CN117980335A - Cd8结合多肽及其用途 - Google Patents

Abstract

本发明提供结合CD8的含VHH多肽。亦提供所述含VHH多肽的用途。

Description

CD8结合多肽及其用途

相关申请的交叉引用

本申请主张2021年7月20日申请的美国临时申请第63/223,786号及2021年12月10日申请的美国临时申请第63/288,111号的优先权，所述申请各自出于任何目的以全文引用的方式并入本文中。

技术领域

本发明涉及CD8结合多肽，及使用CD8结合多肽调节CD8的生物活性的方法。所述方法包括但不限于治疗癌症的方法。在一些实施方案中，CD8结合多肽为包含CD8结合多肽及结合除CD8以外的抗原的多肽的融合多肽。

背景技术

CD8为跨膜糖蛋白，其表达于细胞毒性T细胞(CD8+T细胞)以及淋巴系统的其他细胞(包括自然杀伤细胞、γδT细胞、皮质胸腺细胞及树突状细胞亚群)的表面上。CD8通常为由CD8α链及CD8β链构成的异源二聚体，但在一些情况下可以CD8α同源二聚体形式存在。在细胞毒性T细胞上，CD8充当T细胞受体(TCR)的共受体以增强抗原识别及T细胞活化。细胞毒性T细胞活化为通过TCR与结合至I类主要组织兼容复合体(MHC)蛋白质的肽抗原的相互作用来支配。CD8经由结合至I类MHC蛋白的恒定区来帮助使TCR/肽-MHC相互作用稳定。CD8亦通过将Lck募集至CD8α的细胞质域来增强TCR信号传导，从而产生放大T细胞活化信号的级联。

T细胞的活化亦由其他分子控制，诸如IL-2、IL-15、IL-7、IL-6、IL-12、IFNα、IFNβ及IFNγ。通过活化T细胞本身合成及分泌的细胞因子白介素-2(IL-2)为一种调节辅助T细胞的分化、增强自然杀伤细胞的溶胞活性及调节CD8+T细胞产生的多效性细胞因子。IL-2结合至由T细胞表面上的三个次单元(IL-2α、IL-2β及γc)构成的高亲和性受体。经由IL-2受体复合物的信号传导触发T细胞经由细胞分裂进行，驱动活化T细胞的克隆扩增。

需要CD8结合多肽，所述多肽可使活化分子特异性地靶向CD8+T细胞以提高细胞毒性T细胞反应的效力及选择性。

发明内容

本文提供CD8结合多肽，及使用CD8结合多肽治疗例如癌症的方法。在一些实施方案中，CD8结合多肽包含一种或多种额外结合域和/或细胞因子序列。下文提供某些编号实施方案。

实施方案1一种多肽，其包含至少一个结合CD8的VHH域，该域包含CDR1，其包含SEQID NO:3、73或74的氨基酸序列；CDR2，其包含SEQ ID NO:4、12、14、22、27、29、31、75、76、77、78、79或80的氨基酸序列；及CDR3，其包含SEQ ID NO:5、16或18的氨基酸序列。

实施方案2如实施方案1的多肽，其中至少一个VHH域包含CDR1、CDR2及CDR3，其分别包含氨基酸序列SEQ ID NO:3、4及5；3、12及5；3、14及5；3、4及16；3、4及18；3、22及5；3、14及18；3、27及5；3、29及5；3、31及5；73、14及18；74、14及18；3、75及18；3、76及18；3、77及18；3、78及18；3、79及18；或3、80及18。

实施方案3如实施方案1或2的多肽，其中至少一个VHH域包含：CDR1，其包含SEQ IDNO:3的氨基酸序列；CDR2，其包含SEQ ID NO:78的氨基酸序列；及CDR3，其包含SEQ ID NO:18的氨基酸序列。

实施方案4如实施方案1至3中任一项的多肽，其中至少一个VHH域或各VHH域经人源化。

实施方案5如实施方案1至4中任一项的多肽，其中至少一个VHH域包含与SEQ IDNO:2、6、7、8、9、10、11、13、15、17、19、20、21、23、24、25、26、28、30、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100的氨基酸序列至少85％、90％、95％或至少99％一致的氨基酸序列。

实施方案6如实施方案1至5中任一项的多肽，其中至少一个VHH域包含SEQ ID NO:6、7、8、9、10、11、13、15、17、19、20、21、23、24、25、26、28、30、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99或100的氨基酸序列。

实施方案7如实施方案1至6中任一项的多肽，其中至少一个VHH域包含SEQ ID NO:92或100的氨基酸序列。

实施方案8如实施方案1至7中任一项的多肽，其包含两个VHH域。

实施方案9如实施方案1至7中任一项的多肽，其包含三个VHH域。

实施方案10如实施方案1至9中任一项的多肽，其中该多肽包含免疫细胞活化细胞因子。

实施方案11如实施方案10的多肽，其中该免疫细胞活化细胞因子融合至结合CD8的VHH域的N端或C端。

实施方案12如实施方案10或实施方案11的多肽，其中该免疫细胞活化细胞因子为IL-2、IL-15、IL-7、IL-6、IL-12、IFNα、IFNβ或IFNγ，或其减毒或经修饰型。

实施方案13如实施方案1至12中任一项的多肽，其中该多肽包含Fc区。

实施方案14如实施方案13的多肽，其中该Fc区包含选自SEQ ID NO:32-70或101-111的氨基酸序列。

实施方案15如实施方案13或实施方案14的多肽，其中该多肽包含免疫细胞活化细胞因子。

实施方案16如实施方案15的多肽，其中该免疫细胞活化细胞因子为IL-2、IL-15、IL-7、IL-6、IL-12、IFNα、IFNβ或IFNγ，或其减毒或经修饰型。

实施方案17如实施方案16的多肽，其中该免疫细胞活化细胞因子融合至该Fc区的C端。

实施方案18如实施方案1至17中任一项的多肽，其中该多肽包含至少一个结合除CD8以外的抗原的抗原结合域。

实施方案19如实施方案18的多肽，其中该多肽包含至少一个结合Lag3、CTLA4、TGFBR1、TGFBR2、Fas、TNFR2、PD1、PDL1或TIM3的抗原结合域。

实施方案20如实施方案18或19的多肽，其中该多肽包含至少一个结合以下的抗原结合域：TGFBR1、TGFBR2、Fas、TNFR2、1-92-LFA-3、5T4、α-4整合素、α-V整合素、α4β1整合素、α4β7整合素、AGR2、抗Lewis-Y、Apelin J受体、APRIL、B7-H3、B7-H4、B7-H6、BAFF、BCMA、BTLA、C5补体、C-242、CA9、CA19-9、(Lewis a)、碳酸酐酶9、CD2、CD3、CD6、CD9、CD11a、CD19、CD20、CD22、CD24、CD25、CD27、CD28、CD30、CD33、CD38、CD39、CD40、CD40L、CD41、CD44、CD44v6、CD47、CD51、CD52、CD56、CD64、CD70、CD71、CD73、CD74、CD80、CD81、CD86、CD95、CD117、CD123、CD125、CD132、(IL-2RG)、CD133、CD137、CD138、CD166、CD172A、CD248、CDH6、CEACAM5(CEA)、CEACAM6(NCA-90)、CLAUDIN-3、CLAUDIN-4、cMet、胶原蛋白、Cripto、CSFR、CSFR-1、CTLA4、CTGF、CXCL10、CXCL13、CXCR1、CXCR2、CXCR4、CYR61、DL44、DLK1、DLL3、DLL4、DPP-4、DSG1、EDA、EDB、EGFR、EGFRviii、内皮素B受体(ETBR)、ENPP3、EpCAM、EPHA2、EPHB2、ERBB3、RSV的F蛋白质、FAP、FcRH5、FGF-2、FGF8、FGFR1、FGFR2、FGFR3、FGFR4、FLT-3、叶酸受体α(FRα)、GAL3ST1、G-CSF、G-CSFR、GD2、GITR、GLUT1、GLUT4、GM-CSF、GM-CSFR、GP IIb/IIIa受体、Gp130、GPIIB/IIIA、GPNMB、GPRC5D、GRP78、HAVCAR1、HER2/neu、HER3、HER4、HGF、hGH、HVEM、玻尿酸酶、ICOS、IFNα、IFNβ、IFNγ、IgE、IgE受体(FceRI)、IGF、IGF1R、IL1B、IL1R、IL2、IL11、IL12、IL12p40、IL-12R、IL-12Rβ1、IL13、IL13R、IL15、IL17、IL18、IL21、IL23、IL23R、IL27/IL27R(wsx1)、IL29、IL-31R、IL31/IL31R、IL2R、IL4、IL4R、IL6、IL6R、胰岛素受体、锯齿状配位体(Jagged Ligand)、锯齿状1、锯齿状2、KISS1-R、LAG-3、LIF-R、Lewis X、LIGHT、LRP4、LRRC26、Ly6G6D、LyPD1、MCSP、间皮素、MICA、MICB、MRP4、MUC1、黏蛋白-16(MUC16、CA-125)、Na/K ATP酶、NGF、Nicastrin、Notch受体、Notch 1、Notch2、Notch 3、Notch 4、NOV、OSM-R、OX-40、PAR2、PDGF-AA、PDGF-BB、PDGFRα、PDGFRβ、PD-1、PD-L1、PD-L2、磷脂酰丝氨酸、P1GF、PSCA、PSMA、PSGR、RAAG12、RAGE、SLC44A4、神经鞘胺醇1磷酸酯、STEAP1、STEAP2、TAG-72、TAPA1、TEM-8、TGFβ、TIGIT、TIM-3、TLR2、TLR4、TLR6、TLR7、TLR8、TLR9、TMEM31、TNFα、TNFR、TNFRS12A、TRAIL-R1、TRAIL-R2、转铁蛋白、转铁蛋白受体、TRK-A、TRK-B、TROP-2uPAR、VAP1、VCAM-1、VEGF、VEGF-A、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D、VEGFR1、VEGFR2、VEGFR3、VISTA、WISP-1、WISP-2或WISP-3。

实施方案21如实施方案18至20中任一项的多肽，其中至少一个结合除CD8以外的抗原的抗原结合域为VHH域。

实施方案22如实施方案21的多肽，其中每个结合除CD8以外的抗原的抗原结合域为VHH域。

实施方案23如实施方案18至21中任一项的多肽，其中至少一个结合除CD8以外的抗原的抗原结合域包含重链可变区及轻链可变区。

实施方案24如实施方案23的多肽，其中每个结合除CD8以外的抗原的抗原结合域包含重链可变区及轻链可变区。

实施方案25一种包含第一多肽及第二多肽的复合物，其中该第一多肽为如实施方案13至24中任一项的多肽，其中该第一多肽包含第一Fc区，且其中该第二多肽包含第二Fc区，且其中该第一Fc区及该第二Fc区相同或不同。

实施方案26如实施方案25的复合物，其中该第二多肽包含至少一个结合CD8的VHH域、至少一个免疫细胞活化细胞因子和/或至少一个结合除CD8以外的抗原的抗原结合域。

实施方案27如实施方案26的复合物，其中若该结合除CD8以外的抗原的抗原结合域包含重链可变区及轻链可变区，则该重链可变区融合至包含该第二Fc区的重链恒定区。

实施方案28如实施方案25至27中任一项的复合物，其中该第一Fc区包含杵突变且该第二Fc区包含臼突变。

实施方案29如实施方案28的复合物，其中该第一Fc区包含T366W突变且该第二Fc区包含T366S、L368A及Y407V突变。

实施方案30如实施方案29的复合物，其中该第二Fc区包含H435R或H435K突变。

实施方案31如实施方案13至30中任一项的多肽或复合物，其中该多肽在生理条件下为二聚体，或其中该复合物在生理条件下形成。

实施方案32如实施方案1至31中任一项的多肽或复合物，其中该CD8为人类CD8。

实施方案33如实施方案32的多肽或复合物，其中该人类CD8包含SEQ ID NO:1的序列。

实施方案34一种免疫结合物，其包含如实施方案1至33中任一项的多肽或复合物及细胞毒性剂。

实施方案35如实施方案34的免疫结合物，其中该细胞毒性剂为选自卡奇霉素(calicheamicin)、奥瑞他汀(auristatin)、尾海兔素(dolastatin)、微管素(tubulicin)、类美登素(maytansinoid)、念珠藻素(cryptophycin)、倍癌霉素(duocarmycin)、埃斯培拉霉素(esperamicin)、吡咯并苯并二氮杂卓及烯二炔抗生素。

实施方案36一种药物组合物，其包含如实施方案1至33中任一项的多肽或复合物或如实施方案34或实施方案35的免疫结合物及药学上可接受的载剂。

实施方案37一种经分离核酸，其编码如实施方案1至33中任一项的多肽或复合物。

实施方案38一种载体，其包含如实施方案37的核酸。

实施方案39一种宿主细胞，其包含如实施方案37的核酸或如实施方案38的载体。

实施方案40一种宿主细胞，其表达如实施方案1至33中任一项的多肽或复合物。

实施方案41一种产生如实施方案1至33中任一项的多肽或复合物的方法，其包含在适合于表达该多肽或复合物的条件下培育如实施方案38或实施方案39的宿主细胞。

实施方案42如实施方案41的方法，其进一步包含分离该多肽或复合物。

实施方案43一种增加CD8⁺T细胞增殖的方法，其包含使T细胞与如实施方案1至33中任一项的多肽或复合物接触。

实施方案44如实施方案43的方法，其中所述CD8⁺T细胞系在体外。

实施方案45如实施方案43的方法，其中所述CD8⁺T细胞系在体内。

实施方案46一种治疗癌症的方法，其包含向患有癌症的个体施用药学上有效量的如实施方案1至33中任一项的多肽或复合物或如实施方案36的药物组合物。

实施方案47如实施方案46的方法，其中该癌症为选自基底细胞癌、胆道癌；膀胱癌；骨癌；脑部及中枢神经系统癌；乳腺癌；腹膜癌；子宫颈癌；绒毛膜癌；大肠直肠癌；结缔组织癌；消化系统癌；子宫内膜癌；食道癌；眼部癌；头颈癌；胃癌；胃肠癌；神经胶母细胞瘤；肝癌瘤；肝肿瘤；上皮内赘瘤；肾脏癌或肾癌；喉癌；肝癌；肺癌；小细胞肺癌；非小细胞肺癌；肺腺癌；鳞状细胞肺癌(squamous carcinoma of the lung)；黑素瘤；骨髓瘤；神经母细胞瘤；口腔癌；卵巢癌；胰腺癌；前列腺癌；视网膜母细胞瘤；横纹肌肉瘤；直肠癌；呼吸系统癌；唾液腺癌；肉瘤；皮肤癌；鳞状细胞癌；胃癌；睪丸癌；甲状腺癌；子宫或子宫内膜癌；泌尿系统癌；外阴癌；淋巴瘤；霍奇金氏淋巴瘤(Hodgkin's lymphoma)；非霍奇金氏淋巴瘤；B细胞淋巴瘤；低恶性度(low grade)/滤泡型非霍奇金氏淋巴瘤(NHL)；小淋巴球性(SL)NHL；中恶性度/滤泡型NHL；中恶性度弥漫性NHL；高恶性度免疫母细胞NHL；高恶性度淋巴母细胞NHL；高恶性度小型无裂隙细胞NHL；肿块性病变NHL(bulky disease NHL)；套细胞淋巴瘤；AIDS相关淋巴瘤；瓦尔登斯特伦氏巨球蛋白血症(Waldenstrom's macroglobulinemia)；慢性淋巴球性白血病(CLL)；急性淋巴母细胞白血病(ALL)；毛细胞白血病及慢性骨髓母细胞白血病。

实施方案48如实施方案46或47的方法，其进一步包含施用额外治疗剂。

实施方案49如实施方案48的方法，其中该额外治疗剂为抗癌剂。

实施方案50如实施方案49的方法，其中该抗癌剂为选自化学治疗剂、抗癌生物制剂、放射线疗法、CAR-T疗法及溶瘤病毒。

实施方案51如实施方案48的方法，其中该额外治疗剂为抗癌生物制剂。

实施方案52如实施方案51的方法，其中该抗癌生物制剂为抑制PD-1和/或PD-L1的药剂。

实施方案53如实施方案51的方法，其中该抗癌生物制剂为抑制VISTA、gpNMB、B7H3、B7H4、HHLA2、CTLA4或TIGIT的药剂。

实施方案54如实施方案49中任一项的方法，其中该抗癌剂为抗体。

实施方案55如实施方案51的方法，其中该抗癌生物制剂为细胞因子。

实施方案56如实施方案49的方法，其中该抗癌剂为CAR-T疗法。

实施方案57如实施方案49的方法，其中该抗癌剂为溶瘤病毒。

实施方案58如实施方案46至57中任一项的方法，其进一步包含肿瘤切除和/或放射线疗法。

附图简要说明

图1A-1B展示如通过流式细胞术所评定的格式化为VHH-hIgG1-Fc融合蛋白的靶向CD8a的sdAb的结合。图1A展示与经分离人类T细胞的结合。图1B展示作为CD8a阴性对照与HEK293FS细胞的结合。

图2A-2B展示如通过流式细胞术所评定的格式化为VHH-hIgG1-Fc融合蛋白的靶向CD8a的sdAb的结合。图2A展示与经分离人类T细胞的结合。图2B展示作为CD8a阴性对照与HEK293FS细胞的结合。

图3A-3B展示如通过流式细胞术所评定的格式化为VHH-hIgG1-Fc融合蛋白的靶向CD8a的sdAb的结合。图3A展示与人类CD8a-FL细胞的结合(表达全长CD8a)。图3B展示食蟹猕猴CD8a-FL细胞上的结合。

图4A-4B展示如通过流式细胞术所评定的格式化为VHH-hIgG1-Fc融合蛋白的靶向CD8a的sdAb的结合。图4A展示与经分离人类CD3+CD4-T细胞的结合。图4B展示与经分离食蟹猕猴CD3+CD4-周边血液单核细胞(PBMC)的结合。

图5A-5B展示如通过流式细胞术评定的融合蛋白CD8a-hzB7v15 xELL-Fc的结合。图5A展示与人类CD3+CD4-Leuko 29T细胞的结合。图5B展示与食蟹猕猴CD3+CD4-CD16-T细胞的结合。

图6A-6C展示野生型靶向IL-2及CD8a的VHH-hIgG1融合蛋白的IL-2活性，所述融合蛋白包含CD8a-hzB7v15及IL-2报告细胞上的减毒IL-2。图6A展示不表达CD8的报告细胞上的IL-2活性。图6B展示确实表达CD8的IL-2报告细胞上的IL-2活性。图6C展示野生型IL-2、包含CD8a-hzB7v31及减毒IL-2突变体的融合蛋白及包含表达CD8的IL-2报告细胞上的相同突变的非靶向减毒IL-2突变体的活性。

图7展示在单次给药包含CD8a-hzB7v15及减毒IL-2的融合蛋白之后食蟹猕猴的周边血液中的细胞扩增。

图8A-8B展示如通过流式细胞术评定的格式化为VHH同源二聚体Fc融合蛋白或为包含减毒IL-2突变体的VHH杵臼Fc融合蛋白的靶向CD8a的sdAb的结合。图8A展示与用全长人类CD8a(CD8a-FL)转染的HEK 293F细胞的结合。图8B展示与用全长人类CD8b(CD8b-FL)转染的HEK 293F细胞的结合。

图9A-9B展示如通过流式细胞术评定的格式化为VHH同源二聚体Fc融合蛋白或为包含减毒IL-2突变体的VHH杵臼Fc融合蛋白的靶向CD8a的sdAb的结合。图9A展示与自人类全血中富集的泛T细胞(pan T cell)内的CD8 T细胞的结合。图9B展示缺乏与自人类全血中富集的泛T细胞内的CD4 T细胞的结合。

图10A-10H展示如通过流式细胞术所评定的格式化为VHH-hIgG1-Fc融合蛋白的靶向CD8a的sdAb的结合。图10A-10B及图10E-10F展示与自人类全血中富集的泛T细胞(图10A及10B)或周边血液单核细胞(PBMC)(图10E及图10F)内的CD8 T细胞(图10A及图10D)或CD4T细胞(图10B及图10F)的结合。图10C-10D及图10F-10H展示与自食蟹猕猴全血分离的周边血液单核细胞(PBMC)内的CD8 T细胞(图10C及图10G)或CD4 T细胞(图10D及图10H)的结合。

图11A-11B展示人类供体的周边血液内的STAT5信号传导细胞群。展示自人类全血中富集的泛T细胞内的CD8 T细胞(图11A、图11C)或调节性T细胞(Treg，图11B)或CD4 T细胞(图11D)中的磷酸化STAT5(pSTAT5)的含量(图11A-11B)或表达pSTAT5的细胞百分比(图11C-11D)。细胞用包含CD8a-hzB7v31或CD8aB7v41、Fc区及突变减毒IL-2的融合蛋白；包含CD8a-hzB7v31及Fc区(无IL-2)的融合蛋白；包含非靶向VHH、Fc区及减毒IL-2的融合蛋白；或野生型IL-2处理。

图12A-12C展示来自人类肿瘤样品(两个头颈癌或肾癌病例及一个大肠癌病例，图12A及图12B)的经解离肿瘤细胞准备物或来自健康血液供体(图12C)的PBMC内的CD8 T细胞(图12A及图12C)或CD4 T细胞(图12B)的扩增，所述T细胞用包含CD8a-hzB7v31、Fc区及突变减毒IL-2的融合蛋白；包含CD8a-hzB7v31及Fc区(无IL-2)的融合蛋白；包含非靶向VHH、Fc区及减毒IL-2的融合蛋白；或野生型IL-2进行离体处理。

图13A-13B展示食蟹猕猴中单一剂量(1mg/kg)的包含CD8a-hzB7v15、Fc区及突变减毒IL-2的融合蛋白的活性。图13A展示某些PBMC亚群的扩增，作为给药后七天的细胞数相对于基线的变化倍数。图13B展示在给药前(基线)及给药后七天这些亚群内Ki67+细胞的百分比。

图14A-14B展示针对A431表皮样癌细胞经富集的预刺激CD8 T细胞的细胞毒活性(图14A)或PBMC的抗体依赖性细胞毒性(ADCC)(图14B)。如所指示的，用包含CD8a-hzB7v31、Fc区及减毒IL-2突变体的融合蛋白；包含非靶向VHH、Fc区及减毒IL-2突变体的融合蛋白；或野生型IL-2处理细胞。如所指示，以不同效应子与靶细胞比率(20:1、10:1或5:1)添加CD8T细胞或PBMC。将EGFR特异性治疗抗体西妥昔单抗添加至图14B中的细胞培养物中。

具体实施方式

本文所提供的实施方案涉及CD8结合多肽及其在治疗例如癌症的各种方法中的用途。

定义及各种实施方案

本文使用的章节标题仅出于组织目的而不应被视为限制所述目标物。

本文所引用的所有参考文献(包括专利申请案、专利公开案及Genbank编号)均以引用方式并入本文中，如同各个别参考文献具体地且单独地指出以全文引用的方式并入本文中一般。

本文所描述或提及的技术及程序总体上由本领域技术人员充分了解且通常使用常规方法而采用，诸如以下中所描述的广泛利用的方法：Sambrook等人,MolecularCloning:A Laboratory Manual第3版(2001)Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY(F.M.Ausubel等人编,(2003))；METHODS IN ENZYMOLOGY系列(Academic Press,Inc.):PCR 2:A PRACTICALAPPROACH(M.J.MacPherson,B.D.Hames及G.R.Taylor编(1995)),Harlow及Lane编(1988)ANTIBODIES,A LABORATORY MANUAL,and ANIMAL CELL CULTURE(R.I.Freshney编(1987))；Oligonucleotide Synthesis(M.J.Gait编,1984)；Methods in Molecular Biology,Humana Press；Cell Biology:A Laboratory Notebook(J.E.Cellis编,1998)AcademicPress；Animal Cell Culture(R.I.Freshney)编,1987)；Introduction to Cell andTissue Culture(J.P.Mather及P.E.Roberts,1998)Plenum Press；Cell and TissueCulture Laboratory Procedures(A.Doyle、J.B.Griffiths及D.G.Newell编,1993-8)J.Wiley and Sons；Handbook of Experimental Immunology(D.M.Weir及C.C.Blackwell编)；Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells(J.M.Miller及M.P.Calos编,1987)；PCR:The Polymerase Chain Reaction,(Mullis等人编,1994)；Current Protocols inImmunology(J.E.Coligan等人编,1991)；Short Protocols in Molecular Biology(Wileyand Sons,1999)；Immunobiology(C.A.Janeway及P.Travers,1997)；Antibodies(P.Finch,1997)；Antibodies:A Practical Approach(D.Catty等人,IRL Press,1988-1989)；Monoclonal Antibodies:A Practical Approach(P.Shepherd及C.Dean编,OxfordUniversity Press,2000)；Using Antibodies:A Laboratory Manual(E.Harlow及D.Lane(Cold Spring Harbor Laboratory Press,1999)；The Antibodies(M.Zanetti及J.D.Capra编,Harwood Academic Publishers,1995)；及Cancer:Principles andPractice of Oncology(V.T.DeVita等人编,J.B.Lippincott Company,1993)；及其更新版本。

除非另外定义，否则结合本发明使用的科学与技术术语将具有一般技术者通常理解的含义。此外，除非情景另有需要或另外明确地指出，否则单数术语应包括复数且复数术语应包括单数。关于各种来源或参考文献之间在定义方面的任何冲突，将以本文所提供的定义为准。

一般而言，免疫球蛋白重链中的残基编号为如Kabat等人,Sequences ofProteins of Immunological Interest,第5版Public Health Service,NationalInstitutes of Health,Bethesda,Md.(1991)中的EU索引的编号。“如Kabat中的EU索引”是指人类IgG1 EU抗体的残基编号。

应了解，本文所述的本发明实施方案包括“由实施方案组成”和/或“基本上由实施方案组成”。除非另外指示，否则如本文所用，单数形式“一(a/an)”及“该(the)”包括复数个参考物。术语“或”在本文中的使用不意图暗示替代方案为互相排斥的。

在本申请案中，除非明确地叙述或如本领域技术人员所了解，否则“或”的使用意谓“和/或”。在多重附属项的情况下，“或”的使用重新提及一个以上前述独立项或附属项。

词组“参考样品”、“参考细胞”或“参考组织”表示可用作与具有至少一种未知特征的样品进行比较的具有至少一种已知特征的样品。在一些实施方案中，参考样品可用作阳性或阴性指示物。参考样品可用于确定例如在健康组织中存在的蛋白质和/或mRNA的含量，与在具有未知特征的样品中存在的蛋白质和/或mRNA的含量形成对比。在一些实施方案中，参考样品来自同一个体，但来自所测试个体的不同部位。在一些实施方案中，参考样品来自癌周围或邻近癌的组织区域。在一些实施方案中，参考样品并非来自所测试个体，而是来自已知患有或不患有所讨论病症(例如特定癌症或CD8相关病症)的个体的样品。在一些实施方案中，参考样品来自同一个体，但来自在个体罹患癌症前的时间点。在一些实施方案中，参考样品来自相同或不同个体的良性癌样品。在使用阴性参考样品进行比较时，阴性参考样品中所讨论的分子的表达量或量将指示出本领域技术人员将了解的含量，假定本发明中无分子和/或具有低含量的分子。在使用阳性参考样品进行比较时，阳性参考样品中所讨论的分子的表达量或量将指示出本领域技术人员将了解的含量，假定本发明中存在一定含量的分子。

如本文在受益于治疗剂施用或对治疗剂施用有反应的上下文中所用的术语“益处”、“临床益处”、“反应”及“治疗反应”可通过评定各种评估指标来测量，例如在一定程度上抑制疾病进展，包括减缓及完全遏止；减少疾病发作和/或症状的数量；减小病变大小；抑制(即，减少、减缓或完全停止)疾病细胞浸润至邻近周边器官和/或组织；抑制(即，减少、减缓或完全停止)疾病扩散；在一定程度上减轻与该病症相关的一种或多种症状；增加在治疗后呈现无病(例如，无进展存活期)的时长；增加总体存活率；反应率更高；和/或减小在治疗后给定时间点的死亡率。“无反应”或“无法反应”的个体或癌症为无法满足关于“反应”的上述限制条件的个体或癌症。

术语“核酸分子”、“核酸”及“聚核苷酸”可互换使用，且是指核苷酸聚合物。此类核苷酸聚合物可含有天然和/或非天然核苷酸且包括但不限于DNA、RNA及PNA。“核酸序列”是指包含于核酸分子或多核苷酸中的核苷酸线性序列。

术语“多肽”与“蛋白”可互换使用以指氨基酸残基的聚合物，且不限于最小长度。此类氨基酸残基的聚合物可含有天然或非天然氨基酸残基且包括但不限于氨基酸残基构成的肽、寡肽、二聚体、三聚体及多聚体。全长蛋白质与其片段皆涵盖于该定义中。术语亦包括多肽的表达后修饰，例如糖基化、唾液酸化、乙酰化、磷酸化及类似修饰。此外，出于本发明的目的，“多肽”是指蛋白质，其包括对天然序列的修饰，诸如缺失、添加及取代(实际上通常为保守的)，只要该蛋白质保持所需活性即可。这些修饰可是有意的，如经由定点突变诱发进行；或可为偶然的，诸如经由产生蛋白质的宿主的突变或由于PCR扩增所引起的错误引起。在一些实施方案中，多肽为第一多肽及第二多肽的“复合物”。

术语“CD8a”及“CD8”在本文中可互换使用，指代由细胞中处理CD8前驱体产生的任何天然成熟CD8。除非另外规定，否则该术语包括来自任何脊椎动物来源的CD8，包括哺乳动物，诸如灵长类动物(例如，人类及食蟹猕猴或恒河猴)及啮齿动物(例如，小鼠及大鼠)。该术语亦包括CD8的天然存在的变体，诸如剪接变体或对偶基因变体。非限制性示例性成熟人类CD8氨基酸序列展示于例如NCBI寄存编号NP_001369627.1中。参见SEQ ID NO.1。

术语“特异性结合”至抗原或抗原决定基为本领域充分了解的术语，且用于测定此特异性结合的方法亦为本领域所熟知。若分子与特定细胞或物质的反应或缔合比其与替代性细胞或物质更频繁、更快速，持续时间更长和/或亲和力更大，则称其呈现“特异性结合”或“优选结合”。若单域抗体(sdAb)或含VHH多肽与目标的结合比其与其他物质的结合亲和力、亲合力更大、更容易和/或持续时间更长，则其“特异性结合”或“优先结合”于目标。举例而言，特异性或优先结合至CD8抗原决定基的sdAb或含VHH多肽为与此抗原决定基的结合比其与其他CD8抗原决定基或非CD8抗原决定基的结合亲和力、亲合力更大、更容易和/或持续时间更长的sdAb或含VHH多肽。通过阅读此定义，亦应理解，例如特异性或优先结合至第一目标的sdAb或含VHH多肽可能或可能不特异性或优先结合至第二目标。因此，“特异性结合”或“优先结合”未必需要(尽管其可包括)独占式结合。一般而言，但不一定，提及结合意谓优先结合。“特异性”是指结合蛋白选择性结合抗原的能力。

术语“抑制(inhibition)”或“抑制(inhibit)”是指任何表型特征减少或停止，或该特征的发生率、程度或可能性降低或停止。“降低”或“抑制”为使活性、功能和/或量相较于参考物减小、降低或停滞。在一些实施方案中，“降低”或“抑制”意谓整体减少10％或更多的能力。在一些实施方案中，“降低”或“抑制”意谓整体减少50％或更多的能力。在一些实施方案中，“减小”或“抑制”意谓能够引起总体减少75％、85％、90％、95％或更大。在一些实施方案中，一段时间内上文所提及的量相对于同一段时间内的对照而言受到抑制或减少。

如本文所用，术语“直接抑制”及类似术语是指其中增加的抗体浓度导致抑制增加的抑制特征。在一些实施方案中，在特定浓度之后，达至最大抑制且抑制概况平稳。最大抑制无需为100％抑制，但可为至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％或90％。

如本文所用，术语“抗原决定基”是指抗原结合分子(例如sdAb或含VHH多肽)在目标分子(例如抗原，诸如蛋白质、核酸、碳水化合物或脂质)上结合的位点。抗原决定基常常包括一组表面具有化学活性的分子，诸如氨基酸、多肽或糖侧链，且具有特定三维结构特征以及荷质比特征。抗原决定基可由目标分子的相邻和/或并接非相邻残基(例如，氨基酸、核苷酸、糖、脂质部分)形成。由相邻残基(例如，氨基酸、核苷酸、糖、脂质部分)形成的抗原决定基通常在暴露于变性溶剂时得以保留，而通过三级折叠形成的抗原决定基通常在经变性溶剂处理时丢失。抗原决定基可包括但不限于至少3个、至少5个或8至10个残基(例如，氨基酸或核苷酸)。在一些实施方案中，抗原决定基的长度小于20个残基(例如，氨基酸或核苷酸)、小于15个残基或小于12个残基。若两个抗体对一抗原展现竞争性结合，则其可结合该抗原内的同一个抗原决定基。在一些实施方案中，可根据相对于抗原结合分子上的CDR残基的某一最小距离鉴别抗原决定基。在一些实施方案中，抗原决定基可通过以上距离鉴别，且进一步受限于抗原结合分子的残基与抗原残基之间之一键(例如，氢键)所涉及的那些残基。抗原决定基亦可通过各种扫描来鉴别，例如丙氨酸或精氨酸扫描可指示可与抗原结合分子相互作用的一个或多个残基。除非明确表示，否则作为抗原决定基的一组残基不排除其他残基作为特定抗原结合分子的抗原决定基的一部分。实际上，此类集合的存在表示最小的抗原决定基系列(或物种集合)。因此，在一些实施方案中，鉴别为抗原决定基的残基集合表示该抗原的最小相关抗原决定基，而非抗原上的抗原决定基的排他性残基清单。

“非线性抗原决定基”或“构象抗原决定基”包含在对抗原决定基具有特异性的抗原结合分子所结合的抗原蛋白质内的非相邻多肽、氨基酸和/或糖。在一些实施方案中，至少一个残基将与抗原决定基的其他所指出的残基不相邻；然而，一个或多个残基亦可与其他残基相邻。

“线性抗原决定基”包含在对抗原决定基具有特异性的抗原结合分子所结合的抗原蛋白质内的相邻多肽、氨基酸和/或糖。应注意，在一些实施方案中，并非线性抗原决定基内的每一个残基均需要与抗原结合分子直接结合(或与键相关)。在一些实施方案中，线性抗原决定基可来自用有效地由线性抗原决定基的序列组成的肽免疫，或来自蛋白质中与蛋白质的其余部分相对分离的结构部分(使得抗原结合分子可至少首先与彼序列部分相互作用)。

术语“抗体”以最广泛意义使用且涵盖包含抗体样抗原结合域的各种多肽，包括但不限于常规抗体(通常包含至少一条重链及至少一条轻链)、单域抗体(sdAb，包含至少一个VHH域及Fc区)、含VHH多肽(包含至少一个VHH域的多肽)及前述中的任一者的片段，只要其展现所需抗原结合活性即可。在一些实施方案中，抗体包含二聚域。这些二聚域包括但不限于重链恒定域(包含CH1、铰链、CH2及CH3，其中CH1通常与轻链恒定域CL配对，而铰链介导二聚化)及Fc区(包含铰链、CH2及CH3，其中铰链介导二聚化)。

术语抗体亦包括但不限于嵌合抗体、人源化抗体及诸如骆驼(包括骆马)、鲨鱼、小鼠、人类、食蟹猕猴等各种物种的抗体。

如本文所用，术语“抗原结合域”是指抗体足以结合抗原的一部分。在一些实施方案中，常规抗体的抗原结合域包含三个重链CDR及三个轻链CDR。因此，在一些实施方案中，抗原结合域包含：重链可变区，其包含CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3及维持与抗原结合所需的FR1和/或FR4的任何部分；及轻链可变区，其包含CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3及维持与抗原结合所需的FR1和/或FR4的任何部分。在一些实施方案中，sdAb或含VHH多肽的抗原结合域包含VHH域的三个CDR。因此，在一些实施方案中，sdAb或含VHH多肽的抗原结合域包含VHH域，该VHH域包含CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3及维持与抗原的结合所需的FR1和/或FR4的任何部分。

如本文中所用的术语“VHH”或“VHH域”或“VHH抗原结合域”是指单域抗体的抗原结合部分，该单域抗体诸如骆驼抗体或鲨鱼抗体。在一些实施方案中，VHH包含三个CDR及四个构架区，称为FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3及FR4。在一些实施方案中，VHH可在N端或C端截短，使得其仅包含部分FR1和/或FR4，或缺乏那些构架区中的一者或两者，只要VHH实质上维持抗原结合及特异性即可。

术语“单域抗体”及“sdAb”在本文中可互换使用，指代包含至少一个无轻链单体域(诸如VHH域)及Fc区的抗体。在一些实施方案中，sdAb为两种多肽的二聚物，其中各多肽包含至少一个VHH域及Fc区。如本文所用，术语“单域抗体”及“sdAb”涵盖包含多个VHH域的多肽，诸如具有结构VHH₁-VHH₂-Fc或VHH₁-VHH₂-VHH₃-Fc的多肽，其中VHH₁、VHH₂及VHH₃可相同或不同。

术语“含VHH多肽”是指包含至少一个VHH域的多肽。在一些实施方案中，VHH多肽包含两个、三个或四个或更多个VHH域，其中各VHH域可相同或不同。在一些实施方案中，含VHH多肽包含Fc区。在一些此类实施方案中，含VHH多肽可称为sdAb。另外，在一些此类实施方案中，VHH多肽可形成二聚体。含VHH多肽的非限制性结构(其亦为sdAb)包括VHH₁-Fc、VHH₁-VHH₂-Fc及VHH₁-VHH₂-VHH₃-Fc，其中VHH₁、VHH₂及VHH₃可相同或不同。在此类结构的一些实施方案中，一个VHH可通过接头连接至另一VHH，或一个VHH可通过接头连接至Fc。在一些此类实施方案中，接头包含1-20个氨基酸，优选为1-20个主要由甘氨酸且任选由丝氨酸构成的氨基酸。在一些实施方案中，接头包含：Gly-Gly-Gly-Gly(SEQ ID NO:112)、Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Ser(SEQ ID NO:113)和/或Gly-Gly-Ser-Ser-Gly-Ser(SEQ ID NO:114)。在一些实施方案中，当含VHH多肽包含Fc时，其形成二聚体。因此，若结构VHH₁-VHH₂-Fc形成二聚体，则认为其为四价的(亦即，二聚体具有四个VHH域)。类似地，若结构VHH₁-VHH₂-VHH₃-Fc形成二聚体，则认为其为六价的(亦即，二聚体具有六个VHH域)。

术语“单克隆抗体”是指实质上均质的抗体群的抗体(包括sdAb或含VHH多肽)，即，包含此群体的个别抗体除可能存在少量天然产生的突变以外均相同。单克隆抗体为高度特异性的，其针对单一抗原位点。此外，与典型地包括针对不同决定子(抗原决定基)的不同抗体的多克隆抗体制剂相反，各单克隆抗体针对抗原上的单个决定子。因此，单克隆抗体的样品可结合于抗原上的同一抗原决定基。修饰语“单克隆”指示抗体的特征为自实质上均质的抗体群获得，且不应理解为需要通过任何特定方法来产生该抗体。举例而言，单克隆抗体可通过Kohler及Milstein,1975,Nature 256:495首次描述的杂交瘤方法制造，或可通过诸如美国专利第4,816,567号中所述的重组DNA方法制造。举例而言，单克隆抗体亦可自使用McCafferty等人，1990,Nature 348:552-554中所描述的技术生成的噬菌体库中分离。

术语“CDR”表示互补决定区，如由本领域技术人员通过至少一种鉴别方式所定义。在一些实施方案中，CDR可根据Chothia编号方案、Kabat编号方案、Kabat与Chothia的组合、AbM定义和/或接触定义中的任一者来定义。VHH包含三个CDR，称为CDR1、CDR2及CDR3。在一些实施方案中，CDR为根据AbM定义来定义。

如本文所用，术语“重链恒定区”是指包含至少三个重链恒定域C_H1、铰链、C_H2及C_H3的区域。当然，除非另外指示，否则这些域中的非功能改变性缺失及修改为涵盖于术语“重链恒定区”的范畴内。非限制性示例性重链恒定区包括γ、δ及α。非限制性示例性重链恒定区亦包括ε及μ。各重链恒定区对应于一种抗体同型。举例而言，包含γ恒定区的抗体为IgG抗体，包含δ恒定区的抗体为IgD抗体，且包含α恒定区的抗体为IgA抗体。此外，包含μ恒定区的抗体为IgM抗体，且包含ε恒定区的抗体为IgE抗体。某些同型可进一步再分为亚类。举例而言，IgG抗体包括但不限于IgG1(包含γ₁恒定区)、IgG2(包含γ₂恒定区)、IgG3(包含γ₃恒定区)及IgG4(包含γ₄恒定区)抗体；IgA抗体包括但不限于IgA1(包含α₁恒定区)及IgA2(包含α₂恒定区)抗体；且IgM抗体包括但不限于IgM1及IgM2。

如本文所用，“Fc区”是指包含CH2及CH3的重链恒定区的部分。在一些实施方案中，Fc区包含铰链、CH2及CH3。在各种实施方案中，当Fc区包含铰链时，铰链介导两个含Fc的多肽之间的二聚化。Fc区可为本文所论述的任何抗体重链恒定区同型。在一些实施方案中，Fc区为IgG1、IgG2、IgG3或IgG4。在一些实施方案中，当Fc区包含铰链时，该铰链具有与Fc区相同的同型。在一些实施方案中，IgG4铰链包含S228P稳定突变。

如本文所论述，如本文所用的“受体人类构架”为包含源自人类免疫球蛋白构架或人类共同构架的重链可变域(V_H)构架的氨基酸序列的构架。源自人类免疫球蛋白构架或人类共同构架的受体人类构架可包含与其相同的氨基酸序列，或其可含有氨基酸序列改变。在一些实施方案中，跨单一抗原结合域(诸如VHH)中的所有人类构架，氨基酸改变的数目少于10，或少于9，或少于8，或少于7，或少于6，或少于5，或少于4，或少于3。

“亲和力”是指分子(例如抗体，诸如sdAb，或含VHH多肽)的单一结合位点与其结合搭配物(例如抗原)之间的非共价相互作用的总和的强度。分子X对其搭配物Y的亲和力或表观亲和力通常可分别由解离常数(K_D)或K_D-表观来表示。亲和力可通过本领域已知的常用方法(诸如ELISA K_D、KinExA、流式细胞术和/或表面等离子共振装置)，包括本文所描述的那些方法来测量。此类方法包括但不限于涉及或流式细胞术的方法。

如本文所用的术语“K_D”是指抗原结合分子/抗原相互作用的平衡解离常数。当本文使用术语“K_D”时，其包括K_D及K_D-表观。

在一些实施方案中，抗原结合分子的K_D使用表达抗原的细胞株且将在各抗体浓度下测量的平均荧光拟合至非线性单点结合方程式(Prism Software graphpad)通过流式细胞术来测量。在一些此类实施方案中，K_D为K_D-表观。

术语“生物活性”是指分子的任一种或多种生物特性(无论为在体内发现为天然存在的，或通过重组方式提供或实现的)。生物特性包括但不限于结合配体、诱导或增加细胞增殖(诸如T细胞增殖)及诱导或增加细胞因子的表达。

“激动剂”或“活化”抗体为增加和/或活化目标抗原的生物活性的抗体。在一些实施方案中，激动剂抗体结合于抗原且使其生物学活性增加至少约20％、40％、60％、80％、85％或更多。

“拮抗剂”，一种“阻断”或“中和”抗体，为抑制、降低和/或不活化目标抗原的生物活性的抗体。在一些实施方案中，中和抗体结合于抗原且使其生物学活性降低至少约20％、40％、60％、80％、85％、90％、95％、99％或更多。

“亲和力成熟”sdAb或含VHH多肽是指相较于在一个或多个CDR中不具有一个或多个改变的亲本sdAb或含VHH多肽，具有此类改变的sdAb或含VHH多肽，此类改变改良sdAb或含VHH多肽对抗原的亲和力。

如本文所用，“人源化VHH”是指其中一个或多个构架区已实质上经人类构架区置换的VHH。在一些情况下，人类免疫球蛋白的某些构架区(FR)残基经对应非人类残基置换。此外，人源化VHH可包含既不存在于原始VHH亦不存在于人类构架序列中的残基，但包括所述残基在内以进一步改进及优化sdAb含VHH多肽效能。在一些实施方案中，人源化sdAb或含VHH多肽包含人类Fc区。如将了解，人源化序列可通过其一级序列鉴别且不一定表示创建抗体的过程。

“效应子阳性Fc区”具有天然序列Fc区的“效应功能”。示例性“效应功能”包括Fc受体结合；Clq结合及补体依赖性细胞毒性(CDC)；Fc受体结合；抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)；吞噬作用；细胞表面受体(例如B细胞受体)的下调；以及B细胞活化等。所述效应功能一般需要Fc区与结合域(例如抗体可变域)组合且可使用各种分析评定。

“天然序列Fc区”包含与自然界中存在的Fc区的氨基酸序列一致的氨基酸序列。天然序列人类Fc区包括天然序列人类IgG1 Fc区(非A及A异型)；天然序列人类IgG2 Fc区；天然序列人类IgG3 Fc区；及天然序列人类IgG4 Fc区，以及其天然存在的变体。

“变异Fc区”包含与天然序列Fc区的氨基酸序列相差至少一个氨基酸修饰的氨基酸序列。在一些实施方案中，“变异Fc区”包含与天然序列Fc区的氨基酸序列相差至少一个氨基酸修饰，但保留天然序列Fc区的至少一种效应功能的氨基酸序列。在一些实施方案中，变异Fc区相较于天然序列Fc区或相较于亲本多肽的Fc区具有至少一个氨基酸取代，例如在天然序列Fc区中或在亲本多肽的Fc区中约一个至约十个氨基酸取代，且优选约一个至约五个氨基酸取代。在一些实施方案中，本文中的变异型Fc区与天然序列Fc区和/或亲本多肽的Fc区具有至少约80％序列一致性、与其具有至少约90％序列一致性、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％，或与其至少约99％序列一致性。

“Fc受体”或“FcR”描述与抗体Fc区结合的受体。在一些实施方案中，FcγR为天然人类FcR。在一些实施方案中，FcR为结合IgG抗体的FcR(γ受体)且包括FcγRI、FcγRII及FcγRIII亚类的受体，包括那些受体的对偶基因变体及交替剪接形式。FcγRII受体包括FcγRIIA(“活化受体”)及FcγRIIB(“抑制受体”)，两者具有主要在其细胞质域方面不同的类似氨基酸序列。活化受体FcγRIIA在其细胞质域中含有基于免疫受体酪氨酸的活化模体(ITAM)。抑制受体FcγRIIB在其细胞质域中含有基于免疫受体酪氨酸的抑制模体(ITIM)。(参见例如Daeron,Annu.Rev.Immunol.15:203-234(1997))。FcR评述于例如Ravetch及Kinet,Annu.Rev.Immunol 9:457-92(1991)；Capel等人,Immunomethods 4:25-34(1994)；及de Haas等人,J.Lab.Clin.Med.126:330-41(1995)中。其他FcR，包括待将来鉴别出的那些FcR，为本文中的术语“FcR”所包涵。举例而言，术语“Fc受体”或“FcR”亦包括新生儿受体FcRn，其负责将母体IgG转移至胎儿(Guyer等人,J.Immunol.117:587(1976)及Kim等人,J.Immunol.24:249(1994))且调节免疫球蛋白的稳态。与FcRn的结合的测量方法为已知的(参见例如Ghetie及Ward,Immunol.Today 18(12):592-598(1997)；Ghetie等人,NatureBiotechnology,15(7):637-640(1997)；Hinton等人,J.Biol.Chem.279(8):6213-6216(2004)；WO 2004/92219(Hinton等人))。

如本文所用，术语“实质上类似”或“实质上相同”表示两个或两个以上数值之间的相似度足够高，以使得在通过该值测量生物特征的情况下，本领域技术人员将认为该两个或两个以上值之间的差异具有极小或不具有生物和/或统计显著性。在一些实施方案中，两个或更多个实质上相似的值相差大致不超过以下中的任一者：5％、10％、15％、20％、25％或50％。

多肽“变体”意谓在比对序列且必要时引入间隙以达到最大序列一致性百分比之后，且不考虑任何保守取代为序列一致性的一部分，与天然序列多肽具有至少约80％氨基酸序列一致性的生物活性多肽。所述变体包括例如在多肽的N末端或C末端添加或缺失一个或多个氨基酸残基的多肽。在一些实施方案中，变体将具有至少约80％氨基酸序列一致性。在一些实施方案中，变体将具有至少约90％氨基酸序列一致性。在一些实施方案中，变体与天然序列多肽将具有至少约95％氨基酸序列一致性。

如本文所用，关于肽、多肽或抗体序列的“氨基酸序列一致性百分比(％)”及“同源性”定义为在比对序列且必要时引入间隙以达到最大序列一致性百分比之后，且不考虑任何保守取代为序列一致性的部分，候选序列中与特定肽或多肽序列中的氨基酸残基一致的氨基酸残基的百分比。用于确定氨基酸序列一致性百分比目的的比对可由此项技术范围内的各种方式来达成，例如使用公开可用的计算机软件，诸如BLAST、BLAST-2、ALIGN或MEGALIGNTM(DNASTAR)软件。本领域技术人员可确定适用于测量比对的参数，包括在所比较的序列全长内达成最大比对所需的任何算法。

氨基酸取代可包括但不限于将多肽中的一个氨基酸置换为另一个氨基酸。示例性取代展示于表1中。可向所关注的抗体中引入氨基酸取代，且针对所需活性来筛选产物，该所需活性例如抗原结合保留/改良、免疫原性减小或ADCC或CDC改良。

表1

原始残基	示例性取代
		Ala(A)	Val；Leu；Ile
Arg(R)	Lys；Gln；Asn
		Asn(N)	Gln；His；Asp,Lys；Arg
Asp(D)	Glu；Asn
		Cys(C)	Ser；Ala
Gln(Q)	Asn；Glu
		Glu(E)	Asp；Gln
Gly(G)	Ala
		His(H)	Asn；Gln；Lys；Arg
Ile(I)	Leu；Val；Met；Ala；Phe；正亮氨酸
		Leu(L)	正亮氨酸；Ile；Val；Met；Ala；Phe
Lys(K)	Arg；Gln；Asn
		Met(M)	Leu；Phe；Ile
Phe(F)	Trp；Leu；Val；Ile；Ala；Tyr
		Pro(P)	Ala
Ser(S)	Thr
		Thr(T)	Val；Ser
Trp(W)	Tyr；Phe
		Tyr(Y)	Trp；Phe；Thr；Ser
Val(V)	Ile；Leu；Met；Phe；Ala；正亮氨酸

氨基酸可根据共有侧链特性来进行分组：

(1)疏水性：正亮氨酸、Met、Ala、Val、Leu、Ile；

(2)中性亲水性：Cys、Ser、Thr、Asn、Gln；

(3)酸性：Asp、Glu；

(4)碱性：His、Lys、Arg；

(5)影响链取向的残基：Gly、Pro；

(6)芳族：Trp、Tyr、Phe。

非保守取代将引起这些类别中之一者的成员换成另一个类别。

术语“载体”用于描述可经工程改造为含有可在宿主细胞中繁殖的一个或多个经克隆的聚核苷酸的聚核苷酸。载体可包括以下组件中的一个或多个：复制起点、一个或多个调控所关注多肽的表达的调控序列(诸如启动子和/或强化子)和/或一个或多个可选择标记基因(诸如抗生素抗性基因及可用于比色分析中的基因，例如β-半乳糖)。术语“表达载体”是指用于表达宿主细胞中的所关注多肽的载体。

“宿主细胞”是指可为或已为载体或经分离聚核苷酸的接受者的细胞。宿主细胞可为原核细胞或真核细胞。示例性真核细胞包括哺乳动物细胞，诸如灵长类动物或非灵长类动物细胞；真菌细胞，诸如酵母；植物细胞；以及昆虫细胞。非限制性示例性哺乳动物细胞包括但不限于NSO细胞、PER.细胞(Crucell)以及293及CHO细胞，及其衍生物，诸如293-6E、CHO-DG44、CHO-K1、CHO-S及CHO-DS细胞。宿主细胞包括单个宿主细胞之后代，且后代可能归因于自然、偶然或故意突变而不一定与原始母细胞完全一致(在形态或基因组DNA补体方面)。宿主细胞包括在体内经本文提供的多核苷酸转染的细胞。

如本文所用，术语“经分离”是指已与自然界中通常一起发现或产生的至少一些组分分离的分子。举例而言，当多肽与产生该多肽的细胞的至少一些组分分离时，称该多肽“经分离”。若多肽在表达后由细胞分泌，则以物理方式将含有该多肽的上清液与产生其的细胞分离即视为“分离”多肽。类似地，当聚核苷酸不为通常出现在自然界中的较大聚核苷酸的一部分(诸如在DNA聚核苷酸的情况下为基因组DNA或粒线体DNA)，或与产生其的细胞的至少一些组分分离(例如在RNA聚核苷酸的情况下)时，该聚核苷酸称为“经分离”。因此，宿主细胞内部的载体中所含的DNA聚核苷酸可称为“经分离”。

术语“个体(individual)”与“受试者(subject)”在本文中可互换使用，是指例如哺乳动物的动物。在一些实施方案中，提供治疗哺乳动物的方法，所述哺乳动物包括但不限于人类、啮齿动物、猿猴、猫科动物、犬科动物、马科动物、牛科动物、猪科动物、绵羊、山羊、哺乳类实验室动物、哺乳类农畜、哺乳类运动动物及哺乳类宠物。在一些实施例中，“个体”或“受试者”是指需要治疗疾病或病症的个体或个体。在一些实施方案中，接受治疗的个体可为患者，表明以下事实：该个体已鉴别为患有与该治疗有关联的病症，或有极大的风险感染该病症。

如本文所用，“疾病”或“病症”是指需要和/或期望治疗的病况。

除非另有指示，否则术语“肿瘤细胞”、“癌细胞”、“癌症”、“肿瘤”和/或“赘瘤”在本文中可互换使用，且是指出现生长失控和/或细胞存活异常增加和/或抑制细胞凋亡的细胞，其干扰身体器官及系统的正常功能。此定义中包括良性及恶性癌症、息肉、增生以及潜伏性肿瘤或微小转移病灶。

术语“癌症”及“肿瘤”涵盖实体癌症及血液/淋巴癌，且亦涵盖恶性、癌前及良性生长，诸如发育异常。示例性癌症包括但不限于：基底细胞癌、胆道癌；膀胱癌；骨癌；脑部及中枢神经系统癌；乳腺癌；腹膜癌；子宫颈癌；绒毛膜癌；大肠及直肠癌；结缔组织癌；消化系统癌；子宫内膜癌；食道癌；眼部癌；头颈癌；胃癌(包括胃肠癌)；神经胶母细胞瘤；肝癌瘤；肝癌；上皮内肿瘤；肾脏癌或肾癌；喉癌；白血病；肝癌；肺癌(例如小细胞肺癌、非小细胞肺癌、肺腺癌及肺的鳞状癌瘤)；黑素瘤；骨髓瘤；神经母细胞瘤；口腔癌(唇、舌、口及咽)；卵巢癌；胰腺癌；前列腺癌；视网膜母细胞瘤；横纹肌肉瘤；直肠癌；呼吸系统癌；唾液腺癌瘤；肉瘤；皮肤癌；鳞状细胞癌；胃癌；睪丸癌；甲状腺癌；子宫或子宫内膜癌；泌尿系统癌；外阴癌；淋巴瘤，包括霍奇金氏及非霍奇金氏淋巴瘤以及B细胞淋巴瘤(包括低恶性度/滤泡型非霍奇金氏淋巴瘤(NHL)；小淋巴球性(SL)NHL；中恶性度/滤泡NHL；中恶性度弥漫性NHL；高恶性度免疫母细胞NHL；高恶性度淋巴母细胞NHL；高恶性度小非裂解细胞NHL；肿块性病变NHL；套细胞淋巴瘤；AIDS相关淋巴瘤；及瓦尔登斯特伦氏巨球蛋白血症；慢性淋巴球性白血病(CLL)；急性淋巴母细胞白血病(ALL)；毛细胞白血病；慢性骨髓母细胞白血病；以及其他癌瘤及肉瘤；及移植后淋巴增生病症(PTLD)，以及异常血管增殖伴母斑(细胞)病、水肿(诸如伴有脑瘤的水肿)及梅格斯氏综合征(Meigs'syndrome)。

如本文所用，术语“非肿瘤细胞”是指正常细胞或组织。示例性非肿瘤细胞包括但不限于：T细胞、B细胞、自然杀手(NK)细胞、自然杀伤T(NKT)细胞、树突状细胞、单核球、巨噬细胞、上皮细胞、纤维母细胞、肝细胞、间质性肾细胞、纤维母细胞样滑膜细胞、骨母细胞以及位于乳房、骨骼肌、胰脏、胃、卵巢、小肠、胎盘、子宫、睪丸、肾脏、肺、心脏、大脑、肝、前列腺、大肠、淋巴器官、骨及骨来源间叶干细胞中的细胞。如本文所用，术语“位于周边的细胞或组织”是指并非位于肿瘤细胞附近和/或肿瘤微环境内部的非肿瘤细胞。

如本文所用，术语“肿瘤微环境内的细胞或组织”是指围绕和/或喂饲肿瘤细胞的细胞、分子、细胞外基质和/或血管。肿瘤微环境内的示例性细胞或组织包括但不限于肿瘤血管结构；肿瘤浸润淋巴细胞；纤维母细胞网状细胞；内皮先驱细胞(EPC)；癌症相关纤维母细胞；外被细胞；其他基质细胞；细胞外基质的组分(ECM)；树突状细胞；抗原呈递细胞；T细胞；调节性T细胞(Treg细胞)；巨噬细胞；嗜中性白血球；骨髓衍生的抑制细胞(MDSC)及位于靠近肿瘤处的其他免疫细胞。如下文中所描述，本领域熟知用于鉴别肿瘤细胞和/或位于肿瘤微环境内的细胞/组织的方法。

在一些实施方案中，“增加”或“减少”分别是指统计学上显著的增加或减少。如本领域技术人员将显而易见，“调节”亦可包括相较于相同条件但不存在测试剂的情形，对目标或抗原的配体、结合搭配物、搭配物中之一或多者结合为均多聚体或杂多聚体形式或底物的亲和力、亲合力、特异性和/或选择性实现改变(可为增加或减少)；对目标或抗原对该目标或抗原所存在的介质或环境中的一种或多种条件(诸如pH、离子强度、辅因子的存在等)的敏感度实现改变(可为增加或减少)；和/或细胞增殖或细胞因子产生。视所涉及的目标而定，此可通过任何合适方式和/或使用本身已知或本文所描述的任何合适分析来确定。

如本文所用，“免疫反应”意谓涵盖足以抑制或阻止疾病发作或改善疾病症状(例如癌症或癌转移)的细胞和/或体液免疫反应。“免疫反应”可涵盖先天性及后天性免疫系统两者的方面。

如本文所用，“治疗”为用于获得有利的或所期望的临床结果的途径。如本文所用，“治疗”涵盖对于包括人类在内的哺乳动物的疾病进行的任何施用或施用治疗方案。出于本发明的目的，有益或所需临床结果包括但不限于以下中的任何一或多者：缓解一种或多种症状、减弱疾病程度、预防或推迟疾病扩散(例如转移，例如转移至肺或淋巴结)、预防或推迟疾病复发、推迟或减缓疾病进展、改善疾病状态、抑制疾病或疾病进展、抑制或减缓疾病或其进展、遏制其发展，及缓解(无论部分或完全)。“治疗”亦涵盖增殖性疾病的病理后果减轻。本文所提供的方法涵盖所述治疗方面中的任一种或多种。根据以上所述，术语治疗不需要病症的所有方面百分之一百移除。

“缓解”意谓相较于未施用治疗剂，一种或多种症状得以减轻或改善。“改善”亦包括缩短或减少症状的持续时间。

术语“抗癌剂”在本文中以其最广含义用于是指用于治疗一种或多种癌症的药剂。示例性种类的这些药剂包括但不限于化学治疗剂、抗癌生物制剂(诸如细胞因子、受体细胞外域-Fc融合体及抗体)、放射线疗法、CAR-T疗法、治疗性寡核苷酸(诸如反义寡核苷酸及siRNA)及溶瘤病毒。

术语“生物样品”意谓一定量的来自活物或先前为活物的物质。所述物质包括但不限于血液(例如全血)、血浆、血清、尿液、羊水、滑液、内皮细胞、白细胞、单核细胞、其他细胞、器官、组织、骨髓、淋巴结及脾脏。

术语“对照”或“参考”是指已知不含分析物的组合物(“阴性对照”)或已知含有分析物的组合物(“阳性对照”)。阳性对照可包含已知浓度的分析物。

如本文所用，“延迟疾病发展”意谓推迟、阻碍、减缓、扼止、稳定、遏制和/或推迟疾病(诸如癌症)的发展。此延迟可具有不同时间长度，视所治疗的疾病和/或个体的病史而定。如本领域技术人员显而易见，充分或显著延迟可实际上涵盖预防，使得该个体不发展该疾病。举例而言，可延迟晚期癌症，诸如癌转移发展。

如本文所用，“预防”包括在个体疾病出现或复发方面提供预防作用，该个体可能易患该疾病但尚未诊断患有该疾病。除非另有规定，否则术语“降低”、“抑制”或“预防”不表示或不要求一直完全预防，而仅在所测量的时间段内。

物质/分子(激动剂或拮抗剂)的“治疗有效量”可根据以下因素改变：诸如个体的疾病病况、年龄、性别及体重、及物质/分子(激动剂或拮抗剂)在个体体内引发所要反应的能力。治疗有效量亦为治疗的有利作用超过该物质/分子(激动剂或拮抗剂)的任何有毒或有害作用的量。治疗有效量可经一或多次施用来传递。“治疗有效量”是指在必需剂量下且在必需时间内有效实现所需治疗和/或预防结果的量。

术语“药物调配物”及“药物组合物”可互换地使用，且是指所呈形式准许活性成分的生物活性有效，且不含对调配物将施用的个体具有不可接受毒性的额外组分的制剂。此类调配物可为无菌的。

“药学上可接受的载剂”是指本领域常规的无毒固体、半固体或液体填补剂、稀释剂、囊封材料、调配助剂或载剂，其与治疗剂一起使用，一起构成向个体施用的“药物组合物”。药学上可接受的载剂在所用剂量及浓度下对接受者无毒且与调配物的其他成分兼容。药学上可接受的载剂适于所用的调配物。

与一种或多种其他治疗剂“组合”施用包括同时(并行)及以任何次序依序施用。

术语“并行地”在本文中用以指代施用两种或更多种治疗剂，其中施用的至少部分在时间上重叠，或其中一个治疗剂的施用落入针对另一治疗剂的施用之一较短时间段内，或其中两种药剂的治疗效果重叠至少一个时间段。

术语“依序”在本文中用以指代两种或更多种治疗剂的施用在时间上不重叠，或其中所述药剂的治疗作用不重叠。

如本文中所用，“结合”是指除一种处理形式以外亦施用另一种处理形式。因此，“结合”是指在向个体施用一种处理形式之前、在施用一种处理形式期间或在施用一种处理形式之后施用另一种处理形式。

术语“药品说明书”用以指通常包括于治疗性产品的商业包装中的说明，其含有关于与使用此类治疗性产品有关的适应症、用法、剂量、施用、组合疗法、禁忌和/或警告的信息。

“制品”为包含至少一种试剂，例如用于治疗疾病或病症(例如，癌症)的药物的任何制品(例如，包装或容器)，或用于特异性检测本文所述的生物标记的探针。在一些实施方案中，制品或试剂盒为以用于执行本文所描述的方法的单元形式推销、分销或出售。

术语“标记”及“可检测标记”意谓例如附着至抗体或抗原以使得特异性结合对的成员之间的反应(例如，结合)可检测的部分。特异性结合对的经标记成员称为“可检测地标记”。因此，术语“经标记的结合蛋白”是指并入标记以便鉴别结合蛋白的蛋白质。在一些实施方案中，标记为可产生可通过目视或仪器方式检测的信号的可检测标记，例如并入经放射性标记的氨基酸或连接至可通过经标记的抗生物素蛋白(例如含有可通过光学或比色方法检测的荧光标记或酶促活性的链霉抗生物素蛋白)检测的生物素基部分的多肽。用于多肽的标记的实施例包括但不限于以下：放射性同位素或放射性同位素(例如³H、¹⁴C、³⁵S、⁹⁰Y、⁹⁹Tc、¹¹¹In、¹²⁵I、¹³¹I、¹⁷⁷Lu、¹⁶⁶Ho或¹⁵³Sm)；色素原、荧光标记(例如FITC、若丹明(rhodamine)、镧为磷光体(lanthanide phosphor))、酶标记(例如辣根过氧化酶、荧光素酶、碱性磷酸酶)；化学发光标记；生物素基；由二级报告子识别的预定多肽抗原决定基(例如亮氨酸拉链对序列、二级抗体的结合位点、金属结合域、抗原决定基标签)；及磁化剂，诸如钆螯合物。常用于免疫检定的标记的代表性实施例包括产生光的部分，例如吖片化合物，及产生荧光的部分，例如荧光素。就此而言，该部分自身可能并非可检测标记的，但可在与又一部分反应之后变为可检测的。

示例性CD8结合多肽

本文提供拮抗性CD8结合多肽。在各种实施方案中，CD8结合多肽包含至少一个结合CD8的VHH域。在一些实施方案中，本文所提供的CD8结合多肽包含一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个或八个结合CD8的VHH域。在一些实施方案中，本文所提供的CD8结合多肽包含结合CD8的一个、两个、三个或四个VHH域。此类CD8结合多肽可包含一个或多个额外抗原结合域(例如VHH域)，其结合一种或多种除CD8以外的目标蛋白和/或可包含一个或多个额外多肽序列，诸如细胞因子序列。

在一些实施方案中，CD8结合多肽包含至少一个结合CD8的VHH域及Fc区。在一些实施方案中，本文所提供的CD8结合多肽包含一个、两个、三个或四个结合CD8的VHH域及Fc区。在一些实施方案中，Fc区介导CD8结合多肽在生理条件下的二聚化，使得形成使CD8结合位点数目加倍的二聚体。举例而言，包含三个结合CD8的VHH域及Fc区的CD8结合多肽作为单体为三价，但在生理条件下，Fc区可介导二聚化，使得CD8结合多肽在此类条件下以六价二聚体形式存在。

在一些实施方案中，CD8结合多肽包含至少两个VHH域，其中第一VHH域结合CD8的第一抗原决定基且第二VHH域结合CD8的第二抗原决定基。当CD8结合多肽包含结合CD8的第一抗原决定基的VHH域及结合CD8的第二抗原决定基的VHH域时，CD8结合多肽可称为“双抗原决定基”或“双特异性”。

CD8结合多肽

在各种实施方案中，结合CD8的VHH域包含选自SEQ ID NO:3、73及74的CDR1序列、选自SEQ ID NO:4、12、14、22、27、29、31、75、76、77、78、79及80的CDR2序列及选自SEQ IDNO:5、16及18的CDR3。在各种实施方案中，结合CD8的VHH域包含选自以下的CDR1、CDR2及CDR3序列：SEQ ID NO:3、4及5；SEQ ID NO:3、12及5；3、14及5；3、4及16；3、4及18；3、22及5；3、14及18；3、27及5；3、29及5；3、31及5；73、14及18；74、14及18；3、75及18；3、76及18；3、77及18；3、78及18；3、79及18；以及3、80及18。在各种实施方案中，将VHH域人源化。

在一些实施方案中，结合CD8的VHH域包含与选自SEQ ID NO:2、6、7、8、9、10、11、13、15、17、19、20、21、23、24、25、26、28、30、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99及100的氨基酸序列至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％一致的氨基酸序列。在一些实施方案中，结合CD8的VHH域包含选自SEQ ID NO:2、6、7、8、9、10、11、13、15、17、19、20、21、23、24、25、26、28、30、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99及100的氨基酸序列。在一些实施方案中，结合CD8的VHH域包含选自SEQ ID NO:2、6、7、8、9、10、11、13、15、17、19、20、21、23、24、25、26、28及30的氨基酸序列，其中残基XX不存在。在一些实施方案中，结合CD8的VHH域包含选自SEQ ID NO:2、6、7、8、9、10、11、13、15、17、19、20、21、23、24、25、26、28、30的氨基酸序列，其中残基XX为Gly-Gly。在一些实施方案中，结合CD8的VHH域包含选自SEQ ID NO:2、6、7、8、9、10、11、13、15、17、19、20、21、23、24、25、26、28、30、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98及99的氨基酸序列，其中VHH域包含突变K117D、K117E或K117R。

在一些实施方案中，结合CD8的VHH域包含SEQ ID NO:3的CDR1序列、SEQ ID NO:14的CDR2序列及SEQ ID NO:18的CDR3。在一些实施方案中，结合CD8的VHH域包含与氨基酸序列SEQ ID NO:25至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％一致的氨基酸序列。在一些实施方案中，结合CD8的VHH域包含SEQ ID NO:25的氨基酸序列。在一些实施方案中，结合CD8的VHH域包含SEQ ID NO:3的CDR1序列、SEQ ID NO:78的CDR2序列及SEQ ID NO:18的CDR3。在一些实施方案中，结合CD8的VHH域包含与氨基酸序列SEQ IDNO:92或100至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％一致的氨基酸序列。在一些实施方案中，结合CD8的VHH域包含SEQ ID NO:92的氨基酸序列。在一些实施方案中，结合CD8的VHH域包含SEQ ID NO:100的氨基酸序列。

在各种实施方案中，CD8结合多肽包含一个、两个、三个或四个结合CD8的VHH域。

在一些实施方案中，结合CD8的VHH域可经人源化。人源化抗体(诸如sdAbs或含VHH多肽)适用作治疗性分子，这是因为人源化抗体减少或消除对非人类抗体的人类免疫反应，人类免疫反应可引起对抗体治疗剂的免疫反应且减小治疗剂的有效性。一般而言，人源化抗体包含一个或多个可变域，其中CDR(或其部分)来源于非人类抗体，且FR(或其部分)来源于人类抗体序列。人源化抗体任选亦将包含人类恒定区的至少一部分。在一些实施方案中，人源化抗体中的一些FR残基经来自非人类抗体(例如用于获得CDR残基的抗体)的对应残基取代，从而例如恢复或改良抗体特异性或亲和力。

人源化抗体及其制造方法综述于例如Almagro及Fransson,(2008)Front.Biosci.13:1619-1633中，且进一步描述于以下各者中：例如Riechmann等人,(1988)Nature332:323-329；Queen等人,(1989)Proc.Natl Acad.Sci.USA 86:10029-10033；美国专利第5,821,337号、第7,527,791号、第6,982,321号及第7,087,409号；Kashmiri等人,(2005)Methods36:25-34；Padlan,(1991)Mol.Immunol.28:489-498(描述“表面再塑(resurfacing”)；Dall'Acqua等人,(2005)Methods 36:43-60(描述“FR改组”)；及Osbourn等人,(2005)Methods36:61-68及Klimka等人,(2000)Br.J.Cancer,83:252-260(描述FR改组的“导向选择”方法)。

可用于人源化的人类构架区包括但不限于：使用“最佳拟合(best-fit)”法选择的构架区(参见例如Sims等人(1993)J.Immunol.151:2296)；来源于具有重链可变区的特定子组的人类抗体的共同序列的构架区(参见例如Carter等人(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA,89:4285；及Presta等人(1993)J.Immunol,151:2623)；人类成熟(体细胞突变)构架区或人类生殖系构架区(参见例如Almagro及Fransson,(2008)Front.Biosci.13:1619-1633)；及来源于筛选FR库的构架区(参见例如Baca等人,(1997)J.Biol.Chem.272:10678-10684及Rosok等人,(1996)J.Biol.Chem.271:22611-22618)。通常，VHH的FR区经人类FR区置换以制备人源化VHH。在一些实施方案中，人类FR的某些FR残基经置换以便改良人源化VHH的一个或多个特性。具有这些经置换残基的VHH域在本文中仍称为“人源化”。

在各种实施方案中，CD8结合多肽中所包括的Fc区为人类Fc区，或来源于人类Fc区。

在一些实施方案中，包括于CD8结合多肽中的Fc区来源于人类Fc区，且在低级铰链中包含对应于IgG1 E233、L234及L235的三个氨基酸缺失，本文中称为“Fc xELL”。Fc xELL多肽不接合FcγR，且因此称为“效应子静默”或“效应子空缺”，然而在一些实施方案中，xELL Fc区结合FcRn且因此具有延长的半衰期及与FcRn介导的再循环相关的胞吞转送。

在一些实施方案中，包括于CD8结合多肽中的Fc区来源于人类Fc区且包含突变M252Y及M428V，本文中称作“Fc-YV”。在一些实施方案中，这些突变在核内体的酸性pH(接近6.5)下增强与FcRn的结合，而在中性pH(约7.2)下失去可检测的结合，使得FcRn介导的再循环增强且半衰期延长。

在一些实施方案中，包括于CD8结合多肽中的Fc区来源于人类Fc区且包含针对杂二聚化设计的突变，本文中称为“杵”及“臼”。在一些实施方案中，“杵”Fc区包含突变T366W。在一些实施方案中，“臼”Fc区包含突变T366S、L368A及Y407V。在一些实施方案中，用于杂二聚化的Fc区包含额外突变，诸如位于形成不对称二硫键的异源二聚体Fc对的第一成员上的突变S354C及位于异源二聚体Fc对的第二成员上的对应突变Y349C。在一些实施方案，异源二聚体Fc对的一个成员包含修饰H435R或H435K以阻止蛋白质A结合，同时维持FcRn结合。在一些实施方案中，异源二聚体Fc对的一个成员包含修饰H435R或H435K，而异源二聚体Fc对的第二成员在H435处不经修饰。在各种实施方案中，固持Fc区包含修饰H435R或H435K(在一些情况下，当修饰为H435R时，称为“臼-R”)，而杵Fc区不包含修饰。在一些情况下，相对于可能存在的同源二聚体臼Fc区，臼-R突变改良异源二聚体的纯化。

在一些实施方案中，包括于CD8结合多肽中的Fc区来源于人类Fc区且缺乏C端赖氨酸残基(ΔK447)。

可用于CD8结合多肽的非限制性示例性Fc区包括包含SEQ ID NO:32-70及101-111的氨基酸序列的Fc区。在一些实施方案中，CD8结合多肽包括包含选自SEQ ID NO:33、36-52、68-70及101-111的氨基酸序列的Fc区。

CD8结合多肽的示例性活性

在各种实施方案中，本文所提供的CD8结合多肽体外和/或体内刺激CD8+细胞。在一些实施方案中，使用本文实施例中所提供的方法可测定体外和/或体内CD8+细胞的刺激或活性。

在一些实施方案中，本文所提供的CD8结合多肽包含免疫细胞活化细胞因子或结合除CD8以外的抗原且刺激CD8+T细胞的抗原的抗原结合域。在一些实施方案中，免疫细胞活化细胞因子或结合除CD8以外的抗原的抗原结合域的CD8+刺激活性增加，和/或在融合至CD8结合VHH时，比单独使用时更特异性地靶向细胞毒性T细胞。在一些实施方案中，免疫细胞活化细胞因子或结合除CD8外的抗原的抗原结合域的毒性通过使其特异性靶向CD8+T细胞而降低。

在一些实施方案中，包含免疫细胞活化细胞因子或结合除本文所提供的CD8以外的抗原的抗原结合域的CD8结合多肽体外和/或体内增加T细胞增殖。

在一些实施方案中，本文所提供的CD8结合多肽包含本文所提供的CD8结合VHH及免疫细胞活化细胞因子。在一些此类实施方案中，免疫细胞活化细胞因子为IL-2、IL-15、IL-7、IL-6、IL-12、IFNα、IFNβ或IFNγ。在一些此类实施方案中，免疫细胞活化细胞因子为野生型免疫细胞活化细胞因子。在一些实施方案中，免疫细胞活化细胞因子包含使免疫细胞活化细胞因子的活性相对于野生型细胞因子的活性减弱的突变。在一些实施方案中，包含免疫细胞活化细胞因子的CD8结合多肽体内刺激CD8+T细胞活化及增殖。在一些实施方案中，包含免疫细胞活化细胞因子的CD8结合多肽用于治疗癌症的方法中。

活化CD8⁺T细胞的增殖的增加可通过本领域的任何方法，诸如本文实施例中提供的方法测定。一种非限制性示例性分析如下。CD8⁺T细胞可自一个或多个健康人类供体分离。T细胞用CellTrace紫(CTV)染色且通过抗CD3抗体活化，与本文提供的多肽接触，且随后通过FACS分析。CTV染色损失指示增殖。在一些实施方案中，诸如通过测量自不同健康人类供体分离的CD8⁺T细胞的增殖，以一组实验或合并T细胞的平均值形式测定CD8⁺T细胞增殖的增加。在一些实施方案中，以使用来自至少五个或至少十个不同健康供体的T细胞或来自至少五个或至少十个不同健康供体的T细胞池进行的实验的平均值形式测定CD8⁺T细胞增殖的增加。

在一些实施方案中，本文所提供的CD8结合多肽包含CD8结合VHH及结合除CD8以外的抗原的抗原结合域。在一些此类实施方案中，抗原为Lag3、CTLA4、TGFBR1、TGFBR2、Fas、TNFR2、PD1、PDL1或TIM3。在一些实施方案中，抗原为1-92-LFA-3、5T4、α-4整合素、α-V整合素、α4β1整合素、α4β7整合素、AGR2、抗Lewis-Y、Apelin J受体、APRIL、B7-H3、B7-H4、B7-H6、BAFF、BCMA、BTLA、C5补体、C-242、CA9、CA19-9、(Lewis a)、碳酸酐酶9、CD2、CD3、CD6、CD9、CD11a、CD19、CD20、CD22、CD24、CD25、CD27、CD28、CD30、CD33、CD38、CD39、CD40、CD40L、CD41、CD44、CD44v6、CD47、CD51、CD52、CD56、CD64、CD70、CD71、CD73、CD74、CD80、CD81、CD86、CD95、CD117、CD123、CD125、CD132、(IL-2RG)、CD133、CD137、CD138、CD166、CD172A、CD248、CDH6、CEACAM5(CEA)、CEACAM6(NCA-90)、CLAUDIN-3、CLAUDIN-4、cMet、胶原蛋白、Cripto、CSFR、CSFR-1、CTLA4、CTGF、CXCL10、CXCL13、CXCR1、CXCR2、CXCR4、CYR61、DL44、DLK1、DLL3、DLL4、DPP-4、DSG1、EDA、EDB、EGFR、EGFRviii、内皮素B受体(ETBR)、ENPP3、EpCAM、EPHA2、EPHB2、ERBB3、RSV的F蛋白质、FAP、FcRH5、FGF-2、FGF8、FGFR1、FGFR2、FGFR3、FGFR4、FLT-3、叶酸受体α(FRα)、GAL3ST1、G-CSF、G-CSFR、GD2、GITR、GLUT1、GLUT4、GM-CSF、GM-CSFR、GP IIb/IIIa受体、Gp130、GPIIB/IIIA、GPNMB、GPRC5D、GRP78、HAVCAR1、HER2/neu、HER3、HER4、HGF、hGH、HVEM、玻尿酸酶、ICOS、IFNα、IFNβ、IFNγ、IgE、IgE受体(FceRI)、IGF、IGF1R、IL1B、IL1R、IL2、IL11、IL12、IL12p40、IL-12R、IL-12Rβ1、IL13、IL13R、IL15、IL17、IL18、IL21、IL23、IL23R、IL27/IL27R(wsx1)、IL29、IL-31R、IL31/IL31R、IL2R、IL4、IL4R、IL6、IL6R、胰岛素受体、锯齿状配位体、锯齿状1、锯齿状2、KISS1-R、LAG-3、LIF-R、Lewis X、LIGHT、LRP4、LRRC26、Ly6G6D、LyPD1、MCSP、间皮素、MICA、MICB、MRP4、MUC1、黏蛋白-16(MUC16、CA-125)、Na/K ATP酶、NGF、Nicastrin、Notch受体、Notch 1、Notch2、Notch 3、Notch 4、NOV、OSM-R、OX-40、PAR2、PDGF-AA、PDGF-BB、PDGFRα、PDGFRβ、PD-1、PD-L1、PD-L2、磷脂酰丝氨酸、P1GF、PSCA、PSMA、PSGR、RAAG12、RAGE、SLC44A4、神经鞘胺醇1磷酸酯、STEAP1、STEAP2、TAG-72、TAPA1、TEM-8、TGFβ、TIGIT、TIM-3、TLR2、TLR4、TLR6、TLR7、TLR8、TLR9、TMEM31、TNFα、TNFR、TNFRS12A、TRAIL-R1、TRAIL-R2、转铁蛋白、转铁蛋白受体、TRK-A、TRK-B、TROP-2uPAR、VAP1、VCAM-1、VEGF、VEGF-A、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D、VEGFR1、VEGFR2、VEGFR3、VISTA、WISP-1、WISP-2或WISP-3。在一些实施方案中，CD8结合多肽包含CD8结合VHH及结合肿瘤细胞抗原的抗原结合域。

多肽表达及产生

提供包含编码CD8结合多肽的聚核苷酸的核酸分子。在一些实施方案中，核酸分子亦可编码引导CD8结合多肽的分泌之前导序列，该前导序列通常裂解使得其不存在于所分泌的多肽中。前导序列可为天然重链(或VHH)前导序列，或可为另一种异源前导序列。

核酸分子可使用本领域常规的重组DNA技术来构筑。在一些实施方案中，核酸分子为适于在所选宿主细胞中表达的表达载体。

提供包含编码本文所述的CD8结合多肽的核酸的载体。此类载体包括但不限于DNA载体、噬菌体载体、病毒载体、逆转录病毒载体等。在一些实施方案中，选择经优化以在所需细胞型(诸如CHO或CHO衍生的细胞)或NSO细胞中表达多肽的载体。示例性此类载体描述于例如Running Deer等人,Biotechnol.Prog.20:880-889(2004)中。

在一些实施方案中，CD8结合多肽可在原核细胞中表达，诸如细菌细胞；或在真核细胞中表达，诸如真菌细胞(诸如酵母)、植物细胞、昆虫细胞及哺乳动物细胞。此类表达可例如根据本领域已知的程序进行。可用于表达多肽的示例性真核细胞包括但不限于COS细胞，包括COS 7细胞；293细胞，包括293-6E细胞；CHO细胞，包括CHO-S、DG44.Lec13CHO细胞，及FUT8 CHO细胞；PER.细胞(Crucell)；及NSO细胞。在一些实施方案中，CD8结合多肽可在酵母中表达。参见例如美国公开案第US2006/0270045 A1号。在一些实施方案中，特定的真核宿主细胞系基于其对多肽产生所需翻译后修饰的能力来选择。举例而言，在一些实施方案中，CHO细胞产生多肽，所述多肽的唾液酸化程度高于293细胞中所产生的相同多肽。

将一种或多种核酸(诸如载体)引入至所需宿主细胞中可通过任何方法完成，包括但不限于磷酸钙转染、DEAE-聚葡萄糖介导的转染、阳离子脂质介导的转染、电穿孔、转导、感染等。非限制性示例性方法描述于例如Sambrook等人,Molecular Cloning,ALaboratory Manual,第3版Cold Spring Harbor Laboratory Press(2001)中。核酸可根据任何适合方法短暂或稳定转染于所需宿主细胞中。

亦提供包含本文所描述的任何核酸或载体的宿主细胞。在一些实施方案中，提供表达本文所描述的CD8结合多肽的宿主细胞。宿主细胞中表达的CD8结合多肽可通过任何适合方法纯化。此类方法包括但不限于使用亲和基质或疏水性相互作用色谱。适合的亲和配体包括ROR1 ECD及结合Fc区的药剂。举例而言，蛋白质A、蛋白质G、蛋白质A/G或抗体亲和柱可用于结合Fc区及纯化包含Fc区的CD8结合多肽。疏水相互作用色谱，例如丁基或苯基柱，亦可适用于纯化一些多肽，诸如抗体。离子交换色谱(例如，阴离子交换色谱和/或阳离子交换色谱)亦可适用于纯化一些多肽，诸如抗体。混合模式色谱(例如反相/阴离子交换、反相/阳离子交换、亲水相互作用/阴离子交换、亲水相互作用/阳离子交换等)亦适合于纯化一些多肽，诸如抗体。本领域已知多种用于纯化多肽的方法。

在一些实施方案中，CD8结合多肽在无细胞系统中产生。非限制性示例性无细胞系统描述于例如Sitaraman等人,Methods Mol.Biol.498:229-44(2009)；Spirin,TrendsBiotechnol.22:538-45(2004)；Endo等人,Biotechnol.Adv.21:695-713(2003)中。

在一些实施方案中，提供通过上文所描述的方法制备的CD8结合多肽。在一些实施方案中，CD8结合多肽为在宿主细胞中制备。在一些实施方案中，CD8结合多肽为在无细胞系统中产生。在一些实施方案中，纯化CD8结合多肽。在一些实施方案中，提供包含CD8结合多肽的细胞培养基。

在一些实施方案中，提供包含通过上文所述方法制备的抗体的组合物。在一些实施方案中，组合物包含在宿主细胞中制备的CD8结合多肽。在一些实施方案中，组合物包含在无细胞系统中制备的CD8结合多肽。在一些实施方案中，组合物包含经纯化的CD8结合多肽。

使用CD8结合多肽治疗疾病的示例性方法

在一些实施方案中，提供治疗个体的疾病的包含施用CD8结合多肽的方法。此类疾病包括将得益于T细胞，诸如CD8⁺T细胞的增殖及活化增加的任何疾病。在一些实施方案中，提供用于治疗个体的癌症的方法。在一些实施方案中，治疗癌症的方法包含通过施用包含CD8结合VHH及免疫细胞活化细胞因子或结合除CD8以外的肿瘤细胞抗原的抗原结合域的CD8结合多肽来增加CD8+T细胞的增殖和/或活化。

所述方法包含向个体施用有效量的本文所提供的CD8结合多肽。此类治疗方法可为针对人类或动物。在一些实施方案中，提供治疗人类的方法。可用本发明提供的CD8结合多肽治疗的非限制性示例性癌症包括基底细胞癌、胆道癌；膀胱癌；骨癌；脑部及中枢神经系统癌；乳腺癌；腹膜癌；子宫颈癌；绒毛膜癌；大肠及直肠癌；结缔组织癌；消化系统癌；子宫内膜癌；食道癌；眼部癌；头颈癌；胃癌(包括胃肠癌)；神经胶母细胞瘤；肝癌瘤；肝癌；上皮内肿瘤；肾脏癌或肾癌；喉癌；白血病；肝癌；肺癌(例如小细胞肺癌、非小细胞肺癌、肺腺癌及肺的鳞状癌瘤)；黑素瘤；骨髓瘤；神经母细胞瘤；口腔癌(唇、舌、口及咽)；卵巢癌；胰腺癌；前列腺癌；视网膜母细胞瘤；横纹肌肉瘤；直肠癌；呼吸系统癌；唾液腺癌瘤；肉瘤；皮肤癌；鳞状细胞癌；胃癌；睪丸癌；甲状腺癌；子宫或子宫内膜癌；泌尿系统癌；及外阴癌；淋巴瘤；霍奇金氏淋巴瘤；非霍奇金氏淋巴瘤；B细胞淋巴瘤；低恶性度/滤泡型非霍奇金氏淋巴瘤(NHL)、小淋巴球性(SL)NHL；中恶性度/滤泡型NHL；中恶性度弥漫性NHL；高恶性度免疫母细胞NHL；高恶性度淋巴母细胞NHL；高恶性度小型无裂隙细胞NHL；肿块性病变NHL(bulkydisease NHL)；套细胞淋巴瘤；AIDS相关淋巴瘤；瓦尔登斯特伦氏巨球蛋白血症；慢性淋巴球性白血病(CLL)；急性淋巴母细胞白血病(ALL)；毛细胞白血病及慢性骨髓母细胞白血病。

可视需要向个体施用CD8结合多肽。可由本领域技术人员，诸如主治医师，基于考虑所治疗病况、所治疗个体的年龄、所治疗病况的严重度、所治疗个体的一般健康状况及其类似因素来决定施用频率。在一些实施方案中，向个体施用有效剂量的CD8结合多肽一或多次。在一些实施方案中，每天、每半周、每周、每两周、每月一次等向个体施用有效剂量的CD8结合多肽。向个体施用有效剂量的CD8结合多肽至少一次。在一些实施方案中，可多次，包括在至少一个月、至少六个月或至少一年的时程内多次施用有效剂量的CD8结合多肽。

在一些实施方案中，以有效治疗(包括预防)癌症和/或增加T细胞增殖的量施用药物组合物。治疗有效量通常取决于所治疗个体的体重、其生理或健康状况、所治疗病状的延伸性或所治疗个体的年龄。一般而言，可以每次给药约0.05mg/kg体重至约100mg/kg体重范围内的量施用抗体。

在一些实施方案中，CD8结合多肽可在体内通过各种途径施用，所述途径包括但不限于静脉内、动脉内、非经肠、腹膜内或皮下。适当调配物及施用途径可根据预期应用选择。

在一些实施方案中，使用CD8结合多肽的治疗性治疗通过增加T细胞增殖和/或活化和/或通过使CD8+T细胞与癌细胞接触达成。在一些实施方案中，增加T细胞增殖和/或活化抑制癌症生长。

药物组合物

在一些实施方案中，包含CD8结合多肽的组合物与广泛多种药学上可接受的载剂一起提供于调配物中(参见例如Gennaro,Remington:The Science and Practice ofPharmacy with Facts and Comparisons:Drugfacts Plus,第20版.(2003)；Ansel等人,Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems,第7版,LippencottWilliams and Wilkins(2004)；Kibbe等人,Handbook of Pharmaceutical Excipients,第3版,Pharmaceutical Press(2000))。各种药学上可接受的载剂，包括媒剂、佐剂及稀释剂为可用的。此外，各种药学上可接受的辅助物质，诸如pH调节剂及缓冲剂、张力调节剂、稳定剂、湿润剂及类似物，亦为可用的。非限制性示例性载剂包括盐水、缓冲盐水、右旋糖、水、丙三醇、乙醇及其组合。

在一些实施方案中，药物组合物包含浓度为至少10mg/mL的CD8结合多肽。

组合疗法

CD8结合多肽可单独或与其他治疗模式，诸如其他抗癌剂组合施用。其可在其他治疗模式之前、实质上同时或之后(亦即，并行或依序)提供。在一些实施方案中，本文所描述的治疗方法可进一步包括施用：放射线疗法、化学疗法、疫苗接种、靶向肿瘤疗法、CAR-T疗法、溶瘤病毒疗法、癌症免疫疗法、细胞因子疗法、手术切除、染色体修饰、消融、冷冻疗法、针对肿瘤目标的反义药剂、针对肿瘤目标的siRNA药剂、针对肿瘤目标的微小RNA药剂或抗癌/肿瘤药剂，或生物制剂，诸如抗体、细胞因子或受体胞外域-Fc融合体。

在一些实施方案中，本文提供的CD8结合多肽与第二治疗剂(例如PD1或PD-L1疗法)同时给予。PD-1/PD-L1疗法的实施例包括纳武单抗(nivolumab)(BMS)；皮立珠单抗(pidilizumab)(CureTech，CT-011)、派立珠单抗(pembrolizumab)(Merck)；德瓦鲁单抗(durvalumab)(Medimmune/AstraZeneca)；阿特珠单抗(atezolizumab)(Genentech/Roche)；艾维路单抗(avelumab)(Pfizer)；AMP-224(Amplimmune)；BMS-936559；AMP-514(Amplimmune)；MDX-1105(Merck)；TSR-042(Tesaro/AnaptysBio，ANB-011)；STI-A1010(Sorrento Therapeutics)；STI-A1110(Sorrento Therapeutics)；以及针对程序化死亡-1(PD-1)或程序化死亡配位体1(PD-L1)的其他药剂。

在一些实施方案中，本文提供的CD8结合多肽与免疫刺激剂(例如肿瘤坏死因子受体超家族(TNFRSF)的成员的激动剂或B7家族的成员)同时给予。免疫刺激TNFRSF成员的非限制性实施例包括OX40、GITR、41BB、CD27及HVEM。B7家族成员的非限制性实施例包括CD28及ICOS。因此，在一些实施方案中，本文提供的CD8结合多肽与OX40、GITR、41BB、CD27、HVEM、CD28和/或ICOS的激动剂(诸如激动剂抗体)同时给予。

在一些实施方案中，本文提供的CD8结合多肽与CAR-T(嵌合抗原受体T细胞)疗法、溶瘤病毒疗法、细胞因子疗法和/或靶向其他检查点分子的药剂(诸如VISTA、gpNMB、B7H3、B7H4、HHLA2、CTLA4、TIGIT等)同时给予。

非限制性示例性诊断及治疗方法

在一些实施方案中，本文所描述的方法适用于评估个体和/或来自个体(例如，癌症患者)的试样。在一些实施方案中，评估为诊断、预后和/或对治疗的反应中之一或多者。

在一些实施方案中，本文所描述的方法包含评估蛋白质的存在、不存在或含量。在一些实施方案中，本文所描述的方法包含评估核酸的存在、不存在或表达量。本文所描述的组合物可用于所述测量。举例而言，在一些实施方案中，本文所描述的方法包含使肿瘤或由肿瘤培养的细胞试样与如本文所描述的治疗剂接触。

在一些实施方案中，评估可为直接治疗(包括用本文所述的抗体治疗)。在一些实施方案中，评估可导引辅助疗法在切除之后的使用或保留。辅助疗法(亦称作辅助护理)为除初级、主要或初步治疗以外给与的治疗。借助于非限制性实施例，辅助疗法可为通常在手术后当所有可检测疾病已移除，但由于隐性疾病而仍存在统计学复发风险时所给与的额外治疗。在一些实施方案中，抗体用作癌症治疗中的辅助疗法。在一些实施方案中，抗体用作癌症治疗中唯一的辅助疗法。在一些实施方案中，本文所描述的抗体被拒绝作为癌症治疗中的辅助疗法。举例而言，若患者不大可能对本文所描述的抗体起反应或将具有最低反应，则为生活质量起见及为避免来自无效化学疗法的不必要毒性，可不施用治疗。在这些情况下，可使用姑息性照护。

在一些实施方案中，施用所述分子作为切除前的新辅助疗法。在一些实施方案中，新辅助疗法是指在任何手术之前使肿瘤缩小和/或降等的疗法。在一些实施方案中，新辅助疗法意谓在手术之前向癌症患者施用的化学疗法。在一些实施方案中，新辅助疗法意谓在手术之前向癌症患者施用抗体。通常考虑新辅助化学疗法的癌症类型包括例如乳腺癌、大肠直肠癌、卵巢癌、子宫颈癌、膀胱癌及肺癌。在一些实施方案中，抗体用作癌症治疗中的新辅助疗法。在一些实施方案中，在切除之前使用。

在一些实施方案中，本文所述方法中涵盖的肿瘤微环境为以下中之一或多者：肿瘤血管结构；肿瘤浸润淋巴细胞；纤维母细胞网状细胞；内皮先驱细胞(EPC)；癌症相关纤维母细胞；外被细胞；其他基质细胞；胞外基质的组分(ECM)；树突状细胞；抗原呈递细胞；T细胞；调节性T细胞；巨噬细胞；嗜中性白血球；及位于靠近肿瘤处的其他免疫细胞。

试剂盒

亦提供包括如本文所描述的任何CD8结合多肽及合适包装的制品及试剂盒。在一些实施方案中，本发明包括具有(i)CD8结合多肽及(ii)关于使用试剂盒向个体施用CD8结合多肽的说明书的试剂盒。

适用于本文所描述的组合物的包装为本领域已知，且包括例如小瓶(例如，密封小瓶)、容器、安瓿、瓶子、罐、可挠性包装(例如，密封聚酯薄膜(Mylar)或塑料袋)及其类似物。这些制品可进一步经灭菌和/或密封。亦提供包含本文所描述的组合物的单位剂型。所述单位剂型可按单个或多个单位剂量储存于适合包装中且亦可经进一步灭菌及密封。本发明试剂盒中供应的说明书为通常在标记或药品说明书(例如，试剂盒中包括的纸片)上的书面说明书，但机器可读说明书(例如，磁化或光学储存盘上载有的说明书)亦为可接受的。与使用抗体相关的说明一般包括关于用于预期治疗或工业用途的剂量、给药时程及施用途径的信息。试剂盒可进一步包含关于选择适合的个体或治疗的描述。

容器可为单位剂量、散装(例如，多剂量包装)或次单位剂量。举例而言，亦可提供含有足够剂量的本文所公开分子以对个体提供延长周期的有效治疗的试剂盒，该延长周期诸如约1周、2周、3周、4周、6周、8周、3个月、4个月、5个月、6个月、7个月、8个月、9个月或更多个月中的任一者。试剂盒亦可包括多个单位剂量的分子及使用说明且以对于在药房(例如医院药房及配药房)中储存及使用而言足够的量进行包装。在一些实施方案中，试剂盒包括干燥(例如冻干)组合物，其可经复原、再悬浮或复水以形成一般稳定的抗体水性悬浮液。

实施例

下文所述的实施例仅意欲例示本发明，且不应视为以任何方式限制本发明。所述实施例并非意欲表示下述实验为所进行的所有实验或唯一实验。已尽力确保关于所用数字(例如量、温度等)的准确度。但应考虑一些实验误差及偏差。除非另外指明，否则份为重量份，分子量为平均分子量，温度以摄氏度计，且压力为大气压或接近大气压。

实施例1：CD8a结合VHH域的产生

经由用融合至骆马Fc(SEQ ID NO:72)的人类CD8a的胞外域免疫接种骆马来产生靶向人类CD8a的单域抗体。产生特定抗CD8a抗体效价之后，自经免疫接种的动物的500mL血液中分离出骆马周边血液单核细胞(PBMC)，且使用Qiagen RNeasy Maxi试剂盒分离总mRNA，且随后使用Thermo Superscript IV逆转录酶及寡聚dT引发(oligo-dT priming)转化为第一股cDNA。VHH序列经由PCR使用cDNA作为模板特异性扩增且克隆至酵母表面显示载体中作为VHH-Fc-AGA2融合蛋白。Fc为人类IgG1 Fc(SEQ ID NO:32)，或在一些情况下，具有降低的效应功能的变异IgG1 Fc(例如Fc xELL；SEQ ID NO:33)。

显示VHH-Fc-AGA2融合蛋白的酵母库使用CD8a ECD的重组形式，经由磁珠分离，接着进行荧光活化细胞分选(FACS)来富集。使分选的酵母析出，且挑选分离的群落置于96孔板中且使其在培养基中生长，使表面显示的VHH-Fc表达转变成分泌至培养基中。将来自96孔酵母菌分泌培养物的上清液施加至经CD8a短暂转染的293F细胞(CD8a阳性)或未经转染的293F细胞(CD8a阴性)，洗涤，用荧光团标记的抗人类IgG1 Fc二级抗体处理，且通过96孔流式细胞术分析。

编码结合于CD8a阳性细胞及不结合于CD8a阴性细胞的VHH的核酸序列用人类FcxELL编码区同框克隆至哺乳动物表达载体中，且通过在HEK293 Freestyle细胞(293F细胞)或CHO细胞中使用聚乙烯亚胺瞬时转染表达。在3-7天之后收集上清液，通过蛋白质A色谱纯化所分泌的重组蛋白，且由280nm下的吸亮度及消光系数计算浓度。

使结合CD8a的一个VHH域(克隆B7)人源化。简言之，B7的各种人源化形式为基于人类重链构架制成。某些氨基酸回复突变成供体氨基酸，且例如在CDR中对某些突变针对其结合特性进行测试。B7的氨基酸序列及各种人源化形式提供于下文的某些序列表格中。应注意B7 VHH的序列(SEQ ID NO:2)及人源化形式hzB7v1-hzB7v 18(SEQ ID NO:6-30可在其C端包括任选存在的Gly-Gly(GG)接头(由某些序列表格中的XX表示)。另外，其限制条件为所公开的VHH域中的任一者中残基117处的赖氨酸(K117)可经天冬氨酸(K117D)、谷氨酸(K117E)或精氨酸(K117R)取代。命名为hzB7v41(SEQ ID NO:100)的人源化VHH包含K117R取代(在某些序列表格中以粗体展示且加下划线)。

通过流式细胞术在经分离的人类CD8+T细胞上评定格式化为CD8a VHH-hIgG1-Fc的CD8a结合多肽的结合。将经分离T细胞以30,000个细胞/孔涂铺于96孔盘的FACS缓冲液(PBS，1％BSA，0.1％NaN₃，pH 7.4)中。未经转染的HEK293F细胞用作CD8a阴性对照且以30,000个细胞/孔涂铺于单独的盘中。随后将测试多肽稀释至2×最终浓度1000nM，且进行3、4及5倍连续稀释。无多肽的FACS缓冲液用作仅二级抗体的对照。将多肽稀释液添加至等体积的细胞中，且将分析盘在4℃下培育30分钟。用150μL FACS缓冲液/孔洗涤两次之后，将细胞再悬浮于FACS缓冲液中，其中荧光标记抗人类Fc抗体以1:2000稀释以检测结合，且荧光标记抗CD4抗体(克隆OKT4)以1:100稀释作为复染剂。在4℃下培育分析盘20分钟。再一次用150μL FACS缓冲液/孔洗涤之后，通过流式细胞术对CD4-细胞检测结合多肽。CD8a结合在此群体上测量为647nm下的中值荧光形式。绘制数据且使用GraphPad Prism分析软件分析。在Intellicyt iQue Plus上进行流式细胞术检测。所得最大结合(Bmax)值及结合亲和力(K_d)展示于表2及表3中，且结合曲线展示于图1A-B及图2A-B中。较高Bmax值通常指示较慢的解离速率，较低Bmax值可能指示较快的解离速率。

表2

融合蛋白	Bmax(MFI)	Kd(nM)	SEQ ID NO.
				B7-xELL-Fc	50903	0.06072	2,33
hzB7v2-xELL-Fc	51439	0.06946	7,33
				hzB7v3-xELL-Fc	50103	0.05792	8,33
hzB7v4-xELL-Fc	50839	0.05671	9,33
				hzB7v6-xELL-Fc	43658	0.09356	11,33
hzB7v7-xELL-Fc	58151	0.08346	13,33
				hzB7v8-xELL-Fc	53344	0.05797	15,33
hzB7v9-xELL-Fc	57324	0.05084	17,33

表3

融合蛋白	Bmax(MFI)	Kd(nM)	SEQ ID NO.
				B7-xELL-Fc	39806	0.06663	2,33
hzB7v2-xELL-Fc	38832	0.05951	7,33
				hzB7v10-xELL-Fc	26561	0.1065	19,33
hzB7v11-xELL-Fc	41041	0.06089	20,33
				hzB7v12-xELL-Fc	29460	0.05847	21,33
hzB7v13-xELL-Fc	31494	0.05805	23,33
				hzB7v14-xELL-Fc	36208	0.06564	24,33
hzB7v15-xELL-Fc	39345	0.09653	25,33

如图中所示。1A及2A及上表，所测试CD8结合多肽以低于0.2nM且在大多数实施例中低于0.1nM的亲和力结合人类CD8+T细胞。如图1B及图2B中所示，除亲本B7-xELL-Fc之外的所有测试多肽不展现与293对照细胞的显著结合，且B7-xELL-Fc以相比于结合于CD8+T细胞而言减少超过2,000倍的亲和力结合对照细胞。这些结果表明CD8a结合多肽特异性结合CD8。

实施例2：CD8结合多肽与人类及食蟹猕猴CD8的结合

通过流式细胞术对经转染的HEK293F细胞评定上文所描述的亲本及两种人源化CD8a结合多肽的结合。HEK293F细胞用编码全长人类或食蟹猕猴CD8a的质体，接着用IRES及GFP瞬时转染。将经转染的细胞以30,000个细胞/孔涂铺于96孔盘的FACS缓冲液(PBS，1％BSA，0.1％NaN₃，pH 7.4)中。随后将测试多肽稀释至2×最终浓度500nM，且进行3、4及5倍连续稀释。无多肽的FACS缓冲液用作仅二级抗体的对照。将测试多肽添加至等体积的细胞中，且将分析盘在4℃下培育30分钟。用150μL FACS缓冲液/孔洗涤两次之后，将细胞再悬浮于FACS缓冲液中，其中荧光标记抗人类Fc抗体以1:2000稀释。在4℃下培育分析盘20分钟。再一次用150μL FACS缓冲液洗涤之后，通过流式细胞术检测结合多肽。在Intellicyt iQuePlus上进行流式细胞术检测。表达CD8a的经转染细胞作为GFP阳性闸控且多肽结合测量为647nm下的中值荧光形式。绘制数据且使用GraphPad Prism分析软件分析。结果展示于表4及表5以及图3A-B中。

表4：人类CD8a转染的HEK293F细胞上的结合

融合蛋白	Bmax(MFI)	Kd(nM)	SEQ ID NO.
				B7-xELL-Fc	189563	0.1448	2,33
hzB7v10-xELL-Fc	171061	0.5654	19,33
				hzB7v15-xELL-Fc	187850	0.1784	25,33

表5：食蟹猕猴CD8a转染的HEK293F细胞上的结合

如图3A及表4中所示，所测试CD8结合多肽结合经转染的HEK293F细胞，该细胞表达人类CD8a，其亲和力低于0.6nM。如图3B及表5中所示，所测试的CD8结合多肽以低于0.1nM的亲和力结合表达食蟹猕猴CD8a的HEK293F细胞。

实施例3：CD8结合多肽结合于人类及食蟹猕猴免疫细胞

通过流式细胞术对经分离人类T细胞及经分离食蟹猕猴PBMC评定上文所描述的亲本及两种人源化CD8a结合多肽的结合。对于食蟹猕猴PBMC，将经分离细胞以每孔200,000个细胞，且对于人类T细胞，以每孔50,000个细胞涂铺于96孔盘中FACS缓冲液(PBS，1％BSA，0.1％NaN₃，pH 7.4)中。随后将测试多肽稀释至2×最终浓度250nM且进行4倍连续稀释。单独的FACS缓冲液用作仅二级抗体的对照。将多肽稀释液添加至等体积的细胞中，且将分析盘在4℃下培育30分钟。用150μL FACS缓冲液/孔洗涤两次之后，将细胞再悬浮于FACS缓冲液中，其中荧光标记抗人类抗体以1:1000稀释以检测CD8a结合，且荧光标记抗CD3抗体(克隆SP34.2)以1:40稀释且抗CD4抗体(克隆OKT4)以1:100稀释。在4℃下培育分析盘20分钟。再一次用150μL FACS缓冲液洗涤之后，通过流式细胞术对CD3+CD4-细胞检测CD8a结合。在这些细胞群上的结合经测量为647nm下的平均荧光形式。绘制数据且使用GraphPad Prism分析软件分析。在ACEA Biosciences Novocyte-Quanteon流动式细胞仪上进行流式细胞术检测。结果展示于表6及表7及图4A-B中。

表6：人类CD3+CD4-T细胞上的结合

融合蛋白	Bmax(MFI)	Kd(nM)	SEQ ID NO.
				B7-xELL-Fc	111947	0.02335	2,33
hzB7v10-xELL-Fc	102521	0.08498	19,33
				hzB7v15-xELL-Fc	112777	0.02296	25,33

表7：食蟹猕猴CD3+CD4-细胞上的结合

融合蛋白	Bmax(MFI)	Kd(nM)	SEQ ID NO.
				B7-xELL-Fc	180823	0.04832	2,33
hzB7v10-xELL-Fc	142617	0.07370	19,33
				hzB7v15-xELL-Fc	181851	0.05399	25,33

如图4A及表6中所示，所测试的CD8结合多肽以低于0.1nM的亲和力结合人类CD3+CD4-T细胞。如图4B及表7中所示，所测试的CD8结合多肽以低于0.08nM的亲和力结合食蟹猕猴CD3+CD4-细胞。

通过流式细胞术对人类leukopak T细胞及食蟹猕猴PBMC评定CD8a结合多肽hzB7v15-xELL-Fc的结合。将leukopak T细胞用CTL抗聚集体洗涤解冻溶液解冻且涂铺于96孔U底分析盘中。细胞在400×g下离心5分钟，且丢弃上清液。跨10个孔自200nM的初始浓度以1:3连续稀释hzB7v15-xELL-Fc。FACS缓冲液用作非结合对照，且将该盘在4℃下培育30分钟。以400×g离心分析盘5分钟且丢弃上清液。洗涤细胞一次且在4℃下使其再悬浮于染色组(抗CD3抗体克隆OKT3-BV605(1:200)、抗CD4抗体克隆OKT4-B785(1:200)及荧光标记抗人类Fc抗体(1:500))中30分钟。以400×g离心分析盘5分钟且丢弃上清液。细胞用150μL FACS缓冲液洗涤，且用70μL FACS缓冲液再悬浮以便在Novocyte流动式细胞仪上读数。结果展示于下表8及图5A中。

食蟹猕猴PBMC用CTL抗聚集体洗涤解冻溶液解冻且以每孔500,000个细胞涂铺于96孔U底分析盘中。细胞在400×g下离心5分钟且丢弃上清液。跨10个孔自30nM的初始分析浓度以1:3连续稀释经Alexa Fluor 647化学标记的hzB7v15-xELL-Fc(AF647-hzB7v15-xELL-Fc)。FACS缓冲液用作非结合对照，且将该盘在4℃下培育20分钟。以400×g离心分析盘5分钟且丢弃上清液。细胞用150μL PBS缓冲液洗涤，且用40μL FACS缓冲液、10μL BV染色缓冲液(Brilliant Stain Buffer Plus；BD Biosciences)再悬浮，且将抗体(抗CD3抗体克隆SP34-BV421(1:25)、抗CD4抗体克隆OKT4-BV785(1:100)及抗CD16抗体克隆3G8-PE(1:100))于FACS缓冲液中的50μL混合物添加至细胞。细胞在4℃下染色20分钟。以400×g离心分析盘5分钟且丢弃上清液。细胞用150μL FACS缓冲液洗涤，且用70μL FACS缓冲液再悬浮以便在Novocyte流动式细胞仪上读数。结果展示于下表9及图5B中。

表8：人类CD3+CD4-T细胞上的结合

融合蛋白	Kd(nM)	SEQ ID NO.
			hzB7v15-xELL-Fc	0.09465	25,33

表9：食蟹猕猴CD3+CD4-CD16-细胞上的结合

融合蛋白	Kd(nM)	SEQ ID NO.
			hzB7v15-xELL-Fc	0.05412	25,33

如图5A及表8中所示，hzB7v15-xELL-Fc以低于0.1nM的亲和力结合人类CD3+CD4-T细胞。如图5B及表9中所示，hzB7v15-xELL-Fc以低于0.06nM的亲和力结合食蟹猕猴CD3+CD4-CD16-细胞。

实施例4：减毒IL-2的CD8a靶向恢复活性

在IL-2报告细胞中评定包含CD8a结合VHH hzB7v15或VHH hzB7v31域、Fc区及融合至Fc区的C端的减毒IL-2的多肽的靶向CD8a的IL-2活性。融合蛋白为二聚物，包含融合至杵Fc区及减毒IL-2的VHH hzB7v15或VHH hzB7v31域以及融合至臼Fc区的VHH hzB7v15或VHHhzB7v31域。因此，二聚融合蛋白包含两个CD8a结合VHH域、两个Fc区及一个减毒IL-2。分离HEK-Blue IL2报告细胞或表达CD8a的HEK-Blue IL2报告细胞，将其转移至50mL锥形管，以400×g离心集结5分钟，且以0.5×10^6个细胞/ml的密度再悬浮于新鲜的预温热分析培养基(DMEM+4.5g/L葡萄糖、2mM L-谷氨酰胺+10％热灭活的FBS+100U/mL青霉素+100μg/mL链霉素+100μg/mL normocin)中。在分析培养基中制备2×最终浓度的一系列多肽稀释液，且每孔添加100μL。将100μL的50,000个细胞添加至经组织培养物处理的平底96孔盘的各孔中。将该盘在CO₂培育箱中在37℃下培育20小时。遵循制造商说明书制备Quanti-Blue溶液(再悬浮于水中且在水浴中升温至37℃持续30分钟)。在400×g下短暂离心分析盘5分钟。将100μL上清液转移至新的平底96孔组织培养盘中，且添加100μL/孔的Quanti-Blue溶液，且在5％CO₂培育箱中在37℃下培育1-2小时。在EMax读盘仪上在650nm下读取吸亮度。

如图6A中所示，在不表达CD8a的细胞上，包含减毒IL-2的靶向CD8a的多肽展现比包含非靶向VHH域及野生型IL-2的多肽显著较低的活性。如图6B及图6C中所示，在表达CD8a的细胞中，包含CD8a结合VHH及减毒IL-2的多肽展现稳定的IL-2活性，其类似于包含非靶向VHH域及野生型IL-2的多肽的活性。包含非靶向VHH域及减毒IL-2的多肽在表达CD8a的报告细胞上展现显著较低的活性。这些结果显示IL-2活性可在较宽浓度范围内特异性地靶向表达CD8a的细胞，其范围在此报告分析中大致落在0.01至1nM之间。

实施例5：由包含CD8a结合VHH及减毒IL-2的多肽诱导的T细胞增殖

在非人类灵长类动物中测试对融合蛋白的CD8+T细胞扩增的影响，该融合蛋白包含融合至CD8a结合VHH hzB7v15的C端的减毒IL-2。对食蟹猕猴静脉内推注注射施用0.3mg/kg的融合蛋白。在融合蛋白施用之前及融合蛋白施用之后7天，自研究动物收集全血样品。在Lymphoprep^TM中使用密度离心来分离各时间点的周边血液单核细胞(PBMC)，且用荧光标记细胞类型特异性抗体组合染色细胞。将T细胞分类为表达CD4或CD8a但不表达B细胞标记CD20的CD3+细胞。调节性T细胞(“Treg”)定义为亦表达CD25且具有降低的CD127含量的CD4+T细胞。CD4+常规T细胞(“CD4+Tcon”)定义为不表达CD25且具有正常CD127含量的CD4+T细胞。NK细胞定义为表达NKG2A的非T及非B细胞。针对CD20染色呈阳性的群体归类为B细胞。使用流式细胞术测定各PBMC亚群的绝对细胞计数，且通过用给药后7天绝对细胞计数除以给药前基线计数来计算扩增倍数。

如图7中所示，0.3mg/kg的单次剂量的靶向CD8的减毒IL-2造成CD8+T细胞的5.6倍扩增及NK细胞的2.8倍扩增，同时不显著影响CD8-细胞群，包括Treg、CD4+常规T细胞及B细胞。较高数目的CD8+T细胞亦导致总T细胞的3.2倍增加，且总PBMC数目相比于给药前细胞计数增加2.7倍。这些资料展示靶向CD8a的减毒IL-2特异性地诱导体内CD8+细胞群的细胞增殖。

实施例6：CD8a结合多肽与293F细胞上表达的人类CD8链的结合

通过流式细胞术在用编码人类CD8a或CD8b链的质体瞬时转染的HEK293F细胞上评定包含人源化CD8a结合VHH域、Fc区，且在某些多肽中包含融合至Fc区的C端的突变减毒IL-2的多肽的结合。经标记的复合物或多肽“KiH”包含杵臼异源二聚体Fc区，其中所指示的CD8a结合VHH域融合至各Fc区的N端，且突变IL-2仅融合至“杵”Fc区的C端。在生理条件下未经标记的“KiH”的复合物或多肽形成同源二聚体。将经转染细胞以每孔50,000个细胞涂铺于96孔盘的FACS缓冲液(PBS，1％BSA，0.1％NaN₃，pH 7.4)中。随后将测试多肽稀释至2×最终浓度500nM，且进行6倍连续稀释。无多肽的FACS缓冲液用作仅二级抗体的对照。将测试多肽添加至等体积的细胞中，且将分析盘在4℃下培育30分钟。用150μL FACS缓冲液/孔洗涤两次之后，将细胞再悬浮于FACS缓冲液中，其中荧光标记抗人类Fc抗体以1:1000稀释以检测CD8结合。分析盘在4℃下培育30分钟。再用150μL FACS缓冲液洗涤一次之后，通过流式细胞术在对转染标记citrine呈阳性的细胞上检测结合于CD8的多肽。在这些细胞群上的结合经测量为647nm下的平均荧光强度(MFI)。在IntelliCyt iQue Screener Plus上进行流式细胞术检测。使用GraphPad Prism分析软件绘制及分析数据。结果展示于表10及图8A-B中。

表10：与经转染的HEK293F细胞上表达的人类CD8a的结合

如图8A及表10中所示，所测试CD8a结合多肽以低纳摩尔范围内的亲和力结合人类CD8a。图8B展示多肽以低至可忽略的亲和力结合于人类CD8b。

实施例7：CD8a结合多肽与T细胞的结合

通过流式细胞术在经分离的人类T细胞上评定多肽的结合，所述多肽包含人源化CD8a结合VHH域、Fc区，且在某些多肽中包含融合至Fc区的C端的突变减毒IL-2。经标记的复合物或多肽“KiH”包含杵臼异源二聚体Fc区，其中所指示的CD8a结合VHH域融合至各Fc区的N端，且突变IL-2仅融合至“杵”Fc区的C端。在生理条件下未经标记的“KiH”的复合物或多肽形成同源二聚体。将经分离细胞以每孔50,000个细胞涂铺于96孔盘的FACS缓冲液(PBS，1％BSA，0.1％NaN₃，pH 7.4)中。随后将测试多肽稀释至2×最终浓度200nM，且进行5倍连续稀释。无多肽的FACS缓冲液用作仅二级抗体的对照。将测试多肽添加至等体积的细胞中，且将分析盘在4℃下培育30分钟。用150μL FACS缓冲液/孔洗涤两次之后，将细胞再悬浮于具有以1:1000稀释以检测CD8a结合的荧光标记抗人类IgG抗体及荧光标记抗CD4抗体(克隆OKT4，1:200)的FACS缓冲液中。以1:2000添加碘化丙片(PI)以区分活细胞与死细胞。分析盘在4℃下培育30分钟。在用150μL FACS缓冲液再洗涤一次之后，通过流式细胞术在PI-CD4-细胞及PI-CD4+细胞上检测结合于CD8a的多肽。在这些细胞群上的结合经测量为647nm下的平均荧光强度(MFI)。在ACEA Biosciences Novocyte-Quanteon流动式细胞仪上进行流式细胞术检测。使用GraphPad Prism分析软件绘制及分析数据。结果展示于表11及图9A-B中。

表11：与经转染的HEK293F细胞上表达的人类CD8a的结合

如图9A及表11中所示，所测试CD8a结合多肽以低纳摩尔浓度至次纳摩尔浓度范围内的亲和力结合人类CD8 T细胞。图9B展示多肽不结合于人类CD4 T细胞。

实施例8：CD8a结合多肽与人类及食蟹猕猴CD8a的结合

通过流式细胞术在经分离人类T细胞及经分离人类或食蟹猕猴周边血液单核细胞(PBMC)上评定包含融合至xELL fc区的人源化CD8a结合VHH域的四种多肽的结合。对于食蟹猕猴PBMC，将经分离细胞以每孔200,000个细胞，且对于人类T细胞，以每孔100,000个细胞涂铺于96孔盘中FACS缓冲液(PBS，1％BSA，0.1％NaN₃，pH 7.4)中。随后将测试多肽稀释至2×最终浓度25nM或50nM，且制备3或5倍连续稀释液。单独的FACS缓冲液用作仅二级抗体的对照。将多肽稀释液添加至等体积的细胞中，且将分析盘在4℃下培育30分钟。用150μLFACS缓冲液/孔洗涤两次之后，将细胞再悬浮于FACS缓冲液中，其中该缓冲液具有1:1000稀释以检测CD8a结合的荧光标记抗人类IgG抗体、荧光标记抗CD3抗体(仅针对PBMC制剂，克隆SP34.2，1:50)及荧光标记抗CD4抗体(克隆OKT4，1:100)。以1:2000添加碘化丙片(PI)以区分活细胞与死细胞。分析盘在4℃下培育30分钟。再一次用150μL FACS缓冲液洗涤之后，通过流式细胞术对PI-(CD3+)CD4-细胞检测CD8a结合。在这些细胞群上的结合经测量为647nm下的平均荧光强度(MFI)。在ACEA Biosciences Novocyte-Quanteon流动式细胞仪上进行流式细胞术检测。使用GraphPad Prism分析软件绘制及分析数据。结果展示于表12及表13及图10A-D中。

表12：与人类CD8 T细胞(CD4富集T细胞)的结合

融合蛋白	Bmax(MFI)	Kd(nM)	SEQ ID NO.
				hzB7v15-xELL-Fc	287001	0.09133	25,33
hzB7v29-xELL-Fc	292513	0.07587	90,33
				hzB7v31-xELL-Fc	269349	0.09089	92,33
hzB7v35-xELL-Fc	278470	0.07665	99,33
				hzB7v41-xELL-Fc	363856	0.1093	100,33

表13：食蟹猕猴CD8 T细胞(CD3+CD4-PBMC)上的结合

融合蛋白	Bmax(MFI)	Kd(nM)	SEQ ID NO.
				hzB7v15-xELL-Fc	121170	0.02514	25,33
hzB7v29-xELL-Fc	123694	0.03172	90,33
				hzB7v31-xELL-Fc	103591	0.03887	92,33
hzB7v35-xELL-Fc	110657	0.02359	99,33
				hzB7v41-xELL-Fc	99723	0.04993	100,33

如图10A及图10E以及表12中所示，所测试CD8a结合多肽以等于或低于0.1nM的亲和力结合人类CD8 T细胞。图10B及图10F展示这些多肽不结合于人类CD4 T细胞。如图10C及表13中所示，所测试CD8a结合多肽以低于0.04nM的亲和力结合食蟹猕猴CD8 T细胞。图10D及图10H展示多肽不结合于食蟹猕猴CD4 T细胞。

实施例9：由包含CD8a结合VHH及减毒IL-2的多肽诱导的特异性IL-2信号传导

在pSTAT5分析中评定多肽的靶向CD8a的IL-2活性，该多肽包含CD8结合VHH域(hzB7v31，SEQ ID NO:92，或hzB7v41，SEQ ID NO:100)、Fc区及与Fc区的C端融合的突变减毒IL-2。对照蛋白包括包含CD8a结合VHH域及Fc区但无IL-2的多肽、包含非靶向VHH、Fc区及突变减毒IL-2及野生型IL-2的融合蛋白。磷酸化STAT5(pSTAT5)含量或表达pSTAT5的细胞百分比的增加为通过细胞内流式细胞术测量为IL-2受体接合及信号传导的近端读数形式。将富集的人类T细胞以500,000个细胞/孔涂铺于96孔盘的完全生长培养基(RPMI，10％FBS，1％抗生素-抗霉剂(anti-anti))中。随后将测试多肽稀释至2×最终浓度200nM或50nM，且进行4倍连续稀释。将连续稀释液添加至细胞中且在37℃下培育15分钟。随后将细胞在4℃下于100μL的Cytofix固定缓冲液(BD)中固定30分钟。随后将细胞在200μL FACS缓冲液中洗涤一次且在4℃下于Perm缓冲液III(BD Phosflow)中渗透30分钟。将经渗透细胞在1×渗透缓冲液(eBioscience)中洗涤总共三次，且随后在4℃下于含有针对以下的荧光标记抗体的1×渗透缓冲液中培育隔夜：CD4(OKT4,1:100)、CD3(SP34-2,1:50)、FoxP3(236A/E7，1:40)、pSTAT5(SRBCZX，1:70)、CD25(M-A251，1:500)及CD8(RPA-T8，1:4000)。次日，细胞用150μLFACS缓冲液洗涤且使用ACEA Biosciences Novocyte-Quanteon流动式细胞仪分析。经由用检测CD8 T细胞(CD3+CD8+)或调节性T细胞(Treg，CD3+CD4+FoxP3+)上的pSTAT5的荧光标记抗体染色的阳性细胞的中值荧光强度或百分比的增加来定量IL-2信号传导。使用GraphPadPrism分析软件绘制及分析数据。

如图11A及图11C中所示，包含CD8a结合VHH hzB7v31或VHH hzB7v41域、Fc区及融合至Fc区的C端的突变减毒IL-2的所测试多肽以浓度依赖性方式且以低于0.03nM的EC₅₀诱导pSTAT5含量增加或pSTAT5阳性CD8 T细胞的百分比升高。野生型IL-2(非靶向)展现下降约50倍的强效活性，其中EC₅₀为大致1.6nM。野生型IL2亦以大致2.5pM的EC₅₀诱导Treg上的IL-2受体信号传导，而Treg pSTAT5或pSTAT5阳性CD4 T细胞百分比的可检测增加不由靶向CD8a的减毒IL-2诱导(图11A-11D)。包含CD8a-hzB7v31而无IL-2的多肽或包含非靶向VHH、Fc区及突变减毒IL-2的多肽均不诱导任何测试细胞型中pSTAT5含量的可检测增加，指示需要减毒IL-2靶向细胞以便诱导IL-2受体信号传导活性(图11A-11D)。

实施例10：由包含CD8a结合VHH及减毒IL-2的多肽诱导的人类肿瘤浸润T细胞及健康供体T细胞的T细胞增殖

在用来自人类癌症患者的解离肿瘤细胞(DTC)样品或来自健康人类供体血液的PBMC进行的增殖分析中进一步评定包含CD8a结合VHH hzB7v31域、Fc区及融合至Fc区的C端的突变减毒IL-2的多肽的活性。使用人类肿瘤解离试剂盒(Miltenyi Biotec)由头颈、肾脏或大肠肿瘤的活组织切片产生DTC单细胞悬浮液。DTC或PBMC随后根据制造商建议方案用增殖染料CellTrace紫(Thermo)标记。在补充有10nM测试多肽或测试多肽以200nM浓度开始的5倍稀释液的完全生长培养基(RPMI，10％FBS，1％抗生素-抗霉剂)中培育细胞。对照蛋白包括包含格式化为VHH-hIgG1-xELL Fc的CD8a-hzB7v31的多肽、包含非靶向VHH-hIgG1-xELLFc及突变减毒IL-2及野生型IL-2的融合蛋白。在培养六天或七天之后，用针对CD3(Hit3，1:100)、CD4(OKT4，1:200)、CD8(RPA-T8，1:200)及CD45(HI30，1:100)的荧光标记抗体以及碘化丙片(PI，1:2000)来标记细胞亚群以区分活细胞与死细胞。将T细胞分类为表达CD4或CD8a的CD45+CD3+PI-细胞。在第六或七天使用流式细胞术定量这些T细胞亚群的细胞数。在ACEA Biosciences Novocyte-Quanteon流动式细胞仪上进行流式细胞术检测。使用GraphPad Prism分析软件绘制及分析数据。细胞数以用CD8a-hzB7v31-Fc-xELL处理的样品标准化，来确定相对于不包含IL-2且不引起细胞增殖的对照多肽的细胞计数的增加倍数。通过定量具有比亲本未分裂细胞峰值低的CellTrace紫荧光强度的细胞的百分比来确定增殖百分比。

如图12A及图12C中所示，包含CD8a结合VHH hzB7v31域、Fc区及融合至Fc区的C端的突变减毒IL-2的所测试多肽诱导CD8 T细胞在解离肿瘤样品及健康PBMC中的增殖。野生型IL2亦诱导CD8(图12A及图12C)及CD4(图12B)T细胞的增殖，然而靶向CD8a的突变减毒IL-2不诱导CD4 T细胞的增殖。包含CD8a-hzB7v31而无IL-2的多肽及包含非靶向VHH、Fc区及突变减毒IL-2的多肽均不诱导CD8或CD4 T细胞增殖的可检测增加，指示需要减毒IL-2靶向细胞以便诱导IL-2受体信号传导活性，诸如增殖。

实施例11：由包含CD8a结合VHH及减毒IL-2的多肽诱导的食蟹猕猴PBMC亚群的细胞扩增

在非人类灵长类动物中测试融合蛋白对体内细胞扩增的影响，该融合蛋白包含CD8a结合VHH hzB7v15、xELL P329G、杵臼异源二聚体Fc区及融合至“杵”Fc的C端的减毒IL-2。向食蟹猕猴以1.0mg/kg静脉内推注注射施用融合蛋白。在融合蛋白施用之前及之后七天自研究动物收集全血样品。在Lymphoprep^TM中使用密度离心分离各时间点的PBMC且用荧光标记细胞类型特异性抗体组合染色细胞。将T细胞归类为表达CD4或CD8a、不表达B细胞标记CD20的CD3+细胞。调节性T细胞(“Treg”)定义为亦表达CD25且具有降低的CD127含量的CD4+T细胞。CD4+常规T细胞(“CD4+Tcon”)定义为不表达CD25且具有正常CD127含量的CD4+T细胞。NK细胞定义为表达NKG2A的非T且非B细胞，且对于CD16呈阳性或阴性。针对CD20染色呈阳性的群体归类为B细胞。使用流式细胞术测定各PBMC亚群的绝对细胞计数，且通过用给药后7天绝对细胞计数除以给药前基线计数来计算扩增。使用额外固定、渗透及染色步骤在上文所述的PBMC亚群中测量Ki67表达。简言之，针对细胞表面标记，细胞用荧光标记细胞类型特异性抗体组合染色，接着使用FoxP3转录因子染色缓冲液组(eBioscience)固定及渗透。FoxP3及Ki67接着用特异性荧光标记抗体检测。T细胞归类为表达CD4或CD8a、不表达NK细胞标记NKG2A的CD3+细胞。调节性T细胞(“Treg”)定义为亦表达CD25及FoxP3的CD4+T细胞。CD4+常规T细胞(“CD4+Tcon”)定义为不表达CD25或FoxP3的CD4+T细胞。NK细胞定义为非T且表达NKG2A且对于CD16呈阳性或阴性。在ACEA Biosciences Novocyte-Quanteon流动式细胞仪上进行流式细胞术检测。使用GraphPad Prism分析软件绘制及分析数据。通过用第七天每mL全血中的细胞计数除以基线(给药前)处每mL全血中的细胞计数来计算变化倍数。

如图13A中所示，单次剂量1mg/kg的靶向CD8a的减毒IL-2分别引起CD8 T细胞的5倍扩增，以及表达CD8a的CD16+或CD16-NK细胞的3.9倍及4.7倍扩增。CD8a阴性细胞群，包括Treg、CD4+常规T细胞及B细胞的数目在给药前抽血与第七天之间未显著增加。图13B展示体内表达CD8a的细胞群的特异性扩增伴随增殖标记Ki67的特异性增加。Ki67+增殖CD8 T细胞的百分比自基线处6％增加至第七天的58％，而CD16+及CD16-NK细胞群在相同时间范围中展示Ki67+细胞平均增加40-53％。CD8a阴性细胞群(包括Treg及CD4+常规T细胞)内Ki67+群体的百分比不变。这些资料展示靶向CD8a的减毒IL-2特异性地诱导体内CD8a阳性细胞群的细胞增殖。

实施例12：由包含CD8a结合VHH及减毒IL-2的多肽诱导的CD8 T细胞的细胞毒活性及针对人类癌细胞的抗体依赖性细胞毒性的增强

在用富集CD8 T细胞的肿瘤细胞杀死分析及与西妥昔单抗组合的抗体依赖性细胞毒性(ADCC)分析中进一步评定融合物的活性，该融合物包含CD8a结合VHH hzB7v31域、xELL杵臼异源二聚体Fc区及包含融合至“杵”Fc区的C端的减毒IL-2。对照蛋白包括包含非靶向VHH-hIgG1-xELL Fc及突变减毒IL-2及野生型IL-2的融合蛋白。对于CD8 T细胞杀死分析，来自健康人类供体血液的PBMC用于分离CD8 T细胞，且在培养盘上，在存在或不存在来自野生型IL-2或包含CD8a结合VHH hzB7v31-hIgG1-xELL Fc及突变减毒IL-2的融合蛋白(各1nM)的额外细胞因子支持下，用以1μg/ml涂布的针对CD3的抗体(克隆：OKT3)刺激所富集细胞3天。在靶细胞杀死分析当天，用CYTO-ID红长期细胞示踪剂(Enzo)标记A431细胞，接着在96孔平底培养盘中以4,000个细胞/孔涂铺100μL，且使其黏附4小时。将预刺激的CD8 T细胞在PBS中洗涤一次且如所指示以不同效应子与靶细胞比(20:1、10:1及5:1)添加至经标记的A431靶细胞中。将凋亡蛋白酶-3/7绿色染料(Sartorius)添加至各孔中以检测细胞死亡。20小时后通过使用Incucyte成像器定量凋亡蛋白酶-3/7及CYTO-ID红的重叠来测定A431杀死。

对于ADCC分析，用CYTO-ID红长期细胞示踪剂(Enzo)标记A431细胞，接着在96孔平底培养盘中以10,000个细胞/孔涂铺100μL，且使其黏附4小时。将人类PBMC解冻且通过流式细胞术测试NK细胞频率。对于各孔而言，25μL针对细胞凋亡的凋亡蛋白酶-3/7绿色染料(Sartorius)的最终稀释度为1:2000，25μL培养基或ADCC抗体西妥昔单抗的最终浓度为20nM，25μL培养基，野生型重组IL-2的最终浓度为1nM，或IL-2变体融合多肽的最终浓度为1nM，及25μL人类PBMC的浓度调整至每1个A431细胞10或5个NK细胞。使细胞在室温下静置10分钟，随后将培养盘置于37℃下的Incucyte成像器中进行成像。15小时后通过定量凋亡蛋白酶-3/7及CYTO-ID红的重叠来测定A431杀死，其中最大杀死由20nM西妥昔单抗界定。使用GraphPad Prism分析软件绘制及分析所有数据。

如图14A及图14B中所示，包含CD8a结合VHH hzB7v31域、Fc区及融合至Fc区的C端的突变减毒IL-2的所测试多肽在不同效应子与靶细胞比下增强CD8 T细胞的相对细胞毒性(图14A)，且有助于以次佳子与靶细胞比增加PBMC针对EGFR阳性A431靶细胞的西妥昔单抗驱动的ADCC活性(图14B)。CD8 T细胞活性程度比在野生型IL-2下观测到的程度高3至4倍，但在ADCC分析中为相当的。包含非靶向VHH-hIgG1-xELL Fc及突变减毒IL-2的融合蛋白不能够增加较低效应子与靶细胞比的ADCC活性，指示需要减毒IL-2靶向效应细胞以便诱导IL-2受体信号传导活性及增强的细胞毒性。

在不偏离本发明的精神或基本特征的情况下，本发明可以其他特定形式体现。前述实施方案因此在所有方面中均欲视为说明性而非限制本发明。本发明的范畴因此由所附权利要求书而非由前述描述来指示，且具有权利要求书等效性的含义及范围内的所有变化因此均意欲包括于本文中。

某些序列的表格

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Claims (58)

1.一种多肽，其包含至少一个结合CD8的VHH域，所述VHH域包含CDR1，所述CDR1包含SEQID NO:3、73或74的氨基酸序列；CDR2，所述CDR2包含SEQ ID NO:4、12、14、22、27、29、31、75、76、77、78、79或80的氨基酸序列；及CDR3，所述CDR3包含SEQ ID NO:5、16或18的氨基酸序列。

2.如权利要求1的多肽，其中至少一个VHH域包含CDR1、CDR2及CDR3，其分别包含氨基酸序列SEQ ID NO:3、4及5；3、12及5；3、14及5；3、4及16；3、4及18；3、22及5；3、14及18；3、27及5；3、29及5；3、31及5；73、14及18；74、14及18；3、75及18；3、76及18；3、77及18；3、78及18；3、79及18；或3、80及18。

3.如权利要求1或权利要求2的多肽，其中至少一个VHH域包含：CDR1，所述CDR1包含SEQID NO:3的氨基酸序列；CDR2，所述CDR2包含SEQ ID NO:78的氨基酸序列；及CDR3，所述CDR3包含SEQ ID NO:18的氨基酸序列。

4.如权利要求1至3中任一项的多肽，其中至少一个VHH域或各VHH域经人源化。

5.如权利要求1至4中任一项的多肽，其中至少一个VHH域包含与SEQ ID NO:2、6、7、8、9、10、11、13、15、17、19、20、21、23、24、25、26、28、30、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100的氨基酸序列至少85％、90％、95％或至少99％一致的氨基酸序列。

6.如权利要求1至5中任一项的多肽，其中至少一个VHH域包含SEQ ID NO:6、7、8、9、10、11、13、15、17、19、20、21、23、24、25、26、28、30、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100的氨基酸序列。

7.如权利要求1至6中任一项的多肽，其中至少一个VHH域包含SEQ ID NO:92或100的氨基酸序列。

8.如权利要求1至7中任一项的多肽，其包含两个VHH域。

9.如权利要求1至7中任一项的多肽，其包含三个VHH域。

10.如权利要求1至9中任一项的多肽，其中所述多肽包含免疫细胞活化细胞因子。

11.如权利要求10的多肽，其中该免疫细胞活化细胞因子融合至结合CD8的VHH域的N端或C端。

12.如权利要求10或权利要求11的多肽，其中所述免疫细胞活化细胞因子为IL-2、IL-15、IL-7、IL-6、IL-12、IFNα、IFNβ或IFNγ，或其减毒或经修饰型。

13.如权利要求1至12中任一项的多肽，其中所述多肽包含Fc区。

14.如权利要求13的多肽，其中所述Fc区包含选自SEQ ID NO:32-70及101-111的氨基酸序列。

15.如权利要求13或权利要求14的多肽，其中所述多肽包含免疫细胞活化细胞因子。

16.如权利要求15的多肽，其中所述免疫细胞活化细胞因子为IL-2、IL-15、IL-7、IL-6、IL-12、IFNα、IFNβ或IFNγ，或其减毒或经修饰型。

17.如权利要求16的多肽，其中所述免疫细胞活化细胞因子融合至所述Fc区的C端。

18.如权利要求1至17中任一项的多肽，其中所述多肽包含至少一个结合除CD8以外的抗原的抗原结合域。

19.如权利要求18的多肽，其中所述多肽包含至少一个结合Lag3、CTLA4、TGFBR1、TGFBR2、Fas、TNFR2、PD1、PDL1或TIM3的抗原结合域。

20.如权利要求18或19的多肽，其中所述多肽包含至少一个结合以下的抗原结合域：TGFBR1、TGFBR2、Fas、TNFR2、1-92-LFA-3、5T4、α-4整合素、α-V整合素、α4β1整合素、α4β7整合素、AGR2、抗Lewis-Y、Apelin J受体、APRIL、B7-H3、B7-H4、B7-H6、BAFF、BCMA、BTLA、C5补体、C-242、CA9、CA19-9、(Lewis a)、碳酸酐酶9、CD2、CD3、CD6、CD9、CD11a、CD19、CD20、CD22、CD24、CD25、CD27、CD28、CD30、CD33、CD38、CD39、CD40、CD40L、CD41、CD44、CD44v6、CD47、CD51、CD52、CD56、CD64、CD70、CD71、CD73、CD74、CD80、CD81、CD86、CD95、CD117、CD123、CD125、CD132、(IL-2RG)、CD133、CD137、CD138、CD166、CD172A、CD248、CDH6、CEACAM5(CEA)、CEACAM6(NCA-90)、CLAUDIN-3、CLAUDIN-4、cMet、胶原蛋白、Cripto、CSFR、CSFR-1、CTLA4、CTGF、CXCL10、CXCL13、CXCR1、CXCR2、CXCR4、CYR61、DL44、DLK1、DLL3、DLL4、DPP-4、DSG1、EDA、EDB、EGFR、EGFRviii、内皮素B受体(ETBR)、ENPP3、EpCAM、EPHA2、EPHB2、ERBB3、RSV的F蛋白质、FAP、FcRH5、FGF-2、FGF8、FGFR1、FGFR2、FGFR3、FGFR4、FLT-3、叶酸受体α(FRα)、GAL3ST1、G-CSF、G-CSFR、GD2、GITR、GLUT1、GLUT4、GM-CSF、GM-CSFR、GP IIb/IIIa受体、Gp130、GPIIB/IIIA、GPNMB、GPRC5D、GRP78、HAVCAR1、HER2/neu、HER3、HER4、HGF、hGH、HVEM、玻尿酸酶、ICOS、IFNα、IFNβ、IFNγ、IgE、IgE受体(FceRI)、IGF、IGF1R、IL1B、IL1R、IL2、IL11、IL12、IL12p40、IL-12R、IL-12Rβ1、IL13、IL13R、IL15、IL17、IL18、IL21、IL23、IL23R、IL27/IL27R(wsx1)、IL29、IL-31R、IL31/IL31R、IL2R、IL4、IL4R、IL6、IL6R、胰岛素受体、锯齿状配位体(Jagged Ligand)、锯齿状1、锯齿状2、KISS1-R、LAG-3、LIF-R、Lewis X、LIGHT、LRP4、LRRC26、Ly6G6D、LyPD1、MCSP、间皮素、MICA、MICB、MRP4、MUC1、黏蛋白-16(MUC16、CA-125)、Na/K ATP酶、NGF、Nicastrin、Notch受体、Notch 1、Notch2、Notch 3、Notch 4、NOV、OSM-R、OX-40、PAR2、PDGF-AA、PDGF-BB、PDGFRα、PDGFRβ、PD-1、PD-L1、PD-L2、磷脂酰丝氨酸、P1GF、PSCA、PSMA、PSGR、RAAG12、RAGE、SLC44A4、神经鞘胺醇1磷酸酯、STEAP1、STEAP2、TAG-72、TAPA1、TEM-8、TGFβ、TIGIT、TIM-3、TLR2、TLR4、TLR6、TLR7、TLR8、TLR9、TMEM31、TNFα、TNFR、TNFRS12A、TRAIL-R1、TRAIL-R2、转铁蛋白、转铁蛋白受体、TRK-A、TRK-B、TROP-2uPAR、VAP1、VCAM-1、VEGF、VEGF-A、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D、VEGFR1、VEGFR2、VEGFR3、VISTA、WISP-1、WISP-2或WISP-3。

21.如权利要求18至20中任一项的多肽，其中至少一个结合除CD8以外的抗原的抗原结合域为VHH域。

22.如权利要求21的多肽，其中各结合除CD8以外的抗原的抗原结合域为VHH域。

23.如权利要求18至21中任一项的多肽，其中至少一个结合除CD8以外的抗原的抗原结合域包含重链可变区及轻链可变区。

24.如权利要求23的多肽，其中各结合除CD8以外的抗原的抗原结合域包含重链可变区及轻链可变区。

25.一种包含第一多肽及第二多肽的复合物，其中所述第一多肽为如权利要求13至24中任一项的多肽，其中所述第一多肽包含第一Fc区，且其中所述第二多肽包含第二Fc区，且其中所述第一Fc区及该第二Fc区相同或不同。

26.如权利要求25的复合物，其中所述第二多肽包含至少一个结合CD8的VHH域、至少一个免疫细胞活化细胞因子和/或至少一个结合除CD8以外的抗原的抗原结合域。

27.如权利要求26的复合物，其中若所述结合除CD8以外的抗原的抗原结合域包含重链可变区及轻链可变区，则所述重链可变区融合至包含所述第二Fc区的重链恒定区。

28.如权利要求25至27中任一项的复合物，其中所述第一Fc区包含杵突变且该第二Fc区包含臼突变。

29.如权利要求28的复合物，其中所述第一Fc区包含T366W突变且该第二Fc区包含T366S、L368A及Y407V突变。

30.如权利要求29的复合物，其中所述第二Fc区包含H435R或H435K突变。

31.如权利要求13至30中任一项的多肽或复合物，其中该多肽在生理条件下为二聚体，或其中该复合物在生理条件下形成。

32.如权利要求1至31中任一项的多肽或复合物，其中所述CD8为人类CD8。

33.如权利要求32的多肽或复合物，其中所述人类CD8包含SEQ ID NO:1的序列。

34.一种免疫结合物，其包含如权利要求1至33中任一项的多肽或复合物及细胞毒性剂。

35.如权利要求34的免疫结合物，其中所述细胞毒性剂为选自卡奇霉素(calicheamicin)、奥瑞他汀(auristatin)、尾海兔素(dolastatin)、微管素(tubulicin)、类美登素(maytansinoid)、念珠藻素(cryptophycin)、倍癌霉素(duocarmycin)、埃斯培拉霉素(esperamicin)、吡咯并苯并二氮杂卓及烯二炔抗生素(enediyne antibiotic)。

36.一种药物组合物，其包含如权利要求1至33中任一项的多肽或复合物或如权利要求34或权利要求35的免疫结合物，及药学上可接受的载剂。

37.一种经分离核酸，其编码如权利要求1至33中任一项的多肽或复合物。

38.一种载体，其包含如权利要求37的核酸。

39.一种宿主细胞，其包含如权利要求37的核酸或如权利要求38的载体。

40.一种宿主细胞，其表达如权利要求1至33中任一项的多肽或复合物。

41.一种产生如权利要求1至33中任一项的多肽或复合物的方法，其包含在适合于表达所述多肽或复合物的条件下培育如权利要求39或权利要求40的宿主细胞。

42.如权利要求41的方法，其进一步包含分离所述多肽或复合物。

43.一种增加CD8⁺T细胞增殖的方法，其包含使T细胞与如权利要求1至33中任一项的多肽或复合物接触。

44.如权利要求43的方法，其中所述CD8⁺T细胞系在体外。

45.如权利要求43的方法，其中所述CD8⁺T细胞系在体内。

46.一种治疗癌症的方法，其包含向患有癌症的个体施用药学上有效量的如权利要求1至33中任一项的多肽或复合物或如权利要求36的药物组合物。

47.如权利要求46的方法，其中所述癌症为选自基底细胞癌、胆道癌；膀胱癌；骨癌；脑部及中枢神经系统癌；乳腺癌；腹膜癌；子宫颈癌；绒毛膜癌；大肠直肠癌；结缔组织癌；消化系统癌；子宫内膜癌；食道癌；眼部癌；头颈癌；胃癌；胃肠癌；神经胶母细胞瘤；肝癌瘤；肝肿瘤；上皮内赘瘤；肾脏癌或肾癌；喉癌；肝癌；肺癌；小细胞肺癌；非小细胞肺癌；肺腺癌；鳞状细胞肺癌(squamous carcinoma of the lung)；黑素瘤；骨髓瘤；神经母细胞瘤；口腔癌；卵巢癌；胰腺癌；前列腺癌；视网膜母细胞瘤；横纹肌肉瘤；直肠癌；呼吸系统癌；唾液腺癌；肉瘤；皮肤癌；鳞状细胞癌；胃癌；睪丸癌；甲状腺癌；子宫或子宫内膜癌；泌尿系统癌；外阴癌；淋巴瘤；霍奇金氏淋巴瘤(Hodgkin'slymphoma)；非霍奇金氏淋巴瘤；B细胞淋巴瘤；低恶性度(low grade)/滤泡型非霍奇金氏淋巴瘤(NHL)；小淋巴球性(SL)NHL；中恶性度/滤泡型NHL；中恶性度弥漫性NHL；高恶性度免疫母细胞NHL；高恶性度淋巴母细胞NHL；高恶性度小型无裂隙细胞NHL；肿块性病变NHL(bulky disease NHL)；套细胞淋巴瘤；AIDS相关淋巴瘤；瓦尔登斯特伦氏巨球蛋白血症(Waldenstrom's macroglobulinemia)；慢性淋巴球性白血病(CLL)；急性淋巴母细胞白血病(ALL)；毛细胞白血病；及慢性骨髓母细胞白血病。

48.如权利要求46或47的方法，其进一步包含施用额外治疗剂。

49.如权利要求48的方法，其中所述额外治疗剂为抗癌剂。

50.如权利要求49的方法，其中所述抗癌剂为选自化学治疗剂、抗癌生物制剂、放射线疗法、CAR-T疗法及溶瘤病毒。

51.如权利要求48的方法，其中所述额外治疗剂为抗癌生物制剂。

52.如权利要求49的方法，其中所述抗癌生物制剂为抑制PD-1和/或PD-L1的药剂。

53.如权利要求51的方法，其中所述抗癌生物制剂为抑制VISTA、gpNMB、B7H3、B7H4、HHLA2、CTLA4或TIGIT的药剂。

54.如权利要求49中任一项的方法，其中所述抗癌剂为抗体。

55.如权利要求51的方法，其中所述抗癌生物制剂为细胞因子。

56.如权利要求49的方法，其中所述抗癌剂为CAR-T疗法。

57.如权利要求49的方法，其中所述抗癌剂为溶瘤病毒。

58.如权利要求46至57中任一项的方法，其进一步包含肿瘤切除和/或放射线疗法。