剤。
    （ａ）配列番号１で表されるアミノ酸配列を含むペプチド、
    （ｂ）配列番号１で表されるアミノ酸配列において、１～数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、且つ、免疫抑制性受容体ＬＩＬＲＢ４のフィブロネクチン結合部位に対し結合能を有するペプチド、
    （ｃ）配列番号１で表されるアミノ酸配列において、８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、且つ、免疫抑制性受容体ＬＩＬＲＢ４のフィブロネクチン結合部位に対し結合能を有するペプチド
  11. 　前記免疫チェックポイント関連疾患が、自己免疫疾患、がん、炎症性疾患、及びアレルギー性疾患からなる群から選択される、請求項６～１０のいずれか一項に記載の治療剤。
  12. 　前記がんが、がん転移によるものである、請求項１１に記載の治療剤。
  13. 　免疫抑制性受容体ＬＩＬＲＢ４を活性化する物質を有効成分として含有する免疫チェックポイント関連疾患の治療剤。
  14. 　前記免疫抑制性受容体ＬＩＬＲＢ４を活性化する物質が、抗フィブロネクチン抗体又はその誘導体、抗免疫抑制性受容体ＬＩＬＲＢ４抗体又はその誘導体、若しくはフィブロネクチン又はフィブロネクチンアナログである、請求項１３に記載の治療剤。
  15. 　前記フィブロネクチンアナログが、以下の（ａ）～（ｃ）のいずれか一つのペプチドである、請求項１４に記載の治療剤。
    （ａ）配列番号１で表されるアミノ酸配列を含むペプチド、
    （ｂ）配列番号１で表されるアミノ酸配列において、１～数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、且つ、免疫抑制性受容体ＬＩＬＲＢ４のフィブロネクチン結合部位に対し結合能を有するペプチド、
    （ｃ）配列番号１で表されるアミノ酸配列において、８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、且つ、免疫抑制性受容体ＬＩＬＲＢ４のフィブロネクチン結合部位に対し結合能を有するペプチド
  16. 　前記免疫チェックポイント関連疾患が、骨疾患である、請求項１３～１５のいずれか一項に記載の治療剤。
  17. 　免疫抑制性受容体ＬＩＬＲＢ４を活性化する物質を有効成分として含有する免疫抑制剤。
  18. 　前記免疫抑制性受容体ＬＩＬＲＢ４を活性化する物質が、抗フィブロネクチン抗体又はその誘導体、抗免疫抑制性受容体ＬＩＬＲＢ４抗体又はその誘導体、若しくはフィブロネクチン又はフィブロネクチンアナログである、請求項１７に記載の免疫抑制剤。
  19. 　前記フィブロネクチンアナログが、以下の（ａ）～（ｃ）のいずれか一つのペプチドである、請求項１８に記載の免疫抑制剤。
    （ａ）配列番号１で表されるアミノ酸配列を含むペプチド、
    （ｂ）配列番号１で表されるアミノ酸配列において、１～数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、且つ、免疫抑制性受容体ＬＩＬＲＢ４のフィブロネクチン結合部位に対し結合能を有するペプチド、
    （ｃ）配列番号１で表されるアミノ酸配列において、８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、且つ、免疫抑制性受容体ＬＩＬＲＢ４のフィブロネクチン結合部位に対し結合能を有するペプチド
  20. 　配列番号１で表されるアミノ酸配列に結合する抗フィブロネクチン抗体又はその誘導体。
  21. 　以下の（ａ）～（ｃ）のいずれか一つのペプチドと免疫グロブリンＧのＦｃ領域とが融合したフィブロネクチンアナログ。
    （ａ）配列番号１で表されるアミノ酸配列を含むペプチド、
    （ｂ）配列番号１で表されるアミノ酸配列において、１～数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、且つ、免疫抑制性受容体ＬＩＬＲＢ４のフィブロネクチン結合部位に対し結合能を有するペプチド、
    （ｃ）配列番号１で表されるアミノ酸配列において、８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、且つ、免疫抑制性受容体ＬＩＬＲＢ４のフィブロネクチン結合部位に対し結合能を有するペプチド
  22. 　請求項２０に記載の抗フィブロネクチン抗体又はその誘導体を含み、生体試料中に含まれる配列番号１で表されるアミノ酸配列を含むフィブロネクチンまたはその部分タンパク質を検出するためのキット。
  23. 　請求項２２に記載のキットを用いる、生体試料中のフィブロネクチン又はその部分タンパク質を検出する方法。
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