JPH0644877B2 - 抗ヒト・フイブロネクチンモノクロ−ナル抗体 - Google Patents
抗ヒト・フイブロネクチンモノクロ−ナル抗体Info
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- JPH0644877B2 JPH0644877B2 JP61308311A JP30831186A JPH0644877B2 JP H0644877 B2 JPH0644877 B2 JP H0644877B2 JP 61308311 A JP61308311 A JP 61308311A JP 30831186 A JP30831186 A JP 30831186A JP H0644877 B2 JPH0644877 B2 JP H0644877B2
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Description
【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、新規なヒト・フイブロネクチン（以下、ヒト
ＦＮと略称する）のモノクローナル抗体に関する。
ＦＮと略称する）のモノクローナル抗体に関する。
ＦＮは線維芽細胞や内皮細胞の表面、生体の基底膜面、
血液中等に存在する粘着性の糖蛋白質で、サブユニツト
α及びβが２個のジスルフイド結合している分子量約４
０万の高分子物質であり、コラーゲン、ヘパリン、フイ
ブリンに親和性を示し、細胞の粘着及び増殖を促進し、
更に免疫応答の環境作りに関与する性質を有する〔モレ
キユラー アンド セルラー バイオケミストリー（Mo
lecular and Celluler Biochem.）第２９巻、第１０３
〜１２８頁（１９８０）〕。
血液中等に存在する粘着性の糖蛋白質で、サブユニツト
α及びβが２個のジスルフイド結合している分子量約４
０万の高分子物質であり、コラーゲン、ヘパリン、フイ
ブリンに親和性を示し、細胞の粘着及び増殖を促進し、
更に免疫応答の環境作りに関与する性質を有する〔モレ
キユラー アンド セルラー バイオケミストリー（Mo
lecular and Celluler Biochem.）第２９巻、第１０３
〜１２８頁（１９８０）〕。
また、近年ヒトＦＮ分子自体の研究が急速に進み、種々
のプロテアーゼによるヒトＦＮ断片化の解析により機能
的部位（ドメイン）構造が明らかになりまた全アミノ酸
配列がヒトＦＮｃＤＮＡの塩基配列より推定された。更
に細胞膜上のヒトＦＮレセプターも同定され、ヒトＦＮ
の細胞への生理活性発現のメカニズムが研究されつつあ
る〔ジヤーナル オブ バイオロジカル ケミストリー
（Ｊ.Biol. Chem.）第２５８巻、第３３３２〜３３４０
頁（１９８３）〕。
のプロテアーゼによるヒトＦＮ断片化の解析により機能
的部位（ドメイン）構造が明らかになりまた全アミノ酸
配列がヒトＦＮｃＤＮＡの塩基配列より推定された。更
に細胞膜上のヒトＦＮレセプターも同定され、ヒトＦＮ
の細胞への生理活性発現のメカニズムが研究されつつあ
る〔ジヤーナル オブ バイオロジカル ケミストリー
（Ｊ.Biol. Chem.）第２５８巻、第３３３２〜３３４０
頁（１９８３）〕。
そして臨床医学の分野では、癌化及び各種疾患との関係
で注目されるようになつたが、いまのところ因果関係は
明確ではない。
で注目されるようになつたが、いまのところ因果関係は
明確ではない。
これらの研究には、一般の生理活性物質と同様のその特
異的抗体を使用するのが有利であるが、常法によつて得
られるヒトＦＮ抗血清（ポリクローナル抗体）は認識部
位が雑多であり、他種のＦＮとも反応すると共にヒトＦ
Ｎの種々の生物活性をほとんど阻止してしまう等の非特
異的なものであつたため、上記研究には使用できなかつ
た。そのため、ヒトＦＮのそれぞれの生物活性をもつド
メインを種々のアフイニテイクロマトグラフイーにより
単離し、それらを実験動物に免疫してそれぞれのドメイ
ンに特異的に反応する抗血清を作製することが当業者間
で試みられた〔ジヤーナル オブ パイオロジカル ケ
ミストリー第２５８巻、第３９６７〜３９７３頁（１９
８３）〕。
異的抗体を使用するのが有利であるが、常法によつて得
られるヒトＦＮ抗血清（ポリクローナル抗体）は認識部
位が雑多であり、他種のＦＮとも反応すると共にヒトＦ
Ｎの種々の生物活性をほとんど阻止してしまう等の非特
異的なものであつたため、上記研究には使用できなかつ
た。そのため、ヒトＦＮのそれぞれの生物活性をもつド
メインを種々のアフイニテイクロマトグラフイーにより
単離し、それらを実験動物に免疫してそれぞれのドメイ
ンに特異的に反応する抗血清を作製することが当業者間
で試みられた〔ジヤーナル オブ パイオロジカル ケ
ミストリー第２５８巻、第３９６７〜３９７３頁（１９
８３）〕。
しかし、ヒトＦＮはドメインごとにその抗原性が大きく
異つており、前述の方法を用いて各ドメインに特異的な
抗血清を作製してもほとんど抗体価がなく、作製した抗
血清を濃縮しなければ実際の使用に供すことができなか
つた〔ジヤーナル オブ バイオロジカル ケミストリ
ー第２５４巻、第６０５４〜６０５９頁（１９７
９）〕。
異つており、前述の方法を用いて各ドメインに特異的な
抗血清を作製してもほとんど抗体価がなく、作製した抗
血清を濃縮しなければ実際の使用に供すことができなか
つた〔ジヤーナル オブ バイオロジカル ケミストリ
ー第２５４巻、第６０５４〜６０５９頁（１９７
９）〕。
本発明の目的は、上記問題点のない新規な抗ヒトＦＮモ
ノクローナル抗体を提供することにある。
ノクローナル抗体を提供することにある。
本発明を概説すれば、本発明は新規な抗ヒトＦＮモノク
ローナル抗体ＦＮ−３０に関する発明であつてヒトＦＮ
で免疫した哺乳動物の脾臓細胞と骨髄腫細胞との融合に
よつて産生されるハイブリドーマより生産される、下記
の性質： 分子量：１５０，０００±５，０００、IgG サブクラ
ス：IgG1、等電点：５．３〜５．８、抗原との結合部
位：ヒトＦＮをサーモリシンで開裂した分子量１０５，
０００のドメイン、生物活性：ヒトＦＮと反応すること
により癌細胞のヒトＦＮへの結合を阻害する、 を有することを特徴とする。
ローナル抗体ＦＮ−３０に関する発明であつてヒトＦＮ
で免疫した哺乳動物の脾臓細胞と骨髄腫細胞との融合に
よつて産生されるハイブリドーマより生産される、下記
の性質： 分子量：１５０，０００±５，０００、IgG サブクラ
ス：IgG1、等電点：５．３〜５．８、抗原との結合部
位：ヒトＦＮをサーモリシンで開裂した分子量１０５，
０００のドメイン、生物活性：ヒトＦＮと反応すること
により癌細胞のヒトＦＮへの結合を阻害する、 を有することを特徴とする。
前記の様な問題点を解決するために、本発明者らは長期
にわたり鋭意研究を行つた結果、ヒトＦＮに特異的に反
応し、その反応ドメイン及びヒトＦＮの生物活性中和能
が明確な抗ヒトＦＮモノクローナル抗体を得ることに成
功した。
にわたり鋭意研究を行つた結果、ヒトＦＮに特異的に反
応し、その反応ドメイン及びヒトＦＮの生物活性中和能
が明確な抗ヒトＦＮモノクローナル抗体を得ることに成
功した。
かかる本発明の抗ヒトＦＮモノクローナル抗体は、ヒト
ＦＮの研究のために有用であると共に、通常の抗体の一
般的用途、例えば精製、測定、臨床診断等に使用でき
る。具体的には、上記モノクローナル抗体を固定化した
カラムクロマトグラフイーを用いてあるドメインだけを
単離したり、各種疾患の際に生体の血液中、尿中及び組
織中に出現してくると言われているヒトＦＮの分解物の
定量及び検出に使用することができる。
ＦＮの研究のために有用であると共に、通常の抗体の一
般的用途、例えば精製、測定、臨床診断等に使用でき
る。具体的には、上記モノクローナル抗体を固定化した
カラムクロマトグラフイーを用いてあるドメインだけを
単離したり、各種疾患の際に生体の血液中、尿中及び組
織中に出現してくると言われているヒトＦＮの分解物の
定量及び検出に使用することができる。
本発明において、モノクローナル抗体を生産するハイブ
リドーマの調製は、公知の方法、例えばネーチヤー（Na
ture）第２５６巻、第４９５〜４９７頁（１９７５）に
記載の方法に準じて行われる。
リドーマの調製は、公知の方法、例えばネーチヤー（Na
ture）第２５６巻、第４９５〜４９７頁（１９７５）に
記載の方法に準じて行われる。
抗原のヒトＦＮとしては、ヒト血漿、羊水等の体液、細
胞表面等に由来するものが使用されるが、特にヒト血漿
ＦＮが好ましい。これらのヒトＦＮは上記体液または培
養液から、常法により単離精製することにより得られる
〔インターナシヨナル ジヤーナル オブ キヤンサー
（Int.J.Cancer）第２０巻、第１〜５頁（１９７
７）〕。
胞表面等に由来するものが使用されるが、特にヒト血漿
ＦＮが好ましい。これらのヒトＦＮは上記体液または培
養液から、常法により単離精製することにより得られる
〔インターナシヨナル ジヤーナル オブ キヤンサー
（Int.J.Cancer）第２０巻、第１〜５頁（１９７
７）〕。
又は、上記の方法より精製された市販品を使用してもよ
い。抗原を免疫する哺乳動物は特に限定されないが、一
般にはマウスがよく用いられる。
い。抗原を免疫する哺乳動物は特に限定されないが、一
般にはマウスがよく用いられる。
例えばBalb/cマウスの腹腔内に、上記の方法等により得
たヒトＦＮを注射し、４週間後に追加免疫を行い、その
３日後にマウスより脾臓を摘出する。脾臓細胞とマウス
骨髄腫細胞（Ｐ３−Ｘ６３−ＡＧ８−Ｕ１）とをポリエ
チレングリコールの作用により融合させ、そして常法に
より９６穴マイクロプレート中にて培養する。各培養液
の上清を採取し、ＥＬＩＳＡ法により特異的抗体を産生
している細胞を選択し、更に限界希釈法によりクローニ
ングを行い、抗ヒトＦＮモノクローナル抗体産生ハイブ
リドーマを取得する。
たヒトＦＮを注射し、４週間後に追加免疫を行い、その
３日後にマウスより脾臓を摘出する。脾臓細胞とマウス
骨髄腫細胞（Ｐ３−Ｘ６３−ＡＧ８−Ｕ１）とをポリエ
チレングリコールの作用により融合させ、そして常法に
より９６穴マイクロプレート中にて培養する。各培養液
の上清を採取し、ＥＬＩＳＡ法により特異的抗体を産生
している細胞を選択し、更に限界希釈法によりクローニ
ングを行い、抗ヒトＦＮモノクローナル抗体産生ハイブ
リドーマを取得する。
これらのハイブリドーマは培養液中にモノクローナル抗
体を分泌する。市販の無血清培地などを用いてハイブリ
ドーマを培養し、その上清から硫安塩析などの操作によ
り抗体画分を得ることができる。また同系のマウス体内
にてハイブリドーマを培養し、その動物の体液より同様
の操作により抗体画分を得ることもできる。
体を分泌する。市販の無血清培地などを用いてハイブリ
ドーマを培養し、その上清から硫安塩析などの操作によ
り抗体画分を得ることができる。また同系のマウス体内
にてハイブリドーマを培養し、その動物の体液より同様
の操作により抗体画分を得ることもできる。
このようにして得られたモノクローナル抗体がヒトＦＮ
の特定のどのドメインと特異的に反応するのかは常法に
より調べることができる〔ジヤーナル オブ バイオロ
ジカル ケミストリー第２６０巻、第５１０５〜５１１
４頁（１９８５）〕。すなわち、ヒトＦＮをサーモリシ
ン（プロテアーゼ：シグマ社）などによつて開裂させた
のち、ＳＤＳポリアクリルアミド電気泳動法〔ネーチヤ
ー、第２２７巻、第６８０〜６８５頁（１９７０）参
照〕及びニトロセルロース紙上へのウエスタンブロツテ
イング法〔プロシーデイング オブ ナシヨナルアカデ
ミー オブ サイエンス オブ ザ U.S.A.(Proc.Nat
l.Acad.Sci.U.S.A.)第７６巻、第４３５０〜４３５４頁
（１９７９）参照〕などを行つたのち、そのニトロセル
ロース紙と各モノクローナル抗体とを反応させることに
より、そのモノクローナル抗体が認識する特定のドメイ
ンを検出することができる〔「役に立つ免疫実験法」参
照：(株)講談社サイエンテイフイク発行、１９８４年６
月１日〕。
の特定のどのドメインと特異的に反応するのかは常法に
より調べることができる〔ジヤーナル オブ バイオロ
ジカル ケミストリー第２６０巻、第５１０５〜５１１
４頁（１９８５）〕。すなわち、ヒトＦＮをサーモリシ
ン（プロテアーゼ：シグマ社）などによつて開裂させた
のち、ＳＤＳポリアクリルアミド電気泳動法〔ネーチヤ
ー、第２２７巻、第６８０〜６８５頁（１９７０）参
照〕及びニトロセルロース紙上へのウエスタンブロツテ
イング法〔プロシーデイング オブ ナシヨナルアカデ
ミー オブ サイエンス オブ ザ U.S.A.(Proc.Nat
l.Acad.Sci.U.S.A.)第７６巻、第４３５０〜４３５４頁
（１９７９）参照〕などを行つたのち、そのニトロセル
ロース紙と各モノクローナル抗体とを反応させることに
より、そのモノクローナル抗体が認識する特定のドメイ
ンを検出することができる〔「役に立つ免疫実験法」参
照：(株)講談社サイエンテイフイク発行、１９８４年６
月１日〕。
ヒトＦＮの各ドメインの生物活性及び機能は既に公知で
あり、特にヒトＦＮの開裂に使用するプロテアーゼとし
てサーモリシンを用いた時、各ドメインの生物活性が細
分化及び明確化されることが知られている〔バイオケミ
カル アンド バイオフイジカル リサーチ コミユニ
ケーシヨンズ(Biochem.Biophys.Res.Commun.)第１１６
巻、第５３４〜５４０頁（１９８３）〕。ヒトＦＮをサ
ーモリシンによつて開裂した各ドメインの機能を第１表
に示す。
あり、特にヒトＦＮの開裂に使用するプロテアーゼとし
てサーモリシンを用いた時、各ドメインの生物活性が細
分化及び明確化されることが知られている〔バイオケミ
カル アンド バイオフイジカル リサーチ コミユニ
ケーシヨンズ(Biochem.Biophys.Res.Commun.)第１１６
巻、第５３４〜５４０頁（１９８３）〕。ヒトＦＮをサ
ーモリシンによつて開裂した各ドメインの機能を第１表
に示す。
以上のようにすることにより、ハイブリドーマＦＮ４か
らはドメイン６に、またハイブリドーマＦＮ９からはド
メイン１に、ハイブリドーマＦＮ１０とＦＮ３０からは
ドメイン４に特異的に結合するモノクローナル抗体が得
られた。
らはドメイン６に、またハイブリドーマＦＮ９からはド
メイン１に、ハイブリドーマＦＮ１０とＦＮ３０からは
ドメイン４に特異的に結合するモノクローナル抗体が得
られた。
常法に従い、ＳＤＳポリアクリルアミド電気泳動法によ
り分子量、等電点電気泳動法により等電点を決定した。
また、IgGサブクラスは、抗マウスIgGサブクラス抗血清
（生化学工業）を用いたＥＬＩＳＡ法により調べた。
り分子量、等電点電気泳動法により等電点を決定した。
また、IgGサブクラスは、抗マウスIgGサブクラス抗血清
（生化学工業）を用いたＥＬＩＳＡ法により調べた。
更に、本発明者らはこれら４種のモノクローナル抗体に
ついて鋭意研究を続けた結果、ハイブリドーマＦＮ３０
から得られた本発明のモノクローナル抗体の１例である
モノクローナル抗体ＦＮ３０が、癌細胞とヒトＦＮとの
結合を阻害し、正常細胞とヒトＦＮとの結合を阻害しな
いことを見出した。すなわち、ヒトＦＮを被膜したマイ
クロプレート上では、一部の癌細胞は伸展接着すること
ができるが、ヒトＦＮを被膜したマイクロプレートをあ
らかじめこのモノクローナル抗体で前処理すると、それ
ら癌細胞の伸展接着が阻害されることが観察された。ま
た、正常細胞を用いた場合は、上記の様な接着阻害現象
は見られず、このモノクローナル抗体が正常細胞のヒト
ＦＮへの伸展接着に影響を与えないことが観察された。
ついて鋭意研究を続けた結果、ハイブリドーマＦＮ３０
から得られた本発明のモノクローナル抗体の１例である
モノクローナル抗体ＦＮ３０が、癌細胞とヒトＦＮとの
結合を阻害し、正常細胞とヒトＦＮとの結合を阻害しな
いことを見出した。すなわち、ヒトＦＮを被膜したマイ
クロプレート上では、一部の癌細胞は伸展接着すること
ができるが、ヒトＦＮを被膜したマイクロプレートをあ
らかじめこのモノクローナル抗体で前処理すると、それ
ら癌細胞の伸展接着が阻害されることが観察された。ま
た、正常細胞を用いた場合は、上記の様な接着阻害現象
は見られず、このモノクローナル抗体が正常細胞のヒト
ＦＮへの伸展接着に影響を与えないことが観察された。
以下、本発明を実施例及び参考例により更に具体的に説
明するが、本発明はこれら実施例に限定されない。な
お、下記例において、モノクローナル抗体ＦＮ４、ＦＮ
９、及びＦＮ１０は、本発明の参考例として示したもの
である。
明するが、本発明はこれら実施例に限定されない。な
お、下記例において、モノクローナル抗体ＦＮ４、ＦＮ
９、及びＦＮ１０は、本発明の参考例として示したもの
である。
実施例１ (1) ヒトＦＮに対するモノクローナル抗体の調製 ヒト血漿ＦＮ（コラボレーテイブ・リサーチ社）抗原１
００μｇを生理食塩水０．１mlに溶解し、等量のコンプ
リート・フロイント・アジユバントを加えて乳化させ、
Balb/cマウスの腹腔内に注射した。４週間後に抗原１０
０μｇのみを同マウスの腹腔内に注射した。その３日後
にマウスより脾臓を摘出し、単細胞化させたのち、Ｐ３
−Ｘ６３−Ａｇ８−Ｕ１マウスミエローマ細胞と細胞数
１０：１の比で混合し、５０％ポリエチレングリコール
及び２０％ジメチルスルホキシド存在下で１分間放置し
細胞融合した。１０％牛胎児血清含有ＤＭＥＭ培地にて
細胞を懸濁し、９６穴マイクロウエルプレートに１穴当
り２×104細胞となる様に分注した。その後１〜３日ご
とに培地の半分量をＨＡＴ培地で交換し、１０〜２０日
後にハイブリドーマの生育してきたウエルの培養上清を
採取し、抗体産生の有無をＥＬＩＳＡ法などにより調
べ、目的抗原に対する抗体を産生しているハイブリドー
マを３９個選択した。これらのハイブリドーマについて
限界希釈法により２回クローニングを行い、最も力価の
高い抗体を産生するハイブリドーマのクローンとして、
ＦＮ４、ＦＮ９、ＦＮ１０、ＦＮ３０の４株を取得し
た。これらのモノクローナル抗体を大量に得るために、
Balb/cマウス腹腔内に約２×107個のＦＮ４、ＦＮ９、
ＦＮ１０又はＦＮ３０ハイブリドーマを注射し、腹水腫
瘍を作らせ１０日後に腹水を採取し、抗ヒトＦＮモノク
ローナル抗体液を得た。
００μｇを生理食塩水０．１mlに溶解し、等量のコンプ
リート・フロイント・アジユバントを加えて乳化させ、
Balb/cマウスの腹腔内に注射した。４週間後に抗原１０
０μｇのみを同マウスの腹腔内に注射した。その３日後
にマウスより脾臓を摘出し、単細胞化させたのち、Ｐ３
−Ｘ６３−Ａｇ８−Ｕ１マウスミエローマ細胞と細胞数
１０：１の比で混合し、５０％ポリエチレングリコール
及び２０％ジメチルスルホキシド存在下で１分間放置し
細胞融合した。１０％牛胎児血清含有ＤＭＥＭ培地にて
細胞を懸濁し、９６穴マイクロウエルプレートに１穴当
り２×104細胞となる様に分注した。その後１〜３日ご
とに培地の半分量をＨＡＴ培地で交換し、１０〜２０日
後にハイブリドーマの生育してきたウエルの培養上清を
採取し、抗体産生の有無をＥＬＩＳＡ法などにより調
べ、目的抗原に対する抗体を産生しているハイブリドー
マを３９個選択した。これらのハイブリドーマについて
限界希釈法により２回クローニングを行い、最も力価の
高い抗体を産生するハイブリドーマのクローンとして、
ＦＮ４、ＦＮ９、ＦＮ１０、ＦＮ３０の４株を取得し
た。これらのモノクローナル抗体を大量に得るために、
Balb/cマウス腹腔内に約２×107個のＦＮ４、ＦＮ９、
ＦＮ１０又はＦＮ３０ハイブリドーマを注射し、腹水腫
瘍を作らせ１０日後に腹水を採取し、抗ヒトＦＮモノク
ローナル抗体液を得た。
(2) 抗ヒトＦＮモノクローナル抗体の物性試験(1)で得
られたモノクローナル抗体液を常法に従い硫安塩析を行
い、ＤＥＡＥ−セルロースカラムクロマトグラフイーに
より、精製抗ヒトＦＮモノクローナル抗体を得た。更
に、常法に従いＳＤＳポリアクリルアミド電気泳動法に
より抗ヒトＦＮモノクローナル抗体の分子量を決定し、
等電点電気泳動法により抗ヒトＦＮモノクローナル抗体
の等電点を決定した。モノクローナル抗体のIgGサブク
ラスは、抗マウスIgGサブクラス抗血清（生化学工業）
を用いたＥＬＩＳＡ法により調べた。
られたモノクローナル抗体液を常法に従い硫安塩析を行
い、ＤＥＡＥ−セルロースカラムクロマトグラフイーに
より、精製抗ヒトＦＮモノクローナル抗体を得た。更
に、常法に従いＳＤＳポリアクリルアミド電気泳動法に
より抗ヒトＦＮモノクローナル抗体の分子量を決定し、
等電点電気泳動法により抗ヒトＦＮモノクローナル抗体
の等電点を決定した。モノクローナル抗体のIgGサブク
ラスは、抗マウスIgGサブクラス抗血清（生化学工業）
を用いたＥＬＩＳＡ法により調べた。
その結果を第２表に示す。
(3) 抗ヒトＦＮモノクローナル抗体の特異性試験 抗原として用いたヒト血漿ＦＮを室温下に、サーモリシ
ン処理（シグマ社）して、各々ヒト血漿ＦＮドメインを
得る〔ジヤーナル オブ バイロジカル ケミストリ
ー、第260巻、第５１０５〜５１１４頁（１９８
５）〕。
ン処理（シグマ社）して、各々ヒト血漿ＦＮドメインを
得る〔ジヤーナル オブ バイロジカル ケミストリ
ー、第260巻、第５１０５〜５１１４頁（１９８
５）〕。
上記、各ドメイン及び未処理ヒト血漿ＦＮをＳＤＳ−ポ
リアクリルアミド電気泳動に付す。更に、ウエスタン・
ブロツテイング法により、ニトロセルロース紙上に各ド
メインを吸着させた。そのうちの第１のニトロセルロー
スは、これは０．１％フアスト・グリーンにて染色し
た。そして、第２のニトロセルロースはＦＮ４、ＦＮ
９、ＦＮ１０又はＦＮ３０モノクローナル抗体とインキ
ユベートし、次いでパーオキシダーゼ標識ウサギ抗マウ
スIgG抗体（カツペル社）、続いて４−クロロ−１−ナ
フトール（和光純薬）溶液と反応させた〔「役に立つ免
疫実験法」参照：(株)講談社サイエンテイフイク発行、
１９８４年６月１日〕。ニトロセルロース紙上の発色部
分より、ＦＮ４、ＦＮ９、ＦＮ１０又はＦＮ３０モノク
ローナル抗体のサーモリシン処理ヒト血漿ＦＮに対する
結合特異性は下記第３表に示すとおりであつた。
リアクリルアミド電気泳動に付す。更に、ウエスタン・
ブロツテイング法により、ニトロセルロース紙上に各ド
メインを吸着させた。そのうちの第１のニトロセルロー
スは、これは０．１％フアスト・グリーンにて染色し
た。そして、第２のニトロセルロースはＦＮ４、ＦＮ
９、ＦＮ１０又はＦＮ３０モノクローナル抗体とインキ
ユベートし、次いでパーオキシダーゼ標識ウサギ抗マウ
スIgG抗体（カツペル社）、続いて４−クロロ−１−ナ
フトール（和光純薬）溶液と反応させた〔「役に立つ免
疫実験法」参照：(株)講談社サイエンテイフイク発行、
１９８４年６月１日〕。ニトロセルロース紙上の発色部
分より、ＦＮ４、ＦＮ９、ＦＮ１０又はＦＮ３０モノク
ローナル抗体のサーモリシン処理ヒト血漿ＦＮに対する
結合特異性は下記第３表に示すとおりであつた。
(4) 培養細胞のヒトＦＮへの結合阻害実験 ゼラチン被膜マイクロプレート（コーニング社）に、ヒ
ト血漿ＦＮ（コラボレーテイブ・リサーチ社）を１００
μｇ／mlの濃度で被膜し、生理食塩水でプレートを洗浄
することにより余剰のヒト血漿ＦＮを取除く。次いで、
上記プレートに各モノクローナル抗体（ＦＮ４、ＦＮ
９、ＦＮ１０又はＦＮ３０）を１０μｇ／mlの濃度で作
用させ、６時間インキユベートする。その後、生理食塩
水でプレートを洗浄することにより余剰のモノクローナ
ル抗体を取除く。それぞれのモノクローナル抗体を反応
させたプレート、及び抗体による処理をしていないプレ
ートを用意する。無血清ＤＭＥＭ培地（日水製薬）中に
ヘラ（HeLa）細胞、あるいは正常ヒト皮膚線維芽細胞を
懸濁し、十分に単細胞化させたのち、上記プレート上に
分散させ、インキユベートする。一定時間後、顕微鏡下
でそれぞれのプレート中の細胞の形態を観察することに
より、細胞の伸展接着が影響を受けているがどうかを判
定した。
ト血漿ＦＮ（コラボレーテイブ・リサーチ社）を１００
μｇ／mlの濃度で被膜し、生理食塩水でプレートを洗浄
することにより余剰のヒト血漿ＦＮを取除く。次いで、
上記プレートに各モノクローナル抗体（ＦＮ４、ＦＮ
９、ＦＮ１０又はＦＮ３０）を１０μｇ／mlの濃度で作
用させ、６時間インキユベートする。その後、生理食塩
水でプレートを洗浄することにより余剰のモノクローナ
ル抗体を取除く。それぞれのモノクローナル抗体を反応
させたプレート、及び抗体による処理をしていないプレ
ートを用意する。無血清ＤＭＥＭ培地（日水製薬）中に
ヘラ（HeLa）細胞、あるいは正常ヒト皮膚線維芽細胞を
懸濁し、十分に単細胞化させたのち、上記プレート上に
分散させ、インキユベートする。一定時間後、顕微鏡下
でそれぞれのプレート中の細胞の形態を観察することに
より、細胞の伸展接着が影響を受けているがどうかを判
定した。
その結果、上記すべてのモノクローナル抗体が正常ヒト
線維芽細胞の伸展接着を阻害しないこと、更にＦＮ３０
モノクローナル抗体のみが、ヘラ細胞の伸展接着を阻害
することを見出した。
線維芽細胞の伸展接着を阻害しないこと、更にＦＮ３０
モノクローナル抗体のみが、ヘラ細胞の伸展接着を阻害
することを見出した。
以上詳細に説明したように、本発明により結合ドメイン
が明らかな新規な抗ヒトＦＮモノクローナル抗体が提供
された。本発明のモノクローナル抗体は、ヘラ細胞の伸
展接着を阻害する。また、ヒトＦＮの生化学研究に非常
に有用である。
が明らかな新規な抗ヒトＦＮモノクローナル抗体が提供
された。本発明のモノクローナル抗体は、ヘラ細胞の伸
展接着を阻害する。また、ヒトＦＮの生化学研究に非常
に有用である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｖ 8310−2Ｊ 33/577 Ｂ 9015−2Ｊ (Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:91） (72)発明者 大林 晃 滋賀県大津市瀬田３丁目４番１号 寳酒造 株式会社中央研究所内 (56)参考文献 特開 昭59−33295（ＪＰ，Ａ) Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，260（８）, 5105−5114（1985) Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ, 72（１），145−156（1984) Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．，215（１），147 −152（1983) Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ ｉ．ＵＳＡ，80（５），1362−1366 （1983) ＥＭＢＯ Ｊ．１（８），929−934 （1982) Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，24（23）, 6685−6696（1985) Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，54（３），407 −418（1985)
Claims (1)
- 【請求項１】ヒト・フイブロネクチンで免疫した哺乳動
物の脾臓細胞と骨髄腫細胞との融合によつて産生される
ハイブリドーマより生産される、下記の性質を有するこ
とを特徴とする抗ヒト・フイブロネクチンモノクローナ
ル抗体ＦＮ３０。 a) 分子量：１５０，０００±５，０００ b) IgG サブクラス：IgG1 c) 等電点：５．５〜５．８ d) 抗原との結合部位： ヒト・フイブロネクチンをサーモリシンで開裂した分子
量１０５，０００のドメイン e) 生物活性： ヒト・フイブロネクチンと反応とすることにより、癌細
胞のヒト・フイブロネクチンへの結合を特異的に阻害す
る
Priority Applications (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP61308311A JPH0644877B2 (ja) | 1986-12-26 | 1986-12-26 | 抗ヒト・フイブロネクチンモノクロ−ナル抗体 |
| DE19873743402 DE3743402C2 (de) | 1986-12-26 | 1987-12-21 | Verfahren zur Krebsdiagnose beim Menschen |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP61308311A JPH0644877B2 (ja) | 1986-12-26 | 1986-12-26 | 抗ヒト・フイブロネクチンモノクロ−ナル抗体 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS63219393A JPS63219393A (ja) | 1988-09-13 |
| JPH0644877B2 true JPH0644877B2 (ja) | 1994-06-15 |
Family
ID=17979524
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP61308311A Expired - Fee Related JPH0644877B2 (ja) | 1986-12-26 | 1986-12-26 | 抗ヒト・フイブロネクチンモノクロ−ナル抗体 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0644877B2 (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP2236517A1 (en) | 2009-03-31 | 2010-10-06 | Takara Bio, Inc. | Anti-fibronectin fragment monoclonal antibody |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN117487012A (zh) * | 2019-08-13 | 2024-02-02 | 东北泰克诺亚奇股份有限公司 | 用于抑制纤维粘连蛋白与lilrb4的结合的抗lilrb4抗体或其衍生物 |
| MX2022007288A (es) | 2019-12-19 | 2022-07-12 | Ngm Biopharmaceuticals Inc | Agentes de union a ilt3 y metodos de uso de los mismos. |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS5933295A (ja) * | 1982-08-20 | 1984-02-23 | Otsuka Pharmaceut Co Ltd | 抗ヒトフイブロネクチン抗体 |
-
1986
- 1986-12-26 JP JP61308311A patent/JPH0644877B2/ja not_active Expired - Fee Related
Non-Patent Citations (7)
| Title |
|---|
| Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．，２１５（１），１４７−１５２（１９８３） |
| Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２４（２３），６６８５−６６９６（１９８５） |
| ＥＭＢＯＪ．１（８），９２９−９３４（１９８２） |
| Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，５４（３），４０７−４１８（１９８５） |
| Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６０（８），５１０５−５１１４（１９８５） |
| Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，７２（１），１４５−１５６（１９８４） |
| Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８０（５），１３６２−１３６６（１９８３） |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP2236517A1 (en) | 2009-03-31 | 2010-10-06 | Takara Bio, Inc. | Anti-fibronectin fragment monoclonal antibody |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS63219393A (ja) | 1988-09-13 |
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