CN114531851A - 免疫检查点抑制剂、免疫检查点相关疾病的治疗剂、免疫抑制剂、抗纤维粘连蛋白抗体或其衍生物、纤维粘连蛋白类似物、用于检测纤维粘连蛋白或其部分蛋白质的试剂盒和检测纤维粘连蛋白或其部分蛋白质的方法 - Google Patents

免疫检查点抑制剂、免疫检查点相关疾病的治疗剂、免疫抑制剂、抗纤维粘连蛋白抗体或其衍生物、纤维粘连蛋白类似物、用于检测纤维粘连蛋白或其部分蛋白质的试剂盒和检测纤维粘连蛋白或其部分蛋白质的方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及含有抑制纤维粘连蛋白与免疫抑制性受体LILRB4的结合的物质作为有效成分的免疫检查点抑制剂、免疫检查点相关疾病的治疗剂、含有活化免疫抑制性受体LILRB4的物质作为有效成分的免疫抑制剂、抗纤维粘连蛋白抗体或其衍生物、纤维粘连蛋白类似物、用于检测纤维粘连蛋白或其部分蛋白质的试剂盒和使用所述试剂盒检测生物样品中的纤维粘连蛋白或其部分蛋白质的方法。

Description

免疫检查点抑制剂、免疫检查点相关疾病的治疗剂、免疫抑制 剂、抗纤维粘连蛋白抗体或其衍生物、纤维粘连蛋白类似物、 用于检测纤维粘连蛋白或其部分蛋白质的试剂盒和检测纤维 粘连蛋白或其部分蛋白质的方法
技术领域
本发明涉及免疫检查点抑制剂、免疫检查点相关疾病的治疗剂、免疫抑制剂、抗纤维粘连蛋白抗体或其衍生物、纤维粘连蛋白类似物、用于检测纤维粘连蛋白或其部分蛋白质的试剂盒和检测纤维粘连蛋白或其部分蛋白质的方法。
本申请主张基于2019年8月13日在日本申请的特愿2019-148423号的优先权，并将其内容并入本文。
背景技术
近年来，使用免疫检查点抑制剂的癌症免疫疗法受到关注。免疫检查点抑制剂是指与具有抑制对自身的免疫应答、抑制过度免疫反应的作用的免疫检查点分子或其配体结合，并通过抑制免疫抑制信号的传递而解除免疫检查点分子对T细胞的活化抑制的试剂。
本发明的发明人发现，通过使用作为对未知配体的免疫抑制性受体的LILRB4(白细胞Ig样受体(Leukocyte Ig-like receptor)B4，以下也称为B4)，能够判定由感染或自身免疫引起的炎症性疾病(专利文献1)。
作为LILRB4的配体，最近报告了CD166、ApoE、Angptls等(非专利文献1-3)。然而，这些化合物是生理配体的证明还不够充分。
纤维粘连蛋白(Fibronectin，以下也称为FN)是存在于细胞外基质(Extracellular Matrix，以下也称为ECM)、细胞表面上和体液中的约259kDa的糖蛋白。纤维粘连蛋白通过作为蛋白水解酶的热溶素(thermolysin)处理分成6个区域(结构域)。这些区域基于它们各自的特异性分子结合能力被称为1.纤维蛋白-肝素结合域(Fibrin/Heparin binding-FN)、2.胶原蛋白结合域(Collagen binding-FN)、3.肝素结合域(Heparin binding-FN)、4.细胞/整合素结合域(cell/integrin-binding-domain(CBD)-FN)、5.第二肝素结合域(second Heparin binding-FN)、6.第二纤维蛋白结合域(secondFibrin binding-FN)。像这样，FN由具有不同结合生理分子能力的多个结构域组成。迄今为止，在系统性红斑狼疮(Systemic Lupus Erythematosus，SLE)、类风湿关节炎(RheumatoidArthritis，RA)这样的部分自身免疫病中，除了观察到血浆中、体液(例如关节液)中的FN浓度的变动以外，也报告了使用单克隆抗体来评价FN的片段化(fragmentation)的结构域分析对于疾病的诊断或严重程度评价是有用的(非专利文献4-6)。特别地，Fibrin/Heparinbinding-FN浓度与健康人(61±18μg/ml)相比，SLE为24±12μg/ml(p<0.003)，RA为36±22μg/ml(p<0.00002)，并且预期用于诊断。另外，报道了FN促进肺癌细胞株的转移能力和浸润能力(非专利文献7)。但是，在上述任意一篇文献中都没有报告FN是LILRB4的配体。
现有技术文件
专利文献
专利文献1：日本特开2018-25554号公报
非专利文献
非专利文献1：J Immunol.2018Feb1；200(3):1207-1219。
非专利文献2：Blood.2014Aug；124(6):924-935。
非专利文献3：Nature.2018Oct；562(7728):605-609。
非专利文献4：Rheumatology(Oxford).2007Jul；46(7):1071-1075。
非专利文献5：J Rheumatol.1987Oct:14(5):1052-1054。
非专利文献6：Rheumatol Int.2013Jan；33(1):37-43。
非专利文献7：Br J Cancer 2009Jul 21；101(2):327-334。
发明内容
本发明的目的在于提供免疫检查点抑制剂、免疫检查点相关疾病的治疗剂、免疫抑制剂、抗纤维粘连蛋白抗体或其衍生物、纤维粘连蛋白类似物、用于检测纤维粘连蛋白或其部分蛋白质的试剂盒和检测纤维粘连蛋白或其部分蛋白质的方法。
本发明的发明人发现LILRB4的生理配体是作为ECM的主要构成蛋白之一的纤维粘连蛋白，鉴定纤维粘连蛋白中的LILRB4的靶序列，发现抑制该靶序列与纤维粘连蛋白的结合的物质作为免疫检查点抑制剂、免疫检查点相关疾病的治疗剂和免疫抑制剂是有用的，从而完成了本发明。
本发明包括以下方式。
[1]一种免疫检查点抑制剂，其含有抑制纤维粘连蛋白与免疫抑制性受体LILRB4的结合的物质作为有效成分。
[2]根据[1]所述的免疫检查点抑制剂，其中，所述纤维粘连蛋白通过所述纤维粘连蛋白中的序列编号1所示的氨基酸序列与免疫抑制性受体LILRB4结合。
[3]根据[1]或[2]所述的免疫检查点抑制剂，其中，所述抑制纤维粘连蛋白与免疫抑制性受体LILRB4的结合的物质为抗纤维粘连蛋白抗体或其衍生物、抗免疫抑制性受体LILRB4抗体或其衍生物、或者纤维粘连蛋白类似物。
[4]根据[3]所述的免疫检查点抑制剂，其中，所述抗纤维粘连蛋白抗体或其衍生物与纤维粘连蛋白中的序列编号1所示的氨基酸序列结合。
[5]根据[3]所述的免疫检查点抑制剂，其中，所述纤维粘连蛋白类似物为以下(a)-(c)中任意一种的肽，
(a)含有序列编号1所示的氨基酸序列的肽；
(b)含有在序列编号1所示的氨基酸序列中缺失、插入、取代或添加了1至数个氨基酸的氨基酸序列、且对免疫抑制性受体LILRB4的纤维粘连蛋白结合位点具有结合能力的肽；
(c)含有在序列编号1所示的氨基酸序列中具有80％以上同一性的氨基酸序列、且对免疫抑制性受体LILRB4的纤维粘连蛋白结合位点具有结合能力的肽。
[6]一种免疫检查点相关疾病的治疗剂，其含有抑制纤维粘连蛋白与免疫抑制性受体LILRB4的结合的物质作为有效成分。
[7]根据[6]所述的治疗剂，其中，所述纤维粘连蛋白通过所述纤维粘连蛋白中的序列编号1所示的氨基酸序列与免疫抑制性受体LILRB4结合。
[8]根据[6]或[7]所述的治疗剂，其中，所述抑制纤维粘连蛋白与免疫抑制性受体LILRB4的结合的物质为抗纤维粘连蛋白抗体或其衍生物、抗免疫抑制性受体LILRB4抗体或其衍生物、或者纤维粘连蛋白类似物。
[9]根据[8]的治疗剂，其中，所述抗纤维粘连蛋白抗体或其衍生物与纤维粘连蛋白中的序列编号1所示的氨基酸序列结合。
[10]根据[8]所述的治疗剂，其中，所述纤维粘连蛋白类似物为以下(a)-(c)中任意一种的肽，
(a)含有序列编号1所示的氨基酸序列的肽；
(b)含有在序列编号1所示的氨基酸序列中缺失、插入、取代或添加了1至数个氨基酸的氨基酸序列、且对免疫抑制性受体LILRB4的纤维粘连蛋白结合位点具有结合能力的肽；
(c)含有在序列编号1所示的氨基酸序列中具有80％以上同一性的氨基酸序列、且对免疫抑制性受体LILRB4的纤维粘连蛋白结合位点具有结合能力的肽。
[11]根据[6]-[10]中任意一项所述的治疗剂，其中，所述免疫检查点相关疾病选自自身免疫病、癌症、炎症性疾病和过敏性疾病。
[12]根据[11]所述的治疗剂，其中，所述癌症由癌转移引起。
[13]一种免疫检查点相关疾病的治疗剂，其含有活化免疫抑制性受体LILRB4的物质作为有效成分。
[14]根据[13]所述的治疗剂，其中，所述活化免疫抑制性受体LILRB4的物质为抗纤维粘连蛋白抗体或其衍生物、抗免疫抑制性受体LILRB4抗体或其衍生物、或者纤维粘连蛋白或纤维粘连蛋白类似物。
[15]根据[14]所述的治疗剂，其中，所述纤维粘连蛋白类似物为以下(a)-(c)中任意一种的肽，
(a)含有序列编号1所示的氨基酸序列的肽；
(b)含有在序列编号1所示的氨基酸序列中缺失、插入、取代或添加了1至数个氨基酸的氨基酸序列、且对免疫抑制性受体LILRB4的纤维粘连蛋白结合位点具有结合能力的肽；
(c)含有在序列编号1所示的氨基酸序列中具有80％以上同一性的氨基酸序列、且对免疫抑制性受体LILRB4的纤维粘连蛋白结合位点具有结合能力的肽。
[16]根据[13]-[15]中任意一项所述的治疗剂，其中，所述免疫检查点相关疾病为骨疾病。
[17]一种免疫抑制剂，其含有活化免疫抑制性受体LILRB4的物质作为有效成分。
[18]根据[17]所述的免疫抑制剂，其中，所述活化免疫抑制性受体LILRB4的物质为抗纤维粘连蛋白抗体或其衍生物、抗免疫抑制性受体LILRB4抗体或其衍生物、或者纤维粘连蛋白或纤维粘连蛋白类似物。
[19]根据[18]所述的免疫抑制剂，其中，所述纤维粘连蛋白类似物为以下(a)-(c)中任意一种的肽，
(a)含有序列编号1所示的氨基酸序列的肽；
(b)含有在序列编号1所示的氨基酸序列中缺失、插入、取代或添加了1至数个氨基酸的氨基酸序列、且对免疫抑制性受体LILRB4的纤维粘连蛋白结合位点具有结合能力的肽；
(c)含有在序列编号1所示的氨基酸序列中具有80％以上同一性的氨基酸序列、且对免疫抑制性受体LILRB4的纤维粘连蛋白结合位点具有结合能力的肽。
[20]一种抗纤维粘连蛋白抗体或其衍生物，其与序列编号1所示的氨基酸序列结合。
[21]一种纤维粘连蛋白类似物，其由以下(a)-(c)中任意一种的肽与免疫球蛋白G的Fc区融合而成。
(a)含有序列编号1所示的氨基酸序列的肽；
(b)含有在序列编号1所示的氨基酸序列中缺失、插入、取代或添加了1至数个氨基酸的氨基酸序列、且对免疫抑制性受体LILRB4的纤维粘连蛋白结合位点具有结合能力的肽；
(c)含有在序列编号1所示的氨基酸序列中具有80％以上同一性的氨基酸序列、且对免疫抑制性受体LILRB4的纤维粘连蛋白结合位点具有结合能力的肽。
[22]一种试剂盒，其用于检测生物样品中包含的含有序列编号1所示的氨基酸序列的纤维粘连蛋白或其部分蛋白质，含有[20]所述的抗纤维粘连蛋白抗体或其衍生物。
[23]一种检测生物样品中的纤维粘连蛋白或其部分蛋白质的方法，其使用[22]所述的试剂盒。
根据本发明，可以提供免疫检查点抑制剂、免疫检查点相关疾病的治疗剂、免疫抑制剂、抗纤维粘连蛋白抗体或其衍生物、纤维粘连蛋白类似物、用于检测纤维粘连蛋白或其部分蛋白质的试剂盒和检测纤维粘连蛋白或其部分蛋白质的方法。
附图说明
图1示出通过流式细胞术分析小鼠野生型幼稚CD8阳性T细胞(上部)和B4缺陷幼稚CD8阳性T细胞(下部)中B4(左)、PD-1(中)、Tim-3(右)的表达的结果。纵轴表示以直方图的峰值为100％时的细胞比例，横轴表示荧光强度(蛋白质的表达强度)。实线表示用各抗原特异性抗体染色的结果，无实线灰色表示用同种型对照抗体染色的结果。
图2示出通过流式细胞术分析抗CD3抗体/抗CD28抗体对小鼠野生型CD8阳性T细胞(上部)和B4缺陷型CD8阳性T细胞(下部)的活化刺激中B4(左)、PD-1(中)、Tim-3(右)的表达随时间变化(第0-3天)的结果。以将纵轴中直方图的峰值为100％时的细胞比例以及横轴中以荧光强度(蛋白质的表达强度)表示的各测定日的直方图重叠而成的图示出。实线表示用各抗原特异性抗体染色的结果，无实线灰色表示用同种型对照抗体染色的结果。
图3示出通过流式细胞术分析小鼠野生型幼稚CD4阳性T细胞(上部)和B4缺陷型幼稚CD4阳性T细胞(下部)中B4(左)、PD-1(中)、Tim-3(右)的表达的结果。纵轴表示以直方图的峰值为100％时的细胞的比例，横轴表示荧光强度(蛋白质的表达强度)。实线表示用各抗原特异性抗体染色的结果，无实线灰色表示用同种型对照抗体染色的结果。
图4示出通过流式细胞术分析抗CD3抗体/抗CD28抗体对小鼠野生型CD4阳性T细胞(上部)和B4缺陷型CD4阳性T细胞(下部)的活化刺激中B4(左)、PD-1(中)、Tim-3(右)的表达随时间变化(第0-3天)的结果。以将纵轴中直方图的峰值为100％时的细胞比例以及横轴中以荧光强度(蛋白质的表达强度)表示的各测定日的直方图重叠而成的图示出。实线表示用各抗原特异性抗体染色的结果，无实线灰色表示用同种型对照抗体染色的结果。
图5示出通过流式细胞术分析抗CD3抗体/抗CD28抗体对小鼠CD8阳性T细胞(上部)和CD4阳性T细胞(下部)的活化刺激中B4和PD-1的共表达随时间变化(第0-3天)的结果。纵轴表示PD-1的表达强度，横轴表示B4的表达强度，用十字划分的左下区域表示PD-1阴性B4阴性，左上区域表示PD-1单阳性，右上区域表示PD-1阳性B4阳性，右下区域表示PD-1阴性B4阳性。
图6示出通过流式细胞术分析抗CD3抗体/抗CD28抗体对人CD8阳性T细胞(上部)和CD4阳性T细胞(下部)的活化刺激中B4(左)、PD-1(中)、Tim-3(右)表达随时间变化(第0-3天)的结果。以将纵轴中直方图的峰值为100％时的细胞比例以及横轴中以荧光强度(蛋白质的表达强度)表示的各测定日的直方图重叠而成的图示出。实线表示用各抗原特异性抗体染色的结果，浅灰色表示用同种型对照抗体染色的结果。
图7示出在人MSC和B4-GFP报告细胞的共培养中，通过B4-GFP报告细胞中表达GFP的细胞的比例，评估抗FN30单克隆抗体对FN-B4结合的抑制效果的结果。绘制图的纵轴表示细胞的大小，横轴表示GFP的荧光强度，绘制图中的数值表示GFP阳性细胞(框内)的比例(％)。柱状图表示用各抗体处理时GFP阳性细胞的比例(％)。
图8示出用抗FN30单克隆抗体对来自小鼠骨髓的间充质干细胞和来自人骨髓的间充质干细胞染色并用流式细胞术分析的结果。实线表示用抗FN30单克隆抗体染色的结果，无实线灰色表示用同种型对照抗体染色的结果。
图9示出用抗FN30单克隆抗体No.5对小鼠癌细胞株(上部)和人癌细胞株(下部)染色并用流式细胞术分析的结果。实线表示用抗FN30单克隆抗体染色的结果，无实线灰色表示用同种型对照抗体染色的结果。
图10示出对于野生型小鼠摄取B16F10细胞株(上部，2只)和3LL细胞株(下部，3只)形成的肿瘤内浸润的CD8-阳性T细胞，用流式细胞术分析B4和PD-1的表达的结果。纵轴表示PD-1的表达强度，横轴表示B4的表达强度，用十字划分的左下区域表示PD-1阴性B4阴性，左上区域表示PD-1单阳性，右上区域表示PD-1阳性B4阳性，右下区域表示PD-1阴性B4阳性。
图11示出对于野生型小鼠摄取B16F10细胞株(上部，2只)和3LL细胞株(下部，3只)形成的肿瘤内浸润的CD4-阳性T细胞，用流式细胞术分析B4和PD-1的表达的结果。纵轴表示PD-1的表达强度，横轴表示B4的表达强度，用十字划分的左下区域表示PD-1阴性B4阴性，左上区域表示PD-1单阳性，右上区域表示PD-1阳性B4阳性，右下区域表示PD-1阴性B4阳性。
图12示出采用使用人血浆样品中的抗纤维粘连蛋白抗体的蛋白质印迹法的蛋白质的检测结果。左侧表示用抗纤维粘连蛋白多克隆抗体染色的结果，右侧表示用抗FN30单克隆抗体No.4和No.5染色的结果。
图13示出使用抗纤维粘连蛋白抗体的健康人血浆中纤维粘连蛋白全长分子和纤维粘连蛋白24kDa片段的定量结果。以标准蛋白的吸光度为基础，通过4参数逻辑回归进行非线性近似，由样品的吸光度值算出浓度。上部表示用抗FN30单克隆抗体检测的纤维粘连蛋白浓度[A(μg/ml)]，下部表示用抗FN44抗体检测的纤维粘连蛋白浓度[B(μg/ml)]。
图14示出使用抗FN单克隆抗体的健康人血浆中的纤维粘连蛋白全长分子和纤维粘连蛋白24kDa片段的浓度的第一、第二、第三四分位点以及最大值、最小值的箱线图。左侧表示纤维粘连蛋白全长分子的浓度，右侧表示纤维粘连蛋白24kDa片段的浓度。
图15示出将对照IgG或FN30-Fc腹腔内给予BXSB/Yaa小鼠，并测定血清中抗dsDNAIgG水平的结果。
图16示出将对照IgG或抗gp49B单克隆抗体H1.1腹腔内给予BXSB/Yaa小鼠，并测定血清中抗dsDNA IgG水平的结果。
图17A示出将Lewis肺癌细胞(Lewis lung carcinoma，LLC)从尾静脉注入野生型(WT)B6小鼠和gp49B缺陷小鼠，经过30天后对肺表面进行H&E染色的结果。WT表示野生型小鼠的结果，gp49B-/-表示gp49B缺陷小鼠的结果。
图17B示出将Lewis肺癌细胞(LLC)从尾静脉注入野生型(WT)B6小鼠和gp49B缺陷小鼠，经过30天后的肺的转移灶数的定量结果。
图17C示出将Lewis肺癌细胞(LLC)从尾静脉注入野生型(WT)B6小鼠和gp49B缺陷小鼠，经过30天后对肝脏进行H&E染色的结果。WT表示野生型小鼠的结果，gp49B-/-表示gp49B缺陷小鼠的结果。
图17D示出将Lewis肺癌细胞(LLC)从尾静脉注入野生型(WT)B6小鼠和gp49B缺陷小鼠，经过30天后的肝脏的转移灶数的定量结果。
图18A示出将小鼠黑色素瘤细胞B16F10从尾静脉注入野生型(WT)B6小鼠和gp49B缺陷小鼠，经过20天后对肺表面进行H&E染色的结果。WT表示野生型小鼠，gp49B-/-表示gp49B缺陷小鼠。
图18B示出将小鼠黑色素瘤细胞B16F10从尾静脉注入野生型(WT)B6小鼠和gp49B缺陷小鼠，经过20天后对肝脏进行H&E染色的结果。WT表示野生型小鼠，gp49B-/-表示gp49B缺陷小鼠。
图19示出将野生型小鼠的骨髓细胞或gp49B缺陷小鼠的骨髓细胞进行过继转移的结果。左侧表示肺(上部)、肝脏(下部)的H&E染色的结果，右侧表示肺(上部)、肝脏(下部)的转移灶数。WT-R表示野生型小鼠，gp49B-/-R表示gp49B缺陷小鼠。
图20A示出将小鼠黑色素瘤细胞B16F10注入野生型(WT)B6小鼠后，给予对照同种型IgG抗体、抗PD-1单克隆抗体、抗gp49B单克隆抗体或者抗PD-1单克隆抗体与抗gp49B单克隆抗体的组合的方案。
图20B示出将小鼠黑色素瘤细胞B16F10注入野生型(WT)B6小鼠后，给予对照同种型IgG抗体、抗PD-1单克隆抗体、抗gp49B单克隆抗体或者抗PD-1单克隆抗体与抗gp49B单克隆抗体的组合，产生B16F10肿瘤的小鼠肺和肝转移状态。上部表示肺的肿瘤结节的H&E染色，下部表示肝脏的H&E染色像。
图20C示出将小鼠黑色素瘤细胞B16F10注入野生型(WT)B6小鼠后，给予对照同种型IgG抗体、抗PD-1单克隆抗体、抗gp49B单克隆抗体或者抗PD-1单克隆抗体与抗gp49B单克隆抗体的组合，并在各抗体处置组中比较肺的肿瘤结节数的图。
图20D示出将小鼠黑色素瘤细胞B16F10注入野生型(WT)B6小鼠后，给予对照同种型IgG抗体、抗PD-1单克隆抗体、抗gp49B单克隆抗体或者抗PD-1单克隆抗体与抗gp49B单克隆抗体的组合，并在各抗体处置组中比较B16F10至肝脏的转移灶数的图。
图20E示出将Lewis肺癌细胞(LLC)注入野生型(WT)B6小鼠后，给予对照同种型IgG抗体、抗PD-1单克隆抗体、抗gp49B单克隆抗体或者抗PD-1单克隆抗体与抗gp49B单克隆抗体的组合的方案。
图20F示出将Lewis肺癌细胞(LLC)注入野生型(WT)B6小鼠后，给予对照同种型IgG抗体、抗PD-1单克隆抗体、抗gp49B单克隆抗体或者抗PD-1单克隆抗体与抗gp49B单克隆抗体的组合，注入LLC细胞的小鼠21天后的体内生物发光成像(In vivo bioluminescenceimaging)结果。
图20G示出将Lewis肺癌细胞(LLC)注入野生型(WT)B6小鼠后，给予对照同种型IgG抗体、抗PD-1单克隆抗体、抗gp49B单克隆抗体或者抗PD-1单克隆抗体与抗gp49B单克隆抗体的组合，基于注入LLC细胞的小鼠21天后的体内生物发光成像的像，用平均直径(photons/s/cm2/steradian)进行生物发光分析，并在各抗体处置组中比较的结果。
图21示出将Lewis肺癌细胞(LLC)注入野生型(WT)B6小鼠后，给予对照同种型IgG抗体、抗PD-1单克隆抗体、抗gp49B单克隆抗体或者抗PD-1单克隆抗体与抗gp49B单克隆抗体的组合的小鼠的肺和肝脏病理切片的分析结果。上部表示肺表面的H&E染色，下部表示肝脏的H&E染色。箭头表示癌转移灶的位置。
图22示出通过添加对照同种型IgG抗体、抗gp49B单克隆抗体H1.1、抗gp49B单克隆抗体H1.1的F(ab’)2片段或抗FN30单克隆抗体No.6从骨髓细胞分化诱导为破骨细胞的结果。照片示出破骨细胞的TRAP染色图像，图表示添加各抗体的分化诱导率。在照片和图中，Mock表示不添加抗体的情况。
图23示出添加抗LILRB4单克隆抗体ZM4.1(右图)或小鼠IgG1κ(左图)的情况下破骨细胞的TRAP染色图像。
图24示出从野生型B6小鼠或gp49B缺陷小鼠的骨髓细胞分化诱导破骨细胞的结果。照片左侧表示从野生型B6小鼠的骨髓细胞分化的破骨细胞的TRAP染色图像，照片右侧表示从gp49B缺陷小鼠的骨髓细胞分化的破骨细胞的TRAP染色图像。图表示从野生型B6小鼠的骨髓细胞和gp49B缺陷小鼠的骨髓细胞分别分化诱导破骨细胞的情况下的分化诱导率。WT表示野生型B6小鼠，gp49B-/-和KO表示gp49B缺陷小鼠。
图25示出野生型B6小鼠和gp49B缺陷小鼠的大腿骨中的破骨细胞的TRAP染色图像。左图表示野生型B6小鼠的TRAP染色图像，右图表示gp49B缺陷小鼠的TRAP染色图像。
具体实施方式
[免疫检查点抑制剂]
本发明的免疫检查点抑制剂含有抑制纤维粘连蛋白与免疫抑制性受体LILRB4的结合的物质作为有效成分。纤维粘连蛋白可以通过所述纤维粘连蛋白中的序列编号1所示的氨基酸序列与LILRB4结合。即，序列编号1所示的氨基酸序列是LILRB4的纤维粘连蛋白中的靶序列。
作为抑制纤维粘连蛋白与LILRB4的结合的物质，只要是具有抑制纤维粘连蛋白与LILRB4的结合的活性的物质，就没有特别限制，可以举出抗纤维粘连蛋白抗体或其衍生物、抗LILRB4抗体或其衍生物、纤维粘连蛋白类似物等。
作为抗纤维粘连蛋白抗体，只要是与纤维粘连蛋白反应的抗体，则可以是单克隆抗体、多克隆抗体中的任意一种，优选使用单克隆抗体。该抗体的制作可以用公知的方法制作。例如，在多克隆抗体的制作中，作为免疫的动物，可以使用小鼠、大鼠、仓鼠、兔、山羊、绵羊、鸡等。抗血清可以在将抗原一次或多次给予至动物的皮下、皮内、腹腔等后从血清获得。当蛋白质或肽用作抗原时，更优选使用具有免疫赋活效果的蛋白质或肽与补液的混合物。
另外，单克隆抗体的制作可以按照公知的单克隆抗体制作方法来制作，例如，按照长宗香明、寺田弘共著、“单克隆抗体”广川书店(1990年)、或者Jame W.Golding，“Monoclonal Antibody”，3rd edition，Academic Press，1996年制作。另外，也可以通过DNA免疫法制作单克隆抗体，可以参考Nature 1992Mar12；356 152-154或J.ImmunolMethods Mar1；249 147-154进行制作。
作为用于抗体制作的抗原，可以使用纤维粘连蛋白、或其部分片段(肽)、或者整合了编码纤维粘连蛋白或其部分片段的cDNA的载体。为了得到抑制纤维粘连蛋白与LILRB4的结合的单克隆抗体，优选使用包含作为纤维粘连蛋白中的LILRB4的靶序列的序列编号1所示的氨基酸序列的肽。作为最适合的免疫用抗原基因，可以使用纤维粘连蛋白载体，该纤维粘连蛋白载体是插入了编码含有序列编号1所示的氨基酸序列的肽的基因的构建物。DNA免疫法可以通过将上述基因构建物单独或混合，用对免疫动物的各种基因导入法(例如肌肉注射、电穿孔、基因枪等)中的任意一种，注入动物(小鼠或大鼠等)的皮下，使其进入细胞内来实施。
所述抗纤维粘连蛋白单克隆抗体可以通过培养按常规方法制作的杂交瘤并从培养上清中分离的方法，将该杂交瘤给予与其有相容性的哺乳类动物并作为腹水回收的方法制造。另外，所述抗纤维粘连蛋白单克隆抗体也可以用公知的基因重组技术制作。具体而言，可以通过克隆上述制作的杂交瘤生产的单克隆抗体、编码所述抗体的基因，制作含有所述基因的载体，将其导入宿主细胞进行转化，由此获得表达抗纤维粘连蛋白抗体的细胞，并对其进行细胞培养来制作。该制备中使用的细胞、载体的种类、细胞的种类、培养条件等均在本领域技术人员的技术范围内，可以设定适宜适当的条件。
根据需要，可以将抗体进一步纯化后进行使用。作为纯化和分离抗体的方法，可以举出常规公知的方法，例如硫酸铵沉淀法等的盐析、使用Sephadex等的凝胶过滤法、离子交换色谱法、使用蛋白质A柱等的亲和纯化法等。
作为抗纤维粘连蛋白抗体的衍生物，例如可以举出所述抗纤维粘连蛋白抗体的F(ab’)2、F(ab)2、Fab’、Fab、Fv、scFv、它们的突变体、包含抗体部分的融合蛋白或融合肽等。抗纤维粘连蛋白抗体的衍生物可以按照公知的抗体的衍生物的制造方法来制造。
抗纤维粘连蛋白抗体或其衍生物与纤维粘连蛋白中的序列编号1所示的氨基酸序列或其部分序列结合。在本发明的免疫检查点抑制剂中，抗纤维粘连蛋白抗体或其衍生物可以通过与纤维粘连蛋白中的序列编号1所示的氨基酸序列或其部分序列结合，来抑制纤维粘连蛋白与LILRB4的结合。
作为抗LILRB4抗体，只要是与LILRB4结合的抗体，则可以是单克隆抗体、多克隆抗体中的任意一种，优选使用单克隆抗体。所述抗LILRB4抗体可以通过与所述抗纤维粘连蛋白抗体同样的方法制作。
作为用于抗LILRB4抗体制作的抗原，可以使用LILRB4蛋白质、或其部分片段(肽)、或者整合了编码LILRB4蛋白质的cDNA的载体。为了得到识别LILRB4高级结构的单克隆抗体，作为包含人LILRB4全长基因的构建物的全长LILRB4载体成为最适合的免疫用抗原基因，此外，插入了LILRB4序列的部分区域的构建物也可以作为免疫用抗原基因使用。作为LILRB4序列的部分区域，优选作为纤维粘连蛋白中的LILRB4的靶序列的、序列编号1所示的氨基酸序列与LILRB4结合的LILRB4的区域(纤维粘连蛋白结合位点)。DNA免疫法可以通过将所述基因构建物单独或混合，用对免疫动物的各种基因导入法(例如肌肉注射、电穿孔、基因枪等)中的任意一种，注入动物(小鼠或大鼠等)的皮下，使其进入细胞内来实施。
所述抗LILRB4抗体的纯化可以通过与所述抗纤维粘连蛋白抗体同样的方法进行。作为所述抗LILRB4抗体的衍生物，例如可以举出所述抗LILRB4抗体的F(ab’)2、F(ab)2、Fab’、Fab、Fv、scFv、它们的突变体、包含抗体部分的融合蛋白或融合肽等。
在本发明的免疫检查点抑制剂中，抗LILRB4抗体或其衍生物可以抑制纤维粘连蛋白通过纤维粘连蛋白中的序列编号1所示的氨基酸序列结合LILRB4。
纤维粘连蛋白与LILRB4的结合的抑制，可以通过评价抑制纤维粘连蛋白与表达LILRB4的细胞的结合来进行。作为表达LILRB4的细胞，只要是表达LILRB4的细胞，就没有特别限制，例如可以举出脾脏细胞、外周血白细胞、骨髓细胞、或者从它们中分离的B细胞、浆细胞、单核细胞·巨噬细胞、树突状细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、嗜中性粒细胞、肥大细胞、活化T细胞等。
LILRB4的碱基序列和氨基酸序列可以从美国生物技术信息中心(NCBI)提供的数据库中得知。人(Homo sapiens)LILRB4的情况下，例如可以举出EntrezGeneID为11006(2019年6月17日时间点)，RefSeq ProteinID为NP_001265355.2、NP_001265356.2、NP_001265357.2、NP_001265358.2、NP_001265359.2(相当于异构体1-5)。作为小鼠(Musmusculus)LILRB4，可以举出GeneID为14728(2016年6月24日时间点)，NP_038560.1，作为大鼠(Rattus norvegicus)LILRB4，可以举出GeneID为292594(2019年4月18日时间点)，RefSeq ProteinID为NP_001013916，并且已知其他动物也具有LILRB4。不限于上述的LILRB4，其他LILRB4也包含在本发明中的LILRB4中。
纤维粘连蛋白的碱基序列和氨基酸序列可以从美国生物技术信息中心(NCBI)提供的数据库得知。人(Homo sapiens)纤维粘连蛋白的情况下，例如可以举出Entrez GeneID为2335，RefSeq ProteinID为NP_997647、NP_001352447、XP_005246463等。作为小鼠(Musmusculus)纤维粘连蛋白，可以举出GeneID为14268，作为大鼠(Rattus norvegicus)纤维粘连蛋白，可以举出GeneID为25661，RefSeq ProteinID为NP_062016，并且已知其他动物也具有纤维粘连蛋白。不限定于上述的纤维粘连蛋白，其他纤维粘连蛋白也包含在本发明的纤维粘连蛋白中。
纤维粘连蛋白通过所述纤维粘连蛋白中的序列编号1所示的氨基酸序列，与存在于细胞表面(如浆细胞、T细胞、巨噬细胞等)的LILRB4结合，并活化免疫检查点分子。换言之，LILRB4通过与纤维粘连蛋白中的序列编号1所示的氨基酸序列与纤维粘连蛋白结合，来表达免疫抑制功能。
本发明中，作为纤维粘连蛋白类似物，只要具有抑制纤维粘连蛋白与LILRB4结合的作用，则也包含任何纤维粘连蛋白类似物，例如可以举出以下(a)-(c)中任意一种的肽，
(a)含有序列编号1所示的氨基酸序列的肽；
(b)含有在序列编号1所示的氨基酸序列中缺失、插入、取代或添加了1至数个氨基酸的氨基酸序列、且对免疫抑制性受体LILRB4的纤维粘连蛋白结合位点具有结合能力的肽；
(c)含有在序列编号1所示的氨基酸序列中具有80％以上同一性的氨基酸序列、且对免疫抑制性受体LILRB4的纤维粘连蛋白结合位点具有结合能力的肽。
上述氨基酸序列的同一性为80％以上，优选为85％以上，更优选为90％以上，进一步优选为95％以上，更进一步优选为98％以上。另外，上述的氨基酸序列的缺失、取代或添加的数量优选为1-5个，更优选为1-4个，进一步优选为1-3个，更进一步优选为1-2个。氨基酸序列的同一性可以通过GenBank数据库上提供的BLAST检索来求出。
作为所述纤维粘连蛋白类似物，也可以是所述(a)-(c)中任意一种的肽与免疫球蛋白G的Fc区融合而成的纤维粘连蛋白类似物。
所述纤维粘连蛋白类似物可以通过公知的方法、例如基因重组技术来制作。
本发明的免疫检查点抑制剂含有抑制纤维粘连蛋白与LILRB4的结合的物质作为有效成分，还可以含有药学上可接受的载体、添加剂。
作为载体和添加剂的例子，可以举出但不限于水、食盐水、磷酸盐缓冲液、葡萄糖、甘油、乙醇等药学上可接受的有机溶剂、胶原蛋白、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、羧乙烯基聚合物、羧甲基纤维素钠、聚丙烯酸钠、海藻酸钠、水溶性葡聚糖、羧甲基淀粉钠、果胶、甲基纤维素、乙基纤维素、黄原胶、阿拉伯胶、酪蛋白、琼脂、聚乙二醇、二甘油、甘油、丙二醇、凡士林、石蜡、硬脂醇、硬脂酸、人血清白蛋白、甘露醇、山梨醇、乳糖、表面活性剂等。
本发明的免疫检查点抑制剂可以是多种形式，例如液剂(例如注射剂)、分散剂、混悬剂、片剂、丸剂、粉剂、栓剂等。优选的实施方案是注射剂，优选非经口(例如静脉内、经皮、腹腔内、肌内)给予。
本发明的免疫检查点抑制剂可以用作免疫检查点相关疾病的治疗剂。
本发明的免疫检查点抑制剂的给予量可以是例如0.025-50mg/kg，优选0.1-50mg/kg，更优选0.1-25mg/kg，进一步优选0.1-10mg/kg或0.1-3mg/kg，但不限于此。
[免疫检查点相关疾病的治疗剂]
本发明的免疫检查点相关疾病的治疗剂含有抑制纤维粘连蛋白与LILRB4的结合的物质作为有效成分。
作为抑制纤维粘连蛋白与LILRB4的结合的物质，只要是具有抑制纤维粘连蛋白与LILRB4的结合的活性的物质，就没有特别限制，可以举出抗纤维粘连蛋白抗体或其衍生物、抗LILRB4抗体或其衍生物、纤维粘连蛋白类似物等。作为抗纤维粘连蛋白抗体或其衍生物、抗LILRB4抗体或其衍生物、以及纤维粘连蛋白类似物，可以举出上文所述的那些。
在本发明中，作为免疫检查点相关疾病，只要是与作为免疫检查点分子的LILRB4相关的疾病即可，没有特别限制，例如可以举出自身免疫病、癌症、炎症性疾病、过敏性疾病等。
作为自身免疫病，例如可以举出格雷夫斯病、类风湿关节炎、桥本甲状腺炎、1型糖尿病、系统性红斑狼疮、血管炎、艾迪生病、多发性肌炎、皮肌炎、银屑病、干燥综合征、系统性硬皮病、肾小球肾炎等。
作为癌症，例如可以举出肺癌、大肠癌、肾癌、恶性黑色素瘤、霍奇金淋巴瘤、头颈癌、胰腺癌、肝癌、前列腺癌、骨肉瘤、白血病等。癌症可以是原发性，也可以是转移性，对于转移性的癌症，优选使用。
作为炎症性疾病，例如可以举出系统性红斑狼疮、皮肌炎、川崎病、银屑病、带状疱疹、慢性阻塞性肺疾病(COPD)、支气管哮喘、特应性皮炎、类风湿关节炎、抗磷脂抗体综合征、多发性肌炎、血管炎综合征、干燥综合征、白塞氏病、格雷夫斯病、桥本病、心肌炎、主动脉炎综合征、溃疡性大肠炎、克罗恩病、原发性胆汁性肝硬化、自身免疫性肝炎、自身免疫性胰腺炎、多发性硬化症、重症肌无力症、格林-巴利综合征、肾小球肾炎、ANCA相关性肾炎、淀粉样变性、TINU综合征、过敏性肺炎、嗜酸性粒细胞性肺炎、结节病等。
作为过敏性疾病，可以举出出过敏性鼻炎、支气管哮喘、荨麻疹·特应性皮炎、带状疱疹、慢性阻塞性肺疾病(COPD)、过敏性结膜炎、食物过敏、过敏反应、自身免疫性溶血性贫血、血小板减少症、粒细胞减少症、新生儿溶血性黄疸、血清病、过敏性肺炎、狼疮性肾炎(慢性肾小球肾炎)、系统性红斑狼疮、接触性皮炎、桥本病、白塞氏病、脏器移植后的排斥反应、移植物抗宿主病(GVHD)等。
本发明的免疫检查点相关疾病的治疗剂，可以含有活化LILRB4的物质作为活性成分。作为活化LILRB4的物质，只要是通过与LILRB4结合而活化LILRB4的物质，就没有特别限制，例如可以举出抗纤维粘连蛋白抗体或其衍生物、抗LILRB4抗体或其衍生物、纤维粘连蛋白或纤维粘连蛋白类似物等。作为抗纤维粘连蛋白抗体或其衍生物、抗LILRB4抗体或其衍生物、纤维粘连蛋白或纤维粘连蛋白类似物，可以举出上文所述的那些，在本发明的含有活化LILRB4的物质作为有效成分的免疫检查点相关疾病的治疗剂中，抗纤维粘连蛋白抗体或其衍生物、抗LILRB4抗体或其衍生物、纤维粘连蛋白或纤维粘连蛋白类似物通过与LILRB4结合，活化LILRB4，表达LILRB4的免疫抑制功能。
在本发明的含有活化LILRB4的物质作为有效成分的免疫检查点相关疾病的治疗剂中，作为所述免疫检查点相关疾病，只要是通过活化LILRB4抑制免疫功能而具有治疗效果的疾病，就没有特别限制，例如可以举出类风湿性关节炎、大理石骨病、骨质疏松症等骨疾病等。本发明的活化LILRB4的物质例如可以通过抑制破骨细胞的增殖来治疗骨疾病。
本发明的免疫检查点相关疾病的治疗剂还可以含有药学上可接受的载体、添加剂。药学上可接受的载体和添加剂包括上文所述的那些。
本发明的免疫检查点相关疾病的治疗剂可以是各种形式，例如液剂(例如注射剂)、分散剂、混悬剂、片剂、丸剂、粉剂、栓剂等。优选的实施方案是注射剂，优选非经口(例如静脉内、经皮、腹腔内、肌内)给予。
本发明的免疫检查点相关疾病的治疗剂的给予量可以是例如0.025-50mg/kg，优选0.1-50mg/kg，更优选0.1-25mg/kg，进一步优选0.1-10mg/kg或0.1-3mg/kg，但不限于此。
[免疫抑制剂]
本发明的免疫抑制剂含有活化LILRB4的物质作为有效成分。作为活化LILRB4的物质，可以举出在免疫检查点相关疾病的治疗剂中提到的那些。在本发明的含有活化LILRB4的物质作为有效成分的免疫抑制剂中，抗纤维粘连蛋白抗体或其衍生物、抗LILRB4抗体或其衍生物、纤维粘连蛋白或纤维粘连蛋白类似物通过与LILRB4结合，活化LILRB4，表达LILRB4的免疫抑制功能。本发明的免疫抑制剂可以应用于移植医疗。
本发明的免疫抑制剂还可以含有药学上可接受的载体、添加剂。药学上可接受的载体和添加剂包括上文所述的那些。
本发明的免疫抑制剂可以是各种形式，例如液剂(例如注射剂)、分散剂、混悬剂、片剂、丸剂、粉剂、栓剂等。优选的实施方案是注射剂，优选非经口(例如静脉内、经皮、腹腔内、肌内)给予。
本发明的免疫抑制剂的给予量例如可以是0.025-50mg/kg，优选0.1-50mg/kg，更优选0.1-25mg/kg，进一步优选0.1-10mg/kg或0.1-3mg/kg，但不限于此。
[纤维粘连蛋白检测试剂盒和纤维粘连蛋白检测方法]
用于检测本发明的纤维粘连蛋白或其部分肽的试剂盒包含与序列编号1所示的氨基酸序列结合的抗纤维粘连蛋白抗体或其衍生物，可以检测生物样品中的所述纤维粘连蛋白或其部分肽。
作为生物样品，没有特别限制，例如可以举出血液、唾液、尿、脊髓液、骨髓液、胸腔积液、腹水、关节液、泪液、眼房水、玻璃体液、淋巴液等。
在本发明的试剂盒中，作为纤维粘连蛋白的部分肽，只要是抗纤维粘连蛋白抗体或其衍生物所结合的肽，则没有特别限制，优选为含有序列编号1所示的氨基酸序列的分子量24kDa的部分肽。
本发明的试剂盒中，除了与序列编号1所示的氨基酸序列结合的抗纤维粘连蛋白抗体或其衍生物以外，还可以包含纤维粘连蛋白的检测所需的其它构成要素，例如反应缓冲液、反应容器。
通过使用本发明的用于检测纤维粘连蛋白或其部分肽的试剂盒，可以检测生物样品中的纤维粘连蛋白或其部分肽。
作为检测生物样品中的纤维粘连蛋白或其部分肽的方法，只要该方法包括与序列编号1所示的氨基酸序列结合的抗纤维粘连蛋白抗体或其衍生物，并且能够检测生物样品中的纤维粘连蛋白或其部分肽即可，没有特别限制，但优选通过使用抗纤维粘连蛋白抗体或其衍生物的免疫学方法进行测定。作为免疫学方法，例如可通过但不限于实施免疫染色(蛋白质印迹法)、酶联免疫吸附测定法(ELISA)、夹心ELISA、免疫沉淀法、免疫比浊法(TIA或LTIA)、酶免疫测定、化学发光免疫测定、荧光免疫测定、流式细胞术等，检测与纤维粘连蛋白或其部分肽的分子量一致的条、或斑点或峰来进行。
实施例
下面，示出实施例对本发明进行更详细的说明，但本发明并不限定于以下的实施例。
[实施例1]小鼠T细胞中LILRB4的表达
在48孔板(Thermo公司制，#150687)中加入分别以10μg/mL浓度含有抗小鼠CD3抗体(BD Bioscience公司制，Clone：145-2C11，#553058)和抗小鼠CD28抗体(BD Bioscience公司制，Clone：37.51，#553298)的PBS(-)缓冲液100μL，在室温下包被孔30分钟，然后用500μL的PBS(-)缓冲液洗涤孔3次。将从10周龄的雌性gp49B缺陷小鼠或野生型小鼠的脾脏中采集的脾脏细胞进行溶血处理后，悬浮于含有10％胎牛血清(BioWest公司制，#S1530)、50μM2-巯基乙醇(富士胶片和光公司制，#139-06861)、1％青霉素(5000U/mL)/链霉素(5000μg/mL)溶液(Sigma公司制，#P4458)的RPMI-1640培养基(Sigma公司制，#R8758)中。此外，gp49B是小鼠中的与人LILRB4同源的分子。
将悬浮的脾脏细胞以1×106个细胞/200μL/孔的浓度接种在抗体包被的孔中，并在37℃、5％二氧化碳的条件下培养0-3天。细胞从孔中回收后，悬浮于含有2％胎牛血清和0.05％叠氮化钠(Sigma公司制，#S8032)的PBS(-)缓冲液中，在冰温条件下，使用FITC标记抗小鼠CD4抗体(BioLegend公司制，Clone：GK1.5，#100406)、Alexa647标记抗小鼠CD8a抗体(BD Biosciences公司制，Clone：53-6.7，#557882)、PE标记抗小鼠gp49A/B抗体(BioLegend公司制，Clone：H1.1，#144904)、BV421标记抗小鼠PD-1抗体(BioLegend公司制，Clone：29F.1A12，#135218)、PerCP-Cy5.5标记抗小鼠Tim-3(BioLegend公司制，Clone：B8.2C12，#134012)、作为同种型对照抗体的PE标记亚美尼亚仓鼠IgG(BioLegend公司制，Clone：HTK888，#400908)、BV421标记大鼠IgG2a(BioLegend公司制，Clone：RTK2758，#400549)、PerCP-Cy5.5标记大鼠IgG1(BioLegend公司制，Clone：K2071，#400426)进行染色，通过BDFACSAriaIII细胞分选仪(BD Biosciences公司制)进行测定，通过FlowJo软件(BDBiosciences公司制)分析数据。其结果示于图1-5。
图1示出鼠初始CD8阳性T细胞中B4、PD-1、Tim-3的表达。如图1所示，在小鼠初始CD8阳性T细胞中，略微观察到PD-1的表达，但未观察到B4和Tim-3的表达。另外，由于缺失B4，未见对PD-1或Tim-3的表达产生影响。
图2示出在抗CD3抗体/抗CD28抗体刺激后的小鼠CD8阳性T细胞中B4、PD-1、Tim-3的表达。如图2所示，通过抗CD3抗体/抗CD28抗体的活化刺激，小鼠CD8阳性T细胞上PD-1的表达在第1天几乎达到极大，而B4和Tim-3的表达在第1天表达略有上升，在第2天以后达到极大，表明其与PD-1的表达受到不同的调节。在B4缺陷型CD8阳性T细胞中，虽然通过抗CD3抗体/抗CD28抗体的活化刺激对PD-1的表达没有影响，但Tim-3的表达减弱。
图3示出小鼠初始CD4阳性T细胞中B4、PD-1、Tim-3的表达。如图3所示，在小鼠初始CD4阳性T细胞中，虽然PD-1弱，也观察到明显的表达，但未观察到B4和Tim-3的表达。另外，由于缺失B4，未见对PD-1或Tim-3的表达产生影响。
图4示出在抗CD3抗体/抗CD28抗体刺激后的小鼠CD4阳性T细胞中B4、PD-1、Tim-3的表达。如图4所示，通过抗CD3抗体/抗CD28抗体的活化刺激，小鼠CD4阳性T细胞上的PD-1表达在第1天几乎达到极大，而B4和Tim-3的表达在第1天表达略有上升，在第2天以后达到极大，表明其与PD-1的表达受到不同的调节。在B4缺陷型CD4阳性T细胞中，虽然通过抗CD3抗体/抗CD28抗体的活化刺激对PD-1的表达没有影响，但Tim-3的表达减弱。
图5示出在抗CD3抗体/抗CD28抗体刺激后的小鼠CD8阳性和CD4阳性T细胞中B4和PD-1的表达。如图5所示，小鼠CD8阳性T细胞和CD4阳性T细胞均为PD-1表达先上升，然后B4表达延迟上升，成为PD-1和B4的双阳性细胞。
从以上结果可知，B4在小鼠T细胞中表达，是与PD-1和Tim-3不同的免疫检查点分子。
[实施例2]人T细胞中LILRB4的表达
在48孔板(Thermo公司制，#150687)中加入分别以10μg/mL浓度含有抗人CD3抗体(BD Bioscience公司制，Clone：UCHT1，#555329)和抗人CD28抗体(BD Bioscience公司制，Clone：CD28.2，#555725)的PBS(-)缓冲液100μL，在室温下包被孔30分钟，然后用500μL的PBS(-)缓冲液洗涤孔3次。将冷冻人末梢血单核细胞(C.T.L.公司制)在37℃的温浴中快速解冻，悬浮于含有10％胎牛血清、50μM 2-巯基乙醇、1％青霉素(5000U/mL)/链霉素(5000μg/mL)溶液、20U/mL DNase I(Sigma公司制，#D5025)的RPMI-1640培养基(Sigma公司制，#R8758)中过夜培养后，回收细胞，使用Naive Pan T cell Isolation Kit，human(Miltenyi公司制，#130-097-095)将T细胞纯化，悬浮于上述组成的不含DNase I的培养基中。将悬浮T细胞以1×106个细胞/200μL/孔的浓度接种在抗体包被的孔中，并在37℃、5％二氧化碳的条件下培养0-3天。细胞从孔中回收后，悬浮于含有2％胎牛血清和0.05％叠氮化钠的PBS(-)缓冲液，在冰温条件下，使用FITC标记抗人CD4抗体(BioLegend公司制，Clone：RPA-T4，#300506)、Alexa647标记抗人CD8a抗体(BioLegend公司制，Clone：RPA-T8，#301022)、PE标记抗人CD85k(LILRB4)抗体(eBioscience公司制，Clone：ZM4.1，#12-5139-42)、BV421标记抗人PD-1抗体(BioLegend公司制，Clone：EH12.2H7，#329920)、PerCP-Cy5.5标记抗人Tim-3(BioLegend公司制，Clone：F38-2E2，#345016)、作为同种型对照抗体的PE标记小鼠IgG1,k(eBioscience公司制，Clone：P3.6.2.8.1，#12-4714-42)、BV421标记小鼠IgG1(BioLegend公司制，Clone：MOPC-21，#400158)、PerCP-Cy5.5标记小鼠IgG1(BD Biosciences公司制，Clone：MOPC-21，#552834)进行染色，通过BD FACSAriaIII细胞分选仪(BD Biosciences公司制)进行测定，通过FlowJo软件(BD Biosciences公司制)分析数据。
图6示出在抗CD3抗体/抗CD28抗体刺激后的人CD8阳性和CD4阳性T细胞中B4、PD-1、Tim-3的表达。如图6所示，人CD8阳性T细胞和CD4阳性T细胞在无刺激(第0天)时均未发现B4、PD-1、Tim-3的表达。但是，通过抗CD3抗体/抗CD28抗体的活化刺激，与PD-1和Tim-3同样地确认了B4的表达上升。
从以上结果可知，B4在人T细胞中表达，是与PD-1和Tim-3不同的免疫检查点分子。
[实施例3]纤维粘连蛋白与LILRB4的结合位点的分析
人纤维粘连蛋白从由位于2q35的单个基因转录的多种mRNA异构体翻译而成，通常由2240-2483个氨基酸残基组成，包括26个残基的信号肽。纤维粘连蛋白在血浆中作为可溶性二聚体存在，在细胞表面或细胞外基质(ECM)中作为二聚体或多聚体存在。二聚体的纤维粘连蛋白为两个几乎相同的210kDa～250kDa的多肽在C末端附近2个二硫键连接而成的结构，其中每个多肽由多个功能模块组成，这些模块具有与包括纤维蛋白、胶原蛋白、整合素、肝素、蛋白聚糖、纤维粘连蛋白的其他蛋白质结合的性质。
为了鉴定纤维粘连蛋白中的B4结合位点，通过报告细胞测定和BLI(Bio-layerinterferometry)分析对包含那些模块的单个结构域进行B4结合性分析。
BLI分析使用BLItz如下进行。将带有人His标签的人LILRB4固定在Ni-NTA传感器上，并用磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗去未结合的蛋白质。将该传感器浸在待测蛋白质中后，浸在PBS中解离。曲线回归和数据处理利用BLItz Pro软件进行。
报告细胞测定如下进行：使用胞外结构域为人LILRB4、跨膜结构域和胞内结构域为活化型paired immunoglobulin-like receptor beta的嵌合受体，用逆转录病毒载体转染表达NFAT-GFP报告基因和DAP12的小鼠T细胞杂交瘤细胞株，将得到的5×104个报告细胞与待测蛋白质培养，用流式细胞术分析GFP的表达。
其结果是，人纤维粘连蛋白N末端的组织蛋白酶D消化片段70kDa多肽与其胰蛋白酶消化片段N末端侧的30kDa片段具有结合性，C末端侧的45kDa片段在报告细胞测定和BLI分析中无结合性。纤维粘连蛋白的更靠C末端侧的部分，即氨基酸残基607-1265、1266-1908、1277-2477在报告细胞测定和BLI分析中均未诱导信号。结果显示纤维粘连蛋白中的B4结合位点在N末端的30kDa片段(FN30)中。
进而，通过将FN30的每20个氨基酸残基中每8个残基分别重叠而进行肽图分析，只有Cys123～His142的氨基酸序列(CysThrCysIleGlyAlaGlyArgGlyArgIleSerCysThrIleAlaAsnArgCysHis)在报告细胞中诱导了显著的信号。纤维粘连蛋白的Cys123～His142的氨基酸序列如序列编号1所示。由该结果可知，纤维粘连蛋白通过序列编号1所示的氨基酸序列与B4结合。
[实施例4]重组纤维粘连蛋白靶序列-Fc融合蛋白的制备
按照以下的步骤制备使人纤维粘连蛋白的N末端30kDa(相当于40号谷氨酰胺残基～282号甘氨酸残基，Sigma公司制，#9911，以下也称为FN30)与小鼠IgG2a的Fc融合而成的重组蛋白质(以下也称为FN30-Fc)。
使用以下引物从来自人间充质干细胞的mRNA扩增编码FN30的DNA片段。
FN30正向引物：5’-ATAGAATTCGCAGTCCCCGGTGGCTGTCAGT-3’(序列编号2)
FN30反向引物：5’-TTAAGATCTTCCGCTCGATGTGGTCTGCAC-3’(序列编号3)
扩增的FN30 DNA片段用Eco RI和Bgl II消化并插入pFUSE-mIgG2Ae1-Fc2载体的相应位点。本载体是在Fc部分导入了L235E、E318A、K320A、K322A的突变以降低IgG2a的Fc本来具有的抗体依赖性细胞毒性(ADCC)和补体依赖性细胞毒性(CDC)的载体。
对得到的质粒pFUSE-mIgG2Ae1-Fc2/FN30进行序列分析并确认后，用于蛋白质表达。为了表达FN30-Fc，使用Lipofectamine2000将本质粒转染至CHO-K1细胞中，并且在用Zeocin(0.8mg/ml)选择稳定的导入细胞克隆之后，通过超稀释法获得。重组FN30-Fc用HiTrap Protein G HP柱从细胞培养上清液纯化，然后用PBS(-)透析。
[实施例5]抗纤维粘连蛋白抗体的制备
将用组织蛋白酶D处理来自人血浆的纤维粘连蛋白而得到的70kDa片段用胰蛋白酶处理后，利用肝素结合性纯化纤维粘连蛋白的N末端侧30kDa片段(FN30，Sigma公司制，＃9911)，用该片段作为抗原对WKY大鼠进行免疫，在50％聚乙二醇存在下使髂淋巴结细胞与骨髓瘤细胞融合，获得杂交瘤。通过使用人FN30、实施例4中得到的FN30-Fc、小鼠FN(Abcam公司制，＃ab92784)、FN30的合成肽片段的ELISA进行选择，得到9个克隆的产生抗纤维粘连蛋白单克隆抗体(以下也称为FN30单克隆抗体)的杂交瘤。建立的9种抗FN30单克隆抗体的克隆名称、同种型、与小鼠MSC的结合性以及与人MSC的结合性示于表1。表中，(-)表示无结合性，(+)表示弱结合性，(++)表示强结合性。
[表1]
抗体编号 同种型(大鼠IgG) 与小鼠MSC的结合性 与人MSC的结合性
1 IgG2b - -
2 IgG2a - -
3 IgG2b - -
4 IgG2a ++ ++
5 IgG2a ++ ++
6 IgG2b ++ ++
7 IgG2c + +
8 IgG2a - -
9 IgG2a - +
[实施例6]抗纤维粘连蛋白抗体的阻断效果
将来自人骨髓的间充质干细胞(PromoCell公司制，＃C-12974)悬浮于间充质干细胞增殖培养基(PromoCell公司制，C-28009)中，以1×105个细胞/300μL/孔的方式接种在48孔板中，在37℃、5％二氧化碳的条件下进行培养。培养24小时后的间充质干细胞充分贴附于平板的状态下，吸去培养基，添加含有实施例5中得到的抗FN30单克隆抗体(No.1～No.9)20μg/mL的PBS(-)缓冲液300μL，并在37℃下反应1小时。然后，吸去含有抗FN30单克隆抗体的PBS(-)缓冲液，用含有0.5％胎牛血清、50μM 2-巯基乙醇、1％青霉素(5000U/mL)/链霉素(5000μg/mL)溶液的RPMI-1640培养基500μL洗涤孔2次，将悬浮于相同组成的RPMI-1640培养基中的B4嵌合受体GFP报告细胞(B4-2B4细胞)或未表达嵌合受体的对照GFP报告细胞(2B4细胞)以1×105细胞/200μL/孔接种，并在37℃、5％二氧化碳的条件下培养18小时。细胞从孔中回收后，悬浮于含有2％胎牛血清和0.05％叠氮化钠的PBS(-)缓冲液中，通过BDFACSCalibur流式细胞仪(BD Biosciences公司制)进行测定，并通过FlowJo软件分析数据。其结果示于图7。
如图7所示，用抗FN30单克隆抗体No.1-5和No.7-9处理时，显示出与无抗体的阳性对照相当的GFP表达，与之相对，用抗FN30单克隆抗体No.6处理时，显示出与仅用报告细胞的阴性对照相当的GFP表达，因此No.6抗体可以说是抑制FN30与B4结合的抗体。
[实施例7]各抗人FN30单克隆抗体的交叉性(来自小鼠骨髓的间充质干细胞(MSC)和来自人骨髓的间充质干细胞的染色)
将未经酶处理等而从培养皿通过移液器回收的来自小鼠骨髓的间充质干细胞(Cyagen公司制，#MUBMX-01001)和来自人骨髓的间充质干细胞悬浮于含有2％胎牛血清和0.05％叠氮化钠的PBS(-)缓冲液中，在冰温条件下，用实施例5中得到的抗FN30单克隆抗体或PE标记大鼠IgG1,k(BD Biosciences公司制，Clone：R3-34，#553925)进行处理，清洗后用PE标记山羊抗大鼠IgG多克隆抗体(BioLegend公司制，#405406)染色，用BD FACSCalibur流式细胞仪进行测定，通过FlowJo软件分析数据。其结果示于图8。
如图8所示，抗FN30单克隆抗体No.4、No.5和No.6对小鼠MSC和人MSC均进行强染色，而No.7抗体对小鼠MSC和人MSC进行弱染色。对于No.9抗体，仅对人MSC进行弱染色。No.1、No.2、No.3和No.8抗体均未对MSC染色。
[实施例8]人和鼠癌细胞株中纤维粘连蛋白(FN30)的细胞表面表达
将未经酶处理等而从培养皿通过移液器回收的小鼠癌细胞株的B16F10(黑色素瘤)、3LL(路易斯肺癌)、人癌细胞株的Daudi(伯基特淋巴瘤)、HL60(早幼粒细胞白血病)、HeLa(宫颈上皮样癌)、HepG2(肝细胞癌)、Saos-2(骨肉瘤)悬浮于含有2％胎牛血清和0.05％叠氮化钠的PBS(-)缓冲液中，在冰温条件下用抗FN30单克隆抗体(No.5)或PE标记大鼠IgG2a,k(BD Biosciences公司制，Clone：R35-95，#554689)进行处理，清洗后用Alexa488标记山羊抗大鼠IgG多克隆抗体(Invitrogen公司制，#A-11006)染色，用BD FACSCalibur流式细胞仪进行测定，通过FlowJo软件分析数据。其结果示于图9。
如图9所示，在小鼠癌细胞株中，纤维粘连蛋白(FN30)在细胞表面的表达在B16F10中弱，在3LL中强。在人癌细胞株中，Daudi、HL60、HeLa中没有细胞表面表达，HepG2和Saos-2中可以观察到强的细胞表面表达。
[实施例9]肿瘤内浸润淋巴细胞的B4和PD-1表达
在野生型小鼠的左脚大腿部皮下接种5×105个细胞/100μL/只的B16F10细胞或3LL细胞，然后，在直径成长至1.5cm左右的阶段，通过二氧化碳的过量吸入使小鼠安乐死，取出肿瘤，使用Tumor Dissociation Kit，mouse(Miltenyi公司制，#130-096-730)和gentleMACS Dissociator(Miltenyi公司制，#130-093-235)制备单细胞悬浮液，通过用Percoll(GE Healthcare公司制，#17089102)的比重分离回收淋巴细胞。回收的细胞悬浮于含有2％胎牛血清和0.05％叠氮化钠的PBS(-)缓冲液中，在冰温条件下，使用FITC标记抗小鼠CD4抗体、Alexa647标记抗小鼠CD8a抗体、PE标记抗小鼠gp49A/B抗体、BV421标记抗小鼠PD-1抗体、作为同种型对照抗体的PE标记亚美尼亚仓鼠IgG、BV421标记大鼠IgG2a进行染色，通过BD FACSAriaIII细胞分选仪进行测定，通过FlowJo软件分析数据。其结果示于图10和图11。
图10示出肿瘤内浸润淋巴细胞(小鼠CD8阳性T细胞)中B4和PD-1的表达。如图10所示，在浸润至B16F10肿瘤内的CD8阳性T细胞的一部分中观察到B4和PD-1的表达，其中大部分为B4和PD-1双重阳性细胞，并且还观察到B4单阳性细胞。浸润至3LL肿瘤内的CD8阳性T细胞大多数是B4阳性的，其中80％以上是PD-1阳性的。
图11示出肿瘤内浸润淋巴细胞(小鼠CD4阳性T细胞)中B4和PD-1的表达。如图11所示，在浸润至B16F10肿瘤内的CD4阳性T细胞的一部分中观察到B4和PD-1的表达，也观察到B4和PD-1双重阳性细胞以及B4单阳性细胞。浸润至3LL肿瘤内的CD4阳性T细胞大多数是PD-1和B4双重阳性细胞。
[实施例10]通过抗纤维粘连蛋白多克隆抗体、抗纤维粘连蛋白单克隆抗体进行的血浆样品的蛋白质检测(蛋白质印迹法)
使用健康男性(年龄25-31岁)血液作为血浆样品，将血液10.5ml/人采集至Venoject II真空采血管(注册商标)中，并在通用冷却离心机(KUBOTA S911)中离心2500rpm×3分钟，分离并回收血浆。
将血浆样品用超纯水稀释15倍，添加还原剂(1Mβ-ME)和表面活性剂(4％SDS)，在95℃×5分钟加热后的还原条件下，用7.5％丙烯酰胺凝胶进行电泳。电泳后，将分离的蛋白质转印至聚偏氟乙烯(PVDF)膜。得到的印迹作为第一抗体添加抗FN多克隆抗体、以及实施例5中得到的抗FN30单克隆抗体No.4和No.5，作为第二抗体分别添加抗rabbit IgG-HRP抗体(cell signaling公司制，#7074)、抗rat IgG-HRP抗体(Biolegend公司制，Clone：Poly4054，#405405)后，使用ThermoFisher公司制Pierce ECL Western BlottingSubstrate对基质进行染色。图像分析使用GE Healthcare公司制ImageQuant LAS4000mini。结果示于图12。
如图12所示，用抗FN30单克隆抗体No.4、No.5确认了250kDa的条带。在抗FN多克隆抗体和抗FN30单克隆抗体中均观察到分子量约24kDa的条带，确认了24kDa的FN片段存在于健康人血浆中。
[实施例11]使用抗纤维粘连蛋白抗体的健康人血浆中纤维粘连蛋白全长分子和纤维粘连蛋白24kDa片段的定量(ELISA法)
使用以实施例5中得到的抗FN30单克隆抗体No.6和Collagen binding-FN为抗原的抗FN44kDa抗体(Origene公司制，Clone：OTI3F9，以下也称为抗FN44抗体)和作为多克隆抗体的Anti-Fibronectin antibody produced in rabbit(Sigma-Aldrich公司制，#F3648，以下也称为抗FN多克隆抗体)，在96孔板(Greiner Bio-one公司制，MICROLON(注册商标))中用碳酸缓冲液(NaHCO3 0.01M)稀释各单克隆抗体以使最终浓度为4μg/ml，在4℃下静置12小时并涂布板。在用含1％BSA的PBS封闭之后，加入标准FN蛋白(R&D公司制，Fibronectin ELISA DuoSet)和健康人血浆。
使用抗FN多克隆抗体(稀释13500倍)和抗rabbit IgG-HRP抗体(稀释250倍)检测结合单克隆抗体的纤维粘连蛋白的量。各操作间的板洗涤使用TBS 0.1％Tween20。加入底物后，用酶标仪(BioRad公司制，Model 680)测定波长450nm的吸光度并数值化。
以标准蛋白的吸光度为基础，通过4参数逻辑回归进行非线性近似，由样品的吸光度值算出浓度。其结果示于图13。用抗FN30单克隆抗体检测的纤维粘连蛋白浓度[A(μg/ml)]和用抗FN44抗体检测的纤维粘连蛋白浓度[B(μg/ml)]被认为是图13所示的浓度。
如果将纤维粘连蛋白全长分子设为xμg/ml、将24kDa缺失纤维粘连蛋白设为yμg/ml、将24kDa纤维粘连蛋白设为zμg/ml，考虑到24kDa缺失纤维粘连蛋白和24kDa纤维粘连蛋白均为分解产物、第二抗体所结合的多克隆抗体与分子量成大致比例，则成为下述式的关系。
[数学式1]
Figure BDA0003536679880000211
根据该式，x、y和z通过下式计算。
[数学式2]
Figure BDA0003536679880000212
将结果作为表示第一、第二、第三四分位点以及最大值、最小值的箱线图显示(图14)。该结果表明，纤维粘连蛋白全长分子浓度为279±131μg/ml，符合公知的FN浓度(300μg/ml)。使用抗FN30单克隆抗体No.6和抗FN44抗体，利用各浓度的差异，计算出血浆中的FN24kDa浓度为6.49±7.44μg/ml。
[实施例12]FN30对自身抗体疾病的治疗效果
如下验证FN30的抑制是否对抑制gp49B与纤维粘连蛋白的结合而由病原性浆细胞导致的自身抗体产生显示治疗效果。
以2周的间隔重复两次向BXSB/Yaa小鼠腹腔内给予对照IgG或实施例4中得到的FN30-Fc。其结果示于图15。
如图15所示，给予对照IgG的小鼠组的抗dsDNA IgG血清抗体效价逐渐升高，而FN30-Fc给予组在观察期间IgG自身抗体水平保持相对恒定。
这种抑制效果在BXSB/Yaa小鼠中以与给予FN30-Fc同样的时间表将抗gp49B单克隆抗体H1.1在腹腔内给予时也同样观察到(图16)。自身抗体效价的提高抑制对脾脏重量、总脾脏细胞数、总骨髓细胞数、脾脏与骨髓中的浆细胞的比例、脾脏中的dsDNA自身抗体产生细胞的频率等没有特别的影响。
这些结果表明，通过将FN30-Fc或抗gp49B单克隆抗体H1.1给予BXSB/Yaa小鼠，不特别消除抗体产生细胞，抑制了抗dsDNAIgG的进一步上升。这些结果表明，FN-30和抗B4抗体通过阻断B4与FN的结合，从而有效地缓解自身免疫病。
[实施例13]LILRB4在癌转移中的参与
为了评价LILRB4(在小鼠中为gp49B)是否参与肿瘤的转移，通过尾静脉将Lewis肺癌细胞(LLC)或小鼠黑色素瘤细胞B16F10注入野生型(WT)B6小鼠和gp49B缺陷小鼠中，分别经过30天、20天后，摘除肺和肝脏，计数H&E染色或表面的肿瘤结节数进行评价。注入LLC的结果示于图17A～图17D，注入B16F10的结果示于图18A、图18B和图19。
如图17A和图17B所示，与WT相比，gp49B缺陷小鼠中LLC向肺的转移降低。另外，如图17C和图17D所示，肿瘤转移的部位仅在注入LLC的WT小鼠的肝脏中观察到，而在gp49B缺陷小鼠的肝脏中未观察到。
关于B16F10，如图18A和图18B所示，gp49B缺陷小鼠中肺的总表面的肿瘤结节数优先降低(图18A)，向肝脏的转移也降低(图18B)。
然后，用8.5Gy对C57BL/6NJcl小鼠进行全身放射线照射，1天后从尾静脉以5×106个细胞/只注射并转移来自野生型和gp49B缺陷小鼠的骨髓细胞。过继转移后，将小鼠用庆大霉素(gentamycin)处理1个月，转移后4周时，用流式细胞术确认全血图像中供体细胞的置换状态。其结果示于图19。如图19所示，向肺和肝的转移在将gp49B缺陷的骨髓细胞过继转移的小鼠中比将野生型小鼠的骨髓细胞过继转移的对照小鼠低。这些结果表明gp49B参与肿瘤细胞的转移。
[实施例14]由LILRB4抑制产生的癌转移抑制效果
如实施例12所示，由于gp49B缺陷时肿瘤转移减少，因此如下研究了使用抗gp49B单克隆抗体H1.1抑制gp49B时肿瘤的转移受到怎样的影响。
向注入了B16F10的B6小鼠腹腔内注射6次对照同种型IgG抗体、抗PD-1单克隆抗体、抗gp49B单克隆抗体、或者抗PD-1单克隆抗体与抗gp49B单克隆抗体的组合，给予抗体后，评价肺肿瘤结节数和肝转移灶数。其结果示于图20A～图20D。
如图20A～图20D所示，抗gp49B单克隆抗体处理组与抗PD-1单克隆抗体处理组、或者用抗gp49B单克隆抗体与抗PD-1单克隆抗体的组合处理的组同等，肺、肝脏的B16F10肿瘤的转移灶数均降低。进而，研究了向B6小鼠注射荧光素酶表达LLC(LLC-Luc2)后，对照同种型IgG抗体、抗PD-1单克隆抗体、抗gp49B单克隆抗体或者抗PD-1单克隆抗体与抗gp49B单克隆抗体的组合的效果，结果发现抗gp49B单克隆抗体处理组以及抗PD-1单克隆抗体与抗gp49B单克隆抗体的组合处理组中，肺、肝脏的LLC-Luc2肿瘤的转移灶数均减少(图20E～图20G)。
进而，在携带LLC-Luc2肿瘤的小鼠中联合使用抗PD-1单克隆抗体和抗gp49B单克隆抗体，统计学上显著减少了转移灶数(图20G)。gp49B抑制与PD-1和gp49B的同时抑制同样，病理切片的分析中也抑制了肺和肝脏的LLC-Luc2的转移(图21)。由这些结果可知，通过抑制LILRB4，癌的转移得到抑制。
[实施例15]由LILRB4抑制产生的破骨细胞分化促进效果的验证1
从野生型B6小鼠中采集骨髓细胞，并在48孔板上以5.0×105细胞/孔使用含有10％FCS和10μg/ml的对照同种型IgG抗体、抗gp49B单克隆抗体H1.1、抗gp49B单克隆抗体H1.1的F(ab’)2片段或抗FN30单克隆抗体No.6的α-MEM培养基进行培养。培养2小时后添加20ng/孔的M-CSF，再培养48小时。从此时刻起，为了分化诱导为破骨细胞，进一步添加含有20ng/ml M-CSF和100ng/ml RANKL的添加了10％FCS的α-MEM，6天后进行TRAP染色。其结果示于图22。
如图22所示，向破骨细胞的分化诱导是通过添加抗gp49B单克隆抗体H1.1或抗gp49B单克隆抗体H1.1的F(ab’)2片段，分化诱导率(％)(破骨细胞数/总细胞数×100)分别为3.5％、3.4％，与对照同种型IgG抗体的情况(2.7％)相比，有稍微上升的倾向。另外，添加抗FN-30单克隆抗体No.6后分化诱导率为7.9％，可见显著上升。
[实施例16]由LILRB4抑制产生的破骨细胞分化促进效果的验证2
使用磁力细胞分选仪MACS(Miltenyi Biotec公司制)从由健康个体采集的血液样品制备的外周血单核细胞(PBMC)得到CD11b阳性单核细胞。将其在含有100ng/ml RANKL、25ng/ml M-CSF的添加了10％FCS的α-MED培养基中，添加抗LILRB4单克隆抗体ZM4.1(Thermo Fisher Scientific公司制)1.0μg/ml或作为对照同种型抗体的小鼠IgG1κ(Biolegend公司制)1.0μg/ml，培养7天，TRAP染色。其结果示于图23。
如图23中所示，PBMC向破骨细胞的分化诱导率为13.7％，与对照同种型抗体的情况(7.6％)相比，通过添加抗LILRB4抗体向破骨细胞的分化诱导提高了约2倍。
[实施例17]由LILRB4抑制产生的破骨细胞分化促进效果的验证3
从野生型B6小鼠和gp49B缺陷小鼠采集骨髓细胞，使用10％FCS、20ng/ml M-CSF、1.0×106细胞/ml的α-MEM培养基，在24孔板中培养2天。然后，为了分化诱导为破骨细胞，添加含有20ng/孔M-CSF和100ng/ml RANKL的添加了10％FCS的α-MEM，5天后进行TRAP染色。其结果示于图24。
如图24所示，向破骨细胞的分化诱导率与来自野生型小鼠的骨髓细胞相比，来自gp49B缺陷小鼠的骨髓细胞约上升3倍。
[实施例18]由LILRB4抑制产生的破骨细胞分化促进效果的验证4
从18周龄的野生型B6小鼠(雌)和18周龄的gp49B缺陷小鼠(雌)分离大腿骨，用川本法(“非脱灰硬组织冷冻切片标本制作技术(川本法2008)及其应用”川本忠文“病理技术72卷2号76-83页，2009年”)包埋后制作冷冻切片，TRAP染色，检测破骨细胞。其结果示于图25。
如图25所示，与野生型B6小鼠相比，gp49B缺陷小鼠检测出更多的破骨细胞。
工业实用性
根据本发明，可以提供免疫检查点抑制剂、免疫检查点相关疾病的治疗剂、免疫抑制剂、抗纤维粘连蛋白抗体或其衍生物、纤维粘连蛋白类似物、用于检测纤维粘连蛋白或其部分蛋白质的试剂盒和检测纤维粘连蛋白或其部分蛋白质的方法。
SEQUENCE LISTING
<110> 国立大学法人东北大学
<120> 免疫检查点抑制剂、免疫检查点相关疾病的治疗剂、免疫抑制剂、抗纤维粘连蛋白抗体或其衍生物、纤维粘连蛋白类似物、用于检测纤维粘连蛋白或其部分蛋白质的试剂盒和检测纤维粘连蛋白或其部分蛋白质的方法
<130> P74503SIP
<140> JP 2019-148423
<141> 2019-08-13
<160> 3
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 20
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 1
Cys Thr Cys Ile Gly Ala Gly Arg Gly Arg Ile Ser Cys Thr Ile Ala
1 5 10 15
Asn Arg Cys His
20
<210> 2
<211> 31
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> FN30 forward primer
<400> 2
atagaattcg cagtccccgg tggctgtcag t 31
<210> 3
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> FN30 reverse primer
<400> 3
ttaagatctt ccgctcgatg tggtctgcac 30

Claims (23)

1.一种免疫检查点抑制剂，其含有抑制纤维粘连蛋白与免疫抑制性受体LILRB4的结合的物质作为有效成分。
2.根据权利要求1所述的免疫检查点抑制剂，其中，所述纤维粘连蛋白通过所述纤维粘连蛋白中的序列编号1所示的氨基酸序列与免疫抑制性受体LILRB4结合。
3.根据权利要求1或2所述的免疫检查点抑制剂，其中，所述抑制纤维粘连蛋白与免疫抑制性受体LILRB4的结合的物质为抗纤维粘连蛋白抗体或其衍生物、抗免疫抑制性受体LILRB4抗体或其衍生物、或者纤维粘连蛋白类似物。
4.根据权利要求3所述的免疫检查点抑制剂，其中，所述抗纤维粘连蛋白抗体或其衍生物与纤维粘连蛋白中的序列编号1所示的氨基酸序列结合。
5.根据权利要求3所述的免疫检查点抑制剂，其中，所述纤维粘连蛋白类似物为以下(a)-(c)中任意一种的肽，
(a)含有序列编号1所示的氨基酸序列的肽；
(b)含有在序列编号1所示的氨基酸序列中缺失、插入、取代或添加了1至数个氨基酸的氨基酸序列、且对免疫抑制性受体LILRB4的纤维粘连蛋白结合位点具有结合能力的肽；
(c)含有在序列编号1所示的氨基酸序列中具有80％以上同一性的氨基酸序列、且对免疫抑制性受体LILRB4的纤维粘连蛋白结合位点具有结合能力的肽。
6.一种免疫检查点相关疾病的治疗剂，其含有抑制纤维粘连蛋白与免疫抑制性受体LILRB4的结合的物质作为有效成分。
7.根据权利要求6所述的治疗剂，其中，所述纤维粘连蛋白通过所述纤维粘连蛋白中的序列编号1所示的氨基酸序列与免疫抑制性受体LILRB4结合。
8.根据权利要求6或7所述的治疗剂，其中，所述抑制纤维粘连蛋白与免疫抑制性受体LILRB4的结合的物质为抗纤维粘连蛋白抗体或其衍生物、抗免疫抑制性受体LILRB4抗体或其衍生物、或者纤维粘连蛋白类似物。
9.根据权利要求8所述的治疗剂，其中，所述抗纤维粘连蛋白抗体或其衍生物与纤维粘连蛋白中的序列编号1所示的氨基酸序列结合。
10.根据权利要求8所述的治疗剂，其中，所述纤维粘连蛋白类似物为以下(a)-(c)中任意一种的肽，
(a)含有序列编号1所示的氨基酸序列的肽；
(b)含有在序列编号1所示的氨基酸序列中缺失、插入、取代或添加了1至数个氨基酸的氨基酸序列、且对免疫抑制性受体LILRB4的纤维粘连蛋白结合位点具有结合能力的肽；
(c)含有在序列编号1所示的氨基酸序列中具有80％以上同一性的氨基酸序列、且对免疫抑制性受体LILRB4的纤维粘连蛋白结合位点具有结合能力的肽。
11.根据权利要求6-10中任意一项所述的治疗剂，其中，所述免疫检查点相关疾病选自自身免疫性疾病、癌症、炎症性疾病和过敏性疾病。
12.根据权利要求11所述的治疗剂，其中，所述癌症由癌转移引起。
13.一种免疫检查点相关疾病的治疗剂，其含有活化免疫抑制性受体LILRB4的物质作为有效成分。
14.根据权利要求13所述的治疗剂，其中，所述活化免疫抑制性受体LILRB4的物质为抗纤维粘连蛋白抗体或其衍生物、抗免疫抑制性受体LILRB4抗体或其衍生物、或者纤维粘连蛋白或纤维粘连蛋白类似物。
15.根据权利要求14所述的治疗剂，其中，所述纤维粘连蛋白类似物为以下(a)-(c)中任意一种的肽，
(a)含有序列编号1所示的氨基酸序列的肽；
(b)含有在序列编号1所示的氨基酸序列中缺失、插入、取代或添加了1至数个氨基酸的氨基酸序列、且对免疫抑制性受体LILRB4的纤维粘连蛋白结合位点具有结合能力的肽；
(c)含有在序列编号1所示的氨基酸序列中具有80％以上同一性的氨基酸序列、且对免疫抑制性受体LILRB4的纤维粘连蛋白结合位点具有结合能力的肽。
16.根据权利要求13-15中任意一项所述的治疗剂，其中，所述免疫检查点相关疾病为骨疾病。
17.一种免疫抑制剂，其含有活化免疫抑制性受体LILRB4的物质作为有效成分。
18.根据权利要求17所述的免疫抑制剂，其中，所述活化免疫抑制性受体LILRB4的物质为抗纤维粘连蛋白抗体或其衍生物、抗免疫抑制性受体LILRB4抗体或其衍生物、或者纤维粘连蛋白或纤维粘连蛋白类似物。
19.根据权利要求18所述的免疫抑制剂，其中，所述纤维粘连蛋白类似物为以下(a)-(c)中任意一种的肽，
(a)含有序列编号1所示的氨基酸序列的肽；
(b)含有在序列编号1所示的氨基酸序列中缺失、插入、取代或添加了1至数个氨基酸的氨基酸序列、且对免疫抑制性受体LILRB4的纤维粘连蛋白结合位点具有结合能力的肽；
(c)含有在序列编号1所示的氨基酸序列中具有80％以上同一性的氨基酸序列、且对免疫抑制性受体LILRB4的纤维粘连蛋白结合位点具有结合能力的肽。
20.一种抗纤维粘连蛋白抗体或其衍生物，其与序列编号1所示的氨基酸序列结合。
21.一种纤维粘连蛋白类似物，其由以下(a)-(c)中任意一种的肽与免疫球蛋白G的Fc区融合而成，
(a)含有序列编号1所示的氨基酸序列的肽；
(b)含有在序列编号1所示的氨基酸序列中缺失、插入、取代或添加了1至数个氨基酸的氨基酸序列、且对免疫抑制性受体LILRB4的纤维粘连蛋白结合位点具有结合能力的肽；
(c)含有在序列编号1所示的氨基酸序列中具有80％以上同一性的氨基酸序列、且对免疫抑制性受体LILRB4的纤维粘连蛋白结合位点具有结合能力的肽。
22.一种试剂盒，其用于检测生物样品中包含的含有序列编号1所示的氨基酸序列的纤维粘连蛋白或其部分蛋白质，含有权利要求20所述的抗纤维粘连蛋白抗体或其衍生物。
23.一种检测生物样品中的纤维粘连蛋白或其部分蛋白质的方法，其使用权利要求22的试剂盒。
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