JPH09235300A - ヒトｔｉｍｐ−３及び抗ヒトｔｉｍｐ−３モノクローナル抗体並びにその用途 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 ＴＩＭＰ−３をタンパク質レベルで特異的か
つ高感度に検出、定量できる簡便で、再現性、定量性に
優れた方法及び正常組織から安価、大量に可溶性組換え
及び天然型ヒトＴＩＭＰ−３を提供する。 【解決手段】 ヒトＴＩＭＰ−３またはヒトＴＩＭＰ−
３と実質的に同一の活性を有するタンパク質あるいはそ
の塩、該タンパク質をコードする遺伝子、該遺伝子を含
有するベクター、該ベクターを含有する形質転換体、該
タンパク質の製造及び精製方法、ＴＩＭＰ−３に特異的
に免疫反応するモノクローナル抗体、該モノクローナル
抗体の製造方法、並びにそれらの用途。特に可溶性タン
パク質として組換えタンパク質を得ることが可能とな
り、さらにヒトＴＩＭＰ−３の選択的な検出及び定量、
更には精製が該モノクローナル抗体により可能となる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、新規なヒトＴＩＭ
Ｐ−３またはヒトＴＩＭＰ−３と実質的に同一の活性を
有するタンパク質あるいはその塩、該タンパク質をコー
ドする遺伝子、該遺伝子を含有するベクター、該ベクタ
ーを含有する形質転換体、該タンパク質の製造方法、Ｔ
ＩＭＰ−３に特異的に免疫反応するモノクローナル抗
体、該モノクローナル抗体の製造方法、並びにそれらの
用途に関する。また、本発明は、ＴＩＭＰ−３に特異的
に免疫反応するモノクローナル抗体を用いての、ヒトＴ
ＩＭＰ−３の免疫学的測定方法、該測定のための試薬及
びヒトＴＩＭＰ−３の精製方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】

１．ＴＩＭＰｓについて ＴＩＭＰｓは、ＥＣＭ（Ｅｘｔｒａ ｃｅｌｌｕｌａｒ
ｍａｔｒｉｘ）代謝制御に関与するＭＭＰｓ（Ｍａｔ
ｒｉｘ ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅｓ）の活
性化阻害剤あるいは活性阻害剤としての機能を持つ分泌
性のタンパク質である。これらのＴＩＭＰｓは、互いに
遺伝子およびアミノ酸配列に相同性を持つファミリーを
形成しており、これまでに糖鎖修飾を受けた分子量２８
ｋＤａのＴＩＭＰ−１（Docherty et al., Nature, 31
8, 66-69 (1985)）、糖鎖修飾のない分子量２２ｋＤａ
のＴＩＭＰ−２（Stetler-Stevenson et al., J.Biol.C
hem., 264, 17374-17378 (1989) ）が知られている。

【０００３】２．ＴＩＭＰ−３発見の経緯 ラウス・ザルコーマ・ウイルス（Ｒｏｕｓ ｓａｒｃｏ
ｍａ ｖｉｒｕｓ）感染によるニワトリ胎仔線維芽細胞
の形質転換に伴ってニワトリ胎仔線維芽細胞が発現する
ＥＣＭ結合性で不溶性のタンパク質（分子量２１ｋＤ
ａ）の存在が知られていた（Blenis et al., Proc.Nat
l.Acad.Sci.USA, 80,770-774(1983), Blenis et al.,
J.Biol.Chem., 259, 11563-11570 (1984) ）。この分子
量２１ｋＤａのタンパク質のＮ末端側のアミノ酸配列に
ＴＩＭＰ−１、ＴＩＭＰ−２と相同性が認められ、さら
にＭＭＰｓの阻害活性が確認された（Staukus et al.,
J.Biol.Chem., 266, 449-454(1991)) 。このニワトリ由
来の２１ｋＤａタンパク質の遺伝子がクローニングさ
れ、遺伝子上でＴＩＭＰ−１、ＴＩＭＰ−２と相同性が
みいだされ「ＣｈＩＭＰ−３」と命名された（Pavloff
et al., J.Biol.Chem., 267, 17321-17326(1992)）。ま
た、ＣｈＩＭＰ−３の遺伝子と相同性を持つＴＩＭＰ−
１、ＴＩＭＰ−２以外の遺伝子がマウス（Leco et al.,
J.Biol.Chem., 269, 9352-9369 (1994), Apte et al.,
Develop.Dynam., 200, 177-197 (1994)）、およびヒト
（Apte et al., Genomics, 19, 86-90.(1994), Kishnan
i et al., Matrix Biol., 14, 479-488.(1994), Wilde
et al., DNA Cell Biol., 13, 711-718.(1994), Uria e
t al., Cancer Res., 54, 2092-2094.(1994), Silbiger
et al., Gene, 141, 293-297.(1994), Wick et al.,
J. Biol. Chem., 269, 18953-18960.(1994)）から相次
いでクローニングされＴＩＭＰ−３と呼ばれるに至っ
た。

【０００４】３．ＣｈＩＭＰ−３に関する知見 ＣｈＩＭＰ−３はニワトリ胎仔線維芽細胞のＥＣＭ成分
中に存在する２１ｋＤａの糖鎖修飾を受けていないタン
パク質で、リバース・ザイモグラフィーあるいはプロテ
アーゼ／サブストレート・ゲル電気泳動と呼ばれるＭＭ
Ｐ阻害活性に基づく分析方法で検出された。ＣｈＩＭＰ
−３はニワトリ胎仔線維芽細胞の培養上清には現れない
ことから不溶性とされている（Pavloff et al., J.Bio
l.Chem.,267, 17321-17326(1992)）。ＣｈＩＭＰ−３の
生理活性として、ＭＭＰｓ阻害活性の他にマウス肉腫ウ
イルスによって形質転換された細胞がＥＣＭから離脱す
るのを促進したり、その形態変化を引き起こすという活
性、あるいは、低血清下で増殖が抑制されている線維芽
細胞の増殖を促進するという活性などが報告されている
（Yang et al., Proc.Natl. Acad. Sci. USA, 89, 1067
6-10680 (1992)）。

【０００５】４．マウスＴＩＭＰ−３に関する知見 マウスの各組織におけるＴＩＭＰ−３の発現の様子がそ
れぞれの組織のｍＲＮＡについてノーザン・ブロッティ
ングで分析され、胸腺、心臓、肺、卵巣、子宮、腎臓、
筋肉、脳、骨で発現が認められた（Leco et al., J.Bio
l.Chem., 269,9352-9369 (1994)）との報告がある。別
の報告では、心臓、脳、脾臓、肺、腎臓、筋肉、睾丸で
発現が認められ、特に腎臓と肺で高く、肝臓と骨格筋で
発現は見られなかった（Apte et al., Develop.Dynam.,
200, 177-197 (1994)）とされている。また、マウス胎
児、新生児の各組織におけるＴＩＭＰ−３の発現の様子
がｍＲＮＡのｉｎ ｓｉｔｕ ハイブリダイゼーション
で分析され、発生の一時期に心筋、骨格筋、上皮、軟
骨、胎盤栄養膜などで発現することが示された（Apte e
tal., Develop.Dynam., 200, 177-197 (1994)）。ま
た、着床した受精胚の近傍の母系細胞でも発現が見られ
たと報告されている（Reponen et al., Develop.Dyna
m., 202, 388-396 (1995))。タンパク質レベルの知見と
して、以下の報告がなされている。マウスからクローニ
ングされたＴＩＭＰ−３遺伝子を導入したＣＯＳ−１細
胞のＥＣＭ画分に２４ｋＤａと２７ｋＤａのタンパク質
の発現がリバースザイモグラフィーあるいはプロテアー
ゼ／サブストレートゲル電気泳動で確認され、うち２４
ｋＤａのものが、ＴＩＭＰ−３と同定された。この組換
えマウスＴＩＭＰ−３はＣｈＩＭＰ−３と同様にＥＣＭ
に局在し、ＣＯＳ−１細胞の培養上清からは見い出され
ていない。また、マウスＣ３Ｈ１０Ｔ１／２線維芽細胞
の発現するＴＩＭＰ−３もまたＥＣＭに局在し、培養上
清には存在していなかった。ＣｈＩＭＰ−３に対するラ
ビット由来ポリクローナル抗体によるウエスタン・ブロ
ッティングでマウスＣ３Ｈ１０Ｔ１／２線維芽細胞のＥ
ＣＭに極在する２３−２４ｋＤａのタンパク質が、ＴＩ
ＭＰ−３と同定された（Leco et al., J.Biol.Chem., 2
69, 9352-9369 (1994)）。一方、マウスＴＩＭＰ−３を
コードする遺伝子によって可溶性組換えＴＩＭＰ−３の
発現が検討された（Apte et al., J.Biol.Chem., 270,
14313-14318 (1995)）。マウスＴＩＭＰ−３遺伝子はＥ
ＣＭを作らないＮＳＯマウスミエローマ細胞に導入さ
れ、形質転換細胞は２７ｋＤａの糖鎖修飾をうけたＴＩ
ＭＰ−３を培養上清に蓄積した。マウスＴＩＭＰ−３は
リバースザイモグラフィーあるいはプロテアーゼ／サブ
ストレート・ゲル電気泳動で検出された。

【０００６】５．ヒトＴＩＭＰ−３に関する知見 ヒト組織におけるＴＩＭＰ−３の発現の様子がそれぞれ
の組織から調製したｍＲＮＡについてのノーザン・ブロ
ッティングで分析されている。たとえば胎盤で高く、心
臓、腎臓、肺、肝臓、すい臓、骨格筋で中程度の、脳で
はわずかな発現が確認されたもの（Apte et al., Genom
ics, 19, 86-90.(1994) ）、肝臓と卵巣で発現がなく、
胎盤、子宮および乳癌で発現が確認されたもの（Uria e
t al., Cancer Res., 54, 2092-2094.(1994)）、成人の
脾臓、前立腺、卵巣、小腸、心臓、胎盤、肺、腎臓で高
く、結腸、末梢血白血球(periherial blood leukocyt
e)、脳、肝臓、膵臓で低く発現、胎児の組織では心臓、
肝臓で特徴的に高かった（Wilde et al., DNA Cell Bio
l., 13, 711-718.(1994)）とするものなどが報告されて
いる。ヒト組織におけるＴＩＭＰ−３の発現の様子をｍ
ＲＮＡのｉｎ ｓｉｔｕ ハイブリダイゼーションで分
析したものとして、乳癌組織では癌細胞に近接した線維
芽細胞に、そして胎盤の子宮内膜脱落細胞に強い発現が
見られたとの報告がある（Byrne et al., Mol.Med., 1,
418-427. (1995)）。ヒト培養細胞におけるＴＩＭＰ−
３の発現の様子をそれぞれの培養細胞のｍＲＮＡについ
てノーザン・ブロッティングで分析したものとして、Ｗ
Ｉ−３８、ＨＬ−６０（Wick et al., J. Biol. Chem.,
269, 18953-18960.(1994)）、Ｈｓ２９４Ｔ、Ｈｓ５７
８Ｔ、Ｈｓ６８、ＷＩ−３８、ＭＤＡ−ＭＢ−３２１、
ＣａＯＶ−３、ＨｅｐＧ２、ＳＫ−Ｈｅｐ−１（Silbig
er et al., Gene 141, 293-297.(1994))で発現が見られ
たとの報告がある。

【０００７】タンパク質レベルの知見として、以下の報
告がなされている。培養細胞の発現するヒトＴＩＭＰ−
３をリバース・ザイモグラフィーあるいはプロテアーゼ
／サブストレート・ゲル電気泳動で検索の結果、２９３
・ＳＫ−Ｎ−ＳＨ、ＦＨｓ１７３Ｗｅ、ＨｅＬａｓ３、
Ｃａｃｏ−２、ＨＣＴ−８、ＳＷ６８４、Ｈｓ９１３
Ｔ、ＧＦ１１、１２９２などの培養細胞株で発現が観察
されたが、いずれも培養上清からは検出されなかった
（Kishnani et al., Matrix Biol., 14, 479-488.(199
4) ）。また、ＣｈＩＭＰ−３のＮ末端側配列を模して
合成されたＣＶＰＩＨＰＱＤＡＦＣの配列をもつペプチ
ドを免疫源として得られたラビット由来ポリクローナル
抗体が、ウエスタン・ブロッティングでニワトリ胎仔線
維芽細胞のＥＣＭ成分中に存在する２１ｋＤａのＣｈＩ
ＭＰ−３およびやや分子量の大きいＣｈＩＭＰ−ａ、ヒ
ト培養細胞ＦＨｓ１７３ＷｅのＥＣＭのＴＩＭＰ−３
（糖鎖非修飾の２４．７ｋＤａ）に反応した（Kishnani
et al., Matrix Biol., 14, 479-488.(1994) ）との報
告がある。マウスＴＩＭＰ−３遺伝子の５’側の非翻訳
領域からマウスＴＩＭＰ−３の３９番目のＴをコードす
る遺伝子とヒトＴＩＭＰ−３の３９番目のＴ以降の３’
側をコードするヒトＴＩＭＰ−３遺伝子を共通の制限酵
素ＡｃｃＩの切断部位でつないだマウス−ヒトキメラ遺
伝子によって組換えＴＩＭＰ−３の発現が検討された
（Apte et al., J.Biol.Chem., 270, 14313-14318 (199
5)）。この遺伝子はＥＣＭを作らないＮＳＯマウスミエ
ローマ細胞に導入され、形質転換細胞は２７ｋＤａの糖
鎖修飾をうけたＴＩＭＰ−３を培養上清に蓄積した。臨
床例との関連においては遺伝性の色素性網膜炎の光受容
体でＴＩＭＰ−３のｍＲＮＡの発現が昂進（Jones et a
l., FEBS letter, 352, 171-174 (1995); Jomary et a
l., J.Neurochem., 64, 2370-2373 (1995) ）している
ことが報告されている。以上のように、現在までのヒト
ＴＩＭＰ−３に関する知見は、そのｍＲＮＡを発現する
組織や細胞の検索、ポリクローナル抗体による定性的な
検出、特殊な宿主による組換え体の発現、網膜関連の疾
患との関与などに限られている。

【０００８】

【発明が解決しようとする課題】

１．ＴＩＭＰ−３の検出方法 ＴＩＭＰｓの検出にはＴＩＭＰｓをコードするｍＲＮＡ
の発現をこれに相同性を持つＤＮＡあるはＲＮＡプロー
ブを用いてハイブリダイゼーションによって行う方法が
ある。たとえばＴＩＭＰ−３の検出には、（１）検体と
なる組織や細胞から抽出したｍＲＮＡを電気泳動し、適
当な膜に転写、固定したものにＴＩＭＰ−３特異的な核
酸プローブをハイブリダイズさせるノーザン・ハイブリ
ダイゼーション、（２）検体となる組織のｃＤＮＡライ
ブラリーを電気泳動し、適当な膜に転写、固定したもの
にＴＩＭＰ−３特異的な核酸プローブをハイブリダイズ
させるサザン・ハイブリダイゼーション、（３）検体と
なる組織や細胞を適当な方法でそのままガラスあるいは
プラスチック板などに固定し、ＴＩＭＰ−３特異的な核
酸プローブをハイブリダイズさせるｉｎ ｓｉｔｕ ハ
イブリダイゼーションなどが汎用されている。これらの
方法を用いると、ＴＩＭＰ−３の発現する組織や細胞を
検索することができるが、いずれの方法も簡便性はな
く、再現性、定量性に乏しい。またＴＩＭＰｓの検出に
はＴＩＭＰｓのＭＭＰｓ阻害活性を指標にした方法があ
る。リバース・ザイモグラフィーあるいはプロテアーゼ
／サブストレート・ゲル電気泳動と呼ばれる方法はＭＭ
Ｐｓの基質となるゼラチン、カゼインあるいはコラーゲ
ンを含んだポリアクリルアミド・ゲル上で検体を電気泳
動させた後、活性型ＭＭＰｓを含む緩衝液中でゲルをイ
ンキュベートし、ゲル中のＭＭＰｓの基質を消化させ、
ＣＢＢで染色するものである。検体中のＴＩＭＰｓは、
活性型ＭＭＰｓと複合体を形成しＭＭＰｓの活性を阻害
するので、ＴＩＭＰｓが電気泳動された場所の基質は消
化されないため、ＣＢＢのタンパク質染色によってＴＩ
ＭＰｓの存在を検出できる。リバース・ザイモグラフィ
ーあるいはプロテアーゼ／サブストレート・ゲル電気泳
動には、ＭＭＰｓの基質およびＭＭＰｓを予め含んだポ
リアクリルアミド・ゲルで検体を電気泳動する方法など
もある。これらの方法はＭＭＰｓ阻害活性を持つタンパ
ク質の検索に有用で分子量によって阻害因子を識別でき
る。ところがこの分析方法には大量の活性型ＭＭＰｓが
必要であるうえ、簡便性はなく、定量性も期待できな
い。

【０００９】この他にＴＩＭＰｓのＭＭＰｓ阻害活性を
指標にしたＴＩＭＰｓの検出方法としてＲＩあるいは蛍
光物質で標識したゼラチン、カゼインあるいはコラーゲ
ンを基質として用い、分解された標識基質を検出する方
法がある。この方法では、ＴＩＭＰｓの阻害活性を一定
量のＭＭＰｓの標識基質分解活性を５０％阻害するＴＩ
ＭＰｓ濃度として数値化することができるが、検体中の
ＴＩＭＰ−１、ＴＩＭＰ−２およびＴＩＭＰ−３の識別
はできない。また、検体にＭＭＰｓ以外の基質分解物質
やＴＩＭＰｓ以外のＭＭＰｓ阻害因子が混入している場
合、分析は困難になる。ＴＩＭＰ−３の特異的な検出方
法としては抗ＴＩＭＰ−３抗体を用いたウエスタン・ブ
ロッティングがある。抗体の調製に用いる免疫源として
は精製したＣｈＩＭＰ−３（Leco et al., J.Biol.Che
m. 269, 9352-9369 (1994) ）あるいはＣｈＩＭＰ−３
のアミノ酸配列を模した合成ペプチド（Kishnani et a
l., MatrixBiol. 14, 479-488.(1994)）がある。これら
はいずれもポリクローナル抗体で、調製が容易である一
方、ロット毎に特異性や親和性が一定せず実用において
モノクローナル抗体に劣る場合がある。また、ＴＩＭＰ
ｓのように互いに似通った構造、ペプチド配列を持つフ
ァミリーを形成する抗原の場合、交差反応を除去するた
めに吸収操作が必要である。以上の様に、ＴＩＭＰ−３
をタンパク質レベルで特異的かつ高感度に検出、定量で
きる簡便な方法はなく、ＴＩＭＰ−３が関与する各種疾
患の研究および診断に有効な手段は得られていない。

【００１０】２. ヒトＴＩＭＰ−３ ＴＩＭＰ−１およびＴＩＭＰ−２は活性型ＭＭＰｓと複
合体を形成し、その活性を阻害する機能とプロＭＭＰｓ
と複合体を形成し、ＭＭＰｓの活性化を阻害する機能が
あることが知られている。ＭＭＰｓとＴＩＭＰｓは様々
な生理状態、例えば排卵、胎生発生と分化、血管新生、
トロホブラスト浸潤、子宮内膜、分娩、骨の形成と改
造、創傷治癒、器官形成、退縮、加齢などの場面で精緻
な発現および活性化の制御がなされている。正常な生理
状態においてＭＭＰｓとＴＩＭＰｓはある適正なバラン
スをもって存在しており、そのバランスの崩れが様々な
疾患をもたらしていることが知られている。たとえば癌
細胞における基底膜浸潤活性の上昇による浸潤転移の促
進、慢性関節リウマチや歯周疾患などの炎症における組
織破壊、慢性（難治性）の皮膚潰瘍、角膜潰瘍、熱傷潰
瘍、皮膚水泡性疾患にみられる組織破壊などはその例と
されている。現在のところ、ヒトＴＩＭＰ−３に関して
はこれらの知見は得られていないが、各種の疾患治癒に
対応し得る医薬品組成物としてヒトＴＩＭＰ−３を大量
にかつ簡単に得ることは重要である。また天然型ヒトＴ
ＩＭＰ−３は癌培養細胞のＥＣＭから検出された報告は
あるが、正常組織から安価、大量に精製する方法は報告
されていない。また、医薬品組成物としての天然型ヒト
ＴＩＭＰ−３は可溶性であることが望ましい。

【００１１】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、ヒトＴＩ
ＭＰ−３を大量にかつ簡単に得ることができれば、上記
した課題を解決するのに役立つとともに、こうしたヒト
ＴＩＭＰ−３を利用することによりヒトＴＩＭＰ−３に
特異的に免疫反応するモノクローナル抗体を取得してＴ
ＩＭＰ−３の検出・測定を簡単に行えると考えて鋭意研
究の結果、本発明を完成した。本発明は、新規なヒトＴ
ＩＭＰ−３またはヒトＴＩＭＰ−３と実質的に同一の活
性を有するタンパク質あるいはその塩、該タンパク質を
コードする遺伝子、該遺伝子を含有するベクター、該ベ
クターを含有する形質転換体、該タンパク質の製造方
法、ＴＩＭＰ−３に特異的に免疫反応するモノクローナ
ル抗体、該モノクローナル抗体の製造方法、並びにそれ
らの用途に関する。また、本発明は、ＴＩＭＰ−３に特
異的に免疫反応するモノクローナル抗体を用いての、ヒ
トＴＩＭＰ−３の免疫学的測定方法、該測定のための試
薬及びヒトＴＩＭＰ−３の精製方法に関する。

【００１２】すなわち、本発明は （１）ＴＩＭＰ−３に特異的に免疫反応するモノクロー
ナル抗体（なお、本抗体としては通常の抗体のほかに、
その抗体の結合部位を含む断片であってよい、以下同
様）、 （２）８個から１９個のアミノ酸からなるＴＩＭＰ−３
に特有なアミノ酸配列で親水性を示すアミノ酸配列を特
異的に認識し、ヒトＴＩＭＰ−３と免疫反応することを
特徴とする上記（１）記載のモノクロナール抗体、 （３）ヒトＴＩＭＰ−３のＫＫＬＶＫＥＧＰＦＧＴＬＶ
ＹＴ（Ｒ２６−４０）のアミノ酸配列又はその一部を含
む領域を特異的に認識し、ヒトＴＩＭＰ−３と免疫反応
することを特徴とする上記（１）記載のモノクローナル
抗体、 （４）ヒトＴＩＭＰ−３のＹＲＧＦＴＫＭＰＨＶＱＹＩ
ＨＴＥＡＳ（Ｒ４７−６４）のアミノ酸配列又はその一
部を含む領域を特異的に認識し、ヒトＴＩＭＰ−３と免
疫反応することを特徴とする上記（１）記載のモノクロ
ーナル抗体、 （５）ヒトＴＩＭＰ−３のＳＷＹＲＧＷＡＰＰＤＫＳＩ
ＩＮＡＴＤＰ（Ｒ１７０−１８８）のアミノ酸配列又は
その一部を含む領域を特異的に認識し、ヒトＴＩＭＰ−
３と免疫反応することを特徴とする上記（１）記載のモ
ノクローナル抗体、

【００１３】（６）ヒトＴＩＭＰ−３のうちアミノ酸に
糖鎖の付加のない分子種と特異的に免疫反応することを
特徴とする上記（１）記載のモノクローナル抗体、 （７）ヒトＴＩＭＰ−３のうちアミノ酸に糖鎖の付加の
ある分子種と特異的に免疫反応することを特徴とする上
記（１）記載のモノクローナル抗体、 （８）ヒトＴＩＭＰ−３のうちアミノ酸に糖鎖の付加の
ない分子種と糖鎖の付加のある分子種を共通して認識
し、両分子種と免疫反応することを特徴とする上記
（１）記載のモノクローナル抗体、 （９）ヒトＴＩＭＰ−３関連ポリペプチドで免疫したマ
ウスの抗体生産細胞とマウスミエローマ細胞との融合に
より得られたハイブリドーマを培養し、得られた培養上
清またはマウス腹水中からモノクローナル抗体を得るこ
とを特徴とするＴＩＭＰ−３に特異的に免疫反応するモ
ノクローナル抗体の製造法、 （１０）ヒトＴＩＭＰ−３に特異的に免疫反応するモノ
クロナール抗体を含むことを特徴とするヒトＴＩＭＰ−
３の免疫学的測定用試薬（なお、本抗体としては通常の
抗体のほかに、その抗体の結合部位を含む断片であって
よい、以下同様）、 （１１）ヒトＴＩＭＰ−３に特異的に免疫反応するモノ
クローナル抗体を測定試薬として用いることを特徴とす
るヒトＴＩＭＰ−３の免疫学的測定方法、 （１２）実質的に異なる２つのヒトＴＩＭＰ−３の抗原
決定基に対し、それぞれ特異的に結合するモノクローナ
ル抗体の少なくとも２種を組み合わせて測定試薬として
用いることを特徴とする上記（１１）記載の方法、

【００１４】（１３）測定試薬として（ｉ）ヒトＴＩＭ
Ｐ−３のＫＫＬＶＫＥＧＰＦＧＴＬＶＹＴ（Ｒ２６−４
０）のアミノ酸配列又はその一部を含む領域を特異的に
認識し、ヒトＴＩＭＰ−３と免疫反応するモノクローナ
ル抗体および（ｉｉ）ヒトＴＩＭＰ−３のＳＷＹＲＧＷ
ＡＰＰＤＫＳＩＩＮＡＴＤＰ（Ｒ１７０−１８８）のア
ミノ酸配列又はその一部を含む領域を特異的に認識し、
ヒトＴＩＭＰ−３と免疫反応するモノクローナル抗体を
少なくとも用いることを特徴とする上記（１１）記載の
方法、 （１４）測定試薬としてヒトＴＩＭＰ−３のうちアミノ
酸に糖鎖の付加のない分子種と特異的に免疫反応するこ
とを特徴とする上記（６）記載のモノクローナル抗体を
用い、アミノ酸に糖鎖の付加のないヒトＴＩＭＰ−３を
特異的に測定することを特徴とする上記（１１）記載の
方法、 （１５）測定試薬としてヒトＴＩＭＰ−３のうちアミノ
酸に糖鎖の付加のある分子種と特異的に免疫反応するこ
とを特徴とする上記（７）記載のモノクローナル抗体を
用い、アミノ酸に糖鎖の付加のあるヒトＴＩＭＰ−３を
特異的に測定することを特徴とする上記（１１）記載の
方法、 （１６）測定試薬としてヒトＴＩＭＰ−３のうちアミノ
酸に糖鎖の付加のない分子種と糖鎖の付加のある分子種
と免疫反応することを特徴とする上記（８）記載のモノ
クローナル抗体を用い、ヒトＴＩＭＰ−３を測定するこ
とを特徴とする上記（１１）記載の方法、 （１７）測定試薬として（ｉ）ヒトＴＩＭＰ−３のうち
アミノ酸に糖鎖の付加のない分子種と免疫反応すること
を特徴とする上記（６）記載のモノクローナル抗体およ
び（ｉｉ）ヒトＴＩＭＰ−３のうちアミノ酸に糖鎖の付
加のある分子種と免疫反応することを特徴とする上記
（７）記載のモノクローナル抗体の混合物を用い、ヒト
ＴＩＭＰ−３を測定することを特徴とする上記（１１）
記載の方法、

【００１５】（１８）ヒトＴＩＭＰ−３またはヒトＴＩ
ＭＰ−３と実質的に同一の活性を有するタンパク質、あ
るいはその塩、 （１９）ヒトＴＩＭＰ−３がヒト胎盤に由来するもので
ある上記（１１）記載のタンパク質、 （２０）ヒト胎盤に由来すると共に可溶性のタンパク質
であることを特徴とする上記（１８）記載のタンパク
質、 （２１）蛋白質中のアミノ酸に糖鎖の付加のない分子種
のものであることを特徴とする上記（１９）記載のタン
パク質、 （２２）蛋白質中のアミノ酸に糖鎖の付加のある分子種
のものであることを特徴とする上記（１９）記載のタン
パク質、 （２３）蛋白質中のアミノ酸に糖鎖の付加のない分子種
と蛋白質中のアミノ酸に糖鎖の付加のある分子種との混
合物であることを特徴とする上記（１９）記載のタンパ
ク質、 （２４）ＴＩＭＰ−３またはＴＩＭＰ−３と実質的に同
一の活性を有する可溶性タンパク質をコードする遺伝
子、 （２５）ＴＩＭＰ−３またはＴＩＭＰ−３と実質的に同
一の活性を有するタンパク質をコードする遺伝子を含有
し且つヒトＴＩＭＰ−１の分泌シグナルをコードする遺
伝子とＴＩＭＰ−３の成熟タンパク質をコードする遺伝
子とが連結されていることを特徴とする可溶性タンパク
質をコードする遺伝子、 （２６）上記（２４）または（２５）記載の遺伝子を含
有することを特徴とするベクター、 （２７）上記（２６）記載のベクターを含有することを
特徴とする形質転換体

【００１６】（２８）宿主細胞が大腸菌、酵母、ＣＨＯ
細胞及びＣＯＳ細胞からなる群から選ばれたものである
ことを特徴とする上記（２７）記載の形質転換体、 （２９）上記（２７）記載の形質転換体を培養し、可溶
性の分泌タンパク質としてＴＩＭＰ−３またはＴＩＭＰ
−３と実質的に同一の活性を有するタンパク質を発現さ
せることを特徴とする組換えタンパク質の製造方法、 （３０）ヒトＴＩＭＰ−３と免疫反応するモノクローナ
ル抗体を用いることを特徴とするヒトＴＩＭＰ−３の精
製方法、 （３１）ヒトＴＩＭＰ−３と免疫反応するモノクローナ
ル抗体結合アフィニティーゲルを用い、該ヒトＴＩＭＰ
−３と免疫反応するモノクローナル抗体がヒトＴＩＭＰ
−３のＹＲＧＦＴＫＭＰＨＶＱＹＩＨＴＥＡＳ（Ｒ４７
−６４）のアミノ酸配列又はその一部を含む領域を特異
的に認識するものであることを特徴とする上記（３０）
記載のヒトＴＩＭＰ−３の精製方法、及び （３２）ヒトＴＩＭＰ−３と免疫反応するモノクローナ
ル抗体結合アフィニティーゲルを用い、該ヒトＴＩＭＰ
−３と免疫反応するモノクローナル抗体がヒトＴＩＭＰ
−３のＳＷＹＲＧＷＡＰＰＤＫＳＩＩＮＡＴＤＰ（Ｒ１
７０−１８８）のアミノ酸配列又はその一部を含む領域
を特異的に認識するものであることを特徴とする上記
（３０）記載のヒトＴＩＭＰ−３の精製方法を提供す
る。

【００１７】より具体的には、本発明は （３３）ヒトＴＩＭＰ−３関連ポリペプチドで免疫した
マウスの抗体生産細胞とマウスミエローマ細胞との融合
により得られたハイブリドーマを培養し、得られた培養
上清またはマウス腹水中から得られたことを特徴とする
ＴＩＭＰ−３に特異的に免疫反応するモノクローナル抗
体、 （３４）ヒトＴＩＭＰ−３のＫＫＬＶＫＥＧＰＦＧＴＬ
ＶＹＴ（Ｒ２６−４０）のアミノ酸配列又はその一部を
含む領域、ヒトＴＩＭＰ−３のＹＲＧＦＴＫＭＰＨＶＱ
ＹＩＨＴＥＡＳ（Ｒ４７−６４）のアミノ酸配列又はそ
の一部を含む領域及びヒトＴＩＭＰ−３のＳＷＹＲＧＷ
ＡＰＰＤＫＳＩＩＮＡＴＤＰ（Ｒ１７０−１８８）のア
ミノ酸配列又はその一部を含む領域からなる群から選ば
れたヒトＴＩＭＰ−３関連ポリペプチドで免疫したマウ
スの抗体生産細胞をマウスミエローマ細胞と融合せしめ
て得られたハイブリドーマ由来のものであることを特徴
とする上記（３３）記載のモノクローナル抗体、 （３５）８個から１９個のアミノ酸からなるＴＩＭＰ−
３に特有なアミノ酸配列で親水性を示すアミノ酸配列を
特異的に認識し、ヒトＴＩＭＰ−３と免疫反応するモノ
クロナール抗体を含むことを特徴とする上記（１０）記
載のヒトＴＩＭＰ−３の免疫学的測定用試薬、 （３６）ヒトＴＩＭＰ−３のＫＫＬＶＫＥＧＰＦＧＴＬ
ＶＹＴ（Ｒ２６−４０）のアミノ酸配列又はその一部を
含む領域を特異的に認識し、ヒトＴＩＭＰ−３と免疫反
応するモノクロナール抗体を含むことを特徴とする上記
（１０）記載のヒトＴＩＭＰ−３の免疫学的測定用試
薬、 （３７）ヒトＴＩＭＰ−３のＹＲＧＦＴＫＭＰＨＶＱＹ
ＩＨＴＥＡＳ（Ｒ４７−６４）のアミノ酸配列又はその
一部を含む領域を特異的に認識し、ヒトＴＩＭＰ−３と
免疫反応するモノクロナール抗体を含むことを特徴とす
る上記（１０）記載のヒトＴＩＭＰ−３の免疫学的測定
用試薬、

【００１８】（３８）ヒトＴＩＭＰ−３のＳＷＹＲＧＷ
ＡＰＰＤＫＳＩＩＮＡＴＤＰ（Ｒ１７０−１８８）のア
ミノ酸配列又はその一部を含む領域を特異的に認識し、
ヒトＴＩＭＰ−３と免疫反応するモノクロナール抗体を
含むことを特徴とする上記（１０）記載のヒトＴＩＭＰ
−３の免疫学的測定用試薬、 （３９）ヒトＴＩＭＰ−３に特異的な標識されたモノク
ロナール抗体を含むことを特徴とするヒトＴＩＭＰ−３
の免疫学的測定用試薬、 （４０）ヒトＴＩＭＰ−３に特異的な酵素標識モノクロ
ナール抗体を含むことを特徴とする上記（３９）記載の
ヒトＴＩＭＰ−３の免疫学的測定用試薬、 （４１）ヒトＴＩＭＰ−３に特異的な固相化モノクロナ
ール抗体を含むことを特徴とするヒトＴＩＭＰ−３の免
疫学的測定用試薬、 （４２）対象抗原としてヒトＴＩＭＰ−３を含有する疑
いのある被検試料に第一の抗体と第二の抗体を接触させ
ることによる前記対象抗原と前記第一の抗体と前記第二
の抗体とからなる複合体を形成させる工程を含む免疫学
的測定方法において、前記第一の抗体と前記第二の抗体
のいずれか一方として、ＴＩＭＰ−３に特異的に免疫反
応するモノクローナル抗体を用いることを特徴とする方
法、 （４３）前記被検試料を、当該被検試料中の対象抗原で
あるヒトＴＩＭＰ−３に特異的に免疫反応する固相担体
に結合している第一のモノクローナル抗体及び標識され
ている第二の抗体とに接触させ、当該第一の抗体と当該
第二の抗体との複合体を形成させ、当該複合体における
標識抗体又は未反応標識抗体のいずれかを測定すること
を特徴とする上記（４２）記載の方法、

【００１９】（４４）前記第一の抗体として、ヒトＴＩ
ＭＰ−３のＫＫＬＶＫＥＧＰＦＧＴＬＶＹＴ（Ｒ２６−
４０）のアミノ酸配列又はその一部を含む領域からなる
ヒトＴＩＭＰ−３関連ポリペプチドで免疫したマウスの
抗体生産細胞をマウスミエローマ細胞と融合せしめて得
られたハイブリドーマ由来のものを用い、前記第二の抗
体としてヒトＴＩＭＰ−３のＹＲＧＦＴＫＭＰＨＶＱＹ
ＩＨＴＥＡＳ（Ｒ４７−６４）のアミノ酸配列又はその
一部を含む領域及びヒトＴＩＭＰ−３のＳＷＹＲＧＷＡ
ＰＰＤＫＳＩＩＮＡＴＤＰ（Ｒ１７０−１８８）のアミ
ノ酸配列又はその一部を含む領域からなる群から選ばれ
たヒトＴＩＭＰ−３関連ポリペプチドで免疫したマウス
の抗体生産細胞をマウスミエローマ細胞と融合せしめて
得られたハイブリドーマ由来のものを用いることを特徴
とする上記（４２）又は（４３）記載の方法、 （４５）前記第一の抗体として、ヒトＴＩＭＰ−３のＳ
ＷＹＲＧＷＡＰＰＤＫＳＩＩＮＡＴＤＰ（Ｒ１７０−１
８８）のアミノ酸配列又はその一部を含む領域からなる
ヒトＴＩＭＰ−３関連ポリペプチドで免疫したマウスの
抗体生産細胞をマウスミエローマ細胞と融合せしめて得
られたハイブリドーマ由来のものを用い、前記第二の抗
体としてヒトＴＩＭＰ−３のＫＫＬＶＫＥＧＰＦＧＴＬ
ＶＹＴ（Ｒ２６−４０）のアミノ酸配列又はその一部を
含む領域及びヒトＴＩＭＰ−３のＹＲＧＦＴＫＭＰＨＶ
ＱＹＩＨＴＥＡＳ（Ｒ４７−６４）のアミノ酸配列又は
その一部を含む領域からなる群から選ばれたヒトＴＩＭ
Ｐ−３関連ポリペプチドで免疫したマウスの抗体生産細
胞をマウスミエローマ細胞と融合せしめて得られたハイ
ブリドーマ由来のものを用いることを特徴とする上記
（４２）又は（４３）記載の方法、

【００２０】（４６）ヒト胎盤に由来する天然型ヒトＴ
ＩＭＰ−３または該天然型ヒトＴＩＭＰ−３と実質的に
同一の活性を有するタンパク質あるいはその塩である上
記（１８）記載のタンパク質、 （４７）ＴＩＭＰ−３またはＴＩＭＰ−３と実質的に同
一の活性を有するタンパク質をコードする遺伝子を含有
し且つヒトＴＩＭＰ−１の分泌シグナルをコードする遺
伝子とＴＩＭＰ−３の成熟タンパク質をコードする遺伝
子とが連結されておりそして可溶性の分泌タンパク質と
してＴＩＭＰ−３またはＴＩＭＰ−３と実質的に同一の
活性を有するタンパク質を発現させることができること
を特徴とする上記（２６）記載のベクター、 （４８）上記（４７）記載のベクターで形質転換された
形質転換体、 （４９）ｐＵＲＨＴ３で形質転換された上記（４８）記
載の形質転換体、 （５０）ｐＳＧＨＴ３で形質転換された上記（４８）記
載の形質転換体、 （５１）ｐＣＭＶＨＴ３で形質転換された上記（４８）
記載の形質転換体、 （５２）ＴＩＭＰ−３またはＴＩＭＰ−３と実質的に同
一の活性を有するタンパク質をコードする遺伝子を含有
し且つヒトＴＩＭＰ−１の分泌シグナルをコードする遺
伝子とＴＩＭＰ−３の成熟タンパク質をコードする遺伝
子とが連結した遺伝子で、大腸菌、酵母、ＣＨＯ細胞及
びＣＯＳ細胞からなる群から選ばれた宿主細胞を形質転
換させて、得られた形質転換体細胞を培養し、可溶性の
分泌タンパク質としてＴＩＭＰ−３またはＴＩＭＰ−３
と実質的に同一の活性を有するタンパク質を発現させる
ことを特徴とする組換えタンパク質の製造方法、 （５３）ｐＥＸＨＴ３又はｐＵＲＨＴ３で形質転換され
た形質転換体を培養し、可溶性の分泌タンパク質として
ＴＩＭＰ−３またはＴＩＭＰ−３と実質的に同一の活性
を有するタンパク質を発現させることを特徴とする上記
（５２）記載の組換えタンパク質の製造方法、

【００２１】（５４）ｐＳＧＨＴ３で形質転換された形
質転換体を培養し、可溶性の分泌タンパク質としてＴＩ
ＭＰ−３またはＴＩＭＰ−３と実質的に同一の活性を有
するタンパク質を発現させることを特徴とする上記（５
２）記載の組換えタンパク質の製造方法、 （５５）ｐＣＭＶＨＴ３で形質転換された形質転換体を
培養し、可溶性の分泌タンパク質としてＴＩＭＰ−３ま
たはＴＩＭＰ−３と実質的に同一の活性を有するタンパ
ク質を発現させることを特徴とする上記（５２）記載の
組換えタンパク質の製造方法、 （５６）上記（２９）及び（５２）〜（５５）のいずれ
か一記載の方法で得られた組換えヒトＴＩＭＰ−３また
はヒトＴＩＭＰ−３と実質的に同一の活性を有する組換
えタンパク質、あるいはその塩、 （５７）ヒト細胞あるいはヒト組織由来のＥＣＭを尿素
処理して可溶化し、次に得られた可溶画分を精製処理す
ることを特徴とするヒトＴＩＭＰ−３の精製方法、 （５８）ヒト細胞あるいはヒト組織由来の可溶化ヒトＴ
ＩＭＰ−３をイオン交換、ゲルろ過、色素およびヒトＴ
ＩＭＰ−３と免疫反応するモノクローナル抗体をリガン
ドとしたアフィニティーゲルクロマトグラフィーから成
る群から選ばれた精製処理の少なくとも一つにかけるこ
とを特徴とするヒトＴＩＭＰ−３の精製方法、 （５９）上記（２９）及び（５２）〜（５５）のいずれ
か一記載の方法で得られた組換えヒトＴＩＭＰ−３また
はヒトＴＩＭＰ−３と実質的に同一の活性を有する組換
えタンパク質あるいはその塩を含有する画分をイオン交
換、ゲルろ過、色素およびヒトＴＩＭＰ−３と免疫反応
するモノクローナル抗体をリガンドとしたアフィニティ
ーゲルクロマトグラフィーから成る群から選ばれた精製
処理の少なくとも一つにかけることを特徴とする組換え
ヒトＴＩＭＰ−３の精製方法、

【００２２】（６０）上記（３０）〜（３２）及び（５
７）〜（５９）のいずれか一記載の方法で得られたヒト
ＴＩＭＰ−３またはヒトＴＩＭＰ−３と実質的に同一の
活性を有する精製タンパク質、あるいはその塩、 （６１）ヒトｃＤＮＡライブラリーより配列番号：４で
表される塩基配列を含有するプライマー及び配列番号：
５で表される塩基配列を含有するプライマーを用いてポ
リメラーゼ・チェーン・リアクション（ＰＣＲ）により
増幅され且つＴＩＭＰ−３またはＴＩＭＰ−３と実質的
に同一の活性を有する可溶性タンパク質をコードするＤ
ＮＡ、 （６２）（ｉ）上記（６１）記載のＤＮＡあるいは該Ｄ
ＮＡと実質的に同一の機能を有するＤＮＡと、（ｉｉ）
ヒトＴＩＭＰ−１をコードするＤＮＡを含有するベクタ
ーより配列番号：６で表される塩基配列を含有するプラ
イマー及び配列番号：７で表される塩基配列を含有する
プライマーを用いてポリメラーゼ・チェーン・リアクシ
ョン（ＰＣＲ）により増幅され且つヒトＴＩＭＰ−１分
泌シグナルをコードするＤＮＡあるいは該ＤＮＡと実質
的に同一の機能を有するＤＮＡとを含有していることを
特徴とするＴＩＭＰ−３またはＴＩＭＰ−３と実質的に
同一の活性を有する可溶性タンパク質をコードしている
ＤＮＡ、 （６３）上記（１８）〜（２３）、（４６）、（５６）
及び（６０）のいずれか一記載のタンパク質、あるいは
その塩を含有する医薬組成物、 （６４）ＭＭＰｓの活性化阻害剤あるいは活性阻害剤と
して用いるものであることを特徴とする上記（６３）記
載の医薬組成物、及び （６５）ＭＭＰｓとＴＩＭＰｓとの生体内バランスに関
連した様々な生理状態、例えば排卵、胎生発生と分化、
血管新生、トロホブラスト浸潤、子宮内膜、分娩、骨の
形成と改造、創傷治癒、器官形成、退縮、加齢などの場
面で、そのバランスの崩れに起因した様々な疾患、例え
ば癌細胞における基底膜浸潤活性の上昇による浸潤転移
の促進、慢性関節リウマチや歯周疾患などの炎症におけ
る組織破壊、慢性（難治性）の皮膚潰瘍、角膜潰瘍、熱
傷潰瘍、皮膚水泡性疾患にみられる組織破壊などにおけ
る病的症状の予防あるいは治療に用いるものであること
を特徴とする上記（６３）記載の医薬組成物を提供す
る。

【００２３】さらには、本発明は （６６）ヒトＴＩＭＰ−３のＫＫＬＶＫＥＧＰＦＧＴＬ
ＶＹＴ（Ｒ２６−４０）のアミノ酸配列を含む領域を特
異的に認識し、ヒトＴＩＭＰ−３と免疫反応することを
特徴とする上記（３）記載のモノクローナル抗体、 （６７）ヒトＴＩＭＰ−３のＹＲＧＦＴＫＭＰＨＶＱＹ
ＩＨＴＥＡＳ（Ｒ４７−６４）のアミノ酸配列を含む領
域を特異的に認識し、ヒトＴＩＭＰ−３と免疫反応する
ことを特徴とする上記（４）記載のモノクローナル抗
体、 （６８）ヒトＴＩＭＰ−３のＳＷＹＲＧＷＡＰＰＤＫＳ
ＩＩＮＡＴＤＰ（Ｒ１７０−１８８）のアミノ酸配列を
含む領域を特異的に認識し、ヒトＴＩＭＰ−３と免疫反
応することを特徴とする上記（５）記載のモノクローナ
ル抗体、 （６９）測定試薬として（ｉ）ヒトＴＩＭＰ−３のＫＫ
ＬＶＫＥＧＰＦＧＴＬＶＹＴ（Ｒ２６−４０）のアミノ
酸配列を含む領域を特異的に認識し、ヒトＴＩＭＰ−３
と免疫反応するモノクローナル抗体および（ｉｉ）ヒト
ＴＩＭＰ−３のＳＷＹＲＧＷＡＰＰＤＫＳＩＩＮＡＴＤ
Ｐ（Ｒ１７０−１８８）のアミノ酸配列を含む領域を特
異的に認識し、ヒトＴＩＭＰ−３と免疫反応するモノク
ローナル抗体を少なくとも用いることを特徴とする上記
（１３）記載の方法、 （７０）ヒトＴＩＭＰ−３と免疫反応するモノクローナ
ル抗体結合アフィニティーゲルを用い、該ヒトＴＩＭＰ
−３と免疫反応するモノクローナル抗体がヒトＴＩＭＰ
−３のＹＲＧＦＴＫＭＰＨＶＱＹＩＨＴＥＡＳ（Ｒ４７
−６４）のアミノ酸配列を含む領域を特異的に認識する
ものであることを特徴とする上記（３１）記載のヒトＴ
ＩＭＰ−３の精製方法、 （７１）ヒトＴＩＭＰ−３と免疫反応するモノクローナ
ル抗体結合アフィニティーゲルを用い、該ヒトＴＩＭＰ
−３と免疫反応するモノクローナル抗体がヒトＴＩＭＰ
−３のＳＷＹＲＧＷＡＰＰＤＫＳＩＩＮＡＴＤＰ（Ｒ１
７０−１８８）のアミノ酸配列を含む領域を特異的に認
識するものであることを特徴とする上記（３２）記載の
ヒトＴＩＭＰ−３の精製方法、

【００２４】（７２）ヒトＴＩＭＰ−３のＫＫＬＶＫＥ
ＧＰＦＧＴＬＶＹＴ（Ｒ２６−４０）のアミノ酸配列を
含む領域、ヒトＴＩＭＰ−３のＹＲＧＦＴＫＭＰＨＶＱ
ＹＩＨＴＥＡＳ（Ｒ４７−６４）のアミノ酸配列を含む
領域及びヒトＴＩＭＰ−３のＳＷＹＲＧＷＡＰＰＤＫＳ
ＩＩＮＡＴＤＰ（Ｒ１７０−１８８）のアミノ酸配列を
含む領域からなる群から選ばれたヒトＴＩＭＰ−３関連
ポリペプチドで免疫したマウスの抗体生産細胞をマウス
ミエローマ細胞と融合せしめて得られたハイブリドーマ
由来のものであることを特徴とする上記（３４）記載の
モノクローナル抗体、 （７３）ヒトＴＩＭＰ−３のＫＫＬＶＫＥＧＰＦＧＴＬ
ＶＹＴ（Ｒ２６−４０）のアミノ酸配列を含む領域を特
異的に認識し、ヒトＴＩＭＰ−３と免疫反応するモノク
ロナール抗体を含むことを特徴とする上記（３６）記載
のヒトＴＩＭＰ−３の免疫学的測定用試薬、 （７４）ヒトＴＩＭＰ−３のＹＲＧＦＴＫＭＰＨＶＱＹ
ＩＨＴＥＡＳ（Ｒ４７−６４）のアミノ酸配列を含む領
域を特異的に認識し、ヒトＴＩＭＰ−３と免疫反応する
モノクロナール抗体を含むことを特徴とする上記（３
７）記載のヒトＴＩＭＰ−３の免疫学的測定用試薬、 （７５）ヒトＴＩＭＰ−３のＳＷＹＲＧＷＡＰＰＤＫＳ
ＩＩＮＡＴＤＰ（Ｒ１７０−１８８）のアミノ酸配列を
含む領域を特異的に認識し、ヒトＴＩＭＰ−３と免疫反
応するモノクロナール抗体を含むことを特徴とする上記
（３８）記載のヒトＴＩＭＰ−３の免疫学的測定用試
薬、

【００２５】（７６）前記第一の抗体として、ヒトＴＩ
ＭＰ−３のＫＫＬＶＫＥＧＰＦＧＴＬＶＹＴ（Ｒ２６−
４０）のアミノ酸配列を含む領域からなるヒトＴＩＭＰ
−３関連ポリペプチドで免疫したマウスの抗体生産細胞
をマウスミエローマ細胞と融合せしめて得られたハイブ
リドーマ由来のものを用い、前記第二の抗体としてヒト
ＴＩＭＰ−３のＹＲＧＦＴＫＭＰＨＶＱＹＩＨＴＥＡＳ
（Ｒ４７−６４）のアミノ酸配列を含む領域及びヒトＴ
ＩＭＰ−３のＳＷＹＲＧＷＡＰＰＤＫＳＩＩＮＡＴＤＰ
（Ｒ１７０−１８８）のアミノ酸配列を含む領域からな
る群から選ばれたヒトＴＩＭＰ−３関連ポリペプチドで
免疫したマウスの抗体生産細胞をマウスミエローマ細胞
と融合せしめて得られたハイブリドーマ由来のものを用
いることを特徴とする上記（４４）記載の方法、及び （７７）前記第一の抗体として、ヒトＴＩＭＰ−３のＳ
ＷＹＲＧＷＡＰＰＤＫＳＩＩＮＡＴＤＰ（Ｒ１７０−１
８８）のアミノ酸配列を含む領域からなるヒトＴＩＭＰ
−３関連ポリペプチドで免疫したマウスの抗体生産細胞
をマウスミエローマ細胞と融合せしめて得られたハイブ
リドーマ由来のものを用い、前記第二の抗体としてヒト
ＴＩＭＰ−３のＫＫＬＶＫＥＧＰＦＧＴＬＶＹＴ（Ｒ２
６−４０）のアミノ酸配列を含む領域及びヒトＴＩＭＰ
−３のＹＲＧＦＴＫＭＰＨＶＱＹＩＨＴＥＡＳ（Ｒ４７
−６４）のアミノ酸配列を含む領域からなる群から選ば
れたヒトＴＩＭＰ−３関連ポリペプチドで免疫したマウ
スの抗体生産細胞をマウスミエローマ細胞と融合せしめ
て得られたハイブリドーマ由来のものを用いることを特
徴とする上記（４５）記載の方法を提供する。

【００２６】

【発明の実施の形態】本発明は、ＴＩＭＰ−３と特異的
に免疫反応することのできるモノクローナル抗体、その
モノクローナル抗体を測定試薬として用いたＴＩＭＰ−
３の免疫測定法さらにはその測定に用いる試薬を提供す
る。本発明は、さらにＴＩＭＰ−３と特異的に免疫反応
することのできる少なくとも２種のモノクローナル抗体
によるサンドイッチ法に基づくＴＩＭＰ−３の酵素免疫
測定法をも提供するものである。本発明の方法は、固相
担体に結合させる抗体あるいは標識物質を付与する抗体
としてそれぞれＴＩＭＰ−３の実質的に異なる抗原決定
基に対し結合するモノクローナル抗体を使用することを
特徴とするものでもある。本発明に従えば（ｉ）ヒトＴ
ＩＭＰ−３のＫＫＬＶＫＥＧＰＦＧＴＬＶＹＴ（Ｒ２６
−４０）のアミノ酸配列又はその一部を含む領域を特異
的に認識し、ヒトＴＩＭＰ−３と免疫反応するモノクロ
ーナル抗体および（ｉｉ）ヒトＴＩＭＰ−３のＳＷＹＲ
ＧＷＡＰＰＤＫＳＩＩＮＡＴＤＰ（Ｒ１７０−１８８）
のアミノ酸配列又はその一部を含む領域を特異的に認識
し、ヒトＴＩＭＰ−３と免疫反応するモノクローナル抗
体とを組合わせて測定試薬として用い、酵素免疫学的に
ＴＩＭＰ−３の測定を行う方法および試薬が提供され
る。特には本発明は、（ｉ）ヒトＴＩＭＰ−３のＫＫＬ
ＶＫＥＧＰＦＧＴＬＶＹＴ（Ｒ２６−４０）のアミノ酸
配列を含む領域を特異的に認識し、ヒトＴＩＭＰ−３と
免疫反応するモノクローナル抗体および（ｉｉ）ヒトＴ
ＩＭＰ−３のＳＷＹＲＧＷＡＰＰＤＫＳＩＩＮＡＴＤＰ
（Ｒ１７０−１８８）のアミノ酸配列を含む領域を特異
的に認識し、ヒトＴＩＭＰ−３と免疫反応するモノクロ
ーナル抗体とを組合わせて測定試薬として用い、サンド
イッチ法により酵素免疫学的にＴＩＭＰ−３の測定を行
う方法および試薬を提供する。

【００２７】また、本発明は、ヒトＴＩＭＰ−３を精製
する方法を提供する。本発明はヒト胎盤のＥＣＭを尿素
で処理して可溶化した画分に見いだされた可溶性ＴＩＭ
Ｐ−３の精製方法を提供するものである。この可溶性ヒ
トＴＩＭＰ−３は２４ｋＤａの糖鎖の付加をうけていな
い分子種のものと２７ｋＤａの糖鎖の付加を受けた分子
種の混合物であり、精製の方法としてはイオン交換、ゲ
ルろ過、色素およびヒトＴＩＭＰ−３と免疫反応するモ
ノクローナル抗体をリガンドとしたアフィニティーゲル
クロマトグラフィーを組合わせたもので、アフィニティ
ーゲルのリガンドとして用いるヒトＴＩＭＰ−３と免疫
反応するモノクローナル抗体がヒトＴＩＭＰ−３のＹＲ
ＧＦＴＫＭＰＨＶＱＹＩＨＴＥＡＳ（Ｒ４７−６４）の
アミノ酸配列又はその一部を含む領域を特異的に認識
し、ヒトＴＩＭＰ−３と免疫反応するモノクローナル抗
体あるいはヒトＴＩＭＰ−３のＳＷＹＲＧＷＡＰＰＤＫ
ＳＩＩＮＡＴＤＰ（Ｒ１７０−１８８）のアミノ酸配列
又はその一部を含む領域を特異的に認識し、ヒトＴＩＭ
Ｐ−３と免疫反応するモノクローナル抗体であることを
特徴とする。得られた可溶性の精製ヒトＴＩＭＰ−３は
医薬品組成物として使用することができる。

【００２８】また、本発明は、可溶性の組換えヒトＴＩ
ＭＰ−３を精製する方法を提供する。特には本発明は、
ヒトＴＩＭＰ−３の分泌シグナル領域をヒトＴＩＭＰ−
１の分泌シグナルに交換して得られたヒトＴＩＭＰ−１
／−３のキメラ遺伝子の発現によって得られた分泌性Ｔ
ＩＭＰ−３を精製する方法を提供する。本発明は、ヒト
ＴＩＭＰ−１／−３のキメラ遺伝子で形質転換された動
物由来細胞（例えばＣＨＯ細胞またはＣＯＳ細胞など）
の培養上清に蓄積したヒトＴＩＭＰ−３の精製法を提供
する。この可溶性の組換えヒトＴＩＭＰ−３は糖鎖の付
加をうけていない分子種であって且つ約２４ｋＤａの分
子サイズをもつものと糖鎖の付加を受けた分子種であっ
て且つ約２７ｋＤａの分子サイズをもつものとの混合物
として培養上清中に得られる。可溶性の組換えヒトＴＩ
ＭＰ−３の精製の方法としては、少なくともヒトＴＩＭ
Ｐ−３と免疫反応するモノクローナル抗体をリガンドと
したアフィニティーゲルクロマトグラフィーを用いた方
法が挙げられる。この方法によれば、上記糖鎖の付加を
うけていない分子種であって且つ約２４ｋＤａの分子サ
イズをもつヒトＴＩＭＰ−３またはヒトＴＩＭＰ−３と
実質的に同一の活性を有するタンパク質あるいはその塩
と、糖鎖の付加を受けた分子種であって且つ約２７ｋＤ
ａの分子サイズをもつヒトＴＩＭＰ−３またはヒトＴＩ
ＭＰ−３と実質的に同一の活性を有するタンパク質ある
いはその塩とを分離精製することができる。アフィニテ
ィーゲルのリガンドとして用いるヒトＴＩＭＰ−３と免
疫反応するモノクローナル抗体としては、好ましくは
（１）ヒトＴＩＭＰ−３のＹＲＧＦＴＫＭＰＨＶＱＹＩ
ＨＴＥＡＳ（Ｒ４７−６４）のアミノ酸配列又はその一
部を含む領域を特異的に認識し、ヒトＴＩＭＰ−３と免
疫反応するモノクローナル抗体あるいは（２）ヒトＴＩ
ＭＰ−３のＳＷＹＲＧＷＡＰＰＤＫＳＩＩＮＡＴＤＰ
（Ｒ１７０−１８８）のアミノ酸配列又はその一部を含
む領域を特異的に認識し、ヒトＴＩＭＰ−３と免疫反応
するモノクローナル抗体が挙げられる。また精製の方法
としてはイオン交換、ゲルろ過、色素およびヒトＴＩＭ
Ｐ−３と免疫反応するモノクローナル抗体をリガンドと
したアフィニティーゲルクロマトグラフィーを組合わせ
たものであることもできる。実質的に均一な分子種とし
て可溶性の組換えヒトＴＩＭＰ−３を得ることができる
方法が選択され、好ましい方法である。得られた可溶性
の精製組換えヒトＴＩＭＰ−３は医薬品組成物として使
用することができる。

【００２９】本発明のヒトＴＩＭＰ−３またはヒトＴＩ
ＭＰ−３と実質的に同一の活性を有するタンパク質をコ
ードしているＤＮＡは、例えば以下に示す方法によって
取得した。なお、遺伝子組換え技術は、例えばT. Mania
tis et al.,"Molecular Cloning", 2nd Ed., Cold Spri
ng Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N. T.(19
89)；日本生化学会編、「続生化学実験講座１、遺伝子
研究法ＩＩ」、東京化学同人（１９８６）；日本生化学
会編、「新生化学実験講座２、核酸ＩＩＩ（組換えＤＮ
Ａ技術）」、東京化学同人（１９９２）；R. Wu ed.,
"Methods in Enzymology", Vol. 68, Academic Press,
New York (1980)；R. Wu et al. ed., "Methods in Enz
ymology", Vol. 100 & 101, Academic Press, New York
(1983)；R. Wu et al. ed., "Methods in Enzymolog
y", Vol. 153, 154 & 155, AcademicPress, New York
(1987) などに記載の方法あるいはそこで引用された文
献記載の方法あるいはそれらと実質的に同様な方法や改
変法により行うことができる。

【００３０】市販の種々のヒト組織由来ｃＤＮＡライブ
ラリー（例えば、ＣＬＯＮＴＥＣＨなどより入手可能）
を鋳型に使用してＰＣＲ法を適用することができる。典
型的な場合、既知のＴＩＭＰファミリーのアミノ酸配列
から選択したアミノ酸配列を基に、デジェネレイテッド
・プライマーを作製する。例えば、マウスからクローニ
ングされたマウス由来ＴＩＭＰ−３をコードするＤＮＡ
の塩基配列をもとにＰＣＲ増幅反応用プライマーを作製
することが可能である。好ましくはApte et al., Genom
ics, 19, 86-90,(1994) の報告に基づいてＰＣＲプライ
マー、例えば図１に示されるプライマーT3F1及びT3R1を
合成して用いることができる。プライマーの合成は、当
該分野で知られた方法で行うことができ、例えばＤＮＡ
自動合成装置を用い、フォスフォジエステル法、フォス
フォトリエステル法、フォスフォアミダイト法などによ
り合成できる。このプライマーと上記ｃＤＮＡライブラ
リーとを用い、ＰＣＲを行う。ＰＣＲ反応は、当該分野
で公知の方法あるいはそれと実質的に同様な方法や改変
法により行うことができるが、例えば R. Saiki, et a
l., Science, Vol. 230, pp. 1350 (1985); R. Saiki,
et al., Science, Vol. 239, pp. 487 (1985)；ＰＣＲ
テクノロジー (PCR Technology) ，ストックトンプレス
(Stockton Press) などに記載された方法に従って行う
ことができる。

【００３１】ｃＤＮＡライブラリーを構築するには、例
えば種々のヒト組織（胎盤等）あるいは培養細胞からｍ
ＲＮＡを単離する。ｍＲＮＡの単離は、当該分野で公知
の方法あるいはそれと実質的に同様な方法や改変法によ
り行うことができるが、T. Maniatis et al.,"Molecula
r Cloning", 2nd Ed., Chapter 7, Cold Spring Harbor
Laboratory, Cold Spring Harbor, N. T. (1989); L.
Grossman et al. ed.,"Methods in Enzymology", Vol.
12, Part A & B, Academic Press, New York(1968); S.
L. Berger et al. ed., "Methods in Enzymology", Vo
l. 152, p.33& p.215, Academic Press, New York (198
7);Biochemistry, 18, 5294-5299, 1979 などに記載の
方法、例えばグアニジン−塩化セシウム法、チオシアン
酸グアニジン法、フェノール法などの方法で行うことが
出来る。必要に応じ、得られた全ＲＮＡはオリゴ（ｄ
Ｔ）−セルロースカラムなどを使用して精製してポリ
（Ａ）⁺ ｍＲＮＡを得ることが出来る。このｍＲＮＡ及
び逆転写酵素を用いてｃＤＮＡを作製する。ｍＲＮＡ及
び逆転写酵素を用いてのｃＤＮＡ合成は当該分野で公知
の方法あるいはそれと実質的に同様な方法や改変法によ
り行うことができるが、H. Land et al., "Nucleic Aci
ds Res.", Vol. 9, 2251 (1981); U. Gubler et al.,
"Gene", Vol. 25, 263-269 (1983); S. L. Berger et a
l. ed., "Methods in Enzymology", Vol. 152, p.307,
Academic Press, New York (1987) などに記載の方法
が挙げられる。こうして作製されたｃＤＮＡを基にｃＤ
ＮＡライブラリーを構築できる。またファージベクター
を使用する以外で、大腸菌などの宿主細胞の形質転換を
するには、例えばカルシウム法、ルビジウム／カルシウ
ム法など当該分野で知られた方法あるいはそれと実質的
に同様な方法で行うことができる（D. Hanahan, J. Mo
l. Biol., Vol. 166, p.557 (1983) など）。

【００３２】得られたＰＣＲ産物をクローニングし、得
られたＰＣＲ産物の塩基配列を決定し、新規なＴＩＭＰ
遺伝子配列を有するＤＮＡ断片を取得する。塩基配列の
決定は、ダイデオキシ法、例えばＭ１３ダイデオキシ法
など、Maxam-Gilbert 法などを用いて行うことができる
が、市販のシークエンシングキット、例えば Taqダイプ
ライマーサイクルシークエンシングキットなどを用いた
り、自動塩基配列決定装置、例えば蛍光ＤＮＡシーケン
サー装置などを用いて行うことが出来る。特にはこのＤ
ＮＡ断片をプローブに種々のヒト組織（胎盤等）あるい
は培養細胞（ヒト線維芽細胞、ヒト白血球細胞等）から
構築されたｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングし、
塩基配列の決定から目的とするＤＮＡを単離することが
できる。好ましくは胎盤ｃＤＮＡライブラリーをスクリ
ーニングし、塩基配列の決定をして目的とするＤＮＡを
単離する。なお、プローブなどを放射性同位体などによ
って標識するには、市販の標識キット、例えばランダム
プライムドＤＮＡラベリングキット (Boehringer Mannh
aim)などを使用して行うことが出来る。

【００３３】以下にさらに詳細に記述する。本発明者ら
は、既知のヒトＴＩＭＰ−３をコードするＤＮＡの塩基
配列を基に、次の配列を有する５’プライマー、 （配列番号：４） AGGATCCGAGCATGCACATGCTCGCCCAGC (T3F1) （配列番号：５） ATCTAGACTCAGGGGTCTGTGGCATTGATG (T3R1) を設計、合成した。これらのプライマーとヒト胎盤細胞
から調製したｃＤＮＡライブラリーを用い、ＰＣＲ反応
を行った。プライマーのデザインから予想されるサイズ
（５８７ｂｐｓ）を持つところの得られたＰＣＲ産物を
サブクローニングする。こうして得られたＤＮＡを「ヒ
トＴＩＭＰ−３遺伝子」と命名した。可溶性の組換えヒ
トＴＩＭＰ−３を得るため、ヒトＴＩＭＰ−３の分泌シ
グナル領域をヒトＴＩＭＰ−１の分泌シグナルに置き換
える。こうして交換して得られたヒトＴＩＭＰ−１／−
３のキメラ遺伝子をトランスフェクションした大腸菌な
どの微生物細胞あるいはＣＯＳ−１細胞などの発現に適
した動物細胞などを用いて、ヒトＴＩＭＰ−３遺伝子産
物の確認を行った。この外来遺伝子を大腸菌などの微生
物細胞に導入する方法としては当該分野で知られた方法
あるいはそれと実質的に同様な方法で行うことができ、
例えばT. Maniatis et al.,"Molecular Cloning", 2nd
Ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Ha
rbor, N. T. (1989)；R. Wu ed., "Methods in Enzymol
ogy", Vol. 68, Academic Press, New York (1980)；R.
Wu et al. ed., "Methods in Enzymology", Vol. 100
& 101, Academic Press, New York (1983)；R. Wu et a
l. ed., "Methods in Enzymology", Vol. 153, 154 & 1
55, Academic Press, New York (1987) などに記載の方
法あるいはそこで引用された文献記載の方法により行う
ことができる。

【００３４】この外来遺伝子を哺乳動物などの動物細胞
に導入する方法としては当該分野で知られた方法あるい
はそれと実質的に同様な方法で行うことができ、例えば
リン酸カルシウム法（例えば、F. L. Graham et al.,
"Virology", Vo. 52, pp.456(1973)など）、ＤＥＡＥ−
デキストラン法（例えば、D. Warden et al., "J. Gen.
Virol.", Vo. 3, pp.371 (1968)など）、エレクトロポ
レーション法（例えば、E. Neumann et al., "EMBO J",
Vo. 1, pp.841 (1982) など）、マイクロインジェクシ
ョン法、リボソーム法、ウイルス感染法、ファージ粒子
法などが挙げられる。こうしてヒトＴＩＭＰ−３遺伝子
をトランスフェクションされた大腸菌や動物細胞などの
産生する遺伝子産物をポリアクリルアミド・ゲル電気泳
動などで解析した結果、細胞ライゼートのうちに融合タ
ンパク質が発現していることが検出される。こうして得
られるヒトＴＩＭＰ−１／−３などのヒトＴＩＭＰ−３
のキメラ遺伝子は、新規な可溶性ヒトＴＩＭＰ−３タン
パク質をコードしている新規な遺伝子であることは明白
であり、ヒトＴＩＭＰ−３キメラ遺伝子を用いて作製し
た組換え体プラスミドは全て新規な組換え体であり、そ
のプラスミドで形質転換あるいはトランスフェクトされ
得られた形質転換体あるいはトランスフェクタントも新
規なものである。

【００３５】ヒトＴＩＭＰ−３遺伝子は、可溶性タンパ
ク質としてヒトＴＩＭＰ−３またはヒトＴＩＭＰ−３と
実質的に同一の活性を有するタンパク質を得るようにキ
メラ遺伝子とすることが好ましいが、ヒトＴＩＭＰ−３
遺伝子を組込むプラスミドとしては遺伝子工学的に常用
される宿主細胞（例えば、大腸菌、枯草菌等の原核細胞
宿主、酵母、ＣＨＯ細胞等の真核細胞宿主、Ｓｆ２１等
の昆虫細胞宿主）中で該ＤＮＡが発現できるプラスミド
であればどのようなプラスミドでもよい。こうした配列
内には、例えば選択した宿主細胞で発現するのに好適な
コドンが導入されていることができるし、制限酵素部位
が設けられていることもできるし、目的とする遺伝子の
発現を容易にするための制御配列、促進配列など、目的
とする遺伝子を結合するのに役立つリンカー、アダプタ
ーなど、さらには抗生物質耐性などを制御したり、代謝
を制御したりし、選別などに有用な配列等を含んでいる
ことができる。好ましくは、適当なプロモーター、例え
ば大腸菌を宿主とするプラスミドでは、トリプトファン
（ｔｒｐ）プロモーター、ラクトース（ｌａｃ）プロモ
ーター、トリプトファン・ラクトース（ｔａｃ）プロモ
ーター、リポプロテイン（ｌｐｐ）プロモーター、λフ
ァージＰＬプロモーター等を、動物細胞を宿主とするプ
ラスミドでは、ＳＶ４０レートプロモーター、ＭＭＴＶ
ＬＴＲプロモーター、ＲＳＶ ＬＴＲプロモーター、
ＣＭＶプロモーター、ＳＲαプロモーター等を、酵母を
宿主とするプラスミドでは、ＧＡＬ１、ＧＡＬ１０プロ
モーター等を使用し得る。

【００３６】大腸菌を宿主とするプラスミドとしては、
例えばｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、ｐＵＣ
１１８、ｐＵＣ１１９、ｐＳＰ６４、ｐＳＰ６５、ｐＴ
Ｚ−１８Ｒ／−１８Ｕ、ｐＴＺ−１９Ｒ／−１９Ｕ、ｐ
ＧＥＭ−３、ｐＧＥＭ−４、ｐＧＥＭ−３Ｚ、ｐＧＥＭ
−４Ｚ、ｐＧＥＭ−５Ｚｆ（−）、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉ
ｐｔ ＫＳ^TM (Stratagene) などが挙げられる。大腸菌
での発現に適したプラスミドベクターとしては、ｐＡ
Ｓ、ｐＫＫ２２３ (Pharmacia)、ｐＭＣ１４０３、ｐＭ
Ｃ９３１、ｐＫＣ３０なども挙げられる。動物細胞を宿
主とするプラスミドとしては、ＳＶ４０ベクター、ポリ
オーマ・ウイルスベクター、ワクシニア・ウイルスベク
ター、レトロウイルスベクターなどが挙げられ、例えば
ｐｃＤ、ｐｃＤ−ＳＲα、ＣＤＭ８、ｐＣＥＶ４、ｐＭ
Ｅ１８Ｓ、ｐＢＣ１２ＢＩ、ｐＳＧ５ (Stratagene) な
どが挙げられる。酵母を宿主とするプラスミドとして
は、ＹＩｐ型ベクター、ＹＥｐ型ベクター、ＹＲｐ型ベ
クター、ＹＣｐ型ベクターなどが挙げられ、例えばｐＧ
ＰＤ−２などが挙げられる。宿主細胞としては、宿主細
胞が大腸菌の場合、例えば大腸菌Ｋ１２株に由来するも
のが挙げられ、例えばＮＭ５３３ ＸＬ１−Ｂｌｕｅ、
Ｃ６００、ＤＨ１、ＨＢ１０１、ＪＭ１０９などが挙げ
られる。宿主細胞が動物細胞の場合、例えばアフリカミ
ドリザル線維芽細胞由来のＣＯＳ−７細胞、ＣＯＳ−１
細胞、ＣＶ−１細胞、マウス線維芽細胞由来のＣＯＰ細
胞、ＭＯＰ細胞、ＷＯＰ細胞、チャイニーズ・ハムスタ
ー細胞由来のＣＨＯ細胞、ＣＨＯ ｄｈｆｒ^- 細胞、ヒ
トＨｅＬａ細胞、マウス細胞由来Ｃ１２７細胞、マウス
細胞由来ＮＩＨ ３Ｔ３細胞などが挙げられる。昆虫細
胞としては、カイコ核多角体病ウイルス (Bombyx mori
nuclear polyhedrosis virus) をベクターとし、カイコ
幼虫あるいはカイコ培養細胞、例えばＢＭ−Ｎ細胞など
を用いることが挙げられる。

【００３７】本発明の遺伝子工学的手法においては、当
該分野で知られたあるいは汎用されている制限酵素、逆
転写酵素、ＤＮＡ断片をクローン化するのに適した構造
に修飾したりあるいは変換するための酵素であるＤＮＡ
修飾・分解酵素、ＤＮＡポリメラーゼ、末端ヌクレオチ
ジルトランスフェラーゼ、ＤＮＡリガーゼなどを用いる
ことが出来る。制限酵素としては、例えば、R. J. Robe
rts, Nucleic Acids Res., Vol. 13, r165 (1985); S.
Linn et al. ed. Nucleases, p. 109, Cold Spring Har
bor Lab., Cold Spring Harbor, New York, 1982などに
記載のものが挙げられる。逆転写酵素としては、例えば
マウスモロネイ白血病ウイルス (mouseMoloney leukemi
a virus; MMLV) 由来の逆転写酵素 (reverse transcrip
tase)、ニワトリ骨髄芽球症ウイルス (avian myeloblas
tosis virus; AMV)由来の逆転写酵素などが挙げられ、
特にはRNase H 欠損体などは好ましく用いることが出来
る。ＤＮＡポリメラーゼとしては、例えば大腸菌ＤＮＡ
ポリメラーゼ、その誘導体であるクレノウ・フラグメン
ト、大腸菌ファージＴ４ ＤＮＡポリメラーゼ、大腸菌
ファージＴ７ ＤＮＡポリメラーゼ、耐熱菌ＤＮＡポリ
メラーゼなどが挙げられる。末端ヌクレオチジルトラン
スフェラーゼとしては、例えばR. Wu et al.ed., "Meth
ods in Enzymology", Vol. 100, p. 96, Academic Pres
s, New York(1983) に記載の３’−ＯＨ末端にデオキシ
ヌクレオチド（ｄＮＭＰ）を付加するＴｄＴａｓｅなど
が挙げられる。ＤＮＡ修飾・分解酵素としては、エキソ
ヌクレアーゼ、エンドヌクレアーゼなどが挙げられ、例
えばヘビ毒ホスホジエステラーゼ、脾臓ホスホジエステ
ラーゼ、大腸菌ＤＮＡエキソヌクレアーゼＩ、大腸菌Ｄ
ＮＡエキソヌクレアーゼＩＩＩ、大腸菌ＤＮＡエキソヌ
クレアーゼＶＩＩ、λエキソヌクレアーゼ、ＤＮａｓｅ
Ｉ、ヌクレアーゼＳ１、ミクロコッカス (Micrococcu
s) ヌクレアーゼなどが挙げられる。ＤＮＡリガーゼと
しては、例えば大腸菌ＤＮＡリガーゼ、Ｔ４ ＤＮＡリ
ガーゼなどが挙げられる。ＤＮＡ遺伝子をクローニング
してＤＮＡライブラリーを構築するのに適したベクター
としては、プラスミド、λファージ、コスミド、Ｐ１フ
ァージ、Ｆ因子、ＹＡＣなどが挙げられ、好ましくはλ
ファージ由来のベクターが挙げられ、例えばＣｈａｒｏ
ｎ ４Ａ、Ｃｈａｒｏｎ ２１Ａ、λｇｔ１０、λｇｔ
１１、λＤＡＳＨＩＩ、λＦＩＸＩＩ、λＥＭＢＬ３、
λＺＡＰＩＩ^TM (Stratagene) などが挙げられる。

【００３８】さらに、本発明に係わるヒトＴＩＭＰ−３
の遺伝子塩基配列をもとに遺伝子工学的に常用される方
法を用いることにより、ヒトＴＩＭＰ−３のアミノ酸配
列中に適宜、１個ないし複数個以上のアミノ酸の置換、
欠失、挿入、転移あるいは付加したごとき変異を導入し
た相当するタンパク質を製造することができる。こうし
た変異・変換・修飾法としては、日本生化学会編、「続
生化学実験講座１、遺伝子研究法ＩＩ」、ｐ１０５（広
瀬進）、東京化学同人（１９８６）；日本生化学会編、
「新生化学実験講座２、核酸ＩＩＩ（組換えＤＮＡ技
術）」、ｐ２３３（広瀬進）、東京化学同人（１９９
２）；R. Wu, L. Grossman, ed., "Methodsin Enzymolo
gy", Vol. 154, p. 350 & p. 367, Academic Press, Ne
w York (1987)；R. Wu, L. Grossman, ed., "Methods i
n Enzymology", Vol. 100, p. 457 &p. 468, Academic
Press, New York (1983)；J. A. Wells et al., "Gen
e", Vol. 34, p. 315 (1985)；T. Grundstroem et al.,
"Nucleic Acids Res", Vol. 13, p. 3305 (1985) ；J.
Taylor et al., "Nucleic Acids Res.", Vol. 13, p.8
765 (1985) ；R. Wu ed., "Methods in Enzymology", V
ol. 155, p. 568, Academic Press, New York (1987)
；A. R. Oliphant et al., "Gene", Vol. 44, p.177
(1986) などに記載の方法が挙げられる。例えば合成オ
リゴヌクレオチドなどを利用する位置指定変異導入法
（部位特異的変異導入法）、 Kunkel 法、 dNTP[αS]法
（Eckstein) 法、亜硫酸や亜硝酸などを用いる領域指定
変異導入法等の方法が挙げられる。さらに得られた本発
明のタンパク質は、化学的な手法でその含有されるアミ
ノ酸残基を修飾することもできるし、ペプチダーゼ、例
えばペプシン、キモトリプシン、パパイン、ブロメライ
ン、エンドペプチダーゼ、エキソペプチダーゼなど酵素
などを用いて修飾したり、部分分解したりしてその誘導
体などにすることができる。また遺伝子組換え法で製造
する時に融合タンパク質として発現させ、生体内あるい
は生体外で天然のヒトＴＩＭＰ−３と実質的に同等の生
物学的活性を有しているものに変換・加工してもよい。
遺伝子工学的に常用される融合産生法を用いることがで
きるが、こうした融合タンパク質はその融合部を利用し
てアフィニティクロマトグラフィーなどで精製すること
も可能である。タンパク質の構造の修飾・改変などは、
例えば日本生化学会編、「新生化学実験講座１、タンパ
ク質ＶＩＩ、タンパク質工学」、東京化学同人（１９９
３）を参考にし、そこに記載の方法あるいはそこで引用
された文献記載の方法、さらにはそれらと実質的に同様
な方法で行うことができる。また下記するようにその生
物学的活性のうちには、免疫的に活性、例えば抗原性を
有するということも含まれてよい。

【００３９】かくして本発明は、１個以上のアミノ酸残
基が同一性の点で天然のものと異なるもの、１個以上の
アミノ酸残基の位置が天然のものと異なるものであって
もよい。本発明は、ヒトＴＩＭＰ−３に特有なアミノ酸
残基が１個以上（例えば、１〜８０個、好ましくは１〜
６０個、さらに好ましくは１〜４０個、さらに好ましく
は１〜２０個、特には１〜１０個など）欠けている欠失
類縁体、特有のアミノ酸残基の１個以上（例えば、１〜
８０個、好ましくは１〜６０個、さらに好ましくは１〜
４０個、さらに好ましくは１〜２０個、特には１〜１０
個など）が他の残基で置換されている置換類縁体、１個
以上（例えば、１〜８０個、好ましくは１〜６０個、さ
らに好ましくは１〜４０個、さらに好ましくは１〜２０
個、特には１〜１０個など）のアミノ酸残基が付加され
ている付加類縁体も包含する。また本発明のヒトＴＩＭ
Ｐ−３は天然のヒトＴＩＭＰ−３と実質的に同等の一次
構造コンフォメーションあるいはその一部を有している
ものも含まれてよいと考えられ、さらに天然のヒトＴＩ
ＭＰ−３と実質的に同等の生物学的活性を有しているも
のも含まれてよいと考えられる。さらに天然に生ずる変
異体の一つであることもできる。こうした本発明のヒト
ＴＩＭＰ−３は、下記で説明するように分離・精製処理
されることができる。一方では、こうして本発明は上記
したポリペプチドをコードするＤＮＡ配列、そして天然
の特性の全部あるいは一部を有するヒトＴＩＭＰ−３の
ポリペプチド、さらにその類縁体あるいは誘導体をコー
ドするＤＮＡ配列も包含する。

【００４０】本発明のＤＮＡ配列は、例えばヒトＴＩＭ
Ｐ−３及び関連タンパク質をコードする哺乳動物、特に
好ましくはヒトの、ゲノムＤＮＡ及びｃＤＮＡの単離及
び検知のためのプロープとして有用である。遺伝子の単
離にあたっては、ＰＣＲ法、さらには逆転写酵素（Ｒ
Ｔ）を用いたＰＣＲ法（ＲＴ−ＰＣＲ）を利用すること
が出来る。ヒトＴＩＭＰ−３ ｃＤＮＡ及びその関連Ｄ
ＮＡは、クローニングされ、配列決定されたヒトＴＩＭ
Ｐ−３ ｃＤＮＡ配列から推定されるアミノ酸配列に基
づき特徴的な配列領域を選び、ＤＮＡプライマーをデザ
インして化学合成し、得られたＤＮＡプライマーを用い
て、ＰＣＲ法、ＲＴ−ＰＣＲ、その他の方法を用いてヒ
トＴＩＭＰ−３関連遺伝子の単離、検出などに利用する
ことが出来る。

【００４１】ヒトＴＩＭＰ−３ ｍＲＮＡのヒト組織中
での発現を各種の組織由来Ｐｏｌｙ（Ａ）⁺ ＲＮＡに対
するノーザンブロット分析により検討することができ
る。本発明のヒトＴＩＭＰ−３ｃＤＮＡをプローブとし
て用いれば、例えばノーザン・ブロティング、サザン・
ブロティング、ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション
などによりヒト組織中でのヒトＴＩＭＰ−３ ｍＲＮＡ
の発現やヒトＴＩＭＰ−３遺伝子自体などを検出・測定
でき、ひいては癌細胞の有無、癌の悪性度の診断等の癌
の診断治療、またアルツハイマー病の診断等の研究に応
用できる。以上述べた、本発明者らの研究成果によりヒ
トＴＩＭＰ−３のキメラ遺伝子及び組換えＤＮＡ分子を
宿主に移入し、可溶性ヒトＴＩＭＰ−３を発現させ、目
的とする可溶性ＴＩＭＰ−３を得る方法が提供される。
こうして本発明によれば、可溶性ヒトＴＩＭＰ−３の遺
伝子を実質的に発現する組換え体あるいはトランスフェ
クタント及びその製造法、さらにはその用途も提供され
る。別の面では、本発明は天然のＴＩＭＰ−３あるいは
それと実質的に同等な活性を有することを特徴とする可
溶性タンパク質又はその塩、より好ましくはヒトＴＩＭ
Ｐ−３またはその塩と実質的に同等な活性を有するか、
あるいは実質的に同等の一次構造コンフォメーションを
持つ該タンパク質の少なくとも一部あるいは全部を有す
るポリペプチドを、大腸菌などの原核生物あるいは哺乳
動物細胞などの真核生物で可溶性タンパク質として発現
させることを可能にするＤＮＡやＲＮＡなどの核酸に関
するとすることができる。こうした核酸で形質転換さ
れ、本発明の該ポリペプチドを発現できる大腸菌などの
原核生物あるいは哺乳動物細胞などの真核生物も本発明
の特徴をなす。

【００４２】本発明はヒト由来の正常細胞あるいは正常
組織、例えば、胎盤から精製単離処理を加えて得たもの
であることができる。好ましくはこうした細胞あるいは
組織から得られたヒトＴＩＭＰ−３に富んだＥＣＭは、
尿素で処理して可溶化した画分とする。こうして得られ
た可溶性ＴＩＭＰ−３に富んだ画分は、イオン交換、ゲ
ルろ過、色素およびモノクローナル抗体をリガンドとし
たアフィニティーゲルクロマトグラフィーにより精製さ
れる。こうして得られた可溶性ヒトＴＩＭＰ−３は２４
ｋＤａの糖鎖の付加をうけていない分子種のものと２７
ｋＤａの糖鎖の付加を受けた分子種の混合物として得る
ことができるし、それぞれ２４ｋＤａの糖鎖の付加をう
けていない分子種のものと２７ｋＤａの糖鎖の付加を受
けた分子種のものとに分離して得ることもできる。イオ
ン交換による分離には、当該分野慣用的に使用される、
ＣＭイオン交換樹脂、ＤＥＡＥイオン交換樹脂などが挙
げられる。ゲルろ過による分離には、当該分野慣用的に
使用される、セファロース・ゲルなどが挙げられる。色
素ゲルクロマトグラフィーには、例えば、マトリクスゲ
ルグリーンＡ（アミコングレース）、リアクティブレッ
ド１２０（シグマ）などの当該分野慣用的に使用される
ものが挙げられる。また、ヒトＴＩＭＰ−３と免疫反応
するモノクローナル抗体をリガンドとしたアフィニティ
ーゲルクロマトグラフィーが好適に用いられる。アフィ
ニティーゲルのリガンドとしては、例えば（１）ヒトＴ
ＩＭＰ−３と免疫反応するモノクローナル抗体がヒトＴ
ＩＭＰ−３のＹＲＧＦＴＫＭＰＨＶＱＹＩＨＴＥＡＳ
（Ｒ４７−６４）のアミノ酸配列又はその一部を含む領
域を特異的に認識し、ヒトＴＩＭＰ−３と免疫反応する
モノクローナル抗体及び（２）ヒトＴＩＭＰ−３のＳＷ
ＹＲＧＷＡＰＰＤＫＳＩＩＮＡＴＤＰ（Ｒ１７０−１８
８）のアミノ酸配列又はその一部を含む領域を特異的に
認識し、ヒトＴＩＭＰ−３と免疫反応するモノクローナ
ル抗体が挙げられる。特には、例えば（３）ヒトＴＩＭ
Ｐ−３のＹＲＧＦＴＫＭＰＨＶＱＹＩＨＴＥＡＳ（Ｒ４
７−６４）のアミノ酸配列を含む領域を特異的に認識
し、ヒトＴＩＭＰ−３と免疫反応するモノクローナル抗
体や（４）ヒトＴＩＭＰ−３のＳＷＹＲＧＷＡＰＰＤＫ
ＳＩＩＮＡＴＤＰ（Ｒ１７０−１８８）のアミノ酸配列
を含む領域を特異的に認識し、ヒトＴＩＭＰ−３と免疫
反応するモノクローナル抗体が挙げられる。

【００４３】さらに、本発明では、ＴＩＭＰ−３に特異
的に免疫反応するモノクローナル抗体が提供される。本
発明に係わるモノクローナル抗体は、本発明により得ら
れるヒトＴＩＭＰ−３を免疫源として公知の方法で動物
を免疫し、当該分野で知られたあるいは汎用されている
方法、例えばケーラー及びミルシュタインの方法（Ｎａ
ｔｕｒｅ，２５６：４９５〜４９７，１９７５）により
製造することができる。この方法において、免疫源とし
ては天然型ヒトＴＩＭＰ−３、リコンビナントヒトＴＩ
ＭＰ−３及び連続した少なくとも８個のアミノ酸からな
るヒトＴＩＭＰ−３の一部のアミノ酸配列を有する合成
ペプチド等の何れでも使用することができる。さらに該
モノクローナル抗体は、常用される方法によって適宜標
識することができる。標識としては、酵素、補欠分子
類、色素物質、蛍光物質、化学ルミネッセンス化合物、
発光物質、放射性物質等を使用することができる。以下
抗体の作製につき詳しく説明する。本発明のモノクロー
ナル抗体は、ミエローマ細胞を用いての細胞融合技術を
利用して得られたモノクローナル抗体であってよいこと
はいうまでもない。本発明で使用されるモノクローナル
抗体は、例えば次のような工程で作製できる。 １．免疫原性抗原の調製 ２．免疫原性抗原による動物の免疫 ３．ミエローマ細胞（骨髄腫細胞）の調製 ４．抗体産生細胞とミエローマ細胞との細胞融合 ５．ハイブリドーマ（融合細胞）の選択及びモノクロー
ン化 ６．モノクローナル抗体の製造

【００４４】１．免疫原性抗原の調製 抗原としては、例えば本発明の方法に従い精製して得ら
れた天然由来のヒトＴＩＭＰ−３、本発明の方法に従い
調製したリコンビナント・ヒトＴＩＭＰ−３を用いるこ
とができる。ヒトＴＩＭＰ−３は、さらに免疫原性コン
ジュゲートなどにしてもよいが、そのままあるいは適当
なアジュバントと混合して動物を免疫するのに使用でき
る。こうした抗原は、各種原料、例えば培養細胞、培養
組織など、形質転換体細胞などの抗原産生材料から従来
公知の方法、例えば硫酸アンモニウム沈殿法などの塩
析、セファデックスなどによるゲルろ過法、例えばジエ
チルアミノエチル基あるいはカルボキシメチル基などを
持つ担体などを用いたイオン交換クロマトグラフィー
法、例えばブチル基、オクチル基、フェニル基など疎水
性基を持つ担体などを用いた疎水性クロマトグラフィー
法、色素ゲルクロマトグラフィー法、ポリアクリルアミ
ド電気泳動などの電気泳動法、透析、限外ろ過法、アフ
ィニティ・クロマトグラフィー法、高速液体クロマトグ
ラフィー法などにより精製して得ることができるが、好
ましくは本発明の精製方法により処理し、精製分離処理
できる。さらにヒトＴＩＭＰ−３は、それを断片化した
もの、あるいはクローニングされ、配列決定されたｃＤ
ＮＡ配列から推定されるアミノ酸配列に基づき特徴的な
配列領域を選び、ポリペプチドをデザインして化学合成
し、こうして得られたポリペプチド断片であってもよ
く、その断片を適当な縮合剤を介して種々の担体タンパ
ク質類と結合させてハプテン−タンパク質の如き免疫原
性コンジュゲートとし、これを用いて特定の配列のみを
認識できるモノクローナル抗体をデザインするのに用い
ることもできる。デザインされるポリペプチドには予め
システイン残基などを付加し、免疫原性コンジュゲート
の調製を容易にできるようにしておくことができる。好
ましくは、こうした合成ポリペプチド抗原としては、例
えば、Apte et al., Genomics, 19, 86-90 (1994) に記
載のヒトＴＩＭＰ−３ポリペプチドのアミノ酸配列の内
から選択することができる。特に好ましくはこれらを免
疫源として得られた目的モノクローナル抗体がヒトＴＩ
ＭＰ−１およびヒトＴＩＭＰ−２と交差反応をしないも
のとなるよう、ヒトＴＩＭＰ−３に特異的に反応するよ
うのものが得られるよう合成ポリペプチド領域を選択す
ることにより得られたヒトＴＩＭＰ−３関連合成ポリペ
プチド抗原が挙げられる。また、いずれのポリペプチド
もヒトＴＩＭＰ−３分子のなかで親水性を示す領域を含
むように選択し、抗原性をより示しやすいようにしてデ
ザインされた領域であるヒトＴＩＭＰ−３関連合成ポリ
ペプチド抗原が挙げられる。こうした領域としては、例
えば、 （配列番号：１） ＫＫＬＶＫＥＧＰＦＧＴＬＶＹＴ（Ｒ２６−４０） （配列番号：２） ＹＲＧＦＴＫＭＰＨＶＱＹＩＨＴＥＡＳ（Ｒ４７−６
４）および （配列番号：３） ＳＷＹＲＧＷＡＰＰＤＫＳＩＩＮＡＴＤＰ（Ｒ１７０−
１８８） のポリペプチドが挙げられる。

【００４５】配列番号：１のポリペプチド領域のよう
に、ヒトＴＩＭＰ−１の相同部位に対して１３％、ヒト
ＴＩＭＰ−２の相同部位に対して３３％の相同性を示す
ものが好ましい領域として挙げられる。また配列番号：
２のポリペプチド領域のように、ヒトＴＩＭＰ−１の相
同部位に対して２８％、ヒトＴＩＭＰ−２の相同部位に
対して２８％の相同性を示すものが好ましい領域として
挙げられる。更に配列番号：３のポリペプチド領域のよ
うに、ヒトＴＩＭＰ−１の相同部位に対して５％、ヒト
ＴＩＭＰ−２の相同部位に対して４７％の相同性を示す
ものが好ましい領域として挙げられる。担体タンパク質
類と結合させるにあたっては、担体タンパク質類はまず
活性化されることができる。こうした活性化にあたり活
性化結合基を導入することが挙げられる。活性化結合基
としては、（１）活性化エステルあるいは活性化カルボ
キシル基、例えばニトロフェニルエステル基、ペンタフ
ルオロフェニルエステル基、１−ベンゾトリアゾールエ
ステル基、Ｎ−スクシンイミドエステル基など、（２）
活性化ジチオ基、例えば２−ピリジルジチオ基などが挙
げられる。担体タンパク質類としては、キーホール・リ
ンペット・ヘモシアニン（ＫＬＨ），牛血清アルブミン
（ＢＳＡ）、卵白アルブミン、グロブリン、ポリリジン
などのポリペプタイド、細菌菌体成分、例えばＢＣＧな
どが挙げられる。

【００４６】２．免疫原性抗原による動物の免疫 動物を免疫するには、例えば村松繁、他編、実験生物学
講座１４、免疫生物学、丸善株式会社、昭和６０年、日
本生化学会編、続生化学実験講座５、免疫生化学研究
法、東京化学同人、１９８６年、日本生化学会編、新生
化学実験講座１２、分子免疫学 III、抗原・抗体・補
体、東京化学同人、１９９２年などに記載の方法に準じ
て行うことができる。抗原と共に用いられるアジュバン
トとしては、例えばフロイント完全アジュバント、リビ
（Ｒｉｂｉ）アジュバント、百日咳ワクチン、ＢＣＧ、
リピッドＡ、リポソーム、水酸化アルミニウム、シリカ
などが挙げられる。免疫は、例えばＢＡＬＢ／ｃなどの
マウスをはじめとする動物を使用して行われる。抗原の
投与量は、例えばマウスに対して約１〜４００μｇ／動
物で、一般には宿主動物の腹腔内や皮下に注射し、以後
１〜４週間おきに、好ましくは１〜２週間ごとに腹腔
内、皮下、静脈内あるいは筋肉内に追加免疫を２〜１０
回程度反復して行う。免疫用のマウスとしてはＢＡＬＢ
／ｃ系マウスの他、ＢＡＬＢ／ｃ系マウスと他系マウス
とのＦ１マウスなどを用いることもできる。必要に応
じ、抗体価測定系を調製し、抗体価を測定して動物免疫
の程度を確認できる。

【００４７】３．ミエローマ細胞（骨髄腫細胞）の調製 細胞融合に使用される無限増殖可能株（腫瘍細胞株）と
しては免疫グロブリンを産生しない細胞株から選ぶこと
ができ、例えばＰ３−ＮＳ−１−Ａｇ４−１（ＮＳ−
１，Eur. J. Immunology, 6, 511〜519, 1976)、ＳＰ２
／０−Ａｇ１４（ＳＰ２，Nature, 276, 269〜270, 197
8 ) 、マウスミエローマＭＯＰＣ−２１セルライン由来
のＰ３−Ｘ６３−Ａｇ８−Ｕ１（Ｐ３Ｕ１，Current to
pics in Microbiol. and Immunol., 81, 1〜7, 1978
）、Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ８（Ｘ６３，Nature, 256, 49
5〜497, 1975 ) 、Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ８−６５３ (６
５３，J.Immunol., 123, 1548〜1550, 1979) などを用
いることができる。８−アザグアニン耐性のマウスミエ
ローマ細胞株はダルベッコＭＥＭ培地（ＤＭＥＭ培
地）、ＲＰＭＩ−１６４０培地などの細胞培地に、例え
ばペニシリン、アミカシンなどの抗生物質、牛胎児血清
（ＦＣＳ）などを加え、さらに８−アザグアニン（例え
ば５〜４５μｇ／ｍｌ）を加えた培地で継代されるが、
細胞融合の２〜５日前に正常培地で継代して所要数の細
胞株を用意することができる。また使用細胞株は、凍結
保存株を約３７℃で完全に解凍したのちＲＰＭＩ−１６
４０培地などの正常培地で３回以上洗浄後、正常培地で
培養して所要数の細胞株を用意したものであってもよ
い。

【００４８】４．抗体産生細胞とミエローマ細胞との細
胞融合 上記２．の工程に従い免疫された動物、例えばマウスは
最終免疫後、２〜５日後にその脾臓が摘出され、それか
ら脾細胞懸濁液を得る。脾細胞の他、生体各所のリンパ
節細胞を得て、それを細胞融合に使用することもでき
る。こうして得られた脾細胞懸濁液と上記３．の工程に
従い得られたミエローマ細胞株を、例えば最小必須培地
（ＭＥＭ培地）、ＤＭＥＭ培地、ＲＰＭＩ−１６４０培
地などの細胞培地中に置き、細胞融合剤、例えばポリエ
チレングリコールを添加する。細胞融合剤としては、こ
の他各種当該分野で知られたものを用いることができ、
この様なものとしては不活性化したセンダイウイルス
（ＨＶＪ：Ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎａｔｉｎｇ ｖｉｒ
ｕｓ ｏｆ Ｊａｐａｎ）なども挙げられる。好ましく
は、例えば３０〜６０％のポリエチレングリコールを
０．５〜２ｍｌ加えることができ、分子量が１，０００
〜８，０００のポリエチレングリコールを用いることが
でき、さらに分子量が１，０００〜４，０００のポリエ
チレングリコールがより好ましく使用できる。融合培地
中でのポリエチレングリコールの濃度は、例えば３０〜
６０％となるようにすることが好ましい。必要に応じ、
例えばジメチルスルホキシドなどを少量加え、融合を促
進することもできる。融合に使用する脾細胞（リンパ
球）：ミエローマ細胞株の割合は、例えば１：１〜２
０：１とすることが挙げられるが、より好ましくは４：
１〜７：１とすることができる。融合反応を１〜１０分
間行い、次にＲＰＭＩ−１６４０培地などの細胞培地を
加える。融合反応処理は複数回行うこともできる。融合
反応処理後、遠心などにより細胞を分離した後選択用培
地に移す。

【００４９】５．ハイブリドーマ（融合細胞）の選択及
びモノクローン化 選択用培地としては、例えばヒポキサンチン、アミノプ
テリン及びチミジンを含む、ＦＣＳ含有ＭＥＭ培地、Ｒ
ＰＭＩ−１６４０培地などの培地、所謂ＨＡＴ培地が挙
げられる。選択培地交換の方法は、一般的には培養プレ
ートに分注した容量と等容量を翌日加え、その後１〜３
日ごとにＨＡＴ培地で半量ずつ交換するというようにす
ることができるが、適宜これに変更を加えて行うことも
できる。また融合後８〜１６日目には、アミノプテリン
を除いた、所謂ＨＴ培地で１〜４日ごとに培地交換をす
ることができる。フィーダーとして、例えばマウス胸腺
細胞を使用することもでき、それが好ましい場合があ
る。ハイブリドーマの増殖のさかんな培養ウェルの培養
上清を、例えば放射免疫分析（ＲＩＡ）、酵素免疫分析
（ＥＬＩＳＡ）、蛍光免疫分析（ＦＩＡ）などの測定
系、あるいは蛍光惹起細胞分離装置（ＦＡＣＳ）など
で、ヒトＴＩＭＰ−３あるいはその断片ペプチドを抗原
として用いたり、あるいは標識抗マウス抗体を用いて目
的抗体を測定するなどして、スクリーニングしたり分離
する。目的抗体を産生しているハイブリドーマをクロー
ニングする。クローニングは、寒天培地中でコロニーを
ピック・アップするか、あるいは限界希釈法によりなさ
れうる。限界希釈法でより好ましく行うことができる。
クローニングは複数回行うことが好ましい。

【００５０】６．モノクローナル抗体の製造 得られたハイブリドーマ株は、ＦＣＳ含有ＭＥＭ培地、
ＲＰＭＩ−１６４０培地などの適当な増殖用培地中で培
養し、その培地上清から所望のモノクローナル抗体を得
ることが出来る。大量の抗体を得るためには、ハイブリ
ドーマを腹水化することが挙げられる。この場合ミエロ
ーマ細胞由来の動物と同系の組織適合性動物の腹腔内に
各ハイブリドーマを移植し、増殖させるか、例えばヌー
ド・マウスなどに各ハイブリドーマを移植し、増殖さ
せ、該動物の腹水中に産生されたモノクローナル抗体を
回収して得ることが出来る。動物はハイブリドーマの移
植に先立ち、プリスタン（２，６，１０，１４−テトラ
メチルペンタデカン）などの鉱物油を腹腔内投与してお
くことができ、その処理後、ハイブリドーマを増殖さ
せ、腹水を採取することもできる。腹水液はそのまま、
あるいは従来公知の方法、例えば硫酸アンモニウム沈殿
法などの塩析、セファデックスなどによるゲルろ過法、
イオン交換クロマトグラフィー法、電気泳動法、透析、
限外ろ過法、アフィニティ・クロマトグラフィー法、高
速液体クロマトグラフィー法などにより精製してモノク
ローナル抗体として用いることができる。好ましくは、
モノクローナル抗体を含有する腹水は、硫安分画した
後、ＤＥＡＥ−セファロースの如き、陰イオン交換ゲル
及びプロテインＡカラムの如きアフィニティーカラムな
どで処理し精製分離処理できる。特に好ましくは抗原又
は抗原断片（例えば合成ペプチド、組換え抗原タンパク
質あるいはペプチド、抗体が特異的に認識する部位な
ど）を固定化したアフィニティー・クロマトグラフィ
ー、プロテインＡを固定化したアフィニティー・クロマ
トグラフィーなどが挙げられる。

【００５１】またこうして大量に得られた抗体の配列を
決定したり、ハイブリドーマ株から得られた抗体をコー
ドする核酸配列を利用して、遺伝子組換え技術により抗
体を作製することも可能である。さらにこれら抗体をト
リプシン、パパイン、ペプシンなどの酵素により処理し
て、場合により還元して得られるＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ
（ａｂ’）₂ といった抗体フラグメントにして使用して
もよい。標識物を付与する抗体としては、ＩｇＧ画分、
更にはペプシン消化後還元して得られる特異的結合部Ｆ
ａｂ’を用いることができる。これらの場合の標識物の
例としては、下記するように酵素（ペルオキシダーゼ、
アルカリホスファターゼあるいはβ−Ｄ−ガラクトシダ
ーゼなど）、化学物質、蛍光物質あるいは放射性同位元
素などがある。本発明での検知・測定は、イムノ染色、
例えば組織あるいは細胞染色、イムノアッセイ、例えば
競合型イムノアッセイまたは非競合型イムノアッセイで
行うことができ、ラジオイムノアッセイ、ＥＬＩＳＡな
どを用いることができ、Ｂ−Ｆ分離を行ってもあるいは
行わないでその測定を行うことができる。好ましくは放
射免疫測定法や酵素免疫測定法であり、さらにサンドイ
ッチ型アッセイが挙げられる。例えばサンドイッチ型ア
ッセイでは、ヒトＴＩＭＰ−３に特異的に免疫反応する
モノクローナル抗体の一方を検出可能に標識化する。同
じ抗原を認識できる他の抗体を固相に固定化する。検体
と標識化抗体及び固相化抗体を必要に応じ順次反応させ
るためインキュベーション処理し、ここで非結合抗体を
分離後、標識物を測定する。測定された標識の量は抗
原、すなわちヒトＴＩＭＰ−３の量と比例する。このア
ッセイでは、不溶化抗体や、標識化抗体の添加の順序に
応じて同時サンドイッチ型アッセイ、フォワード（forw
ard)サンドイッチ型アッセイあるいは逆サンドイッチ型
アッセイなどと呼ばれる。こうして本発明に従えば、対
象抗原としてヒトＴＩＭＰ−３を含有する疑いのある被
検試料に第一の抗体と第二の抗体を接触させることによ
る前記対象抗原と前記第一の抗体と前記第二の抗体とか
らなる複合体を形成させる工程を含む免疫学的測定方法
において、前記第一の抗体と前記第二の抗体のいずれか
一方として、ＴＩＭＰ−３に特異的に免疫反応するモノ
クローナル抗体を用いることを特徴とする方法が提供さ
れることが明らかである。

【００５２】該免疫学的測定方法において、他方の抗体
としてはポリクローナル抗体、抗血清、あるいはモノク
ローナル抗体を用いることが出来るが、好ましくはモノ
クローナル抗体を用いることが出来る。例えば、測定試
薬としてヒトＴＩＭＰ−３の実質的に異なる２つの抗原
決定基に対し、それぞれ特異的に結合するモノクローナ
ル抗体の少なくとも２種を組み合わせることを特徴とす
る方法が挙げられる。より好ましくは（ｉ）前記第一の
抗体として、ヒトＴＩＭＰ−３のＫＫＬＶＫＥＧＰＦＧ
ＴＬＶＹＴ（Ｒ２６−４０）のアミノ酸配列又はその一
部を含む領域からなるヒトＴＩＭＰ−３関連ポリペプチ
ドに特異的に免疫反応するモノクローナル抗体を用い、
前記第二の抗体としてヒトＴＩＭＰ−３のＹＲＧＦＴＫ
ＭＰＨＶＱＹＩＨＴＥＡＳ（Ｒ４７−６４）のアミノ酸
配列又はその一部を含む領域及びヒトＴＩＭＰ−３のＳ
ＷＹＲＧＷＡＰＰＤＫＳＩＩＮＡＴＤＰ（Ｒ１７０−１
８８）のアミノ酸配列又はその一部を含む領域からなる
群から選ばれたヒトＴＩＭＰ−３関連ポリペプチドに特
異的に免疫反応するモノクローナル抗体を用いることを
特徴とする方法、あるいは（ｉｉ）前記第一の抗体とし
て、ヒトＴＩＭＰ−３のＳＷＹＲＧＷＡＰＰＤＫＳＩＩ
ＮＡＴＤＰ（Ｒ１７０−１８８）のアミノ酸配列又はそ
の一部を含む領域からなるヒトＴＩＭＰ−３関連ポリペ
プチドに特異的に免疫反応するモノクローナル抗体を用
い、前記第二の抗体としてヒトＴＩＭＰ−３のＫＫＬＶ
ＫＥＧＰＦＧＴＬＶＹＴ（Ｒ２６−４０）のアミノ酸配
列又はその一部を含む領域及びヒトＴＩＭＰ−３のＹＲ
ＧＦＴＫＭＰＨＶＱＹＩＨＴＥＡＳ（Ｒ４７−６４）の
アミノ酸配列又はその一部を含む領域からなる群から選
ばれたヒトＴＩＭＰ−３関連ポリペプチドに特異的に免
疫反応するモノクローナル抗体を用いることを特徴とす
る方法が挙げられる。

【００５３】別の態様では、測定試薬としてヒトＴＩＭ
Ｐ−３のうちアミノ酸に糖鎖の付加のない分子種と特異
的に免疫反応することを特徴とするモノクローナル抗体
を用い、アミノ酸に糖鎖の付加のないヒトＴＩＭＰ−３
を特異的に測定することを特徴とする方法、測定試薬と
してヒトＴＩＭＰ−３のうちアミノ酸に糖鎖の付加のあ
る分子種と特異的に免疫反応することを特徴とするモノ
クローナル抗体を用い、アミノ酸に糖鎖の付加のあるヒ
トＴＩＭＰ−３を特異的に測定することを特徴とする方
法、測定試薬としてヒトＴＩＭＰ−３のうちアミノ酸に
糖鎖の付加のない分子種と糖鎖の付加のある分子種を共
通して認識し、両分子種と免疫反応するモノクローナル
抗体を用い、ヒトＴＩＭＰ−３を測定することを特徴と
する方法、さらには測定試薬として（ｉ）ヒトＴＩＭＰ
−３のうちアミノ酸に糖鎖の付加のない分子種と免疫反
応することを特徴とするモノクローナル抗体および（ｉ
ｉ）ヒトＴＩＭＰ−３のうちアミノ酸に糖鎖の付加のあ
る分子種と免疫反応することを特徴とするモノクローナ
ル抗体の混合物を用い、ヒトＴＩＭＰ−３を測定するこ
とを特徴とする方法も挙げられる。こうした方法におい
て、例えば洗浄、撹拌、振盪、ろ過あるいは抗原の予備
抽出等は、特定の状況のもとでそれら測定工程の中で適
宜採用される。特定の試薬、緩衝液等の濃度、温度ある
いはインキュベーション処理時間などのその他の測定条
件は、検体中の抗原の濃度、検体試料の性質等の要素に
従い変えることができる。当業者は通常の実験法を用い
ながら各測定に対して有効な最適の条件を適宜選定して
測定を行うことが出来る。

【００５４】抗原あるいは抗体を固相化できる多くの担
体が知られており、本発明ではそれらから適宜選んで用
いることができる。担体としては、抗原抗体反応などに
使用されるものが種々知られており、本発明においても
勿論これらの公知のものの中から選んで使用できる。特
に好適に使用されるものとしては、例えばガラス、例え
ば活性化ガラス、多孔質ガラス、シリカゲル、シリカ−
アルミナ、アルミナ、磁化鉄、磁化合金などの無機材
料、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリ塩化ビニル、
ポリフッ化ビニリデン、ポリ酢酸ビニル、ポリメタクリ
レート、ポリスチレン、スチレン−ブタジエン共重合
体、ポリアクリルアミド、架橋ポリアクリルアミド、ス
チレン−メタクリレート共重合体、ポリグリシジルメタ
クリレート、アクロレイン−エチレングリコールジメタ
クリレート共重合体など、架橋化アルブミン、コラーゲ
ン、ゼラチン、デキストラン、アガロース、架橋アガロ
ース、セルロース、微結晶セルロース、カルボキシメチ
ルセルロース、セルロースアセテートなどの天然または
変成セルロース、架橋デキストラン、ナイロンなどのポ
リアミド、ポリウレタン、ポリエポキシ樹脂などの有機
高分子物質、さらにそれらを乳化重合して得られたも
の、細胞、赤血球などで、必要に応じ、シランカップリ
ング剤などで官能性基を導入してあるものが挙げられ
る。さらに、ろ紙、ビーズ、試験容器の内壁、例えば試
験管、タイタープレート、タイターウェル、ガラスセ
ル、合成樹脂製セルなどの合成材料からなるセル、ガラ
ス棒、合成材料からなる棒、末端を太くしたりあるいは
細くしたりした棒、末端に丸い突起をつけたりあるいは
偏平な突起をつけた棒、薄板状にした棒などの固体物質
（物体）の表面などが挙げられる。

【００５５】これら担体へは、抗体を結合させることが
でき、好ましくは本発明で得られるヒトＴＩＭＰ−３に
特異的に免疫反応するモノクローナル抗体を結合させる
ことができる。担体とこれら抗原抗体反応に関与するも
のとの結合は、吸着などの物理的な手法、あるいは縮合
剤などを用いたり、活性化されたものなどを用いたりす
る化学的な方法、さらには相互の化学的な結合反応を利
用した手法などにより行うことが出来る。標識として
は、酵素、酵素基質、酵素インヒビター、補欠分子類、
補酵素、酵素前駆体、アポ酵素、蛍光物質、色素物質、
化学ルミネッセンス化合物、発光物質、発色物質、磁気
物質、金属粒子、例えば金コロイドなど、放射性物質な
どを挙げることができる。酵素としては、脱水素酵素、
還元酵素、酸化酵素などの酸化還元酵素、例えばアミノ
基、カルボキシル基、メチル基、アシル基、リン酸基な
どを転移するのを触媒する転移酵素、例えばエステル結
合、グリコシド結合、エーテル結合、ペプチド結合など
を加水分解する加水分解酵素、リアーゼ、イソメラー
ゼ、リガーゼなどを挙げることができる。酵素は複数の
酵素を複合的に用いて検知に利用することもできる。例
えば酵素的サイクリングを利用することもできる。

【００５６】代表的な放射性物質の標識用同位体元素と
しては、〔³²Ｐ〕、〔¹²⁵ Ｉ〕、〔¹³¹Ｉ〕、〔
³Ｈ〕、〔 ¹⁴ Ｃ〕、〔³⁵Ｓ〕などが挙げられる。代表
的な酵素標識としては、西洋ワサビペルオキシダーゼな
どのペルオキシダーゼ、大腸菌β−Ｄ−ガラクトシダー
ゼなどのガラクトシダーゼ、マレエート・デヒドロゲナ
ーゼ、グルコース−６−ホスフェート・デヒドロゲナー
ゼ、グルコースオキシダーゼ、グルコアミラーゼ、アセ
チルコリンエステラーゼ、カタラーゼ、ウシ小腸アルカ
リホスファターゼ、大腸菌アルカリホスファターゼなど
のアルカリ・ホスファターゼなどが挙げられる。アルカ
リホスファターゼを用いた場合、４−メチルウンベリフ
ェリルホスフェートなどのウンベリフェロン誘導体、ニ
トロフェニルホスフェートなどのリン酸化フェノール誘
導体、ＮＡＤＰを利用した酵素的サイクリング系、ルシ
フェリン誘導体、ジオキセタン誘導体などの基質を使用
したりして、生ずる蛍光、発光などにより測定できる。
ルシフェリン、ルシフェラーゼ系を利用したりすること
もできる。カタラーゼを用いた場合、過酸化水素と反応
して酸素を生成するので、その酸素を電極などで検知す
ることもできる。電極としてはガラス電極、難溶性塩膜
を用いるイオン電極、液膜型電極、高分子膜電極などで
あることもできる。酵素標識は、ビオチン標識体と酵素
標識アビジン（ストレプトアビジン）に置き換えること
も可能である。標識は、複数の異なった種類の標識を使
用することもできる。こうした場合、複数の測定を連続
的に、あるいは非連続的に、そして同時にあるいは別々
に行うことを可能にすることもできる。

【００５７】本発明においては、信号の形成に４−ヒド
ロキシフェニル酢酸、１，２−フェニレンジアミン、テ
トラメチルベンジジンなどと西洋ワサビ・ペルオキシダ
ーゼ、ウンベリフェリルガラクトシド、ニトロフェニル
ガラクトシドなどとβ−D −ガラクトシダーゼ、グルコ
ース−６−リン酸・デヒドロゲナーゼなどの酵素試薬の
組合わせも利用でき、ヒドロキノン、ヒドロキシベンゾ
キノン、ヒドロキシアントラキノンなどのキノール化合
物、リポ酸、グルタチオンなどのチオール化合物、フェ
ノール誘導体、フェロセン誘導体などを酵素などの働き
で形成しうるものが使用できる。蛍光物質あるいは化学
ルミネッセンス化合物としては、フルオレセインイソチ
オシアネート、例えばローダミンＢイソチオシアネー
ト、テトラメチルローダミンイソチオシアネートなどの
ローダミン誘導体、ダンシルクロリド、ダンシルフルオ
リド、フルオレスカミン、フィコビリプロテイン、アク
リジニウム塩、ルミフェリン、ルシフェラーゼ、エクォ
リンなどのルミノール、イミダゾール、シュウ酸エステ
ル、希土類キレート化合物、クマリン誘導体などが挙げ
られる。標識するには、チオール基とマレイミド基の反
応、ピリジルジスルフィド基とチオール基の反応、アミ
ノ基とアルデヒド基の反応などを利用して行うことがで
き、公知の方法あるいは当該分野の当業者が容易になし
うる方法、さらにはそれらを修飾した方法の中から適宜
選択して適用できる。また上記免疫原性複合体作製に使
用されることのできる縮合剤、担体との結合に使用され
ることのできる縮合剤などを用いることができる。

【００５８】縮合剤としては、例えばグルタルアルデヒ
ド、ヘキサメチレンジイソシアネート、ヘキサメチレン
ジイソチオシアネート、Ｎ，Ｎ’−ポリメチレンビスヨ
ードアセトアミド、Ｎ，Ｎ’−エチレンビスマレイミ
ド、エチレングリコールビススクシニミジルスクシネー
ト、ビスジアゾベンジジン、１−エチル−３−（３−ジ
メチルアミノプロピル）カルボジイミド、スクシンイミ
ジル ３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（Ｓ
ＰＤＰ）、Ｎ−スクシンイミジル ４−（Ｎ−マレイミ
ドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート（Ｓ
ＭＣＣ）、Ｎ−スルホスクシンイミジル ４−（Ｎ−マ
レイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレー
ト、Ｎ−スクシンイミジル （４−ヨードアセチル）ア
ミノベンゾエート、Ｎ−スクシンイミジル ４−（１−
マレイミドフェニル）ブチレート、Ｎ−（ε−マレイミ
ドカプロイルオキシ）コハク酸イミド（ＥＭＣＳ），イ
ミノチオラン、Ｓ−アセチルメルカプトコハク酸無水
物、メチル−３−（４’−ジチオピリジル）プロピオン
イミデート、メチル−４−メルカプトブチリルイミデー
ト、メチル−３−メルカプトプロピオンイミデート、Ｎ
−スクシンイミジル−Ｓ−アセチルメルカプトアセテー
トなどが挙げられる。

【００５９】本発明の測定法によれば、測定すべき物質
を酵素などで標識したモノクローナル抗体などの標識抗
体試薬と、担体に結合された抗体とを順次反応させるこ
とができるし、同時に反応させることもできる。試薬を
加える順序は選ばれた担体系の型により異なる。感作さ
れたプラスチックなどのビーズを用いた場合には、酵素
などで標識したモノクローナル抗体などの標識抗体試薬
を測定すべき物質を含む検体試料と共に最初適当な試験
管中に一緒に入れ、その後該感作されたプラスチックな
どのビーズを加えることにより測定を行うことができ
る。本発明の定量法においては、免疫学的測定法が用い
られるが、その際の固相担体としては、抗体などタンパ
ク質を良く吸着するポリスチレン製、ポリカーボネイト
製、ポリプロピレン製あるいはポリビニル製のボール、
マイクロプレート、スティック、微粒子あるいは試験管
などの種々の材料および形態を任意に選択し、使用する
ことができる。測定にあたっては至適ｐＨ、例えばｐＨ
約４〜９に保つように適当な緩衝液系中で行うことがで
きる。特に適切な緩衝剤としては、例えばアセテート緩
衝剤、クエン酸塩緩衝剤、ホスフェート緩衝剤、トリス
緩衝剤、トリエタノールアミン緩衝剤、ボレート緩衝
剤、グリシン緩衝剤、炭酸塩緩衝剤、トリス−塩酸緩衝
剤などが挙げられる。緩衝剤は互いに任意の割合で混合
して用いることができる。抗体抗原反応は約０℃〜６０
℃の間の温度で行うことが好ましい。

【００６０】酵素などで標識されたモノクローナル抗体
などの抗体試薬及び担体に結合せしめられた抗体試薬、
さらには測定すべき物質のインキュベーション処理は、
平衡に達するまで行うことができるが、抗体抗原反応の
平衡が達成されるよりもずっと早い時点で固相と液相と
を分離して限定されたインキュベーション処理の後に反
応を止めることができ、液相又は固相のいずれかにおけ
る酵素などの標識の存在の程度を測ることができる。測
定操作は、自動化された測定装置を用いて行うことが可
能であり、ルミネセンス・ディテクター、ホト・ディテ
クターなどを使用して基質が酵素の作用で変換されて生
ずる表示シグナルを検知して測定することもできる。抗
体抗原反応においては、それぞれ用いられる試薬、測定
すべき物質、さらには酵素などの標識を安定化したり、
抗体抗原反応自体を安定化するように適切な手段を講ず
ることができる。さらに、非特異的な反応を除去し、阻
害的に働く影響を減らしたり、あるいは測定反応を活性
化したりするため、タンパク質、安定化剤、界面活性化
剤、キレート化剤などをインキュベーション溶液中に加
えることもできる。キレート化剤としては、エチレンジ
アミン四酢酸塩（ＥＤＴＡ）がより好ましい。当該分野
で普通に採用されていたりあるいは当業者に知られた非
特異的結合反応を防ぐためのブロッキング処理を施して
もよく、例えば、哺乳動物などの正常血清タンパク質、
アルブミン、スキムミルク、乳発酵物質、コラーゲン、
ゼラチンなどで処理することができる。非特異的結合反
応を防ぐ目的である限り、それらの方法は特に限定され
ず用いることが出来る。本発明の測定方法で測定される
試料としては、あらゆる形態の溶液やコロイド溶液、非
流体試料などが使用しうるが、好ましくは生物由来の試
料、例えば血液、血漿、関節液、脳脊髄液、唾液、羊
水、尿、その他の体液、細胞培養液、組織培養液、組織
ホモジュネート、生検試料、組織、細胞などが挙げられ
る。こうしてヒトＴＩＭＰ−３に特異的に免疫反応する
モノクローナル抗体を測定試薬として用いることを特徴
とするヒトＴＩＭＰ−３の免疫学的測定方法及びそのた
めの試薬が提供されることが明らかである。なお、本発
明のＤＮＡも上記抗体と同様に処理することが出来、そ
れ自体公知の方法又はそれと実質的に同様な方法で標識
されたり、測定に用いることができることは理解される
べきである。

【００６１】本発明の前述した種々の態様を利用するこ
とにより、癌細胞の有無、癌の悪性度の診断等の癌の診
断治療に関わる研究に有用な診断手段として、あるいは
その他の医学的生理学的用途に適用される種々の技術手
段を提供することができる。以下に実施例を掲げ、本発
明を具体的に説明するが、本発明はこれら実施例に限定
されず、本明細書の思想に基づく様々な実施形態が可能
であることは理解されるべきである。なお、明細書及び
図面において、塩基及びアミノ酸等を略号で表示する場
合、ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ Commision on Biochemical N
omenclature によるか、あるいは当該分野において慣用
的に使用される用語の意味に基づくものであり、アミノ
酸に光学異性体が存在する場合は、特に断らないかぎり
Ｌ−体を示す。

【００６２】

【実施例】以下に実施例を挙げ、本発明を具体的に説明
するが、本発明は実施例に限定されること無く様々な態
様が含まれることは理解されるべきである。 実施例１ 組換えヒトＴＩＭＰ−３の発現 ａ．ヒトＴＩＭＰ−３遺伝子のクローニング Apte et al., Genomics, 19, 86-90,(1994) の報告に基
づいてＰＣＲプライマー( 図１; T3F1, T3R1) を合成し
た。 （配列番号：４） AGGATCCGAGCATGCACATGCTCGCCCAGC (T3F1) （配列番号：５） ATCTAGACTCAGGGGTCTGTGGCATTGATG (T3R1) ヒト胎盤cDNAライブラリー（CLONTECH）を鋳型としてＰ
ＣＲを行い、ヒトＴＩＭＰ−３遺伝子のクローニングを
試みた。ＰＣＲ反応は上記合成プライマーT3F1, T3R1各
５００pM、０．２５mM dNTPs、10倍に希釈したヒト胎盤
cDNAライブラリー１μl 、Taq DNA polymerase 0.5μl
及び酵素に添付されたバッファー 5μl の反応液の組成
物を総反応溶液量50μlとしたものを、92℃・１分30
秒、42℃・２分、72℃・１分30秒のサイクルを30回繰り
返して増幅を行った。増幅産物の確認は２．０％アガロ
ース・ゲル電気泳動及びエチジウム・ブロミド染色によ
って行った。

【００６３】ＰＣＲ後の反応産物は２．０％の低融点ア
ガロース・ゲル電気泳動にて分離した後、バンドの部分
をカミソリで切り出し、次に熱融解、フェノール抽出、
エタノール沈殿を行ってＤＮＡを回収した。得られた58
7bpsの長さを持つＰＣＲ産物ＤＮＡについて、制限酵素
HindIII, PvuII, ApaI およびKpnI（New England Biol
abs, Inc. ）による切断を行ったところ、ヒトTIMP-3の
遺伝子配列から予想される断片を示した。すなわち、Hi
ndIII による切断では 390と197bpsの断片が、PvuII に
よる切断では 521と66bps の断片が、ApaIによる切断で
は430,110 と47bps の断片が、さらにKpnIによる切断で
は 528と59bps の断片が観察された。この確認は２．０
％アガロース・ゲル電気泳動及びエチジウム・ブロミド
染色によって行った。この断片をＰＣＲプライマー上の
制限酵素サイト(SphI およびXbaI) で切断し（制限酵素
はNew England Biolabs, Inc. のものを使用した）、pU
C18 （Pharmacia Biotech ）をSphIおよびXbaIで開いた
ベクターと連結しpUCHT3を構築した( 図２) 。ライゲー
ションは、挿入 DNA断片150ng とベクターDNA50ngをT4
DNAリガーゼ（New England Biolabs, Inc. ）0.5 μl
および酵素に添付されたバッファー 2μl の反応液の組
成物を総反応液量20μl とし16℃、 4時間で行なった。
サブクローニング・ベクターpUCHT3を大腸菌ＪＭ１０９
competent cell （宝酒造）に導入して形質転換したの
ち、挿入ＤＮＡ断片をもつクローンを、50μg/mlアンピ
シリン、 1mMＩＰＴＧ及び40μg/mlＸ−ｇａｌを含むＬ
Ｂ寒天培地中で選択し、白色を呈するクローンのみを拾
い上げる。得られたクローンを50μg/mlアンピシリンを
含むＬＢ培地中で一晩培養し、アルカリ／ＳＤＳ法でプ
ラスミドＤＮＡを調製した。調製したＤＮＡをＲＮａｓ
ｅ処理、フェノール抽出、エタノール沈殿を行ってＤＮ
Ａを濃縮した。この断片は成熟型ヒトＴＩＭＰ−３をコ
ードしており、分泌シグナル領域は含んでいないと考え
られる。

【００６４】ｂ．分泌シグナルベクターの構築 ヒトＴＩＭＰ−１遺伝子をサブクローニングしたベクタ
ーpFYK3 を鋳型とし、ＰＣＲプライマー( 図３; JR1, Q
53F1) でＰＣＲを行った。ベクターpFYK3 は、特開平5-
199868に開示されたベクターpUFYK-1 から制限酵素SalI
およびEcoRI で切出したヒトTIMP-1遺伝子をSalIおよび
EcoRI で開いたpBluescript II KS に連結して調製し
た。 （配列番号：６） TGGGACACAGGTGCATGCCCTGCT (JR1) （配列番号：７） GAAGTCCAGCAGACCACCTTA (Q53F1) ＰＣＲ反応は上記合成プライマーJR1 、Q53F1 各500pM
、0.25mM dNTPs、pFYK3 10ng、Taq DNA polymerase 0.
5μl 及び酵素に添付されたバッファー 5μl の反応液
の組成物を総反応液量50μl としたものを、92℃・１分
30秒、42℃・２分、72℃１分30秒のサイクルを30回繰り
返して増幅を行なった。ＰＣＲ後の反応産物は上記ａと
同様にして単離処理してＤＮＡを回収した。精製して得
られた3.5kbps の増幅断片を、クレノーフラグメント、
ポリヌクレオチドキナーゼで末端を平滑化し、セルフラ
イゲーションにより、pTS3を構築した( 図２) 。pTS3
は、pFYK3 のベースであるpBluescript II KS とTIMP-1
分泌シグナル領域および成熟型ヒトＴＩＭＰ−１の一部
を含んでいる( 図２) 。ヒトＴＩＭＰ−１分泌シグナル
の3'末端にはプライマーJR1 に由来するSphIサイトが導
入されている( 図３) 。上記ａと同様にして大腸菌ＪＭ
１０９ competent cell （宝酒造）に導入して形質転換
して、形質転換されたクローンよりヒトＴＩＭＰ−１分
泌シグナル領域を含有するベクターを調製した。

【００６５】ｃ．キメラ遺伝子の構築 pTS3およびpUCHT3を制限酵素SphIおよび EcoRI（New En
gland Biolabs, Inc.）で切断し、それぞれよりベクタ
ー部分とヒトＴＩＭＰ−３遺伝子を上記ａと同様にして
単離精製処理した後、連結した。ライゲーションは上記
ａと同様にして行なった。得られたpTSHT3はヒトＴＩＭ
Ｐ−１分泌シグナル−成熟型ヒトＴＩＭＰ−３キメラ遺
伝子を含んでいる( 図２および４) 。上記ａと同様にし
て大腸菌ＪＭ１０９ competent cell （宝酒造）に導入
して形質転換して、形質転換されたクローンよりヒトＴ
ＩＭＰ−１分泌シグナル−成熟型ヒトＴＩＭＰ−３キメ
ラ遺伝子（ヒトＴＩＭＰ−１／−３キメラ遺伝子）を含
有するベクターを調製した。ベクターpTSHT3を含んだ大
腸菌 JM109（pTSHT3/JM109）は、工業技術院生命工学工
業技術研究所に寄託した（生工研受託番号ＦＥＲＭ Ｐ
−１５４２０）。

【００６６】ｄ．発現ベクターの構築 pTSHT3より制限酵素BamHI あるいはXbaIでヒトＴＩＭＰ
−１分泌シグナル−成熟型ヒトＴＩＭＰ−３キメラ遺伝
子を切出し、大腸菌用発現ベクターpEX2(BamHIサイト，
ベーリンガーマンハイム) 、動物細胞用発現ベクターpS
G5(COS細胞; BamHI サイト，Stratagene) 、およびpRc/
CMV (CHO細胞; XbaIサイト，invitrogen) に挿入して発
現ベクターを構築する( 図５) 。ライゲーションは上記
ａと同様にして行う。同様にpTSHT3より制限酵素BamHI
あるいはXbaIでヒトＴＩＭＰ−１分泌シグナル−成熟型
ヒトＴＩＭＰ−３キメラ遺伝子を切出し、大腸菌用発現
ベクターpUR292 (BamHI サイト) 、動物細胞用発現ベク
ターpSG6 ( COS細胞; BamHI サイト) 、およびpCMV (CH
O 細胞; XbaIサイト) に挿入して発現ベクターを構築し
た( 図６) 。このライゲーションも上記ａと同様にして
行った。

【００６７】ｅ．大腸菌でのヒトTIMP-3発現の確認 得られたヒトＴＩＭＰ−１分泌シグナル−成熟型ヒトＴ
ＩＭＰ−３キメラ遺伝子が正常にヒトＴＩＭＰ−３を発
現できるか否かを原核細胞である大腸菌を宿主細胞とし
て用いて検討した。大腸菌用発現ベクターpEX2にヒトＴ
ＩＭＰ−１分泌シグナル−成熟型ＴＩＭＰ−３キメラ遺
伝子を挿入して得られるpEXHT3( 図５) で大腸菌N4830-
l(Pharmacia Biotech)を形質転換し、β- ｇａｌ−ヒト
ＴＩＭＰ−３融合タンパク質の発現を誘導する。pEXHT3
を受容した大腸菌株 N4830-lを50μg/mlアンピシリンを
含むＬＢ培地中で30℃、一晩培養する。この１次培養液
から50μl を採り、５mlの50μg/mlアンピシリンを含む
ＬＢ培地に接種し、O.D.550 が0.4 になるまで30℃で培
養し２次培養とする。２次培養液をさらに２時間42℃で
培養を継続、氷冷後、遠心で細胞を集める。同様にし
て、大腸菌用発現ベクターpUR292にヒトＴＩＭＰ−１分
泌シグナル−成熟型ヒトＴＩＭＰ−３キメラ遺伝子を挿
入して得られたpURHT3( 図６) で大腸菌JM109 を形質転
換し、β- ｇａｌ−ヒトＴＩＭＰ−３融合タンパク質の
発現を誘導した。pURHT3を受容した大腸菌株JM109 を50
μg/mlアンピシリンを含むＬＢ培地中で37℃、一晩培養
した。この１次培養液から50μl を採り、５mlの50μg/
mlアンピシリンを含むＬＢ培地に接種し、O.D.550 が0.
4 になるまで37℃で培養し２次培養とした。２次培養液
に最終濃度1mM となるようにIPTGを添加しさらに２時間
37℃で培養を継続、氷冷後、遠心で細胞を集めた。PBS
で細胞画分を２回洗浄後、250 μl のPBS で懸濁し超音
波破砕で細胞ライゼートを調製した。形質転換大腸菌の
ライゼートをドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）−ポリ
アクリルアミド・ゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）にかけＣＢ
Ｂ染色して発現タンパク質を確認した。この大腸菌は、
誘導により分子量約140kDaの組換えタンパク質を発現し
た( 図７) 。β- ｇａｌ−ヒトＴＩＭＰ−３融合タンパ
ク質の分子量は約140kDa( β-gal; 116kDa, 糖鎖非修飾
型TIMP-3; 24kDa)と見積もられることから、ヒトＴＩＭ
Ｐ−１分泌シグナル−成熟型ヒトＴＩＭＰ−３キメラ遺
伝子が機能したことが示された。

【００６８】ｆ．動物細胞株での組換えヒトＴＩＭＰ−
３の発現 1. COS細胞における一過性発現 動物細胞用発現ベクターpSG5にヒトＴＩＭＰ−１分泌シ
グナル−成熟型ヒトＴＩＭＰ−３キメラ遺伝子を挿入し
て得られる下記pSGHT3と実質的に同一のベクター（10μ
g ) からリン酸カルシウム沈殿法で調製されるリン酸カ
ルシウム−ＤＮＡ共沈液(1ml）をCOS-1 細胞(5×10⁵cel
l/dish, 培地；10% FCS を含むDMEM，10ml) に加え、16
時間培養して遺伝子を導入する。同様にして、動物細胞
用発現ベクターpSG6にヒトＴＩＭＰ−１分泌シグナル−
成熟型ヒトＴＩＭＰ−３キメラ遺伝子を挿入して得られ
たpSGHT3（10μg ；図６) からリン酸カルシウム沈殿法
で調製したリン酸カルシウム−ＤＮＡ共沈液(1ml）をCO
S-1 細胞(5×10⁵cell/dish, 培地；10% FCS を含むDME
M，10ml) に加え、16時間培養して遺伝子を導入した。P
BS で細胞を洗浄した後、FCS 不含のDMEM, 10mlで48時
間培養を継続し、細胞と培養上清を回収した。回収した
培養上清は遠心により不溶成分を除去した後ウルトラフ
リー C3LGC（ミリポア）で濃縮（1/20容）した。細胞は
氷冷下でセルスクレーパーを用いて培養プレート（直径
10cm）からかきとり、１ｍｌのPBS で懸濁して回収し
た。遠心によりPBS で細胞画分を２回洗浄後、100 μｌ
のPBS に再懸濁し超音波破砕で細胞ライゼートを調製し
た。

【００６９】2. CHO細胞における連続発現 動物細胞用発現ベクターpRc/CMV にヒトＴＩＭＰ−１分
泌シグナル−成熟型ＴＩＭＰ−３キメラ遺伝子を挿入し
て得られる下記pCMVHT3 と実質的に同一のベクター(10
μg ) からリン酸カルシウム沈殿法で調製されるリン酸
カルシウム−ＤＮＡ共沈液(1ml）をCHO 細胞(5×10⁵cel
l/dish, 培地；10% FCS を含むα-MEM,10ml) に加え16
時間培養して遺伝子を導入する。遺伝子を導入されたCH
O 細胞は10%FCS，800 μm/ml geneticinを含むα-MEMで
培養し、pCMVHT3 を受容した細胞を選択する。さらに限
界希釈法でクローンＴＲＭ−Ｄを得、10% FCS を含むα
-MEMでコンフルエントまで培養、10%FCS不含のα-MEM,
10mlに交換し48時間培養を継続して細胞と培養上清を回
収する。同様な手法で、動物細胞用発現ベクターpCMVに
ヒトＴＩＭＰ−１分泌シグナル−成熟型ヒトＴＩＭＰ−
３キメラ遺伝子を挿入して得られたpCMVHT3(10μg ；図
６) と10μg のpSV2-dhfr からリン酸カルシウム沈殿法
で調製したリン酸カルシウム−ＤＮＡ共沈液(1ml）をCH
O dhfr^- 細胞(5×10⁵cell/dish, 培地；10% FCS を含む
α-MEM, 10ml) に加え16時間培養して遺伝子を導入し
た。遺伝子を導入したCHO 細胞は10%FCS, 800 μm/ml g
eneticinを含むα-MEMで培養し、pCMVHT3 を受容した細
胞を選択、続いて10％透析FCS, 800μm/ml geneticin,
5 ×10^-8M methotrexate(MTX) を含むα-MEM（リボヌク
レオシド、デオキシリボヌクレオシド不含）で培養、dh
frおよびヒトＴＩＭＰ−１分泌シグナル−成熟型ＴＩＭ
Ｐ−３キメラ遺伝子の増幅を誘導した。MTX 濃度を1 ×
10^-7M まで上昇させた条件下で安定して増殖する細胞を
選択、限界希釈法でクローニングした。MTX 濃度1 ×10
^-7M 耐性株からクローン番号ＴＲＭ−１Ｇ１２を選択、
10% FCS を含むα-MEMでコンフルエントまで培養、FCS
不含のα-MEM, 10mlに交換し48時間培養を継続して細胞
と培養上清を回収した。細胞ライゼートおよび培養上清
は上記ｆ．１と同様にして調製した。 上記ｆ．１及び
２で得られた細胞ライゼートおよび培養上清は上記ｅと
同様にしてその内に発現タンパク質が存在していること
を確認できる。

【００７０】実施例２ ヒトＴＩＭＰ−３ポリペプチ
ドの合成 ヒトＴＩＭＰ−３ポリペプチドとしてApte et al., Gen
omics, 19, 86-90.(1994) に記載のアミノ酸配列を参考
にして、以下のポリペプチドをペプチドシンセサイザー
９６００（ミリジェン／バイオサーチ製）で合成した。 （配列番号：１） ＫＫＬＶＫＥＧＰＦＧＴＬＶＹＴ（Ｒ２６−４０） （配列番号：２） ＹＲＧＦＴＫＭＰＨＶＱＹＩＨＴＥＡＳ（Ｒ４７−６
４） および （配列番号：３） ＳＷＹＲＧＷＡＰＰＤＫＳＩＩＮＡＴＤＰ（Ｒ１７０−
１８８） なお、ペプチドＮ末端にシスティンを導入した。

【００７１】ＫＫＬＶＫＥＧＰＦＧＴＬＶＹＴ（Ｒ２６
−４０）は、ヒトＴＩＭＰ−１の相同部位に対して１３
％、ヒトＴＩＭＰ−２の相同部位に対して３３％の相同
性を示し、ＹＲＧＦＴＫＭＰＨＶＱＹＩＨＴＥＡＳ（Ｒ
４７−６４）は、ヒトＴＩＭＰ−１の相同部位に対して
２８％、ヒトＴＩＭＰ−２の相同部位に対して２８％の
相同性を示し、ＳＷＹＲＧＷＡＰＰＤＫＳＩＩＮＡＴＤ
Ｐ（Ｒ１７０−１８８）は、ヒトＴＩＭＰ−１の相同部
位に対して５％、ヒトＴＩＭＰ−２の相同部位に対して
４７％の相同性を示した（表１）。免疫源の選択にあた
り、これらを免疫源として調製されるモノクローナル抗
体がヒトＴＩＭＰ−１およびヒトＴＩＭＰ−２と交差反
応せず、ヒトＴＩＭＰ−３に特異的に反応するよう考慮
した。また、いずれのポリペプチドもヒトＴＩＭＰ−３
分子のなかで親水性を示す領域を含むように選択し、抗
原性をより示しやすいよう考慮した。

【００７２】

【表１】

【００７３】実施例３ 抗ヒトＴＩＭＰ−３ポリペプ
チド（配列番号：３）抗体の作製 ａ．抗原コンジュゲートの調製 ０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に溶解した２０
８．８ｎｍｏｌｅのＢＳＡにジメチルホルムアミド（Ｄ
ＭＦ）に溶解したＥＭＣＳをＢＳＡの２００倍モル量添
加し、３０℃、３０分間インキュベートした。上記混合
液を０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で平衡化した
ＰＤ−１０カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）でゲルろ過
し、マレイミドが結合したＢＳＡを分取し２．１ｍｌに
濃縮した。マレイミドが結合したＢＳＡに対して５０倍
モル量の合成ポリペプチドＣＳＷＹＲＧＷＡＰＰＤＫＳ
ＩＩＮＡＴＤＰ（０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）
溶解液）を混合し４℃、２０時間インキュベートしポリ
ペプチド−ＢＳＡ複合体を調製した。

【００７４】ｂ．免疫及び抗体産生細胞の調製 ポリペプチド−ＢＳＡ複合体を２００μｇを完全フロイ
ントアジュバントと共に、６週令ＢＡＬＢ／ｃ雌マウス
２匹にそれぞれ腹腔内投与し、初回免疫とした。その後
１８日目に０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）に溶解
した２００μｇのポリペプチド−ＢＳＡ複合体を腹腔内
に投与し追加免疫した。最終免疫として、５３日目に
０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）に溶解したポリペ
プチド−ＢＳＡ複合体９３．３μｇを静脈内に、１０
６．７μｇを腹腔内に投与し、３日後にマウス脾臓を取
りだし脾細胞を調製した。

【００７５】ｃ．細胞融合 （１）以下の材料および方法を用いた。 ＲＰＭＩ−１６４０培地：ＲＰＭＩ−１６４０（Ｆｌｏ
ｗ Ｌａｂ．）に重炭酸ナトリウム（２４ｍＭ）、ピル
ビン酸ナトリウム（１ｍＭ）、ペニシリンＧカリウム
（５０Ｕ／ｍｌ）、硫酸アミカシン（１００μｇ／ｍ
ｌ）を加え、ドライアイスでｐＨを７．２にし、０．２
μｍ東洋メンブレンフィルターで除菌ろ過した。 ＮＳ−１培地：上記ＲＰＭＩ−１６４０培地に除菌ろ過
したＦＣＳ（Ｍ．Ａ．Ｂｉｏｐｒｏｄｕｃｔｓ）を１５
％（ｖ／ｖ）の濃度になるように加えた。 ＰＥＧ４０００溶液：ＲＰＭＩ−１６４０培地にポリエ
チレングリコール４０００（ＰＥＧ ４０００，Ｍｅｒ
ｋ ＆ Ｃｏ．）を５０％（ｗ／ｗ）になるように加
え、無血清溶液を調製した。 ８−アザグアニン耐性ミエローマ細胞ＳＰ２（ＳＰ２／
０−Ａｇ１４）との融合は、Selected Method in Cellu
lar Immunology pp351-372(ed. B. B. Mishelland S.
N. Shiigi), W. H. Freeman and Company (1980)に記載
のＯｉらの方法を若干改変して行った。

【００７６】（２）以下では、ポリペプチド−ＢＳＡ複
合体で免疫したマウス由来の有核脾細胞とミエローマ細
胞ＳＰ２との融合に関して詳述する。前記（ｂ）で調製
した有核脾細胞（生細胞率１００％）それぞれとミエロ
ーマ細胞（生細胞率１００％）とを５：１の比率で以下
の手順で融合した。脾細胞懸濁液とミエローマ細胞をそ
れぞれＲＰＭＩ１６４０培地で洗浄した。次に同じ培地
に懸濁し、融合させるために有核脾細胞６. ５×１０⁸
個とミエローマ細胞１. ３×１０⁸ 個を混合した。次に
遠心分離により細胞を沈殿させ、上清を完全に吸引除去
した。沈殿した細胞に３７℃に加温したＰＥＧ４０００
溶液［５０％（ｗ／ｖ）ポリエチレングリコール４００
０含有ＲＰＭＩ１６４０培地］７. １ｍｌを１分間で滴
下し、１分間攪拌し、細胞を再懸濁、分散させた。次に
３７℃に加温したＲＰＭＩ１６４０培地１４. ２ｍｌを
２分間で滴下した後、同培地４９. ７ｍｌを２〜３分間
で常に攪拌しながら滴下し、細胞を分散させた。これを
遠心分離し、上清を完全に吸引除去した。次にこの沈殿
した細胞に３７℃に加温したＮＳ−１培地［除菌ろ過し
た１５％（ｗ／ｖ）仔牛胎児血清（ＪＲＨ Ｂｉｏｓｃ
ｉｅｎｃｅｓ）含有ＲＰＭＩ１６４０培地］７１ｍｌを
速やかに加え、大きい細胞塊を注意深くピペッティング
で分散した。さらに同培地１４２ｍｌを加えて希釈し、
ポリスチレン製９６穴マイクロウェルにウェル当り６.
０×１０⁵ 個／０. １ｍｌの細胞を加えた。細胞を加え
た上記マイクロウェルを７％炭酸ガス／９３％空気中で
温度３７℃、湿度１００％で培養した。

【００７７】ｄ．選択培地によるハイブリドーマの選択
的増殖 （１）使用する培地は以下の通りである。 ＨＡＴ培地：前記（ｃ）（１）で述べたＮＳ−１培地に
更にヒポキサンチン（１００μＭ）、アミノプテリン
（０．４μＭ）およびチミジン（１６μＭ）を加えた。 ＨＴ培地：アミノプテリンを除去した以外は上記ＨＡＴ
培地と同一組成のものである。 （２）前記（ｃ）の培養開始後翌日（１日目）、細胞に
パスツールピペットでＨＡＴ培地２滴（約０. １ｍｌ）
を加えた。２、３、５、８日目に培地の半分（約０. １
ｍｌ）を新しいＨＡＴ培地で置き換え、１１日目に培地
の半分を新しいＨＴ培地で置き換えた。１４日目にハイ
ブリドーマの生育が肉眼にて認められた全ウエルについ
て固相−抗体結合テスト法（ＥＬＩＳＡ）により陽性ウ
エルを調べて、抗ヒトＴＩＭＰ−３ポリペプチド抗体産
生ハイブリドーマを検索した。すなわち、ポリスチレン
性９６穴プレートを抗原としたポリペプチド（１００ｎ
ｇ／ウエル）でそれぞれコートして固相化抗原とし、次
に洗浄用ＰＢＳ（０.０５％Ｔｗｅｅｎ２０含有）を用
いて洗浄して未吸着のペプチドを除いた。さらに各ウエ
ルの未コート部分を１％ＢＳＡでブロックした。この各
ウエルにハイブリドーマの生育が確認されたウエルの上
清０. １ｍｌを添加し、室温で約１時間静置した。２次
抗体として西洋わさびペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）標識
ヤギ抗マウス免疫グロブリン（Ｃａｐｐｅｌ Ｌａ
ｂ．）を加え、さらに室温で約１時間静置した。次に基
質である過酸化水素とο- フェニレンジアミンを加え、
発色の程度をマイクロプレート用吸光度測定機（ＭＲＰ
−Ａ４、東ソー）を用いて４９２ｎｍの吸光度で測定し
た。

【００７８】ｅ．ハイブリドーマのクローニング 上記（ｄ）で得られた抗原ペプチドに対する陽性ウエル
中の各ハイブリドーマを、限界希釈法を用いてモノクロ
ーン化した。すなわち、ＮＳ−１培地 １ｍｌ当りフィ
ーダーとして１０⁷ 個のマウス胸腺細胞を含むクローニ
ング培地を調製し、９６穴マイクロウエルにハイブリド
ーマをウエル当り５個、１個、０. ５個になるように希
釈し、それぞれ３６穴、３６穴、２４穴に加えた。５日
目、１２日目に全ウエルに約０. １ ｍｌのＮＳ−１培
地を追加した。クローニング開始後約２週間で、肉眼的
に十分なハイブリドーマの生育を認め、コロニー形成陰
性ウエルが５０％以上である群について（ｄ）に記載し
たＥＬＩＳＡを行った。調べた全ウエルが陽性でない場
合、抗体陽性ウエル中のコロニー数が１個のウエルを４
〜６個選択し、再クローニングを行った。最終的にポリ
ペプチド（配列番号：３、ＳＷＹＲＧＷＡＰＰＤＫＳＩ
ＩＮＡＴＤＰ）に対するモノクローナル抗体を産生する
ハイブリドーマが１６クローン得られた。

【００７９】ｆ．モノクローナル抗体の精製 得られた各ハイブリドーマ細胞をＮＳ−１培地で培養
し、その上清から濃度１０〜１００μｇ／ｍｌのモノク
ローナル抗体を得ることができた。また、得られたハイ
ブリドーマの１０⁷ 個を予め１週間前にプリスタンを腹
腔内投与したマウス（ＢＡＬＢ／ｃ系、♀、６週齢）に
同じく腹腔内投与し、１〜２週間後、腹水中からも４〜
７ｍｇ／ｍｌのモノクローナル抗体を含む腹水を得るこ
とができた。得られた腹水を４０％飽和硫酸アンモニウ
ムで塩析後、抗体をプロテインＧゲル（Ｐｈａｒｍａｃ
ｉａ）に吸着させ、０. １Ｍグリシン−塩酸緩衝液（ｐ
Ｈ２．７）で溶出することにより精製した。

【００８０】ｇ．モノクローナル抗体のクラス、サブク
ラスの決定 前述したＥＬＩＳＡに従い、ポリペプチド（配列番号：
３、ＳＷＹＲＧＷＡＰＰＤＫＳＩＩＮＡＴＤＰ）をコー
トしたマイクロタイトレーションプレートに、上記
（ｆ）で得られたモノクローンの上清を加えた。次にＰ
ＢＳで洗浄後、アイソタイプ特異的ウサギ抗マウスＩｇ
Ｇ抗体（Ｚｙｍｅｄ Ｌａｂ. ）を加えた。ＰＢＳによ
り洗浄後、西洋わさびペルオキシダーゼ標識ヤギ抗ウサ
ギＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）を加え、基質として過酸化水素およ
び２，２’−アジノ−ジ（３−エチルベンゾチアゾリン
酸）を用いてクラス、サブクラスを決定した。モノクロ
ーナル抗体のアイソタイプを調べたところ、γ１／κが
６種、γ２ａ／κが４種、γ２ｂ／κが２種、γ３／κ
が３種、μ／κが１種であった。

【００８１】実施例４ 抗ヒトＴＩＭＰ−３ポリペプ
チド（配列番号：１）抗体の作製 ａ．抗原コンジュゲートの調製 ０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に溶解した１８
５．３ｎｍｏｌｅのＢＳＡにジメチルホルムアミド（Ｄ
ＭＦ）に溶解したＥＭＣＳをＢＳＡの２００倍モル量添
加し、３０℃、３０分間インキュベートした。上記混合
液を０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で平衡化した
ＰＤ−１０カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ製）でゲルろ過
し、マレイミドが結合したＢＳＡを分取し、１．３６ｍ
ｌに濃縮した。マレイミドが結合したＢＳＡに対して５
０倍モル量の合成ポリペプチドＣＫＫＬＶＫＥＧＰＦＧ
ＴＬＶＹＴ（０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）溶解
液）を混合し４℃、２０時間インキュベートしポリペプ
チド−ＢＳＡ複合体を調製した。

【００８２】ｂ．免疫及び抗体産生細胞の調製 ポリペプチド−ＢＳＡ複合体を２００μｇを完全フロイ
ントアジュバントと共に、６週令ＢＡＬＢ／ｃ雌マウス
２匹にそれぞれ腹腔内投与し、初回免疫とした。その後
１８日目に０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）に溶解
した２００μｇのポリペプチド−ＢＳＡ複合体を腹腔内
に投与し追加免疫した。最終免疫として、５５日目に
０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）に溶解したポリペ
プチド−ＢＳＡ複合体を１８０μｇを腹腔内に投与し、
３日後にマウス脾臓を取りだし脾細胞を調製した。

【００８３】ｃ．細胞融合及びクローニング 細胞融合は上記実施例３（ｃ）に記載の方法と同様にし
て行った。融合には有核脾細胞６．１×１０⁸ 個とミエ
ローマ細胞１．２×１０⁸ 個を用いた。また選択培地に
よるハイブリドーマの選択的増殖、ハイブリドーマのク
ローニング、モノクローナル抗体の精製及びモノクロー
ナル抗体のクラス、サブクラスの決定は、それぞれ上記
実施例３（ｄ）〜実施例３（ｇ）に記載の方法と同様に
して行った。但し、ＥＬＩＳＡ法による抗ヒトＴＩＭＰ
−３ポリペプチド抗体産生ハイブリドーマの検索には、
固相化抗原としてポリペプチド（配列番号：１、ＫＫＬ
ＶＫＥＧＰＦＧＴＬＶＹＴ）１００ｎｇ／ウエルでコー
トしたものを用いた。最終的にポリペプチド（配列番
号：１）に対するモノクローナル抗体を産生するハイブ
リドーマが４クローン得られた。モノクローナル抗体の
アイソタイプを調べたところ、γ１／κが４種であっ
た。

【００８４】実施例５ 抗ヒトＴＩＭＰ−３ポリペプ
チド（配列番号：２）抗体の作製 ａ．抗原コンジュゲートの調製 ０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に溶解した１８
５．３ｎｍｏｌｅのＢＳＡにジメチルホルムアミド（Ｄ
ＭＦ）に溶解したＥＭＣＳをＢＳＡの２００倍モル量添
加し、３０℃、３０分間インキュベートした。上記混合
液を０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で平衡化した
ＰＤ−１０カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）でゲルろ過
し、マレイミドが結合したＢＳＡを分取し１．３６ｍｌ
に濃縮した。マレイミドが結合したＢＳＡに対して５０
倍モル量の合成ポリペプチドＣＹＲＧＦＴＫＭＰＨＶＱ
ＹＩＨＴＥＡＳ（０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）
溶解液）を混合し４℃、２０時間インキュベートしポリ
ペプチド−ＢＳＡ複合体を調製した。

【００８５】ｂ．免疫及び抗体産生細胞の調製 ポリペプチド−ＢＳＡ複合体を２１３μｇを完全フロイ
ントアジュバントと共に、６週令ＢＡＬＢ／ｃ雌マウス
２匹にそれぞれ腹腔内投与し、初回免疫とした。その後
１６日目に０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）に溶解
した２００μｇのポリペプチド−ＢＳＡ複合体を腹腔内
に投与し追加免疫した。その後５１日目に０．１Ｍリン
酸緩衝液（ｐＨ６．０）に溶解した２００μｇのポリペ
プチド−ＢＳＡ複合体を腹腔内に投与し追加免疫した。
最終免疫として、８６日目に０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐ
Ｈ６．０）に溶解したポリペプチド−ＢＳＡ複合体を２
００μｇを腹腔内に投与し、３日後にマウス脾臓を取り
だし脾細胞を調製した。

【００８６】ｃ．細胞融合及びクローニング 細胞融合は上記実施例３（ｃ）に記載の方法と同様にし
て行った。融合には有核脾細胞２．１×１０⁸ 個とミエ
ローマ細胞４．１×１０⁷ 個を用いた。また選択培地に
よるハイブリドーマの選択的増殖、ハイブリドーマのク
ローニング、モノクローナル抗体の精製及びモノクロー
ナル抗体のクラス、サブクラスの決定は、それぞれ上記
実施例３（ｄ）〜実施例３（ｇ）に記載の方法と同様に
して行った。但し、ＥＬＩＳＡ法による抗ヒトＴＩＭＰ
−３ポリペプチド抗体産生ハイブリドーマの検索には、
固相化抗原としてポリペプチド（配列番号：２、ＹＲＧ
ＦＴＫＭＰＨＶＱＹＩＨＴＥＡＳ）１００ｎｇ／ウエル
でコートしたものを用いた。最終的にポリペプチド（配
列番号：２）に対するモノクローナル抗体を産生するハ
イブリドーマが２クローン得られた。モノクローナル抗
体のアイソタイプを調べたところ、γ１／κが２種であ
った。

【００８７】実施例６ 抗ヒトＴＩＭＰ−３ポリペプ
チド抗体の選択 得られた組換えヒトＴＩＭＰ−３と抗ヒトＴＩＭＰ−３
ポリペプチドモノクローナル抗体の反応性を調べた。 ａ．ウエスタン・ブロッティングによる選択 上記実施例１（ｆ）で得られた組換えヒトＴＩＭＰ−３
発現CHO 細胞株ＴＲＭ−Ｄ又はＴＲＭ−１Ｇ１２をFCS
不含のα-MEMで48時間培養後、その培養上清を回収す
る。培養上清を遠心し細胞残渣を除去した後、２０倍ま
で濃縮し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥに供し、ウエスタン・ブロ
ッティングを行い、各精製モノクローナル抗体と反応
後、ＨＲＰ標識ヤギ抗マウス免疫グロブリン抗体（Ｃａ
ｐｐｅｌ Ｌａｂ．）を用い間接法により免疫染色を行
った。得られた２２クローンのうち８クローンが、２４
ｋＤａおよび２７ｋＤａの２バンドと反応した。結果を
表２に示す。

【００８８】

【表２】

【００８９】ｂ．アフィニティーゲルによる選択 上記組換えヒトＴＩＭＰ−３を抗原としたウエスタン・
ブロッティングで選択された８クローンの精製抗体を用
いて、0.2ml のアフィニティーゲルを調製した。各モノ
クローナル抗体 500μg を 200μl （乾燥重量60mg）の
膨潤したCNBr-activated Sepharose 4B （ファルマシア
バイオテク）に結合させて調製した。結合法は同ゲル
の基本的カップリング法に従った。組換えヒトＴＩＭＰ
−３発現CHO 細胞株ＴＲＭ−Ｄ又はＴＲＭ−１Ｇ１２の
培養上清を供し、組換えヒトＴＩＭＰ−３吸着能のある
クローンを検索した。０．１Ｍ ＮａＣｌ，３ｍＭ Ｃ
ａＣｌ₂ を含む３０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐ
Ｈ８．０）で平衡化した抗体結合セファロース４Ｂゲル
カラムに培養上清45ｍｌを供し、平衡化バッファーで十
分洗浄した。吸着タンパク質は０．１Ｍグリシン−塩酸
（ｐＨ２．０）で溶出、直ちに３Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ
（ｐＨ８．０）を添加し中和した。溶出画分をウルトラ
フリーＣ３ＬＧＣ（ミリポア）で濃縮、ＳＤＳ−ＰＡＧ
Ｅに供しウエスタン・ブロッティング(136-13H4)を行い
24kDa あるいは27kDa のＴＩＭＰ−３と反応するクロー
ンの選択を行った。 A) C 末端側抗ペプチド（ＣＳＷＹＲＧＷＡＰＰＤＫＳ
ＩＩＮＡＴＤＰ）抗体群から136-17B12 および136-18D8
を選択した。両クローンのゲルから溶出された組換えヒ
トＴＩＭＰ−３には、27kDa および24kDa の両分子種が
みられた（図８）。また、136-13H4および136-23F2も組
換えヒトＴＩＭＰ−３吸着能が認められた。 B) N 末端側抗ペプチド（ＣＫＫＬＶＫＥＧＰＦＧＴＬ
ＶＹＴ）抗体群から得られた143-3F2 は組換えヒトＴＩ
ＭＰ−３吸着能が認められなかった。 C) N 末端側抗ペプチド（ＣＹＲＧＦＴＫＭＰＨＶＱＹ
ＩＨＴＥＡＳ）抗体群から169-2E3 を選択した。溶出し
た組換えヒトＴＩＭＰ−３は24kDa のものが主であった
（図８）。

【００９０】実施例７ ヒト天然型ＴＩＭＰ−３の精
製 ａ．ＥＣＭ画分の調製 ２個のヒト胎盤から羊膜、臍帯を除去、ミンス機で細切
し０．１Ｍ ＮａＣｌ及び５ｍＭ ＣａＣｌ₂ を含む５
０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０） １．
５リットルで懸濁した。ポリトロン・ホモジナイザーで
更に細断し、遠心操作（日立、ＲＰＲ１０−２ロータ
ー、１０、０００ｒｐｍ、４℃、３０分）で上清を除去
した。沈殿物を０．１Ｍ ＮａＣｌ及び５ｍＭ ＣａＣ
ｌ₂ を含む５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ
８．０） １．５リットルで再懸濁し上記の操作を５回
繰り返し、可溶性成分の除去を行った。４Ｍ 尿素、
０．１ＭＮａＣｌ及び５ｍＭ ＣａＣｌ₂ を含む５０ｍ
Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０） １リット
ルで懸濁し、１晩、４℃で撹拌、遠心操作（日立、ＲＰ
Ｒ１０−２ローター、１０、０００ｒｐｍ、４℃、３０
分）で上清を回収した。上清は十分量の０．１Ｍ Ｎａ
Ｃｌ及び５ｍＭ ＣａＣｌ₂ を含む５０ｍＭ Ｔｒｉｓ
−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）に対して透析し、尿素を
除去しＥＣＭ画分を得た。遠心操作で回収した沈殿物に
０．５リットルの４Ｍ 尿素、０．１ＭＮａＣｌ及び５
ｍＭ ＣａＣｌ₂ を含む５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩
衝液（ｐＨ８．０）を加え再抽出し、同様の方法でＥＣ
Ｍ画分を調製、１回目の抽出画分と合せて１．５リット
ルのＥＣＭ画分を得た。

【００９１】ｂ．ヒトＴＩＭＰ−３の精製 ＥＣＭ画分５０ｍｌを０．１Ｍ ＮａＣｌ及び５ｍＭ
ＣａＣｌ₂ を含む５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液
（ｐＨ８．０）で平衡化した４０ｍｌのＣＭ５２（ワッ
トマン）ゲルカラムに供し、平衡化緩衝液で十分洗浄し
た。１Ｍ ＮａＣｌ及び５ｍＭ ＣａＣｌ₂ を含む５０
ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）でＣＭ５
２ゲルに吸着したタンパク質を溶出、回収した。溶出画
分を０．１％ Ｂｒｉｊ３５及び５ｍＭ ＣａＣｌ₂ を
含む５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）
で２倍に希釈、０．１Ｍ ＮａＣｌ、０．０５％ Ｂｒ
ｉｊ３５及び５ｍＭ ＣａＣｌ₂ を含む５０ｍＭ Ｔｒ
ｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）で平衡化した抗ヒト
ＴＩＭＰ−３モノクローナル抗体１３６−１８Ｄ８結合
セファロース４Ｂゲルカラムに供し、平衡化緩衝液で十
分洗浄した。吸着タンパク質は０．１Ｍ グリシン−塩
酸（ｐＨ２．０）で溶出、直ちに３ＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ
（ｐＨ８．０）を添加し中和した。抗ヒトＴＩＭＰ−３
モノクローナル抗体１３６−１８Ｄ８結合セファロース
４Ｂゲルカラムから溶出したタンパク質はＳＤＳ−ＰＡ
ＧＥ後、ＣＢＢ染色およびウエスタン・ブロッティング
で分析された。この画分に含まれるヒトＴＩＭＰ−３
は、２４ｋＤａと２７ｋＤａの２つの分子種で、またそ
の純度は、約６０％と見積もった（表３）。

【００９２】

【表３】

【００９３】実施例８ サンドイッチＥＩＡ ａ．標識抗体の調製 ７．３ｍｇの抗ヒトＴＩＭＰ−３モノクローナル抗体１
４３−３Ｆ２（生工研受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１５４０
６）及び０．１Ｍ ＮａＣｌを含む０．１Ｍ酢酸緩衝液
（ｐＨ４．２）に抗体量の２％（ｗ／ｗ）のペプシンを
加え、３７℃、２４時間消化した。消化物に３ＭＴｒｉ
ｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）を添加し、反応を停止した。
０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で平衡化したウル
トロゲルＡｃＡ５４カラムによるゲルろ過でＦ（ａ
ｂ’）₂ 画分を分取した。このＦ（ａｂ’）₂ 画分に最
終濃度０．０１Ｍとなるようにシステアミン塩酸塩を添
加し、３７℃、１．５時間還元し、５ｍＭＥＤＴＡ含有
０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）で平衡化したウル
トロゲルＡｃＡ５４カラムによるゲルろ過でＦａｂ’画
分を分取した。上記の操作とは別に８．２ｍｇのＨＲＰ
を０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に溶解、ＨＲＰ
の２５倍モル量のＥＭＣＳをＤＭＦ溶液として加え、３
０℃、３０分間反応させた。これを０．１Ｍリン酸緩衝
液（ｐＨ６．０）で平衡化したＮＩＣＫ−５カラム（Ｐ
ｈａｒｍａｃｉａ）でゲルろ過しマレイミド標識ＨＲＰ
画分を分取した。Ｆａｂ’画分とマレイミド標識ＨＲＰ
を等モルとなるように両画分を混合し４℃、２０時間反
応させた後、Ｆａｂ’の１０倍モル量のＮ−エチルマレ
イミドで未反応のチオール基をブロックした。これを
０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６．５）で平衡化したウル
トロゲルＡｃＡ５４カラムでゲルろ過し、Ｆａｂ’−Ｈ
ＲＰ標識抗体を分取した。得られた１４３−３Ｆ２ Ｆ
ａｂ’−ＨＲＰ標識抗体は３．９ｍｇであった。これに
０．１％ ＢＳＡおよび０．００１％クロルヘキシジン
を添加して４℃で保存した。

【００９４】ｂ．モノクローナル抗体結合担体の調製 抗ヒトＴＩＭＰ−３モノクローナル抗体１３６−１７Ｂ
１２（生工研受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１５４０５）を
０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）に溶解し、５０μ
ｇ／ｍｌの濃度に調製した。このモノクローナル抗体溶
液を９６穴マイクロプレートにウエルあたり１００μｌ
ずつ加え、４℃、１８時間静置した。モノクローナル抗
体溶液を除去し、生理食塩液で１回、０．０５％Ｔｗｅ
ｅｎ２０、０．１Ｍ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＣａＣｌ₂ を
含む５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）
で３回洗浄後、１％ＢＳＡ、０．１Ｍ ＮａＣｌ、５ｍ
ＭＣａＣｌ₂ を含む５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液
（ｐＨ８．０）を加えブロッキングした。

【００９５】ｃ．１ステップサンドイッチＥＩＡ法 アフィニティー精製したヒトＴＩＭＰ−３（タンパク質
濃度１３５μｇ／ｍｌ、純度６０％、ヒトＴＩＭＰ−３
含量８０μｇ／ｍｌ）画分を標準抗原としてヒトＴＩＭ
Ｐ−３定量用標準曲線を作成した。標準ヒトＴＩＭＰ−
３を３２０ｎｇ／ｍｌとなるように１％ＢＳＡ、０．０
５％Ｂｒｉｊ３５、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０、０．１
Ｍ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＣａＣｌ₂ を含む５０ｍＭ Ｔ
ｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）で希釈、これを同
緩衝液を用いて５ｎｇ／ｍｌまで段階希釈して調製した
標準ヒトＴＩＭＰ−３を６０μｌずつ分注、それぞれに
１％ＢＳＡ、０．０５％Ｂｒｉｊ３５、０．０５％Ｔｗ
ｅｅｎ２０、０．１Ｍ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＣａＣｌ₂
を含む５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．
０）で２μｇ／ｍｌに調製した標識抗体１４３−３Ｆ２
Ｆａｂ’−ＨＲＰを６０μｌずつ添加し十分混和し
た。調製した抗体結合マイクロプレートを０．０５％Ｔ
ｗｅｅｎ２０、０．１Ｍ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＣａＣｌ
₂ を含む５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．
０）で３回洗浄し、先に調製した標準抗原と標識抗体の
混合液を１００μｌ／ウエルずつ添加した。室温で１時
間反応した後０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０、０．１Ｍ Ｎ
ａＣｌ、５ｍＭ ＣａＣｌ₂ を含む５０ｍＭ Ｔｒｉｓ
−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）で３回洗浄した。次に、
０．０２％過酸化水素含有０．１Ｍクエン酸−リン酸緩
衝液（ｐＨ４．９）に溶解した１．２ｍｇ／ｍｌ ｏ−
フェニレンジアミンをウエルあたり１００μｌ添加し、
室温で２０分間反応後、２Ｎ硫酸を１００μｌ添加し反
応を停止した。この反応混液のＡ４９２をマイクロプレ
ートリーダーを用いて測定し、標準曲線を求めた。得ら
れた標準曲線を図９に示した。

【００９６】実施例９ 添加回収試験 実施例８に記載した方法に準じて以下のように添加回収
試験を行った。標準ヒトＴＩＭＰ−３を３２０ｎｇ／ｍ
ｌとなるように１０％ヒト正常血清、１％ＢＳＡ、０．
０５％Ｂｒｉｊ３５、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０、０．
１Ｍ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＣａＣｌ₂ を含む５０ｍＭ
Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）で希釈、これを
同緩衝液を用いて４０ｎｇ／ｍｌまで段階希釈して調製
した標準品添加検体を６０μｌずつ分注、それぞれに１
％ＢＳＡ、０．０５％Ｂｒｉｊ３５、０．０５％Ｔｗｅ
ｅｎ２０、０．１Ｍ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＣａＣｌ₂ を
含む５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）
で２μｇ／ｍｌに調製した標識抗体１４３−３Ｆ２ Ｆ
ａｂ’−ＨＲＰを６０μｌずつ添加し十分混和した。一
方、標準ヒトＴＩＭＰ−３を３２０ｎｇ／ｍｌとなるよ
うに１％ＢＳＡ、０．０５％Ｂｒｉｊ３５、０．０５％
Ｔｗｅｅｎ２０、０．１Ｍ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＣａＣ
ｌ₂ を含む５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ
８．０）で希釈、これを同緩衝液を用いて４０ｎｇ／ｍ
ｌまで段階希釈して調製した標準品を６０μｌずつ分
注、それぞれに１０％ヤギ正常血清、１％ＢＳＡ、０．
０５％Ｂｒｉｊ３５、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０、０．
１Ｍ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＣａＣｌ₂ を含む５０ｍＭ
Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）で２μｇ／ｍｌ
に調製した標識抗体１４３−３Ｆ２ Ｆａｂ’−ＨＲＰ
を６０μｌずつ添加し十分混和した。標準品添加検体お
よび標準品と標識抗体の混合液の最終ヒトＴＩＭＰ−３
添加量は１６、８および４ｎｇ／ウエルとなる。調製し
た抗体結合マイクロプレートを０．０５％Ｔｗｅｅｎ２
０、０．１Ｍ ＮａＣｌ及び５ｍＭ ＣａＣｌ₂ を含む
５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）で３
回洗浄し、標準品添加検体および標準品と標識抗体の混
合液を１００μｌ／ウエルずつ添加した。室温で１時間
反応した後０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０、０．１Ｍ Ｎａ
Ｃｌ及び５ｍＭ ＣａＣｌ₂ を含む５０ｍＭ Ｔｒｉｓ
−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）で３回洗浄した。次に、
０．０２％過酸化水素含有０．１Ｍクエン酸−リン酸緩
衝液（ｐＨ４．９）に溶解した１．２ｍｇ／ｍｌ ｏ−
フェニレンジアミンをウエルあたり１００μｌ添加し、
室温で２０分間反応後、２Ｎ硫酸を１００μｌ添加し反
応を停止した。この反応混液のＡ４９２をマイクロプレ
ートリーダーを用いて測定し、標準曲線を求めた。得ら
れた標準曲線から標準品添加検体から回収されたヒトＴ
ＩＭＰ−３量を算出し回収率を求めた（表４）。

【００９７】

【表４】

【００９８】実施例１０ ＥＬＩＳＡおよびウエスタ
ン・ブロッティングによる特異性試験 （１）陽性抗原としてヒトＴＩＭＰ−３、陰性抗原とし
てヒトＴＩＭＰ−１およびヒトＴＩＭＰ−２のそれぞれ
を炭酸緩衝液（ｐＨ９．６）で５００ｎｇ／ｍｌに調製
し９６穴マイクロプレートにウエルあたり１００μｌず
つ加え、４℃、１８時間静置した。抗原溶液を除去し、
０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含む０．１Ｍリン酸緩衝液
（ｐＨ７．０）で３回洗浄後、１％ＢＳＡを含む０．１
Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）を加え室温で１時間静置
しブロッキングした。０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含む
０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で３回洗浄後、１
％ＢＳＡを含む０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で
１００ｎｇ／ｍｌに希釈した抗ヒトＴＩＭＰ−３モノク
ローナル抗体、抗ヒトＴＩＭＰ−１モノクローナル抗体
および抗ヒトＴＩＭＰ−２モノクローナル抗体をウエル
あたり１００μｌずつ加え、室温で１時間反応した。
０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含む０．１Ｍリン酸緩衝液
（ｐＨ７．０）で３回洗浄後、１％ＢＳＡを含む０．１
Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で１／３０００に希釈し
たＨＲＰ標識ヤギ抗マウス免疫グロブリン抗体（Ｃａｐ
ｐｌｅ Ｌａｂ．）をウエルあたり１００μｌずつ加
え、室温で１時間反応した。０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０
を含む０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で３回洗浄
後、０．０２％過酸化水素含有０．１Ｍクエン酸−リン
酸緩衝液（ｐＨ４．９）に溶解した１．２ｍｇ／ｍｌ
ｏ−フェニレンジアミンをウエルあたり１００μｌ添加
し、室温で２０分間反応後、２Ｎ硫酸を１００μｌ添加
し反応を停止した。この反応混液のＡ４９２をマイクロ
プレートリーダーを用いて測定した。結果を表５に示
す。この結果から、抗ヒトＴＩＭＰ−３モノクローナル
抗体がいずれも、ヒトＴＩＭＰ−３に特異的に反応する
ことが確認された。

【００９９】

【表５】

【０１００】（２）ウエスタン・ブロッティング；陽性
抗原としてヒトＴＩＭＰ−３、陰性抗原としてヒトＴＩ
ＭＰ−１およびヒトＴＩＭＰ−２のそれぞれを５００ｎ
ｇ／レーンでＳＤＳ−ＰＡＧＥに供し、ウエスタン・ブ
ロッティングを行い、抗ヒトＴＩＭＰ−３モノクローナ
ル抗体と反応後、ＨＲＰ標識ヤギ抗マウス免疫グロブリ
ン抗体（Ｃａｐｐｌｅ Ｌａｂ．）を用い間接法により
免疫染色を行った。抗ヒトＴＩＭＰ−３モノクローナル
抗体１３６−１３Ｈ４および１３６−２３Ｆ２はヒトＴ
ＩＭＰ−３のみと反応した。

【０１０１】実施例１１ サンドイッチＥＩＡによる
特異性試験 陽性抗原としてヒトＴＩＭＰ−３を１０ｎｇ／ウエル、
陰性抗原としてヒトＴＩＭＰ−１およびヒトＴＩＭＰ−
２をそれぞれ１０ｎｇ／ウエルで実施例８に記載した方
法に準じてサンドイッチＥＩＡに供し特異性試験を行っ
た。Ａ４９２はヒトＴＩＭＰ−３で１．２５０、ヒトＴ
ＩＭＰ−１で０．０３４、ヒトＴＩＭＰ−２で０．００
９を示し、本実施例記載のサンドイッチＥＩＡがＴＩＭ
Ｐ−３を特異的に検出することを示した。

【０１０２】実施例１２ サンドイッチＥＩＡによる
ＴＩＭＰ−３の検出 組織ホモジネートを検体としたサンドイッチＥＩＡによ
るＴＩＭＰ−３の検出を実施例８に記載した方法に準じ
て行った。検体組織２ｇを氷冷下の０．１ＭＮａＣｌ、
５ｍＭ ＣａＣｌ₂ を含む５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ
緩衝液（ｐＨ８．０，２０ｍｌ）中でハサミを用いて細
切し、ポリトロン・ホモジナイザーでさらに細断、遠心
で上清を除去した。沈殿物を２ｍｌの０．０５％Ｂｒｉ
ｊ３５、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０、０．１Ｍ ＮａＣ
ｌ、５ｍＭ ＣａＣｌ₂ を含む５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｈ
Ｃｌ緩衝液（ｐＨ８．０）に懸濁した。調製した組織ホ
モジネート６μｌを５４μｌの０．０５％Ｂｒｉｊ３
５、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０、０．１Ｍ ＮａＣｌ、
５ｍＭ ＣａＣｌ₂ を含む５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ
緩衝液（ｐＨ８．０）で希釈、１％ＢＳＡ、０．０５％
Ｂｒｉｊ３５、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０、０．１Ｍ
ＮａＣｌ、５ｍＭ ＣａＣｌ₂ を含む５０ｍＭ Ｔｒｉ
ｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）で２μｇ／ｍｌに調製
した標識抗体１４３−３Ｆ２ Ｆａｂ’−ＨＲＰを６０
μｌずつ添加し十分混和した。調製した抗体結合マイク
ロプレートを０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０、０．１Ｍ Ｎ
ａＣｌ、５ｍＭ ＣａＣｌ₂ を含む５０ｍＭ Ｔｒｉｓ
−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）で３回洗浄し、検体と標
識抗体の混合液を１００μｌ／ウエルずつ添加した。室
温で１時間反応した後０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０、０．
１Ｍ ＮａＣｌ、５ｍＭＣａＣｌ₂ を含む５０ｍＭ Ｔ
ｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）で３回洗浄した。
次に、０．０２％過酸化水素含有０．１Ｍクエン酸−リ
ン酸緩衝液（ｐＨ４．９）に溶解した１．２ｍｇ／ｍｌ
ｏ−フェニレンジアミンをウエルあたり１００μｌ添
加し、室温で２０分間反応後、２Ｎ硫酸を１００μｌ添
加し反応を停止した。この反応混液のＡ４９２をマイク
ロプレートリーダーを用いて測定した。卵巣癌１検体と
胎盤６検体でＴＩＭＰ−３が検出された。なお、明細書
中、配列番号：８はヒトＴＩＭＰ−３と実質的に同一の
活性を有するタンパク質中のアミノ酸配列をコードする
塩基配列を示し、同様に配列番号：９はヒトＴＩＭＰ−
３と実質的に同一の活性を有するタンパク質中のアミノ
酸配列を示していると考えられる。配列番号：１０はヒ
トＴＩＭＰ−１タンパク質のアミノ酸配列をコードする
塩基配列を示し、配列番号：１１はヒトＴＩＭＰ−１タ
ンパク質のアミノ酸配列を示している。配列番号：１２
はヒトＴＩＭＰ−１分泌シグナル−成熟型ヒトＴＩＭＰ
−３融合タンパク質のアミノ酸配列をコードするキメラ
遺伝子の塩基配列を示し、配列番号：１３はヒトＴＩＭ
Ｐ−１分泌シグナル−成熟型ヒトＴＩＭＰ−３融合タン
パク質のアミノ酸配列を示している。

【０１０３】

【発明の効果】本発明で、新規なかつ天然由来で正常細
胞由来のヒトＴＩＭＰ−３またはヒトＴＩＭＰ−３と実
質的に同一の活性を有するタンパク質をコードする遺伝
子を得ることができたことにより、該遺伝子を含有する
ベクター、該ベクターを含有する形質転換体を得ること
ができヒトＴＩＭＰ−３またはヒトＴＩＭＰ−３と実質
的に同一の活性を有するタンパク質を大量に製造して得
ることが可能になった。さらにまた本発明では、ＴＩＭ
Ｐ−３に特異的に免疫反応するモノクローナル抗体、該
モノクローナル抗体の製造方法などが提供されたことに
より、該モノクローナル抗体を用いての、ヒトＴＩＭＰ
−３の免疫学的測定方法、該測定のための試薬及びヒト
ＴＩＭＰ−３の精製方法が実施できる。こうして簡便
性、再現性、定量性にすぐれたＴＩＭＰ−３の定性的及
び定量的測定が可能となる。特にＴＩＭＰ−３をタンパ
ク質レベルで特異的かつ高感度に検出、定量できる。そ
してＴＩＭＰ−３が関与する各種疾患の研究および診断
の有効な手段となる。天然型あるいは正常細胞由来のヒ
トＴＩＭＰ−３またはヒトＴＩＭＰ−３と実質的に同一
の活性を有するタンパク質を癌細胞の有無、癌の悪性度
の診断等の癌の診断治療に関わる研究、さらには医薬用
途に用いる道を開くことが可能となった。

【０１０４】

【配列表】

【配列番号：１】 配列の長さ：15 配列の型：アミノ酸 配列の種類：合成ポリペプチド 配列 Lys Lys Leu Val Lys Glu Gly Pro Phe Gly Thr Leu Val Tyr Thr 1 5 10 15

【０１０５】

【配列番号：２】 配列の長さ：18 配列の型：アミノ酸 配列の種類：合成ポリペプチド 配列 Tyr Arg Gly Phe Thr Lys Met Pro His Val Gln Tyr Ile His Thr Glu 1 5 10 15 Ala Ser 18

【０１０６】

【配列番号：３】 配列の長さ：19 配列の型：アミノ酸 配列の種類：合成ポリペプチド 配列 Ser Trp Tyr Arg Gly Trp Ala Pro Pro Asp Lys Ser Ile Ile Asn Ala 1 5 10 15 Thr Asp Pro 19

【０１０７】

【配列番号：４】 配列の長さ：30 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：その他の核酸、合成ＤＮＡ 配列 AGGATCCGAG CATGCACATG CTCGCCCAGC 30

【０１０８】

【配列番号：５】 配列の長さ：30 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：その他の核酸、合成ＤＮＡ 配列 ATCTAGACTC AGGGGTCTGT GGCATTGATG 30

【０１０９】

【配列番号：６】 配列の長さ：24 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：その他の核酸、合成ＤＮＡ 配列 TGGGACACAG GTGCATGCCC TGCT 24

【０１１０】

【配列番号：７】 配列の長さ：21 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：その他の核酸、合成ＤＮＡ 配列 GAAGTCCAGC AGACCACCTT A 21

【０１１１】

【配列番号：８】 配列の長さ：567 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：cDNA 起源 生物名：ヒト 配列 TGCACATGCT CGCCCAGCCA CCCCCAGGAC GCCTTCTGCA ACTCCGACAT CGTGATCCGG 60 GCCAAGGTGG TGGGGAAGAA GCTGGTAAAG GAGGGGCCCT TCGGCACGCT GGTCTACACC 120 ATCAAGCAGA TGAAGATGTA CCGAGGCTTC ACCAAGATGC CCCATGTGCA GTACATCCAT 180 ACGGAAGCTT CCGAGAGTCT CTGTGGCCTT AAGCTGGAGG TCAACAAGTA CCAGTACCTG 240 CTGACAGGTC GCGTCTATGA TGGCAAGATG TACACGGGGC TGTGCAACTT CGTGGAGAGG 300 TGGGACCAGC TCACCCTCTC CCAGCGCAAG GGGCTGAACT ATCGGTATCA CCTGGGTTGT 360 AACTGCAAGA TCAAGTCCTG CTACTACCTG CCTTGCTTTG TGACTTCCAA GAACGAGTGT 420 CTCTGGACCG ACATGCTCTC CAATTTCGGT TACCCTGGCT ACCAGTCCAA ACACTACGCC 480 TGCATCCGGC AGAAGGGCGG CTACTGCAGC TGGTACCGAG GATGGGCCCC CCCGGATAAA 540 AGCATCATCA ATGCCACAGA TCCCTGA 567

【０１１２】

【配列番号：９】 配列の長さ：188 配列の型：アミノ酸 配列の種類：タンパク質 起源 生物名：ヒト 配列 Cys Thr Cys Ser Pro Ser His Pro Gln Asp Ala Phe Cys Asn Ser Asp 1 5 10 15 Ile Val Ile Arg Ala Lys Val Val Gly Lys Lys Leu Val Lys Glu Gly 20 25 30 Pro Phe Gly Thr Leu Val Tyr Thr Ile Lys Gln Met Lys Met Tyr Arg 35 40 45 Gly Phe Thr Lys Met Pro His Val Gln Tyr Ile His Thr Glu Ala Ser 50 55 60 Glu Ser Leu Cys Gly Leu Lys Leu Glu Val Asn Lys Tyr Gln Tyr Leu 65 70 75 80 Leu Thr Gly Arg Val Tyr Asp Gly Lys Met Tyr Thr Gly Leu Cys Asn 85 90 95 Phe Val Glu Arg Trp Asp Gln Leu Thr Leu Ser Gln Arg Lys Gly Leu 100 105 110 Asn Tyr Arg Tyr His Leu Gly Cys Asn Cys Lys Ile Lys Ser Cys Tyr 115 120 125 Tyr Leu Pro Cys Phe Val Thr Ser Lys Asn Glu Cys Leu Trp Thr Asp 130 135 140 Met Leu Ser Asn Phe Gly Tyr Pro Gly Tyr Gln Ser Lys His Tyr Ala 145 150 155 160 Cys Ile Arg Gln Lys Gly Gly Tyr Cys Ser Trp Tyr Arg Gly Trp Ala 165 170 175 Pro Pro Asp Lys Ser Ile Ile Asn Ala Thr Asp Pro 180 185 188

【０１１３】

【配列番号：１０】 配列の長さ：624 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：cDNA 起源 生物名：ヒト 配列 ATGGCCCCCT TTGAGCCCCT GGCTTCTGGC ATCCTGTTGT TGCTGTGGCT GATAGCCCCC 60 AGCAGGGCCT GCACCTGTGT CCCACCCCAC CCACAGACGG CCTTCTGCAA TTCCGACCTC 120 GTCATCAGGG CCAAGTTCGT GGGGACACCA GAAGTCAACC AGACCACCTT ATACCAGCGT 180 TATGAGATCA AGATGACCAA GATGTATAAA GGGTTCCAAG CCTTAGGGGA TGCCGCTGAC 240 ATCCGGTTCG TCTACACCCC CGCCATGGAG AGTGTCTGCG GATACTTCCA CAGGTCCCAC 300 AACCGCAGCG AGGAGTTTCT CATTGCTGGA AAACTGCAGG ATGGACTCTT GCACATCACT 360 ACCTGCAGTT TCGTGGCTCC CTGGAACAGC CTGAGCTTAG CTCAGCGCCG GGGCTTCACC 420 AAGACCTACA CTGTTGGCTG TGAGGAATGC ACAGTGTTTC CCTGTTTATC CATCCCCTGC 480 AAACTGCAGA GTGGCACTCA TTGCTTGTGG ACGGACCAGC TCCTCCAAGG CTCTGAAAAG 540 GGCTTCCAGT CCCGTCACCT TGCCTGCCTG CCTCGGGAGC CAGGGCTGTG CACCTGGCAG 600 TCCCTGCGGT CCCAGATAGC CTGA 624

【０１１４】

【配列番号：１１】 配列の長さ：207 配列の型：アミノ酸 配列の種類：タンパク質 起源 生物名：ヒト 配列 Met Ala Pro Phe Glu Pro Leu Ala Ser Gly Ile Leu Leu Leu Leu Trp 1 5 10 15 Leu Ile Ala Pro Ser Arg Ala Cys Thr Cys Val Pro Pro His Pro Gln 20 25 30 Thr Ala Phe Cys Asn Ser Asp Leu Val Ile Arg Ala Lys Phe Val Gly 35 40 45 Thr Pro Glu Val Asn Gln Thr Thr Leu Tyr Gln Arg Tyr Glu Ile Lys 50 55 60 Met Thr Lys Met Tyr Lys Gly Phe Gln Ala Leu Gly Asp Ala Ala Asp 65 70 75 80 Ile Arg Phe Val Tyr Thr Pro Ala Met Glu Ser Val Cys Gly Tyr Phe 85 90 95 His Arg Ser His Asn Arg Ser Glu Glu Phe Leu Ile Ala Gly Lys Leu 100 105 110 Gln Asp Gly Leu Leu His Ile Thr Thr Cys Ser Phe Val Ala Pro Trp 115 120 125 Asn Ser Leu Ser Leu Ala Gln Arg Arg Gly Phe Thr Lys Thr Tyr Thr 130 135 140 Val Gly Cys Glu Glu Cys Thr Val Phe Pro Cys Leu Ser Ile Pro Cys 145 150 155 160 Lys Leu Gln Ser Gly Thr His Cys Leu Trp Thr Asp Gln Leu Leu Gln 165 170 175 Gly Ser Glu Lys Gly Phe Gln Ser Arg His Leu Ala Cys Leu Pro Arg 180 185 190 Glu Pro Gly Leu Cys Thr Trp Gln Ser Leu Arg Ser Gln Ile Ala 195 200 205

【０１１５】

【配列番号：１２】 配列の長さ：636 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：cDNA 起源 生物名：ヒト 配列 ATGGCCCCCT TTGAGCCCCT GGCTTCTGGC ATCCTGTTGT TGCTGTGGCT GATAGCCCCC 60 AGCAGGGCAT GCACATGCTC GCCCAGCCAC CCCCAGGACG CCTTCTGCAA CTCCGACATC 120 GTGATCCGGG CCAAGGTGGT GGGGAAGAAG CTGGTAAAGG AGGGGCCCTT CGGCACGCTG 180 GTCTACACCA TCAAGCAGAT GAAGATGTAC CGAGGCTTCA CCAAGATGCC CCATGTGCAG 240 TACATCCATA CGGAAGCTTC CGAGAGTCTC TGTGGCCTTA AGCTGGAGGT CAACAAGTAC 300 CAGTACCTGC TGACAGGTCG CGTCTATGAT GGCAAGATGT ACACGGGGCT GTGCAACTTC 360 GTGGAGAGGT GGGACCAGCT CACCCTCTCC CAGCGCAAGG GGCTGAACTA TCGGTATCAC 420 CTGGGTTGTA ACTGCAAGAT CAAGTCCTGC TACTACCTGC CTTGCTTTGT GACTTCCAAG 480 AACGAGTGTC TCTGGACCGA CATGCTCTCC AATTTCGGTT ACCCTGGCTA CCAGTCCAAA 540 CACTACGCCT GCATCCGGCA GAAGGGCGGC TACTGCAGCT GGTACCGAGG ATGGGCCCCC 600 CCGGATAAAA GCATCATCAA TGCCACAGAC CCCTGA 636

【０１１６】

【配列番号：１３】 配列の長さ：211 配列の型：アミノ酸 配列の種類：タンパク質 起源 生物名：ヒト 配列 Met Ala Pro Phe Glu Pro Leu Ala Ser Gly Ile Leu Leu Leu Leu Trp 1 5 10 15 Leu Ile Ala Pro Ser Arg Ala Cys Thr Cys Ser Pro Ser His Pro Gln 20 25 30 Asp Ala Phe Cys Asn Ser Asp Ile Val Ile Arg Ala Lys Val Val Gly 35 40 45 Lys Lys Leu Val Lys Glu Gly Pro Phe Gly Thr Leu Val Tyr Thr Ile 50 55 60 Lys Gln Met Lys Met Tyr Arg Gly Phe Thr Lys Met Pro His Val Gln 65 70 75 80 Tyr Ile His Thr Glu Ala Ser Glu Ser Leu Cys Gly Leu Lys Leu Glu 85 90 95 Val Asn Lys Tyr Gln Tyr Leu Leu Thr Gly Arg Val Tyr Asp Gly Lys 100 105 110 Met Tyr Thr Gly Leu Cys Asn Phe Val Glu Arg Trp Asp Gln Leu Thr 115 120 125 Leu Ser Gln Arg Lys Gly Leu Asn Tyr Arg Tyr His Leu Gly Cys Asn 130 135 140 Cys Lys Ile Lys Ser Cys Tyr Tyr Leu Pro Cys Phe Val Thr Ser Lys 145 150 155 160 Asn Glu Cys Leu Trp Thr Asp Met Leu Ser Asn Phe Gly Tyr Pro Gly 165 170 175 Tyr Gln Ser Lys His Tyr Ala Cys Ile Arg Gln Lys Gly Gly Tyr Cys 180 185 190 Ser Trp Tyr Arg Gly Trp Ala Pro Pro Asp Lys Ser Ile Ile Asn Ala 195 200 205 Thr Asp Pro 210

【図面の簡単な説明】

【図１】 TIMP-3のcDNAおよびアミノ酸配列とPCR プラ
イマーとの関係を示す。なお、ヒトＴＩＭＰ−３のcDNA
配列は、Apte et al., Genomics, 19, 86-90.(1994) に
開示されたもの及びそれから予測されるアミノ酸配列を
示した。矢印はPCR プライマーの伸張方向を示す。

【図２】 ヒト胎盤ｃＤＮＡライブラリーからＰＣＲ増
幅により得られたヒトＴＩＭＰ−３をコードするＤＮＡ
を挿入断片として含有するクローニング・ベクターの構
築を示す。またヒトTIMP-1分泌シグナル−成熟型ヒトTI
MP-3キメラ遺伝子を挿入断片として含有するクローニン
グ・ベクターの構築を示す。

【図３】 TIMP-1のcDNAおよびアミノ酸配列とPCR プラ
イマーとの関係を示す。ここではベクターpFYK3 にクロ
ーニングされたヒトＴＩＭＰ−１のcDNAとアミノ酸配列
を示した。PCR プライマーの伸張の方向を矢印で示し
た。PCR プライマー JR1は、ヒトＴＩＭＰ−１の分泌シ
グナル領域と成熟型ヒトＴＩＭＰ−１の境界（アミノ酸
配列ＳＲＡ／ＣＴＣＶＰ）をまたぐよう設計した。分泌
シグナルのC 末端側に1 塩基置換(C→t)を入れ制限酵素
サイト(SphI; GCAtGC)を導入した。

【図４】 ヒトTIMP-1分泌シグナル−成熟型ヒトTIMP-3
キメラ遺伝子を示す。ここではpTSHT3にサブクローニン
グされたヒトＴＩＭＰ−１分泌シグナル- 成熟型ヒトＴ
ＩＭＰ−３キメラ遺伝子の塩基配列とアミノ酸配列を示
した。下線部の制限酵素SphIサイトでヒトＴＩＭＰ−１
分泌シグナル遺伝子と成熟型ヒトＴＩＭＰ−３遺伝子が
連結されている。

【図５】 ヒトTIMP-1分泌シグナル−成熟型ヒトTIMP-3
キメラ遺伝子を挿入断片として含有するヒトＴＩＭＰ−
３発現ベクターの構成を示す。

【図６】 ヒトTIMP-1分泌シグナル−成熟型ヒトTIMP-3
キメラ遺伝子を挿入断片として含有するヒトＴＩＭＰ−
３発現ベクターの構成を示す。

【図７】 実施例１．ｅ．でヒトＴＩＭＰ−１分泌シグ
ナル−成熟型ヒトＴＩＭＰ−３キメラ遺伝子を挿入して
得られたベクターで大腸菌を形質転換し、β- ｇａｌ−
ヒトＴＩＭＰ−３融合タンパク質を発現させ、得られた
形質転換大腸菌のライゼートをＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけ
ＣＢＢ染色して得られた結果を示す。レーン１はβ- ｇ
ａｌを発現する大腸菌のライゼート、レーン２はβ- ｇ
ａｌ−ヒトＴＩＭＰ−３融合タンパク質を発現する大腸
菌のライゼートである。レーン１では約１１６ｋＤａの
β- ｇａｌの発現が認められ、レーン２では約１４０ｋ
Ｄａのβ- ｇａｌ−ヒトＴＩＭＰ−３融合タンパク質の
発現が認められる。

【図８】 組換えＣＨＯ細胞株ＴＲＭ−１Ｇ１２から発
現により得られた組換えヒトＴＩＭＰ−３の抗体アフィ
ニティーゲル（１３６−１７Ｂ１２、１３６−１８Ｄ８
及び１６９−２Ｅ３）よりの溶出物を抗ヒトＴＩＭＰ−
３モノクローナル抗体と反応後、ＨＲＰ標識ヤギ抗マウ
ス免疫グロブリン抗体で免疫染色するウエスタン・ブロ
ッティングの結果を示す。

【図９】 アフィニティー精製したヒトＴＩＭＰ−３
（タンパク質濃度１３５μｇ／ｍｌ、純度６０％、ヒト
ＴＩＭＰ−３含量８０μｇ／ｍｌ）画分を標準抗原とし
て１ステップサンドイッチＥＩＡ法により作成されたヒ
トＴＩＭＰ−３の標準曲線を示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｎ 15/02 Ｃ１２Ｐ 21/08 15/09 ＺＮＡ Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｄ Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｖ 21/08 33/577 Ｂ Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ 9282−4Ｂ 15/00 Ｃ 33/577 9282−4Ｂ ＺＮＡＡ //(Ｃ１２Ｎ 1/15 Ｃ１２Ｒ 1:85） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:91） (72)発明者 吉田 真一 富山県高岡市長慶寺530番地 富士薬品工 業株式会社内 (72)発明者 岩田 和士 富山県高岡市長慶寺530番地 富士薬品工 業株式会社内

Claims (32)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 ＴＩＭＰ−３に特異的に免疫反応するモ
   ノクローナル抗体。
2. 【請求項２】 ８個から１９個のアミノ酸からなるＴＩ
   ＭＰ−３に特有なアミノ酸配列で親水性を示すアミノ酸
   配列を特異的に認識し、ヒトＴＩＭＰ−３と免疫反応す
   ることを特徴とする請求項１記載のモノクロナール抗
   体。
3. 【請求項３】 ヒトＴＩＭＰ−３のＫＫＬＶＫＥＧＰＦ
   ＧＴＬＶＹＴ（Ｒ２６−４０；配列番号：１）のアミノ
   酸配列又はその一部を含む領域を特異的に認識し、ヒト
   ＴＩＭＰ−３と免疫反応することを特徴とする請求項１
   記載のモノクローナル抗体。
4. 【請求項４】 ヒトＴＩＭＰ−３のＹＲＧＦＴＫＭＰＨ
   ＶＱＹＩＨＴＥＡＳ（Ｒ４７−６４；配列番号：２）の
   アミノ酸配列又はその一部を含む領域を特異的に認識
   し、ヒトＴＩＭＰ−３と免疫反応することを特徴とする
   請求項１記載のモノクローナル抗体。
5. 【請求項５】 ヒトＴＩＭＰ−３のＳＷＹＲＧＷＡＰＰ
   ＤＫＳＩＩＮＡＴＤＰ（Ｒ１７０−１８８；配列番号：
   ３）のアミノ酸配列又はその一部を含む領域を特異的に
   認識し、ヒトＴＩＭＰ−３と免疫反応することを特徴と
   する請求項１記載のモノクローナル抗体。
6. 【請求項６】 ヒトＴＩＭＰ−３のうちアミノ酸に糖鎖
   の付加のない分子種と特異的に免疫反応することを特徴
   とする請求項１記載のモノクローナル抗体。
7. 【請求項７】 ヒトＴＩＭＰ−３のうちアミノ酸に糖鎖
   の付加のある分子種と特異的に免疫反応することを特徴
   とする請求項１記載のモノクローナル抗体。
8. 【請求項８】 ヒトＴＩＭＰ−３のうちアミノ酸に糖鎖
   の付加のない分子種と糖鎖の付加のある分子種を共通し
   て認識し、両分子種と免疫反応することを特徴とする請
   求項１記載のモノクローナル抗体。
9. 【請求項９】 ヒトＴＩＭＰ−３に特有なアミノ酸配列
   を有するポリペプチドで免疫したマウスの抗体生産細胞
   とマウスミエローマ細胞との融合により得られたハイブ
   リドーマを培養し、得られた培養上清またはマウス腹水
   中からモノクローナル抗体を得ることを特徴とするＴＩ
   ＭＰ−３に特異的に免疫反応するモノクローナル抗体の
   製造法。
10. 【請求項１０】 ヒトＴＩＭＰ−３に特異的に免疫反応
    するモノクローナル抗体を含むことを特徴とするヒトＴ
    ＩＭＰ−３の免疫学的測定用試薬。
11. 【請求項１１】 ヒトＴＩＭＰ−３に特異的に免疫反応
    するモノクローナル抗体を測定試薬として用いることを
    特徴とするヒトＴＩＭＰ−３の免疫学的測定方法。
12. 【請求項１２】 実質的に異なる２つのヒトＴＩＭＰ−
    ３の抗原決定基に対し、それぞれ特異的に結合するモノ
    クローナル抗体の少なくとも２種を組み合わせて測定試
    薬として用いることを特徴とする請求項１１記載の方
    法。
13. 【請求項１３】 測定試薬として（ｉ）ヒトＴＩＭＰ−
    ３のＫＫＬＶＫＥＧＰＦＧＴＬＶＹＴ（Ｒ２６−４０；
    配列番号：１）のアミノ酸配列又はその一部を含む領域
    を特異的に認識し、ヒトＴＩＭＰ−３と免疫反応するモ
    ノクローナル抗体および（ｉｉ）ヒトＴＩＭＰ−３のＳ
    ＷＹＲＧＷＡＰＰＤＫＳＩＩＮＡＴＤＰ（Ｒ１７０−１
    ８８；配列番号：３）のアミノ酸配列又はその一部を含
    む領域を特異的に認識し、ヒトＴＩＭＰ−３と免疫反応
    するモノクローナル抗体を少なくとも用いることを特徴
    とする請求項１１記載の方法。
14. 【請求項１４】 測定試薬としてヒトＴＩＭＰ−３のう
    ちアミノ酸に糖鎖の付加のない分子種と特異的に免疫反
    応することを特徴とする請求項６記載のモノクローナル
    抗体を用い、アミノ酸に糖鎖の付加のないヒトＴＩＭＰ
    −３を特異的に測定することを特徴とする請求項１１記
    載の方法。
15. 【請求項１５】 測定試薬としてヒトＴＩＭＰ−３のう
    ちアミノ酸に糖鎖の付加のある分子種と特異的に免疫反
    応することを特徴とする請求項７記載のモノクローナル
    抗体を用い、アミノ酸に糖鎖の付加のあるヒトＴＩＭＰ
    −３を特異的に測定することを特徴とする請求項１１記
    載の方法。
16. 【請求項１６】 測定試薬としてヒトＴＩＭＰ−３のう
    ちアミノ酸に糖鎖の付加のない分子種と糖鎖の付加のあ
    る分子種と免疫反応することを特徴とする請求項８記載
    のモノクローナル抗体を用い、ヒトＴＩＭＰ−３を測定
    することを特徴とする請求項１１記載の方法。
17. 【請求項１７】 測定試薬として（ｉ）ヒトＴＩＭＰ−
    ３のうちアミノ酸に糖鎖の付加のない分子種と免疫反応
    することを特徴とする請求項６記載のモノクローナル抗
    体および（ｉｉ）ヒトＴＩＭＰ−３のうちアミノ酸に糖
    鎖の付加のある分子種と免疫反応することを特徴とする
    請求項７記載のモノクローナル抗体の混合物を用い、ヒ
    トＴＩＭＰ−３を測定することを特徴とする請求項１１
    記載の方法。
18. 【請求項１８】 ヒトＴＩＭＰ−３またはヒトＴＩＭＰ
    −３と実質的に同一の活性を有するタンパク質、あるい
    はその塩。
19. 【請求項１９】 ヒトＴＩＭＰ−３がヒト胎盤に由来す
    るものである請求項１８記載のタンパク質。
20. 【請求項２０】 ヒト胎盤に由来すると共に可溶性のタ
    ンパク質であることを特徴とする請求項１８記載のタン
    パク質。
21. 【請求項２１】 蛋白質中のアミノ酸に糖鎖の付加のな
    い分子種のものであることを特徴とする請求項１９記載
    のタンパク質。
22. 【請求項２２】 蛋白質中のアミノ酸に糖鎖の付加のあ
    る分子種のものであることを特徴とする請求項１９記載
    のタンパク質。
23. 【請求項２３】 蛋白質中のアミノ酸に糖鎖の付加のな
    い分子種と蛋白質中のアミノ酸に糖鎖の付加のある分子
    種との混合物であることを特徴とする請求項１９記載の
    タンパク質。
24. 【請求項２４】 ＴＩＭＰ−３またはＴＩＭＰ−３と実
    質的に同一の活性を有する可溶性タンパク質をコードす
    る遺伝子。
25. 【請求項２５】 ＴＩＭＰ−３またはＴＩＭＰ−３と実
    質的に同一の活性を有するタンパク質をコードする遺伝
    子を含有し且つヒトＴＩＭＰ−１の分泌シグナルをコー
    ドする遺伝子とＴＩＭＰ−３の成熟タンパク質をコード
    する遺伝子とが連結されていることを特徴とする可溶性
    タンパク質をコードする遺伝子。
26. 【請求項２６】 請求項２４または２５記載の遺伝子を
    含有することを特徴とするベクター。
27. 【請求項２７】 請求項２６記載のベクターを含有する
    ことを特徴とする形質転換体。
28. 【請求項２８】 宿主細胞が大腸菌、酵母、ＣＨＯ細胞
    及びＣＯＳ細胞からなる群から選ばれたものであること
    を特徴とする請求項２７記載の形質転換体。
29. 【請求項２９】 請求項２７記載の形質転換体を培養
    し、可溶性の分泌タンパク質としてＴＩＭＰ−３または
    ＴＩＭＰ−３と実質的に同一の活性を有するタンパク質
    を発現させることを特徴とする組換えタンパク質の製造
    方法。
30. 【請求項３０】 ヒトＴＩＭＰ−３と免疫反応するモノ
    クローナル抗体を用いることを特徴とするヒトＴＩＭＰ
    −３の精製方法。
31. 【請求項３１】 ヒトＴＩＭＰ−３と免疫反応するモノ
    クローナル抗体結合アフィニティーゲルを用い、該ヒト
    ＴＩＭＰ−３と免疫反応するモノクローナル抗体がヒト
    ＴＩＭＰ−３のＹＲＧＦＴＫＭＰＨＶＱＹＩＨＴＥＡＳ
    （Ｒ４７−６４；配列番号：２）のアミノ酸配列又はそ
    の一部を含む領域を特異的に認識するものであることを
    特徴とする請求項３０記載のヒトＴＩＭＰ−３の精製方
    法。
32. 【請求項３２】 ヒトＴＩＭＰ−３と免疫反応するモノ
    クローナル抗体結合アフィニティーゲルを用い、該ヒト
    ＴＩＭＰ−３と免疫反応するモノクローナル抗体がヒト
    ＴＩＭＰ−３のＳＷＹＲＧＷＡＰＰＤＫＳＩＩＮＡＴＤ
    Ｐ（Ｒ１７０−１８８；配列番号：３）のアミノ酸配列
    又はその一部を含む領域を特異的に認識するものである
    ことを特徴とする請求項３０記載のヒトＴＩＭＰ−３の
    精製方法。